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特表2024-541964変異を含むドーパミン作動性ニューロン及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】変異を含むドーパミン作動性ニューロン及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20241106BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/16 20060101ALN20241106BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793 ZNA
C12Q1/02
C12N5/16
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525222
(86)(22)【出願日】2022-10-28
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 US2022078851
(87)【国際公開番号】W WO2023077050
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/273,480
(32)【優先日】2021-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
(71)【出願人】
【識別番号】510003830
【氏名又は名称】フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】521488495
【氏名又は名称】フジフィルム ホールディングス アメリカ コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ラジェシュ ディーピカ
(72)【発明者】
【氏名】ファティ アリ
(72)【発明者】
【氏名】リュウ ジン
(72)【発明者】
【氏名】バクシー キランマイエー
(72)【発明者】
【氏名】ディッカーソン サラ
(72)【発明者】
【氏名】プーン ウェイン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ91
4B063QR77
4B063QR80
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BC01
4B065CA44
(57)【要約】
本開示は、疾患関連変異を含むｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを提供する。ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを、神経変性疾患の診断、予後、及び処置のための新規標的、バイオマーカー、及び治療薬を同定するなどの神経炎症の研究に使用する方法が本明細書でさらに提供される。本細胞培養モデルを用いて神経炎症を研究するためのアッセイが本明細書でさらに提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む、単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株。
【請求項2】
ＧＢＡ変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項3】
ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異又はＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項4】
ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＧＢＡ Ｌ４４４Ｐ変異、又はＧＢＡ ＲｅｃＮｉｌ変異を有する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項5】
ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を有する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項6】
ＬＲＲＫ２変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項7】
ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｒ１４４１Ｇ変異、ＬＲＲＫ２ Ｒ１４４１Ｃ変異、又はＬＲＲＫ２ Ｉ２０２０Ｔ変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項8】
ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項9】
ＳＮＣＡ変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項10】
ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異、ＳＮＣＡ Ｅ４６Ｋ変異、ＳＮＣＡ重複、又はＳＮＣＡ三重複を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項11】
ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項12】
前記ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株のｉＰＳＣが、神経変性疾患を有するドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項13】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロン細胞株のｉＰＳＣが、パーキンソン病のドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項14】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンのｉＰＳＣが、ＧＢＡ変異、ＬＲＲＫ２変異、又はＳＮＣＡ変異を含むように遺伝子操作されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項15】
ヒト細胞株である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項16】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、中脳ドーパミン作動性ニューロンである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項17】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、ＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する末期ドーパミン作動性ニューロンである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項18】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴ転写産物レベルが少なくとも５０％増加している、請求項１～１７のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項19】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、ＫＣｌ刺激に応答したドーパミンの放出が少なくとも３０％増加している、請求項１～１８のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項20】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、細胞死、ミトコンドリアストレス、及びα－シヌクレインタンパク質凝集が増加している、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項21】
アイソジェニックである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項22】
ＳＮＣＡ変異を含む前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、疾患関連変異を有していない健常なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、リソソームＧＣａｓｅ活性が低下している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項23】
ＳＮＣＡ変異を含む前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、疾患関連変異を有していない健常なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、リソソームＧＣａｓｅ活性が低下している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項24】
前記ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンが、ＲＮＡ配列決定及びカルシウムイメージングによって測定される細胞内カルシウムシグナル伝達が欠如している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項25】
適当な容器に入れられた請求項１～２１のいずれか一項に記載の細胞株を含むキット。
【請求項26】
第１の容器に入れられたＧＢＡ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株、及び第２の容器に入れられたＬＲＲＫ２変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項27】
第１の容器に入れられたＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株、及び第２の容器に入れられたＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項28】
疾患関連変異を有していないｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項29】
前記ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株のｉＰＳＣが、健康なドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである、請求項２８に記載のキット。
【請求項30】
前記健康なドナーが、神経変性疾患を有していない、請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
第３の容器に入れられた、疾患関連変異を発現するように操作されたｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株をさらに含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項32】
前記疾患関連変異が、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）の変異である、請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
前記ＳＮＣＡの変異が、ミスセンス点変異である、請求項３２に記載のキット。
【請求項34】
前記ミスセンス点変異がＡ５３Ｔである、請求項３３に記載のキット。
【請求項35】
それぞれ適切な容器に入れられた星状細胞、周皮細胞、脳微小血管内皮細胞、ミクログリア、及び／又はニューロンをさらに含む、請求項２５又は２７に記載のキット。
【請求項36】
それぞれ適切な容器に入れられた、ドーパミンのレベル、ＧＢＡ活性、ニューロンマエストロ多電極アレイ（ＭＥＡ）多活性、及びα－シヌクレイン媒介タンパク質凝集の低下を検出するための試薬をさらに含む、請求項２５～３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項37】
ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴ転写レベルを測定するための試薬をさらに含む、請求項２５～３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項38】
グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）活性を検出するための試薬、及び／又はカルシウムイメージングを行うための試薬をさらに含む、請求項２５～３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項39】
前記試薬が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試薬としてさらに定義される、請求項３６に記載のキット。
【請求項40】
ＥＬＩＳＡプレートをさらに備える、請求項３９に記載のキット。
【請求項41】
神経変性疾患の検出のための、請求項２５～４０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項42】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項４１に記載の使用。
【請求項43】
神経変性疾患の処置用の治療薬のスクリーニングのための、請求項２５～４０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項44】
請求項２５～４０のいずれか一項に記載のキットのパーキンソン病のモデルとしての使用。
【請求項45】
ＧＢＡ変異、ＬＲＲＫ２変異、又はＳＮＣＡ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む培養物。
【請求項46】
ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む、請求項４５に記載の培養物。
【請求項47】
ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む、請求項４５に記載の培養物。
【請求項48】
ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む、請求項４５に記載の培養物。
【請求項49】
ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む、請求項４５に記載の培養物。
【請求項50】
細胞培養物が、２次元（２Ｄ）培養物である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項51】
培地がＤＡＰＴを含む、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項52】
細胞が、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた表面で培養される、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項53】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、マウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍から精製された基底膜抽出物（ＢＭＥ）である、請求項５２に記載の培養物。
【請求項54】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＧＥＬＴＲＥＸ（商標）、コラーゲン、又はラミニンである、請求項５２に記載の培養物。
【請求項55】
細胞培養物が、３次元（３Ｄ）培養物である、請求項４５～５４のいずれかの培養物。
【請求項56】
細胞培養物が、星状細胞、周皮細胞、脳微小血管内皮細胞、ミクログリア、及び／又はニューロンをさらに含む、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項57】
前記ｉＰＳＣがヒトである、請求項４５～５６のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項58】
ゼノフリー、フィーダーフリー、及び／又は馴化培地フリーである、請求項４５～５７のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項59】
培地が規定培地である、請求項４５～５８のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項60】
請求項４５～５９のいずれか一項に記載の培養物の神経変性疾患のモデルとしての使用。
【請求項61】
前記モデルが、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、健康なドナーからのｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を発現するように操作されたｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含有する培養物を含む、請求項６０に記載の使用。
【請求項62】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン又は請求項４５～５９のいずれか一項に記載の培養物と試験化合物を接触させて、細胞の機能活性、生理機能、又は生存率を測定することを含む、神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングする方法。
【請求項63】
機能活性の増加が、前記試験化合物が神経変性疾患を処置できることを示す、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
ドーパミンのレベルを測定することを含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項65】
細胞株をＫＣｌと接触させることをさらに含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
機能活性を測定することが、ＧＢＡ活性、ＭＥＡ活性、α－シヌクレイン媒介タンパク質凝集、及び／又はミトコンドリアＲＯＳレベルを測定することを含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
機能活性を測定することが、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）活性を測定することを含む、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
ＧＣａｓｅ活性の少なくとも１０％の増加が候補化合物を同定する、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
カルシウム振動を測定するためにカルシウムイメージングアッセイを行うことをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項70】
カルシウム振動を測定することが、ピーク数、ピークレート、及び曲線下面積からなる群から選択される測定値の１つ以上を測定することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
測定されたカルシウム振動が、ＡＨＮニューロン又は変異ニューロンと関連し得る、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
カルシウム振動を測定することを、化合物スクリーニングに使用することができる、請求項７０に記載の方法。
【請求項73】
前記ドーパミンのレベルが、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項74】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、競合的ドーパミンＥＬＩＳＡである、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
ドーパミンのレベルを測定することが、ドーパミンのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定することを含む、請求項６４～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
ドーパミンの少なくとも３０％又は３０ｎｇ／ｍＬ超の増加が候補化合物を示す、請求項６４～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及びＣＯＭＴ転写産物レベルを測定することをさらに含む、請求項６２～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
α－シヌクレイン蛋白質凝集が、チオフラビン染色及びαシヌクレイン発現によって測定される、請求項６６に記載の方法。
【請求項79】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項６２～７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴのＲＮＡ発現の少なくとも１．５倍の増加が候補化合物を同定する、請求項６２～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
ＭＥＡ活性の増加が候補化合物を同定する、請求項６２～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項82】
α－シヌクレインの発現及び凝集並びに／又はミトコンドリアＲＯＳの少なくとも３０％の増加が候補化合物を同定する、請求項６２～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
ＧＢＡ活性の少なくとも５０％の減少が候補化合物を同定する、請求項６２～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
ＧＢＡ変異又はＬＲＲＫ２変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンをサンプルと接触させることを含む、神経変性疾患のスクリーニング方法。
【請求項85】
神経変性疾患をスクリーニングすることが、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異又はＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンをサンプルと接触させることを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを前記サンプルと接触させることをさらに含む、請求項８４又は８５に記載の方法。
【請求項87】
前記ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン及び／又は前記ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンが、請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞である、請求項８４又は８６に記載の方法。
【請求項88】
前記サンプルが、患者サンプルである、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記ドーパミンのレベルを検出することをさらに含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
ドーパミンのレベルの増加が、神経変性疾患の存在を示す、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２１年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２７３，４８０号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２７３，４８０号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
この出願は、電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表ＸＭＬを含む。２０２２年１０月２７日に作成された前記ＸＭＬ配列表は、ＣＤＩＮＰ０１１１ＷＯ．ｘｍｌというファイル名で、サイズは１，９３３バイトである。
【背景技術】
【0003】
１．分野
本発明は、一般に、分子生物学及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したニューロンの組成物及びその使用方法に関する。
本発明は、一般に、分子生物学及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したニューロンの組成物及びその使用方法に関する。
【0004】
２．関連技術の説明
ヒトｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、前脳及び線条体を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の様々な領域を神経支配するヒト中脳ドーパミン作動性ニューロンの発生学的及び生理学的に適切なインビトロモデルを提供する。ドーパミン作動性ニューロンの喪失は、ＣＮＳのドーパミンレベルの低下を引き起こし、パーキンソン病（ＰＤ）を含む神経変性状態を引き起こす。ドーパミン作動性ニューロンは、加齢とともに減少し、加齢とともに増加するドーパミン酸化によって生じる酸化ストレスに対して選択的に脆弱である。疾患モデリングには、疾患関連変異を有するドーパミン作動性ニューロンに対する満たされていない要望が存在する。
ヒトｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、前脳及び線条体を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の様々な領域を神経支配するヒト中脳ドーパミン作動性ニューロンの発生学的及び生理学的に適切なインビトロモデルを提供する。ドーパミン作動性ニューロンの喪失は、ＣＮＳのドーパミンレベルの低下を引き起こし、パーキンソン病（ＰＤ）を含む神経変性状態を引き起こす。ドーパミン作動性ニューロンは、加齢とともに減少し、加齢とともに増加するドーパミン酸化によって生じる酸化ストレスに対して選択的に脆弱である。疾患モデリングには、疾患関連変異を有するドーパミン作動性ニューロンに対する満たされていない要望が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
いくつかの実施形態において、本開示は、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株を提供する。
【0006】
いくつかの態様において、細胞株は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異又はＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有する。特定の態様において、細胞株は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＧＢＡ Ｌ４４４Ｐ変異、又はＧＢＡ ＲｅｃＮｉｌ変異を有する。特定の態様において、細胞株は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を有する。特定の態様において、細胞株は、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｒ１４４１Ｇ変異、ＬＲＲＫ２ Ｒ１４４１Ｃ変異、又はＬＲＲＫ２ Ｉ２０２０Ｔ変異を有する。特定の態様において、細胞株は、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有する。特定の態様において、細胞株は、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異、ＳＮＣＡ Ｅ４６Ｋ変異、ＳＮＣＡ重複、又はＳＮＣＡ三重複を有する。いくつかの態様において、細胞株は、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を有する。
【0007】
いくつかの態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンのｉＰＳＣは、ＧＢＡ変異、ＬＲＲＫ２変異、又はＳＮＣＡ変異を含むように遺伝子操作される。
【0008】
いくつかの態様において、ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株のｉＰＳＣは、神経変性疾患を有するドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである。特定の態様において、ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンのｉＰＳＣは、パーキンソン病のドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである。
【0009】
いくつかの態様において、細胞株は、ヒト細胞株である。特定の態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、中脳ドーパミン作動性ニューロンである。いくつかの態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、ＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する末期ドーパミン作動性ニューロンである。特定の態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴ転写レベルが少なくとも５０％増加している。特定の態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、ＫＣｌ刺激に応答するドーパミンの放出が少なくとも３０％増加している。いくつかの態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、細胞死、ミトコンドリアストレス、及びα－シヌクレインタンパク質凝集を増加させた。特定の態様において、ＳＮＣＡ変異を含むｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、リソソームＧＣａｓｅ活性を低下させた。特定の態様において、ＳＮＣＡ変異を含むｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、疾患関連変異を有していない健康なドナーから再プログラムされたｉＰＳＣから分化したＤＡニューロンと比較して、リソソームＧＣａｓｅ活性を低下させた。いくつかの態様において、ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、ＲＮＡ配列決定及びカルシウムイメージングによって測定される細胞内カルシウムシグナル伝達が欠如している。特定の態様において、細胞株はアイソジェニックである。
【0010】
さらなる実施形態は、適当な容器に入れられた本実施形態の細胞株（例えば、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株）を含むキットを提供する。
【0011】
いくつかの態様において、キットは、第１の容器に入れられたＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株、及び第２の容器に入れられたＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株を含む。特定の態様において、キットは、疾患関連変異を有していないｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株をさらに含む。特定の態様において、ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株のｉＰＳＣは、神経変性疾患を有していない健康なドナーなどの健康なドナーからエピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣである。いくつかの態様において、キットは、第３の容器に入れられた、疾患関連変異を発現するように操作されたｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン細胞株をさらに含む。特定の態様において、疾患関連変異は、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）における変異である。いくつかの態様において、ＳＮＣＡにおける変異は、Ａ５３Ｔなどのミスセンス点変異である。
【0012】
いくつかの態様において、キットは、それぞれ適切な容器に入れられた星状細胞、周皮細胞、脳微小血管内皮細胞、ミクログリア、及び／又はニューロンをさらに含む。特定の態様において、キットは、それぞれ適切な容器に入れられた、ドーパミンのレベル、ＧＢＡ活性、ニューロンマエストロ多電極アレイ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｅｓｔｒｏ ｍｕｌｔｉ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ）（ＭＥＡ）活性、及びα－シヌクレイン媒介タンパク質凝集を検出するための試薬をさらに含む。さらなる態様において、本キットは、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴ転写産物レベルを測定するための試薬をさらに含む。特定の態様において、試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試薬としてさらに定義される。いくつかの態様において、キットは、ＥＬＩＳＡプレートをさらに含む。いくつかの態様において、キットは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）活性を検出するための試薬、及び／又はカルシウムイメージングを行うための試薬をさらに含む。
【0013】
神経変性疾患の検出のための、本実施形態のキット（例えば、適切な容器に入れられた本実施形態の細胞株（例えば、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株）を含むキット）の使用が本明細書でさらに提供される。いくつかの態様において、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【0014】
別の実施形態は、神経変性疾患の処置用の治療薬のスクリーニングのための、本実施形態のキット（例えば、適切な容器に入れられた本実施形態の細胞株（例えば、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株）を含むキット）の使用を提供する。
【0015】
さらに別の実施形態において、パーキンソン病のモデルとしての、本実施形態のキット（例えば、適切な容器に入れられた本実施形態の細胞株（例えば、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ）変異、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）変異、又はα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）変異を含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞株）を含むキット）の使用を提供する。
【0016】
別の実施形態は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む培養物を提供する。
【0017】
いくつかの態様において、培養物は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む。特定の態様において、培養物は、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む。いくつかの態様において、培養物は、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む。
【0018】
特定の態様において、細胞培養は、２次元（２Ｄ）培養である。いくつかの態様において、培地は、ＤＡＰＴを含む。特定の態様において、細胞は、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた表面で培養される。例えば、細胞外マトリックスは、マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍から精製された基底膜抽出物（ＢＭＥ）である。いくつかの態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＧＥＬＴＲＥＸ（商標）、コラーゲン、又はラミニンである。いくつかの態様において、細胞培養は、３次元（３Ｄ）培養である。
【0019】
いくつかの態様において、細胞培養は、星状細胞、周皮細胞、脳微小血管内皮細胞、ミクログリア、及び／又は他のタイプのニューロンをさらに含む。
【0020】
ある態様において、ｉＰＳＣはヒトである。いくつかの態様において、培養物は、ゼノフリー、フィーダーフリー、及び／又は馴化培地フリーである。特定の態様において、培地は、規定培地である。
【0021】
本実施形態の培養物（例えば、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む培養物）の神経変性疾患のモデルとしての使用が本明細書でさらに提供される。いくつかの態様において、このモデルは、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、健康なドナーからのｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を発現するように操作されたｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む培養物を含む。
【0022】
別の実施形態は、神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、試験化合物を本実施形態のｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン又は本実施形態の培養物（例えば、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異、又はＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを含む培養物）と接触させること、及び細胞の機能活性、生理学、又は生存率を測定することを含む。
【0023】
いくつかの態様において、機能活性の増加は、試験化合物が神経変性疾患を処置できることを示す。特定の態様において、この方法は、ドーパミンのレベルを測定することを含む。いくつかの態様において、細胞株をＫＣｌと接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、機能活性を測定することは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）活性を測定することを含む。特定の態様において、ＧＣａｓｅ活性の少なくとも１０％の増加は、候補化合物を同定する。いくつかの態様において、この方法は、カルシウムイメージングアッセイを行ってカルシウム振動を測定することをさらに含む。いくつかの態様において、カルシウム振動を測定することは、ピーク数、ピークレート、及び曲線下面積からなる測定値の１つ以上を測定することを含む。特定の態様において、測定されたカルシウム振動は、ＡＨＮニューロン又は変異ニューロンと関連し得る。いくつかの態様において、カルシウム振動を測定することは、化合物スクリーニングに使用することができる。
【0024】
特定の態様において、機能活性を測定することは、ＧＢＡ活性、ＭＥＡ活性、α－シヌクレイン媒介タンパク質凝集、及び／又はミトコンドリアＲＯＳレベルを測定することを含む。いくつかの態様において、ドーパミンのレベルは、競合的ドーパミンＥＬＩＳＡなどのＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。いくつかの態様において、ドーパミンレベルを測定することは、ドーパミンのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定することを含む。特定の態様において、ドーパミンの少なくとも３０％又は３０ｎｇ／ｍＬ超の増加は、候補化合物を示す。
【0025】
いくつかの態様において、この方法は、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及びＣＯＭＴ転写産物レベルを測定することをさらに含む。特定の態様において、α－シヌクレインタンパク質凝集は、チオフラビン染色及びαシヌクレイン発現によって測定される。
【0026】
特定の態様において、神経変性疾患は、パーキンソン病である。
【0027】
いくつかの態様において、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及び／又はＣＯＭＴのＲＮＡ発現の少なくとも１．５倍の増加は、候補化合物を同定する。特定の態様において、ＭＥＡ活性の増加は、候補化合物を同定する。いくつかの態様において、α－シヌクレインの発現及び凝集及び／又はミトコンドリアＲＯＳの少なくとも３０％の増加は、候補化合物を同定する。特定の態様において、ＧＢＡ活性の少なくとも５０％の減少は、候補化合物を同定する。
【0028】
別の実施形態は、神経変性疾患のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異又はＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンをサンプルと接触させることを含む。
【0029】
いくつかの態様において、この方法は、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを前記サンプルと接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロン及び／又はＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を含むｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、本実施形態による細胞である。いくつかの態様において、サンプルは、患者サンプルである。特定の態様において、サンプルは、血液サンプルである。いくつかの態様において、この方法は、ドーパミンのレベルを検出することをさらに含む。特定の態様において、ドーパミンのレベルの増加は、神経変性疾患の存在を示す。いくつかの態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症である。
【0030】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び修正形態は、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【0031】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1A-1F】ＰＤモデリングのためのｉＰＳＣの生成及び特性評価。（図１Ａ）エピソームで再プログラムされたｉＰＳＣ ０１２７９を操作して、ヘテロ接合体（ＨＺ）ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異株を生成した。操作を、模式的に説明し、アミノ酸５３のアラニンからスレオニンへの変化を黄色で強調表示している。（図１Ｂ）ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を有するＰＤ患者に由来するＩＰＳＣ。アスパラギン３７０のセリンへのアミノ酸変化を黄色で強調表示している。（図１Ｃ）変異ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有するＰＤ患者由来のＩＰＳＣを模式的に説明し、グリシン２０１９のセリンへのアミノ酸変化を黄色で強調表示している。（図１Ｄ～１Ｆ）正常核型、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ、ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ）、及びＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）を詳述する各ｉＰＳ細胞株由来のＧバンド中期細胞の細胞遺伝学的解析。
【0033】
【図2A-2C】疾患モデリングのための、明らかに健康な正常（ＡＨＮ）ｉＰＳＣ、操作されたアイソジェニックｉＰＳＣ、及びＰＤ患者からのドーパミン作動性ニューロンの生成及び特性評価。（図２Ａ）ｉＰＳＣからドーパミン作動性ニューロンへの時系列の分化プロセス及びそのプロセス全体を通して利用されたサイトカインの概略図を示す。（図２Ｂ）中脳転写因子ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１を発現する、１７日目のドーパミン作動性前駆細胞の代表的なフローサイトメトリードットプロット。（図２Ｃ）ＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）酵素（チロシンからのドーパミン合成に必要な酵素）を発現するプロセス終了時のドーパミン作動性ニューロンの代表的なフローサイトメトリードットプロット。
【0034】
【0035】
【0036】
【図5A-5B】ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２ ＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ＫＣｌで刺激されるとより多くのドーパミンを放出する。（図５Ａ）製造元の指示に従って、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、２１日間プレーティングし、細胞によって放出されるドーパミンのレベルを、競合ドーパミンＥＬＩＳＡ（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＯＰ３１－Ｋ０１）を用いて定量化した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭでグラフ化した検量線を示す。（図５Ｂ）ＤＡニューロンのドーパミン放出を、ＫＣＬで刺激されたＨＢＳＳ緩衝液中の培養２１日目のＡＨＮ ＤＡニューロンによって放出されるドーパミンと比較した（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【0037】
【図6A-6E】ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、より高い細胞死及びミトコンドリアストレスを明らかにする。（図６Ａ）異なる時点における１μＭのＹＯＹＯ－３ヨウ化物（死細胞）及びカルセインＡＭ（生細胞）による末期ＤＡニューロンの代表的な染色。（図６Ｂ）ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、プレーティングした。生細胞／死細胞のパーセンテージを、緑と赤のチャネルの陽性オブジェクトに基づいて計算した。このデータは、９６ウェルプレートの１ウェル（０．１４３ｃｍ２）あたりの生細胞を示している。（図６Ｃ）ＭｉｔｏＳＯＸ色素で染色し（左の画像）、相の画像と重ね合わせ（中央の画像）、生細胞についてカルセインＡＭで共染色した（右の画像）ＤＡニューロンの代表的な画像。（図６Ｄ～６Ｅ）ＡＨＮニューロンと比較した、疾患ニューロンにおけるＭｉｔｏＳＯＸシグナル強度（平均±ＳＤ）の定量化及びＭｉｔｏＳＯＸ陽性細胞のパーセンテージを示す。（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）
【0038】
【図7A-7C】ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、著しく多いａＳｙｎタンパク質凝集を有する。（図７Ａ）チオフラビン（Ｔｈ－Ｔ）染色を行って、オリゴマーａＳｙｎ（４μＭ／ｍｌ）を２４時間添加した後の２２ＤＩＶに、生ＤＡニューロン培養物上に凝集したａＳｙｎを明らかにした。（図７Ｂ）すべてのａＳｙｎ＋細胞をカウントし、異なる発現ビンの個々のニューロンにおけるＴｈ－Ｔシグナル強度に対してプロットした。（図７Ｃ）Ｔｈ－Ｔ画像を、活性オリゴマーａＳｙｎで処理した２１ＤＩＶに、ＤＡニューロン培養について、２４時間、４８時間又は７２時間定量化した（ｎ＝４、ダネット多重比較検定による一元配置分散分析）。
【0039】
【0040】
【図9A-9F】ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、低いＧＣａｓｅ活性を有する。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、１４日間プレーティングし、サンプルを回収してＲＮＡＳｅｑ解析及びウェスタンブロット解析のために提出した。ＧＢＡ転写産物のＦＰＫＭ値を定量化した（図９Ａ）。溶解物中のＧＢＡタンパク質の量を、各タンパク質の曲線下面積に基づいて定量化し、ＭＡＰＴ発現に対して正規化した（図９Ｂ）。基質としての異なる濃度の４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド（４－ＭＵ）（図９Ｃ）及びＧＣａｓｅ特異的阻害剤コンズリトールＢエポキシド（ＣＢＥ）（図９Ｄ）を試験した。１０ｍＭの４－ＭＵと２ｍＭのＣＢＥが最適な濃度であることが判明し、これを、以下のＧＣａｓｅ活性アッセイに使用した。異なる濃度のタンパク質溶解物も、ＡＨＮ ＤＡニューロン由来のＧＣａｓｅ活性について試験した（図９Ｅ）。５ｕｇのタンパク質溶解物を使用して、異なるＤＡニューロン間でＧＣａｓｅ活性を比較した（図９Ｆ）。（ｎ＝４、ｐ＜０．００１ 平均比較のためのダネット検定による一元配置分散分析）。（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【0041】
【図10A-10B】ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ニューラルネットワーク活動の進化における違いを明らかにする。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、４８ウェルのＣｌａｓｓｉｃ多電極アレイ（ＭＥＡ）プレート（１ウェルあたり１２０Ｋ細胞の細胞密度でロットあたり８ウェル）に完全なＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地にプレーティングした。ニューロン活動を、Ａｘｉｏｎ ＭａｅｓｔｒｏＭＥＡを使用して定量化した。その結果、３５日目のラスタープロット（図１０Ａ）におけるＡＨＮ細胞と比較して、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、及びＳＮＣＡニューロンにおける活動及びネットワーク強度が低いことが、経時的なバースト率、ネットワークバースト頻度、及び同期指数の定量化（図１０Ｂ）で明らかになった。
【0042】
【図11A-11C】解凍の１４日後のＲＮＡｓｅｑデータ解析。変異ＤＡニューロンの転写産物をＡＨＮ ＤＡニューロンに対してプロットすると、遺伝子発現レベルにおいて高い相関を示し、有意に異なる転写産物を色で強調表示した（図１１Ａ）。ＡＨＮサンプルと比較した変異体サンプルについての差次的遺伝子発現解析を行い、有意に変化した転写産物の数をベン図にまとめた（図１１Ｂ）。ＤＡＶＩＤデータベースのＡＨＮ ＤＡニューロンと比較して、変異ＤＡニューロンで差次的に制御された転写産物の遺伝子セットの濃縮及び経路解析。色で強調表示した経路は、すべての変異ＤＡニューロンにおいて一般に調節された経路であった（図１１Ｃ）。
【0043】
【図12A-12C】ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンのパネルを用いた化合物スクリーニング。（図１２Ａ）ＡＨＮを対照とした、ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２ ＤＡニューロンにおけるＧｃａｓｅ活性に対する３つの濃度での１２の化合物の効果。（図１２Ｂ）組み合わせスクリーニングでは、改善されたＧＣａｓｅ活性を示す最初のスクリーニングから４つの分子をピックアップし、ＧＢＡ細胞で試験するために異なる方法で組み合わせた。単一化合物を、急性曝露（３日）と慢性曝露（２週間）の両方について試験した。組み合わせスクリーニングは、１０ｕＭのアンブロキソールによる慢性処理がＧＢＡ細胞において最も高いＧＣａｓｅ活性を有することを示した。（図１２Ｃ）これを、ＡＨＮと比較して、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＧＢＡにおいてさらに試験した。解凍の２１日後に、１０ｕＭのアンブロキソールで２週間処理すると、すべての変異ニューロンでＧｃａｓｅ活性が有意に増加した。（点線は、ＤＭＳＯビヒクル対照のＧｃａｓｅレベルを示す、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）
【0044】
【図13A-13D】ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンのカルシウムイメージング。プレーティングの１４日後のＤＡニューロンのカルシウム振動の痕跡をＦＤＳＳ／μＣＥＬＬ器具を用いて２０分間捕捉した。（図１３Ａ）１０ｕＭのアンブロキソールで１週間処理した後のＡＨＮ及び３つの変異すべてのＣａ振動のベースライン測定値。未処理のＡＨＮ ＤＡニューロンと比較して、アンブロキソールによる処理は、ＡＨＮ、ＬＲＲＫ２、及びＳＮＣＡ ＤＡニューロンに過興奮性を引き起こしたが、ＧＢＡ変異ＤＡニューロンのピーク数とピークレートを救った。（図１３Ｂ）ピーク数、（図１３Ｃ）毎分ピークレート、及び（図１３Ｄ）ピーク振幅（平均）を含むカルシウム過渡特性を、Ｗａｖｅｆｏｒｍソフトウェアを用いて各細胞株のすべてのウェル（反復）について定量化した。
【発明を実施するための形態】
【0045】
特定の態様において、本開示は、疾患関連変異を有するヒトｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを提供する。本明細書では、前脳及び線条体を含むＣＮＳの様々な領域を神経支配するヒト中脳ドーパミン作動性ニューロンの発生学的及び生理学的に適切なインビトロモデルとしてのこれらの細胞の使用がさらに提供される。
【0046】
ドーパミン作動性ニューロンの喪失は、ＣＮＳのドーパミンレベルの低下を引き起こし、パーキンソン病（ＰＤ）を含む神経変性状態を引き起こす。ドーパミン作動性ニューロンは、加齢とともに減少し、加齢とともに増加するドーパミン酸化によって生じる酸化ストレスに対して選択的に脆弱である。本研究は、ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ）又はＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）変異（ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２株はパーキンソン病進行マーカーイニシアチブ（ＰＰＭＩ）ｉＰＳ細胞バンクの一部である）及び遺伝子操作されたＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ ｉＰＳＣのいずれかを受け継いだ２人のＰＤ患者からのｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンの生成及び特性評価について概説する。健康なドナー及びＰＤドナーに由来する末期ドーパミン作動性ニューロンを、ＧＢＡ活性、ニューロンＭＥＡ活性、及びα－シヌクレイン媒介タンパク質凝集について評価した。これらの結果は、皿の中のＰＤの多くの特徴を要約した。具体的には、本研究は、ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２由来のＤＡが、ＡＨＮ ＤＡと比較してより多くのドーパミンを産生及び放出することを実証した。ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２ ＤＡはまた、ＳＮＣＡ ＤＡに匹敵する高いα－シヌクレイン凝集も示した。さらに、すべての変異ＤＡ（ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、及びＳＮＣＡ）は、より低いＧＢＡ活性を示し、それらのニューロンネットワーク活動は、ＡＨＮ ＤＡと比較してより速く発達したが、その後、時間の経過とともに減少した。
【0047】
したがって、疾患特異的な変異を有するヒトｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンの本パネルを、様々なインビトロ用途に使用して、ドーパミン作動性ニューロン変性の機構的洞察及び新規治療標的の同定を明らかにすることができる。
【0048】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、パーキンソン病などの神経変性疾患の診断、予後、及び処置のための新規な標的、バイオマーカー、及び治療薬を同定するなど、神経炎症の研究のためのインビトロ培養モデルを提供する。特定の態様において、本細胞及びモデルは、パーキンソン病の早期発症の検出に使用することができる。
【0049】
本明細書では、本細胞培養モデルを用いて神経炎症を研究するためのアッセイがさらに提供される。本モデルの結果は、ＧＢＡ活性、ニューロンＭＥＡ活性、ミトコンドリア酸化ストレス及び膜電位、リゾチーム及びオートファジー活性、並びにα－シヌクレイン媒介タンパク質凝集であり得る。患者からのｉＰＳＣに由来するこれらのＤＡニューロンは、２Ｄ又は３Ｄオルガノイド系におけるヒトミクログリア及び星状細胞などの他の細胞間の複雑な相互作用を理解して、神経変性疾患を模倣するためのより正確なモデルを作成するためのインビトロツールを提供する。本方法によって生成された細胞は、疾患モデリング、創薬、及び再生医療に利用することができる。
【0050】
いくつかの態様において、本ＤＡニューロンは、ドーパミン放出アッセイを用いて、又はニューロンにおけるＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及びＣＯＭＴ転写産物及びタンパク質発現レベルを測定することによって、ＰＤの早期診断に使用することができる。リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）活性アッセイは、ＰＤの家族性又は散発性に関係なく、早期診断テスト並びに薬物及び化合物をスクリーニングするための疾患表現型として、ＰＤ及びゴーシェ病の患者由来のＤＡニューロンの両方に使用することができ使用できる。α－シヌクレイン凝集及びミトコンドリアＲＯＳレベルもまた、早期診断並びに薬物及び化合物のスクリーニングのための疾患の情報としても使用することができる。
【0051】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ以上を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ以上を意味し得る。
【0052】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り又は代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義をサポートする。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のもの又はそれを超えるものを意味し得る。
【0053】
「本質的に」という用語は、方法又は組成物が特定のステップ又は材料のみを含み、それらの方法及び組成物の基本的な及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさないものを含むことを理解されたい。
【0054】
本明細書で使用される場合、特定の物質又は材料を「実質的に含まない」組成物又は培地は、３０％以下、２０％以下、１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下又は最も好ましくは１％以下の物質又は材料を含む。
【0055】
本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「およそ」という用語は、関連する基本機能に変化をもたらすことなく、許容される程度に変化し得る定量的比較、値、測定又は他の表現を変更するために適用され得る。
【0056】
「約」という用語は、一般に、記載された値を測定するための標準的な分析技術を使用して決定された、記載された値の標準偏差内を意味する。この用語は、記載値のプラス又はマイナス５％を指すことによっても使用され得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書において、特定の成分のいずれも意図的に組成物に配合されておらず、且つ／又は汚染物質として若しくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出できない組成物である。
【0058】
本明細書で使用される場合、「細胞株」は、特定の条件下で無限に増殖する同じタイプの１つの細胞又は細胞のセットに由来する確立された細胞培養物である。細胞株の細胞は、均一な遺伝子構成を含み得る。
【0059】
「フィーダーフリー」又は「フィーダー非依存性」は、フィーダー細胞層の代わりとして、サイトカイン及び成長因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、その類似体若しくは模倣物）が補充された培養物を指すために本明細書で使用される。したがって、「フィーダーフリー」又はフィーダー非依存性の培養システム及び培地を使用して、多能性細胞を未分化及び増殖状態に培養及び維持し得る。いくつかの場合、フィーダーフリー培養は、動物ベースのマトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、又はフィブロネクチン、コラーゲン若しくはビトロネクチンなどの基質上で培養される。これらのアプローチにより、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずにヒト幹細胞を本質的に未分化の状態に保つことができる。
【0060】
「フィーダー層」は、本明細書において、培養皿の底などの細胞のコーティング層として定義される。フィーダー細胞は、栄養素を培地に放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着できる表面を提供することができる。
【0061】
「規定」又は「完全規定」という用語は、培地、細胞外マトリックス又は培養条件に関連して使用される場合、ほぼ全ての成分の化学組成及び量が既知である培地、細胞外マトリックス又は培養条件を指す。例えば、規定培地には、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンなどの未定義の因子が含まれていない。一般に、規定培地は、組換えアルブミン、組成が既知である脂質及び組換えインスリンが補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液、抗酸化剤及びエネルギー源を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。完全規定培地の例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。
【0062】
ヒト細胞で使用される培地、細胞外マトリックス又は培養システムについて、「ゼノフリー（ＸＦ）」という用語は、使用される材料が非ヒト動物由来ではない状態を指す。
【0063】
「処置」又は「処置すること」には、（１）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患を阻害すること（例えば、病状及び／又は総体症状のさらなる発展を抑止すること）、（２）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患を改善すること（例えば、病状及び／又は総体症状を逆転させること）、及び／又は（３）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患に測定可能な減少をもたらすことが含まれる。
【0064】
「予防的処置」には、（１）疾患のリスクがあり、且つ／又は疾患の素因がある可能性があるが、疾患の病状又は総体症状のいずれか又は全てを依然として経験又は示していない対象又は患者において疾患を発症するリスクを低減又は軽減すること、及び／又は（２）疾患のリスク及び／又は素因がある可能性があるが、疾患の病状又は総体症状のいずれか又は全てを依然として経験又は示していない対象又は患者における疾患の病状又は総体症状の発症を遅らせることが含まれる。
【0065】
本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット又はそれらのトランスジェニック種などの生きた哺乳動物を指す。特定の実施形態において、患者又は対象は、霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若年、乳児及び胎児である。
【0066】
「効果的」という用語は、その用語が本明細書及び／又は特許請求の範囲で使用される場合、所望の、期待される又は意図された結果を達成するのに適切であることを意味する。化合物で患者又は対象を処置することに関連して使用される場合の「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与されたとき、そのような疾患の処置又は予防に影響を与えるのに十分な量である化合物の量を意味する。
【0067】
一般に本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は合理的な利益／リスク比に見合った他の問題又は合併症がなく、ヒト及び動物の組織、器官及び／又は体液との接触での使用に適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
【0068】
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」とは、因子の組み合わせ（本明細書では再プログラミング因子と呼ぶ）の発現又は発現の誘導によって体細胞を再プログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年又は成人の体細胞を使用して生成することができる。特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子には、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８が含まれる。いくつかの実施形態において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子又は４つの再プログラミング因子を発現することによって再プログラミングされる。
【0069】
「細胞外マトリックスタンパク質」という用語は、周囲の細胞に構造的及び生化学的サポートを提供する分子を指す。細胞外マトリックスタンパク質は、組換え型であり得、またその断片又はペプチドも指す。例には、コラーゲン及びヘパリン硫酸が含まれる。
【0070】
「接着培養物」は、細胞又は細胞の凝集体が表面に付着した培養物を指す。
【0071】
「懸濁培養物」は、細胞又は細胞の凝集体が液体培地に懸濁中に増殖する培養物を指す。
【0072】
「三次元（３Ｄ）培養」は、生体細胞が３次元全てで成長又は周囲と相互作用することができる、人工的に作成された環境を指す。３Ｄ培養物は、バイオリアクター、細胞がスフェロイドに成長することができる小さいカプセル又は非接着培養プレートなどの様々な細胞培養容器で成長することができる。特定の態様において、３Ｄ培養は、足場なしである。対照的に、「二次元（２－Ｄ）」培養は、接着表面上の単層などの細胞培養を指す。
【0073】
「凝集体促進培地」という用語は、作用機序について一切の制限がない細胞の凝集体形成を増強する任意の培地を意味する。
【0074】
「凝集体」という用語、すなわち胚様体は、懸濁液中で培養された分化細胞、部分分化細胞、及び／又は多能性幹細胞を含む細胞の均質又は不均一なクラスタを指す。
【0075】
「ニューロン」又は「ニューロン細胞」又は「ニューロン細胞型」又は「神経系統」は、任意のニューロン系統細胞を含み得、特段の記載がない限り、一切の制限がないニューロン個体発生の任意の段階にある細胞を指すものと見なすことができる。例えば、ニューロンは、ニューロン前駆細胞及び／又は成熟ニューロンの両方を含み得る。「神経系細胞」又は「神経系細胞型」及び「神経系系統」細胞は、特段の記載がない限り、制限がない任意のニューロン系統及び／又は神経個体発生の任意の段階を含み得る。例えば、神経系細胞は、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞、成熟ニューロン、及び／又はグリアを含み得る。
【0076】
本明細書で使用される場合、「中脳ＤＡニューロン前駆細胞」、「ｍＤＡニューロン前駆細胞」、及び「ｍＤＡ前駆細胞」は、互換的に使用され、ＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１、及びＥＮ１（中脳特異的マーカー）を発現するニューロン前駆細胞を指すが；この細胞は、Ｎｕｒｒ１を発現しない。中脳ＤＡニューロン前駆細胞は、ＧＢＸ２、ＯＴＸ２、ＥＴＶ５、ＤＢＸ１ＴＰＨ２、ＴＨ、ＢＡＲＨＬ１、ＳＬＣ６Ａ４、ＰＩＴＸ３、ＰＩＴＸ２、ＧＡＴＡ２、ＮＲ４Ａ２、ＧＡＤ１、ＤＣＸ、ＮＸＫ６－１、ＲＢＦＯＸ３、ＫＣＮＪ６、ＣＯＲＩＮ、ＣＤ４４、ＳＰＲＹ１、ＦＡＢＰ７、ＳＬＣ１７Ａ７、ＯＴＸ１、及び／又はＦＧＦＲ３の１つ以上を発現し得る。ｍＤＡ前駆細胞は、分化の異なる段階で選択された遺伝子を発現し得る。
【0077】
本明細書で使用される場合、遺伝子の「破壊」は、破壊がない場合の遺伝子産物の発現レベルと比較した、細胞内の対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現の排除又は減少を指す。例示的な遺伝子産物には、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が含まれる。破壊は、一時的又は可逆的である場合もあれば、永続的である場合もある。切断型又は非機能性の産物が産生され得るという事実にもかかわらず、いくつかの場合、破壊は、機能性又は完全長のタンパク質又はｍＲＮＡの破壊である。本明細書のいくつかの実施形態において、発現とは対照的に、遺伝子の活性又は機能が破壊される。遺伝子破壊は、一般に、人工的な方法、すなわち化合物、分子、複合体又は組成物の添加又は導入により、且つ／又はＤＮＡレベルなどにおいて、遺伝子の核酸又は遺伝子に関連する核酸の破壊によって誘導される。遺伝子破壊の例示的な方法には、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト及び／又は遺伝子編集などの遺伝子破壊技術が含まれる。例には、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び／又はリボザイムなどのアンチセンス技術が含まれ、これらは、一般に、発現の一過性の低下並びに例えば切断及び／又は相同組換えの誘導による、標的遺伝子の不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術をもたらす。例には、挿入、変異及び欠失が含まれる。破壊は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常又は「野生型」産物の発現の抑制及び／又は完全な欠如をもたらす。そのような遺伝子破壊の例は、遺伝子全体の欠失を含む、遺伝子又は遺伝子の一部の挿入、フレームシフト及びミスセンス変異、欠失、ノックイン及びノックアウトである。そのような破壊は、コーディング領域、例えば１つ以上のエクソンで発生し得、その結果、完全長の産物、機能性産物又は終止コドンの挿入などによる任意の産物を産生することができなくなる。そのような破壊は、遺伝子の転写を防ぐために、転写の活性化に影響を与えるプロモーター若しくはエンハンサー又は他の領域の破壊によっても起こり得る。遺伝子破壊には、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化を含む遺伝子標的化が含まれる。
【0078】
ＩＩ．ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロン
Ａ．多能性幹細胞
特定の実施形態において、本開示は、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンの分化のための方法を提供する。分化は、当技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に開示される方法によって行うことができる。
Ａ．多能性幹細胞
特定の実施形態において、本開示は、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンの分化のための方法を提供する。分化は、当技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に開示される方法によって行うことができる。
【0079】
理論的には、多能性幹細胞は、体のどの細胞にも分化することができ、多能性の実験的決定は、典型的には、多能性細胞の各胚層のいくつかの細胞型への分化に基づいている。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることによって誘導された人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞核移植によって得られる胚性幹細胞である。多能性幹細胞は、健康な対象（例えば、健康なヒト）又は疾患（例えば、神経変性疾患、パーキンソン病など）を有する対象から得られるか、又は由来し得る。
【0080】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有する細胞であるが、分化した体細胞のリプログラミングによって得られる。人工多能性幹細胞は、様々な方法によって得られる。１つの方法では、成人のヒト皮膚線維芽細胞に、レトロウイルス形質導入を用いて転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４をトランスフェクトする（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，２００７）。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した培地中のＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞株）にプレーティングする。約２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーに似たコロニーが培養物中に出現する。ＥＳ細胞様コロニーを、ｂＦＧＦの存在下でフィーダー細胞上でピックアップし、増殖させる。いくつかの好ましい実施形態において、ｉＰＳ細胞は、ヒトｉＰＳ細胞である。
【0081】
細胞特性に基づくと、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は、人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似しており、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが知られている条件下で増殖させると、人工多能性幹細胞は、それに応じて分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、ニューロン構造及びニューロンマーカーを有する細胞に分化することができる。例えばＹｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８に記載されるものを含む実質的にすべてのｉＰＳ細胞又は細胞株が本発明とともに使用できると予想される。
【0082】
別の方法では、ヒト胎児又は新生児線維芽細胞に、レンチウイルス形質導入を用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の４つの遺伝子をトランスフェクトする（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。感染の１２～２０日後、ヒトＥＳ細胞の形態を持つコロニーが見えるようになる。コロニーをピックアップして増殖させる。コロニーを構成する人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスへの注入後に神経組織、軟骨、腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【0083】
マウス細胞から人工多能性幹細胞を調製する方法も公知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導には、典型的には、Ｓｏｘファミリーの少なくとも１つのメンバー及びＯｃｔファミリーの少なくとも１つのメンバーの発現又は曝露が必要である。Ｓｏｘ及びＯｃｔは、ＥＳ細胞の同一性を特定する転写調節階層の中心であると考えられている。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ－１、Ｓｏｘ－２、Ｓｏｘ－３、Ｓｏｘ－１５、又はＳｏｘ－１８であり得；Ｏｃｔは、Ｏｃｔ－４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、又はｃ－Ｍｙｃのような追加の因子は、リプログラミング効率を向上させることができ；リプログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ－２、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、及び任意選択によりＬｉｎ－２８を含む；又は、Ｓｏｘ－２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、及び任意選択によりｃ－Ｍｙｃを含むセットであり得る。
【0084】
ＩＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、及びＳＳＥＡ－４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、並びにＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１（Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）の抗体を用いて、免疫組織化学又はフローサイトメトリーによって同定又は確認できる特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、例えば、８～１２週齢の雄のＳＣＩＤマウスの後脚の筋肉に約０．５～１０×１０６細胞を注入することによって確認することができる。３つの胚葉のそれぞれで少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が生じる。
【0085】
本発明の特定の態様において、ｉＰＳ細胞は、例えば上述したように、Ｋｌｆ又はＮａｎｏｇと組み合わせて、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２などのＯｃｔファミリーメンバー及びＳｏｘファミリーメンバーを含むリプログラミング因子を用いて、体細胞をリプログラミングすることから生成される。体細胞は、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞、又はβ細胞などの多能性に誘導され得る任意の体細胞であり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞もまた、リプログラミングのための体細胞の供給源として使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／１４１８０１号パンフレットを参照されたい）。
【0086】
リプログラミング因子は、１つ以上のベクター、例えば、組み込みベクター、染色体に組み込まれないＲＮＡウイルスベクター（参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１３／０５４，０２２号明細書を参照されたい）、又はＥＢＶエレメントベース系などのエピソームベクターを含む発現カセットから発現され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１４９２３３号パンフレット；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照されたい）。さらなる態様において、タンパク質又はＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡなど）のリプログラミングは、タンパク質又はＲＮＡトランスフェクションによって体細胞に直接導入することができる（Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【0087】
多能性幹細胞の調製及び培養の方法は、奇形癌及び胚性幹細胞を含む細胞生物学、組織培養、及び発生学における標準的な教科書及びレビューで確認することができる：すべてが参照により本明細書に組み入れられるＧｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８）。組織培養で使用される標準的な方法は、一般にＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（１９８７）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７ ＆ １９９５）に記載されている。
【0088】
体細胞をリプログラミング因子に導入又は接触させた後、これらの細胞は、多能性及び未分化状態を維持するのに十分な培地で培養することができる。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２３８１７０号明細書、同第２００３／０２１１６０３号明細書、及び同第２００８／０１７１３８５号明細書に記載されている霊長類多能性幹細胞、胚性幹細胞、又はｉＰＳ細胞を培養するために開発された様々な培地及び技術を使用することができる。当業者には公知であろう多能性幹細胞の培養及び維持のためのさらなる方法を本発明とともに使用できると考えられる。
【0089】
特定の実施形態において、非規定条件を使用することができる；例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、多能性細胞を、線維芽細胞フィーダー細胞又は線維芽細胞フィーダー細胞に曝露した培地上で培養することができる。或いは、多能性細胞を、ＴｅＳＲ培地（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）又はＥ８培地（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６号明細書）などの規定フィーダー非依存性培養系を用いて培養し、本質的に未分化状態で維持することができる。フィーダー非依存性培養系及び培地を使用して、多能性細胞を培養して維持することができる。これらのアプローチにより、ヒト多能性幹細胞は、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに、本質的に未分化の状態を維持することが可能になる。本明細書に記載されるように、所望に応じてコストを削減するために、これらの方法に様々な修正を加えることができる。
【0090】
様々なマトリックス成分を、ヒト多能性幹細胞の培養、維持、又は分化に使用することができる。参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように、例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンを組み合わせて使用して、多能性細胞増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングすることができる。
【0091】
また、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して、ヒト多能性幹細胞の細胞培養及び維持のための基質を提供することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者によって細胞培養の基質として使用されている。
【0092】
多能性幹細胞の神経分化効率（特に中脳ＤＡ分化効率）を改善するための方法を提供することができる。多能性幹細胞の分化は、付着したコロニーで、又は細胞凝集体の形成によって、例えば、それらの凝集体が胚様体（ＥＢ）と呼ばれる低接着環境などで、様々な方法で誘導することができる。ＥＢ内の分子及び細胞の形態形成シグナル及びイベントは、発生中の胚におけるそのような細胞の自然な個体発生の多くの側面を模倣している。細胞をニューロンの分化に導く方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２７６０６３号明細書に提供されている。ＤＡニューロンの分化のためのより詳細で特異的なプロトコルは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレットに記載されている。
【0093】
胚様体（ＥＢ）は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞由来の細胞の集合体であり、マウス胚性幹細胞を用いて長年にわたって研究されてきた。インビボ分化に固有の手がかりのいくつかを再現するために、３次元凝集体（すなわち、胚様体）を中間段階として生成することができる。細胞凝集が始まると、分化が始まることができ、細胞は、限られた程度まで胚発生を再現し始めることができる。それらは、栄養外胚葉組織（胎盤を含む）を形成することはできないが、生物に存在する実質的に他のすべてのタイプの細胞が発生し得る。本発明は、凝集体形成後の神経分化をさらに促進することができる。
【0094】
細胞凝集は、懸滴、非組織培養処理プレート又はスピナーフラスコへのプレーティングによって強制することができ；どちらの方法も、細胞が表面に付着して典型的なコロニー増殖を形成するのを防止する。ＲＯＣＫ阻害剤又はミオシンＩＩ阻害剤を、凝集体形成の前、最中、又は後に使用して多能性幹細胞を培養することができる。
【0095】
多能性幹細胞は、細胞培養の技術分野において公知の任意の方法を用いて凝集促進培地に播種することができる。例えば、多能性幹細胞は、単一コロニー又はクローン群として凝集促進培地に播種することができ、多能性幹細胞もまた、本質的に個々の細胞として播種することができる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、当技術分野で公知の機械的又は酵素的方法を用いて、本質的に個々の細胞に分離する。非限定的な例として、多能性幹細胞は、細胞と培養表面との間及び細胞自体の間の結合を破壊するタンパク質分解酵素に曝露することができる。凝集体形成及び分化のために多能性幹細胞を個別にするために使用できる酵素は、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥなどの様々なその市販製剤、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素の混合物を含み得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、多能性細胞は、本質的に個々の（又は分散した）細胞として、培養表面上での培養物形成のための培養培地に添加又は播種することができる。
【0096】
例えば、分散した多能性細胞を培養培地に播種することができる。これらの実施形態において、培養表面は、当技術分野で標準的な無菌細胞培養方法と適合する本質的に任意の材料、例えば、非接着性表面から構成することができる。培養表面は、本明細書に記載されるようなマトリックス成分を追加的に含み得る。いくつかの実施形態において、マトリックス成分は、表面を細胞及び培地と接触させる前に、培養表面に適用することができる。
【0097】
コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、及びマトリゲルなどの基質を、分化を誘導するために使用することができる。分化は、増殖を再開始することなく（すなわち、ニューロスフェアが分離することなく）、増殖誘導成長因子の存在下で細胞を懸濁液中に放置することによっても誘導することができる。
【0098】
いくつかの実施形態において、細胞は、培養培地中の固定基質上で培養する。次いで、増殖誘導成長因子を細胞に投与することができる。増殖誘導成長因子は、細胞を基質（例えば、ポリオルニチン処理プラスチック又はガラス）に付着させ、平坦化し、異なる細胞型への分化を開始させることができる。
【0099】
Ｂ．ドーパミン作動性ニューロン
中脳のドーパミン作動性ニューロンは、哺乳動物中枢神経系におけるドーパミン（ＤＡ）の主な供給源である。それらの喪失は、最も顕著な人間の神経疾患の１つであるパーキンソン病（ＰＤ）に関連している。いくつかの実施形態において、ドーパミン作動性ニューロンは、国際公開第２０１３０６７３６２号パンフレット；同第２０１３１６３２２８号パンフレット；同第２０１２０８０２４８号パンフレット；又は同第２０１１１３０６７５号パンフレットに記載されているように生成することができる。
中脳のドーパミン作動性ニューロンは、哺乳動物中枢神経系におけるドーパミン（ＤＡ）の主な供給源である。それらの喪失は、最も顕著な人間の神経疾患の１つであるパーキンソン病（ＰＤ）に関連している。いくつかの実施形態において、ドーパミン作動性ニューロンは、国際公開第２０１３０６７３６２号パンフレット；同第２０１３１６３２２８号パンフレット；同第２０１２０８０２４８号パンフレット；又は同第２０１１１３０６７５号パンフレットに記載されているように生成することができる。
【0100】
いくつかの実施形態において、以下の方法を使用して、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを生成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、米国特許出願公開第２０１２／０２７６０６３号明細書の方法を使用して、多能性幹細胞からニューロンを生成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβを、凝集体形成の開始前（細胞がまだ接着培養物中にある間）にｉＰＳ細胞などの多能性細胞を培養するために使用される培地から取り出すことができ（例えば、ＴｅＳＲ又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地などの規定培地から取り出し）、次いで、これを使用して、多能性細胞のニューロン分化を促進することができる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳ細胞をＴｅＳＲ増殖因子の非存在下で「プライミング」する、すなわち、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を有していない任意の培地で培養すると、凝集体形成前の数日間、細胞は、純度、迅速性、及び一貫性を有する神経系統に発達し得る。ニューロンを生成するための他の方法には、Ｚｈａｎｇら（２０１３）、米国特許第７，８２０，４３９号明細書、国際公開第２０１１／０９１０４８号パンフレット、米国特許第８，１５３，４２８号明細書、同第８，２５２，５８６号明細書、及び同第８，４２６，２００号明細書が含まれる。いくつかの態様において、単一ＳＭＡＤ又は二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、ｉＰＳＣをＤＡニューロンに分化させることができる。
【0101】
いくつかの態様において、多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を中脳ドーパミン作動性細胞などの神経細胞に変換する方法において、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤又は単一のＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤のいずれかが、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害するために使用される。例えば、いくつかの態様において、多能性細胞は、中脳ＤＡニューロンを含む神経細胞の集団に変換され、分化が、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含む培地中で起こる。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン、又はＤＭＨ－１である。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例には、ドルソモルフィン、ドミナントネガティブＢＭＰ、切断型ＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体－Ｆｃキメラ、ノギン、ＬＤＮ－１９３１８９、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン、及びアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、又は他の遺伝的方法を使用して、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。本明細書で使用される場合、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、単に「ＢＭＰ阻害剤」を指し得る。ＢＭＰ阻害剤は、分化の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び／又は１７日目に、又はその中で導出可能な任意の範囲（例えば、１～１７日目、１～１６日目、１～１５日目、２～１５日目など）に分化培地に含めることができる。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、分化の１～１７日目のすべての日で分化培地に含められる。それにもかかわらず、ＢＭＰ阻害剤を特定の時間、例えば上記の日の１日目、２日目、又は３日目に分化培地から取り除くことが可能であり得ると予想される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、任意選択により、１１～１７日目の分化培地に含められず、いくつかの好ましい実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、１～１０日目の分化培地に含められる。
【0102】
いくつかの態様において、多能性細胞を単一ＳＭＡＤ法を用いて、約３６０～４５６時間、より好ましくは約３８４～４３２時間の期間分化させて神経系細胞の培養物を生成した。単一ＳＭＡＤ法では、多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を中脳ドーパミン作動性細胞などの神経細胞に変換する方法において、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤又は単一のＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤などの単一のＳＭＡＤ阻害剤を使用してＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する。一般に、他の二重ＳＭＡＤ分化法とは対照的に、単一ＳＭＡＤ分化法は、単一のＳＭＡＤ阻害剤のみを利用し、第２のＳＭＡＤ阻害剤は、分化培地に含めない。例えば、いくつかの態様において、多能性細胞は、中脳ＤＡニューロン前駆細胞を含むニューロン前駆細胞の集団に変換され、分化が、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含む培地中で起こる。
【0103】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン、ＤＭＨ－１、又はノギンである。例えば、細胞は、約１～２５００、１～２０００、又は１～１，０００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（例えば、約１０～５００、５０～５００、５０～３００、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、又は約２５００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９、又はその中で導出可能な任意の範囲）を含む培地で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、約０．１～１０μＭのドルソモルフィン（例えば、約０．１～１０、０．５～７．５、０．７５～５、０．５～３、１～３、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、又は約２μＭのドルソモルフィン、又はその中で導出可能な任意の範囲）を含む培地で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、約１μＭのＤＭＨ－１（例えば、約０．２～８、０．５～２、又は約１μＭのＤＭＨ－１、又はその中で導出可能な任意の範囲）を含む培地で培養することができる。以下の実施例に示されるように、ＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン、及びＤＭＨ－１はいずれも、ｉＰＳ細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成する単一ＳＭＡＤ阻害法での使用に成功している。
【0104】
いくつかの態様において、ＴＧＦβ阻害剤を、単一のＳＭＡＤ阻害剤として使用してＳＭＡＤを阻害し、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、分化培地は、少なくとも第１のＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例には、Ａ－８３－０１、ＧＷ６６０４、ＩＮ－１１３０、Κｉ２６８９４、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７（ＨＴＳ－４６６２８４）、Ａ－８３－０１、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５７３６３６、ＬＹ５８０２７６、ＮＰＣ－３０３４５、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＤ－０９３、Ｓｍｌ６、ＳＭ３０５、ＳＸ－００７、Ａｎｔｐ－Ｓｍ２Ａ、及びＬＹ２１０９７６１が含まれる。例えば、分化培地中のＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２であり得る。いくつかの態様において、細胞は、約０．１～１００μＭのＳＢ４３１５４２（例えば、約１～１００μＭ、１０～８０μＭ、１５～６０μＭ、２０～５０μＭ、又は約４０μＭのＳＢ４３１５４２）を含む培地中で培養される。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含むＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、単に「ＴＧＦβ阻害剤」と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ阻害剤は、分化培地に含められない。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）は、単一のＳＭＡＤ阻害剤として、１～３日目、又は１日目、２日目、３日目、及び／若しくは４日目に分化培地に含められる。以下の実施例に示されるように、いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤が単一のＳＭＡＤ阻害剤として使用されるのは、これらの化合物が、ＴＧＦβ阻害剤の使用と比較して、多能性細胞の中脳ＤＡニューロンへの優れた分化を生じさせることが観察されたためである。
【0105】
いくつかの態様において、ＭＥＫ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ阻害剤又は単一のＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを産生させるために分化培地に含められる。いくつかの実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である。使用できるＭＥＫ阻害剤の非限定的な例には、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＭＥＫ１６２、コビメチニブ、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１７３０７４、ＢＩＸ０２１８９、ＡＺＤ８３３０、及びＰＤ９８０５９が含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、この方法は、約０．１～１０μＭ（例えば、約０．１～５、０．５～３、又は０．５～１．５μＭ）のＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤の存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、分化の３日目、４日目、５日目、又は３～５日目にＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）と接触させる。
【0106】
いくつかの実施形態において、中脳ＤＡニューロン前駆細胞は、以下を含む方法によって生成することができる：多能性細胞の集団を得ること；ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）を含む培地中で細胞を神経系統細胞集団に分化させること（培地は、分化の１日目に外部から添加されるＦＧＦ８ｂを含まない）；及び神経系統細胞集団の細胞をさらに分化させて、中脳ＤＡニューロンの濃縮された集団を提供すること。いくつかの実施形態において、１日目の分化培地中へＦＧＦ８（例えば、ＦＧＦ８ｂ）を含めることは、いくつかの例において、中脳ＤＡニューロン前駆細胞への細胞の分化を阻害又は防止し得ることが観察された。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ８は、任意選択により、例えば、分化の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７日後、又はその中で導出可能な任意の範囲の後に分化培地に含めることができる。例えば、好ましくは、多能性細胞の接触が、１日目に分化培地中の単一のＳＭＡＤ阻害剤で開始される。
【0107】
いくつかの態様において、Ｗｎｔ活性化因子（例えば、ＧＳＫ３阻害剤）は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を生成するために、例えばＢＭＰ阻害剤又は単一のＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて分化培地に含められる。いくつかの実施形態において、多能性細胞を、中脳ＤＡニューロンを含む神経細胞の集団に分化させ、この分化は、少なくともＷｎｔシグナル伝達の第１の活性化因子を含む培地中である。
【0108】
様々なＷｎｔ活性化因子又はＧＳＫ３阻害剤を、本開示の様々な態様において使用することができる。例えば、ＷＮＴシグナル伝達の活性化因子は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤であり得る。ＧＳＫ３阻害剤の非限定的な例には、ＮＰ０３１１１２、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＳＢ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、及びＣＨＩＲ９９０２１が含まれる。いくつかの実施形態において、多能性細胞を、ＳＢ４１５２８６ではない単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。したがって、いくつかの態様において、実施形態による使用のための培地は、約０．１～約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（例えば、約０．１～５、０．５～５、０．５～３、約１．２５超～２．２５、約１．２５、１．５、１．５５、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．９、２．０、又は約１．７５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、又はその中で導出可能な任意の範囲）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、約１．６～１．７μＭ又は約１．６５μＭのＣＨＩＲ９９０２１が使用される。
【0109】
いくつかの態様において、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成するために、例えばＢＭＰ阻害剤又は単一のＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて、分化培地に含められる。いくつかの実施形態において、ソニック・ヘッジホッグ活性化因子は、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）又は変異Ｓｈｈである。Ｓｈｈは、例えば、ヒト又はマウスのタンパク質であり得、又はヒト又はマウスのＳｈｈに由来し得る。例えば、いくつかの実施形態において、Ｓｈｈは、マウスＣ２５ＩＩ Ｓｈｈ又はヒトＣ２４ＩＩ Ｓｈｈなどの変異マウスＳｈｈタンパク質である。いくつかの実施形態において、分化培地は、Ｓｈｈ（例えば、Ｃ２５ＩＩ Ｓｈｈ）及びＳＨＨの低分子活性化因子、例えば、プルモルファミンなどの両方を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ソニック・ヘッジホッグのＳｈｈ及び／又は活性化因子は、神経底板（ｎｅｕｒａｌ ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ）の分化を促進し得る。
【0110】
ｉＰＳ細胞を含む多能性細胞由来の神経細胞型の培養物も市販されており、購入することができる。例えば、ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎｓ、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ、及びｉＣｅｌｌ（登録商標）Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓは、ヒトｉＰＳ細胞に由来し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入することができる。ｉＣｅｌｌ（登録商標）ニューロンは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロンであり、天然のヒトニューロンに特徴的な生化学的、電気生理学的、及び病態生理学的特性を示す。ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎｓは、その高純度、機能的関連性、及び使いやすさにより、基礎研究や医薬品開発の多くの分野における神経生物学の調査に非常に有用なインビトロ試験システムである。
【0111】
いくつかの実施形態において、規定培地（すなわち、組織、フィーダー細胞、又は細胞馴化培地を含まない培地）を使用して、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞からニューロン又は星状細胞を生成することができる。
【0112】
神経系細胞は、いくつかの表現型基準に従って特徴付けることができる。基準には形態学的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出又は定量化、酵素活性、神経伝達物質とその受容体、及び電気生理学的機能が含まれるが、これらに限定されない。
【0113】
いくつかの実施形態において、モデルは、マイクロ流体デバイス内に提供することができる。インビトロ血管モデルの形態を含む、細胞の支持に有用な様々なマイクロ流体デバイスの構成が当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５３２０７号明細書及び米国特許出願公開第２０１４／００３８２７９号明細書を参照されたい。一般に、本明細書で教示される血液脳関門モデルを含むマイクロ流体デバイスは、内皮細胞層及び神経細胞層が、モデルの内皮細胞層と流体接触する第１のチャンバー又は開口部と、モデルの神経細胞層と流体接触する第２のチャンバー又は開口部との間の境界を画定するように、血液脳関門モデルをその中に受け入れるような寸法のチャンバーを含み得る。流体は、培地や緩衝液などの液体であってもよい。このデバイスは、各チャンバーの流体入口及び流体出口、それらに接続された流体リザーバ（例えば、培地リザーバ）などをさらに含み得る。
【0114】
いくつかの実施形態において、細胞培養に使用される細胞は、健康なドナーから得られた細胞から生成されたｉＰＳ細胞から生成される。他の実施形態において、ドナーは疾患を有する。例えば、いくつかの実施形態において、ドナーは、神経学的又は神経変性疾患などの疾患、例えば、てんかん、自閉症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、ハンチントン病、家族性てんかん、統合失調症、家族性アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、遺伝性痙性不全対麻痺、白質ジストロフィー、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、ウィルソン病、依存障害、抑うつ、又は気分障害などを有する。この疾患は、遺伝性疾患又は特定の神経疾患に対する遺伝的感受性の増加であり得る。さらに、本明細書では、本細胞培養モデルを用いて神経炎症を研究するためのアッセイが提供される。
【0115】
細胞は、一般に、フラスコ、６ウェル、２４ウェル、又は９６ウェルプレートなどの組織培養プレートなどの適切な培養容器に播種される。細胞を培養するために使用される培養容器には、特に限定されないが：内部で幹細胞を培養できるのであれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトルが含まれ得る。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積で培養され得る。特定の実施形態において、培養容器は、バイオリアクターであってもよく、これは、細胞が増殖できるように生物学的に活性な環境をサポートするエクスビボの任意のデバイス又はシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも、又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積を有し得る。
【0116】
Ｃ．遺伝子破壊
特定の態様において、ＳＮＣＡ、ＧＢＡ又はＬＲＲＫ２遺伝子の発現、活性又は機能は、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣ）などの細胞において破壊される。いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ノックアウト、挿入、ミスセンス又は二対立遺伝子フレームシフト変異などのフレームシフト変異、遺伝子の全部又は一部、例えば１つ以上のエクソン又はその部分の欠失及び／又はノックインなどの遺伝子の破壊をもたらすことによって実行される。例えば、破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ及び遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む配列特異的又は標的ヌクレアーゼによって行うことができる。
特定の態様において、ＳＮＣＡ、ＧＢＡ又はＬＲＲＫ２遺伝子の発現、活性又は機能は、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣ）などの細胞において破壊される。いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ノックアウト、挿入、ミスセンス又は二対立遺伝子フレームシフト変異などのフレームシフト変異、遺伝子の全部又は一部、例えば１つ以上のエクソン又はその部分の欠失及び／又はノックインなどの遺伝子の破壊をもたらすことによって実行される。例えば、破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ及び遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む配列特異的又は標的ヌクレアーゼによって行うことができる。
【0117】
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊は、遺伝子を破壊することによって実行される。いくつかの態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子破壊の非存在下又は破壊をもたらすために導入された成分の非存在下での発現と比較して少なくとも又は約２０、３０又は４０％、一般に少なくとも又は約５０、６０、７０、８０、９０又は９５％減少するように破壊される。
【0118】
いくつかの実施形態において、破壊は、一過性又は可逆的であり、その結果、遺伝子の発現は、後に回復する。他の実施形態において、破壊は、可逆的又は一過性ではなく、例えば永続的である。
【0119】
いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、典型的には、標的化された方法において、遺伝子における１つ以上の二本鎖切断及び／又は１つ以上の一本鎖切断の誘導によって実行される。いくつかの実施形態において、二本鎖又は一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えばエクソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、誘導は、コード領域のＮ末端部分の近く、例えば第１のエクソン、第２のエクソン又は後続のエクソンで発生する。
【0120】
いくつかの態様において、二本鎖又は一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）などによる細胞修復プロセスを介して修復を受ける。いくつかの態様において、修復プロセスは、エラーが発生しやすく、フレームシフト突然変異、例えば二対立遺伝子フレームシフト変異などの遺伝子の破壊をもたらし、これは、遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、変異及び／又は挿入を誘発することを含む。いくつかの実施形態において、破壊は、早期停止コドンの存在をもたらす。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異及び／又は未成熟終止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊をもたらす。
【0121】
いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）及び／又はリボザイムなどによるアンチセンス技術を使用して達成されて、遺伝子の発現を選択的に抑制又は阻止する。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列と、ヌクレオチド配列に相補的な配列とを有する二本鎖ＲＮＡ分子を用いたＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、又は異なる領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロン構築物に含まれる。特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡからの野生型及び変異体タンパク質の翻訳の両方を抑制する。
【0122】
いくつかの実施形態において、破壊は、遺伝子に特異的に結合又はハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質若しくはＤＮＡ結合核酸などのＤＮＡ標的化分子又はそれを含む複合体、化合物若しくは組成物を使用して達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）又はＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン又はメガヌクレアーゼからのＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガー又はＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）を介して所定のヌクレオチド配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー又はＴＡＬＥ）は、非天然型のタンパク質である。設計の合理的な基準には、既存のＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥ設計の情報及び結合データを格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルール及びコンピューター化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット及び国際公開第０３／０１６４９６号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書も参照されたい。
【0123】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子、複合体又は組み合わせは、ＤＮＡ結合分子と、遺伝子の抑制又は破壊を促進するためのエフェクタードメインなどの１つ以上のさらなるドメインとを含む。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ＤＮＡ結合タンパク質及び異種調節ドメイン又はその機能的断片を含む融合タンパク質によって実行される。いくつかの態様において、ドメインには、例えば、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、癌遺伝子などの転写因子ドメイン、ＤＮＡ修復酵素並びにそれに関連する因子及び修飾因子、ＤＮＡ再配列酵素並びにそれに関連する因子及び修飾因子、クロマチン関連タンパク質並びにその修飾因子、例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ及びＤＮＡ修飾酵素、例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ並びにそれらに関連する因子及び修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；同第２００６／０１８８９８７号明細書及び同第２００７／０２１８５２８号明細書を参照されたい。いくつかの態様において、追加のドメインはヌクレアーゼドメインである。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ヌクレアーゼなどの非特異的ＤＮＡ切断分子と融合又は複合体化された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成される、ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ含有複合体又は融合タンパク質などの操作されたタンパク質を使用する遺伝子又はゲノム編集によって促進される。
【0124】
いくつかの態様において、これらの標的化キメラヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ含有複合体は、標的化された二本鎖切断又は一本鎖切断を誘導し、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）を含む細胞のＤＮＡ修復メカニズムを刺激することにより、正確な遺伝子改変を実行する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのエンドヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質などのＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。
【0125】
いくつかの実施形態において、ドナー核酸、例えばドナープラスミド又は遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸が提供され、ＤＳＢの導入に続く遺伝子編集の部位でＨＤＲによって挿入される。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子の破壊及び抗原受容体、例えばＣＡＲの導入は、同時に実行され、それにより、遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸のノックイン又は挿入によって部分的に破壊される。
【0126】
いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、提供されない。いくつかの態様において、ＤＳＢの導入後のＮＨＥＪ媒介修復は、例えば、ミスセンス変異又はフレームシフトを作製することにより、遺伝子破壊を引き起こし得る挿入又は欠失変異をもたらす。
【0127】
１．ＺＦＰ及びＺＦＮ
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む。例には、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮが含まれる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む。例には、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮが含まれる。
【0128】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又はそのドメインを含む。ＺＦＰ又はそのドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するより大きいタンパク質内のタンパク質又はドメインであり、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、その構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、よくジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略される。ＺＦＰの中には、個々のフィンガー組み立てによって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。
【0129】
ＺＦＰには、単一フィンガードメインがおよそ３０アミノ酸長であり、亜鉛を介して単一のベータターンの２つのシステインと配位した２つの不変ヒスチジン残基を含み、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのフィンガーを有するアルファヘリックスを含むものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックスの４つのヘリックス位置（－１、２、３、及び６）でアミノ酸置換を行うことによって変更され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ又はＺＦＰ含有分子は、非天然型、例えば選択された標的部位に結合するように操作される。
【0130】
いくつかの態様において、ＳＮＣＡの破壊は、遺伝子の第１の標的部位を第１のＺＦＰと接触させることによって実行され、それにより遺伝子を破壊する。いくつかの実施形態において、遺伝子の標的部位は、６つのフィンガー及び調節ドメインを含む融合ＺＦＰと接触し、それにより遺伝子の発現を阻害する。
【0131】
いくつかの実施形態において、接触させるステップは、遺伝子内の第２の標的部位を第２のＺＦＰと接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、第１及び第２の標的部位は、隣接している。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＺＦＰは、共有結合している。いくつかの態様において、第１のＺＦＰは、調節ドメイン又は少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。
【0132】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のＺＦＰは、それぞれ調節ドメインを含むか、又はそれぞれ少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、調節ドメインは、転写抑制因子、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又はヒストンデアセチラーゼである。
【0133】
いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸によってコードされる。いくつかの態様において、方法は、脂質：核酸複合体において又はネイキッド核酸として、核酸を最初に細胞に投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる。いくつかの態様において、ＺＦＰは、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる。
【0134】
いくつかの実施形態において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接する。
【0135】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するためにＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプｌｉＳ制限酵素からの切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含み、これらは、操作されていても又はされていなくてもよい。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、タイプｌｉＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド及び他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。
【0136】
いくつかの実施形態において、ＺＦＮは、操作された細胞に存在する遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ＺＦＮは、例えば、遺伝子のコード領域の所定の部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生成する。標的とされる典型的な領域には、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン及びプロモーター又はエンハンサー領域が含まれる。いくつかの実施形態において、ＺＦＮの一過性発現は、操作された細胞における標的遺伝子の高度に効率的且つ永続的な破壊を促進する。特に、いくつかの実施形態において、ＺＦＮの送達は、５０％を超える効率で遺伝子の永久的な破壊をもたらす。
【0137】
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共同でジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者がジンクフィンガーの構築及び検証を全体でバイパスできるようにし、数千のタンパク質に特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態において、市販のジンクフィンガーが使用されるか又はカスタム設計される。
【0138】
２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質など、天然型の又は操作された（非天然型の）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質など、天然型の又は操作された（非天然型の）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。
【0139】
ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン又はＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥの同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「リピートユニット」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピートユニットは、典型的には、リピートの１２及び／又は１３位において、リピート可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つ又は２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識の天然の（標準的な）コードは、１２位及び１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）に結合し、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧ又はＡに結合し、ＮＯがＴに結合するように決定されており、非標準（非典型）ＲＶＤも知られている。米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって任意の遺伝子を標的とし得る。標的配列は、一般的にチミジンで始まる。
【0140】
いくつかの実施形態において、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメインと、核酸標的配列を切断するためのヌクレアーゼ触媒ドメインとを含む融合タンパク質である。
【0141】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、遺伝子中の標的配列を認識し、切断する。いくつかの態様において、ＤＮＡの切断は、二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様において、切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは、切断部位でのＤＮＡ配列の変化につながることの多い不完全な修復プロセスである。いくつかの態様において、修復メカニズムは、直接の再ライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９８）又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介して２つのＤＮＡ末端の残りを再結合することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪを介した修復は、小さい挿入又は欠失をもたらし、それを使用して遺伝子を破壊し、それにより遺伝子を抑制することができる。いくつかの実施形態において、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失又は付加であり得る。いくつかの態様において、切断誘導性変異誘発イベント、すなわちＮＨＥＪイベントに続く変異誘発イベントが発生した細胞は、当技術分野で周知の方法によって同定及び／又は選択することができる。
【0142】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的とするように組み立てられる。１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築された。カスタム設計のＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。
【0143】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入される。いくつかの態様において、プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞の同定及び／又は選択を提供する選択マーカーを含み得る。
【0144】
３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）
いくつかの実施形態において、破壊は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した破壊など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を使用して実行される。例えば、破壊は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行することができる。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的なダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも呼ばれる）及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を指示する転写物及び他のエレメントを総称して指す。
いくつかの実施形態において、破壊は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した破壊など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を使用して実行される。例えば、破壊は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行することができる。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的なダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも呼ばれる）及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を指示する転写物及び他のエレメントを総称して指す。
【0145】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムには、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ及びヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を備えたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含めることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、タイプＩ、タイプＩＩ又はタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来し得る。
【0146】
いくつかの態様において、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡ及び固定化ｔｒａｃｒＲＮＡの融合物を含む）が細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位により、相補的な塩基対を使用してＣａｓヌクレアーゼが標的部位、例えば遺伝子を標的とする。標的部位は、典型的には、ＮＧＧ又はＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の直接５’の位置に基づいて選択することができる。この点において、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１又は１０ヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列に対応するように修飾することにより、所望の配列を標的とする。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は、必ずしも必要ではない。
【0147】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発し、その後、本明細書で説明するような破壊を引き起こし得る。他の実施形態において、「ニッカーゼ」と見なされるＣａｓ９バリアントを使用して、標的部位で一本鎖にニックを入れる。対のニッカーゼは、例えば、特異性を改善するために使用することができ、ニックを同時に導入すると５’オーバーハングが導入されるように、配列を標的とする異なるｇＲＮＡの対によってそれぞれ指向される。他の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、転写リプレッサー又はアクチベーターなどの異種エフェクタードメインに融合されて、遺伝子発現に影響を与える。
【0148】
標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の小器官内など、細胞の核又は細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列又はテンプレートは、「編集テンプレート」、又は「編集ポリヌクレオチド」、又は「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれ得る。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。
【0149】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成は、標的配列内又はその近く（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０又はそれを超える数の塩基対内）の一方又は両方の鎖の切断をもたらす。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部又は一部を含むか又はそれからなり得るｔｒａｃｒ配列（例えば、約２０以上、約２６以上、約３２以上、約４５以上、約４８以上、約５４以上、約６３以上、約６７以上、約８５以上又はそれを超えるヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒ配列）は、ガイド配列に動作可能に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全部又は一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対する相補性（最適にアラインされた場合のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列相補性など）を有する。
【0150】
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように細胞に導入することができる。成分は、タンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達することもできる。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。代わりに、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを単一のベクターに組み合わせ、１つ以上のさらなるベクターが第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の成分を提供し得る。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１つ以上の挿入部位を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化し得る。
【0151】
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体又はそれらの改変バージョンが含まれる。これらの酵素は、公知であり、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２に見出され得る。
【0152】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内及び／又は標的配列の補体内などの標的配列の位置で一方又は両方の鎖の切断を指示することができる。ベクターは、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができる。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えばＤＮＡ標的のセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用することができる。
【0153】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない、哺乳動物などの特定の生物のもの又はそれに由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドンを、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することにより、目的の宿主細胞における発現を強化するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で選択されたｔＲＮＡが支配的であるのは、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。
【0154】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するために、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上又はそれを超える。
【0155】
最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。
【0156】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列及び任意選択により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例には、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが含まれる。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むが、これらに限定されない他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合させ得る。
【0157】
Ｄ．分化培地
細胞は、細胞の特定の各集団の成長をサポートするために必要な栄養素で培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源及びｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地で培養される。培地には、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、ｐＨ指示薬及び無機塩を含めることもできる。例示的な増殖培地は、幹細胞の成長を強化するために、非必須アミノ酸及びビタミンなどの様々な栄養素が補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含む。最小必須培地の例には、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地及びＦ１２培地が含まれるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地にウマ、仔ウシ又はウシ胎児血清などの添加剤を補充し得る。代わりに、培地は、無血清であり得る。他の場合、増殖培地は、培養において幹細胞などの未分化細胞を増殖及び維持するように最適化された無血清製剤として本明細書で呼ばれる「ノックアウト血清置換」を含み得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書に開示されている。好ましくは、ＰＳＣは、フィーダーフリーの完全規定培地で培養される。
細胞は、細胞の特定の各集団の成長をサポートするために必要な栄養素で培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源及びｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地で培養される。培地には、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、ｐＨ指示薬及び無機塩を含めることもできる。例示的な増殖培地は、幹細胞の成長を強化するために、非必須アミノ酸及びビタミンなどの様々な栄養素が補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含む。最小必須培地の例には、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地及びＦ１２培地が含まれるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地にウマ、仔ウシ又はウシ胎児血清などの添加剤を補充し得る。代わりに、培地は、無血清であり得る。他の場合、増殖培地は、培養において幹細胞などの未分化細胞を増殖及び維持するように最適化された無血清製剤として本明細書で呼ばれる「ノックアウト血清置換」を含み得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書に開示されている。好ましくは、ＰＳＣは、フィーダーフリーの完全規定培地で培養される。
【0158】
いくつかの実施形態において、培地は、血清の任意の代替物を含んでも又は含まなくてもよい。血清の代替物には、アルブミン（脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール又はその均等物を適切に含有する材料を含めることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。代わりに、より便宜的には、市販の材料を使用することもできる。市販の材料には、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＳＲ）、組成が既知である脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
【0159】
他の培養条件は、適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃、例えば少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、特にそれらに限定されない。一実施形態において、細胞は、３７℃で培養される。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、例えば約２～５％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとも最大又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。
【0160】
本開示の特定の態様による分化培地は、動物細胞の培養に使用される培地をその基礎培地として使用して調製することができる。いくつかの実施形態において、分化培地を使用して、単一のＢＭＰ阻害剤又は単一のＴＧＦ－β阻害剤のみを用いて、多能性細胞を中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞（例えば、Ｄ１７細胞）に分化させる。例えば、多能性細胞の分化（例えば、中脳ドーパミン作動性前駆細胞への分化）を促進するために使用される分化培地は、単一のＢＭＰ阻害剤（ＬＤＮ－１９３１８９又はドルソモルフィンなど；例えば、分化の１～１７日目）；ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子（プルモルファミン、ヒトＣ２５ＩＩ ＳＨＨ、又はマウスＣ２４ＩＩ ＳＨＨなど；例えば、１～６、２～７、又は１～７日目）；Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子（ＧＳＫ阻害剤など、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１；例えば、２～１７又は３～１７日目）、及び／又はＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１など；例えば、２～４又は３～５日目）を含み得る。いくつかの実施形態において、単一のＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ－４３１５４２など；例えば、１～４日目）は、単一のＢＭＰ阻害剤の代わりに使用することができるが；いくつかの実施形態において、単一のＢＭＰ阻害剤は、単一のＴＧＦ－β阻害剤の使用と比較して、細胞のＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞への優れた分化をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－８（例えば、ＦＧＦ－８ｂ）は、最初の日又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日目、又はそれらの任意の組み合わせの日（例えば、１～８日目）に分化培地に含められず；例えば、いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－８は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７日目、又はそれらの任意の組み合わせの日に分化培地に含められる。様々な実施形態において、分化培地は、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦを含んでもよく、或いは、分化培地は、本質的にＴＧＦβ及びｂＦＧＦを含まなくてもよい。
【0161】
特定の態様において、実施形態による分化の方法は、例えば細胞が、
－ 単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地中の接着培養物において；
－ 単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地中の懸濁液（細胞凝集体が形成される）において；
－ 成熟のために、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－グルタミン、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、及びＤＡＰＴ（及び任意選択により、外部から添加されるレチノール又はレチノイン酸を欠く）を含む神経基底培地中での接着培養物において、培養される様々な培地条件による細胞の継代を含む。
－ 単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地中の接着培養物において；
－ 単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地中の懸濁液（細胞凝集体が形成される）において；
－ 成熟のために、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－グルタミン、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、及びＤＡＰＴ（及び任意選択により、外部から添加されるレチノール又はレチノイン酸を欠く）を含む神経基底培地中での接着培養物において、培養される様々な培地条件による細胞の継代を含む。
【0162】
基礎培地としては、任意の化学的に規定された培地、例えば、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ １６４０、及びフィッシャー培地、それらの変種又は組み合わせを使用することができ、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦを含んでもよいし、含まなくてもよい。
【0163】
さらなる実施形態において、細胞分化環境は、サプリメント、例えば、Ｂ－２７サプリメント、インスリン、トランスフェリン、及びセレン（ＩＴＳ）サプリメント、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２サプリメント（５μｇ／ｍＬのインスリン、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭのセレン、１００μＭのプトレシン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ， ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９７９ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６，５１４－５１７）、及び／又はβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）も含み得る。フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、レチノイン酸を含むが、これらに限定されない追加の因子を添加してもよいし、添加しなくてもよいことが企図される。
【0164】
成長因子は、分化培地に添加してもよいし、添加しなくてもよい。上記に概説した因子に加えて、又はその代わりに、成長因子、例えば、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ８を含む線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長及び分化因子（ＧＤＦ）ファミリーのアンタゴニストを、プロセスの様々なステップで使用することができる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－８は、本明細書に記載されるように分化培地に含められる。分化培地に付加されてもよいし、付加されなくてもよい他の因子には、デルタ様及びＪａｇｇｅｄファミリーのタンパク質、並びにガンマセクレターゼ阻害剤及びＤＡＰＴなどのＮｏｔｃｈプロセシング又は切断の他の阻害剤を含むが、これらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを介したシグナル伝達を活性化又は不活性化することができる分子が含まれる。他の成長因子には、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）、ｗｉｎｇｌｅｓｓ関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、及びヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーが含まれ得る。
【0165】
追加の因子を凝集体形成及び／又は分化培地に添加して、神経幹／前駆細胞の増殖及び生存、並びにニューロンの生存及び分化を促進することができる。これらの神経栄養因子には、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルディオトロフィン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長及び分化因子（ＧＤＦ）ファミリーのメンバー、ニュールツリン、ニューブラスチン／アルテミン、及びペルセフィンが含まれるが、これらに限定されない、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバー、及び肝細胞増殖因子に関連する因子及びこれを含む因子が含まれるが、これらに限定されない。最終分化して有糸分裂後ニューロンを形成する神経培養物はまた、５－フルオロ２’－デオキシウリジン、マイトマイシンＣ、及び／又はシトシンβ－Ｄ－アラビノ－フラノシド（Ａｒａ－Ｃ）を含むが、これらに限定されない、有糸分裂阻害剤又は有糸分裂阻害剤の混合物を含み得る。
【0166】
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地は、未処理又は未精製の血清を含まない培地を指すことがあり、したがって、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（成長因子など）を含有する培地を含み得る。異種動物由来成分の混入を防止するという観点から、血清は、幹細胞と同じ動物由来であり得る。いくつかの実施形態において、培地は、規定培地であり、培地は、血清又は他の動物組織由来成分（放射線照射マウス線維芽細胞、又は放射線照射線維芽細胞フィーダー細胞で馴化された培地など）を含まない。
【0167】
培地は、血清の代替品を含んでもよいし、含まなくてもよい。血清の代替物は、アルブミン（脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、及びタンパク質加水分解物など）、トランスフェリン（又は他の鉄トランスポーター）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、又はそれらに等価物を適切に含む材料を含み得る。例えば、血清の代替物は、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。或いは、より利便性を高めるために市販の物質を使用することもできる。市販の物質には、ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）及び化学的に規定された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
【0168】
培地には、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、及び無機塩も含まれ得る。２－メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５～１．０ｍＭ、特に約０．１～０．５、又は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０ｍＭ又は任意の中間値であり得るが、その濃度は、幹細胞の培養に適当である限り、特にこれらに限定されない。
【0169】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、神経誘導及び底板パターニングを改善するために凝集体形成の前に（例えば、凝集体形成を誘導するために単一細胞又は小さな凝集体に分離する前に）培地中で培養される。本発明の特定の実施形態において、幹細胞は、フィーダー細胞、フィーダー細胞抽出物、及び／又は血清の非存在下で培養され得る。
【0170】
Ｅ．培養条件
細胞の培養に使用される培養容器には、特に限定されないが、細胞を培養できる限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、スピナーフラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトルが含まれ得る。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、８００、１０００、１５００ｍｌ、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積で培養され得る。特定の実施形態において、培養容器はバイオリアクターであってもよく、これは、生物学的に活性な環境をサポートする任意のデバイス又はシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも、又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積を有する。
細胞の培養に使用される培養容器には、特に限定されないが、細胞を培養できる限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、スピナーフラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトルが含まれ得る。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、８００、１０００、１５００ｍｌ、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積で培養され得る。特定の実施形態において、培養容器はバイオリアクターであってもよく、これは、生物学的に活性な環境をサポートする任意のデバイス又はシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも、又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、又はその中で導出可能な任意の範囲の体積を有する。
【0171】
培養容器表面は、目的に応じて、細胞接着剤を用いて、又は用いずに調製することができる。細胞接着性培養容器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着用の任意の基材でコーティングして、細胞に対する容器表面の接着性を向上させることができる。細胞接着に使用される基材は、幹細胞又はフィーダー細胞（使用する場合）を接着することを目的とした任意の材料であり得る。細胞接着用の非限定的な基材には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチン、及びそれらの混合物、例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞由来のタンパク質混合物（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧｅｌｔｒｅｘなど）及び溶解細胞膜調製物（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００５）が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞接着性培養容器は、カドヘリンタンパク質、例えば上皮カドヘリン（Ｅ－カドヘリン）でコーティングされている。
【0172】
その他の培養条件は適宜定めることができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃、例えば、特に限定されないが、少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、例えば約２～７％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。酸素圧は、少なくとも又は約１、５、８、１０、２０％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。
【0173】
接着培養物は、特定の態様で使用することができる。必要に応じて、細胞は、フィーダー細胞の存在下で培養することができる。フィーダー細胞を用いる場合、胎児線維芽細胞などの間質細胞を、フィーダー細胞として使用することができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）；Ｍａｒｔｉｎ（１９８１）；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１）；Ｊａｉｎｃｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９６９）；Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）；Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８２）；及び国際公開第０１／０８８１００号パンフレット及び米国特許出願公開第２００５／０８０５５４号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、細胞培養培地に含められず、細胞は、規定条件を用いて培養することができる。
【0174】
他の態様において、懸濁培養物を使用することができる。使用できる懸濁培養物には、担体上の懸濁培養物（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）又はゲル／生体ポリマーカプセル化（米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号明細書）が含まれる。幹細胞の懸濁培養物は、一般に、培地中の培養容器又はフィーダー細胞（使用する場合）に関して非接着条件下での細胞（例えば、幹細胞）の培養を含む。幹細胞の懸濁培養物には、一般に、幹細胞の分離培養及び幹細胞の凝集懸濁培養物が含まれる。幹細胞の分離培養には、単一の幹細胞、又は複数の幹細胞（例えば、２～４００個程度の細胞）からなる幹細胞の小細胞凝集体などの懸濁幹細胞の培養が含まれる。分離培養を継続すると、培養して分離した細胞が、通常は、幹細胞のより大きな凝集体を形成し、その後、凝集懸濁培養物を生成又は利用することができる。凝集懸濁培養法には、胚様培養法（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照）及びＳＦＥＢ（無血清胚様体）法（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；国際公開第２００５／１２３９０２号パンフレット）が含まれる。
【0175】
特定の態様において、非静置培養は、多能性幹細胞の培養及び分化に使用することができる。非静置培養は、例えば、振とう、回転、又は攪拌プラットフォーム、又は培養容器、特に大容量回転バイオリアクターを使用することによって、細胞が制御された移動速度に保たれる任意の培養物であり得る。いくつかの実施形態において、ロッカーテーブルを使用することができる。撹拌は、栄養素及び細胞老廃物の循環を改善し、撹拌を使用して、より均一な環境を提供することによって細胞凝集を制御することもできる。例えば、回転速度は、少なくとも又は最大で約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００ｒｐｍ、又はその中で導出可能な任意の範囲に設定することができる。多能性幹細胞、細胞凝集体、分化幹細胞、又はそれらに由来する子孫細胞の非静置培養におけるインキュベーション期間は、少なくとも又は約４時間、８時間、１６時間、又は１、２、３、４、５、６日、又は１、２、３、４、５、６、７週間、又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。
【0176】
多能性幹細胞の培養のいくつかの実施形態において、培養容器が満杯になると、コロニーは、分離に適した任意の方法によって凝集細胞又は単一細胞にさえ分割され、次いで、これらの細胞は、継代のために新しい培養容器に入れられる。細胞継代又は分割は、細胞が、長期間わたって培養条件下で生存及び増殖できるようにする技術である。細胞は、典型的には、約７０％～１００％のコンフルエントである場合に継代されることになる。
【0177】
多能性幹細胞の単一細胞の分離とそれに続く単一の細胞継代は、細胞増殖、細胞分別、及び分化のための規定された播種を容易にし、培養手順及びクローン増殖の自動化を可能にするようないくつかの利点を備えた本方法で使用することができる。例えば、単一細胞からクローニングにより得られた子孫細胞は、遺伝的構造が均一であり得、且つ／又は細胞周期が同期し得、これにより標的の分化が促進され得る。単一細胞の継代の例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号明細書に記載されているであろう。
【0178】
Ｆ．凍結保存
本明細書に開示される方法によって産生された細胞は、ステージＩ、ステージＩＩ又はステージＩＩＩなどのプロセスの任意の段階で凍結保存することができ、例えば参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。細胞は、基質を伴って又は伴わずに凍結保存することができる。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲及びそれらの重複範囲である。いくつかの実施形態において、より低い温度は、凍結保存された細胞の貯蔵（例えば、維持）のために使用される。いくつかの実施形態において、液体窒素（又は他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態において、細胞は、約６時間を超えて保存される。さらなる実施形態において、細胞は、約７２時間保存される。いくつかの実施形態において、細胞は、４８時間～約１週間保存される。さらに他の実施形態において、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７又は８週間保存される。さらなる実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別個に又は本明細書に開示される基質のいずれかなどの基質上に凍結保存することができる。
本明細書に開示される方法によって産生された細胞は、ステージＩ、ステージＩＩ又はステージＩＩＩなどのプロセスの任意の段階で凍結保存することができ、例えば参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。細胞は、基質を伴って又は伴わずに凍結保存することができる。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲及びそれらの重複範囲である。いくつかの実施形態において、より低い温度は、凍結保存された細胞の貯蔵（例えば、維持）のために使用される。いくつかの実施形態において、液体窒素（又は他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態において、細胞は、約６時間を超えて保存される。さらなる実施形態において、細胞は、約７２時間保存される。いくつかの実施形態において、細胞は、４８時間～約１週間保存される。さらに他の実施形態において、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７又は８週間保存される。さらなる実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別個に又は本明細書に開示される基質のいずれかなどの基質上に凍結保存することができる。
【0179】
いくつかの実施形態において、追加の凍結防止剤を使用することができる。例えば、細胞は、ＤＭ８０などの１つ以上の凍結保護剤、ヒト又はウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンを含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。特定の実施形態において、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態において、溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％又は約８％～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はアルブミンを含む。特定の実施形態において、溶液は、２．５％のＤＭＳＯを含む。別の特定の実施形態において、溶液は、１０％のＤＭＳＯを含む。
【0180】
細胞は、例えば、凍結保存中に約１℃／分で冷却され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存温度は、約－８０℃～約－１８０℃又は約－１２５℃～約－１４０℃である。いくつかの実施形態において、細胞は、約１℃／分で冷却する前に４℃に冷却される。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施形態において、例えば細胞が約－８０℃に達すると、それらは、液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存は、コントロールレートフリーザーを使用して行うこともできる。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃～約４０℃の温度、典型的には約３７℃の温度で解凍され得る。
【0181】
ＩＩＩ．使用方法
本開示は、疾患関連変異を有するｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを生成する方法を提供する。これらは、いくつかの重要な研究、開発、及び商業目的に使用することができる。これらは、ほんの数例を挙げると、インビボでの細胞の移植又は埋入；細胞毒性化合物、発癌性物質、変異原性物質、成長／調節因子、医薬品化合物などのインビトロでのスクリーニング；薬物及び／又は成長因子が作用するメカニズムの研究；患者の癌の診断及びモニタリング；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な製品の生産であるが、これらに限定されない。
本開示は、疾患関連変異を有するｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを生成する方法を提供する。これらは、いくつかの重要な研究、開発、及び商業目的に使用することができる。これらは、ほんの数例を挙げると、インビボでの細胞の移植又は埋入；細胞毒性化合物、発癌性物質、変異原性物質、成長／調節因子、医薬品化合物などのインビトロでのスクリーニング；薬物及び／又は成長因子が作用するメカニズムの研究；患者の癌の診断及びモニタリング；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な製品の生産であるが、これらに限定されない。
【0182】
本明細書に提供される中脳ＤＡ前駆細胞（例えば、Ｄ１７細胞）は、本明細書に提供されるＤＡニューロンの特性に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチドなど）又は環境条件（培養条件又は操作など）のスクリーニングに使用することができる。
【0183】
いくつかの適用例では、幹細胞（分化又は未分化）を使用して、神経系統に沿った細胞の成熟を促進する因子、又は長期培養におけるそのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補となる神経成熟因子又は成長因子は、それらを異なるウェル内の幹細胞に添加し、次いで、細胞のさらなる培養及び使用のための望ましい基準に従って、結果として生じるあらゆる表現型の変化を決定することによって試験することができる。
【0184】
本明細書で提供される細胞培養物は、例えば、神経の分化若しくは生存に対する分子の効果の試験、又は毒性試験、又は神経若しくは神経機能に対する分子の効果の試験に使用され得る。これは、ニューロン活動、可塑性（例えば、長期増強）、又は機能に影響を与える化合物を同定するためのスクリーニングを含み得る。細胞培養は、神経幹細胞、神経前駆細胞又は分化神経細胞又は神経細胞型の生物学と相互作用し、それに影響を与える、新薬及び化合物の発見、開発及び試験に使用され得る。神経細胞はまた、軸索ガイダンス、神経変性疾患、神経可塑性並びに学習及び記憶を含むがこれらに限定されない、神経の発達及び機能不全の細胞及び分子基盤を同定するように設計された研究においても非常に有用である。このような神経生物学の研究は、これらのプロセスの新規分子成分を同定し、既存の薬剤及び化合物の新規用途を提供し、新たな薬剤標的又は薬剤候補を同定するために使用され得る。
【0185】
一部の適用例では、化合物を、その潜在的な神経毒性についてスクリーニング又は試験することができる。細胞毒性は、まず、細胞の生存率、生存、形態、又は培地への酵素の漏出に対する影響によって決定することができる。いくつかの実施形態において、化合物が毒性を引き起こすことなく細胞機能（神経伝達又は電気生理学など）に影響を及ぼすかどうかを決定するために試験が行われる。
【0186】
いくつかの実施形態において、１つ以上の特定の化合物を試験して、その化合物が疾患の処置に有益であり得る効果を有するかが決定され得る。機能活性に対する化合物の効果に基づいて、その化合物が疾患の処置に有用であり得るかを判断できる可能性がある。いくつかの実施形態において、細胞は、神経疾患又は神経変性疾患（例えば、自閉症、てんかん、ＡＤＨＤ、統合失調症、双極性障害など）などの疾患（例えば、遺伝性疾患、又は遺伝要素若しくは危険因子を伴う疾患）を有する対象からのｉＰＳ細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、神経培養物が疾患状態と同様の特性を示すように、第１の化合物又は毒素の存在下で培養され得る。これらの実施形態において、第２の化合物を細胞培養物に提供して、第２の化合物が第１の化合物又は毒素の影響を緩和又は低減できるかどうかが確認され得る。他の実施形態において、細胞培養物は、化合物が細胞培養物に対して毒性又は有害作用を生じるかどうかを決定するために使用され得る。
【0187】
例えば、１つ以上の候補薬剤が、様々な濃度で培養培地に添加され得る。細胞内で発現される目的のポリペプチドの発現を促進する薬剤は有用であると考えられる。このような薬剤は、例えば、神経発達又は神経機能の欠陥を特徴とする傷害、疾患又は障害を予防、遅延、改善、安定化、又は処置するための治療剤として使用され得る。同定された薬剤は、神経学的状態の処置又は予防に使用され得る。別の実施形態において、オルガノイドの細胞の活性又は機能が、候補化合物の存在下及び非存在下で比較される。細胞の活性又は機能を望ましく変更する化合物は、本方法において有用なものとして選択される。
【0188】
本方法において有用な薬剤は、当技術分野で公知の方法に従って、天然産物若しくは合成（又は半合成）抽出物の大きなライブラリー、又は化学物質ライブラリー、又はポリペプチド若しくは核酸ライブラリーから同定され得る。創薬及び開発の分野の当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な供給源が本発明の方法のスクリーニング手順にとって重要ではないことを理解するであろう。スクリーニングに使用される薬剤には、神経学的状態の処置のための治療剤として知られる公知の薬剤が含まれ得る。或いは、実質的に任意の数の未知の化学抽出物又は化合物を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることができる。このような抽出物又は化合物の例には、植物、真菌、原核生物又は動物ベースの抽出物、発酵ブロス、及び合成化合物、並びに既存のポリペプチドの改変物が含まれるが、これらに限定されない。
【0189】
細胞の機能活性を決定するためのアッセイは、生存アッセイ、ＧＢＡアッセイ、カルシウムアッセイ、ＭＥＡアッセイ、顕微鏡アッセイによるシナプス刈り込み、様々な経路のリン酸化中間体を追跡するシグナル伝達、正常な細胞型及び疾患特異的な細胞型を含む培養培地中に放出された分析物の分析を含み得る。例えば、アイソジェニック操作された細胞又は患者特異的な細胞をＡＨＮ対照と比較する疾患モデリング用途の場合、アミロイドベータ、ミエリン、シナプトソーム又はタウなどの神経発生性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）タンパク質への処置又は曝露により、カルシウムシグナル伝達及び電気活性が低下し、神経炎症性サイトカインが増加するであろう。例えば、これらの機能活性測定値のいずれかにおける増加（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を超える）は、候補薬剤を示し得る。
【0190】
いくつかの態様において、初期の病原性変化は、神経変性の発生に関連する遺伝子発現プロファイルの変化又は主にダウンレギュレーションを観察することによって定量化され得る。特定の態様において、神経炎症性サイトカインの放出に関連する免疫関連遺伝子のアップレギュレーションは、神経変性に関連するものとして測定され得る。
【0191】
アッセイはハイスループット方式で実施してもよい。例えば、細胞培養物は、潜在的な治療分子の同定のため、培養皿、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば、単一マルチウェルディッシュ又は８、１６、３２、６４、９６、３８４及び１５３６マルチウェルプレート又はディッシュなどのディッシュ）上に、任意選択により規定の位置に、配置する、又は置くことができる。スクリーニング可能なライブラリーには、例えば、小分子ライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリー、アデノウイルストランスフェクションベクターライブラリーが含まれる。スクリーニングプラットフォームは、ロボットによる自動化など、自動化することができる。培養プラットフォームは、自動細胞洗浄機及びハイコンテンツイメージャーを含み得る。
【0192】
いくつかの態様において、本アッセイにより、無菌細菌感染（リポ多糖（ＬＰＳ）曝露）、機械的損傷（引っかき傷）、及び発作活性（グルタミン酸誘導性興奮毒性）を模倣する異なる神経炎症性刺激に対する本細胞培養物の応答を定量化され得る。対照及びＬＰＳに曝露された培養物の分泌サイトカインプロファイルが測定され得る。
【0193】
本明細書に記載されるモデルは、薬剤の血液脳関門通過の薬力学的試験又は薬物動態試験のためなどの、化合物又は処置スクリーニング又は試験（例えば、有効性、毒性、又は他の代謝活性若しくは生理活性について）に使用され得る。このような試験は、本明細書に記載のモデルを、その産物の構成細胞を生存状態に維持する条件下（例えば、酸素添加された培地中）で提供すること；試験される化合物（例えば、薬剤候補）を細胞に適用する（例えば、内皮層への投与によって）こと；次いで、内皮層を通る化合物の浸透及び／又は他の生理学的反応（例えば、損傷、瘢痕組織形成、感染、細胞増殖、熱傷（ｂｕｍ）、細胞死、ヒスタミン放出などのマーカー放出、サイトカイン放出、遺伝子の変化など）を検出することによって実施され得、これは、前記化合物が血液脳関門を通過できるかどうか、及び／又は哺乳動物対象に全身的に（例えば、血管内に）送達された場合に脳内で治療効果、毒性、又は他の代謝活性若しくは生理活性を有するかどうかを示し得る。モデルの対照サンプルを同様の条件下で維持し、それに対照化合物（例えば、生理食塩水、複合ビヒクル又は担体）を適用して比較結果を得てもよく、又は過去のデータ若しくは試験化合物の希釈レベルなどの適用によって得られたデータとの比較に基づいて損傷を判定することができる。
【0194】
試験化合物が免疫活性を有するかどうかを判定する方法は、細胞モデルのＤＡニューロンによる、免疫グロブリン生成、ケモカイン生成及びサイトカイン生成の試験を含み得る。
【0195】
本明細書で教示されるモデルを用いて試験され得る血液脳関門（例えば、ヒト血液脳関門）を通過する方法には、異なる傍細胞密着結合の透過性、細胞層を通る受動拡散、受容体媒介性トランスサイトーシス、及び／又は細胞流出阻害が含まれるが、これらに限定されない。
【0196】
いくつかの実施形態において、モデルは、薬剤の血液脳関門通過の薬力学的試験又は薬物動態試験のためなどの、モデルの少なくとも一部の細胞が対象からのものである、対象の個別化試験（例えば、有効性、毒性、又は他の代謝活性若しくは生理活性について）に使用され得る。例えば、対象の線維芽細胞は、誘導多能性幹細胞（例えば、誘導多能性神経幹細胞）に指向され得、その後、その細胞は、モデル用の１つ以上の細胞型、例えば、神経細胞、オリゴデンドロサイト、内皮細胞、星状細胞、又はミクログリアに指向され得る。
【0197】
「神経変性疾患又は障害」及び「神経障害」という用語は、末梢神経系又は中枢神経系が主に関与する疾患又は障害を包含する。本明細書に提供される化合物、組成物、及び方法は、神経性又は神経変性疾患及び障害の処置に使用され得る。本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」、「神経変性障害」、「神経疾患」、及び「神経障害」という用語は、互換的に使用される。
【0198】
神経障害又は疾患の例には、糖尿病性末梢神経障害（第三神経麻痺、単神経障害、多発性単神経障害、糖尿病性筋萎縮症、自律神経障害及び胸腹部神経障害を含む）、アルツハイマー病、加齢に伴う記憶力低下、老衰、加齢に伴う認知症、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上性麻痺（Ｓｔｅｅｌ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ症候群）、多系統変性症（シャイ・ドレーガー症候群）、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）を含む運動ニューロン疾患、変性性運動失調、大脳皮質基底核変性症、グアムＡＬＳ－パーキンソン病－認知症複合、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症（「ＭＳ」）、シヌクレイノパチー、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病／脊髄小脳失調症３型及びオリーブ橋小脳変性症、ジル・ド・ラ・トゥレット病、球麻痺及び仮性球麻痺、脊髄及び球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルニッケ・コルサコフ関連認知症（アルコール誘発性認知症）、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルク・ヴェランダー病、テイ・サックス病、サンドホフ病、家族性痙性疾患、Ｗｏｈｉｆａｒｔ－Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ－Ｗｅｌａｎｄｅｒ病、痙性不全対麻痺、進行性多巣性白質脳症、並びにプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー病、クールー病、致死的家族性不眠症を含む）などの、慢性神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。本開示の方法にさらに含まれる他の症状には、加齢に伴う認知症及び他の認知症、並びに血管性認知症、びまん性白質疾患（ビンスワンガー病）、内分泌又は代謝起源の認知症、頭部外傷及びびまん性脳損傷による認知症、ボクサー認知症、及び前頭葉認知症を含む記憶喪失を伴う症状が含まれる。また、塞栓性閉塞及び血栓性閉塞を含む脳虚血又は脳梗塞、並びにあらゆる種類の頭蓋内出血（硬膜外、硬膜下、くも膜下、及び脳内を含むがこれらに限定されない）、及び頭蓋内及び椎体内の病変（挫傷、穿通、せん断、圧迫、及び裂傷を含むがこれらに限定されない）に起因する他の神経変性疾患も含まれる。したがって、この用語は、脳卒中、外傷性脳損傷、統合失調症、末梢神経損傷、低血糖、脊髄損傷、てんかん、並びに酸素欠乏症及び低酸素症を伴うものなどの、急性神経変性障害も包含する。
【0199】
Ａ．医薬組成物
本明細書では、本細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤も提供される。
本明細書では、本細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤も提供される。
【0200】
したがって、本発明による対象に投与するための細胞組成物は、化合物を、薬学的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、任意の従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。
【0201】
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する有効成分（細胞など）を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で１つ以上の任意選択による薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【0202】
Ａ．商業、治療及び研究目的での配布
いくつかの実施形態において、製造、流通又は使用中の任意の時間に存在する細胞を含む試薬システムが提供される。キットは、多くの場合に同じゲノムを共有する、未分化の多能性幹細胞又は他の分化された細胞型と組み合わせて、本開示に記載される細胞の任意の組み合わせを含み得る。各細胞型は、事業関係を共有する同じ主体又は異なる主体の制御下において、一緒に、又は同じ施設内の別々の容器に、又は異なる場所で同じ又は異なる時間にパッケージ化され得る。医薬組成物は、任意選択により、機構的毒性などの所望の目的のための書面による説明とともに適切な容器中にパッケージすることができる。
いくつかの実施形態において、製造、流通又は使用中の任意の時間に存在する細胞を含む試薬システムが提供される。キットは、多くの場合に同じゲノムを共有する、未分化の多能性幹細胞又は他の分化された細胞型と組み合わせて、本開示に記載される細胞の任意の組み合わせを含み得る。各細胞型は、事業関係を共有する同じ主体又は異なる主体の制御下において、一緒に、又は同じ施設内の別々の容器に、又は異なる場所で同じ又は異なる時間にパッケージ化され得る。医薬組成物は、任意選択により、機構的毒性などの所望の目的のための書面による説明とともに適切な容器中にパッケージすることができる。
【0203】
いくつかの実施形態において、例えば、細胞を産生するための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。試薬システムは、必要に応じて、水性媒体中又は凍結乾燥形態のいずれかにパッケージ化することができる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含み、その中に成分を入れ、好ましくは適切に分割し得る。キットに複数の成分が含まれる場合、キットには、一般に、追加の成分が別個に配置され得る第２、第３又は他の追加の容器も含まれる。ただし、成分の様々な組み合わせをバイアルに含め得る。キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒は、別の容器手段でも提供され得ることが想定される。本開示のキットは、典型的には、市販のためにキットの成分を密に閉じ込めて収容するための手段も含む。そのような容器は、所望のバイアルがその中に保持される、射出又はブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。キットには、印刷形式又はデジタル形式などの電子形式などの使用説明書を含めることもできる。
【実施例】
【0204】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることを当業者は理解すべきである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に対する多くの変更形態がなされ得、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることを当業者は理解すべきである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に対する多くの変更形態がなされ得、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【0205】
実施例１－ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンの生成及び特性評価
エピソームに再プログラムされたｉＰＳＣ ０１２７９を操作して、ヘテロ接合体（ＨＺ）ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異株を作製した（図１Ａ）。ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ ＨＺ（ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ）ｉＰＳＣを、ヌクレアーゼ媒介相同組換え及びドナーオリゴＳＪＤ １４－１３２（配列番号：１：ＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＴｇＧｔｇＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＣ）によってＡＨＮ ｉＰＳＣ０１２７９から遺伝子操作した。得られたｉＰＳＣには、アミノ酸５３がアラニンからスレオニンに変化したＳＮＰ ｒｓ１０４８９３８７７が含まれ、その結果、変異にＡ５３Ｔ変異体が生じて、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔヘテロ接合体ｉＰＳＣ株（ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ）になり、疾患α－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）及び２つのサイレント変異がＰＤにもたらされた。この操作は、図１Ｂに概略的に示され、アミノ酸５３のアラニンからスレオニンへの変化を黄色で強調表示して示している。
エピソームに再プログラムされたｉＰＳＣ ０１２７９を操作して、ヘテロ接合体（ＨＺ）ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ変異株を作製した（図１Ａ）。ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ ＨＺ（ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ）ｉＰＳＣを、ヌクレアーゼ媒介相同組換え及びドナーオリゴＳＪＤ １４－１３２（配列番号：１：ＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＴｇＧｔｇＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＣ）によってＡＨＮ ｉＰＳＣ０１２７９から遺伝子操作した。得られたｉＰＳＣには、アミノ酸５３がアラニンからスレオニンに変化したＳＮＰ ｒｓ１０４８９３８７７が含まれ、その結果、変異にＡ５３Ｔ変異体が生じて、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔヘテロ接合体ｉＰＳＣ株（ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ）になり、疾患α－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）及び２つのサイレント変異がＰＤにもたらされた。この操作は、図１Ｂに概略的に示され、アミノ酸５３のアラニンからスレオニンへの変化を黄色で強調表示して示している。
【0206】
次に、ＧＢＡ Ｎ３７０Ｓ変異を有するＰＤ患者からｉＰＳＣを得た。アスパラギン３７０のセリンへのアミノ酸変化は、図１Ｂに黄色で強調表示されている。ｉＰＳＣは、概略的に示されているＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を有するＰＤ患者に由来し、図１Ｃに黄色で強調表示されたグリシン２０１９のセリンへのアミノ酸変化を示している。各ｉＰＳ細胞株由来のＧバンド中期細胞の細胞遺伝学的解析を行って、正常な核型、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ、ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ）、及びＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）を詳述した（図１Ｄ～１Ｆ）。Ｇ分染核型決定を行い、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって分析した。
【0207】
時系列のｉＰＳＣからドーパミン作動性ニューロンへの分化プロセス及びそのプロセス全体を通して利用したサイトカインの概略図を図２Ａに示す。未分化ｉＰＳ細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングプレート上でフィーダーフリーで培養し、Ｅ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して維持した。ニューロンのパターニングを、Ｅ８培地を交換し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地［Ｎ２（１Ｘ）、Ｂ２７（－ｖｉｔＡ）（１Ｘ）ニューロンサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミン、及びＣＨＩＲ９９０２１を含む］を添加することによってＤ０に開始させた。５日目に、細胞を分離し、凝集体としてスピナーフラスコで培養した。この細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地［Ｎ２（１Ｘ）、Ｂ２７（－ｖｉｔＡ）（１Ｘ）、ニューロンサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＦＧＦ８を含む］で１２日間培養した。この細胞を１７日目に回収し、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１を染色することによりフローサイトメトリーによって評価した。細胞を、神経細胞成熟培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋神経系サプリメント及び神経サプリメントＢ（ＦＣＤＩ）及びＤＡＰＴ（Ｔｏｃｒｉｓ））で２０日間さらに成熟させ、３７日目に分離して凍結保存した。中脳転写因子ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１を発現する１７日目のドーパミン作動性前駆細胞の代表的なフローサイトメトリーのドットプロットを図２Ｂに示す。図２Ｃは、チロシンからのドーパミン合成に必要な酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）酵素及びＦＯＸＡ２を発現するプロセス終了時のドーパミン作動性ニューロンの代表的なフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【0208】
【表1】
【0209】
免疫蛍光染色を、末期ＤＡニューロンに対して行った（図３Ａ～３Ｂ）。凍結保存ＤＡニューロンを解凍し、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒイメージングプレートに２００Ｋ／ｃｍ２でプレーティングした。細胞を、解凍後３日目及び１４日目に、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。この細胞を、フルオレセイン標識二次抗体を用いて室温で１時間染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで２０分間対比染色して洗浄した。サンプルを、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で画像化した（図３Ｂ）。フローサイトメトリー解析を、ドーパミン作動性ニューロンにおけるＦＯＸＡ２及びＴＨタンパク質の定量化のために行った（図３Ｃ）。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットをプレーティングし、３日目と１４日目にＡｃｃｕｔａｓｅを用いて３７℃で１５分間回収した。細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能赤色死細胞染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、次いで、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。この細胞を、ＦＯＸＡ２及びＴＨ発現の存在のために染色し、細胞内フローサイトメトリーによって定量化した。
【0210】
ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ドーパミンの合成及び分解に関与する酵素の異常なｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現を示した（図４Ａ）。ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及びＣＯＭＴ転写レベルを、ＡＮＨ、操作された及びＰＤ患者由来のＤＡニューロンにおいて定量化した。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットをプレーティングし、解凍の１４日後に回収し、ペレットを、ＲＮＡ Ｓｅｑ解析のために提出した。（ＦＰＫＭ）値を用いた、ＤＡニューロンの複数のロットにわたるＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯＡ、及びＣＯＭＴ転写産物の定量化を解析した（図４Ｂ）。ＴＨ及びＤＤＣタンパク質レベルを、ＡＮＨ、操作された及びＰＤ患者由来のＤＡニューロンにおいて定量化した。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットをプレーティングし、解凍の１４日後に回収し、細胞溶解物を、ＴＨ（１：２５０、Ｔ２９２８ Ｓｉｇｍａ）、ＧＢＡ（１：１００、Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ４７１０）、ＤＤＣ（１：５００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢ３００－１７４）、ＭＡＰＴ（１：１０００、ＭＡＢ３６１ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてプローブしたキャピラリーにロードし、製造元の指示に従ってＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅシステムを用いてＴＨ及びＧＢＡタンパク質の存在を検出した。ＴＨ及びＤＤＣタンパク質を、各タンパク質の曲線下面積に基づいて定量化し、ＭＡＰＴ発現に対して正規化した。（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）（図４Ｃ）。
【0211】
ＧＢＡ及びＬＲＲＫ２ ＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ＫＣｌで刺激すると、より多くのドーパミンを放出した（図５Ａ）。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍して２１日間培養し、製造元の指示に従って、細胞から放出されるドーパミンのレベルを競合ドーパミンＥＬＩＳＡを用いて定量化した（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＯＰ３１－Ｋ０１）。３つの技術的反復を、生物学的サンプルごとに行った。検量線をＧｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭでグラフ化し、図５Ａに示した。ドーパミンの定量化を、対数（アゴニスト）対反応－可変勾配（４つのパラメーター）モデルを使用した非線形回帰を使用して行った。ＤＡニューロンのドーパミン放出を、ＨＢＳＳ緩衝液中での培養２１日目にＫＣＬで刺激した時にＡＨＮ ＤＡニューロンによって放出されるドーパミンと比較した（図５Ｂ）（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【0212】
ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、より高い細胞死及びミトコンドリアストレスを明らかにした（図６Ａ）。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、プレーティングした。ＤＡニューロンの経時的な生存率及びミトコンドリア酸化ストレスを、３８日間の培養での異なる時点での生細胞と死細胞を定量化するカルセインＡＭ及びＹＯＹＯ－３による生培養染色によって定量化した。１μＭのＹＯＹＯ－３ヨウ化物及びカルセインＡＭによる解凍の２１日後の末期ＤＡニューロンの代表的な染色を図６Ａに示す。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、９６ウェル光学プレートに１ウェルあたり６４，０００細胞の密度でプレーティングした。細胞を１μＭのＹＯＹＯ－３ヨウ化物及び１μＭのカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに室温で３０分間インキュベートし、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３で３０分ごとに３時間イメージングした（図６Ｂ）。生細胞／死細胞の割合を、緑と赤のチャネルの陽性オブジェクトに基づいて計算した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ緩衝液で溶解し、１分間振とうした後、１０分間インキュベートした。発光シグナルを捕捉し、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて定量化した。データは、９６ウェルプレートの１ウェル（０．１４３ｃｍ２）あたりの生細胞を示す。図６Ｃは、位相画像（中央の画像）及び生細胞についてＣａｌｃｅｉｎ ＡＭで共染色したＤＡニューロン（右の画像）と重ね合わせた、ＭｉｔｏＳＯＸ色素で染色したＤＡニューロン（左の画像）の代表的な画像を示す。
【0213】
ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、プレーティングした。ＭｉｔｏＳＯＸ ｒｅｄ（５μＭ）をニューロンに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＭｉｔｏＳＯＸを除去し、カルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｃ１４３０）をニューロンに添加し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３で３時間、３０分ごとにイメージングした。２μＭのロテノン（ミトコンドリア毒素）を陽性対照として使用した。陽性対照のニューロンを、ロテノンで３０分間、３７℃で処理し、続いて完全なニューロン培地で洗浄した。ＡＨＮニューロンと比較した、疾患ニューロンにおけるＭｉｔｏＳＯＸシグナル強度（平均±ＳＤ）及びＭｉｔｏＳＯＸ陽性細胞の割合の定量化を決定し、その結果をロテノンによって誘導されたミトコンドリアにおけるＲＯＳと比較した（図６Ｄ～６Ｅ）。
【0214】
ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者由来のＤＡニューロンは、著しく多いａＳｙｎタンパク質凝集を有していた（図７）。α－シヌクレインタンパク質凝集がＤＡニューロンで観察された。チオフラビン（Ｔｈ－Ｔ）染色を行って、２４時間のオリゴマーａＳｙｎ（４μＭ／ｍｌ）の添加後、２２ＤＩＶに生ＤＡニューロン培養上に凝集したａＳｙｎを明らかにした（図７Ａ）。すべてのａＳｙｎ＋細胞をカウントし、異なる発現ビンにおける個々のニューロンのＴｈ－Ｔシグナル強度に対してプロットした（図７Ｂ）。Ｔｈ－Ｔ画像を、活性オリゴマーａＳｙｎで２４時間、４８時間、又は７２時間処理した培養２１日目に定量化した（ｎ＝４、ダネット多重比較検定による一元配置分散分析）（図７Ｃ）。α－シヌクレインタンパク質凝集アッセイ（Ｔｈ－Ｔ染色）では、細胞を、Ｔｈ－Ｔ染色のために９６ウェルプレートに１ウェルあたり６４Ｋの密度で播種した。２１日目に、解凍後細胞を４ｕｇ／ｍｌの組換えマウスα－シヌクレインタンパク質凝集体（Ａｃｔｉｖｅ）（Ａｂｃａｍ，ａｂ２４６００２）で２４時間、４８時間、及び７２時間処理し、次いでチオフラビンＴで染色した。チオフラビンＴ（Ｔｈ－Ｔ）（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２０７５１）をＨＢＳＳに溶解した（Ｔｈ－Ｔは３７℃で８ｍｇ／ｍｌ（２ｍＭ）の濃度で完全に溶解した）。細胞を、培養培地でＴｈ－Ｔ色素（最終濃度１０μＭ）及びヨウ化ＹＯＹＯ－３（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ－Ｙ３６０６ １ｕＭ）で染色した。細胞を３０分間インキュベートし、温かいＨＢＳＳで洗浄し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅの２０倍対物レンズでイメージングした。Ｔｈ－Ｔのシグナルの強度は、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアを使用して、様々な条件で各ニューロンで定量化した。
【0215】
ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、より大きなａＳｙｎ凝集を有していた（図８）。α－シヌクレインタンパク質凝集の定量化を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）Ｕ－ＰＬＥＸ ヒトα－シヌクレインキット（ＭＳＤ－Ｋ１５）を使用して行った。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、培養中に２１日間（図８Ｂ）又は４２日間（図８Ｃ）プレーティングした。細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に溶解し、タンパク質含有量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。ヒトα－シヌクレインの定量化を、ＭＳＤのＭＳＤ－Ｋ１５キットを用いて行った。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、最大４２日間培養した。分析物濃度を、検量線にバックフィッティングすることによってＥＣＬシグナルから決定した（図８Ａ）。検量線を確立して濃度を決定するための計算は、ＭＳＤ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＷＯＲＫＢＥＮＣＨ（登録商標）解析ソフトウェアを使用して行った。ＡＨＮのα－シヌクレインタンパク質濃度が３４ｎｇ／ｍｌ±０．１６であるのに対して、ＳＮＣＡ＝６６．５ｎｇ／ｍｌ±２．４４、ＧＢＡ＝８９．５ｎｇ／ｍｌ±４．４５、及びＬＲＲＫ２＝５３ｎｇ／ｍｌ±０．６８（平均±ＳＤ）であった。α－シヌクレインタンパク質濃度がＡＨＮ細胞の２０％を超えると常に、病態と見なすことができる。
【0216】
ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ＧＣａｓｅ活性が低いことが観察された。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、１４日間プレーティングし、サンプルを回収し、ＲＮＡＳｅｑ解析及びウェスタンブロット解析のために提出した。ＧＢＡ転写産物のＦＰＫＭ値を定量化した（図９Ａ）。２．５μｇのタンパク質を含むすべてのサンプルからの総細胞溶解物を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ装置を使用してゲルキャピラリーにロードし、６６ｋｄ ＧＢＡタンパク質の検出を確認した。溶解物中のＧＢＡタンパク質の量を、各タンパク質の曲線下面積に基づいて定量化し、ＭＡＰＴ発現に対して正規化した（図９Ｂ）。基質としての異なる濃度の４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド（４－ＭＵ）（図９Ｃ）及びＧＣａｓｅ特異的阻害剤コンズリトールＢエポキシド（ＣＢＥ）（図９Ｄ）を試験した。１０ｍＭの４－ＭＵと２ｍＭのＣＢＥが最適な濃度であることが判明し、以下のＧＣａｓｅ活性アッセイに使用した。異なる濃度のタンパク質溶解物も、ＡＨＮ ＤＡニューロン由来のＧＣａｓｅ活性について試験した（図９Ｅ）。５μｇのタンパク質溶解物を使用して、異なるＤＡニューロン間のＧＣａｓｅ活性を比較した（図９Ｆ）。（ｎ＝４、ｐ＜０．００１ 平均比較のためのダネット検定による一元配置分散分析）。（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【0217】
ＧＣａｓｅ活性アッセイでは、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、１４日間プレーティングした。細胞を回収し、溶解し、２０，０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離した。総タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。溶解物あたり５μｇのタンパク質を使用して、１０ｍＭの４－メチルウンベリフェリルβ－グルコピラノシド（ｇｌｕｃｏｐｈｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（４－ＭＵ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｍ３６３３）（図９Ｃ）を含み、２ｍＭのコンズリトール－ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）（図９Ｄ）を含む又は含まない１％ＢＳＡの存在下でのＧＣａｓｅ活性を決定した。組換えヒトグルコシルセラミダーゼ／ＧＢＡ（ｒｈＧＢＡ）（Ｒ＆Ｄ，７４１０－ＧＨＢ－０２０）を陽性対照として使用した。サンプルを３７℃で４０分間インキュベートし、等量の１Ｍグリシン（ｐＨ１２．５）を添加して反応を停止させた。１００μｌの反応液を、白色の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，＃１３６１０１）にロードし、蛍光（ｅｘ＝３５５ｎｍ、ｅｍ＝４６０、０．１ｓ）シグナルを、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。ＣＢＥ処理されていない溶解物の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、対応するＣＢＥ処理溶解物からシグナルを差し引くことによって計算した。ＡＨＮ細胞は、変異体と比較してＧＣａｓｅ活性が高かった（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝３１１１７±６３９、ＧＢＡ＝１３６２２±３８５、ＬＲＲＫ２＝２０６１９±１７９、及びＳＮＣＡ＝１７３４２９±２９３００）。
【0218】
ＳＮＣＡが操作されたｉＰＳＣ及びＰＤ患者ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンは、ニューラルネットワーク活動の進化における違いを明らかにした（図１０）。ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来の凍結保存ＤＡニューロンの複数のロットを解凍し、完全ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地の４８ウェルＣｌａｓｓｉｃ多電極アレイ（ＭＥＡ）プレート（１ウェルあたり１２０Ｋ細胞の細胞密度でロットあたり８ウェル）にプレーティングした。ニューロンの活動を、Ａｘｉｏｎ Ｍａｅｓｔｒｏ ＭＥＡを使用して定量化した。数日ごとにＭＥＡを記録して、培養中に同期的にバーストするニューロンネットワークの発達を経時的にモニタリングした。．ＲＡＷデータファイルを．ｓｐｋファイルに変換し、その後、ＡｘｉｏｎのＮｅｕｒａｌ Ｍｅｔｒｉｃ Ｔｏｏｌソフトウェアを使用して解析した。バースト検出は「エンベロープ法」を用いて行った。自然の活動電位（黒い目盛りは「スパイク」）、バースト挙動（青色の目盛り）を観察した。同期ネットワークバーストも検出された（ヒストグラムのピークと、すべての電極のバーストの下のまとまったスパイクの周りの対応するピンク／マゼンタのボックスを参照されたい）。その結果、３５日目のラスタープロット（図１０Ａ）におけるＡＨＮ細胞と比較して、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、及びＳＮＣＡニューロンにおける活性及びネットワーク強度が低いことが、経時的なバースト率、ネットワークバースト頻度、及び同期指数の定量化で明らかになった（図１０Ｂ）。
【0219】
ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析では、ｉＣｅｌｌ Ｄｏｐａ Ｎｅｕｒｏｎ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅに従って、ドーパミン作動性ニューロンを解凍し、維持した。簡単に述べると、２．０Ｅ＋６細胞をＰＬＯ／ラミニンコーティング６ウェル組織培養プレートにプレーティングし、解凍後１５日以上培養する。細胞を、４００マイクロリットルのＱｉａｇｅｎ ＲＬＴ＋溶解緩衝液を使用してウェル内で直接溶解した。それぞれ約２００万個の細胞の重複サンプル／ロットを溶解し、ＲＮＡ抽出が行われるまで－８０℃で保存した。ＱｉａＳｙｍｐｈｏｎｙを使用してＲＮＡを抽出した。サンプルの許容純度を確保するために、ＲＮＡ濃度が２０ｎｇ／μＬを超えるようにし、吸光度の比（ＯＤ ２６０／２８０）を２．０より大きくする必要がある。
【0220】
ｃＤＮＡライブラリーの調製をＮｏｖｏｇｅｎｅで行い、サンプルに尾部を付け、修飾オリゴでライゲーションし、サイズを選択し、増幅した。次いで、（１）ライブラリーのサイズ分類と品質評価のためのＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、及び（２）ライブラリーの濃度とＩｌｌｕｍｉｎａアンカー配列の存在を測定するためのｑＰＣＲを使用して、配列決定の前にすべてのライブラリーを検査した。次いで、ＲＮＡ配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００プラットフォームでリード長１５０塩基対を用いるペアエンド技術を使用して行った。次いで、サンプルあたり２，０００万以上のリードペアからなる「ｆａｓｔｑ」ファイルと呼ばれる出力データファイルを、ハードドライブ上のＦＣＤＩに送った。これらの生データファイルを、Ｌｉｎｕｘクラスタにコピーし、ファイルの整合性を確認した後にアーカイブに保管した。サンプルスワップの可能性を確認するためのコンピュータ内サンプルＱＣを、ｂｏｗｔｉｅ２と呼ばれるアライメントプログラムを使用して、ヒトＤＮＡ及びｍＲＮＡ、マウス、ｐｈｉＸ、ウイルス、真菌、及び細菌の配列から構成された社内の配列データベースにリードをアライメントすることによって行った。サンプルは、ヒト配列の７５％超を含む場合は合格と見なした。配列決定リードの品質レポートを、ＦＡＳＴＱＣプログラムを使用して作成した。次いで、すべての高品質のリードを、スプライス対応アライメントプログラム（ｓｐｌｉｃｅ－ａｗａｒｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）ＨＩＳＡＴ２を用いてＨＧ３８トランスクリプトームにアライメントした。次いで、アライメントファイル（ｂａｍファイルと呼ばれる）を使用して、Ｒｓｕｂｒｅａｄ：：ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓプログラムを用いてリードカウントマトリックスを作成し、このＲｓｕｂｒｅａｄ：：ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓプログラムをさらに使用して、ＤＥＳｅｑ２プログラムを用いて目的のサンプル間の差次的発現解析を行うことができた。正規化されたリードカウントを、ｌｏｇ１０（ＦＰＫＭ＋０．０００１）値に変換し、単純な散布図をＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアで可視化することができた。
【0221】
変異ＤＡニューロンの転写産物を、ＡＨＮ ＤＡニューロンに対してプロットすると、遺伝子発現レベルにおいて高い相関を示し、有意に異なる転写産物を強調表示した（図１１Ａ）。ＡＨＮサンプルと比較した変異体サンプルの差次的遺伝子発現差解析を行い、有意に変化した転写産物の数をベン図にまとめた（図１１Ｂ）。ＤＡＶＩＤデータベースにおけるＡＨＮ ＤＡニューロンと比較した変異ＤＡニューロンにおいて差次的に調節された転写産物の遺伝子セットの濃縮及び経路解析を図１１Ｃに示す。
【0222】
化合物スクリーニングでは、ＧＣａｓｅ活性の改善にプラスの効果があることが以前に示された１２の化合物を選択した。ＤＡニューロンを、９６ウェルプレートにおいて高密度（２００，０００／ウェル）で培養した。Ｇｃａｓｅ活性を、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、及びＡＨＮ ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンから、化合物処理後に測定した。１８日目に、解凍後の細胞に、異なる化合物を３つの濃度（表２の化合物の１倍、１０倍、１００倍）で投与した。プレーティングの２１日後（投与の３日後）に、細胞を、１００μｌのアッセイ緩衝液を使用して溶解し、Ｇｃａｓｅ活性を、５μｇのタンパク質溶解物を使用して測定した。正味のＧｃａｓｅ活性を、陰性対照として０．１％ＤＭＳＯ処理細胞と比較してグラフ化した。溶解物中の総タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量化した。
【0223】
ＧＣａｓｅ活性は、疾患ニューロンの化合物スクリーニングの読み出しとして使用することができ、この化合物スクリーニングでは、ＡＨＮが対照として機能し、ＧＣａｓｅ活性を救うことができる化合物が陽性ヒットと見なされることになる。ＡＨＮを対照とするＧＢＡ及びＬＲＲＫ２ ＤＡニューロンにおけるＧｃａｓｅ活性に対する３つ濃度での１２の化合物の効果を図１２Ａに示す。組み合わせスクリーニングでは、改善されたＧＣａｓｅ活性を示す最初のスクリーニングから４つの分子をピックアップし、ＧＢＡ細胞を用いて試験するために異なる方法で組み合わせた（図１２Ｂ）。単一化合物を、急性曝露（３日間）と慢性曝露（２週間）の両方について試験した。組み合わせスクリーニングは、１０μＭのアンブロキソールによる慢性処理がＧＢＡ細胞で最も高いＧＣａｓｅ活性を示した（平均±ＳＤ、ＡＢＸ＝１３３６５９±１０５４２と比較してＤＭＳＯ＝９０３０２±３９８６、ＧＣａｓｅ活性の４８％の増加）。これを、ＡＨＮと比較してＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、及びＧＢＡにおいてさらに試験した（図１２Ｃ）。解凍の２１日後に、１０μＭのアンブロキソールでの２週間の処理により、すべての変異ニューロンでＧｃａｓｅ活性が有意に増加した。（平均で、ＡＨＮは１６５０５２から１７１６６９、ＧＢＡは１０８４１７から１２１２２５（１２％増加）、ＬＲＲＫ２は１５２７９３から１８０１１２（１８％増加）、ＳＮＣＡは１６５１０７から１８９０８２（１４％増加））（点線は、ＤＭＳＯビヒクル対照のＧｃａｓｅレベルを示す、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【0224】
【表2】
【0225】
カルシウムイメージング実験では、ＤＡニューロンをスフェロイド（５０，０００／ウェル）として３８４ Ｕ底ＵＬＡプレート（Ｓ－ｂｉｏプレート）で培養し、Ｂｒａｉｎｐｈｙｓ完全培地（Ｂｒａｉｎｐｈｙｓ基礎培地＋神経サプリメントＡ＋ＮＳＳ）を供給した。プレーティングの７日後に、いくつかのウェルを１０μＭのアンブロキソールで処理した。プレーティングの１４日後（処理の７日後）に、細胞を、１Ｘ ＥａｒｌｙＴＯＸ心毒性キットにロードし、３７℃で２時間インキュベートした後、ＦＤＳＳ／μＣＥＬＬ装置を使用してＣａ２＋振動を２０分間捕捉した。波形ソフトウェアをＣａ振動の定量化に使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。
【0226】
プレーティングの１４日後のＤＡニューロンのカルシウム振動痕跡をＦＤＳＳ／μＣＥＬＬ装置を用いて２０分間捕捉した。１０μＭのアンブロキソールで１週間処理した後のＡＨＮ及び３つすべての変異におけるＣａ振動のベースライン測定値を図１３Ａに示す。未処理のＡＨＮ ＤＡニューロンと比較して、アンブロキソールによる処理は、ＡＨＮ、ＬＲＲＫ２、及びＳＮＣＡ ＤＡニューロンに過興奮性を引き起こしたが、ＧＢＡ変異ＤＡニューロンのピーク数とピークレートを救った。（図１３Ｂ）ピーク数、（図１３Ｃ）毎分ピークレート、及び（図１３Ｄ）曲線下面積／ピーク（平均）を含むカルシウム過渡特性を、Ｗａｖｅｆｏｒｍソフトウェアを用いて各細胞株のすべてのウェル（反復）について定量化した。ピーク数は、突然変異（疾患ニューロン）間で異なり、ＡＨＮと比較する（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝２１．５５±３、ＧＢＡ＝１３．４３±１、ＬＲＲＫ２＝２８．８３±３．６５、及びＳＮＣＡ＝２４．５±５．３）。アンブロキソール処理は、ＡＨＮ（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝３３．７５±７．１４、ＧＢＡ＝２１．８±１．８、ＬＲＲＫ２＝３５．３±３．９、及びＳＮＣＡ＝３３．８±１．５）を含むすべてのニューロンのピーク数を増加させた。また、１分間あたりのピーク数であるピークレートも細胞株間で差を示し（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝１．１２±０．１６、ＧＢＡ＝０．７２±０．０６、ＬＲＲＫ２＝１．５２±０．１６、及びＳＮＣＡ＝１．２６±０．３）、アンブロキソールで処理した場合も増加した（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝１．７４±０．３２、ＧＢＡ＝１．１３±０．１、ＬＲＲＫ２＝１．８９±０．１８、及びＳＮＣＡ＝１．６１±０．１２）。カルシウムチャネルが開いている時間及び／又は細胞質カルシウムの直接的な測定値である曲線下の面積も、ＡＨＮと比較して変異ニューロンで異なり（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝３４．６Ｅ０４±１３．５Ｅ０４、ＧＢＡ＝５７．３Ｅ０４±１３．４Ｅ０４、ＬＲＲＫ２＝２７．４Ｅ０４±１０．３Ｅ０４、及びＳＮＣＡ＝４１．３Ｅ０４±１７．６Ｅ０４）、及びアンブロキソール処理は、細胞質カルシウムＧＢＡ及びＳＮＣＡを減少させたが、ＬＲＲＫ２変異ＤＡニューロンでは減少しなかった（平均±ＳＤ、ＡＨＮ＝２５．７Ｅ０４±１３．０Ｅ０４、ＧＢＡ＝３８Ｅ０４±７８Ｅ０３、ＬＲＲＫ２＝２６．１Ｅ０４±４９．５Ｅ０３、及びＳＮＣＡ＝３７．４Ｅ０４±４１．７Ｅ０３）。正常で健康な細胞の１分あたりのピーク数であるピークレートは、プレーティングの１４日後に０．９６＜ＡＨＮ＜１．３であり、３０％の変化を異常なピークレートと見なす。健康なニューロンの平均曲線下面積は、２１．１Ｅ０４＜ＡＨＮ＜４８．２Ｅ０４であり、曲線下面積の変化が４０％超は異常なピークと見なす。ピークレートと曲線下面積（ピーク）は、ＡＨＮが対照として機能し、これら２つのパラメータを救う可能性のある化合物が化合物スクリーニングの陽性ヒットと見なすことができる場合、疾患ニューロンによる化合物スクリーニングの読み出しとして使用することができる。
【0227】
本明細書で開示及び特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又は一連のステップに変更を適用し得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代わりに使用し得、そこで同じ又は同様の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替形態及び改変形態の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内にあると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９８／５３０５８
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９８／５３０５９
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９８／５３０６０
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ０１／０８８１００
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２００５／０８０５５４
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２００５／１２３９０２
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２０１１１３０６７５
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２０１２０８０２４８
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２０１３／０６７３６２
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２０１３０６７３６２
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Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４５３，２４２
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５３４，２６１
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，８２０，４３９
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，１５３，４２８
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Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ０３／０１６４９６
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ２００９／１４９２３３
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ２０１０／１４１８０１
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Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８／０１７１３８５
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Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２０１１／０３０１０７３
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２０１１／０３０１０７３
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２０１２／０２７６０６３
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Ｙｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２（１５）：１９８７－９７，２００８．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０，２００７．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２８）：７９７－８０１，２００９．
【図1A-1F】
【図2A-2C】
【図3A-3C】
【図4A-4C】
【図5A-5B】
【図6A-6E】
【図7A-7C】
【図8A-8C】
【図9A-9F】
【図10A-10B】
【図11A-11C】
【図12A-12C】
【図13A-13D】
【配列表】
【国際調査報告】