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▶ ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】サイトカインストームの影響を治療する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241106BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241106BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241106BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241106BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P37/02
A61P31/12
A61K31/7105
A61K48/00
A61K35/76
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K31/713
A61K31/711
A61P31/14
A61P31/16
A61P9/00
A61P1/16
A61P13/12
A61K45/06
A61P31/04
A61P31/10
A61P33/00
A61P35/00
A61P37/06
A61P3/10
A61P3/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525327
(86)(22)【出願日】2022-10-20
(85)【翻訳文提出日】2024-06-25
(86)【国際出願番号】 US2022047254
(87)【国際公開番号】W WO2023076096
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,402
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507235354
【氏名又は名称】ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュー，スマント・シン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084AA20
4C084MA02
4C084MA52
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4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZB07
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4C087ZB26
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4C087ZB35
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4C087ZC02
4C087ZC21
4C087ZC35
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(57)【要約】
本発明は、呼吸器系感染症又は非呼吸器系感染症、及び多臓器への影響を含む軽度から重度のサイトカインストームの影響、並びに死亡率の低減に関する予防及び治療に対する新規なアプローチを提供する。より詳しくは、本発明は、重度のウイルス性サイトカインストームの結果としての死亡率を解消又は低減するために枯渇させなければならない特定の組合せ又はサイトカイン又は可溶性受容体について記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、軽度から中等度のサイトカインストームの影響の阻害、治療又は予防を必要とする患者における、軽度から中等度のサイトカインストームの影響を阻害、治療又は予防するための方法であって、１種以上のサイトカインの阻害剤が患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させ、軽度のサイトカインストームの症状が緩和される、方法。
【請求項2】
軽度から中等度のサイトカインストームがウイルス感染の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
１種以上のサイトカインの阻害剤が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルス、１種以上のサイトカインに対する抗体又は抗体断片、１種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又は他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びサイトカイン媒介受容体に結合して１種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ｓｈＲＮＡがベクターに結合されているか又はベクターの一部である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
抗体又は抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び二価抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体に対するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
抗体又は抗体断片が、２種の異なるサイトカインを標的とする二価抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
１種以上のサイトカインの阻害剤が、改変された１種以上のサイトカイン遺伝子をコードする１つ以上のＤＮＡ断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
１つ以上のＤＮＡ断片が、ＣＲＩＳＰＲによって改変された１種以上のサイトカイン遺伝子をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラウイルスからなる群から選択される感染によって引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項11】
軽度から中等度のサイトカインストームの影響が、非呼吸器系の影響である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
非呼吸器系の影響が、急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
１種以上のサイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
２種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、重度のサイトカインストームの影響の阻害、治療又は予防を必要とする患者における重度のサイトカインストームの影響を阻害、治療又は予防するための方法であって、２種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させ、重度のサイトカインストームの症状が緩和される、方法。
【請求項15】
重度のサイトカインストームがウイルス感染の結果である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
２種以上のサイトカインの阻害剤が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルス、２種以上のサイトカインに対する抗体又は抗体断片、２種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又は他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びサイトカイン媒介受容体に結合して２種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストを含む薬剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
ｓｈＲＮＡが、ベクターに結合されているか又はベクターの一部である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
２種以上のサイトカインに対する抗体又は抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び二価抗体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
抗体又は抗体断片が、２種の異なるサイトカインを標的とする二価抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
２種以上のサイトカインの阻害剤が、改変された２種以上のサイトカイン遺伝子をコードする２つ以上のＤＮＡ断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項22】
２つ以上のＤＮＡ断片が、ＣＲＩＳＰＲによって改変された２種以上のサイトカイン遺伝子をコードしている、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラウイルスからなる群から選択される感染によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項24】
重度のサイトカインストームの影響が非呼吸器系の影響である、請求項１４に記載の方法。
【請求項25】
非呼吸器系の影響が、急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
１種以上のサイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項27】
２種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、重度のサイトカインストーム後の死亡率の低減を必要とする患者における、重度のサイトカインストーム後の死亡率を低減するための方法であって、２種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させ、死亡率を低減する、方法。
【請求項28】
重度のサイトカインストームが、ウイルス感染の結果である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
２種以上のサイトカインの阻害剤が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルス、２種以上のサイトカインに対する抗体又は抗体断片、２種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又は他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びサイトカイン媒介受容体に結合して２種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストを含む薬剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
ｓｈＲＮＡがベクターに結合されているか又はベクターの一部である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
２種以上のサイトカインに対する抗体又は抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び二価抗体からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
抗体又は抗体断片が、２種の異なるサイトカインを標的とする二価抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
２種以上のサイトカインの阻害剤が、改変された２種以上のサイトカイン遺伝子をコードする２つ以上のＤＮＡ断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項35】
２つ以上のＤＮＡ断片が、ＣＲＩＳＰＲによって改変された２種以上のサイトカイン遺伝子をコードしている、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
ウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラウイルスからなる群から選択される感染によって引き起こされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項37】
重度のサイトカインストームの影響が非呼吸器系の影響である、請求項２７に記載の方法。
【請求項38】
非呼吸器系の影響が、急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
１種以上のサイトカインがＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項40】
１種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、サイトカインストームによって引き起こされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療又は予防するための方法であって、１種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させる、方法。
【請求項41】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響が、非呼吸器系の影響である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
非呼吸器系の影響が、急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
１種以上のサイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項44】
１種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、ウイルス感染の再発を予防するための方法であって、１種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させる、方法。
【請求項45】
ウイルス感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラウイルスからなる群から選択される感染によって引き起こされる、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
１種以上のサイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
１種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療又は予防するための方法であって、１種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させる、方法。
【請求項48】
１種以上のサイトカインがＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
１種以上のサイトカインの阻害剤の患者への投与を含む、患者におけるウイルス感染を治療又は予防するための方法であって、１種以上のサイトカインの阻害剤が、患者から１種以上のサイトカインを中和又は枯渇させる、方法。
【請求項50】
１種以上のサイトカインがＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
軽度から中等度のサイトカインストームが、軽度から中等度のサイトカインストームが起こるいずれかの疾患状態の結果であり、前記疾患状態が、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症、がん、臓器移植、糖尿病及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項52】
重度のサイトカインストームが、重度のサイトカインストームが起こるいずれかの疾患状態の結果であり、前記疾患状態が、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症、がん、臓器移植、糖尿病及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項53】
重度のサイトカインストームが、重度のサイトカインストームが起こるいずれかの疾患状態の結果であり、前記疾患状態が、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症、がん、臓器移植、糖尿病及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
政府助成金に関する記載
本発明は、国立衛生研究所から授与された、いくつかの助成金（１Ｒ０１ＤＫ１０９７１３、１Ｒ０１ＤＫ１１１１０２、１Ｒ０１ＤＫ１２９５２２、１Ｒ０１ＤＫ１２８２０３）に基づく政府支援を受けて行われた。政府は一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所から授与された、いくつかの助成金（１Ｒ０１ＤＫ１０９７１３、１Ｒ０１ＤＫ１１１１０２、１Ｒ０１ＤＫ１２９５２２、１Ｒ０１ＤＫ１２８２０３）に基づく政府支援を受けて行われた。政府は一定の権利を有する。
【0002】
本開示の一般的な分野は、サイトカインストームの影響の予防及び治療に対する新規なアプローチである。本発明は、重度のウイルス性サイトカインストームの結果としての死亡率を解消又は低減するために枯渇させなければならない特定の組合せ又はサイトカイン又は可溶性受容体について記載する。
【背景技術】
【0003】
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの際立った特徴は、呼吸器、腎臓、脳、肝臓、心臓、胃腸管、眼及び他の多くの臓器を含む多系統病変である。例えば、Ｈｕａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」、（２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９５：４９７～５０６頁；Ｗａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ６９ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」、（２０２０） Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ７１：７６９～７７７頁を参照されたい。ウイルスは罹患した臓器で常に検出されるわけではなく、心臓剖検の研究ではウイルスの有無は炎症細胞浸潤の程度に影響しないようであった。Ｓｐｕｄｉｃｈら、「Ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７５：２６７～２６９頁；Ｔｏｐｏｌ、「ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｎ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ」、（２０２０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０：４０８～４０９頁；Ｌｉｎｄｎｅｒら、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ａｕｔｏｐｓｙ ｃａｓｅｓ．」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：１２８１～１２８５頁；Ｇｕｐｔａら、「Ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０年） Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２６：１０１７～１０３２頁を参照されたい。
【0004】
ウイルス感染は、自然免疫反応及び適応免疫反応の一環としてサイトカインの産生を引き起こす。本発明者らは以前、パンデミックの初期に記録された広範囲のサイトカインストームが臓器損傷に関与している可能性があることを疑い、サイトカイン介在性の末端臓器損傷の新規のエビデンスに基づくモデルを開発した。Ｈｕａｎｇら、２０２０を参照されたい。研究した３種類の臓器のうち、心臓病変に関する文献では、心筋トロポニンＩ値の上昇（急性心筋梗塞に類似）、心筋炎、心筋壊死、心膜炎、不整脈及び心不全が示されている４、７。Ｔｏｐｏ ２０２０；Ｉｎｃｉａｒｄｉら、「Ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：８１９～８２４頁を参照されたい。肝障害のエビデンスには、アミノトランスフェラーゼレベルの上昇、肝細胞障害、炎症及び脂肪肝が含まれる８。Ｈｅｒｔａら、「ＣＯＶＩＤ－ １９ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ － Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ」、（２０２１） Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ４１ 補遺１：１～８頁を参照されたい。腎臓の症状発現が入院のＣＯＶＩＤ－１９患者において非常に多く見られ、４０％近くがタンパク尿を発症し、約３分の１が急性腎障害（ＡＫＩ）を発症する。Ｃｈｅｎｇら、「Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－ １９」、（２０２０年） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９７：８２９～８３８頁；Ｈｉｒｓｃｈら、「Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９８：２０９～２１８頁を参照されたい。重度のタンパク尿及び／又は腎機能障害のあるＣＯＶＩＤ－１９患者の腎生検研究では、巣状及び分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の虚脱型（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）及び急性腎障害が最も一般的に記録されている。Ｋｕｄｏｓｅら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３１：１９５９～１９６８頁；Ｎａｓｒら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ」、（２０２１） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ７７：４６５～４６８頁（２０２１）を参照されたい。初期の剖検研究ではウイルス粒子が疑われたが、生存患者の腎生検ではいかなるウイルス粒子も確認されなかった。Ｂｒａｄｌｅｙら、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｆａｔａｌ ＣＯＶＩＤ－ １９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ」、（２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９６：３２０～３３２頁も参照されたい。
【0005】
腎臓疾患を中心としたＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルを構築する利点は、いくつかの要素を共有する風邪のサイトカインストームの稀な症状発現とメカニズム的に比較することができることである。Ｂａｓｎｅｔら、「Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、（２０１９） Ｃｈｅｓｔ １５５：１０１８～１０２５頁；Ｗｉｎｅら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｌｄ ａｎｄ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ」、（２０１２） Ｃｕｒｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｒｅｐ．１２：５７４～５８１頁；Ｎｉｅｔｅｒｓら、「Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ， ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ａ Ｇｅｒｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、（２００１） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． １０８：２４１～２４８頁；Ｎｏａｈら、「Ｎａｓａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒａｌ ａｃｕｔｅ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ」、（１９９５） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １７１：５８４～５９２頁；ｖａｎ Ｋｅｍｐｅｎら、「Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、（１９９９） Ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ ３７：９７～１０３頁；Ｗｈｉｔｅｍａｎら、「ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＡＭ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＣＡＭ－１ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、（２００８） Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ （Ｌｏｎｄ）．５：８頁；Ｊａｒｔｔｉら、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ Ｔ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｖｓ． ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅａｒｌｙ ｗｈｅｅｚｉｎｇ： ａｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ」、（２００９） Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ．１０：８５頁；Ｈｅｒｓｈｅｙら、「Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｏｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、（１９９７） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３３７：１７２０～１７２５頁；Ａｂｄｅｌ－Ｈａｆｅｚら、「Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ａｔｏｐｙ： ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｎｋ？」、（２００９） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．５４：９４５～９５３頁を参照されたい。
【0006】
ライノウイルスによってよく引き起こされる風邪は、糸球体疾患であるＭＣＤ及びＦＳＧＳ再発のエピソードの約７０％を引き起こす。Ｐａｓｓｉｏｔｉら、「Ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｌｄ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｃｕｒｅ」、（２０１４） Ｃｕｒｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｒｅｐ．１４：４１３頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「Ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅ ｉｎ ｓｔｅｒｏｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、（２００７） Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２２：２３２～２３６頁を参照されたい。
【0007】
この再発経路は不明であるが、本発明者らはサイトカインストームが主要な役割を果たしていると長い間考えてきた。ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームは、風邪のサイトカインストームよりも広範囲であるため、減算分析によってそれぞれの疾患の特定の側面における主要な要因を同定できる可能性がある。ヒト及び実験的ＭＣＤとほとんどの形態のＦＳＧＳは、転写因子ＺＨＸ２のポドサイト発現低下と関連している。Ｍａｃｅら、「ＺＨＸ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９７：７５３～７６４頁を参照されたい。対照的に、実験的エビデンスは、ＦＳＧＳの虚脱型では基礎ポドサイトＺＨＸ２発現が高いことを示唆している。Ｍａｃｅら、２０２０。他の多くの細胞とは対照的に、ポドサイトはすべてのＺＨＸタンパク質の大部分を細胞膜（非核）分布において発現する。適切な組合せ及びＺＨＸ２発現状態の変化の設定において、全身性サイトカイン放出が正常な（アミノペプチダーゼＡ／ＡＰＡ、エフリンＢｌ）又は推定上の代替細胞膜アンカーからポドサイト核へのＺＨＸタンパク質の移動を誘導する可能性がある。
【0008】
しかし、ＣＯＶＩＤ－１９感染後に見られる結果的なサイトカインストームを理解するための努力にもかかわらず、未だ、この現象の根底にあるメカニズム及び結果としての臨床症状発現を理解することが必要とされている。このような理解は、サイトカインストームに関連した臓器の損傷を低減する治療アプローチの設計を容易にする。
【0009】
本発明は、これらのニーズに応えるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｈｕａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」、（２０２０年） Ｌａｎｃｅｔ ３９５：４９７～５０６頁
【非特許文献2】Ｗａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ６９ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」、（２０２０） Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ７１：７６９～７７７頁
【非特許文献3】Ｓｐｕｄｉｃｈら、「Ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７５：２６７～２６９頁
【非特許文献4】Ｔｏｐｏｌ、「ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｎ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ」、（２０２０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０：４０８～４０９頁
【非特許文献5】Ｌｉｎｄｎｅｒら、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ａｕｔｏｐｓｙ ｃａｓｅｓ．」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：１２８１～１２８５頁
【非特許文献6】Ｇｕｐｔａら、「Ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２６：１０１７～１０３２頁
【非特許文献7】Ｉｎｃｉａｒｄｉら、「Ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：８１９～８２４頁
【非特許文献8】Ｈｅｒｔａら、「ＣＯＶＩＤ－ １９ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ － Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ」、（２０２１） Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ４１ 補遺１：１～８頁
【非特許文献9】Ｃｈｅｎｇら、「Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－ １９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９７：８２９～８３８頁
【非特許文献10】Ｈｉｒｓｃｈら、「Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９８：２０９～２１８頁
【非特許文献11】Ｋｕｄｏｓｅら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３１：１９５９～１９６８頁
【非特許文献12】Ｎａｓｒら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ」、（２０２１） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ７７：４６５～４６８頁（２０２１）
【非特許文献13】Ｂｒａｄｌｅｙら、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｆａｔａｌ ＣＯＶＩＤ－ １９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ」、（２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９６：３２０～３３２頁
【非特許文献14】Ｂａｓｎｅｔら、「Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、（２０１９） Ｃｈｅｓｔ １５５：１０１８～１０２５頁
【非特許文献15】Ｗｉｎｅら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｌｄ ａｎｄ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ」、（２０１２） Ｃｕｒｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｒｅｐ．１２：５７４～５８１頁
【非特許文献16】Ｎｉｅｔｅｒｓら、「Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ， ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ａ Ｇｅｒｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、（２００１） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． １０８：２４１～２４８頁
【非特許文献17】Ｎｏａｈら、「Ｎａｓａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒａｌ ａｃｕｔｅ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ」、（１９９５） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １７１：５８４～５９２頁
【非特許文献18】ｖａｎ Ｋｅｍｐｅｎら、「Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、（１９９９） Ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ ３７：９７～１０３頁
【非特許文献19】Ｗｈｉｔｅｍａｎら、「ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＡＭ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＣＡＭ－１ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、（２００８） Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ （Ｌｏｎｄ）．５：８頁
【非特許文献20】Ｊａｒｔｔｉら、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ ａｎｄ Ｔ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｖｓ． ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅａｒｌｙ ｗｈｅｅｚｉｎｇ： ａｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ」、（２００９） Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ．１０：８５頁
【非特許文献21】Ｈｅｒｓｈｅｙら、「Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｏｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、（１９９７） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３３７：１７２０～１７２５頁
【非特許文献22】Ａｂｄｅｌ－Ｈａｆｅｚら、「Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ａｔｏｐｙ： ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｎｋ？」、（２００９） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．５４：９４５～９５３頁
【非特許文献23】Ｐａｓｓｉｏｔｉら、「Ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｌｄ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｃｕｒｅ」、（２０１４） Ｃｕｒｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｒｅｐ．１４：４１３頁
【非特許文献24】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「Ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅ ｉｎ ｓｔｅｒｏｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、（２００７） Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２２：２３２～２３６頁
【非特許文献25】Ｍａｃｅら、「ＺＨＸ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９７：７５３～７６４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
（発明の要旨）
本発明は、様々なサイトカインを標的とするメカニズムを提供する。本発明は、死亡率及び末端臓器損傷を含むサイトカインストームの影響を解消又は低減するために枯渇させなければならないサイトカイン又は可溶性因子の特定の組合せについて記載する。
本発明は、様々なサイトカインを標的とするメカニズムを提供する。本発明は、死亡率及び末端臓器損傷を含むサイトカインストームの影響を解消又は低減するために枯渇させなければならないサイトカイン又は可溶性因子の特定の組合せについて記載する。
【0012】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの呼吸器系ウイルスを含むウイルス性疾患は、明白な直接的なウイルス感染がなくても非呼吸器系臓器に病理学的影響を及ぼす。それに加えて、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及びエボラ出血熱などの他の呼吸器系ウイルス及び非呼吸器系ウイルスによって発症する病気もまた、サイトカインストームを引き起こし、死亡及び多臓器損傷を引き起こすことも知られている。
【0013】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の肺外症状発現におけるウイルス性サイトカインストームの役割を研究し比較するため、臨床データから新規のＣＯＶＩＤ－１９とサイトカインとの組合せ「カクテル」が開発され、マウスに注射された。本発明者らによる以前の研究では、風邪サイトカインの組合せ「カクテル」を使用したライノウイルス風邪感染モデルにおける有効性が実証されている。
【0014】
初期の研究では、本発明者らは、Ｚｈｘ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ及びＮＰＨＳ２プロモーター駆動Ｃｒｅマウスを利用した。しかし、その後、本発明者らは、Ｚｈｘ２ハイポモルフ状態の確立されたモデルであるＢＡＬＢ／ｃＪマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｚｈｘ２＋／＋）を使用した。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ－ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃＪ ｍｉｃｅ ｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｚｈｘ２ ｇｅｎｅ．」 （２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３９６～４０１１頁；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＴｎＩＩ－ａｌｐｈａ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＢＡＬＢ／ｃＪ Ｚｈｘ２ （Ａｆｒｌ） ａｌｌｅｌｅ」、（２００８） Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ １９：２６～３１頁；Ｇａｒｇａｌｏｖｉｃら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｈｘ２ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、（２０１０） Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ． ３：６０～６７頁；Ｃｒｅａｓｙら、「Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ ２ （Ｚｈｘ２） Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ Ｃｙｐ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ」、（２０１６） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． １７：７～１７頁；Ｊｉａｎｇら、「Ｚｈｘ２ （ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ ２） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｊｏｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ」、（２０１７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２：６７６５～６７７４頁 （２０１７）；Ｅｒｂｉｌｇｉｎら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｚｈｘ２ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ」、（２０１８） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ． ３８：２０１６～２０２７頁を参照されたい。
【0015】
低用量では、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルは、個々のサイトカインではなく、マウスにおける糸球体損傷及びＣＯＶＩＤ－１９関連タンパク尿に似たアルブミン尿を誘発した。サイトカインカクテルは培養した糸球体上皮細胞においてＳＴＡＴ６シグナル伝達を活性化したが、ＣＲＩＳＰＲ Ｂ Ｚｈｘ２ハイポモルフ糸球体上皮細胞ではそれが減少した。選択した単一サイトカインの枯渇により、糸球体損傷及びアルブミン尿が改善した。高用量では、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルは、個々のサイトカインではなく、マウスにおいて、急性心臓損傷、心筋炎、心膜炎、肝臓及び腎臓損傷を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疾患の一般的な臨床症状発現、並びに高死亡率を誘発した。ＳＴＡＴ５経路、ＳＴＡＴ６経路及びＮＦκＢ経路がこれらの臓器で活性化された。ＢＡＬＢ／ｃにおけるＴＮＦ－αとＩＬ－２又はＩＬ－１３又はＩＬ－４の選択的組合せのモデル誘導後の二重枯渇。要約すると、ウイルス性サイトカインストームの全身症状発現、疾患の機序、及び罹患率と死亡率を低減する治療原則が特定された。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明の実施形態において、患者から１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させることを含む、患者におけるウイルス感染の結果としてのサイトカインストームの影響を阻害、治療又は予防する方法が提供される。
【0017】
いずれかの実施形態において、サイトカインストームは、任意の呼吸器系ウイルス又は非呼吸器系ウイルスによって引き起こされるウイルス感染によって誘発され得る。したがって、ウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの呼吸器系ウイルスを含むウイルス性の病気によって引き起こされる可能性があり、明白な直接的ウイルス感染がない場合であっても、非呼吸器系臓器に対して病理学的影響を及ぼす。さらに、ウイルス感染は、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及びエボラ出血熱などの他の呼吸器系ウイルス及び非呼吸器系ウイルスによって引き起こされる可能性があり、これらもまたサイトカインストームを引き起こし、死亡及び多臓器損傷を引き起こすことが知られている。
【0018】
別の実施形態において、サイトカインストームは、非ウイルス感染、例えば、細菌、真菌又は原虫によって引き起こされる感染によって引き起こされる。
【0019】
さらに別の実施形態において、サイトカインストームは非感染性の病因によるものであり、例えば、がん若しくはその治療、臓器移植に関連するもの、又は糖尿病などの全身性障害の安定したサイトカイン環境の変化に関連するものなどである。
【0020】
さらに、本発明者らは、風邪（軽度の疾患を引き起こす。）と、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス感染によって引き起こされるより重度のサイトカインストームプロファイルとの間の大きな違いは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３に関連する「アレルギー経路」の随伴性急性活性化の存在であることを発見したので、本発明はまた、アレルギー経路の顕著な随伴性活性化を含むウイルス感染を含む。
【0021】
一部の実施形態において、本発明は、重度のサイトカインストームによって引き起こされる死亡率を低減するために、２種以上のサイトカインを枯渇させる方法を提供する。
【0022】
本発明の他の実施形態において、サイトカインストームによって使用される急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷の影響を治療する方法が提供される。一部の実施形態において、サイトカインストームはウイルス感染によって引き起こされる。
【0023】
本発明のさらに他の実施形態において、サイトカインストームによって引き起こされる死亡率を低減する方法が提供される。一部の実施形態において、サイトカインストームはウイルス感染によって引き起こされる。
【0024】
本開示の実施形態において、２種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、サイトカインストームによって誘発される多臓器損傷を予防する方法が提供される。
【0025】
本発明のさらに他の実施形態において、１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療又は予防するための方法が提供される。
【0026】
本開示の実施形態において、ウイルス感染の再発を予防する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む。
【0027】
本発明のさらに他の実施形態において、１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療又は予防するための方法が提供される。
【0028】
他の実施形態において、サイトカインストームの影響を治療又は予防する方法を試験するための、ウイルス感染及び他の疾患状態によって引き起こされる前記サイトカインストームの動物モデルが提供される。
【0029】
したがって、本発明で提供されるいずれかの方法では、１種以上のサイトカインは、患者に薬剤の患者への投与によって阻害、中和又は枯渇させることが可能であり、その薬剤は、１種以上のサイトカインに対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を含む。
【0030】
一部の実施形態において、ｓｈＲＮＡは市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合されていてもよいし、又はその一部であってもよい。
【0031】
他の実施形態において、薬剤は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む。さらに他の実施形態において、薬剤は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む。さらに他の実施形態において、薬剤は、１種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0032】
さらに他の実施形態において、薬剤は、サイトカイン媒介受容体に結合し、１種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストである。
【0033】
本開示の実施形態において、ウイルス感染を治療するための方法が提供される。特定の実施形態において、この方法は、１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む。
【0034】
開示されたいずれかの実施形態において、阻害、中和又は枯渇される１種以上のサイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む。
【0035】
処置されるウイルス感染又は他の状態の重症度に応じて、２種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇が単一のサイトカインの枯渇よりも効果的であり得ることは、本明細書の開示から理解される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1b】ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘの組成。
【図1c】ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。１／２倍（Ｘ／２）は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。
【図1d】ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。
【図1e】ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝マウス６匹）。
【図1f】ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝マウス６匹）。
【図1g】ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
【図2a】図２ａ－ｉは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷を、低用量又は３倍用量の個々の成分と比較した評価である。（図２ａ）心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベルによって評価された急性心筋損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2b】アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性レベルによって評価した急性肝臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2c】質量分析法を使用して測定した血清クレアチニンによって評価した急性腎臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2d】カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性心臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、線維破壊（青色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。
【図2e】カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性肝臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、突出したクッファー細胞（緑色矢印）、再生変化（黄色矢印）、及び中心静脈周囲損傷（青色矢印）が認められた。
【図2f】カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＰＡＳ染色切片（列１、２、４）及び腎臓電子顕微鏡（列３）を使用した急性腎臓損傷の組織学的評価（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。最初の３列は近位尿細管を示し、最後の列は遠位尿細管を示す。近位尿細管において、空胞化（赤色矢印）、刷子縁破壊（緑色矢印）、及び尿細管変性（黒色矢印）が認められた。遠位尿細管において、剥離のエビデンス（青色矢印）が存在した。泡沫細胞も認められた（白色矢印）。光学顕微鏡スケールバー２０μｍ；電子顕微鏡スケールバー２．６６μｍ。
【図2g】ＢＡＬＢ／ｃマウスの心臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。
【図2h】ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。
【図2i】ＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図3a】図３ａ－ｈは、軽度及び中等度のサイトカインストームが糸球体疾患及び全身性疾患に及ぼす影響に関する治療戦略を示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。（図３ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス、用量Ｘ／２）におけるカクテルＣモデル誘導後のアルブミン尿、続いてコントロールＩｇＧ又は枯渇抗体。群は、左から右に効力順に並んでいる。
【図3b】抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のベースラインとカクテルＤ用量１．８倍（１．８Ｘ）モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の尿アルブミンとクレアチニンの比。
【図3c】抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。
【図3d】抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清ＡＬＴ活性。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。
【図3e】抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清クレアチニン。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。
【図3f】コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の心臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。
【図3g】コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の肝臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。
【図3h】コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の腎臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。形態計測分析１群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図4a】図４ａ－ｇは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの全身性疾患に対する重度のサイトカインストームの影響に対する可能な治療戦略を示している。１群あたりの注射されたマウスの数をパネルａに示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。大きな（赤色）アスタリスクは普遍的な死亡率を示す。（図４ａ）カクテルＤ３倍（３Ｘ）をコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体とともに注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率表。コントロールＩｇＧ群において代謝ケージ使用の場合（５／６）の死亡率が使用しない場合（２／６）よりも高かったため、これらの試験においてアルブミン尿の定時採尿は実施されなかった。
【図4b】カクテルＤ３倍用量をマウスに注射し、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。
【図4c】カクテルＤ３倍用量をマウスに注射し、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清ＡＬＴ活性レベル。
【図4d】カクテルＤ３倍用量をマウスに注射し、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清クレアチニンレベル。
【図4e】コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の心臓組織学の形態計測比較。
【図4f】コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の肝臓組織学の形態計測比較。
【図4g】コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の腎臓組織学の形態計測比較。形態計測分析 １群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図5a】図５ａ－ｅは、ＣＯＶＩＤカクテルによるシグナル伝達経路の活性化及び疾患メカニズムを示している。カクテルＤ３倍又はコントロールの生理食塩水を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹）の全臓器タンパク質抽出物のウェスタンブロットによるＮＦκＢ／ｐ－ｐ６５（肝臓、３０分）、ｐＳＴＡＴ６（腎臓、６０分）及びｐＳＴＡＴ５（心臓、１５分）活性化についての定性試験の例。
【図5b】カクテルＣのヒト対応物（最終濃度Ｘ／１００，０００、条件あたりｎ＝３プレート）とインキュベートした野生型及びＺＨＸ２ハイポモルフ（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）培養ヒトポドサイトにおけるｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の活性化を評価する定量試験のウェスタンブロット。
【図5c】カクテルＣとインキュベートしたパネルｂからの野生型及びＣＲＩＳＰＲ Ｂポドサイトのウェスタンブロットの密度測定。
【図5d】カクテルＣ用量Ｘ／２を注射した後のＩｌ４ａ－／－マウス及びコントロールＢＡＬＢ／ｃＪマウスのアルブミン尿（左パネル）、及び１日目のアルブミン尿のベースラインからのパーセンテージ増加（右パネル）（１群あたりｎ＝５～８匹のマウス）。
【図5e】糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、及びポドサイトにおいて既に記載されている特異的受容体へのＣＯＶＩＤカクテル成分の結合可能性、並びにこれらの細胞間のフィードバックループ（赤色）の概略図。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、図５ｄの右側のパネルが片側検定であることを除き、すべての値は両側検定に基づいている。
【図6a】図６ａ－ｃは、補助的なヒトデータ及びサイトカインカクテルの追加効果を示す。（図６ａ）一般のＣＯＶＩＤ－１９患者、年齢、性別、及び人種をマッチさせた健常なコントロール、並びにタンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＥＬＩＳＡにより評価された血漿ＩＬ－４Ｒαレベル。アッセイされた患者サンプルの数を以下に示す。
【図6b】カクテルＤ用量Ｘ／２の注射後１日目のＢＡＬＢ／ｃＪマウス糸球体の電子顕微鏡画像。局所的な足突起消失（黒色矢印）、内皮空胞化（緑色丸）及び内皮肥大（青色丸）の領域が認められた。
【図6c】質量分析法により測定した血清クレアチニンは、ＣＯＶＩＤサイトカインカクテル用量Ｘ／２モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス；１群あたりｎ＝６匹のマウス）では増加されない。スケールバー０．５μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図7a】異なる用量のカクテルＤ注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝４匹のマウス）の骨格筋損傷のマーカーである血漿クレアチンキナーゼ。
【図7d】図２ａ～ｃに対応する、サイトカイン単回３倍用量を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの１８時間アルブミン尿。カクテルＤ３倍後のそれらの死亡率が高いことを考慮すると、定時採尿のための代謝ケージ飼育は、この用量のＢＡＬＢ／ｃマウスでは実施不可能である。
【図7e】カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。広範な足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が認められた。
【図7f】カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色骨格筋。局所的炎症（黒色矢印）が一部の切片において認められた。
【図7g】ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス、用量Ｘ／２）におけるカクテルＣ誘導後、ＩＬ－４Ｒα、ＴＮＦＲ１、ＩＬ－１０Ｒβに対する抗体、又はコントロールＩｇＧを使用した受容体遮断後のアルブミン尿。スケールバー（ｅ）０．５μｍ、（ｆ）２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図8a】図８ａ－ｅは、中間用量損傷の組織学を示す。カクテルＤ１．８倍用量の注射後、モデル誘導後１時間で追加の抗体又はコントロールＩｇＧを注射した後に２４時間で安楽死させたＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）の試験からの組織学的切片（図３を参照）。各群の番号コードは以下のとおりである：「１」＝コントロールＩｇＧ；「２」＝抗ＴＮＦα抗体；「３」＝抗ＩＬ－６抗体；「４」＝抗ＩＬ－１０抗体；「５」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＦＮγ＋抗ＩＬ－４抗体；「６」＝抗ＩＬ４抗体；「７」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４＋抗ＩＬ－１０抗体；「８」＝抗ＩＦＮγ抗体；「９」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４抗体。（図８ａ）心臓及び心膜のＨ＆Ｅ染色切片の２列。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、心膜炎（橙色矢印）及び心膜微小石灰化（青色矢印）が認められた。
【図8b】肝臓のＨ＆Ｅ染色切片。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、変性変化（緑色矢印）及び再生変化（黄色矢印）が認められた。
【図8c】肉眼的な尿細管形態を示すトルイジンブルーで染色した腎臓のエポン切片。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。
【図8d】腎臓尿細管の電子顕微鏡写真。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。
【図8e】糸球体の電子顕微鏡写真。ポドサイト足突起消失領域（黒色矢印）が認められた。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ（ｃ）２０μｍ（ｄ）０．５μｍ（ｅ）０．５μｍ。
【図9a】図９ａ－ｄは、重度損傷モデルの組織学を示す。カクテルＤ３倍用量の注射し、モデル誘導後１時間で追加の抗体又は対照ＩｇＧを注射した後２４時間で安楽死させたＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）の試験からの組織学的切片（図４を参照）。各群の番号コードは以下のとおりである：「１」＝コントロールＩｇＧ；「２」＝抗ＩＬ－２抗体；「３」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－２抗体；「４」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－１３抗体；「５」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４抗体；「６」＝抗ＴＮＦα抗体；「７」＝抗ＩＬ－１３；「８」＝抗ＩＬ－４抗体；「９」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＦＮγ抗体；「１０」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－６抗体；「１１」＝抗ＩＦＮγ抗体；「１２」＝抗ＴＮＦα＋抗ＡＣＥ２抗体；「１３」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－１０抗体；「１４」＝抗ＩＬ－６抗体。（図９ａ）心臓及び心膜のＨ＆Ｅ染色切片の２列。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。
【図9b】肝臓のＨ＆Ｅ染色切片の２列。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、変性変化（緑色矢印）及び再生変化（黄色矢印）が認められた。
【図9c】肉眼的な尿細管形態を示すトルイジンブルーで染色した腎臓の切片２列。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。
【図9d】糸球体の画像を示す腎臓の電子顕微鏡写真２列。ポドサイト足突起消失領域（黒色矢印）が認められた。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ（ｃ）２０μｍ（ｄ）０．５μｍ。
【図10a】ＢＡＬＢ／ｃマウス糸球体におけるサイトカイン受容体の共焦点発現。白色矢印は、ポドサイト（Ｐ）、内皮細胞（Ｅ）、及びメサンギウム細胞（Ｍ）における受容体の発現を示す。ＴＮＦＲ１はポドサイトと内皮細胞とにおいて発現しているので、ポドサイトタンパク質であるネフリン（青色）との部分的な共局在のみが認められる。緑色は核染色である。
【図10b】ＢＡＬＢ／ｃマウスの腎尿細管におけるＡＣＥ－２及びサイトカイン受容体の共焦点発現（赤色）。ほとんどの画像は近位尿細管を示すが、ＩＬ－１０Ｒβの画像は集合管である。
【図10c】サイトカインカクテルを構成する組換えタンパク質を使用した枯渇試験に使用した抗体のウェスタンブロット特性決定。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ。
【図11a】図１１ａは、ヒトタンパク質アトラスプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）から集められたデータの概略図であり、サイトカイン受容体及びＡＣＥ２腎臓尿細管分節のおおよその分布及び半定量的発現を示す。
【図11b】サイトカイン受容体及び心筋のおおよその分布及び半定量的発現を示す。
【図11c】サイトカイン受容体及び肝臓のおおよその分布及び半定量的発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明は、様々なサイトカインを標的とするメカニズムを提供する。本発明は、死亡率及び末端臓器損傷を含むサイトカインストームの影響を排除又は低減するために枯渇させなければならないサイトカイン又は可溶性因子の特定の組合せについて記載する。
提供される方法の概要
本発明は、患者から１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させることを含む、患者におけるウイルス感染の結果としてのサイトカインストームの影響を阻害、治療又は予防する方法を提供する。
提供される方法の概要
本発明は、患者から１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させることを含む、患者におけるウイルス感染の結果としてのサイトカインストームの影響を阻害、治療又は予防する方法を提供する。
【0038】
本発明者らは、いずれかの実施形態において、サイトカインストームは、いずれかの呼吸器系ウイルス又は非呼吸器系ウイルスによって引き起こされるウイルス感染によって誘発され得ると考える。したがって、ウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの呼吸器系ウイルスを含むウイルス性疾患によって引き起こされる可能性があり、明白な直接的ウイルス感染がない場合であっても、非呼吸器系臓器に病理学的影響を及ぼす。さらに、ウイルス感染は、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、他のコロナウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及びエボラ出血熱などの他の呼吸器系ウイルス及び非呼吸器系ウイルスによって引き起こされる可能性があり、これらもまた、サイトカインストームを引き起こし、死亡率及び多臓器損傷を引き起こすことも知られている。さらに、本発明者らは、風邪（軽度の疾患を引き起こす。）と、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス感染によって引き起こされるより重度のサイトカインストームプロファイルとの間の大きな違いは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３に関連する「アレルギー経路」の随伴性急性活性化の存在であることを発見したので、本発明はまた、アレルギー経路の顕著な随伴性活性化を含むウイルス感染を含む。
【0039】
本発明の実施形態は以下を提供する。
【0040】
・重度のサイトカインストームによって引き起こされる死亡率を低減するために２種以上のサイトカインを枯渇させる方法；
・サイトカインストームによって引き起こされる急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷の影響を治療する方法。本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考える；
・サイトカインストームによって引き起こされる死亡率を低減する方法。本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考える；
・２種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、サイトカインストームによって誘発される多臓器損傷を予防する方法；
・１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療又は予防するための方法；
・１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む、ウイルス感染の再発を予防する方法；
・１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療する又は予防するための方法；
・サイトカインストームの影響を治療する又は予防する方法を試験するための、ウイルス感染及び他の疾患状態によって誘発されるサイトカインストームの動物モデル；及び、
・方法はウイルス感染を治療するためのものである。
・サイトカインストームによって引き起こされる急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷の影響を治療する方法。本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考える；
・サイトカインストームによって引き起こされる死亡率を低減する方法。本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考える；
・２種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、サイトカインストームによって誘発される多臓器損傷を予防する方法；
・１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療又は予防するための方法；
・１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む、ウイルス感染の再発を予防する方法；
・１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療する又は予防するための方法；
・サイトカインストームの影響を治療する又は予防する方法を試験するための、ウイルス感染及び他の疾患状態によって誘発されるサイトカインストームの動物モデル；及び、
・方法はウイルス感染を治療するためのものである。
【0041】
本発明者らはまた、本発明の方法が、非ウイルス起源の疾患、例えば、細菌感染症、真菌感染症若しくは寄生虫感染症、がん、臓器移植、又は糖尿病若しくはメタボリック症候群などの多臓器疾患の全身性サイトカイン環境の変化に起因する疾患を含む、サイトカインストームが起こるいずれかの疾患状態において使用できると考える。
【0042】
本発明者らは、開示された方法のいずれかにおいて、１種以上のサイトカインを阻害、中和又は枯渇させることができると考える。考えられる１つの方法は、１種以上のサイトカインに対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤の患者への投与である。ｓｈＲＮＡは作製することができる又は購入可能であり、それはプラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド、人工染色体を含む当技術分野で公知の任意のベクターに結合させることができる又はその一部となり得る。
【0043】
１種以上のサイトカインを枯渇させることについて考えられる別の方法は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の投与によるものである。さらに他の実施形態において、薬剤は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む。
【0044】
薬剤はまた、１種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【0045】
さらに他の実施形態において、薬剤は、サイトカイン媒介受容体に結合し、１種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストである。
【0046】
開示されたいずれかの実施形態において、阻害される、中和される又は枯渇される１種以上のサイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む。処置されるウイルス感染又は他の状態の重症度に応じて、２種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇が、単一のサイトカインの枯渇よりも効果的であり得ることは、本明細書の開示から理解されよう。
【0047】
本開示を通じて、様々な数量は、例えば、量、サイズ、寸法、比率などは、範囲形式で示される。範囲形式での数量の説明は、単に便宜上のもので簡潔にするためであり、いかなる実施形態の範囲に対しても柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲についての説明は、文脈上明白に別のことが示されていない限り、その範囲内の可能性のあるすべての部分範囲とすべての個別の数値を詳しく開示したものと考えるものとする。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの詳しく開示された部分範囲及びその範囲内の個々の値、例えば１．１、２、２．３、４．６２、５、５．９などを有すると考えるものとする。これは範囲の広さに関係なく適用される。これらの介在する範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれる場合があり、また記載された範囲内において任意の特に除外される限定を条件として、本開示の範囲内に包含される。記載された範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、文脈上明白に別のことが指示されていない限り、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
【0048】
本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、いかなる実施形態も限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明白に別のことを示さない限り、複数形も含むことを意図する。本明細書で使用される場合の「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではないことはさらに理解されよう。本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語には、列挙された関連する項目の１つ以上の任意の組合せ及びすべての組合せが含まれる。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」という形式においてリストに含まれる項目は、（Ａ）；（Ｂ）；（Ｃ）；（Ａ及びＢ）；（Ｂ及びＣ）；（Ａ及びＣ）；又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味し得ることに留意されたい。同様に、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」という形式においてリストされる項目は、（Ａ）；（Ｂ）；（Ｃ）；（Ａ及びＢ）；（Ｂ及びＣ）；（Ａ及びＣ）；又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味し得る。
【0049】
特に明記されていない限り、又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、数値又は数値範囲に関する「約」という用語は、記載された数値及びその＋／－１０％の数値、又は範囲として挙げられた値については、挙げられた下限値の１０％を下回り、また挙げられた上限値の１０％を上回ることを意味すると理解する。
【0050】
本明細書に開示されるいずれかの実施形態において、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語には、既存の症状又は障害の進行又は重症度を抑制すること、遅延させること、停止させること、又は逆転させることが含まれる。
【0051】
本明細書で開示されるいずれかの実施形態において、「患者」という用語はヒトを指す。
【0052】
サイトカイン阻害剤
本発明は、様々なサイトカインがいくつかの異なる非限定的な方法によって中和又は阻害され得ることを企図している。例えば、本明細書に記載のように、標的サイトカインは、１種以上のサイトカイン（ｓｈ－「サイトカイン」）に対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。一部の実施形態において、ｓｈ－「サイトカイン」は市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合させる又はその一部とすることができる。
本発明は、様々なサイトカインがいくつかの異なる非限定的な方法によって中和又は阻害され得ることを企図している。例えば、本明細書に記載のように、標的サイトカインは、１種以上のサイトカイン（ｓｈ－「サイトカイン」）に対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。一部の実施形態において、ｓｈ－「サイトカイン」は市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合させる又はその一部とすることができる。
【0053】
代替的には、本明細書に記載のように、１つ又は複数の標的サイトカインは、１つ又は複数の特定の標的サイトカインに対する抗体、二価抗体、又はモノクローナル抗体を含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。
【0054】
さらに、本明細書に記載のように、１つ又は複数の標的サイトカインは、１つ又は複数の標的サイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。
【0055】
また、本明細書において企図されるように、１つ又は複数の標的サイトカインは、標的サイトカイン媒介受容体に結合し、１つ又は複数の標的サイトカインの結合を防止するアンタゴニストを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。
【0056】
１つ又は複数の標的サイトカイン阻害剤又はその組成物は、１日１回、１日２回以上、又は１週間に１回投与することができる。１つ又は複数の標的サイトカイン阻害剤又はそれを含有する組成物は、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は静脈内投与を含む任意の従来の手段により対象に投与することができる。注射する場合、１回の投与につき単一の部位に注射することも、１回の投与につき複数の部位に注射することもできる。
【0057】
サイトカイン抗体及び関連の阻害剤
より詳しくは、サイトカイン阻害剤は、本明細書に開示のように任意のサイトカインに対する抗体である。１つ以上の標的サイトカインに対する適切な抗体の例は、本明細書に開示されており、当業者に公知である。サイトカイン抗体はまた、１つ以上の標的サイトカインを阻害する抗体断片若しくは二価抗体又はその断片も含み得る。本明細書に記載のように、サイトカイン阻害剤は医薬組成物の一部であってもよく、この組成物は、１つ以上の標的サイトカインに対する抗体又はその断片のいずれかを含み得る。
より詳しくは、サイトカイン阻害剤は、本明細書に開示のように任意のサイトカインに対する抗体である。１つ以上の標的サイトカインに対する適切な抗体の例は、本明細書に開示されており、当業者に公知である。サイトカイン抗体はまた、１つ以上の標的サイトカインを阻害する抗体断片若しくは二価抗体又はその断片も含み得る。本明細書に記載のように、サイトカイン阻害剤は医薬組成物の一部であってもよく、この組成物は、１つ以上の標的サイトカインに対する抗体又はその断片のいずれかを含み得る。
【0058】
本明細書に記載の抗サイトカイン抗体は、市販されているものを含め、当技術分野で公知の任意の手段によって作製又は入手することができる。また、抗体は特定のサイトカインタンパク質と特異的に反応することができる又はポリペプチドもまたアンタゴニストとして使用することもできると考えられる。本明細書における抗サイトカイン抗体は、サイトカインに結合する抗体若しくはその断片、又は２種の異なるサイトカインに結合する二価抗体であり得る。
【0059】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然のものである又は部分的に若しくは完全に合成的に生成されたものかを問わず、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインである又は抗原結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も網羅する。この用語は、「抗原結合断片」及び以下に記載のものなど、類似の結合断片を表す他の交換可能な用語をさらに含む。
【0060】
天然抗体及び天然免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されている。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、鎖内に規則的な間隔でジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＨ」又は「ＶＨ」）を有し、その後にいくつかの定常ドメイン（「ＣＨ」又は「ＣＨ」）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＬ」又は「ＶＬ」）を有し、その別の一端に定常ドメイン（「ＣＬ」又は「ＣＬ」）を有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられる。
【0061】
本明細書に記載のサイトカイン阻害剤は、「合成遺伝子」に由来する「合成ポリヌクレオチド」に由来する「合成ポリペプチド」であり得るが、これは、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はアミノ酸配列若しくはその一部が、同等の天然配列と比較して、設計された、又は新規に合成された若しくは改変された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体又は抗原結合断片）又は合成遺伝子は、限定するものではないが、核酸配列又はアミノ酸配列の化学合成を含む、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。合成遺伝子は、典型的には、アミノ酸レベル又はポリヌクレオチドレベル（又はその両方）で天然遺伝子とは異なっており、また典型的には、合成発現制御配列のコンテキスト内に配置されている。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して、必ずしも異なるアミノ酸を有するタンパク質をコードするとは限らない。例えば、これらの配列はまた、異なるコドンを組み込んでいるが同じアミノ酸をコードする合成ポリヌクレオチド配列も含み得る（すなわち、ヌクレオチドの変化はアミノ酸レベルでのサイレント突然変異を表す。）。
【0062】
抗サイトカイン抗体に関して、「抗原」という用語は、それぞれ、本明細書に開示のサイトカインタンパク質のいずれ又はそのタンパク質分子のいずれかの断片を指す。
【0063】
「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」又は「抗体の機能性断片」という用語は、本明細書では、１種以上のサイトカインに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指すように交換可能に使用される。
【0064】
サイトカイン抗体はまた、「ダイアボディ」が含まれることが想定され、これは２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインの間で対になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対になることが強いられ、２つの抗原結合部位が作製される。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４ ６４４８頁（１９９３）を参照されたい。
【0065】
サイトカイン抗体にはまた、非ヒト（例えばマウス）抗体の「キメラ」形態も含み得ることが想定され、これには非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体が含まれる。ほとんどの場合、キメラ抗体は、マウス Ｆｃ の代わりに、通常はヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部が挿入されたマウス抗体である。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５頁（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２９頁（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３～５９６頁（１９９２）を参照されたい。
【0066】
サイトカイン抗体はまた、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す「モノクローナル抗体」も含み得ることが想定され、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生可能な変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含み得る従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法によって作製され得る又はファージ抗体から単離され得る。
【0067】
本明細書で使用する場合、「免疫反応性」とは、サイトカインタンパク質上のアミノ酸残基の配列（「結合部位」又は「エピトープ」）に特異的であるが、他のペプチド／タンパク質と交差反応性である場合でも、ヒト使用への投与用に製剤化されるレベルでは毒性がない結合剤、抗体又はその断片を指す。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指し、塩橋及び水橋などの相互作用並びに他の従来の結合手段が含まれる。「優先的に結合する」という用語は、結合剤が、無関係なアミノ酸配列に結合するよりも高い親和性で結合部位に結合することを意味する。
【0068】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的な結合の平衡定数を指し、Ｋｄとして表される。リガンドに対する結合タンパク質の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）であり得る。本明細書で使用される場合、「結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）」という用語は、２つ以上の薬剤の複合体の希釈後の解離に対する抵抗性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの方法、又は当業者によく知られている任意の他の技術によって決定することができる。結合活性は、スキャッチャード分析などの方法、又は当業者によく知られている任意の他の技術によって決定することができる。
【0069】
「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することが可能な抗原又は他の巨大分子の部分を指す。
【0070】
「特異的」という用語は、抗体によって認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子に抗体がいかなる有意な結合も示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインがいくつかの抗原によって担持される特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、その場合、抗体はエピトープを担持する様々な抗原に結合することができる。「優先的に結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体が無関係なアミノ酸配列に結合するよりも高い親和性でエピトープに結合し、そのエピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応性がある場合でも、ヒト使用への投与用に製剤化されたレベルでは毒性がないことを意味する。
【0071】
「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指し、塩橋及び水橋などの相互作用並びに任意の他の従来の結合手段が含まれる。
【0072】
本明細書で検討されているように、標的サイトカイン阻害剤は、遺伝子発現技術によって生成することができる。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシング又は低下を指す。これは、サイレンシングされた遺伝子の配列と二重鎖領域において相同性があるｓｉＲＮＡによって開始される、動物及び植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、生物にとって内因性であっても外因性であってもよく、染色体に組み込まれて存在する又はゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全に又は部分的に阻害される。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得る。標的ＲＮＡの機能は、完全又は部分的であり得る。
【0073】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８～２５ヌクレオチド長の二重鎖又は二本鎖領域を含む。多くの場合、ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に約２～４個の不対ヌクレオチドを含有する。ｓｉＲＮＡの二重鎖又は二本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子と実質的に相同である又は実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス鎖」であり、標的ＲＮＡ分子に相同な鎖は「センス鎖」であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖にも相補的である。ｓｉＲＮＡはまた、追加の配列も含有し得る。そのような配列の非限定的な例としては、連結配列、又はループ、及びステム、並びに他の折り畳み構造が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物及び脊椎動物におけるＲＮＡ干渉の誘発、並びに植物における転写後遺伝子サイレンシングの際の配列特異的ＲＮＡ分解の誘発で重要な媒介として機能するように思われる。
【0074】
また、本明細書で実施例に開示されているように、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用することにより、任意のサイトカイン遺伝子をサイレンシング又は「オフ」にすることができることも検討される。
【0075】
「急性期後後遺症」
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＣＯＶＩＤ－１９の「急性期後後遺症」は、「ロングＣＯＶＩＤ」とも呼ばれ、本明細書では、ＣＯＶＩＤ－１９の原因となるウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に一次感染した後、数週間から数か月後に経験される可能性のある、本発明の一部として記載の長期的な症状又は影響のいずれかを表すために使用される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＣＯＶＩＤ－１９の「急性期後後遺症」は、「ロングＣＯＶＩＤ」とも呼ばれ、本明細書では、ＣＯＶＩＤ－１９の原因となるウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に一次感染した後、数週間から数か月後に経験される可能性のある、本発明の一部として記載の長期的な症状又は影響のいずれかを表すために使用される。
【0076】
一般的な方法
ＣＯＶＩＤ及び風邪のサイトカインカクテル並びに関連の動物試験
実施されたすべての動物試験は、ラッシュ大学又はアラバマ大学バーミンガム校のＩＡＣＵＣによって承認された。すべての動物は、プロトコルに従って人道的扱いを受けた。Ｄｙｎａｂｅａｄによるマウス糸球体の分離、ふるい分けによるラット糸球体の分離、組織切片の組織保存、給餌しない代謝ケージでの１８時間の採尿、アルブミン尿及びタンパク尿の評価、リアルタイムＰＣＲ、共焦点イメージング、電子顕微鏡検査及びサンプル処理、光学顕微鏡検査のための組織学検査、ウェスタンブロット法及び共免疫沈降法の方法は、既に記載されており、公知である。以下を、血清サンプルを使用する市販のキットを使用してアッセイした；マウスＡＬＴ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｋ７５２－１００）、マウス心臓トロポニンＩタイプ３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢＰ３－００４５６）、マウスクレアチンキナーゼ（Ａｂｅａｍ ａｂ１５５９０１）及びヒトＩＬ－４Ｒα ＥＬＩＳＡ（Ａｂｅａｍ ａｂ４６０２２）。以下の抗体をウェスタンブロット用に購入した：抗ｐＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ｃａｔ ＃ ５６５５４、１：５００希釈）；抗ＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃ ５３９７、１：５００希釈）。ＺＨＸ１、ＺＨＸ２、及びＺＨＸ３に対する抗体は、既に記載されている２５、３７、３８。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｌｉｕら、「ＺＨＸ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，」 （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：３９６８１～３９６９２頁；Ｃｌｅｍｅｎｔら、「Ｅａｒｌｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，」 （２００７） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７２：３３７～３４７頁。
ＣＯＶＩＤ及び風邪のサイトカインカクテル並びに関連の動物試験
実施されたすべての動物試験は、ラッシュ大学又はアラバマ大学バーミンガム校のＩＡＣＵＣによって承認された。すべての動物は、プロトコルに従って人道的扱いを受けた。Ｄｙｎａｂｅａｄによるマウス糸球体の分離、ふるい分けによるラット糸球体の分離、組織切片の組織保存、給餌しない代謝ケージでの１８時間の採尿、アルブミン尿及びタンパク尿の評価、リアルタイムＰＣＲ、共焦点イメージング、電子顕微鏡検査及びサンプル処理、光学顕微鏡検査のための組織学検査、ウェスタンブロット法及び共免疫沈降法の方法は、既に記載されており、公知である。以下を、血清サンプルを使用する市販のキットを使用してアッセイした；マウスＡＬＴ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｋ７５２－１００）、マウス心臓トロポニンＩタイプ３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢＰ３－００４５６）、マウスクレアチンキナーゼ（Ａｂｅａｍ ａｂ１５５９０１）及びヒトＩＬ－４Ｒα ＥＬＩＳＡ（Ａｂｅａｍ ａｂ４６０２２）。以下の抗体をウェスタンブロット用に購入した：抗ｐＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ｃａｔ ＃ ５６５５４、１：５００希釈）；抗ＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃ ５３９７、１：５００希釈）。ＺＨＸ１、ＺＨＸ２、及びＺＨＸ３に対する抗体は、既に記載されている２５、３７、３８。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｌｉｕら、「ＺＨＸ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，」 （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：３９６８１～３９６９２頁；Ｃｌｅｍｅｎｔら、「Ｅａｒｌｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，」 （２００７） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７２：３３７～３４７頁。
【0077】
すべてのサイトカイン、可溶性受容体及び抗体は、げっ歯類に静脈内注射され、以下にリストアップされている：
【0078】
【表1】
【0079】
枯渇試験に使用された抗体は、対応する組換えタンパク質を使用したウェスタンブロットによって特性決定された。各用量のサイトカインカクテルは、最終容量１００μＬの滅菌０．９％生理食塩水に溶解させた。ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）マウス及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｅｎｖｉｇｏ）マウスを８週齢で購入し、２週間馴化させ、ベースラインの１８時間採尿及び尾部血液サンプル採取を実施した。追加のベースライン採尿をＢＡＬＢ／ｃＪマウスに対して実施した。ほとんどのインビボ試験は、１０週齢～１５週齢の間に実施した。Ｅｎｐｅｐ－／－２５；Ｚｈｘ２ｄｅｆ／ｄｅｆの混合バックグラウンドは、Ｅｎｐｅｐ－／－２５とＺｈｘ２欠損ＢＡＬＢ／ｃＪマウスとの間のＦ２交配によって得られた。サイトカインカクテルの腎炎発症用量スペクトルは、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＬ４ｒ－／－マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に対して確立された。閾値腎炎原性用量（ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｉ１４ｒ－／－のＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンド、Ｘ／２）を使用するマウスサイトカイン試験の際、血管内水分補給を維持するために、サイトカインカクテルの静脈内投与直後に１００μＬの０．９％生理食塩水を腹腔内投与した。中間カクテルモデル及び高カクテルモデルにおいて、６時間及び２３時間に０．９％生理食塩水１００μＬを２回、追加腹腔内注射した。サイトカイン枯渇試験において、マウスサイトカインカクテル投与後の１時間に、異なるマウス群に５０μｇのコントロールＩｇＧ又はそれぞれの抗体若しくは抗体の組合せを静脈内投与した。
【0080】
血漿クレアチニンの質量分析アッセイ
血清クレアチニンは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステムと、２ｘ５０ｍｍ、２μｍのＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ－ＧＥＬ ａｍｉｄｅ－８０ ＬＣカラムを組み合わせて使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５３連４重極質量分析計に接続したＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。オーブン温度は４０℃で固定した。移動相は、ＬＣＭＳグレードの水（３５％）及びＬＣＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ；６５％）中の１０ｍＭ酢酸アンモニウムで構成した。合成クレアチニン（２０μｇ／ｍｌ～０．１６μｇ／ｍｌ範囲；Ｓｉｇｍａ）及び同位体標識クレアチニン（Ｄ３－クレアチニン、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ標準及び内部標準として使用した。次いで、１０ｕｌのサンプル又は標準を５μｌの内部標準及び２３５ｕｌの１００％ＡＣＮと合わせ、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＬＣＭＳグレードの水に溶解した１０ｍＭ酢酸アンモニウムと６５％アセトニトリル２００μＬとを入れた新しいチューブに上清を移し、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行い、その後測定した。すべてのサンプルは２回測定した。
血清クレアチニンは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステムと、２ｘ５０ｍｍ、２μｍのＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ－ＧＥＬ ａｍｉｄｅ－８０ ＬＣカラムを組み合わせて使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５３連４重極質量分析計に接続したＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。オーブン温度は４０℃で固定した。移動相は、ＬＣＭＳグレードの水（３５％）及びＬＣＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ；６５％）中の１０ｍＭ酢酸アンモニウムで構成した。合成クレアチニン（２０μｇ／ｍｌ～０．１６μｇ／ｍｌ範囲；Ｓｉｇｍａ）及び同位体標識クレアチニン（Ｄ３－クレアチニン、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ標準及び内部標準として使用した。次いで、１０ｕｌのサンプル又は標準を５μｌの内部標準及び２３５ｕｌの１００％ＡＣＮと合わせ、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＬＣＭＳグレードの水に溶解した１０ｍＭ酢酸アンモニウムと６５％アセトニトリル２００μＬとを入れた新しいチューブに上清を移し、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行い、その後測定した。すべてのサンプルは２回測定した。
【0081】
ヒトゲノムＤＮＡ及びヒト腎生検の提供元
ネフローゼ症候群の患者３６名、コントロールとなる対象３３名、及び糖尿病性腎症の患者１６名からのゲノムＤＮＡサンプルは、以下の提供元から入手した。（ａ）ＤＮＡ、血液、尿サンプルを収集するためのＩＲＢ承認プロトコルＸ０８０８１３００１により取得した、アラバマ大学バーミンガム校のネフローゼ症候群患者の血漿からの不死化単球、（ｂ）糸球体疾患患者からの保存された腎生検又は健康な生きた血縁の腎ドナーからの移植前腎生検が含まれる、メキシコシティの国立心臓研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ）でのＩＲＢ承認の研究（ＣＯＮＡＣＹＴ ３４７５１Ｍ、ＣＯＮＡＣＹＴ １１－０５、ＤＰＡＧＡ－ＵＮＡＭ ＩＮ－２０１９０２）、（ｃ）ペルーのリマ、アルベルト・サボガル・エッサルド国立病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｓａｂｏｇａｌ Ｅｓｓａｌｕｄ）からのＩＲＢ免除の保存された腎生検、（ｄ）ポドサイト発現関連遺伝子に公知の変異を持つ、デューク分子生理学研究所（Ｄｕｋｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの既発表４３，４４のＦＳＧＳ患者の保存されたヒトＤＮＡ、（ｅ）１０００ゲノムプロジェクト及びＨＡＰＭＡＰプロジェクトからのＤＮＡを保存する、コーリエル細胞貯蔵機関（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）。症例とコントロールとの間の分析比較のため、１０００ゲノムプロジェクト・フェーズ３ Ｅｎｓａｍｂｌ ｖ８４を単一の追加コントロールとして含めた。
ネフローゼ症候群の患者３６名、コントロールとなる対象３３名、及び糖尿病性腎症の患者１６名からのゲノムＤＮＡサンプルは、以下の提供元から入手した。（ａ）ＤＮＡ、血液、尿サンプルを収集するためのＩＲＢ承認プロトコルＸ０８０８１３００１により取得した、アラバマ大学バーミンガム校のネフローゼ症候群患者の血漿からの不死化単球、（ｂ）糸球体疾患患者からの保存された腎生検又は健康な生きた血縁の腎ドナーからの移植前腎生検が含まれる、メキシコシティの国立心臓研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ）でのＩＲＢ承認の研究（ＣＯＮＡＣＹＴ ３４７５１Ｍ、ＣＯＮＡＣＹＴ １１－０５、ＤＰＡＧＡ－ＵＮＡＭ ＩＮ－２０１９０２）、（ｃ）ペルーのリマ、アルベルト・サボガル・エッサルド国立病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｓａｂｏｇａｌ Ｅｓｓａｌｕｄ）からのＩＲＢ免除の保存された腎生検、（ｄ）ポドサイト発現関連遺伝子に公知の変異を持つ、デューク分子生理学研究所（Ｄｕｋｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの既発表４３，４４のＦＳＧＳ患者の保存されたヒトＤＮＡ、（ｅ）１０００ゲノムプロジェクト及びＨＡＰＭＡＰプロジェクトからのＤＮＡを保存する、コーリエル細胞貯蔵機関（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）。症例とコントロールとの間の分析比較のため、１０００ゲノムプロジェクト・フェーズ３ Ｅｎｓａｍｂｌ ｖ８４を単一の追加コントロールとして含めた。
【0082】
Ａｇｉｌｅｎｔカスタムキャプチャー及びハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング
第８染色体上のＨＡＳ２とＺＨＸ２との間のゲノム間隔を分離するために、カスタムキャプチャーシーケンスパネルを作製した。標的間隔は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）のＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにアップロードされた。ゲノムＤＮＡライブラリーの調製及び間隔キャプチャーは、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＱＸＴ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキットを使用して行った。得られたＤＮＡライブラリーはＱＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）により定量化し、標準プロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００又はＮｅｘｔＳｅｑ ５００でペアエンド１００ｂｐシーケンスによりシーケンスした。約１，５００万個の配列が反応ごとに得られた。ＦＡＳＴＱファイルの生成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）のｂｃｌ２ｆａｓｔｑコンバーターを使用して行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェア（バージョン１２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を使用して、ペアのＩｌｌｕｍｉｎａ配列をｈｇ３８データベース（ＧＲＣｈ３８．ｐｌ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）と比較した。３ｂｐサイズ以上の挿入及び欠失、並びに最低２０シーケンスの読み取りを分析のために選択した。試験の対象及びコントロールの対象における挿入及び欠失のフィッシャー検定比較がＥｘｃｅｌ形式でエクスポートされ、その後、コントロールに存在するすべての挿入及び欠失がソフトウェア支援及び手動により除外された。ＩＧＶブラウザソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して続いて確認された挿入及び欠失のみを含めた。ホモ接合性の確立には、８５％超の配列にＩｎＤｅｌの存在すること、またその後ＩＧＶにより確認することが必要であった。挿入又は欠失の部位にわずかな不一致（１～２塩基対の位置の相違）が２つのソフトウェア間で時折認められた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試験の設計の間にサンガーシーケンスによって解決された。すべてのゲノムの番号付けは、ｈｇ３８及びＣＬＣゲノミクスソフトウェアに基づいている。
第８染色体上のＨＡＳ２とＺＨＸ２との間のゲノム間隔を分離するために、カスタムキャプチャーシーケンスパネルを作製した。標的間隔は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）のＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにアップロードされた。ゲノムＤＮＡライブラリーの調製及び間隔キャプチャーは、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＱＸＴ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキットを使用して行った。得られたＤＮＡライブラリーはＱＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）により定量化し、標準プロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００又はＮｅｘｔＳｅｑ ５００でペアエンド１００ｂｐシーケンスによりシーケンスした。約１，５００万個の配列が反応ごとに得られた。ＦＡＳＴＱファイルの生成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）のｂｃｌ２ｆａｓｔｑコンバーターを使用して行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェア（バージョン１２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を使用して、ペアのＩｌｌｕｍｉｎａ配列をｈｇ３８データベース（ＧＲＣｈ３８．ｐｌ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）と比較した。３ｂｐサイズ以上の挿入及び欠失、並びに最低２０シーケンスの読み取りを分析のために選択した。試験の対象及びコントロールの対象における挿入及び欠失のフィッシャー検定比較がＥｘｃｅｌ形式でエクスポートされ、その後、コントロールに存在するすべての挿入及び欠失がソフトウェア支援及び手動により除外された。ＩＧＶブラウザソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して続いて確認された挿入及び欠失のみを含めた。ホモ接合性の確立には、８５％超の配列にＩｎＤｅｌの存在すること、またその後ＩＧＶにより確認することが必要であった。挿入又は欠失の部位にわずかな不一致（１～２塩基対の位置の相違）が２つのソフトウェア間で時折認められた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試験の設計の間にサンガーシーケンスによって解決された。すべてのゲノムの番号付けは、ｈｇ３８及びＣＬＣゲノミクスソフトウェアに基づいている。
【0083】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した培養ヒトポドサイトのゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９に関する基本的な方法論は既に発表されている。Ｃｏｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」 （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９～８２３頁を参照されたい。確立された初期継代不死化ヒトポドサイト細胞株５１から単一細胞由来の細胞クローンが作製され、ゲノム編集試験に使用された。使用したオリゴヌクレオチド及びプライマーを表４に挙げている。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９に関する基本的な方法論は既に発表されている。Ｃｏｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」 （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９～８２３頁を参照されたい。確立された初期継代不死化ヒトポドサイト細胞株５１から単一細胞由来の細胞クローンが作製され、ゲノム編集試験に使用された。使用したオリゴヌクレオチド及びプライマーを表４に挙げている。
【0084】
【表2】
【0085】
ＣＲＩＳＰＲ Ｂ
ｓｇＲＮＡプラスミドの作製：１０ｂｐの挿入（ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ）を導入するために、挿入部位の４５ｂｐ下流の特定の部位（Ｃｈｒ８～１２２、５３３、６９４～１２２、５３３、６９５）を認識するｓｇＲＮＡをＢｅｎｃｈｌｉｎｇのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を使用して設計した。オリゴＧ００１６及びＧ００１７を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化及びアニールし、ＢｂｓＩで消化し、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇからの提供、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）にライゲーションした。ライゲーション産物をＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理して不必要な組換え産物を防止し、次いで、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。１０個のコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。プラスミドＤＮＡは、プライマーＫＩ１４５を使用して配列決定した（表４を参照されたい。）。
ドナープラスミドの作製：研究対象の挿入を含む患者Ｅ５８－１３のヒトゲノム配列は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、特定の患者ゲノムＤＮＡ、並びにプライマーＫＩ１９５及びＫＩ１９６を使用して増幅され、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位との間のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターにクローニングされた。ＫＩ２０７を使用してプラスミドＤＮＡを配列決定し、挿入の存在を確認した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）並びにプライマーのＫ１２１５及びＫ１２１６を使用してＰＡＭ配列に単一変異を作製し、このドナー鋳型プラスミドの切断を防止し、配列決定によってその変化を確認した。次に、このプラスミドをプライマーのＫ１２１９及びＫ１２２０を使用して線状で増幅し、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化し、残存する環状鋳型プラスミドを除去した。ＩＴＲ配列によって挟まれた抗生物質選択カセット（ピューロマイシン耐性及び切断型チミジンキナーゼ）を、プライマーのＫ１２１７及びＫ１２１８を使用してＰＢ－ＭＶ１ Ｐｕｒｏ－ＴＫプラスミド（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して挿入の７８ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミド（上記参照）ライゲーションした。ＮＥＢ（登録商標）５－アルファコンピテントイー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を２μｌのアセンブリ反応産物で形質転換した。１０コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、プライマーＫ１２１７を使用して配列決定し、正しいアセンブリを確認した。
ｓｇＲＮＡ及びドナープラスミドを使用するゲノム編集：腎臓病患者において確認されたＩｎＤｅｌをインビトロ複製するために、単一細胞由来の培養ヒトポドサイトを、特異的ｓｇＲＮＡを含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター並びに、ドナー配列及び抗生物質選択カセットを含有するドナープラスミドを用いたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム、０．２ｃｍキュベット、矩形波モード、１５０Ｖ、１０ミリ秒パルス）によってトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｇｉｂｃｏ）で１５日間のインキュベートにより非トランスフェクト細胞を除去した後、１０μｇの切除のみの（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ－ｏｎｌｙ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクター（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎｅ）をトランスフェクトし、抗生物質選択カセットを傷跡なく除去した。トランスフェクション後４日に、細胞を２．５μＭのガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、残存する切断型チミジンキナーゼ活性を持つ細胞を除去した。単一細胞をピックアップし、クローンを確立し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにプライマーＫＩ１８９及びＫＩ１８８を使用して標的領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲル精製し、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、挿入はＭｌ３フォワード・シーケンシング・プライマーを使用して配列決定した。配列は、天然のポドサイトゲノム配列及びドナーの鋳型配列とＢＬＡＳＴによりアラインメントした。
ｓｇＲＮＡプラスミドの作製：１０ｂｐの挿入（ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ）を導入するために、挿入部位の４５ｂｐ下流の特定の部位（Ｃｈｒ８～１２２、５３３、６９４～１２２、５３３、６９５）を認識するｓｇＲＮＡをＢｅｎｃｈｌｉｎｇのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を使用して設計した。オリゴＧ００１６及びＧ００１７を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化及びアニールし、ＢｂｓＩで消化し、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇからの提供、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）にライゲーションした。ライゲーション産物をＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理して不必要な組換え産物を防止し、次いで、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。１０個のコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。プラスミドＤＮＡは、プライマーＫＩ１４５を使用して配列決定した（表４を参照されたい。）。
ドナープラスミドの作製：研究対象の挿入を含む患者Ｅ５８－１３のヒトゲノム配列は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、特定の患者ゲノムＤＮＡ、並びにプライマーＫＩ１９５及びＫＩ１９６を使用して増幅され、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位との間のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターにクローニングされた。ＫＩ２０７を使用してプラスミドＤＮＡを配列決定し、挿入の存在を確認した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）並びにプライマーのＫ１２１５及びＫ１２１６を使用してＰＡＭ配列に単一変異を作製し、このドナー鋳型プラスミドの切断を防止し、配列決定によってその変化を確認した。次に、このプラスミドをプライマーのＫ１２１９及びＫ１２２０を使用して線状で増幅し、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化し、残存する環状鋳型プラスミドを除去した。ＩＴＲ配列によって挟まれた抗生物質選択カセット（ピューロマイシン耐性及び切断型チミジンキナーゼ）を、プライマーのＫ１２１７及びＫ１２１８を使用してＰＢ－ＭＶ１ Ｐｕｒｏ－ＴＫプラスミド（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して挿入の７８ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミド（上記参照）ライゲーションした。ＮＥＢ（登録商標）５－アルファコンピテントイー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を２μｌのアセンブリ反応産物で形質転換した。１０コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、プライマーＫ１２１７を使用して配列決定し、正しいアセンブリを確認した。
ｓｇＲＮＡ及びドナープラスミドを使用するゲノム編集：腎臓病患者において確認されたＩｎＤｅｌをインビトロ複製するために、単一細胞由来の培養ヒトポドサイトを、特異的ｓｇＲＮＡを含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター並びに、ドナー配列及び抗生物質選択カセットを含有するドナープラスミドを用いたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム、０．２ｃｍキュベット、矩形波モード、１５０Ｖ、１０ミリ秒パルス）によってトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｇｉｂｃｏ）で１５日間のインキュベートにより非トランスフェクト細胞を除去した後、１０μｇの切除のみの（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ－ｏｎｌｙ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクター（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎｅ）をトランスフェクトし、抗生物質選択カセットを傷跡なく除去した。トランスフェクション後４日に、細胞を２．５μＭのガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、残存する切断型チミジンキナーゼ活性を持つ細胞を除去した。単一細胞をピックアップし、クローンを確立し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにプライマーＫＩ１８９及びＫＩ１８８を使用して標的領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲル精製し、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、挿入はＭｌ３フォワード・シーケンシング・プライマーを使用して配列決定した。配列は、天然のポドサイトゲノム配列及びドナーの鋳型配列とＢＬＡＳＴによりアラインメントした。
【0086】
ＣＲＩＳＰＲ Ａ
全体的な方法は、使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド、並びに以下の部位固有の詳細を除いて、ＣＲＩＳＰＲ Ｂの場合と同じであった。８ｂｐの挿入物（ＴＧＧＡＴＧＧＡ）をＣｈｒ８～１２２、３０４、０９４～１２２、３０４、０９５）に導入し、挿入部位の７３ｂｐ上流の特定の部位を認識するようにｓｇＲＮＡを設計した。ドナープラスミドを作製する際、患者特異的ゲノムＤＮＡ（患者ＳＦ３）をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターのＳｐｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングした。ギブソンアセンブリの際、抗生物質耐性カセットを、挿入の５１ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミドとライゲートした。
全体的な方法は、使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド、並びに以下の部位固有の詳細を除いて、ＣＲＩＳＰＲ Ｂの場合と同じであった。８ｂｐの挿入物（ＴＧＧＡＴＧＧＡ）をＣｈｒ８～１２２、３０４、０９４～１２２、３０４、０９５）に導入し、挿入部位の７３ｂｐ上流の特定の部位を認識するようにｓｇＲＮＡを設計した。ドナープラスミドを作製する際、患者特異的ゲノムＤＮＡ（患者ＳＦ３）をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターのＳｐｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングした。ギブソンアセンブリの際、抗生物質耐性カセットを、挿入の５１ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミドとライゲートした。
【0087】
インビトロでのＳＴＡＴ６シグナル伝達試験
野生型（ＣＲＩＳＰＲ改変ポドサイトの前駆体）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｂポドサイトを、熱不活化１０％ウシ胎児血清、１％インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－カタログ番号４１４０００４５）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で３３℃にて培養した。細胞を継代培養し、１０ｃｍ培養皿に５０，０００個細胞／皿で播種し、３７℃で３日間培養した。次に、培養培地を、熱不活性化０．２％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０と交換した。２４時間後、細胞をカクテルＣ又は風邪カクテル（Ｘ／１００，０００）で１０分間、２０分間及び３０分間処理した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して単離した（１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤がそれぞれ１錠ずつ含まれていた。）。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価した。
野生型（ＣＲＩＳＰＲ改変ポドサイトの前駆体）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｂポドサイトを、熱不活化１０％ウシ胎児血清、１％インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－カタログ番号４１４０００４５）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で３３℃にて培養した。細胞を継代培養し、１０ｃｍ培養皿に５０，０００個細胞／皿で播種し、３７℃で３日間培養した。次に、培養培地を、熱不活性化０．２％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０と交換した。２４時間後、細胞をカクテルＣ又は風邪カクテル（Ｘ／１００，０００）で１０分間、２０分間及び３０分間処理した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して単離した（１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤がそれぞれ１錠ずつ含まれていた。）。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価した。
【0088】
ＩＬ－４Ｒαアッセイ用のＣＯＶＩＤ－１９患者及びコントロール患者からヒト血漿
ヒト血漿の１００μＬアリコートは、次の提供元から入手した。（ａ）ラッシュ（Ｒｕｓｈ）大学のＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｂ）タンパク尿の存在に関して選択された、ラッシュ大学 ＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｃ）Ｚｅｎｂｉｏ（Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、米国）から購入した、年齢、性別、人種をａ群とマッチングさせた匿名化された血漿サンプル。
ヒト血漿の１００μＬアリコートは、次の提供元から入手した。（ａ）ラッシュ（Ｒｕｓｈ）大学のＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｂ）タンパク尿の存在に関して選択された、ラッシュ大学 ＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｃ）Ｚｅｎｂｉｏ（Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、米国）から購入した、年齢、性別、人種をａ群とマッチングさせた匿名化された血漿サンプル。
【0089】
統計分析
すべてのグラフの値は、平均＋標準誤差である。２つの群に関与するタンパク尿、アルブミン尿、又は遺伝子発現の差異については、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１３で独立スチューデントｔ検定を使用した。特に指定のない限り、すべての有意性は両側検定である。
すべてのグラフの値は、平均＋標準誤差である。２つの群に関与するタンパク尿、アルブミン尿、又は遺伝子発現の差異については、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１３で独立スチューデントｔ検定を使用した。特に指定のない限り、すべての有意性は両側検定である。
【0090】
以下の実験の実施例をさらに参照されたい。
【実施例】
【0091】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明する目的で提供されており、本開示をいかなる形態に置いても限定することを意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在のところ好ましい実施形態を代表するものであり、単なる例示として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含されるそこでの変更及び他の使用は、当業者には自明である。
【0092】
［実施例１］
新規のＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームカクテルの開発
図１ａ～ｇは、ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ａ）ヒト疾患の状況におけるＣＯＶＩＤ－１９誘発性サイトカインストームの模式図。（図１ｂ）ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘの組成。（図１ｃ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。Ｘ／２は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。（図１ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。（図１ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｆ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
新規のＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームカクテルの開発
図１ａ～ｇは、ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ａ）ヒト疾患の状況におけるＣＯＶＩＤ－１９誘発性サイトカインストームの模式図。（図１ｂ）ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘの組成。（図１ｃ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。Ｘ／２は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。（図１ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。（図１ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｆ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
【0093】
図６ａ～ｃは、補助的なヒトデータ及びサイトカインカクテルの追加効果を示す。（図６ａ）一般のＣＯＶＩＤ－１９患者、年齢、性別、及び人種をマッチさせた健常なコントロール、並びにタンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＥＬＩＳＡにより評価された血漿ＩＬ－４Ｒαレベル。アッセイされた患者サンプルの数を以下に示す。（図６ｂ）カクテルＤ用量Ｘ／２の注射後１日目のＢＡＬＢ／ｃＪマウス糸球体の電子顕微鏡画像。局所的な足突起消失（黒色矢印）、内皮空胞化（緑色丸）及び内皮肥大（青色丸）の領域が認められた。（図６ｃ）質量分析法により測定した血清クレアチニンは、ＣＯＶＩＤサイトカインカクテル用量Ｘ／２モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス；１群あたりｎ＝６匹のマウス）では増加されない。スケールバー０．５μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0094】
ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄは、集中治療室に入院しているＣＯＶＩＤ－１９患者をモデル化するために段階的に開発された（図１ｂ、ｃ）。最初の５種のサイトカイン（図１ｂ）は、すべてのカクテルに共通である。循環ＩＬ－４Ｒαレベルもまた、タンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ患者において上昇している（図６ａ）。集中治療室のＣＯＶＩＤ－１９罹患患者及び重度のＣＯＶＩＤ－１９疾患になりやすい高齢者とメタボリックシンドローム患者においては血漿ｓＡＣＥ２レベルが有意により高いことから、ＣＯＶＩＤ－１９受容体であるＡＣＥ２がＣＯＶＩＤ－１９カクテルに含まれていた。ＣＯＶＩＤ－１９罹患患者の血漿ＩＬ－１３及びＩＬ－４の高レベルは、この疾患におけるアレルギー経路の急性活性化を示唆している。カクテルＡからｓＩＬ－４Ｒαを除去し、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を加えることによりカクテルＢが作製され、カクテルＡにＩＬ－４を加えることによりカクテルＣが得られた。カクテルＣにＩＬ－１３を加えることによりカクテルＤが得られた。
【0095】
［実施例２］
ＣＯＶＩＤ－１９カクテルによって誘発される相乗的なマルチサイトカイン損傷の全身性症状発現
カクテルＤの高用量（３倍）の注射によりアルブミン尿を誘発されるとともに、血清心筋トロポニンＩ３型（ｃＴＰＩ３；心筋損傷、図２ａ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；急性肝臓損傷、図２ｂ）、血清クレアチニン（急性腎臓損傷、ＡＫＩ；図２ｃ）及び血漿クレアチンキナーゼ（ＣＫ、骨格筋損傷；図７ａ）の上昇が生じた。
ＣＯＶＩＤ－１９カクテルによって誘発される相乗的なマルチサイトカイン損傷の全身性症状発現
カクテルＤの高用量（３倍）の注射によりアルブミン尿を誘発されるとともに、血清心筋トロポニンＩ３型（ｃＴＰＩ３；心筋損傷、図２ａ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；急性肝臓損傷、図２ｂ）、血清クレアチニン（急性腎臓損傷、ＡＫＩ；図２ｃ）及び血漿クレアチンキナーゼ（ＣＫ、骨格筋損傷；図７ａ）の上昇が生じた。
【0096】
図２ａ～ｉは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍）によって誘発される全身性損傷を、低用量又は３倍用量の個々の成分と比較した評価である。（図２ａ）心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベルによって評価された急性心筋損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性レベルによって評価した急性肝臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｃ）質量分析法を使用して測定した血清クレアチニンによって評価した急性腎臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｄ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性心臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、線維破壊（青色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。（図２ｅ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性肝臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、突出したクッファー細胞（緑色矢印）、再生変化（黄色矢印）、中心静脈周囲損傷（青色矢印）が認められた。（図２ｆ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＰＡＳ染色切片（列１、２、４）及び腎臓電子顕微鏡（列３）を使用した急性腎臓損傷の組織学的評価（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。最初の３列は近位尿細管を示し、最後の列は遠位尿細管を示す。近位尿細管において、空胞化（赤色矢印）、刷子縁破壊（緑色矢印）、及び尿細管変性（黒色矢印）が認められた。遠位尿細管において、剥離のエビデンス（青色矢印）が存在した。泡沫細胞も認められた（白色矢印）。電子顕微鏡スケールバーＢＡＬＢ／ｃ、２．６６μｍ。（図２ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの心臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。（図２ｈ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。（図２ｉ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓における組織学的変化の形態計測分析を示す表。光学顕微鏡スケールバー２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0097】
図７ａ～ｇ：（図７ａ）異なる用量のカクテルＤ注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝４匹のマウス）の骨格筋損傷のマーカーである血漿クレアチンキナーゼ。（図７ｂ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ａから得られた血清心筋トロポニンＩレベルのデータ。（図７ｃ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ｂから得られた血清ＡＬＴレベルデータ。（図７ｄ）図２ａ～ｃに対応する、サイトカイン単回３倍用量を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの１８時間アルブミン尿。カクテルＤ３倍投与後のそれらの死亡率が高いことを考慮すると、定時採尿のための代謝ケージ飼育は、この用量のＢＡＬＢ／ｃマウスでは実施不可能である。（図７ｅ）カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。広範な足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が存在した。（図７ｆ）カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色骨格筋。局所的炎症（黒色矢印）が一部の切片において認められた。（図７ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス、用量Ｘ／２）におけるカクテルＣ誘導後、ＩＬ－４Ｒα、ＴＮＦＲ１、及びＩＬ－１０Ｒβに対する抗体又はコントロールＩｇＧを使用した受容体遮断後のアルブミン尿。スケールバー（ｅ）０．５μｍ、（ｆ）２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0098】
ｃＴＰＩ３、ＡＬＴ及びアルブミン尿もまた、カクテルよりも有意に低いレベルではあったがいくつかの個々のサイトカインについては３倍用量で増加した（図２ａ、ｂ；図７ｂ～ｅ）。アルブミン尿評価のための代謝ケージでの定時採尿は、カクテルＤ３倍用量を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける高死亡率を考慮して実施されなかった（下記参照）。カクテルＤ３倍用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて重度の心臓損傷、肝臓損傷及び急性腎臓損傷を誘発した。心臓組織学（図２ｄ）では、心筋溶解、局所的な線維破壊及び好酸球増多、炎症（心筋炎）及び心膜炎が明らかになった。肝臓組織学（図２ｅ）では、実質的肝細胞損傷、突出したクッファー細胞、高頻度の変性変化と再生変化及び軽度の炎症が示された。腎臓の尿細管－間質区画の組織学的評価（図２ｆ）では、頻繁な空胞化、内腔の拡大、刷子縁破壊及び尿細管上皮細胞の剥離という形で近位尿細管損傷の証拠が明らかになった。上皮細胞の剥離、泡沫細胞、及び空胞形成もまた遠位尿細管において認められた。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるカクテルＤ３倍注射後２４時間のこれらの臓器の形態計測学的変化もまた、図２ｇ、ｈ、ｉに記載されている。重度又は広範な炎症の証拠は見られなかった。
【0099】
［実施例３］
軽度及び中等度のサイトカインストームにおける相乗作用を破壊するための治療的サイトカイン枯渇
図３ａ～ｈは、軽度及び中等度のサイトカインストームが糸球体疾患及び全身性疾患に及ぼす影響に関する治療戦略を示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。（図３ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス、用量Ｘ／２）におけるカクテルＣモデル誘導後のアルブミン尿、続いてコントロールＩｇＧ又は枯渇抗体。群は、左から右に効力順に並んでいる。（図３ｂ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のベースラインとカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の尿アルブミンとクレアチニンの比。（図３ｃ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｄ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清ＡＬＴ活性。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｅ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清クレアチニン。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｆ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の心臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。（図３ｇ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の肝臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。（図３ｈ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の腎臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。形態計測分析１群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
軽度及び中等度のサイトカインストームにおける相乗作用を破壊するための治療的サイトカイン枯渇
図３ａ～ｈは、軽度及び中等度のサイトカインストームが糸球体疾患及び全身性疾患に及ぼす影響に関する治療戦略を示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。（図３ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス、用量Ｘ／２）におけるカクテルＣモデル誘導後のアルブミン尿、続いてコントロールＩｇＧ又は枯渇抗体。群は、左から右に効力順に並んでいる。（図３ｂ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のベースラインとカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の尿アルブミンとクレアチニンの比。（図３ｃ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｄ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清ＡＬＴ活性。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｅ）抗体で１つ以上の成分を枯渇させた後のカクテルＤ１．８倍用量モデル（１群あたりｎ＝８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス）の１日目の血清クレアチニン。コントロール及びカクテルＤ１．８倍＋ＩｇＧ注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスを比較のために示す。（図３ｆ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の心臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。（図３ｇ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の肝臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。（図３ｈ）コントロールＩｇＧと抗体処理したＢＡＬＢ／ｃマウスとの間の腎臓における形態計測分析と組織学的変化の比較を示す表。形態計測分析１群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0100】
図８ａ～ｅは、中間用量損傷の組織学を示す。カクテルＤ１．８倍用量を注射し、モデル誘導後１時間で追加の抗体又はコントロールＩｇＧを注射した後２４時間で安楽死させたＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）の試験からの組織学的切片（図３を参照）。各群の番号コードは以下のとおりである：「１」＝コントロールＩｇＧ；「２」＝抗ＴＮＦα抗体；「３」＝抗ＩＬ－６抗体；「４」＝抗ＩＬ－１０抗体；「５」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＦＮγ＋抗ＩＬ－４抗体；「６」＝抗ＩＬ４抗体；「７」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４＋抗ＩＬ－１０抗体；「８」＝抗ＩＦＮγ抗体；「９」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４抗体。（図８ａ）心臓及び心膜のＨ＆Ｅ染色切片の２列。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、心膜炎（橙色矢印）及び心膜微小石灰化（青色矢印）が認められた。（図８ｂ）肝臓のＨ＆Ｅ染色切片。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、変性変化（緑色矢印）及び再生変化（黄色矢印）が認められた。（図８ｃ）肉眼的な尿細管形態を示すトルイジンブルーで染色した腎臓のエポン切片。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。（図８ｄ）腎臓尿細管の電子顕微鏡写真。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。（図８ｅ）糸球体の電子顕微鏡写真。ポドサイト足突起消失領域（黒色矢印）が認められた。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ（ｃ）２０μｍ（ｄ）０．５μｍ（ｅ）０．５μｍ。
【0101】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに低用量（Ｘ／２）のカクテルＣを注射し（図３ａ）、続いて単独又は組合せのサイトカイン枯渇を行った場合、抗ＴＮＦ－α、抗ＩＬ－１０、抗ＩＦＮ－γ及び選択した抗ＴＮＦα抗体ベースの組合せによってアルブミン尿が有意に減少することを示した。多くの場合、より多くのサイトカインを枯渇することは、特に軽度のサイトカインストームモデルにおいては必ずしも良いことであるとは限らず、サイトカイン環境の過剰な操作は逆効果となり得ることが示唆された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるカクテルＤの中間用量（１．８倍）モデルにおいて、抗ＩＬ－４、抗ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びいくつかの抗ＴＮＦα抗体ベースの組合せは、アルブミン尿（図３ｂ）、ｃＴＰＩ３（抗ＩＬ－４を除く、図３ｃ）、血清ＡＬＴレベル（図３ｄ）の減少及び血清クレアチニンの正常化（図３ｅ）に効果的であった。これらの試験の形態計測分析により、上述の最も効果的なレジメンにおいて組織学的変化に有意な改善が示された。（図３ｆ～ｈ；図８ａ～ｅ）。
【0102】
［実施例４］
重度のサイトカインストームにおいて相乗作用を阻害し、死亡を防ぎ、多臓器毒性を軽減する治療的サイトカイン枯渇
ＢＡＬＢ／ｃマウスにカクテルＤ３倍を注射すると、２４時間に高い死亡率が生じ（図４ａ）、集中治療を必要とするＣＯＶＩＤ－１９罹患患者のモデルとして使用された。図４ａ～ｇは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの全身性疾患に対する重度のサイトカインストームの影響に対する可能な治療戦略を示している。１群あたりの注射されたマウスの数をパネルａに示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。大きな赤色アスタリスクは普遍的な死亡率を示す。（図４ａ）カクテルＤ３倍をコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体とともに注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率表。コントロールＩｇＧ群において代謝ケージ使用の場合（５／６）の死亡率が使用しない場合（２／６）よりも高かったため、これらの試験においてアルブミン尿の定時採尿は実施されなかった。（図４ｂ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。（図４ｃ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清ＡＬＴ活性レベル。（図４ｄ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清クレアチニンレベル。（図４ｅ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の心臓組織学の形態計測比較。（図４ｆ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の肝臓組織学の形態計測比較。（図４ｇ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の腎臓組織学の形態計測比較。形態計測分析 １群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
重度のサイトカインストームにおいて相乗作用を阻害し、死亡を防ぎ、多臓器毒性を軽減する治療的サイトカイン枯渇
ＢＡＬＢ／ｃマウスにカクテルＤ３倍を注射すると、２４時間に高い死亡率が生じ（図４ａ）、集中治療を必要とするＣＯＶＩＤ－１９罹患患者のモデルとして使用された。図４ａ～ｇは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの全身性疾患に対する重度のサイトカインストームの影響に対する可能な治療戦略を示している。１群あたりの注射されたマウスの数をパネルａに示す。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後の１時間に静脈内注射された。大きな赤色アスタリスクは普遍的な死亡率を示す。（図４ａ）カクテルＤ３倍をコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体とともに注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率表。コントロールＩｇＧ群において代謝ケージ使用の場合（５／６）の死亡率が使用しない場合（２／６）よりも高かったため、これらの試験においてアルブミン尿の定時採尿は実施されなかった。（図４ｂ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベル。（図４ｃ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清ＡＬＴ活性レベル。（図４ｄ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウス、続いてコントロールＩｇＧ抗体又は枯渇抗体を注射したマウスの生存マウスにおける１日目の血清クレアチニンレベル。（図４ｅ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の心臓組織学の形態計測比較。（図４ｆ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の肝臓組織学の形態計測比較。（図４ｇ）コントロール群とサイトカイン枯渇群との間の腎臓組織学の形態計測比較。形態計測分析 １群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0103】
図９ａ～ｄは、重度損傷モデルの組織学を示す。カクテルＤ３倍用量を注射し、モデル誘導後１時間で追加の抗体又はコントロールＩｇＧを注射した後２４時間で安楽死させたＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）の試験からの組織学的切片（図４を参照）。各群の番号コードは以下のとおりである：「１」＝コントロールＩｇＧ；「２」＝抗ＩＬ－２抗体；「３」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－２抗体；「４」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－１３抗体；「５」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－４抗体；「６」＝抗ＴＮＦα抗体；「７」＝抗ＩＬ－１３；「８」＝抗ＩＬ－４抗体；「９」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＦＮγ抗体；「１０」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－６抗体；「１１」＝抗ＩＦＮγ抗体；「１２」＝抗ＴＮＦα＋抗ＡＣＥ２抗体；「１３」＝抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ－１０抗体；「１４」＝抗ＩＬ－６抗体。（図９ａ）心臓及び心膜のＨ＆Ｅ染色切片の２列。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。（図９ｂ）肝臓のＨ＆Ｅ染色切片の２列。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、変性変化（緑色矢印）及び再生変化（黄色矢印）が認められた。（図９ｃ）肉眼的な尿細管形態を示すトルイジンブルーで染色した腎臓の切片２列。尿細管空胞化（赤色矢印）及び尿細管変性（黒色矢印）が近位尿細管において認められた。（図９ｄ）糸球体の画像を示す腎臓の電子顕微鏡写真２列。ポドサイト足突起消失領域（黒色矢印）が認められた。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ（ｃ）２０μｍ（ｄ）０．５μｍ。
【0104】
コントロールＩｇＧ群におけるほぼ全例死亡（５／６が死亡）を回避するため、この試験では、採尿用の代謝ケージは使用しなかった。ＴＮＦ－αの枯渇とＩＬ－２、ＩＬ－１３若しくはＩＬ－４の組合せ、又はＴＮＦ－α、ＩＬ－１３若しくはＩＬ－４の枯渇の単独療法は、カクテル成分の相乗作用の阻害において最も効果的であり、２４時間でのマウスの死亡をなくし、全体的な活性を正常化した（図４ａ）。これらの介入、特に特異的な抗ＴＮＦ－α抗体をベースとした組合せは、ｃＴＰＩ３、ＡＬＴ及びクレアチニンの血清レベルを低下させるのに最も効果的であった（図４ｂ、ｃ、ｄ）。ＩＬ－２枯渇の単独療法は臓器損傷を効果的に軽減したが、まだマウスは２４時間でも一部立毛があり、軽度の苦痛を示した。ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γの枯渇に関する単独療法はすべて逆効果であった。心臓、肝臓、腎臓の形態計測分析により、最も効果的なレジメンにおいて有意な改善が示された（図４ｅ、ｆ、ｇ；図９ａ～ｄ）。
【0105】
図５ａ～ｅは、ＣＯＶＩＤカクテルによるシグナル伝達経路の活性化及び疾患メカニズムを示している。（図５ａ）カクテルＤ３倍又はコントロールの生理食塩水を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）の全臓器タンパク質抽出物のウェスタンブロットによるＮＦκＢ／ｐ－ｐ６５（肝臓、３０分、定性試験）、ｐＳＴＡＴ６（腎臓、６０分）及びｐＳＴＡＴ５（心臓、１５分）活性化についての例。（図５ｂ）カクテルＣのヒト対応物（最終濃度Ｘ／１００，０００、条件あたりｎ＝３プレート）とインキュベートした野生型及びＺＨＸ２ハイポモルフ（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）培養ヒトポドサイトにおけるｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の活性化を評価する定量試験のウェスタンブロット。（図５ｃ）カクテルＣとインキュベートしたパネルｂからの野生型及びＣＲＩＳＰＲ Ｂポドサイトのウェスタンブロットの密度測定。（図５ｄ）カクテルＣ用量Ｘ／２を注射した後のＩｌ４ａ－／－マウス及びコントロールＢＡＬＢ／ｃＪマウスのアルブミン尿（左パネル）、及び１日目のアルブミン尿のベースラインからのパーセンテージ増加（右パネル）（１群あたりｎ＝５～８匹のマウス）。（図５ｅ）糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、及びポドサイトにおいて既に記載されている特異的受容体へのＣＯＶＩＤカクテル成分の結合可能性、並びにこれらの細胞間のフィードバックループ（赤色）の概略図。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、図５ｄの右側のパネルが片側検定であることを除き、すべての値は両側検定に基づいている。
【0106】
図１０ａ～ｃ。（図１０ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス糸球体におけるサイトカイン受容体の共焦点発現。白色矢印は、ポドサイト（Ｐ）、内皮細胞（Ｅ）、及びメサンギウム細胞（Ｍ）における受容体の発現を示す。ＴＮＦＲ１はポドサイトと内皮細胞とにおいて発現しているので、ポドサイトタンパク質であるネフリン（青色）との部分的な共局在のみが認められる。緑色は核染色である。（図１０ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの腎尿細管におけるＡＣＥ－２及びサイトカイン受容体の共焦点発現（赤色）。ＩＬ－１０Ｒβの画像が集合管であることを除き、ほとんどの画像は近位尿細管を示す。（図１０ｃ）サイトカインカクテルを構成する組換えタンパク質を使用した枯渇試験に使用した抗体のウェスタンブロット特性決定。スケールバー（ａ）２０μｍ（ｂ）２０μｍ。
【0107】
考察
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は呼吸器において始まり、顕著な免疫反応を引き起こし、場合によっては直接感染により他の臓器も巻き込まれる。肺外病変の規模は直接感染とは比例しないことが多く、一次感染に対する自然免疫反応及び適応免疫反応が病原性に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。この研究は、パンデミックにおいて初期に記録された広範なサイトカインストームの多系統病原作用に焦点を当てている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は呼吸器において始まり、顕著な免疫反応を引き起こし、場合によっては直接感染により他の臓器も巻き込まれる。肺外病変の規模は直接感染とは比例しないことが多く、一次感染に対する自然免疫反応及び適応免疫反応が病原性に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。この研究は、パンデミックにおいて初期に記録された広範なサイトカインストームの多系統病原作用に焦点を当てている。
【0108】
２つのウイルス性サイトカインストームモデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣＯＶＩＤ－１９）を新たに構築することにより、構成要素の個々の作用よりむしろ相乗作用に焦点が当てられる。糸球体疾患は、軽度のサイトカインストームの選択モデルとして使用されたが、これは、他の末端臓器損傷が存在しない場合に、稀な臨床シナリオ（例えば、風邪によるＭＣＤの再発）及び一般的な臨床シナリオ（ＣＯＶＩＤ－１９誘発性タンパク尿）に対する２つの一般的なウイルス感染の影響を比較することができたからである。
【0109】
カクテルＤの１．８倍又は３倍用量を使用してＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて重度のＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームを再現したところ、３倍用量を注射したマウスにおいて、急性心筋炎、心膜炎、肝臓損傷及び腎臓損傷、並びに有意な急性全死亡を含む、糸球体損傷以外の影響が認められた。サイトカインストームの起源はこれらの臓器の外因性であったため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者において認められることが多い軽度から中等度の炎症しか存在しなかった。ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、Ｚｈｘ２ｈｙｐｏ／ｈｙｐｏ ＢＡＬＢ／ｃＪマウスは、心臓、肝臓及び腎臓の損傷の重症度がより低く、死亡率がより低い一方で、糸球体損傷の程度も同様であった。文献が示唆するように、糸球体の損傷と他の形態の損傷との間の相違は、ポドサイトにおけるＺＨＸタンパク質の主たる細胞膜局在と、心臓、肝臓及び腎臓尿細管の細胞における大規模な核発現とに関係している可能性が高い。
【0110】
枯渇抗体はサイトカインカクテルの注射後の１時間に投与されたが、これは多経路損傷を開始するのに十分な時間であり、高用量のカクテルＤを注射したすべてのマウスが６時間時点で同様に発病していたからである。２４時間時点での改善、又はその消失は、枯渇レジメンの治療効果を反映していた。
【0111】
ほとんどのＩＣＵ入院患者に相当する、ＢＡＬＢ／ｃマウスの重度のサイトカインストームに対する最も効果的なレジメンは、ＴＮＦαとＩＬ－２、ＩＬ－４又はＩＬ－１３の枯渇組合せであった。これらの組合せを使用することにより、死亡はなくなり、マウスの全体的な活動性は正常化し、血清のｃＴＰＩ３、ＡＬＴ及びクレアチニンのレベルは正常に最も近くなった。ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＬ－４及びＩＬ－１３枯渇の単独療法でも死亡はなくなり、全体的な活動性も改善されたが、バイオマーカーレベルは組合せ群よりも高くなる傾向がある又は軽度の苦痛、例えば、毛の逆立ちなどが持続した。ＩＬ－６枯渇又はＩＬ－１０枯渇の単独療法は、他の群よりも結果は悪かった。カクテルＤ１．８倍の中間用量もまた、死亡がなく多臓器損傷が少なかったことから、入院患者の非集中治療環境を模倣するためＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて試験した。これらのマウスは、選択した単一サイトカイン枯渇に十分に応答した。軽度のカクテルＣモデル（用量Ｘ／２）において、抗ＴＮＦ－α抗体、抗ＩＬ－１０抗体、抗ＩＦＮ－γ抗体及び選択した抗ＴＮＦα抗体ベースの組合せがアルブミン尿の減少に効果的であった。
【0112】
サイトカインカクテル内の異なるサイトカイン間の相乗作用の概念は、個々のサイトカインの同等用量又は高用量によるものではなく、明確に示されている。この試験において説明されているサイトカイン枯渇レジメンは、この相乗作用を低下させることによって効果を発揮し得る。
【0113】
サイトカインストーム中にポドサイトにおいて活性化する可能性のある多数の経路のうち、少なくとも２つが規定された。ＺＨＸタンパク質の細胞膜からの移動及びｐＳＴＡＴ６シグナル伝達は、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルによってＩＬ－４Ｒαの下流で活性化された。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルにおける循環ｓＡＣＥ－２の病原性作用は、インテグリン４１との相互作用により媒介され得る。タンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者における血漿ｓＩＬ－４Ｒαレベルの上昇は、この経路がこの患者サブセットにおいて活性化している可能性が高いことを示唆している。
【0114】
本明細書の記載から理解されるように、多種多様な態様及び実施形態が本開示によって検討されており、その例には、限定するものではないが、以下に列挙されている態様及び実施形態が含まれる：
患者から１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させることを含む、患者におけるウイルス感染の結果としてのサイトカインストームの影響を阻害する、治療する又は予防するための方法；
重度のサイトカインストームによって引き起こされる死亡を低減するために２種以上のサイトカインを枯渇させる方法；
サイトカインストームによって引き起こされる急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷の影響を治療する方法；本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考えている；
サイトカインストームによって引き起こされる死亡を低減する方法；本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考えている；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、サイトカインストームによって誘発される多臓器損傷を予防する方法；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療する又は予防するための方法；
１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む、ウイルス感染の再発を防止する方法；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療する又は予防するための方法；
サイトカインストームの影響を治療する又は予防する方法を試験するための、ウイルス感染及び他の疾患状態によって誘発されるサイトカインストームの動物モデル；及び
本方法はウイルス感染を治療するためのものである。
患者から１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させることを含む、患者におけるウイルス感染の結果としてのサイトカインストームの影響を阻害する、治療する又は予防するための方法；
重度のサイトカインストームによって引き起こされる死亡を低減するために２種以上のサイトカインを枯渇させる方法；
サイトカインストームによって引き起こされる急性心臓損傷、急性肝臓損傷及び急性腎臓損傷の影響を治療する方法；本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考えている；
サイトカインストームによって引き起こされる死亡を低減する方法；本発明者らは、一部の実施形態において、サイトカインストームがウイルス感染によって引き起こされ得ると考えている；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、サイトカインストームによって誘発される多臓器損傷を予防する方法；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染後の急性期後後遺症の影響を治療する又は予防するための方法；
１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる治療を提供することを含む、ウイルス感染の再発を防止する方法；
１種以上のサイトカインの阻害、中和又は枯渇を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｍＲＮＡワクチンの影響を治療する又は予防するための方法；
サイトカインストームの影響を治療する又は予防する方法を試験するための、ウイルス感染及び他の疾患状態によって誘発されるサイトカインストームの動物モデル；及び
本方法はウイルス感染を治療するためのものである。
【0115】
細菌感染症、真菌感染症若しくは寄生虫感染症、がん、臓器移植を含むウイルス起源ではない、又は糖尿病若しくはメタボリックシンドロームなどの多臓器疾患の全身性サイトカイン環境の変化に起因するサイトカインストームを治療する方法。
【0116】
１種以上のサイトカインに対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤を患者に投与することにより１種以上のサイトカインを阻害する、中和する又は枯渇させる方法。ｓｈＲＮＡは作製する又は購入することも可能であり、それはプラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド、及び人工染色体を含む当技術分野で公知の任意のベクターに結合され得る又はその一部となり得る。
【0117】
１種以上のサイトカインを枯渇させる方法は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の投与による。さらに他の実施形態において、薬剤は、１種以上のサイトカインに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む。
【0118】
１種以上のサイトカインを枯渇させる方法は、１種以上のサイトカインを標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与による。
【0119】
１種以上のサイトカインを枯渇させる方法は、サイトカイン媒介受容体に結合し、１種以上のサイトカインの結合を防止するアンタゴニストの投与による。
【0120】
いずれかの本開示の方法において、阻害される、中和される又は枯渇される１種以上のサイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６を含む。本明細書の開示において、処置されるウイルス感染の重症度又は他の症状に応じて、２つ以上のサイトカインの阻害、中和、又は枯渇が、単一のサイトカインの枯渇よりも効果的であり得ることが理解されよう。
【0121】
本開示の実施形態が本明細書に記載されているが、そのような実施形態は単なる例として提供されていることを当業者には理解されたい。当業者であれば、本発明を逸脱することなく、数多くの変形、変更及び代替を思いつく。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義しており、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造とそれらの均等物がそれにより網羅されることが意図されている。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図4g】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図7f】
【図7g】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【国際調査報告】