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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ＰＯＥＧＭＡベース脂質ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20241106BHJP
A61K 47/06 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241106BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20241106BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241106BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61K9/16
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/32
A61K47/34
A61K47/06
A61K47/18
A61K47/22
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/711
A61P31/00
A61P25/14
A61P21/00
A61P37/06
A61P35/00
A61K48/00
C12N15/113 Z
C12N15/88 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524728
(86)(22)【出願日】2022-10-25
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 US2022078659
(87)【国際公開番号】W WO2023076902
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/271,595
(32)【優先日】2021-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】チルコティ アシュトッシュ
(72)【発明者】
【氏名】サハ ソウメン
(72)【発明者】
【氏名】シロヒ パルル
(72)【発明者】
【氏名】ハックナル アンガス
(72)【発明者】
【氏名】デシュパンデ ソナル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076CC26
4C076CC29
4C076DD34
4C076DD49
4C076DD59
4C076DD60
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE12
4C076EE23
4C076EE48
4C076EE49
4C076FF34
4C084AA13
4C084AA17
4C084MA05
4C084MA41
4C084NA10
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA941
4C084ZB081
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB321
4C084ZC411
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA41
4C086NA10
4C086NA14
4C086ZA15
4C086ZA94
4C086ZB08
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZB32
4C086ZC41
(57)【要約】
本明細書では、ＰＥＧベースの対応物によって被る免疫上の帰結を伴わずに治療薬を効果的にカプセル化及び送達することができるＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が開示される。脂質ナノ粒子例は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート、及び治療薬を含む。また、本明細書では、ＰＯＥＧＭＡベース脂質ナノ粒子を含む医薬組成物、疾患又は障害を治療する方法、及び治療薬を細胞に送達する方法も開示される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イオン化可能な脂質；リン脂質；
ステロール；
ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が１００ｋＤａ未満の数平均分子量を有する、１０ｍｏｌ％未満にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及び
治療薬
を含む、脂質ナノ粒子。
【請求項2】
ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及び前記骨格に共有結合で付着した複数の側鎖を有し、各側鎖は、タンデムに反復したエチレングリコール（ＥＧ）の２～９つのモノマーを含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項3】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項4】
対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応しない、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項5】
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質はＣ2-40炭化水素鎖を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項6】
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質は、トリアゾール、アミド、エステル、エーテル、又は炭化水素リンカーを介してＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートされている、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項7】
ＰＯＥＧＭＡは、約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項8】
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％で含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項9】
イオン化可能な脂質は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（1,2-Dilinoleylcarbanioyloxy-3-dimethylaniinopropane）（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（l,2-Dilmoleoyl-3-dimethylammopropane）（ＤＬｍ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（2,2-dilmoleyl-4-(2-dimethylaiiimoethyl)-[l,3]-dioxolane）（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（(6Z,9Z,28Z,3lZ)-heptatriaeonta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate）（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドログリシルカルボキシスペルミン（dioctadecylamidoglycyocarboxyspermine）（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）、ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（N-(NAN’-dimethylammoethanej-carbam oxl cholesterol）（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲ１Ｅ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ））プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（N-(l-(2,3-dioleyloxy3)propyl)-N-2-(spenninecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylamrnonium trifluoracetate）（ＤＯＳＰＡ）、２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、アミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（aminopropyl-dimethyl-bis(dodecyloxy)-propanaminiumbromide）（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項10】
イオン化可能な脂質は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項11】
イオン化可能な脂質を約２０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％で含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項12】
リン脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項13】
リン脂質を約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％で含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項14】
ステロールは、コレステロール、カンペステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、スチグマステロール、シトステロール、オキシステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、コレスタ－４－エン－３－オン、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項15】
ステロールを約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％で含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項16】
治療薬は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの組合せを含む核酸である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項17】
核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの組合せを含む、請求項１６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項18】
（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；
コレステロール；
ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及び
ｍＲＮＡ
を含む、脂質ナノ粒子。
【請求項19】
約４：１～約１６：１のＮ：Ｐ比を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項20】
約３０ｎｍ～約３００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項21】
蛍光により測定して７５％以上の治療薬カプセル化効率を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項22】
ターゲティングリガンドをさらに含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項23】
請求項１に記載の１つ又は複数の脂質ナノ粒子；及び薬学的に許容される賦形剤
を含む、医薬組成物。
【請求項24】
疾患又は障害を治療する必要がある対象において前記疾患又は障害を治療する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と組合せでよい、請求項１に記載の１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項25】
１つ又は複数の脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有する；対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応しはない、又はそれらの組合せである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
疾患又は障害は、感染症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、又はがんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
細胞に治療薬を送達する方法であって、細胞を請求項１に記載の１つ又は複数の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、それによって治療薬は細胞に送達される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月２５日出願の米国仮特許出願第６３／２７１，５９５号の優先権を主張するものであり、上記仮特許出願は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
電子形式配列表の参照
電子形式配列表（名称：０２８１９３－９３７６－ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：９，２１０バイト；作成日：２０２２年１０月２５日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子及び薬物送達等の生物医学的用途におけるそれらの使用に関する。
本出願は、２０２１年１０月２５日出願の米国仮特許出願第６３／２７１，５９５号の優先権を主張するものであり、上記仮特許出願は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
電子形式配列表の参照
電子形式配列表（名称：０２８１９３－９３７６－ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：９，２１０バイト；作成日：２０２２年１０月２５日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子及び薬物送達等の生物医学的用途におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
緒論
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、その生体適合性、ペイロードとの効率的な複合体形成、細胞取り込み、及びエンドソーム脱出の成功により、核酸送達（例えば、ｍＲＮＡ）用の有力な担体として浮上してきた。ＬＮＰは、ｍＲＮＡを効果的に保護し細胞に輸送する上でのその役割から、ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンの重要な成分として注目を浴びてきた。ＬＮＰは、ＬＮＰにステルス特性をもたらすことができるＰＥＧ化脂質を通常には含む。ＰＥＧコーティングを備えるＬＮＰは、オプソニン作用の減少及び溶解性の改善に起因して、ネイティブなＬＮＰよりもはるかに長い血漿半減期を有する。残念なことに、ＰＥＧ化ＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ投与には、免疫原性、アレルギー副反応、並びに誘導性及び既存のＰＥＧ抗体によるクリアランスの増強を含めて、いくつかの制限がある。ＰＥＧの反復投与により、その非生分解性構造及びＲＥＳによるクリアランスに起因して、主要臓器において空胞が形成される場合もある。さらに、ＰＥＧ不耐容性により、いくつかの治験が早期終了させられ、いくつかの治療薬が市場から撤退させられてきた。ＣＤＣによると、ＰＥＧは、ＬＮＰベースのＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｃｏｖｉｄワクチンに対するアレルギー反応の原因となる主要成分の１つであると特定されてきた。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、その生体適合性、ペイロードとの効率的な複合体形成、細胞取り込み、及びエンドソーム脱出の成功により、核酸送達（例えば、ｍＲＮＡ）用の有力な担体として浮上してきた。ＬＮＰは、ｍＲＮＡを効果的に保護し細胞に輸送する上でのその役割から、ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンの重要な成分として注目を浴びてきた。ＬＮＰは、ＬＮＰにステルス特性をもたらすことができるＰＥＧ化脂質を通常には含む。ＰＥＧコーティングを備えるＬＮＰは、オプソニン作用の減少及び溶解性の改善に起因して、ネイティブなＬＮＰよりもはるかに長い血漿半減期を有する。残念なことに、ＰＥＧ化ＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ投与には、免疫原性、アレルギー副反応、並びに誘導性及び既存のＰＥＧ抗体によるクリアランスの増強を含めて、いくつかの制限がある。ＰＥＧの反復投与により、その非生分解性構造及びＲＥＳによるクリアランスに起因して、主要臓器において空胞が形成される場合もある。さらに、ＰＥＧ不耐容性により、いくつかの治験が早期終了させられ、いくつかの治療薬が市場から撤退させられてきた。ＣＤＣによると、ＰＥＧは、ＬＮＰベースのＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｃｏｖｉｄワクチンに対するアレルギー反応の原因となる主要成分の１つであると特定されてきた。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、イオン化可能な脂質；リン脂質；ステロール；ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が１００ｋＤａ未満の数平均分子量を有する、１０ｍｏｌ％未満にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及び治療薬を含む、脂質ナノ粒子が開示される。
別の態様では、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；コレステロール；ＰＯＥＧＭＡが約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及びｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子が開示される。
別の態様では、本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子；及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物が開示される。
別の態様では、それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と組合せでよい、本明細書で開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含む、方法が開示される。
別の態様では、細胞に治療薬を送達する方法であって、細胞を本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、それによって治療薬は細胞に送達される、方法が開示される。
別の態様では、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；コレステロール；ＰＯＥＧＭＡが約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及びｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子が開示される。
別の態様では、本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子；及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物が開示される。
別の態様では、それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と組合せでよい、本明細書で開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含む、方法が開示される。
別の態様では、細胞に治療薬を送達する方法であって、細胞を本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、それによって治療薬は細胞に送達される、方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1A】例示のアジドポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）に関するゲル浸透クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）（図１Ａ）及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（図１Ｂ）のトレースを示す図である。
【図2A】例示のＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート（ＰＯＥＧＭＡＬ）に関する精製及び特性評価を示す図である。図２Ａ：ＰＯＥＧＭＡＬの精製の概略図。図２Ｂ：ＰＯＥＧＭＡ化脂質の典型的なＴＬＣトレース。図２Ｃ：ＰＯＥＧＭＡ10及びＰＯＥＧＭＡＬ10の物理的外観。図２Ｄ：δ０．５～２．５とδ７．３～７．８の間のプロトンの理論数の比及びプロトンＮＭＲによって実験的に決定された相当する値。
【図3A】例示のＬＮＰに関する動的光散乱分析を示す図である。図３Ａ～図３Ｃ：ブランクＬＮＰ。ｍＲＮＡを含まない種々のＬＮＰの流体力学的半径（図３Ａ）、多分散性（図３Ｂ）、及び粒径分布（図３Ｃ）。図３Ｄ～図３Ｆ：ｍＲＮＡを含むＬＮＰ。ｍＲＮＡを含む種々のＬＮＰの流体力学的半径（図３Ｄ）、多分散性（図３Ｅ）、及び粒径分布（図３Ｆ）。
【図4A】例示のＬＮＰの中にカプセル化されたｍＲＮＡの特性評価及び定量化を示す図である。図４Ａ：ＴｒｉｔｏｎＸ－１００添加前（－）及び添加後（＋）の種々のＬＮＰのゲル電気泳動。図４Ｂ：Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイの概略図。図４Ｃ：Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって測定されたｍＲＮＡカプセル化効率％。*Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．００１；二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
【図5A】例示のＬＮＰのルシフェラーゼｍＲＮＡカプセル化効率（ＥＥ）を改善するための脂質比の解析を示す図である。図５Ａ：ＰＯＥＧＭＡＬ10-50及びＳＭ－１０２の種々のｍｏｌ％にてのＬＮＰのＥＥ。０．５（図５Ｂ）、１．５（図５Ｃ）、及び２．５（図５Ｄ）の各ｍｏｌ％にての種々のＬＮＰのＥＥと流体力学的半径との間の関係。図５Ｅ：ＰＢＳに対する透析後の例示のＬＮＰのＥＥ。
【図7】ＰＢＳに対する透析後のＬＮＰPOEGMAL5（上パネル）及びＬＮＰPOEGMAL10（下パネル）の低温透過電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図8A】治療上重要な成熟完全長ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡをカプセル化するようにＬＮＰPOEGMAL10のＥＥを改善するパラメータの解析を示す図である。ＰＢＳに対する透析前（図８Ａ）及び透析後（図８Ｂ）のＥＥ。図８Ｃ：示された緩衝剤に対する透析後の流体力学的半径。ｍＲＮＡカプセル化に対するＮ：Ｐ（図８Ｄ）、ＬＮＰ調製過程でのエタノール画分（図８Ｅ）、及び脂質ｍｏｌ％（図８Ｆ）の影響。
【図9A】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における例示のＬＮＰのＣｌｕｃ ｍＲＮＡカーゴの発現を示す図である。図９Ａ：ｍＲＮＡ ５００ｎｇにてのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００に対する相対発現；図９Ｂ：ｍＲＮＡ ３００ｎｇにてのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００に対する相対発現；図９Ｃ：５００ｎｇにての種々のＮ：Ｐにての生のＡＵＣ値；及び図９Ｄ：３００ｎｇにての種々のＮ：Ｐにての生のＡＵＣ値。
【図10】４８時間の連続処理後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＬＮＰの毒性を示す図である。
【図11A】４：１～８：１の範囲の電荷比（Ｎ：Ｐ）にてのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における例示のＬＮＰの種々の量のＣＬｕｃ ｍＲＮＡカーゴの発現を示す図である、丸：ＬＮＰPOEGMAL5、四角：ＬＮＰPOEGMAL10、及び三角：ＬＮＰPEG-DMG。図１１Ａ：８：１にてのｍＲＮＡ ５００ｎｇ；図１１Ｂ：６：１にてのｍＲＮＡ ５００ｎｇ；図１１Ｃ：４：１にてのｍＲＮＡ ５００ｎｇ；図１１Ｄ：８：１にてのｍＲＮＡ ３００ｎｇ；図１１Ｅ：６：１にてのｍＲＮＡ ３００ｎｇ；及び図１１Ｆ：４：１にてのｍＲＮＡ ３００ｎｇ。
【図12】ＲＮａｓｅ保護アッセイを示す図である。例示のＬＮＰを、ＲＮａｓｅの添加後に０．５時間インキュベートした。添加順序を左側の表に示し、ゲルを右側に示す。例示のＬＮＰの全てが、ＲＮａｓｅからＣｌｕｃ ｍＲＮＡカーゴを保護する。
【発明を実施するための形態】
【0005】
本明細書では、８５％超のＥＥを備える、完全長モデルルシフェラーゼｍＲＮＡ及び治療上重要なＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡ等の、治療薬をカプセル化するためのステルスＬＮＰを造り上げるために使用することができるＰＯＥＧＭＡ化脂質が開示される。エタノール画分、電荷比（Ｎ：Ｐ）、脂質ｍｏｌ％、及び緩衝剤交換等のＬＮＰ作製のパラメータを調査することにより、各パラメータがＬＮＰのＥＥにどのように影響を及ぼすことができるかを明らかにした。ＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達の成功に必須条件である、ＲＮａｓｅに対するｍＲＮＡへの必要な保護ももたらした。さらに、レポーターｍＲＮＡ発現アッセイでは、１０ｋＤａ ＰＯＥＧＭＡ化脂質を含むＬＮＰはＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰ製剤よりも優れていた。このことは、ＰＥＧの免疫原性を潜在的に回避しながらｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡワクチン送達のためのＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰプラットフォームの強力な事例を為すものであることから、期待できるものである。
【0006】
１．定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。本明細書に開示の材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料を、開示されている本発明の実践又は試験において使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それら全体が参照により組み込まれる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という各用語及びこれらの変化形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為又は構造の可能性を除外しないオープンエンド形式の移行句、用語又は語句であることが意図される。単数形「１つの（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に別段の指示をしない限り、複数形への言及を含む。本開示はまた、明示的に示されるか否かにかかわらず、本明細書に提供される実施形態又は要素「を含む」、それ「からなる」及びそれ「から本質的になる」他の実施形態も企図するものである。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。本明細書に開示の材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料を、開示されている本発明の実践又は試験において使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それら全体が参照により組み込まれる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という各用語及びこれらの変化形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為又は構造の可能性を除外しないオープンエンド形式の移行句、用語又は語句であることが意図される。単数形「１つの（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に別段の指示をしない限り、複数形への言及を含む。本開示はまた、明示的に示されるか否かにかかわらず、本明細書に提供される実施形態又は要素「を含む」、それ「からなる」及びそれ「から本質的になる」他の実施形態も企図するものである。
【0007】
量に関連して使用される「約」という修飾語句は、記載されている値を含むものであり、文脈によって指示される意味を有する（例えば、これは、特定の量の測定に伴う誤差の度合いを少なくとも含む）。「約」という修飾語句は、２つの端点の絶対値によって定義される範囲も開示するものとみなすべきである。例えば、「約２～約４」という表現は、範囲「２～４」も開示する。「約」という用語は、示される数のプラス又はマイナス１０％を指すことができる。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示すことができ、「約１」は、０．９～１．１を意味する場合がある。四捨五入等の「約」の他の意味は文脈から明らかとなる場合があり、そのため、例えば、「約１」は０．５～１．４を意味する場合もある。
【0008】
本明細書での数値範囲の記述について、同じ精度をもってそれらの間にある各介在する数が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲について、６及び９に加えて数７及び８が企図され、且つ６．０～７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の各数が明示的に企図される。
【0009】
「抗原」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体が結合することができる分子を指す。「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープも包含する。付加的に抗原は、免疫系が認識することができ、並びに／又は、液性免疫応答及び／若しくは細胞性免疫応答を誘導してＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化を招くことができる。一部の実施形態では、抗原は、Ｔｈ細胞エピトープを含有するか又はこれに連結されている。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢエピトープとＴエピトープ）を有することができる。抗原には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、小分子、ポリマー、ポリマーコンジュゲート、及びそれらの組合せが含まれ得る。抗原はまた、幾種かのそれぞれ異なった抗原の混合物であってもよい。
「抗原性」という用語は、Ｔ細胞受容体又は抗体に特異的に結合する抗原の能力を指し、これには、対象における既存の抗体に対する抗原の反応性が含まれる。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な若しくは望ましい生物学的結果及び／又は臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。
「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘導する抗原の能力を指し、これには、対象において抗体を産生する抗原の固有の能力が含まれる。本明細書で使用される場合、「抗原性」という用語と「免疫原性」という用語は、免疫系の異なる側面を指すものであり、互換性ではない。
「抗原性」という用語は、Ｔ細胞受容体又は抗体に特異的に結合する抗原の能力を指し、これには、対象における既存の抗体に対する抗原の反応性が含まれる。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な若しくは望ましい生物学的結果及び／又は臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。
「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘導する抗原の能力を指し、これには、対象において抗体を産生する抗原の固有の能力が含まれる。本明細書で使用される場合、「抗原性」という用語と「免疫原性」という用語は、免疫系の異なる側面を指すものであり、互換性ではない。
【0010】
「ｍＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡは、１つ又は複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、若しくはリンカー等の修飾された及び／又は天然に存在しない成分を含むことができる。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを含むことができる。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有することができる。ｍＲＮＡの翻訳によって、例えば、哺乳動物細胞内部でのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳によって、ポリペプチドを産生することができる。通常、ｍＲＮＡ分子の基本成分には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ配列が含まれる。
「Ｎ：Ｐ比」という用語は、本明細書で使用される場合、脂質中のイオン化可能な（生理学的ｐＨ範囲における）窒素原子と核酸（例えば、ＲＮＡ）中のリン酸基のモル比を指す。
「Ｎ：Ｐ比」という用語は、本明細書で使用される場合、脂質中のイオン化可能な（生理学的ｐＨ範囲における）窒素原子と核酸（例えば、ＲＮＡ）中のリン酸基のモル比を指す。
【0011】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物及び／又は物質を包含する。こういったポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれる場合が多い。例示の核酸又はポリヌクレオチドの例としては、それらに限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導性作用剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、これには、ｂ－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、ａ－Ｌ－リボ立体配置を有するａ－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ａ－ＬＮＡが含まれる）、又はそれらのハイブリッドが挙げられる。核酸は、化学合成法によって得られる場合があり、組換え法によって得られる場合もある。
【0012】
「リン脂質」という用語は、本明細書で使用される場合、リン酸部分及び不飽和脂肪酸鎖等の１つ又は複数の炭素鎖を含む脂質を指す。リン脂質は、１つ又は複数の多重（例えば、二重又は三重）結合（例えば、１つ又は複数の不飽和）を含むことができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という各用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも３個のアミノ酸のストリングを指して互換的に使用することができる。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、自然界には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）、及び／又はアミノ酸アナログを含有することができる。また、ペプチド中のアミノ酸のうちの１個又は複数を、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション用のリンカー、官能基化、又はその他の修飾等の化学的実体の付加によって修飾することができる。修飾には、ペプチドの環化、Ｄ－アミノ酸の組込み等が含まれ得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という各用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも３個のアミノ酸のストリングを指して互換的に使用することができる。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、自然界には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）、及び／又はアミノ酸アナログを含有することができる。また、ペプチド中のアミノ酸のうちの１個又は複数を、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション用のリンカー、官能基化、又はその他の修飾等の化学的実体の付加によって修飾することができる。修飾には、ペプチドの環化、Ｄ－アミノ酸の組込み等が含まれ得る。
【0013】
「ＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよいリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、１つ又は複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はリンカー等の修飾された及び／又は天然に存在しない成分を含むことができる。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを含むことができる。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有することができる。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びそれらの混合物からなる非限定的な群から選択することができる。
【0014】
「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患からの対象の保護、例えば、当該疾患を予防する、抑制する、抑止する、改善する、又は完全に消散させることを指す。疾患を予防することは、本開示のコンジュゲートを対象に疾患の発症前に投与することを伴う。疾患を抑制することは、本開示のコンジュゲートを対象に疾患の誘導後であるがその臨床的視診前に投与することを伴う。疾患を抑止すること又は改善することは、本開示のコンジュゲートを対象に疾患の臨床的視診後に投与することを伴う。
「対象」という用語には、ヒト及び哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ及びウマ）が含まれる。本開示の典型的な対象には、哺乳動物、特に霊長類及びヒトが含まれ得る。獣医学的用途の場合、適切な対象には、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタ類等の家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ等の家禽、並びに飼い慣らされた動物、特にイヌ及びネコ等のペットが含まれ得る。研究用途の場合、適切な対象には、哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類及び近交系ブタ等のブタ類等が含まれ得る。
「対象」という用語には、ヒト及び哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ及びウマ）が含まれる。本開示の典型的な対象には、哺乳動物、特に霊長類及びヒトが含まれ得る。獣医学的用途の場合、適切な対象には、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタ類等の家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ等の家禽、並びに飼い慣らされた動物、特にイヌ及びネコ等のペットが含まれ得る。研究用途の場合、適切な対象には、哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類及び近交系ブタ等のブタ類等が含まれ得る。
【0015】
２．脂質ナノ粒子
本明細書では、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が開示される。脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート、及び治療薬を含むことができる。脂質ナノ粒子は、細胞、組織、臓器、対象等への核酸等の治療薬の導入を容易にすることができる。脂質ナノ粒子はまた、標的細胞との相互作用を容易にすることができるターゲティングリガンドを含むこともできる。例えば、ターゲティングリガンドは、標的細胞と特異的に相互作用して（例えば、標的細胞の表面上の細胞外タンパク質と特異的に相互作用して）、投与の後の脂質ナノ粒子の局在化を改善することができる。ターゲティングリガンドの例としては、それらに限定されないが、アプタマー、炭水化物、タンパク質、抗体、単鎖可変断片等が挙げられる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子はターゲティングリガンドをさらに含む。加えて、脂質ナノ粒子の成分は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
本明細書では、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が開示される。脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート、及び治療薬を含むことができる。脂質ナノ粒子は、細胞、組織、臓器、対象等への核酸等の治療薬の導入を容易にすることができる。脂質ナノ粒子はまた、標的細胞との相互作用を容易にすることができるターゲティングリガンドを含むこともできる。例えば、ターゲティングリガンドは、標的細胞と特異的に相互作用して（例えば、標的細胞の表面上の細胞外タンパク質と特異的に相互作用して）、投与の後の脂質ナノ粒子の局在化を改善することができる。ターゲティングリガンドの例としては、それらに限定されないが、アプタマー、炭水化物、タンパク質、抗体、単鎖可変断片等が挙げられる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子はターゲティングリガンドをさらに含む。加えて、脂質ナノ粒子の成分は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【0016】
治療薬が核酸を含む場合、脂質（例えば、イオン化可能な脂質）の量と核酸の量は、特定のＮ：Ｐ比をもたらすように選択することができる。脂質ナノ粒子のＮ：Ｐ比とは、１つ又は複数の脂質中の窒素原子と核酸中のリン酸基の数のモル比を指す。１つ又は複数の核酸、脂質、及びそれらの量は、約２：１～約２０：１、例えば、約３：１～約１９：１、約４：１～約１８：１、約５：１～約１７：１、約４：１～約１６：１、約６：１～約１６：１、約７：１～約１５：１、約８：１～約１４：１、約９：１～約１３：１、約７：１～約１２：１、約５：１～約１４：１、約８：１～約１２：１、約２：１～約１２：１、又は約３：１～約１２：１のＮ：Ｐ比をもたらすように選択することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２：１超、３：１超、４：１超、５：１超、６：１超、７：１超、８：１超、９：１超、１０：１超、又は１１：１超のＮ：Ｐ比を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０：１未満、１９：１未満、１８：１未満、１７：１未満、１６：１未満、１５：１未満、１４：１未満、１３：１未満、１２：１未満、又は１１：１未満のＮ：Ｐ比を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０：１のＮ：Ｐ比を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約８：１のＮ：Ｐ比を有する。
【0017】
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子に含まれる脂質成分に左右され得る様々な粒径を有してもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約３５ｎｍ～約２５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３５ｎｍ～約９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３５ｎｍ～約１２５ｎｍの直径を有することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、３０ｎｍ超、３５ｎｍ超、４０ｎｍ超、４５ｎｍ超、又は５０ｎｍ超の直径を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、又は１００ｎｍ未満の直径を有する。
【0018】
脂質ナノ粒子のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位によって脂質ナノ粒子の表面電荷を説明することができる。比較的低い電荷を、正電荷か負電荷かにかかわらず、有する脂質ナノ子粒子が一般に望ましいが、これは、より高度に帯電した種は、細胞、組織、及び体内のその他のエレメントと望ましくない相互作用をする場合があるからである。脂質ナノ粒子は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、例えば、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、又は約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶのゼータ電位を有することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、－５ｍＶ超、０ｍＶ超、＋１ｍＶ超、＋２ｍＶ超、＋３ｍＶ、又は＋４ｍＶ超のゼータ電位を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は＋２０ｍＶ未満、＋１９ｍＶ未満、＋１８ｍＶ未満、＋１７ｍＶ未満、＋１６ｍＶ未満、又は＋１５ｍＶ未満のゼータ電位を有する。
【0019】
治療薬のカプセル化の効率によって、提供される初期の量と比較した、調製後に脂質ナノ粒子にカプセル化されるか、そうでなければ脂質ナノ粒子と他の方法で会合した治療薬の量を表す。カプセル化効率は、高いのが望ましい。カプセル化効率は、例えば、１種又は複数の有機溶媒又は洗浄剤で脂質ナノ粒子を崩壊させる前後で脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬の量を比較することによって測定することができる。蛍光を使用して、溶液中の遊離治療薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、治療薬分子のカプセル化効率は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上、又は約１００％とすることができる。一部の実施形態では、カプセル化効率は７５％以上である。一部の実施形態では、カプセル化効率は８５％以上である。一部の実施形態では、カプセル化効率は約７０％～約９９％、例えば約７０％～約９０％、約７５％～約９５％、又は約７５％～約９９％である。
脂質ナノ粒子は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過電子顕微鏡法又は走査電子顕微鏡法）を使用して、脂質ナノ粒子の形態及びサイズ分布を調べることができる。動的光散乱又は電位差測定法（例えば、電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱を利用して、粒径を同様に決定することができる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、英国）等の機器を使用して、脂質ナノ粒子の複数の特性、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位を測定することもできる。
脂質ナノ粒子は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過電子顕微鏡法又は走査電子顕微鏡法）を使用して、脂質ナノ粒子の形態及びサイズ分布を調べることができる。動的光散乱又は電位差測定法（例えば、電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱を利用して、粒径を同様に決定することができる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、英国）等の機器を使用して、脂質ナノ粒子の複数の特性、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位を測定することもできる。
【0020】
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの組み入れにより、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートと比較して、開示された脂質ナノ粒子は有利な免疫応答特性を有することができる。例えば、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧを含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有することができる。減少又は消失した免疫応答には、脂質ナノ粒子に関して減少若しくは消失した抗原性、減少若しくは消失した免疫原性、又はその両方が含まれ得る。脂質ナノ粒子の有益な免疫相互作用は、脂質ナノ粒子が対象の既存の抗ＰＥＧ抗体と反応しないとし得るという点においても捉えることができる。したがって、開示された脂質ナノ粒子は、対象の免疫系と有益な相互作用を有することができる。対象の免疫系との脂質ナノ粒子相互作用の解析は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０２３１５８（ＷＯ２０２２／２１２９１１として公開）に記載のとおりに評価することができる。
【0021】
脂質ナノ粒子は、いくつの様々な技術によって作製することができる。例示技法としては、アルコール注入法が挙げられる。例えば、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及びＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートをアルコールに添加して、第１の混合物を形成することができる。アルコールはエタノールであってもよい。第１の混合物を第２の混合物へと注入して、脂質ナノ粒子混合物を用意することができる。第２の混合物は、治療薬及び緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤）を含むことができる。脂質ナノ粒子混合物は、用意した後に透析する場合がある。
【0022】
Ａ．ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートは、ＰＯＥＧＭＡ及び脂質を含む。ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートによれば、コンジュゲートに有利なステルス性及び免疫系特性を注ぎ込むことができる。脂質ナノ粒子は、１タイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート（例えば、単一種のコンジュゲート）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む。一例として、脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡの分子量、脂質の炭化水素の長さ、又はその両方によって異なる少なくとも２種の異なるＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含むことができる。こういった変化（例えば、分子量及び炭化水素鎖長等の）については、下でさらに論議する。ＰＯＥＧＭＡと脂質を１：１の化学量論的モル比で含めることができる。例えば、コンジュゲートは、１つの脂質分子に付着した１つのＰＯＥＧＭＡ分子を含むことができる。
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートは、ＰＯＥＧＭＡ及び脂質を含む。ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートによれば、コンジュゲートに有利なステルス性及び免疫系特性を注ぎ込むことができる。脂質ナノ粒子は、１タイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート（例えば、単一種のコンジュゲート）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含む。一例として、脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡの分子量、脂質の炭化水素の長さ、又はその両方によって異なる少なくとも２種の異なるＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを含むことができる。こういった変化（例えば、分子量及び炭化水素鎖長等の）については、下でさらに論議する。ＰＯＥＧＭＡと脂質を１：１の化学量論的モル比で含めることができる。例えば、コンジュゲートは、１つの脂質分子に付着した１つのＰＯＥＧＭＡ分子を含むことができる。
【0023】
ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及びその骨格に共有結合で付着した複数の側鎖を有する。側鎖はエチレングリコール（ＥＧ）のオリゴマーである。例えば、各側鎖は、タンデムに反復したＥＧの２～９つのモノマー、例えばタンデムに反復したＥＧの２～８つのモノマー、タンデムに反復したＥＧの２～７つのモノマー、タンデムに反復したＥＧの２～６つのモノマー、タンデムに反復したＥＧの２～５つのモノマー、又はタンデムに反復したＥＧの２～４つのモノマーを含むことができる。一部の実施形態では、各側鎖は、タンデムに反復したＥＧの３つのモノマーを含む。
隣接する側鎖は、同一ＰＯＥＧＭＡ分子内で同じであってもよく又は異なっていてもよい。例えば、一方の側鎖は、タンデムに反復したＥＧの３つのモノマーを有することができ、一方、別の側鎖は（同一ＰＯＥＧＭＡ分子中）、タンデムに反復したＥＧの４つのモノマーを有することができる。
隣接する側鎖は、同一ＰＯＥＧＭＡ分子内で同じであってもよく又は異なっていてもよい。例えば、一方の側鎖は、タンデムに反復したＥＧの３つのモノマーを有することができ、一方、別の側鎖は（同一ＰＯＥＧＭＡ分子中）、タンデムに反復したＥＧの４つのモノマーを有することができる。
【0024】
各側鎖は、第１の末端及び第２の末端を有することができる。第１の末端を、骨格に共有結合で付着させることができる。第２の末端は遊離であってもよい。第２の末端を修飾してもよい。一部の実施形態では、第２の末端それぞれは独立して、アルキル、エステル、アミン、アミド、又はカルボキシルの各基を含む。一部の実施形態では、第２の末端それぞれはアルキルを含む。一部の実施形態では、第２の末端それぞれはＣ1－Ｃ4アルキルを含む。一部の実施形態では、第２の末端それぞれはメチル基を含む。一部の実施形態では、第２の末端それぞれはヒドロキシル基を含まない。各側鎖の第２の末端は、同一ＰＯＥＧＭＡ分子内の隣接する側鎖の第２の末端と同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、各側鎖の第２の末端は、ＰＯＥＧＭＡ全体をとおして同じである。一部の実施形態では、少なくとも１つの側鎖の第２の末端は、少なくとも１つの隣接する側鎖の第２の末端とは異なる。
加えて、骨格は、第１の末端及び第２の末端を有することができる。
加えて、骨格は、第１の末端及び第２の末端を有することができる。
【0025】
ＰＯＥＧＭＡは、様々な分子量を有することができる。例えば、ＰＯＥＧＭＡは、約１ｋＤａ～約１００ｋＤａ、例えば、約１ｋＤａ～約８５ｋＤａ、約１ｋＤａ～約７５ｋＤａ、約１ｋＤａ～約６０ｋＤａ、約１ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約２ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約３ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約４ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約１ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１ｋＤａ～約１２ｋＤａ、又は約１ｋＤａ～約１０ｋＤａの数平均分子量を有することができる。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡは、１ｋＤａ超、２ｋＤａ超、３ｋＤａ超、４ｋＤａ超、５ｋＤａ超、６ｋＤａ超、７ｋＤａ超、８ｋＤａ超、９ｋＤａ超、又は１０ｋＤａ超の数平均分子量を有する。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡは、１００ｋＤａ未満、９０ｋＤａ未満、８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、１５ｋＤａ未満、１２ｋＤａ未満、又は１０ｋＤａ未満の数平均分子量を有する。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡは約１０ｋＤａの数平均分子量を有する。ＰＯＥＧＭＡの分子量は、ＳＥＣ、多角度光散乱と組み合わせたＳＥＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー等の当技術分野内で使用される技法によって測定することができる。
【0026】
コンジュゲートの脂質は、ＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートすることができ且つそのコンジュゲートが脂質ナノ粒子に含まれることを可能にする適切なあらゆる脂質とすることができる。脂質は飽和であっても不飽和であってもよい。脂質には、様々な長さの炭化水素鎖が含まれ得る。炭化水素鎖における炭素原子の数は、接頭辞「Ｃx-y」又は「Ｃx－Ｃy－」によって指すことができ、この場合、ｘは炭化水素鎖における炭素原子の最小数であり、ｙは最大数である。したがって、例えば、「Ｃ6-22炭化水素鎖」又は「Ｃ6－Ｃ22炭化水素鎖」とは、６～２２個の炭素原子を含有する炭化水素鎖を指す。脂質には、Ｃ2-40炭化水素鎖、例えば、Ｃ2-35炭化水素鎖、Ｃ2-30炭化水素鎖、Ｃ2-25炭化水素鎖、Ｃ2-20炭化水素鎖、Ｃ4-40炭化水素鎖、Ｃ10-40炭化水素鎖、Ｃ6-22炭化水素鎖、Ｃ10-28炭化水素鎖、Ｃ12-20炭化水素鎖、Ｃ10-22炭化水素鎖、Ｃ12-30炭化水素鎖、Ｃ14-40炭化水素鎖、Ｃ12-18炭化水素鎖、又はＣ8-18炭化水素鎖が含まれ得る。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質は、長さ４個超の炭素、長さ６個超の炭素、長さ８個超の炭素、長さ１０個超の炭素、長さ１２個超の炭素、又は長さ１４個超の炭素である、炭化水素鎖を有する。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質は、長さ４０個未満の炭素、長さ３６個未満の炭素、長さ３２個未満の炭素、長さ３０個未満の炭素、長さ２４個未満の炭素、又は長さ２０個未満の炭素である、炭化水素鎖を有する。
【0027】
脂質は、１つの炭化水素鎖又は複数の炭化水素鎖を含むことができる。例えば、脂質は、１～５つの個別の炭化水素鎖、例えば、１～４つの個別の炭化水素鎖、２～５つの個別の炭化水素鎖、１～３つの個別の炭化水素鎖、又は２～４つの個別の炭化水素鎖を含むことができる。一部の実施形態では、脂質は、１つ超の個別の炭化水素鎖、２つ超の個別の炭化水素鎖、又は３つ超の個別の炭化水素鎖を含む。一部の実施形態では、脂質は、５つ未満の個別の炭化水素鎖、４つ未満の個別の炭化水素鎖、又は３つ未満の個別の炭化水素鎖を含む。２つ以上の炭化水素鎖を有する脂質は、上記のように、様々な長さの炭化水素鎖を有することができる。加えて、複数の炭化水素鎖を含む実施形態は、全て同じ長さの個別の炭化水素鎖を含む場合があり、又は脂質は、様々な長さの個別の炭化水素鎖を含む場合もある。
【0028】
脂質はまた、脂質をＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートさせる際の柔軟性を可能にすることができるいくつかの様々な官能基を含むこともできる。例えば、脂質は、トリアゾール、アミド、エステル、エーテル、炭化水素リンカー、及びその他の適切なコンジュゲーションリンカーを含むことができる。一部の実施形態では、脂質は、トリアゾール、アミド、エステル、エーテル、又は炭化水素リンカーを介してＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジミリスチルオキシプロピル（dimyristyloxlpropyl）－３－アミン、又はそれらの組合せが含まれる。様々なリンカー戦略のさらなる論議については、下で論議する。
【0029】
ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子中に様々な量で含めることができる。例えば、脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを、約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、例えば、約０．２ｍｏｌ％～約９．５ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約０．４ｍｏｌ％～約８．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約７．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約７ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約６．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約５．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％～約７ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約５．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％、又は約０．１ｍｏｌ％～約０．７５ｍｏｌ％で含むことができる。ここで及び全体をとおしてｍｏｌ％とは、脂質ナノ粒子の脂質成分（例えば、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及びＰＯＥＧＭＡ脂質コンジュゲート）の総量に関連して、成分、例えば、ここではＰＯＥＧＭＡ脂質コンジュゲートのモルパーセンテージを指す。
【0030】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを、０．１ｍｏｌ％超、０．１５ｍｏｌ％超、０．２ｍｏｌ％超、０．２５ｍｏｌ％超、０．３ｍｏｌ％超、０．３５ｍｏｌ％超、０．４ｍｏｌ％超、０．４５ｍｏｌ％超、０．５ｍｏｌ％超、１ｍｏｌ％超、２ｍｏｌ％超、３ｍｏｌ％超、４ｍｏｌ％超、又は５ｍｏｌ％超で含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを、１０ｍｏｌ％未満、９．５ｍｏｌ％未満、９ｍｏｌ％未満、８．５ｍｏｌ％未満、８ｍｏｌ％未満、７．５ｍｏｌ％未満、７ｍｏｌ％未満、６．５ｍｏｌ％未満、６ｍｏｌ％未満、５．５ｍｏｌ％未満、５ｍｏｌ％未満、４．５ｍｏｌ％未満、４ｍｏｌ％未満、３．５ｍｏｌ％未満、３ｍｏｌ％未満、２．５ｍｏｌ％未満、２ｍｏｌ％未満、１．５ｍｏｌ％未満、１ｍｏｌ％未満、０．９ｍｏｌ％未満、０．８ｍｏｌ％未満、０．７５ｍｏｌ％未満、又は０．６ｍｏｌ％未満で含む。
【0031】
ＰＯＥＧＭＡは、当技術分野で公知のあらゆる適切なコンジュゲーション戦略を介して脂質にコンジュゲートさせることができる。例えば、脂質及びＰＯＥＧＭＡは、適正な条件下で官能基間に共有結合を形成することができるという点で、互いに補完的（complimentary）である官能基をそれぞれ個々に有することができる。共有結合を形成することができる代表的な補完的官能基としては、それらに限定されないが、アミンと活性化エステル、アミンとイソシアネート、アミンとイソチオシアネート、アミンとカルボネート、ジスルフィドの形成のためのチオール、エナミン形成のためのアルデヒドとアミン、及びＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションを経るアミドの形成のためのアジドが挙げられる。コンジュゲーションに適した官能基には、生体直交型官能基も含まれる。生体直交型官能基は、補完的生体直交型官能基と選択的に反応することができる。生体直交型官能基には、それらに限定されないが、クリック化学反応を経るトリアゾールの形成のためのアジドとアルキン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）及びにテトラジン（Ｔｚ）（例えば１，２，４，５－テトラジン）等が含まれる。一部の実施形態では、脂質及びＰＯＥＧＭＡはそれぞれ個々に生体直交型官能基を含む。一部の実施形態では、脂質はジベンゾシクロオクチンで官能化されており、ＰＯＥＧＭＡはアジド又はその両方で官能化されている。官能基に応じて、様々な結合又はリンケージを脂質とＰＯＥＧＭＡの間に形成することができる。ＰＯＥＧＭＡは、その骨格で又は側鎖で官能化することができる。
【0032】
ＰＯＥＧＭＡ、その合成、及びその適用に関するさらなる議論は、米国特許第８，４９７，３５６号及び米国特許第１０，３６４，４５１号に見出すことができ、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0033】
Ｂ．イオン化可能な脂質
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のイオン化可能な脂質を含むことができる。「イオン化可能な脂質」（又は代替的にカチオン性脂質）とは、生理学的ｐＨ（例えば、約７．４のｐＨ）で正電荷又は部分的な正電荷を有する脂質を指す。イオン化可能な脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正と負の電荷の両方を有する中性分子であってもよい。脂質ナノ粒子は、１種のイオン化可能な脂質（例えば、単一種のイオン化可能な脂質）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのイオン化可能な脂質を含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのイオン化可能な脂質を含む。
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のイオン化可能な脂質を含むことができる。「イオン化可能な脂質」（又は代替的にカチオン性脂質）とは、生理学的ｐＨ（例えば、約７．４のｐＨ）で正電荷又は部分的な正電荷を有する脂質を指す。イオン化可能な脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正と負の電荷の両方を有する中性分子であってもよい。脂質ナノ粒子は、１種のイオン化可能な脂質（例えば、単一種のイオン化可能な脂質）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのイオン化可能な脂質を含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのイオン化可能な脂質を含む。
【0034】
イオン化可能な脂質の例としては、それらに限定されないが、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（1,2-Dilinoleylcarbanioyloxy-3-dimethylaniinopropane）（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（l,2-Dilmoleoyl-3-dimethylammopropane）（ＤＬｍ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（2,2-dilmoleyl-4-(2-dimethylaiiimoethyl)-[l,3]-dioxolane）（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（(6Z,9Z,28Z,3lZ)-heptatriaeonta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate）（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドログリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）、ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（N-(NAN’-dimethylammoethanej-carbam oxl cholesterol）（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲ１Ｅ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ））プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（N-(l-(2,3-dioleyloxy3)propyl)-N-2-(spenninecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylamrnonium trifluoracetate）（ＤＯＳＰＡ）、２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、アミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（aminopropyl-dimethyl-bis(dodecyloxy)-propanaminiumbromide）（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）が挙げられる。
【0035】
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質には、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質には、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）が含まれる。
【0036】
イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子中に様々な量で含めることができる。例えば、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質を、約２０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、例えば、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、又は約４５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質を、２０ｍｏｌ％超、２５ｍｏｌ％超、３０ｍｏｌ％超、３５ｍｏｌ％超、４０ｍｏｌ％超、４５ｍｏｌ％超、５０ｍｏｌ％超、又は５５ｍｏｌ％超で含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質を、６５ｍｏｌ％未満、６０ｍｏｌ％未満、５８ｍｏｌ％未満、５６ｍｏｌ％未満、５４ｍｏｌ％未満、５２ｍｏｌ％未満、５０ｍｏｌ％未満、又は４５ｍｏｌ％未満で含む。
【0037】
Ｃ．リン脂質
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のリン脂質を含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ又は複数の脂肪酸部分を含むことができる。脂質ナノ粒子は、１種のリン脂質（例えば、単一種のリン脂質）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのリン脂質を含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのリン脂質を含む。
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のリン脂質を含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ又は複数の脂肪酸部分を含むことができる。脂質ナノ粒子は、１種のリン脂質（例えば、単一種のリン脂質）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのリン脂質を含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのリン脂質を含む。
【0038】
リン脂質の例としては、それらに限定されないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【0039】
一部の実施形態では、リン脂質（phospholipoid）には、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＧ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＧ、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、リン脂質には、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＯＰＣ、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、リン脂質にはＤＳＰＣが含まれる。一部の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。
【0040】
リン脂質は、脂質ナノ粒子中に様々な量で含めることができる。例えば、脂質ナノ粒子は、リン脂質を、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、例えば、約６ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％～約１６ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、又は約９ｍｏｌ％～約１１ｍｏｌ％で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を、５ｍｏｌ％超、６ｍｏｌ％超、７ｍｏｌ％超、８ｍｏｌ％超、９ｍｏｌ％超、１０ｍｏｌ％超、又は１５ｍｏｌ％超で含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を、２０ｍｏｌ％未満、１９ｍｏｌ％未満、１８ｍｏｌ％未満、１７ｍｏｌ％未満、１６ｍｏｌ％未満、１５ｍｏｌ％未満、１４ｍｏｌ％未満、１３ｍｏｌ％未満、１２ｍｏｌ％未満、１１ｍｏｌ％未満、又は１０ｍｏｌ％未満で含む。
【0041】
Ｄ．ステロール
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のステロールを含むことができる。「ステロール」という用語は、ステロイドアルコールとしても知られるステロイドのサブグループを指す。ステロールは２つのクラス：（１）「フィトステロール」としても知られる植物ステロール、及び（２）「ズーステロール」としても知られる動物ステロール、に通常には分けられる。脂質ナノ粒子は、１種のステロール（例えば、単一種のステロール）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのステロールを含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのステロールを含む。一部の実施形態では、ステロールはズーステロールを含む。
脂質ナノ粒子は、１種又は複数のステロールを含むことができる。「ステロール」という用語は、ステロイドアルコールとしても知られるステロイドのサブグループを指す。ステロールは２つのクラス：（１）「フィトステロール」としても知られる植物ステロール、及び（２）「ズーステロール」としても知られる動物ステロール、に通常には分けられる。脂質ナノ粒子は、１種のステロール（例えば、単一種のステロール）を含む場合があり、又は少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種若しくは少なくとも５種の異なるタイプのステロールを含む場合もある。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２～５種の異なるタイプのステロールを含む。一部の実施形態では、ステロールはズーステロールを含む。
【0042】
ステロールの例としては、それらに限定されないが、コレステロール、カンペステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、スチグマステロール、シトステロール、オキシステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、及びコレスタ－４－エン－３－オンが挙げられる。一部の実施形態では、ステロールには、コレステロール、カンペステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、スチグマステロール、シトステロール、オキシステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、コレスタ－４－エン－３－オン、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、ステロールには、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、コレスタ－４－エン－３－オン、又はそれらの組合せが含まれる。
【0043】
一部の実施形態では、ステロールはコレステロールを含む。一部の実施形態では、ステロールはコレステロールである。コレステロールは、コレステロール自体、又はその塩若しくはそのエステル、例えば、コハク酸コレステロール、硫酸コレステロール、ヘミコハク酸コレステロール、フタル酸コレステロール、リン酸コレステロール、吉草酸コレステロール、酢酸コレステロール、オレイン酸コレステリル、リノール酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、アラキジン酸コレステリル、又はコレステリルホスホリルコリンとすることができる。
【0044】
ステロールには、コレステロールの誘導体が含まれ得る。コレステロールの誘導体例としては、それらに限定されないが、ジヒドロコレステロール、ｅｎｔ－コレステロール、エピコレステロール、デスモステロール、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、３β［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２５（Ｒ）－２７－ヒドロキシコレステロール、２２－オキサコレステロール、２３－オキサコレステロール、２４－オキサコレステロール、シクロアルテノール、２２－ケトステロール、２０－ヒドロキシステロール、７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２２－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、７－デヒドロコレステロール、５α－コレスタ－７－エン－３β－オール、３，６，９－トリオキサオクタン－１－オール－コレステリル－３ｅ－オール、デヒドロエルゴステロール、デヒドロエピアンドロステロン、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、ラノステノール、ルミステロール、シトカルシフェロール、カルシポトリオール、コプロスタノール、コレカルシフェロール、ルペオール、エルゴカルシフェロール、２２－ジヒドロエルゴカルシフェロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、チモステロール、ジオスゲニン、フコステロール、フェコステロール、及びフェコステロール、又はそれらの塩若しくはそれらのエステルが挙げられる。
【0045】
ステロールは、脂質ナノ粒子中に様々な量で含めることができる。例えば、脂質ナノ粒子は、ステロールを、約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、例えば、約１５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、又は約１５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ステロールを、１０ｍｏｌ％超、１５ｍｏｌ％超、２０ｍｏｌ％超、２５ｍｏｌ％超、３０ｍｏｌ％超、又は３５ｍｏｌ％超で含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ステロールを、５０ｍｏｌ％未満、４５ｍｏｌ％未満、４２ｍｏｌ％未満、４０ｍｏｌ％未満、３８ｍｏｌ％未満、又は３５ｍｏｌ％未満で含む。
【0046】
Ｅ．治療薬
脂質ナノ粒子は、１種又は複数の治療薬を含むことができる。治療薬の例としては、それらに限定されないが、核酸及びアニオン性ポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、核酸、アニオン性ポリペプチド、又はその両方を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、核酸又はアニオン性ポリペプチドを含む。
脂質ナノ粒子は、１種又は複数の治療薬を含むことができる。治療薬の例としては、それらに限定されないが、核酸及びアニオン性ポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、核酸、アニオン性ポリペプチド、又はその両方を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、核酸又はアニオン性ポリペプチドを含む。
【0047】
脂質ナノ粒子は、１種又は複数の核酸を含むことができる。核酸は、例えば細胞内でのポリペプチドの産生に用いることができる。核酸の例としては、それらに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、及びＤＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、核酸には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、核酸には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、又はＤＮＡが含まれる。一部の実施形態では、核酸には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＣｉｒｃＲＮＡが含まれる。一部の実施形態では、核酸には、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、核酸にはｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡが含まれる。一部の実施形態では、核酸にはｍＲＮＡが含まれる。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、天然に存在する若しくは天然に存在しない又は他の方法で修飾されたあらゆるポリペプチドを含めて、目的のポリペプチドをコードすることができる。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、任意のサイズのものとすることができ、任意の二次構造又は活性を有することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞内で発現される場合に治療効果を有することができる。
【0048】
核酸はＲＮＡとすることができる。ＲＮＡの例としては、それらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（例えば、目的のタンパク質をコードする）、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ結合部位（ｍｉＲ結合部位）を組み入れるｍＲＮＡ、機能性ＲＮＡエレメントを含む修飾ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴミル、低分子（短）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（ショートマー及びダイサー基質ＲＮＡを含む）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、核酸は配列番号１又は配列番号２を含む。
一部の実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、核酸は配列番号１又は配列番号２を含む。
【0049】
核酸及びアニオン性ポリペプチドは市販のものを購入することができる。代替的に、核酸は、ＤＮＡテンプレートからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することもできる。ＤＮＡテンプレートから核酸を用意する技法及び方法は、実施例に記載のもの等の当技術分野内で公知の技法によって行うことができる。核酸は、配列安定化、キャッピング、及びポリアデニル化によって適用前に修飾することができる。加えて、アニオン性ポリペプチドは、化学合成及び／又は組換え法を介して調製することができる。
【0050】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；コレステロール；ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及びｍＲＮＡを含む。
【0051】
３．医薬組成物
本明細書では、１つ又は複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物がさらに開示される。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、非毒性、不活性な固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は任意のタイプの製剤助剤を意味する。薬学的に許容される賦形剤として利用することができる材料の一部の例は、それらに限定されないが、ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖；それらに限定されないが、トウモロコシデンプン及びバレイショデンプン等のデンプン；それらに限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；それらに限定されないが、ココアバター及び座薬ワックス等の賦形剤；それらに限定されないが、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；それらに限定されないが、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル；寒天；それらに限定されないが、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝化剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール、クエン酸緩衝剤及びリン酸緩衝溶液、並びに、それらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の適合滑沢剤であり、同様に、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤及び香料、保存剤及び抗酸化剤も、配合者の判断に従って、組成物中に同様に存在してもよい。組成物が投与される経路及び組成物の形態によって、使用される賦形剤のタイプを規定することができる。
本明細書では、１つ又は複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物がさらに開示される。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、非毒性、不活性な固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は任意のタイプの製剤助剤を意味する。薬学的に許容される賦形剤として利用することができる材料の一部の例は、それらに限定されないが、ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖；それらに限定されないが、トウモロコシデンプン及びバレイショデンプン等のデンプン；それらに限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；それらに限定されないが、ココアバター及び座薬ワックス等の賦形剤；それらに限定されないが、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；それらに限定されないが、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル；寒天；それらに限定されないが、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝化剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール、クエン酸緩衝剤及びリン酸緩衝溶液、並びに、それらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の適合滑沢剤であり、同様に、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤及び香料、保存剤及び抗酸化剤も、配合者の判断に従って、組成物中に同様に存在してもよい。組成物が投与される経路及び組成物の形態によって、使用される賦形剤のタイプを規定することができる。
【0052】
薬学的に許容される賦形剤は、脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の総質量又は体積の５０％超を構成することができる。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、医薬組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれより多く構成することができる。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋である。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、ヒトでの使用のために及び獣医学的使用のために承認されている。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は医薬品グレードである。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／又は国際薬局方の基準を満たす。
【0053】
医薬組成物及び薬剤の製剤化及び製造についての一般的な指針は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006において入手可能である。従来の何らかの賦形剤又は補助成分が脂質ナノ粒子の１種又は複数の成分と不適合である恐れがある限りを除いて、従来の賦形剤及び補助成分は、あらゆる医薬組成物において使用することができる。賦形剤又は補助成分は、脂質ナノ粒子の成分とのその組合せが、何らかの望ましくない生物学的影響又は他の形で悪影響をもたらす恐れがある場合、脂質ナノ粒子の成分と不適合とすることができる。
【0054】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤には、緩衝化剤、可溶化剤、溶媒、抗菌保存剤、抗酸化剤、懸濁剤、錠剤又はカプセル希釈剤、錠剤崩壊剤、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤には、緩衝化剤、可溶化剤、溶媒、抗菌保存剤、抗酸化剤、懸濁剤、錠剤又はカプセル希釈剤、又は錠剤崩壊剤が含まれる。
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤には緩衝剤が含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤にはクエン酸塩及びアルコールが含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤は、約７０％～約８０％ｍＭのクエン酸塩－エタノール緩衝剤である。一部の実施形態では、緩衝剤は別の緩衝剤に対して透析される。一部の実施形態では、緩衝剤はｔｒｉｓ酢酸緩衝剤に対して透析される。
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤には緩衝剤が含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤にはクエン酸塩及びアルコールが含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤は、約７０％～約８０％ｍＭのクエン酸塩－エタノール緩衝剤である。一部の実施形態では、緩衝剤は別の緩衝剤に対して透析される。一部の実施形態では、緩衝剤はｔｒｉｓ酢酸緩衝剤に対して透析される。
【0055】
医薬組成物は、製薬技術分野の当業者に周知の対象（例えば、ヒトであってもよい患者又は非ヒトであってもよい患畜）への投与に適切とすることができる。医薬組成物は、対象への投与向けに調製することができる。このような医薬組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重及び状態、並びに投与経路等の要因を考慮して、医療技術分野の当業者に周知の投薬量及び技法によって投与することができる。
組成物は、予防的に投与してもよく、治療的に投与してもよい。予防的投与では、組成物は、応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。治療用途では、組成物は、治療効果を引き出すのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することができる。これを達成するのに適当な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与されるコンジュゲートレジメンの特定の組成、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の一般的な健康状態、並びに処方する医師の判断次第である。
組成物は、単回用量で与えるのが、又は適正な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日当たり２、３、４回若しくはそれより多いサブ用量として与えるのが好都合である。サブ用量自体は、例えば、いくつかの別々のおおまかに間隔を開けた投与にさらに分けられる場合もある。
組成物は、予防的に投与してもよく、治療的に投与してもよい。予防的投与では、組成物は、応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。治療用途では、組成物は、治療効果を引き出すのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することができる。これを達成するのに適当な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与されるコンジュゲートレジメンの特定の組成、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の一般的な健康状態、並びに処方する医師の判断次第である。
組成物は、単回用量で与えるのが、又は適正な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日当たり２、３、４回若しくはそれより多いサブ用量として与えるのが好都合である。サブ用量自体は、例えば、いくつかの別々のおおまかに間隔を開けた投与にさらに分けられる場合もある。
【0056】
当業者であれば容易に明らかであるように、投与すべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投薬量及び投与の特定の様式は、年齢、体重、苦痛の重症度、及び治療される対象、用いられる特定の化合物、及びこれらの化合物が用いられる特定の用途によって異なることになる。有効投薬量レベル、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投薬量レベルの決定は、ルーチンな方法、例えばヒト治験、ｉｎ ｖｉｖｏ研究及びｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を使用して、当業者であれば行うことができる。
投薬量及び間隔を個々に調整して、モジュレーション効果又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分である生物学的活性剤の血漿レベルを提供することができる。ＭＥＣは薬剤毎に異なるが、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを得るのに必要な投薬量は、個体の特徴及び投与経路次第である。しかし、当業者に周知のアッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。投薬間隔は、ＭＥＣ値を使用して決定することもできる。組成物は、時間の１０～９０％、例えば３０～９０％の間又は５０～９０％の間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与することができる。局所投与又は選択的取り込みの場合では、薬物の有効局所濃度は血漿濃度と関連していなくてもよい。
投薬量及び間隔を個々に調整して、モジュレーション効果又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分である生物学的活性剤の血漿レベルを提供することができる。ＭＥＣは薬剤毎に異なるが、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを得るのに必要な投薬量は、個体の特徴及び投与経路次第である。しかし、当業者に周知のアッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。投薬間隔は、ＭＥＣ値を使用して決定することもできる。組成物は、時間の１０～９０％、例えば３０～９０％の間又は５０～９０％の間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与することができる。局所投与又は選択的取り込みの場合では、薬物の有効局所濃度は血漿濃度と関連していなくてもよい。
【0057】
医薬組成物は、例えば、対象の様々な特徴及び投与経路に応じて、種々の投薬量で投与してもよい。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、所与の用量で、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで投与することができ、この場合、用量１ｍｇ／ｋｇによって、対象の体重１ｋｇ当たり治療用ナノ粒子又は脂質ナノ粒子１ｍｇを供給する。一部の実施形態では、用量約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの本開示の治療用ナノ粒子又は脂質ナノ粒子を投与する場合がある。
【0058】
主治医であれば、毒性若しくは臓器不全に起因して、投与を終了、中断、若しくは調整する方法及び時期を知っているはずであることに留意されたい。反対に、主治医であればまた、臨床応答が適正ではなかった場合（毒性を除く）に、治療をより高いレベルへと調整することも知っているはずである。目的の障害の管理における投与用量の振幅は、治療する症状の重症度及び投与経路によって異なる。さらに、用量及びおそらく用量頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答に従って異なる。上で論議のものに相当するプログラムを獣医学で使用することができる。
【0059】
４．方法
本明細書では、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物を使用する方法も開示される。脂質ナノ粒子、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、治療薬、及び医薬組成物に関する記載はまた、本明細書に開示の、治療する方法及び細胞に治療薬を送達する方法にも適用することができる。
本明細書では、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物を使用する方法も開示される。脂質ナノ粒子、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、治療薬、及び医薬組成物に関する記載はまた、本明細書に開示の、治療する方法及び細胞に治療薬を送達する方法にも適用することができる。
【0060】
Ａ．疾患又は障害を治療する方法
それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法がさらに提供される。方法は本明細書で開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含むことができる。脂質ナノ粒子は、薬学的に許容される賦形剤と組合せで（例えば、開示された医薬組成物として）投与してもよい。
開示された脂質ナノ粒子は、細胞、組織、臓器、又は対象内でのポリペプチドの産生を容易にすることができる。したがって、いくつかの疾患又は障害がこの能力から恩恵を被ることができる。疾患例又は障害例としては、それらに限定されないが、感染症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、及びがんが挙げられる。一部の実施形態では、疾患又は障害は、感染症、がん、又は自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス等の感染症である。
一部の実施形態では、方法は、感染症に罹患している対象による免疫応答をモジュレートして、それによって対象における感染症病原体に対する免疫応答を増強することができる。治療することができる感染症の非限定的な例としては、ウイルス、細菌、真菌、酵母及び寄生性病原体によって生じる感染症が挙げられる。ウイルスの例としては、それらに限定されないが、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス、ジカ、狂犬病、ＲＳＶ、チクングニア熱、シクロメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラ出血熱、ＨＩＶ－１、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法がさらに提供される。方法は本明細書で開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含むことができる。脂質ナノ粒子は、薬学的に許容される賦形剤と組合せで（例えば、開示された医薬組成物として）投与してもよい。
開示された脂質ナノ粒子は、細胞、組織、臓器、又は対象内でのポリペプチドの産生を容易にすることができる。したがって、いくつかの疾患又は障害がこの能力から恩恵を被ることができる。疾患例又は障害例としては、それらに限定されないが、感染症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、及びがんが挙げられる。一部の実施形態では、疾患又は障害は、感染症、がん、又は自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス等の感染症である。
一部の実施形態では、方法は、感染症に罹患している対象による免疫応答をモジュレートして、それによって対象における感染症病原体に対する免疫応答を増強することができる。治療することができる感染症の非限定的な例としては、ウイルス、細菌、真菌、酵母及び寄生性病原体によって生じる感染症が挙げられる。ウイルスの例としては、それらに限定されないが、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス、ジカ、狂犬病、ＲＳＶ、チクングニア熱、シクロメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラ出血熱、ＨＩＶ－１、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
【0061】
方法は、例えばワクチンによってモジュレートされるような様式で、免疫応答をモジュレートするために使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の核酸によって、樹状細胞又は骨髄細胞等の免疫細胞の活性化又は活性を刺激することができるポリペプチドを供給することができる。例えば、核酸は、ワクチン抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原）等の抗原であるポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に会合する／脂質ナノ粒子によってカプセル化される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、がん抗原又は感染症抗原（例えば、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原虫抗原又は寄生虫抗原）等の目的の抗原をコードする。
【0062】
一部の実施形態では、方法は、がんを患っている対象による免疫応答を刺激して、それによって対象におけるがんに対する免疫応答を増強するために使用される。治療することができるがんの非限定的な例としては、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がん及び下咽頭がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群（難治性貧血及び難治性血球減少症を含む）、骨髄増殖性新生物又は疾患（真性多血症、本態性血小板増多症及び原発性骨髄線維症を含む）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部肉腫、基底及び扁平上皮がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽喉がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、及びがん治療によって引き起こされる二次がんが挙げられる。
【0063】
一部の実施形態では、方法は、自己免疫疾患、アレルギー性障害又は炎症応答を患っている対象を含めて、異常な免疫活性を有する対象による免疫応答をモジュレートするために使用される。治療することができる自己免疫疾患の非限定的な例としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、バセドウ病、橋本甲状腺炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、糸球体腎炎及び血管炎が挙げられる。
他の箇所で論議のように、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物は、有利な免疫特性を有することができる。例えば、投与の後、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物は、ＰＥＧを含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有することができるか；対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応しない可能性があるか；又はそれらの組合せである。
他の箇所で論議のように、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物は、有利な免疫特性を有することができる。例えば、投与の後、脂質ナノ粒子及びその医薬組成物は、ＰＥＧを含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有することができるか；対象において既存の抗ＰＥＧ抗体と反応しない可能性があるか；又はそれらの組合せである。
【0064】
Ｂ．治療薬を細胞に送達する方法
治療薬を細胞に送達する方法も提供される。方法は、細胞を本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子又はその医薬組成物と接触させるステップによって、細胞に治療薬を送達することを含むことができる。一部の実施形態では、治療薬は核酸である。細胞を脂質ナノ粒子と接触させるステップにより、粒子を、例えばエンドサイトーシスによって内在化させることができ、核酸（例えばｍＲＮＡ）は細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる。
細胞を接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養中で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。細胞と接触させる脂質ナノ粒子の量、及び／又はその中の治療薬の量は、接触する細胞又は組織のタイプ、投与手段、脂質ナノ粒子及びその中の治療薬の物理化学的特徴（例えば、サイズ、電荷及び化学組成）、並びにその他の要因次第であってもよい。脂質ナノ粒子又はその医薬組成物の有効量によって、細胞内での効率的なポリペプチド産生を可能にすることができる。効率の測定基準には、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び／又は免疫応答指標が含まれ得る。
治療薬を細胞に送達する方法も提供される。方法は、細胞を本明細書に開示の１つ又は複数の脂質ナノ粒子又はその医薬組成物と接触させるステップによって、細胞に治療薬を送達することを含むことができる。一部の実施形態では、治療薬は核酸である。細胞を脂質ナノ粒子と接触させるステップにより、粒子を、例えばエンドサイトーシスによって内在化させることができ、核酸（例えばｍＲＮＡ）は細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる。
細胞を接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養中で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。細胞と接触させる脂質ナノ粒子の量、及び／又はその中の治療薬の量は、接触する細胞又は組織のタイプ、投与手段、脂質ナノ粒子及びその中の治療薬の物理化学的特徴（例えば、サイズ、電荷及び化学組成）、並びにその他の要因次第であってもよい。脂質ナノ粒子又はその医薬組成物の有効量によって、細胞内での効率的なポリペプチド産生を可能にすることができる。効率の測定基準には、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び／又は免疫応答指標が含まれ得る。
【0065】
標的とすることができる又は送達することができる細胞のタイプは一般に限定されるものではない。したがって、無数の細胞タイプを本明細書に開示の方法で使用することができる。細胞例としては、それらに限定されないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞が挙げられる。
他の箇所で記載のように、脂質ナノ粒子に含まれる核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ワクチン抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原）等の抗原であるポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に会合する／脂質ナノ粒子によってカプセル化される核酸は、がん抗原又は感染症抗原等の抗原をコードする。
他の箇所で記載のように、脂質ナノ粒子に含まれる核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ワクチン抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原）等の抗原であるポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に会合する／脂質ナノ粒子によってカプセル化される核酸は、がん抗原又は感染症抗原等の抗原をコードする。
【0066】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中に含まれる核酸は、脂質ナノ粒子と接触させる細胞においては実質的に存在してない場合がある、１種又は複数のポリペプチドに取って代わることができる組換えポリペプチドをコードすることができる。１種又は複数の実質的に存在していないポリペプチドは、コードする遺伝子又はその調節経路の遺伝子突然変異に起因して欠落している場合がある。或いは、核酸の翻訳により生成される組換えポリペプチドは、細胞中に存在するか、細胞の表面上に存在するか、又は細胞から分泌される内因性タンパク質の活性をアンタゴナイズすることができる。アンタゴニスト性組換えポリペプチドは、内因性タンパク質の活性により引き起こされる悪影響、例えば突然変異により引き起こされる活性又は局在化の変更と闘うために望ましい場合がある。一部の実施形態では、核酸の翻訳により生成される組換えポリペプチドは、細胞中に存在するか、細胞の表面上に存在するか、又は細胞から分泌される生物学的部分の活性を間接的又は直接的にアンタゴナイズすることができる。アンタゴナイズされる生物学的部分には、それらに限定されないが、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、及び小分子毒素が含まれ得る。核酸の翻訳により生成される組換えポリペプチドは、細胞内での、例えば核等の特異的コンパートメント内での局在化に向けて操作することができ、又は、細胞からの分泌に向けて若しくは細胞の原形質膜へのトランスロケーションに向けて操作することができる。
【0067】
疾患又は障害を治療する方法には、細胞に治療薬を送達することが含まれる場合があるので、細胞に治療薬を送達する方法に関する記載は、疾患又は障害を治療する方法にも適用することができる。同様に、疾患又は障害を治療する方法に関する記載は、細胞に治療薬を送達する方法にも（適用できる場合には）適用することができる。
開示される発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例によって例示される。
開示される発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【0068】
５．実施例
（実施例１）
材料及び方法
一般材料。特に別途明記しない限り、全ての化学物質はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。全ての溶媒はＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）から購入した。１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（１６ＤＢＣＯ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から調達した。（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）［ＳＭ－１０２］はＳＩＮＯＰＥＧ（中国）から入手した。ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子をコードするｐＣＭＶ－ＣＬｕｃ２、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ、及びＭｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ＫｉｔはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉｔ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、及びクエン酸緩衝剤はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手した。ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット及びプロテイナーゼＫはＰｒｏｍｅｇａから調達した。
（実施例１）
材料及び方法
一般材料。特に別途明記しない限り、全ての化学物質はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。全ての溶媒はＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）から購入した。１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（１６ＤＢＣＯ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から調達した。（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）［ＳＭ－１０２］はＳＩＮＯＰＥＧ（中国）から入手した。ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子をコードするｐＣＭＶ－ＣＬｕｃ２、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ、及びＭｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ＫｉｔはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉｔ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、及びクエン酸緩衝剤はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手した。ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット及びプロテイナーゼＫはＰｒｏｍｅｇａから調達した。
【0069】
アジドＰＯＥＧＭＡ（ＰＯＥＧＭＡ5-50）の合成。トリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレートを塩基性アルミナに通して、フリーラジカル阻害剤を除去した。臭化銅（ＩＩ）及びｔｒｉｓ（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）を超純水中で混合して、最終濃度０．０１Ｍ ＣｕＢｒ2及び０．０８Ｍ ＴＰＭＡを含む触媒錯体を調製した。氷浴上に置いたシュレンクフラスコに、以下：トリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（１０ｍｍｏｌ、２．２６ｍＬ）、メタノール（５．８ｍＬ）、Ｃｕ触媒錯体（０．０１ｍｍｏｌ、１ｍＬ）、水－ＮａＣｌ溶液（２ｍｍｏｌ、０．５Ｍから４ｍｌ）、アジドエチル－２－ブロモイソブチレート（０．１ｍｍｏｌ、１６．４μＬ）を添加し、フラスコをセプタムで密封した。別のシュレンクフラスコで、超純水中のアスコルビン酸フレッシュ溶液（６４ｍＭ、２ｍＬ）を調製した。両方のフラスコを氷浴中で低温に維持し、アルゴンで４５分間パージして酸素を除去した。脱酸素後、不活性雰囲気下でシリンジポンプを使用して０．００１ｍＬ／分の速度で重合フラスコへと様々な時間にわたってアスコルビン酸溶液を連続注入して、様々な分子量を得た。生成する溶液を空気で１時間パージして反応をクエンチし、次いで水に対して４日間透析した。次いで、透析溶液を凍結乾燥して、アジドＰＯＥＧＭＡを粘稠なゲルとして得、これを－２０℃で保存した。様々なＭＷのアジドＰＯＥＧＭＡを合成するための条件を下の表１に与える。
【0070】
【表1】
【0071】
ゲル浸透クロマトグラフィー－多角光散乱（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）。ＧＰＣ－ＭＡＬＳを使用して、ＰＯＥＧＭＡポリマーのサイズ及び分散性を特徴付けた。全てのＧＰＣ実験を、溶離液としてＴＨＦ（１００ｐｐｍ ＢＨＴで安定化）を使用して、２本のインラインカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬｇｅｌ混合－Ｃカラム１０５Å、７．５×３００ｍｍ、５μｍ、部品番号ＰＬ１１１０－６５００）で室温で実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｉｓｏｃｒａｔｉｃポンプを使用して、流量１ｍｌ／分に設定した。インラインＷｙａｔｔ－ＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ ＭＡＬＳ検出器及びＷｙａｔｔ－Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ屈折率検出器を使用して、分子量を決定した。屈折率増加（ｄｎ／ｄｃ）値を、試料の既知の濃度と質量に対してＷｙａｔｔ Ａｓｔｒａソフトウェアに内蔵されるオンライン１００％質量回収仮定法を使用することによって決定した。ＵＶ吸光度を、インラインＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＶ検出器を用いて測定した。試料２ｍｇをＨＰＬＣグレードＴＨＦ １ｍｌに溶解させ、孔径０．２μｍの無機膜シリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、Ａｎｏｔｏｐ（商標）１０）を通して濾過することによって、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ分析用の全試料を調製した。
【0072】
ＰＯＥＧＭＡ化脂質（ＰＯＥＧＭＡＬ5-50）の合成。アジドＰＯＥＧＭＡ10-50１００ｍｇを２０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解させた。５モル過剰の１６ ＤＢＣＯ ＰＥを添加し、溶液を３７℃のシェーカーで２４時間インキュベートした。反応物を、移動相としてクロロホルム中１０％メタノール（ｖ／ｖ）を使用する薄層クロマトグラフィーでモニタリングした。２４時間後、反応混合物を蒸発させ、ＰＯＥＧＭＡＬ5を除いて、１０％クロロホルムヘキサン混合物から再沈殿させた。ＰＯＥＧＭＡＬ5の場合、１０％メタノールヘキサン混合物を使用した。３～４ラウンドの再沈殿により、純粋なＰＯＥＧＭＡ化脂質が＞９０％の収率で得られた。
【0073】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）。ＰＯＥＧＭＡ5-50の純度を、固定相としてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラム及び移動相として１ｍＬ／分にてのメタノールを使用する逆相ＨＰＬＣによって評価した。化合物を、インラインＵＶ検出器を使用して２３０ｎｍで検出した。
ＮＭＲ分光法。ＮＭＲを、ＢＢＯ室温プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ １６．４ Ｔｅｓｌａ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、英国）で実施した。ＰＯＥＧＭＡＬ5-50をＣＤＣｌ3に可溶化させ、溶液を１Ｄ次元性1Ｈ分光分析で調査した。データはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ ｘ６４を使用して処理した。
ＮＭＲ分光法。ＮＭＲを、ＢＢＯ室温プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ １６．４ Ｔｅｓｌａ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、英国）で実施した。ＰＯＥＧＭＡＬ5-50をＣＤＣｌ3に可溶化させ、溶液を１Ｄ次元性1Ｈ分光分析で調査した。データはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ ｘ６４を使用して処理した。
【0074】
ｍＲＮＡの合成及びアガロースゲル電気泳動。ウミホタルルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（テーリング付き）（ＮＥＢカタログ番号：Ｅ２０６０Ｓ）を使用して合成した。簡潔に述べると、レポーター遺伝子ルシフェラーゼをコードするプラスミドｐＣＭＶ－ＣＬｕｃ２（ＮＥＢカタログ番号：Ｎ０３２１）を、ＸｂａＩ（２０ユニット／μｇ ＤＮＡ）によって３７℃で３０分間線状化し、Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒスピンカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：Ｄ４０６０）を使用して精製した。遺伝子の下流のプラスミド線状化によって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる長い異種転写物の生成が回避される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応物２０μＬを、線状プラスミド１μｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼミックス２μＬ及び１×リボヌクレオチドミックス（１ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭアンチリバースキャップアナログ、１．２５ｍＭ ＣＴＰ、１．２５ｍＭ ＵＴＰ、最終＞１．２５ ｍＭ ＡＴＰ）でセットした。反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＩＶＴ反応におけるＤＮＡテンプレートを、０．２Ｕ／μＬの濃度にてのＤＮａｓｅＩを使用して消化し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応物１００μＬでポリ（Ａ）ポリメラーゼ５μＬを使用して、１×ポリ（Ａ）緩衝剤中でポリ（Ａ）テーリングを実施した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。合成した成熟ｍＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢカタログ番号：Ｔ２０５０）を使用して精製し、ＲＮＡ保存緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：ＡＭ７００１）２０μＬで溶出した。
【0075】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質ｍＲＮＡのＤＮＡテンプレートを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して自社で組み立てた。非翻訳領域（ＵＴＲ）を含めてＷｕｈａｎ株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１－１２７３、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）をコードするｇｂｌｏｃｋを、ＵＴＲとともにｐＣＭＶベクターに組み立てた。具体的には、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率を向上させるために、（ｉ）コザック配列を有するヒトアルファ－グロビン５’ＵＴＲをタンパク質コード配列の上流に組み込み、（ｉｉ）ミトコンドリアでコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）及びスプリットのアミノ－末端エンハンサー（ＡＥＳ）に由来する３‘ＵＴＲを下流にタンデムに組み込み、（ｉｉｉ）共転写テーリングに向けて、１０ｎｔリンカー（Ａ３０ＬＡ７０、Ｌ＝ＧＣＡＵＡＵＧＡＣＵ）によって中断されるポリＡテールをテンプレートの３’末端に組み込んだ。これらのエレメントを、ＷＨＯ国際「医薬品一般名称プログラム」からアクセスしたｍＲＮＡ配列に基づいて選択した。Ｔ７プロモーター配列もＣｌｅａｎＣａｐ－ＡＧ（Ｃａｐ１）との共転写キャッピングに向けて修飾し、ＢｂｓＩ部位をスカーレスランオフ転写に向けて導入した。テンプレート配列をサンガー配列決定法によって検証し、プラスミドをＮＥＢ－５－アルファコンピテント細胞に形質転換した。ｐＣＭＶ－ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ｓプラスミドをＱｉａｇｅｎのプラスミド精製キットを使用して精製し、ＢｂｓＩを使用して線状化した。典型的なＩＶＴ反応物は、１×転写緩衝剤（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ＝７．５）、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ、製造業者（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）によって推奨される濃度にてのリボヌクレアーゼ阻害剤、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ、それぞれ２．５ｍＭ又は５ｍＭ）、Ｃｌｅａｎｃａｐ ＡＧ（３’ＯＭｅ）（ＧＴＰの８０％）及びＭｇＣｌ2を含み、典型的なＩＶＴ反応物を３７℃で２時間又は４時間インキュベートした。副生成物を最小限に抑えるために、Ｍｇ：ＮＴＰ比、総ＮＴＰ濃度、及びインキュベーション時間を最適化した。ｍＲＮＡを、ＮＥＢのＭｏｎａｒｃｈ ｍＲＮＡ精製キットを使用して精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して定量化した。ｍＲＮＡの品質を、ＲＮＡローディング色素を添加し、試料を６５℃で１０分間変性させた後、ＴＡＥ緩衝剤中で１３０ｍＶで３０分間ランさせる１％アガロースゲル電気泳動によって検証した。ゲルを、ＳｙＢｒ ｓａｆｅ染色によって画像化した。
【0076】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤。ＬＮＰを、広く使用されているエタノール注入法を使用することによって調製した（双方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Duong et al., Preparation of Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers for Drug Delivery and the Effects of Preparation Parameters of Solvent Injection Method. Molecules 2020, 25 (20), 1-36及びGanesan et al., Lipid Nanoparticles: Different Preparation Techniques, Characterization, Hurdles, and Strategies for the Production of Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers for Oral Drug Delivery. Sustain. Chem. Pharm. 2017, 6, 37-56を参照されたい）。簡潔に述べると、イオン化可能な脂質ＳＭ－１０２、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びステルス脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧ又はＰＯＥＧＭＡＬ5-50）を５０：１０：３８．５：０．５～２．５ｍｏｌ％でエタノールに溶解させた。上記の脂質混合物を含有するエタノール溶液（１容量）を、４：１～８：１の窒素（ＳＭ－１０２由来）とリン（ｍＲＮＡ由来）のモル比（Ｎ：Ｐ）でｍＲＮＡを含有する１０ｍＭクエン酸緩衝剤（ｐＨ４）４容量へと速やかに注入した。特に言及のない限り、ＬＮＰPOEGMAL5-50をＮ：Ｐ ８：１で調製し、一方、ＬＮＰPEG-DMGを６：１で調製した。生成する溶液をＰＢＳに対して２４時間透析し、４℃で保存した。
【0077】
緩衝剤組成物。以下の緩衝剤を、ｍＲＮＡをロードしたＬＮＰPOEGMAL(n)及びＬＮＰPEG-DMGの透析に使用した：Ａ）Ｐｆｉｚｅｒ：１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝剤、３００ｍＭスクロース、ｐＨ７．４。Ｂ）Ｍｏｄｅｒｎａ：Ｔｒｉｓ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２．５ｍｇ／ｍＬ）、氷酢酸（０．０４２ｍｇ／ｍＬ）、酢酸ナトリウム三水和物（０．２ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（８７ｍｇ／ｍＬ）。
動的光散乱（ＤＬＳ）研究。全てのＬＮＰの流体力学的半径（Ｒh）及び多分散性を、温度がプログラムされたＤｙｎａＰｒｏマイクロサンプラー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。試料をＰＢＳ中で調製し、透明平底の黒色９６ウェルプレートへと濾過した（０．２μｍセルロースフィルター）。少なくとも１５回の取得を２５℃で行い、収集データは、ＤＹＮＡＭＩＣＳ ｖ７ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して自己相関関数の正則化フィットによって解析した。
動的光散乱（ＤＬＳ）研究。全てのＬＮＰの流体力学的半径（Ｒh）及び多分散性を、温度がプログラムされたＤｙｎａＰｒｏマイクロサンプラー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。試料をＰＢＳ中で調製し、透明平底の黒色９６ウェルプレートへと濾過した（０．２μｍセルロースフィルター）。少なくとも１５回の取得を２５℃で行い、収集データは、ＤＹＮＡＭＩＣＳ ｖ７ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して自己相関関数の正則化フィットによって解析した。
【0078】
Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを、非透析試料に対して実施した。製造業者のプロトコルに従って、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイキットを使用して、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝剤中の１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の有り又は無しで、ＬＮＰをｍＲＮＡについて評価した。ＬＮＰ試料を１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とともに室温で５分間インキュベートして、ＬＮＰの破壊を行った。カプセル化効率を、式：カプセル化％＝（ＲＦＵｆ－ＲＦＵｉ）／ＲＦＵｆ＊１００（式中、ＲＦＵｉ及びＲＦＵｆは、それぞれＴｒｉｔｏｎｘ－１００をＬＮＰに添加する前及び添加した後の相対蛍光単位である）を使用することによって算出した。
【0079】
細胞培養。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＤｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ施設から入手した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（熱不活化、Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞は５％ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で維持した。
ルシフェラーゼ発現アッセイ。アッセイを、製造業者の推奨プロトコルに従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ（１×１０4個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ2中３７℃で一晩インキュベートした。培地を除去し、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μＬ／ウェルに調製したｍＲＮＡ ３００ｎｇ又は５００ｎｇで処理し、５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造業者のプロトコルに従って使用した。ルシフェラーゼの発現を、トランスフェクト細胞からの培地５μＬを、キット付属のアッセイ緩衝剤中の１×Ｖａｒｇｕｌｉｎ ２５μＬに添加することによって、所定の時点でモニタリングした。室温で１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋのＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ハイブリッドマルチモードリーダーを使用して、発光を４６３ｎｍで定量化した。
ルシフェラーゼ発現アッセイ。アッセイを、製造業者の推奨プロトコルに従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ（１×１０4個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ2中３７℃で一晩インキュベートした。培地を除去し、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μＬ／ウェルに調製したｍＲＮＡ ３００ｎｇ又は５００ｎｇで処理し、５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造業者のプロトコルに従って使用した。ルシフェラーゼの発現を、トランスフェクト細胞からの培地５μＬを、キット付属のアッセイ緩衝剤中の１×Ｖａｒｇｕｌｉｎ ２５μＬに添加することによって、所定の時点でモニタリングした。室温で１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋのＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ハイブリッドマルチモードリーダーを使用して、発光を４６３ｎｍで定量化した。
【0080】
細胞傷害性アッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに３０００個の細胞／ウェルで処理の１６時間前に播種した。細胞を一連の濃度の種々のＬＮＰで処理した。処理の４８時間後、膜不全である細胞からの放出乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＬＤＨ－ｇｌｏアッセイキットを用いて評価した。
ＲＮａｓｅ保護アッセイ。ＣＬｕｃ ｍＲＮＡ ３００ｎｇを含有するＬＮＰを、最終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘの添加前又は添加後に、３３３ｐｇ ＲＮａｓｅ／μｇ ｍＲＮＡとともに３７℃で２時間インキュベートした。最終的に、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ／ＣａＣｌ2緩衝剤中の１×プロテイナーゼＫとともに５５℃で２０分間試料をインキュベートすることによってＲＮａｓｅをクエンチした。試料を、前記のように１％アガロースゲル上で流した。
ＲＮａｓｅ保護アッセイ。ＣＬｕｃ ｍＲＮＡ ３００ｎｇを含有するＬＮＰを、最終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘの添加前又は添加後に、３３３ｐｇ ＲＮａｓｅ／μｇ ｍＲＮＡとともに３７℃で２時間インキュベートした。最終的に、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ／ＣａＣｌ2緩衝剤中の１×プロテイナーゼＫとともに５５℃で２０分間試料をインキュベートすることによってＲＮａｓｅをクエンチした。試料を、前記のように１％アガロースゲル上で流した。
【0081】
（実施例２）
アジドＰＯＥＧＭＡ（ＰＯＥＧＭＡ5-50）の合成及び特性評価
ＰＯＥＧＭＡ化脂質（ＰＯＥＧＭＡＬ）を、２つの構成要素：ＰＯＥＧＭＡポリマー及び脂肪酸テールのクリックコンジュゲーションを使用して合成した。ＤＢＣＯ修飾脂肪酸テール（１６：０ ＤＢＣＯ ＰＥ）は商業的に入手したが、一方、アジド修飾ＰＯＥＧＭＡポリマーは自社で合成した（スキーム１）。簡潔に述べると、銅（ＩＩ）－ｔｒｉｓ（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）触媒錯体を、不活性雰囲気下で氷浴中でトリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート及びアジドエチル－２－ブロモイソブチレートとともにインキュベートした。アスコルビン酸のフレッシュ溶液をフラスコに連続的に添加することによって反応を開始した。完了時に、混合物を空気でパージすることによって反応をクエンチした。アジドＰＯＥＧＭＡを水に対して透析することによって精製し、凍結乾燥された粘稠なゲルとして保存した。
アジドＰＯＥＧＭＡ（ＰＯＥＧＭＡ5-50）の合成及び特性評価
ＰＯＥＧＭＡ化脂質（ＰＯＥＧＭＡＬ）を、２つの構成要素：ＰＯＥＧＭＡポリマー及び脂肪酸テールのクリックコンジュゲーションを使用して合成した。ＤＢＣＯ修飾脂肪酸テール（１６：０ ＤＢＣＯ ＰＥ）は商業的に入手したが、一方、アジド修飾ＰＯＥＧＭＡポリマーは自社で合成した（スキーム１）。簡潔に述べると、銅（ＩＩ）－ｔｒｉｓ（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）触媒錯体を、不活性雰囲気下で氷浴中でトリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート及びアジドエチル－２－ブロモイソブチレートとともにインキュベートした。アスコルビン酸のフレッシュ溶液をフラスコに連続的に添加することによって反応を開始した。完了時に、混合物を空気でパージすることによって反応をクエンチした。アジドＰＯＥＧＭＡを水に対して透析することによって精製し、凍結乾燥された粘稠なゲルとして保存した。
【0082】
スキーム１：アジドＰＯＥＧＭＡの合成
【化1】
【0083】
アジドＰＯＥＧＭＡの５種のバリアントを５～５０ｋＤａの範囲のＭＷをもって合成した。アジドＰＯＥＧＭＡの数平均分子量（Ｍn）、質量平均分子量（Ｍw）、及び多分散性（Ｄ）を、ゲル浸透クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）によって評価した。ＧＰＣ－ＭＡＬＳの結果により、アジドＰＯＥＧＭＡのサイズ及び狭い多分散性が確認された（表２及び図１Ａ）。重合度（ｎ）を、ＰＯＥＧＭＡのＭwから重合開始剤のＭwを差し引き、生成する質量をモノマー単位の平均Ｍwで割ることによって算出した（表２）。アジドＰＯＥＧＭＡの純度もまた、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。２３０ｎｍにての全てのＰＯＥＧＭＡのＨＰＬＣトレースにより、９５％超の純度が確認された（図１Ｂ）。この構造を、種々のプロトンの積分比を算出することによって1ＨＮＭＲを用いてさらに確認したが、これは予想された構造とぴったりと合致した。最終的に、アジドの組込みを、アジド－ＰＯＥＧＭＡを過剰のＤＢＣＯ－ＰＥＧ4と反応させることによって確認した。ＤＢＣＯは３０８ｎｍに特徴的な吸光度を有し、この吸光度はＤＢＣＯの濃度に比例する。ＤＢＣＯはＰＯＥＧＭＡポリマーのアジド基とほぼ１００％の効率で反応するので、未反応ＤＢＣＯの濃度を算出することで、反応混合物中のアジドの濃度を決定することが可能になる。４４時間目のＤＢＣＯ－ＰＥＧ4とのアジドＰＯＥＧＭＡ5-50の反応が示したところは、全てのＰＯＥＧＭＡポリマーにおける９０％超のアジド含有量である。
【0084】
【表2】
【0085】
（実施例３）
ＰＯＥＧＭＡ－脂質（ＰＯＥＧＭＡＬ5-50）の合成及び特性評価
アジドＰＯＥＧＭＡ5-50を、ひずみ促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）によってクロロホルム中で５モル過剰の１６ＤＢＣＯ ＰＥとクリックコンジュゲートさせて、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート（ＰＯＥＧＭＡＬ5-50）を得た。反応の２４時間後、過剰のヘキサンを用いて５ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬについてはメタノールから又は１０～５０ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬについてはクロロホルムから再沈殿させることによって生成物を精製した（図２Ａ）。ペレットをメタノールに最終的に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣに供した。典型的な薄層クロマトグラフィープレートを図２Ｂに示す。ＰＯＥＧＭＡＬ10はＰＯＥＧＭＡ10よりもゆっくりと移動した。また、アジドＰＯＥＧＭＡの典型的な物理的外観は透明であるが、一方、ＰＯＥＧＭＡＬの物理的外観は不透明である（図２Ｃ）。ＨＰＬＣトレースにおいて未反応のＰＯＥＧＭＡ5-50ピークが非存在であったことにより、ＰＯＥＧＭＡ5-50及び１６ ＤＢＣＯ ＰＥはそれぞれの反応で完全に消費されたことが示される。予想どおり、疎水性脂質残基の添加後、ＰＯＥＧＭＡＬの保持時間はＰＯＥＧＭＡと比較して大きくなる。
ＰＯＥＧＭＡ－脂質（ＰＯＥＧＭＡＬ5-50）の合成及び特性評価
アジドＰＯＥＧＭＡ5-50を、ひずみ促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）によってクロロホルム中で５モル過剰の１６ＤＢＣＯ ＰＥとクリックコンジュゲートさせて、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート（ＰＯＥＧＭＡＬ5-50）を得た。反応の２４時間後、過剰のヘキサンを用いて５ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬについてはメタノールから又は１０～５０ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬについてはクロロホルムから再沈殿させることによって生成物を精製した（図２Ａ）。ペレットをメタノールに最終的に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣに供した。典型的な薄層クロマトグラフィープレートを図２Ｂに示す。ＰＯＥＧＭＡＬ10はＰＯＥＧＭＡ10よりもゆっくりと移動した。また、アジドＰＯＥＧＭＡの典型的な物理的外観は透明であるが、一方、ＰＯＥＧＭＡＬの物理的外観は不透明である（図２Ｃ）。ＨＰＬＣトレースにおいて未反応のＰＯＥＧＭＡ5-50ピークが非存在であったことにより、ＰＯＥＧＭＡ5-50及び１６ ＤＢＣＯ ＰＥはそれぞれの反応で完全に消費されたことが示される。予想どおり、疎水性脂質残基の添加後、ＰＯＥＧＭＡＬの保持時間はＰＯＥＧＭＡと比較して大きくなる。
【0086】
コンジュゲーションをさらに確認するために、1ＨＮＭＲ分析を行った。最終的なＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートのＮＭＲスペクトログラムは、ＰＯＥＧＭＡ5-50と１６ＤＢＣＯ ＰＥの両方のトレースを保有し、このことは、コンジュゲーションの成功を示す。ＰＯＥＧＭＡＬ5-50ではδおよそ７．３～７．８ｐｐｍに芳香族プロトンが存在することで、ＤＢＣＯ修飾脂肪酸テールのＰＯＥＧＭＡ骨格への統合が成功したことが示唆されている。ＰＯＥＧＭＡ5-50及び１６ＤＢＣＯ ＰＥ脂質には、デコンボリューションするのが困難である重複領域がいくつかあり、１６ＤＢＣＯ ＰＥの芳香族領域（化学シフトδおよそ７．３～７．８ｐｐｍ）のみがこの重複領域から遠く離れている。したがって、δおよそ０．５～２．５ｐｐｍの間と７．３～７．８の間との積分比（Ｉ0.5-2.5／Ｉ7.3-7.8）を使用してプロトン比を算出した（図２Ｄ）。理論比と実験比の間の差異は、（ｉ）プロトン数がδおよそ７．３～７．８ｐｐｍよりもδおよそ０．５～２．５ｐｐｍで大きく、このことによって感度が抑制される可能性があるためである；及び／又は（ｉｉ）δおよそ７．３～７．８ｐｐｍ領域の残留溶媒ピークが算出を妨げる可能性があるためであると推定される。それにもかかわらず、まとめると、これら全てのデータによれば、ＰＯＥＧＭＡ化脂質の合成及び精製の成功が強く示唆されている。
【0087】
（実施例４）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤及び特性評価
ＬＮＰを、括弧内に示されたｍｏｌ％をもって異なる４種の共脂質を用いてエタノール注入法を使用して製剤化した：（ｉ）イオン化可能な脂質（ＳＭ１０２）、これは、ｍＲＮＡをカプセル化する一助となる、安定性をもたらす、及びエンドソーム脱出の成功に向けて粒子の一助となる（５０ｍｏｌ％）；（ｉｉ）ＤＳＰＣ（１０ｍｏｌ％）；（ｉｉｉ）コレステロール（３８．５ｍｏｌ％）；並びに（ｉｖ）市販のＰＥＧ－ＤＭＧ又は自社合成ＰＯＥＧＭＡ化脂質のいずれかであるステルス脂質（１．５ｍｏｌ％）。この脂質比は、ＰＥＧ化脂質向けに特別に仕立てられており、ＰＯＥＧＭＡ化脂質を含むＬＮＰを製剤化するための良好な出発点をもたらす。ＰＥＧ－ＤＭＧを含むＬＮＰ製剤はベンチマークとして機能し、こういった脂質組成物はＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ ＣＯＶＩＤ１９ワクチンでも使用された。留意されたいこととは、１０～５０ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬが、ＬＮＰのｍＲＮＡカプセル化効率に対するＭＷ及び脂質比の役割に関する最初の研究に使用され、研究の後半部分ではＰＯＥＧＭＡＬ５が組み込まれたことである。少容量のエタノールに可溶化させた脂質を、ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するクエン酸緩衝剤（ｐＨ４）に迅速に注入して、ＬＮＰを得た。次いで、ＬＮＰを４℃でＰＢＳと緩衝剤交換した。ｍＲＮＡを全く含まない一連のＬＮＰも合成した。動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ナノ粒子の形成を特徴付けた。図３Ａ及び図３Ｂにまとめられているように、ステルス脂質を使用した場合に安定なＬＮＰが得られた。ＰＥＧ化脂質又はＰＯＥＧＭＡ化脂質を含まないＬＮＰはより混濁しているように見え、高い多分散性を有し、Ｒh＞６００ｎｍを提示した。対照的に、他の全てのＬＮＰは半透明であり、狭い多分散性をもって１００ｎｍ未満Ｒhを有した（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃ）。ｍＲＮＡのカプセル化は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＯＥＧＭＡＬ10、及びＰＯＥＧＭＡＬ20についてはナノ粒子のサイズを有意に変化させることはなかった。ＰＯＥＧＭＡＬ40及びＰＯＥＧＭＡＬ50を含むＬＮＰのＲhは、ｍＲＮＡカプセル化後、それぞれ１．３倍及び１．９倍拡大した（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤及び特性評価
ＬＮＰを、括弧内に示されたｍｏｌ％をもって異なる４種の共脂質を用いてエタノール注入法を使用して製剤化した：（ｉ）イオン化可能な脂質（ＳＭ１０２）、これは、ｍＲＮＡをカプセル化する一助となる、安定性をもたらす、及びエンドソーム脱出の成功に向けて粒子の一助となる（５０ｍｏｌ％）；（ｉｉ）ＤＳＰＣ（１０ｍｏｌ％）；（ｉｉｉ）コレステロール（３８．５ｍｏｌ％）；並びに（ｉｖ）市販のＰＥＧ－ＤＭＧ又は自社合成ＰＯＥＧＭＡ化脂質のいずれかであるステルス脂質（１．５ｍｏｌ％）。この脂質比は、ＰＥＧ化脂質向けに特別に仕立てられており、ＰＯＥＧＭＡ化脂質を含むＬＮＰを製剤化するための良好な出発点をもたらす。ＰＥＧ－ＤＭＧを含むＬＮＰ製剤はベンチマークとして機能し、こういった脂質組成物はＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ ＣＯＶＩＤ１９ワクチンでも使用された。留意されたいこととは、１０～５０ｋＤａのＰＯＥＧＭＡＬが、ＬＮＰのｍＲＮＡカプセル化効率に対するＭＷ及び脂質比の役割に関する最初の研究に使用され、研究の後半部分ではＰＯＥＧＭＡＬ５が組み込まれたことである。少容量のエタノールに可溶化させた脂質を、ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するクエン酸緩衝剤（ｐＨ４）に迅速に注入して、ＬＮＰを得た。次いで、ＬＮＰを４℃でＰＢＳと緩衝剤交換した。ｍＲＮＡを全く含まない一連のＬＮＰも合成した。動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ナノ粒子の形成を特徴付けた。図３Ａ及び図３Ｂにまとめられているように、ステルス脂質を使用した場合に安定なＬＮＰが得られた。ＰＥＧ化脂質又はＰＯＥＧＭＡ化脂質を含まないＬＮＰはより混濁しているように見え、高い多分散性を有し、Ｒh＞６００ｎｍを提示した。対照的に、他の全てのＬＮＰは半透明であり、狭い多分散性をもって１００ｎｍ未満Ｒhを有した（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃ）。ｍＲＮＡのカプセル化は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＯＥＧＭＡＬ10、及びＰＯＥＧＭＡＬ20についてはナノ粒子のサイズを有意に変化させることはなかった。ＰＯＥＧＭＡＬ40及びＰＯＥＧＭＡＬ50を含むＬＮＰのＲhは、ｍＲＮＡカプセル化後、それぞれ１．３倍及び１．９倍拡大した（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。
【0088】
（実施例５）
ｍＲＮＡカプセル化効率の定量化
ＬＮＰのｍＲＮＡカプセル化効率を、アガロース電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して第１に定性的に評価した。遊離ｍＲＮＡのみがアガロースゲルをとおって泳動するので － ＬＮＰｍＲＮＡは泳動しないが － 製剤中のＬＮＰ ｍＲＮＡから遊離ｍＲＮＡを分離することができる。ｍＲＮＡの総量は － カプセル化された及び遊離の － カプセル化されたｍＲＮＡを放出するＴｒｉｔｏｎ－Ｘ等の界面活性剤でＬＮＰを破裂させることにより、アガロースゲル上で推定した。均等の濃度にての遊離ｍＲＮＡは、実験の対照としての役割を果たす。電気泳動実験により、調製及び保存過程でのｍＲＮＡのあらゆる分解が同様に示される。図４Ａからわかるように、全てのＬＮＰは相当量のｍＲＮＡをカプセル化した。ＬＮＰPOEGMAL40及びＬＮＰPEG-DMGは、ハンドリング及び保管過程でのｍＲＮＡの分解を有意に減少させた。他方、ＬＮＰPOEGMAL50の場合ではｍＲＮＡが分解された。ＬＮＰPOEGMAL10~20では、遊離ｍＲＮＡのみが分解されたが、カプセル化ｍＲＮＡは分解されなかった。このことが示すところは、ＬＮＰPOEGMAL40の場合の非カプセル化ｍＲＮＡは、溶液中で完全に遊離であるわけではなく、むしろＬＮＰと弱く会合していることであり、普通ならＬＮＰPOEGMAL10-20の場合と同様に分解されてしまったはずである。次に、ＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰ内のｍＲＮＡのカプセル化パーセントをＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで定量化し、ＰＥＧ化ＬＮＰのカプセル化パーセントとともにベンチマーキングした。ハンドリング及び保管の影響を無効にするために、製剤を透析せずに調製直後にカプセル化を評価した。ＤＬＳによって、ＬＮＰのサイズが透析前と透析後の両方で同様のままであることが確認された。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは、遊離のｍＲＮＡにのみ結合し、ＬＮＰと会合したｍＲＮＡ又は分解されたヌクレオチドには結合しない有機色素である。非結合状態では、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは蛍光をほとんど又は全く保有しないが、遊離ｍＲＮＡに結合する場合に強烈な蛍光を呈する（図４Ｂ）。ＬＮＰと混合されたＲｉｂｏｇｒｅｅｎの相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、ＬＮＰ溶液中の遊離ｍＲＮＡの量に比例するが、一方、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで破裂させたＬＮＰ中のＲｉｂｏｇｒｅｅｎのＲＦＵは、総ｍＲＮＡ（遊離とカプセル化両方の合計）に比例する。したがって、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎの相対蛍光吸光度を使用して、カプセル化％を算出することができる。図４Ｃから証明されるように、ＬＮＰPOEGMAL50のカプセル化効率は最低およそ１２％であった。対照的に、ＬＮＰのカプセル化効率は、ＬＮＰPOEGMAL50と比較して、ＬＮＰPOEGMAL40についておよそ４．５倍、ＬＮＰPOEGMAL20について４．１倍、及びＬＮＰPOEGMAL10について３．８倍向上した。ＰＯＥＧＭＡＬ40を含有するＬＮＰは、ＰＥＧ－ＤＭＧよりわずか１．５分倍だけ低いという５６％の相当量のカプセル化を示した。このようなより低いカプセル化効率は、ＰＥＧ化ＬＮＰ向けに仕立てられるＬＮＰを調製するのに使用される脂質比として、予想することができる。
ｍＲＮＡカプセル化効率の定量化
ＬＮＰのｍＲＮＡカプセル化効率を、アガロース電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して第１に定性的に評価した。遊離ｍＲＮＡのみがアガロースゲルをとおって泳動するので － ＬＮＰｍＲＮＡは泳動しないが － 製剤中のＬＮＰ ｍＲＮＡから遊離ｍＲＮＡを分離することができる。ｍＲＮＡの総量は － カプセル化された及び遊離の － カプセル化されたｍＲＮＡを放出するＴｒｉｔｏｎ－Ｘ等の界面活性剤でＬＮＰを破裂させることにより、アガロースゲル上で推定した。均等の濃度にての遊離ｍＲＮＡは、実験の対照としての役割を果たす。電気泳動実験により、調製及び保存過程でのｍＲＮＡのあらゆる分解が同様に示される。図４Ａからわかるように、全てのＬＮＰは相当量のｍＲＮＡをカプセル化した。ＬＮＰPOEGMAL40及びＬＮＰPEG-DMGは、ハンドリング及び保管過程でのｍＲＮＡの分解を有意に減少させた。他方、ＬＮＰPOEGMAL50の場合ではｍＲＮＡが分解された。ＬＮＰPOEGMAL10~20では、遊離ｍＲＮＡのみが分解されたが、カプセル化ｍＲＮＡは分解されなかった。このことが示すところは、ＬＮＰPOEGMAL40の場合の非カプセル化ｍＲＮＡは、溶液中で完全に遊離であるわけではなく、むしろＬＮＰと弱く会合していることであり、普通ならＬＮＰPOEGMAL10-20の場合と同様に分解されてしまったはずである。次に、ＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰ内のｍＲＮＡのカプセル化パーセントをＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで定量化し、ＰＥＧ化ＬＮＰのカプセル化パーセントとともにベンチマーキングした。ハンドリング及び保管の影響を無効にするために、製剤を透析せずに調製直後にカプセル化を評価した。ＤＬＳによって、ＬＮＰのサイズが透析前と透析後の両方で同様のままであることが確認された。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは、遊離のｍＲＮＡにのみ結合し、ＬＮＰと会合したｍＲＮＡ又は分解されたヌクレオチドには結合しない有機色素である。非結合状態では、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは蛍光をほとんど又は全く保有しないが、遊離ｍＲＮＡに結合する場合に強烈な蛍光を呈する（図４Ｂ）。ＬＮＰと混合されたＲｉｂｏｇｒｅｅｎの相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、ＬＮＰ溶液中の遊離ｍＲＮＡの量に比例するが、一方、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで破裂させたＬＮＰ中のＲｉｂｏｇｒｅｅｎのＲＦＵは、総ｍＲＮＡ（遊離とカプセル化両方の合計）に比例する。したがって、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎの相対蛍光吸光度を使用して、カプセル化％を算出することができる。図４Ｃから証明されるように、ＬＮＰPOEGMAL50のカプセル化効率は最低およそ１２％であった。対照的に、ＬＮＰのカプセル化効率は、ＬＮＰPOEGMAL50と比較して、ＬＮＰPOEGMAL40についておよそ４．５倍、ＬＮＰPOEGMAL20について４．１倍、及びＬＮＰPOEGMAL10について３．８倍向上した。ＰＯＥＧＭＡＬ40を含有するＬＮＰは、ＰＥＧ－ＤＭＧよりわずか１．５分倍だけ低いという５６％の相当量のカプセル化を示した。このようなより低いカプセル化効率は、ＰＥＧ化ＬＮＰ向けに仕立てられるＬＮＰを調製するのに使用される脂質比として、予想することができる。
【0089】
（実施例６）
ｍＲＮＡカプセル化を最大化するためのＬＮＰの解析及び特性評価
改善されたカプセル化効率（ＥＥ）を得るために、一時一事法（ＯＦＡＴ）研究を設計して、ナノ粒子を安定して形成することができ、一方、ＥＥを最大化することができる、ＰＯＥＧＭＡＬとＳＭ－１０２のモル分率を解析した。ＰＯＥＧＭＡＬ10-50とＳＭ－１０２とのｍｏｌ％を変化させ、ＥＭＳＡによる透析の前にｍＲＮＡカプセル化を測定した。図５Ａからわかるように、ＰＯＥＧＭＡＬ10及びＰＯＥＧＭＡＬ20は、≧７５％という相当量のローディングを提示したが、これを、ＬＮＰ候補物質を下方選択する閾値として設定した。ＳＭ－１０２のｍｏｌ％を変更することはＥＥに影響を及ぼした。ＥＥとナノ粒子サイズ分布との間の関係を図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに図示する。全てのＰＯＥＧＭＡＬは、それらのＥＥにかかわらず、全てのｍｏｌ％で安定な単分散ナノ粒子を形成した。選択された候補物質（図５Ａで丸で囲んだ）をＰＢＳに対して透析し、ＤＬＳ及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで特徴付けた。選択された全ての候補物質は安定なナノ粒子を形成したが、０．５ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡＬ10のＬＮＰはおよそ２．５倍拡大のサイズを示し、この製剤は安定且つ再現性のあるＥＥ＞８５％を示した（図５Ｅ）。この事実に動機付けられて、ＯＦＡＴ研究を、ｍｏｌ％を変動させることによってＰＯＥＧＭＡ5を用いて実施して、ＰＯＥＭＡＬのＭＷをさらに低下させることでＥＥが向上するかどうかを評価した。全ての製剤が、１００ｎｍ未満の半径及び＜３０％の多分散性という状態で安定なナノ粒子を呈した。ＥＥは、透析前で全てのｍｏｌ％で＞９０％であったが、透析後は０．５ｍｏｌ％が最も高いＥＥを呈することがわかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。まとめると、０．５ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡＬ5とＰＯＥＧＭＡＬ10は両方とも、透析後でも８５％超のｍＲＮＡを保持することができる安定なＬＮＰを形成した。そこで、これら２つの製剤をｃｒｙｏ－ＴＥＭにより画像化することにした。図７からわかるように、両方とも球状のナノ粒子を形成した。
ｍＲＮＡカプセル化を最大化するためのＬＮＰの解析及び特性評価
改善されたカプセル化効率（ＥＥ）を得るために、一時一事法（ＯＦＡＴ）研究を設計して、ナノ粒子を安定して形成することができ、一方、ＥＥを最大化することができる、ＰＯＥＧＭＡＬとＳＭ－１０２のモル分率を解析した。ＰＯＥＧＭＡＬ10-50とＳＭ－１０２とのｍｏｌ％を変化させ、ＥＭＳＡによる透析の前にｍＲＮＡカプセル化を測定した。図５Ａからわかるように、ＰＯＥＧＭＡＬ10及びＰＯＥＧＭＡＬ20は、≧７５％という相当量のローディングを提示したが、これを、ＬＮＰ候補物質を下方選択する閾値として設定した。ＳＭ－１０２のｍｏｌ％を変更することはＥＥに影響を及ぼした。ＥＥとナノ粒子サイズ分布との間の関係を図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに図示する。全てのＰＯＥＧＭＡＬは、それらのＥＥにかかわらず、全てのｍｏｌ％で安定な単分散ナノ粒子を形成した。選択された候補物質（図５Ａで丸で囲んだ）をＰＢＳに対して透析し、ＤＬＳ及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで特徴付けた。選択された全ての候補物質は安定なナノ粒子を形成したが、０．５ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡＬ10のＬＮＰはおよそ２．５倍拡大のサイズを示し、この製剤は安定且つ再現性のあるＥＥ＞８５％を示した（図５Ｅ）。この事実に動機付けられて、ＯＦＡＴ研究を、ｍｏｌ％を変動させることによってＰＯＥＧＭＡ5を用いて実施して、ＰＯＥＭＡＬのＭＷをさらに低下させることでＥＥが向上するかどうかを評価した。全ての製剤が、１００ｎｍ未満の半径及び＜３０％の多分散性という状態で安定なナノ粒子を呈した。ＥＥは、透析前で全てのｍｏｌ％で＞９０％であったが、透析後は０．５ｍｏｌ％が最も高いＥＥを呈することがわかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。まとめると、０．５ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡＬ5とＰＯＥＧＭＡＬ10は両方とも、透析後でも８５％超のｍＲＮＡを保持することができる安定なＬＮＰを形成した。そこで、これら２つの製剤をｃｒｙｏ－ＴＥＭにより画像化することにした。図７からわかるように、両方とも球状のナノ粒子を形成した。
【0090】
（実施例７）
治療上重要なｍＲＮＡのカプセル化
次に、治療上重要なＳＡＲＳ ＣＯＶ－２スパイクタンパク質ｍＲＮＡをカプセル化するためにＬＮＰシステムを精査した。完全長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ＷＨＯ国際「医薬品一般名称プログラム」からアクセスした。このｍＲＮＡはＰｆｉｚｅｒのＣＯＶＩＤ１９ワクチンに使用されていると推定される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のパラメータを使用して、ｍＲＮＡ収量を増加させ、副産物（長い転写物及びｄｓＲＮＡ）の形成を最小限にした。使用された製剤はルシフェラーゼｍＲＮＡ用に仕立てられている － ０．５ｍｏｌ％ＰＯＥＧＭＡＬ5&10、Ｎ：Ｐ ８：１、２０％エタノール、ＰＢＳに対して透析されている。透析後のＥＥは、ＬＮＰPOEGMAL5がおよそ３０％のみのＥＥを呈するという状態で、損なわれた。このことは、以下の３つの理由で完全に予想外というわけではない：（ｉ）ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡのサイズはルシフェラーゼｍＲＮＡよりも２倍大きい；（ｉｉ）透析緩衝剤が最適ではない、及び（ｉｉｉ）調製方法、脂質、及びＮ：Ｐ比が効果的でない可能性がある。これら全ての課題について、ＬＮＰPOEGMAL10を用いて精査した（図８）。第１に、透析緩衝剤の役割を評価した（図８Ａ及び図８Ｂ）。本製剤はＭｏｄｅｒｎａのバイオシミラーであるため、Ｍｏｄｅｒｎａ ＬＮＰワクチン向けにぴったりと仕立てられている緩衝剤中では改善されたＥＥ（およそ６７％）を示した（図８Ｂ）。また、ＬＮＰのサイズは未変化のままであった（図８Ｃ）。したがって、Ｍｏｄｅｒｎａ緩衝剤をその後の解析には使用した。第２に、ＥＥを、一連のＮ：Ｐ及びエタノール濃度で評価した。Ｎ：Ｐ １０：１（図８Ｄ）及び３０％エタノール（図８Ｅ）がｍＲＮＡのカプセル化に有用であり、透析後でＥＥを８０％超に押し上げることがわかる。第３に、同様のＯＦＡＴ研究を設計し、０．５ｍｏｌ％がなおもＰＯＥＧＭＡＬ10に対して最も有効な脂質濃度であることがわかった（図８Ｆ）。より高いＮ：Ｐ比では上昇する可能性があり且つＬＮＰの毒性上昇の一因とすることができる表面電位についても評価した。興味深いことに、表面電荷は有意には上昇せず、このことが示すところは、より高いＮ：Ｐでは、ＬＮＰのｍＲＮＡ含有量は、向上しながら且つ表面電荷を中和していることである。全ての透析製剤の表面電荷は１０ｍＶ未満であった。この範囲内のゼータ電位は、ほぼ中性であると考えられる。まとめると、これらのデータが示唆したところは、ＬＮＰPOEGMAL10がモデルルシフェラーゼｍＲＮＡ並びに治療上重要なＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡを高いＥＥ（およそ８５％）で首尾よくカプセル化することができることである。
治療上重要なｍＲＮＡのカプセル化
次に、治療上重要なＳＡＲＳ ＣＯＶ－２スパイクタンパク質ｍＲＮＡをカプセル化するためにＬＮＰシステムを精査した。完全長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡは、ＷＨＯ国際「医薬品一般名称プログラム」からアクセスした。このｍＲＮＡはＰｆｉｚｅｒのＣＯＶＩＤ１９ワクチンに使用されていると推定される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のパラメータを使用して、ｍＲＮＡ収量を増加させ、副産物（長い転写物及びｄｓＲＮＡ）の形成を最小限にした。使用された製剤はルシフェラーゼｍＲＮＡ用に仕立てられている － ０．５ｍｏｌ％ＰＯＥＧＭＡＬ5&10、Ｎ：Ｐ ８：１、２０％エタノール、ＰＢＳに対して透析されている。透析後のＥＥは、ＬＮＰPOEGMAL5がおよそ３０％のみのＥＥを呈するという状態で、損なわれた。このことは、以下の３つの理由で完全に予想外というわけではない：（ｉ）ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡのサイズはルシフェラーゼｍＲＮＡよりも２倍大きい；（ｉｉ）透析緩衝剤が最適ではない、及び（ｉｉｉ）調製方法、脂質、及びＮ：Ｐ比が効果的でない可能性がある。これら全ての課題について、ＬＮＰPOEGMAL10を用いて精査した（図８）。第１に、透析緩衝剤の役割を評価した（図８Ａ及び図８Ｂ）。本製剤はＭｏｄｅｒｎａのバイオシミラーであるため、Ｍｏｄｅｒｎａ ＬＮＰワクチン向けにぴったりと仕立てられている緩衝剤中では改善されたＥＥ（およそ６７％）を示した（図８Ｂ）。また、ＬＮＰのサイズは未変化のままであった（図８Ｃ）。したがって、Ｍｏｄｅｒｎａ緩衝剤をその後の解析には使用した。第２に、ＥＥを、一連のＮ：Ｐ及びエタノール濃度で評価した。Ｎ：Ｐ １０：１（図８Ｄ）及び３０％エタノール（図８Ｅ）がｍＲＮＡのカプセル化に有用であり、透析後でＥＥを８０％超に押し上げることがわかる。第３に、同様のＯＦＡＴ研究を設計し、０．５ｍｏｌ％がなおもＰＯＥＧＭＡＬ10に対して最も有効な脂質濃度であることがわかった（図８Ｆ）。より高いＮ：Ｐ比では上昇する可能性があり且つＬＮＰの毒性上昇の一因とすることができる表面電位についても評価した。興味深いことに、表面電荷は有意には上昇せず、このことが示すところは、より高いＮ：Ｐでは、ＬＮＰのｍＲＮＡ含有量は、向上しながら且つ表面電荷を中和していることである。全ての透析製剤の表面電荷は１０ｍＶ未満であった。この範囲内のゼータ電位は、ほぼ中性であると考えられる。まとめると、これらのデータが示唆したところは、ＬＮＰPOEGMAL10がモデルルシフェラーゼｍＲＮＡ並びに治療上重要なＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡを高いＥＥ（およそ８５％）で首尾よくカプセル化することができることである。
【0091】
（実施例８）
ＬＮＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ性能
最終的に、本ＬＮＰシステムがＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡワクチンを送達する代替方法として機能することができるという事実に動機付けられて、以下について評価した：（ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における傷害性；（ｉｉ）ある一定期間にわたりＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてルシフェラーゼｍＲＮＡを発現させる有効性；及び（ｉｉｉ）ＲＮａｓｅからｍＲＮＡを保護する能力。まとめると、これらの実験は、可能性のあるｉｎ ｖｉｖｏ有用性を実証するためにｍＲＮＡワクチン研究で広く使用されているモデルスクリーニングプラットフォームとして機能する。さらに、ＬＮＰの性能を、ＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMG及び／又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でベンチマーキングした。ＬＮＰの傷害性について、ＬＤＨアッセイでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して評価した。４８時間の連続処理の後でも、全てのＬＮＰは最小限の傷害性を示した（図１０）。ルシフェラーゼ発現を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｎ：Ｐ比４：１～８：１及びｍＲＮＡ量３００～５００ｎｇにての種々のＬＮＰで処理した。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、及び図１１Ｆにまとめたが、ＬＮＰPOEGMAL5とＬＮＰPOEGMAL10の両方が、９６時間にわたってルシフェラーゼの有意な発現を示した。ＬＮＰPOEGMAL10はＬＮＰPOEGMAL5よりも良好であることが判明した。 － ＬＮＰPOEGMAL10については８：１とＬＮＰPEG-DMGについては６：１ － のＮ：Ｐで、両方の製剤がＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００よりも優れていた（図９Ａ及び図９Ｂ）。発現の差異は、ｍＲＮＡ３００ｎｇでより顕著になり、この場合、ＬＮＰPOEGMAL10はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００よりも３００％超のルシフェラーゼ活性を示し、ＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMGよりも優れていた。ルシフェラーゼ発現をおよそ３日の期間にわたって測定し、台形則を使用する曲線下面積（ＡＵＣ）の測定を行った。図９Ｃ及び図９Ｄにまとめたように、ＬＮＰPOEGMAL10は、全てのＮ：Ｐ比にてＬＮＰPOEGMAL5よりも優れていた。等しく重要な観察とは、より高量のｍＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用した場合、ＬＮＰPOEGMAL10とＬＮＰPEG-DMGの両方が同様のＡＵＣを示したことである。しかし、より低いｍＲＮＡ量（３００ｎｇ）では、ＬＮＰPOEGMAL10は、同一のＮ：Ｐ ６：１にておよそ２倍より高いＡＵＣをもってＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMGよりも優れており、Ｎ：Ｐ ８：１にては、ＬＮＰPOEGMAL10はＬＮＰPEG-DMGよりも２．３倍高いＡＵＣを示した。最終的に、ｍＲＮＡカーゴをＲＮａｓｅから保護するＬＮＰの有効性を調査した。これは、ＬＮＰ－ｍＲＮＡワクチンの前臨床上の及び臨床上の橋渡しの成功を左右する重要なパラメータである。ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの性能の不良な結果をもたらす細胞外ＲＮａｓｅによって容易に消化される可能性がある。自社アッセイ、ここでは、ＬＮＰ－ｍＲＮＡワクチン候補物質を高濃度のＲＮａｓｅとインキュベートした。ＲＮａｓｅの添加前又は後にＬＮＰ破壊剤（ｒｕｐｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を添加した。インキュベーションの時間の後、過剰なＲＮａｓｅをプロテイナーゼＫでクエンチした。図１２にまとめてあるが、全ての候補物質ＬＮＰは、ＲＮａｓｅからの有意な保護を与えることができる。対照の遊離ｍＲＮＡと、ＲＮａｓｅを添加する前にＴｒｉｔｏｎ－Ｘが添加される群は、ｍＲＮＡの完全な分解を示す。まとめると、これらのデータが示唆するところは、ＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰは、ｍＲＮＡワクチン送達プラットフォームとして機能することができ且つ臨床上の橋渡しを成功させる高い可能性を有している。
前述の詳細な説明及び添付の実施例は、単に例示的ものであり、本発明の範囲を限定するものと取られるべきものではないことが理解される。
ＬＮＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ性能
最終的に、本ＬＮＰシステムがＳＡＲＳ ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡワクチンを送達する代替方法として機能することができるという事実に動機付けられて、以下について評価した：（ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における傷害性；（ｉｉ）ある一定期間にわたりＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてルシフェラーゼｍＲＮＡを発現させる有効性；及び（ｉｉｉ）ＲＮａｓｅからｍＲＮＡを保護する能力。まとめると、これらの実験は、可能性のあるｉｎ ｖｉｖｏ有用性を実証するためにｍＲＮＡワクチン研究で広く使用されているモデルスクリーニングプラットフォームとして機能する。さらに、ＬＮＰの性能を、ＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMG及び／又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でベンチマーキングした。ＬＮＰの傷害性について、ＬＤＨアッセイでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して評価した。４８時間の連続処理の後でも、全てのＬＮＰは最小限の傷害性を示した（図１０）。ルシフェラーゼ発現を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｎ：Ｐ比４：１～８：１及びｍＲＮＡ量３００～５００ｎｇにての種々のＬＮＰで処理した。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、及び図１１Ｆにまとめたが、ＬＮＰPOEGMAL5とＬＮＰPOEGMAL10の両方が、９６時間にわたってルシフェラーゼの有意な発現を示した。ＬＮＰPOEGMAL10はＬＮＰPOEGMAL5よりも良好であることが判明した。 － ＬＮＰPOEGMAL10については８：１とＬＮＰPEG-DMGについては６：１ － のＮ：Ｐで、両方の製剤がＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００よりも優れていた（図９Ａ及び図９Ｂ）。発現の差異は、ｍＲＮＡ３００ｎｇでより顕著になり、この場合、ＬＮＰPOEGMAL10はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００よりも３００％超のルシフェラーゼ活性を示し、ＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMGよりも優れていた。ルシフェラーゼ発現をおよそ３日の期間にわたって測定し、台形則を使用する曲線下面積（ＡＵＣ）の測定を行った。図９Ｃ及び図９Ｄにまとめたように、ＬＮＰPOEGMAL10は、全てのＮ：Ｐ比にてＬＮＰPOEGMAL5よりも優れていた。等しく重要な観察とは、より高量のｍＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用した場合、ＬＮＰPOEGMAL10とＬＮＰPEG-DMGの両方が同様のＡＵＣを示したことである。しかし、より低いｍＲＮＡ量（３００ｎｇ）では、ＬＮＰPOEGMAL10は、同一のＮ：Ｐ ６：１にておよそ２倍より高いＡＵＣをもってＭｏｄｅｒｎａバイオシミラーＬＮＰPEG-DMGよりも優れており、Ｎ：Ｐ ８：１にては、ＬＮＰPOEGMAL10はＬＮＰPEG-DMGよりも２．３倍高いＡＵＣを示した。最終的に、ｍＲＮＡカーゴをＲＮａｓｅから保護するＬＮＰの有効性を調査した。これは、ＬＮＰ－ｍＲＮＡワクチンの前臨床上の及び臨床上の橋渡しの成功を左右する重要なパラメータである。ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの性能の不良な結果をもたらす細胞外ＲＮａｓｅによって容易に消化される可能性がある。自社アッセイ、ここでは、ＬＮＰ－ｍＲＮＡワクチン候補物質を高濃度のＲＮａｓｅとインキュベートした。ＲＮａｓｅの添加前又は後にＬＮＰ破壊剤（ｒｕｐｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を添加した。インキュベーションの時間の後、過剰なＲＮａｓｅをプロテイナーゼＫでクエンチした。図１２にまとめてあるが、全ての候補物質ＬＮＰは、ＲＮａｓｅからの有意な保護を与えることができる。対照の遊離ｍＲＮＡと、ＲＮａｓｅを添加する前にＴｒｉｔｏｎ－Ｘが添加される群は、ｍＲＮＡの完全な分解を示す。まとめると、これらのデータが示唆するところは、ＰＯＥＧＭＡ化ＬＮＰは、ｍＲＮＡワクチン送達プラットフォームとして機能することができ且つ臨床上の橋渡しを成功させる高い可能性を有している。
前述の詳細な説明及び添付の実施例は、単に例示的ものであり、本発明の範囲を限定するものと取られるべきものではないことが理解される。
【0092】
開示された実施形態に対する様々な変更及び改変は、当業者であれば明らかであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、又は使用方法に関するものを非限定的に含めて、かかる変更及び改変は、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
完全を期すため、本発明の種々の態様を以下の番号付き節において記載する：
完全を期すため、本発明の種々の態様を以下の番号付き節において記載する：
【0093】
節１．イオン化可能な脂質；リン脂質；ステロール；ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が１００ｋＤａ未満の数平均分子量を有する、１０ｍｏｌ％未満にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及び治療薬を含む、脂質ナノ粒子。
節２．ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及び骨格に共有結合で付着した複数の側鎖を有し、各側鎖は、タンデムに反復したエチレングリコール（ＥＧ）の２～９つのモノマーを含む、節１の脂質ナノ粒子。
節３．脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有する、節１又は２の脂質ナノ粒子。
節４．脂質ナノ粒子は、対象における既存の抗ＰＥＧ抗体と反応性ではない、節１～３のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節５．ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質はＣ2-40炭化水素鎖を含む、節１～４のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２．ＰＯＥＧＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）骨格及び骨格に共有結合で付着した複数の側鎖を有し、各側鎖は、タンデムに反復したエチレングリコール（ＥＧ）の２～９つのモノマーを含む、節１の脂質ナノ粒子。
節３．脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有する、節１又は２の脂質ナノ粒子。
節４．脂質ナノ粒子は、対象における既存の抗ＰＥＧ抗体と反応性ではない、節１～３のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節５．ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質はＣ2-40炭化水素鎖を含む、節１～４のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0094】
節６．ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートの脂質は、トリアゾール、アミド、エステル、エーテル、又は炭化水素リンカーを介してＰＯＥＧＭＡにコンジュゲートされている、節１～５のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節７．ＰＯＥＧＭＡは、約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、節１～６のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節８．脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％で含む、節１～７のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節９．イオン化可能な脂質は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｍ－ＤＡＰ）、１，２（l,2）－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドログリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）、ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲ１Ｅ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、アミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５））、又はそれらの組合せを含む、節１～８のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節７．ＰＯＥＧＭＡは、約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、節１～６のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節８．脂質ナノ粒子は、ＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲートを約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％で含む、節１～７のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節９．イオン化可能な脂質は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｍ－ＤＡＰ）、１，２（l,2）－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドログリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）、ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲ１Ｅ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、アミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５））、又はそれらの組合せを含む、節１～８のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0095】
節１０．イオン化可能な脂質は、（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）を含む、節１～９のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0096】
節１１．脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質を約２０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％で含む、節１～１０のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0097】
節１２．リン脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの組合せを含む、節１～１１のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0098】
節１３．脂質ナノ粒子は、リン脂質を約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％で含む、節１～１２のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１４．ステロールは、コレステロール、カンペステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、スチグマステロール、シトステロール、オキシステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、コレスタ－４－エン－３－オン、又はそれらの組合せを含む、節１～１３のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１４．ステロールは、コレステロール、カンペステロール、アントロステロール、デスモステロール、ニカステロール、スチグマステロール、シトステロール、オキシステロール、Ｃ4-10ステロール、エルゴステロール、コレスタ－４－エン－３－オン、又はそれらの組合せを含む、節１～１３のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0099】
節１５．脂質ナノ粒子は、ステロールを約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％で含む、節１～１４のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１６．治療薬は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの組合せを含む核酸である、節１～１５のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１７．核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの組合せを含む、節１６の脂質ナノ粒子。
節１８．（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；コレステロール；ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及びｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子。
節１９．脂質ナノ粒子は、約４：１～約１６：１のＮ：Ｐ比を有する、節１～１８のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１６．治療薬は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＣｉｒｃＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの組合せを含む核酸である、節１～１５のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節１７．核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの組合せを含む、節１６の脂質ナノ粒子。
節１８．（ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート）（ＳＭ－１０２）；ＤＳＰＣ；コレステロール；ポリ［オリゴ（エチレングリコール）エーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）が約１ｋＤａ～約５０ｋＤａの数平均分子量を有する、約０．２５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％にてのＰＯＥＧＭＡ－脂質コンジュゲート；及びｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子。
節１９．脂質ナノ粒子は、約４：１～約１６：１のＮ：Ｐ比を有する、節１～１８のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
【0100】
節２０．脂質ナノ粒子は約３０ｎｍ～約３００ｎｍの直径を有する、節１～１９のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２１．脂質ナノ粒子は、蛍光により測定して７５％以上の治療薬カプセル化効率を有する、節１～２０のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２２．ターゲティングリガンドをさらに含む、節１～２１のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２３．節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子；及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
節２４．それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と組合せでよい、節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
節２１．脂質ナノ粒子は、蛍光により測定して７５％以上の治療薬カプセル化効率を有する、節１～２０のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２２．ターゲティングリガンドをさらに含む、節１～２１のいずれか１節の脂質ナノ粒子。
節２３．節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子；及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
節２４．それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と組合せでよい、節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
【0101】
節２５．１つ又は複数の脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む脂質ナノ粒子と比べて減少した免疫応答を有する；対象における既存の抗ＰＥＧ抗体と反応性ではない、又はそれらの組合せである、節２４の方法。
節２６．疾患又は障害は、感染症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、又はがんである、節２４又は２５の方法。
節２７．細胞に治療薬を送達する方法であって、細胞を節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、それによって治療薬は細胞に送達される、方法。
節２６．疾患又は障害は、感染症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、又はがんである、節２４又は２５の方法。
節２７．細胞に治療薬を送達する方法であって、細胞を節１～２２のいずれか１節に従う１つ又は複数の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、それによって治療薬は細胞に送達される、方法。
【0102】
配列
配列番号１ ウミホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ：
GGGAGACCCAAGCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCGCCACCAUGAAGACCUUAAUUCUUGCCGUUGCAUUAGUCUACUGCGCCACUGUUCAUUGCCAGGACUGUCCUUACGAACCUGAUCCACCAAACACAGUUCCAACUUCCUGUGAAGCUAAAGAAGGAGAAUGUAUUGAUAGCAGCUGUGGCACCUGCACGAGAGACAUACUAUCAGAUGGACUGUGUGAAAAUAAACCAGGAAAAACAUGUUGCCGAAUGUGUCAGUAUGUAAUUGAAUGCAGAGUAGAGGCCGCAGGAUGGUUUAGAACAUUCUAUGGAAAGAGAUUCCAGUUCCAGGAACCUGGUACAUACGUGUUGGGUCAAGGAACCAAGGGCGGCGACUGGAAGGUGUCCAUCACCCUGGAGAACCUGGAUGGAACCAAGGGGGCUGUGCUGACCAAGACAAGACUGGAAGUGGCUGGAGACAUCAUUGACAUCGCUCAAGCUACUGAGAAUCCCAUCACUGUAAACGGUGGAGCUGACCCUAUCAUCGCCAACCCGUACACCAUCGGCGAGGUCACCAUCGCUGUUGUUGAGAUGCCAGGCUUCAACAUCACCGUCAUUGAGUUCUUCAAACUGAUCGUGAUCGACAUCCUCGGAGGAAGAUCUGUAAGAAUCGCCCCAGACACAGCAAACAAAGGAAUGAUCUCUGGCCUCUGUGGAGAUCUUAAAAUGAUGGAAGAUACAGACUUCACUUCAGAUCCAGAACAACUCGCUAUUCAGCCUAAGAUCAACCAGGAGUUUGACGGUUGUCCACUCUAUGGAAAUCCUGAUGACGUUGCAUACUGCAAAGGUCUUCUGGAGCCGUACAAGGACAGCUGCCGCAACCCCAUCAACUUCUACUACUACACCAUCUCCUGCGCCUUCGCCCGCUGUAUGGGUGGAGACGAGCGAGCCUCACACGUGCUGCUUGACUACAGGGAGACGUGCGCUGCUCCCGAAACUAGAGGAACCUGCGUUUUGUCUGGACAUACUUUCUACGAUACAUUUGACAAAGCAAGAUACCAAUUCCAGGGUCCCUGCAAGGAGAUUCUUAUGGCCGCCGACUGUUUCUGGAACACUUGGGAUGUGAAGGUUUCACACAGGAAUGUUGACUCUUACACUGAAGUAGAGAAAGUACGAAUCAGGAAACAAUCGACUGUAGUAGAACUCAUUGUUGAUGGAAAACAGAUUCUGGUUGGAGGAGAAGCCGUGUCCGUCCCGUACAGCUCUCAGAACACUUCCAUCUACUGGCAAGAUGGUGACAUACUGACUACAGCCAUCCUACCUGAAGCUCUGGUGGUCAAGUUCAACUUCAAGCAACUGCUCGUCGUACAUAUUAGAGAUCCAUUCGAUGGUAAGACUUGCGGUAUUUGCGGUAACUACAACCAGGAUUUCAGUGAUGAUUCUUUUGAUGCUGAAGGAGCCUGUGAUCUGACCCCCAACCCACCGGGAUGCACCGAAGAACAGAAACCUGAAGCUGAACGACUCUGCAAUAGUCUCUUCGCCGGUCAAAGUGAUCUUGAUCAGAAAUGUAACGUGUGCCACAAGCCUGACCGUGUCGAACGAUGCAUGUACGAGUAUUGCCUGAGGGGACAACAGGGUUUCUGUGACCACGCAUGGGAGUUCAAGAAAGAAUGCUACAUAAAGCAUGGAGACACCCUAGAAGUACCAGAUGAAUGCAAAUAGGCGGCCGCAAUAAAAUAUCUUUAUUUUCAUUACAUCUGUGUGUUGGUUUUUUGUGUGUCUAG(A)200-300
配列番号１ ウミホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ：
GGGAGACCCAAGCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCGCCACCAUGAAGACCUUAAUUCUUGCCGUUGCAUUAGUCUACUGCGCCACUGUUCAUUGCCAGGACUGUCCUUACGAACCUGAUCCACCAAACACAGUUCCAACUUCCUGUGAAGCUAAAGAAGGAGAAUGUAUUGAUAGCAGCUGUGGCACCUGCACGAGAGACAUACUAUCAGAUGGACUGUGUGAAAAUAAACCAGGAAAAACAUGUUGCCGAAUGUGUCAGUAUGUAAUUGAAUGCAGAGUAGAGGCCGCAGGAUGGUUUAGAACAUUCUAUGGAAAGAGAUUCCAGUUCCAGGAACCUGGUACAUACGUGUUGGGUCAAGGAACCAAGGGCGGCGACUGGAAGGUGUCCAUCACCCUGGAGAACCUGGAUGGAACCAAGGGGGCUGUGCUGACCAAGACAAGACUGGAAGUGGCUGGAGACAUCAUUGACAUCGCUCAAGCUACUGAGAAUCCCAUCACUGUAAACGGUGGAGCUGACCCUAUCAUCGCCAACCCGUACACCAUCGGCGAGGUCACCAUCGCUGUUGUUGAGAUGCCAGGCUUCAACAUCACCGUCAUUGAGUUCUUCAAACUGAUCGUGAUCGACAUCCUCGGAGGAAGAUCUGUAAGAAUCGCCCCAGACACAGCAAACAAAGGAAUGAUCUCUGGCCUCUGUGGAGAUCUUAAAAUGAUGGAAGAUACAGACUUCACUUCAGAUCCAGAACAACUCGCUAUUCAGCCUAAGAUCAACCAGGAGUUUGACGGUUGUCCACUCUAUGGAAAUCCUGAUGACGUUGCAUACUGCAAAGGUCUUCUGGAGCCGUACAAGGACAGCUGCCGCAACCCCAUCAACUUCUACUACUACACCAUCUCCUGCGCCUUCGCCCGCUGUAUGGGUGGAGACGAGCGAGCCUCACACGUGCUGCUUGACUACAGGGAGACGUGCGCUGCUCCCGAAACUAGAGGAACCUGCGUUUUGUCUGGACAUACUUUCUACGAUACAUUUGACAAAGCAAGAUACCAAUUCCAGGGUCCCUGCAAGGAGAUUCUUAUGGCCGCCGACUGUUUCUGGAACACUUGGGAUGUGAAGGUUUCACACAGGAAUGUUGACUCUUACACUGAAGUAGAGAAAGUACGAAUCAGGAAACAAUCGACUGUAGUAGAACUCAUUGUUGAUGGAAAACAGAUUCUGGUUGGAGGAGAAGCCGUGUCCGUCCCGUACAGCUCUCAGAACACUUCCAUCUACUGGCAAGAUGGUGACAUACUGACUACAGCCAUCCUACCUGAAGCUCUGGUGGUCAAGUUCAACUUCAAGCAACUGCUCGUCGUACAUAUUAGAGAUCCAUUCGAUGGUAAGACUUGCGGUAUUUGCGGUAACUACAACCAGGAUUUCAGUGAUGAUUCUUUUGAUGCUGAAGGAGCCUGUGAUCUGACCCCCAACCCACCGGGAUGCACCGAAGAACAGAAACCUGAAGCUGAACGACUCUGCAAUAGUCUCUUCGCCGGUCAAAGUGAUCUUGAUCAGAAAUGUAACGUGUGCCACAAGCCUGACCGUGUCGAACGAUGCAUGUACGAGUAUUGCCUGAGGGGACAACAGGGUUUCUGUGACCACGCAUGGGAGUUCAAGAAAGAAUGCUACAUAAAGCAUGGAGACACCCUAGAAGUACCAGAUGAAUGCAAAUAGGCGGCCGCAAUAAAAUAUCUUUAUUUUCAUUACAUCUGUGUGUUGGUUUUUUGUGUGUCUAG(A)200-300
【0103】
配列番号２ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質ｍＲＮＡ：
AGGAAUAAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUGUCCAGCCAGUGUGUGAACCUGACCACCAGAACACAGCUGCCUCCAGCCUACACCAACAGCUUUACCAGAGGCGUGUACUACCCCGACAAGGUGUUCAGAUCCAGCGUGCUGCACUCUACCCAGGACCUGUUCCUGCCUUUCUUCAGCAACGUGACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCCGGCACCAAUGGCACCAAGAGAUUCGACAACCCCGUGCUGCCCUUCAACGACGGGGUGUACUUUGCCAGCACCGAGAAGUCCAACAUCAUCAGAGGCUGGAUCUUCGGCACCACACUGGACAGCAAGACCCAGAGCCUGCUGAUCGUGAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAAGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCCUUCCUGGGCGUCUACUACCACAAGAACAACAAGAGCUGGAUGGAAAGCGAGUUCCGGGUGUACAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAGUACGUGUCCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAGCAGGGCAACUUCAAGAACCUGCGCGAGUUCGUGUUUAAGAACAUCGACGGCUACUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUCAACCUCGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCUCUGCUCUGGAACCCCUGGUGGAUCUGCCCAUCGGCAUCAACAUCACCCGGUUUCAGACACUGCUGGCCCUGCACAGAAGCUACCUGACACCUGGCGAUAGCAGCAGCGGAUGGACAGCUGGUGCCGCCGCUUACUAUGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUCCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACCGACGCCGUGGAUUGUGCUCUGGAUCCUCUGAGCGAGACAAAGUGCACCCUGAAGUCCUUCACCGUGGAAAAGGGCAUCUACCAGACCAGCAACUUCCGGGUGCAGCCCACCGAAUCCAUCGUGCGGUUCCCCAAUAUCACCAAUCUGUGCCCCUUCGGCGAGGUGUUCAAUGCCACCAGAUUCGCCUCUGUGUACGCCUGGAACCGGAAGCGGAUCAGCAAUUGCGUGGCCGACUACUCCGUGCUGUACAACUCCGCCAGCUUCAGCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGUCCCCUACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACAAACGUGUACGCCGACAGCUUCGUGAUCCGGGGAGAUGAAGUGCGGCAGAUUGCCCCUGGACAGACAGGCAAGAUCGCCGACUACAACUACAAGCUGCCCGACGACUUCACCGGCUGUGUGAUUGCCUGGAACAGCAACAACCUGGACUCCAAAGUCGGCGGCAACUACAAUUACCUGUACCGGCUGUUCCGGAAGUCCAAUCUGAAGCCCUUCGAGCGGGACAUCUCCACCGAGAUCUAUCAGGCCGGCAGCACCCCUUGUAACGGCGUGGAAGGCUUCAACUGCUACUUCCCACUGCAGUCCUACGGCUUUCAGCCCACAAAUGGCGUGGGCUAUCAGCCCUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAACUGCUGCAUGCCCCUGCCACAGUGUGCGGCCCUAAGAAAAGCACCAAUCUCGUGAAGAACAAAUGCGUGAACUUCAACUUCAACGGCCUGACCGGCACCGGCGUGCUGACAGAGAGCAACAAGAAGUUCCUGCCAUUCCAGCAGUUUGGCCGGGAUAUCGCCGAUACCACAGACGCCGUUAGAGAUCCCCAGACACUGGAAAUCCUGGACAUCACCCCUUGCAGCUUCGGCGGAGUGUCUGUGAUCACCCCUGGCACCAACACCAGCAAUCAGGUGGCAGUGCUGUACCAGGACGUGAACUGUACCGAAGUGCCCGUGGCCAUUCACGCCGAUCAGCUGACACCUACAUGGCGGGUGUACUCCACCGGCAGCAAUGUGUUUCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGAGCCGAGCACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCCAUCGGCGCUGGAAUCUGCGCCAGCUACCAGACACAGACAAACAGCCCUCGGAGAGCCAGAAGCGUGGCCAGCCAGAGCAUCAUUGCCUACACAAUGUCUCUGGGCGCCGAGAACAGCGUGGCCUACUCCAACAACUCUAUCGCUAUCCCCACCAACUUCACCAUCAGCGUGACCACAGAGAUCCUGCCUGUGUCCAUGACCAAGACCAGCGUGGACUGCACCAUGUACAUCUGCGGCGAUUCCACCGAGUGCUCCAACCUGCUGCUGCAGUACGGCAGCUUCUGCACCCAGCUGAAUAGAGCCCUGACAGGGAUCGCCGUGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGUGUUCGCCCAAGUGAAGCAGAUCUACAAGACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGCGGCUUCAAUUUCAGCCAGAUUCUGCCCGAUCCUAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCUUCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAAGUGACACUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAGCAGUAUGGCGAUUGUCUGGGCGACAUUGCCGCCAGGGAUCUGAUUUGCGCCCAGAAGUUUAACGGACUGACAGUGCUGCCUCCUCUGCUGACCGAUGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCCGGCACAAUCACAAGCGGCUGGACAUUUGGAGCAGGCGCCGCUCUGCAGAUCCCCUUUGCUAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGAGUGACCCAGAAUGUGCUGUACGAGAACCAGAAGCUGAUCGCCAACCAGUUCAACAGCGCCAUCGGCAAGAUCCAGGACAGCCUGAGCAGCACAGCAAGCGCCCUGGGAAAGCUGCAGGACGUGGUCAACCAGAAUGCCCAGGCACUGAACACCCUGGUCAAGCAGCUGUCCUCCAACUUCGGCGCCAUCAGCUCUGUGCUGAACGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCUCCUGAGGCCGAGGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACAGGCAGACUGCAGAGCCUCCAGACAUACGUGACCCAGCAGCUGAUCAGAGCCGCCGAGAUUAGAGCCUCUGCCAAUCUGGCCGCCACCAAGAUGUCUGAGUGUGUGCUGGGCCAGAGCAAGAGAGUGGACUUUUGCGGCAAGGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGUCUGCCCCUCACGGCGUGGUGUUUCUGCACGUGACAUAUGUGCCCGCUCAAGAGAAGAAUUUCACCACCGCUCCAGCCAUCUGCCACGACGGCAAAGCCCACUUUCCUAGAGAAGGCGUGUUCGUGUCCAACGGCACCCAUUGGUUCGUGACACAGCGGAACUUCUACGAGCCCCAGAUCAUCACCACCGACAACACCUUCGUGUCUGGCAACUGCGACGUCGUGAUCGGCAUUGUGAACAAUACCGUGUACGACCCUCUGCAGCCCGAGCUGGACAGCUUCAAAGAGGAACUGGACAAGUACUUUAAGAACCACACAAGCCCCGACGUGGACCUGGGCGAUAUCAGCGGAAUCAAUGCCAGCGUCGUGAACAUCCAGAAAGAGAUCGACCGGCUGAACGAGGUGGCCAAGAAUCUGAACGAGAGCCUGAUCGACCUGCAAGAACUGGGGAAGUACGAGCAGUACAUCAAGUGGCCCUGGUACAUCUGGCUGGGCUUUAUCGCCGGACUGAUUGCCAUCGUGAUGGUCACAAUCAUGCUGUGUUGCAUGACCAGCUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGUUGUAGCUGUGGCAGCUGCUGCAAGUUCGACGAGGACGAUUCUGAGCCCGUGCUGAAGGGCGUGAAACUGCACUACACAUGAUGACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCUGGAGCUAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】