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特表2024-541935ヒト及びサル組織における増強されたＢＣＭＡ免疫組織化学検出のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ヒト及びサル組織における増強されたＢＣＭＡ免疫組織化学検出のための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20241106BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241106BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20241106BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20241106BHJP
C12N 5/07 20100101ALN20241106BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241106BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
C12Q1/02
G01N33/48 M
G01N33/48 S
C07K16/28
C12N5/07
C12N5/09
C12N5/10
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525000
(86)(22)【出願日】2022-10-26
(85)【翻訳文提出日】2024-05-22
(86)【国際出願番号】 US2022078683
(87)【国際公開番号】W WO2023076921
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,600
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】カレイラ，ヴィニシウス
(72)【発明者】
【氏名】マレラ，マシュー
(72)【発明者】
【氏名】コルナックス，イングリッド
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA26
2G045BA13
2G045BB22
2G045CB02
2G045DA36
2G045FB03
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ79
4B063QR03
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4B065AA90X
4B065AA90Y
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA50
(57)【要約】
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）分子を検出する方法であって、ａ．ＦＦＰＥ試料を切片化及びマウントすることと；
ｂ．試料を脱パラフィンすることと；
ｃ．試料の熱媒介抗原賦活化と；
ｄ．ブロッキング剤による試料の前処理と；
ｅ．前記試料を第１の検出剤と接触させることであって、前記第１の検出剤は任意選択で、前記試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、接触させることと；
ｆ．任意選択で、未結合試料を除去することと；
ｇ．前記第１の検出剤に結合した前記試料を第２の検出剤と接触させることであって、前記第２の検出剤は任意選択で、抗体又はその断片である、接触させることと；
ｈ．任意選択で、未結合の第２の検出剤を除去することと；及び
ｉ．前記試料に結合した前記第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
前記試料に結合した前記第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、前記試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子の存在を示す、方法。
【請求項2】
前記熱媒介抗原賦活化が、ＥＤＴＡ系溶液を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＥＤＴＡ系溶液が、８．５～９．５のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＥＤＴＡ系溶液が９．０のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記熱媒介抗原賦活化の工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間又は６０分間行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記熱媒介抗原賦活化の工程が、８５℃～１００℃の温度で行われる、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記熱媒介抗原賦活化の工程が１００℃で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ブロッキング剤が内因性ペルオキシダーゼを遮断する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記ブロッキング剤が過酸化物ブロックである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
過酸化物ブロックで前処理する前記工程が、２分間、５分間、８分間、１０分間又は１５分間行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ブロッキング剤が、非特異的抗体結合を遮断する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記ブロッキング剤がＤａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋで前処理する前記工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、又は３０分間行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第１の検出剤が抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記試料を前記第１の検出剤と室温又は３７℃で接触させた、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記試料を前記第１の検出剤と１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９５分間、又は１２０分間接触させた、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第１の検出剤に結合した前記試料を前記第２の検出剤と、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間接触させた、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記組織が脳組織である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記組織が、線条体、視床、中脳、又は脳の髄質領域に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記組織が、腫瘍組織である、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記試料が、対象由来のものである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記哺乳動物が、カニクイザルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項28】
対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む、前記対象をＢＣＭＡ標的化剤で処置する方法。
【請求項29】
前記試料中のＢＣＭＡを検出する工程が、請求項１～２２又は２４～２６のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記標的化剤が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項31】
前記標的化剤がＴ細胞リダイレクト抗体である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が癌を有する、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記癌は、多発性骨髄腫である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０２１年１０月２７日に出願された米国特許出願第６３／２７２，６００号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年１０月２７日に出願された米国特許出願第６３／２７２，６００号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（分野）
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法が提供される。
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法が提供される。
【0003】
（概要）
一態様では、本明細書では、ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）の分子を検出する方法であって、ＦＦＰＥ試料を切片化してマウントすることと；試料を脱パラフィンすることと；試料の熱媒介抗原賦活化と；ブロッキング剤による試料の前処理と；試料を第１の検出剤と接触させることであって、第１の検出剤は任意選択で、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、接触させることと；任意選択で、未結合試料を除去することと；第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることであって、第２の検出剤は任意選択で、抗体又はその断片である、接触させることと；任意選択で未結合の第２の検出剤を除去することと；試料に結合した第２の検出剤の存在を検出することとを含み；試料に結合した第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子の存在を示す、方法が提供される。
一態様では、本明細書では、ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）の分子を検出する方法であって、ＦＦＰＥ試料を切片化してマウントすることと；試料を脱パラフィンすることと；試料の熱媒介抗原賦活化と；ブロッキング剤による試料の前処理と；試料を第１の検出剤と接触させることであって、第１の検出剤は任意選択で、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、接触させることと；任意選択で、未結合試料を除去することと；第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることであって、第２の検出剤は任意選択で、抗体又はその断片である、接触させることと；任意選択で未結合の第２の検出剤を除去することと；試料に結合した第２の検出剤の存在を検出することとを含み；試料に結合した第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子の存在を示す、方法が提供される。
【0004】
いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化は、ＥＤＴＡ系溶液を使用して行われる。
【0005】
いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ系溶液は、８．５～９．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ系溶液は、９．０のｐＨを有する。
【0006】
いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化の工程は、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、又は６０分間行われる。
【0007】
いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化の工程は、８５℃～１００℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化の工程は、１００℃で行われる。
【0008】
いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は内因性ペルオキシダーゼを遮断する。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は、過酸化物ブロックである。
【0009】
いくつかの実施形態では、過酸化物ブロックで前処理する工程は、２分間、５分間、８分間、１０分間、又は１５分間行われる。
【0010】
いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は非特異的抗体結合を遮断する。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤はＤａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋである。
【0011】
いくつかの実施形態では、Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋで前処理する工程は、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、又は３０分間行われる。
【0012】
いくつかの実施形態では、第１の検出剤は、抗体又はその抗原結合断片である。
【0013】
いくつかの実施形態では、試料を第１の検出剤と室温又は３７℃で接触させた。
【0014】
いくつかの実施形態では、試料を第１の検出剤と１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９５分間、又は１２０分間接触させた。
【0015】
いくつかの実施形態では、第２の検出剤は、抗体又はその抗原結合断片である。
【0016】
いくつかの実施形態では、第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間接触させた。
【0017】
いくつかの実施形態では、試料は、体液又は組織由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、組織は、脳組織である。他の実施形態では、組織は、線条体、視床、中脳、又は脳の髄質領域に由来する。
【0018】
いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織である。
【0019】
いくつかの実施形態では、試料は、対象からのものである。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、この哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はカニクイザルである。
【0020】
一態様では、本明細書では、本明細書に開示される方法を実施するためのキットが提供される。
【0021】
一態様では、本明細書では、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法であって、対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む方法が提供される。
【0022】
いくつかの実施形態では、試料中のＢＣＭＡを検出する工程は、本明細書に開示される方法を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、標的化剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、標的化剤は、Ｔ細胞リダイレクト抗体である。
【0024】
いくつかの実施形態では、対象は、癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【0025】
前述の「発明の概要」、並びに以下の、本出願の特定の実施形態の「発明を実施するための形態」は、添付図面と共に読んだときにより深く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1-1】ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレット及び組織対照に対する免疫組織化学（「ＩＨＣ」）によるＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）タンパク質の検出、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）によるＢＣＭＡ ＲＮＡの検出を示す。図１Ａは、Ｈ９２９細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｂは、ＭＭ１Ｒ細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｃは、Ｊｅｋｏ－１細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。暗い山形は、核周囲領域におけるＢＣＭＡ検出を示す。図１Ｄは、Ｒａｊｉ細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。暗い山形は、核周囲領域におけるＢＣＭＡ検出を示す。図１Ｅは、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｆは、Ｕ－９３７細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｇは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｌ～図１Ｒは、それぞれＨ９２９、ＭＭ１Ｒ、Ｊｅｋｏ－１、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、Ｕ－９３７、及びＨＥＫ２９３細胞に対する実証的ＩＳＨを示す。明るい山形は、図１Ｎ及び図１ＯにおけるＢＣＭＡ ＲＮＡの検出を示す。図１Ｈは、ヒト結腸ＦＦＰＥ試料におけるＢＣＭＡ ＩＨＣを示す。ＢＣＭＡ発現は、粘膜固有層内の推定常在性形質細胞における膜性及び核周囲である。図１Ｈの挿入図は、推定形質細胞のより高い倍率を示す。図１Ｉは、陽性推定形質細胞を有する、ヒト結腸ＦＦＰＥにおけるＢＣＭＡ発現のＩＳＨを示す。図１Ｉの挿入図は、推定形質細胞のより高い倍率を示す。
【図1-2】ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレット及び組織対照に対する免疫組織化学（「ＩＨＣ」）によるＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）タンパク質の検出、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）によるＢＣＭＡ ＲＮＡの検出を示す。図１Ａは、Ｈ９２９細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｂは、ＭＭ１Ｒ細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｃは、Ｊｅｋｏ－１細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。暗い山形は、核周囲領域におけるＢＣＭＡ検出を示す。図１Ｄは、Ｒａｊｉ細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。暗い山形は、核周囲領域におけるＢＣＭＡ検出を示す。図１Ｅは、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｆは、Ｕ－９３７細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｇは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＢＣＭＡ発現を示す。図１Ｌ～図１Ｒは、それぞれＨ９２９、ＭＭ１Ｒ、Ｊｅｋｏ－１、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、Ｕ－９３７、及びＨＥＫ２９３細胞に対する実証的ＩＳＨを示す。明るい山形は、図１Ｎ及び図１ＯにおけるＢＣＭＡ ＲＮＡの検出を示す。図１Ｈは、ヒト結腸ＦＦＰＥ試料におけるＢＣＭＡ ＩＨＣを示す。ＢＣＭＡ発現は、粘膜固有層内の推定常在性形質細胞における膜性及び核周囲である。図１Ｈの挿入図は、推定形質細胞のより高い倍率を示す。図１Ｉは、陽性推定形質細胞を有する、ヒト結腸ＦＦＰＥにおけるＢＣＭＡ発現のＩＳＨを示す。図１Ｉの挿入図は、推定形質細胞のより高い倍率を示す。
【図1-3】ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレット及び組織対照に対する免疫組織化学（「ＩＨＣ」）によるＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）タンパク質の検出、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）によるＢＣＭＡ ＲＮＡの検出を示す。図１Ｊ及び図１Ｋは、ＢＡＦＦＲ（図１Ｊ）又はＴＡＣＩ（図１Ｋ）でトランスフェクトされたＢＣＭＡ陰性細胞上のＢＣＭＡ発現のＩＨＣを示す。図１Ｊ及び図１Ｋの挿入図は、抗タグ免疫反応性（挿入図）によって示されるように細胞株のトランスフェクションの成功にもかかわらず、免疫反応性が検出されないことを示す。
【図2-1】脳試料に対して様々なＢＣＭＡ抗体を用いて行ったＩＨＣアッセイの結果を示す。図２Ａは、被殻におけるＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｅ６Ｄ７Ｂクローン（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。図２Ｂ～２Ｃは、髄質における Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｅ６Ｄ７Ｂクローン（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。
【図2-2】脳試料に対して様々なＢＣＭＡ抗体を用いて行ったＩＨＣアッセイの結果を示す。図２Ｄ及び図２Ｇは、被殻におけるＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈクローンＤ６（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。図２Ｅ～２Ｆ及び図２Ｈ～２Ｉは、髄質におけるＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈクローンＤ６（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。
【図2-3】脳試料に対して様々なＢＣＭＡ抗体を用いて行ったＩＨＣアッセイの結果を示す。図２Ｄ及び図２Ｇは、被殻におけるＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈクローンＤ６（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。図２Ｅ～２Ｆ及び図２Ｈ～２Ｉは、髄質におけるＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈクローンＤ６（タグ）でのＢＣＭＡ免疫反応性を示す。
【図3-1】トランス及びシスゴルジマーカーとのＢＣＭＡの共局在を示す。図３Ａ～３Ｄは、様々な抗体によるＨ９２９細胞における免疫蛍光染色の結果を示す。図３Ａは、ＤＡＰＩ染色を示す。図３Ｂは、ＧＯＬＭ１染色を示す。図３Ｃは、Ｅ６Ｄ７Ｂ染色を示す。図３Ｄは、ＧＯＬＭ１及びＥ６Ｄ７Ｂの共局在を示す。矢印は、ＧＯＬＭ１及びＥ６Ｄ７Ｂの共局在を示す。
【図3-2】トランス及びシスゴルジマーカーとのＢＣＭＡの共局在を示す。図３Ｅ～３Ｈは、様々な抗体による髄質における免疫蛍光染色の結果を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩ染色を示す。図３Ｆは、ＧＯＬＭ１染色を示す。図３Ｇは、Ｅ６Ｄ７Ｂ染色を示す。図３Ｈは、ＧＯＬＭ１、Ｅ６Ｄ７Ｂ及びＢＣＭＡの共局在を示す。山形は、点在するニューロンにおける自己蛍光を示す。
【図4-3】様々な脳領域におけるＢＣＭＡ ＲＮＡ発現を示す。図４Ｃは、ドナー年齢によってプロットされた、Ａｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎ由来の線条体及び線条体の成分（ＧＴＥｘ：尾状核及び被殻）についての凝集ＢＣＭＡ ＲＮＡ発現データを示す。略語：ＴＰＭ、１００万当たりの転写産物。
【0026】
（詳細な記述）
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて、各種刊行物、論文及び特許が引用又は記載され、これらの参照文献の各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の前後関係を与えるためのものである。そのような考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて、各種刊行物、論文及び特許が引用又は記載され、これらの参照文献の各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の前後関係を与えるためのものである。そのような考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0027】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。
【0028】
本明細書に記載又は参照されている技術及び手順には、当業者が概ねよく理解しているもの、及び／又は当業者が従来の手法を用いて通常採用しているもの、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載されている広く利用されている手法などが含まれる。本明細書中で特に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。この明細書を解釈するために、以下の用語の説明が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含まれ、その逆もまた同様である。記載された用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合、以下に記載された用語の説明が優先されるものとする。
【0029】
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｂｉｎｇｈａｍｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８（５５）：９３３９２－４０３；Ｂｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１３；４１（７）：１０２８－４８；Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；７（７）：１０９３－１０６；Ｕｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１４；３４（６）：５７１－７；Ｓｃｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１９８（８）：３０８１－８；ａｎｄ Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０２０；３４（４）：９８５－１００５。
【0030】
定義
本明細書において、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本明細書において、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【0031】
本明細書の用語について複数の定義が存在する場合、別段記述されない限り、本項の定義が優先される。
【0032】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値が測定又は決定される方法に部分的に依存する。特定の態様では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３、又は４つ以内の標準偏差を意味する。特定の態様では、「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．０５％以内を意味する。
【0033】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0034】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形は、述べられている要素又は要素群を含むことが意図されるが、これら以外の他の要素又は要素群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に固有である他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。
【0035】
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「からなる（consists of）」、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された要素又は要素群を包含するが、追加の要素又は要素群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。
【0037】
本明細書で使用されるとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された要素又は要素群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された要素又は要素群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【0038】
本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」は、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野において既知の、経口、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び／又は他の任意の物理的送達方法などによって、体外に存在する物質を患者に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状が治療される場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症後に生じる。疾患又はその症状が予防される場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症前に生じる。
【0039】
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0040】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に存在する、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。発現される抗体は、宿主細胞の細胞質内、細胞培養物の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
【0041】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲートを包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知である他の修飾も定義内に含まれる。
【0042】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0043】
「抗体」、「免疫グロブリン」、又は「Ｉｇ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長又はインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、及びそのフラグメント（例えば、ドメイン抗体）を包含する。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／又は親和性成熟されたものであり、また他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどからの抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、２つの同一の対のポリペプチド鎖で構成される、ポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図しており、各対は、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）；、及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照。また、抗体としては、合成抗体、組換え産生抗体、ラクダ科種（例えば、ラマやアルパカ）由来などの単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、体内抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかの機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、フラグメントの由来となった抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す。機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の非限定的な例としては、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ）を含有する抗原結合ドメイン又は分子を含む。そのような抗体フラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５、及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもなくアンタゴニストでもなくてもよい。
【0044】
「抗原」とは、抗体が選択的に結合することができる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連し、例えば、細胞上又は細胞内に存在する。
【0045】
本明細書で使用するとき、「ＢＣＭＡ」という用語は、Ｂ細胞成熟抗原を指し、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（tumor necrosis factor receptor superfamily member 17、ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られ、ヒトにおいてＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子を認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球において優先的に発現される。「ＢＣＭＡ」という用語は、細胞（Ｂ細胞を含む）によって天然に発現されるか、又はそのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞上に発現され得る、任意のＢＣＭＡバリアント、アイソフォーム、及び種間相同体を含む。記載されない限り、好ましくは、ＢＣＭＡはヒトＢＣＭＡである。例示的なヒトＢＣＭＡヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０５８２９１によって提供される。ヒトゲノムにはＢＣＭＡ遺伝子の４つの主要なハプロタイプが存在し、本開示では、「ＢＣＭＡ」という用語は、４つ全てを包含することを意味する（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２：２７６－９，２００１）。
【0046】
「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合フラグメント」又は「抗原に結合するドメイン」は、抗原に特異的に結合する分子の一部を指す。抗原結合ドメインは、抗原に結合する免疫グロブリンの一部、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨ又は１つのＶＬから成るドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨ、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、並びに抗原に結合する非抗体スカフォールドを含んでもよい。
【0047】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、当該技術分野の用語であり、結合分子（例えば、単鎖抗体配列を含む抗体）が特異的に結合することができる抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープ、非線状エピトープ、又は不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸（「線状」エピトープ）であり得るか、又はエピトープは、ポリペプチドの２つ又は３つ以上の非連続領域からのアミノ酸（「立体構造」、「非線状」、又は「不連続」エピトープ）を含み得る。概ね、線状エピトープは、二次、三次、又は四次構造に依存する場合もあれば、依存しない場合もあることが当業者によって理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、アミノ酸が天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているかどうかにかかわらず、アミノ酸の群に結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体構造（例えば、屈曲、ねじれ、回転、又はフォールディング）を示すことを必要とする。
【0048】
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含むものである。定常領域には、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列の変異体が含まれ得る。特定の実施形態では、インタクト抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有する。
【0049】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖについては、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【0050】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、単一の単量体可変抗体ドメインを指し、抗原結合が可能である。単一ドメイン抗体には、本明細書に記載のＶＨＨドメインが含まれる。単一ドメイン抗体の例としては、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種（例えば、ラマ）由来のものなどの軽鎖を自然に欠く抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されているように、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで産生された抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種でも、天然に軽鎖を持たない重鎖抗体を産生することがある。そのような他の種に由来するＶＨＨは、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、別の分子（例えば、薬剤）に遺伝的に融合するか又は化学的にコンジュゲートし得る。単一ドメイン抗体は、より大きな結合分子（例えば、多重特異性抗体又は機能的外因性受容体）の一部であり得る。
【0051】
「結合」又は「結合すること」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体には、共有結合若しくは非共有結合、相互作用、又は力によって一緒に保持された２つ又は３つ以上の分子の結合も含まれ得る。抗体の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一のエピトープとの間の非共有相互作用全体の強さが、そのエピトープに対する抗体又は機能的フラグメントの親和性である。一価の抗原に対する結合分子（例えば、抗体）の解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、親和性とは逆の関係にある。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。ＫＤの値は、抗体及び抗原の異なる複合体によって様々であり、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書において提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書において提供される任意の方法、又は当業者に周知である任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位での親和性は、必ずしも抗体と抗原との間の相互作用の真の強さを反映するものではない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含有する複雑な抗原が、複数の結合部位を含む抗体と接触した場合、ある部位での抗体の抗原との相互作用は、第２部位での反応の確率を増加させるであろう。そのような多価抗体と抗原との間の複数の相互作用の強さは、親和力と呼ばれる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「体液（body fluid）」又は「体液（bodily fluid）」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）患者などの患者から得られる流体を指す。例えば、体液は、血液、脳脊髄液（cerebral spinal fluid、ＣＳＦ）、母乳、又は尿であり得る。体液はまた、細胞を除去するために分画された血液（すなわち、血漿）又は細胞及び凝固因子を除去するために分画された血液（すなわち、血清）であり得る。
【0053】
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」又は「第１の抗体」という用語は、固体支持体に固定化された、例えば、結合された、又は別の方法で連結された別の組成物によって特異的に結合され得る組成物を指す。本明細書で提供される検出部分の多くは、結合事象が伴う限り、捕捉部分として使用することもできる。例えば、有用な捕捉部分としては、特異的かつ選択的なリガンドが利用可能である親和性標識（例えば、ビオチンとアビジン、グルタチオンとＧＳＴ）、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能であるハプテン及びタンパク質（例えば、ｃ－Ｍｙｃ）、標的に相補的な配列を有する核酸分子、並びに特異的かつ選択的なリガンドが利用可能であるペプチド（例えば、ヒスチジンタグとＮｉ）が挙げられる。クロマトグラフィー樹脂への結合特性に影響を及ぼす分子も想定される。固体支持体は、例えば、フィルタ、プレート、膜、クロマトグラフィー樹脂、又はビーズであり得る。
【0054】
本明細書で使用される場合、「カットポイント係数」又は「閾値」という用語は、概ね、ナイーブプールマトリックス（例えば、血清又は血漿）からのシグナルを数学的に操作して、陽性とみなされるために必要とされる試料かの最小シグナルを設定するために使用される値を指す。
【0055】
「誘導体」という用語は、本明細書で提供される方法で使用される抗体物質及びポリペプチドに関連して使用される場合、ユビキチン化、治療薬又は診断薬へのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性核種又は様々な酵素による）、ペグ化などの共有ポリマー結合（すなわち、ポリエチレングリコールによる誘導体化）、及びヒトタンパク質では通常生じないオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入又は置換を含むがこれらに限定されない技法によって化学修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は、非誘導体化分子の結合特性を保持することができる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「検出可能な部分」、「検出部分」、又は「標識」という用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段を含むがこれらに限定されない手段によって検出可能な組成物（例えば、ポリペプチド又は抗体）を指す。例えば、有用な検出可能な部分又は標識としては、ルテニウム（Ｒｕ）ベースの触媒、ユーロピウム、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン－ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、並びに標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な部分又は標識は、多くの場合、試料中の結合した検出可能な部分又は標識の量を定量化するために使用することができる、放射性シグナル、発色シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。
【0057】
本発明において使用されてもよい標識の例としては、フルオロフォア、発色団、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、ビーズ若しくは他の固体表面、金若しくは他の金属粒子若しくは重原子、スピン標識、放射性同位体、酵素基質、ハプテン、抗原、量子ドット、アミノヘキシル、ピレン、核酸若しくは核酸類似体、又は例えば、受容体、ペプチドリガンド若しくは基質、酵素、及び抗体（抗体断片を含む）などのタンパク質が挙げられる。
【0058】
本発明によるいくつかの標識は、標的が試料中の色の有無又は色の変化によって検出される「色標識」を含む。「色標識」の例は、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、電気化学発光標識、生物発光標識、及び基質の色変化を触媒する酵素である。いくつかの実施形態では、例えば、識別可能な色標識を単一の検出ユニットに付着させることによって、又は各々が異なる識別可能な色標識を担持する２つ以上の検出ユニットを使用することによって、２つ以上の種類の色を使用してもよい。
【0059】
本明細書に記載される「フルオロフォア」は、１つ又は複数の波長の電磁放射線で励起されると検出可能な電磁放射線を放出する分子である。多種多様なフルオロフォアが当技術分野で公知であり、標識として使用するために化学者によって開発され、本発明のリンカーにコンジュゲートすることができる。例としては、フルオレセイン又はその誘導体、例えばフルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５－（及び６）－カルボキシフルオレセイン、５－又は６－ｅａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６－（フルオレセイン）－５－（及び６）－カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン及びテトラメチルローダミン－５－（及び－６）－イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などのローダミン又はその誘導体が挙げられる。本発明のリンカーにコンジュゲートさせることもある他の例示的なフルオロフォアとしては、（ジエチル－アミノ）クマリン又は７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸、スクシンイミジルエステル（ＡＭＣＡ）などのクマリン色素、スルホローダミン１０１スルホニルクロリド（ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）又はＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）スルホニルクロリド；５－（及び－６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＸＲ）としても知られている、５－（及び－６）－カルボキシローダミン１０１、スクシンイミジルエステル、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド（ＬｉＳＲ）などのリサミン又はリサミン誘導体、５－（及び－６）－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＩ）；フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＤＥＣＣＡ）；５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＴＭＲ）；７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＨＣＣＡ）；６－（フルオレセイン－５－（及び－６）－カルボキサミドヘキサン酸（ＦＣＨＡ）；Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－３－インダセンプロピオン酸、スクシンイミジルエステル；５，７－ジメチルＢＯＤＩＰＹ（商標）プロピオン酸スクシンイミジルエステル（ＤＭＢＰ）としても知られる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な「活性化フルオレセイン誘導体」（ＦＡＰ）；エオシン－５－イソチオシアネート（ＥＩＴＣ）；エリスロシン－５－イソチオシアネート（ＥｒＩＴＣ）；及びＣａｓｃａｄｅ（商標）Ｂｌｕｅアセチルアジド（ＣＢＡＡ）（１－ヒドロキシ－３，６，８－ピレントリスルホン酸の０－アセチルアジド誘導体）が挙げられる。本発明において有用な更に他の潜在的なフルオロフォアには、緑色蛍光タンパク質及びその類似体又は誘導体などの蛍光タンパク質、チロシン及びトリプトファン並びにそれらの類似体などの蛍光アミノ酸、蛍光ヌクレオシド、並びにＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリスリン、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルー、ローダミングリーン、及びアレクサ色素などの他の蛍光分子が含まれる。本発明において使用されてもよい蛍光標識の更に他の例としては、Ｒ－フィコエリスリン又はａｌｉｉｏｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎの結合体、被覆ＣｄＳｅナノ微結晶のような半導性材料に基づく粒子などの無機蛍光標識が挙げられる。
【0060】
上記の多数のフルオロフォア並びに他のものは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの会社から市販されている。
【0061】
本発明において使用されてもよいポリマー粒子標識の例としては、ポリスチレン、ＰＭＭＡ又はシリカの微粒子、ビーズ又はラテックス粒子が挙げられ、これらは、蛍光色素、又は色素、酵素若しくは基質を含有するポリマーミセル若しくはカプセルに埋め込まれることができる。
【0062】
本発明において使用されてもよい金属粒子の例としては、金粒子及び被覆金粒子が挙げられ、これらは銀染色によって変換することができる。
【0063】
いくつかの実施形態でコンジュゲートされてもよいハプテンの例は、フルオロフォア、ｍｙｃ、ニトロチロシン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、２，４－ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ブロモデオキシウリジン、スルホネート、アセチルアミノフルレン、マーキュリートリニトロフェノール、及びエストラジオールである。
【0064】
本発明において使用されてもよい酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を含む。
【0065】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のために一般的に使用される基質の例としては、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル増強を伴うジアミノベンジジン、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジン二塩酸塩（ＢＤＨＣ）、Ｈａｎｋｅｒ－Ｙａｔｅｓ試薬（ＨＹＲ）、インドファンブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４－クロロ－１－ナフトール（ＣＮ）、α－ナフトールピロニン（α－ＮＰ）、ｏ－ジアニシジン（ＯＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２－（ｐ－ヨードフェニル）－３－ｐ－ニトロフェニル－５－フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドキシル－β－Ｄ－ガラクトシド／フェロ－フェリシアニド（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【0066】
アルカリホスファターゼに一般的に使用される基質の例としては、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－ＭＸ－リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－ＭＸ－リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－リン酸／ニューフクシン（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－ｂ（ベータ）－ｄ（デルタ）－ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【0067】
本発明において使用されてもよい発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２－ジオキセタン及びピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。
【0068】
本発明において使用されてもよい放射性標識の例としては、ヨウ化物、コバルト、セレン、水素、炭素、硫黄及びリンの放射性同位体が挙げられる。
【0069】
本明細書で使用される場合、「検出可能な抗体」という用語は、検出され得る任意の抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な部分により直接標識される。特定の実施形態では、抗体は、検出可能な抗Ｉｇ抗体である。本明細書で使用される場合、「検出可能な抗Ｉｇ抗体」という用語は、検出され得る抗Ｉｇ抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗Ｉｇ抗体は、Ｉｇ分子へのその固有の結合に加えて、検出可能な部分により直接標識される。Ｉｇ抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹアイソタイプのものであり得る。
【0070】
本明細書で使用される場合、「一次抗体」という用語は、目的の抗原に直接結合する抗体を指す。本明細書で使用される場合、「二次抗体」という用語は、検出標識にコンジュゲートされた抗体を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二次抗体は、一次抗体に直接結合する。他の実施形態では、本明細書に提供される二次抗体は、例えば、一次抗体を認識する別の抗体に結合することによって、一次抗体に間接的に結合する。
【0071】
ペプチド又はポリペプチドの文脈において、本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、完全長未満のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。そのようなフラグメントは、例えば、アミノ末端での切断、カルボキシ末端での切断、及び／又はアミノ酸配列からの残基（複数可）の内部欠失から生じ得る。フラグメントは、例えば、選択的ＲＮＡスプライシング又はインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。特定の実施形態では、フラグメントは、標的抗原に免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、標的抗原に免疫特異的に結合する抗体フラグメントは、抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの機能を保持する。
【0072】
２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセントの同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する、２つ又は３つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【0073】
標的抗原と「免疫特異的に結合する抗体」という用語及び類似の用語は、本明細書において互換的に使用され、標的抗原又はエピトープのみに特異的に結合する抗体及びそのフラグメントを指す。更に他の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡアイソタイプなどのＩｇに免疫特異的に結合する。
【0074】
本明細書で使用される場合、「干渉」という用語は、概ね、標的分析物の正確な検出及び測定を妨げる体液（例えば、血清又は血漿）試料中の物質の存在を指す。本明細書で使用される場合、干渉は、概ね、濃度－応答関係に対する遊離薬物の効果又はマトリックス（例えば、血清又は血漿）の効果を指す。例えば、マトリックスからの干渉は、７５～１２５％の相対精度の範囲を目標とするために、潜在的な干渉のない試料に対する相対精度として評価され得る。
【0075】
試料の文脈における「インビボ」という用語は、生物学的試料、例えば、生物学的若しくは体液、例えば、血液、血漿、血清、骨髄、髄液、脳液、又は組織、例えば、リンパ組織、薄層細胞学的試料、新鮮な凍結組織試料若しくは腫瘍組織を含む、対象、例えば、患者、例えばヒト患者から得られた試料を指す。「インビボ」という用語は、生きている生物の外で培養又は増殖された細胞若しくは細胞株、又は細胞の生体分子成分を包含する「インビトロ」という用語と区別されるべきである。
【0076】
「検出限界」、「ＬＯＤ」、又は「感度」という用語は、本明細書で使用される場合、概ね、検出され得るが必ずしも正確な値として定量されない体液（例えば、血清又は血漿）試料中の最低分析物濃度を指す。例えば、ＬＯＤは、プールされたナイーブマトリックス＋カットポイント係数の測定された平均応答よりも大きいシグナルを一貫して生成する分析物濃度として定義され得る。
【0077】
本明細書で使用される場合、「マトリックス（matrix）」又は「マトリックス（matrices）」という用語は、概ね、抗体が測定される生物学的バックグラウンドを指す。マトリックスの例としては、例えば、体液及び組織が挙げられる。
【0078】
「モノクローナル抗体」という用語は、均質又は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。特定の実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞によって生成される抗体である。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製するための特定の方法に限定されるものではない。例えば、本明細書で提供される方法において使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は当該技術分野において既知の技法を使用してファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当該該分野において周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【0079】
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」は、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答において生成される抗体集団を指し、したがって、タンパク質内の同じエピトープ及び異なるエピトープ向けられた様々な異なる抗体を含む。ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【0080】
本明細書で使用される場合、「精度」という用語は、概ね、分析者と日数との間のシグナルの変動性を指す。例えば、精度は、変動係数、値の範囲として、又はＡＮＯＶＡ統計を使用して評価され得る。
【0081】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、本明細書で提供される療法又は療法の組み合わせの投与から生じる、疾患及び／又はそれに関連する症状（例えば、患者におけるＰＫＵ又は癌などのフェニルアラニンレベルの上昇に関連する疾患又はそれに関連する症状）の発生、再発、発症、又は拡大の全体的又は部分的な阻害を指す。
【0082】
本明細書で使用される場合、「試薬安定性」という用語は、概ね、試薬の調製の堅牢性及び貯蔵安定性を指す。例えば、試薬安定性は、新たに調製された試薬に対して７５～１２５％の精度内で値が測定されることを依然として可能にする条件によって確立され得る。
【0083】
本明細書で使用される場合、「堅牢性」という用語は、概ね、方法パラメータの小さな変動によって影響を受けないままであるアッセイの能力を指し、通常の実行条件中のアッセイの信頼性を示す。例えば、堅牢性は、公称条件に対して７５～１２５％の精度内で依然としてシグナルを生成する試薬濃度、試薬体積、又はインキュベーション時間のパーセント変化として評価することができる。
【0084】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、概ね、本明細書で提供される方法において使用することができる、例えば、患者から採取された試験流体又は組織を指す。いくつかの実施形態では、試料は、インビボ試料、例えば、対象、例えば、患者、例えば、ヒト患者由来の体液（又は生物学的流体）である。そのような体液の非限定的な例としては、血液（例えば、ヒト末梢血（human peripheral blood、ＨＰＢ））、血液溶解物、血清、血漿、細針吸引物、管洗浄液、髄液、脳液、骨髄、腹水、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。他の実施形態では、試料は、対象からの腫瘍組織などの生検組織、又は他の体組織若しくは臓器の薄層細胞学的試料から採取される。特定の実施形態では、試料は、末梢血試料、腫瘍組織又は疑わしい腫瘍組織、薄膜細胞学的試料、細針吸引試料、骨髄試料、リンパ節試料、尿試料、腹水試料、洗浄試料、食道ブラッシング試料、膀胱又は肺洗浄試料、髄液試料、脳液試料、管吸引試料、乳房分泌物試料、胸水試料、新鮮な凍結組織試料、パラフィン包埋組織試料を含む。他の実施形態では、試料は、末梢血試料、腫瘍組織若しくは疑わしい腫瘍組織、薄膜細胞学的試料、細針吸引試料、骨髄試料、尿試料、腹水試料、洗浄試料、食道ブラッシング試料、膀胱若しくは肺洗浄試料、髄液試料、脳液試料、管吸引試料、乳房分泌物試料、胸水試料、新鮮な凍結組織試料、又はパラフィン包埋組織試料のうちのいずれかからの抽出液であるか、又はそれから産生された処理された試料である。
【0085】
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、概ね、特定のタンパク質と反応する抗体を検出するアッセイの能力を指す。例えば、特異性は、非特異的タンパク質に対する応答がＬＯＤ未満であるべきである一方で、特定の分析物との比例的な検出応答を指し得る。比例的な応答は、０．９８以上の相関係数Ｒ値に対して評価され得る。標的抗原を検出するために本明細書で提供される方法に関連して使用される場合、特異性は、特定のタンパク質と反応する抗原を検出する能力を指す。
【0086】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。本明細書で提供される方法及びキットのいくつかの実施形態では、患者は、疾患若しくは症状、又は癌を有する。本明細書で提供される方法及びキットの他の実施形態では、患者は、癌療法を受けている患者である。本明細書で提供される方法及びキットの更に他の実施形態では、患者は、妊婦又は乳児（例えば、０～約３６ヶ月齢）である。
【0087】
本明細書で使用される場合、「タグ」及び「標識」という用語は、互換的に使用され、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本明細書で提供される方法において使用される他のポリペプチドに結合される任意の種類の部分を指す。抗体又はタグに関する「検出可能な」又は「検出」という用語は、可視化することができる任意の抗体又はタグを指すか、あるいは抗体又はタグの存在を別の方法で決定及び／又は測定することができる（例えば、定量化によって）。検出可能なタグの非限定的な例としては、蛍光タグ又は他の化学発光タグ、及びＰＣＲを使用して増幅及び定量され得るタグが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法において使用される二次抗体は、標識されたストレプトアビジンと組み合わせて使用されるビオチン化二次抗体である。
【0088】
本明細書で使用される場合、「療法」という用語は、疾患（又はそれに関連する症状）又は癌の予防、管理、治療、及び／又は寛解において使用され得る任意のプロトコル、方法、及び／又は薬剤を指す。特定の実施形態では、「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」という用語は、医療関係者などの当業者に既知の疾患又は癌の予防、管理、治療、及び／又は寛解に有用な生物学的療法、支持療法、及び／又は他の療法を指す。
【0089】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、哺乳動物、例えばヒトから得られる組織を指す。例えば、組織は、生検試料、外科的に除去された組織、又は死後収集物由来のものであり得る。更に、組織をホモジナイズし抽出して、組織から酵素又は抗体を単離することができる。
【0090】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、１つ又は２つ以上の療法を投与することによって生じる、疾患（それに関連する症状）又は癌の進行、重症度、及び／又は持続期間の減少又は寛解を指す。
【0091】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、元のポリペプチドコードドメインに対してコード領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含むポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持する。
【0092】
本明細書で使用される場合、「インサイチュハイブリダイゼーション」又は「ＩＳＨ」という用語は、供給源試料の形態を保存しながら、特定の標的核酸を局在化及び可視化するための技法を指す。
【0093】
本明細書で使用される場合、「免疫組織化学」又は「ＩＨＣ」という用語は、供給源試料の形態を保存しながら、抗体を利用して供給源試料中の目的のタンパク質を検出するための技法を指す。免疫蛍光（Immunofluorescence、ＩＦ）は、蛍光標識を指し、したがって、ＩＨＣという用語にも包含される。
【0094】
本明細書で使用される場合、「架橋」という用語は、２つ又は３つ以上の分子を一緒に結合するプロセスを指す。「架橋剤」又は均等物は、タンパク質及び他の分子に見られる官能基に自身を結合する２つ又は３つ以上の化学的に反応性の末端を含有する薬剤を指す。具体的には、架橋剤がホルムアルデヒド又はその均等物である場合、アミノ酸又は核酸塩基上の求核基は、ホルムアルデヒドと共有結合を形成し、これは、しばしば別の分子上の別の官能基を伴う第２のステップにおいて安定化され、メチレン架橋の形成をもたらす。架橋剤が酸化剤である場合、それはタンパク質及び他の生体分子の側鎖と反応することができ、組織構造を安定化させる架橋の形成を可能にする。
【0095】
本明細書で使用される場合、「固定」又は「固定すること」という用語は、ＩＨＣプロセスにおける試料の固定に関して行われる場合、例えば、自己分解又は腐敗による崩壊から試料を保護するための手順を指す。それは、任意の進行中の生化学反応を終結させ、また、処理された組織の機械的強度又は安定性を増加させ得る。
【0096】
本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、概ね、任意の形態の測定を指し、要素が存在するか否かを決定することを含む。この用語は、定量的及び／又は定性的決定を含む。
【0097】
ＢＣＭＡを検出するためのＩＨＣ方法
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）は、目的の標的タンパク質を発現する細胞を同定し、潜在的な毒性を予測することによる、Ｒ＆Ｄ治療キャンペーンにおける重要なステップである。堅牢なＩＨＣアッセイは、最適な特異性及び感度で標的を確実に認識する好適な一次抗体に依存する。ＦＦＰＥ組織は、しばしば、立体構造が変化した過剰固定タンパク質を提示し、これは、非ＩＨＣアッセイにおいて検証された抗体の再目的化を極めて不確実にする。組織調製及び保存プロセス中に、ホルマリンなどの架橋剤が使用される場合、ホルマリン固定は、エピトープをマスクし、免疫反応性の減少をもたらしてもよい（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ７１：２２４－２３０（１９９６）を参照されたい）。ホルマリン固定は、固定時間が増加すると平衡点までタンパク質へのホルムアルデヒド基結合が連続する時間依存性プロセスである（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３３：８４５－８５３（１９８５）を参照されたい）。研究により、ホルマリン固定は、特に延長された場合、抗原性を減少させることが示されており（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ ａｎｄ Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３４：１０９５－１１００（１９８６）を参照されたい）、これにより、診断的ＩＨＣのためのホルマリン固定組織の使用が制限される（Ｒａｍｏｓ－Ｖａｒａ，Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４２：４０５－４２６（２００５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７（８）：７５３－７６１（２００９）を参照されたい）。新しいＩＨＣ抗体の生成は、好適な試薬が市販されていない場合、関連する対照に対して多くの候補をスクリーニングすることを必要とする。
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）は、目的の標的タンパク質を発現する細胞を同定し、潜在的な毒性を予測することによる、Ｒ＆Ｄ治療キャンペーンにおける重要なステップである。堅牢なＩＨＣアッセイは、最適な特異性及び感度で標的を確実に認識する好適な一次抗体に依存する。ＦＦＰＥ組織は、しばしば、立体構造が変化した過剰固定タンパク質を提示し、これは、非ＩＨＣアッセイにおいて検証された抗体の再目的化を極めて不確実にする。組織調製及び保存プロセス中に、ホルマリンなどの架橋剤が使用される場合、ホルマリン固定は、エピトープをマスクし、免疫反応性の減少をもたらしてもよい（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ７１：２２４－２３０（１９９６）を参照されたい）。ホルマリン固定は、固定時間が増加すると平衡点までタンパク質へのホルムアルデヒド基結合が連続する時間依存性プロセスである（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３３：８４５－８５３（１９８５）を参照されたい）。研究により、ホルマリン固定は、特に延長された場合、抗原性を減少させることが示されており（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ ａｎｄ Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３４：１０９５－１１００（１９８６）を参照されたい）、これにより、診断的ＩＨＣのためのホルマリン固定組織の使用が制限される（Ｒａｍｏｓ－Ｖａｒａ，Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４２：４０５－４２６（２００５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７（８）：７５３－７６１（２００９）を参照されたい）。新しいＩＨＣ抗体の生成は、好適な試薬が市販されていない場合、関連する対照に対して多くの候補をスクリーニングすることを必要とする。
【0098】
一態様では、本明細書ではホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢＣＭＡを検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、（１）ＦＦＰＥ試料を切片化し、マウントすることと、（２）試料を脱パラフィンすることと、（３）試料を加熱して抗原賦活化を媒介することと、（４）試料をブロッキング剤で前処理することと、（５）試料を第１の検出剤と接触させることと、（６）第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることと、（７）試料に結合した未結合の第２の検出剤の存在を検出することとを含む。
【0099】
別の実施形態では、本方法は、（１）ＦＦＰＥ試料を切片化し、マウントすることと、（２）試料を脱パラフィンすることと、（３）試料を加熱して抗原賦活化を媒介することと、（４）試料をブロッキング剤で前処理することと、（５）試料を第１の検出剤と接触させることと、（６）未結合試料を除去することと、（７）第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることと、（８）未結合の第２の検出剤を除去することと、（９）試料に結合した未結合の第２の検出剤の存在を検出することとを含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって検出されたＢＣＭＡは、細胞（Ｂ細胞を含む）によって天然に発現されるか、又はそのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞上に発現されることができる、任意のＢＣＭＡバリアント、アイソフォーム、及び種間相同体を含む。記載されない限り、好ましくは、ＢＣＭＡはヒトＢＣＭＡである。
【0101】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用される試料は、体液又は組織から収集された細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、生物に見られる任意の組織を含んでもよい。いくつかの実施形態では、生物は、脊椎動物又は無脊椎動物を含む。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、ヒト又は非ヒト霊長類を含む。いくつかの実施形態では、サルは、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル（Macaca mulatta）、マーモセット（Callithrix jacchus）、チンパンジー（Pan troglodytes）、ボノボ（Pan paniscus）、ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）、タパヌリオランウータン（Pongo tapanuliensis）又は任意の他の既知の霊長類種を含む。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍組織は、良性腫瘍を含む。別の実施形態では、腫瘍組織は前悪性腫瘍を含む。他の実施形態では、腫瘍組織は悪性腫瘍を含む。本開示によって企図される例示的な腫瘍組織の非網羅的なリストには、肉腫、癌腫、腺癌、リンパ腫、乳腺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、下垂体腫瘍、神経膠芽腫、髄芽腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、膀胱腫瘍、膵腫瘍、膵島腫瘍、肝腫瘍、卵巣腫瘍、直腸結腸腫瘍、肺腫瘍、気管支腫瘍、気管気管支腫瘍、皮膚腫瘍、リンパ系腫瘍、及び胃腸腫瘍が含まれる。
【0102】
更なる実施形態では、組織は脳組織を含んでもよい。脳組織は更に、脳の線条体領域、視床領域、中脳領域又は髄質領域を含んでもよい。
【0103】
いくつかの実施形態では、本開示の方法において使用される試料は、対象から取得される。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト又は非霊長類ヒトである。他の実施形態では、哺乳動物はカニクイザル（Macaca fascicularis）である。試料は、当技術分野において公知の任意の方法によって収集してもよい。当業者は、収集手順が試料の種類及び意図される分析に応じて変わることを理解する。例えば、血液試料は、真空管システムを用いて静脈内経路によって収集されてもよい。脳組織は、頭皮を切開し、頭蓋骨に穴を開け、脳に針を挿入して脳組織を取得することによって収集してもよい。
【0104】
本開示のいくつかの実施形態では、組織又は細胞試料を、固定又は包埋してもよい。固定剤は、例えば、細胞及び組織を再現可能及び生きているような方法で保存するために必要とされてもよい。固定剤はまた、細胞及び組織を安定化し、それによってそれらを処理及び染色技術の過酷な状況から保護してもよい。例えば、組織ブロック、切片、又は塗抹標本を含む試料を、固定液に浸漬してもよく、又は塗抹標本の場合、乾燥してもよい。
【0105】
組織標本を固定及び包埋する多くの方法、例えば、ホルマリン固定及びその後のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）が知られている。任意の好適な固定剤を使用してもよい。例としては、エタノール、酢酸、ピクリン酸、２－プロパノール、３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物、アセトイン（単量体の混合物）及び二量体、アクロレイン、クロトンアルデヒド（シス＋トランス）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、四酸化オスミニウム、パラホルムアルデヒド、塩化水銀、トリレン－２，４－ジイソシアネート、トリクロロ酢酸、タングステン酸が挙げられる。他の例としては、ホルマリン（水性ホルムアルデヒド）及び中性緩衝ホルマリン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミデート、ベンゾキノン（benzoequinone）、オスミウム酸及び四酸化オスミウムが挙げられる。新鮮な生検標本、細胞学的調製物（接触調製物及び血液塗抹標本を含む）、凍結切片、及びＩＨＣ分析用の組織を、エタノール、酢酸、メタノール及び／又はアセトン試料を含む有機溶媒中で固定してもよい。
【0106】
本開示のいくつかの実施形態では、本方法は、非特異的相互作用を低減しながら、試料中の標的分子の反応性又はアクセシビリティを増加させるための前処理工程を含む。このプロセスは抗原賦活化と呼ばれ、標的賦活化、エピトープ賦活化、標的アンマスキング又は抗原アンマスキングとしても知られている。例えば，Ｓｈｉｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，４５（３）：３２７（１９９７）を参照されたい。抗原賦活化は、例えばプロテイナーゼ、プロナーゼ、ペプシン、パパイン、トリプシン又はノイラミニダーゼなどのタンパク質分解酵素による酵素消化を含む様々な方法を包含する。いくつかの実施形態では、熱、例えば「熱媒介抗原賦活化」を使用してもよい。加熱は、マイクロ波照射、又は適切なｐＨに安定化された緩衝液中での水浴、スチーマ、通常のオーブン、オートクレーブ、若しくは圧力調理器を含んでもよい。いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化は、ＥＤＴＡ系溶液を使用して行われる。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ系溶液は、８．０～９．０、８．５～９．５、９．０～１０．０、９．５～１０．５、１０～１１、１０．５～１１．５、１２．０～１３．０、１２．５～１３．５又は１３．０～１４．０のｐＨを有する。別の実施形態では、ＥＤＴＡ系溶液は、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５又は１４．０のｐＨを有する。更なるｐＨ安定化緩衝液としては、ＥＧＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、尿素、グリシン－ＨＣｌ又はホウ酸を挙げてもよい。
【0108】
いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化の工程は、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分又は６０分にわたって行われる。他の実施形態では、熱媒介抗原賦活化工程は、８０℃～１２０℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、熱媒介抗原賦活化工程は、８０°Ｃ～９５°Ｃ、８５°Ｃ～１００°Ｃ、９０°Ｃ～１０５°Ｃ、９５°Ｃ～１１０°Ｃ、１００°Ｃ～１１５°Ｃ、又は１０５°Ｃ～１２０°Ｃの温度で行われる。他の実施形態では、熱媒介抗原賦活化法は、９８℃、９９℃、１００℃、又は１２０℃で行われる。特定の実施形態では、熱媒介抗原賦活化法は１００℃で行われる。いくつかの実施形態では、上記の抗原賦活化法の任意の組み合わせを使用してもよい。
【0109】
本開示のいくつかの実施形態では、方法は、ブロッキング剤で試料を遮断することを含む。当技術分野で公知のブロッキング剤としては、とりわけ、血清（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ゼラチン、サケ精子ＤＮＡ、アビジン／ビオチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は内因性ペルオキシダーゼを遮断する。したがって、ブロッキング剤は過酸化物ブロックを含んでもよい。ブロッキングは、持続時間にわたって行われてもよい。いくつかの実施形態では、過酸化物ブロックによるブロッキングは、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、又は２０分間実施されてもよい。他の実施形態では、ブロッキング剤は、非特異的抗体結合を遮断する。したがって、ブロッキング剤は、Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋを含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋによるブロッキングは、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、９０分間、又は１２０分間実施されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋによるブロッキングは、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間又は１２時間にわたって行われてもよい。更なるブロッキング剤を使用してもよいことが理解される。当業者は、ブロッキング剤及びブロッキングのための時間が処理される組織に依存することを理解する。
【0110】
本開示は、多くの既知の検出フォーマット及びそれらに関連する試料と互換性がある。例えば、本発明は、イムノアッセイ、タンパク質検出アッセイ、又は核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、とりわけ表面又はアレイ上の標識する、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に関連して使用されてもよい。これらの検出アッセイの全ては、研究だけでなく、例えば種々の疾患及び状態の検出及び診断においても有用である。
【0111】
例えば、ＩＨＣは、インサイチュで試料又は組織標本中の標的を検出する方法を具体的に提供する（Ｍｏｋｒｙ １９９６，ＡＣＴＡ ＭＥＤＩＣＡ ３９：１２９を参照されたい）。ＩＨＣでは試料の全体的な細胞完全性が維持されるので、目的の標的の有無及び位置の両方の検出が可能になる。典型的には、試料をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、染色及びその後の光学顕微鏡による検査のために切片に切断する。ＩＨＣの現在の方法は、直接標識又は二次抗体ベース若しくはハプテンベースの標識のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例としては、例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｐｏｗｅｒｖｉｓｉｏｎ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ，ＡＺ）、ＮＢＡ（商標）キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＨｉｓｔｏＦｉｎｅ（登録商標）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）が挙げられる。本発明は、ＩＨＣ検出プラットフォームにおけるシグナルの増強又は柔軟性の増加を可能にしてもよい。
【0112】
ＩＨＣ、ＩＳＨ及び病因学的技術は、部分的に架橋され、本質的に非常に不均一であってもよい組織、細胞及びタンパク質のマトリックス中で実施されてもよい。拡散速度は、濃度の増加及び温度の上昇と共に増加するが、分子量及び分子サイズと共に減少する。したがって、構成要素の物理的サイズは非常に重要である。例えば、大きな分子は、試料の一部への拡散から除外されることができるが、小さなサイズの成分は、試料の異なる区画の内外に容易に拡散してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のユニットは、標的認識及び検出を改善するために、小さいサイズ、例えば、抗体又はビオチン－ストレプトアビジン複合体より小さいサイズであるように設計されてもよい。
【0113】
本開示のいくつかの実施形態では、方法は、試料を検出剤と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「検出剤」という用語は、標的に特異的に結合することができる結合剤を指す。このような結合剤としては、例えば、抗体及びリガンドが挙げられる。抗体には、完全長抗体並びに上記に例示したものなどの機能的断片が含まれる。リガンドには、上で例示したものなどの完全長ポリペプチド及びその機能的結合断片が含まれる。リガンドにはまた、上記に例示された非ポリペプチドリガンドも含まれる。標的への特異的結合に言及する場合、本開示の検出剤は、標的に直接結合することができ、又は間接的手段によって標的に特異的にすることができる。いくつかの実施形態では、試料を第１の検出剤及び第２の検出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、検出剤は、抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、試料を室温で第１の検出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、試料を４℃又は３７℃で第１の検出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、試料を第１の検出剤と１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、９５分間、１００分間、１０５分間、１１０分間、１１５分間又は１２０分間接触させた。いくつかの実施形態では、試料を第１の検出剤と３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間又は１２時間接触させた。いくつかの実施形態では、試料を室温で第２の検出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、試料を３７℃で第２の検出剤と接触させる。他の実施形態では、試料を４℃で第２の検出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、試料を第２の検出剤と１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、又は６０分間接触させた。
【0114】
いくつかの実施形態では、試料に結合した第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、試料中の少なくとも１分子のＢＣＭＡの存在を示す。
【0115】
いくつかの実施形態では、ＦＦＰＥ試料中のＢＣＭＡ”）を検出する方法は、ヒト及びカニクイザル由来の結腸、脾臓、及びリンパ節のＦＦＰＥ試料を切片化及びマウントすることと、試料を脱パラフィンすることと；試料を、ｐＨ９．０のＥＤＴＡ系溶液中、１００℃で２０分間加熱することと；試料を内因性ペルオキシダーゼ溶液で１０分間前処理し、次いで試料をＤａｋｏ無血清タンパク質ブロックで１０分間前処理することと；試料を抗体希釈剤中７．８μｇ／ｍＬの濃度のウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体と３０分間接触させることと；試料を広範囲に洗浄することと；第１の検出剤に結合した試料をＤＡＢを含む第２の検出剤と接触させることとを含む。
【0116】
ＩＳＨ
ＩＳＨは、中期又は間期染色体調製物に関して標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）を含有する試料（例えば、スライドにマウントした細胞又は組織試料）を、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対して特異的にハイブリダイズ可能又は特異的であるプローブ（すなわち、上記の標的核酸プローブ）と接触させることを含む。スライドは、例えば均一なハイブリダイゼーションを妨害することができるパラフィン又は他の物質を除去するために、任意選択で前処理される。染色体試料及びプローブは共に、例えば、二本鎖核酸を変性させるための加熱によって処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で配合される）及び試料は、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡に達する）ことを可能にする条件下及び十分な時間で組み合わせられる。染色体調製物を洗浄して過剰な標的核酸プローブを除去し、染色体標的の特異的標識の検出を行う。本開示のプローブ及びプローブシステムは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順（例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））などの核酸検出に使用することができる。相補的核酸分子間のハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオチドユニット間のワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合を介して媒介される。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補的核酸塩基である。本開示のプローブの特定の位置のヌクレオチド単位が、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、標的核酸配列）の同じ位置のヌクレオチド単位と水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドは、その位置で互いに相補的である。プローブ及びＤＮＡ又はＲＮＡは、各分子中の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができ、したがって検出可能な結合を生じることができるヌクレオチド単位によって占められる場合、互いに相補的である。プローブは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列例えば、ゲノム標的核酸配列）に１００％相補的である必要はない。しかしながら、その配列が複合体混合物例えば、全細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在する場合、プローブが標的核酸配列にのみ、又は実質的にのみ結合、二本鎖化又はハイブリダイズするように十分な相補性が必要である。
ＩＳＨは、中期又は間期染色体調製物に関して標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）を含有する試料（例えば、スライドにマウントした細胞又は組織試料）を、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対して特異的にハイブリダイズ可能又は特異的であるプローブ（すなわち、上記の標的核酸プローブ）と接触させることを含む。スライドは、例えば均一なハイブリダイゼーションを妨害することができるパラフィン又は他の物質を除去するために、任意選択で前処理される。染色体試料及びプローブは共に、例えば、二本鎖核酸を変性させるための加熱によって処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で配合される）及び試料は、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡に達する）ことを可能にする条件下及び十分な時間で組み合わせられる。染色体調製物を洗浄して過剰な標的核酸プローブを除去し、染色体標的の特異的標識の検出を行う。本開示のプローブ及びプローブシステムは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順（例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））などの核酸検出に使用することができる。相補的核酸分子間のハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオチドユニット間のワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合を介して媒介される。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補的核酸塩基である。本開示のプローブの特定の位置のヌクレオチド単位が、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、標的核酸配列）の同じ位置のヌクレオチド単位と水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドは、その位置で互いに相補的である。プローブ及びＤＮＡ又はＲＮＡは、各分子中の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができ、したがって検出可能な結合を生じることができるヌクレオチド単位によって占められる場合、互いに相補的である。プローブは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列例えば、ゲノム標的核酸配列）に１００％相補的である必要はない。しかしながら、その配列が複合体混合物例えば、全細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在する場合、プローブが標的核酸配列にのみ、又は実質的にのみ結合、二本鎖化又はハイブリダイズするように十分な相補性が必要である。
【0117】
本開示のいくつかの実施形態では、検出は、標的核酸プローブへの検出剤のハイブリダイゼーションによって促進される。検出剤は、直接検出又は間接検出によって検出してもよい。例えば、いくつかの直接検出の実施形態では、検出剤は、１つ又は複数の蛍光化合物で標識され、試料は、蛍光顕微鏡又は画像化によって分析される。いくつかの間接検出の実施形態では、検出剤は、結合対の第１のメンバー（すなわち、ハプテン又はビオチン）を含む複数の検出可能な部分を含み、第１のメンバーは、試料を検出可能な部分（すなわち、蛍光色素又は量子ドット）にコンジュゲートされた結合対の第２のメンバー（すなわち、抗ハプテン抗体又はアビジン）を含む化合物と接触させることによって検出される。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照されたい。ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨの多数の手順が当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを行うための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号、同第５，４７２，８４２号、同第５，４２７，９３２号、及び例えば、Ｐｉｎｋｅｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８３：２９３４－２９３８，１９８６；Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：９１３８－９１４２，１９８８，ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：９６６４－９６６８，１９８８に記載されている。ＣＩＳＨは、例えば、Ｔａｎｎｅｒｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：１４６７－１４７２，２０００、及び米国特許第６，９４２，９７０に記載されている。更なる検出方法は、米国特許第６，２８０，９２９号に提供されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってウイルスを検出するための例示的な手順は、Ｐｏｄｄｉｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４９：Ｍ３４０－Ｍ３４４，１９９６に見出すことができる。
【0118】
多数の試薬及び検出スキームを、感度、分解能、又は他の望ましい特性を改善するために、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨ手順と組み合わせて使用することができる。上述したように、フルオロフォア（蛍光色素及びＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＳ（商標）を含む）で標識された検出剤は、ＦＩＳＨを行う場合に直接光学的に検出することができる。あるいは、検出剤は、ハプテン（例えば、以下の非限定的な例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び種々のオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びこれらの組み合わせ）、リガンド、又は他の間接的に検出可能な部分などの非蛍光分子で標識することができる。次いで、そのような非蛍光分子で標識された検出剤（及びそれらが結合する標的核酸配列）は、試料（例えば、プローブが結合している細胞又は組織試料）を、選択されたハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は受容体、又は他の特異的結合パートナー）などの標識された検出試薬と接触させることによって検出することができる。検出試薬は、フルオロフォア（例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（商標））又は別の間接的に検出可能な部分で標識することができ、又はフルオロフォアで標識することができる１つ又は複数の追加の特異的結合剤（例えば、二次抗体又はは特異的抗体）と接触させることができる。任意選択で、検出可能な標識は、抗体、受容体（又は他の特異的結合剤）に直接結合される。あるいは、検出可能な標識は、ヒドラジドチオールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、又は同等の反応性を有する任意の他の可撓性結合部分などのリンカーを介して結合剤に結合される。例えば、抗体、受容体（又は他の抗リガンド）、アビジンなどの特異的結合剤を、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーなどのヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーを介してフルオロフォア（又は他の標識）で共有結合的に修飾することができる。ヘテロ二官能性リンカーは、例えばカルボニル反応性基、アミン反応性基、チオール反応性基及び光反応性基から選択される２つの異なる反応性基を組み合わせ、そのうちの第１のものは標識に結合し、そのうちの第２のものは特異的結合剤に結合する。
【0119】
他の例では、検出剤又は特異的結合剤（例えば、一次抗体などの抗体、受容体又は他の結合剤）は、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光、着色又は他の検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の沈着のようなもの）に変換することができる酵素を含む。上記のように、酵素は、関連するプローブ又は検出試薬にリンカーを介して直接的又は間接的に結合させることができる。適切な試薬（例えば、結合試薬）及び化学物質（例えば、リンカー及び結合化学物質）の例は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号、同第２００６／０２４６５２３号、及び米国特許出願公開第２００７０１１７１５号に記載されている。
【0120】
標識された検出剤及び／又は標識された結合対を適切に選択することによって、単一のアッセイ（例えば、単一の細胞若しくは組織試料上、又は１つ超の細胞若しくは組織試料上）で複数の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出を容易にするよう多重検出スキームを作製することができることが当業者には理解される。例えば、第１の標的核酸プローブに対応する第１の検出剤は、ビオチンなどの第１のハプテンで標識することができ、第２の標的核酸配列に対応する第２の検出剤は、ＤＮＰなどの第２のハプテンで標識することができる。試料をプローブセットに曝露した後、試料を第１の特異的結合剤（この場合、第１のフルオロフォア、例えば、５８５ｎｍで発光する、例えば第１のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（商標）で標識されたアビジン）及び第２の特異的結合剤（この場合、第２のフルオロフォア（例えば、７０５ｎｍで発光する第２のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（商標）で標識された抗ＤＮＰ抗体又は抗体断片）と接触させることによって、結合したプローブを検出することができる。更なるプローブ／結合剤対を、他のスペクトル的に異なるフルオロフォアを使用して多重検出スキームに加えることができる。直接的及び間接的な（１工程、２工程以上）の多数の変形を想定することができ、これらの全ては、開示されたプローブ及びアッセイの文脈において適切である。
【0121】
標準的な蛍光顕微鏡は、量子ドットバイオコンジュゲートなどの蛍光化合物を組み込んだ試薬及びプローブを検出するための安価なツールである。量子ドットコンジュゲートは実質的に光安定性であるため、顕微鏡で時間をかけて目的の領域を見つけ、試料に十分に焦点を合わせることができる。量子ドットコンジュゲートは、明るい光安定発光が必要とされるときはいつでも有用であり、１つの励起源／フィルタのみが利用可能であり、色間の最小限のクロストークが必要とされる多色用途において特に有用である。
【0122】
治療方法
一態様では、本明細書では、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法であって、対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法は、最初にＢＣＭＡを検出することを含む。本明細書に開示される方法のいずれも、ＢＣＭＡを検出する方法において使用されてもよい。
一態様では、本明細書では、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法であって、対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法は、最初にＢＣＭＡを検出することを含む。本明細書に開示される方法のいずれも、ＢＣＭＡを検出する方法において使用されてもよい。
【0123】
いくつかの実施形態では、標的化剤は、当技術分野で公知の任意の標的化剤を含む。本明細書で使用される場合、「標的化剤」とは、目的の標的と相互作用することができる任意の分子を指す。したがって、いくつかの実施形態では、標的化剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞又はＴ細胞リダイレクト抗体を含む。他の実施形態では、標的化剤は、抗体又はその抗原断片を含む。抗体又はその抗原性断片は、抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原断片を含んでもよい。更なる実施形態では、抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体を含んでもよい。二重特異性又は多重特異性抗体は、抗ＢＣＭＡ二重特異性又は多重特異性抗体を含んでもよい。他の実施形態では、標的化剤は、ＢＣＭＡに結合することができる小分子を含んでもよい。他の実施形態では、標的化剤は、ＢＣＭＡポリペプチドを含んでもよい。
【0124】
いくつかの実施形態では、目的の標的は、可溶性ポリペプチドである。他の実施形態では、目的の標的は、受容体を含む膜結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、受容体はＢＣＭＡを含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法の対象は、疾患、障害、状態又は症候群を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、状態又は症候群は、当技術分野で公知の任意のヒト疾患、障害、状態又は症候群であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の標的化剤はまた、ＢＣＭＡを発現する疾患を治療するためにも使用されてもよい。
【0126】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法の対象は、癌又は腫瘍を有する。他の実施形態では、癌は、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ）ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、肝癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、白血病、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵癌、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚癌）、中皮種、悪性、副鼻腔及び鼻腔癌（頭頸部癌）、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（頭頸部癌）、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、及び外陰癌を含んでもよい。
【0127】
更なる実施形態では、乳癌の例としては、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、乳管内上皮内癌及び非浸潤性小葉癌が挙げられるが、これらに限定されない。気道癌の例としては、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支腺腫及び胸膜肺芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。脳癌の例としては、脳幹及び視床下部神経膠腫、小脳及び大脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫並びに神経外胚葉性及び松果体腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。男性生殖器腫瘍としては、前立腺癌及び精巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。女性生殖器腫瘍としては、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、腟癌、外陰癌及び子宮筋腫（hysteroma）が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸腫瘍としては、肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵癌、直腸癌、小腸癌及び唾液腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。尿道腫瘍としては、膀胱癌、陰茎癌、腎細胞癌、腎盂腎癌、尿管癌及び尿道癌が挙げられるが、これらに限定されない。眼癌としては、眼球内黒色腫及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。肝癌の例としては、肝細胞癌（線維層板型変動を伴う又は伴わない肝細胞癌）、胆管細胞癌（肝内胆管癌）及び混合型肝細胞癌－胆管細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚癌としては、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞癌及び非黒色腫皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。頭頸部癌としては、喉頭／下咽頭／鼻咽頭／中咽頭癌、並びに口唇及び口腔癌が挙げられるが、これらに限定されない。リンパ腫としては、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病及び中枢神経系リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。肉腫としては、軟部肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫及び横紋筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【0128】
いくつかの実施形態では、癌は、血液癌を含んでもよい。血液の癌は、血液又は骨髄の癌である。いくつかの実施形態では、本開示の血液（又は血行性）癌は、白血病（急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ種、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞性白血病、脊髄形成異常症、二次性白血病、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）又はバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（風土性バーキットリンパ腫又は孤発性バーキットリンパ腫）、悪性形質細胞腫瘍、ＢＣＭＡ＋高悪性度リンパ腫、カーレル病及び骨髄腫症、形質細胞白血病；形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、濾胞性リンパ腫（濾胞性非ホジキンリンパ腫型を含む）、辺縁帯リンパ腫（粘膜関連リンパ組織：ＭＡＬＴ １ ＭＡｌｔｏｍａ、単球様Ｂ細胞リンパ腫、絨毛リンパ球を有する脾リンパ腫）、マントル細胞リンパ腫；大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞、びまん性混合細胞、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫肺Ｂ細胞）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫；亜急性骨髄性白血病、骨髄肉腫、緑色腫、顆粒球性肉腫、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病）又は他のＢ細胞性白血病若しくはリンパ腫を含んでもよい。
【0129】
いくつかの実施形態では、本開示の対象は、重鎖病、原発性又は免疫細胞関連アミロイドーシス、及び意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ））などの形質細胞障害を有する。
【0130】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法の対象は、疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、脳疾患、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー症、筋萎縮性側索硬化症、関節炎、骨疾患、炎症性疾患、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、喘息、血液障害、脳疾患、認知症、糖尿病、腸疾患、肝疾患、腎疾患、肺疾患、皮膚疾患、胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、高血圧、又は心血管障害を含んでもよい。他の実施形態では、疾患又は状態は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿道（urethrae）、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺及び副甲状腺の疾患又は障害を含んでもよい。
【0131】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法の対象は、免疫学的障害、特に自己免疫障害を有する。いくつかの実施形態では、自己免疫障害としては、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、急速進行性糸球体腎炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群（Sjorgren's syndrome）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核、及び移植片対宿主病免疫介在性血小板減少症、溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病、アジソン病、落葉状天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎が含まれるが、これらに限定されない。
【0132】
いくつかの実施形態では、本発明の治療方法の対象は、炎症性疾患を有する。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、ＩＢＤ、線維筋痛症（fibromyalga）、肥満細胞症、セリアック病などの自己免疫疾患、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。更に、本発明の方法は、糖尿病、特に１型糖尿病を治療するのに有用であってもよい。
【0133】
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0134】
１組の実施形態では、以下が提供される。
１．ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）分子を検出する方法であって、
ａ．ＦＦＰＥ試料を切片化及びマウントすることと；
ｂ．試料を脱パラフィンすることと；
ｃ．試料の熱媒介抗原賦活化と；
ｄ．ブロッキング剤による試料の前処理と；
ｅ．試料を第１の検出剤と接触させることであって、第１の検出剤は任意選択で、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、接触させることと；
ｆ．任意選択で、未結合試料を除去することと；
ｇ．第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることであって、第２の検出剤は任意選択で、抗体又はその断片である、接触させることと；
ｈ．任意選択で、未結合の第２の検出剤を除去することと；
ｉ．試料に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
試料に結合した第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子の存在を示す、方法が提供される。
２．熱媒介抗原賦活化が、ＥＤＴＡ系溶液を使用して行われる、実施形態１に記載の方法。
３．ＥＤＴＡ系溶液が、８．５～９．５のｐＨを有する、実施形態２に記載の方法。
４．ＥＤＴＡ系溶液が９．０のｐＨを有する、実施形態３に記載の方法。
５．熱媒介抗原賦活化の工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間又は６０分間行われる、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．熱媒介抗原賦活化の工程が、８５℃～１００℃の温度で行われる、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．熱媒介抗原賦活化の工程が１００℃で行われる、実施形態６に記載の方法。
８．ブロッキング剤が内因性ペルオキシダーゼを遮断する、実施形態１～７のいずれか一項記載の方法。
９．ブロッキング剤が過酸化物ブロックである、実施形態８に記載の方法。
１０．過酸化物ブロックで前処理する工程が、２分間、５分間、８分間、１０分間又は１５分間行われる、実施形態９に記載の方法。
１１．ブロッキング剤が、非特異的抗体結合を遮断する、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．ブロッキング剤がＤａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋである、実施形態１１に記載の方法。
１３．Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋで前処理する工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、又は３０分間行われる、実施形態１２に記載の方法。
１４．第１の検出剤が抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．試料を第１の検出剤と室温又は３７℃で接触させた、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．試料を第１の検出剤と１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９５分間、又は１２０分間接触させた、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間接触させた、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．組織が脳組織である、実施形態１９に記載の方法。
２１．組織が、線条体、視床、中脳、又は脳の髄質領域に由来する、実施形態２０に記載の方法。
２２．組織が、腫瘍組織である、実施形態１９に記載の方法。
２３．試料が、対象由来のものである、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．対象が哺乳動物である、実施形態２３に記載の方法。
２５．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２４に記載の方法。
２６．哺乳動物がカニクイザルである、実施形態２４に記載の方法。
２７．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の方法を行うための、キット。
２８．対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法。
２９．試料中のＢＣＭＡを検出する工程が、実施形態１～２２又は２４～２６のいずれか一項に記載の方法を含む、実施形態２８に記載の方法。
３０．標的化剤がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、実施形態２８又は２９に記載の方法。
３１．標的化剤がＴ細胞リダイレクト抗体である、実施形態２８又は２９に記載の方法。
３２．対象が癌を有する、実施形態２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．癌は、多発性骨髄腫である、実施形態３２に記載の方法。
１．ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）試料中のＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）分子を検出する方法であって、
ａ．ＦＦＰＥ試料を切片化及びマウントすることと；
ｂ．試料を脱パラフィンすることと；
ｃ．試料の熱媒介抗原賦活化と；
ｄ．ブロッキング剤による試料の前処理と；
ｅ．試料を第１の検出剤と接触させることであって、第１の検出剤は任意選択で、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、接触させることと；
ｆ．任意選択で、未結合試料を除去することと；
ｇ．第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と接触させることであって、第２の検出剤は任意選択で、抗体又はその断片である、接触させることと；
ｈ．任意選択で、未結合の第２の検出剤を除去することと；
ｉ．試料に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
試料に結合した第２の検出剤の量のバックグラウンドを超える検出は、試料中の少なくとも１つのＢＣＭＡ分子の存在を示す、方法が提供される。
２．熱媒介抗原賦活化が、ＥＤＴＡ系溶液を使用して行われる、実施形態１に記載の方法。
３．ＥＤＴＡ系溶液が、８．５～９．５のｐＨを有する、実施形態２に記載の方法。
４．ＥＤＴＡ系溶液が９．０のｐＨを有する、実施形態３に記載の方法。
５．熱媒介抗原賦活化の工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間又は６０分間行われる、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．熱媒介抗原賦活化の工程が、８５℃～１００℃の温度で行われる、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．熱媒介抗原賦活化の工程が１００℃で行われる、実施形態６に記載の方法。
８．ブロッキング剤が内因性ペルオキシダーゼを遮断する、実施形態１～７のいずれか一項記載の方法。
９．ブロッキング剤が過酸化物ブロックである、実施形態８に記載の方法。
１０．過酸化物ブロックで前処理する工程が、２分間、５分間、８分間、１０分間又は１５分間行われる、実施形態９に記載の方法。
１１．ブロッキング剤が、非特異的抗体結合を遮断する、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．ブロッキング剤がＤａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋである、実施形態１１に記載の方法。
１３．Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋで前処理する工程が、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、又は３０分間行われる、実施形態１２に記載の方法。
１４．第１の検出剤が抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．試料を第１の検出剤と室温又は３７℃で接触させた、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．試料を第１の検出剤と１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９５分間、又は１２０分間接触させた、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．第１の検出剤に結合した試料を第２の検出剤と、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間接触させた、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．組織が脳組織である、実施形態１９に記載の方法。
２１．組織が、線条体、視床、中脳、又は脳の髄質領域に由来する、実施形態２０に記載の方法。
２２．組織が、腫瘍組織である、実施形態１９に記載の方法。
２３．試料が、対象由来のものである、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．対象が哺乳動物である、実施形態２３に記載の方法。
２５．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２４に記載の方法。
２６．哺乳動物がカニクイザルである、実施形態２４に記載の方法。
２７．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の方法を行うための、キット。
２８．対象由来の試料中のＢＣＭＡを検出する工程を含む、対象をＢＣＭＡ標的化剤で治療する方法。
２９．試料中のＢＣＭＡを検出する工程が、実施形態１～２２又は２４～２６のいずれか一項に記載の方法を含む、実施形態２８に記載の方法。
３０．標的化剤がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、実施形態２８又は２９に記載の方法。
３１．標的化剤がＴ細胞リダイレクト抗体である、実施形態２８又は２９に記載の方法。
３２．対象が癌を有する、実施形態２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．癌は、多発性骨髄腫である、実施形態３２に記載の方法。
【0135】
本発明の特定の実施形態が本明細書に記載される。前述の説明を読むと、開示された実施形態の変形形態は、当業者に明らかになり得、必要に応じてそのような変形形態を採用し得ることが予想される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されること、並びに本発明が、適用法によって許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての修正物及び均等物を含むことが意図される。更に、全ての可能性のあるこれらの変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において別途記載のない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、本明細書に包含される。本発明の多くの実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、実施例のセクションにおける説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するのではなく、例示することを意図するものである。
【実施例】
【0136】
以下は、試験に使用された様々な方法及び材料の説明であり、当業者に本開示の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するように記載されており、本発明者らがその開示とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施され、実施可能な実験の全てであることを表すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記述は、必ずしも実行されたものではなく、むしろ記述は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実行できるものであることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）についての正確度を保証するための努力はなされているが、多少の実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。
【0137】
実施例１：免疫化学的方法の開発
スクリーニングした抗体を表１に示す。
スクリーニングした抗体を表１に示す。
【0138】
【表1】
【0139】
アッセイ対照の作製。公的に入手可能なＣＣＬＥ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／）及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｇａ－ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｄａｃｓ／ＥＧＡＣ００００１００００５５）データセットからのＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいて、内因性ＢＣＭＡ ＲＮＡ発現レベルに従って７つの細胞株を選択した。選択された細胞株は、ＢＣＭＡ発現が陰性、低、中、及び高レベルである適格な試薬対照として機能した（表１）。ＢＣＭＡは、ＢＣＭＡとリガンドを共有するＢＡＦＦＲ及びＴＡＣＩを含む腫瘍壊死因子受容体のより大きなファミリーの一部であるので、潜在的に保存されたエピトープに対する抗体交差反応性の欠如を確認するために更なる研究を行った。ＴＡＣＩ又はＢＡＦＦＲを発現する操作された細胞株を、タグエピトープと結合したヒトＴＡＣＩ又はヒトＢＡＦＦＲ遺伝子を有するレンチウイルスでＨＥＫ２９３親細胞をトランスフェクトすることによって作製した。細胞株を１００％コンフルエンスまで培養し、非酵素的に収集し、遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、日常的な方法でパラフィン処理し、包埋して単一のパラフィンブロック中にアレイを形成した。
【0140】
結腸、脾臓、及びリンパ節のＦＦＰＥ試料を、常在性ＢＣＭＡ発現形質細胞の存在のために内因性組織対照として取得した。カニクイザル由来の同じ組織を使用して、この種との抗体の交差反応性を確認した。全ての組織を、解剖学的位置、組織病理学の欠如、並びにＩＨＣ及びＩＳＨに対する適合性について品質管理（ＱＣｅｄ）し、ＱＣ基準を満たした試料のみを実験に使用した。ＩＨＣに適していると考えられるためには、試料は、シナプトフィジンＩＨＣによって予想される免疫標識パターンを示す必要があった。ＩＳＨに対する適合性は、ｍＲＮＡハウスキーピング遺伝子、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）に対する豊富な陽性シグナル、及びＤａｐＢ（陰性対照プローブ）シグナルの欠如によって確認された。
【0141】
候補ＩＨＣ試薬のスクリーニング。ＩＨＣアッセイは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ自動染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で展開した。表１は、最終的なＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイを展開すると考えられるＩＨＣ候補試薬を要約する。ＩＨＣ試薬を細胞ペレット試薬対照で試験して、ＢＣＭＡタンパク質に対する特異性及び感受性を評価した。試験した全ての試薬のうち、ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］のみが、許容されるＩＨＣ結合特異性及び感度を示した。したがって、抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］を、組織切片上のＢＣＭＡタンパク質の内因性発現の検出のための一次抗体として、精製アッセイで使用した。
【0142】
アッセイ条件。最後のＩＨＣ法は、ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃８８１８３）を使用した。ＦＦＰＥブロックを４μｍに切片化し、試料をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラススライド（ＶＷＲ、カタログ番号４８３１１－７０３）上にマウントした。簡潔に述べると、未焼成ガラススライドを自動染色装置に装填し、一般的なＬｅｉｃａ脱パラフィンプロトコルに従って脱パラフィンした。ＥＤＴＡ系溶液（ｐＨ約９．０）による熱媒介抗原賦活化を、１００℃で２０分間行った。次いで、スライドを内因性ペルオキシダーゼ溶液で１０分間前処理した。ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］の１／２００希釈物（抗体希釈剤［Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ＃Ｋ０００４］中の最終濃度７．８μｇ／ｍＬ）で３０分間インキュベーションする直前に、Ｄａｋｏ無血清タンパク質ブロック（Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号Ｘ０９０９）を試料に１０分間適用した。広範な洗浄工程の後、結合した一次抗体を、製造業者の推奨に従って、発色Ｌｅｉｃａ ｒｅｆｉｎｅ ＤＡＢ検出キット（Ｌｅｉｃａカタログ番号ＤＳ９８００）によって検出した。スライドにカバーガラスをマウントし、明視野顕微鏡で検査した。
【0143】
ＩＨＣ及びＩＳＨのためのヒト脳組織の研究。ＦＦＰＥヒト正常脳組織は、様々なベンダーから商業的に供給された。各脳組織試料を、Ｈ＆Ｅによる位置精度、及びシナプトフィジン染色によるＩＨＣ適合性についてチェックした（ウサギモノクローナル抗シナプトフィジン抗体１／８０００［Ａｂｃａｍ＃３２１２７］）。広範囲の脳座位に及ぶ合計１０７個の脳試料を本研究で使用した。試料は６３人の異なるドナーに由来した。試料のサブセットを、ＰＰＩＢ（陽性対照プローブ）を使用してＩＳＨ適合性について更に評価した。
【0144】
２匹の性的に成熟していない雄及び２匹の性的に成熟していない雌に由来するＦＦＰＥカニクイザル正常脳組織を、種特異的脳トリミングスキームに従って冠状切片から評価した。カニクイザル組織は、他の種における生物学的治療交差反応性及び薬理学的活性が欠如しているため、いくつかの生物学的治療薬の前臨床安全性においてこの種が日常的に研究されているので含めた。分析前の変数を減少させ、組織試料品質を最大化するために、標準化された組織サンプリング及び処理プロトコルに従った。
【0145】
共局在化研究。Ｅ６Ｄ７Ｂ及びゴルジ装置で観察されたＩＨＣ免疫反応性と神経原線維変化マーカーとの間の共局在化研究を、免疫蛍光によって行った。Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ）を使用して染色の評価を完了した。共局在化実験では、以下の抗体プローブを含めた：シス及びトランスゴルジマーカー、マウスモノクローナル抗ＴＧＮ４６抗体１／５００（ＬＳＢｉｏ＃ＬＳ－Ｃ１３３６５４－１００）、マウスポリクローナル抗ＧＯＬＧＡ２抗体１／１００（Ａｂｎｏｖａ＃Ｈ００００２８０１－Ｂ０１Ｐ）、マウスモノクローナル抗ＧＯＬＧＡ５抗体１／３００（ＮｏｖｕｓＢｉｏ＃ＮＢＰ２－６６８７５）、及びマウスモノクローナル抗ＧＯＬＭ１抗体１／１００（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃１３０６６－ＭＭ１２）。各特異的抗体を以下の二次結合剤によって検出した：ヤギポリクローナルＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃１１５－５４６－１４６）、及びヤギポリクローナルＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃１１１－５８６－１４４）。
【0146】
ビルショウスキー銀染色。神経原線維変化を強調するために、重要な組織試料をビルショウスキー銀染色法（Ａｂｃａｍ ａｂ２４５８７７）で染色した。この方法は製造業者の推奨に従って実行した。簡潔に述べると、４μｍの組織切片を脱パラフィンし、水和した後、硝酸銀溶液中で４０℃で１５分間、続いてアンモニア銀溶液中で１０分間インキュベートした。銀染色を、所望の着色になるまで撹拌しながら現像液中で現像した。沈殿した銀を５％チオ硫酸ナトリウムで２分間固定し、スライドを脱水し、デジタル捕捉前にＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＰ１５－１００）でマウントした。リン酸化タウタンパク質の検出はまた、タングルマーカープローブ：マウスモノクローナル抗ｐＴａｕ １／１００（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＭＡＢ３４９４１－１００）を使用して実行した。
【0147】
実施例２：ＲＮＡ ＩＮ ＳＩＴＵハイブリダイゼーションアッセイの開発
対照。実施例１で前述したように、細胞ペレットアレイ及びヒトＦＦＰＥ結腸試料を試薬対照とした。各ＩＳＨ染色アッセイについて、ＦＦＰＥブロックを４μｍで切片化し、試料をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラススライド上にマウントした。
対照。実施例１で前述したように、細胞ペレットアレイ及びヒトＦＦＰＥ結腸試料を試薬対照とした。各ＩＳＨ染色アッセイについて、ＦＦＰＥブロックを４μｍで切片化し、試料をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラススライド上にマウントした。
【0148】
試薬。ＩＳＨアッセイは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ自動染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で、以下の重要な試薬を使用して開発した：ヒトＢＣＭＡ特異的プローブ（Ｈｓ－ＴＮＦＲＳＦ１７、ＡＣＤＢｉｏカタログ番号５８５７９１）、ヒト陽性組織ＰＰＩＢ対照プローブ（Ｈｓ－ＰＰＩＢ、ＡＣＤＢｉｏカタログ番号３１３９０８）、及び陰性対照プローブＤａｐＢ（ＡＣＤＢｉｏカタログ番号３１２０３８）を含むｍＲＮＡ検出プローブ。ハイブリダイズしたプローブを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳｘ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ－Ｒｅｄ（ＡＣＤＢｉｏカタログ番号３２２７５０）を使用して検出した。
【0149】
アッセイ条件。ＢＣＭＡ ＩＳＨアッセイは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ自動染色装置で行った。簡潔に述べると、スライドガラスを自動染色装置に装填し、６０℃で３０分間焼成し、一般的なＬｅｉｃａ脱パラフィンプロトコルに従って脱パラフィンした。ＥＤＴＡ系溶液（ｐＨ約９．０）を用いた熱媒介抗原賦活化を、細胞ペレット試薬対照については８５℃で、又は組織試料については９５℃で１５分間行った。次いで、プロテイナーゼＫ（ＡＣＤＢｉｏ ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳｘキットで提供される）による非特異的酵素消化を、各組織学的試料に４０℃で１５分間適用した。特異的プローブのハイブリダイゼーションは、４２℃で１２０分間行った。広範な洗浄後、特異的に結合したプローブを一連のシグナル増幅工程によって検出した。最後に、アルカリホスファターゼ酵素活性が色原体と反応し、明視野顕微鏡下で可視の赤色沈殿シグナルを生じた。
【0150】
ＩＳＨ染色シグナルは、細胞内ドット様パターンをもたらす。細胞当たりの陽性ドットの数は一般に、存在する検出可能なｍＲＮＡ転写物の量と相関する。各ドットのサイズは、プローブセット全体の設計に優先的に依存する。ＩＳＨシグナルの評価は、製造業者のガイドラインに従って目視で行った。細胞陽性を考慮する場合のドットの最小数及び相関タンパク質発現に対するその関係は、目的の各標的に依存する。ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの間に差があることができるので、ＩＳＨシグナルレベルとＩＨＣ免疫反応性強度との間の対照特徴付けは、タンパク質発現に対して考慮すべきＩＳＨシグナル閾値の許容可能な指標を提供する。
【0151】
エタノール中での長時間などの組織採取及び処理における分析前の変数は、ＩＳＨ法で検出することができるｍＲＮＡの品質に影響を及ぼしてもよい。ＰＰＩＢはハウスキーピング遺伝子であり、そのＩＳＨシグナルを使用して、ＦＦＰＥ試料中に存在するｍＲＮＡの全体的な品質を評価した（すなわち、ＱＣチェック）。対照アレイに含まれる各細胞ペレットは、細胞当たり３～４ドットの製造業者の最小推奨閾値をはるかに上回るＩＳＨ ＰＰＩＢシグナルを示した。
【0152】
ＧＴＥｘ ＲＮＡ－ｓｅｑデータ。ＧＴＥｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖ８のＲＮＡ－ｓｅｑデータをｄｂＧａＰデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇａｐ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｔｕｄｙ．ｃｇｉ？ｓｔｕｄｙ＿ｉｄ＝ｐｈｓ０００４２４．ｖ８．ｐ２）から得て、Ｏｍｉｃｓｏｆｔ Ａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒｒａｙｓｅｒｖｅｒ．ｃｏｍ／ｗｉｋｉ／）を使用して処理した。ヒトゲノム構成ＧＲＣｈ３８及び遺伝子モデルＧＥＮＣＯＤＥ Ｒｅｌｅａｓｅ ３３（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／ｈｕｍａｎ／）を、ＲＮＡ－ｓｅｑ配列をゲノムにマッピングし、遺伝子発現を定量化するために採用した。２４６個の尾状核試料及び２０４個の被殻試料を含む１３個の脳領域の２６４１個の試料全てを、ヒト脳におけるＢＣＭＡ発現のプロファイリングのために選択した。１００万当たりの転写産物（「ＴＰＭ」）を遺伝子発現測定の単位として採用した。
【0153】
Ａｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎ ＲＮＡ－ｓｅｑデータ。全ての遺伝子発現データを、ｂｒａｉｎ Ａｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎｓｐａｎ．ｏｒｇ／）からリンクｈｔｔｐｓ／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎｓｐａｎ．ｏｒｇ／ａｐｉ／ｖ２／ｗｅｌｌ＿ｋｎｏｗｎ＿ｆｉｌｅ＿ｄｏｗｎｌｏａｄ／２６７６６６５２５を使用してダウンロードした。ＧＴＥｘデータとの適合性を可能にするために、データを１００万キロベース当たりの読み取りからＴＰＭに変換した。ＢＣＭＡ発現は、脳領域及び発達段階によってグループ化された試料で報告された。
【0154】
凝集ＲＮＡ－ｓｅｑデータ。ヒト線条体におけるＢＣＭＡ遺伝子の発現が発達段階と共にどのように変化するかを決定するために、Ａｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎデータセットからの線条体試料並びにＧＴＥｘデータセットからの尾状核及び被殻試料におけるＢＣＭＡ遺伝子発現データを抽出した。合わせたデータを一緒にプロットし、ドナーの年齢群によって分割した。
【0155】
実施例３：ＩＨＣ及びＩＳＨアッセイの結果
ＩＨＣアッセイ。細胞ペレット試薬対照アレイ染色結果を表１及び図１Ａ～１Ｒに要約する。マウスモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［１００４０２３］（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１９３１）、マウスモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［クローン１９Ｆ２］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５７５０２）、及びラットモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｖｉｃｋｙ－１］（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＮＢＰ１－９７６３７ＳＳ）は、発現されたＢＣＭＡタンパク質に対しても、対照細胞ペレットによっても、許容される特異性及び感度を生じなかった（データは示さず）。ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］は、細胞ペレット対照においてＢＣＭＡ特異的免疫反応性の予想パターン（すなわち、膜及び／又はゴルジ様パターン）を生成した（図１Ａ～１Ｒ）。Ｈ９２９及びＭＭ１．Ｒ細胞は、それらの細胞質において顕著な陽性膜染色及び顕著なゴルジ様染色パターンを示した。ＪＥＫＯ－１及びＲａｊｉ細胞は、ほとんどが細胞の細胞質に存在するゴルジ様構造において観察可能な、低強度から非常に低強度の染色を示した。予想通り、ＢＣＭＡ陰性細胞株（Ｋ５６２、Ｕ９３７及びＨＥＫ２９３）ではＥ６Ｄ７Ｂで免疫反応性は観察されなかった。クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］によって生成されたＢＣＭＡ免疫反応性を、ＢＣＭＡ ｍＲＮＡを検出するのに特異的なＩＳＨアッセイを用いて直交的に確認した。密接に関連する標的ＢＡＦＦＲ並びに膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）を過剰発現するＨＥＫ２９３－ＢＡＦＦｒ及びＨＥＫ２９３－ＴＡＣＩ細胞株は、いかなるＢＣＭＡ免疫反応性も示さず、ＢＣＭＡに対するＥ６Ｄ７Ｂの特異性が更に示された。
ＩＨＣアッセイ。細胞ペレット試薬対照アレイ染色結果を表１及び図１Ａ～１Ｒに要約する。マウスモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［１００４０２３］（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１９３１）、マウスモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［クローン１９Ｆ２］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５７５０２）、及びラットモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｖｉｃｋｙ－１］（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＮＢＰ１－９７６３７ＳＳ）は、発現されたＢＣＭＡタンパク質に対しても、対照細胞ペレットによっても、許容される特異性及び感度を生じなかった（データは示さず）。ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］は、細胞ペレット対照においてＢＣＭＡ特異的免疫反応性の予想パターン（すなわち、膜及び／又はゴルジ様パターン）を生成した（図１Ａ～１Ｒ）。Ｈ９２９及びＭＭ１．Ｒ細胞は、それらの細胞質において顕著な陽性膜染色及び顕著なゴルジ様染色パターンを示した。ＪＥＫＯ－１及びＲａｊｉ細胞は、ほとんどが細胞の細胞質に存在するゴルジ様構造において観察可能な、低強度から非常に低強度の染色を示した。予想通り、ＢＣＭＡ陰性細胞株（Ｋ５６２、Ｕ９３７及びＨＥＫ２９３）ではＥ６Ｄ７Ｂで免疫反応性は観察されなかった。クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］によって生成されたＢＣＭＡ免疫反応性を、ＢＣＭＡ ｍＲＮＡを検出するのに特異的なＩＳＨアッセイを用いて直交的に確認した。密接に関連する標的ＢＡＦＦＲ並びに膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）を過剰発現するＨＥＫ２９３－ＢＡＦＦｒ及びＨＥＫ２９３－ＴＡＣＩ細胞株は、いかなるＢＣＭＡ免疫反応性も示さず、ＢＣＭＡに対するＥ６Ｄ７Ｂの特異性が更に示された。
【0156】
組織切片では、ヒトリンパ節、脾臓及び結腸試料中の形質細胞と一致する形態を有する細胞において特異的陽性標識が同定された。ＢＣＭＡ陽性細胞ペレット試薬対照と同様に、形質細胞は、切断面に存在する場合、強い膜染色及びゴルジ様陽性構造を示した。リンパ節及び脾臓における陽性細胞の相対強度は、結腸組織試料において観察されたものより小さかった。カニクイザル組織試料との交差反応性の証拠は、同様の解剖学的位置で同定された。陽性ＢＣＭＡ ＩＨＣ細胞の全体的強度は、カニクイザルではヒトで観察されたものよりも小さかった。カニクイザル結腸は、ヒト結腸よりも高密度のＢＣＭＡ陽性細胞を示した。ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］を作製するために使用された正確なペプチド免疫原配列は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）の所有権である。ＣＳＴは、モノクローナル抗体が、ヒトＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡタンパク質のＬｅｕ１１５を取り囲む残基に対応する合成ペプチドで動物を免疫することによって産生されることを公表した。ヒト及びカニクイザルＢＣＭＡタンパク質の細胞質部分（アミノ酸残基７８～１８４）の生物情報学的アラインメントは、カニクイザルタンパク質とヒトタンパク質（ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＮＩＨ）との間で９２．５％の配列同一性を示した。
【0157】
ＩＳＨアッセイ。ＢＣＭＡ特異的ＩＳＨ染色は、１００万キロベース当たりのＢＣＭＡ ｍＲＮＡ断片（ＦＰＫＭ）スコアの低いものから高いものまでの、ある範囲の内因性発現を提示する細胞株で同定された（表１、図１Ａ～１Ｒ）。高いＢＣＭＡ ＦＰＫＭスコアを有する細胞株（Ｈ９２９及びＭＭ１．Ｒ）は、細胞あたり１５以上のドットを示した。より低いＦＰＫＭスコアを有する細胞（ＪＥＫＯ－１及びＲａｊｉ）では、細胞当たり５ドット又は１ドットがそれぞれ観察された。予想されるように、ＢＣＭＡ ＩＳＨアッセイは、極めて低い又は０のＦＰＫＭスコアを示す細胞株（Ｋ５６２、Ｕ９３７、及びＨＥＫ２９３）において特異的シグナルを生成することができなかった。
【0158】
同じ対照細胞ペレットにおけるＢＣＭＡ ＩＳＨシグナルとＢＣＭＡ ＩＨＣ免疫反応性との間の直接相関を、視覚的に推定した（表１、図１Ａ～１Ｒ）。ＦＦＰＥ細胞ペレットでは、ＢＣＭＡ ＩＨＣ免疫反応性の強度とＢＣＭＡ ＩＳＨシグナルとの間に許容される一致が観察された。全てのＲａｊｉ細胞が切断面においてＢＣＭＡ ＩＳＨ陽性を示したわけではなく、陽性細胞は主に１ドットを示し、稀に２ドットを示した。その細胞株について、陽性ＢＣＭＡ ＩＳＨシグナルの全体密度は、ＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイで観察されたものと一致し、製造業者によって推奨されるスコアリングによって決定される陽性の閾値に達した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｄｉｃａｌａｂ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１８／０４／ＭＫ＿５１＿１０３＿ＲＮＡＳｃｏｐｅ＿ｄａｔａ＿ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｇｕｉｄｅ＿ＲｅｖＢ．ｐｄｆ）。ＩＳＨシグナルが陰性対照細胞株（Ｋ５６２、Ｕ－９３７、及びＨＥＫ２９３）に時折存在したが、シグナルはまれであり、１０細胞あたり１ドットの閾値に達しなかった。
【0159】
ヒト正常結腸組織切片（陽性対照）では、形質細胞と一致する形態を有する細胞において特異的陽性ＢＣＭＡ ＩＳＨ標識が同定された。これらの細胞のほとんどは、低レベルのＢＣＭＡ ＩＳＨシグナル（１ドット／細胞及び時折２～３ドット／細胞）を示した。単一のＢＣＭＡ ＩＳＨドットシグナルを示す形質細胞の群は、その後の隣接切片においてＩＨＣアッセイによって強く染色されるようであり、Ｒａｊｉ対照細胞と同様に、組織におけるＩＨＣ検出可能なＢＣＭＡタンパク質発現が、１ドット／細胞という低い持続的なＩＳＨレベルを示す細胞について予測されることもあることを示す。
【0160】
ＢＣＭＡ ＩＳＨアッセイによって生成される観察可能な陽性シグナルの存在は、ＰＰＩＢ ＱＣ ＩＳＨアッセイによって評価されるように、特定の全体的なｍＲＮＡ品質閾値（４ドット／細胞以上）を必要とした。特異的陽性ＢＣＭＡ ＩＳＨシグナルを提示した形質細胞は一般に、ＱＣ ＰＰＩＢ ＩＳＨシグナル中に存在する細胞当たり最低４ドットを有した。対照的に、形質細胞が４ドット／細胞未満の低いＰＰＩＢ ＩＳＨシグナルを有する領域では、タンパク質レベルでの強力かつ特異的な陽性シグナル（直接隣接する切片でのＩＨＣ）にもかかわらず、対応するＢＣＭＡ ＩＳＨシグナルは検出されなかった。
【0161】
ヒトＦＦＰＥ正常脳試料におけるＢＣＭＡ ＩＨＣ。ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］（ＣＳＴ）による免疫反応性が、いくつかの正常ヒト脳試料の特定の解剖学的領域におけるニューロンの小サブセットにおいて観察された。免疫反応性パターンは、細胞体（細胞体（soma））及び特定のニューロンの軸索突起（図２Ａ～図２Ｉ）に見られ、グリア細胞突起にまれに見られる細胞質原線維又は針状構造として示された。ＩＨＣ免疫反応性を有するニューロンは主に、背側線条体、視床、中脳、及び延髄において観察された。組織切片上に存在する全てのニューロンの中で、免疫反応性を有する細胞の密度は、調べた位置によって異なり、一般的に低かった。免疫反応性の類似の局所パターンは、試料の人口統計又は商業的起源にかかわらず、脳組織及びドナーにわたって一貫して再現された。この研究で評価された試料は比較的少数なので、Ｅ６Ｄ７ＢによるＩＨＣ免疫反応性と、組織試料に関連する利用可能な人口統計データとの間に明確な類似は見られなかった。
【0162】
ヒト正常脳における免疫反応性のユニークな原線維様又は針様細胞内、非膜性、非ゴルジ様パターンは、このタンパク質を発現することが知られている細胞（例えば、形質細胞）における特徴的パターンとは大きく異なっていたので、予想外だった。予想外の免疫反応性により、更なる特徴付けが必要となった。その目的のために、ＩＨＣ免疫反応性が観察された代表的なヒト脳試料に対して直交実験を行った。
【0163】
ヒト脳試料におけるＢＣＭＡ発現を更に評価するために、外部分子病理学サービス提供者（ＣＲＯ）を契約して、低レベルのＢＣＭＡタンパク質の検出に適用するために、少なくともＥ６Ｄ７Ｂと同程度の感度の独立したＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイを開発した。Ｒｅｖｅａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＨｅｍａｔｏｇｅｎｉｘ（Ｔｉｎｌｅｙ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で開発された２つのＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のマウスモノクローナル抗ＢＣＭＡクローンＤ６に基づいた。これらの２つのアッセイは、内部ＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイを開発するために使用される同じ細胞ペレット試薬及び結腸組織対照上のＢＣＭＡを標的化する際に、許容されかつ同等の特異性及び感度を生じた。Ｅ６Ｄ７Ｂクローンを使用して免疫反応性を示した同じ脳試料のセットを、盲検様式で染色するために各ＣＲＯに送った。対照試料では、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ抗ＢＣＭＡ抗体クローンＤ６に基づくＢＣＭＡ ＩＨＣは、内部ＢＣＭＡ ＩＨＣに非常に類似した染色パターンを示した（図５Ａ～５Ｐ）。対照的に、脳試料では、ＢＣＭＡ染色も原線維様免疫反応性も見られなかった。したがって、２つの契約研究所で独立して行われたＳａｎｔａ Ｃｒｕｚマウスモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローンＤ６に基づくＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイは、ウサギモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体クローン［Ｅ６Ｄ７Ｂ］を用いて脳試料で最初に観察された免疫反応性を再現しなかった。
【0164】
ヒトＦＦＰＥ正常脳試料におけるＢＣＭＡ ＩＳＨ。同じ細胞及び解剖学的領域における目的のタンパク質の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の特異的検出は、観察された免疫反応性の特異性における信頼性を高めることができた。したがって、ＢＣＭＡ ＩＳＨは、解剖学的及び細胞分解能を有する遺伝子発現を明らかにするので、Ｅ６Ｄ７Ｂクローンを使用した場合に観察された免疫反応性を確証するためにＢＣＭＡ ＩＳＨを使用した。Ｅ６Ｄ７Ｂ媒介免疫反応性に関係なく無作為に選択した合計４９個の脳試料を、ｍＲＮＡ ＱＣプローブＰＰＩＢで染色した。これら４９個の試料のうち、２５個が許容されるＰＰＩＢ対照シグナル（細胞当たり４ドット以上）を示し、その後の実験に使用した。ＢＣＭＡ特異的プローブをこれらの２５個の試料に適用し、これらの試料のうち４個のみが、切片中に存在する数千個の細胞のうち１個又は２個の細胞にスポットされた非常に低い（１～２ドット／細胞）陽性シグナルを生じた。同様のシグナルを陰性対照細胞ペレット試料（ＨＥＫ２９３細胞）で検出することができたが、このシグナルは、アッセイに基づいて陽性とみなされるものの閾値未満だった。Ｅ６Ｄ７Ｂクローンで生成された免疫反応性は、脳切片全体にわたって時折ニューロンにおいて見られたが、ＩＳＨシグナルは非常に稀だった。
【0165】
共局在アッセイ。正常ヒト脳組織に対して行われたＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイから生じる免疫反応性を更に特徴付けるために、ゴルジ装置マーカーを用いた免疫蛍光共局在実験を行った。ＢＣＭＡタンパク質を内因的に発現する形質細胞では、ＢＣＭＡは、細胞膜上又はゴルジ装置内に見出すことができる。ニューロンのゴルジ装置は、形質細胞と比較した場合、形状、サイズ、及び分布が大きく異なり、したがって、ＢＣＭＡ免疫反応性がニューロン細胞体内の既知のゴルジタンパク質と共局在するかどうかを決定することが適切であると考えられた。ゴルジ装置のスパンをカバーするために、シス（ＧＯＬＧＡ２及びＧＯＬＭ１、ＰＭＩＤ：１８９５３４３８）及びトランス（ＴＧＮ４６、ＰＭＩＤ：２９３１１４７７）ゴルジＩＨＣマーカーを調べた。組織常在性形質細胞及び試薬対照細胞ペレットでは、ＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイは、タンパク質を形質膜に位置付け、細胞質中のゴルジ様構造に常に位置付けた。予想されたように、ゴルジマーカーとＢＣＭＡ抗体との間で行われた共焦点観察では、細胞ペレット対照中に明らかに共局在した。正常ヒト脳試料のニューロンでは、シス及びトランス－ゴルジマーカーとＥ６Ｄ７Ｂから生じる免疫反応性との間に共局在は観察することができなかった（図３Ａ～３Ｈ）。
【0166】
更に、免疫反応性原線維は、アルツハイマー病などの神経変性疾患において見られる神経原線維変化を形態学的に暗示するので、ｐＴａｕ（アルツハイマー病において前臨床的及び臨床的に見られる最も一般的な凝集タンパク質）とＢＣＭＡとの共局在も調べた。共局在を共焦点顕微鏡によって評価した。ｐタウＩＨＣ染色は、評価された組織試料中に変化がないことを示し、したがって、Ｅ６Ｄ７Ｂで観察された免疫反応性は、そのマーカーとの共局在を示さなかった（図６Ａ～６Ｆ）。ｐタウ共局在試験は、組織試料に見られる免疫反応性とのいかなる関係も明らかにしなかった。タンパク質凝集体は、ｐタウ以外の多種多様なタンパク質によって形成されることができるので、ビルショウスキー銀染色を使用して、関与するタンパク質（複数可）とは無関係にほとんどの変化を同定した。選択されたニューロンは点状神経細胞内好銀性凝集体を示し、細胞の大部分は透明な原形質を示した。髄質では、好銀性凝集体の分布及び形態は、Ｅ６Ｄ７Ｂ ＩＨＣによって生成されたパターンに類似せず、免疫反応性が凝集タンパク質に由来しない可能性が最も高いことを示唆した（図６Ａ～６Ｆ）。
【0167】
カニクイザル脳試料における比較ＢＣＭＡ ＩＨＣ。ヒトで考慮されたものに対応するカニクイザル正常脳位置を、Ｅ６Ｄ７Ｂクローンを使用してＢＣＭＡ ＩＨＣアッセイで染色した。ＢＣＭＡ免疫反応性は、尾状核、被殻、及び視床などのヒトで研究された同じ解剖学的位置を含む、評価したカニクイザル組織試料では観察されなかった。
【0168】
ＧＴＥｘ ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析。脳試料にわたって、ＢＣＭＡ ＲＮＡ検出は、一般に無視できる（０～０．２１ＴＰＭ）。尾状核及び被殻（線条体の構成要素）では、わずかに高いＴＰＭ値（１～３ＴＰＭ）を有するサンプルの小さなサブセットが存在する。
【0169】
Ａｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎ ＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）ＲＮＡ発現（図４Ａ～４Ｃ）は、胎児（平均ＴＰＭ＝５．２）、乳児（平均ＴＰＭ＝１５．１）、若年（平均ＴＰＭ＝９．５）、思春期（１人のドナー、ＴＰＭ＝２．２）、及び若年成人（１９歳及び２０歳、平均ＴＰＭ＝４．６）由来の試料中の線条体で検出される。ＢＣＭＡ ＲＮＡレベルは、複数の発達段階が検査された全ての他の脳領域では無視できる（平均ＴＰＭが０．４未満）。
【0170】
凝集ＢＣＭＡ ＲＮＡ－ｓｅｑ発現データ：線条体。線条体及び線条体の成分（尾状核及び被殻）のＧＴＥｘ及びＡｌｌｅｎ ＢｒａｉｎＳｐａｎ ＢＣＭＡ ＲＮＡ発現レベルの場合、試料（ｎ＝４７８）は、年齢の増加と共に明らかな発現低下を示す（図４Ａ～４Ｃ）。ＢＣＭＡ ＲＮＡ発現は一般に、３０歳を超えるドナーの線条体では無視できる。
【0171】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【国際調査報告】