特表 2024-541983 ＲＮＡプログラム可能な細胞編集のための組成物およびシステム、ならびにそれを作製および使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-13

(54)【発明の名称】ＲＮＡプログラム可能な細胞編集のための組成物およびシステム、ならびにそれを作製および使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20241106BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241106BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241106BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20241106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/52 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N15/85 Z

C12N5/10

C12N15/09 100

C12Q1/02

C12Q1/6897

A61P43/00 105

A61P25/08

A61P25/28

A61K48/00

A61P25/04

A61P29/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525343

(86)(22)【出願日】2022-10-31

(85)【翻訳文提出日】2024-06-25

(86)【国際出願番号】 US2022079008

(87)【国際公開番号】W WO2023077138

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/273,343

(32)【優先日】2021-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/343,669

(32)【優先日】2022-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(71)【出願人】

【識別番号】598174705

【氏名又は名称】コールド スプリング ハーバー ラボラトリー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ファン， ゼット． ジョシュ

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ヨンジュン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QR35

4B063QR80

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA21

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA24

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA061

4C084ZA062

4C084ZA081

4C084ZA082

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZB211

4C084ZB212

(57)【要約】

readrRNA(内因性ADARによるＲＮＡセンシング）分子は、哺乳動物神経系の細胞、例えば哺乳動物中枢神経系および／もしくは末梢神経系の神経または非神経細胞を含む細胞の細胞型もしくは細胞状態のセンシングおよび検出を容易にし、ならびに／または選択された細胞へのエフェクタータンパク質の送達を容易にする、モジュラーRNA分子である。そのようなモジュラーRNA分子および別の核酸（モジュラーRNA分子に連結または非連結）を含む組成物は、CellREADR(内因性ADARによるRNAセンシングを通した細胞アクセス）である。CellREADRは、readrRNAを介して哺乳動物神経系の細胞における選択された細胞RNAの存在を感知し、細胞を定義するRNAの検出を哺乳動物神経系の細胞における１つまたは複数のエフェクタータンパク質の翻訳と組み合わせるために、ADAR(RNAにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ）によって媒介されるRNA編集を活用する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）哺乳動物の中枢神経系の細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、前記センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに
（ｉｉ）タンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、前記タンパク質コードドメインが、前記センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域
を含む、モジュラーＲＮＡ分子であって、
Ａｄａｒ酵素を含む前記細胞への前記モジュラーＲＮＡの導入の際に、前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間および前記細胞ＲＮＡの前記対応するヌクレオチド区間が、前記停止コドンを含むＲＮＡ二重鎖を形成し、前記ＲＮＡ二重鎖に含まれる前記停止コドンが、前記細胞においてＡＤＡＲによって編集され、それによって、前記タンパク質の翻訳が可能になる、
モジュラーＲＮＡ分子。

【請求項2】

ｉ．哺乳動物の末梢神経系の細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、前記センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに
ｉｉ．タンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、前記タンパク質コードドメインが、前記センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域
を含む、モジュラーＲＮＡ分子であって、
Ａｄａｒ酵素を含む前記細胞への前記モジュラーＲＮＡの導入の際に、前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間および前記細胞ＲＮＡの前記対応するヌクレオチド区間が、前記停止コドンを含むＲＮＡ二重鎖を形成し、前記ＲＮＡ二重鎖に含まれる前記停止コドンが、前記細胞においてＡＤＡＲによって編集され、それによって、前記タンパク質の翻訳が可能になる、
モジュラーＲＮＡ分子。

【請求項3】

前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、ｍＲＮＡの少なくとも一部分とＲＮＡ二重鎖を形成することが可能であり、前記一部分が、連続ヌクレオチドの対応する区間を含む、請求項１または請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項4】

前記タンパク質コード領域が、エフェクタータンパク質をコードする、請求項１または請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項5】

前記分子が、前記センサードメインと前記３’タンパク質コードドメインとの間に位置する自己切断２Ａペプチドをさらにコードする、請求項１または請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項6】

前記自己切断２Ａペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドのうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項５に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項7】

３’タンパク質コードドメインが、標識、転写活性化因子、および転写抑制因子の群から選択されるタンパク質を含む、請求項１または請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項8】

ｉ）（ｉ）中枢神経系の哺乳動物細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインであって、前記センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、センサードメイン、および（ｉｉ）エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインであって、前記第１のタンパク質コード領域が、前記センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、第１のタンパク質コードドメインを含む、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸、ならびに
ｉｉ）第２のタンパク質コードドメインを含む第２の核酸
を含む組成物。

【請求項9】

ｉ）（ｉ）末梢神経系の哺乳動物細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインであって、前記センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、センサードメイン、および（ｉｉ）エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインであって、前記第１のタンパク質コード領域が、前記センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、第１のタンパク質コードドメインを含む、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸、ならびに
ｉｉ）第２のタンパク質コードドメインを含む第２の核酸
を含む組成物。

【請求項10】

前記第１および第２の核酸が、単一の核酸分子を含む、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記第１および第２の核酸が、２つの核酸分子を含む、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項12】

前記第１および第２の核酸が、共有結合的に連結されている、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項13】

前記第２のタンパク質コードドメインが、転写制御エレメント、必要に応じて、プロモーターを含む遺伝子内に含まれている、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項14】

前記エフェクタータンパク質が、前記遺伝子に結合する、請求項８または９に記載の組成物。

【請求項15】

前記第２のタンパク質コードドメインの発現が、前記エフェクタータンパク質によってモジュレートされる、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項16】

前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子または転写抑制因子をコードする、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項17】

前記第１のタンパク質コードドメインが、ＤＮＡリコンビナーゼをコードする、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項18】

前記細胞が、哺乳動物皮質細胞を含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項19】

前記細胞が、前記末梢神経系の哺乳動物シュワン細胞または哺乳動物サテライト細胞を含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項20】

前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質をコードする、請求項８に記載の組成物。

【請求項21】

前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、Ｆｅｚｆ２遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的である、請求項８または２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下の第２のタンパク質コード領域を含む、請求項８、２０または２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質をコードする、請求項９に記載の組成物。

【請求項24】

前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、末梢ＣＮＳ細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的である、請求項９または２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下の第２のタンパク質コード領域を含む、請求項９、２３、または２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記第１のタンパク質コード領域が、以下：
〇チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）からなる群から選択される細胞死滅タンパク質、
〇ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ９、ＢＣＬ、ＧＳＤＭＥ、ＧＳＤＭＤ、ＧＺＭＡおよびＧＺＭＢからなる群から選択されるプログラム細胞死タンパク質、
〇ＣｈＲ２およびＤＲＥＡＤＤ－Ｍ３Ｄｑからなる群から選択される神経活性化タンパク質、
・ＩＦＮＢ、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される免疫エンハンサータンパク質、
・ＮａＣｈＢａｃおよびＫｉｒ２．１からなる群から選択される生理学的編集タンパク質、ｆ）リシンを含むタンパク質合成阻害タンパク質、
・ＤＲＥＡＤＤ－ｈＭ４Ｄ、ＮｐＨＲおよびＧｔＡＣＲ１からなる群から選択される神経阻害タンパク質、
・ＮＥＵＲＯＤなどの神経細胞運命に関与するタンパク質、ならびに
・表皮増殖因子を含む細胞再生と関与するタンパク質
から選択されるエフェクタータンパク質をコードする、請求項８または請求項９に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１もしくは２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、および／あるいは請求項１もしくは２に記載の前記モジュラーＲＮＡ分子、または請求項８もしくは請求項９に記載の前記組成物をコードするＤＮＡを含む核酸送達ビヒクル。

【請求項28】

ナノ粒子、リポソーム、ベクター、エキソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃、および細胞送達のための選択的内因性封入（ＳＥＮＤ）システムからなる群から選択される、請求項２７に記載の核酸送達ビヒクル。

【請求項29】

ウイルスベクターを含む、請求項２８に記載の核酸送達ビヒクル。

【請求項30】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される、請求項２９に記載の核酸送達ビヒクル。

【請求項31】

ＤＮＡベクターによってコードされる、請求項１または請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子。

【請求項32】

前記モジュラーＲＮＡ分子が、ＤＮＡベクターによってコードされる、請求項８または９に記載の組成物。

【請求項33】

前記モジュラーＲＮＡ分子が、ＤＮＡベクターによってコードされる、請求項２７に記載の送達ビヒクル。

【請求項34】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、または請求項２７に記載の送達ビヒクル、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項35】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、または請求項２７に記載の送達ビヒクルを含む細胞。

【請求項36】

哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の細胞。

【請求項37】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、または請求項２７に記載の送達ビヒクル、およびそれらのためのパッケージングを含むキット。

【請求項38】

請求項１もしくは２に記載のモジュラーＲＮＡ、前記モジュラーＲＮＡをコードする請求項８もしくは９に記載の核酸組成物、または前記モジュラーＲＮＡもしくは前記モジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物を含む請求項２７に記載の送達ビヒクルを哺乳動物の選択された細胞に導入する方法であって、
前記哺乳動物の細胞を前記モジュラーＲＮＡ分子、前記モジュラーＲＮＡをコードする前記核酸組成物、または前記モジュラーＲＮＡもしくは前記モジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物を含む前記送達ビヒクルと、前記哺乳動物の前記細胞が、前記モジュラーＲＮＡ、または前記モジュラーＲＮＡもしくは前記モジュラーＲＮＡをコードする前記核酸組成物を含む前記送達ビヒクルを含むことを可能にする条件下で接触させるステップを含み、
前記モジュラーＲＮＡが、請求項１または請求項２に記載されるものであり、前記核酸組成物が、請求項８または請求項９に記載されるものであり、前記送達ビヒクルが、請求項２７に記載されるものである、
方法。

【請求項39】

選択された標的細胞ＲＮＡを含む哺乳動物の細胞において、停止コドンのＡＤＡＲ編集を誘発して、インフレームの下流のコードされるタンパク質の発現を可能にする方法であって、
前記モジュラーＲＮＡが前記細胞に含まれる条件下で、モジュラーＲＮＡ分子を前記哺乳動物の前記細胞に導入するステップであって、前記モジュラーＲＮＡが、（ｉ）前記選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、前記センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに（ｉｉ）エフェクタータンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、前記タンパク質コード領域が、前記センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域を含み、
前記哺乳動物への前記モジュラーＲＮＡ分子の導入の際に、ＲＮＡ二重鎖が、前記細胞において、前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間と前記細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの前記対応する区間との間で形成され、前記ＲＮＡ二重鎖が、前記ＡＤＡＲ編集可能停止コドンを含み、ＡＤＡＲが、前記ＲＮＡ二重鎖に含まれる前記停止コドンを編集し、それによって、前記タンパク質の翻訳を可能にし、
前記タンパク質が、前記哺乳動物において産生される、ステップ
を含む、方法。

【請求項40】

哺乳動物における疾患または障害を処置するための方法であって、
薬剤を準備するステップであって、前記薬剤が、請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項８、９、１１もしくは１２に記載の核酸組成物、または請求項２７に記載の送達ビヒクルを含む、ステップ、および
前記哺乳動物の選択された細胞において、前記３’のコードされるタンパク質または前記エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、前記薬剤を前記哺乳動物に投与し、それによって、前記細胞において前記タンパク質を産生させるステップであって、前記細胞における前記タンパク質の産生が、前記哺乳動物における前記疾患または障害の処置を提供する、ステップ
を含む、方法。

【請求項41】

請求項８もしくは請求項９に記載の前記組成物または請求項２３に記載の前記送達ビヒクルを含む前記薬剤が、投与され、前記薬剤に含まれる前記エフェクタータンパク質をコードする前記第１のタンパク質コード領域が、前記第２のタンパク質コード領域の発現を活性化するトランス活性化タンパク質をコードし、前記選択された細胞における前記第２のタンパク質コード領域の発現が、前記疾患または障害の処置において治療的に有効である、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

前足の機械的刺激に応答する、測光法によって測定される、マウスの前肢体性感覚皮質におけるＬ５ｂ／Ｌ６皮質下行性投射ニューロンシグナルを刺激する方法であって、
請求項８に記載の組成物を前記マウスに投与するステップであって、前記センサードメインが、Ｃｔｉｐ２またはＦｅｚｆをコードする細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含み、前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質をコードし、前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記投与が、前記エフェクタータンパク質および前記レポータータンパク質の産生を提供し、
それによって、前記マウスの前記前肢体性感覚皮質における前記Ｌ５ｂ／Ｌ６ ＣＦＰＮシグナルの刺激を可能にする、ステップ
を含む、方法。

【請求項43】

マウスの尾側前肢領域（ＣＦＡ）の光刺激に応答する、前肢の移動を刺激する方法であって、
請求項８に記載の組成物を前記マウスに投与するステップであって、前記センサードメインが、Ｃｔｉｐ２をコードする細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含み、前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質をコードし、前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下の光活性化レポータータンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記投与が、前記エフェクタータンパク質および前記光活性化レポータータンパク質の産生を提供し、それによって、前記マウスの前記前肢の動きの光刺激を可能にする、ステップ
を含む、方法。

【請求項44】

第２の遺伝子が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、前記第２の遺伝子が、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）をコードし、前記投与が、高感度黄色蛍光タンパク質の産生を提供する、請求項３９に記載の方法。

【請求項45】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、および／または請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、および／または請求項２７に記載の送達システム、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項46】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、および／または請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、および／または請求項２７に記載の送達システムを含む細胞。

【請求項47】

請求項１もしくは請求項２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、および／または請求項８もしくは請求項９に記載の組成物、および／または請求項２７に記載の送達システムを含むキット。

【請求項48】

ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、
組成物のＳ１バレル皮質および海馬の細胞へのトランスフェクション、ならびに前記タンパク質コード領域の発現を可能にする条件下で、請求項８に記載の組成物を前記哺乳動物に投与するステップであって、
前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、皮質細胞の選択された細胞ｖＧＡＴ ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、
前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質および第１のレポータータンパク質を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下の第２のレポータータンパク質のコード領域を含み、
前記モジュラーＲＮＡ分子を含む前記第１の核酸が、プロモーターの制御下にあり、前記モジュラーＲＮＡ分子が、前記センサードメインの上流にあって、プロモーターの制御下の第３のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記タンパク質が、前記コード領域から産生され、
ｖＧＡＴ ｍＲＮＡを含む前記哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの同定が、前記第１、第２および第３のレポータータンパク質のうちの１つまたは複数の検出の際に可能である、ステップ
を含む、方法。

【請求項49】

ｓｅｓＲＮＡ標的化ｖＧＡＴ ｍＲＮＡが、ｖＧＡＴ ｍＲＮＡのエクソン１の全部または一部分に相補的である、請求項４４に記載の方法。

【請求項50】

ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、組成物による前記哺乳動物皮質の細胞のトランスフェクションおよび前記組成物によってコードされる前記タンパク質の産生を可能にする条件下で、請求項８に記載の組成物を哺乳動物に投与するステップであって、
前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、皮質細胞の選択された細胞Ｔｌｅ４ ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、
前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質および第１のレポータータンパク質を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、
前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの転写制御下の第２のレポータータンパク質のコード領域を含み、
前記モジュラーＲＮＡ分子を含む前記第１の核酸が、プロモーターの制御下にあり、
前記モジュラーＲＮＡ分子が、前記センサードメインの上流にあって、プロモーターの制御下の第３のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記哺乳動物皮質の細胞における前記第１、第２および第３のレポータータンパク質のうちの１つまたは複数の検出が、ＴＬＥ４陽性投射ニューロンの同定を可能にし、それによって、前記哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する、ステップ
を含む、方法。

【請求項51】

前記センサードメインが、Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡのエクソン１５の全部または一部分に相補的である、請求項４６に記載の方法。

【請求項52】

培養物において、哺乳動物皮質の皮層のフォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２（ＦＯＸＰ２）ＲＮＡを含む細胞の存在を決定する方法であって、
哺乳動物皮質の培養された皮層を請求項９に記載の組成物と接触させるステップであって、
前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、皮質細胞の選択されたＦＯＸＰ２細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、
前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質および第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、
前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの制御下の第２のレポータータンパク質のコード領域を含み、
前記モジュラーＲＮＡ分子が、前記センサードメインの上流の第３のレポータータンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、
ステップ、
前記第１、第２および第３のレポータータンパク質のうちの１つまたは複数を検出するステップであって、前記皮層の細胞体における前記検出が、前記細胞の存在を示す、ステップ
を含む、方法。

【請求項53】

焦点性てんかん発作を促進する哺乳動物における神経活動を抑制するための方法であって、
治療有効量の薬剤を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記薬剤が、請求項１に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項８に記載の核酸組成物、または請求項２７に記載の送達ビヒクルを含み、
前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、ＳＳＴ遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、
前記第１のタンパク質コードドメインが、ａ）転写活性化因子およびｂ）第１のエフェクタータンパク質をコードし、
前記第２の核酸が、前記転写活性化因子によって誘導される誘導性プロモーターの制御下の第２のエフェクタータンパク質のコード領域を含み、
前記モジュラーＲＮＡ分子が、前記センサードメインの上流の第３のエフェクタータンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、
前記組成物が、ＤＲＥＡＤＤ受容体をコードする遺伝子またはＰＳＡＭをコードする遺伝子をさらに含み、
前記ＤＲＥＡＤＤまたは前記ＰＳＡＭ遺伝子によってコードされる前記受容体を活性化するのに有効な薬物の存在下で、前記ＤＲＥＡＤＤ受容体または前記ＰＳＡＭ受容体が活性化され、それによって、前記哺乳動物における１つまたは複数の前記エフェクタータンパク質の産生、およびてんかんの処置を可能にする、ステップ
を含む、方法。

【請求項54】

焦点性てんかん発作を促進する哺乳動物の神経活動を抑制するための方法であって、
治療有効量の薬剤を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記薬剤が、請求項１に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項１１に記載の核酸組成物、または請求項３４に記載の送達ビヒクルを含み、前記モジュラーＲＮＡの前記センサードメインの連続ヌクレオチドの前記区間が、皮質細胞の選択されたｃｆｏｓ細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子を含む第１のエフェクタータンパク質およびｏｓｍＦｌａｇをコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、
前記第２の核酸が、誘導性プロモーターの制御下の第１のレポータータンパク質のコード領域を含み、
前記モジュラーＲＮＡ分子を含む前記第１の核酸が、プロモーターの制御下にあり、
前記モジュラーＲＮＡ分子が、前記センサードメインの上流にあって、前記プロモーターの制御下の第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記薬剤が、ＤＲＥＡＤＤ受容体をコードする遺伝子またはＰＳＡＭをコードする遺伝子をさらに含み、
前記投与が、前記ＤＲＥＡＤＤまたは前記ＰＳＡＭ受容体を活性化する薬物の存在下で、前記哺乳動物の選択された細胞における前記エフェクタータンパク質の翻訳を可能にし、それによって、前記細胞において前記タンパク質が産生され、前記細胞における前記タンパク質の産生が、前記哺乳動物において、焦点性てんかん発作を促進する神経活動を抑制するのに有効である、ステップ
を含む、方法。

【請求項55】

哺乳動物における慢性疼痛を処置する方法であって、
治療有効量の薬剤を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記薬剤が、請求項１もしくは２に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項１２に記載の核酸組成物、または請求項３４に記載の送達ビヒクルを含み、
前記モジュラーＲＮＡの前記センサードメインが、選択されたＴＲＰＶ１またはＮａＶ１．８ 細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的な連続ヌクレオチドの区間、および転写活性化因子を含むエフェクタータンパク質をコードする前記第１のタンパク質コードドメインを含み、
前記モジュラーＲＮＡが、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＲＮＡに結合するｓｈＲＮＡをコードするドメインをさらに含み、前記ｓｈＲＮＡをコードする前記ドメインが、誘導性プロモーターの制御下にあり、
前記哺乳動物の前記細胞における前記転写活性化因子および前記ｓｈＲＮＡの産生が、それによって、前記哺乳動物における慢性疼痛を処置する、ステップ
を含む、方法。

【請求項56】

哺乳動物におけるアルツハイマー病を処置する方法であって、
治療有効量の薬剤を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記薬剤が、請求項１に記載のモジュラーＲＮＡ分子、または請求項１２に記載の核酸組成物、または請求項３４に記載の送達ビヒクルを含み、
前記モジュラーＲＮＡの前記センサードメインが、以下の遺伝子：ａ）アルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー１メンバーＬ１のヒトアストロサイトマーカー遺伝子（Ａｌｄｈ１Ｌ１）、ｂ）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子、ｃ）興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）遺伝子、およびｄ）ミクログリア遺伝子：Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、ｅ）膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）、およびｆ）イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）から選択される遺伝子によってコードされる選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的な連続ヌクレオチドの前記区間を含み、
前記モジュラーＲＮＡの前記第１のタンパク質コードドメインが、転写活性化因子をコードし、
前記モジュラーＲＮＡが、ＡｐｏＥ４の抑制因子をコードする第２のコードドメインをさらに含み、前記第２のコードドメインが、誘導性プロモーターの制御下にあり、
前記細胞における前記転写活性化因子および前記抑制因子の産生が、それによって、前記哺乳動物におけるアルツハイマー病の進行を処置および／または防止する、ステップ
を含む、方法。

【請求項57】

前記組成物を前記哺乳動物の前記Ｓ１バレル皮質および海馬に投与するステップを含む、請求項４４または４６に記載の方法。

【請求項58】

前記第１のレポータータンパク質が、抗原タンパク質タグを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項59】

前記抗原タンパク質タグが、ｓｍＶ５を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項60】

転写活性化因子が、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含む、請求項２０、２３、３８、３９、４４～４９に記載の組成物。

【請求項61】

前記第２のタンパク質コード領域が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下にある、請求項２２、２５、３８、３９、４４～４９に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
このＰＣＴ出願は、２０２２年５月１９日に出願された米国仮出願第６３／３４３，６６９号、および２０２１年１０月２９日に出願された同第６３／２７３，３４３号に基づく利益を主張し、それぞれの内容は、それらの全体が、本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
この発明は、国立衛生研究所によって付与された連邦政府助成金番号Ｕ１９ＭＨ１１４８２１－０３およびＤＰ１ＭＨ１２９９５４の政府支援で行われた。連邦政府は、この発明に対する特定の権利を有する。

【0003】

配列表
本出願は、パテントセンターを介して、ＷＩＰＯ標準のＳＴ．２６ ＸＭＬファイルとして提出された配列表を含む。２０２２年１０月３１日に作成された前記ＸＭＬファイルは、「１２３６５８－１０９０３．ｘｍｌ」という名称であり、１９３，９１３バイトのサイズである。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

背景
細胞型の多様性は、個々の生物内の生命の形態および生理学的システムの多様性の基礎になる［１］。それらの異なる遺伝子発現プロファイル、形態学的および生理学的特性、ならびに組織機能によって定義される細胞型は、遺伝情報が生物の表現型および挙動を形作る媒介である。すべての身体機能は、細胞型の間の相互作用から出現し、異常な細胞型の生理および機能は、無数の疾患を生じさせる［２］。最近のハイスループット単一細胞ゲノムアプローチは、ヒト身体および多くの他の生物における分子的に定義された主要な細胞型のすべてを同定する見込みがある［３］［４］。分子プロファイリングを超えて、生物学的組織化のレベルにわたって、組織構造およびシステム機能におけるそれらの特異的な役割を同定するために、ありとあらゆる細胞型をモニターおよび操作することが必要である。

【0005】

多細胞生物における細胞型のアクセスおよび操作の文脈では、すべてではないがほとんどの遺伝的アプローチは、これまでに、生殖細胞系列細胞もしくは体細胞を通してゲノム内におけるＤＮＡ調節エレメントを操作することによって、または転写エンハンサーに基づくウイルスベクターを使用することによって、細胞型特異的なｍＲＮＡ発現を再現しようと試みている。これまでに、細胞型に対するほぼすべての遺伝的アプローチは、一握りのみの生物の生殖細胞系列操作を主に通して、ある特定の細胞特異的ＲＮＡ発現を模倣するツール遺伝子（例えば、マーカー、センサー、エフェクター）を発現するためのＤＮＡに基づく転写調節エレメントに依拠している［５～７］。ＣＲＩＳＰＲ［８～１０］を含む、すべての生殖細胞系列アプローチは、本質的に扱いにくく、遅く、増減および一般化が困難であり、特に、霊長類およびヒトにおいて、倫理的な問題を生じる［１１、１２］。最近、ウイルスベクターに基づく転写エンハンサーが、動物における細胞型を標的化するために見込みがあることを示したが［１３～１９］、そのようなエンハンサーは、同定および検証することが困難であり、多くの場合、標的遺伝子および細胞型とのそれらの複雑な関係に起因して、大規模な努力を必要とする［１３］。通常ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による、体細胞操作は、現在、低効率であり、意図しないオフターゲットを含む傾向がある。エンハンサーウイルスベクターアプローチも、遺伝子発現および細胞型とのその複雑な関係に根差した主要な限界を有し、これは、大規模な努力、特殊専門技術、広範な検証を必要とし、種にわたって、真にスケーラブルで、ユーザーフレンドリーで、一般化可能である可能性は低い。そのため、転写エンハンサーに基づくウイルスベクターが、動物における体細胞型を標的化するために見込みがあることを示すが、そのようなエンハンサーは、同定および検証することが困難であり、多くの場合、標的遺伝子および細胞型とのそれらの複雑な関係に起因して、大規模な努力を必要とする。本質的には、すべてのＤＮＡおよび転写に基づくアプローチは、細胞型特異的ＲＮＡ発現パターンを模倣および活用する試みにおいて、本質的に間接的である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の要約
本開示は、部分的には、ＤＮＡに基づく転写プロセスを避け、細胞型を定義するＲＮＡに直接関与する、細胞型技術の新しいクラスの発見に基づく。一部の実施形態では、この新規技術（ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ：内因性ＡＤＡＲ［ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ］によるＲＮＡセンシングを通した細胞アクセスと称する）は、細胞ＲＮＡの存在を検出し、細胞型をモニターおよび操作するためにエフェクタータンパク質の翻訳のスイッチをオンにするために、すべての動物細胞に遍在するＲＮＡセンシングおよび編集メカニズムを利用する。本明細書に提供される組成物および方法は、標的ＲＮＡの存在のおかげで特定の細胞型を標的にする、ワトソン－クリック塩基対合を通した単一ＲＮＡ分子のオペレーティングとして、展開可能である。したがって、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、種にわたって、本質的に特異的で、構築および使用するのが容易で、スケーラブルで、プログラム可能で、一般的である。

【0007】

したがって、本開示は、（ｉ）哺乳動物の中枢神経系の細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに（ｉｉ）タンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、タンパク質コードドメインが、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域を含む、モジュラーＲＮＡ分子であって、Ａｄａｒ酵素を含む哺乳動物の中枢神経系の細胞へのモジュラーＲＮＡの導入の際に、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間および細胞ＲＮＡの対応するヌクレオチド区間が、停止コドンを含むＲＮＡ二重鎖を形成し、ＲＮＡ二重鎖に含まれる停止コドンが、細胞においてＡＤＡＲによって編集され、それによって、タンパク質の翻訳が可能になる、モジュラーＲＮＡ分子を提供する。

【0008】

（ｉ）哺乳動物の末梢神経系の細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに（ｉｉ）タンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、タンパク質コードドメインが、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域を含む、モジュラーＲＮＡ分子であって、Ａｄａｒ酵素を含む哺乳動物の末梢神経系の細胞へのモジュラーＲＮＡの導入の際に、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間および細胞ＲＮＡの対応するヌクレオチド区間が、停止コドンを含むＲＮＡ二重鎖を形成し、ＲＮＡ二重鎖に含まれる停止コドンが、細胞においてＡＤＡＲによって編集され、それによって、タンパク質の翻訳が可能になる、モジュラーＲＮＡ分子も本明細書に開示される。モジュラーＲＮＡ分子では、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間は、ｍＲＮＡの少なくとも一部分とＲＮＡ二重鎖を形成することが可能である。モジュラーＲＮＡ分子では、タンパク質コード領域は、エフェクタータンパク質をコードする。モジュラーＲＮＡ分子の一態様では、これは、センサードメインとエフェクターＲＮＡ領域との間に位置する自己切断２Ａペプチドをさらにコードする。モジュラーＲＮＡ分子の一態様では、自己切断２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドのうちの１つまたは複数からなる群から選択される。モジュラーＲＮＡ分子の一態様では、ｅｆＲＮＡコードタンパク質は、標識、および転写活性化因子または抑制因子の群から選択されるタンパク質を含む。

【0009】

（ｉ）（ａ）中枢神経系の哺乳動物細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインであって、センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、センサードメイン、および（ｂ）エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインであって、第１のタンパク質コード領域が、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、第１のタンパク質コードドメインを含む、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸、ならびに（ｉｉ）第２のタンパク質コードドメインを含む第２の核酸を含む組成物も本明細書に開示される。（ｉ）（ａ）末梢神経系の哺乳動物細胞の細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインであって、センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、センサードメイン、および（ｂ）エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインであって、第１のタンパク質コード領域が、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、第１のタンパク質コードドメインを含む、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸、ならびに（ｉｉ）第２のタンパク質コードドメインを含む第２の核酸を含む組成物も本明細書に開示される。組成物の一態様では、第１および第２の核酸は、単一の核酸分子を含む。組成物の一態様では、第１および第２の核酸は、２つの核酸分子を含む。組成物の一態様では、第１および第２の核酸は、共有結合的に連結されている。組成物の一態様では、第２のタンパク質コードドメインは、転写制御エレメント、必要に応じて、プロモーターを含む遺伝子内に含まれている。組成物の一態様では、エフェクタータンパク質は、遺伝子に結合する。組成物の一態様では、第２のタンパク質コードドメインの発現は、エフェクタータンパク質によってモジュレートされる。組成物の一態様では、第１のタンパク質コードドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子をコードする。組成物の一態様では、第１のタンパク質コードドメインは、ＤＮＡリコンビナーゼをコードする。組成物の一態様では、脳細胞は、哺乳動物皮質細胞を含む。組成物の一態様では、脳細胞は、末梢神経系の哺乳動物シュワン細胞または哺乳動物サテライト細胞を含む。組成物の一態様では、第１のタンパク質コードドメインは、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質をコードし、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間は、Ｆｅｚｆ２遺伝子によってコードされる脳皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第２の核酸は、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の第２のタンパク質コード領域を含む。組成物の一態様では、第１のタンパク質コードドメインは、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質をコードし、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間は、末梢ＣＮＳ細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第２の核酸は、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の第２のタンパク質コード領域を含む。組成物の一態様では、第１のタンパク質コード領域は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ９、ＢＣＬ、ＧＳＤＭＥ、ＧＳＤＭＤ、ＧＺＭＡおよびＧＺＭＢからなる群から選択されるプログラム細胞死タンパク質、ＣｈＲ２およびＤＲＥＡＤＤ－Ｍ３Ｄｑからなる群から選択される神経活性化タンパク質、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される免疫エンハンサータンパク質、ＮａＣｈＢａｃおよびＫｉｒ２．１からなる群から選択される生理学的編集タンパク質、リシンを含むタンパク質合成阻害タンパク質、ＤＲＥＡＤＤ－ｈＭ４Ｄ、ＮｐＨＲおよびＧｔＡＣＲ１からなる群から選択される神経阻害タンパク質、ＮＥＵＲＯＤなどの神経細胞運命に関与するタンパク質、表皮増殖因子を含む細胞再生と関与するタンパク質からなる群から選択される細胞死滅タンパク質をコードする。

【0010】

本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子、または本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含む核酸送達ビヒクルも本明細書に開示される。一態様では、核酸送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、ベクター、エキソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃、および細胞送達のための選択的内因性封入（ＳＥＮＤ）システムであり得る。一態様では、核酸送達ビヒクルは、ウイルスベクターを含み、ウイルスベクターは、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルスからなるものを含む。

【0011】

ＤＮＡベクターによってコードされるモジュラーＲＮＡ分子も本明細書に開示される。モジュラーＲＮＡ分子が、ＤＮＡベクターによってコードされる、組成物も本明細書に開示される。ＤＮＡベクターによってコードされるモジュラーＲＮＡ分子を含む、送達ビヒクルも本明細書に開示される。本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子、および／または本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または本明細書に記載される送達ビヒクルと一緒に、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物も本明細書に開示される。本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子、および／または本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または本明細書に記載される送達ビヒクルを含む細胞も本明細書に開示される。また、哺乳動物細胞である、細胞も本明細書に開示される。本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子、および／または本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または本明細書に記載される送達ビヒクル、およびそれらのためのパッケージングを含むキットも本明細書に開示される。

【0012】

モジュラーＲＮＡ、またはモジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物、またはモジュラーＲＮＡもしくはモジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物を含む送達ビヒクルを哺乳動物の選択された細胞に導入する方法であって、哺乳動物の細胞が、本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡまたはモジュラーＲＮＡもしくはモジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物を含む送達ビヒクルを含むことを可能にする条件下で、哺乳動物の細胞をモジュラーＲＮＡ分子、モジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物、またはモジュラーＲＮＡもしくはモジュラーＲＮＡをコードする核酸組成物を含む送達ビヒクルと接触させるステップを含む、方法も本明細書に開示される。

【0013】

選択された標的細胞ＲＮＡを含む哺乳動物の細胞において、停止コドンのＡＤＡＲ編集を誘発して、インフレームの下流のコードされるタンパク質の発現を可能にする方法であって、モジュラーＲＮＡが細胞に含まれる条件下で、モジュラーＲＮＡ分子を哺乳動物の細胞に導入するステップであって、モジュラーＲＮＡが、（ｉ）選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含むセンサードメインを含む５’領域であって、センサードメインが、ＡＤＡＲによって編集可能な停止コドンを含む、５’領域、ならびに（ｉｉ）エフェクタータンパク質をコードするドメインを含む３’領域であって、タンパク質コード領域が、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、３’領域を含み、哺乳動物へのモジュラーＲＮＡ分子の導入の際に、ＲＮＡ二重鎖が、細胞において、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間と細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間との間で形成され、ＲＮＡ二重鎖が、ＡＤＡＲ編集可能停止コドンを含み、ＡＤＡＲが、ＲＮＡ二重鎖に含まれる停止コドンを編集し、それによって、タンパク質の翻訳を可能にし、タンパク質が、哺乳動物において産生される、ステップを含む、方法も本明細書に開示される。

【0014】

哺乳動物における疾患または障害を処置するための方法であって、薬剤を準備するステップであって、薬剤が、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含む、ステップ、ならびに哺乳動物の選択された細胞において、エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、薬剤を哺乳動物に投与し、それによって、細胞においてタンパク質を産生させるステップであって、細胞におけるタンパク質の産生が、哺乳動物における疾患または障害の処置を提供する、ステップを含む、方法も本明細書に開示される。方法のある態様では、薬剤は、本明細書に記載されるモジュラーＲＮＡ分子、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含む薬剤を含む組成物を含み、投与され、薬剤に含まれるエフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コード領域は、第２のタンパク質コード領域の発現を活性化するトランス活性化タンパク質をコードし、選択された細胞における第２のタンパク質コード領域の発現は、疾患または障害の処置において治療的に有効である。

【0015】

前足の機械的刺激に応答する、測光法によって測定される、マウスの前肢体性感覚皮質におけるＬ５ｂ／Ｌ６皮質下行性投射ニューロン（ＣＦＰＮ）シグナルを刺激するための方法であって、組成物をマウスに投与するステップであって、センサードメインが、Ｃｔｉｐ２をコードする細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含み、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下のカルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓをコードする遺伝子を含む、ステップを含む、方法も本明細書に開示される。

【0016】

マウスの尾側前肢領域（ＣＦＡ）の光刺激に応答する、前肢の移動を刺激するための方法であって、組成物をマウスに投与するステップであって、センサードメインが、Ｃｔｉｐ２をコードする細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの対応する区間に相補的である連続ヌクレオチドの区間を含み、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の光活性化イオンチャネルのチャネルロドプシン－２をコードする遺伝子を含む、ステップを含む、方法も本明細書に開示される。方法の一態様では、第２の遺伝子は、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、第２の遺伝子は、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）をコードする。

【0017】

本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含む薬剤、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物も本明細書に記載される。本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含む細胞も本明細書に記載される。本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含むキットも本明細書に記載される。

【0018】

ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質における小胞状ＧＡＢＡトランスポーター（ｖＧＡＴ）ｍＲＮＡを標的化することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを哺乳動物のＳ１バレル皮質および海馬に投与するステップであって、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間が、ｖＧＡＴ遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質およびｓｍＶ５をコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の緑色蛍光タンパク質のコード領域を含み、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸が、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、モジュラーＲＮＡ分子が、センサードメインの上流にあり、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下のｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含み、投与の際に、哺乳動物のＳ１バレル皮質および海馬におけるｖＧＡＴ ｍＲＮＡが、赤紫色およびＧＦＰで共標識され、哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの同定を示す、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。方法の一態様では、ｓｅｓＲＮＡ標的化ｖＧＡＴ ｍＲＮＡは、ｖＧＡＴ ｍＲＮＡのエクソン１の全部または一部分に相補的である。

【0019】

トランスデューシン様エンハンサータンパク質４（Ｔｌｅ４）ｍＲＮＡを標的化することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを哺乳動物のＳ１バレル皮質に投与するステップであって、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間が、Ｔｌｅ４遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質およびｓｍＦｌａｇをコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の緑色蛍光タンパク質のコード領域を含み、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸が、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、モジュラーＲＮＡ分子が、センサードメインの上流にあり、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下のｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含み、投与の際に、哺乳動物のＳ１バレル皮質におけるＴｌｅ４ ｍＲＮＡが、赤紫色およびＧＦＰで共標識され、哺乳動物皮質におけるＴＬＥ４陽性投射ニューロンの同定を示す、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。方法の一態様では、ｓｅｓＲＮＡ標的化Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡは、Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡのエクソン１５の全部または一部分に相補的である。

【0020】

器官培養プラットフォームにおいてヒトＦＯＸＰ２を発現する皮層を決定する方法であって、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを培養物に投与するステップであって、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間が、フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２（ＦＯＸＰ２）遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質およびｓｍＶ５をコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の緑色／黄色蛍光タンパク質（ｍＮｅｏｎ）のコード領域を含み、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸が、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、モジュラーＲＮＡ分子が、センサードメインの上流にあり、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下のＣｌｉｐＦをコードする遺伝子を含み、投与の５日後に、ｍＮｅｏｎ標識化細胞体が、器官培養プラットフォームの皮層の上層および深層で観察され、上層および深層におけるヒトＦＯＸＰ２の発現を示す、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【0021】

発作の活動に関与する病態生理学的神経集合（ＰＮＥ）の神経活動の細胞型標的化モジュレーションを含むＰＮＥを標的化することを含む、焦点性てんかん発作を促進する神経活動を抑制するための方法であって、（ｉ）本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを準備するステップであって、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間が、ヒトＳＳＴ遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質およびｏｓｍＦｌａｇをコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＢ）のコード領域を含み、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸が、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、モジュラーＲＮＡ分子が、センサードメインの上流にあり、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下のｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含み、デザイナードラッグによって独占的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする遺伝子または薬理学的選択的アクチュエータモジュール／薬理学的選択的エフェクター分子（ＰＳＡＭ）をコードする遺伝子をさらに提供する、ステップ、ならびに（ｉｉ）哺乳動物の選択された細胞において、ＤＲＥＡＤＤを活性化するオランザピンまたはクロザピン－ｎ－オキシドの経口用量またはＰＳＡＭを活性化するバレニクリンの経口用量の投与の際に、エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、薬剤およびデザイナー受容体遺伝子を哺乳動物に投与し、それによって、細胞においてタンパク質を産生させるステップであって、細胞におけるタンパク質の産生が、哺乳動物におけるてんかんの処置を提供する、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【0022】

発作の活動に関与する病態生理学的神経集合（ＰＮＥ）の神経活動の細胞型標的化モジュレーションを含むＰＮＥを標的化することを含む、焦点性てんかん発作を促進する神経活動を抑制するための方法であって、（ｉ）薬剤を準備するステップであって、薬剤が、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含み、センサードメインの連続ヌクレオチドの区間が、ヒト中初期成長ｃｆｏｓ遺伝子によってコードされる皮質細胞の選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であり、第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含むエフェクタータンパク質およびｏｓｍＦｌａｇをコードする遺伝子を含む第２のエフェクタータンパク質をコードし、第２の核酸が、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＢ）のコード領域を含み、モジュラーＲＮＡ分子を含む第１の核酸が、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、モジュラーＲＮＡ分子が、センサードメインの上流にあり、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下のｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を含む、ステップ、（ｉｉ）デザイナードラッグによって独占的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする遺伝子または薬理学的選択的アクチュエータモジュール／薬理学的選択的エフェクター分子（ＰＳＡＭ）をコードする遺伝子をさらに準備するステップ、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物の選択された細胞において、ＤＲＥＡＤＤを活性化するオランザピンまたはクロザピン－ｎ－オキシドの経口用量またはＰＳＡＭを活性化するバレニクリンの経口用量の投与の際に、エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、薬剤およびデザイナー受容体遺伝子を哺乳動物に投与し、それによって、細胞においてタンパク質を産生させるステップであって、細胞におけるタンパク質の産生が、哺乳動物における疾患または障害の処置を提供する、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【0023】

哺乳動物における慢性疼痛を処置する方法であって、（ｉ）薬剤を準備するステップであって、薬剤が、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含み、モジュラーＲＮＡの第１のモジュールが、ヒトＴＲＰＶ１遺伝子またはヒトＮａＶ１．８遺伝子のいずれかによってコードされる選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であるセンサードメインの連続ヌクレオチドの区間を含み、エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含み、モジュラーＲＮＡ分子の第１のモジュールが、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、センサードメインの上流にスペーサーをさらに含み、モジュラーＲＮＡが、第２のモジュールをさらに含み、第２のモジュールが、第１のモジュールの上流にあり、第２のモジュールが、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８に対するｓｈＲＮＡをコードし、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下にある、ステップ、ならびに（ｉｉ）哺乳動物の選択された細胞において、エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、薬剤を哺乳動物に投与し、それによって、細胞においてタンパク質を産生させるステップであって、細胞におけるタンパク質の産生が、哺乳動物における慢性疼痛の処置を提供する、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【0024】

哺乳動物におけるアルツハイマー病を処置する方法であって、（ｉ）薬剤を準備するステップであって、薬剤が、本明細書にすべて記載される、モジュラーＲＮＡ分子を含む組成物、および／または核酸組成物、および／または送達ビヒクルを含み、モジュラーＲＮＡの第１のモジュールが、アルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー１メンバーＬ１のヒトアストロサイトマーカー遺伝子（Ａｌｄｈ１Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）遺伝子、およびミクログリア遺伝子：Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）からなる群のうちの１つによってコードされる選択された細胞ＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間に相補的であるセンサードメインの連続ヌクレオチドの区間を含み、エフェクタータンパク質をコードする第１のタンパク質コードドメインが、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含み、モジュラーＲＮＡ分子の第１のモジュールが、ｈＳｙｎプロモーターの転写制御下にあり、センサードメインの上流にスペーサーをさらに含み、モジュラーＲＮＡが、第２のモジュールをさらに含み、第２のモジュールが、第１のモジュールの上流にあり、第２のモジュールが、ＡｐｏＥ４に対するｓｈＲＮＡをコードし、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターの転写制御下にある、ステップ、ならびに（ｉｉ）哺乳動物の選択された細胞において、エフェクタータンパク質の翻訳を可能にする治療有効量で、薬剤を哺乳動物に投与し、それによって、細胞においてタンパク質を産生させるステップであって、細胞におけるタンパク質の産生が、哺乳動物におけるアルツハイマー病の処置を提供する、ステップを含む、方法も本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ設計および哺乳動物細胞における実行 ａ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、翻訳的にインフレームの５’－センサードメイン（ｓｅｓＲＮＡ）および３’－エフェクタードメイン（ｅｆＲＮＡ）からなり、Ｔ２ａコード領域によって分離された、単一モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子である。ｓｅｓＲＮＡは、細胞ＲＮＡに相補的であり、ｅｆＲＮＡ翻訳を防止するインフレームのＳＴＯＰコドンを含有する。ｓｅｓＲＮＡと標的ＲＮＡとの間の塩基対合は、ＡＤＡＲを動員し、これは、Ａ→Ｉの編集を媒介し、ＵＡＧ ＳＴＯＰをＵＧＧ Ｔｒｐコドンに変換し、エフェクタータンパク質の翻訳のスイッチをオンにする。ｂ～ｄ、ｂ、ＣＡＧ－ｔｄＴ（上）は、ＣＡＧプロモーターからｔｄＴｏｍａｔｏ標的ＲＮＡを発現し、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}（下）は、ＣＡＧプロモーターによって駆動される、ＢＦＰコード領域とそれに続くｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｅｆＲＮＡ^ＧＦＰからなるｒｅａｄｒＲＮＡを発現する。ｃ、ＣＡＧ－ｔｄＴおよびＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}の両方でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、ＢＦＰおよびＲＦＰと共局在化したロバストなＧＦＰ発現を示した（下）。ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}のみ（上）、またはＳＴＯＰコドンを含有するスクランブルコード配列を有するｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌを発現するＣＡＧ－ｔｄＴおよび対照ＲＥＡＤＲ^Ｃｔｒｌ（中央）でトランスフェクトされた細胞は、ＧＦＰ発現をほとんど示さなかった。ＧＦＰおよびＲＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を右に示す。ｄ、ＦＡＣＳによるＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率の定量化。ｅ～ｇ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲにおける標的ＲＮＡレベルの効果。ｅ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲにおける標的ＲＮＡレベルの効果を定量化するための発現ベクター。ｒｔＴＡ－ＴＲＥ－ＣｈＥＴＡにおいて（上）、ＢＦＰ－ＣｈＥＴＡ融合標的ＲＮＡは、テトラサイクリンの濃度依存性の様式で構成的に発現されたｒｔＴＡによって駆動される、ＴＲＥから転写される。ＲＥＡＤＲ^{ＣｈＥＴＡ－ＧＦＰ}（下）は、ｍＣｈｅｒｒｙコード領域とそれに続くｓｅｓＲＮＡ^{ＣｈＥＴＡ}およびｅｆＲＮＡ^ＧＦＰからなるｒｅａｄｒＲＮＡを発現する。ｆ、ｒｔＴＡ－ＴＲＥ－ＣｈＥＴＡおよびＲＥＡＤＲ^{ＣｈＥＴＡ－ＧＦＰ}で共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、培地中のテトラサイクリン濃度の増加が、ＲＦＰ^＋細胞においてＢＦＰ^＋の増加したパーセンテージをもたらしたことが、ＦＡＣＳ解析によって明らかになった。ｇ、ＧＦＰ^＋のＲＦＰ＋に対する比は、テトラサイクリン濃度の増加とともに増加した。ＢＦＰ－ＣｈＥＴＡ ＲＮＡを構成的に発現するＣＡＧ－ＣｈＥＴＡは、陽性対照としての役割を果たし、ｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌを発現するＲＥＡＤＲ^Ｃｔｒｌは、陰性対照としての役割を果たした。ｈ～ｉ、ＡＤＡＲ１は、ＣｅｌｌＲＥＤＡＲ機能のために必要である。ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴのみ、ｓｅｓＲＮＡ^ＣｔｒｌおよびｔｄＴ、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｔｄＴ、またはＡＤＡＲ２過剰発現を伴うｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｔｄＴを発現する野生型またはＡＤＡＲ１^ＫＯ２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析（ｈ）。矢印は、ＧＦＰ^＋／ＲＦＰ^＋集団を示す。ｉ、細胞変換比の定量化。ｊ、示された異なる試料における意図した編集部位でのＡからＧへの変換を示すサンガーシークエンシングのエレクトロフェログラム。ｋ、棒グラフは、標的化編集部位でのＡからＧへの変換率の定量化を示す。ｄ、ｆ、ｇ、およびｋにおけるエラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝３、ｎは、並行して行われた独立した実験の数を表す。

【0026】

【図2】ｓｅｓＲＮＡの特性。 ａ、最適なｓｅｓＲＮＡの長さは、約２００～３００ｎｔである。ＲＥＡＤＲ^{ＢＦＰ－ｔｄＴ－ＧＦＰ}および標的ＲＮＡとしてｔｄＴを使用して、可変の長さを有するｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴを試験して、ＦＡＣＳアッセイにおける細胞変換比として定量化される、最適な長さを同定した。ｂ、ｓｅｓＲＮＡと標的ＲＮＡ塩基対合との間のミスマッチの効果。ミスマッチの数（上）およびｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴとｔｄＴ標的ＲＮＡとの間の同一性パーセント（下）を、それぞれの場合について示す。ｃ、ＥＦ１ａ－ＣｈＥＴＡ－ｔｄＴベクターから発現された標的ＲＮＡ（例えば、異なるＣｈＥＴＡおよびｔｄＴコード領域）内の異なる場所および配列のｓｅｓＲＮＡセンシングの効果；プロモーター領域を陰性対照として使用した。ｒｅａｄｒＲＮＡの効率を示した（下）。ｄ、ストリンジェンシーを改善するために、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴを、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－Ｌｕｃ}ベクター中に１～３つのＳＴＯＰコドン（Ｘ－ＴＡＧ）を含有するように設計した。ｅ～ｆ、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－Ｌｕｃ}のみでトランスフェクトされたか（ｅ）、またはＣＡＧ－ｔｄＴと共トランスフェクトされた（ｆ）、２９３Ｔ細胞の発光。ｇ、ＥＦ１ａ－ＣｈＥＴＡ－ｔｄＴから発現されたＣｈＥＴＡ－ｔｄＴ融合転写物の異なる領域を標的化するｓｅｓＲＮＡアレイを用いる、二重および三重センサーＲＥＡＤＲ^{ＣｈＥＴＡ／ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクターの概略図。ｈ、ＥＦ１ａ－ＣｈＥＴＡ－ｔｄＴおよび二重または三重ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクターで共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析。矢印は、ＧＦＰ＋／ＲＦＰ＋集団を示す。ｉ、（ｈ）におけるさまざまな二重または三重ＲＥＡＤＲ_{ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクターの効率の定量化。ｊ、二重センサーＲＥＡＤＲ^{ＣｈＥＴＡ／ｔｄＴ－ＧＦＰ}またはＲＥＡＤＲ^{ＣｈＥＴＡ／ｔｄＴ－Ｌｕｃ}ベクターを使用する２つの標的ＲＮＡ（ＣｈＥＴＡおよびｔｄＴ）を発現する細胞の交差標的化のためのスキーム；二重センサーアレイにおけるそれぞれのｓｅｓＲＮＡは、編集可能ＳＴＯＰを含有する。ｋ、ＦＡＣＳ解析は、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｈｅｔ／ａｔｄＴ－ＧＦＰ}およびＣＡＧ－ＣｈＥＴＡまたはＣＡＧ－ｔｄＴのいずれかによる２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションがＧＦＰ翻訳をほとんどもたらさず、三重トランスフェクションのみがＧＦＰ発現をもたらしたことを示した。ＥＦ１ａ－ＣｈＥＴＡ－ｔｄＴ（ＣｈＥＴＡ－ｔｄＴ融合転写物を発現する）共トランスフェクションを陽性対照として使用した。定量化を、ＦＡＣＳ（ｌ）およびルシフェラーゼアッセイ（ｍ）を用いて示した。ａ～ｃ、ｅ～ｆ、ｉ、およびｌ～ｍにおけるエラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝３、ｎは、並行して行われた独立した実験の数を表す。

【0027】

【図3-1】ＣｅｌｌＲＥＡＤＲを用いる内因性ＲＮＡセンシング。 ａ、エクソンおよびイントロン構造（縮尺通りではない）、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（中央）、ならびにｍＲＮＡ（下）を示す、ヒトＥＥＦ１Ａ１遺伝子のゲノム遺伝子座の概略図。ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１}（１～７）を、コード配列（ＣＤＳ）を含むＥＥＦ１Ａ１転写物にわたってサンプリングするように設計した。ｂ、ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１}（１～７）を試験するためのＲＥＡＤＲ_{ＥＥＦ１Ａ１－ＧＦＰ}ベクターの概略図；ＢＦＰ発現カセットは、すべてのトランスフェクト細胞を標識する。ｃ、２９３Ｔ細胞におけるｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１}（１～７）の効率の定量化。ｄ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの高い感度。異なる発現レベルを有するいくつかの内因性細胞ＲＮＡについてのＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率の定量化；ＲＮＡｓｅｑデータからのＴＰＭ（１００万あたりの転写物）を使用して、細胞ＲＮＡ発現レベルを示した。１～３つのｓｅｓＲＮＡを、それぞれの標的について設計した。ｅ、二重センサーＲＥＡＤＲ^{ＥＥＦ１Ａ１／ＡＣＴＢ－ＧＦＰ}ベクターを使用する２つの内因性ＲＮＡ（ＥＥＦ１Ａ１およびＡＣＴＢ）の交差標的化のための概略図；二重センサーアレイにおけるそれぞれのｓｅｓＲＮＡは、編集可能ＳＴＯＰを含有する。二重センサーＲＥＡＤＲ_{Ｃｔｒｌ／Ｃｔｒｌ－ＧＦＰ}、ＲＥＡＤＲ^{ＥＥＦ１Ａ１／Ｃｔｒｌ－ＧＦＰ}またはＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｒｌ／ＡＣＴＢ－ＧＦＰ}を対照として使用した。効率の定量化は、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｈｅｔ／ａｔｄＴ－ＧＦＰ}トランスフェクションによる２９３Ｔ細胞のみが、有意なＧＦＰ発現をもたらしたことを示した。ｆ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、ＲＮＡシークエンシングによってアッセイされる細胞トランスクリプトームを変更しなかった。ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１（７）}またはｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌ（上）およびｓｅｓＲＮＡ_ＰＣＮＡまたはｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌ（下）でトランスフェクトされた細胞間のトランスクリプトームの比較。ｇ．ｓｅｓＲＮＡ_{ＥＥＦ１Ａ１}またはｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌ（上）、ｓｅｓＲＮＡ^ＰＣＮＡまたはｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌ（下）間の差次的遺伝子発現解析のボルケーノプロット。調整Ｐ値＜０．０１およびｌｏｇ_２（倍数変化）＞２を有する遺伝子を、有意な差次的発現遺伝子として定義し、赤色で標識した。１つの遺伝子ＯＡＳ２が、ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ}群において、有意に増加した発現を伴って検出された。ｈ、ＲＮＡシークエンシングによるＡからＩの編集に対するｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１}（上）またはｓｅｓＲＮＡ^ＡＣＴＢ（下）の効果のトランスクリプトーム－ワイド解析。ピアソン相関係数分析を使用して、差次的ＲＮＡ編集率を評価した。ｃ～ｅにおけるエラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝３、ｎは、並行して行われた独立した実験の数を表す。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【0028】

【図4-1】マウスにおける神経細胞型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化、モニタリング、および操作 ａ．示されたｓｅｓＲＮＡ３およびｓｅｓＲＮＡ８の場所を有するマウスＣｔｉｐ２遺伝子のゲノム構造。ｂ．脳組織におけるＣｔｉｐ２ニューロンを標的化するための特異およびバイナリーＡＡＶベクターの概略図。特異ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２－ｓｍＦｌａｇ／ｔＴＡ２}ベクターにおいて、ｈＳｙｎプロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙとそれに続くｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｉｐ^２、ｓｍＦｌａｇおよびｔＴＡ２エフェクターをコードする配列の発現を駆動する。バイナリーベクターにおいて、レポーターベクターは、^{ＲＥＡＤＲＣｔｉｐ２－ｓｍＦｌａｇ／ｔＴＡ２}由来のｔＴＡ２に応答して、ＴＲＥプロモーターからのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ発現を駆動する。ｃ、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）－ｓｍＦｌａｇ／ｔＴＡ２}ＡＡＶを注射されたＳ１皮質の冠状断面。ＦＬＡＧ（左）およびＣＴＩＰ２（中央）抗体による免疫蛍光は、ＲＥＡＤＲ標識化細胞（ＦＬＡＧ^＋、緑色）がＣＴＩＰ２^＋ＰＮとの高い共局在化を示したことを示した。ｄ、（ｃ）における囲み領域の拡大図。矢じり形は、代表的な共標識化細胞を示す。ｅ、特異ベクターを用いて送達されたＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）}の特異性。ｆ、バイナリーＡＡＶベクターを共注射されたＳ１皮質において、ニューロンは、ｍＣｈｅｒｒｙを発現したＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２}に感染した（ｆ１）。これらのニューロンのサブセットにおいて、ｓｅｓＲＮＡ^{Ｃｔｉｐ２（３）}は、Ｌ５ｂ ＰＮにおけるｔＴＡ２の翻訳およびｍＮｅｏｎ発現の活性化を引き起こした（ｆ２）。Ｃｔｉｐ２ ＰＮにおけるｍＮｅｏｎ発現の特異性を、ＣＴＩＰ２免疫蛍光を用いて評価した（ｆ３～５）。ｆ５は、ｆ４における囲み領域である。矢じり形は、共標識化細胞を示す。ｇ、バイナリーベクターで送達されたＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）}の特異性。ｈ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＴＩＰ２発現細胞内のＧＦＰ^＋細胞として計算された、バイナリーＲＥＡＤＲ^Ｃｔｉ _ｐ ^２（３）の効率。ｉ～ｌ、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）}は、ｉｎ ｖｉｖｏで特異的な皮質ニューロン型のカルシウムイメージングを可能にした。ｉ～ｊ、麻酔マウスにおける左足の刺激の概略図（ｉ）、およびファイバー測光記録（ｊ）。ｊ、ＡＡＶ－ＰＴエンハンサー－ｔＴＡ２またはＡＡＶ－Ｃｔｉｐ２－ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ－ｔＴＡ２を、ＡＡＶ－ＴＲＥ－ＧＣａＭＰ６ｓとともに、一次体性感覚皮質、上肢領域（ＳＳｐ－ｕｌ）に共注射した。ｋ、左足の刺激の開始と整列させたニューロン活動のヒートマップ。ｌ、左足の刺激の開始と整列させた平均カルシウムシグナル（左の２つのパネル）。応答のピークＺスコアを示した（右パネル、それぞれｎ＝２頭のマウス）。灰色領域は、１秒の刺激を示す。黒色トレースは、シャッフルされた開始時間と整列させたデータからである。平均周辺の影付きは、±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｍ～ｐ、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）}は、マウスの行動における特定の皮質ニューロン型の光遺伝学的操作を可能にした。ｍ～ｎ、頭を固定したマウスにおける光遺伝学的刺激実験（ｍ）、およびウイルス注射（ｎ）の概略図。２つのカメラを使用して、誘導された移動を記録した。鼻先が座標原点である。Ｘ、Ｙ、およびＺ軸は、それぞれ、中央－側面、前－後、および背側－腹側の軸に対応する。反射マーカーを、追跡するために、左足の後側に取り付けた（赤色ドット）。ｎ、ＡＡＶ－ＰＴエンハンサー－ｔＴＡ２またはＡＡＶ－Ｃｔｉｐ２－ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ－ｔＴＡ２を、ＡＡＶ－ＴＲＥ－ＣｈＲｇｅｒ２－ｅＹＦＰとともに、尾側前肢領域（ＣＦＡ）に共注射した。ｏ、刺激開始前および後の左足のスピード（ＰＴエンハンサーマウスについてｎ＝２０の試行；Ｃｔｉｐ２ ＣｅｌｌＲＥＡＤＲマウスについてｎ＝１６の試行）。黒色トレースは、平均を示す。赤色線は、刺激の開始を示す。青色バーは、５００ミリ秒の刺激を表す（補充ビデオ１も参照されたい）。ｐ、光遺伝学的刺激の間の左足の移動の軌跡（ＰＴエンハンサーマウスについてｎ＝２０の試行；Ｃｔｉｐ２ ＣｅｌｌＲＥＡＤＲマウスについてｎ＝１６の試行）。側面（左）および前面（右）の軌跡を、左足の開始位置に対して正規化した。黒色軌跡は、平均を示す。四角は、刺激を停止した時の左足の位置を示す。

【図4-2】同上。

【図4-3】同上。

【図4-4】同上。

【0029】

【図5-1】ヒト皮質ニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲが可能にする標的化および記録 ａ、ヒト脳組織におけるニューロン型を標的化するためのバイナリーＡＡＶベクターの概略図。ＲＥＡＤＲベクターにおいて、ｈＳｙｎプロモーターはＣｌｉｐＦ－Ｔａｇとそれに続くｓｅｓＲＮＡ^{ＦＯＸＰ２}、ｓｍＶ５、およびｔＴＡ２をコードする配列の転写を駆動する。ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎにおいて、ＴＲＥプロモーターは、ＲＥＡＤＲウイルス由来のｔＴＡに応答して、ｍＮｅｏｎを駆動する。ｂ、ヒトＦＯＸＰ２遺伝子のゲノム構造。２つのｓｅｓＲＮＡを、ＦＯＸＰ２ ｍＲＮＡを標的化するように設計した。ｃ、ヒトＦＯＸＰ２細胞のＲＥＡＤＲ標的化。上層のＦＯＸＰ２細胞（ｍＮｅｏｎ、ネイティブ蛍光）を側頭部新皮質からの器官スライスにおけるＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（１）}ＡＡＶで標的化した（ｃ１）。より深い層のＦＯＸＰ２細胞を頭頂部新皮質からＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}で標的化した（ｃ２）。ｃ１およびｃ２における挿入図は、囲み領域の拡大図を示した。破線は、軟膜および白質を描写する。ｄ、ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}標識化ニューロンにおけるＦＯＸＰ２の免疫染色。矢じり形は、ｍＮｅｏｎネイティブ蛍光（左）およびＦＯＸＰ２免疫蛍光（中央）で共標識されたニューロンを示し、矢印は、ｍＮｅｏｎのみによって標識された細胞を示す。ｅ、ＦＯＸＰ２免疫蛍光法によってアッセイされたＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}の特異性。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝２の生物学的反復を行った。ｆ、３つのｍＮｅｏｎ標識化ニューロンの電流－クランプ記録トレース（上）。細胞のインプット－アウトプット曲線は、類似のスパイク挙動を示す（上）。ｇ、（ｆ）において記録された標識化ニューロンの形態（青色曲線）。パッチされた細胞は、事後回復のためにビオサイチンで満たされ、明視野で、銀染色によって視覚化された。茶色の矢じり形、青緑色の矢じり形、および紫色の矢じり形は、それぞれ、細胞体、軸索、および樹状突起を示す。ｈ、ヒトＶＧＡＴ ｍＲＮＡのエクソン２を標的化するように設計されたＳｅｓＲＮＡ。ｉ、ＡＡＶ－ＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴ、ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎに共感染し、感染８日後のネイティブ蛍光によって可視化された、ヒト側頭部新皮質からの器官スライス。ｊ～ｋ、ＡＡＶ－ＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴ標識化介在ニューロンの形態。ｌ、ｍＮｅｏｎネイティブ蛍光（左）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＶＧＡＴ ｍＲＮＡ（中央）との共局在化。矢じり形は、共標識化ニューロンを示し、矢印は、ｍＮｅｏｎのみによって標識された細胞を示す。ｍ、ｉｎ ｓｉｔｕでＶＧＡＴ ｍＲＮＡによってアッセイされたＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴの特異性。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝２の生物学的反復を行った。ｎ、事後回復のためにビオサイチンで満たされた、３つの標識化ニューロンの電流－クランプ記録トレース（上）。ストレプトアビジン色素を、視覚化のために使用した。インプット－アウトプット曲線（下）は、別個のスパイク挙動を示す（協調的（青色）、速い（緑色）、遅れて発生（赤色））。ｏ、（ｎ）において記録されたＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴ標識化細胞の形態。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【図5-4】同上。

【0030】

【図6-1】特異およびバイナリーＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターの設計および試験 ａ、特異ＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターの概略図。左、ＰＧＫ－ｔｄＴは、ＰＧＫプロモーターからｔｄＴｏｍａｔｏ標的ＲＮＡを発現する。ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}は、ＣＡＧプロモーターによって駆動される、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｅｆＲＮＡ^ＧＦＰからなるＲＥＡＤＲ ＲＮＡを発現する。縦の破線は、ｔｄＴ ｍＲＮＡとｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴとの間の相補的塩基対合領域を示し、編集可能ＳＴＯＰコドンを取り囲む配列を右に示す。編集部位で、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴにおける編集可能アデニン（青緑色）は、ｔｄＴ ｍＲＮＡにおけるシトシンとミスマッチである。ＴｄＴｏｍａｔｏは、２つのｄＴｏｍａｔｏ遺伝子のタンデムリピートであり、したがって、ｔｄＴ ＲＮＡは、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴ塩基対合のための標的配列の２つのコピーを含有する。ｂ～ｄ、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクターの検証。ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}およびＰＧＫ－ｔｄＴで共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において（ｂ）、多くは、ＧＦＰ翻訳および蛍光のスイッチをオンにした（ｃ、上側矢印）。対照空ベクターで共トランスフェクトされた細胞において、わずかな細胞が、ＧＦＰ発現を示した（ｃ、下側）。ＧＦＰ発現を、ウエスタンブロットによってさらにアッセイした（ｄ）。ｅ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲルシフェラーゼアッセイのためのバイナリーベクター設計。ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ｔＴＡ２}は、ｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｅｆＲＮＡ^ｔＴＡ２からなるｒｅａｄｒＲＮＡを発現し、ＴＲＥ－ｆｆＬｕｃは、ｔＴＡ２活性化の際に、ルシフェラーゼＲＮＡを発現する。ｆ、ルシフェラーゼ活性は、（ｅ）における３つのベクターでトランスフェクトされた細胞においてのみ劇的に増加した。ｔＴＡ２を構成的に発現する、ＴＲＥ－ｆｆＬｕｃとＣＡＧ－ｔＴＡ２の共トランスフェクションは、陽性対照としての役割を果たした。ｇ、スペーサー配列がｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴコード領域の前に挿入されている、概略的なＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクター。ｈ、２９３Ｔ細胞は、それぞれ、ｔｄＴ標的ＲＮＡ発現なし（灰色）またはあり（ピンク色）の可変の長さのスペーサーをコードするＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}ベクターでトランスフェクトされた。ＲＦＰ^＋細胞のうちのＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージとして計算された変換比の定量化。ｉ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲアッセイのためのバイナリーベクター設計。ｊ、（ｉ）におけるバイナリーベクターによるＧＦＰ変換の代表画像。ｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌベクターで共トランスフェクトされた細胞において、わずかなＧＦＰ^＋細胞が観察された。変換パーセンテージを右に示す。ｆおよびｈにおけるエラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｆについてｎ＝３、ｈについてｎ＝２、ｎは、並行して行われた独立した実験の数を表す。

【図6-2】同上。

【図6-3】同上。

【0031】

【図7-1】ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、ＲＮＡセンシング依存性遺伝子編集および細胞アブレーションを可能にする ａ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ媒介および標的ＲＮＡ依存性遺伝子編集のためのベクター設計。ＲＥＡＤＲ_{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}において、ＣＡＧプロモーターは、ＢＦＰとそれに続くｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴ、Ｃａｓ９、およびｅＧＦＰエフェクターをコードする配列の発現を駆動する。別のベクターでは、ＥＦ１ａプロモーターは、ｔｄＴ発現を駆動し、Ｕ６ｂプロモーターは、２９３Ｔ細胞において、ＤＹＲＫ１Ａ遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を駆動する。ｂ、ｔｄＴ標的ＲＮＡありまたはなしで、ＲＦＰおよびＢＦＰを発現する細胞間のＧＦＰのパーセントとしてのＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}効率の定量化。ｃ、Ｕ６ｂ－ｇＲＮＡ^{ＤＹＲＫ１Ａ}－ＣＡＧ－ｔｄＴおよびＲＥＡＤＲ_{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}の両方でトランスフェクトされた細胞は、ＢＦＰおよびＲＦＰと共局在化したロバストなＧＦＰ発現を示した（下）。ＲＥＡＤＲ_{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}のみでトランスフェクトされた細胞（上）は、ＧＦＰ発現をほとんど示さなかった。ｄ、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイは、ヒトＤＹＲＫ１Ａ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を示した。ＤＮＡ切断は、Ｕ６ｂ－ｇＲＮＡ^{ＤＹＲＫ１Ａ}－ＣＡＧ－ｔｄＴおよびＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}でトランスフェクトされた細胞溶解物において観察されたが、ｔｄＴ標的ＲＮＡを欠くＵ６ｂ－ｇＲＮＡ^{ＤＹＲＫ１Ａ}およびＲＥＡＤＲ_{ｔｄＴ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ}では観察されなかった。プラスミドトランスフェクションなしのＣＡＧ－Ｃａｓ９とＵ６ｂ－ｇＲＮＡ_{ＤＹＲＫ１Ａ}細胞溶解物および２９３Ｔ細胞溶解物を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。矢印は、切断産物を示す。ｅ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ媒介および標的ＲＮＡ依存性細胞死誘導のためのベクター設計。ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ｔａＣａｓｐ３－ＴＥＶｐ}において、ＣＡＧプロモーターは、ＢＦＰとそれに続くエフェクターとしてのｓｅｓＲＮＡ^ｔｄＴおよびｔａＣａｓｐ３－ＴＥＶｐをコードする配列の発現を駆動して、細胞死を誘導する。ｆ．発光によって測定された細胞アポトーシスレベルは、ｔｄＴ ＲＮＡなしの細胞と比較して、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ｔａＣａｓｐ３－ＴＥＶｐ}およびＥＦ１ａ－ｔｄＴでトランスフェクトされた細胞において増加した。ｂおよびｆにおけるエラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝３、ｎは、並行して行われた独立した実験の数を表す。

【図7-2】同上。

【0032】

【図8】標的化ｍＲＮＡに対するＣｅｌｌＲＥＡＤＲの効果 ａ、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ媒介ｓｅｓＲＮＡ発現が、標的化ＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼさなかったことを示す定量的ＰＣＲ。ｂ、ＥＥＦ１Ａ１ ｍＲＮＡおよびｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１－ＣＤＳ}の塩基対合。ＥＥＦ１Ａ１ ｍＲＮＡまたはｓｅｓＲＮＡを、それぞれ、青色および赤色で表した。ＥＥＦ１Ａ１ ｍＲＮＡから翻訳されたペプチドを、茶色で強調した。ＥＥＦ１Ａ１ ｍＲＮＡの標的化領域を、ＲＮＡｓｅｑによって解析した。ｃ、それぞれのアデノシン位置でのＥＥＦ１Ａ１ ｍＲＮＡのＡからＧへの変化の比を定量化し、ヒートマップに示した。２つのアデノシン（Ａ１０７およびＡ１１５）が、より高いＡからＧへの編集の比を示した（ｃ）。２つの感受性アデノシンのオフターゲット編集は、潜在的なアミノ酸変化を誘導し得る（ｂにおける下線）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎ＝３、ｎは、行われた生物学的反復の数を表す。

【0033】

【図9-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＦｅｚｆ２およびＣｔｉｐ２ ＲＮＡを標的化するｓｅｓＲＮＡの設計およびスクリーニング。 ａ～ｂ、示された通り、さまざまなｓｅｓＲＮＡの場所を有する、マウスＦｅｚｆ２（ａ）およびＣｔｉｐ２（ｂ）遺伝子のゲノム構造。ｃ、ｓｅｓＲＮＡスクリーニングのために使用されたｓｅｓＲＮＡおよびＦｅｚｆ２およびＣｔｉｐ２標的遺伝子断片のリスト。ｄ、標的ベクターＣＡＧ－ＢＦＰ－Ｆｅｚｆ２またはＣＡＧ－ＢＦＰ－Ｃｔｉｐ２において、（ａ、ｂ）におけるｓｅｓＲＮＡに相補的な配列を含有するＦｅｚｆ２またはＣｔｉｐ２遺伝子の２００ｂｐ～３０００ｂｐのゲノム領域を、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるＢＦＰおよびＴ２ａコード領域の下流でクローニングした。ＲＥＡＤＲベクターにおいて、ＲＥＡＤＲ^{Ｆｅｚｆ２－ＧＦＰ}またはＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２－ＧＦＰ}は、（ａ、ｂ）に示される対応するｓｅｓＲＮＡを発現する。ｅ～ｆ、それぞれ、ＣＡＧ－ＢＦＰ－Ｆｅｚｆ２またはＣＡＧ－ＢＦＰ－Ｃｔｉｐ２標的ベクターで共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳアッセイによるＧＦＰ変換比としてのＲＥＡＤＲ^{Ｆｅｚｆ２－ＧＦＰ}（ｅ）またはＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２－ＧＦＰ}（ｆ）の効率の定量化。ｇ、バイナリーＲＥＡＤＲ ＡＡＶベクターの概略図。ＲＥＡＤＲベクターにおいて、ｈＳｙｎプロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙとそれに続くｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｉｐ^２、ｓｍＦｌａｇおよびｔＴＡ２エフェクターをコードする配列の発現を駆動する。レポーターベクターにおいて、ＴＲＥプロモーターは、ＲＥＡＤＲベクター由来のｔＴＡ２に応答して、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを駆動する。ｈ、バイナリーＲＥＡＤＲ^{Ｆｅｚｆ２}ベクターを注射されたマウス皮質の冠状断面。ｍＮｅｏｎＧは、ＲＥＡＤＲ^{Ｆｅｚｆ２}標識化細胞を示した。４つのＦｅｚｆ２ ｓｅｓＲＮＡをスクリーニングした。ｉ、（ｈ）における４つのＦｅｚｆ２ ｓｅｓＲＮＡの特異性の定量化。Ｆｅｚｆ２ ｓｅｓＲＮＡのｉｎ－ｖｉｖｏスクリーニングのために、それぞれのｓｅｓＲＮＡの特異性を、ＲＥＡＤＲ ＡＡＶおよびＣＴＩＰ２抗体（ＦＥＺＦ２抗体の欠如に起因する）による共標識化によって計算し、Ｃｔｉｐ２は、Ｆｅｚｆ２＋細胞（示さない）のサブセットを表し、ＣＴＩＰ２抗体は、Ｆｅｚｆ２ ｓｅｓＲＮＡの特異性の過小評価を与える。ＳｅｓＲＮＡ１は、最も高い特異性を示した。ｊ、バイナリーＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２}ベクターを注射されたマウス皮質の冠状断面。ｍＮｅｏｎＧは、バイナリーＲＥＡＤＲ標識化細胞を示した。８つのＣｔｉｐ２ ｓｅｓＲＮＡをスクリーニングした。ｋ、（ｊ）における８つのｓｅｓＲＮＡの特異性の定量化。それぞれのｓｅｓＲＮＡの特異性を、バイナリーＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２}ＡＡＶおよびＣＴＩＰ２抗体の共標識化によって計算した（示さない）。ＳｅｓＲＮＡ３およびｓｅｓＲＮＡ８は、最も高い特異性を示した。

【図9-2】同上。

【0034】

【図10】ＡＤＡＲ２過剰発現を有するマウス皮質における^{ＰＮＦｅｚｆ２} _および ^{ＰＮＣ ｔｉｐ２}型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化 ａ～ｂ、それぞれ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するマウスＦｅｚｆ２（ａ）およびＣｔｉｐ２（ｂ）遺伝子のゲノム構造。ｃ、ニューロン型を標的化するためのバイナリーＡＡＶベクターの概略図。ＲＥＡＤＲ^Ｆｅｚｆ^{２－ｔＴＡ２}において、ｈＳｙｎプロモーターは、ＡＤＡＲ２とそれに続くｓｅｓＲＮＡ^{Ｆｅｚｆ２（１）}、Ｔ２ａ、およびｔＴＡ２エフェクターをコードする配列の発現を駆動する。ＴＲＥ－ｍＲｕｂｙにおいて、ＴＲＥプロモーターは、ＲＥＡＤＲウイルス由来のｔＴＡ２に応答して、ｍＲｕｂｙ３を駆動する。ｄ、Ｓ１体性感覚皮質におけるＦｅｚｆ２^＋ＰＮの分布パターンを示す、Ｆｅｚｆ２－ＣｒｅＥＲ；ＬｏｘｐＳＴＯＰＬｏｘｐ－Ｈ２ｂＧＦＰマウス脳からの冠状断面の画像（ｄ１）。Rodrigo Munoz-Castaneda et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex Nature volume 598, pages 159-166 (2021)、Ｃｒｅレポータートランスジェニックマウスを、「ノックイン」ＣｒｅドライバーとKim, Y. et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell 171, 456-469.e422 (2017)に以前に記載されたレポーターマウス（ＣＡＧ－ＬｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ＬｏｘＰ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）とを交雑することによって作出した。ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ_{Ｆｅｚｆ２（１）－ｔＴＡ２}およびＴＲＥ－ｍＲｕｂｙの共注射は、Ｌ５ｂおよびＬ６において、ＰＮを特異的に標識した（ｄ２）。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ＡＡＶおよびＨ２ｂＧＦＰによる共標識化（ｄ３）と、（ｄ４）の拡大図。矢印は、共標識化細胞を示し、矢じり形は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ＡＡＶによって標識されたが、Ｆｅｚｆ２－Ｈ２ｂＧＦＰによって標識されなかったニューロンを示す（ｄ４）。ｅ、ＲＥＡＤＲ_{Ｆｅｚｆ２（１）－ｔＴＡ２}の特異性。ｆ、Ｓ１皮質におけるＣｔｉｐ２^＋ＰＮの分布パターンを示す、ＣＴＩＰ２抗体で免疫染色されたＷＴ脳の冠状断面（ｆ１）。ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（１）}およびＴＲＥ－ｍＲｕｂｙの共注射は、Ｌ５ｂにおいて、ＰＮを特異的に標識した（ｆ２）。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ＡＡＶおよびＣＴＩＰ２抗体による共標識化（ｆ３）と、（ｆ４）の拡大図。矢印は、共標識細胞を示し、矢じり形は、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（１）}によって誤って標識された細胞を示した（ｆ４）。ｇ、ＲＥＡＤＲ^Ｃｔｉｐ^２（１）の特異性。ｈ、Ｓ１皮質におけるＡＡＶ ＲＥＡＤＲ_{Ｃｔｉｐ２（１）－ｔＴＡ２}およびＴＲＥ－ｅＹＦＰ感染ＰＮの軸索投射パターン。線条体、視床、中脳、脳橋および髄質（矢印）に対する投射を示す代表画像。ｉ、冠状断面の概略的な場所を右パネルに示す。

【0035】

【図11】マウスにおける皮質細胞型マーカーの発現レベルおよび層分布。 ａ．Ａｌｌｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅからのデータセットに基づく、トランスクリプトーム細胞型クラスターにおける選択された遺伝子の群プロット。遺伝子発現レベルおよび皮質分布を示した。ｂ、主要な細胞型マーカー遺伝子の遺伝子発現レベル。プロットは、ｓｃＲＮＡｓｅｑデータ^４０を用いて作成した。

【0036】

【図12】マウスにおける追加の皮質ニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化 ａ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するマウスＳａｔｂ２遺伝子のゲノム構造。ｂ～ｃ、図４ｉに記載されたバイナリーベクターの共注射によるＳ１における細胞標識化パターン。（ｂ１）上層および深層の両方におけるＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^{Ｓａｔｂ２}およびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎ標識化細胞。（ｂ２）Ｓａｔｂ２ ｍＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（ｂ３）ＲＥＡＤＲ^{Ｓａｔｂ２}およびＳａｔｂ２ ｍＲＮＡによる共標識化。ｃ、（ｂ３）における囲み領域の拡大図。矢印は、共標識化細胞を示す。ｄ、Ａｌｌｅｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ＡｔｌａｓからのＰ５６でのＳ１皮質におけるＳａｔｂ２ ｍＲＮＡ発現パターン。ｅ、ｍＮｅｏｎ細胞のうちのＳａｔｂ２^＋細胞のパーセントとして測定されたＲＥＡＤＲ^{Ｓａｔｂ２}の特異性。ｆ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するマウスＰｌｘｎＤ１遺伝子のゲノム構造。ｇ～ｈ、Ｓ１における上層およびＬ５ａのＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^{ＰｌｘｎＤ１}およびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎ標識化細胞（ｇ１）。ＰｌｘｎＤ１ ｍＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｇ２）。ＲＥＡＤＲ^{ＰｌｘｎＤ１} ＡＡＶおよびＰｌｘｎＤ１ ｍＲＮＡによる共標識化（ｇ３）。ｈ、（ｇ３）における囲み領域の拡大図。矢印は、共標識化細胞を示す。ｉ、Ａｌｌｅｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ＡｔｌａｓからのＰ５６ Ｓ１皮質におけるＰｌｘｎＤ１ ｍＲＮＡ発現。ｊ、ｍＮｅｏｎ細胞のうちのＰｌｘｎＤ１^＋細胞のパーセントとして測定されたＲＥＡＤＲ^{ＰｌｘｎＤ１}の特異性。ｋ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するマウスＲｏｒｂ遺伝子のゲノム構造。ｌ、層４におけるＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^ＲｏｒｂおよびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎ標識化細胞（ｌ１、ｌ３）。ＤＡＰＩ染色は、層構造を示した（ｌ２）。ｍＮｅｏｎ標識化パターンは、Ａｌｌｅｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ＡｔｌａｓからのＰ５６ Ｓ１皮質におけるＲｏｒｂ ｍＲＮＡ発現と一致し（ｍ）、Ｒｏｒｂ ｓｅｓＲＮＡの特異性は、さらに、ＲＯＲＢに対する特異的抗体およびＲｏｒｂ ｍＲＮＡに対するｉｎ ｓｉｔｕプローブの欠如に起因して、厳密に定量化されるべきである。ｎ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するマウスｖＧＡＴ遺伝子のゲノム構造。ｏ～ｐ、バイナリーＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴおよびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎ標識化細胞（ｏ１）。ｖＧＡＴ ｍＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｏ２）。ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴ ＡＡＶおよびｖＧＡＴ ｍＲＮＡによる共標識化（ｏ３）。ｐ、（ｏ３）における長方形の拡大図。矢印は、共標識化細胞を示す。ｑ、Ａｌｌｅｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ＡｔｌａｓからのＰ５６ Ｓ１皮質におけるｖＧＡＴ ｍＲＮＡ発現。ｒ、ｍＮｅｏｎ細胞のうちのｖＧＡＴ^＋細胞のパーセントとして測定されたＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴの特異性。

【0037】

【図13】ＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターの長期発現後の皮質細胞の免疫応答の評価 ａ、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣｅｌｌＲＥＡＤＲの長期効果の評価の概略図。それぞれのマウスについて、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）}またはＣＡＧ－ｔｄＴ対照ＡＡＶを、Ｓ１皮質に注射し、３か月間インキュベートした。新鮮な脳を解剖し、注射部位の皮質組織の小片を収集した。定量的ＰＣＲをすぐに行った。ウイルス注射なしのマウスのＳ１組織を対照として使用した。ｂ、グリア活性化および免疫原性に関わる９つの遺伝子の発現レベル変化のヒートマップ。

【0038】

【図14】ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２}およびＴＲＥ－ＣｈＲｇｅｒ２－ｅＹＦＰによって標的化された尾側前肢運動野におけるＬ５／６ ＣＦＰＮの軸索投射パターン ａ、光遺伝学的活性化および軸索投射追跡のためのＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２（３）－ｓｍＦｌａｇ／ｔＴＡ２}およびＴＲＥ－ＣｈＲｇｅｒ２－ｅＹＦＰのバイナリーＡＡＶベクターの概略図。ｂ、ＣＦＡに感染したＣＦＰＮの軸索投射パターン。線条体（ｂ２）、視床（ｂ３、ｂ４）、脳橋（ｂ５）および髄質（ｂ６、矢印）への投射を示す代表画像。ｃ、ｂにおける冠状断面の概略的な場所を示す。

【0039】

【図15】ラットにおけるニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化 ａ、ラットにおける細胞型標的化のためのバイナリーＡＡＶベクターの概略図。ＲＥＡＤＲベクターにおいて、ｈＳｙｎプロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙとそれに続くｓｅｓＲＮＡ、ｓｍＦｌａｇおよびｔＴＡ２エフェクターをコードする配列の発現を駆動する。ＲＥＡＤＲと一緒に、レポーターベクターは、ＲＥＡＤＲベクター由来のｔＴＡ２に応答して、ＴＲＥプロモーターからｍＮｅｏｎＧ発現を駆動する。ｂ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するラットｖＧＡＴ遺伝子のゲノム構造。ｃ、ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴおよびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎを皮質深層および海馬に注射した。バイナリーベクター標識化細胞を皮質において示した（ｃ１）。ｃ２、（ｃ１）における囲み領域の拡大図。ｖＧＡＴ ｍＲＮＡを、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標識化した（ｃ３）。ｍＮｅｏｎおよびｖＧＡＴ ｍＲＮＡによる共標識化（ｃ４）。矢印は、共標識化細胞を示した。ｄ、ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴおよびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎの共注射による海馬ＣＡ１領域における細胞標識化パターン。ｅ、（ｄ）における囲み領域の拡大図。矢印は、共標識化細胞を示す。ｆ－ｇ、ｍＮｅｏｎ細胞のうちのｖＧＡＴ^＋細胞のパーセントとして測定されたラット皮質（ｆ）および海馬（ｇ）におけるラットＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴの特異性。ｈ、示されたｓｅｓＲＮＡの場所を有するラットＴｌｅ４遺伝子のゲノム構造。ｉ～ｊ、ＡＡＶ ＲＥＡＤＲ^Ｔｌｅ４およびＴＲＥ－ｍＮｅｏｎ（図４ｉ）を、深層において濃縮されたラット運動皮質標識化細胞に共注射した（ｉ１）。Ｔｌｅ４^＋ＰＮを、ＴＬＥ４抗体染色によって標識化した（ｉ２、３）。ｊ、（ｉ）における囲み領域の拡大図。矢印は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲおよびＴＬＥ４抗体による共標識化細胞を示す。ｋ、ｍＮｅｏｎ細胞のうちのＴＬＥ４＋細胞のパーセントとして測定されたラット皮質におけるラットＲＥＡＤＲ^Ｔｌｅ４の特異性。

【0040】

【図16】ヒト皮質ｅｘ ｖｉｖｏ組織におけるニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクター標的化 ａ、ヒト皮質ｅｘ ｖｉｖｏ組織のための器官プラットフォームの概略図。ｂ、幅広い神経細胞標識化を駆動するために使用されたｈＳｙｎ－ｅＧＦＰウイルス構築物の概略図。ｃ．ＡＡＶｒｇ－ｈＳｙｎ－ｅＧＦＰ標識化細胞は、すべての層にわたって分布し、多様な形態を示した（ｃ１）。ｃ１（ｃ２）およびｃ２（ｃ３、４）からの挿入図は、顕著な垂直方向の尖端樹状突起を含む、錐体形態を有する多数の細胞を表す。ｄ、ヒト新皮質におけるＦＯＸＰ２発現。上層および深層発現（矢印）を示す、Ａｌｌｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのヒト脳マップ（検体番号４３１２）から取られたＦＯＸＰ２ ｍＲＮＡ発現パターン（ｄ１）。現在の研究におけるＦＯＸＰ２免疫染色（赤紫色）も、上層および深層の標識化の両方を実証した（ｄ２、４）。皮質ニューロンを表すＮｅｕＮ免疫染色（赤色）（ｄ３、４）。破線は、軟膜および白質を描写する。ｅ、ｄ）において使用された同じ組織に由来する器官スライスにおけるＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（１）}標識化。ｄにおいて観察されたものと比較して、非常に限定的な標識化を実証する、器官スライスにおける明視野およびｍＮｅｏｎネイティブ蛍光の概要。上層の錐体ニューロンの形態を表すｅ２（ｅ３）からの挿入図。ｆ、ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}の２つの特異ベクターの概略図。ＲＥＡＤＲ_{ＦＯＸＰ２（１）}において、ｈＳｙｎプロモーターは、ＣｌｉｐＦ、ｓｅｓＲＮＡ１、ｓｍＶ５、およびｔＴＡ２をコードする発現カセットを駆動する。ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}において、ｈＳｙｎプロモーターは、ＣｌｉｐＦ、ｓｅｓＲＮＡ２、ｓｍＦｌａｇ、およびＦｌｐＯをコードする発現カセットを駆動する。ｇ、ＤＩＶ １におけるＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}ＡＡＶの適用７日後に、組織を固定化し、ＦＯＸＰ２およびＦＬＡＧに対する抗体で染色した。ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}からのＦＬＡＧ標識化細胞は、短い尖端樹状突起を有する比較的小さい細胞体を示した（矢じり形）。非特異的バックグラウンド蛍光シグナル（例えば、血管様プロファイル）を、中央パネルの薄い矢印によって示す。ｉ、それぞれ、ＦＯＸＰ２免疫染色によって標識化されたＶ５^＋細胞（ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（１）}について）およびＦＬＡＧ^＋細胞（ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２（２）}について）のパーセンテージとして測定されたＣｅｌｌＲＥＡＤＲ特異性の定量化。

【0041】

【図17】ｉｎ ｖｉｖｏでのマカク皮質におけるＧＡＢＡニューロンのてんかんＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化。 ａ．マカクｖＧＡＴ遺伝子の概略図。ｂ．バイナリーＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ＡＡＶベクター。ｃ～ｅ、ＡＡＶインキュベーションの２か月後のマカク一次視覚野における介在ニューロン形態を有するニューロンの標識化。

【0042】

【図18】切除されたてんかん患者由来のヒト新皮質ｅｘ ｖｉｖｏ組織におけるヒトＰＶおよびＳＳＴニューロンのてんかんＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化。 ａ．ヒトＳＳＴ遺伝子およびｓｅｓＲＮＡ設計。ｂ．ＧＡＢＡニューロン型を標識および操作するためのバイナリーＡＡＶベクター。ｃ．ヒトＰＶ遺伝子およびｓｅｓＲＮＡ設計。ｄ．ヒトＰＶニューロンの形態学的標識化および発火パターンの例。ｅ．ＰＶセンサーによって標的化された１５のうち１４のニューロンが、ＰＶ介在ニューロンの特徴である速いスパイクを示す。

【0043】

【図19】マカクにおけるＧＬＵおよびＧＡＢＡニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化。 ａ．Ｖ１におけるＡＡＶ－ＲＥＡＤＲＦＯＸＰ２；ＡＡＶ－ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ標識化推定ＦＯＸＰ２細胞。囲み領域は、ｂにおいて、主にＬ６にある尖端樹状突起（白矢じり形）を有するＧＦＰ＋錐体、およびそれらの遠心性を示唆する白質の軸索（黒矢じり形）を示すために拡大する。ｃ．Ｖ１におけるＡＡＶ－ＲＥＡＤＲＶＧＡＴ；ＡＡＶ－ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ標識化推定ＧＡＢＡ細胞。ｄ～ｇ．多様なＧＡＢＡ ＩＮの特徴である突起部がわずかな樹状突起を有するｃからの多極細胞の例。

【0044】

【図20】慢性疼痛の細胞特異的処置 転写活性化因子ｔＴＡの翻訳がＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＲＮＡセンサーによってゲーティングされ、次いで、ｔＴＡが、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＲＮＡについてのｓｈＲＮＡの転写を活性化する、バイナリー発現ベクター。

【0045】

【図21】アルツハイマー病の細胞特異的介入 ＡＤマーカーＲＮＡを標的化するｓｅｓＲＮＡ、およびｈＳｙｎプロモーターによって駆動されるｔＴＡ２をコードするエフェクターＲＮＡからなるＲＥＡＤＲ ＲＮＡの概略図。このカセットの上流で、ＡｐｏＥ４ ＲＮＡに対するｓｈＲＮＡは、ＴＲＥエンハンサーによって駆動される。

【発明を実施するための形態】

【0046】

説明
定義
本開示の原理の理解を促進する目的のために、ここに、好ましい実施形態を参照し、特定の言語を使用して、それを記載する。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定が、それによって意図されず、本明細書で説明される本開示のそのような変更およびさらなる改変が、本開示が関連する技術分野の当業者が通常想到するとして企図されることが理解されるであろう。

【0047】

したがって、本開示の一態様は、（ｉ）センサーＲＮＡドメインを含む５’領域であって、センサードメインが、ＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンを含む、５’領域、および（ｉｉ）センサードメインの下流にあり、それとインフレームにあるエフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）ドメインを含む３’領域を含むモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子であって、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子のセンサードメインが、配列特異的塩基対合を通して、細胞、好ましくは、皮質の細胞または細胞の群において差次的発現される遺伝子によってコードされる細胞ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡ二重鎖を形成し、ｅｆＲＮＡが、タンパク質をコードし、ＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンが、翻訳スイッチとして作用し、それによって、ｅｆＲＮＡ領域の翻訳を可能にして、エフェクタータンパク質を産生する、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を提供する。

【0048】

一態様では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子は、センサードメインとエフェクターＲＮＡ領域との間に位置する自己切断２Ａペプチドをさらにコードする。自己切断２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドのうちの１つまたは複数からなる群から選択される。好ましくは、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａである。

【0049】

一態様では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡのエフェクター（ｅｆＲＮＡ）ドメインは、検出可能タンパク質もしくは検出可能タンパク質断片（標識）、および／または転写活性化因子もしくは抑制因子をコードする。

【0050】

一態様では、皮質の細胞において差次的発現する遺伝子（複数可）は、Ｆｅｚｆ２、Ｃｔｉｐ２、ＰｌｘｎＤ１、Ｓａｔｂ２、ＲｏｒｂおよびｖＧＡＴからなる群から選択される。

【0051】

本発明の別の実施形態は、少なくとも２つの構成要素を含むＣｅｌｌＲＥＡＤＲ「システム」であり、第１の構成要素は、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含み、第２の構成要素は、エフェクタードメインコードタンパク質に応答性である遺伝子を含む。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムのある態様では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子によるｅｆＲＮＡコードタンパク質はテトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２を含み、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子のセンサードメインは、Ｃｔｉｐ２遺伝子によってコードされる細胞ＲＮＡに特異的に結合し、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムの第２の構成要素は、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２に応答性であるＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムのある態様では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子によるｅｆＲＮＡコードタンパク質は、ｓｍＦｌａｇをさらに含む。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムのある態様では、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子は、カルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓをコードする。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムのある態様では、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子は、カルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓをコードする。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムのある態様では、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子は、光活性化イオンチャネルのチャネルロドプシン－２をコードする。

【0052】

本発明の別の実施形態は、前足の機械的刺激に応答する、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}で形質導入されたマウスにおいて、測光法によって測定される、前肢体性感覚皮質におけるＧＣａＭＰ６ｓシグナルを刺激する方法であって、マウスに上記で言及したＣｅｌｌＲｅａｄＲシステムを共感染させるステップを含む、方法である。

【0053】

本発明の別の実施形態は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}で形質導入されたマウスのＣＦＡの光刺激に応答する、前肢の移動を刺激する方法であって、マウスに上記で言及したＣｅｌｌＲｅａｄＲシステムを共感染させるステップを含む、方法である。別の態様では、第２の遺伝子は、ＴＲＥ－３Ｇ真核生物誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、第２の遺伝子（ｅＹＦＰ）は、高感度黄色蛍光タンパク質をコードする。

【0054】

本発明の別の実施形態は、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡを器官、組織または細胞に投与するためのビヒクルと作動可能に会合したモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む送達システムである。

【0055】

本発明の別の実施形態は、上記で言及したＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを器官、組織または細胞に投与するためのビヒクルと作動可能に会合した上記で言及したＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを含む送達システムである。

【0056】

本発明の別の実施形態は、送達ビヒクルが、ナノ粒子、リポソーム、ベクター、エキソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃、および細胞送達のための選択的内因性封入（ＳＥＮＤ）システムからなる群から選択される、送達システムである。

【0057】

本発明の別の実施形態は、送達ビヒクルが、組換えウイルスベクター、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルス、およびその組合せのうちの１つを含む、送達システムである。

【0058】

本発明の別の実施形態は、上記で言及したモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／または上記で言及したＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムおよび／または上記で言及した送達システム、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物である。

【0059】

本発明の別の実施形態は、上記で言及したモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／または上記で言及したＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステム、または上記で言及した送達システムを含む細胞であり、ここで、優先的には、細胞は、哺乳動物細胞である。

【0060】

本発明の別の実施形態は、上記で言及したモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、および／または上記で言及したＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムおよび／または上記で言及した送達システムを含むキットである。

【0061】

本発明の別の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質における小胞状ＧＡＢＡトランスポーター（ｖＧＡＴ）ｍＲＮＡを標的化することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、（ｉ）ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴを含むバイナリーＡＡＶベクター、および（ｉｉ）レポーター^{ｍＮｅｏｎ}を哺乳動物のＳ１バレル皮質および海馬に投与するステップを含み、ＲＥＡＤＲｖＧＡＴが、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＲＮＡとそれに続くｓｅｓＲＮＡ標的化ｖＧＡＴ ｍＲＮＡ、２ａタンパク質、ｓｍＦｌａｇ（ｓｍＶ５）、第２の２ａタンパク質、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２およびＷ３ＳＬをコードする配列に作動可能に連結されたヒトＳｙｎプロモーターである、５’から３’の転写順序の［ｈＳｙｎ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｅｓＲＮＡ^{ｖＧＡＴ－}ｓｍＦｌａｇ－ｔＴＡ２］を含み、レポーター^{ｍＮｅｏｎ}が、［ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ－ＷＰＲＥ］を含み、
投与の際に、哺乳動物のＳ１バレル皮質および海馬におけるｖＧＡＴ ｍＲＮＡが、赤紫色およびＧＦＰで共標識され、哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの同定を示す、方法である。一態様では、ｓｅｓＲＮＡ標的化ｖＧＡＴ ｍＲＮＡは、ｖＧＡＴ ｍＲＮＡのエクソン１の全部または一部分に相補的である。

【0062】

本発明の別の実施形態は、トランスデューシン様エンハンサータンパク質４（Ｔｌｅ４）ｍＲＮＡを標的化することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定する方法であって、（ｉ）ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴを含むバイナリーＡＡＶベクター、および（ｉｉ）レポーター^{ｍＮｅｏｎ}を哺乳動物のＳ１バレル皮質に投与するステップを含み、ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴが、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＲＮＡとそれに続くｓｅｓＲＮＡ標的化Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡ、２ａタンパク質、ｓｍＦｌａｇ（ｓｍＶ５）、第２の２ａタンパク質、テトラサイクリン依存性転写活性化因子ｔＴＡ２およびＷ３ＳＬをコードする配列に作動可能に連結されたヒトＳｙｎプロモーターである、５’から３’の転写順序の［ｈＳｙｎ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｅｓＲＮＡｖＧＡＴ－ｓｍＦｌａｇ－ｔＴＡ２］を含み、レポーター^{ｍＮｅｏｎ}が、［ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ－ＷＰＲＥ］を含み、投与の際に、哺乳動物のＳ１バレル皮質におけるＴｌｅ４ ｍＲＮＡが、赤紫色およびＧＦＰで共標識され、哺乳動物皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの同定を示す、方法である。一態様では、ｓｅｓＲＮＡ標的化Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡは、Ｔｌｅ４ ｍＲＮＡのエクソン１５の全部または一部分に相補的である。

【0063】

本発明の別の実施形態は、器官培養プラットフォームにおいて、ヒト言語スキルの発達に関わる進化的に保存された遺伝子であるヒトＦＯＸＰ２を発現する皮層を決定する方法であって、ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}ＡＡＶ（ｈＳｙｎ－ＣｌｉｐＦ－ｓｅｓＲＮＡ^{ＦＯＸＰ２}－ｓｍＶ５－ｔＴＡ２とＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ）を、器官培養プラットフォームのヒト新皮質スライスに投与するステップを含み、投与の５日後に、ｍＮｅｏｎ標識化細胞体が、器官培養プラットフォーム皮層の上層および深層で観察され、上層および深層におけるヒトＦＯＸＰ２の発現を示す、方法である。

【0064】

本発明の別の実施形態は、発作の活動に関与する病態生理学的神経集合（ＰＮＥ）の神経活動の細胞型標的化モジュレーションを含むＰＮＥを標的化することを含む、焦点性てんかん発作を促進する一部の細胞型における神経活動を抑制するための方法であって、神経活動についてのマーカーが、最初期遺伝子（ＩＥＧ）ｃ－ｆｏｓの迅速な上方調節であり、電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．１（ＫＣＮＡ１）、抑制性ＤＲＥＡＤＤ（ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）阻害性受容体）、および塩化物透過性である無脊椎動物グルタミン酸受容体（ｅＧｌｕＣＬ）からなる群から選択される３つのエフェクター遺伝子のうちの１つに作動可能に連結されたＲＥＡＤＲ^{ｃ－ｆｏｓ}を投与するステップを含み、てんかんの間に、ｃ－ｆｏｓ ＲＮＡの上方調節が、エフェクター翻訳を引き起こして、ＰＮＥ活動を抑制する、方法である。一態様では、エフェクター遺伝子は、抑制性ＤＲＥＡＤＤ受容体であり、これは、経口薬物オランザピンによって活性化される。別の態様では、エフェクター遺伝子は、ｅＧｌｕＣＬであり、これは、薬物イベルメクチンによって活性化される。別の態様では、エフェクター遺伝子は、抑制性ＰＳＥＭであり、これは、薬物バレニクリンによって活性化される。

【0065】

本発明の別の実施形態は、慢性疼痛を処置する方法であって、後根神経節の電位依存性ナトリウムチャネルＴＲＰＶ１またはＮａＶ１．８によってコードされるＲＮＡを標的化するＲＮＡセンサーを含む侵害受容器を標的化するステップ、およびノックダウンアプローチにおいてＣｅｌｌＲｅａｄＲ細胞型特異的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してエフェクター発現を媒介して、侵害受容器におけるＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８ ｍＲＮＡを下方調節するステップを含む、方法である。

【0066】

本発明の別の実施形態は、限定されるものではないが、アストロサイトにおいて、アルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー１メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）、およびミクログリアにおいて、Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）を含む、アルツハイマー病標的化マーカー遺伝子／ＲＮＡを処置する方法であって、ＣｅｌｌＲｅａｄＲ細胞型特異的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してエフェクター発現を媒介して、ＡｐｏＥ４を下方調節するステップを含む、方法である。

【0067】

本明細書で使用される場合、「停止コドン」という用語は、細胞中でタンパク質合成を停止するシグナルを伝達するＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における３つのヌクレオチド（トリヌクレオチド）の配列を指す。

【0068】

メッセンジャーＲＮＡにおける「コドン」は、アミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットに対応する。ＲＮＡ中の連続コドンは、タンパク質に翻訳可能である。本来は、停止コドンは、ｍＲＮＡのコード領域の３’末端に位置し、結合放出因子による翻訳の終結をシグナル伝達し、この結合は、リボソームサブユニットを解離させ、それによって、アミノ酸鎖を放出させる。６４の異なるトリヌクレオチドコドンが存在する：６１の特異的アミノ酸および３つが停止コドンである（すなわち、ＲＮＡにおけるＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡ、ならびにＤＮＡにおけるＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ）。

【0069】

本明細書で使用される場合、「編集可能停止コドン」は、停止コドンから翻訳可能コドンまでの細胞によって編集可能である停止コドンを指す。そのため、ＲＮＡでは、ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡである編集可能停止コドンは、細胞によって、ＵＩＩ、ＵＩＧ、またはＵＧＩに編集可能である。編集可能停止コドンは、編集可能停止コドンの下流の任意のコドンのための翻訳スイッチとして機能する。停止コドンの編集は、内因性ＡＤＡＲ酵素が存在する細胞中で起こる。

【0070】

停止コドンの「編集」は、編集可能停止コドンを含有する感覚性ＲＮＡが、標的ＲＮＡとｄｓＲＮＡを形成し、それによって、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員する場合に起こる。ＡＤＡＲは、ＳＴＯＰコドンで作用し、ＡからＩへの編集を行い、このようにして、例えば、ＵＡＧ ＳＴＯＰをＵＩＧ（トリプトファン）コドンに変換し、これは、下流のコドンの翻訳を可能にする。

【0071】

「ＡＤＡＲ」という用語は、ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼを表す曖昧性除去である。ＡＤＡＲ酵素は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に結合し、脱アミノ化によってアデノシンをイノシン（ヒポキサンチン）に変換する。ＡＤＡＲタンパク質は、転写後に作用し、ＲＮＡのヌクレオチド含有量を変化させる。ＲＮＡにおけるアデノシンからイノシン（ＡからＩ）への変換は、正常なＡ：Ｕ対合を破壊し、ＲＮＡを不安定化する。イノシンは、イノシンとシトシン（Ｉ：Ｃ）の結合をもたらすグアニン（Ｇ）に構造的に類似している。イノシンは、典型的には、翻訳の間に、グアノシンを模倣するが、ウラシル、シトシン、およびアデノシンにも結合することができるにもかかわらず、これは、好ましくない。

【0072】

本明細書で使用される場合、「ｒｅａｄｒＲＮＡ」は、５’領域および３’領域を有する分子であって、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子が、（ｉ）センサー（ｓｅｓ）ドメインを含む５’領域であって、センサードメインが、少なくとも１つのＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンを含む、５’領域、および（ｉｉ）センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、分子を指す。

【0073】

ｒｅａｄｒＲＮＡでは、ＡＤＡＲ編集可能停止コドンは、センサーＲＮＡ内、およびインフレームエフェクターコード領域の上流に位置する。

【0074】

本明細書で使用される場合、「ＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドン」は、ＡＤＡＲによって細胞中で編集可能である停止コドンを指す。Schneider, M. F., Wettengel, J., Hoffmann, P. C., & Stafforst, T. (2014). Optimal guide RNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2 in trans. Nucleic acids research, 42(10), e87. https://doi.org/10.1093/nar/gku272

【0075】

本明細書で使用される場合、「センサードメイン」は、ｒｅａｄｒＲＮＡの一部分を形成するヌクレオチドの連続セットを指し、ここで、センサードメインは、少なくとも１つの編集可能停止コドンおよび下流のエフェクタードメインも含む。センサードメインは、配列特異的塩基対合を通して、特定の細胞型のＲＮＡに相補的である連続ヌクレオチドを含有する。センサードメインは、少なくとも１０ヌクレオチド～少なくとも１０００ヌクレオチド、またはそれよりも多くを含む、任意の数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、センサードメインは、約１００～約９００ヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。別の実施形態では、センサードメインは、約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの範囲を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。センサードメインは、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００またはそれよりも多くの連続ヌクレオチドの長さであってもよい。

【0076】

センサードメイン中の少なくとも１つの編集可能停止コドンは、ｒｅａｄｒＲＮＡのセンサードメイン内のどこかに位置する。センサードメインは、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子中で５’から３’の方向を有し、上流（５）’部分および下流（３）’部分を含む。編集可能停止コドンは、センサードメインの上流部分またはセンサードメインの下流部分に位置し得る。編集可能停止コドンは、センサードメインの中央に近いセンサードメインの上流部分に位置していてもよく、または編集可能停止コドンは、センサードメインの下流の末端に近いセンサードメインの下流部分に位置していてもよい。例えば、センサードメインが、６００ヌクレオチドの長さであり、空間的に半分に分割される場合、第１のヌクレオチドは、センサードメインの５’末端を表し、３００番目のヌクレオチドは、センサードメインの中央を表し、センサードメインの最後（６００番目）のヌクレオチドは、センサードメインの３’末端を表し、編集可能停止コドンは、センサードメインの上流部分、または下流部分、または中央の近傍に位置し得る。およそ同じ長さを有するセンサードメインが４分の１に分割される場合、編集可能停止コドンは、センサードメインの第１の４分の１部分（ヌクレオチド１～２５０）、センサードメインの第２の４分の１部分（ヌクレオチド１５０～３００）、センサードメインの第３の４分の１部分（ヌクレオチド３００～４５０）、またはセンサードメインの第４の４分の１部分（ヌクレオチド４５０～６００）に位置し得る。そのため、所与の長さのセンサードメインについて、編集可能停止コドンは、センサードメインの選択された部分に位置し得る。一般に、編集可能停止コドンは、センサードメインの下流の半分、またはセンサードメインの下流の４分の１に位置し得る。編集可能停止コドンを含有するセンサードメインの選択された部分は、センサードメインの３’末端の１０～５０ヌクレオチド内にあり得る。

【0077】

本明細書で使用される場合、「エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）」は、エフェクタータンパク質を翻訳可能であるおよびコードする、ＲＮＡである。

【0078】

「エフェクタータンパク質」は、エフェクターＲＮＡドメインによってコードされ、それが発現される細胞に対する効果を有する、タンパク質である。エフェクタータンパク質は、細胞中で、エフェクターＲＮＡから翻訳され、したがって、それをコードするＲＮＡのようなエフェクタータンパク質は、同じ内因性タンパク質を含有していてもよく、含有していなくてもよい、細胞に導入される。エフェクタータンパク質は、それが翻訳される細胞に対する、または細胞から分泌された場合に、周囲の細胞に対する効果を有するタンパク質である。エフェクタータンパク質の非限定的な例としては、酵素、検出可能タンパク質、サイトカイン、毒素、ポリメラーゼ、転写もしくは翻訳因子、腫瘍抑制因子、神経活性化因子もしくは抑制因子、アポトーシス性タンパク質、または生理学的因子が挙げられる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）領域」は、センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、エフェクターＲＮＡを含むｒｅａｄｒＲＮＡの一部分を指す。

【0080】

エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）は、目的のエフェクタータンパク質をコードし得る。所望のエフェクタータンパク質の選択は、十分に当業者の技能内であり、ｒｅａｄｒＲＮＡの所望の使用の文脈に依存する。例えば、所与の疾患を処置することが所望される場合、エフェクタータンパク質は、疾患を確立するおよび／または長引かせるために重要である細胞に対する阻害効果をそれが有することに基づいて選択されてもよい。例えば、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ（ｅｆＲＮＡ）のエフェクターモジュールは、活性および機能を増強すること、活性および機能を抑制すること、欠失または突然変異タンパク質のインタクトバージョンを再導入することによって突然変異細胞の機能をレスキューすること、活性および機能を変更および編集すること、細胞のアイデンティティー、運命および機能を初期化すること、細胞型を死滅および除去すること、ある種類の細胞数の産生を増加または減少させること、ならびに細胞型特異的ゲノム編集および遺伝子調節を含む、複数の方法で、細胞を操作するように構築され得る。

【0081】

エフェクターの非限定的な例を下記の表１にリストする。表１は、本発明に従って有用なエフェクタータンパク質（ペイロード）の非限定的なリスト、および細胞に対するそれらの効果を提供する。
表１

【表1】

【0082】

エフェクターＲＮＡ「ペイロード」の文脈における「ペイロード」という用語は、エフェクタータンパク質をコードするＲＮＡによってコードされるタンパク質を意味する。

【0083】

本明細書で使用される場合、「細胞型」という語句は、生物、器官、組織、細胞の集団、もしくは細胞系、またはハイブリドーマ、同種細胞集団、もしくは異種細胞集団、休止もしくは静止もしくは活性化されている細胞、または形質転換もしくは罹患もしくはストレスもしくは炎症もしくはヒートショックを受けている細胞の体細胞であるか、あるいはＲＮＡの差次的発現を通して同定され得る、自然免疫系の一部、天然免疫系の一部、幹細胞、多能性幹細胞、腸幹細胞、幹細胞、胎児細胞、ホメオスタシスに寄与する細胞、心臓もしくは血管関連細胞、消化器系の細胞、神経系の細胞、骨格構造の細胞、器官の細胞である。

【0084】

おそらく、あらゆる細胞またはその群は、異なり、単一細胞ＲＮＡ解析は、細胞の系統、その活性化状態、発達の状態、他の細胞、組織および器官との相互作用の結果としてその状態、可溶性分子、ならびに／または細胞が罹患、形質転換もしくは感染しているかに関して、この多様性の証拠が得られている。

【0085】

本明細書で使用される場合、「自己切断２Ａペプチド」または「２Ａペプチド」という用語は、細胞におけるタンパク質の翻訳の間にリボソームスキッピングを誘導し得る１８～２２アミノ酸長のペプチドのクラスを指す。これらのペプチドは、ＤｘＥｘＮＰＧＰのコア配列モチーフを共有し、広範囲のウイルスファミリーで見出され、リボソームがペプチド結合を作るのを失敗させることによって、ポリタンパク質の生成を助ける。２Ａペプチドの好適な例としては、限定されるものではないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなどが挙げられる（Liu, Ziqing et al. "Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector." Scientific reports vol. 7,1 2193. 19 May. 2017, doi:10.1038/s41598-017-02460-2）。そのような自己切断２Ａペプチドの１つは、Ｔ２Ａペプチドを含む。

【0086】

いくつかの２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、およびＣ型ロタウイルスにおいて同定されている。本明細書で使用される場合、Ｔ２Ａは、トセアアシグナウイルス２Ａにおいて同定された２Ａペプチドであり、Ｐ２Ａは、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａにおいて同定された２Ａペプチドであり、Ｅ２Ａは、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａにおいて同定された２Ａペプチドであり、Ｆ２Ａは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の自己切断２Ａペプチドとして同定された２Ａペプチドである。以下の表は、さまざまな２ＡペプチドのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を提供する。下線付きの配列は、アミノ酸ＧＳＧをコードし、これは、切断効率を改善するために設計された、ネイティブ２Ａ配列に対する必要に応じた付加の例であり、Ｐ２Ａは、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ、Ｔ２Ａは、トセアアシグナウイルス２Ａ、Ｅ２Ａは、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ、Ｆ２Ａは、ＦＭＤＶ ２Ａを示す。これは、Kim J.H.et al. (High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice) PLoS One. 2011; 6(4): e18556. Published online 2011 Apr 29. doi: 10.1371/journal.pone.0018556の表１が出典である。
表２

【表2】

【0087】

本明細書で使用される場合、「自己切断２Ａペプチドをコードする配列」は、上記に記載される自己切断２Ａペプチドをコードする、核酸、好ましくは、ＲＮＡである。本発明によれば、自己切断２Ａペプチドをコードする配列は、典型的には、センサードメインとエフェクターＲＮＡ領域との間に位置する。

【0088】

「モジュラー」という用語は、「モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子」という語句の文脈で使用される場合、核酸レベル、好ましくは、ＲＮＡレベルで設計されたタンパク質ドメインをコードする核酸配列（好ましくは、ＲＮＡ配列）を含む組換えｒｅａｄｒＲＮＡ分子を指し、ここで、異なるタンパク質ドメインは、特定の数のリピート（０を含む）で、所望の順序で、組換えｒｅａｄｒＲＮＡ分子において、アセンブルされ得る。

【0089】

本明細書で使用される場合、「ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ」は、「内因性ＡＤＡＲ［ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ］によるＲＮＡセンシングを通した細胞アクセス」を表し、これは、ＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンによるなどのすべての動物細胞に遍在性の編集メカニズムの、５’センサー－編集－スイッチ領域（ｓｅｓＲＮＡ）および３’エフェクタータンパク質（またはタンパク質断片）コード領域（ｅｆ ＲＮＡ）からなり、自己切断ペプチドＴ２Ａをコードする連結配列によって分離された、単一のモジュラーＲｅａｄｒ ＲＮＡ分子として設計される。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、細胞ＲＮＡの存在を検出するため、ならびにエフェクタータンパク質の翻訳のスイッチをオンにして、細胞型の生理、機能および／または構造をモニターおよび操作するためのメカニズムを提供する。以下の表は、濃縮されたｍＲＮＡの指標とともに、さまざまな組織の細胞型を提供する。
表3

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【0090】

本明細書で使用される場合、「ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステム」は、以下の構成要素を含む：（ｉ）選択された細胞ＲＮＡの一部分に相補的であるヌクレオチドの連続セットを含むセンサーＲＮＡドメイン、（ｉｉ）エフェクタータンパク質をコードするエフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）ドメインであって、ｅｆＲＮＡドメインが、センサーＲＮＡドメインの下流にあり、それとインフレームにある、ｅｆＲＮＡドメイン、（ｉｉｉ）センサーＲＮＡドメイン内にあるか、またはセンサーとエフェクターＲＮＡドメインとの間にあるＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドン、ならびに（ｉｖ）第２のタンパク質コード核酸、または遺伝子制御エレメントを必要に応じて含む遺伝子であって、ここで（ｉｖ）は、センサーＲＮＡおよびエフェクターＲＮＡドメインに物理的に連結されていてもよく、または連結されていなくてもよい。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムは、ｒｅａｄｒＲＮＡに物理的に連結されていない（例えば、別々のベクター上の）外因性遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み得る。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムは、ｒｅａｄｒＲＮＡ核酸を含有する細胞を含んでいてもよく、核酸は、第２のタンパク質をコードし、細胞は、多細胞の生物、植物、動物、またはヒトへの送達のために使用される。

【0091】

本明細書で使用される場合、「送達システム」は、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを投与するためのビヒクルを含むシステムを指し、ここで、ビヒクルには、限定されるものではないが、ナノ粒子、リポソーム、ベクター、エキソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃、ＳＥＮＤシステム、およびその組合せが含まれる。

【0092】

「ＳＥＮＤシステム」は、ヒトゲノム中に存在するレトロエレメントに基づくヒト化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むｍＲＮＡ送達システムである（Segel M, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021;373:882-889. doi: 10.1126/science.abg6155）。そのような送達システムのベクターとしては、限定されるものではないが、組換えウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルス、およびその組合せが挙げられる。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターを含む。

【0093】

本明細書で使用される場合、「と二重鎖を形成することが可能である」は、「連続ヌクレオチドの対応する区間」がセンサードメインＲＮＡの連続ヌクレオチドの区間と塩基対合し得ることを意味する。

【0094】

本明細書で使用される場合、「対応する区間」は、同じ長さのヌクレオチドであり、塩基対合を通してマッチする、配列を意味する。

【0095】

「区間」は、少なくとも１５塩基またはそれよりも多くの連続ヌクレオチドの長さを示し、より多くには、２０塩基、２５塩基、３０塩基，４０塩基、５０塩基、６０塩基、７５塩基、１００塩基、１２５塩基、１５０塩基、１７５塩基、２００塩基、２２５塩基、２５０塩基、２７５塩基、３００塩基、３２５塩基、３５０塩基、３７５塩基、４００塩基、４２５塩基、４５０塩基、４７５塩基、５００塩基、５２５塩基、５５０塩基、５７５塩基、６００塩基、６２５塩基、６５０塩基、６７５塩基、７００塩基、７２５塩基、７５０塩基、７７５塩基、８００塩基、８２５塩基、８５０塩基、８７５塩基、９００塩基、９２５塩基、９５０塩基、９７５塩基、１０００塩基、およびそれよりも多くが含まれる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「翻訳スイッチ」は、ＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドン構成要素を含むｒｅａｄｒＲＮＡ分子の構成要素であり、これは、標的ＲＮＡに相補的な上流のセンサーＲＮＡに結合して、二本鎖ＲＮＡ構造を形成する際に、その後のＡＵＧ停止コドンのＡＤＡＲ媒介編集をもたらし、エフェクタータンパク質をコードする下流ＲＮＡの翻訳をもたらす。

【0097】

本明細書で使用される場合、「細胞ＲＮＡ」は、それが、細胞に導入された遺伝子から転写されているか、または細胞に感染した病原体（ウイルス、細菌、真菌または別の微生物など）から転写されているので、ＲＮＡが細胞に対して内因性である（すなわち、細胞に対して内因性の遺伝子から転写される）かどうか、または細胞に存在するかにかかわらず、所与の細胞に存在するＲＮＡを意味する。

【0098】

本明細書で使用される場合、「細胞の細胞ＲＮＡ」は、ＲＮＡが特定の特徴を有する細胞に存在することが公知であるので、特定の特徴を有する結果として同定可能である、細胞に存在するＲＮＡを意味する。

【0099】

本明細書で使用される場合、「細胞状態を定義する細胞ＲＮＡ」は、目的の選択細胞または細胞の群に存在する１つまたは複数のＲＮＡ配列を指し、その存在が、限定されるものではないが、特定の細胞の生理、細胞の特定の発達段階、細胞の特定の形質転換、または細胞の活性化状態を含む、所与の細胞の状態を同定する。

【0100】

すなわち、細胞の特定の生理は、大部分では、ＲＮＡ転写物の固有のレパートリーのその発現によって決定される。ＲＮＡ転写物の固有のレパートリーは、目的の特定の細胞もしくは細胞の群を同定するか、または目的の特定の細胞もしくは細胞の群の特定の活性化状態を同定するか、または目的の特定の細胞もしくは細胞の群の特定の発達段階を同定するか、または目的の細胞もしくは特定の細胞もしくは細胞の群の多数の生理学的状態のうちのいずれか１つを同定する１つの手段である。

【0101】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、線状または分枝状であってもよく、これは、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識化構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。

【0102】

本明細書に提供されるポリペプチドおよび分子の文脈では、「融合」、「融合された」、「組み合わせ」、および「連結された」という用語は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むどんな手段によっても、２つより多くのタンパク質構成要素を一緒に接続することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続的であり、リーディング段階またはインフレームにあることを意味する。本明細書で使用される場合、「インフレーム（ｉｎ－ｆｒａｍｅ）」または「インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）」という用語は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正しいリーディングフレームを維持する様式で、２つまたはそれよりも多くのＯＲＦを接続して、連続的なより長いＯＲＦを形成することを指す。そのため、得られた組換え分子は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれよりも多くのセグメントを含有する単一タンパク質である（このセグメントは、通常、天然でそのように結合していない）。

【0103】

ポリペプチドの文脈では、「線状配列」または「配列」は、配列中の互いに隣接する残基が、ポリペプチドの一次構造中で連続的である、アミノ末端からカルボキシル末端への方向のポリペプチド中のアミノ酸の順序である。「部分配列」は、一方向または両方向で追加の残基を含むことが公知のポリペプチドの部分の線状配列である。

【0104】

「異種」とは、比較される実体の残部とは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、そのネイティブコード配列から除去され、ネイティブ配列以外のコード配列に作動可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体の残部のものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。

【0105】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、公知または未知の任意の機能を行ってもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識化構成要素とのコンジュゲーションによってさらに修飾されてもよい。

【0106】

「に相補的な」、「ポリヌクレオチドの相補体」という語句は、逆方向の塩基配列を有する核酸と塩基対合する、５’から３’または３’から５’の方向の塩基配列を有する相補性を有するポリヌクレオチド核酸分子を表す。本明細書で記載される場合、センサーＲＮＡは、不可避のミスマッチコドン（好ましくは、センサーＲＮＡ中のＡＵＧ）を除いて、特定の標的ＲＮＡに相補的である。

【0107】

センサードメインの文脈における「細胞ＲＮＡに相補的である部分」という語句は、細胞ＲＮＡの対応する連続ヌクレオチドと塩基対合することが可能なセンサー核酸ドメインの連続ヌクレオチドを指す。

【0108】

センサードメインの文脈における「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的である部分」という語句は、ｍＲＮＡの対応する連続ヌクレオチドと塩基対合することが可能なセンサー核酸ドメインの連続ヌクレオチドを指す。

【0109】

「細胞ＲＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよいが、実質的にリボヌクレオチドであるヌクレオチドから構成される細胞中の核酸を指す。細胞ＲＮＡの種類としては、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡが挙げられる。細胞ＲＮＡは、ミスマッチを編集および修復するようにＡＤＡＲを引き付ける、ミスマッチを含有するセンサーＲＮＡと核酸二重鎖を形成するのに十分な長さを有する。したがって、細胞ＲＮＡは、少なくとも１０残基の長さであり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチドの長さ、またはそれよりも長くてもよい。

【0110】

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング、制限および／またはライゲーションステップ、ならびに宿主細胞において潜在的に発現され得る構築物をもたらす他の手順のさまざまな組合せの産物であることを意味する。

【0111】

「遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、本明細書で互換的に使用される。それらは、転写および翻訳された後に、特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子」という用語は、オープンリーディングフレームだけでなく、適切な転写因子の存在下でオープンリーディングフレームの転写を開始するように、オープンリーディングフレームと作動可能に会合する少なくともプロモーターを含む。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有し、これが、コード領域全体またはそのセグメントをカバーし得る限り、ゲノムまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、一緒に連結されている少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドから構成される遺伝子である。

【0112】

「相同性」または「相同」は、２つもしくはそれよりも多くのポリヌクレオチド配列、または２つもしくはそれよりも多くのポリペプチド配列間の配列の類似性または互換性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列の同一性、類似性または相同性を決定するためにＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用する場合、デフォルト設定が使用されてもよく、または適切なスコアリング行列、例えば、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択されてもよい。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その配列と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、９５％、より好ましくは、９７％、より好ましくは、９８％、さらにより好ましくは、９９％の配列同一性を有するものである。

【0113】

本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者によって呈されるか、または患者が感受性であり得る、疾患、障害または生理学的状態に応答して行われる臨床介入を指す。処置の目的には、症状の軽減もしくは防止、疾患、障害もしくは状態の進行もしくは悪化を遅延させることもしくは停止させること、および／または疾患、障害もしくは状態の寛解が含まれる。本明細書で使用される場合、「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害もしくは状態を有していないが、それを発生するリスクがあるまたはその疑いがある対象において、疾患、障害または状態の発生する確率を低減することを指す。「有効量」または「治療有効量」という用語は、有利なまたは所望の生物学的および／または臨床結果を生じるのに十分な量を指す。

【0114】

本明細書で使用される有効量は、さまざまな文脈において、疾患の症状の発生を遅延させる、疾患の症状の経過を変更する（例えば、限定されるものではないが、疾患の症状の進行を遅延させる）、または疾患の症状を反転させるのに十分な量も含む。そのため、正確な「有効量」を規定することは一般に実現可能ではない。しかしながら、任意の所与の事例について、適切な「有効量」は、ルーチン的な実験のみを使用して、当業者によって決定することができる。

【0115】

有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％が治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、数ある中でも、腫瘍成長および／またはサイズについてのアッセイによってモニターすることができる。投薬量は、医師によって決定することができ、必要により、処置の観察された効果を満足させるために調整され得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、薬剤、例えば、治療実体を動物または細胞に「投与すること」という用語は、意図される標的に物質を分配すること、送達することまたは適用することを指すことが意図される。治療剤の観点から、「投与すること」という用語は、非経口または経口経路、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、くも膜下腔内投与、頬側投与、経皮送達、外用投与、および鼻腔内または気道経路による投与のいずれかによる送達を含む、動物における所望の場所への治療剤の送達のための任意の好適な経路によって、対象に治療剤を接触させることもしくは分配すること、送達すること、または適用することを指すことが意図される。

【0117】

本明細書で使用される「生体試料」という用語には、限定されるものではないが、対象から単離された、組織、細胞、および／または体液を含有する試料が含まれる。生体試料の例としては、限定されるものではないが、組織、細胞、生検、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、および涙液が挙げられる。生体試料は、直接対象から（例えば、血液または組織サンプリングによって）、または第三者から（例えば、ヘルスケア提供者または実験助手などの仲介者から受け取る）得てもよい。

【0118】

本明細書で使用される場合、「状態および／または疾患」という用語には、限定されるものではないが、生物の一部分に影響を及ぼす構造または機能の任意の異常な状態および／または障害が含まれる。これは、外部要因、例えば、感染性疾患によって、または、内部機能障害、例えば、がん、がん転移、遺伝性障害／突然変異（先天性および環境的の両方）などによって引き起こされ得る。

【0119】

本明細書で使用される場合、遺伝子中に根本的な遺伝的突然変異を含む単一遺伝子体細胞障害は、単一遺伝子のバリアントによって引き起こされる単一遺伝子（monogenetic）障害を指す。バリアントは、染色体の対の一方または両方に存在し得る。単一遺伝子障害の非限定的な例は、嚢胞性線維症、ハンチントン病および鎌状赤血球症である。

【0120】

当技術分野で公知であるように、がんは、一般に、未制御の細胞成長と考えられる。本発明の方法を使用して、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含む、任意のがん、およびその任意の転移を処置することができる。そのようながんのより特定の例としては、乳がん、前立腺がん、結腸がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、結腸直腸がん、子宮頸がん、子宮内膜癌、唾液腺癌、中皮腫、腎臓がん、外陰部がん、膵臓がん、甲状腺がん、肝癌、皮膚がん、黒色腫、脳がん、神経芽細胞腫、骨髄腫、さまざまな種類の頭頸部がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫および末梢性神経上皮腫が挙げられる。

【0121】

例えば、「試料を接触させること」におけるような、本明細書で使用される「接触させること」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、本明細書に定義される対象内）で、直接的または間接的に、試料または細胞と接触させることを指す。試料を接触させることには、化合物（例えば、本明細書に提供されるｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／または本明細書に提供されるｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む送達システム）の試料への添加、または対象への投与が含まれ得る。接触させることは、溶液、細胞、組織、哺乳動物、対象、患者、またはヒトへの投与を包含する。さらに、細胞を接触させることには、薬剤を細胞培養物に添加することが含まれる。

【0122】

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。本明細書に開示される方法および組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、単離された細胞または組織）、または対象（すなわち、生体、例えば、患者）においてｉｎ ｖｉｖｏでのいずれかで、試料に対して使用することができる。

【0123】

「減少させる」、「低減された」、「低減」、および「阻害する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、「低減する」、「低減」または「減少させる」または「阻害する」とは、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置または薬剤の非存在）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも高い減少を含み得る。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して、完全阻害または低減を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較して、１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有さない個体についての正常範囲内として許容されるレベルへの低下であり得る。

【0124】

「増加した」、「増加させる」、「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、「増加した」、「増加させる」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大で１００％の増加を含む増加、または１０～１００％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍、もしくはそれよりも高い任意の増加を意味し得る。マーカーまたは症状の文脈では、「増加させる」は、そのようなレベルの統計学的に有意な増加である。

【0125】

中枢神経系（ＣＮＳ）は、３つの主な構成要素：脳、脊髄、およびニューロン（または神経細胞）を有する。

【0126】

これは、神経系の２つの部分のうちの１つである。他の部分は、末梢神経系であり、これは、脳および脊髄を身体の残りの部分に接続する神経からなる。

【0127】

中枢神経系の主要な細胞型は、ニューロン、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、およびミクログリア）、脈絡叢細胞、血管および被覆に関連する細胞を含む。末梢神経系は、遠心性ニューロン（運動ニューロン）、求心性ニューロン（感覚ニューロン）およびシュワン細胞を含む。

【0128】

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、家畜動物または狩猟動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。家畜動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科の種、例えば、飼い猫、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、トラウト、ナマズおよびサケが挙げられる。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書で互換的に使用される。

【0129】

好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、がんの動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。対象は、雄または雌であり得る。

【0130】

対象は、処置を必要とする状態（例えば、がん）またはそのような状態に関連する１つもしくは複数の合併症を患っているまたはそれを有していると以前に診断もしくは同定されており、必要に応じて、状態または状態に関連する１つもしくは複数の合併症のための処置を既に受けているものであり得る。あるいは、対象はまた、状態または状態に関連する１つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていないものであり得る。例えば、対象は、状態または状態に関連する１つもしくは複数の合併症についての１つもしくは複数のリスク因子を示すもの、またはリスク因子を示さない対象であり得る。

【0131】

特定の状態のための処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、またはその状態を発生するリスクがある、対象であり得る。

【0132】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のうちの１つの機能的断片であり得る。本明細書で使用される場合、「機能的断片」は、本明細書の下記に記載されるアッセイに従って、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。

【0133】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載される配列のバリアントであり得る。一部の実施形態では、バリアントは、保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、ネイティブヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。「バリアント」は、本明細書で言及される場合、ネイティブまたは参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、１つまたは複数の欠失、挿入または置換を理由として、ネイティブまたは参照ポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ネイティブまたは参照ＤＮＡ配列と比較した場合に、ヌクレオチドの１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持するバリアントタンパク質またはその断片をコードする、配列を包含する。多種多様なＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発アプローチは、当技術分野において公知であり、当業者によって適用され得る。

【0134】

一部の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換または修飾を含み得る。一部の実施形態では、置換および／または修飾は、対象において、タンパク質分解を防止もしくは低減することができ、および／またはポリペプチドの半減期を延長することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、非限定的な例の目的で、トランスフェリン（Ｗ００６０９６５１５Ａ２号）、アルブミン（Yeh et al., 1992）、成長ホルモン（ＵＳ２００３１０４５７８ＡＡ号）、セルロース（Levy and Shoseyov, 2002）、および／またはＦｃ断片（Ashkenazi and Chamow, 1997）によって、それを他のポリペプチドまたはポリペプチドドメインにコンジュゲートまたは融合することによって修飾され得る。前述の段落における参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそのアナログの組み込み単位である、任意の分子、好ましくは、ポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの１つの核酸鎖であり得る。あるいは、これは、任意の二本鎖ＤＮＡに由来しない一本鎖核酸であり得る。一態様では、核酸は、ＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸は、ＲＮＡであり得る。好適なＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが含まれ得る。好適なＲＮＡには、例えば、ｍＲＮＡが含まれ得る。

【0136】

「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、ならびに適切な場合、分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指し、適用可能な場合、限定されるものではないが、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳およびタンパク質フォールディング、修飾、ならびにプロセシングを含む。発現は、本発明の１つもしくは複数の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積、ならびに／またはポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を指し得る。

【0137】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、組織特異的である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、網羅的である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、全身的である。

【0138】

「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域に先行するおよびそれに続く領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。

【0139】

「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素が、それらの通常の機能を行うように構成されている、エレメントの配置を指す。そのため、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現を生じさせることができる。制御エレメントは、それらがその発現を方向付けるように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。そのため、例えば、介在するまだ翻訳されていないが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、依然として、コード配列に「作動可能に連結された」と考えられる。さらに、それらは、物理的に連結されている必要はない。

【0140】

本発明の文脈における「マーカー」は、対照対象（例えば、健康な対象）から得た同等の試料と比較して、糖尿病またはがんを有する対象から得られた試料中に差次的に存在する、発現産物、例えば、核酸またはポリペプチドを指す。「バイオマーカー」という用語は、「マーカー」という用語と互換的に使用される。

【0141】

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも１つのマーカーのレベルを測定すること、検出すること、または決定することに関する。本明細書で使用される場合、「検出すること」または「測定すること」という用語は、例えば、試料中の分析物の存在を示す、プローブ、標識、または標的分子からのシグナルを観察することを指す。特定の標識部分を検出するための当技術分野において公知の任意の方法を、検出のために使用することができる。例示的な検出方法としては、限定されるものではないが、分光学的、蛍光、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的方法が挙げられる。態様のいずれかの一部の実施形態では、測定することは、定量的観察であり得る。

【0142】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、または細胞は、操作することができる。本明細書で使用される場合、「操作された」は、人の手によって操作されている態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、その配列の少なくとも１つの態様が、それが天然に存在する態様と異なるように人の手によって操作されている場合、「操作されている」と考えられる。通常のプラクティスであるように、および当業者によって理解されるように、操作された細胞の子孫は、典型的には、実際の操作が以前の実体に対して行われていたとしても、依然として「操作された」と称される。

【0143】

「外因性」という用語は、そのネイティブ起源以外の細胞中に存在する物質を指す。「外因性」という用語は、本明細書で使用される場合、人の手を含むプロセスによって、生物システムに導入された、核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチド、例えば、それが通常見出されない細胞または生物であり、そのような細胞または生物に核酸またはポリペプチドを導入することを望むものを指し得る。あるいは、「外因性」は、人の手を含むプロセスによって、生物システムに導入された、核酸またはポリペプチド、例えば、比較的低い量で見出され、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルを作出することを望むものである細胞または生物を指し得る。対照的に、「内因性」という用語は、生物システムまたは細胞に対してネイティブである物質を指す。本明細書で使用される場合、「異所性」は、普通ではない場所および／または量で見出される物質を指す。異所性物質は、所与の細胞中で通常見出されるが、非常に低い量および／または異なる時に見出されるものであり得る。異所性は、その天然環境中で所与の細胞において天然に見出されないまたは発現されない、物質、例えば、ポリペプチドまたは核酸も含む。

【0144】

本明細書に記載される態様の一部では、本明細書に記載される所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターに作動可能に連結されている。「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への送達のため、または異なる宿主細胞間の移入のために設計された核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスであり得る。「ベクター」という用語は、適した制御エレメントと会合した場合に複製でき、遺伝子配列を細胞に移入することができる、任意の遺伝エレメントを包含する。ベクターとしては、限定されるものではないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、およびビリオンが挙げられ得る。

【0145】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、組換えであり、例えば、これは、少なくとも２つの異なる起源を起源とする配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる種を起源とする配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる遺伝子を起源とする配列を含み、例えば、これは、少なくとも１つの非ネイティブ（例えば、異種）遺伝子制御エレメント（例えば、プロモーター、抑制因子、活性化因子、エンハンサー、応答エレメントなど）に作動可能に連結されている、発現産物をコードする融合タンパク質または核酸を含む。

【0146】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列から、ＲＮＡまたはポリペプチドの発現を方向付ける、ベクターを指す。発現される配列は、必ずしもではないが、多くの場合に、細胞に対して異種である。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでいてもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有していてもよく、このようにして、２つの生物、例えば、発現のためにヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核宿主において、それを維持することを可能にする。

【0147】

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、任意の核酸を細胞に移入する目的のために利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが、当技術分野において公知である。

【0148】

本明細書に記載されるベクターが、一部の実施形態では、他の好適な組成物および治療と組み合わされ得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、高コピー数の外部染色体ＤＮＡで、対象において、目的のヌクレオチドを維持し、それによって、染色体の組み込みの潜在的な効果を排除する手段を提供する。

【0149】

態様のいずれかの一部の実施形態では、処置の予防的方法が本明細書に記載される。本明細書で使用される場合、「予防的」は、疾患または症状に対する処置のタイミングおよび意図を指し、すなわち、処置は、疾患または症状から患者を保護するために、その特定の疾患または症状の臨床検出または診断の前に投与される。予防的処置は、疾患もしくは症状の重症度もしくはその発生のスピードの低減を包含し得るか、または疾患もしくは症状からのより早い回復に寄与し得る。したがって、本明細書に記載される方法は、転移または腫瘍形成に対して予防的であり得る。態様のいずれかの一部の実施形態では、予防的処置は、疾患のすべての症状または兆候の防止ではない。

【0150】

本明細書で使用される場合、「組合せ」は、例えば、同じ対象への投与のための、一緒に使用するための２つまたはそれよりも多くの物質の群を指す。２つまたはそれよりも多くの物質は、任意の分子的または物理的配置で、同じ製剤中に、例えば、混合剤、溶液、混合物、懸濁液、コロイド、エマルジョン中に存在し得る。製剤は、均一なまたは不均一な混合物であり得る。態様のいずれかの一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの物質の活性化合物は、同じまたは異なる超構造、例えば、ナノ粒子、リポソーム、ベクター、細胞、スキャフォールドなどに含まれ得、超構造は、溶液、混合物、混合剤、溶媒との懸濁液、担体、または２つもしくはそれよりも多くの物質の一部である。あるいは、２つまたはそれよりも多くの物質は、同じ対象に投与される、２つまたはそれよりも多くの別々の製剤中に、例えば、別々の容器中に複数の製剤を含むキットまたはパッケージ中に存在し得る。

【0151】

キットは、本明細書に記載される少なくとも１つの試薬を含む、材料または構成要素の集団である。キットに構成される構成要素の正確な特質は、その意図される目的に依存する。態様のいずれかの一部の実施形態では、キットは、使用説明書を含む。「使用説明書」は、典型的には、例えば、対象を処置するためまたは対象に投与するための、キットの構成要素を使用するのに用いられる技法を記載する目に見える表現を含む。本発明にさらに従って、「使用説明書」は、典型的には意図される目的のための、本明細書に記載される少なくとも１つの試薬の調製を記載する目に見える表現、例えば、希釈、混合、またはインキュベーションの説明などを含み得る。必要に応じて、キットは、他の有用な構成要素、例えば、測定ツール、希釈剤、緩衝液、注射器、薬学的に許容される担体、または当業者に容易に認識される他の有用な道具も含有する。

【0152】

キットに組み立てられる材料または構成要素は、それらの操作性および有用性を保つ任意の便利で好適な方法で、開業医が貯蔵するために提供され得る。例えば、構成要素は、溶解、脱水、または凍結乾燥形態であり得、それらは、室温、冷蔵温度または凍結温度で提供され得る。構成要素は、典型的には、好適なパッケージング材料に含有される。本明細書で用いられる場合、「パッケージング材料」という語句は、キットの内容物、例えば、発明組成物などを収容するために使用される１つまたは複数の物理的構造を指す。パッケージング材料は、好ましくは、無菌の、夾雑物を含まない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。パッケージングはまた、好ましくは、光、湿度、および酸素から保護する環境を提供し得る。本明細書で使用される場合、「パッケージ」という用語は、個々のキットの構成要素を保持することができる、好適な固体マトリックスまたは材料、例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート、またはＭｙｌａｒなど）などを指す。そのため、例えば、パッケージは、ある体積の本明細書に記載される少なくとも１つの試薬を含有する好適な量の組成物を含有するために使用されるガラスバイアルであり得る。パッケージング材料は、一般に、キットおよび／またはその構成要素の内容物および／または目的を示す、外部ラベルを有する。

【0153】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、約１～１，０００ナノメートル程度の直径または幅である粒子を指す。「ナノ粒子」という用語には、ナノスフェア、ナノロッド、ナノシェル、およびナノプリズムが含まれ、これらのナノ粒子は、ナノネットワークの一部分であってもよい。「ナノ粒子」という用語は、ナノ粒子のサイズを有するリポソームおよび脂質粒子も包含する。例示的なナノ粒子としては、脂質ナノ粒子またはフェリチンナノ粒子が挙げられる。脂質ナノ粒子は、例えば、イオン化可能脂質（ＭＣ３、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＡＬＣ－０３１５、またはＳＭ－１０２など）、ペグ化脂質（ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ、ＡＬＣ－０１５９など）、リン脂質（ＤＳＰＣなど）、およびコレステロールを含む、複数の構成要素を含み得る。

【0154】

例示的なリポソームは、例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロール、水素化ダイズホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびその組合せを含み得る。

【0155】

本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、所望の部位で薬剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路による、本明細書に開示される化合物の対象への配置を指す。本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。一部の実施形態では、投与は、物理的なヒトの活動、例えば、注射、摂取の行為、適用の行為、および／または送達デバイスもしくは機械の操作を含む。そのような活動は、例えば、医療専門家および／または処置される対象によって行われ得る。

【0156】

本明細書で使用される場合、「接触させること」は、薬剤を少なくとも１つの細胞に送達または曝露するための任意の好適な手段を指す。例示的な送達方法としては、限定されるものではないが、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法が挙げられる。一部の実施形態では、接触することは、物理的なヒトの活動、例えば、注射、分配、混合および／もしくはデカンテーションする行為、ならびに／または送達デバイスもしくは機械の操作を含む。

【0157】

「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）またはそれよりも大きい差を意味する。

【0158】

操作実施例以外に、または他に示される場合、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されているとして理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージと併せて使用される場合、±１％を意味し得る。

【0159】

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、他の要素も、提示された定義された要素に加えて存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定的ではなく、包括的を示す。

【0160】

「からなる」という用語は、実施形態のその記載に列挙されていない任意の要素が排除される、本明細書に記載される組成物、方法、およびその個々の構成要素を指す。

【0161】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態について必要な要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規のまたは機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。

【0162】

本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの分子、化合物、細胞および／または粒子間の化学的相互作用であって、ここで、第１の実体は第２の標的実体に、非標的である第３の実体にそれが結合するよりも高い特異性および親和性で結合する、化学的相互作用を指す。一部の実施形態では、特異的結合は、第３の非標的実体に対する親和性よりも、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれよりも高い、第２の標的実体に対する第１の実体の親和性を指し得る。所与の標的に特異的な試薬は、利用されるアッセイの条件下で、その標的に対して特異的結合を示すものである。

【0163】

本明細書に他に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有するものとする。本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、それ自体変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見ることができ、これらの内容は、それらの全体が、参照により本明細書にすべて組み込まれる。

【0164】

当業者は、使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier; and Fischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照されたい）。

【0165】

ｍＣｈｅｒｒｙは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．に由来する、２００４年に公開された、塩基性（構成的に蛍光性の）赤色蛍光タンパク質である。これは、酸感受性が低く、非常に迅速に成熟するモノマーであると報告されており、ウイルスによって発現されたｍＣｈｅｒｒｙは、赤紫色に疑似着色される。
ＳｍＶ５は、スパゲッティモンスター（spaghetti monster）Ｖ５を指す。
ｓｍＦＬＡＧは、スパゲッティモンスターＦＬＡＧ：エピトープタグＦＬＡＧ－（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）の１０コピーを指す。
ｔＴＡ２は、テトラサイクリン依存性転写活性化因子である。

【0166】

Ｗ３ＳＬは、切断型ウッドチャック肝炎の転写後調節エレメントおよびポリアデニル化シグナルカセットである（Choi et al., 2014）。Choi JH, Yu NK, Baek GC, Bakes J, Seo D, Nam HJ, Baek SH, Lim CS, Lee YS, Kaang BK (2014)。

【0167】

ｅＹＦＰは、高感度黄色蛍光タンパク質である。

【0168】

ＰＴエンハンサーは、ＣＦＰＮのサブセットであるＬ５錐体路（ＰＴ）ニューロンを標識する、ｍｓｃＲＥ４エンハンサーである。

【0169】

カルシウム飽和ＧＣａＭＰ６ｓは、その親蛍光タンパク質の高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）よりも２７％明るい。

【0170】

ＰｌｘｎＤ１（Ｌ２／３およびＬ５ａにおける終脳内－ＩＴ ＰＮ）、Ｓａｔｂ２（上層および下層の両方にわたるＩＴ ＰＮ）、Ｒｏｒｂ（Ｌ４錐体ニューロン）、およびｖＧＡＴ（ｐａｎ－ＧＡＢＡ作動性ニューロン）。

【0171】

Ｆｅｚｆ２は、ＦＥＺファミリージンクフィンガー２遺伝子である。ＦＥＺＦ２と関連する疾患としては、部分的胎児性アルコール症候群および胸腺形成異常が挙げられる。

【0172】

Ｃｔｉｐ２ ｔｉｐ２／Ｂｃｌ１１ｂは、さまざまな組織の発達の間に、エピジェネティック調節を遺伝子転写と組み合わせる、二重作用（抑制／活性化）を有するジンクフィンガー転写因子である。転写因子ＣＯＵＰ ＴＦ１相互作用タンパク質２（ＣＴＩＰ２）は、軸索伸長および大脳皮質の大脳下投射ニューロンによる経路探索の間に重要な役割を果たす（Arlotta et al., 2005）。ここで、我々は、線条体内で、Ｃｔｉｐ２が、この重要なニューロン集団を初期有糸分裂後段階から特異的に標識する、ＭＳＮによって固有に発現されることを報告する。Ｃｔｉｐ２機能の喪失は、ＭＳＮ分化の失敗、ＭＳＮのパッチ－マトリックス組織化の破壊、およびパッチ区画の新規分子識別子を含む複数の遺伝子の発現の異なる変化をもたらす。パッチ凝集の欠陥はまた、線条体の異常なドーパミン作動性神経支配をもたらす。最後に、突然変異線条体内の細胞反発および異所形成の出現に関与する分子の発現の変更が存在し、Ｃｔｉｐ２の喪失が、発達の間の細胞反発の正常なメカニズムを破壊することを強く示唆している。Journal of Neuroscience 16 January 2008, 28 (3) 622-632; DOI: doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2986-07.2008。

【0173】

皮質下行性投射ニューロン（ＣＦＰＮ）は、ＰｌｘｎＤ１（Ｌ２／３およびＬ５ａにおける終脳内－ＩＴ ＰＮ）、Ｓａｔｂ２（上層および下層の両方にわたるＩＴ ＰＮ）、Ｒｏｒｂ（Ｌ４錐体ニューロン）、およびｖＧＡＴ（ｐａｎ－ＧＡＢＡ作動性ニューロン）を含む、皮質のアウトプットチャネルを構成する。
ｈＳｙｎは、ヒトシナプシン１遺伝子プロモーターを指し、これは、成体ラット脳において、アデノウイルスベクターからの非常にニューロン特異的な長期の導入遺伝子発現を付与することが、当技術分野で認識されている。

【0174】

ＴＲＥ－３Ｇは、真核生物誘導性プロモーターを指し、ＴＲＥは、ミニマルプロモーター（通常、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーターに由来するミニマルプロモーター配列）に融合されたＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列コンカテマーから構成される。ＴｃまたはＤｏｘの非存在下で、ｔＴＡは、ＴＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化する。

【0175】

ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍに由来する、２０１３年に公開された、塩基性（構成的に蛍光性の）緑色／黄色蛍光タンパク質である。

【0176】

ＷＰＲＥは、各種のウイルスベクターからの導入遺伝子発現を増加させるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であるが、正確なメカニズムは公知ではない。ＷＰＲＥは、導入遺伝子の下流、ポリアデニル化シグナルの近位に配置される場合、最も有効である。

【0177】

ｄＴｏｍａｔｏ遺伝子は、ｄＴｏｍａｔｏをコードする遺伝子であり、これは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．に由来する、塩基性（構成的に蛍光性の）橙色蛍光タンパク質である。

【0178】

ｔｄＴｏｍａｔｏは、ｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の２つのコピーの遺伝子融合物であり、ｔｄＴｏｍａｔｏは、並外れて明るい赤色蛍光タンパク質である。

【0179】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。

【0180】

詳細な説明
本開示は、一部では、二重機能ＲＮＡ分子（ｒｅａｄｒＲＮＡ）の発見に基づき、これは、（ｉ）その転写プロファイルに基づく、選択された体細胞の標的化、および（ｉｉ）ＲＮＡ分子によってコードされる所望のエフェクタータンパク質の選択された細胞における翻訳、ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって媒介されるＲＮＡ編集によって実行されるエフェクタータンパク質の翻訳を可能にする。

【0181】

ＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集
ＲＮＡ編集は、すべての後生動物細胞において遍在性のＤＮＡ鋳型によってコードされるＲＮＡの配列を変更する広範囲の転写後プロセスである。動物界にわたって、ＲＮＡ編集の最も普及している形態は、哺乳動物において３つのメンバー（ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３）を有するＡＤＡＲ（ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ）ファミリーの酵素によって触媒されるアデノシンからイノシン（ＡからＩ）の変換である。次いで、編集されたイノシンは、代わりに、システインと塩基対合し、さまざまな細胞機構によって、グアノシン（Ｇ）として認識される。ＡＤＡＲ媒介Ａ－Ｉ編集は、すべての後生動物細胞に遍在性である。図３を参照されたい。

【0182】

ヒトおよび動物のトランスクリプトーム中に数百万のＡＤＡＲ編集部位が存在し、この編集のわずかな割合のみが、コードｍＲＮＡにおいて起こり、タンパク質の特性を変更する。大部分は非コード領域にあり、ＲＮＡスプライシング、マイクロＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る。それらの最も必須の役割は、感染の間に免疫系にウイルスｄｓＲＮＡを破壊させながら、自然免疫応答から細胞を保護して、ｄｓＲＮＡを自己生成することである。

【0183】

ｒｅａｄｒＲＮＡ
「ｒｅａｄｒＲＮＡ」は、５’領域および３’領域を有するＲＮＡに基づく分子であって、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子が、（ｉ）センサー（ｓｅｓ）ドメインを含む５’領域であって、センサードメインが、少なくとも１つのＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンを含む、５’領域、および（ｉｉ）センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、分子を指す。出願人の発明の二重機能ｒｅａｄｒＲＮＡは、選択された体細胞において発現された標的ＲＮＡとのミスマッチを有するｄｓＲＮＡの形成によって、ｒｅａｄｒＲＮＡ中の特異的部位を編集するように、ＡＤＡＲデアミナーゼの動員を可能にする。ｒｅａｄｒＲＮＡ分子からの停止コドンのＡＤＡＲ媒介除去の際に、ｒｅａｄｒＲＮＡによってコードされる下流の作動可能に連結されたエフェクタータンパク質の翻訳は、選択された体細胞において起こる。図４。選択された体細胞における標的ＲＮＡの非存在下で、ｒｅａｄｒＲＮＡは、細胞において不活性のままである。

【0184】

ｒｅａｄｒＲＮＡが、選択された体細胞において標的ＲＮＡを検出または「感知」するので、ｒｅａｄｒＲＮＡは、細胞型を定義するＲＮＡの検出を体細胞におけるエフェクタータンパク質の翻訳と組み合わせるためのＡＤＡＲ（ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ）によって媒介されるＲＮＡ編集を活用するプログラム可能なＲＮＡセンシング技術である、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ（内因性ＡＤＡＲによるＲＮＡセンシングを通した細胞アクセス）に含まれるシステムの統合構成要素である。

【0185】

細胞型を定義するＲＮＡ
ＲＮＡは、細胞型および細胞状態の多様性の根底にある遺伝情報の中心的かつ普遍的なメディエーターであり、これは、種および寿命にわたって、組織の組織化および生物機能を一緒に形作る。ＲＮＡシークエンシングの進歩および生命科学にわたるトランスクリプトームデータセットの大規模な蓄積にもかかわらず、細胞型を観察および操作するためにＲＮＡを活用する技術の不足は、生物学および医薬における法外なボトルネックのままである。（Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0186】

細胞型は、進化の産物であり、それらは、生物の基本的な機能単位である。脳および身体における細胞型のレパートリー全体は、単一の受精卵の接合子から出発する、空間的および時間的に協調した発生事象の連続的および並行的なシリーズを通して構築される。この発生プログラムは、進化を通してゲノムにおいてコードされるすべての細胞型のアイデンティティーを解明する、注目すべき実行計画を行う。転写およびエピジェネティック調節プログラムは、ゲノム配列から展開され、細胞の増殖および分化プロセスのカスケードシリーズを駆動し、多様な細胞表現型の顕在化をもたらす。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0187】

ＲＮＡ発現プロファイルは、ほぼ間違いなく、細胞が特徴付けられ、細胞のワンタイムスナップショットである場合の時間または状態で、細胞のすべての表現型特徴の根底にある。区別の重要なポイントは、選択された細胞において発現されたＲＮＡが、細胞型が異なる状態で存在し得るように、特定の細胞状態－背景に対する細胞の一過的または動的に応答する特性－または細胞型を表すかどうかである。異なる細胞状態と関連するＲＮＡ発現の細胞型特異的変化は、概日周期、変動する代謝状態、発生、老化、または挙動的、薬理学的、もしくは病的状態の間に見られ得る（Mayr et al., 2019；Morris, 2019）。（Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0188】

単一細胞トランスクリプトームは、唯一の細胞のワンタイムスナップショットである。しかしながら、異なる時点、または異なる挙動的、生理学的、もしくは病理学的状態から収集されたトランスクリプトームを比較することができる。細胞が、それらの状態を継続的に変化し、ある特定の重要な時点で、それらが、それらの細胞型のアイデンティティーを切り替え得るので、細胞型と細胞状態との間の区別は、特に、発生の間の課題である。しかしながら、絶対的ではないが、トランスクリプトームの変化が、細胞状態の遷移の間に、より連続的になる傾向があるが、細胞が、それらの種類を切り替える場合に、より突然または別々になる傾向があると仮定することが合理的である。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0189】

意味がある細胞型の定義のために、これは、理想的には、細胞型が行うものと関連する。そのため、その細胞型を定義するＲＮＡに基づいて細胞型を定義することに加えて、細胞型は、そのＲＮＡ発現を、解剖学的および機能的情報に関連付けることによって定義される。今までのところ、トランスクリプトームの種類が、それらの空間分布パターンと優れた対応を有することが示されている。空間分布パターンが発生の間に定義されるので、これは、トランスクリプトームが発生プランを保持し得ることを示唆する。（Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0190】

系列追跡および他の表現型特徴付けと組み合わせた、高い時間分解能を有する体系的な単一細胞トランスクリプトーム、エピゲノムおよび空間的に分解されたトランスクリプトームプロファイリングは、これらの一連の事象に関与する遺伝子およびゲノム調節ネットワークの重要なセットを捕捉し、細胞型の成体段階のレパートリーをもたらす、細胞型および状態の極めて複雑な空間的および時間的遷移を解決することを開始する驚異的な可能性を保持する（Allaway et al., 2021；Bandler et al., 2022；Bhaduri et al., 2021；Cao et al., 2019b；Chen et al., 2022；Delgado et al., 2022；Di Bella et al., 2021；Klingler et al., 2021；La Manno et al., 2021；Romanov et al., 2020；Schmitz et al., 2022；Sharma et al., 2020；Shekhar et al., 2022；Tiklovaet al., 2019；Zhu et al., 2018）。（Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0191】

トランスクリプトーム的に定義された細胞型の段階的組織化
本明細書で使用される場合、「脳細胞」という用語は、哺乳動物の脳において見出される任意の細胞型を指す。

【0192】

これらの主要な脳構造のそれぞれ内で、多くの細胞型をそれぞれ有する、複数の領域および下位領域が存在する。哺乳動物の脳の基本構造（Swanson, 2000, 2012）は、終脳、間脳、中頭（中脳）、および菱脳（後脳）から構成される。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0193】

終脳（５つの主要な脳構造（１）皮質、（２）海馬形成［ＨＰＦ］、（３）嗅覚野、（４）皮質サブプレート、および（５）大脳核からなる）。終脳および間脳（視床および視床下部を含む）は、まとめて前脳と呼ばれる。中頭（中脳）は、蓋および被蓋に分けられる。菱脳（後脳）は、脳橋、髄質、および小脳に分けられる。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0194】

皮質では、分岐の第１の（最も高い）レベルは、神経細胞およびさまざまな非神経細胞のクラスの分離である（図２Ａ）。ニューロンについて、分岐の第２のレベルは、主要な脳構造／領域によって決定され、第３のレベルは、それぞれの主要な脳構造内のさまざまな細胞サブクラスおよび細胞型を含むが、発生の間の細胞輸送に起因する脳構造間を横断するまたはそこで共有される細胞型が存在し得る。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0195】

皮質は、複数の皮質領（視覚野および運動野を含む）から構成され、感覚、運動、または連合性の機能をそれぞれ媒介する。これらの領域のそれぞれでは、それらが放出する優位な神経伝達物質に基づく２つの神経細胞クラスであるグルタミン酸作動性およびＧＡＢＡ作動性、ならびにいくつかの非神経細胞クラスが存在する。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0196】

グルタミン酸作動性興奮性ニューロンは、大部分が、他の皮質および／または皮質下領域への長距離軸索投射を有する。それらは、それらの層の特異性および長距離投射パターンに基づいて９つのサブクラスに分けられる：Ｌ２／３終脳内投射［ＩＴ］、Ｌ４／５ ＩＴ、Ｌ５ ＩＴ、Ｌ６ ＩＴ、Ｃａｒ３ ＩＴ、Ｌ５終脳外投射［ＥＴ］、Ｌ５／６近投射［ＮＰ］、Ｌ６皮質視床投射［ＣＴ］、およびＬ６ｂ。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0197】

ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンは、ほとんどが、局所領域内に制限されるそれらの軸索投射を有する。それらは、標準マーカー遺伝子の後の名付けられた６つのサブクラスに分けられる：Ｌａｍｐ５、Ｓｎｃｇ、Ｖｉｐ、Ｓｓｔ、Ｓｓｔ－Ｃｈｏｄｌ、およびＰｖａｌｂ。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0198】

グルタミン酸作動性またはＧＡＢＡ作動性サブクラスのそれぞれ、ならびにそれぞれの非神経細胞クラス内で、いくつかのトランスクリプトームのクラスターまたは種類が存在し、それぞれの皮質領において合計で１１０のトランスクリプトーム細胞型をもたらす（Brain Initiative Cell Census Network, 2021; Tasic et al., 2018）。この組織化は、過去５０年にわたって、各種の表現型モダリティにおいて広く研究されてきた皮質細胞型についての既存の知識と非常に一致し（Harris and Shepherd, 2015；Tremblay et al., 2016；Yuste et al., 2020；Zeng and Sanes, 2017）、単一細胞トランスクリプトミクスが、単独で、クラスおよびサブクラスレベルで、細胞型組織化の全体をきちんと捕捉することができることを示唆する。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0199】

しかしながら、皮質内では、皮質領域に特異的な細胞型または領域間で共有される細胞型の両方が同定されている。共有される細胞型は、多くの場合、細胞型間の別個のおよび連続的な変動が共存する領域にわたって勾配分布または勾配遺伝子発現を示す。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0200】

別個の変動は、通常、階層のより上位の分岐にある、細胞サブクラスおよび主要な細胞型内に存在する。連続的な変動は、通常、より下位の分岐、例えば、Ｌ２／３～Ｌ６の皮質の深さにわたる多くのＩＴニューロン型で、密接に関連するトランスクリプトームのクラスターまたはサブタイプ内で見出される（図２Ｃ）。連続体の反対端の細胞は、明確に別個のトランスクリプトームプロファイルを有するが、一方の端から他方への推移は、連続体を構成する細胞内で段階的である。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0201】

空間的分解トランスクリプトーム法であるトランスクリプトミクスおよびＭＥＲＦＩＳＨの統合は、マウス運動皮質細胞型の空間的組織化を明らかにする（Zhang et al., 2021a）。この研究の主要な知見は、予想されるグルタミン酸作動性ニューロンサブクラスの層分布に加えて、それぞれのサブクラス内の均一なＧＡＢＡ作動型が、層選択的局在化を示し、個々のグルタミン酸作動型またはＧＡＢＡ作動型内の連続的な変動が、皮層／深さに沿ったそれらの連続的な分布と十分に相関することである（顕著な例では、興奮性のＬ２／３～Ｌ６ ＩＴ型のすべてが、Ｌ２／３～Ｌ６の皮質の深さに沿って並んでいる）。（Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031）

【0202】

しかしながら、異なる表現型特徴によって定義された細胞型が互いに一致するのかも、どの特徴が細胞型を定義するのに正しいのかも、多くの場合、不明確である。

【0203】

特異的ＲＮＡ転写物の標的化を蛍光タンパク質などのコードされるエフェクター分子の発現と関連付けることによって、ｃｅｌｌ ｒｅａｄｒＲＮＡシステムは、転写物に基づいておよび空間的／形態学的に、細胞型およびその状態を同時にモニターするシステムを提供する。

【0204】

本明細書に記載される発明は、ワトソン－クリック塩基対合およびＲＮＡ編集に基づいており、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、１）細胞ＲＮＡおよびＲＮＡ発現によって定義される細胞に対する固有および絶対特異性を有し、２）設計する、構築する、使用する、および広めることが容易であり（例えば、ＤＮＡベクター）、３）任意の組織において、すべてのＲＮＡが定義する細胞型の標的化；「細胞医療設備」のライブラリーのために非常にスケーラブルであり、４）ヒトを含むほとんどの動物種に一般化可能であり、５）ほとんどの細胞型および組織に対して網羅的であり、６）動物種にわたって一般的であり、７）ヒト生物学および医薬に適用可能であり、８）２つまたはそれよりも多くのＲＮＡによって定義される細胞の交差標的化、ならびに同じ組織におけるいくつかの細胞型の多重標的化および操作を達成するためにプログラム可能である。
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ技術

【0205】

ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ技術のコアは、ＲＮＡ配列特異的分子センサー－エフェクター分子に作動可能に連結されたスイッチである、ｒｅａｄｒＲＮＡである。これは、５’－プライム感知－編集－スイッチドメイン（ｓｅｓＲＮＡ）および３’－プライムエフェクタードメイン（ｅｆＲＮＡ）を含む単一モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡである。ｓｅｓＲＮＡの標的特異性は、標的ｍＲＮＡにおける相補配列とのその相互作用に起因する。相補性の程度は、ｓｅｓＲＮＡのＡＤＡＲ媒介編集が存在するかどうかを決定する。標的ＲＮＡに完全に相補的であるｓｅｓＲＮＡは、ＡＤＡＲ編集可能停止コドンで、ｓｅｓＲＮＡのＡＤＡＲ媒介編集を誘導する。

【0206】

ｒｅａｄｒＲＮＡは、従来のＤＮＡ発現ベクターから作成することができる。これらのベクターは、プロモーター、ｓｅｓＲＮＡおよびｅｆＲＮＡをコードするＤＮＡカセット、ならびに３’非翻訳領域からなり、これは、ルーチン的なＤＮＡ合成および分子クローニングによってアセンブルすることができる。一実施形態では、ｓｅｓＲＮＡコードカセットは、約２００～３００塩基対であってもよく、エフェクター遺伝子カセットは、約１～２キロ塩基対であってもよい。これらの発現ベクターは、さまざまなウイルス粒子に容易にパッケージングされ得る。ｒｅａｄｒＲＮＡは、必要により、化学修飾ヌクレオチドの組み込みを用いる、直接一本鎖オリゴヌクレオチド合成によって作成することもできる。
モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ

【0207】

したがって、本開示の一態様は、（ｉ）センサードメインを含む５’領域であって、センサードメインが、少なくとも１つのＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンを含む、５’領域、および（ｉｉ）センサードメインの下流にあり、それとインフレームにある、エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を提供する。「モジュラー」という用語は、「モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子」という語句の文脈で使用される場合、非常に少数の連結された構造単位の組合せを含む組換えｒｅａｄｒＲＮＡ分子を指し、ここで、それぞれの構造単位は、独立して機能するタンパク質分子をコードする。

【0208】

異なるタンパク質コードドメインがＲＮＡレベルで設計され、特定の数のリピート設計を有する所望の順序で組換えｒｅａｄｒＲＮＡ分子にアセンブルされる、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子のモジュラー設計は、多様な特性を有するｒｅａｄｒＲＮＡ分子の産生を可能にする。翻訳機構は、所望のｒｅａｄｒＲＮＡ分子が、特定のアミノ酸配列を有するように、高い忠実性も有する。

【0209】

一般に、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子は、限定されるものではないが、生物システムにおける時空間インプット／アウトプットを生じさせることを含んで、細胞間の相互作用の促進、環境刺激のセンシング、環境刺激に対する応答を生じさせることを含む、特定の機能を付与するモジュラードメインから構成される。
モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡのセンサードメイン

【0210】

センサードメイン（ｓｅｓＲＮＡ）は、特定の細胞型に存在するＲＮＡとの配列特異的な塩基対合を通して、特定の細胞型に相補的であり、特定の細胞型を検出することができる、ヌクレオチドのセットを含む。センサードメインは、任意の数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、センサードメインは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００を含む。一部の実施形態では、センサードメインは、約１００～約９００ヌクレオチドの範囲を含む。別の実施形態では、センサードメインは、約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの範囲を含む。好ましくは、センサードメイン（ｓｅｓＲＮＡ）は、塩基対合を通して、特定の細胞型ＲＮＡに相補的な、したがって、それを検出することができる、約２００ヌクレオチドを含有する。

【0211】

センサードメインは、翻訳スイッチ（本明細書で感知－編集－スイッチＲＮＡ（ｓｅｓＲＮＡ）と称される）として作用する１つまたは複数のＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンも含む。センサードメインは、このようにして、感知－編集－スイッチＲＮＡ（ｓｅｓＲＮＡ）として機能する。センサーＲＮＡは、細胞ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。

【0212】

モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子はまた、自己切断２Ａペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。そのような実施形態では、２Ａペプチドは、本明細書でさらに論じられるように、ドメイン間、好ましくは、センサードメインとエフェクターＲＮＡ領域との間および／またはｒｅａｄｒＲＮＡ分子またはＣｅｌｌＲＥＡＤＥＲシステムに存在し得る追加のドメイン／領域間に位置する。

【0213】

モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡのインフレームエフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）コード領域
センサードメインの下流に、必要に応じて自己切断２Ａペプチドをコードする配列によって分離された、インフレームエフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）コード領域がある。エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）は、目的のエフェクタータンパク質、例えば、標識された細胞の視覚化を可能にする標識をコードしてもよい。エフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）は、細胞の生理機能を変化させるエフェクタータンパク質をコードしてもよい。例えば、単一遺伝子における突然変異によって引き起こされる疾患を処置する事例では、コードされるエフェクタータンパク質は、突然変異した遺伝子の補正されたコピーであり得る。生物に対して内因性または外因性であるある特定のタンパク質を提供することによって疾患を処置する事例では、タンパク質は、エフェクター領域においてコードされ得る。

【0214】

所与のｅｆＲＮＡの選択は、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子のｒｅａｄｒＲＮＡの所望される使用（例えば、疾患の処置、タンパク質／経路の研究など）に依存し、当業者によって容易に決定することができる。例えば、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲのエフェクターモジュール（ｅｆＲＮＡ）は、活性および機能を増強すること、活性および機能を抑制すること、欠失または突然変異タンパク質のインタクトバージョンを再導入することによって突然変異細胞の機能をレスキューすること、活性および機能を変更および編集すること、細胞のアイデンティティー、運命および機能を初期化すること、細胞型を死滅および除去すること、ある種類の細胞数の産生を増加または減少させること、ならびに細胞型特異的ゲノム編集および遺伝子調節を含む、複数の方法で、細胞を操作するように構築され得る。

【0215】

標的ＲＮＡを発現する細胞では、ｓｅｓＲＮＡは、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員するｄｓＲＮＡを形成する。ＳＴＯＰコドンで、ＡからＩへの編集は、ＳＴＯＰを、ＴＩ（Ｇ）Ｇトリプトファンコドンに変換し、ｅｆＲＮＡの翻訳、およびエフェクタータンパク質の生成のスイッチをオンにする。Ｎ末端ペプチドＴ２ＡおよびＣ末端エフェクターを含む得られる融合タンパク質は、次いで、Ｔ２Ａにより自己切断され、機能性エフェクタータンパク質を放出する。標的ＲＮＡを発現しない細胞では、ｒｅａｄｒＲＮＡは不活性のままである。

【0216】

ｅｆＲＮＡコードタンパク質は、細胞複製、遺伝子発現、および／または転写／翻訳に関与するか、またはそれに影響を及ぼし得る、任意のタンパク質を含んでいてもよい。好適な例としては、限定されるものではないが、転写活性化因子、転写阻害因子、およびＤＮＡリコンビナーゼなどが挙げられる。

【0217】

エフェクタータンパク質としては、限定されるものではないが、
Ａ）酵素、例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシラーゼ、アセチラーゼ、またはリパーゼ、ｂ）宿主細胞タンパク質の機能を模倣するタンパク質、ｃ）転写因子、ｄ）タンパク質間相互作用を促進するタンパク質パートナー、ｄ）例えば、感染を容易にすることによって、および／または防御応答を引き起こすこと、および／または形態形成を促進することによって、宿主細胞の構造および機能を変更するタンパク質（毒性因子または毒素）が挙げられる（Cachat, E., Liu, W., Hohenstein, P. et al. A library of mammalian effector modules for synthetic morphology. J Biol Eng 8, 26 (2014). https://doi.org/10.1186/1754-1611-8-26）。

【0218】

例えば、例示的なエフェクタータンパク質を、下記の表４にリストする。

【表4】

【0219】

したがって、エフェクター機能は、ファゴサイトーシス、サイトカインの分泌、免疫細胞の輸送、または機能、遊走、生存および増殖の促進を含む、自然免疫細胞応答の活動に影響を及ぼし得る。

【0220】

したがって、コードされるエフェクター分子は、目的の遺伝子のプロモーター／増強領域に結合することによって、目的の遺伝子の発現をそれぞれ刺激または抑制し、内因性遺伝子または細胞の背後のシステムの一部分として投与される外因性遺伝子である、トランス活性化因子またはトランス抑制因子であり得る。

【0221】

転写活性化因子は、ＤＮＡ（またはレトロウイルスの事例では、ＲＮＡ）中の１つまたは複数の特異的調節配列に結合し、１つまたは複数の近傍の遺伝子の転写を刺激する、タンパク質または低分子である。ほとんどの活性化因子は、ＲＮＡポリメラーゼの結合（閉鎖複合体の形成）または転写の開始に必要な開放複合体への移行を増強する。ほとんどの活性化因子は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットと直接相互作用する。

【0222】

転写抑制因子は、ヒストン修飾酵素を含む複数のタンパク質を含有する共役制御因子複合体を動員することによって機能すると一般に考えられる、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。

【0223】

本明細書で使用される場合、「モジュレートされた」とは、活性化されたまたは阻害されたという意味で、調節されたを意味する。

【0224】

本明細書で使用される場合、病原体は、人間において疾患を引き起こす生物を含む。病原体としては、限定されるものではないが、細菌、ウイルス、寄生生物、昆虫、藻類、プリオンおよび真菌が挙げられる。

【0225】

ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステム２のレポーター遺伝子
本開示の別の態様は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを提供し、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムは、少なくとも２つの構成要素を含み、第１の構成要素は、本明細書に記載されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、および必要に応じて、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子のｅｆＲＮＡコードタンパク質（例えば、転写調節因子、例えば、ＡＰ１およびＳＰ１）に作動可能に連結された（この実施形態では、物理的に連結されていない）応答遺伝子を含む追加の構成要素を含む。これは、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子が、物理的に別々の外部から添加された核酸分子、例えば、細胞死をもたらすカスパーゼ分子においてコードされる別のタンパク質の転写を活性化し、増加させ、減少させ、または抑制することを可能にする。
ＡＤＡＲが媒介するプログラム可能性および交差標的化

【0226】

センサーおよびエフェクターモジュールは、コンビナトリアルで、容易にプログラム可能であり、これは、それぞれを具体的かつ協調した方法で、複数の方法でそれぞれの細胞型を操作し、組織中の複数の細胞型を同時に操作することを可能にする。上記に提供されるように、一部の実施形態では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子は、自己切断ペプチド２Ａをコードする配列の必要に応じた連結によって分離された、５’センサー－編集－スイッチ領域（ｓｅｓＲＮＡ）および３’エフェクターコード領域（ｅｆＲＮＡ）を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ｓｅｓＲＮＡは、塩基対合を通して、特定の細胞型ＲＮＡに相補的な、したがって、それを検出することができる、約２００～約３００ヌクレオチドを含有するが、翻訳スイッチとして作用し、下流に、目的のさまざまなエフェクタータンパク質を生成するインフレームのエフェクターコード領域がある、１つまたは複数のＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンも含む。

【0227】

標的ＲＮＡを発現する細胞では、ｓｅｓＲＮＡは、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員する標的ＲＮＡを有するｄｓＲＮＡを形成する。ＳＴＯＰコドンで、ＡからＩへの編集は、ＳＴＯＰを、ＴＩ（Ｇ）Ｇトリプトファンコドンに変換し、ｅｆＲＮＡの翻訳、およびエフェクタータンパク質の生成のスイッチをオンにする。Ｎ末端ペプチド２ＡおよびＣ末端エフェクターを含む得られる融合タンパク質は、次いで、２Ａにより自己切断され、機能性エフェクタータンパク質を放出する。重要なことには、標的ＲＮＡを発現しない細胞では、ｒｅａｄｒＲＮＡは不活性のままである。そのため、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子は、このようにして単一ＲＮＡ分子として展開され得、ＡＤＡＲが細胞内因性であるので、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に容易に適合し得る。

【0228】

一部の状況では、ＡＤＡＲタンパク質は、細胞において、高度に発現されないか、または一部の事例では、存在しない。そのような事例では、本開示は、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子内に含められる、および／または別々のベクターを介してシステムに添加される、ＡＤＡＲタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ２）の添加を提供する。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの最も基本的な特徴は、それが、全体的に、限定されるものではないが、（ｉ）細胞ＲＮＡに対する固有および絶対特異性、（ｉｉ）設計、構築、使用および共有の容易さ（ＤＮＡベクター）、（ｉｉｉ）「細胞医療設備」の非常にスケーラブルなライブラリー、（ｉｉｉ）ほとんどの細胞型および組織に対して網羅的、（ｉｖ）動物種にわたって一般的、ならびに（ｖ）ヒト生物学および医薬を含む、多数の非常に所望される特性を付与する、ワトソン－クリック塩基対合に基づいて、それにより作動するＲＮＡ配列であることである。そのため、網羅的でコンビナトリアルなＣｅｌｌＲＥＡＤＲセンサー－エフェクターライブラリーを、器官系および動物種にわたって、細胞型を同定する、特徴付ける、および操作するために構築することができる。

【0229】

本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子のプログラム可能性は、追加の能力を付与する。したがって、本開示の別の実施形態は、プログラム可能なモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／または本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を使用する交差標的化を提供する。

【0230】

第１に、２つまたはそれよりも多くのＲＮＡセンサーを、２つまたはそれよりも多くの別々の細胞ＲＮＡを検出して、２つまたはそれよりも多くの特定の細胞型の交差標的化を達成するように設計することができる。第２に、同じＲＮＡセンサーを、異なるエフェクターに連結して、同じ細胞型を標識、記録、および操作することができる。第３に、複数のＲＮＡセンサーのコホートを、異なるエフェクターをそれぞれ発現する同じ組織におけるいくつかの細胞型を標的化して、組織機能を協調的にモジュレートするように設計することができる。第４に、ＲＮＡセンサーを、標的ＲＮＡの異なる閾値レベルを検出して、ＲＮＡレベルによって定義される異なる細胞状態をモニターおよび操作するように設計することができる。

【0231】

一実施形態では、本開示は、２つの別々の細胞ＲＮＡを検出して、より多くの特定の細胞型の交差標的化を達成するように設計されている、２つのセンサーを提供する。一態様では、それぞれのセンサーモジュールは、ＳＴＯＰコドンを有し、両方が除去された場合にのみ、発現されるエフェクター分子であり得る。一実施形態では、それぞれのセンサーは、少なくとも１つのＳＴＯＰコドンを含む。別の実施形態では、同じセンサーを、異なるエフェクターを発現させて、同じ細胞型を標識、記録、および操作するために使用することができる。さらに別の実施形態では、多数のセンサーは、異なるエフェクターをそれぞれ発現する同じ組織におけるいくつかの細胞型を標的化して、それによって、組織機能のモジュールを協調させるように設計される。

【0232】

そのため、ＲＮＡセンシングドメインは、任意の細胞ＲＮＡを検出する能力、ならびにしたがって、任意のヒト組織において任意のＲＮＡが定義する細胞型および細胞状態にアクセスする性能を有する。エフェクタードメインは、任意のタンパク質をコードする能力、ならびにしたがって、多くの細胞特性をモニター、操作、および編集する性能を有する。
細胞型および細胞状態を標的化する一般性

【0233】

ＲＮＡセンサードメインは、細胞型および細胞状態を定義するＲＮＡマーカーを検出することができる。単一細胞ＲＮＡシークエンシングにおける最近の進展は、すべてのヒトおよび動物組織における大規模データセットを作成している^{１、２、３}。いくつかの主な努力は、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ａｔｌａｓプロジェクト（humancellatlas.orgのワールドワイドウェブ）、（commonfund.nih.gov/hubmap）のＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｔｌａｓプログラム、ＢＲＡＩＮ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｓｕｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（biccn.org/）、およびＡｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｔｌａｓ（portal.brain-map.org/）を含んで、進歩を推進している。

【0234】

すべての単一細胞トランスクリプトームデータセットは、公にアクセス可能である。ＲＮＡマーカーは、すべてではないが、主要なヒト細胞型のほとんどについて同定されている^{１、２、３}。さらにまた、ＲＮＡマーカーは、多くの罹患細胞状態について同定されている^４。これらのＲＮＡマーカーはすべて、細胞型および細胞状態を標的化するために、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによって使用され得る。これらのマーカーの一部を、表５にリストする。
表5

【表5】

【0235】

参考文献

【化1】

【化2】

【0236】

送達
ＡＤＡＲが細胞内因性であるので、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲを、単一ＲＮＡ分子として展開することができる。また、＜４．７Ｋｂで、ＡＡＶ ウイルスベクターに容易に適合させることができる。実際に、ｒｅａｄｒＲＮＡ全体は、どの特定のセンサーおよびエフェクターが分子に組み込まれるかに応じて、数キロ塩基であり、したがって、送達システムを通して、細胞に送達可能である。標的ＲＮＡを発現する細胞では、ｓｅｓＲＮＡは、標的とｄｓＲＮＡを形成し、これは、ＡＤＡＲを動員して、編集複合体をアセンブルする。編集可能ＳＴＯＰコドンで、ＡＤＡＲは、ＡからＩに変換し、これは、標的ＲＮＡ中の反対のＣと対合する。このＡ→Ｇ置換は、ＴＡＧ ＳＴＯＰコドンをＴＩ（Ｇ）Ｇトリプトファンコドンに変換し、ｅｆＲＮＡの翻訳のスイッチをオンにする。インフレーム翻訳は、Ｎ末端ペプチド２Ａ（使用される場合）およびＣ末端エフェクターを含む融合タンパク質を生成し、これは、次いで２Ａにより自己切断され、機能性エフェクタータンパク質を放出する（例えば、図１ａを参照されたい）。ｒｅａｄｒＲＮＡは、標的ＲＮＡを発現しない細胞では、不活性のままである。

【0237】

本開示および当技術分野における知識により、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子もしくはその任意の構成要素、その核酸分子、および／またはその構成要素をコードもしくは提供する核酸分子、ならびに本明細書に提供される任意のＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムは、さまざまな送達システムによって送達され得る。そのような送達システムの例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクション法：化学試薬（ＰＥＩ、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、リン酸カルシウムなど）または電気穿孔が挙げられ、ＤＮＡ発現ベクターは、リポソームナノ粒子にパッケージングされ得る。ｒｅａｄｒＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写または合成され得、リポソームナノ粒子、ナノ粒子、リポソーム、組換えウイルスベクター（ウイルスベクター：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、および水疱性口内炎ウイルスが好ましいウイルスビヒクルである）、電気穿孔エキソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃、細胞送達のための選択的内因性封入（ＳＥＮＤ）システム、ヒトゲノムに存在するレトロエレメントに基づくヒト化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むｍＲＮＡ送達システム（Segel M, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021;373:882-889. doi: 10.1126/science.abg6155）、その組合せなどにパッケージングされ得る。

【0238】

モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはＲＮＡ（例えば、ｓｅｓＲＮＡ、ｅｆＲＮＡなど）のいずれかおよび／または任意の付属タンパク質および／またはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムは、好適なベクター、例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルス、および他のウイルスベクター、またはその組合せを使用して、送達することができる。タンパク質、例えば、ｓｅｓＲＮＡ、ｅｆＲＮＡ、ｅｆＲＮＡ応答遺伝子、タンパク質コードまたは非コードＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＨＡ、ｓｈＲＮＡなど）、Ｃｅｌｌ ＲＥＡＤＲシステムなどは、１つまたは複数のベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターにパッケージングされ得る。例えば、一部の実施形態では、ｅｆＲＮＡコードタンパク質に作動可能に連結されたｅｆＲＮＡ応答遺伝子を含む第２の発現ベクターは、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムと共送達され、ここで、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子およびエフェクターＲＮＡの翻訳の成功の際に、レポーター産物の成功裏の結合および活性化をもたらす。一部の実施形態では、ｅｆＲＮＡ応答遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、限定されるものではないが、ＧＦＰ、ｍＲｕｂｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣｈＲ２、ＤＴＡ、Ｇｃａｍｐ、ＴＫ、インターフェロンなどを含むレポーター遺伝子）を含む。他の実施形態では、ｅｆＲＮＡ応答遺伝子は、第２のエフェクター遺伝子を含む。

【0239】

細菌適用のために、適用可能な場合、本明細書に記載されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子システムの構成要素のいずれかをコードする核酸は、ファージを使用して、細菌に送達することができる。例示的なファージとしては、限定されるものではないが、Ｔ４ファージ、μ、λファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、Φ２９、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｑβ、およびΦＸ１７４が挙げられる。そのような実施形態では、外因性ＡＤＡＲの添加が必要であり得る。

【0240】

一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、経口投与、または粘膜投与によって、目的の組織に送達される。そのような送達は、単回用量または複数回用量を介してのいずれかであり得る。当業者は、本明細書における送達される実際の投薬量が、各種の要因、例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、組織、処置される対象の全身状態、求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与方式、求められる形質転換／修飾の種類などに応じて、大きく変わり得ることを理解する。

【0241】

一部の実施形態では、組換えウイルスベクターは、少なくとも１×１０^５個粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスを含有する単回用量であり得る、アデノウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０^６個粒子、少なくとも約１×１０^７個粒子、少なくとも約１×１０^８個粒子、および少なくとも約１×１０^９個粒子のアデノウイルスである。

【0242】

一部の実施形態では、送達は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを介してである。例えば、一部の実施形態では、改変ＡＡＶベクターが、送達のために使用されてもよい。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈｌＯ、改変ＡＡＶベクター（例えば、改変ＡＡＶ２、改変ＡＡＶ３、改変ＡＡＶ６）および偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢおよびその任意のバリアント、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓおよびその任意のバリアント、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１およびその任意のバリアントなどを含む、いくつかのカプシド型のうちの１つまたは複数に基づき得る。例示的なＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶ粒子を生成するために使用され得る技法は、当技術分野において公知である。

【0243】

一部の実施形態では、送達は、プラスミドを介してである。投薬量は、応答を誘発するのに十分な数のプラスミドであり得る。一部の事例では、プラスミド組成物におけるプラスミドＤＮＡの好適な量は、約０．１～約２ｍｇであり得る。プラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）プロモーター（例えば、同じプロモーターまたは異なるプロモーター）にそれぞれ作動可能に連結された、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムをコードする配列、（ｉｉｉ）選択マーカー、（ｉｖ）複製起点、ならびに（ｖ）（ｉｉ）の下流にあり、それに作動可能に連結された転写ターミネーターを含む。プラスミドは、他のＲＮＡ構成要素をコードすることもできるが、これらのうちの１つまたは複数は、代わりに、異なるベクター上でコードされてもよい。投与の頻度は、医学もしくは獣医学の実務家（例えば、医師、獣医師）、または当業者の範囲内である。

【0244】

ＡＤＡＲタンパク質が発現されないか、または低レベルで発現される、これらの細胞／システム（例えば、細菌細胞およびある特定の植物細胞）では、プラスミド（本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／もしくはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを単独で、またはこれらを発現するもののいずれか）は、ＡＤＡＲ遺伝子（例えば、Ａｄａｒ１、Ａｄａｒ２など）をコードする配列をさらに含んでいてもよい。

【0245】

外因性ＡＤＡＲまたは操作されたＡＤＡＲ（すなわち、改善された機能性を有する）は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムの効率を増加させることがある。外因性ＡＤＡＲは、以下の方法で、動物（または植物）細胞に送達することができる。
１）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２は、トランスフェクションまたはウイルス感染（ＡＡＶ、レンチウイルスなど）によって、ＣＭＶ、ＣＡＧプロモーターを有する別々の構築物／ＤＮＡベクター（Ｒｅａｄｒ構築物由来）を用いて送達される。
２）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２は、同じＣｅｌｌＲｅａｄｒ構築物／ＤＮＡベクターにおいて、ＳｅｓＲＮＡ配列の前に置かれ、トランスフェクションまたはウイルス感染によって、細胞に送達される。
３）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２ ｍＲＮＡは、ＣｅｌｌＲｅａｄｒ ＤＮＡベクターまたはＲＮＡを有するＬＮＰによって、細胞に送達される。
４）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２タンパク質は、ＣｅｌｌＲｅａｄｒ ＤＮＡベクターまたはＲＮＡを有するＬＮＰまたはＶＬＰ（ウイルス様粒子）によって、細胞に送達される。

【0246】

別の実施形態では、送達は、リポソームまたはリポフェクション製剤などを介してであり、当業者に公知の方法によって調製することができる。そのような方法は、例えば、ＷＯ２０１６２０５７６４号、ならびに米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0247】

一部の実施形態では、送達は、ナノ粒子またはエキソソームを介してである。例えば、エキソソームは、ＲＮＡの送達において特に有用であることが示されている。

【0248】

本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子システムの１つまたは複数の構成要素を細胞に導入するさらなる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用することによる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子に連結されている。一部の実施形態では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはその任意の構成要素は、１つまたは複数のＣＰＰと組み合わされて、細胞（例えば、植物プロトプラスト）内部でそれらを効率的に輸送する。一部の実施形態では、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子および／またはその任意の構成要素は、細胞送達のために１つまたは複数のＣＰＰと組み合わされた、１つまたは複数の環状または非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。

【0249】

ＣＰＰは、レポーター非依存性の様式で、細胞膜を横断して生体分子を輸送することができるタンパク質由来またはキメラ配列由来の３５よりも少ないアミノ酸の短いペプチドである。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチおよび抗微生物配列を有するペプチド、ならびにキメラまたは二連ペプチドであり得る。ＣＰＰの例としては、例えば、Ｔａｔ（ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核転写活性化因子タンパク質である）、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリン３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇｓ配列、グアニンリッチ分子トランスポーター、およびスイートアローペプチドが挙げられる。

【0250】

本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子システムの１つまたは複数の構成要素を細胞に導入するさらに別の手段は、ＳＥＮＤを使用することによる（例えば、Segel, M. et al., 2021. Science 373:6557; 882-889を参照されたく、その内容は、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。そのような実施形態では、細胞外ウイルス様カプシドにおいて、それ自身のｍＲＮＡに直接結合し、それを分泌する、レトロウイルス様タンパク質、例えば、ＰＥＧ１０は、フソゲンにより偽型化されて、機能性ｍＲＮＡカーゴ（すなわち、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子）を哺乳動物細胞に送達する。

【0251】

本開示の他の実施形態は、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子の修飾を提供する。そのような修飾は、任意の目的、例えば、安定性の増加、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子が対象の免疫を回避する性能などのためであり得る。例えば、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子が環状ＲＮＡ分子を含む実例では、１つのそのような修飾は、Ｎ６－メチルアデノシン修飾を含み得る。例えば、Ｎ６－メチルアデノシン（methyadenosine）リーダーＹＴＨＤＦ２配列の包含は、Ｎ６－メチルアデノシン－環状ＲＮＡの隔絶を可能にし、それによって、自然免疫の抑制を可能にする（例えば、Chen, Y.G.et al., (2019) Molecular Cell (76):1; 96-109を参照されたく、その内容は、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。他の実施形態では、そのような修飾は、対象の免疫系の回避を助けるウリジンのシュードウリジンによる置き換えを含み得る（例えば、Dolgin, E.(2021) Nature 597; 318-324を参照されたく、その内容は、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。
医薬組成物

【0252】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、または本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子（本明細書において、「分子」として単純にまたは一緒に使用される）を含む送達システムの１つまたは複数、および適切な担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物を提供する。担体、賦形剤または希釈剤の正確な特質は、組成物についての所望の使用に依存し、獣医的使用に好適であるか、もしくはそれに許容されるものから、ヒト使用に好適であるか、もしくはそれに許容されるものまでの範囲であり得る。組成物は、必要に応じて、１つまたは複数の追加の化合物および／または治療剤を含んでいてもよい。

【0253】

医薬組成物は、例えば、外用、眼、経口、頬側、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、経膣などを含む、事実上任意の投与の形式に好適な形態、または吸入もしくはガス注入による投与に好適な形態を取り得る。

【0254】

あるいは、他の医薬送達システムが用いられてもよい。リポソームおよびエマルジョンは、分子を送達するために使用され得る送達ビヒクルの周知の例である。通常、より高い毒性を犠牲にするが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのある特定の有機溶媒も用いられてもよい。

【0255】

医薬組成物は、所望により、分子を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得る、パックまたは分注デバイスで提示されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたは分注デバイスは、投与のための説明書が付随していてもよい。

【0256】

本明細書に記載される分子、またはその医薬組成物は、一般に、意図される結果を達成するために有効な量、例えば、処置される特定の疾患を処置または防止するために有効な量で使用される。治療利益とは、患者は、患者が依然として基礎障害を患っていることがあるにもかかわらず、気分または状態が改善したと報告するような、処置される基礎障害の根絶もしくは回復、および／または基礎障害と関連する１つまたは複数の症状の根絶もしくは回復を意味する。治療利益には、一般に、改善を自覚するかどうかにかかわらず、疾患の進行の中止または遅延も含まれる。

【0257】

特定の使用および投与の方式のための分子の有効投薬量の決定は、十分に当業者の能力内である。有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性および代謝アッセイから最初に推定され得る。例えば、動物における使用のための化合物の最初の投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定される、特定の化合物のＩＣ５０またはそれを上回る、活性化合物（例えば、ｅｆＲＮＡ産物）の代謝物の循環血液または血清濃度を達成するように処方され得る。所望の投与の経路を介した特定の化合物の生物学的利用率を考慮に入れて、そのような循環血液または血清濃度を達成するための投薬量を計算することは、十分に当業者の能力内である。化合物の最初の投薬量は、動物モデルなどのｉｎ ｖｉｖｏデータから推定することもできる。上記に記載されるさまざまな疾患を処置または防止するための活性代謝物の有効性を試験するために有用な動物モデルは、当技術分野において周知である。化合物の生物学的利用率および／またはその活性代謝物への代謝を試験するために好適な動物モデルも周知である。当業者は、ヒト投与に好適な特定の化合物の投薬量を決定するためのそのような情報をルーチン的に適応させることができる。

【0258】

投薬量は、他の要因の中でも、活性化合物の活性、化合物の生物学的利用率、その代謝動態および他の薬物動態学的特性、投与の方式、ならびに上記で論じたさまざまな他の要因に依存する。投薬量および間隔は、治療または予防効果を維持するのに十分である化合物および／または活性代謝化合物の血漿レベルを提供するように、個々に調整され得る。例えば、化合物は、数ある中でも、投与の方式、処置される特定の指標、および処方医師の判断に応じて、週に１回、週に数回（例えば、１日おき）、１日１回または１日に複数回投与されてもよい。局所投与または選択的取り込み、例えば、局所の外用投与の事例では、化合物および／または活性代謝化合物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しないことがある。当業者は、過度の実験なしで、有効投薬量を最適化することができる。
細胞操作

【0259】

目的の細胞または細胞の群の生理機能をモニターおよび／または変化させるために、目的の細胞は、ｒｅａｄｒＲＮＡのＳＥＳ構成要素を通して、細胞の１つまたは複数のＲＮＡ転写物の差次的発現に基づいて同定される。ＡＤＡＲ媒介編集を通して、作動可能に連結されたエフェクター分子は、翻訳され、細胞を蛍光的に標識してもよく、および／または細胞死を含む細胞の生理機能の一部の所望の変化を生じさせてもよい。

【0260】

ｒｅａｄｒＲＮＡのコードされるエフェクターへのｒｅａｄｒＲＮＡのＳＥＳ構成要素の物理的連結に加えて、目的の細胞は、ｒｅａｄｒＲＮＡのコードされるエフェクターの制御下にあり、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムと呼ばれるシステムを含む、第２の核酸実体をさらに含むことができる。例えば、ＲｅａｄｒＲＮＡのエフェクターは、第２の核実体上でコードされるいずれかの遺伝子を活性化し得るトランス活性化因子をコードすることができ、ここで、第２の核実体は、細胞に対して内因性であるトランス活性化因子の制御下で遺伝子をコードする細胞に対して内因性であり、および／または第２の核実体は、細胞に外部から添加され、細胞に対して外因性および／または内因性であるトランス活性化因子の制御下の遺伝子をコードする。

【0261】

トランス活性化因子または抑制因子は、サイレンシングする緊密なヘアピンループ（ｓｈＲＮＡ）をコードする外因性遺伝子の発現を制御することによって、細胞において特定の内因性遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させることもできる。第２の核実体上に位置することの代替で、トランス活性化因子の制御下の遺伝子が、必要に応じて、ｒｅａｄｒＲＮＡ分子それ自身上に位置し得ることにも留意されたい。患者における疾患または障害を最終的に引き起こす突然変異遺伝子を含む細胞の事例では、エフェクターは、機能性遺伝子をコードすることができ、および／または機能性遺伝子をコードする核の発現を引き起こすことができる。

【0262】

したがって、細胞または組織は、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、およびそのようなモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含むシステムを発現する。それ故に、本開示の別の態様は、提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、または本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む送達システムを含む細胞を提供する。本明細書に提供されるｒｅａｄｒＲＮＡ分子は、原核細胞および真核細胞において発現され得る。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞を含む。一実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞または植物細胞を含む。

【0263】

本開示の別の態様は、本明細書に提供される細胞を含む動物モデルまたは植物モデルを提供する。
処置

【0264】

本開示は、本明細書に提供されるおよび下記の実施例に提供されるｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む方法をさらに包含する。

【0265】

本開示の別の態様は、１つもしくは複数のエフェクタータンパク質の細胞状態を定義する細胞ＲＮＡの存在もしくは動態を検出する方法、および／またはその翻訳のスイッチをオンにする方法であって、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、または本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む送達システム、または本明細書に提供される医薬組成物を用いて標的エフェクターＲＮＡを検出する／ハイブリダイズするステップであって、センサードメインが、配列特異的塩基対合を通して特定の細胞型ＲＮＡを検出およびそれに結合し、１つまたは複数のＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンが、翻訳スイッチとして作用し、それによって、エフェクタータンパク質をコードするエフェクターＲＮＡの翻訳を可能にする、ステップを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、方法を提供する。

【0266】

一部の実施形態では、エフェクタータンパク質は、細胞内にある。

【0267】

細胞の動的状態を検出すること／評価することは、診断のために、個体における疾患を検出するために重要である。細胞の動的状態を検出すること／評価することは、治療薬が最も効果的であり得、多面的な副作用が低減された特定の標的細胞に特異的な治療薬を提供することによる、個体における疾患の標的化処置のために重要である。しかしながら、エフェクター分子は、その後、例えば、分泌サイトカインおよびインターロイキン、ならびにＴ－ＣＡＲの事例では、特定の細胞外で機能し得る。

【0268】

本開示の別の態様は、それを必要とする対象における状態および／または疾患を処置する方法であって、状態および／または疾患が対象において処置されるように、本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、または本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子を含む送達システムを対象に投与することを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、方法を提供する。

【0269】

一部の実施形態では、状態および／または疾患は、がん、感染性疾患、遺伝性障害などからなる群から選択される。

【0270】

本明細書で使用される場合、状態および／または疾患を「処置すること」は、状態および／または疾患と関連する任意の状態または症状を回復させることである。同等の未処置対照と比較した場合に、そのような低減は、任意の標準技法によって測定されるように、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも高い。本明細書に記載される組成物を対象に投与するための各種の手段は、当業者に公知である。そのような方法としては、限定されるものではないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、外用、注射、または腫瘍内投与が挙げられ得る。投与は、局所または全身であり得る。態様のいずれかの一部の実施形態では、投与は、皮下である。

【0271】

体細胞型特異的遺伝子治療の例としては、限定されるものではないが、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、先天性難聴、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高コレステロール血症、ヘモクロマトーシス、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、鎌状赤血球症およびテイ－サックス病を含む、単一遺伝子疾患における正常なｍＲＮＡ／タンパク質の細胞型特異的補完が挙げられる。

【0272】

がんの処置：（例えば、固形腫瘍；白血病）は、ＲＮＡのそれらの上方調節されたおよび／または異常な形態によってがん細胞を検出するために、ならびに、限定されるものではないが、カスパーゼ、プログラム細胞死タンパク質１、カスパーゼ８、Ｂｃｌ－２関連Ｘタンパク質、ＰＤＬ－Ｌ１、カスパーゼ３、ＣＦＬＡＲ、Ｂｃｌ－ｘｌ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｄｉａｂｌｏホモログ、Ｂｃｌ－２ホモログアンタゴニストキラー、ＦＡＤＤ、ＢＥＣＮ１、Ｄｅａｔｈ受容体５、ＰＤＣＤ６、ＲＩＰ１キナーゼ、ＲＩＰ３キナーゼ、およびグランザイムを含む、１つまたは複数の細胞死タンパク質；または限定されるものではないが、ＣＤ１６、ケモカイン受容体（ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸ３ＣＲ１）およびβ２－インテグリンＬＦＡ－１を含む免疫キラー細胞を動員する受容体の発現によって、がん細胞を排除するために、ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲを使用することを含む。

【0273】

ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲは、限定されるものではないが、慢性Ｂ、Ｃ型肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む肝臓疾患（門脈を介した脂質ナノ粒子による送達の利点など）、心臓の疾患、ならびに限定されるものではないが、潜伏性ウイルス感染症（細胞内寄生生物）、および耐性感染症、例えば、エプスタインバーウイルス、ヘルペス、結核、プリオン、ジカ熱、ＨＩＶを含む、感染性疾患の処置のために使用することができる。

【0274】

ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲは、慢性疼痛の処置：広く広範囲にわたる影響；例えば、糖尿病性神経障害；ＮＩＤＡ、ＮＩＮＤＳ ＨＥＡＬ主導の依存性のない疼痛の処置のために使用することができる。ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲは、標的化局所ＡＡＶベクター注射によって、末梢神経節における特定の感覚ニューロンおよびグリア細胞型におけるイオンチャネルおよび受容体発現をモジュレートすることができる。

【0275】

ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲは、現在、多くの場合に、脳組織の外科的切除によって処置されるてんかんの処置のために使用することができる。てんかんは、多くの場合、ある特定の神経細胞型における異常な神経活動から生じる。すなわち、てんかんは、病理学的脳ネットワークの過剰同期化された神経活動によって特徴付けられる。脳回路は、複数の興奮性および抑制性の細胞型を含み、それぞれ、情報処理および興奮－抑制のバランスにおいて固有に寄与している。他の細胞型において、てんかんの異なる段階（開始、維持）で発作を抑制しながら、一部の細胞型における神経活動が促進される。ＲＮＡセンサー－エフェクター（例えば、新薬の開発につながるようなＧＰＣＲ、イオンチャネルなど）を通して脳回路の活動の細胞型特異的モジュレーションのためにｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲを使用することは、てんかんを制御するおよび処置するための有望なアプローチである。そのため、ｒｅａｄｒＲＮＡおよびｃｅｌｌＲＥＡＤＲは、神経活動の細胞型標的化モジュレーションのために使用して、てんかんを抑制および処置することができる。

【0276】

キット
本開示は、本明細書に提供される組成物を含み、本明細書に提供される対象の方法を行うための、キットをさらに提供する。例えば、一実施形態では、対象のキットは、以下：（ｉ）本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子、（ｉｉ）本明細書に提供されるＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステム、（ｉｉｉ）本明細書に提供されるモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡおよび／もしくはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを含む送達システム、（ｉｖ）本明細書に提供される、モジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ、ならびに／またはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステム、ならびに／またはモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡおよび／もしくはＣｅｌｌＲＥＡＤＲシステムを含む送達システムを含む細胞、ならびに／あるいは（ｖ）本明細書に提供される医薬組成物のうちの１つまたは複数を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。

【0277】

他の実施形態では、キットは、他の構成要素をさらに含んでいてもよい。そのような構成要素は、個々にまたは組合せで提供されてもよく、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、または管で提供されてもよい。そのような構成要素の例としては、限定されるものではないが、（ｉ）１つまたは複数の追加の試薬、例えば、１つまたは複数の希釈緩衝液、１つまたは複数の再構成溶液、１つまたは複数の洗浄緩衝液、１つまたは複数の貯蔵緩衝液、１つまたは複数の対照試薬など、（ｉｉ）１つまたは複数の対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）本明細書に提供される分子、細胞、送達システムなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生および／または維持のための１つまたは複数の試薬などが挙げられる。構成要素（例えば、試薬）はまた、特定のアッセイにおいて使用可能な形態、または使用前に１つもしくは複数の他の構成要素の添加を必要とする形態（例えば、濃縮または凍結乾燥形態）で提供されてもよい。好適な緩衝液としては、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびその組合せが挙げられる。キットの構成要素は、個々にまたは組合せで提供されてもよく、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、または管で提供されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示される実施形態における使用のための１つまたは複数の試薬を含む。

【0278】

上記で述べた構成要素に加えて、対象のキットは、対象の方法を実施するために、キットの構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。対象の方法を実施するための説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、基材、例えば、紙またはプラスチックなどに印刷されていてもよい。そのため、説明書は、キットまたはその構成要素の容器のラベル（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに関連する）などにおいて、添付文書としてキット中で提示されていてもよい。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピューター可読ストレージ媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子ストレージデータファイルとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の説明書は、キット中に存在しないが、例えば、インターネットを介して、リモートソースから説明書を入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を見ることができるおよび／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。

【0279】

本開示の別の態様は、本明細書に記載され、説明されるものをすべて提供する。以下の実施例は、実例の目的で提供され、限定する目的で提供されるものではない。

【実施例】

【0280】

下記の作業実施例に共通する一般的方法
補充動画１．バイナリーＣｅｌｌＲＥＡＤＲウイルスベクターを注射されたマウスの光遺伝学的活性化
バイナリーＲＥＡＤＲ^Ｃｔｉｐ^２／３／レポーター^ＣｈＲｇ^{ｅｒ２－ｅＹＦＰ} ＡＡＶを注射されたマウスにおける光遺伝学的活性化（ＣＦＡ、０．５秒）は、足踏みする前肢の移動を誘導する。上方移動は、肘、手首、および指の屈曲とそれに続く伸びを順番に含む。

【0281】

補充動画２．バイナリーＰＴエンハンサーウイルスベクターを注射されたマウスの光遺伝学的活性化
ＰＴエンハンサー／レポーター^{ＣｈＲｇｅｒ２－ｅＹＦＰ}ＡＡＶを注射されたマウスにおける光遺伝学的活性化（ＣＦＡ、０．５秒）は、指の伸びに付随して起こる肘の伸びを誘導する。

【0282】

作業実施例において使用される方法
プラスミド
すべての構築物は、標準的な分子クローニング手順を使用して作成した。ベクター骨格を、制限酵素消化を使用して線状化し、ＤＮＡ断片インサートを、ＰＣＲまたはｇＢｌｏｃｋ合成（ＩＤＴ）を使用して作成した。すべてのプラスミドについての情報は、表６に含まれる。すべてのｓｅｓＲＮＡインサートは、ｇＢｌｏｃｋ合成（ＩＤＴ）によって作成し、この研究で使用されたｓｅｓＲＮＡ配列は、表７に含まれる。

【0283】

細胞培養およびトランスフェクション：ＨｅＬａ細胞系を、Ａ．Ｋｒａｉｎｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ－２ａ（Ｎ２ａ）細胞を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ、カタログ８９１２１４０４）から購入した。ＨＥＫ２９３ＴおよびＫＰＣ１２４２細胞系を、Ｄ．Ｆｅａｒｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅｌａおよびＮ２ａ細胞系を、５％のＣＯ２下、３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１６００００３６）を有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）中で培養した。１％のペニシリン－ストレプトマイシンを、培地に補充した。細胞を、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１６６８０１９）ＤＮＡトランスフェクション試薬でトランスフェクトした。インターフェロン処置のために、１ｎＭの組換えマウスＩＦＮ－β（Ｒ＆Ｄ、カタログ８２３４－ＭＢ）を含有する培地を使用し、トランスフェクションプロセスの間、２４時間ごとに交換した。テトラサイクリン処置のために、示されたテトラサイクリン濃度を含有する培地を、トランスフェクション２４時間後に使用して、分析前に４８時間、テトラサイクリンを含まない培地に置き換えた。アポトーシスアッセイのために、細胞を、トランスフェクション後７２時間インキュベートし、ＲｅａｌＴｉｍｅ－ＧｌｏＴＭ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｎｅｃｒｏｓｉｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＪＡ１０１１）を使用して、アポトーシスレベルを定量化した。

【0284】

ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ（ＤＹＲＫ１Ａについてのプライマー、フォワード：ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡ；リバース：ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＴＣＣＣＡＣＧＴＴ）を使用して、改変および未改変細胞の異種集団からＣａｓ９標的領域を増幅し、ＰＣＲ産物を、ゆっくりと再アニーリングして、ヘテロ二重鎖を作成した。再アニーリングされたヘテロ二重鎖を、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼによって切断する一方で、ホモ二重鎖は、インタクトのままである（ＩＤＴ：Ａｌｔ－Ｒゲノム編集検出キット）。Ｃａｓ９媒介切断効率（インデル％）を、切断ＤＮＡの割合に基づいて計算する^３１。

【0285】

動物
６～２０週齢（雄および雌両方）のマウスを、この研究で使用した。幅広い型のマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、０００６６４）。Ｆｅｚｆ２－ＣｒｅＥＲおよびＲｏｓａ２６－ＬｏｘｐＳＳＴＯＬｏｘｐ－Ｈ２ｂＧＦＰマウスは、以前に記載された^{３９、５６}。Ｆｅｚｆ２^＋皮質錐体ニューロンを標識するために、２００ｍｇ／ｋｇ用量のタモキシフェン（Ｔ５６６４８、Ｓｉｇｍａ）を、ＡＡＶ注射の２日前に、腹腔内注射によって投与した。Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、１２週齢、５０～２５０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。すべての動物を、マウスについてケージあたり最大５頭の動物およびラットについてケージあたり１頭の動物で、１２時間：１２時間の明：暗サイクルで維持した。すべての動物の維持および実験手順は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＤｕｋｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒによって確立されたガイドラインに従って行った。

【0286】

ＡＤＡＲ１ノックアウト細胞系構築：ＡＤＡＲ１ノックアウト細胞系を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を介して作成した。ｇＲＮＡを、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ｐｕｒｏ（ｐＸ４５９）（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ６２９８８）にクローニングした。ｇＲＮＡ配列は、５’ＧＧＡＴＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＧ ３’（ｇＲＮＡ１）および５’ＧＴＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＡＴＧ ３’（ｇＲＮＡ２）であった。簡潔には、ＡＤＡＲ１ノックアウト細胞を、ＡＤＡＲ１－ｐ１１０およびＡＤＡＲ１－ｐ１５０アイソフォームの両方によって共有される、２つのｇＲＮＡ標的化エクソン２を用いて作成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１１６６８０１９）を使用して、１ｕｇのｐＸ４５９－ｇＲＮＡ１およびｐＸ４５９－ｇＲＮＡ２のプラスミド混合物でトランスフェクトした。翌日、トランスフェクション試薬を含有するすべての培地を除去し、ピューロマイシン（最終濃度２ｕｇ／ｍｌ）が補充された新鮮な培地で置き換えた。ピューロマイシンを有する新鮮な培地を、２日ごとに３回、古い培地で置き換えた。ピューロマイシン選択後の残った細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１２６０５０３６）を用いて回収し、それぞれのウェルに１～２個細胞で、９６ウェルプレートに分配した。増えた単一クローンを、ウエスタンブロットによってＡＤＡＲ１欠損をスクリーニングし、ＡＤＡＲ１ゲノム遺伝子座の崩壊を、サンガーシークエンシングによって確認した。

【0287】

フローサイトメトリー分析：トランスフェクションの２日後、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１２６０５０３６）を用いて回収し、９６ウェル丸底プレートに分配し、５００ｒｐｍで、４℃で１分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１％のＰＦＡ緩衝液で再懸濁し、４℃で終夜またはより長い時間、インキュベートした。次いで、細胞を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する分析の前に、２００ｕｌのフローサイトメトリー染色緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ００－４２２２－２６）で再懸濁した。Ｆｏｒｔｅｓｓａを、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアによって作動させた。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏ １０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いて行った。選別するために、細胞を、１％のＰＦＡ処置なしであるが、フローサイトメトリー分析に関して同じ手順に供し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して処理した。

【0288】

外因性または内因性転写物についてのＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率
蛍光レポーター遺伝子を用いてＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率をアッセイするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１ノックアウト細胞を、最初に、２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、合計で１．５μｇのプラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、細胞を、収集し、１％のＰＦＡで固定し、ＦＡＣＳ解析のために調製した。ＦＡＣＳデータからＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率を計算するために、ＲＥＡＤＲベクターを発現する細胞を、スペーサーによって発現する蛍光タンパク質（例えば、図１ｂ～ｄにおけるＢＦＰ）によってゲーティングし、効率を、ゲート内のすべての標的ＲＮＡ発現細胞内のｅｆＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方を発現する二重陽性細胞の比として計算した。スペーサーが蛍光タンパク質ではない場合（図１ｈおよび図２）、比は、標的ＲＮＡ発現細胞内のｅｆＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方を発現する二重陽性細胞の比として直接計算した。一部の対照について、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率を、すべてのカウントされた細胞内のｅｆＲＮＡ発現細胞のパーセントとして計算した。

【0289】

ｓｅｓＲＮＡ設計
以下の手順を、ｓｅｓＲＮＡ設計のために使用する：１）ｓｅｓＲＮＡは、特定の細胞のコードまたは非コードＲＮＡ配列に対して相補的、すなわち、アンチセンスである、２）ｓｅｓＲＮＡの最適な長さは、２００～３００ヌクレオチドである、３）ｒｅａｄｒＲＮＡは、連続する翻訳リーディングフレームに配置されたｓｅｓＲＮＡおよびｅｆＲＮＡからなる、４）１つまたは複数のＳＴＯＰコドン（ＴＡＧ）を、ｓｅｓＲＮＡの中央近くに置く（５’末端から約８０２２０ヌクレオチドの間の範囲）、５）ｓｅｓＲＮＡ中の５’－ＴＧＧ－３’配列に相補的である、標的ＲＮＡ中の５’－ＣＣＡ－３’配列を見出し、次いで、５’－ＴＧＧ－３’を５’－ＴＡＧ－３’で置き換え、その結果、Ａ－Ｃミスマッチを、ｓｅｓＲＮＡが標的ＲＮＡと塩基対合する場合に、導入す、６）他のＳＴＯＰコドンがｓｅｓＲＮＡに存在しないことを確実にするために、ｓｅｓＲＮＡ中のすべての他のＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ配列を、それぞれ、ＧＡＧ、ＧＡＡ、ＧＧＡに変換し、好ましくは、変換されたＳＴＯＰコドンは、ステップ５で定義されたＴＡＧの近くにない（すなわち、それから１０ｂｐ超）、７）意図しない翻訳開始の可能性を排除するために、ステップ５で定義されたＴＡＧの後にＡＴＧ（開始コドン）があってはならない、８）ｓｅｓＲＮＡは、エクソン、イントロン、ＵＴＲ領域、またはスプライシング後の成熟ｍＲＮＡを含む細胞転写物の任意の領域に方向付けられ得る、９）複雑な二次構造を有するｓｅｓＲＮＡを回避する。

【0290】

ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによるＡからＩの編集率
ＡからＩの編集率を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレートに播種した。トランスフェクション４８時間後、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ７４１０６）を用いて精製し、ＴａｑＭａｎＴＭ逆転写試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｎ８０８０２３４）を使用してｃＤＮＡに変換した。全ｓｅｓＲＮＡ領域をカバーするＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎｅＡｍｐ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３９２９８）で作成し、サンガーシークエンシングのために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号７４０６１）を用いて精製した。編集効率を、サンガーピーク高さの比Ｇ／（Ａ ＋ Ｇ）として計算した。３回の生物学的反復を行った。

【0291】

トランスクリプトーム－ワイドＲＮＡシークエンシング解析
赤色蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ）発現カセットを有するｒｅａｄｒＲＮＡ^ＣｔｒｌまたはｒｅａｄｒＲＮＡ^ＰＣＮＡ、ｒｅａｄｒＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ１－ＣＤＳ}発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＲＦＰ^＋細胞（約５×１０＾５個）を、トランスフェクションの４８時間後に、ＦＡＣＳ選別によって濃縮し、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ７４１０６）を用いて精製した。ライブラリーを調製するために、ＲＮＡ試料を、ＴｒｕｅＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、２００２０５９４）およびＴｒｕｅＳｅｑ ＲＮＡ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｄｅｘｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、２００２０４９２）で処理した。ディープシークエンシング解析を、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＮＧＳ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォームにおいて行った。ＦａｓｔＱＣを、ＲＮＡ－ｓｅｑデータに適用して、シークエンシング品質をチェックした。品質チェックを通過したすべての試料を、参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８－ｈｇ３８）に対してマッピングした。ＳＴＡＲ（バージョン２．７．２）およびＲＳＥＭ（バージョン１．３．２）を使用して、遺伝子をアノテートした。ＴＰＭ値を、ＲＳＥＭから計算した。ゼロを上回るリードのライブラリーのうちの少なくとも１つを有するすべての遺伝子について、生物学的反復にわたる平均発現値を、ＤＥＳｅｑ２を使用して、差次的発現する遺伝子を検出するために、試料間で比較した^３６。調整ｐ値＜０．０１および倍数変化＞２または＜０．５を有する遺伝子を、有意に差次的発現したとして同定した。包括的なＡからＧの編集率の解析のために、ＡからＧの編集率の計算を、ＲＥＤＩｔｏｏｌのためのｐｙｔｈｏｎ ｗｒａｐｐｅｒであるＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＲＥＤＰ）を使用して行った^３７。パラメーターを、デフォルト値に設定した。アライメントステップを、デフォルトおよび座標ソートパラメーターを用いて、ＳＴＡＲ ｖ２．７．８ａを使用して行った。Ｇｅｎｃｏｄｅ ＧＲＣＨ３８．ｐ１３からのゲノム参照を使用し、ＥＥＦ１Ａ１およびＰＣＮＡを含む標的遺伝子からの公知配列と連結させた。

【0292】

ウエスタンブロット
ＡＤＡＲ１に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２７１８５４、１：５００）、ＧＦＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ２９５６、１：１００００）、β－アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ３７００、１：１００００）を、この研究で使用した。標準的なウエスタンブロットプロトコールを使用する。簡潔には、約２×１０^６個細胞を溶解し、等量のそれぞれの溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのためにロードした。次いで、試料タンパク質を、二フッ化ポリビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、ＡＤＡＲ１またはＧＦＰに対する一次抗体を用いて免疫ブロットし、それに続いて二次抗体インキュベーション（１：１０，０００）および曝露を行った。

【0293】

ルシフェラーゼ相補性アッセイ
トランスフェクションの４８時間後、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、粉砕によって収集し、９６ウェルプレートに移した。Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５００）を使用した。ホタル発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定した。

【0294】

ｑＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮＡを、抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ７４１０６）を用いて精製した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎＴＭ逆転写試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｎ８０８０２３４）を使用してｃＤＮＡに変換した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムにおいて、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて行った。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰを、正規化のために使用した。遺伝子プローブを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＥＦ１Ａ１：Ｈｓ０１５９１９８５、ＰＣＮＡ：Ｈｓ００４２７２１４、ＸＩＳＴ：Ｈｓ００３００５３５、ＡＣＴＢ：Ｈｓ０３０２３９４３、Ｍｄａ５：Ｍｍ００４５９１８３＿ｍ１、Ｒｉｇ－Ｉ：Ｍｍ０１２１６８５３＿ｍ１、Ｉｆｎｂ１：Ｍｍ００４３９５５２＿ｓ１、Ｉｌ６：Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１、Ｃｃｌ２：Ｍｍ００４４１２４２＿ｍ１、Ｆｇｆ２：Ｍｍ０１２８５７１５＿ｍ１、Ｃｄ４０：Ｍｍ００４４１８９１＿ｍ１、Ｉｂａ１：Ｍｍ００４７９８６２＿ｇ１、Ｃｘｃｌ１０：Ｍｍ００４４５２３５＿ｍ１）。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ヒトＴＢＰ：Ｈｓ００４２７６２０、マウスＴｂｐ：Ｍｍ０１２７７０４２＿ｍ１）を、正規化のために使用した。

【0295】

ウイルス生成
ＲＥＡＤＲおよびレポーターウイルスを生成するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＥＩ ＭＡＸ（カタログ２４７６５、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、ＲＥＡＤＲまたはレポータープラスミド、ＡＡＶ血清型プラスミド、およびｐＨｅｌｐｅｒを用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、細胞培養培地中で収集し、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、細胞溶解緩衝液に再懸濁し、ドライアイス／エタノール浴を使用して、凍結および解凍を３回行った。細胞溶解物を、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清中の夾雑ＤＮＡを、ベンゾナーゼを添加することによって除去し、３７℃で３０分間インキュベートした。ウイルスの粗溶液を、イオジキサノール密度勾配にロードし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ローターを使用して、６０，０００ｒｐｍで９０分間スピンした。遠心分離後、３～４ｍｌの粗ウイルス調製物を、１０ｍｌの注射器に取り付けられた１８ゲージ針を用いて、４０～６０％の層から収集した。ウイルスの粗溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルター（１００ｋＤａ）を使用して、２００～２５０μｌまで濃縮し、８ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、適切な体積まで濃縮した。アリコートを、使用まで、－８０℃で貯蔵した。マウスおよびラットＲＥＡＤＲおよびレポーターウイルスを、ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ血清型としてパッケージングした。ＰＴエンハンサー－ｔＴＡ２ウイルスを、Ａｄｄｇｅｎｅ（番号１６３４８０）からのベクターを用いて、ＰＨＰ．ｅＢとしてパッケージングした。ヒトＲＥＡＤＲおよびレポーターウイルスを、ＡＡＶ２－Ｒｅｔｒｏ血清型としてパッケージングした。ｐＡＡＶ（ＤＪ）－ｈＳｙｎ－Ａｄａｒ２－ｓｅｓＲＮＡ^Ｆｅｚｆ^２－ｔＴＡ２およびｐＡＡＶ（ＰＨＰ．ｅＢ）－ｈＳｙｎ－ＡＤＡＲ２－ｓｅｓＲＮＡ^{Ｃｔｉｐ２（１）}－ｔＴＡ２を、Ｖｉｇｅｎｅ Ｉｎｃ．からパッケージングした。

【0296】

免疫組織化学的検査
マウスまたはラットを、麻酔し（アバチンを使用）、生理食塩水、続いて、０．１ＭのＰＢＳ緩衝液中の４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で心臓内に灌流した。４℃での終夜の固定後、脳を、３回すすぎ、Ｌｅｉｃａ １０００ｓビブラトームを用いて、５０μｍの厚さに切片化した。切片を、ＰＢＳ１Ｘ中の１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）および０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００を含有するブロッキング溶液中に１時間入れ、次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体とともに４℃で終夜インキュベートした。抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａｖｅｓ、ＧＦＰ－１０２０）、抗ＣＴＩＰ２（１：２５０、Ａｂｃａｍ １８４６５）、抗ＴＬＥ４（１：５００、Ｓｃｂｔ：ｓｃ－３６５４０６）、抗Ｒｏｒｂ（１：３００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢＰ１－８２５３２）を使用した。切片を、ＰＢＳ中で３回すすぎ、対応する二次抗体（１：５００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに室温で１時間インキュベートした。切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ４６８０）マウンティング培地を使用して、スライド上にドライマウントした。

【0297】

ヒト組織について、ウイルス発現がピークに達した後、またはパッチクランプ記録後、皮質スライスを、４％のＰＦＡ中で終夜固定し、次いで、ＰＢＳ中ですすぎ、アジドを有するＰＢＳ中で１～７日貯蔵した。ビオサイチン回収のために、組織を、シェーカープレート上で、１０％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、５％のＮＧＳ、１００ｕＭのグリシン、および０．５％のＢＳＡを有するＰＢＳ中、室温で３０分間透過処理した。一次抗体および二次抗体はどちらも、４℃で２４時間インキュベートした。ビオサイチンを、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートストレプトアビジンで直接的に、または活性部位に金属銀が堆積している銀イオン基材で処理されたペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを使用する酵素金属組織学的方法で間接的に発色させた。回収された細胞を、１０倍または２０倍の対物レンズを備えたＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００において画像化した。ネイティブｍＮｅｏｎ蛍光の大きな概要画像を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８正立共焦点顕微鏡において作製した。ＦＯＸＰ２、およびＮｅｕＮの免疫組織化学的標識化のために、組織を、３０％のスクロース中、少なくとも２４時間凍結保護し、次いで、スライド式ミクロトームを用いて４０ｕｍに再切片化した。浮遊切片を、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、５％のＮＧＳ、および１００ｕＭのグリシンを有するＰＢＳ中、室温で３０分間透過処理し、一次抗体（ウサギ抗ＦＯＸＰ２ Ａｂｃａｍ番号１６０４６ １：５００、ラット抗Ｆｌａｇ １：５００ Ｎｏｖｕｓ ＮＢＰ１－０６７１２、マウス抗ＮｅｕＮ Ａｂ １：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ 番号９４４０３Ｓ）を用いて、４℃で終夜標識化した。二次抗体について、組織を、ビオチン化抗ウサギＡｂ（１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３１８２２）とともに室温で２時間、続いて、ストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とともに室温で１時間（ＦＯＸＰ２、またはヤギ抗マウスＡｂ（１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３２７２３）とともに室温で２時間（ＮｅｕＮ）、インキュベートした。

【0298】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
すべてのプローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓに注文した（マウスＳａｔｂ２ カタログ番号ＰＲＭ１２８、マウスＰｌｘｎＤ１ カタログ番号ＰＲＫ８８５、マウスＦｅｚｆ２ カタログ番号ＰＲＡ３３９、マウスｖＧＡＴ カタログ番号ＰＲＥ８５３、ラットｖＧＡＴ カタログ番号ＰＲＮ０２４およびヒトＶＧＡＴ カタログ番号ＰＲＭ３５１）。マウス脳を、ＰＦＡ灌流固定およびスクロース保護後、５０μｍの厚さのスライスに、スライスした。ｉｎ ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション連鎖反応を、２４ウェルプレートにおいて、浮遊法を介して行った。最初に、脳スライスを、ＨＣＲプローブセットを有するプローブハイブリダイゼーション緩衝液に、３７℃で２４時間曝した。脳スライスを、プローブ洗浄緩衝液で洗浄し、増幅緩衝液とともにインキュベートし、２５℃で２４時間増幅した。３日目に、脳スライスを、洗浄し、必要により対比染色した。

【0299】

定位ウイルス注射
８週齢またはそれよりも高齢の成体マウスを、一定の空気の流れ（０．４Ｌ／分）で送達される２％のイソフルランの吸入によって麻酔した。ケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）およびデキサメタゾン（０．５ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ、先制鎮痛として、脳浮腫を防止するために、皮下投与し、手術の前に、リドカイン（２～４ｍｇ／ｋｇ）を適用した。マウスを、定位ヘッドフレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、９４０シリーズまたはＬｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｎｇｌｅ Ｔｗｏ）にマウントした。定位座標を特定した。切開術を、頭皮に対して行い、頭蓋に小さな穿頭孔を開け、脳の表面を露出させた。ウイルス懸濁液を含有する２０～３０μｍの引きガラスピペットチップを、脳まで下げ、５００ｎｌ体積の単一または混合ウイルスを、Ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖａｌｖｅ Ｃｏｒｐ）を使用して、３００ｕｍおよび７００ｕｍ（１：１体積）の注射部位に、３０ｎｌ／分の速度で送達し、ピペットを、引き戻す前に逆流を防止するために１０分間所定の位置に留め、その後、切開部を、ナイロン縫合糸（Ｅｔｈｉｌｏｎ Ｎｙｌｏｎ Ｓｕｔｕｒｅ、Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＴｉｓｓｕｅｇｌｕｅ（３Ｍ Ｖｅｔｂｏｎｄ）で閉じ、動物を、完全に回復するまで、加温パッド上で温めたままにした。ラットＴｌｅ４細胞型の標的化のために、ＲＥＡＤＲ^Ｔｌｅ４およびレポーターＡＡＶの３：１混合物を、皮質に定位注射し（０ｍｍ後方、３．５ｍｍ外側）、それぞれ、１０００ｕｌ体積を－２ｍｍ腹側に注射し、１０００ｕｌ体積を－１ｍｍ腹側に注射した。ラットｖＧＡＴの標的化のために、ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴおよびレポーターＡＡＶの３：１混合物を、皮質に定位注射し（－４ｍｍ後方、３．５ｍｍ外側）、それぞれ、１０００ｕｌ体積を－２．５ｍｍ腹側に注射し、１０００ｕｌ体積を－１．５ｍｍ腹側に注射した。免疫組織化学的検査またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのさらなる実験を、ウイルスインキュベーションの３週間後に行った。

【0300】

マウスにおける生理機能
－定位手術およびウイルス注射。すべての手術を、無菌条件下で行い、体温を、加温パッドを用いて維持した。標準的な手術手順を、定位注射および光ファイバー埋め込みのために使用した。マウスを、イソフルランで麻酔し（開始時に２～５％および手術手順の安静の間０．８～１．２％）、定位フレームに置き、加温パッドの上で、３４～３７℃で維持した。ケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を、手術の前および後の鎮痛として腹腔内（ＩＰ）投与し、リドカイン（２％）を、手術の前に、頭皮の下に、皮下適用した。頭皮および結合組織を除去して、頭蓋の背面を露出させた。皮膚を、傍らに押し出し、頭蓋表面を、生理食塩水を使用してきれいにした。デジタルｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ａｔｌａｓを、定位フレームに連結させて、異なる脳領域の同定および標的化をガイドした（Ａｎｇｌｅ Ｔｗｏ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。以下の座標を、ＳＳｐ－ｕｌにおける注射および埋め込みのために使用した：ブレグマから－０．０９、正中線から２．４６ｍｍ外側、ＣＦＡ：ブレグマから０．３７ｍｍ、正中線から１．１３ｍｍ 外側。

【0301】

ウイルス注射のために、小さな穿頭孔を、頭蓋に開け、脳の表面を露出させた。ウイルス懸濁液を含有する２０～３０μｍの引きガラスピペットチップを、脳まで下げ、５００ｎｌ体積を、Ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖａｌｖｅ Ｃｏｒｐ）を使用して、１０～３０ｎｌ／分の速度で送達し、ピペットを、引き戻す前に逆流を防止するために５分間所定の位置に留めた。注射を、７００μｍの深さで行った。次いで、光ファイバー（直径２００μｍ；ＮＡ、０．３９）を、それぞれ、光遺伝学的活性化またはファイバー測光法のために、ＣＦＡまたはＳＳｐ－ｕｌに埋め込んだ。光ファイバーを、脳表面に触れるそのチップを用いて埋め込んだ。光ファイバーを頭蓋に固定するために、シリコーン接着剤（Ｋｗｉｋ－Ｓｉｌ、ＷＰＩ）を、孔を覆うために適用し、それに続いて、歯科用セメント（Ｃ＆Ｂ Ｍｅｔａｂｏｎｄ、Ｐａｒｋｅｌｌ）、次いで、黒色瞬間接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ ４２６）、および歯科用セメント（Ｏｒｔｈｏ－Ｊｅｔ、Ｌａｎｇ Ｄｅｎｔａｌ）の層を適用した。チタンヘッドバーを、歯科用セメントを使用して、ラムダの周囲の頭蓋に固定した。マウスを、完全に回復するまで、加温パッド上に移した。光遺伝学的活性化またはファイバー測光法のさらなる実験を、ウイルスインキュベーションの８週間後に行った。

【0302】

－ｉｎ ｖｉｖｏ光遺伝学的活性化。マウスを、最初に、イソフルラン（２％）で短時間麻酔して、それらの左足の後ろに反射マーカーを取り付けた。次いで、マウスを、管に移し、頭部をステージに固定し、刺激開始前に、麻酔から完全に回復させた。ファイバー結合レーザー（５－ミリ秒のパルス、１０～２０ｍＷ；λ＝４７３ｎｍ）を使用して、２０および５０Ｈｚで、０．５秒間何度も刺激した。刺激間の間隔は、９．５秒であった。１つが前方、１つが側面カメラの２つのカメラ（ＦＬＩＲ、ＦＬ３－Ｕ３－１３Ｅ４Ｃ－Ｃ）を、ステージに設置して、高フレームレート（１００Ｈｚ）動画を撮影した。２つのカメラを、特注のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）プログラムによって制御されるＴＴＬシグナルによって同期させた。動画およびＴＴＬシグナル状態を、Ｂｏｎｓａｉソフトウェアにおけるワークフローを使用して、同時に取得した。４つのＬＥＤ光ランプを、照明のために使用した（それぞれのカメラについて２つ）。

【0303】

－行動の動画解析。２つのカメラを、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のＣａｍｅｒａ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ａｐｐを使用して較正した。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を使用した左足の追跡のために、動画からの画像を、Ｇａｕｓｓｉａｎローパスフィルター（サイズ９、シグマ１．８）を用いて平滑化した。足の上の反射マーカーの重心を、最初に、輝度および色相閾値の組合せによって検出し、次いで、特徴に基づく追跡アルゴリズム（ＰｏｉｎｔＴｒａｃｋｅｒ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ Ｔｏｏｌｂｏｘ）によって追跡した。追跡結果を、手動で検証し、エラーを、それに従って補正した。マウスが刺激開始前（０．５秒以内）に自発運動を行った試行を、さらなる分析から除外した。

【0304】

－足の刺激。左足を刺激するために、マウスを、イソフルラン（０．７５～１％）で軽く麻酔した。体温を、フィードバック制御加温パッドを使用して維持した。ミニチュアｐｉｅｚｏ ｄｒｉｖｅｒ（ＰＤｕ１００Ｂ、ＰｉｅｚｏＤｒｉｖｅ）によって駆動されるｐｉｅｚｏ ｂｅｎｄｅｒ（ＢＡ４５１０、ＰｉｅｚｏＤｒｉｖｅ）を、尖っていない針が接着されたＫａｐｔｏｎテープを用いて絶縁した。針の先を、足の後ろに取り付けて、振動（１００Ｈｚ、正弦波、１秒）によりそれを刺激した。刺激間隔は、１０秒であった。

【0305】

－ｉｎ ｖｉｖｏファイバー測光法およびデータ解析。市販のファイバー測光システム（Ｎｅｕｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して、ＳＳｐ－ｕｌからのカルシウム活性を記録した。パッチコード（ファイバーコア直径、２００μｍ；Ｄｏｒｉｃ Ｌｅｎｓｅｓ）を使用して、埋込型光ファイバーを備えた測光システムを接続した。ＧＣａＭＰ励起に対する青色光（λ＝４７０ｎｍ）の強度を、パッチコードの先端で約６０μＷに調整した。紫色光（λ＝４１５ｎｍ、先端で約６０μＷ）を使用して、等吸収制御シグナルを取得して、カルシウム非依存性人為現象を検出した。放出されたシグナルを、バンドパスフィルター処理し、ＣＭＯＳカメラのセンサーに焦点を合わせた。測光シグナルおよび刺激開始を、多機能Ｉ／Ｏデバイス（ＰＣＩｅ－６３２１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって生じたＴＴＬシグナルに基づいて整列させた。ＲＯＩからのシグナルの平均値を計算し、Ｂｏｎｓａｉソフトウェアを使用することによってセーブし、さらなる解析のためにＭＡＴＬＡＢ（登録商標）にエクスポートした。

【0306】

記録された測光シグナルを処理するために、それぞれのシグナルの最初のベースライン補正を、適応的に反復的に再重み付けされたＰｅｎａｌｉｚｅｄ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ（ａｉｒＰＬＳ）アルゴリズム（https:// at github.com/zmzhang/airPLS）を使用して行って、シグナルにおける傾きおよび低頻度の変動を除去した。ベースライン補正されたシグナルを、５秒のベースライン期間の中央値および標準偏差を使用して、試行ごとの基準で標準化した（Ｚスコア）。標準化された４１５ｎｍの励起等吸収シグナルは、ロバスト線形回帰を使用して、標準化された４７０ｎｍの励起ＧＣａＭＰシグナルに適合させた。最後に、標準化された等吸収シグナルを、線形回帰のパラメーターを使用して調整し、標準化されたＧＣａＭＰシグナルから復帰させて、カルシウム依存性シグナルを得た。

【0307】

ヒト器官試料調製
ヒト新皮質組織（前頭、頭頂、側頭）を、てんかんのために脳切除を受けている小児および成人患者（Ｎ＝６；６～６０歳）から得た。Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩＲＢプロトコール００１０３０１９の元で、インフォームドコンセントを、組織の供与について得た。

【0308】

組織調製は、一般に、文献^{４１、５７、５８}に記載された方法に従った。解剖溶液は、９５／５％のＯ２／ＣＯ２（ｐＨ７．４）でバブリングされた、７５ｍＭのスクロース、８７ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのグルコース、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含有した。皮質を、氷冷（約４℃）の酸素化解剖溶液下で注意深く解剖して、軟膜を除去した。単一の脳回を、スライスするためにブロックし、Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００において３００ｕｍの厚さで切断した。スライスを、ハンクス緩衝食塩水中ですすぎ、６ウェルプレートにおいて、ＰＴＦＥ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＰＩＣＭＯＲＧ５０）上に置いた。組織を、文献^４０に記載された条件付け培地中で培養した。条件付け培地はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、最初の７日間、抗生物質／抗真菌薬（１×、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＧｉｂｃｏ）、および培養期間全体にわたって、シクロスポリン（５ｕｇ／ｍＬ）を含有していた。ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）を、スライス後最初の１時間、培地に添加した。ＡＡＶレトログレード（ＡＡＶ－ｒｇ）ウイルスを、条件付け培地に懸濁し、プレーティングの日に、ピペットによってスライス表面に直接適用した。ｍＮｅｏｎレポーターの発現を、ＤＩＶ ３から前方へモニターし、組織を、ＤＩＶ ６～ＤＩＶ １４の免疫組織化学的検査およびパッチクランプ実験のために使用した。

【0309】

ヒト器官試料における電気生理学
培養されたヒト新皮質組織を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－５０正立顕微鏡のプラットフォーム上の加熱された記録バス（３２～３４℃）に移した。記録溶液は、９５／５％のＯ２／ＣＯ２で完全に飽和された、１１８ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、３０ｍＭのグルコースを含有した。ホウケイ酸塩パッチピペットを、４．０～５．５ＭΩの抵抗で引き、ＫＯＨで７．４に調整されたｐＨの、１３４ｍＭのグルコン酸Ｋ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４ｍＭのＡＴＰ三リン酸Ｍｇ塩、３ｍＭのＧＴＰ三リン酸Ｎａ塩、１４ｍＭのクレアチンリン酸、６ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＮａＣｌを含有する内液で満たした。ビオサイチン（０．２％）を、内液に添加して、記録後の形態の同定を可能にした。パッチされた細胞を、最低でも１２分間、ホールセルモードで保って、ビオサイチンで完全に満たすのを確実にした。ｍＮｅｏｎを発現する細胞を、Ａｘｏｐａｔｃｈ ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、視線誘導下でパッチクランプした。データを、（Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ｂ）でデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ １０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて記録した。膜電圧を、１００ｋＨｚで記録し、１０ｋＨｚでローパスフィルター処理した。液間電位差は補正しなかった。ピペットキャパシタンスおよび直列抵抗を、それぞれの記録の開始の際に相殺し、記録設定の安定性のために周期的にチェックした。内在性膜の特性を、－１０ｐＡの電流ステップを用いて測定した。発火基電流を、１秒の期間の勾配電流および１００～３００ｐＡの最終振幅を用いて測定した。インプット－アウトプット曲線を、最大発火率が誘発されるまで、－５０ｐＡで開始して、１０ｐＡの増分で増加する一連の電流ステップから作成した。データを、ＮｅｕｒｏＭａｔｉｃおよび組織内のルーチンのＩｇｏｒ Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して解析した。

【0310】

顕微鏡法および画像解析：組織培養における細胞イメージングを、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（ＣＳＨＬ Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ）において行った。連続的にマウントされた脳切片からのイメージングを、胎児組織について６３倍および５倍、ならびに成体組織について２０倍の対物レンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０または７１０共焦点顕微鏡（ＣＳＨＬ Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ）およびＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ９０ｉ蛍光顕微鏡において、ならびにＭＢＦ Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａソフトウェア（ＭＢＦ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｍ２システムにおいて５倍で、行った。定量化および画像解析を、Ｉｍａｇｅ Ｊ／ＦＩＪＩソフトウェアを使用して行った。グラフの統計学およびプロットを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して行った。

【0311】

統計学：独立両側スチューデントのｔ検定を、群比較のために使用した。統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で行った。ＤＥＳｅｑ２を使用して、トランスクリプトーム－ワイドＲＮＡ－ｓｅｑデータの統計学的有意性を分析した。

【0312】

本明細書で参照されるすべての参考文献、刊行物、オンラインリソース、特許および／または非特許文献は、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0313】

プログラム可能ＲＮＡセンシングによる細胞型アクセスの概要
多細胞生物における多様な細胞型は、そのゲノムを構築し、生物の表現型を組織化する、必須の中間体である。この生物学的情報フローおよび疾患におけるその変更の組織論理を解読することは、多様な種にわたる細胞型の特異的で網羅的な分析を可能にする方法を必要とする。以下の例は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ（内因性ＡＤＡＲによるＲＮＡセンシングを通した細胞アクセス）を記載し、これは、ＲＮＡにおいて作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって媒介されるＲＮＡ編集を通して実行される、所望のエフェクタータンパク質の翻訳に体細胞型を定義するＲＮＡの検出を組み合わせる。以下の例は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲが、ヒトおよびマウス細胞系において、およびウイルスベクターによって送達される場合に、マウス大脳皮質の異なるニューロン型において、レポータータンパク質を翻訳する特定のＲＮＡ配列を感知することを実証する。このＲＮＡプログラム可能技術は、生物学、医学、およびバイオテクノロジーにおいて広範な適用を有する、器官系および種にわたって、特異的で、単純で、多目的の、一般的な方法で、動物細胞型を発見し、モニターし、および編集する可能性を強調する。

【0314】

（実施例１）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ設計および哺乳動物細胞における検証
ＲＮＡ編集は、再コード化、スプライシング、マイクロＲＮＡ標的化、ならびに他のＲＮＡプロセシングおよび細胞プロセスに関わる後生動物遺伝子の調節ツールキットに必須の、広く、ロバストな転写後メカニズムである［２０，２１］。ＲＮＡ編集の最も普及している形態は、ＡＤＡＲによって触媒されるアデノシンからイノシン（Ａ→Ｉ）変換であり、イノシンは、細胞機構によってグアノシン（Ｇ）として認識される［２１］。ＡＤＡＲは、塩基対合二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの区間を認識し、それによって動員され［２０］、このようにして、配列がガイドする塩基編集マシンとして作動することができ、トランスクリプトーム編集のために利用されている［２２～２６］。ＡＤＡＲは、動物細胞において遍在性であるので［２７］、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、単一およびモジュラーｒｅａｄｒＲＮＡ分子として設計した（図１ａ）。ｒｅａｄｒＲＮＡの５’領域は、約３００ヌクレオチドのセンサードメインを含有し、これは、配列特異的塩基対合を通して、特定の細胞型ＲＮＡに相補的であり、このようにして、それを検出する。このセンサードメインは、翻訳スイッチとして作用する１つまたは複数のＡＤＡＲ編集可能ＳＴＯＰコドンを含有し、これは、感知－編集－スイッチＲＮＡ（ｓｅｓＲＮＡ）に対するこの領域の命名法をもたらす。ｓｅｓＲＮＡの下流およびＳＴＯＰのインフレームには、自己切断ペプチド２Ａをコードする配列があり、インフレームで、さまざまなエフェクタータンパク質をコードするエフェクターＲＮＡ（ｅｆＲＮＡ）領域が続く。ｒｅａｄｒＲＮＡ全体は、特異的センサーおよびエフェクターに応じて、数キロ塩基であり、このようにして、ウイルスベクターまたはリポソームナノ粒子を通して細胞に送達可能である。標的ＲＮＡを発現する細胞では、ｓｅｓＲＮＡは、標的とｄｓＲＮＡを形成し、これは、ＡＤＡＲを動員して、編集複合体をアセンブルする。編集可能ＳＴＯＰコドンで、ＡＤＡＲは、ＡからＩに変換し、これは、標的ＲＮＡ中の反対のＣと対合する。このＡ→Ｇ置換は、ＴＡＧ ＳＴＯＰコドンをＴＩ（Ｇ）Ｇトリプトファンコドンに変換し、ｅｆＲＮＡの翻訳のスイッチをオンにする。インフレーム翻訳は、Ｎ末端ペプチド２ＡおよびＣ末端エフェクターを含む融合タンパク質を生成し、これは、次いで２Ａにより自己切断され、機能性エフェクタータンパク質を放出する（図１ａ）。ｒｅａｄｒＲＮＡは、標的ＲＮＡを発現しない細胞では、不活性のままであると予想される。

【0315】

（実施例２）
ヒト細胞における操作性
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの原理証明バージョンを構築し、ヒト２９３Ｔ細胞系において、それを試験した。発現ベクター（ＰＧＫ－ｔｄＴ）を使用して、外因性標的ＲＮＡとしてｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を発現させ、トランスフェクト細胞を標識した。次に、５’センサー領域からＴＡＧ ＳＴＯＰコドンが埋め込まれたｔｄＴ配列（ｓｅｓＲＮＡｔｄＴ）、２Ａコード配列、および緑色蛍光（ＧＦＰ）のための３’コードカセットからなる、ｒｅａｄｒＲＮＡを発現するＲＥＡＤＲベクター（ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰ）を設計した、図６。ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰとＰＧＫ－ｔｄＴの共トランスフェクションは、ｔｄＴ＋細胞のサブセットにおけるＧＦＰ発現をもたらした（図６）。この結果を立証するために、ＲＥＡＤＲベクターのＧＦＰコード領域を、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターからホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）の発現を駆動するテトラサイクリン誘導性転写活性化因子（ｔＴＡ２）のものと置き換えた（図６）。ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ｔＴＡ２およびＴＲＥ ＬｕｃとＰＧＫ－ｔｄＴの共トランスフェクションは、空ベクター対照と比較して、発光の劇的な誘導をもたらした（図６）。それぞれ、わずかなおよび弱いＧＦＰまたはルシフェラーゼ発現は、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰ単独または空ＰＧＫベクターと共トランスフェクトされた場合のＲＥＡＤＲｔｄＴ－ｔＴＡ２／ＴＲＥ Ｌｕｃから観察され（図６ｂ～ｆ）、これは、ｓｅｓＲＮＡにおけるＳＴＯＰコドンの偶然のリードスルーから生じ得た［２８］。

【0316】

（実施例３）
スペーサー
スペーサー配列は、本開示の一実施形態に従って、ｒｅａｄｒＲＮＡの漏出を低減した。ｓｅｓＲＮＡの前のおよそ６００ｂｐのインフレームスペーサー領域の包含は、残ったＧＦＰ翻訳を実質的に排除した、図２ａ。図６ｇおよび６ｉは、スペーサー配列がｓｅｓＲＮＡｔｄＴコード領域の前に挿入されている、概略的なＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰベクターである。図６Ｊは、それぞれ、ｔｄＴ標的ＲＮＡ発現あり（上側）またはなし（下側）の可変の長さのスペーサーをコードするＲＥＡＤＲｔｄＴ－Ｇ’Ｐベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰおよびＲＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析である。（図６ｊ）より長いスペーサーは、ｔｄＴ標的ＲＮＡの存在下で、ｒｅａｄｒＲＮＡの有効性を減少させ（図６ｈ）、図６Ｊに示されるＲＦＰ＋細胞内のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして計算された変換比の定量化を示す。

【0317】

（実施例４）
定量化
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率をより定量的に特徴付けるために、ＢＦＰコードカセットを、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰにおいて、ｓｅｓＲＮＡｔｄＴ領域の上流に挿入し、これは、スペーサーとして機能するだけでなく、ＣＡＧ－ｔｄＴトランスフェクト細胞と一緒にすべてのＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰトランスフェクト細胞を標識した（図１ｂ、ｃ）。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率を、ＦＡＣＳ解析において、ＢＦＰ＋細胞においてゲーティングされたＲＦＰ＋細胞内のＧＦＰ＋細胞の比として計算した。ｔｄＴ標的ＲＮＡの非存在下で、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰは、漏出性のＧＦＰ発現を示さなかった。ｔｄＴ ＲＮＡの存在下で、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰの効率は、１５．２％であったが（図１ｃ、ｄ）、ＳＴＯＰコドンを含有するスクランブルコード配列によりｓｅｓＲＮＡＣｔｒｌを発現する対照ＲＥＡＤＲベクターは、ＧＦＰ翻訳を示さなかった。

【0318】

（実施例５）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率は標的ＲＮＡレベルと相関する
次に、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率が、標的ＲＮＡレベルと相関するかどうかを調べた。ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰの効率は、２９３Ｔ細胞トランスフェクションにおいて、ＣＡＧ－ｔｄＴベクターの量の増加とともに増加した。ＣｈＥＴＡ（光ゲート型チャネルロドプシン－２のバリアント）コード配列が青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）に融合され、ＴＲＥによって駆動される、テトラサイクリン誘導性発現ベクターをさらに設計し、このようにして、ＢＦＰ蛍光レベルは、培養培地中のテトラサイクリン濃度と相関したＣｈｅｔａ転写レベルを示した。テトラサイクリン濃度およびＢＦＰ発現レベルの増加は、Ｃｈｅｔａ ＲＮＡ依存性の様式で、ＲＥＡＤＲＣｈｅｔａ－ＧＦＰ効率を増加させた。図１ｅ～ｆ。ＢＦＰ－Ｃｈｅｔａ発現を駆動する構成的プロモーターにより、ＲＥＡＤＲＣｈｅｔａ－ＧＦＰ効率は、４１．５％の高さに達した。これらの結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの標的ＲＮＡレベル依存性およびロバスト性を示した。生理学的機能を媒介するためのエフェクターＲＮＡの能力を実証するために、我々は、ゲノムＤＮＡ編集のためにＣａｓ９タンパク質を発現するようにＲＥＡＤＲｔｄＴ－Ｃａｓ９ ２９を、およびプログラム細胞死のための機能性カスパーゼ３タンパク質を発現するようにＲＥＡＤＲｔｄＴ－ｔａＣａｓ３／ＴＥＶ ３０を構築した。効率的な遺伝子編集（図７ａ～ｄ）および細胞アポトーシスの増加（図７ｅ～ｆ）が、それぞれ、ｔｄＴ標的ＲＮＡが存在する場合のみ、誘導された。

【0319】

（実施例６）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能におけるＡＤＡＲタンパク質の役割
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能におけるＡＤＡＲタンパク質の役割を調べるために、ＡＤＡＲ１遺伝子ノックアウト（ＫＯ）２９３Ｔ細胞系を、ＣＲＩＳＰＲを使用して作成した。２９３Ｔ細胞において、ＡＤＡＲ１が高度に発現される一方で、ＡＤＡＲ２が辛うじて発現されるので、ＡＤＡＲ１ＫＯ ２９３Ｔは、本質的に、ＡＤＡＲヌル細胞系を表した。ＡＤＡＲ１の除去は、主に、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰ機能性を排除し（図５ｈ、ｉ）、これは、ｐ１１０またはｐ１５０ ＡＤＡＲ１アイソフォームのいずれか、およびＡＤＡＲ２タンパク質（図５ｈ、ｉ）の外因性発現によってレスキューされた。野生型細胞におけるＡＤＡＲ２の過剰発現は、ＲＥＡＤＲ^{ｔｄＴ－ＧＦＰ}効率を約２５～３０％増加させた（図５ｈ、ｉ）。サンガーシークエンシングは、ＴＡＧ ＳＴＯＰコドンをＴＧＧトリプトファンコドンに変換した、意図した部位でのＡからＩ／Ｇの編集を確認した（図５ｊ、ｋ）。ＡＤＡＲ発現が、インターフェロン刺激によって誘導され得るので［３２、３３］、ＡＤＡＲ１－ｐ１１０およびＡＤＡＲ１－ｐ１５０ ＡＤＡＲが、野生型２９３Ｔ細胞において、インターフェロン刺激によって誘導されたことをさらに確認し、したがって、ＲＥＡＤＲｔｄＴ－ＧＦＰ効率が増加したことを実証した。

【0320】

（実施例７）
広範囲の細胞におけるＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能
２９３Ｔ細胞に加えて、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能性を、ヒトＨｅＬａ、マウスＮ２ａ、およびマウスＫＰＣ１２４２細胞系を含む、異なる組織または種が起源のいくつかの他の細胞系において実証した。集合的に、これらの結果は、細胞－内因性ＡＤＡＲを活用することによって、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲが、特異的で、有効で、ロバストな方法で、細胞ＲＮＡの検出をエフェクタータンパク質の翻訳と組み合わせることができることを実証する。

【0321】

（実施例８）
ｓｅｓＲＮＡの特性はＣｅｌｌＲＥＡＤＲプログラム可能性を付与する
ｓｅｓＲＮＡは、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの重要な構成要素であるので、ｓｅｓＲＮＡのいくつかの特性を、ロバストアッセイとして、ＡＤＡＲ２過剰発現ＲＥＡＤＲＡｄａｒ２－ｔｄＴ－ＧＦＰベクターを使用して調べた。１００ヌクレオチド未満のｓｅｓＲＮＡが、ほとんどが無効であった一方で、長さが増加したｓｅｓＲＮＡが、２００～２５０ｎｔの最適な長さで、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率と正に相関したことを見出した。

【0322】

（実施例９）
プログラム可能性におけるミスマッチの役割
標的ＲＮＡとの配列ミスマッチの観点から、約２００ｎｔのｓｅｓＲＮＡは、最大で１０のミスマッチ（配列の長さの５％の）またはＲＥＡＤＲＡｄａｒ２－ｔｄＴ－ＧＦＰ効率の大きな減少なしのインフレームのインデルを許容し（図２）、この特性は、ｓｅｓＲＮＡ設計に対する柔軟性を付与する（方法を参照されたい）。

【0323】

しかしながら、編集部位の近傍のミスマッチは、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率を有意に低減した。ｓｅｓＲＮＡ設計における標的転写物に沿って場所の効果を検討するために、ＥＦ１ａ－Ｃｈｅｔａ－ｔｄＴ発現ベクターを使用し、それぞれ、プロモーター、異なるコード領域、および３’ＵＴＲを標的化する５つのｓｅｓＲＮＡを試験した。転写領域を標的化する４つのｓｅｓＲＮＡはすべて、プロモーターを標的化するものを除いて、ロバストな効率を示した。最後に、より多くのＳＴＯＰコドンの包含が、ｓｅｓＲＮＡのストリンジェンシーをさらに増加させ得るかどうか（すなわち、標的ＲＮＡの非存在下で、基礎的な翻訳を低減する）を調べた。読み飛ばしの翻訳の感知指標としてルシフェラーゼを使用して、２つのＳＴＯＰコドンを有するｓｅｓＲＮＡは、１つのＳＴＯＰコドンを有するものと比較して、同等の効率で漏出性の低減を示したが、３つのＳＴＯＰコドンは、効率を有意に低減した（図２ｄ～ｆ）。同時に、これらの結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲのストリンジェンシー、効率、および柔軟性を増強する戦略を示唆する。

【0324】

（実施例１０）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは本質的にプログラム可能である
ワトソン－クリック塩基対合において構築された、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、本質的にプログラム可能であり、より特定の細胞型の定義のために２つまたはそれよりも多くの細胞ＲＮＡを交差標的化するための可能性を付与する。この特性を検討するために、同じ転写物の異なる領域を標的化する二重または三重ｓｅｓＲＮＡアレイを設計した。試験されたｓｅｓＲＮＡアレイはすべて、単一ｓｅｓＲＮＡのものと同等の、ロバストなＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性を示した。

【0325】

２つの標的ＲＮＡの交差標的化のための可能性を調べるために、タンデムに配置されたｓｅｓＲＮＡｔｄＴおよびｓｅｓＲＮＡＣｈｅｔａ（ｓｅｓＲＮＡｔｄＴ／Ｃｈｅｔａ）からなるｓｅｓＲＮＡアレイを設計した。単一の標的ＲＮＡ、ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＣｈｅｔａは、ｒｅａｄｒＲＮＡｔｄＴ／ＣｈｅｔａによるＧＦＰまたはＬｕｃ発現の誘導に失敗したが、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣｈｅｔａベクターの両方がトランスフェクトされた場合に、それぞれ、有意なＧＦＰ発現または発光の増加が観察された。この結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲのプログラム可能性に基づく交差細胞型標的化の可能性を実証した。図２。

【0326】

（実施例１１）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによる内因性ＲＮＡセンシング
外因性ＲＮＡを発現する合成遺伝子と比較して、内因性遺伝子は、多くの場合、多数のエクソン、イントロン、および調節エレメントを含む、より複雑なゲノム構造を有し、転写された内因性ＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡとしてプロセシングされる前に、複数の精巧な転写後ステップ、例えば、スプライシングおよび化学修飾を受ける。細胞内因性ＲＮＡを標的化するためのＣｅｌｌＲＥＡＤＲの能力を調べるために、２９３Ｔ細胞において高度に発現されるＥＥＦ１Ａ１ハウスキーピング遺伝子を、最初に選択し、そのさまざまなエクソン、イントロン、５’および３’ＵＴＲ、ならびにｍＲＮＡを標的化するｓｅｓＲＮＡのセットを体系的に設計した（図３）。これらのｓｅｓＲＮＡは、すべての意図されるＥＥＦ１Ａ１領域を感知して、ｅｆＲＮＡ翻訳のスイッチをオンにするのに有効であり、エクソンは、ＵＴＲおよびイントロンよりも良好な標的であった。とりわけ、２つのエクソンから接続されたｍＲＮＡ領域に相補性的なｓｅｓＲＮＡは、エクソン内に含有されたものと同等の有効性を達成し、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲが、ｍＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍＲＮＡにおいて作用したことを示した。ＥＥＦ１Ａ１ ＲＮＡに対するＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性は、細胞トランスフェクション後のインキュベーション時間とともに増加した。高度に発現されるＡＣＴＢ、中程度に発現されるＰＣＮＡ、および長鎖非コードＲＮＡ ＸＩＳＴを含む、いくつかの他の内因性ＲＮＡを、２９３Ｔ細胞においてさらに試験した。これらのＲＮＡすべてについてのロバストなＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性（図３ｄ）が観察された。外因性ＡＤＡＲ２過剰発現は、むしろ、約３０％のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性の中程度の増加をもたらした（図３ｃ、ｄ）。同時に、これらの結果は、細胞内因性ＡＤＡＲが、細胞内因性ＲＮＡに対する有効でロバストなＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能性を可能にすることを示唆する。

【0327】

（実施例１２）
標的化転写物のレベルに対するＣｅｌｌＲＥＡＤＲの効果
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってアッセイされる標的化転写物のレベルを変更せず（図３ｅ）、この結果は、ｒｅａｄｒＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ干渉の可能な効果も除外した。ＲＮＡシークエンシング解析をさらに行って、ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ}またはｓｅｓＲＮＡ^ＰＣＮＡを発現する２９３Ｔ細胞のトランスクリプトームプロファイルを、スクランブル化ｓｅｓＲＮＡＣｔｒｌを発現するものと比較することによって、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲのトランスクリプトームの効果を評価した。相関分析は、ｓｅｓＲＮＡＥＥＦ１ＡまたはｓｅｓＲＮＡＰＣＮＡ発現が、全体的なトランスクリプトームに対する有意な影響を有さなかったことを示し（図３ｆ）、ＤＥＳｅｑ２分析は、ｓｅｓＲＮＡ^{ＥＥＦ１Ａ}またはｓｅｓＲＮＡ^ＰＣＮＡとｓｅｓＲＮＡ^Ｃｔｒｌ群との間の有意な差次的遺伝子発現がないことを明らかにし、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲが、細胞トランスクリプトームに対する有意な効果を有さないことを実証した。

【0328】

（実施例１３）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによるさらなる内因性ＲＮＡセンシング
外因性ＲＮＡを発現する合成遺伝子と比較して、内因性遺伝子は、多くの場合、多数のエクソン、イントロン、および調節エレメントを含む、より複雑なゲノム構造を有し、転写された内因性ＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡｓ３４としてプロセシングされる前に、複数の精巧な転写後ステップ、例えば、スプライシングおよび化学修飾を受ける。細胞内因性ＲＮＡを検出するためのＣｅｌｌＲＥＡＤＲの能力を調べるために、２９３Ｔ細胞において高度に発現されるハウスキーピング遺伝子のＥＥＦ１Ａ１を、最初に選択し、そのさまざまなエクソン、イントロン、５’および３’ＵＴＲ、ならびにｍＲＮＡを標的化するｓｅｓＲＮＡのセットを体系的に設計した（図３ａ、ｂ）。これらのｓｅｓＲＮＡは、すべての意図されるＥＥＦ１Ａ１領域を感知して、ｅｆＲＮＡ翻訳のスイッチをオンにするのに有効であり、エクソンは、イントロンよりも良好な標的であると思われた（図３ｃ）。とりわけ、２つのスプライスされたエクソンから接続されたｍＲＮＡ領域に相補的なｓｅｓＲＮＡは、エクソン内に含有されたものと同等の効率を達成し、ｓｅｓＲＮＡを、ｐｒｅ－ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ配列の両方を標的化するように設計することができることを示した。ＥＥＦ１Ａ１ ＲＮＡに対するＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性は、細胞トランスフェクション後のインキュベーション時間とともに増加した。

【0329】

（実施例１４）
感度
標的ＲＮＡレベルに対するＣｅｌｌＲＥＡＤＲの感度を調べるために、高度に発現されるＡＣＴＢ、中程度に発現されるＰＣＮＡ、および長鎖非コードＲＮＡ ＸＩＳＴを含む、いくつかの他の内因性ＲＮＡを、２９３Ｔ細胞においてさらに試験した。高いレベル（ＡＣＴＢ、ＰＣＮＡ）から、中程度のレベル（ＴＰ５３、ＸＩＳＴ）、低いレベル（ＨＥＲ２、ＡＲＣ）までの範囲の発現を有するいくつかの内因性ＲＮＡを選択した。これらのＲＮＡすべてについてのロバストなＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性（図３ｄ）が観察された。外因性ＡＤＡＲ２過剰発現は、むしろ、約３０％のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性の中程度の増加をもたらした（図３ｃ、ｄ）。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、はるかに低い効率であったが、低レベルのＡＲＣ ＲＮＡでさえ確実に検出することが可能であった。同時に、これらの結果は、細胞内因性ＡＤＡＲが、細胞内因性ＲＮＡに対する有効でロバストなＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能性を可能にすることを示唆する。

【0330】

実施例１～１４の要約
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲを、ヒト２９３Ｔ細胞におけるレポーターＲＮＡ編集アッセイを構築することによって、ヒトおよびマウス細胞系において試験し、ここで、標的ＲＮＡは、ＲＦＰ発現ベクターから作製され、センサーＲＮＡは、ＲＦＰ標的に対してアンチセンスであり、次いで、第３のベクターにおいてＧＦＰ発現を活性化および増幅するｔＴＡ転写活性化因子に続く。細胞にトランスフェクトされたら、センサーＲＮＡは、ＲＦＰ ＲＮＡと対合し、ＡＤＡＲが動員されて、ＳＴＯＰコドンを編集し、ＧＦＰを活性化するｔＴＡの翻訳のスイッチをオンにし、それによって、細胞を赤色から緑色にする。編集は、蛍光標識細胞分取［ＦＡＣＳ］アッセイによって定量化することもでき、ここで、右上象限は、ＲＦＰ／ＧＦＰ陽性細胞である。

【0331】

この変換は、それがＡＤＡＲ１ノックアウト細胞系において起こらなかったので、ＡＤＡＲ媒介であり、これは、次いで、Ａｄａｒ２の発現によってレスキューされ得る。サンガーシークエンシングは、これが、実際に、ＳＴＯＰコドンを解除した意図したＡ－Ｉ（Ｇ）変換に起因することを証明した。

【0332】

このシステムはまた、ヒトＨｅｌａ細胞、ならびにマウスＮ２ａ細胞および細胞内因性ＲＮＡにおいて作動する。Ｅｆ１ａ遺伝子およびｐｒｅ－ｍＲＮＡの異なる領域が標的として使用された場合に、エクソンおよびコード領域が、イントロンおよび非翻訳領域よりも良好なセンシング標的であることが見出された。加えて、これは、非コードＲＮＡを含む５つの他の細胞ＲＮＡについて作動した。

【0333】

（実施例１５）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲで標的化する神経細胞型
神経組織および細胞を含む、動物組織における特定の細胞型にアクセスするために使用されるＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、特異ベクターシステムおよびバイナリーベクターシステムの両方を含む（図４ｂ）。特異ベクターシステムでは、すなわち、特異ＲＥＡＤＲベクターは、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子とそれに続くｓｅｓＲＮＡならびにｓｍＦｌａｇおよびｔＴＡ２をコードするｅｆＲＮＡの転写を駆動する、ｈＳｙｎプロモーターを含む。この特異ＲＥＡＤＲベクターは、ＲＮＡ検出をエフェクター遺伝子発現と直接組み合わせ、その効率および特異性は、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓｍＦｌａｇ、および標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の共局在化によって評価される。

【0334】

バイナリーシステムは、追加のレポーターベクターを含み、これは、ＲＥＡＤＲベクターから翻訳されたテトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｔＴＡ２）に応答して、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｍＮｅｏｎ）または他のエフェクタータンパク質を駆動するＴＲＥプロモーターを含有する（図４ｂ）。バイナリーベクターは、エフェクター遺伝子発現の増幅、ならびにＲＥＡＤＲおよびレポーターベクターが対合することによって、異なる細胞型において異なるエフェクター遺伝子を発現するコンビナトリアルな柔軟性を提供する。

【0335】

Ｆｅｚｆ２またはＣｔｉｐ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ標的化
マウス大脳皮質の主要なグルタミン酸作動性投射ニューロン（ＰＮ）型を定義するｍＲＮＡを標的化するＲＥＡＤＲベクターのセットを、２９３Ｔ細胞において、２９３Ｔ細胞における個々のｓｅｓＲＮＡ標的化ニューロンＲＮＡ配列、この場合では、Ｃｔｉｐ２およびＦｅｚｆ２配列を共発現させることによって、最初に試験およびスクリーニングした（図９ａ、ｂ、ｄ）。ジンクフィンガー転写因子Ｆｅｚｆ２は、皮質アウトプットチャネルを構成する層５ｂ（Ｌ５ｂ）およびＬ６の皮質下行性投射ニューロン（ＣＦＰＮ）の大部分を標識するが、Ｃｔｉｐ２は、優先的に、Ｌ５ｂ／Ｌ６ ＣＦＰＮニューロンのサブセットを標識する^{３８、３９}。すべてのｓｅｓＲＮＡは、外因性Ｆｅｚｆ２またはＣｔｉｐ２標的配列の存在下、２９３Ｔ細胞において、可変であるが有意なＣｅｌｌＲＥＡＤＲ効率を示した（図９ｅ～ｆ）。

【0336】

Ｆｅｚｆ２またはＣｔｉｐ２のｉｎ ｖｉｖｏ標的化
ＡＡＶベクターを使用して、ウィスカーバレルの体性感覚皮質（Ｓ１）または運動皮質（Ｍ１）への局所注射によって、これらのｓｅｓＲＮＡをマウス皮質に投与した。バイナリーベクターで送達される場合、Ｆｅｚｆ２ ｓｅｓＲＮＡ１は、８６．４％の特異性を示し、Ｃｔｉｐ２ ｓｅｓＲＮＡ３および８は、Ｃｔｉｐ２抗体染色によってアッセイされる、９０％を超える特異性に達した（図９ｊ～ｋ）。

【0337】

Ｃｔｉｐ２ ｓｅｓＲＮＡ３は、以下の実験の中心であった。一次体性感覚マウス皮質（Ｓ１皮質）に特異ＲＥＡＤＲＡＡＶ^{Ｃｔｉｐ２／３}を感染させた場合に、ＦＬＡＧ免疫蛍光は、深層に集中し（図４ｃ）、ＣＴＩＰ２およびＦＬＡＧ免疫標識細胞の共局在化（図４ｃ、ｄ）は、９４．１％の特異性を示した（図４ｅ）。バイナリーＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}ＡＡＶに共感染したＳ１皮質では、ＲＥＡＤＲベクターからのｍＣｈｅｒｒｙ発現は、皮層にわたって細胞を標識したが、レポーターベクターからのｍＮｅｏｎ発現は、Ｌ５ｂおよび一部のＬ６ニューロンを特異的に標識し（図４ｆ）、ＣＴＩＰ２免疫蛍光は、９０．４％の特異性を示した（図４ｇ）。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣｔｉｐ２二重陽性細胞内のＧＦＰ細胞の比として計算されるＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}の効率は、８４．２％に達した（図４ｈ）。

【0338】

ＡＤＡＲ２過剰発現
ＲＥＡＤＲベクターからのＡＤＡＲ２過剰発現が、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ機能性を増強する可能性があるかどうかを試験するために、ＲＥＡＤＲベクターにおけるｍＣｈｅｒｒｙモジュールを、ＡＤＡＲ２ ｃＤＮＡで置き換えた。バイナリーＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}／レポーター^{ｍＲｕｂｙ３}またはバイナリーＲＥＡＤ^{Ｆｅｚｆ２}／レポーター^{ｍＲｕｂｙ３}に共感染したマウス皮質を、Ｆｅｚｆ２およびＣｔｉｐ２についてのｓｅｓＲＮＡの発現について試験した、図１０ａ～ｃ。ＡＤＡＲ２過剰発現が内因性ＡＤＡＲに依拠するバイナリーベクターと比較して、特異性または効率を特に増強しなかったことが分かった（図１０ｃ～ｉ）。

【0339】

（実施例１６）
ＲＮＡ発現レベルおよびＣｅｌｌＲＥＡＤＲ
ＣＦＰＮ（視床および脊髄を含む皮質外の領域にそれらの軸索を送る皮質下行性投射ニューロン）をマークするＣｔｉｐ２およびＦｅｚｆ２ ｍＲＮＡに加えて、ある範囲のレベルで発現されるいくつかの他のｍＲＮＡｗ標的化するｓｅｓＲＮＡ^４０を、それぞれ、ＰｌｘｎＤ１（Ｌ２／３およびＬ５ａにおける終脳内投射ニューロン（ＩＴ ＰＮ））、Ｓａｔｂ２（上層および下層の両方にわたるＩＴ ＰＮ）、Ｒｏｒｂ（Ｌ４錐体ニューロン）、およびｖＧＡＴ（ｐａｎ－ＧＡＢＡ作動性ニューロン）を含むバイナリーベクターにおいて構築した（図１１）。７５％またはそれを上回る特異性を達成するいくつかのｓｅｓＲＮＡを同定した（図１２）。これらの結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲが、ロバストな方法であり、特定の細胞型の標的化が、それぞれの標的についての複数のｓｅｓＲＮＡを試験することによって達成され得ることを示す。

【0340】

（実施例１７）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの長期効果
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ｓｅｓＲＮＡの長期効果を評価するために、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}および対照ＣＡＧ－ｔｄＴ ＡＡＶを、マウス皮質において、３か月間モニターした。グリア活性化および免疫原性に関わる９つの遺伝子の発現に対する定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}感染組織対対照組織において、有意な変化を示さなかった（図１３）。
（実施例１８）
ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによるニューロン型の記録および制御

【0341】

ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ有効性を使用して、マウスにおいて、神経機能を記録および制御した。ベンチマークとして、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲを、転写エンハンサーに基づく細胞型標的化アプローチと比較した。ｍｓｃＲＥ４エンハンサーを同定して、ＣＦＰＮのサブセットであるＬ５錐体トラック（ＰＴ）ニューロンを有効にした^１８。このようにして、ｍｓｃＲＥ４エンハンサー（すなわち、ＰＴエンハンサー）とＣｔｉｐ２ ｓｅｓＲＮＡ３の有効性を、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓおよび光活性化イオンチャネルチャネルロドプシン２を発現するための同じｔＴＡ－ＴＲＥバイナリーベクターを使用することによって比較した（図４ｉ～ｐ）。

【0342】

マウス前肢体性感覚皮質においてＰＴエンハンサー－ｔＴＡ２／レポーター^{ＧＣａＭＰ６ｓ}またはＲＥＡＤＲ^Ｃｔｉｐ^２／３／レポーター^{ＧＣａＭＰ６ｓ}ＡＡＶに共感染したマウスにおいて、前足の機械的刺激は、ＰＴエンハンサーおよびＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}両方の感染マウスにおいて、ファイバー測光法によって測定される、前肢体性感覚皮質のＧＣａＭＰ６ｓシグナルの確実で時間固定の増加を誘導した（図４ｉ～ｌ）。この結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによって達成されたエフェクター遺伝子発現レベルが、生きている動物において細胞生理学をモニターするのに十分であったことを示す。

【0343】

尾側前肢運動野（ＣＦＡ）においてＰＴエンハンサー－ｔＴＡ２／レポーター^{ＣｈＲｇｅｒ２－ｅＹＦＰ}またはＲＥＡＤＲ^Ｃｔｉｐ^２／３／レポーター^ＣｈＲｇ^{ｅｒ２－ｅＹＦＰ}ＡＡＶに共感染したマウスにおいて、ＣＦＡの光刺激は、確実で時間固定の前肢の移動を誘導し、これは、ＰＴエンハンサー感染マウスと比較して、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}においてより強いと思われた（図４ｍ～ｐ、拡張データ動画１）。この結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲによって達成されたエフェクター遺伝子発現レベルが、動物の行動における細胞機能を制御するのに十分であったことを示す。ｅＹＦＰ発現の解剖学的解析は、線条体、視床、脳橋、および髄質を含む皮質下標的における軸索投射によって明らかにされるように、ＲＥＡＤＲ^{Ｃｔｉｐ２／３}によるＬ５ ＰＴニューロン標識化を確認した（図１４）。

【0344】

（実施例１９）
哺乳動物種にわたるニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化
ラットおよびヒトの脳における一連の実験を行って、哺乳動物種にわたるＣｅｌｌＲＥＡＤＲの一般化可能性を実証した。ＧＡＢＡ作動性ニューロンを、バイナリーＡＡＶベクター標的化ｖＧＡＴ ｍＲＮＡ、ｐａｎ－ＧＡＢＡ作動性転写物を使用することによって、ラットにおいて標的化した（図１５ｂ）。ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴ（ｈＳｙｎ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｅｓＲＮＡ^ｖＧＡＴ－ｓｍＦｌａｇ－ｔＴＡ２）とレポーター^{ｍＮｅｏｎ}（ＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ）ＡＡＶ（図１５ａ）のラットＳ１バレル皮質および海馬への共注射は、皮質（図１５ｃ）および海馬（図１５ｄ～ｃ）のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを特異的に標識化した。ｖＧＡＴ ｍＲＮＡ（赤紫色）およびＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴ（ＧＦＰ）の共標識化によってアッセイされる特異性は、それぞれ、皮質について９１．７％および海馬について９３．８％であった（図１５ｆ～ｇ）。Ｔｌｅ４は、げっ歯類においてＬ６皮質視床（ＣＴ）錐体細胞をマークする、保存された転写因子である。バイナリーＲＥＡＤＲ^Ｔｌｅ４ ＡＡＶによって送達されたＴｌｅ４ ｍＲＮＡのエクソン１５を標的化するｓｅｓＲＮＡ（図１５ｈ）は、６２．５％で、ＴＬＥ４抗体による共標識化によって、深層ニューロンを標識した（図１５ｉ～ｋ）。

【0345】

（実施例２０）
新皮質器官培養プラットフォーム
器官培養プラットフォームを、てんかん手術から収集されたヒト新皮質検体においてＣｅｌｌＲＥＡＤＲを研究するために確立した^４１（図１６ａ）。ｈＳｙｎプロモーター（ＡＡＶｒｇ－ｈＳｙｎ－ｅＧＦＰ）によって駆動されるＧＦＰ構築物によるこれらの試料の感染は、顕著な尖端樹状突起によって特徴付けられる多くの錐体ニューロンの観察された形態および支配を伴って、複数の層にわたる高密度のウイルス標識化を示した（図１６ｂ、ｃ）。皮質および線条体投射ニューロンにおいて発現され、ヒト言語スキル発達^４２に関わる、進化的に保存された遺伝子である、２つのｓｅｓＲＮＡ標的化ＦＯＸＰ２ ｍＲＮＡ（フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２）（図５ａ、ｂ）が発生した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫染色は、ＦｏｘＰ２発現がＬ６ ＣＴニューロンに制限される^３９マウスとは異なって、ヒトＦＯＸＰ２が、皮層にわたって発現されることを示す（図１６ｄ）。バイナリーＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}ＡＡＶ（ｈＳｙｎ－ＣｌｉｐＦ－ｓｅｓＲＮＡ^{ＦＯＸＰ２}－ｓｍＶ５－ｔＴＡ２とＴＲＥ３ｇ－ｍＮｅｏｎ）をヒト新皮質スライスに適用した５日後、ｍＮｅｏｎ標識化細胞体を、上層および深層において観察した（図５ｃ、図１６ｅの拡張データ）。ＦＯＸＰ２免疫染色は、バイナリーＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}の特異性が、ほぼ８０％であったことを示した（図５ｄ、ｅ）。標識化されたニューロンは、グルタミン酸作動性錐体ニューロンと一致した、電気生理学的（図５ｆ）および形態学的（図５ｇ）特性も示した^４３。それぞれ異なるｓｅｓＲＮＡを有する２つの特異ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}ベクターを使用して、標的化ＦＯＸＰ２ニューロンの９７％を超える特異性が観察された（図１６ｆ～ｉ）。

【0346】

（実施例２１）
ヒト新皮質ＧＡＢＡ作動性細胞の標的化
ヒト新皮質ＧＡＢＡ作動性細胞を、ｓｅｓＲＮＡを使用して、ＶＧＡＴに標的化した（図５ｈ）。バイナリーＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴ／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}を使用して、新皮質層にわたる細胞標識化を観察し（図５ｉ）、標識化細胞は、多極および平滑な樹状突起を含む介在ニューロンの多様な形態学的特徴（図５ｊ）、際立って高密度の垂直方向の軸索（図５ｉ、ｋ）を示した。ＶＧＡＴ ｍＲＮＡについてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、おそらく、培養されたｅｘ ｖｉｖｏ組織におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの潜在的に低減された感受性に起因する過小評価の、７６．５％の特異性を示した（図５ｌ、ｍ）。この可能性のサポートにおいて、非常に少ない標識化細胞が、錐体の形態で観察された（図５ｉ～ｌ）。ウイルス適用７日後のＲＥＡＤＲ^ＶＧＡＴ／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}標識化介在ニューロンの標的化パッチ－クランプ記録は、協調的で、速く、遅れて開始する発火を含む、さまざまな内在性の特性を明らかにした（図５ｎ）。パッチされた細胞の生理学的特性（図５ｎ）および部分的に再構築された形態（図５ｏ）は、哺乳動物の新皮質介在ニューロンのものと一致した^４４。同時に、これらの結果は、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲの異種間の一般化可能性および有用性を実証する。

【0347】

（実施例２２）
てんかんを処置するための標的化ニューロン型および病理学的神経集合
疾患および臨床背景
てんかんは、人口のおよそ１％に影響を及ぼし、先進国では、患者の最大で３０％が、最適な抗てんかん薬物療法にもかかわらず、発作を経験し続けている^１。焦点性てんかんの最も有効な処置は手術であるが、これは、脳組織を除去する許容されない影響を理由として、非常に少ない患者に対して好適である。新規治療標的を同定し、新しい処置戦略を開発する緊急の必要性が存在する。遺伝子治療は、機能を保存しながら、難治性てんかん病巣における神経興奮性を調節し得る^１。しかしながら、現在の十分な細胞型および疾患状態特異性の欠如は、有効な遺伝子治療のための主要な障害である^２。

【0348】

焦点性てんかんは、病理学的脳ネットワークの過剰同期化された神経活動によって特徴付けられる興奮および抑制の不均衡によって生じる^１。脳回路は、複数の興奮性および抑制性の細胞型を含み、それぞれ、情報処理および興奮－抑制のバランスにおいて固有に寄与している^３，４。神経活動は、一部の細胞型において促進するが、他の細胞型において発作を抑制する^２。したがって、てんかん進行の適切な段階、例えば、開始、維持などで神経活動の細胞型標的化モジュレーションを達成することは重要である^１、２。病態生理学的集合を抑制するための方法、発作活動に実際に関与する方法が、特に有効であり得る。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ技術は、ＲＮＡセンサーを使用して、新薬の開発につながるようなモジュレート性受容体（例えば、ＧＰＣＲ）およびイオンチャネルの発現を通して、脳回路の活動の細胞型および疾患状態特異的モジュレーションを達成することができ、このようにして、焦点性てんかんを制御および処置する有望なアプローチを提示することができる。

【0349】

ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン型の標的化
ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、脳回路の抑制性制御を媒介し、多様なニューロン型を含む^４。小胞状ＧＡＢＡトランスポーター（ｖＧＡＴ）は、すべてのＧＡＢＡニューロンにおいて発現されるが、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマスタチン（ＳＳＴ）、カルレチニン（ＣＲ）、およびＶＩＰは、いくつかの主要な下位集団／型をマークする。発作の病因におけるこれらの介在ニューロン型の役割は、完全に理解されていないままである。ＰＶニューロンは、微妙に異なる役割を有し、てんかんの異なる段階で、発作を促進または抑制することが示されている。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ技術は、マウス、ラット、ヒトの新皮質^９（表Ａを参照されたい）、およびより最近では、マカクザルの新皮質において、ＧＡＢＡ介在ニューロンを標的化する助けになる（図１７）。ヒトＰＶおよびＳＳＴニューロンを標的化するためのセンサー（図１８）が、てんかん患者の側頭葉または前頭葉から切除された、すべてのヒトｅｘ ｖｉｖｏ皮質組織において使用される。
表A

【表A-1】

【表A-2】

【0350】

ＧＡＢＡ抑制性ニューロンのためのエフェクターおよび予想される結果
発作活動を抑制するためのＳＳＴニューロン媒介阻害を活性化する２種類のリガンド開口型メカニズムを使用する化学遺伝学的アプローチ^１。化学遺伝学は、内因性受容体の改変または外因性リガンドに応答する改変キメラ受容体の産生に依拠する。

【0351】

第１に、興奮性ＤＲＥＡＤＤ（デザイナー薬物によって独占的に活性化されるデザイナー受容体；ｈＭ３Ｄｑ興奮性受容体）^１０。ＤＲＥＡＤＤは、ＦＤＡが承認した薬物であるクロザピン－ｎ－オキシドまたはオランザピンによって特異的に活性化され得る^１１。薬物の用量は、有害作用なく発作を抑制するために、用量設定され得る。

【0352】

第２に、興奮性ＰＳＡＭ（薬理学的選択的アクチュエータモジュール／薬理学的選択的エフェクター分子）^１２。禁煙のために承認された薬物であるバレニクリン^１３に感受性である新たなバージョンのＰＳＡＭが開発された。

【0353】

化学遺伝学的アプローチの利点は、遺伝子治療が、薬物が与えられるまで不活性であり、その結果、遺伝子治療の「オフおよびオン」を変えることが可能であることである。また、効果の大きさは、リガンドの用量に依存する。したがって、任意の可能性のある副作用を回避するが、依然として有効性を最適化するために、薬物の用量を設定することが可能である。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲに基づく細胞特異的化学遺伝学的戦略を一般化して、発作および他の神経疾患を処置するために、他のＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性ニューロン型を標的化することができる。

【0354】

病態生理学的神経集合（ＰＮＥ）の標的化
てんかんを管理または処置するための特に有効な戦略は、過剰活動を生じるニューロンおよび神経集合、すなわち、病態生理学的神経集合（ＰＮＥ）だけでも抑制または制御することである。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、このために有用である。過剰および同期化神経活動は、最初期遺伝子（ＩＥＧ）ｃ－ｆｏｓの迅速な上方調節をもたらし^{１４、１５}、これは、ＰＮＥを構成する大部分のグルタミン酸作動性興奮性ニューロンをマークする。ｃ－ｆｏｓ ＲＮＡセンサーは、ＰＮＥを標的化およびモジュレートするように構築されている。４つのセンサーのパネルを試験し、その多くは、すでに、神経細胞培養における有望な結果を示している。ｃ－ｆｏｓに加えて、ＰＮＥを標的化するためにも使用され得る他のＩＥＧ^１５の拡張リストが存在する。

【0355】

エフェクター遺伝子
３種類のエフェクター遺伝子が、ｃ－ｆｏｓセンサーと組み合わされる。

【0356】

第１は、ＰＮＥのニューロンにおいてスパイクを低減する電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．１（ＫＣＮＡ１）^１６である。これは、ＰＮＥ内のニューロンの発火を抑制する。

【0357】

第２は、抑制性ＤＲＥＡＤＤ（ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）抑制性受容体）^１０であり、これは、経口薬物のオランザピンによって活性化され得る。

【0358】

第３は、塩化物透過性である無脊椎動物グルタミン酸受容体（ｅＧｌｕＣＬ）である^{１７、１８}。ｅＧｌｕＣＬは、発作活動の間に放出されたグルタミン酸に結合し、ＦＤＡが承認した薬物のイベルメクチンによっても活性化され得、得られた塩素流が、神経活動を抑制する。イベルメクチンはまた、慢性的にまたはレスキュー薬物療法としてのいずれかで、神経活動を低減するために与えられ得る。

【0359】

ＰＮＥを標的化するこのアプローチの固有の利点は、これが「閉鎖ループ」制御であることである。正常な生理学的状態下で、ｃ－ｆｏｓは、顕著に発現されず、したがって、エフェクター発現は存在しない。てんかんの間、ｃ－ｆｏｓ ＲＮＡの上方調節が、エフェクター翻訳を引き起こして、ＰＮＥ活動を抑制する。戦略は、発作および他の神経疾患を処置するために、他のＩＥＧを標的化するように一般化され得る。

【0360】

送達
上記のＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターはすべて、ＡＡＶベクター（血清型２／９およびｐｈｐ．ｅｂ）を使用して、てんかん病巣に送達される。従来のてんかん手術の間に、てんかん病巣の脳組織を除去する代わりに、治療用ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ ＡＡＶを、病巣に注射し、脳組織を保存する。

【0361】

予想される結果および現在の処置に対する改善
ＳＳＴセンサーおよびＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターに関して、オランザピン（興奮性ＤＲＥＡＤＤのため）またはバレニクリン（興奮性ＰＳＥＭのため）の経口投与は、ＳＳＴ介在ニューロンを活性化して、焦点性てんかんを抑制する。ｃ－ｆｏｓセンサーおよびＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターにより、オランザピン（抑制性ＤＲＥＡＤＤのため）またはバレニクリン（抑制性ＰＳＥＭのため）の経口投与は、ＰＮＥにおけるグルタミン酸作動性ニューロンの発火を低減して、てんかんを抑制する。同時に、特定の細胞型および特定の疾患状態に特異的なこれらのＲＮＡ治療薬は、てんかんの管理および処置を転換するであろう。
参考文献

【化3】

【化4】

【化5】

【0362】

（実施例２３）
非ヒト霊長類におけるニューロン型のＣｅｌｌＲＥＡＤＲ標的化
我々は、それぞれ、グルタミン酸作動性錐体ニューロン（サブセット）およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンをマークする、マカクザルＦｏｘｐ２およびｖＧＡＴのためのＲＮＡセンサーを開発した。我々は、次いで、ＲＮＡセンシングに対して条件付きのＥＧＦＰを発現するバイナリーＡＡＶ６ベクターを作成した。マカクＦＯＸＰ２およびｖＧＡＴ ｍＲＮＡを標的化するこれらのＡＡＶ ＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターを使用して（図１７）、我々は、バイナリーＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}およびＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}／レポーター^{ｍＮｅｏｎ}ＡＡＶを、マカク皮質のＶ１領域に注射した。ＲＥＡＤＲ^{ＦＯＸＰ２}感染皮質の蛍光顕微鏡法は、顆粒下錐体ニューロンにおけるｍＮｅｏｎ、それらの尖端樹状突起、および白質における遠心性軸索が、グルタミン酸作動性錐体ニューロンを示すことを明らかにした。ＲＥＡＤＲ^ｖＧＡＴ感染皮質由来のｍＮｅｏｎは、皮質層全体にわたって、形態学的に多様な推定上の抑制性ニューロンに制限された。したがって、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、ｉｎ ｖｉｖｏで非ヒト霊長類において有効である。

【0363】

（実施例２４）
慢性疼痛の細胞特異的処置
疾患および臨床背景
慢性疼痛の発生率は、世界中で、２０～２５％であると推定される。慢性疼痛を有するわずかな患者が、現在利用可能な薬物から完全な救済を得ており、半分超が、不完全な救済を報告している^１。無傷の中枢神経系（ＣＮＳ）は、疼痛の意識的知覚のために必要であるが、ＣＮＳにおける変化は、慢性疼痛状態において明らかに明白であり、進行中の末梢侵害受容インプットが慢性疼痛の維持に主要な役割を果たしている^１。有害なまたは潜在的に組織に損傷を与える刺激に選択的に応答し、末梢疼痛を媒介する、皮膚、筋肉、関節および内臓の侵害受容器は、ＣＮＳにインプットする。集中点としての役割を果たすいくつかのイオンチャネル、受容体および第２のメッセンジャーシグナル伝達分子の同定と組み合わせた、侵害受容器興奮性の根底にあるメカニズムの詳細な特徴付けにもかかわらず、有害な副作用を有さない疼痛の管理のための有効な治療介入はとらえどころのないままである^１。侵害受容性求心性神経の間の解剖学的、生理学的、および機能的不均一性は、それらの差次的遺伝子発現に根差しており、新しい治療剤の同定の困難さ、および前臨床データが有効な臨床介入に変換できないいくつかの顕著な失敗に寄与している^１。

【0364】

感覚刺激後の侵害受容器内のシグナル伝達メカニズムの間で、活動電位の発火は、求心性神経シグナルがＣＮＳに至る最終アウトプットである。侵害受容性活動電位は、電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８によって主に駆動される。ヒト遺伝学研究は、侵害受容性プロセシングにおけるＮａＶ１．７についての重要な役割を強調した：機能獲得突然変異は、肢端紅痛症および発作性激痛症などの疼痛症候群と関連するが、機能欠失突然変異は、先天性無痛症と関連する^２。したがって、侵害受容器は、慢性疼痛のための重要な治療標的を提示する。Ｎａｖ１．７の下方調節のための以前のＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９に基づくアプローチは、マウスにおいて、運動機能の変化なく、長期の疼痛の救済を達成した^３。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲ技術は、副作用を低減しながら、治療有効性を達成するための、侵害受容器の特定の型内のナトリウムチャネルおよび他のシグナル伝達メカニズムのモジュレーションを可能にする。

【0365】

後根神経節の侵害受容器の標的化およびエフェクター発現
ＮａＶ１．８およびＴＲＰＶ１は、侵害受容器において特異的に発現される。ＴＲＰＶ１およびＮａＶ１．８のためのＲＮＡセンサーを使用して、侵害受容器への特異的アクセスを確立する。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲに基づく細胞型特異的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、ノックダウンアプローチにおいて使用して、侵害受容器のＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８ ｍＲＮＡを下方調節する。転写活性化因子ｔＴＡの翻訳がＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＲＮＡセンサーによってゲーティングされる、バイナリー発現ベクター（図２０）を生成し、次いで、ｔＴＡは、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＲＮＡについてのｓｈＲＮＡの転写を活性化する。このバイナリーＣｅｌｌＲＥＡＤＲベクターは、ＡＡＶ９にパッケージングされる。

【0366】

腰椎穿刺を介した髄液へのくも膜下腔内注射による送達
これらのＡＡＶベクターは、髄液へのくも膜下腔内注射によって送達されて、後根神経節のニューロンに感染する。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、侵害受容器を定義するＲＮＡセンサーにおいて特異的に発現される。

【0367】

予想される結果および現在の処置に対する改善
特定の種類の侵害受容器内でのＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８、ならびに他のシグナル伝達メカニズムのＣｅｌｌＲＥＡＤＲ媒介モジュレーションは、低い副作用で治療効果を達成するのにより効果的である。

【0368】

アストロサイトおよびサテライトグリア細胞の標的化
アストロサイトは、ＣＮＳのホメオスタシスを維持するために重要である。慢性疼痛を含むいくつかの神経障害は、アストロサイト「グリオパチー」から生じ得る^４。アストロサイトは、神経細胞－グリア細胞およびグリア細胞－グリア細胞の相互作用を介して侵害受容性シナプス伝達、ならびに疼痛シグナル伝達のモジュレーションおよび神経障害性疼痛の維持における脊髄性および上脊髄性アストロサイトの関与を調節することができる^４。加えて、アストロサイト媒介神経炎症は、慢性疼痛の維持の根底にある重要なメカニズムである^４。アストログリオパチーの原因となる特定の経路の標的化は、慢性疼痛のための治療を開発するための新規アプローチを提示する。

【0369】

複数の細胞型が、侵害受容ニューロンと相互作用し、サテライトグリア細胞、Ｔ細胞、オリゴデンドロサイトおよびミクログリアを含む、異なるシグナル伝達メカニズムを通して疼痛の病態形成に寄与する^５。ＣｅｌｌＲＥＡＤＲを使用して、特定のグリア細胞型を標的化することによって、慢性疼痛処置のための神経－グリア相互作用がモジュレートされる。

【0370】

サテライトグリア細胞は、末梢神経系の後根神経節に局在化し、Ｋｉｒ４．１およびＦＡＢＰ７などのマーカーを発現する^６。ＦＡＢＰ７のためのＲＮＡセンサーは、サテライトグリア細胞を標的化する。カリウムチャネルＫｉｒ４．１は、病理学的疼痛状態において下方調節される^６。Ｋｉｒ４．１の機能は、ＦＡＢＰ７＋サテライトグリア細胞に対するカリウムチャネルを発現することによって修復される。

【0371】

ｖＧｌｕＴ１は、病理学的状態の脊髄において下方調節され、グルタミン酸受容体の過剰活性化および慢性疼痛をもたらす^４。アストロサイトを標的化するためのＡｌｄｈ１ｌ１（アストログリア特異的マーカー）およびサテライトグリア細胞を標的化するためのＦａｂｐ７のためのＲＮＡセンサー。小胞状グルタミン酸トランスポーターｖＧｌｕＴ１は、Ａｌｄｈｌ１＋アストロサイトに発現される。とりわけ、くも膜下腔内経路は、ＤＲＧの感覚ニューロンだけでなく、ＤＲＧのサテライトグリア細胞および脊髄のアストロサイトを標的化し得る。

【0372】

ＣｅｌｌＲＥＡＤＲは、くも膜下腔内送達後、ＤＲＧのサテライトグリア細胞および脊髄のアストロサイトを特異的に標識化するための有用なアプローチである。さらにまた、ＣｅｌｌＲＥＡＤＲに基づくアプローチは、病理学的状態のサテライトグリア細胞およびアストロサイトの機能を修復することができ、慢性疼痛の長期の救済および反転をもたらす。
参考文献

【化6】

【0373】

（実施例２４）
アルツハイマー病の細胞特異的介入
疾患および臨床背景
神経炎症は、神経変性疾患の最も一般的な形態であるアルツハイマー病（ＡＤ）において観察されるように、神経変性に関与する中心的なメカニズムである、１、２。ＡＤに対する最も強い遺伝的リスク因子であるアポリポタンパク質Ｅ４（ＡＰＯＥ４）は、アミロイド－βプラーク、神経原線維のタウ濃縮体、および神経炎症を含む、ＡＤの主要な病理学的特徴と相互作用することによって、疾患の発生および進行に直接影響を及ぼす、１、２。基礎条件下のＣＮＳでは、アストロサイトは、ほとんどのａｐｏＥを産生し、脳損傷または神経変性の状況下では、ＡＰＯＥ発現は、ミクログリアにおいて、強く上方調節される。

【0374】

脳における２つの主要な免疫細胞であるミクログリアおよびアストロサイトは、免疫警戒状態で存在し、免疫学的防御、および神経細胞の健康を促進するハウスキーピング機能を提供する。疾患状態下で、これらの免疫細胞は、代謝および免疫調節経路の調節において徐々に機能不全になり、それによって、慢性炎症誘発性神経変性を促進し、この病理学的プロセスの重要な構成要素は、ミクログリア媒介シナプスファゴサイトーシスの上昇である、１、２。

【0375】

アストロサイト由来ａｐｏＥ粒子は、かなり大きく、したがって、ミクログリアによって分泌されたａｐｏＥと比較して、より多くの脂質を含有する。単独でまたはＣ１ｑなどの他の分子とともにのいずれかでのアストロサイト分泌ａｐｏＥ４は、ミクログリア応答を活性化するための特異的ミクログリア受容体のためのオプソニンとしての役割を果たし得る。ＡＤのＰ３０１Ｓタウマウスモデルでは、アストロサイトＡＰＯＥ４の除去により、タウ媒介神経変性が著しく低減され、リン酸化タウ（ｐＴａｕ）病理、ならびにニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアにおける疾患関連遺伝子シグネチャーを減少させた、３。アストロサイトＡＰＯＥ４の除去は、さらに、タウ誘発性シナプス喪失およびシナプスエレメントのミクログリアファゴサイトーシスを減少させ、シナプス変性におけるアストロサイトａｐｏＥについての重要な役割を示唆する、３。

【0376】

標的細胞型
脳、特に大脳皮質のアストロサイトおよびミクログリア。マーカー遺伝子／ＲＮＡは以下を含む。
－アストロサイト：アルデヒドデヒドロゲナーゼファミリー１メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）
－ミクログリア：Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）

【0377】

標的遺伝子
脳のアストロサイトおよび／またはミクログリアにおいて下方調節を達成する、ＡｐｏＥ４ ＲＮＡに対するｓｈＲＮＡ。

【0378】

図２１は、ｒｅａｄｒＲＮＡの第１のモジュールが、ｈＳｙｎプロモーターとそれに続くスペーサー、上記の標的ＲＮＡの１つに特異的なＳＥＳ ＲＮＡ、およびｔＴＡ２転写活性化因子によって駆動され、その際に、ＡＤＡＲ編集が、翻訳され、ｒｅａｄｒＲＮＡの第１のモジュールの上流に位置するＴＲＥに結合し、これが、ＡｐｏＥ４ ＲＮＡに相補的な低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現を駆動する、構築物を図示する。

【0379】

送達
ＡＡＶベクターは、Ｐ３００タウマウスモデルにおける最初の試験のために使用され、Wang and Holtzman Neuron 2021の結果を概括する、すなわち、タウ媒介神経変性およびシナプスファゴサイトーシスの低減を実証する。

【0380】

ＡＤ患者では、前臨床段階から初期および後期段階への進行に沿って、アミロイドの沈着は、側頭底部および前頭内側領域で開始し、続いて、残りの連合新皮質、一次感覚運動野、および側頭葉内側部に、最終的に、線条体に影響を及ぼす、４、５。ＡＡＶベクターは、早期段階の患者の側頭底部および前頭内側領域に注射されて、これらの領域のアストロサイトおよびミクログリアからのＡｐｏＥ４産生が低減される。

【0381】

予想される結果
側頭底部および前頭内側領域のアストロサイトおよびミクログリアからのＡｐｏＥ４産生の低減は、神経炎症応答を弱め、ミクログリアによるタウ媒介神経変性およびシナプスファゴサイトーシスに対して保護する。同時に、これらの処置は、ＡＤの進行を弱めるか、または防止する。
参考文献

【化7】

【化8】

【0382】

表６ （ｉ）原理証明実験のための標的化外因性転写物、（ｉｉ）ｒｅａｄｒＲＮＡ、または（ｉｉｉ）エフェクター遺伝子、例えば、トランス活性化因子をコードして、（物理的に連結されていないが）応答性の遺伝子をコードするプラスミドが本明細書に記載される。

【表6】

【0383】

エフェクターとしてのＵＧＴ１Ａ１遺伝子

【化9】

【化10】

【0384】

エフェクターとしてのＶＥＧＦＡコード配列

【化11】

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【表7-4】

【表7-5】

【表7-6】

【表7-7】

【表7-8】

【表7-9】

【表7-10】

【表7-11】

【表7-12】

【表7-13】

【表7-14】

【表7-15】

【表7-16】

【表7-17】

【表7-18】

【表7-19】

【表7-20】

【表7-21】

【表7-22】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】