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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】乳様生成物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20241106BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/36 20150101ALI20241106BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 A
C12N5/071
C12N5/10
A61P3/02
A61P43/00
A61K35/36
C07K14/62
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524437
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-20
(86)【国際出願番号】 EP2022080115
(87)【国際公開番号】W WO2023073119
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】21205094.2
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(74)【代理人】
【識別番号】100200540
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 祐子
(72)【発明者】
【氏名】ハラー， コリンヌ
(72)【発明者】
【氏名】シャンブリン， ブリス
(72)【発明者】
【氏名】ビアンキ， アリアナ
(72)【発明者】
【氏名】マシンチアン， オミッド
(72)【発明者】
【氏名】クラウス， マリン
(72)【発明者】
【氏名】デスタイラッツ， フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】ヤート， ルシール
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC21
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB23
4B065BC41
4B065BC46
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB39
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZC51
4C087ZC80
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA37
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を製造するための方法であって、哺乳動物乳腺上皮細胞、例えばヒト乳腺上皮細胞に由来するラクトサイトを生成することと、並びに、ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を発現させることと、を含む方法。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む方法。
【請求項2】
ステップＡ）の持続時間が、１４日以下であり、任意選択で１４日間である、請求項２に記載の方法。
【請求項3】
ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、任意選択でＫＲＴ－１８及びＥＲから選択される、１つ又は複数の乳腺陽性細胞マーカーを発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後に１つ以上の乳生物活性マーカーのｍＲＮＡ発現が増加している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後にＬＴＦのｍＲＮＡ発現が増加している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後にＭＦＧＥ８のｍＲＮＡ発現が増加している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記培養培地が、適切な３次元培養系における、例えば三次元懸濁条件における、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステップＡ）が更に、ｉ）前記乳腺上皮細胞を培養すること、及び
ｉｉ）乳タンパク質の発現を誘導すること、を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ステップＡのｉ）が、７日間以下であり、任意選択で７日間である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップＡのｉｉ）が、７日間以下であり、任意選択で７日間である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
ステップＡ）が更に、ｉ）前記乳腺上皮細胞を、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）前記細胞を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ステップＡ）が更に、ｉ）前記乳腺上皮細胞を、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記乳様生成物を更に処理して、調整哺乳動物乳様生成物を生成するステップＣ）を任意選択で含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記乳腺上皮細胞が、ヒト乳腺上皮細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１４の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物。
【請求項16】
治療に使用するための、請求項１５に記載のヒト乳様生成物。
【請求項17】
請求項１５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての、任意選択で母乳代替物としての、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物乳様生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えばヒト乳様生成物をインビトロで製造するための方法であって、哺乳動物乳腺上皮細胞、例えばヒト乳腺上皮細胞に由来するラクトサイトを、並びに／又は、かかるラクトサイトを含む乳腺様腺オルガノイドを、培養及び分化を介して生成することと、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドから哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を発現させることと、を含む方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えば、かかる方法から得ることができるヒト乳様生成物に関する。
【0002】
［背景技術］
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、増殖／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、増殖／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
【0003】
今日、ヒト乳の唯一の供給源は、ヒトドナー（授乳中の母親）である。献乳は、非商業的使用（ヒト乳バイオバンク）及び商業的使用について報告されている。しかしながら、献乳は限られており、強い規制、安全性、及び時には倫理的又は宗教的制約を伴う。
【0004】
哺乳動物の乳、特にヒト乳中には幹細胞が見出されており、ヒト母乳幹細胞（ＨＢｓＣ）と呼ばれている。ｈＢＳＣは、高度に可塑性であり、培養において複数の細胞種に分化し、より重要なことには、ヒト乳腺の小葉－腺房（ｌｏｂｕｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ）構造を形成するのに必要な３つの系統に分化することが示されている（Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２）。しかしながら、ヒト母乳を製造させるためのｈＢＳＣの使用は、ヒトドナーを必要とするため、実用的でもなく、持続可能でもない。
【0005】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる、幹細胞機能を有する細胞株をベースとした技術が知られている。ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）からヒト乳腺様オルガノイド（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）を生成するための信頼できる２ステッププロトコルが開発されている（Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ，２０１７）。
【0006】
したがって、本発明の目的は、乳腺細胞を製造するための代替的かつ改善された方法であって、初期段階の未分化幹細胞を使用することなく、培養細胞において哺乳動物乳、例えばヒト乳の発現を再現する方法を提供することである。また、本発明の目的は、レシピエントの特異的なニーズに適合させることができる培養細胞において、カスタマイズされた哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を調製すること、及び／又は、やはり幹細胞を使用せずに、乳幼児期栄養のための既存のウシベースのソリューションを補完するためのヒト乳生物活性物質を製造することである。
【0007】
［発明の概要］
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書中で提供されるのは、哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む、方法である。
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書中で提供されるのは、哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む、方法である。
【0008】
本明細書中に記載の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物も、本明細書で提供される。
【0009】
治療に使用するための、本明細書中に記載の方法によるヒト乳様生成物も、本明細書で提供される。
【0010】
本明細書中に記載の方法によるヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての使用も、本明細書で提供される。
【0011】
［発明を実施するための形態］
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
【0012】
本発明の文脈において、「哺乳動物」という用語は、哺乳動物種、例えばヒト、ウシ、サル、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどに属する動物を指す。
【0013】
本発明の文脈において、用語「ラクトサイト」又は「乳腺様細胞」は、ＣＫ１８細胞マーカーを発現し、哺乳動物乳腺上皮細胞に由来し、特にヒト乳腺上皮細胞に由来する、分泌上皮細胞を指す。本明細書中で使用されるヒト乳腺上皮細胞は、市販されており、任意の適切な細胞株から選択され得る。本発明の文脈における適切なヒト乳腺上皮細胞株は、例えば、ＭＣＦ－１０などの非腫瘍形成性細胞株であるか、又はＭＣＦ－７などの腫瘍形成性細胞株であり得る。
【0014】
本発明の文脈において、「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｌｉｋｅ）オルガノイド」又は「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ）オルガノイド」という用語は、二次元又は三次元（２Ｄ／３Ｄ）で発達し、上記で定義されたようなラクトサイトを含む、乳腺のミニチュア化及び単純化されたバージョンを意味する。
【0015】
本発明の文脈において、「ヒト乳様生成物」という用語は、細胞培養した乳生成物である。かかる生成物は、本発明の方法に従って生成されたラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドによって発現される食用生成物である。
【0016】
本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分（例えば、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素並びにそれらのレベルの観点による）を有することができる。これを本明細書では「標準ヒト乳生成物」と称する。あるいは、本発明による「ヒト乳様生成物」は栄養状態の良好な母親のヒト母乳に天然に見られるものとは異なる成分比及び成分濃度を有し得る。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然には見出されない成分を含むように調整することができる（「調整（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）乳様生成物」）。ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ヒト母乳代替物（又は代用物）、ならびに生物活性物質の１つ及び／又は一部のみに富んだ原材料、栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素からなる群から選択される。
【0017】
「ヒト乳様生成物」は、自然に分泌される乳を摂取する代わりに使用することができる（「ヒト乳代替物」）。乳代替生成物は、天然に分泌された乳と組み合わせて摂取されるサプリメント（「ヒト乳サプリメント」）又は強化剤（「ヒト乳強化剤」）として使用することができる。
【0018】
一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、少なくとも、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素を含む。一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、少なくとも１つの生物活性物質も含む。本発明による標準ヒト乳様生成物は、天然に生じるヒト母乳分泌物ではない。
【0019】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、それを受ける乳児の具体的なニーズに適合させることができる。本発明によるヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部を含み得る。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「非標準ヒト乳様生成物」という用語で称されることもある。一実施形態では、本発明による非標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物（ヒト乳オリゴ糖を含む）、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール、Ｌ－カルニチン、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、１つ以上の栄養素又は生物活性物質を含む。
【0020】
本発明の文脈において、「無調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されていない、ヒト乳様生成物を示す。無調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物のいずれをも含み得る。非標準ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ならびに栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料からなる群から選択される。
【0021】
本発明の文脈において、「調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されている、ヒト乳様生成物を示す。
【0022】
調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物のいずれをも含み得る。
【0023】
本発明の文脈において、「ＥＢ」という用語は、「胚様体」を意味する。
【0024】
本発明の文脈において、「ｍＥＢ」という用語は、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体」を意味する。
【0025】
ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、基礎培地、少なくとも１種類の増殖サプリメント、ヘパリン及びヒドロコルチゾンを含む、無血清培養培地を指す。
【0026】
本発明の文脈において、「胚様体（ＥＢ）」、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体（ｍＥＢ）」、「マンモスフェア」及び／又は「スフェロイド」という用語は、本発明の方法のステップＡ）下で懸濁液中に形成された三次元凝集体を指す。
【0027】
本発明の文脈における「乳児」という用語は、１２ヶ月齢未満、例えば９ヶ月齢未満、特に６ヶ月齢未満の小児を指す。
【0028】
本発明の文脈において、乳児は、正期産児又は早期産児のいずれかであり得る。本発明の一実施形態では、乳児は、早期産児及び正期産児の群から選択される。
【0029】
用語「正期産児」は、正期産又は３７週以上の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0030】
用語「早期産児」は、３７週未満の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0031】
本発明の文脈において、「出生時体重」という用語は、出生後に胎児又は新生児が獲得していた最初の体重を意味する。
【0032】
本発明の文脈において、「低出生体重」という用語は、２５００ｇ未満（２４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0033】
本発明の文脈において、「極低出生時体重」という用語は、１５００ｇ未満（１４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0034】
本発明の文脈において、「超低出生時体重」という用語は、１０００ｇ未満（９９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0035】
用語「在胎不当過小児」は、在胎期間別成長チャート（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒｔ）の出生時体重に対する平均基準よりも２標準偏差を超えて低い出生時体重を有する乳児、又は同じ在胎齢の乳児から得られた集団ベースの体重データの１０ｔｈパーセンタイル未満の出生時体重を有する乳児を指す。「在胎不当過小児」という用語には、構造的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）もしくは遺伝的起源のいずれかにより、又は子宮内発育遅延の結果として、出生時に小さい乳児が含まれる。
【0036】
本発明の文脈において、「幼児（ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」又は「低年齢の小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）」という用語は、１～３歳の小児を示す。
【0037】
本明細書で使用される「乳児用フォーミュラ」という用語は、乳児を対象とし、Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）、及びＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）に定義されている乳児用特別用途食品（特別医療目的用食品を含む）に定義されている栄養組成物を指す。乳児用フォーミュラはまた、出生後１ケ月の間の乳児の特定の栄養補給用途を意図する食品であって、当該フォーミュラそのものによって、このカテゴリーに該当する乳児の栄養要件（乳児用フォーミュラ及びフォローオンフォーミュラに対する、Ａｒｔｉｃｌｅ ２（ｃ）ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９１／３２１／ＥＥＣ ２００６／１４１／ＥＣ ｏｆ ２２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６）を満たす、食品を指す。乳児用フォーミュラは、スターター乳児用フォーミュラ及びフォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラを包含する。一般に、スターターフォーミュラは、出生時からの乳児のための母乳代替物であり、フォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラは６ヶ月以降のためのものである。
【0038】
「グローイングアップミルク」（又はＧＵＭ）は、１年目以降から与えられる。このミルクは、概して、特に小児の栄養必要量に合わせて調整された乳系飲料である。かかる飲料は、他の食品と組み合わせて１２ヶ月齢から２～３歳の小児に与えるために使用される栄養組成物である。
【0039】
本発明の文脈において、「強化剤」という用語は、乳児又は幼児に対して栄養上の利益を有する１つ以上の栄養素を含む組成物を指す。
【0040】
「乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳のいずれかを強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。したがって、本発明のヒト乳強化剤は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳に溶解させた後に投与することができ、あるいは独立した組成物として投与することができる。
【0041】
独立した組成物として投与される場合、本発明のヒト乳強化剤は、「サプリメント」であると特定することもできる。一実施形態では、本発明の乳強化剤はサプリメントである。
【0042】
「ヒト乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳を強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。本発明による「ヒト乳強化剤」は、極低出生時体重（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＶＬＢＷ）又は超低出生時体重（ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＥＬＢＷ）を有する早産で生まれた乳児に投与されることが意図され得る。
【0043】
本発明による乳強化剤は、液体形態の粉末であってもよい。
【0044】
液体形態を有する乳強化剤組成物は、いくつかの特定の利点を示す。例えば、液体製剤は、特定の重量又は体積の較正された液滴を送達する包装と組み合わせられる場合、より便利であり得る。
【0045】
更に、液体製剤は強化される組成物と混合するのがより容易であるが、粉末製剤は場合によっては塊を形成することがある。
【0046】
本明細書におけるＥｐｉＣｕｌｔ培地又はＥｐｉＣｕｌｔＢ培地への言及は、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを含む無血清培養培地を指す。
【0047】
本明細書中に開示される培養培地は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の成長及び分化を支援するように設計された、必須栄養素を含む固体、半固体又は液体を指す。ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、本発明において使用され得る培養培地の一例である。
【0048】
本発明による方法及び使用
本発明は、特定の条件下で培養される哺乳動物上皮細胞を使用して乳腺細胞を製造する方法、及び該乳腺細胞を使用して哺乳動物乳様生成物をインビトロで製造する方法に関する。
本発明は、特定の条件下で培養される哺乳動物上皮細胞を使用して乳腺細胞を製造する方法、及び該乳腺細胞を使用して哺乳動物乳様生成物をインビトロで製造する方法に関する。
【0049】
驚くべきことに、本発明では、哺乳動物乳様生成物を製造するためのプロトコルにおいて、乳腺上皮細胞を開始材料として使用できることが実証された。乳腺上皮細胞を開始材料として使用することは、例えば、初期段階の未分化幹細胞から乳腺上皮細胞を最初に製造するための複雑な分化プロトコルの必要がないことを意味する。このような必要がないことは、幹細胞プロトコルと比較して、哺乳動物乳様生成物を製造するための方法の全体の時間を短縮し、費用を節約するという利益を有する。
【0050】
したがって、本発明は、哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む方法、に関する。
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む方法、に関する。
【0051】
哺乳動物乳様生成物の製造
本発明は、本明細書で定義されるようなステップＡ）及びステップＢ）のいずれか、ならびに本明細書で定義されるような任意のステップＣ）を含む、明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法に関する。
本発明は、本明細書で定義されるようなステップＡ）及びステップＢ）のいずれか、ならびに本明細書で定義されるような任意のステップＣ）を含む、明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法に関する。
【0052】
ステップＡ ラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドを生成するステップ
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
【0053】
この生成には、乳腺上皮細胞を成長及び成熟させて乳腺様オルガノイド（例えば、ラクトサイト）を製造することが含まれる。
【0054】
本明細書に開示される方法では、乳腺上皮細胞が開始材料として使用され、すなわち、上皮細胞の培養が本方法の第１のステップである。
【0055】
乳腺上皮細胞の成長及び成熟は、特定の培養培地、例えば完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で乳腺上皮細胞を培養することによって生じる。完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、好ましくは、基礎培地、増殖サプリメント、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）から構成される。培地は通常３日毎に交換される。次いで、前記ステップで得られたｍＥＢ（マンモスフェア）を非神経外胚葉細胞に富ませる。
【0056】
いくつかの実施形態では、成長及び成熟段階は、０日目～７日目であり、０日目は、乳腺上皮細胞が初めて培養培地に添加される時点である。いくつかの実施形態では、成長及び成熟段階は、７日間である。いくつかの実施形態では、成長及び成熟段階は、７日間以下である。
【0057】
成長及び成熟段階の後、細胞は、乳タンパク質の発現を誘導される。いくつかの実施形態では、誘導期間は、７日間～１４日間である。いくつかの実施形態では、誘導期間は、７日間である。いくつかの実施形態では、誘導期間は、７日間以下である。
【0058】
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が、
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でヒト乳腺上皮細胞を培養して、７日後、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でヒト乳腺上皮細胞を培養して、７日後、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
【0059】
別の実施形態では、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が、
ｉ）非接着条件下で、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でヒト乳腺上皮細胞を少なくとも７日間培養して、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
ｉ）非接着条件下で、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でヒト乳腺上皮細胞を少なくとも７日間培養して、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
【0060】
一実施形態では、本発明による方法は、ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト乳腺上皮細胞に由来するラクトサイトを生成するように調節した、ステップＡ）による培養条件を提供する。
【0061】
好ましい実施形態では、ヒト乳代用生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含む方法が提供され、かかるステップＡ）は、本明細書中に記載される適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において乳腺上皮細胞を成長及び成熟させて乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも７日間。いくつかの実施形態では、７日間以下。
【0062】
別の好ましい実施形態では、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が、
ｉ）乳腺上皮細胞を、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、少なくとも７日間（０日～７日間）培養して、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
ｉ）乳腺上皮細胞を、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、少なくとも７日間（０日～７日間）培養して、ラクトサイトを生成することを含む、方法が提供される。
【0063】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヒト乳様生成物を製造する方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含み、その際、
ｉ）基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、７日間にわたって（０日～７日）乳腺上皮細胞を培養すること、及び
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で細胞を７日間（７日～１４日）インキュベーションすることにより乳タンパク質の発現を誘導すること、を含む、方法が提供される。
ｉ）基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、７日間にわたって（０日～７日）乳腺上皮細胞を培養すること、及び
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で細胞を７日間（７日～１４日）インキュベーションすることにより乳タンパク質の発現を誘導すること、を含む、方法が提供される。
【0064】
ステップｉｉ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様腺オルガノイドへの分化をもたらす。
【0065】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、ヒト乳様生成物を製造する方法であって、ステップＡ）下でヒト乳腺上皮細胞からラクトサイトを生成することを含み、その際、
ｉ）ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で、乳腺上皮細胞を、本明細書中に記載されるように７日間（０日～７日）培養すること、及び
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で細胞を７日間（７日～１４日）インキュベーションすることにより乳タンパク質の発現を誘導すること、を含む、方法が提供される。
ｉ）ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で、乳腺上皮細胞を、本明細書中に記載されるように７日間（０日～７日）培養すること、及び
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で細胞を７日間（７日～１４日）インキュベーションすることにより乳タンパク質の発現を誘導すること、を含む、方法が提供される。
【0066】
ステップｉｉ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様腺オルガノイドへの分化をもたらす。
【0067】
一実施形態では、特に好ましい実施形態について上記で定義されたステップｉｉ）は、好ましくは、少なくとも乳房細胞、管腔細胞、及び基底細胞への形成／分化をもたらす。これに関連して、乳房細胞は、好ましくは、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、管腔細胞は、好ましくは、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、基底細胞は、好ましくは、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される、１つ又は複数のマーカーを発現する。
【0068】
さらなる一実施形態では、特に好ましい実施形態について上で定義したステップｉｉ）の後に、β－カゼイン、乳タンパク質及びホルモン受容体からなる群から選択される、１つ又は複数のマーカーを発現する乳腺様オルガノイド、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、ＣＫ１８からなる群から選択される、１つ又は複数のマーカーを発現する管腔細胞、ならびにＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される、１つ又は複数のマーカーを発現する基底細胞を得ることができる。
【0069】
本発明の一実施形態では、上記の方法は、ヒト乳様生成物を製造するために提供される。
【0070】
（ステップＡの）一実施形態では、栄養素及び生体模倣刺激の送達は、細胞成長、分化、及び組織形成に影響を及ぼすように制御される。（ステップＡの）一実施形態では、かかる制御は、バイオリアクター内で行われる。
【0071】
いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、乳腺特異的マーカーの高発現を有する。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、ケラチン１８（ＫＲＴ－１８）を発現する。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、エストロゲン受容体（ＥＲ）を発現する。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、５９％を超えるＫＲＴ－１８及びＥＲをエストロゲン受容体陽性管腔乳腺集団として発現する。
【0072】
いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、重要な乳生物活性物質の高発現を有する。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、重要な乳生物活性物質の発現が増加している。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、誘導前（例えば７日目）と比較して誘導後（例えば１４日目）に、重要な乳生物活性物質の発現が増加している。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、誘導前と比較して誘導後にラクトフェリン（ＬＴＦ）のｍＲＮＡ発現が増加している。いくつかの態様では、ステップＡに由来する乳腺様腺オルガノイド又はラクトサイトは、誘導前と比較して誘導後にＭＦＧＥ８（ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８）のｍＲＮＡ発現が増加している。
【0073】
本明細書に開示される任意の方法又は方法ステップは、支持体として膜マトリックスを使用するのではなく、三次元懸濁培養において行われ得ることが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、全ての分化手順の間、細胞は懸濁培養で維持される。
【0074】
ステップＢ ヒト母乳様生成物の発現
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡに従って調製される、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させることを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡに従って調製される、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させることを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
【0075】
一実施形態では、泌乳期のラクトサイトは、催乳（ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ）因子（例えば、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びインスリン）を添加した特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって誘導される。
【0076】
特に、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質又はオリゴ糖、好ましくはヒト乳オリゴ糖などを含むか又はそれらからなる群から選択されるヒト乳の生物活性物質を含有する。本発明者らは、特に、上記で実施されたステップＡのｉ）～ｉｖ）による特に好ましいプロトコルを用いて、とりわけ、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含む７つが検出）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含む、７５が検出）を同定することに成功した。
【0077】
一実施形態では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、オリゴ糖、脂質、タンパク質、エキソソーム及びｍｉＲＮＡを含むか又はそれらからなる群から選択される、ヒト乳の生物活性物質を含有する。
【0078】
別の態様では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、ラクトース、６’ＳＬ、Ｃ－４：０脂肪酸、Ｃ－８：０脂肪酸、Ｃ－１０：０脂肪酸、Ｃ－１４：０脂肪酸、Ｃ－１５：０脂肪酸、Ｃ－１６：０脂肪酸、Ｃ－１６：１ｎ７脂肪酸、Ｃ－１７：０脂肪酸、Ｃ－１８：０脂肪酸、Ｃ－１８：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：１脂肪酸、Ｃ－１８：２ ｎ６脂肪酸、Ｃ－２０：０脂肪酸、Ｃ－２０：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：３ ｎ３脂肪酸、Ｃ－２２：０脂肪酸、ラクトフェリン、アルブミン、プロラクチン、アルファＳ１－カゼイン、ヘモグロビンサブユニットベータ、ヘモグロビンサブユニットアルファ、α－ラクトアルブミン、アルファ－２－マクログロブリン、β－カゼイン、胆汁酸塩活性化リパーゼ、κ－カゼイン、ラクトアドヘリン、ＣＤ１４、脂肪酸シンターゼ、ＩｇＡ、ｐＩｇＲ、血清アルブミン、キサンチンデヒドロゲナーゼ、エキソソーム、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ及びｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐを含むか又はそれらからなる群から選択されるヒト乳生物活性物質を含む。
【0079】
本発明の一実施形態では、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、標準ヒト乳生成物である。本発明の別の実施形態では、ヒト乳腺上皮細胞に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、非標準ヒト乳生成物である。
【0080】
ステップＣ 調整ヒト母乳様生成物を製造するためのさらなる処理
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
【0081】
特定の一実施形態では、本発明のヒト母乳様生成物に対して行われる追加の処理ステップＣ）は、精製ステップ、単離プロセス、抽出プロセス、分画ステップ、富化プロセス、酵素処理、さらなる成分（例えば、ヒト乳腺オルガノイドによって発現され得ないもの（例えば、免疫グロブリン、プロバイオティクス及び／又はミネラルなど））の添加又はそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【0082】
ヒト乳様生成物
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
【0083】
母乳育児の利点は科学文献において周知であり、ヒト母乳様生成物へのアクセスが可能になることで、かかる生成物を多くの同様に周知の健康上の利点のために使用可能になる。
【0084】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、実際の授乳が不可能な状況下で、母乳代替物として使用することができる。
【0085】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、例えば、泌乳が少ない女性、又は出産の６ヶ月後に泌乳しなくなった女性の授乳経験がより長期間になるよう支援するために使用されることが意図される。
【0086】
同様に、ヒト母乳様生成物は、例えば、病気により母親からの実際の授乳が損なわれる状況下であっても、授乳を可能にするために使用されることが意図される。
【0087】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、母乳の産生が自然に開始されない状況、例えば乳児を養子とした場合に使用されることが意図される。
【0088】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、天然に生じるとおりのヒト母乳授乳期の生成物ではない。
【0089】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に最適な栄養を提供する際に使用するためのものである。
【0090】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に健康な発育を提供する際に使用するためのものである。
【0091】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、幼児における感染、肥満の予防及び免疫発達の促進に使用するためのものである。
【0092】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、無調整ヒト母乳様生成物である。
【0093】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、調整ヒト母乳様生成物である。
【0094】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン及びミネラルを含む。
【0095】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル及び生物活性物質を含む。
【0096】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。
【0097】
さらなる実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物はまた、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群において選択される、少なくとも１つの生物活性物質を含む。
【0098】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。
【0099】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、プロバイオティクスを含有する。
【0100】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、いくつかの商業的に入手可能な供給源から得ることができるプロバイオティクス（例えば、Ｂ．ラクティス（Ｂ．Ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．Ｒａｍｎｈｏｓｕｓ））を含有させることにより、本発明の方法に従い調製され得る。
【0101】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0102】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、分泌型ＩｇＡ及びプロバイオティクスを含有する。
【0103】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５６３０１号及び国際公開第２００９／１５６３６７号に記載されているように調製することができるプロバイオティクスと分泌型ＩｇＡとの組合せを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製することができる。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、免疫グロブリンの欠乏を予防するために、及び／又は乳児及び幼児における再発感染の予防において使用され得る。
【0104】
「非標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
【0105】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、乳強化剤、サプリメント、及び／又は特別な目的に適合させたヒト母乳代用物からなる群から選択され得る。
【0106】
ヒト乳強化剤及びヒト乳生物活性サプリメント
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
【0107】
別の実施形態では、本発明の方法は、必要に応じて乳児又は幼児のためのサプリメントとして使用され得るヒト母乳様生成物を提供する。
【0108】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、健康な発育を提供するために、及び／又は、乳児又は幼児における特定の状態（例えば、ぜんそく、アレルギー、認知変化など）に典型的に関連する病気を発症するリスクを低減するために、及び／又は、発育、免疫力の発達、感染からの保護を促進するために、使用され得る。
【0109】
注目すべきことに、かかる強化剤又はサプリメント中の成分（特に生物活性成分）がヒト起源であることは、それらが本発明の方法によるものであるという事実と相まって、かかる成分にそのままの（ｉｎｔａｃｔ）又はより高い機能性を提供すると考えられる。
【0110】
ヒト母乳様生成物は、好ましくは強化剤としての使用が意図される。かかるヒト母乳様生成物は、強化剤としての使用が意図され、例えば、ステップＢ）から得ることができるヒト母乳様生成物からの（特定の）生物活性物質の単離及び／又は富化のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0111】
サプリメントとしての使用が意図されるヒト母乳様生成物は、ヒト乳オリゴ糖（例えば、２ ＦＬ、３ ＦＬ、ＬＮＴ、ＬｎＮＴ、ＤｉＦｌ、６ＳＬ及び／又は３ＳＬ）、脂質、増殖／成長因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子）、サイトカイン（例えば、形質転換増殖因子－β２（ＴＧＦβ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）、ＴＮＦ－α）、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、マイクロＲＮＡを含むエキソソーム、及び抗菌／保護の生物活性物質（例えば、ＩｇＡ、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトアドヘリン）からなる群から選択される、１つ以上の生物活性物質を含み得る。サプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物から生物活性物質を単離するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0112】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フコシル化ヒト乳オリゴ糖、例えば２ＦＬ及び／又は３ＦＬを含有するサプリメント又は乳強化剤である。かかるサプリメント又は乳強化剤は、ＦＵＴ２遺伝子が不活性であることに起因してフコシル化オリゴ糖を分泌しない女性のヒト母乳のプロファイルを充足させる際に使用するためのものである。
【0113】
強化剤又はサプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物からフコシル化オリゴ糖（例えば、２ＦＬ及び／又は３ＦＬ）を単離及び／又は富ませるステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。
【0114】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0115】
遺伝的疾患を有する乳児のためのヒト母乳様生成物
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
【0116】
ガラクトース血症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
【0117】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドを除去されるべきである。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0118】
一実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得られる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（ラクターゼ処理）のステップＣ）、又は膜分画及び限外濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得られ得る。
【0119】
フェニルケトン尿症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
【0120】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニンを除かれる（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）か又は枯渇されるべきである。
【0121】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ＰＫＵに罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0122】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニン含量がそれを受ける対象の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ未満に維持されるようにフェニルアラニンが枯渇している。
【0123】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇又は除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得られる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0124】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得られる無調整ヒト母乳様生成物の酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0125】
別の実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）において、限定量又はゼロ量のフェニルアラニンを提供する培養培地（例えば、乳清由来のグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を含有する培養培地など）を提供することによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0126】
本発明の追加的な実施形態
次のものが提供される：
次のものが提供される：
【0127】
Ｓ１． 哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む方法。
Ａ）乳腺上皮細胞を培養培地中で培養して、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）該ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含む方法。
【0128】
Ｓ２． ステップＡ）の持続時間が、１４日以下であり、任意選択で１４日間である、ステートメント２に記載の方法。
【0129】
Ｓ３． ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、ＫＲＴ－１８及びＥＲから任意選択で選択される、１つ又は複数の乳腺陽性細胞マーカーを発現する、ステートメント１又は２に記載の方法。
【0130】
Ｓ４． ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後に１つ以上の乳生物活性マーカーのｍＲＮＡ発現が増加している、ステートメント１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0131】
Ｓ５． ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後にＬＴＦのｍＲＮＡ発現が増加している、ステートメント１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0132】
Ｓ６． ステップＡ）からの前記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドが、誘導前と比較して誘導後にＭＦＧＥ８のｍＲＮＡ発現が増加している、ステートメント１～５のいずれか１つに記載の方法。
【0133】
Ｓ７． 前記培養培地が、適切な三次元培養系における、例えば、三次元懸濁条件における、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地である、ステートメント１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0134】
Ｓ８． ステップＡ）が更に、
ｉ）前記乳腺上皮細胞を培養すること、及び
ｉｉ）乳タンパク質発現を誘導すること、を含む、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
ｉ）前記乳腺上皮細胞を培養すること、及び
ｉｉ）乳タンパク質発現を誘導すること、を含む、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
Ｓ９． ステップＡのｉ）が、７日間以下であり、任意選択で７日間である、ステートメント８に記載の方法。
【0136】
Ｓ１０． ステップＡｉｉ）が、７日間以下であり、任意選択で７日間である、ステートメント８又は９に記載の方法。
【0137】
Ｓ１１． ステップＡ）が、
ｉ）前記乳腺上皮細胞を、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）細胞を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含むステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
ｉ）前記乳腺上皮細胞を、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）細胞を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含むステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0138】
Ｓ１２． ステップＡ）が、
ｉ）前記乳腺上皮細胞を、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）前記細胞を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含むステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
ｉ）前記乳腺上皮細胞を、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で７日間培養することと、
ｉｉ）前記細胞を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間インキュベーションすることによって乳タンパク質発現を誘導することと、を含むステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0139】
Ｓ１３． 乳様生成物を更に処理して、調整哺乳動物乳様生成物を生成するステップＣ）を任意選択で含む、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
Ｓ１４． 乳腺上皮細胞が、ヒト乳腺上皮細胞である、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0141】
Ｓ１５． ステートメント１４の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物。
【0142】
Ｓ１６． 治療に使用するための、ステートメント１５に記載のヒト乳様生成物。
【0143】
Ｓ１７． ステートメント１５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての、使用。
【0144】
本明細書に開示するとおりの詳細な説明の様々な態様及び実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するものであり、請求項及び詳細な説明と共に考慮するにあたり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の態様及び実施形態に由来する特徴を、本発明の同じ又は異なる態様及び実施形態に由来する更なる特徴と組み合わせてもよいことも理解されたい。
【0145】
発明を実施するための形態及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、別段の指示が文脈上明確にない限り、複数の参照物も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0146】
【図1】Ｙｉｎｇ Ｑｕに概説され、本発明の方法のステップＡ）における１つの代替法に適用されるプロトコルによるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図2】ステップＡ）によるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図3】図２の方法に従って製造されたｈｉＰＳＣの三次元器官型培養が、乳腺特異化に対して高度に許容的であることを示す。三次元分化（４２日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲマーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図4】比較例として製造された、ｈｉＰＳＣの二次元器官培養を示す。二次元分化（３１日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲＮＡ発現を示す。マーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図5】乳腺上皮細胞の三次元（３Ｄ）培養における泌乳誘導を示す。ａは、乳腺上皮細胞の培養プロトコル及び泌乳誘導の概略図である（Ｄ７～１４）。ｂは、乳腺上皮細胞培養物の成長期中の乳腺マーカーケラチン１８及びエストロゲン受容体の、フローサイトメトリーによる解析を示す。ｃは、成長期（７日目）中及び泌乳誘導期（１４日目）中のヒトラクトフェリン（ＬＴＦ）及び乳脂肪球－ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）／ラクトアドヘリンのＲＮＡ発現（ΔＣｔ）レベルである。パネル提示にはΔＣｔ法を使用し、候補参照遺伝子の相対発現に基づいて平均標準偏差（ＳＤ）を計算することによって、ＬＴＦ遺伝子及びＭＦＧＥ８遺伝子をランク付けする。記載の遺伝子のうち最も低いＳＤを有する遺伝子を、最も安定な又は最も発現された遺伝子として同定した。
【図6】遺伝子発現プロファイリングにＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術を使用して、乳腺上皮細胞における様々な乳腺上皮マーカーの発現を示す（ａ～ｈ）。
【0147】
実験
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
【0148】
実施例２
ｈｉＰＳＣの培養及び３Ｄ－ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
ｈｉＰＳＣの培養及び３Ｄ－ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
【0149】
実施例３
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１． ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
２． ＥＢに由来する細胞の付着凝集体（ＥＢ）のビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（抗生物質－抗真菌剤溶液）を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
３． 少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において３次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４． ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１． ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
２． ＥＢに由来する細胞の付着凝集体（ＥＢ）のビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（抗生物質－抗真菌剤溶液）を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
３． 少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において３次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４． ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
【0150】
実施例４
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
（ｉ）三次元分化プロトコル（本発明による）のために、ｈｉＰＳＣの単一細胞を、１０ｕＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、９５ｒｐｍで回転させながら一晩インキュベーションすることによって、ＥＢ（スフェロイド）を形成させた。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
（ｉｉ）分化後、Ｍａｍｍｏ２培地（ＥｐｉＣｕｌｔＢ＋サプリメント、ＰＴＨｒＰ １００ｎｇ／ｍｌ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）中で５日間培養した。培養培地を３日毎（１０日目～１５日目）に交換した。
（ｉｉｉ）上皮構造の枝分かれ、肺胞分化及び乳腺特異化を誘導するために、ｍＥＢｓ（スフェロイド／マンモスフェア）にＭａｍｍｏ３培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びペニシリン／ストレプトマイシン）を２０日間フィードした。培地を３日毎に交換した（１５日目～３５日目）。
（ｉｖ）最後に、乳生物活性物質製造（３Ｄ）を誘導するために、Ｍａｍｍｏ４培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、１０％ＦＢＳ、プロラクチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン、β－エストラジオール及びペニシリン／ストレプトマイシン）を７日間使用し、培地を３日毎に交換した（３５日目～４２日目）。全ての分化手順の間、スフェロイドを懸濁培養で維持した（９５ｒｐｍで回転）。分化手順は４２日目に終了した。結果を図３に表す。
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
（ｉ）三次元分化プロトコル（本発明による）のために、ｈｉＰＳＣの単一細胞を、１０ｕＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、９５ｒｐｍで回転させながら一晩インキュベーションすることによって、ＥＢ（スフェロイド）を形成させた。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
（ｉｉ）分化後、Ｍａｍｍｏ２培地（ＥｐｉＣｕｌｔＢ＋サプリメント、ＰＴＨｒＰ １００ｎｇ／ｍｌ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）中で５日間培養した。培養培地を３日毎（１０日目～１５日目）に交換した。
（ｉｉｉ）上皮構造の枝分かれ、肺胞分化及び乳腺特異化を誘導するために、ｍＥＢｓ（スフェロイド／マンモスフェア）にＭａｍｍｏ３培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びペニシリン／ストレプトマイシン）を２０日間フィードした。培地を３日毎に交換した（１５日目～３５日目）。
（ｉｖ）最後に、乳生物活性物質製造（３Ｄ）を誘導するために、Ｍａｍｍｏ４培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、１０％ＦＢＳ、プロラクチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン、β－エストラジオール及びペニシリン／ストレプトマイシン）を７日間使用し、培地を３日毎に交換した（３５日目～４２日目）。全ての分化手順の間、スフェロイドを懸濁培養で維持した（９５ｒｐｍで回転）。分化手順は４２日目に終了した。結果を図３に表す。
【0151】
（ｂ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化：
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
二次元分化プロトコル（比較のために使用）では、本発明者らは、全ての分化段階中にラクト（Ｌａｃｔｏ）培地（ＲＰＭＩ １６４０、２０％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、４μｇ／ｍｌインスリン、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。培地を２日毎に交換した。結果を図４に表す。
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
二次元分化プロトコル（比較のために使用）では、本発明者らは、全ての分化段階中にラクト（Ｌａｃｔｏ）培地（ＲＰＭＩ １６４０、２０％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、４μｇ／ｍｌインスリン、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。培地を２日毎に交換した。結果を図４に表す。
【0152】
（ｃ）結果
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図３は三次元分化、図４は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統に向かってパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体に富んだものとすることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。両方のマーカーは、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳房組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳房特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図３は三次元分化、図４は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統に向かってパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体に富んだものとすることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。両方のマーカーは、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳房組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳房特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
【0153】
乳腺様オルガノイドのセクレトームの解析は、以下に記載されるように、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含む７つが検出）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含む７５が検出）を含むヒト乳特異的生物活性物質の分泌を示した。
【0154】
初代細胞の上清を、「Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｔ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｌａｃｔｏｓｅ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０１８，１０１０，８６－９６」に記載される手順に従って、わずかな変更を加えて、ラクトース又はヒト乳オリゴ糖の存在について解析した。試料をＵＨＰＬＣで解析し、検出されたラクトース又はヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を、ラクトース及び７種のＨＭＯ（２’ＦＬ、３’ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’ＳＬ及び６’ＳＬ）の混合物の検量線に対して定量した。この方法は０．１ｍｇ／Ｌの限界を有していると推定された。初代細胞の上清では、４２日目にラクトース（０．２２ｍｇ／Ｌ）及び６’ＳＬ（０．３２ｍｇ／Ｌ）が検出された。
【0155】
培地及び細胞上清中の脂肪酸を、水素炎イオン化検出器と連結したガスクロマトグラフィーによって分析した。簡単に説明すると、４２日目に得られた上清を分析して、いくつかの脂質クラスに含まれる脂肪酸の存在を調査する。溶融シリカＣＰ－Ｓｉｌ ８８キャピラリーカラム（１００％シアノプロピルポリシロキサン、１００ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５ｍｍ）を備えた分取ステーションモジュールを有する７６９３オートサンプラーを備えた７８９０Ａガスクロマトグラフを、２５０℃で加熱されたスプリットインジェクター（１：２５比）、及び３００℃で操作される水素炎イオン化検出器と共に使用する。ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）の調製は、メタノール性塩酸（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｒｉｃ ａｃｉｄ）による試料の直接エステル交換によって行われる。ＦＡＭＥの分離は、キャピラリーガスクロマトグラフィー－ＦＩＤ（ＧＣ）を使用して行われる。ＦＡＭＥの同定は、保持時間（ＲＴ）及び外部標準との比較によって行われる。脂肪酸の定量は、内部標準としてメチルＣ１１：０を使用する計算によって行われる。本方法のエステル交換性能は、第２の内部標準としてＴＡＧ Ｃ１３：０を用いて制御される。内部標準の添加後、溶液を２ｍＬのメタノール、２ｍＬのメタノール／ＨＣｌ（３Ｎ）及び１ｍＬのヘキサンと混合した。１００℃／６０分で加熱した後、試料を室温まで冷却し（約１５分）、２ｍＬの水を添加することによって反応を停止させる。遠心分離後、有機相をＧＣに直接注入する。
【0156】
４２日目における実施例４ａのプロトコルからの脂肪酸の結果（培地と上清との間で観察された差）を表１に示す。
【0157】
以下の表１は、細胞上清サンプル中の発現された脂肪酸を列挙する。
【0158】
【表1】
【0159】
細胞上清中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイリング、次いでＬＣ－ＭＳＭＳによる同一性確認のためのバンド単離を使用して分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、調製した試料の全量をゲルにロードした。ヒト乳サンプルを対照として比較のために添加した。選択されたゲル領域（バンド）を切断して、ＬＣ－ＭＳＭＳによってヒトタンパク質を探索した。最終的に、バンドをゲル内トリプシン消化に供し、ＬＣ－ＭＳＭＳによって分析した。ＬＣ－ＭＳＭＳデータをＰｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏで分析し、ヒトタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに対して照合した。
【0160】
以下の表２は、全ての切り出されたバンドについての最良の候補を列挙する。
【0161】
【表2】
【0162】
ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーネットを使用して、エキソソーム単離及びｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーは、ネットワークを形成することによってエキソソームを沈殿させるように作用し、ある程度のサイズのエキソソームを全て回収する。ＥｘｏＱｕｉｃｋメッシュが形成されると、エキソソームは、単純な低速遠心分離によって容易にペレットとして沈殿する。エキソソームは損なわれておらず、タンパク質又はＲＮＡ分析が可能な状態であり、機能試験にあたり生物活性を有する。沈殿緩衝液を０．２５倍の割合で試料に添加し、次いでボルテックスした。混合物を４℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、試料を１５００×ｇで３０分間遠心分離した。エキソソームペレットを、ＱＣ用のＢｕｆｆｅｒ ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）又はｍｉＲＮＡプロファイリング用のＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ Ｗｈｏｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＡｓｓａｙからのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて初期容量でボルテックスすることによって再懸濁した。細胞外小胞（ＥＶ）の単離を評価するために、まず上清を３０００ｇで１５分間遠心分離して、細胞ペレット及び破片を除去した。次いで、１００マイクロリットルの培地を使用し、ＥｘｏＱｕｉｃｋ緩衝液（０．２５×比）により４℃で一晩沈殿させた。ＥＶ沈殿物を１５００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。各試料に対して２回の沈殿を行い、１回目のＥＶ沈殿は、実施する可能性のあるさらなる分析のために緩衝液ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）に再懸濁し、２回目の沈殿では、１０倍濃縮するために５０ ｕｌのＨＴＧ溶解緩衝液のみに再懸濁し、その後ＨＴＧによるｍｉＲＮＡプロファイリングに供した。
【0163】
ｍｉＲＮＡプロファイリングのために、試料を第１の溶解ステップにおいて直接使用した。したがって、全試料を直接使用し、血漿溶解緩衝液で１：１の比で溶解した。次に、プロテイナーゼＫ（１／１０）を添加し、試料をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で５０℃、６００ｒｐｍで３時間インキュベーションした。ＥＶを溶解緩衝液に再懸濁し、同じ条件で溶解し、溶解インキュベーションの前には９５℃で１０分間のインキュベーションステップを加えた。２６μＬの溶解物を、ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ全トランスクリプトームアッセイＶ２手順に従って、ＨＴＧプロセッサ上で７０μＬの油で処理した。インデックス付け及び増幅ライブラリーのために、試料をＩｌｌｕｍｉｎａアダプターでタグ付けし、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（９５℃で４分；１６サイクル：９５℃で１５秒、５６℃で４５秒、６８℃で４５秒；６８℃１０分；４℃で保持）でＰＣＲし、ロボット液体ハンドラーＳｃｉＣｌｏｎｅ ＮＧＳ ＷｏｒｋＳｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でＡＭＰｕｒｅ洗浄した（２．５比）。Ｈａｍｉｌｔｏｎロボット上で本発明者らのカスタムプーリングプログラムを用いてプールを得た。サンプルを、ＧＸタッチチップＨＳ定量に基づいてプールした。２回目には、ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄ（１．８比）を用いて手動でプールを精製して、残っている可能性のある微量のプライマー二量体を除去し、Ｑｕｂｉｔを用いて定量して、最終濃度を２ｎＭに調整した。最後のステップとして、ＭｉＳｅｑ配列決定のために、５％ＰｈｉＸを添加してＭｉＳｅｑ上に２０ｐＭのプールをロードし、１５０Ｖ３キットを用いて５０塩基シングルリードについてＭｉＳｅｑ上で配列決定した。
【0164】
簡潔には、細胞上清中には９７４のｍｉＲＮＡが検出され、そのうちの７５個を超えるｍｉＲＮＡが、乳試料において高度に発現されるｍｉＲＮＡである。
【0165】
以下の表３は、上位１０個の高度に発現されたｍｉＲＮＡを列挙する。
【0166】
【表3】
【0167】
本発明者らの知見は、正常な乳腺細胞の運命及び機能と、母乳生物活性物質製造との調節及び発達を研究するための新規のｉＰＳＣベースの三次元器官型モデルを提供する。
【0168】
実施例５
分化培地Ｍ１／Ｍ４を使用して、７日間の成長期及び７日間の誘導期のために、マトリックスあり及びなしで、三次元フォーマットで乳腺上皮細胞を培養した（図５のａ）。他の異なる培地を使用してもよい。簡潔に述べると、１～５，０００，０００個の解離した上皮細胞を、４．５ｍＬの培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面シェーカープラットフォームを使用して播種した。培養細胞は、フローサイトメトリーによる定量を用いて、ケラチン１８及びエストロゲン受容体などの乳腺特異的マーカーを発現することができ（図５のｂ）、成長期（７日目）中及び誘導期（１４日目）中、ヒトラクトフェリン（ＬＴＦ）及び乳脂肪球－ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）又はラクトアドヘリンのｍＲＮＡレベルを発現することができる（図５のｃ、ｄ）。
分化培地Ｍ１／Ｍ４を使用して、７日間の成長期及び７日間の誘導期のために、マトリックスあり及びなしで、三次元フォーマットで乳腺上皮細胞を培養した（図５のａ）。他の異なる培地を使用してもよい。簡潔に述べると、１～５，０００，０００個の解離した上皮細胞を、４．５ｍＬの培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面シェーカープラットフォームを使用して播種した。培養細胞は、フローサイトメトリーによる定量を用いて、ケラチン１８及びエストロゲン受容体などの乳腺特異的マーカーを発現することができ（図５のｂ）、成長期（７日目）中及び誘導期（１４日目）中、ヒトラクトフェリン（ＬＴＦ）及び乳脂肪球－ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）又はラクトアドヘリンのｍＲＮＡレベルを発現することができる（図５のｃ、ｄ）。
【0169】
本発明者らは、遺伝子発現プロファイリングにＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術を使用して、乳腺上皮細胞における様々な乳房上皮マーカーの発現を評価した（図６）。乳腺上皮前駆細胞マーカーＣＤ２４は一貫して発現し、泌乳時には高発現している傾向があった（図６のａ）。泌乳が進行するにつれて、細胞がＫＲＴ５、ＫＲＴ１４及びＩＴＧＡ６（ＣＤ４９ｆ）などの乳腺基底様細胞のマーカー発現の減少を示すことを観察することは興味深い（図６のｂ～ｄ）。細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１８及びＭＵＣ１などの様々なマーカーを使用して、泌乳中及び泌乳後に管腔様の表現型を維持したようである（図６のｅ～ｈ）。誘導後の期間は、ラクトフェリン（ＬＴＦ）、クラステリン及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）などの異なるタンパク質についての、ラクトサイト（ルミナル様細胞）特異的分泌プロファイルの開始によって評価する（表１ａ）。泌乳後の精製上皮細胞から単離されたエキソソームもまた、表１ｂに掲載されている乳特異的ｍｉＲＮＡの豊富な発現を示す。泌乳後の乳腺上皮細胞における乳腺上皮マーカー及びエキソソーム精製上皮細胞における乳汁特異的ｍｉＲＮＡの発現も、別の分化条件を用いて観察した。
【0170】
【表4】
【0171】
【表5】
【0172】
本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】