特表2024-541897脂質ナノ粒子を調製するためのハイスループット方法及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子を調製するためのハイスループット方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20241106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241106BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20241106BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241106BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K45/00
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61K38/02
A61K47/44
A61K47/24
A61K9/127
A61K47/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524370
(86)(22)【出願日】2022-10-26
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 US2022078710
(87)【国際公開番号】W WO2023076945
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,136
(32)【優先日】2021-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ユイチェン
(72)【発明者】
【氏名】イェン， チュン－ワン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， コー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA65
4C076DD63
4C076EE41
4C076EE51
4C076FF36
4C076FF70
4C084AA03
4C084AA17
4C084BA03
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA38
4C084NA03
4C084NA10
4C086AA01
4C086AA10
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA38
4C086NA03
4C086NA10
(57)【要約】
様々な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を最適化及び製造するためのハイスループット方法及びその使用が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、本開示は、ＬＮＰ組成物を製造するためのハイスループットスクリーニング方法であって、ペイロード及び自己集合可能な複数の分子を含む少なくとも２つの混合可能な溶液を得ることと、制御条件のセット下で前記少なくとも２つの溶液を混合することであって、それにより、注入の順序、速度、体積、相比及び混合持続時間が変化する、前記少なくとも２つの溶液を混合することとを含む、方法を提供する。様々な実施態様において、本開示は、最適な封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性を決定することを可能にする。本明細書に開示される方法は、ＬＮＰベースの治療薬の調製のための製造条件の効率的な最適化を可能にする。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法であって、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法。
【請求項2】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ｍＲＮＡのサイズが約５００から約３０００ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ペイロードがポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ペイロードが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、イオン化可能な脂質種、非カチオン性脂質種、リン脂質種、及び非リン脂質種からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
脂質の総濃度が変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
ＬＮＰがリポソームである、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項32】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項33】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための方法を最適化するためのハイスループット方法であって、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法。
【請求項37】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項３６に記載の方法。
【請求項43】
ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂから約２ｋｂである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
ペイロードがポリペプチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項45】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項46】
ペイロードが小分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項47】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項３６に記載の方法。
【請求項49】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項３６に記載の方法。
【請求項50】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項３６に記載の方法。
【請求項51】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項52】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項53】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項54】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項55】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項57】
脂質の総濃度が変動する、請求項３６に記載の方法。
【請求項58】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項60】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項３６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
ＬＮＰがリポソームである、請求項３６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項３６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項３６に記載の方法。
【請求項67】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項３６に記載の方法。
【請求項68】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項３６から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項３６から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項３６から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法であって、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法。
【請求項72】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項７３に記載の方法。
【請求項76】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項７２から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項７１に記載の方法。
【請求項78】
ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂから約２ｋｂである、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
ペイロードがポリペプチドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項80】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
ペイロードが小分子である、請求項７１に記載の方法。
【請求項82】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項７１に記載の方法。
【請求項84】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項７１に記載の方法。
【請求項85】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項７１に記載の方法。
【請求項86】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項87】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項88】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項89】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項90】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項８９又は９０に記載の方法。
【請求項92】
脂質の総濃度が変動する、請求項８９又は９０に記載の方法。
【請求項93】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項８９又は９０に記載の方法。
【請求項95】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項７２から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項97】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項７１から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項99】
ＬＮＰがリポソームである、請求項７１から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項７１から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項101】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項７１に記載の方法。
【請求項102】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項７１に記載の方法。
【請求項103】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項７１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項104】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項７１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項105】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項７１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項106】
ＬＮＰ調製物を、それを必要とする患者に投与する方法であって、前記ＬＮＰ調製物が、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
によって製造される、方法。
【請求項107】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項108】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項109】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項111】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項１０７から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項112】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項113】
ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂから約２ｋｂである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
ペイロードがポリペプチドである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項115】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
ペイロードが小分子である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項117】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項118】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項119】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項120】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項121】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項122】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項123】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項124】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項125】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項126】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
【請求項127】
脂質の総濃度が変動する、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
【請求項128】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項129】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
【請求項130】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項131】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１０７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項133】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１０６から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項134】
ＬＮＰがリポソームである、請求項１０６から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項135】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１０６から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項137】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項138】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１０６から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項139】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１０６から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１０６から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項141】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法であって、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法。
【請求項142】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項143】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項145】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項146】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項１４２から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項147】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項148】
ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂから約２ｋｂである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項149】
ペイロードがポリペプチドである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項150】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項151】
ペイロードが小分子である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項152】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項153】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項154】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項155】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項156】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項157】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項158】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項159】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項160】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項161】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１５９又は１６０に記載の方法。
【請求項162】
脂質の総濃度が変動する、請求項１５９又は１６０に記載の方法。
【請求項163】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項164】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１５９又は１６０に記載の方法。
【請求項165】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項166】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１４２から１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項167】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項168】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１４１から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項169】
ＬＮＰがリポソームである、請求項１４１から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項170】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１４１から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項171】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項172】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項173】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１４１から１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項174】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１４１から１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項175】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１４１から１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項176】
以下の工程：ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法によって製造される、最適化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
【請求項177】
ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項178】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項179】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項180】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項181】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項１７７から１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項182】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項183】
ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂから約２ｋｂである、請求項１８２に記載の方法。
【請求項184】
ペイロードがポリペプチドである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項185】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項186】
ペイロードが小分子である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項187】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項188】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項189】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項190】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項191】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項192】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項193】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項194】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項195】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１９４に記載の方法。
【請求項196】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１９４又は１９５に記載の方法。
【請求項197】
脂質の総濃度が変動する、請求項１９４又は１９５に記載の方法。
【請求項198】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項１９７に記載の方法。
【請求項199】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１９４又は１９５に記載の方法。
【請求項200】
ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％から約５％の間で変動する、請求項１９９に記載の方法。
【請求項201】
ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１７７から１８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項202】
Ｎ：Ｐ比が約０．５から約５の間で変動する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項203】
ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１７６から２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項204】
ＬＮＰがリポソームである、請求項１７６から２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項205】
ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１７６から２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項206】
前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項207】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項208】
最適なパラメータが、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１７６から２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項209】
最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１７６から２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項210】
ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１７６から２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項211】
ＬＮＰ形成のための複数のパラメータのＨＴＳスクリーニングのためのワークフローであって、（ｉ）ロボット液体ハンドラー；
（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器；及び
（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレート
を含み、
前記ロボット液体ハンドラーが、前記マイクロウェルのそれぞれに複数の溶液を注入することができ；
前記パラメータが、マイクロウェル間で系統的に変動し；
前記所望のＬＮＰ特性が、各マイクロウェルについて測定され得る、
ワークフロー。
【請求項212】
複数のパラメータが、総脂質含有量、自己集合分子のタイプ；前記自己集合分子の組成比；前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度；相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、体積及び速度、並びに混合持続時間から選択される、請求項２１１に記載の方法。
【請求項213】
前記所望のＬＮＰ特性が、平均粒径、粒径分布、封入効率及び粒子安定性からなる群より選択される、請求項２１１に記載の方法。
【請求項214】
前記機器が、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法又は蛍光分光法のいずれかが可能である、請求項２１１に記載のワークフロー。
【請求項215】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法であって、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；
ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及び
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含み、
封入効率が、イオン化可能な脂質／オリゴヌクレオチドの電荷比を測定することによって最適化される、方法。
【請求項216】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項217】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項２１６に記載の方法。
【請求項218】
オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項219】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項２１８に記載の方法。
【請求項220】
オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項２１９に記載の方法。
【請求項221】
オリゴヌクレオチドが約１０から約３０の間のヌクレオチド長である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項222】
ペイロードがｍＲＮＡである、請求項２１５に記載の方法。
【請求項223】
ｍＲＮＡのサイズが約５００から約３０００ヌクレオチド長である、請求項２２２に記載の方法。
【請求項224】
ペイロードがポリペプチドである、請求項２１５に記載の方法。
【請求項225】
前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である、請求項２２４に記載の方法。
【請求項226】
ペイロードが小分子である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項227】
小分子が約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である、請求項２２６に記載の方法。
【請求項228】
ペイロードが第１の溶液に溶解される、請求項２２６に記載の方法。
【請求項229】
ペイロードが第２の溶液に溶解される、請求項２１５に記載の方法。
【請求項230】
第１の溶液が水性緩衝液である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項231】
第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項２１５に記載の方法。
【請求項232】
第２の溶液の有機相がメタノールを含む、請求項２１５に記載の方法。
【請求項233】
第２の溶液の有機相がエタノールを含む、請求項２１５に記載の方法。
【請求項234】
自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項２１５に記載の方法。
【請求項235】
少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、イオン化可能な脂質種、非カチオン性脂質種、リン脂質種、及び非リン脂質種からなる群より選択される、請求項２３４に記載の方法。
【請求項236】
前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項２３５に記載の方法。
【請求項237】
脂質の総濃度が変動する、請求項２１５に記載の方法。
【請求項238】
脂質の総濃度が約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する、請求項２３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
［０００１］本出願は、２０２１年１０月２６日に出願された米国特許仮出願第６３／２７２，１３６号に対する利益を主張するものであり、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
［０００１］本出願は、２０２１年１０月２６日に出願された米国特許仮出願第６３／２７２，１３６号に対する利益を主張するものであり、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
［０００２］脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、生体適合性で安定な薬学的送達プラットフォームとして広く開発されてきた。脂質ナノ粒子を調製するために使用される脂質は、通常、低毒性の生理学的脂質（生体適合性及び生分解性）である。脂質の物理化学的多様性及び生体適合性、並びに薬物の経口バイオアベイラビリティを高めるそれらの能力は、脂質ナノ粒子を薬物送達にとって非常に魅力的な担体にしている。さらに、脂質ベースの製剤は、可溶化能力の増加、腸希釈に対する薬物沈殿の防止、膜透過性の増強、排出輸送体の阻害、ＣＹＰ酵素の減少、カイロミクロン産生及びリンパ輸送の増強を含むいくつかの方法で薬物吸収にプラスの影響を及ぼすことができる。ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡ送達のための主要な非ウイルス担体であり、２０１９年の時点でナノ医薬臨床試験の７０％で使用されている。Ａｎｓｅｌｍｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｂｉｏｅｎｇ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４（３）：ｅ１０１４３。
【0003】
［０００３］脂質ベースのナノキャリアは、その複雑な物理化学的特性に部分的に起因して、薬物製品の品質管理においてさらなる課題をもたらす。米国ＦＤＡによって最近公表されたリポソーム薬物製品に関するガイダンスによれば、これらの製剤は、粒子構造及びサイズ分布、粒子表面の物理化学的特性、脂質含有量、遊離ＡＰＩの量及び封入効率、並びに物理的及び化学的安定性を含む品質属性について指定されるべきである。異なる調製条件及びパラメータは、ＬＮＰ製剤の品質属性に影響を及ぼし得る。例えば、脂質組成、特に異なる量及び／又は分子量のＰＥＧ化脂質の組み込みは、リポソームのコロイド安定性、細胞取り込み、及び薬物動態に有意に影響を及ぼしたが（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１０６６（１）：２９－３６；Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ，１３５（２）：１１７－２９；Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １（３）（２００６）２９７－３１５を参照）、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ負荷は、カチオン性脂質との電荷媒介性相互作用によって制御され得る。Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２６７（１）：９－２１；Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５（７）：１４６７－１４７５． ＬＮＰの下流性能もまた、それらの品質属性によって高度に左右される。したがって、様々なレベルのこれらのパラメータのスクリーニングは、容易な手順及び複数の分析出力を有するハイスループットアプローチを非常に必要とする。
【0004】
［０００４］ＬＮＰの構造及びカーゴの送達は、４つの主要な成分、すなわちイオン化可能な脂質、ヘルパーリン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ－脂質）によって調節される。カチオン性イオン化可能脂質は、ＬＮＰ製剤化時に負電荷を帯びた核酸の封入を促進し、エンドソームのｐＨ範囲５．５～６．５でカーゴの細胞質送達を助ける。ヘルパー脂質及びコレステロールは構造安定性を高め、膜融合を促進し、ＬＮＰのエンドソーム脱出を促進する。ＰＥＧ－脂質添加の効果は多面的で、「ＰＥＧ－ジレンマ」と呼ばれるものの一因となっている。ＰＥＧ－脂質は、自己組織化中に粒径を制御するとともに粒子の凝集を防ぐために必要である。しかし、親水性のＰＥＧコロナが粒子表面と親油性の細胞膜との相互作用を妨げ、その結果、細胞の内在化が悪化する可能性がある。ＰＥＧの存在はまた、受容体媒介エンドサイトーシスを介したＬＮＰ細胞内在化に必要な輸送タンパク質の表面結合を妨げ得る。さらに、ＰＥＧ－脂質は、オプソニンを含む血漿タンパク質の吸着に対する立体障壁として作用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの ＬＮＰ循環時間を延長する。半減期を延長することは治療への曝露を増加させるが、ＬＮＰ循環を増加させることは、有害なアレルギー反応につながる抗ＰＥＧ抗体の生成を誘発する可能性がある。
【0005】
［０００５］このように、効果的な細胞内送達の達成は、ＰＥＧのジレンマを克服するための多価ＰＥＧ－脂質の効果を理解することに大きく依存する。これまでの研究では、ＰＥＧのサイズ、構造、含有量、炭素テールのタイプ、及び長さを調整することで、ＬＮＰの有効性を調節することが示されている。
【発明の概要】
【0006】
［０００６］脂質ベースのナノ医薬のスクリーニング及び最適化の必要性に対処するために、本開示は、様々な治療ペイロードを封入するそのような脂質ベースのナノ粒子を調製するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローを提供する。様々な実施態様において、本発明は、ロボット液体ハンドラーを使用してＬＮＰの容易な自己集合のための最適化された溶媒注入方法を提供する。様々な実施態様において、最適な脂質組成、総脂質濃度、及びペイロードの負荷量が記載される。
【0007】
［０００７］様々な実施態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0008】
［０００８］本明細書で述べるように、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、核酸の送達効率及び治療効果を改善するためにますます利用されている。様々な製剤パラメータが、これらのナノ粒子製剤の品質属性に影響を与え得ることが判明している。しかし、現在のところ、これらの課題に対処するための効果的な体系的スクリーニングアプローチは欠如している。本発明によると、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を担持したＬＮＰの合理化された調製及び分析的特性評価のために、自動化されたハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローが開発された。本発明によれば、この特性評価は９６ウェルプレート全体でわずか３時間以内に行うことができる。
【0009】
［０００９］本発明によれば、ＡＳＯを担持したＬＮＰは、ロボット液体ハンドラーを使用した自動溶媒注入法により製剤化され、粒径分布、カプセル化効率、及びさまざまな製剤組成物とＡＳＯ担持量による安定性について評価された。本明細書に記載された結果は、ＰＥＧ化脂質含量が粒径分布に大きく影響し、イオン化可能脂質／ＡＳＯ電荷比がＡＳＯのカプセル化効率に影響することを示している。さらに、われわれのＨＴＳアプローチの結果は、マイクロ流体フォーミュレーターを用いた最先端のスケールアップ法の結果と相関しており、ロバストな製剤開発及び実験方法設計のための新規の方法を提供するものである。この方法は、材料の使用量を約１０倍削減することができ、それによって分析結果及び情報蓄積を約１００倍改善することができる。
【0010】
［００１０］ＡＳＯ－ＬＮＰを調製し、そのＰＥＧ－脂質含量及び粒径分布の関係を分析するために、新規ＨＴＳワークフローが開発された。ハイスループットの液体ハンドラーを使用して、ホスホグリセリド、ジグリセリド、及びセラミドのファミリーにまたがる複数のＰＥＧ－脂質を含有する様々なＡＳＯ－ＬＮＰのライブラリーが作製され、様々なＰＥＧ－脂質モル比（１～５ｍｏｌ％）で製剤化された。本明細書では、分子量（ｍｗ）、炭素テール長、及びモル比を含むＰＥＧ－脂質パラメータの影響について記載する。さらに、本明細書では、ＰＥＧ構造、脂質テール飽和度、ＰＥＧ－脂質電荷、及びリンカー化学を含む、多数の追加のＰＥＧ－脂質の変数が記載されている。
【0011】
［００１１］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは、約５００～３０００ヌクレオチドである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0012】
［００１２］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0013】
［００１３］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性又はイオン化可能な脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0014】
［００１４］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0015】
［００１５］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための方法を最適化するためのハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成物を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0016】
［００１６］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0017】
［００１７］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0018】
［００１８］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0019】
［００１９］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0020】
［００２０］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0021】
［００２１］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0022】
［００２２］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0023】
［００２３］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0024】
［００２４］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0025】
［００２５］様々な実施態様において、本開示は、ＬＮＰ調製物を、それを必要とする患者に投与する方法に関し、前記ＬＮＰ調製物は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することによって製造される。
【0026】
［００２６］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0027】
［００２７］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0028】
［００２８］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0029】
［００２９］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0030】
［００３０］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0031】
［００３１］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0032】
［００３２］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0033】
［００３３］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0034】
［００３４］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0035】
［００３５］様々な実施態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0036】
［００３６］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0037】
［００３７］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0038】
［００３８］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0039】
［００３９］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0040】
［００４０］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0041】
［００４１］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0042】
［００４２］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0043】
［００４３］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0044】
［００４４］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0045】
［００４５］様々な実施態様において、本開示は、以下の工程：ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む方法によって製造された、最適化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。
【0046】
［００４６］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0047】
［００４７］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0048】
［００４８］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0049】
［００４９］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0050】
［００５０］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；ｄ．ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。
【0051】
［００５１］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施態様では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。
【0052】
［００５２］様々な実施態様において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施態様において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施態様において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。
【0053】
［００５３］様々な実施態様において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施態様において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。
【0054】
［００５４］様々な実施態様において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施態様において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施態様において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施態様において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施態様において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施態様において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有し、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施態様において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。
【0055】
［００５５］様々な実施態様において、本開示は、ＬＮＰ形成についての複数のパラメータのＨＴＳスクリーニングのためのワークフローであって、（ｉ）ロボット液体ハンドラー；（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器；及び；（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレート、を含み、前記ロボット液体ハンドラーは、前記マイクロウェルの各々に複数の溶液を注入することができ；前記パラメータは、マイクロウェル間で系統的に変動し；前記所望のＬＮＰ特性は、各マイクロウェルについて測定され得る、ワークフローに関する。
【0056】
［００５６］様々な実施態様において、複数のパラメータは、総脂質含有量、自己集合分子のタイプ；前記自己集合分子の組成比；前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度；相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、体積及び速度、並びに混合持続期間から選択される。様々な実施態様において、所望のＬＮＰ特性は、平均粒径、粒径分布、封入効率及び粒子安定性からなる群より選択される。様々な実施態様において、機器は、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法又は蛍光分光法のいずれかが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1A-F】［００５７］高速のエタノール－緩衝液注入とそれに続く複数回の混合により生成された、ＡＳＯ負荷が高い均一なＬＮＰのデータを示す。０．４μｍｏｌの総脂質及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００で構成されるＬＮＰを、異なる混合条件を使用して１のＮ／Ｐ比の下でＡＳＯ－１と混合した。ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して、０．１、０．５、又は０．９ｍｌ／ｓの速度での逆の注入順序（エタノールから緩衝液又は緩衝液からエタノール）とそれに続く１０回の混合反復（図１Ａ～１Ｃ）、又は０．５又は０．９ｍｌ／ｓの速度でのエタノールから緩衝液の注入とそれに続く１０又は２０回の混合反復（図１Ｄ～１Ｆ）を調査した。粒径（図１Ａ及び１Ｄ）及び多分散性（図１Ｂ及び１Ｅ）を動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。遊離ＡＳＯ－１をＯＤ２６０によって測定し、封入効率について計算した（図１Ｃ及び１Ｆ）。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（図１Ａ～１Ｃ）二元配置又は一元配置（図１Ｄ～１Ｆ）ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析した。
【図2】［００５８］ＡＳＯ負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳワークフローを示す。ＴＥＣＡＮ（登録商標）液体ハンドラーを使用する自動溶媒注入法によって、４レベルの脂質組成、２レベルの総脂質濃度、及び４レベルのＡＳＯ負荷量で変動する９６個のサンプル（３２条件、ｎ＝３）を調製し、続いて、２６０ｎｍでの吸光度によるＤＬＳ及びＡＳＯ封入による粒径分布の特性評価を行った。代表的なＬＥＡ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ設計レイアウトをサンプルプレートについて示した。
【図3A-E】［００５９］ＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ分析である。図３Ａは、スクリーニング設計を示す画像である。全脂質濃度（２レベル）脂質組成に組み込まれたＰＥＧ化脂質含有量（４レベル）、及びＡＳＯの負荷比（４レベル）を含む製剤パラメータを、各条件について３回反復して９６ウェルプレートでスクリーニングした。図３Ｂ～３Ｄは、サンプルをＰＢＳで希釈し、ＤＬＳによって粒径分布について特性評価したことを示す。図３Ｂは、代表的なサイズ分布を示すグラフであり、脂質組成中に添加されたＰＥＧ化脂質の量が増加した小粒子集団を示した。図３Ｃ～３Ｄは、「範囲外」の黒い点によって示されるように、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００が脂質組成に組み込まれなかった場合の多峰性サイズ分布を有する大きな凝集体（５００～１５００ｎｍの直径）を除いて、ＬＮＰが４５～１４５ｎｍの平均直径及び１０～５０％の％ＰＤを有したことを示すヒートマップである。２ｍＭの総脂質濃度を有するサンプルについても定量分析を示した。図３Ｅは、封入効率を計算するためにＯＤ２６０によって非封入量のＡＳＯについて測定されたサンプルアリコート（２ｍＭの総脂質濃度）を示す棒グラフである。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析）。このデータはＬＣによって確認された。
【図4】［００６０］ＰＥＧ化脂質なしで調製したＬＮＰが大きな凝集体を生成したことを示す棒グラフである。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００なしで調製したＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ（スクリーニングされた条件を図３Ｃ～３Ｄの列Ａ及びＥに示す）の平均粒径を平均±ＳＤとして示す、ｎ＝３；ｎｓ、有意でない、＊Ｐ＜０．０５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＳｉｄａｋの多重比較によって分析）。
【図5A-C】［００６１］ＡＳＯ－１負荷、カチオン性ＬＮＰ製剤のＨＴＳ分析である。スクリーニングしたカチオン性ＬＮＰは、６０～１２０ｎｍの平均直径（図５Ａ）、１０～５０％の多分散性（図５Ｂ）、及びＰＥＧ化脂質の量の増加に関してＭＣ３ ＬＮＰと同様の傾向を示した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００が存在しない場合、「範囲外」の黒い点によって示されるように、又は白い点によって示される不完全な測定（大きな凝集体のため）によって示されるように、多峰性のサイズ分布を有する大きな凝集体が生成された。２ｍＭの総脂質濃度を有するサンプルについても定量分析を示した。（図５Ｃ）ＯＤ２６０によって非封入ＡＳＯの量についてサンプルを測定して、封入効率を計算した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ（図５Ａ～５Ｂ）又はＳｉｄａｋ（図５Ｃ）の多重比較によって分析）。
【図6A-C】［００６２］２ｍＭの総脂質濃度、異なる量のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、及び異なるオリゴヌクレオチド負荷下でイオン化可能な脂質と製剤化されたＡＳＯ－２負荷ＬＮＰのＨＴＳ分析である。結果は、ＡＳＯの粒径（図６Ａ）、多分散性（図６Ｂ）、及び封入効率（図６Ｃ）に関して、ＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ（図３Ａ～３Ｅ）と同様の傾向を示した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析）。
【図7A-E】［００６３］ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）を使用したマイクロ流体調製からの結果と相関するＨＴＳ分析結果である。図７Ａは、ＰＥＧ化脂質の量の増加に伴う粒径の減少及び多分散性の増加の相関を示すグラフである。ＬＮＰは、異なるモル比のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及び固定Ｎ／Ｐ比２で調製した。図７Ｂは、高い総脂質濃度下で粒径が安定であったことを示すグラフである。ＬＮＰは、０．４、０．７、１、又は２ｍＭの総脂質濃度、１．５ｍｏｌ％の固定ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、及びＮ／Ｐ比２の下で調製した。図７Ｃ～図７Ｄは、粒径（図７Ｃ）が安定していた一方で、ＡＳＯ（図７Ｄ）の％ＥＥが高いＡＳＯ負荷及び過剰のＡＳＯ負荷下で減少したことを示す。ＬＮＰは、Ｎ／Ｐ比＝５、２、１、又は０．５、及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００下で調製した。図７Ｅは、ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）又は異なる製剤パラメータを用いたハイスループット溶媒注入によって調製されたＡＳＯ－１負荷ＬＮＰの代表的なｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。拡大画像は、２つのアプローチを使用して同じ製剤パラメータで調製された代表的なＬＮＰ（青色矢印で示す）の同様の構造パターンを示した。パネル（図７Ａ、７Ｃ、及び７Ｄ）におけるＨＴＳの結果は、図３に示される同じスクリーニング実験からのものである。結果は平均±ＳＤ、図７Ｄのマイクロ流体結果についてのｎ＝１を除いてｎ＝３である。
【図8A-B】［００６４］ハイスループット溶媒注入法又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）によって調製されたＡＳＯ－１負荷ＭＣ３ ＬＮＰの４℃で２週間の安定性を示す。図８Ａは、平均粒径を示し、図８Ｂは、２週間にわたる多分散性を示すグラフである。総脂質濃度は２ｍＭであり、Ｎ／Ｐ比は１（ＨＴＳサンプル）又は０．５（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）サンプル）であり、ＰＥＧ量は１．５から５ｍｏｌ％まで変動した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；各群内の０日目の結果に対して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較によって分析。その後の研究（図示せず）は、４℃で１ヶ月貯蔵した後に同様の結果を示した。
【図9】［００６５］４０℃で２週間にわたる、図８Ａ－８Ｂに示したＨＴＳ ＬＮＰの安定性を示すグラフである。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；＊各群内の０日目の結果に対してＰ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較によって分析。
【図10】［００６６］４０℃でのＬＮＰからのＡＳＯ漏出を示すグラフである。２週間以内にＬＮＰから放出されたＡＳＯ－１をＯＤ２６０により測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；１．５ｍｏｌ％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００群に対して、＊Ｐ＜０．０５及びｎｓ、有意ではない、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｒｋｅｙの多重比較によって分析。
【図11】［００６７］ＨＴＳアプローチが、ＡＳＯ負荷ＬＮＰのマイクロ流体調製と比較して、原材料を有意に節約し、分析出力を改善したことを示す。１．５モル％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００及びＮ／Ｐ比（ＭＣ３及びＡＳＯ－１に基づく）１を含有する２ｍＭの総脂質を有する典型的なサンプルについて、必要とされる材料を計算した。
【図12A-B】［００６８］ＡＳＯ封入の定量化の代替方法を示す。図１２Ａは、ワークフローの概略図である。ＡＳＯ負荷ＬＮＰをハイスループット溶媒注入法によって調製し、蛍光プローブＳｙｂｒ－金と混合し、続いて蛍光プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５５０ｎｍ）を使用して定量した。図１２Ｂは、異なるＮ／Ｐ比の下で調製された２つの異なるＬＮＰ製剤の同等の封入効率％を示すグラフである。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝２であり；ｎｓ、有意ではない。
【図13A】［００６９］ＨｉＢｉＴペプチド負荷リポソーム製剤のＨＴＳワークフローを示す。９６ウェルプレート形式でのハイスループットゲル濾過及び透析を含む２つの精製方法を比較した。ＬＮＰをハイスループット溶媒注入法によって合成し、続いてＤＬＳによる粒径分布及びＵＶ－Ｖｉｓ、発光及び蛍光による遊離カーゴ量の特性評価を行った。次いで、ハイスループットゲル濾過又は透析のいずれかを使用してＬＮＰを精製し、続いてＵＶ－Ｖｉｓ、蛍光及びＤＬＳをそれぞれ使用して、精製効率、粒子回収及び粒径安定性の分析を行った。
【図13B】［００７０］スクリーニング設計を示す画像である。ＭＣ３を含まないＤＰＰＣ ＬＮＰ、ＭＣ３を含むＤＰＰＣ ＬＮＰ、ＭＣ３を含まないＤＳＰＣ ＬＮＰ、及びアジドとコンジュゲートした遮蔽ペグ化脂質及びペグ化脂質の両方を含むＭＣ３を含むＤＳＰＣ ＬＮＰを含む製剤パラメータを、各条件について３連で９６ウェルプレートでスクリーニングした。
【図13C】［００７１］「範囲外」の黒い点によって示されるように、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００が脂質組成に組み込まれなかった場合の多峰性サイズ分布を有する大きな凝集体を除いて、ＬＮＰが５０～２００ｎｍの平均直径を有したことを示すヒートマップである。
【図13D-F】［００７２］精製前（図１３Ｄ）及び精製後の遊離ペプチド濃度の定量を示す表である。ゲル濾過及び透析は、それぞれ約９８％（図１３Ｅ）及び約６１％（図１３Ｆ）の平均精製効率をもたらした。４０ｋＤのＭＷＣＯを有する９６の小さいカラムプレートをゲル濾過及びＰＢＳによる溶出のために使用した。１０ｋＤのＭＷＣＯを有する９６ウェル透析プレートを、３ＬのＰＢＳにおける透析のために一晩使用し、３回の培地交換を行った。透析後のデータ点の喪失は、サンプル回収が低いためであった。
【図13G-H】［００７３］ゲル濾過による精製後の粒子回収率及びサイズの定量化を示すデータである。図１３Ｇでは、回収率は、ペグ化脂質なしで調製された凝集サンプルによる低い値を除いて、一般に８０～１２０％の間であった。図１３Ｈでは、粒径分布は、ゲル濾過による精製後も一定のままであった。
【図14】［００７４］ロボット液体ハンドラーを用いた自動溶媒注入によるＬＮＰ調製（左上）及びハイスループットスクリーニング（左下）、続いて品質属性、例えば粒径分布（右上）、ＡＳＯカプセル化（中央下）及びＬＮＰ安定性（右下）の分析を含む、本明細書に記載される一般的手順を示す。
【図15A-F】［００７５］ＡＳＯ－ＬＮＰ製剤ライブラリーの概略図である。ＡＳＯを含む水相と、さまざまなＰＥＧ－脂質組成の溶解脂質混合物を含むエタノール相とを迅速に混合することによってＡＳＯ－ＬＮＰを形成するために、液体処理ロボットを使用した（図１５Ａ）。各脂質混合物は、ホスホグリセリド、ジグリセリド、又はセラミド（図１５Ｂ）ファミリーから選択された別個のＰＥＧ－脂質を、イオン化可能な脂質ＭＣ３（図１５Ｃ）、コレステロール（図１５Ｄ）、及びヘルパー脂質ＤＳＰＣ（図１５Ｅ）と組み合わせて含み、５４の異なる配合を有するＡＳＯ－ＬＮＰライブラリーを生成した。
【図16A-F】［００７６］ＡＳＯ－ＬＮＰの粒径分布を示す。ＡＳＯ－ＬＮＰは、液体処理ロボットを用いて、ＰＥＧ化脂質の種類及び量を変えて調製した。それぞれのＡＳＯ－ＬＮＰ製剤に使用されているＰＥＧ－脂質アナログは、Ｘ軸ラベルの下に＃で示されており、表１から参照することができる。粒子ライブラリーを９６ウェルプレートセットアップで動的光散乱を使用して特性評価して、アニオン性（直鎖状、分岐状）及び中性のＰＥＧ－脂質の異なるサブセットにわたる粒径（図１６Ａ～１６Ｃ）及び多分散性の傾向（図１６Ｄ～１６Ｆ）を、Ｘ軸値で示されるＰＥＧサイズ（Ｄａ）、異なる色の背景で示されるＣテールタイプ、及びそれぞれの棒の色で示されるＡＳＯ－ＬＮＰ中のＰＥＧ－脂質含有量（ｍｏｌ％）に応じて同定した。
【図18】［００７８］ヒットしたＡＳＯ－ＬＮＰのスケールアップ製剤への変換を示す。ＡＳＯ－ＬＮＰ製剤は、われわれのＨＴＳライブラリーの１、３、及び５ｍｏｌ％のデータから同定され、マイクロ流体ミキサーを用いてスケールアップされた。この２つの製剤のスケールと技法は、その粒径分布を比較することによって、スムーズな変換が可能であることが検証された。
【発明を実施するための形態】
【0058】
［００７９］薬物送達のための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製造は、様々な製剤パラメータの影響を受ける複雑な物理化学的特性のために困難である。ＬＮＰ製造における粒子構造及びサイズ分布、粒子表面の物理化学的特性、脂質含有量、遊離ＡＰＩの量及び封入効率、並びに物理的及び化学的安定性の制御は困難かつ複雑である。従来のバッチ法による、脂質種、パーセンテージ、濃度及び薬物負荷を含むＬＮＰ製剤パラメータのスクリーニングは、かなりの時間及び原材料を必要とする。したがって、最小の材料入力並びに効率的な調製及び分析出力を有するハイスループットスクリーニングアプローチが、最適な品質属性を有するリード製剤候補を決定するために好ましいであろう。ロボット液体ハンドラーは、主に液体の添加及び移送に使用されており、精密に調整された機器パラメータを有するＬＮＰフォーミュレーターとしては使用されていない。さらに、ＬＮＰ調製及び分析の両方を統合した合理化されたハイスループットワークフローが不足している。本明細書では、注入ベースのＬＮＰ形成のためのロボット液体ハンドラーを使用して、所望の特性に基づいてＬＮＰ製造を最適化するためのハイスループット方法が提供される。最適化されたＬＮＰ粒子及びそれらの製造方法を、本明細書中にさらに提供する。
【0059】
［００８０］本明細書の説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されよう。本出願では、特に明記しない限り、単数形の使用は複数形を含む。
【0060】
［００８１］本明細書で使用される項目の見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含む本出願で引用された全ての文書、又は文書の一部は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に援用される。以下の用語は、本開示に従って利用される場合、別途指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。
【0061】
［００８２］本出願において、「又は」の使用は、別途記載されない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素」又は「構成要素」等の用語は、別途明記されない限り、１つの単位及び要素を含む、要素及び構成成分と、１つよりも多いサブユニットを含む構成成分との両方を包含する。
【0062】
［００８３］本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象に関して本明細書では互換的に使用される。
【0063】
［００８４］「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾としては、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。
【0064】
［００８５］「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【0065】
［００８６］「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、天然配列の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含む、タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を指す。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有する抗原結合分子、抗体、又は配列を特に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片はまた、天然タンパク質と比較して修飾アミノ酸を含むことができる。有用なポリペプチド断片には、抗原結合分子の免疫学的に機能的な断片が含まれる。
【0066】
［００８７］「単離された」という用語は、（ｉ）通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない；（ｉｉ）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない；（ｉｉｉ）自然界で会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の材料の少なくとも約５０％から分離されている；（ｉｖ）自然界で会合していないポリペプチドと（共有結合又は非共有結合相互作用によって）作用可能に会合している；又は（ｖ）自然界では存在しないことを意味する。
【0067】
［００８８］ポリペプチド（例えば、抗原結合分子）の「バリアント」は、１つ又は複数のアミノ酸残基が別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列に挿入、欠失及び／又は置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントには、例えば、融合タンパク質が含まれる。
【0068】
［００８９］「同一性」という用語は、配列をアライメントして比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。
【0069】
［００９０］同一性パーセントを計算するために、比較される配列は、典型的には、配列間の最大一致を得るようにアライメントされる。同一性パーセントを決定するために使用され得るコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８４，１２，３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定される２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドをアラインメントするために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチングのためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。特定の実施態様では、標準的な比較マトリックスもアルゴリズムによって使用される（例えば、ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５－３５２を参照し；ＢＬＯ－ＳＵＭ ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１０９１５－１０９１９を参照のこと）。
【0070】
［００９１］「誘導体」という用語は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失、又は置換以外の化学修飾を含む分子を指す。特定の実施態様において、誘導体は、限定されないが、ポリマー、脂質、又は他の有機若しくは無機部分との化学結合を含む共有結合修飾を含む。特定の実施態様において、化学的に修飾された抗原結合分子は、化学的に修飾されていない抗原結合分子よりも大きい循環半減期を有することができる。いくつかの実施態様において、誘導体抗原結合分子は、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む１つ又は複数の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合的に修飾される。
【0071】
［００９２］ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」又は「ペプチド模倣薬」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ． Ｌ．，１９８６，Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１９８６，１５，２９；Ｖｅｂｅｒ，Ｄ． Ｆ． ＆ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ． Ｍ．，１９８５，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８，３９２－３９６；及びＥｖａｎｓ，Ｂ． Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，３０，１２２９－１２３９。これらは任意の目的のために参照により本明細書に援用される。
【0072】
［００９３］「治療的有効量」という用語は、哺乳動物において治療応答を生じるように決定された免疫細胞又は他の治療剤の量を指す。そのような治療的有効量は、当業者によって容易に確認される。
【0073】
［００９４］「患者」及び「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象、並びに正式に診断された障害を有する対象、正式に認識された障害を有しない対象、医学的注意を受けている対象、障害を発症するリスクがある対象などを含む。
【0074】
［００９５］「治療する（ｔｒｅａｔ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置、予防的処置、及び対象が障害又は他の危険因子を発症するリスクを低下させる適用を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症候又は根底にある危険因子を軽減する実施態様を包含する。「防止する」という用語は、事象の可能性を１００％排除することを必要としない。むしろ、これは、化合物又は方法の存在下で事象の発生の可能性が低下したことを示す。
【0075】
［００９６］組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実施することができる。前述の技術及び手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されているように実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。この文献は任意の目的のために参照により本明細書に援用される。
【0076】
［００９７］本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さと比較して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％高い量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。一実施態様において、「本質的に同じ」又は「実質的に同じ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さとほぼ同じ量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲を指す。
【0077】
［００９８］本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換的に使用され、細胞集団又は培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、特定の物質を含まない、例えば９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、又は従来の手段で測定して検出不能な組成物を指す。同様の意味は、組成物の特定の物質又は成分の非存在を指す「非存在」という用語にも適用することができる。
【0078】
［００９９］本明細書で使用される場合、「認識できる」という用語は、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量若しくは長さの範囲、又は１つ若しくは複数の標準的な方法によって容易に検出可能な事象を指す。「認識不可能」及び「認識できない」という用語及び等価物は、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量若しくは長さの範囲、又は標準的な方法では容易に検出できない若しくは検出不可能な事象を指す。一実施態様において、ある事象が、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．００１％、又はそれ未満の頻度で発生する場合、認識できない。
【0079】
［０１００］本明細書を通して、文脈上別途要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載された工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を含むが、任意の他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を除外しないことを意味すると理解される。特定の実施態様では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義的に使用される。
【0080】
［０１０１］本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
【0081】
［０１０２］「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について本開示で指定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
【0082】
［０１０３］本明細書を通して、「一実施態様」、「実施態様」、「特定の実施態様」、「関連する実施態様」、「ある特定の実施態様」、「追加の実施態様」、又は「さらなる実施態様」、又はそれらの組み合わせへの言及は、実施態様に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が本発明の少なくとも１つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施態様を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、１つ又は複数の実施態様において、任意の適切な様式で組み合わされ得る。
【0083】
［０１０４］本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。特定の実施態様では、数値に先行する場合の「約」又は「およそ」という用語は、１５％、１０％、５％若しくは１％の範囲、又はそれらの任意の介在範囲をプラス又はマイナスした値を示す。
【0084】
脂質ナノ粒子の製造を最適化するためのハイスループットスクリーニング方法
［０１０５］脂質ベースのナノ医薬のスクリーニング及び最適化の必要性に対処するために、本明細書の開示は、脂質ナノ粒子の調製のための、並びにそれらの粒径分布及びペイロード封入の特性評価のためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローを提供する。
［０１０５］脂質ベースのナノ医薬のスクリーニング及び最適化の必要性に対処するために、本明細書の開示は、脂質ナノ粒子の調製のための、並びにそれらの粒径分布及びペイロード封入の特性評価のためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローを提供する。
【0085】
［０１０６］様々な実施態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製造を最適化するためのハイスループットスクリーニング方法に関する。様々な実施態様において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）ロボット液体ハンドラーと、（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器と、（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む、少なくとも１つのマイクロプレートとを含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）スクリーニングワークフローを利用する。様々な実施態様では、ＬＮＰは、溶媒注入法を使用して上記のＨＴＳスクリーニングワークフローによって形成される。例えば、Ｇｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．２２，１８－３０；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ－Ｇｏｙｍａｎｎ，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５５，１２５－１３１を参照のこと。
【0086】
［０１０７］様々な実施態様において、ＨＴＳワークフローは、所望のＬＮＰ特性を測定することができる機器を含む。そのような特性には、封入効率、平均粒径、及び粒径分布が含まれる。物理的安定性はまた、貯蔵後の異なる時点で粒径及びペイロード放出を測定することによって決定することができる。そのような分析技術は当技術分野で公知であり、走査／透過型電子顕微鏡法（ＳＥＭ／ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）分析超遠心分離（ＡＵＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外線（ＵＶ）分光法、及び流れ場分画（ＦＦＦ）を含む。様々な実施態様において、ＨＴＳワークフローは、ＤＬＳ、ＵＶ－Ｖｉｓ又は蛍光分光法が可能な機器を含む。様々な実施態様において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）ロボット液体ハンドラーと、（ｉｉ）ＤＬＳを実行することができる機器と、（ｉｉｉ）サンプルに対するＵＶ－Ｖｉｓ又は蛍光分光法が可能な機器と、（ｉｖ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレートとを含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）スクリーニングワークフローを利用する。
【0087】
［０１０８］様々な実施態様において、ＨＴＳワークフローは、溶媒注入システムを使用してＬＮＰ製造を最適化する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「溶媒注入システム」は、脂質含有自己集合性分子を含む第１の溶液を第２の溶液に迅速に注入することを意味する。様々な実施態様において、溶液は混合可能又は混和性である。様々な実施態様において、第１の溶液は水混和性溶媒である。様々な実施態様において、少なくとも１つの溶液は有機相溶媒である。アセトン、エタノール、イソプロパノール及びメタノールは全て、ＬＮＰ調製に適した溶媒である。様々な実施態様において、第１の溶液はアルコールである。様々な実施態様において、第１の溶液はエタノールである。様々な実施態様において、第１の溶液はメタノールである。
【0088】
［０１０９］様々な実施態様において、ＬＮＰによって封入されるペイロードは、前記第２の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ＬＮＰによって封入されるペイロードは、前記第１の溶液に溶解される。様々な実施態様において、ペイロードは、第３の水混和性溶媒によって封入される。
【0089】
［０１１０］様々な実施態様において、溶液の少なくとも２つは異なる相である。様々な実施態様において、互いに注入される３つのも溶液が存在する。様々な実施態様において、互いに注入される少なくとも４つの溶液が存在する。様々な実施態様において、少なくとも１つの有機相及び少なくとも１つの水相が存在する。
様々な実施態様において、溶液の１つは水性溶媒を含む。様々な実施態様において、水性溶媒は水性緩衝液である。
様々な実施態様において、溶液の１つは水性溶媒を含む。様々な実施態様において、水性溶媒は水性緩衝液である。
【0090】
［０１１１］一方の溶液の他方の溶液への注入は、ロボット液体ハンドラーによって制御される。本明細書で使用される場合、「ロボット液体ハンドラー」という用語は、液体を複数のウェル、マイクロウェル、又は他の液体リザーバに並行して自動的にピペッティング、移送、及び混合することができる装置を意味する。様々な実施態様において、ロボット液体ハンドラーは、異なる組成又は異なる量の液体を異なるウェル、マイクロウェル又は液体リザーバに並行して送達することができる。様々な実施態様において、ロボット液体ハンドラーは、液体を異なるウェル、マイクロウェル又は液体リザーバに、様々な速度又は持続時間で並行してピペッティング、移送及び混合することができる。
【0091】
［０１１２］様々な実施態様において、前記一方の溶液を前記第２の溶液に注入した後、ロボット液体ハンドラーは前記溶液を繰り返し取り上げて再注入し、それによって少なくとも２つの溶液を混合する。様々な実施態様において、この注入及び／又は混合の速度及び持続時間を変化させて、ＬＮＰ形成の最適なパラメータを決定する。様々な実施態様において、注入及び／又は混合の速度は、０．１ｍｌ／ｓ～０．９ｍｌ／ｓで変動する。様々な実施態様において、初期注入速度（すなわち、液体の第１の注入）は、０．１ｍｌ／ｓ～０．９ｍｌ／ｓの速度で行われる。図１を参照のこと。様々な実施態様において、その後の注入／混合は、１～１０秒間にわたって行われる（０．１ｍｌ／秒～０．９ｍｌ／秒で１０×混合）。
【0092】
［０１１３］様々な実施態様において、ＬＮＰ形成は、少なくとも１つのマイクロプレートで完了する。様々な実施態様では、マイクロプレートは複数のマイクロウェルで構成され、形成条件（例えば、脂質種、脂質組成、総脂質濃度、ペイロード、ペイロード負荷比、相種）はマイクロウェル間で変動する。マイクロプレートは、任意のサイズであり得、任意の数のマイクロウェルを含み得る。様々な実施態様において、マイクロプレートは、４、６、８、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６個のマイクロウェルを含む。
【0093】
［０１１４］本明細書で提供されるＨＴＳ方法の１つの利点は、ＬＮＰ形成が少量の溶液中で迅速に起こり得ることである。本明細書に開示される方法は、材料消費を１０倍減少させ、処理出力を１００倍改善する（図１１参照）。マイクロウェルにおけるＬＮＰ形成は、例えばマイクロ流体ベースの調製物を使用して形成されたＬＮＰよりもかなり少ない材料を使用する。様々な実施態様において、マイクロウェルは、体積が約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、約１２５μＬ、約１５０μＬ、約１７５μＬ、約２００μＬ、約２５０μＬ、約３５０μＬ、約３６０μＬ、約４００μＬ、約５００μＬ、約１０００μＬ、約２０００μＬ、約３０００μＬ、約４０００μＬである。
【0094】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
［０１１５］本明細書では、最適化された脂質ナノ粒子及びこれらの脂質ナノ粒子「ＬＮＰ」の製造を最適化する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、（ｉ）複数の自己集合性分子（前記自己集合性分子は脂質成分を含む）及び（ｉｉ）ペイロードを含む組成物を指す。本発明を使用して製造が最適化されたＬＮＰは、任意の目的に使用することができる。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、ワクチンを送達するために使用され得る。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、薬物を、それを必要とする患者に送達するために使用され得る。ＬＮＰは、核酸、ペプチド、タンパク質及び小分子を含むがこれらに限定されない任意のペイロードを担持し得る。さらに、ＬＮＰは、脂質（例えば、リポソーム）のみからなっていてもよく、又は自己集合が可能なポリマー若しくはタンパク質などの他の成分を含んでいてもよい。
［０１１５］本明細書では、最適化された脂質ナノ粒子及びこれらの脂質ナノ粒子「ＬＮＰ」の製造を最適化する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、（ｉ）複数の自己集合性分子（前記自己集合性分子は脂質成分を含む）及び（ｉｉ）ペイロードを含む組成物を指す。本発明を使用して製造が最適化されたＬＮＰは、任意の目的に使用することができる。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、ワクチンを送達するために使用され得る。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、薬物を、それを必要とする患者に送達するために使用され得る。ＬＮＰは、核酸、ペプチド、タンパク質及び小分子を含むがこれらに限定されない任意のペイロードを担持し得る。さらに、ＬＮＰは、脂質（例えば、リポソーム）のみからなっていてもよく、又は自己集合が可能なポリマー若しくはタンパク質などの他の成分を含んでいてもよい。
【0095】
［０１１６］様々な実施態様において、ＬＮＰは、上記の技術を使用して製造された最適化されたＬＮＰである。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、以下の工程：（ｉ）水相を含む第１の溶液を得ること、（ｉｉ）有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；（ｉｖ）ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；（ｖ）前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボットハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、脂質ナノ粒子を得ること；（ｖｉ）前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；（ｖｉｉ）前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに（ｖｉｉｉ）前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む方法によって製造される。
【0096】
［０１１７］様々な実施態様において、本発明は、ハイスループット方法を使用してＬＮＰを製造する方法に関し、その方法は以下の工程：（ｉ）水相を含む第１の溶液を得ること、（ｉｉ）有機相と、自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解させること；（ｉｖ）ロボット液体ハンドラーを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；（ｖ）前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボットハンドラーを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることを含む。
【0097】
自己集合性分子
［０１１８］本明細書で使用される場合、「自己集合性分子」という用語は、外部供給源からの案内又は管理なしに定義された配置が可能な任意の分子を指す。最適化されたＬＮＰは、単一種の自己集合性分子から構成されてもよく、又は複数種の自己集合性分子から構成されてもよい。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、少なくとも１種の脂質分子を有する脂質成分を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、ポリマー分子及び／又はタンパク質／ペプチド分子を含み得る。様々な実施態様において、ＬＮＰの自己集合性分子は、脂質分子のみを含み得る。
［０１１８］本明細書で使用される場合、「自己集合性分子」という用語は、外部供給源からの案内又は管理なしに定義された配置が可能な任意の分子を指す。最適化されたＬＮＰは、単一種の自己集合性分子から構成されてもよく、又は複数種の自己集合性分子から構成されてもよい。様々な実施態様において、最適化されたＬＮＰは、少なくとも１種の脂質分子を有する脂質成分を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、ポリマー分子及び／又はタンパク質／ペプチド分子を含み得る。様々な実施態様において、ＬＮＰの自己集合性分子は、脂質分子のみを含み得る。
【0098】
［０１１９］脂質成分は、単一の脂質種を含んでもよく、又は２種類以上の脂質を含んでもよい。本発明の様々な実施態様において、ＬＮＰ調製物中の脂質の相対組成は変動する。様々な実施態様において、所与のＬＮＰ製剤の製造のための最適パラメータを考慮する場合、異なる脂質種又は異なる脂質種の組み合わせが評価される。様々な実施態様において、少なくとも１つの脂質分子がペグ化される。様々な実施態様において、脂質成分は、リン脂質を含み得る。
【0099】
［０１２０］様々な実施態様において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数のカチオン性又はイオン化可能な脂質を含み得る。いくつかの実施態様において、１つ又は複数のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（標的２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（標的２４）、Ｎ１ＧＬ、Ｎ２ＧＬ、Ｖ１ＧＬ並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0100】
［０１２１］いくつかの実施態様において、１つ又は複数のカチオン性又はイオン化可能な脂質はアミノ脂質である。様々な実施態様において、アミノ脂質は、第一級、第二級、第三級、第四級アミン、ピロリジン又はピペリジンである。本発明での使用に適したアミノ脂質には、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７１８０９１７号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１７１８０９１７号における例示的なアミノ脂質には、段落［０７４４］に記載されるもの、例えば、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）及び化合物１８が含まれる。他のアミノ脂質としては、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０及び化合物２０が挙げられる。本発明での使用に適したさらなるアミノ脂質には、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７１１２８６５号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１７１１２８６５号の例示的なアミノ脂質には、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、及び（２０－１）の１つによる化合物、並びに段落［００１８５］、［００２０１］、［０２７６］の化合物が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明での使用に適したカチオン性脂質には、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６１１８７２５号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１６１１８７２５号の例示的なカチオン性脂質には、ＫＬ２２及びＫＬ２５などが含まれる。いくつかの実施態様において、本発明での使用に適したカチオン性脂質には、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６１１８７２４号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１６１１８７２５号における例示的なカチオン性脂質には、ＫＬ１０、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）及びＫＬ２５などが含まれる。
【0101】
［０１２２］いくつかの実施態様において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施態様において、１つ又は複数の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。
【0102】
［０１２３］いくつかの実施態様において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施態様において、１つ又は複数のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０ 長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した５ｋＤａまでの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ｎａｄ ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ又はＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【0103】
［０１２４］様々な実施態様において、ＬＮＰ中のＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージ（すなわち、ＰＥＧ密度）は変動する。ＬＮＰ中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）密度は、粒径、表面電荷及び安定性に影響を及ぼすことが分かっている。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．１％と約１０％の間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．２％と約９％の間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．３％と約８％の間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．４％と約７％の間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．５％と約６％の間で変動する。様々な実施態様において、ＰＥＧ密度は、約０．５％と約５％の間で変動する。
【0104】
［０１２５］様々な実施態様において、ＬＮＰ調製のための溶液中に存在する脂質成分の総濃度は、任意の所与のＬＮＰの最適な特性を達成するために変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．１ｍＭと約８ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．２ｍＭと約７ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．３ｍＭと約６ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭと約４ｍＭの間で変動する。様々な実施態様において、脂質の総濃度は、約０．５ｍＭと約３ｍＭの間で変動する。
【0105】
［０１２６］様々な実施態様において、ＬＮＰは、２種類以上の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも２種類の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも３種類の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも４種類の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも５種類の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも６種類の脂質を含む。様々な実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも７種類の脂質を含む。
【0106】
［０１２７］ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質を含み得る。本発明のナノ粒子組成物は、構造脂質（例えば、コレステロールフェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸又はアルファ－トコフェロール）を含み得る。
【0107】
［０１２８］ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ又は複数のリン脂質、例えば１つ又は複数の（ポリ）不飽和脂質を含み得る。一般に、そのような脂質は、リン脂質部分及び１つ又は複数の脂肪酸部分を含み得る。
【0108】
［０１２９］リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然種も企図される。
【0109】
［０１３０］いくつかの実施態様では、ナノ粒子組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はＤＳＰＣとＤＯＰＥの両方を含み得る。本発明の組成物及び方法において有用なリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
【0110】
［０１３１］ＬＮＰ組成物は、前のセクションで説明したものに加えて、１つ又は複数の成分を含んでもよい。例えば、ナノ粒子組成物は、ビタミン（例えば、ビタミンＡ又はビタミンＥ）又はステロールなどの１つ又は複数の疎水性小分子を含み得る。
【0111】
［０１３２］ＬＮＰ組成物はまた、１つ又は複数の透過性増強分子、炭水化物、ポリマー、治療薬、表面改質剤、又は他の成分を含み得る。透過性亢進分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲン及びその誘導体及び類似体）を含み得る。
【0112】
［０１３３］ポリマーは、ＬＮＰ組成物に含まれてもよく、及び／又はＬＮＰ組成物を封入若しくは部分的に封入するために使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／又は生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノクララレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＥＶＡ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えばポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）及びそれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリオキサミン、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）及びトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられ得る。
【0113】
［０１３４］治療剤には、細胞傷害剤、化学療法剤、及び他の治療剤が含まれ得るが、これらに限定されない。細胞傷害性薬剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラケマイシン及びそれらの類似体が挙げられ得る。放射性イオンも治療薬として使用することができ、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、及びプラセオジウムを含んでもよい。他の治療薬としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン及び５－フルオロウラシル、並びにデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラケマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、及びシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びメイタンシノイド）が挙げられ得る。
【0114】
［０１３５］表面改質剤には、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖又は糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミドール、レトスチン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシン１３４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン及びエルドステイン）及びＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮアーゼ）が含まれ得るが、これらに限定されない。表面改質剤は、ＬＮＰ内及び／又はＬＮＰ組成物の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、又は他のプロセスによって）配置され得る。
【0115】
［０１３６］これらの成分に加えて、本発明のＬＮＰ組成物は、薬学的組成物に有用な任意の物質を含み得る。例えば、ＬＮＰ組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される添加物又は補助成分、例えば限定されないが、１つ又は複数の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、保存剤及び他の種を含み得る。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味料、及び芳香剤などの添加物も含まれ得る。薬学的に許容され得る添加物は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６）。
【0116】
［０１３７］希釈剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖及び／又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／又はそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。
【0117】
［０１３８］界面活性剤及び／又は乳化剤としては、限定されないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム及び／又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【0118】
［０１３９］結合剤はデンプン（例えばコーンスターチ及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールガム、ガティガム、イサポールハスクの粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、及びカラスムギのアラビアガム）；アルギネート；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；及びそれらの組み合わせ、又は任意の他の適切な結合剤であり得る。
【0119】
［０１４０］防腐剤としては、限定されないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／又は他の防腐剤が挙げられる。酸化防止剤としては、限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／又は亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／又はエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤としては、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／又はチメロサールが挙げられる。抗真菌性防腐剤としては、限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム及び／又はソルビン酸が挙げられる。アルコール保存剤の例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、ベンジルアルコール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート及び／又はフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性保存剤の例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸及び／又はフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤としては、限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デスルホキシムメシラート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）及び／又はＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられる。
【0120】
［０１４１］緩衝剤の例としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノ－スルホン酸緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張性生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
【0121】
［０１４２］油の例としては、限定されないが、アーモンド、アプリコット穀粒、アボガド、ババス、ベルガモット、クロフサスグリの種子（ｂｌａｃｋ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｅｅｄ）、ボリジ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラの肝臓、コーヒー、コーン、綿実種、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ひょうたん、グレープ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、アオイ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、ヤシ、ヤシ核、トウニン、ピーナッツ、ケシ種子、カボチャ種子、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サスカナ、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、並びにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【0122】
［０１４３］様々な実施態様において、ＬＮＰはリポソームであり得る。様々な実施態様では、ＬＮＰはポリマー－脂質ナノ粒子であり得る。様々な実施態様において、ＬＮＰは、追加のタンパク質又はペプチド分子を含み得る。
【0123】
ペイロード
［０１４４］本発明のＬＮＰは、ペイロードを封入するために製造される。「ペイロード」という用語は、本開示に記載される脂質ナノ粒子製剤と複合体を形成する任意の化学的実体、医薬、薬物（そのような薬物は、小分子、無機固体、ポリマー、又はバイオポリマーであり得るが、これらに限定されない）、小分子、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチドなどを指す。ペイロードはまた、身体機能の疾患、病気、疾病、又は障害を治療又は予防するための候補（例えば、未知の構造及び／又は機能の候補）を包含し、公知の治療化合物及び潜在的な治療化合物の両方である試験化合物を含むが、これらに限定されない。試験化合物は、本開示のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって治療的であると決定することができる。
［０１４４］本発明のＬＮＰは、ペイロードを封入するために製造される。「ペイロード」という用語は、本開示に記載される脂質ナノ粒子製剤と複合体を形成する任意の化学的実体、医薬、薬物（そのような薬物は、小分子、無機固体、ポリマー、又はバイオポリマーであり得るが、これらに限定されない）、小分子、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチドなどを指す。ペイロードはまた、身体機能の疾患、病気、疾病、又は障害を治療又は予防するための候補（例えば、未知の構造及び／又は機能の候補）を包含し、公知の治療化合物及び潜在的な治療化合物の両方である試験化合物を含むが、これらに限定されない。試験化合物は、本開示のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって治療的であると決定することができる。
【0124】
［０１４５］様々な実施態様において、ペイロードは１つ又は複数のヌクレオチドからなる。例えば、様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、そのようなペイロード封入ＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比によって特性評価され得る。本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」は、正に帯電したポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基対負に帯電した核酸リン酸（Ｐ）基の比を指す。Ｎ／Ｐ比は、細胞内ペイロード送達において重要な役割を果たす。様々な実施態様において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．２５と約１０の間で変動する。様々な実施態様において、Ｎ：Ｐ比は、約０．１、約０．２、約０．２５、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０である。
【0125】
［０１４６］様々な実施態様において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。オリゴヌクレオチドは、様々な長さのものであり得る。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９又は約４０ヌクレオチド長である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約２と約４０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約４と約３５の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０と約３０の間のヌクレオチド長である。様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約１２と約１７の間のヌクレオチド長である。
【0126】
［０１４７］様々な実施態様において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施態様において、そのｍＲＮＡは、約５００～３０００ヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ｍＲＮＡは、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド長である。様々な実施態様において、ｍＲＮＡは抗原ペプチドをコードする。様々な実施態様において、ｍＲＮＡはワクチンの一部である。
【0127】
［０１４８］様々な実施態様において、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施態様において、ポリペプチドは、約１，０００Ｄａと１０，０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、ポリペプチドは、約５００Ｄａ、約６００Ｄａ、約７００Ｄａ、約８００Ｄａ、約９００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約２，５００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約３，５００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約４，５００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約５，５００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約６，５００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約７，５００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約８，５００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約９，５００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ又は約２０，０００Ｄａである。
【0128】
［０１４９］様々な実施態様において、ペイロードは小分子である。様々な実施態様において、小分子は、約１００Ｄａと１０００Ｄａの間である。様々な実施態様において、小分子は、約５０Ｄａ、約６０Ｄａ、約７０Ｄａ、約８０Ｄａ、約９０Ｄａ、約１００Ｄａ、約１５０Ｄａ、約２００Ｄａ、約２５０Ｄａ、約３００Ｄａ、約３５０Ｄａ、約４００Ｄａ、約４５０Ｄａ、約５００Ｄａ、約５５０Ｄａ、約６００Ｄａ、約６５０Ｄａ、約７００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約８００Ｄａ、約８５０Ｄａ、約９００Ｄａ、約９５０Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ又は約２，０００Ｄａである。
【0129】
薬学的調製物
［０１５０］様々な実施態様において、最適化された脂質ナノ粒子は、薬学的調製物として全体的又は部分的に製剤化され得る。本発明の薬学的調製物は、１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、薬学的組成物は、１つ又は複数の異なるペイロードを含む１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。本発明の薬学的組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容され得る添加物又は本明細書に記載されるものなどの補助成分をさらに含み得る。薬学的組成物及び薬剤の製剤化及び製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６で利用可能である。従来の添加物及び補助成分は、任意の従来の添加物又は補助成分が本発明のナノ粒子組成物の１つ又は複数の成分と不適合であり得る限りを除いて、本発明の任意の薬学的組成物に使用され得る。添加物又は補助成分は、その成分との組み合わせが任意の望ましくない生物学的効果又は他の有害な効果をもたらし得る場合、ナノ粒子組成物の成分と不適合であり得る。
［０１５０］様々な実施態様において、最適化された脂質ナノ粒子は、薬学的調製物として全体的又は部分的に製剤化され得る。本発明の薬学的調製物は、１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、薬学的組成物は、１つ又は複数の異なるペイロードを含む１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。本発明の薬学的組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容され得る添加物又は本明細書に記載されるものなどの補助成分をさらに含み得る。薬学的組成物及び薬剤の製剤化及び製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６で利用可能である。従来の添加物及び補助成分は、任意の従来の添加物又は補助成分が本発明のナノ粒子組成物の１つ又は複数の成分と不適合であり得る限りを除いて、本発明の任意の薬学的組成物に使用され得る。添加物又は補助成分は、その成分との組み合わせが任意の望ましくない生物学的効果又は他の有害な効果をもたらし得る場合、ナノ粒子組成物の成分と不適合であり得る。
【0130】
［０１５１］いくつかの実施態様において、１つ又は複数の添加物又は補助成分は、本発明のナノ粒子組成物を含む薬学的組成物の総質量又は体積の５０％超を構成し得る。例えば、１つ又は複数の添加物又は補助成分は、薬学的慣例の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれよりも多くを構成し得る。いくつかの実施態様において、薬学的に許容される添加物は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋である。いくつかの実施態様において、添加物は、ヒトにおける使用及び獣医学的使用のために承認されている。いくつかの実施態様において、添加物は米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施態様において、添加物は医薬品グレードである。いくつかの実施態様において、添加物は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方及び／又は国際薬局方の基準を満たす。
【0131】
［０１５２］本開示による薬学的組成物中の１つ又は複数のナノ粒子組成物、１つ又は複数の薬学的に許容される添加物、及び／又は任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／又は症状に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて、変動する。例として、薬学的組成物は、０．１％と１００％の間（ｗｔ／ｗｔ）の１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。
【0132】
［０１５３］１つ又は複数のナノ粒子組成物を含むナノ粒子組成物及び／又は薬学的組成物は、ｍＲＮＡを１つ又は複数の特定の細胞、組織、器官、又はその系若しくは群、例えば腎臓系に送達することによって提供される治療効果から利益を得ることができる患者又は対象を含む任意の患者又は対象に投与され得る。本明細書で提供されるナノ粒子組成物及びナノ粒子組成物を含む薬学的組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した組成物に関するものであるが、そのような組成物は一般に任意の他の哺乳動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した組成物の改変は十分に理解されており、当業者の獣医学薬理学者は、仮にあるとしても単なる通常の実験でそのような改変を設計及び／又は実施することができる。組成物の投与が企図される対象には、ヒト、他の霊長類、並びにウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
【0133】
［０１５４］１つ又は複数のナノ粒子組成物を含む薬学的組成物は、薬理学の分野で公知の又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を添加物及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、所望又は必要に応じて、製品を所望の単回又は複数回投与単位に分割、成形及び／又は包装することを含む。
【0134】
［０１５５］本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／又は複数の単一単位用量として調製、包装、及び／又は販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物（例えば、ナノ粒子組成物）の離散的な量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び／又はそのような投与量の好都合な割合、例えばそのような投与量の半分又は１／３に等しい。
【0135】
［０１５６］本発明の薬学的組成物は、様々な投与経路及び投与方法に適した様々な形態で調製され得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、液体剤形（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル）、注射剤形、固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末及び顆粒）、局所及び／又は経皮投与用の剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤及びパッチ）、懸濁液、粉末、及び他の形態で調製され得る。
【0136】
［０１５７］経口及び非経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及び／又はエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水、又はエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル等のその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤並びにこれらの混合物等の、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤及び／又は芳香剤などのアジュバントを含むことができる。非経口投与のための特定の実施態様では、組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／又はそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
【0137】
［０１５８］注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁化剤を使用する既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤は、無毒の非経口的に許容される希釈剤及び／又は溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／又はエマルジョンであってもよく、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液である。利用され得る許容される添加物及び溶媒には、水、リンゲル液、ＵＳＰ、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油が利用され得る。オレイン酸といった脂肪酸を、注射物の調製に使用することができる。
【0138】
［０１５９］注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散させることのできる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。
【0139】
［０１６０］活性成分の効果を延長するために、皮下注射又は筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。これは、水溶度の低い結晶性又は非晶性の材料の液体懸濁液を使用することにより、達成可能である。次いで、薬物の吸収速度は、薬物の溶解速度に依存し、次いで、溶解速度は、結晶の大きさ及び結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬物を溶解又は懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物の微量封入マトリックスを形成することによって生成される。薬物とポリマーとの比及び使用される具体的なポリマーの性質に応じて、薬物放出速度は制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。
【0140】
［０１６１］直腸投与又は膣内投与のための組成物は、典型的には、組成物を、ココアバター、ポリエチレングリコール又は坐剤用ワックス等の適切な非刺激性添加物であって、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸又は膣内で融解し、活性成分を放出する添加物と混合することによって調製することができる、剤である。
【0141】
［０１６２］経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルム剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される添加物、例えばクエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウム及び／又は充填剤若しくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース及びアカシア）、保湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム）、溶液遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土、ケイ酸塩）及び潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、並びにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【0142】
［０１６３］同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどのような添加物を使用して、ソフトゼラチンカプセル及びハードゼラチンカプセル中の充填剤として利用され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体投薬形態は、腸溶性コーティング及び製剤技術分野において既知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルにより調製することができる。それらは、任意に乳白剤を含んでもよく、それらが１つ又は複数の活性成分を、腸管の特定の部分にのみ又は優先的に、任意選択的に遅延させて、放出する組成物のものとすることもできる。使用可能な埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質及び蝋が挙げられる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどのような添加物を使用して、ソフトゼラチンカプセル及びハードゼラチンカプセル中の充填剤として利用され得る。
【0143】
［０１６４］組成物の局所投与及び／又は経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ジェル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤及び／又はパッチ剤が含まれ得る。一般に、活性成分は、滅菌条件下で薬学的に許容される添加物及び／又は必要に応じて任意の必要な保存剤及び／又は緩衝剤と混合される。さらに、本開示は、身体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有することが多い経皮パッチの使用を企図する。そのような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解及び／又は分注することによって調製され得る。代替的又は追加的に、速度制御膜を提供することによって、及び／又は化合物をポリマーマトリックス及び／又はゲルに分散させることによって、速度を制御することができる。
【0144】
［０１６５］本明細書中に記載される皮内医薬組成物を送達する際に使用するための好適な装置としては、短針装置、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号；米国特許第５，１９０，５２１号；米国特許第５，３２８，４８３号；米国特許第５，５２７，２８８号；米国特許第４，２７０，５３７号；米国特許第５，０１５，２３５号；米国特許第５，１４１，４９６号；及び米国特許第５，４１７，６６２号に記載されるものが挙げられる。皮内組成物は、皮膚への針の有効な貫通長さを制限する装置、例えば、国際公開第９９／３４８５０号に記載されているもの及びその機能的等価物によって投与され得る。液体ジェット注射器を介して、及び／又は角質層を穿刺し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、真皮に液体組成物を送達するジェット注射装置が適している。ジェット噴射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；米国特許第５，５９９，３０２号；米国特許第５，３３４，１４４号；米国特許第５，９９３，４１２号；米国特許第５，６４９，９１２号；米国特許第５，５６９，１８９号；米国特許第５，７０４，９１１号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，８９３，３９７号；米国特許第５，４６６，２２０号；米国特許第５，３３９，１６３号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，５０３，６２７号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第５，５２０，６３９号；米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第４，７９０，８２４号；米国特許第４，９４１，８８０号；米国特許第４，９４０，４６０号；並びに国際公開第９７／３７７０５号及び国際公開第９７／１３５３７号に記載されている。圧縮ガスを使用して粉末形態のワクチンを皮膚の外層を通して真皮まで加速する弾道粉末／粒子送達装置が適している。代替的又は追加的に、従来のシリンジは、皮内投与の古典的なマントー法で使用されてもよい。
【0145】
［０１６６］局所投与に適した製剤には、液体及び／又は半液体製剤、例えば、リニメント剤、ローション、水中油及び／又は油中水エマルジョン、例えば、クリーム、軟膏及び／又はペースト、並びに／あるいは溶液及び／又は懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％～約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限界と同じくらい高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書中に記載される１つ又は複数の追加の成分をさらに含み得る。
【0146】
［０１６７］薬学的組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売され得る。そのような製剤は、活性成分を含んでおり約０．５ｎｍ～約７ｎｍ又は約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。そのような組成物は、粉末を分散させるために噴射剤の流れが導かれ得る乾燥粉末リザーバを含む装置を使用して、及び／又は密封容器内の低沸点噴射剤に溶解及び／又は懸濁された活性成分を含む装置などの自己推進溶媒／粉末分配容器を使用して投与するための乾燥粉末の形態であることが好都合である。このような粉末は、粒子の少なくとも９８％（重量基準）が０．５ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数基準）が７ｎｍ未満の直径を有する粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５％（重量基準）が１ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数基準）が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含んでもよく、単位用量形態で好都合に提供される。
【0147】
［０１６８］低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性及び／又は固体アニオン性界面活性剤及び／又は固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ程度の粒径を有し得る）などの追加の成分をさらに含み得る。
【0148】
［０１６９］肺送達用に製剤化された薬学的組成物は、溶液及び／又は懸濁液の液滴の形態の活性成分を提供し得る。そのような製剤は、活性成分を含む水性及び／又は希釈アルコール溶液及び／又は懸濁液（任意に滅菌）として調製、包装及び／又は販売され得、任意の噴霧化及び／又は霧化装置を使用して好都合に投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、及び／又はヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の追加の成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
【0149】
［０１７０］肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含むとともに約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、スナッフの服用方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻通路を介した迅速な吸入によって投与される。
【0150】
［０１７１］経鼻投与に適した製剤は、例えば、約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）程度の少量から１００％（ｗｔ／ｗｔ）もの活性成分を含み得、本明細書中に記載される１つ又は複数の追加の成分を含み得る。薬学的組成物は、頬側投与に適した製剤で調製、包装及び／又は販売され得る。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して製造された錠剤及び／又はロゼンジの形態であってもよく、例えば、０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分であってもよく、残部は、経口溶解性及び／又は分解性組成物、並びに任意に、本明細書に記載の１つ又は複数の追加の成分を含む。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末並びに／又はエアロゾル化及び／若しくは噴霧化溶液及び／若しくは懸濁液を含み得る。そのような粉末化、エアロゾル化、及び／又はエアロゾル化製剤は、分散されると、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子及び／又は液滴サイズを有し得、本明細書に記載される任意の追加の成分のうちの１つ又は複数をさらに含み得る。
【0151】
［０１７２］薬学的組成物は、眼科投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売され得る。そのような製剤は、例えば、水性又は油性液体添加物中の活性成分の０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）溶液及び／又は懸濁液を含む点眼剤の形態であり得る。そのような滴剤は、緩衝剤、塩、及び／又は本明細書に記載の任意の追加の成分のうちの１つ又は複数をさらに含み得る。有用な他の眼投与可能な製剤には、微結晶形態及び／又はリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳剤及び／又は点眼剤は、本開示の範囲内であると考えられる。
【0152】
［０１７３］１つ又は複数のペイロードを含むナノ粒子組成物は、任意の経路によって投与され得る。いくつかの実施態様において、本発明の１つ又は複数のナノ粒子組成物を含む予防組成物、診断組成物、又はイメージング組成物を含む本発明の組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮又は真皮内、真皮間、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション及び／又は滴剤）、粘膜、鼻、頬側、経腸、硝子体内、腫瘍内、舌下、鼻腔内を含む様々な経路の１つ又は複数によって；気管内注入、気管支注入、及び／又は吸入によって；経口スプレー及び／又は粉末、経鼻スプレー及び／又はエアロゾルとして、及び／又は門脈カテーテルを介して投与される。いくつかの実施態様では、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、又は皮下投与され得る。しかしながら、本開示は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮した任意の適切な経路による本発明の組成物の送達を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ又は複数のｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物の性質（例えば、血流及び消化管などの様々な身体環境におけるその安定性）、患者の症状（例えば、患者が特定の投与経路に耐えることができるかどうか）などを含む様々な因子に依存する。
【0153】
［０１７４］特定の実施態様において、本開示による組成物は、所与の用量において、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇを送達するに十分な用量レベルで投与され得、１ｍｇ／ｋｇの用量は、対象体重１ｋｇあたり１ｍｇの組成物を提供する。特定の実施態様では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量の本発明のナノ粒子組成物を投与することができる。用量は、所望のレベルのｍＲＮＡ発現及び／又は治療、診断、予防、若しくはイメージング効果を得るために、同じ量又は異なる量で１日に１回又は複数回投与され得る。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、又は４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施態様において、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、又はそれよりも多くの投与）を使用して送達され得る。いくつかの実施態様において、単回用量は、例えば、外科手術の前若しくは後に、又は急性の疾患、障害、若しくは症状の場合に投与され得る。
【0154】
［０１７５］１つ又は複数のペイロードを含むナノ粒子組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、予防剤、診断剤、又はイメージング剤と組み合わせて使用され得る。「と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならないこと、及び／又は一緒に送達するために製剤化しなければならないことを意味するものではないが、これらの送達方法は本開示の範囲内である。例えば、１つ又は複数の異なるｍＲＮＡを含む１つ又は複数のナノ粒子組成物を組み合わせて投与することができる。組成物は、１つ又は複数の他の所望の治療薬又は医療処置と同時に、その前に、又はその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与される。いくつかの実施態様において、本開示は、バイオアベイラビリティを改善し、代謝を減少及び／若しくは改変し、排泄を阻害し、及び／又は体内での分布を改変する薬剤と組み合わせた本発明の組成物又はそのイメージング、診断若しくは予防組成物の送達を包含する。
【0155】
［０１７６］組み合わせて利用される治療的、予防的、診断的、又はイメージング活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されてもよく、又は異なる組成物中で別々に投与されてもよいことがさらに理解されるであろう。一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。いくつかの実施態様において、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低くてもよい。
【0156】
［０１７７］併用レジメンで使用する治療（治療薬又は手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／又は手順の適合性並びに達成される所望の治療効果を考慮に入れる。使用される治療は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得るか（例えば、がんを治療するために有用である組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る）、又は異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成し得ることも理解されよう。
【実施例】
【0157】
［０１７８］以下の実施例は、限定することを意図するものではなく、本発明のさらなる情報及び支持を提供するために提示される。以下の実施例は、最適なペイロード負荷及び粒径分布のためにＬＮＰ形成を最適化するＨＴＳ方法が、マイクロ流体ベースのアプローチなどのスケールアップされた製造方法に直接変換され得ることを実証する。このＨＴＳアプローチは、材料消費を約１０倍減少させ、処理出力を約１００倍改善した。これらの結果は、ＬＮＰ製造を最適化するためのＨＴＳ方法のロバスト性及び有用性を示し、したがって、それらの臨床移行を促進する。
【0158】
材料及び方法
材料
［０１７９］１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、及びカチオン性１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。イオン化可能な脂質ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＭＣ３）はＭＣＥ（ＮＪ，ＵＳＡ）から、コレステロールはＳｉｇｍａ（ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。２つのモデルＡＳＯ、ＡＳＯ－１（１３ｍｅｒ、Ｎａ塩形態）及びＡＳＯ－２（１６ｍｅｒ、Ｎａ塩形態）を社内で合成した。他の全ての試薬は、少なくとも試薬グレードであり、ＤＮａｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まなかった。
材料
［０１７９］１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、及びカチオン性１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。イオン化可能な脂質ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＭＣ３）はＭＣＥ（ＮＪ，ＵＳＡ）から、コレステロールはＳｉｇｍａ（ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。２つのモデルＡＳＯ、ＡＳＯ－１（１３ｍｅｒ、Ｎａ塩形態）及びＡＳＯ－２（１６ｍｅｒ、Ｎａ塩形態）を社内で合成した。他の全ての試薬は、少なくとも試薬グレードであり、ＤＮａｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まなかった。
【0159】
ＡＳＯ負荷ＬＮＰのハイスループット調製
［０１８０］ＬＥＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、９６ウェルプレートマトリックスで設計された様々な脂質組成、総脂質濃度、及びＡＳＯ負荷量について、ＬＮＰ製剤をスクリーニングした。ＡＳＯ－１負荷ＭＣ３ ＬＮＰの典型的なスクリーニングでは、ＡＳＯをクエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４）に５、２、１、及び０．５のＮ／Ｐ比に相当する濃度で溶解させ、ロボット液体ハンドラー（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して１５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５１０１，ＮＣ，ＵＳＡ）に分注した。様々な総脂質量（０．２又は０．４μｍｏｌ／ウェル）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００含有量（全脂質の０、１．５、３、又は５ｍｏｌ％）を有する脂質混合物を、個々の脂質ストック（エタノール中２０ｍｇ／ｍｌ）を混合し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを用いてエタノールで希釈することによって調製した。次いで、５０μｌの脂質を０．５ｍｌ／ｓでＡＳＯプレートに迅速に分注し、続いてＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して１０回のピペッティング（毎回１００μｌ）によって相混合して、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの自己集合を促進した。得られたプレートは、並行して３２の条件で変動した９６個のＬＮＰサンプル（２００μｌ／ウェル）を含有していた（４レベルのＡＳＯ負荷、２レベルの総脂質濃度、及び４レベルの脂質組成、ｎ＝３）。他の実験では、イオン化可能な脂質ＭＣ３を永久カチオン性脂質ＤＯＴＡＰで置き換え、又は１３ｍｅｒのＡＳＯ－１を１６ｍｅｒのＡＳＯ－２で置き換え、同様の製剤パラメータについてスクリーニングした。逆の分注順序（ＡＳＯ溶液の脂質混合物への注入）並びに異なる混合速度及び回数も、相混合プロセスを最適化するために調査した。
［０１８０］ＬＥＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、９６ウェルプレートマトリックスで設計された様々な脂質組成、総脂質濃度、及びＡＳＯ負荷量について、ＬＮＰ製剤をスクリーニングした。ＡＳＯ－１負荷ＭＣ３ ＬＮＰの典型的なスクリーニングでは、ＡＳＯをクエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４）に５、２、１、及び０．５のＮ／Ｐ比に相当する濃度で溶解させ、ロボット液体ハンドラー（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して１５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５１０１，ＮＣ，ＵＳＡ）に分注した。様々な総脂質量（０．２又は０．４μｍｏｌ／ウェル）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００含有量（全脂質の０、１．５、３、又は５ｍｏｌ％）を有する脂質混合物を、個々の脂質ストック（エタノール中２０ｍｇ／ｍｌ）を混合し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを用いてエタノールで希釈することによって調製した。次いで、５０μｌの脂質を０．５ｍｌ／ｓでＡＳＯプレートに迅速に分注し、続いてＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して１０回のピペッティング（毎回１００μｌ）によって相混合して、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの自己集合を促進した。得られたプレートは、並行して３２の条件で変動した９６個のＬＮＰサンプル（２００μｌ／ウェル）を含有していた（４レベルのＡＳＯ負荷、２レベルの総脂質濃度、及び４レベルの脂質組成、ｎ＝３）。他の実験では、イオン化可能な脂質ＭＣ３を永久カチオン性脂質ＤＯＴＡＰで置き換え、又は１３ｍｅｒのＡＳＯ－１を１６ｍｅｒのＡＳＯ－２で置き換え、同様の製剤パラメータについてスクリーニングした。逆の分注順序（ＡＳＯ溶液の脂質混合物への注入）並びに異なる混合速度及び回数も、相混合プロセスを最適化するために調査した。
【0160】
ＡＳＯ負荷ＬＮＰの特性評価
［０１８１］ＡＳＯ負荷ＬＮＰの構造を、低温透過型電子顕微鏡（ｃｙｒｏ－ＴＥＭ）によって決定した。ＤＬＳを使用して粒径分布を測定した。簡潔に記載すると、ＡＳＯ負荷ＬＮＰを、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して９６ウェルのガラス底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５８９２，ＮＣ，ＵＳＡ）中のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４０倍希釈し、ＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）プレートリーダーＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して平均粒径及び粒径分布（多分散性％、ＰＤ％で表される）について分析した。６０μｌのアリコートを、１５μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を添加することによって中性ｐＨに調整し、次いで、フィルタープレート（ＭＷＣＯ １００ｋＤ；ＡｃｒｏＰｒｅｐ，ＰＡＬＬ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して濾過した。次いで、５０μｌの濾液中の未封入ＡＳＯを、ＵＶプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｓｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用してＯＤ２６０によって定量化し、ＡＳＯの封入効率パーセント（％ＥＥ）について計算した：
［０１８１］ＡＳＯ負荷ＬＮＰの構造を、低温透過型電子顕微鏡（ｃｙｒｏ－ＴＥＭ）によって決定した。ＤＬＳを使用して粒径分布を測定した。簡潔に記載すると、ＡＳＯ負荷ＬＮＰを、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して９６ウェルのガラス底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５８９２，ＮＣ，ＵＳＡ）中のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４０倍希釈し、ＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）プレートリーダーＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して平均粒径及び粒径分布（多分散性％、ＰＤ％で表される）について分析した。６０μｌのアリコートを、１５μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を添加することによって中性ｐＨに調整し、次いで、フィルタープレート（ＭＷＣＯ １００ｋＤ；ＡｃｒｏＰｒｅｐ，ＰＡＬＬ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して濾過した。次いで、５０μｌの濾液中の未封入ＡＳＯを、ＵＶプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｓｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用してＯＤ２６０によって定量化し、ＡＳＯの封入効率パーセント（％ＥＥ）について計算した：
【0161】
［０１８２］ＡＳＯ標準を同じ緩衝液中で調製し、ＬＮＰサンプルと同じ濾過プロセスに供した。安定性実験のために、Ｎ／Ｐ比１の下で調製した６０μｌのＬＮＰをＰＢＳで１０倍に直接希釈し、４又は４０℃で保存し、２週間にわたって粒径及びＡＳＯ放出について分析した。
【0162】
ＡＳＯ負荷ＬＮＰのマイクロ流体調製
［０１８３］マイクロ流体アプローチを、上記のハイスループットアプローチによってスクリーニングされたＡＳＯ負荷ＬＮＰのスケールアップ調製に使用した。簡単に記載すると、種々の濃度のＡＳＯ－１（クエン酸緩衝液に溶解）と、総脂質濃度及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００含有量が変動する脂質（エタノールに溶解）とを、マイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって、水性緩衝液／エタノール相比３／１及び一定の総流量１２ｍｌ／分で混合した。収集したＬＮＰを遠心分離ベース（２，０００×ｇ、３０分）限外濾過（ＭＷＣＯ １０ｋＤ；Ａｍｉｃｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製して遊離ＡＳＯ及び脂質を除去し、続いてＰＢＳと緩衝液交換した。ＬＮＰを、親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）によるＤＬＳ及びＡＳＯ封入によって粒径分布について分析した。簡単に記載すると、０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ溶液に溶解させることによって、精製ＬＮＰから封入ＡＳＯを抽出した。ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ，１３０Å，１．７μｍ，３ｍｍｘ５０ｍｍ）、移動相Ａ（８０／２０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）、及び移動相Ｂ（４０／６０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）を、１０分以内に、０．８ｍｌ／分の流量、４０℃のカラム温度、及び２６０ｎｍの検出波長で、相Ｂの０～１００％からの勾配溶出に使用した。
［０１８３］マイクロ流体アプローチを、上記のハイスループットアプローチによってスクリーニングされたＡＳＯ負荷ＬＮＰのスケールアップ調製に使用した。簡単に記載すると、種々の濃度のＡＳＯ－１（クエン酸緩衝液に溶解）と、総脂質濃度及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００含有量が変動する脂質（エタノールに溶解）とを、マイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって、水性緩衝液／エタノール相比３／１及び一定の総流量１２ｍｌ／分で混合した。収集したＬＮＰを遠心分離ベース（２，０００×ｇ、３０分）限外濾過（ＭＷＣＯ １０ｋＤ；Ａｍｉｃｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製して遊離ＡＳＯ及び脂質を除去し、続いてＰＢＳと緩衝液交換した。ＬＮＰを、親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）によるＤＬＳ及びＡＳＯ封入によって粒径分布について分析した。簡単に記載すると、０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ溶液に溶解させることによって、精製ＬＮＰから封入ＡＳＯを抽出した。ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ，１３０Å，１．７μｍ，３ｍｍｘ５０ｍｍ）、移動相Ａ（８０／２０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）、及び移動相Ｂ（４０／６０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）を、１０分以内に、０．８ｍｌ／分の流量、４０℃のカラム温度、及び２６０ｎｍの検出波長で、相Ｂの０～１００％からの勾配溶出に使用した。
【0163】
統計分析
［０１８４］全ての結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。データを、一元配置分散分析又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後、Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して複数の群を比較するためのＴｕｒｋｅｙ、Ｓｉｄａｋ又はＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって分析した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。
［０１８４］全ての結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。データを、一元配置分散分析又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後、Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して複数の群を比較するためのＴｕｒｋｅｙ、Ｓｉｄａｋ又はＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって分析した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。
【0164】
実施例１
ロボット液体ハンドラーによる相混合プロセスの最適化
［０１８５］ＬＮＰ調製のためのハイスループット溶媒注入方法を開発するために、粒径及びＡＳＯ封入に対する相混合の効果を最初に調べた。ＡＳＯ－１を、０．４μｍｏｌの総脂質及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００から構成されるＬＮＰに、Ｎ／Ｐ比１の下で電荷媒介錯化によって負荷した。脂質を含有するエタノール相を分注し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）液体ハンドラーを使用して、機器の設定に従って最小０．１ｍｌ／ｓから最大０．９ｍｌ／ｓの範囲の異なるピペット操作速度で水性ＡＳＯ相と混合し、逆も同様に行った。エタノール－緩衝液注入は、注入とそれに続く１０回の混合のための低速、中速、又は高速下で、平均直径約１４５ｎｍ（図１Ａ）、％ＰＤ約１８％（図１Ｂ）、及びＡＳＯの％ＥＥ約８３％（図１Ｃ）を有する同様のＬＮＰを生成した。対照的に、低速（０．１ｍｌ／ｓ）での緩衝液－エタノール注入は、より低い％ＥＥ（約４３％）で、より大きく（平均直径約２２０ｎｍ）、より多分散性（％ＰＤ約４１％）の粒子を生成した（図１Ａ～１Ｃ）。しかしながら、注入速度を増加させると、エタノール－緩衝液注入と同様のＬＮＰが生成され、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの形成には水性緩衝液中の濃縮脂質の迅速な消散が必要であることが示唆された。次に、ＬＮＰをエタノール－緩衝液注入下で調製し、続いて異なるピペッティング回数及び速度で相混合した。中速（０．５ｍｌ／ｓ）及び１０回の混合は、高いＡＳＯ負荷で均一なＬＮＰを生成するのに十分であったが、混合速度又は回数のさらなる増加は、粒径及び％ＥＥに影響しなかった（図１Ｄ～１Ｆ）。したがって、以下の研究のために、エタノール－緩衝液注入とそれに続く０．５ｍｌ／ｓでの１０回の混合の条件を選択した。
ロボット液体ハンドラーによる相混合プロセスの最適化
［０１８５］ＬＮＰ調製のためのハイスループット溶媒注入方法を開発するために、粒径及びＡＳＯ封入に対する相混合の効果を最初に調べた。ＡＳＯ－１を、０．４μｍｏｌの総脂質及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００から構成されるＬＮＰに、Ｎ／Ｐ比１の下で電荷媒介錯化によって負荷した。脂質を含有するエタノール相を分注し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）液体ハンドラーを使用して、機器の設定に従って最小０．１ｍｌ／ｓから最大０．９ｍｌ／ｓの範囲の異なるピペット操作速度で水性ＡＳＯ相と混合し、逆も同様に行った。エタノール－緩衝液注入は、注入とそれに続く１０回の混合のための低速、中速、又は高速下で、平均直径約１４５ｎｍ（図１Ａ）、％ＰＤ約１８％（図１Ｂ）、及びＡＳＯの％ＥＥ約８３％（図１Ｃ）を有する同様のＬＮＰを生成した。対照的に、低速（０．１ｍｌ／ｓ）での緩衝液－エタノール注入は、より低い％ＥＥ（約４３％）で、より大きく（平均直径約２２０ｎｍ）、より多分散性（％ＰＤ約４１％）の粒子を生成した（図１Ａ～１Ｃ）。しかしながら、注入速度を増加させると、エタノール－緩衝液注入と同様のＬＮＰが生成され、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの形成には水性緩衝液中の濃縮脂質の迅速な消散が必要であることが示唆された。次に、ＬＮＰをエタノール－緩衝液注入下で調製し、続いて異なるピペッティング回数及び速度で相混合した。中速（０．５ｍｌ／ｓ）及び１０回の混合は、高いＡＳＯ負荷で均一なＬＮＰを生成するのに十分であったが、混合速度又は回数のさらなる増加は、粒径及び％ＥＥに影響しなかった（図１Ｄ～１Ｆ）。したがって、以下の研究のために、エタノール－緩衝液注入とそれに続く０．５ｍｌ／ｓでの１０回の混合の条件を選択した。
【0165】
実施例２
ＡＳＯ負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
［０１８６］ＬＮＰの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した（図２）。脂質が正電荷を帯びて電荷媒介錯化を促進するように、ＭＣ３のｐＫａ（６．４）より低いｐＨ４．０のクエン酸緩衝液に最初にＡＳＯを最初に溶解させた。次いで、溶液のｐＨをリン酸緩衝液によって中性に調整した後、分析を行った。
ＡＳＯ負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
［０１８６］ＬＮＰの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した（図２）。脂質が正電荷を帯びて電荷媒介錯化を促進するように、ＭＣ３のｐＫａ（６．４）より低いｐＨ４．０のクエン酸緩衝液に最初にＡＳＯを最初に溶解させた。次いで、溶液のｐＨをリン酸緩衝液によって中性に調整した後、分析を行った。
【0166】
［０１８７］典型的なスクリーニングのために、２つのレベルの総脂質濃度、Ｎ／Ｐ比によって調整される４つのレベルのＡＳＯ負荷、及び４つのレベルのＰＥＧ化脂質含有量で変動する３２の異なるサンプル（それぞれ３つの反復）を、９６ウェルプレートで並行してスクリーニングした（図３Ａ）。調査した３つの製剤パラメータの中で、ＰＥＧ化脂質は、脂質組成にＰＥＧが組み込まれていない場合に多峰性の大きな凝集体が生成されたため、ＬＮＰ形成に不可欠であった（図３Ｃ～３Ｄ、図４）。ＰＥＧ化脂質含有量を有意に増加させると（Ｐ＜０．０００１）、平均粒径が減少した、すなわち、１．５、３、及び５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含有する脂質は、それぞれ約１２０、約８０、及び約６０ｎｍのＬＮＰ直径となった（図３Ｃ～３Ｄ）。しかし、多分散性も増加し、５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００は、おそらく小さなＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００ミセルの形成に起因して、亜集団を生成しさえした（図３Ｃ）。例えば、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８５（６）：３８３９－４７；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ２３（３）：２２２－３１を参照のこと。
【0167】
［０１８８］一方、ＡＳＯの％ＥＥは、主にＮ／Ｐ比によって決定された。ＭＣ３中の過剰な錯化部位を有する１より高いＮ／Ｐ比は、８０％超の％ＥＥをもたらした。一方、荷電平衡点を超える２倍過剰量のＡＳＯ－１は、％ＥＥを約５０％まで有意に減少させた（図３Ｅ）。ＭＣ３を別のカチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（図５Ａ～５Ｃ）で置き換えた場合、又はＡＳＯ－１をＡＳＯ－２（図６Ａ～６Ｃ）で置き換えた場合にも同様の結果が見られ、ＨＴＳ結果のロバスト性が実証された。
【0168】
実施例３
スケールアップＬＮＰ調製によるＨＴＳ結果の検証
［０１８９］次いで、スクリーニングされた製剤パラメータのＬＮＰ品質属性への影響を、ＨＴＳアプローチからの結果をマイクロ流体フォーミュレーターからの結果と比較することによって検証した。２つの方法は同様の結果を示した：（１）ＰＥＧ含有量が増加すると、ＬＮＰサイズは減少したが、多分散性は増加した（図７Ａ）；（２）ＬＮＰサイズは、２ｍＭまでの全脂質濃度の増加に伴って安定していた（図７Ｂ）；（３）Ｎ／Ｐ比＜２の場合、ＬＮＰサイズは安定したままであった（図７Ｃ）；（４）過剰なＡＳＯ負荷（Ｎ／Ｐ比＜１）は、％ＥＥの有意な減少をもたらした（図７Ｄ）；及び（５）ＬＮＰは、同じＮ／Ｐ比及びＰＥＧ化脂質含有量で調製された同様の構造を示した（図７Ｅ）。さらに、ＨＴＳアプローチは、線形回帰Ｒ２＞０．９（図７Ａ）との強い相関によって示される、ＰＥＧ化脂質含有量に対する粒径及び多分散性の依存性を首尾よく予測した。
スケールアップＬＮＰ調製によるＨＴＳ結果の検証
［０１８９］次いで、スクリーニングされた製剤パラメータのＬＮＰ品質属性への影響を、ＨＴＳアプローチからの結果をマイクロ流体フォーミュレーターからの結果と比較することによって検証した。２つの方法は同様の結果を示した：（１）ＰＥＧ含有量が増加すると、ＬＮＰサイズは減少したが、多分散性は増加した（図７Ａ）；（２）ＬＮＰサイズは、２ｍＭまでの全脂質濃度の増加に伴って安定していた（図７Ｂ）；（３）Ｎ／Ｐ比＜２の場合、ＬＮＰサイズは安定したままであった（図７Ｃ）；（４）過剰なＡＳＯ負荷（Ｎ／Ｐ比＜１）は、％ＥＥの有意な減少をもたらした（図７Ｄ）；及び（５）ＬＮＰは、同じＮ／Ｐ比及びＰＥＧ化脂質含有量で調製された同様の構造を示した（図７Ｅ）。さらに、ＨＴＳアプローチは、線形回帰Ｒ２＞０．９（図７Ａ）との強い相関によって示される、ＰＥＧ化脂質含有量に対する粒径及び多分散性の依存性を首尾よく予測した。
【0169】
実施例４
ＡＳＯ負荷ＬＮＰの安定性スクリーニング
［０１９０］製剤安定性に対する異なる粒径の影響をさらに調査するために、様々なＰＥＧ含有量で調製したＡＳＯ－１負荷ＬＮＰをＰＢＳで１０倍希釈し、４℃又は４０℃でインキュベートし、２週間にわたる粒径分布をモニタリングした。Ｎ／Ｐ比は１以上に保たれ、ＡＳＯの％ＥＥは約９０％であったため、安定性試験中のＬＮＰからのＡＳＯ漏出を定量化することができた。図８Ａ～８Ｂに示すように、ハイスループット溶媒注入法又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）で調製した、１．５ｍｏｌ％又は３ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰは、４℃でのインキュベーション中も同様に初期の平均粒径（図８Ａ）及び多分散性（図８Ｂ）を維持した。４０℃では、１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含有するＬＮＰは、１週間後に粒径の増加を示したが、多分散性は一定のままであった（図９）。１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰもまた、最初の３日以内に最小のＡＳＯ漏出を示したが、２週間後には３及び５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰと同様のレベルのＡＳＯ漏出を示した（図１０）。４℃でのＡＳＯ漏出は１ヶ月にわたって検出されなかった。
ＡＳＯ負荷ＬＮＰの安定性スクリーニング
［０１９０］製剤安定性に対する異なる粒径の影響をさらに調査するために、様々なＰＥＧ含有量で調製したＡＳＯ－１負荷ＬＮＰをＰＢＳで１０倍希釈し、４℃又は４０℃でインキュベートし、２週間にわたる粒径分布をモニタリングした。Ｎ／Ｐ比は１以上に保たれ、ＡＳＯの％ＥＥは約９０％であったため、安定性試験中のＬＮＰからのＡＳＯ漏出を定量化することができた。図８Ａ～８Ｂに示すように、ハイスループット溶媒注入法又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）で調製した、１．５ｍｏｌ％又は３ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰは、４℃でのインキュベーション中も同様に初期の平均粒径（図８Ａ）及び多分散性（図８Ｂ）を維持した。４０℃では、１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含有するＬＮＰは、１週間後に粒径の増加を示したが、多分散性は一定のままであった（図９）。１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰもまた、最初の３日以内に最小のＡＳＯ漏出を示したが、２週間後には３及び５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むＬＮＰと同様のレベルのＡＳＯ漏出を示した（図１０）。４℃でのＡＳＯ漏出は１ヶ月にわたって検出されなかった。
【0170】
［０１９１］相混合プロセスがロボット液体ハンドラーによって実行できるため、ＬＮＰ製剤のハイスループット調製には溶媒注入法が選択された。手動ピペッティングと比較して、マルチチャネル液体ハンドラーは、９６個のサンプルのハイスループット並列処理を可能にし、ウェル全体で均一な液体分注及び混合を達成した。重要なプロセスは、球状脂質層及びナノ粒子構造への脂質の自己集合を促進するために、相互混和相、例えば脂質を溶解するエタノールと核酸を溶解する水性緩衝液との迅速かつ徹底的な混合を伴った。この方法は、リポソームを調製するために広く使用されており、エタノール相を５０体積％未満に調整すると均一なナノ粒子を生成した。エタノール相比及び／又は脂質濃度を増加させると、低速の緩衝液－エタノール注入（図１Ａ～１Ｂ）の結果によっても示されるように、おそらく非効率的な相混合のために、大きな粒子又は凝集体が生成された。液体ハンドラーによる自動混合プロセスからの知見は、マイクロ流体法によって調製されたＬＮＰの結果と高度に相関していた。流量比（ＦＲＲ、水性対有機流量）は、マイクロ流体調製中の重要な製剤パラメータの１つであり、低いＦＲＲはより大きな粒子を生成する。低速での緩衝液－エタノール注入は、低いＦＲＲの状態を示した。したがって、自動化された混合条件を最適化し、エタノール－緩衝液注入を１／３のエタノール／水性体積比（２５体積％のエタノール）の下で０．５ｍｌ／ｓに設定し、続いて１０回ピペッティングして効率的な相混合を達成し、高い封入効率で均一な粒子を生成した。
【0171】
［０１９２］次に、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの最適な品質属性について、総脂質濃度、脂質組成、及びＡＳＯ負荷量を含む製剤変数をスクリーニングするための合理化されたワークフローを開発した。この目的のために、ＡＳＯの粒径分布及び％ＥＥをそれぞれハイスループットＤＬＳ及びＯＤ２６０によって測定して、高いＡＳＯ負荷量で均一なナノ粒子を生成することができる条件を決定した。スクリーニング結果は、ＰＥＧ化脂質含有量が粒径分布に有意に影響を及ぼすことを示した（図３Ｂ～３Ｄ、５Ａ～５Ｂ、６Ａ～６Ｂ）。総脂質の１．５ｍｏｌ％で組み込まれたＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００は、約１２０ｎｍの平均直径を有する単峰性ナノ粒子を産生したが、より多くのＰＥＧは多分散性を増加させた。第三級アミン構造からなるイオン化可能な脂質は、ヌクレオチドのための脂質ベースの送達システムにますます使用されており、永続的に荷電したカチオン性脂質よりも良好な細胞内送達効率及び低い細胞傷害性を示す。例えば、Ｃｕｌｌｉｓ＆Ｈｏｐｅ，２０１７，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（７）：１４６７－１４７５，Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２６（６）：１５０９－１５１９；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８（２）：１７２－１７６を参照のこと。電荷媒介錯化の負荷機構と一致して、スクリーニング結果はＮ／Ｐ比によって決定されるＡＳＯ封入を示し、Ｎ／Ｐ比＝１で約９０％の％ＥＥを示し（図３Ｅ、５Ｃ、６Ｃ）、０．２９ｍｇのＲＴＲ３８３３／ｍｇ脂質の負荷能力に対応した（１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含む２ｍＭの総脂質）。
【0172】
［０１９３］重要なことに、ＨＴＳアプローチからの結果は、スケーラブルな生成を伴うナノ粒子製剤を調製するためにますます利用されているマイクロ流体フォーミュレーターからの結果を首尾よく予測した。例えば、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１，ｅ３７；ｖａｎ Ｓｗａａｙ＆ｄｅＭｅｌｌｏｗ，２０１３，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３（５）：７５２－６７を参照のこと。どちらの方法も、ＰＥＧ化脂質含有量（図７Ａ）、総脂質濃度（図７Ｂ）、及びＮ／Ｐ比（図７Ｃ）に対するＬＮＰサイズの同様の依存性を示し、ＡＳＯの％ＥＥは、Ｎ／Ｐ比によって同様に制御された（図７Ｄ）。２つの方法はまた、同じ製剤パラメータ（図７Ｅ）下で類似の構造を有するＬＮＰを生成した。さらに、これらのＡＳＯ負荷ＬＮＰは、安定した粒径分布（図８Ａ～８Ｂ）及び４０℃で２週間の貯蔵にわたる封入ＡＳＯの約２０％の漏出を示した（図１０）。しかしながら、マイクロ流体調製と比較して、ＨＴＳアプローチは、調製及び分析出力を約１００倍増加させながら、原料を約１０倍節約することにおいて有意な利点を示した（単一のマイクロ流体実行と比較して、マイクロプレート内の９６個のサンプルを並列処理する）ことから、初期段階の製剤スクリーニングの大きな可能性が示された（図１１）。スクリーニング結果に基づいて、１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及びＮ／Ｐ比≧１は、均一で安定した粒径及び高いＡＳＯ負荷を有する最適なＬＮＰ製剤を生成することが決定された。ＨＴＳシステムに異なる脂質及び他のＡＳＯを導入した後も、同じ意見が依然として有効であり、このスクリーニングプラットフォームがｓｉＲＮＡ及び単一ガイドＲＮＡなどの様々な種類の担体及びカーゴへの適用を拡大できることを示唆した。
【0173】
［０１９４］ＨＴＳスクリーニングアプローチは、ＬＮＰを調製するための再現性のある製剤プラットフォームを実証した。自動注入プラットフォームからマイクロ流体調製物への変換可能な結果は、スクリーニング及びスケールアップ製剤をサポートするためのシームレスなワークフローを作り出し、製剤の不整合から生じるブリッジ研究を回避した。次なるステップは、現在のワークフローを下流のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングと統合して、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの物理化学的属性を治療有効性と相関させることである。さらに、ゼータ電位及び液体クロマトグラフィー戦略によるＡＰＩと添加物との両方の同時定量化などの、より多くの製剤属性に対処するために、ワークフローをさらに改善することができる。Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７９（２０），３６２０－５，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｒ Ａ １６０１：１４５－１５４。
【0174】
［０１９５］この実施例では、製剤パラメータをスクリーニングし、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの品質属性に対処するためのハイスループットアプローチが開発された。自動化された液体の分注及び混合から始まり、続いてハイスループットの粒径及びＡＳＯ封入の分析の合理化されたワークフローは、ＰＥＧ化脂質含有量及びＮ／Ｐ比がそれぞれ粒径分布及び封入効率の主要な決定因子であることを同定した。さらに、ＨＴＳの結果は、マイクロ流体を用いたスケールアップ調製からの結果を首尾よく予測した。ロバストなスクリーニング結果、並びに材料の大幅な節約及び分析出力の改善は、脂質ベースのナノ粒子製剤の開発を進めるためのこのアプローチの大きな将来性を示唆している。
【0175】
実施例５
ＡＳＯ封入の定量化の代替方法
［０１９６］ＡＳＯ封入の定量化を、蛍光プレートリーダーを使用して決定した。簡潔に記載すると、ハイスループット溶媒注入法によってＡＳＯ負荷ＬＮＰを調製し、次いで、ＴＥ緩衝液で５０倍希釈し、等体積の５０００倍希釈蛍光プローブＳｙｂｒ－ｇｏｌｄと混合し、蛍光プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５５０ｎｍ）を使用して非封入ＡＳＯを定量した。次いで、ＬＮＰを、１体積％Ｔｒｉｔｏｎ ＴＥ中の等体積の１００００倍希釈Ｓｙｂｒ－ｇｏｌｄ（すなわち、最終プローブ希釈を１００００倍に保ち、Ｔｒｉｔｏｎ濃度を０．５体積％にした）の直接添加によって破壊した（図１２Ａ）。次いで、蛍光測定を行い、総ＡＳＯを定量した。封入効率（％ＥＥ）を以下のように計算した：
ＡＳＯ封入の定量化の代替方法
［０１９６］ＡＳＯ封入の定量化を、蛍光プレートリーダーを使用して決定した。簡潔に記載すると、ハイスループット溶媒注入法によってＡＳＯ負荷ＬＮＰを調製し、次いで、ＴＥ緩衝液で５０倍希釈し、等体積の５０００倍希釈蛍光プローブＳｙｂｒ－ｇｏｌｄと混合し、蛍光プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５５０ｎｍ）を使用して非封入ＡＳＯを定量した。次いで、ＬＮＰを、１体積％Ｔｒｉｔｏｎ ＴＥ中の等体積の１００００倍希釈Ｓｙｂｒ－ｇｏｌｄ（すなわち、最終プローブ希釈を１００００倍に保ち、Ｔｒｉｔｏｎ濃度を０．５体積％にした）の直接添加によって破壊した（図１２Ａ）。次いで、蛍光測定を行い、総ＡＳＯを定量した。封入効率（％ＥＥ）を以下のように計算した：
【0176】
［０１９７］計算は、蛍光法及びＵＶ－Ｖｉｓ法を使用して異なるＮ／Ｐ比で調製された２つの異なるＬＮＰ製剤について同等の％ＥＥ結果を示した（図１２Ｂ）。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝２として表され；ｎｓ、有意ではない（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＳｉｄａｋの多重比較によって分析）。
【0177】
実施例６
ＨｉＢｉＴペプチド負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
［０１９８］リポソームの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した。ＨｉＢｉＴを最初に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を補充した２０ｍＭヒスチジン－酢酸緩衝液に溶解させ、ロボット液体ハンドラーを使用してマイクロウェルプレートに分注した。実施例２と同様に脂質混合物を調製した（図１３Ａ）。
ＨｉＢｉＴペプチド負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
［０１９８］リポソームの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した。ＨｉＢｉＴを最初に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を補充した２０ｍＭヒスチジン－酢酸緩衝液に溶解させ、ロボット液体ハンドラーを使用してマイクロウェルプレートに分注した。実施例２と同様に脂質混合物を調製した（図１３Ａ）。
【0178】
［０１９９］典型的なスクリーニングのために、４種類のＬＮＰ製剤並びにＰＥＧ化脂質、遮蔽ＰＥＧ化脂質及びアジドとコンジュゲートしたＰＥＧ化脂質の８つの組み合わせで変動する３２個の異なるサンプル（それぞれ３つの反復）を、９６ウェルプレートで並行してスクリーニングした（図１３Ｂ）。調査した８つの製剤パラメータの中で、ＰＥＧ化脂質は、脂質組成にＰＥＧが組み込まれていない場合に多峰性の大きな凝集体が生成されたため、ＬＮＰ形成に必要であった（図１３Ｃ）。精製前後の遊離ペプチド濃度の定量により、ゲル濾過及び透析についてそれぞれ約９８％及び約６１％の平均精製効率が得られた（図１３Ｄ～１３Ｆ）。粒子回収率は、ペグ化脂質なしで調製された凝集サンプルによる低い値を除いて、一般に８０～１２０％の間であった（図１３Ｇ）。さらに、粒径分布は、ゲル濾過による精製後も一定のままであった（図１３Ｈ）。
【0179】
実施例７
ＨＴＳは、ＡＳＯ－ＬＮＰのサイズ分布に対する多様なＰＥＧ－脂質の属性の影響を同定した。
ＨＴＳは、ＡＳＯ－ＬＮＰのサイズ分布に対する多様なＰＥＧ－脂質の属性の影響を同定した。
【0180】
ＡＳＯ負荷ＬＮＰのＨＴＳ調製及び特性評価
［０２００］コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びＬＮＰ製剤用のすべての直鎖状ＰＥＧ化脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。分岐状ＰＥＧ化脂質Ｎ－［２’，３’－ビス（メチルポリオキシエチレンオキシ）プロパン－１’－オキシカルボニル］－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－２ａｒｍ－ＰＥＧ－２ｋ）を、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＹ，ＵＳＡ）から商業的に入手した。ＰＥＧ化脂質の全リストは、以下の表１に列挙される。
［０２０１］ＬＮＰ製剤用のイオン化可能脂質ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ；ＭＣ３）を、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（米国ニュージャージー州）から購入した。ホスホロチオエート骨格を有する１７－ｍｅｒのＡＳＯ（ＭＷ ５６３５Ｄａ、Ｎａ塩型）は、固相合成を用いてＢｉｏＳｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ（フランクフルト、ドイツ）によりカスタム合成された。その他の試薬はすべて、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まず、さらに精製することなく市販のものを使用した。
［０２００］コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びＬＮＰ製剤用のすべての直鎖状ＰＥＧ化脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。分岐状ＰＥＧ化脂質Ｎ－［２’，３’－ビス（メチルポリオキシエチレンオキシ）プロパン－１’－オキシカルボニル］－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－２ａｒｍ－ＰＥＧ－２ｋ）を、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＹ，ＵＳＡ）から商業的に入手した。ＰＥＧ化脂質の全リストは、以下の表１に列挙される。
【0181】
［０２０２］様々なＰＥＧ化脂質を有するＬＮＰを、以前に報告されたハイスループットアプローチを用いて調製した。簡潔に記載すると、ＡＳＯをクエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）に９３．９μｇ／ｍＬで溶解させ、ＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）ロボットリキッドハンドラー（Ｔｅｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５１０１，ＮＣ，ＵＳＡ）に１５０μＬ／ウェルで分注した。自動化されたセットアップを用いて、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びそれぞれのＰＥＧ－脂質アナログで構成される異なる脂質混合物を、エタノール中で、モル比４０：１０：（５０－Ｘ）：Ｘで調製した。ここでＸ＝１、３、又は５であり、得られるＡＳＯ－ＬＮＰのＮ：Ｐ＝２を維持するための総脂質濃度は４ｍＭであった。Ｎ：Ｐは、イオン化可能な脂質中の正電荷を帯びたアミン（Ｎ）基と、核酸骨格上の負電荷を帯びたリン酸（Ｐ）基のモル比として定義される。脂質混合物を１２チャンネルリザーバープレート（Ａｘｙｇｅｎ ＲＥＳ－ＭＷ１２－ＬＰ又は－ＨＰ，ＮＣ，ＵＳＡ）に移し、ロボット（速度＝０．５ｍＬ／ｓ、続いて０．１ｍＬ／サイクルの混合を１０サイクル）を用いて９６ウェルプレート中のＡＳＯ溶液に５０μＬの脂質相を注入し、エタノール：水相体積比１：３で１ウェル当たり総脂質１ｍＭを得た。各ＬＮＰ製剤を３連で調製した。ＡＳＯ負荷ＬＮＰをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し、最終濃度が１ウェルあたり合計１ｍＭのＡＳＯとなるようにした。各サンプルの小アリコートをガラス底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５８９２，ＮＣ，ＵＳＡ）に移し、ＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）プレートリーダーＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径分布の特性評価のために、ＰＢＳでさらに５０倍に希釈した。
【0182】
ＡＳＯ負荷ＬＮＰのマイクロ流体調製及び特性評価
［０２０３］ＨＴＳアプローチによって同定された、選択されたポジティブ及びネガティブヒットＡＳＯ－ＬＮＰ製剤のスケールアップ調製に、マイクロ流体混合法を使用した。ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び選択的なＰＥＧ－脂質アナログで構成される異なる脂質混合物を、エタノール中にモル比４０：１０：（５０－Ｘ）：Ｘで溶解させた。ここでＸ＝１、３、又は５であり、総脂質濃度は４ｍＭであった。エタノール流を、マイクロ流体層流混合デバイス（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒＴＭＢｅｎｃｈｔｏｐ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、クエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解した９３．９μｇ／ｍＬのＡＳＯを含有する水流と１：３の容量比及び総流量１２ ｍＬ／分で急速に混合した。製剤化したＬＮＰを、３０分間２，０００ｇで遠心分離限外濾過（ＭＷＣＯ １０ｋＤ；Ａｍｉｃｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製して、遊離ＡＳＯ及び脂質を除去し、続いてＲＮａｓｅ非含有のＰＢＳと緩衝液交換した。精製した製剤は、ＤＬＳを用いて粒径分布を分析した。
［０２０３］ＨＴＳアプローチによって同定された、選択されたポジティブ及びネガティブヒットＡＳＯ－ＬＮＰ製剤のスケールアップ調製に、マイクロ流体混合法を使用した。ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び選択的なＰＥＧ－脂質アナログで構成される異なる脂質混合物を、エタノール中にモル比４０：１０：（５０－Ｘ）：Ｘで溶解させた。ここでＸ＝１、３、又は５であり、総脂質濃度は４ｍＭであった。エタノール流を、マイクロ流体層流混合デバイス（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒＴＭＢｅｎｃｈｔｏｐ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、クエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解した９３．９μｇ／ｍＬのＡＳＯを含有する水流と１：３の容量比及び総流量１２ ｍＬ／分で急速に混合した。製剤化したＬＮＰを、３０分間２，０００ｇで遠心分離限外濾過（ＭＷＣＯ １０ｋＤ；Ａｍｉｃｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製して、遊離ＡＳＯ及び脂質を除去し、続いてＲＮａｓｅ非含有のＰＢＳと緩衝液交換した。精製した製剤は、ＤＬＳを用いて粒径分布を分析した。
【0183】
統計分析
［０２０４］データのプロット及び統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。すべての結果を平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝３には３つの平均内部反復が含まれる。
［０２０４］データのプロット及び統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。すべての結果を平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝３には３つの平均内部反復が含まれる。
【0184】
ＡＳＯ－ＬＮＰ製剤ライブラリーに使用される多様なＰＥＧ－脂質
［０２０５］本ＨＴＳ脂質ライブラリー設計では、すべてのＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の構成脂質として、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを選択したが、ＰＥＧ－脂質含量は変化させた（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ＭＣ３、ＤＳＰＣ、及びコレステロールの組み合わせは、ＦＤＡが承認した最初のｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤であるＯＮＰＡＴＴＲＯ（登録商標）に使用されており、多くの前臨床ＬＮＰモデル系でオリゴヌクレオチド送達のベンチマークとして使用されている。ＬＮＰカーゴ送達におけるＰＥＧ－脂質の影響を系統的に理解するために、ＡＳＯ－ＬＮＰ形成の際に、いくつかのＰＥＧ－脂質アナログをＭＣ３、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと組み合わせて使用した（表１）。薬物送達用途で一般的に使用されるＰＥＧ－脂質は、アニオン性ホスホグリセリド、中性荷電ジグリセリド及びセラミドを含む生物学的に関連性のある脂質ファミリーから選ばれた。各ＰＥＧ－脂質タイプについて、Ｃテールの長さ又はＰＥＧ鎖のサイズを変えた複数のアナログを含めた（図１５Ｂ）。この研究では、構造（直鎖状又は分岐状）及びＰＥＧ－脂質Ｃテール飽和度の影響も評価した。
［０２０５］本ＨＴＳ脂質ライブラリー設計では、すべてのＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の構成脂質として、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを選択したが、ＰＥＧ－脂質含量は変化させた（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ＭＣ３、ＤＳＰＣ、及びコレステロールの組み合わせは、ＦＤＡが承認した最初のｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤であるＯＮＰＡＴＴＲＯ（登録商標）に使用されており、多くの前臨床ＬＮＰモデル系でオリゴヌクレオチド送達のベンチマークとして使用されている。ＬＮＰカーゴ送達におけるＰＥＧ－脂質の影響を系統的に理解するために、ＡＳＯ－ＬＮＰ形成の際に、いくつかのＰＥＧ－脂質アナログをＭＣ３、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと組み合わせて使用した（表１）。薬物送達用途で一般的に使用されるＰＥＧ－脂質は、アニオン性ホスホグリセリド、中性荷電ジグリセリド及びセラミドを含む生物学的に関連性のある脂質ファミリーから選ばれた。各ＰＥＧ－脂質タイプについて、Ｃテールの長さ又はＰＥＧ鎖のサイズを変えた複数のアナログを含めた（図１５Ｂ）。この研究では、構造（直鎖状又は分岐状）及びＰＥＧ－脂質Ｃテール飽和度の影響も評価した。
【0185】
［０２０６］個々のＰＥＧ－脂質の特徴を試験することに加えて、製剤特性及びカーゴ送達に対する影響を評価するために、ＰＥＧ－脂質濃度を変化させることもした。脂質混合物中のコレステロールのモル比を調整することによって、ＬＮＰ中のＰＥＧ－脂質のモル比を１、３、及び５ｍｏｌ％に調節した。これらのＰＥＧ－脂質パラメータを使用して、ＡＳＯ送達の物理化学的特性評価及びｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のために、５４の異なるＡＳＯ－ＬＮＰ製剤のライブラリーを９６ウェルプレートベースのＨＴＳワークフローで調製した。
【0186】
ＰＥＧ含有量がＡＳＯ－ＬＮＰの粒径分布に影響を与える
［０２０７］５４の異なるＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の平均流体力学的直径は、ＤＬＳによって測定される場合５２と２１２ｎｍの間の範囲であり、ＰＥＧ化脂質のモル比が１％から５％に増加するにつれて粒径が減少する一般的傾向を示した（図１６Ａ～１６Ｃ）。短いＰＥＧ－脂質（Ｍ．Ｗ．＜１０００Ｄａ）を１ｍｏｌ％配合したＬＮＰ、例えば＃６と＃１０は、２１２ｎｍという最大の粒子直径を有していた。対照的に、５ｍｏｌ％の長いＰＥＧ脂質（＃９）は最も小さな粒子（５２ｎｍ）を生成したが、これはおそらくＰＥＧ鎖による立体障害が増大し、粒子の成長を妨げたためであろう。具体的には、アニオン性ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中のＰＥＧモル比と同様に、ＰＥＧサイズが大きくなるにつれて、粒径の明確な減少を示した（図１６Ａ）。対照的に、中性ジグリセリド及びセラミドＰＥＧ脂質を用いて調製したＬＮＰは、粒径とＰＥＧ含有量の間に相関を示さず、特に製剤＃１３及び＃１６では非相関が見られた（図１６Ｂ）。これらの知見は、ＰＥＧ鎖の立体障壁と並んで、アニオン性ＰＥＧ化ＬＮＰの粒径を決定する上で、荷電した頭部基間の反発力が大きな役割を果たしていることを示唆している。さらに、直鎖状及び分岐状のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋのバリアント（＃８及び＃９）の比較では、流体力学的直径に対するＰＥＧ構造の有意な影響は示されなかった（図１６Ｃ）。また、平均粒子直径を色分けしたヒートマップで示し、粒径の傾向を示した（図１７参照）。
［０２０７］５４の異なるＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の平均流体力学的直径は、ＤＬＳによって測定される場合５２と２１２ｎｍの間の範囲であり、ＰＥＧ化脂質のモル比が１％から５％に増加するにつれて粒径が減少する一般的傾向を示した（図１６Ａ～１６Ｃ）。短いＰＥＧ－脂質（Ｍ．Ｗ．＜１０００Ｄａ）を１ｍｏｌ％配合したＬＮＰ、例えば＃６と＃１０は、２１２ｎｍという最大の粒子直径を有していた。対照的に、５ｍｏｌ％の長いＰＥＧ脂質（＃９）は最も小さな粒子（５２ｎｍ）を生成したが、これはおそらくＰＥＧ鎖による立体障害が増大し、粒子の成長を妨げたためであろう。具体的には、アニオン性ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中のＰＥＧモル比と同様に、ＰＥＧサイズが大きくなるにつれて、粒径の明確な減少を示した（図１６Ａ）。対照的に、中性ジグリセリド及びセラミドＰＥＧ脂質を用いて調製したＬＮＰは、粒径とＰＥＧ含有量の間に相関を示さず、特に製剤＃１３及び＃１６では非相関が見られた（図１６Ｂ）。これらの知見は、ＰＥＧ鎖の立体障壁と並んで、アニオン性ＰＥＧ化ＬＮＰの粒径を決定する上で、荷電した頭部基間の反発力が大きな役割を果たしていることを示唆している。さらに、直鎖状及び分岐状のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋのバリアント（＃８及び＃９）の比較では、流体力学的直径に対するＰＥＧ構造の有意な影響は示されなかった（図１６Ｃ）。また、平均粒子直径を色分けしたヒートマップで示し、粒径の傾向を示した（図１７参照）。
【0187】
［０２０８］ＰＥＧ－脂質モル比の増加は、粒子直径に電荷依存的な影響を有するが、ＰＥＧ－脂質含有量は、ＬＮＰ多分散度（％ＰＤ）と全体的に正の相関を有する（図１６Ｄ～１６Ｆ）。この傾向の顕著な例外は、＃６、＃１５、＃１６である。ＰＥＧ－脂質＃１５及び＃１６は、中性荷電セラミド－Ｃ８ ＰＥＧ－脂質ファミリーのもので、これもＰＥＧ－脂質含有量と粒径の間に相関関係は見られなかった。我々の以前のデータと一致して、長いＰＥＧアーム（２０００Ｄａ）を用いて５ｍｏｌ％で配合されたＰＥＧ－脂質は、おそらくミセルＰＥＧ－脂質亜集団の存在により、高度に多分散のサイズ分布を有していた。
【0188】
［０２０９］また、異なるＣテール長（ＤＭＰＥ／ＤＰＰＥ／ＤＳＰＥ、ＤＳＧ／ＤＭＧ、及びＣｅｒ－Ｃ８／Ｃｅｒ－Ｃ１６）、飽和レベル（ＤＳＰＥ／ＤＯＰＥ）、及びＰＥＧ－リンカー化学的性質（ＤＭＰＥ／ＤＭＧ、及びＤＳＰＥ／ＤＳＧ）を有する脂質アンカー基の効果を比較した。ＰＥＧ－脂質の疎水性のテールは、ＬＮＰのサイズ又は多分散性指数に大きな影響を与えなかった。これは、ＰＥＧ－脂質の親水性ＰＥＧ成分の重要性とは対照的である。同様の観察は、１４、１６、１８の炭素鎖を含有するＰＥＧ脂質を用いて調製されたｓｉＲＮＡ－ＬＮＰについても以前に報告されたことがある。
【0189】
ＬＮＰ粒径の回帰分析
［０２１０］線形回帰モデルは、異なるＣテール属性の有意でない影響と比較して、ＬＮＰ粒径分布におけるＰＥＧ－脂質電荷、モル比、及びＰＥＧサイズの有意性（ｐ＜０．０５）を裏付けた（表２及び表３）。
［０２１０］線形回帰モデルは、異なるＣテール属性の有意でない影響と比較して、ＬＮＰ粒径分布におけるＰＥＧ－脂質電荷、モル比、及びＰＥＧサイズの有意性（ｐ＜０．０５）を裏付けた（表２及び表３）。
【0190】
［０２１１］ アニオン性ＰＥＧ－脂質の線形回帰モデル：
ＡＳＯ－ＬＮＰの流体力学的直径（ｎｍ）＝２２５．７１－０．４４＊炭素テール長（＃Ｃ）－０．０５＊ＰＥＧサイズ（Ｄａ）－１４．１２＊ＰＥＧ－脂質ｍｏｌ％。
ＡＳＯ－ＬＮＰの流体力学的直径（ｎｍ）＝２２５．７１－０．４４＊炭素テール長（＃Ｃ）－０．０５＊ＰＥＧサイズ（Ｄａ）－１４．１２＊ＰＥＧ－脂質ｍｏｌ％。
【0191】
［０２１２］モデル概要：
Ｒ平方＝０．８６９、調整後Ｒ平方＝０．８５７、標準誤差＝１５．３７、観察数＝３６。ＡＮＯＶＡ：有意性Ｆ＝３．１６×１０－１４
Ｒ平方＝０．８６９、調整後Ｒ平方＝０．８５７、標準誤差＝１５．３７、観察数＝３６。ＡＮＯＶＡ：有意性Ｆ＝３．１６×１０－１４
【0192】
［０２１３］中性ＰＥＧ－脂質の線形回帰モデル：
ＡＳＯ－ＬＮＰの流体力学的直径（ｎｍ）＝１７２．６８＋１．２９＊炭素テール長（＃Ｃ）－０．０３＊ＰＥＧサイズ（Ｄａ）－６．２１＊ＰＥＧ－脂質ｍｏｌ％。
ＡＳＯ－ＬＮＰの流体力学的直径（ｎｍ）＝１７２．６８＋１．２９＊炭素テール長（＃Ｃ）－０．０３＊ＰＥＧサイズ（Ｄａ）－６．２１＊ＰＥＧ－脂質ｍｏｌ％。
【0193】
［０２１４］モデル概要：
Ｒ平方＝０．７００、調整後Ｒ平方＝０．６３６、標準誤差＝１５．７４、観察数＝１８。ＡＮＯＶＡ：有意性Ｆ＝５．９×１０－４
Ｒ平方＝０．７００、調整後Ｒ平方＝０．６３６、標準誤差＝１５．７４、観察数＝１８。ＡＮＯＶＡ：有意性Ｆ＝５．９×１０－４
【0194】
［０２１５］これらのデータを総合すると、ＬＮＰのサイズ分布は、脂質テールの属性よりも、むしろ表面安定化ＰＥＧ含有量に主に依存し、このＰＥＧ依存性は、アニオン性ＰＥＧ－脂質足場において特に支配的であることが示唆される。
【0195】
実施例８
ＡＳＯ－ＬＮＰ挙動傾向の同定のためのＨＴＳ
［０２１６］本発明のＨＴＳアプローチは、９６ウェルプレートフォーマットでの多様なＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の迅速な調製及び特性評価を可能にする。このハイスループットワークフローは、標的細胞株におけるＬＮＰ送達を評価するためにシームレスに拡張することができる。このＨＴＳアプローチは、材料及び時間の大幅な節約につながる。さらに、ＡＳＯ－ＬＮＰ製剤を同一の環境で直接比較することにより、ロバストなデータセットを生成し、処理のばらつきを最小限に抑える。
ＡＳＯ－ＬＮＰ挙動傾向の同定のためのＨＴＳ
［０２１６］本発明のＨＴＳアプローチは、９６ウェルプレートフォーマットでの多様なＡＳＯ－ＬＮＰ製剤の迅速な調製及び特性評価を可能にする。このハイスループットワークフローは、標的細胞株におけるＬＮＰ送達を評価するためにシームレスに拡張することができる。このＨＴＳアプローチは、材料及び時間の大幅な節約につながる。さらに、ＡＳＯ－ＬＮＰ製剤を同一の環境で直接比較することにより、ロバストなデータセットを生成し、処理のばらつきを最小限に抑える。
【0196】
［０２１７］ＨＴＳアプローチは、データ解析及び解釈にも有利である。第一に、多数の製剤を含む特性評価を短時間で行うことができる（図１６Ａ－１６Ｆ）。第二に、包括的なスクリーニングにより、狭いサンプルサイズでは隠蔽される可能性のある相関関係を同定することができる。例えば、我々のＨＴＳデータセットは、ＰＥＧ－脂質の親水性ＰＥＧ成分がＬＮＰの粒径分布に影響を及ぼすことを示している（図１６Ａ－１６Ｆ）。このような挙動傾向は、回帰分析を用いた予測相関によって定量的に定義することができる。線形回帰モデルは、ＬＮＰのサイズ分布におけるＰＥＧ－脂質濃度及びＰＥＧサイズ（ｐ＜０．０５）の電荷依存性が、Ｃテール属性と比較して有意であることを立証した。これらの相関の精度は、高度な機械学習アルゴリズムと組み合わせて、より広範なサンプルセットを繰り返しスクリーニングすることによって、さらに向上させることができる。
【0197】
ＨＴＳがスケールアップ製剤のＡＳＯ－ＬＮＰ性能を予測する
［０２１８］すべてのスクリーニングアッセイと同様、ＨＴＳアプローチの価値は、スケールアップした系での挙動を予測する能力にある。したがって、我々は、自己組織化ナノ粒子製剤を製造するための、ＨＴＳアプローチからスケーラブルなマイクロ流体法へのＬＮＰ属性の変換可能性を検証した。特定のＰＥＧ種及びモル比（＃１３－１％、＃１６－３％、＃１－５％、＃１０－１％、＃８－３％、＃９－５％）で製剤化した６つのヒットＡＳＯ－ＬＮＰをＨＴＳライブラリーから選んだ。代表的な製剤は、異なる脂質テール飽和レベル（＃１０、＃８）、ＰＥＧ構造（＃９）、及びＰＥＧ－脂質含有量（１、３、５ｍｏｌ％）を有する、ジグリセリド（＃１３）ＰＥＧ－脂質、セラミド（＃１６）ＰＥＧ－脂質、及びホスホグリセリド（＃１）ＰＥＧ－脂質を含む多様なＰＥＧ－脂質アレイを含むことを根拠として選択され、ＬＮＰ中の広範なＰＥＧ含有量にわたるＨＴＳの予測可能性のロバストな検証を確実にする。選択したＡＳＯ－ＬＮＰを、対応するＨＴＳと同様の配合条件下でマイクロ流体ミキサー（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒＴＭＢｅｎｃｈｔｏｐ）を使用して、１０倍にスケールアップした。
［０２１８］すべてのスクリーニングアッセイと同様、ＨＴＳアプローチの価値は、スケールアップした系での挙動を予測する能力にある。したがって、我々は、自己組織化ナノ粒子製剤を製造するための、ＨＴＳアプローチからスケーラブルなマイクロ流体法へのＬＮＰ属性の変換可能性を検証した。特定のＰＥＧ種及びモル比（＃１３－１％、＃１６－３％、＃１－５％、＃１０－１％、＃８－３％、＃９－５％）で製剤化した６つのヒットＡＳＯ－ＬＮＰをＨＴＳライブラリーから選んだ。代表的な製剤は、異なる脂質テール飽和レベル（＃１０、＃８）、ＰＥＧ構造（＃９）、及びＰＥＧ－脂質含有量（１、３、５ｍｏｌ％）を有する、ジグリセリド（＃１３）ＰＥＧ－脂質、セラミド（＃１６）ＰＥＧ－脂質、及びホスホグリセリド（＃１）ＰＥＧ－脂質を含む多様なＰＥＧ－脂質アレイを含むことを根拠として選択され、ＬＮＰ中の広範なＰＥＧ含有量にわたるＨＴＳの予測可能性のロバストな検証を確実にする。選択したＡＳＯ－ＬＮＰを、対応するＨＴＳと同様の配合条件下でマイクロ流体ミキサー（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒＴＭＢｅｎｃｈｔｏｐ）を使用して、１０倍にスケールアップした。
【0198】
［０２１９］マイクロ流体工学を用いて調製した６つの異なるＬＮＰのＤＬＳ特性は、流体力学的直径がＨＴＳ法を用いて製剤化したそれぞれのＬＮＰと類似していることを示した。（図１８）。ＨＴＳのアプローチは、物理化学的特性を確実に予測し、これら属性をマイクロ流体ベースの製剤にスムーズに反映させた。現在、マイクロ流体技術は、ＬＮＰベースの薬物送達ビヒクルの前臨床及び臨床応用に適したスケーラビリティ（＜ｍＬからＬまで）により、広く適応されてきた。このように、予測的ＨＴＳアプローチは、スケーラブルなマイクロ流体工学プラットフォーム上で製剤を最適化するために通常必要とされるリソースを大幅に節約しながら、製剤のスケールアップに利用することができる。
【0199】
［０２２０］本発明に従って、ＰＥＧサイズ、ＬＮＰ中のＰＥＧ－脂質含有量、炭素－テール長などのような様々なＰＥＧ－脂質パラメータに応じてＬＮＰサイズ分布傾向を特性評価するためのハイスループットスクリーニングアプローチが記載される。本明細書に記載された発明は、さらに機械学習アルゴリズムと組み合わせて、ＨＴＳで得られた膨大なデータセットにわたる定量的相関を同定及び定義することができる。
【0200】
参考文献
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Ｎ． Ｐａｒｄｉ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｇａｎ，Ｆ．Ｗ． Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ － ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １７（４）（２０１８）２６１－２７９．
Ｋ．Ａ． Ｄｏｗｄ，Ｓ．Ｙ． Ｋｏ，Ｋ．Ｍ． Ｍｏｒａｂｉｔｏ，Ｅ．Ｓ． Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｓ． Ｐｅｌｃ，Ｃ．Ｒ． ＤｅＭａｓｏ，Ｌ．Ｒ． Ｃａｓｔｉｌｈｏ，Ｐ． Ａｂｂｉｎｋ，Ｍ． Ｂｏｙｄ，Ｒ． Ｎｉｔｙａｎａｎｄａｍ，Ｄ．Ｎ． Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｒ． Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｘ． Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｐ． Ｔｏｄｄ，Ｙ． Ｔｓｙｂｏｖｓｋｙ，Ａ． Ｈａｒｒｉｓ，Ｙ．Ｓ． Ｈｕａｎｇ，Ｓ． Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｌ． Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ，Ｈ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｇ． Ｌｅｗｉｓ，Ｒ． Ｄｅ Ｌａ Ｂａｒｒｅｒａ，Ｋ．Ｈ． Ｅｃｋｅｌｓ，Ｒ．Ｇ． Ｊａｒｍａｎ，Ｍ．Ｃ． Ｎａｓｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｗ．Ｐ． Ｋｏｎｇ，Ｊ．Ｒ． Ｍａｓｃｏｌａ，Ｔ．Ｃ． Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｓ． Ｇｒａｈａｍ，Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４（６３０９）（２０１６）２３７－２４０．
Ｊ．Ｍ． Ｒｉｃｈｎｅｒ，Ｓ． Ｈｉｍａｎｓｕ，Ｋ．Ａ． Ｄｏｗｄ，Ｓ．Ｌ． Ｂｕｔｌｅｒ，Ｖ． Ｓａｌａｚａｒ，Ｊ．Ｍ． Ｆｏｘ，Ｊ．Ｇ． Ｊｕｌａｎｄｅｒ，Ｗ．Ｗ． Ｔａｎｇ，Ｓ． Ｓｈｒｅｓｔａ，Ｔ．Ｃ． Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｇ． Ｃｉａｒａｍｅｌｌａ，Ｍ．Ｓ． Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ １６８（６）（２０１７）１１１４－１１２５ ｅ１０．
Ａ． Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｌ． Ｒｅｕｓｃｈｅｌ，Ｋ．Ａ． Ｋｒａｙｎｙａｋ，Ｔ． Ｒａｃｉｎｅ，Ｄ．Ｈ． Ｐａｒｋ，Ｖ．Ｌ． Ｓｃｏｔｔ，Ｊ． Ａｕｄｅｔ，Ｄ． Ａｍａｎｔｅ，Ｍ．Ｃ． Ｗｉｓｅ，Ａ．Ａ． Ｋｅａｔｏｎ，Ｇ． Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｏ． Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｊ． Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｋ． Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｄ．Ｊ． Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｍ．Ａ． ｄｅ Ｌａ Ｖｅｇａ，Ｒ． Ｐｌｙｌｅｒ，Ｊ． Ｂｏｙｅｒ，Ｋ．Ｅ． Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ，Ｊ． Ｙａｎ，Ａ．Ｓ． Ｋｈａｎ，Ｓ． Ｊｏｎｅｓ，Ａ． Ｂｅｌｌｏ，Ｇ． Ｓｏｕｌｅ，Ｋ．Ｎ． Ｔｒａｎ，Ｓ． Ｈｅ，Ｋ． Ｔｉｅｒｎｅｙ，Ｘ． Ｑｉｕ，Ｇ．Ｐ． Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ． Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｄ．Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ ｂｙ Ｅｂｏｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１９（４）（２０１９）５４４－５５５．
Ｍ．Ｄ． Ｓｈｉｎ，Ｓ． Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｈ． Ｃｈｕｎｇ，Ｖ． Ｂｅｉｓｓ，Ｓ．Ｋ． Ｃｈａｎ，Ｏ．Ａ． Ｏｒｔｅｇａ－Ｒｉｖｅｒａ，Ｄ．Ｍ． Ｗｉｒｔｈ，Ａ． Ｃｈｅｎ，Ｍ． Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｋ． Ｐｏｋｏｒｓｋｉ，Ｎ．Ｆ． Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈ ｆｏｒｗａｒｄ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２０）．
Ｊ． Ｗａｎｇ，Ｚ． Ｌｕ，Ｍ．Ｇ． Ｗｉｅｎｔｊｅｓ，Ｊ．Ｌ． Ａｕ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ １２（４）（２０１０）４９２－５０３．
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Ｋ．Ｋ． Ｇｉｌｌ，Ａ． Ｋａｄｄｏｕｍｉ，Ｓ． Ｎａｚｚａｌ，ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｓ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ：ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ２３（３）（２０１５）２２２－３１．
Ｋ． Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｔ． Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｕ．Ｓ． Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ａ． Ｆａｈｒ，Ｆａｓｔ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ－ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ２２（１）（２０１２）３１－４１．
Ｍ．Ａ． Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃ．Ｃ． Ｍｕｌｌｅｒ－Ｇｏｙｍａｎｎ，Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ－－ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５５（１）（２００３）１２５－３１．
Ａ．Ａ． Ｍｏｋｈｔａｒｉｅｈ，Ｊ． Ｌｅｅ，Ｓ． Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ． Ｌｅｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｓｉｍｐｌｙ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｉｘｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ １８６０（６）（２０１８）１３１８－１３２５．
Ｃ．Ｊａａｆａｒ－Ｍａａｌｅｊ，Ｒ．Ｄｉａｂ，Ｖ．Ａｎｄｒｉｅｕ，Ａ．Ｅｌａｉｓｓａｒｉ，Ｈ．Ｆｅｓｓｉ，Ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ２０（３）（２０１０）２２８－４３．
Ｉ．Ｖ． Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｎ． Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｉ． Ｈａｆｅｚ，Ａ．Ｋ． Ｌｅｕｎｇ，Ｊ． Ｈｕｆｔ，Ｃ． Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８（７）（２０１２）３６３３－４０．
Ｓ． Ｓａｂｎｉｓ，Ｅ．Ｓ． Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｔ． Ｓａｌｅｒｎｏ，Ｃ． Ｍｉｈａｉ，Ｔ． Ｋｅｔｏｖａ，Ｊ．Ｊ． Ｓｅｎｎ，Ａ． Ｌｙｎｎ，Ａ． Ｂｕｌｙｃｈｅｖ，Ｉ． ＭｃＦａｄｙｅｎ，Ｊ． Ｃｈａｎ，Ｏ． Ａｌｍａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ｇ． Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｋ．Ｅ． Ｂｅｎｅｎａｔｏ，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６（６）（２０１８）１５０９－１５１９．
Ｓ．Ｃ． Ｓｅｍｐｌｅ，Ａ． Ａｋｉｎｃ，Ｊ． Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｐ． Ｓａｎｄｈｕ，Ｂ．Ｌ． Ｍｕｉ，Ｃ．Ｋ． Ｃｈｏ，Ｄ．Ｗ． Ｓａｈ，Ｄ． Ｓｔｅｂｂｉｎｇ，Ｅ．Ｊ． Ｃｒｏｓｌｅｙ，Ｅ． Ｙａｗｏｒｓｋｉ，Ｉ．Ｍ． Ｈａｆｅｚ，Ｊ．Ｒ． Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ． Ｑｉｎ，Ｋ． Ｌａｍ，Ｋ．Ｇ． Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｆ． Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｂ． Ｊｅｆｆｓ，Ｌ． Ｎｅｃｈｅｖ，Ｍ．Ｌ． Ｅｉｓｅｎｈａｒｄｔ，Ｍ． Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ． Ｋａｚｅｍ，Ｍ．Ａ． Ｍａｉｅｒ，Ｍ． Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌｕ，Ｍ．Ｊ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｑ． Ｃｈｅｎ，Ｒ． Ａｌｖａｒｅｚ，Ｓ．Ａ． Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ． Ｄｅ，Ｓ．Ｋ． Ｋｌｉｍｕｋ，Ｔ． Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｖ． Ｋｏｓｏｖｒａｓｔｉ，Ｗ．Ｌ． Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｙ．Ｋ． Ｔａｍ，Ｍ． Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ａ． Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｍ．Ａ． Ｔｒａｃｙ，Ａ． ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｉ． ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｔ．Ｄ． Ｍａｄｄｅｎ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｐｅ，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（２）（２０１０）１７２－６．
Ｎ．Ｍ． Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｊ． Ｈｕｆｔ，Ｐ．Ｊ． Ｌｉｎ，Ｓ． Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｋ． Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｊ． Ｌｅａｖｅｒ，Ａ．Ｗ． Ｗｉｌｄ，Ｊ．Ｂ． Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ． Ｔａｙｌｏｒ，Ｙ．Ｋ． Ｔａｍ，Ｃ．Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １（２０１２）ｅ３７．
Ｄ．ｖａｎ Ｓｗａａｙ，Ａ．ｄｅＭｅｌｌｏ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３（５）（２０１３）７５２－６７．
Ｅ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈｙｏｄｏ，Ｎ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ａｓａｋａｗａ，Ｄｉｒｅｃｔ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｏｎ－ｌｉｎｅ ＳＰＥ－ＳＰＥ－ＨＰＬＣ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７９（３０）（２０１１）３６２０－５．
Ｌ．Ｌｉ，Ｊ．Ｐ．Ｆｏｌｅｙ，Ｒ．Ｈｅｌｍｙ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｏｎ－ｐａｉｒ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １６０１（２０１９）１４５－１５４．
Ｋ． Ｓｒｉｄｈａｒａｎ，Ｎ．Ｊ． Ｇｏｇｔａｙ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｔｕｓ，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ８２（３）（２０１６）６５９－７２．
Ａ． Ｇｏｙｏｎ，Ｐ． Ｙｅｈｌ，Ｋ． Ｚｈａｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １８２（２０２０）１１３１０５．
Ｃ． Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ．Ｒ． Ｓｈａｒｍａ，Ｇ． Ｓｈａｒｍａ，Ｃ．Ｇ．Ｐ． Ｄｏｓｓ，Ｓ．Ｓ． Ｌｅｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｉＲＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ：Ｍｏｖｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ ａｓ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ８（２０１７）１３２－１４３．
Ｃ．Ｉ．Ｅ． Ｓｍｉｔｈ，Ｒ． Ｚａｉｎ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ５９（２０１９）６０５－６３０．
Ｄ． Ａｄａｍｓ，Ａ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｄｕａｒｔｅ，Ｗ．Ｄ． Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｃ．Ｃ． Ｙａｎｇ，Ｍ． Ｕｅｄａ，Ａ．Ｖ． Ｋｒｉｓｔｅｎ，Ｉ． Ｔｏｕｒｎｅｖ，Ｈ．Ｈ． Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ． Ｃｏｅｌｈｏ，Ｊ．Ｌ． Ｂｅｒｋ，Ｋ．Ｐ． Ｌｉｎ，Ｇ． Ｖｉｔａ，Ｓ． Ａｔｔａｒｉａｎ，Ｖ． Ｐｌａｎｔｅ－Ｂｏｒｄｅｎｅｕｖｅ，Ｍ．Ｍ． Ｍｅｚｅｉ，Ｊ．Ｍ． Ｃａｍｐｉｓｔｏｌ，Ｊ． Ｂｕａｄｅｓ，Ｔ．Ｈ． Ｂｒａｎｎａｇａｎ，３ｒｄ，Ｂ．Ｊ． Ｋｉｍ，Ｊ． Ｏｈ，Ｙ． Ｐａｒｍａｎ，Ｙ． Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｐ．Ｎ． Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｓ．Ｄ． Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｍ． Ｐｏｌｙｄｅｆｋｉｓ，Ｐ．Ｊ． Ｄｙｃｋ，Ｐ．Ｊ． Ｇａｎｄｈｉ，Ｓ． Ｇｏｙａｌ，Ｊ． Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｌ． Ｓｔｒａｈｓ，Ｓ．Ｖ． Ｎｏｃｈｕｒ，Ｍ．Ｔ． Ｓｗｅｅｔｓｅｒ，Ｐ．Ｐ． Ｇａｒｇ，Ａ．Ｋ． Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ｊ．Ａ． Ｇｏｌｌｏｂ，Ｏ．Ｂ． Ｓｕｈｒ，Ｐａｔｉｓｉｒａｎ，ａｎ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，ｆｏｒ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７９（１）（２０１８）１１－２１．
Ｕ． Ｓａｈｉｎ，Ｋ． Ｋａｒｉｋｏ，Ｏ． Ｔｕｒｅｃｉ，ｍＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－－ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３（１０）（２０１４）７５９－８０．
Ｕ． Ｓａｈｉｎ，Ｅ． Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｐ． Ｋｌｏｋｅ，Ｐ． Ｓｉｍｏｎ，Ｍ． Ｌｏｗｅｒ，Ｖ． Ｂｕｋｕｒ，Ａ．Ｄ． Ｔａｄｍｏｒ，Ｕ． Ｌｕｘｅｍｂｕｒｇｅｒ，Ｂ． Ｓｃｈｒｏｒｓ，Ｔ． Ｏｍｏｋｏｋｏ，Ｍ． Ｖｏｒｍｅｈｒ，Ｃ． Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ａ． Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉ，Ａ．Ｎ． Ｋｕｈｎ，Ｊ． Ｂｕｃｋ，Ｓ． Ｈｅｅｓｃｈ，Ｋ．Ｈ． Ｓｃｈｒｅｅｂ，Ｆ． Ｍｕｌｌｅｒ，Ｉ． Ｏｒｔｓｅｉｆｅｒ，Ｉ． Ｖｏｇｌｅｒ，Ｅ． Ｇｏｄｅｈａｒｄｔ，Ｓ． Ａｔｔｉｇ，Ｒ． Ｒａｅ，Ａ． Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚ，Ｃ． Ｔｏｌｌｉｖｅｒ，Ｍ． Ｓｕｃｈａｎ，Ｇ． Ｍａｒｔｉｃ，Ａ． Ｈｏｈｂｅｒｇｅｒ，Ｐ． Ｓｏｒｎ，Ｊ． Ｄｉｅｋｍａｎｎ，Ｊ． Ｃｉｅｓｌａ，Ｏ． Ｗａｋｓｍａｎｎ，Ａ．Ｋ． Ｂｒｕｃｋ，Ｍ． Ｗｉｔｔ，Ｍ． Ｚｉｌｌｇｅｎ，Ａ． Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ，Ｂ． Ｋａｓｅｍａｎｎ，Ｄ． Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ． Ｂｏｌｔｅ，Ｍ． Ｄｉｋｅｎ，Ｓ． Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｒ． Ｎｅｍｅｃｅｋ，Ｃ． Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｓ． Ｇｒａｂｂｅ，Ｃ． Ｈｏｌｌｅｒ，Ｊ． Ｕｔｉｋａｌ，Ｃ． Ｈｕｂｅｒ，Ｃ． Ｌｏｑｕａｉ，Ｏ． Ｔｕｒｅｃｉ，Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ＲＮＡ ｍｕｔａｎｏｍｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅ ｐｏｌｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ５４７（７６６２）（２０１７）２２２－２２６．
Ｎ． Ｐａｒｄｉ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｇａｎ，Ｆ．Ｗ． Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ － ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １７（４）（２０１８）２６１－２７９．
Ｋ．Ａ． Ｄｏｗｄ，Ｓ．Ｙ． Ｋｏ，Ｋ．Ｍ． Ｍｏｒａｂｉｔｏ，Ｅ．Ｓ． Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｓ． Ｐｅｌｃ，Ｃ．Ｒ． ＤｅＭａｓｏ，Ｌ．Ｒ． Ｃａｓｔｉｌｈｏ，Ｐ． Ａｂｂｉｎｋ，Ｍ． Ｂｏｙｄ，Ｒ． Ｎｉｔｙａｎａｎｄａｍ，Ｄ．Ｎ． Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｒ． Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｘ． Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｐ． Ｔｏｄｄ，Ｙ． Ｔｓｙｂｏｖｓｋｙ，Ａ． Ｈａｒｒｉｓ，Ｙ．Ｓ． Ｈｕａｎｇ，Ｓ． Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｌ． Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ，Ｈ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｇ． Ｌｅｗｉｓ，Ｒ． Ｄｅ Ｌａ Ｂａｒｒｅｒａ，Ｋ．Ｈ． Ｅｃｋｅｌｓ，Ｒ．Ｇ． Ｊａｒｍａｎ，Ｍ．Ｃ． Ｎａｓｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｗ．Ｐ． Ｋｏｎｇ，Ｊ．Ｒ． Ｍａｓｃｏｌａ，Ｔ．Ｃ． Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｓ． Ｇｒａｈａｍ，Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４（６３０９）（２０１６）２３７－２４０．
Ｊ．Ｍ． Ｒｉｃｈｎｅｒ，Ｓ． Ｈｉｍａｎｓｕ，Ｋ．Ａ． Ｄｏｗｄ，Ｓ．Ｌ． Ｂｕｔｌｅｒ，Ｖ． Ｓａｌａｚａｒ，Ｊ．Ｍ． Ｆｏｘ，Ｊ．Ｇ． Ｊｕｌａｎｄｅｒ，Ｗ．Ｗ． Ｔａｎｇ，Ｓ． Ｓｈｒｅｓｔａ，Ｔ．Ｃ． Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｇ． Ｃｉａｒａｍｅｌｌａ，Ｍ．Ｓ． Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ １６８（６）（２０１７）１１１４－１１２５ ｅ１０．
Ａ． Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｌ． Ｒｅｕｓｃｈｅｌ，Ｋ．Ａ． Ｋｒａｙｎｙａｋ，Ｔ． Ｒａｃｉｎｅ，Ｄ．Ｈ． Ｐａｒｋ，Ｖ．Ｌ． Ｓｃｏｔｔ，Ｊ． Ａｕｄｅｔ，Ｄ． Ａｍａｎｔｅ，Ｍ．Ｃ． Ｗｉｓｅ，Ａ．Ａ． Ｋｅａｔｏｎ，Ｇ． Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｏ． Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｊ． Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｋ． Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｄ．Ｊ． Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｍ．Ａ． ｄｅ Ｌａ Ｖｅｇａ，Ｒ． Ｐｌｙｌｅｒ，Ｊ． Ｂｏｙｅｒ，Ｋ．Ｅ． Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ，Ｊ． Ｙａｎ，Ａ．Ｓ． Ｋｈａｎ，Ｓ． Ｊｏｎｅｓ，Ａ． Ｂｅｌｌｏ，Ｇ． Ｓｏｕｌｅ，Ｋ．Ｎ． Ｔｒａｎ，Ｓ． Ｈｅ，Ｋ． Ｔｉｅｒｎｅｙ，Ｘ． Ｑｉｕ，Ｇ．Ｐ． Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ． Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｄ．Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ ｂｙ Ｅｂｏｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１９（４）（２０１９）５４４－５５５．
Ｍ．Ｄ． Ｓｈｉｎ，Ｓ． Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｈ． Ｃｈｕｎｇ，Ｖ． Ｂｅｉｓｓ，Ｓ．Ｋ． Ｃｈａｎ，Ｏ．Ａ． Ｏｒｔｅｇａ－Ｒｉｖｅｒａ，Ｄ．Ｍ． Ｗｉｒｔｈ，Ａ． Ｃｈｅｎ，Ｍ． Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｋ． Ｐｏｋｏｒｓｋｉ，Ｎ．Ｆ． Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈ ｆｏｒｗａｒｄ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２０）．
Ｊ． Ｗａｎｇ，Ｚ． Ｌｕ，Ｍ．Ｇ． Ｗｉｅｎｔｊｅｓ，Ｊ．Ｌ． Ａｕ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ １２（４）（２０１０）４９２－５０３．
Ｍ． Ｄｕｒｙｍａｎｏｖ，Ｊ． Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｉｎｔｏ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｒｒｉｅｒｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９（２０１８）９７１．
Ａ． Ａｋｉｎｃ，Ｍ．Ａ． Ｍａｉｅｒ，Ｍ． Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｋ． Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ． Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｓ． Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ． Ａｎｓｅｌｌ，Ｘ． Ｄｕ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｐｅ，Ｔ．Ｄ． Ｍａｄｄｅｎ，Ｂ．Ｌ． Ｍｕｉ，Ｓ．Ｃ． Ｓｅｍｐｌｅ，Ｙ．Ｋ． Ｔａｍ，Ｍ． Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｄ． Ｗｉｔｚｉｇｍａｎｎ，Ｊ．Ａ． Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｒ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｌ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｔｈｅ Ｏｎｐａｔｔｒｏ ｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（１２）（２０１９）１０８４－１０８７．
Ａ．Ｃ． Ａｎｓｅｌｍｏ，Ｓ． Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ，Ｂｉｏｅｎｇ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（３）（２０１９）ｅ１０１４３．
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ；ｈｕｍａｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ；ａｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，２０１８．
Ｔ．Ｍ． Ａｌｌｅｎ，Ｃ． Ｈａｎｓｅｎ，Ｆ． Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ． Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ａ． Ｙａｕ－Ｙｏｕｎｇ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓｈｏｗ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０６６（１）（１９９１）２９－３６．
Ｏ．Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ，Ｙ．Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ａ．Ｐｒｉｅｖ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｒａｆｔｅｄ ＰＥＧ ｏｎ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｏｎ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ，Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ １３５（２）（２００５）１１７－２９．
Ｍ．Ｌ． Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ，Ｆ． Ｄｏｓｉｏ，Ｌ． Ｃａｔｔｅｌ，Ｓｔｅａｌｔｈ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ，ｒａｔｉｏｎａｌｅ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １（３）（２００６）２９７－３１５．
Ａ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｃ．Ｇ． Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ． Ｃｏｒｔｅｚ，Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｇ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２６７（１）（２０１０）９－２１．
Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｐｅ，Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５（７）（２０１７）１４６７－１４７５．
Ｍ．Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ｄｉｓｋｓ，ａｎｄ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｍｉｃｅｌｌｅｓ：ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇｅｌ ｐｈａｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８５（６）（２００３）３８３９－４７．
Ｋ．Ｋ． Ｇｉｌｌ，Ａ． Ｋａｄｄｏｕｍｉ，Ｓ． Ｎａｚｚａｌ，ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｓ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ：ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ２３（３）（２０１５）２２２－３１．
Ｋ． Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｔ． Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｕ．Ｓ． Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ａ． Ｆａｈｒ，Ｆａｓｔ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ－ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ２２（１）（２０１２）３１－４１．
Ｍ．Ａ． Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃ．Ｃ． Ｍｕｌｌｅｒ－Ｇｏｙｍａｎｎ，Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ－－ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５５（１）（２００３）１２５－３１．
Ａ．Ａ． Ｍｏｋｈｔａｒｉｅｈ，Ｊ． Ｌｅｅ，Ｓ． Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ． Ｌｅｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｓｉｍｐｌｙ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｉｘｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ １８６０（６）（２０１８）１３１８－１３２５．
Ｃ．Ｊａａｆａｒ－Ｍａａｌｅｊ，Ｒ．Ｄｉａｂ，Ｖ．Ａｎｄｒｉｅｕ，Ａ．Ｅｌａｉｓｓａｒｉ，Ｈ．Ｆｅｓｓｉ，Ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ２０（３）（２０１０）２２８－４３．
Ｉ．Ｖ． Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｎ． Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｉ． Ｈａｆｅｚ，Ａ．Ｋ． Ｌｅｕｎｇ，Ｊ． Ｈｕｆｔ，Ｃ． Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８（７）（２０１２）３６３３－４０．
Ｓ． Ｓａｂｎｉｓ，Ｅ．Ｓ． Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｔ． Ｓａｌｅｒｎｏ，Ｃ． Ｍｉｈａｉ，Ｔ． Ｋｅｔｏｖａ，Ｊ．Ｊ． Ｓｅｎｎ，Ａ． Ｌｙｎｎ，Ａ． Ｂｕｌｙｃｈｅｖ，Ｉ． ＭｃＦａｄｙｅｎ，Ｊ． Ｃｈａｎ，Ｏ． Ａｌｍａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ｇ． Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｋ．Ｅ． Ｂｅｎｅｎａｔｏ，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６（６）（２０１８）１５０９－１５１９．
Ｓ．Ｃ． Ｓｅｍｐｌｅ，Ａ． Ａｋｉｎｃ，Ｊ． Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｐ． Ｓａｎｄｈｕ，Ｂ．Ｌ． Ｍｕｉ，Ｃ．Ｋ． Ｃｈｏ，Ｄ．Ｗ． Ｓａｈ，Ｄ． Ｓｔｅｂｂｉｎｇ，Ｅ．Ｊ． Ｃｒｏｓｌｅｙ，Ｅ． Ｙａｗｏｒｓｋｉ，Ｉ．Ｍ． Ｈａｆｅｚ，Ｊ．Ｒ． Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ． Ｑｉｎ，Ｋ． Ｌａｍ，Ｋ．Ｇ． Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｆ． Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｂ． Ｊｅｆｆｓ，Ｌ． Ｎｅｃｈｅｖ，Ｍ．Ｌ． Ｅｉｓｅｎｈａｒｄｔ，Ｍ． Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ． Ｋａｚｅｍ，Ｍ．Ａ． Ｍａｉｅｒ，Ｍ． Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌｕ，Ｍ．Ｊ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｑ． Ｃｈｅｎ，Ｒ． Ａｌｖａｒｅｚ，Ｓ．Ａ． Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ． Ｄｅ，Ｓ．Ｋ． Ｋｌｉｍｕｋ，Ｔ． Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｖ． Ｋｏｓｏｖｒａｓｔｉ，Ｗ．Ｌ． Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｙ．Ｋ． Ｔａｍ，Ｍ． Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ａ． Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｍ．Ａ． Ｔｒａｃｙ，Ａ． ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｉ． ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｔ．Ｄ． Ｍａｄｄｅｎ，Ｍ．Ｊ． Ｈｏｐｅ，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（２）（２０１０）１７２－６．
Ｎ．Ｍ． Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｊ． Ｈｕｆｔ，Ｐ．Ｊ． Ｌｉｎ，Ｓ． Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｋ． Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｊ． Ｌｅａｖｅｒ，Ａ．Ｗ． Ｗｉｌｄ，Ｊ．Ｂ． Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ． Ｔａｙｌｏｒ，Ｙ．Ｋ． Ｔａｍ，Ｃ．Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １（２０１２）ｅ３７．
Ｄ．ｖａｎ Ｓｗａａｙ，Ａ．ｄｅＭｅｌｌｏ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３（５）（２０１３）７５２－６７．
Ｅ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈｙｏｄｏ，Ｎ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ａｓａｋａｗａ，Ｄｉｒｅｃｔ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｏｎ－ｌｉｎｅ ＳＰＥ－ＳＰＥ－ＨＰＬＣ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７９（３０）（２０１１）３６２０－５．
Ｌ．Ｌｉ，Ｊ．Ｐ．Ｆｏｌｅｙ，Ｒ．Ｈｅｌｍｙ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｏｎ－ｐａｉｒ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １６０１（２０１９）１４５－１５４．
【図1A-B】
【図1C-D】
【図1E-F】
【図2】
【図3A-B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A-B】
【図6C】
【図7A】
【図7B-D】
【図7E】
【図8A-B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A-B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D-E】
【図13F-G】
【図13H】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C-E】
【図16A-F】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】