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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】慢性創傷治癒のための手段および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241106BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241106BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P17/02 ZNA
A61P9/00
A61P43/00 121
A61K35/12
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525682
(86)(22)【出願日】2022-10-26
(85)【翻訳文提出日】2024-06-27
(86)【国際出願番号】 EP2022079987
(87)【国際公開番号】W WO2023073046
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/273,504
(32)【優先日】2021-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514185600
【氏名又は名称】ブイアイビー ブイゼットダブリュ
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＢ ＶＺＷ
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｚａｎｎｅ Ｔａｓｓｉｅｒｓｔｒａａｔ １，９０５２ Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
(71)【出願人】
【識別番号】514185611
【氏名又は名称】ユニベルシテイト ゲント
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＧＥＮＴ
【住所又は居所原語表記】Ｓｉｎｔ－Ｐｉｅｔｅｒｓｎｉｅｕｗｓｔｒａａｔ ２５， Ｂ－９０００ Ｇｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラヴィチャンドラン，コディマンガラム
(72)【発明者】
【氏名】マサリディ，ソフィア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZA89
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZA89
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、組織再生の分野、特に創傷、より具体的には慢性創傷などの皮膚病変の分野に関する。本発明は、創傷治癒組成物を提供する。具体的には、本発明は、例えば糖尿病性創傷などの慢性創傷を処置するために使用するための、抗体、shRNA、siRNA、ロックド核酸、ペプチド核酸、およびモルホリノなどのSlc7a11トランスポータを標的とする分子を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せ。
【請求項2】
医薬品としての使用のための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せ。
【請求項3】
哺乳動物における創傷治癒を処置するための使用のための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せ。
【請求項4】
哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するための使用のための、Slc7a11の阻害剤。
【請求項5】
阻害剤が、Slc7a11を標的とする、小化合物か、抗体か、ギャップマーか、shRNAか、合成siRNAか、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、もしくはモルホリノから選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドか、CRISPRか、TALENか、またはジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、請求項4に記載の使用のための阻害剤。
【請求項6】
該慢性創傷治癒が、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈の創傷治癒、または圧迫創傷である、請求項4または請求項5に記載の使用のための阻害剤。
【請求項7】
請求項5において定義されるとおりのSlc7a11の阻害剤と、GDF-15とを含む、組成物。
【請求項8】
医薬品としての使用のための、請求項7に記載の組成物。
【請求項9】
哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するための使用のための、請求項7に記載の組成物。
【請求項10】
哺乳動物における慢性創傷を処置するための使用のための、請求項4または請求項5において定義されるとおりの阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項11】
該慢性創傷治癒が、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈の創傷治癒、または圧迫創傷である、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項12】
請求項1において定義されるとおりの組合せを含む、医薬組成物。
【請求項13】
創傷治癒を処置するための使用のための、請求項12に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野
本発明は、組織再生の分野、特に創傷、より具体的には慢性創傷などの皮膚病変の分野に関する。本発明は、創傷治癒組成物を提供する。具体的には、本発明は、例えば糖尿病性創傷治癒などの慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11トランスポータを標的とする分子を提供する。
本発明は、組織再生の分野、特に創傷、より具体的には慢性創傷などの皮膚病変の分野に関する。本発明は、創傷治癒組成物を提供する。具体的には、本発明は、例えば糖尿病性創傷治癒などの慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11トランスポータを標的とする分子を提供する。
【背景技術】
【0002】
本発明の序論
体内の数十億個の細胞は、毎日アポトーシスによってターンオーバーされる。次いで、これらの死亡細胞は、「エフェロサイトーシス」1のプロセスを介して食細胞によって認識され、かつ除去される。生理学的な観点から、エフェロサイトーシスの失敗は、慢性炎症状態をもたらす消散しない炎症に関連している2、3、4、5、6。樹状細胞は、ほぼ全ての組織に存在する食細胞の不均一な群である。樹状細胞は、食作用および病原体認識受容体のバッテリーを提示し、自然免疫および適応免疫の調節を介して組織の恒常性を維持するのを助ける7。樹状細胞によるアポトーシス細胞の取り込みは長い間認識されてきたが、これは主に、抗原提示および適応免疫の産生との関連で研究されてきた8、9、10、11、12。マクロファージと比較して、樹状細胞におけるエフェロサイトーシスの分子調節、および炎症を制限することへの樹状細胞のエフェロサイトーシスの寄与については、あまり知られていない。
体内の数十億個の細胞は、毎日アポトーシスによってターンオーバーされる。次いで、これらの死亡細胞は、「エフェロサイトーシス」1のプロセスを介して食細胞によって認識され、かつ除去される。生理学的な観点から、エフェロサイトーシスの失敗は、慢性炎症状態をもたらす消散しない炎症に関連している2、3、4、5、6。樹状細胞は、ほぼ全ての組織に存在する食細胞の不均一な群である。樹状細胞は、食作用および病原体認識受容体のバッテリーを提示し、自然免疫および適応免疫の調節を介して組織の恒常性を維持するのを助ける7。樹状細胞によるアポトーシス細胞の取り込みは長い間認識されてきたが、これは主に、抗原提示および適応免疫の産生との関連で研究されてきた8、9、10、11、12。マクロファージと比較して、樹状細胞におけるエフェロサイトーシスの分子調節、および炎症を制限することへの樹状細胞のエフェロサイトーシスの寄与については、あまり知られていない。
【0003】
身体の最大の器官として、我々の皮膚は、極端な温度、水分喪失、紫外線、微生物的および化学的侵襲、ならびに損傷から内部組織を保護するバリアとして作用する。皮膚損傷後の組織修復は、創傷部位での食細胞によるアポトーシス細胞のクリアランスに関与し、次に、炎症の解消およびバリアの回復を助ける13、14。糖尿病、老化、または血管疾患に関連するものなどの慢性の非治癒性創傷は、生活の質に深刻な影響を及ぼし、感染の有意なリスクをもたらす15。健康な皮膚における恒常性は、組織に増殖する樹状細胞、マクロファージ、およびT細胞を包含する、免疫細胞によって維持される。表皮に常在するランゲルハンス細胞(Langerhans cell)(LC)は、真皮中の樹状細胞と共に、恒常性の間に死細胞または病原体を捕捉し、それらをエフェクターT細胞へ提示するための監視状況にある16、17。皮膚損傷後、常在するまたは動員されたマクロファージ18、19および好中球20は、創傷治癒動力学(dynamics)と正および負に関係している;しかしながら、損傷修復に対する樹状細胞の寄与の知識は限られている。
【0004】
慢性創傷とは、正常な、整然とした、かつ適時の一連の修復を通して進行することができないもの、または修復プロセスが3ヶ月後に解剖学的および機能的完全性を回復することができないものである。米国ではおよそ500万人の患者(patients)が慢性創傷に罹患している。長寿、肥満、および糖尿病の増加に伴い、慢性創傷の問題が増加し、有意な罹患率、仕事からの時間損失、および膨大な医療費をもたらしている。American Diabetes Associationによると、糖尿病を有する人々の25％が生涯に創傷の問題を患い、およそ82,000回の非外傷性創傷のための肢切断が2002年に糖尿病患者を有する人々において実施された。The Agency for Health Care Policy and Researchは、圧迫潰瘍への創傷ケアは、入院、耐久医療品、介護ホームでのケア、医師、および輸送に対して、年間2,000億ドルを使用すると報告している。糖尿病性創傷の外科的処置は依然として困難であり、しばしば不充分であり、それら患者の高い罹患率につながる。一部の慢性創傷は治癒するのに数十年かかることがあり、したがってうつ病などの二次的な状態に寄与する。糖尿病性潰瘍発症後の5年死亡率はおよそ40％である。創傷治癒の理解における最近の進歩にもかかわらず、創傷治癒障害の根底にある分子機序は完全には理解されておらず、現在利用可能な方法もまた限られた有効性を示している(Perez-Favila A.et al(2019)Medicina(Kaunas)55:714)。
【発明の概要】
【0005】
本発明の概要
本発明では、樹状細胞がアポトーシス細胞を貪食する際に樹状細胞の遺伝子プログラムがどのように修飾されるかを理解しようとしながら、本発明者らは、樹状細胞媒介性エフェロサイトーシスに対する新規ブレーキとしての原形質膜タンパク質Slc7a11の役割を偶然発見し、皮膚性創傷治癒に対するその関連性を明らかにした。本発明者らは、Slc7a11の薬理学的阻害剤、Slc7a11のsiRNAノックダウン、または樹状細胞によるアポトーシス細胞取り込みを増強するSlc7a11の遺伝子欠失の使用が、哺乳動物における創傷閉鎖の増加をもたらすことを示す。
本発明では、樹状細胞がアポトーシス細胞を貪食する際に樹状細胞の遺伝子プログラムがどのように修飾されるかを理解しようとしながら、本発明者らは、樹状細胞媒介性エフェロサイトーシスに対する新規ブレーキとしての原形質膜タンパク質Slc7a11の役割を偶然発見し、皮膚性創傷治癒に対するその関連性を明らかにした。本発明者らは、Slc7a11の薬理学的阻害剤、Slc7a11のsiRNAノックダウン、または樹状細胞によるアポトーシス細胞取り込みを増強するSlc7a11の遺伝子欠失の使用が、哺乳動物における創傷閉鎖の増加をもたらすことを示す。
【0006】
一側面において、本発明は、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞とを含む組合せを提供する。
更に別の側面において、本発明は、医薬品として使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞とを含む組合せを提供する。
更に別の側面において、本発明は、医薬品として使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞とを含む組合せを提供する。
【0007】
更に別の側面において、本発明は、創傷治癒を処置するために使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞とを含む組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤を提供する。
別の側面において、本発明は、哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤を提供する。
【0008】
別の側面において、本発明は、慢性創傷治癒を処置するために使用するための阻害剤を提供し、ここで、阻害剤は、Slc7a11に結合する小化合物か、抗体結合Slc7a11か、Slc7a11のmRNAに結合するギャップマーか、Slc7a11のmRNAに結合するshRNAか、Slc7a11のmRNAに結合する合成siRNAか、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)、ペプチド核酸(peptide nucleic acid)(PNA)、もしくはモルホリノから選択されるslc7a11のmRNAを結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドか、Slc7a11遺伝子を標的とするCRISPRか、TALENか、またはジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。
【0009】
特定の側面において、該慢性創傷治癒は、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈の創傷治癒、または圧迫創傷である。
別の側面において、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書において前に定義されたSlc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、慢性創傷治癒を処置するために使用するための、本明細書において前に定義されたSlc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書において前に定義されたSlc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、慢性創傷治癒を処置するために使用するための、本明細書において前に定義されたSlc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
【0010】
別の側面において、本発明は、慢性創傷を処置するために使用するための、本明細書において前に定義された阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈創傷治癒、または圧迫創傷などの慢性創傷治癒を処置するために使用するための、本明細書において前に定義された阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈創傷治癒、または圧迫創傷などの慢性創傷治癒を処置するために使用するための、本明細書において前に定義された阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
図の説明文
【図1a-1】
図1: Slc7a11は、アポトーシス細胞の樹状細胞貪食に対する破壊として作用する。 a、アポトーシスヒトJurkat細胞、生細胞、またはプレーンなビーズ(2.0μm)が供給された、骨髄由来樹状細胞(bone-marrow derived dendritic cell)(BMDC)による食作用アッセイの概略図(左)。RNAseqは、標的との共培養の4時間後に、選別された貪食BMDCに対して実施された。ヒストグラムは、エフェロサイトーシス性(efferocytic)DCにおける黄緑色(ビーズ)およびCypHer5E(細胞)の蛍光を例示する。
【図1a-2】ヒストグラムは、エフェロサイトーシス性DCにおける黄緑色(ビーズ)およびCypHer5E(細胞)の蛍光を例示する。
【図1b】b、c、樹状細胞におけるエフェロサイトーシス後に特有に調節されたトランスポータ活性に関連する遺伝子が、機能性(b)によって分類され、タンパク質ファミリー(c)によってグループ分けされた。データは条件ごとに4回の独立した実験的反復からのものである。
【0012】
【図1c】b、c、樹状細胞におけるエフェロサイトーシス後に特有に調節されたトランスポータ活性に関連する遺伝子が、機能性(b)によって分類され、タンパク質ファミリー(c)によってグループ分けされた。データは条件ごとに4回の独立した実験的反復からのものである。
【図1d】d、SLC7ファミリー遺伝子発現は、aのように、アポトーシス細胞取り込みに対するプレーンビーズの食作用後に、qRT-PCRによって測定された。明確にするために、Slc7a5およびSlc7a11は青色で強調表示されている。データは、条件ごとに3回の生物学的反復、****P=0.0001、Sidakの多重比較検定による二元配置分散分析(ANOVA)を表す。ND、検出されず。
【0013】
【図1e-g】e、Slc7a11 siRNA標的化は、Incucyteによる生細胞画像化分析で例示されるように、pHrodo Green染色アポトーシス細胞のエフェロサイトーシスを増加させる。 f、Slc7a11の薬理学的阻害剤であるエラスチンによる処置は、経時的に示されるように、樹状細胞によるアポトーシス細胞取り込みを促進する。 g、Slc7a11 WTマウスおよびSlc7a11 KOマウス、ならびに骨髄または脾臓から単離された食細胞の概略図。
【図1h】h、エラスチンまたはビヒクルで処置したSlc7a11 WTおよびSlc7a11 KO BMDCによるエフェロサイトーシスの動態学(Kinetics)。全ての生細胞画像化データは、平均±SEM、n=4～8、****p＜0.00001;Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析として表現される。
【0014】
【図1i】i、TAMRA標識またはCypHer5E標識されたアポトーシスJurkat細胞の食作用のパーセンテージは、対照と、Slc7a11ヌルBMDCとの間で比較された(左パネル)。CypHer5E標識アポトーシスJurkat細胞の食作用のパーセンテージは、対照と、それぞれの遺伝子型を有するマウスの脾臓から以前に単離されたSlc7a11ヌルcDCとの間で比較された。樹状細胞は、アポトーシス標的と共に1:5の食細胞:標的比で4時間インキュベートされた。n＝3～5回の生物学的反復からのデータ、*p＜0.05;**p＜0.01;Dunnettの多重比較検定による一元配置分散分析。 全ての生細胞画像化データ(e、f、h)は、平均±SEM、n=4～8、****p＜0.00001;Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析として表現される。ABC、ATP結合カセットトランスポータ;GPCR、Gタンパク質共役受容体。
【0015】
【図2a-c】
図2: Slc7a11遮断の状況における加速された皮膚創傷治癒。 a、肺、脾臓、および皮膚由来の樹状細胞間の差次的に発現されたSLC(DE)の相対的発現レベルを視覚化するための六角形の三重図表(Tri-wise diagram)(左)。差次的に発現された(Differentially expressed)(DE)SLC遺伝子(オレンジ色)および差次的に発現されなかった(灰色)が示されている。近接は、複数の集団におけるアップレギュレーションを表し、原点からの距離は、このアップレギュレーションの強さを表す。32倍以上発現した遺伝子は外側のグリッド線にプロットされる。ビン、およびそれらが最も発現されるDCサブタイプにグループ分けされた45個のDE Slc遺伝子(よって、全てオレンジ色のドット)を描写するローズプロット(右)。 b、Slc7a11欠損同腹子および対照同腹子の耳から富化させた皮膚食細胞は、アポトーシスJurkat細胞と共にインキュベートされ、食作用は、それぞれの細胞型で評定された。(群あたりn=5;*p＜0.05、独立t検定)。 c、d、創傷(創傷後d2)皮膚からの皮膚切片におけるCD11c＋食細胞(赤色)およびSlc7a11(緑色)の局在化(c)。点線は挿入図を表す。核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色)で染色された。スケールバー、10μm。開裂型カスパーゼ-3陽性(緑色)死体を捕捉するCD11c＋食細胞(赤色)(d)。核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色)で染色された。スケールバー、50μm。
【0016】
【図2d】c、d、創傷(創傷後d2)皮膚からの皮膚切片におけるCD11c＋食細胞(赤色)およびSlc7a11(緑色)の局在化(c)。点線は挿入図を表す。核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色)で染色された。スケールバー、10μm。開裂型カスパーゼ-3陽性(緑色)死体を捕捉するCD11c＋食細胞(赤色)(d)。核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色)で染色された。スケールバー、50μm。
【図2e-f】e、Slc7a11の発現を強調する、非病変(non-lesional)(NL)および病変(lesional)(L)皮膚から単離された、全生皮膚細胞の注釈付きUMAPクラスタリング(方法を参照のこと)。右パネルは、scRNAseq分析後に病変皮膚でクラスタ化した細胞のtSNEプロットを描写する。 f、指し示された遺伝子についてRT-qPCRによって分析された、未創傷マウスおよび創傷マウスの全皮膚溶解物からのmRNA(1条件あたりn=3～4;*p＜0.05;****p＜0.0001、独立t検定)。
【0017】
【図2g】g、0日目～2日目に投与されたエラスチンまたはDMSOビヒクルと一緒に、0日目にアポトーシス細胞(Ap.cells)の創傷部位へ単回投与することからなるエラスチンまたはビヒクルレジメンで処置した、野生型マウスの創傷治癒動力学。データは、8mmのパンチ生検による全層創傷後の、群あたりn=8のマウスを用いた4つの独立した実験のうち1つを示す(*p＜0.05;***群間でp＜0.001;多重比較による二元配置分散分析)。
【図2h-i】h、i、創傷後の異なる日におけるエラスチンまたはビヒクルレジメンでのマウス由来の創傷のH&E染色皮膚切片。スケールバー:100μm(h、)アポトーシス開裂型カスパーゼ-3＋細胞の定量化(条件あたりn=6～7マウス;(*独立t検定でp＜0.5)。
【図2j-k】j、創傷修復の異なる段階におけるエラスチンレジメンの有効性を比較する、創傷治癒動態学(群あたりn=10のマウス);****p＜0.0001;多重比較による二元配置分散分析。 k、全層創傷後のSlc7a11 WTマウスとSlc7a11 KOマウスとを比較した創傷治癒動力学。マウスは、創傷時にアポトーシス細胞の単回投与を受けた(群あたりn=6、創傷後の表示日に群間で*p＜0.05;多重比較による二元配置分散分析)。
【0018】
【図3a-b】
図3: 解糖系およびグリコーゲンが、燃料増強されたエフェロサイトーシスを貯蔵する a、アポトーシス細胞を貪食するSlc7a11欠損樹状細胞のRNA-seq分析の概略図。Slc7a11欠損または対照BMDCは、TAMRA標識アポトーシスJurkat細胞と共に4時間にわたり培養された。食細胞が収集され、TAMRA＋細胞(すなわち、貪食者(engulfers))がRNA-seq分析のために溶解緩衝液へと直接選別された。輪郭プロット画像は4つの独立した実験の代表である。 b、WT型貪食者と比較してSlc7a11 KO貪食者において調節される、差次的に発現される遺伝子の経路分析。糖新生および糖尿病/肥満の転写プログラムに該当するいくつかの遺伝子(太字で描写され、灰色の四角で強調されている)が、更なる分析のために選択された。データは3～4回の独立した実験反復からのものである。
【0019】
【図3c-d】c、エラスチンで処置したWTマウスから、またはSlc7a11 KOマウスからの樹状細胞集団の溶解物中のグリコーゲンの測定。(*p＜0.05;**p＜0.01;独立t検定、またはTukeyの多重比較検定による一元配置分散分析を介する)。結果は、WTまたはDMSO処置樹状細胞からの倍率変化(fold change)(FC)として表現される。ns、有意でない。 d、CP-91149によって阻害されたグリコーゲン分解工程を指し示す、グリコーゲン代謝経路の概略図(左)。エラスチンもしくはCP-91149または両方で処置したBMDCのグリコーゲンレベルに対する影響(中央パネル)。エラスチンまたはエラスチン＋CP-91149処置後のエフェロサイトーシスの動態学(右)。DMSOはビヒクル対照として使用され、CytoDはエフェロサイトーシスの陰性対照として使用された。全ての生細胞画像化データは、平均±SEM、n=3～5(*p＜0.05;****p＜0.00001.Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析)として表現される。
【0020】
【図3e】e、アポトーシス細胞クリアランスおよびSlc7a11阻害中の樹状細胞における好気性解糖の増加。解糖およびOXPHOSは、休止樹状細胞において、またはSeahorse XF)を用いるエフェロサイトーシスの間に、細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)を介して測定された。データは、n=4の平均値±SEMを表す;*独立t検定またはTukeyの多重比較検定による二元配置分散分析により、*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001)。
【図3f】f、それぞれの阻害剤を用いた好気性解糖経路、および指し示された解糖阻害剤で処置されたBMDCによるエフェロサイトーシスの動態学の概略図。全ての生細胞画像化データは、平均±SEM、n=4～5(**p＜0.01;****p＜0.00001.Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析)として表現される。
【0021】
【図4a-c】
図4: Slc7a11阻害およびGDF15は糖尿病性皮膚創傷治癒を促進する a、正常血糖(B6)マウスに対する糖尿病(db/db)マウスにおける、皮膚性創傷治癒の遅延。(創傷後のそれぞれの日に群間で、群あたりn=11、****p＜0.0001;多重比較による二元配置分散分析)。 b、全皮膚溶解物が、WT、db/db、およびGDF15 KOマウスにおける未創傷および創傷(創傷後4日)から調製され、mRNAが単離され、続いて、Slc7a11のRT-qPCR分析を行った(群あたりn=4～6;データは、群あたりの未創傷皮膚におけるSlc7a11発現に対する倍率変化として提示される)。 c、エラスチンは単独で糖尿病マウスの皮膚創傷治癒を改善する。水溶性イミダゾールケトンエラスチン(エラスチン)、またはビヒクル対照用のDMSO(群あたりn=7～8マウス、*創傷後のそれぞれの日数に群間でp＜0.05;多重比較による二元配置分散分析)で処置した、db/dbマウスの創傷治癒動力学。
【0022】
【図4d-f】d、エラスチンレジメンは、糖尿病マウスの皮膚創傷治癒を加速させる。エラスチンレジメン(またはビヒクル)で処置したdb/dbマウスの創傷治癒動力学。示されるデータは、8mmのパンチ生検による全層創傷後の群あたりn=7～8のマウスを用いた3つの独立した実験のうち1つを表す(創傷後の表示日に群間で*p＜0.05または**p＜0.01;多重比較による二元配置分散分析)。(Ap.Cellsはアポトーシス細胞を指す) e、エラスチンを介したSlc7a11阻害は、糖尿病マウス由来の樹状細胞におけるエフェロサイトーシスを増強する。エフェロサイトーシスデータは、平均±SEMとして表現され、n=4～7、***p＜0.001 ****p＜0.0001である。Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析。 f、エラスチンまたはビヒクルで処置したdb/dbマウスの創傷皮膚における開裂型カスパーゼ-3について陽性に染色される、創傷生検内のアポトーシス細胞の数の定量化(条件あたりn=4マウス;(独立t検定で*p＜0.5)。
【0023】
【図4g-h】g、全層創傷後のエフェロサイトーシス性Slc7a11 KOおよび対照樹状細胞からの上清で処置した、野生型マウス(群あたりn=10)の創傷治癒動力学(*p＜0.05、創傷後の表示日の群間;多重比較による二元配置分散分析)。全ての創傷サイズは、初期創傷サイズのパーセンテージとして表現される。データは平均±SEMを表す。 h、(左)TGFスーパーファミリーに属する遺伝子の調節を示すヒートマップ。データは、条件ごとに3回の独立した実験的反復からのものであり、列によってスケーリングされ、0を中心とするzスコアがもたらされる。(右)GDF-15分泌は、アポトーシス標的またはアポトーシス標的単独とのインキュベーションの12時間後に、WTおよびSlc7a11-KOエフェロサイトーシス性樹状細胞の上清中において、ELISAによって評価された。n=4、*p＜0.05 ***p＜0.001。Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析。
【0024】
【図4i-k】i、ELISAによる未創傷皮膚溶解物および創傷皮膚溶解物(創傷後の2日および8日)中のGDF15レベル。 j、全層創傷後のGDF15 KOマウスと同腹子対照マウスとを比較する創傷治癒動力学(群あたりn=16、**p＜0.01、独立t検定による2群間)。 k、糖尿病マウスの創傷皮膚への組換えGDF15の局所投与は、治癒をブーストする。(群あたりn=10～11、*p＜0.05、創傷後の表示日の群間;多重比較による二元配置分散分析)。
【0025】
【0026】
【図5c-f】c、樹状細胞におけるSlc7a5 siRNA標的化は、Incucyte生細胞画像化によって評価されるように、アポトーシス細胞取り込みに有意に影響しない。データはn=4の平均±SDとして表現される。 d、異なる濃度のSlc7a5阻害剤であるJPH-203で処置した樹状細胞による、TAMRA標識アポトーシスJurkat細胞のエフェロサイトーシス。(条件あたりn=2)。 e、3μM JPH-203で処置したBMDCによるエフェロサイトーシスの動態学。生細胞画像化データは、n=3である平均±SEMとして表現される。 f、Slc7a11 KOおよびWT樹状細胞によるエフェロサイトーシス後の、TAMRA(pH非感受性)およびCell Trace Violet(pH感受性)共標識アポトーシス標的の分解の測定。樹状細胞は、アポトーシス標的と共に1:5の食細胞:標的比で4時間インキュベートされた。
【0027】
【図5g-h】g、エラスチン処置の有無にかかわらず、Slc7a11 WTおよびSlc7a11 KO骨髄由来マクロファージによるエフェロサイトーシスの動態学。全ての生細胞画像データは、平均±SEMとして表現され、n=4、ns:有意ではない。Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析。 h、エラスチンを介したSlc7a11阻害後の腹膜マクロファージによるエフェロサイトーシス。(条件あたりn=3;ns:有意でない、独立t検定あり)。
【0028】
【図6a-d】
図6: フェロトーシス誘導剤およびDCエフェロサイトーシス a、エラスチン処置の有無にかかわらず異なる時点で測定された樹状細胞によるE.coli生体粒子の食作用。 b、フェロトーシス誘導剤ML-162は樹状細胞によるエフェロサイトーシスを増強しない。生細胞画像化データは、n=4～6、***p＜0.001;****p＜0.0001である、平均±SEMとして表現される。Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析)。 c、エラスチンで処置した樹状細胞におけるグルタチオンレベルの測定。 d、Sytox Green蛍光を測定することによる樹状細胞におけるエラスチン薬物細胞傷害性の評価。
【図6e-f】e、フェロトーシス誘導剤で処置した樹状細胞における脂質過酸化およびROSの測定。 f、グルタミン酸で処置した樹状細胞によるエフェロサイトーシスの動態学。生細胞画像化データは、n=4～6、**p＜0.01である、平均±SEMとして表現される。Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析)。
【0029】
【図7b-e】b、Slc7a11陽性(赤色)細胞を描写する、未創傷PDGFR-GFPマウスからの皮膚切片の免疫蛍光画像。核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色)で染色された。スケールバー、50μm。 c、病変皮膚において生じる自然免疫細胞集団の注釈。 d、病変皮膚および非病変皮膚の自然免疫細胞におけるSlc7a11発現の頻度。 e、創傷後10日目のエラスチンまたはビヒクルで処置したマウスの創傷の代表的な画像。
【図7f-g】f、全層創傷後のWT(C57B/6)マウスを、創傷の日に8mmのパンチ生検およびアポトーシス標的の単回局所投与(群あたりn=8)、または0日目～2日目のエラスチンのみ(群あたりn=8)と比較した、創傷治癒動力学。 g、エラスチンレジメンに対してRSL3レジメンで処置したWTマウスにおける、創傷後2日目の創傷閉鎖の比較。全てのマウスは、創傷日(群あたりn=7～9、*p＜0.05;**p＜0.01、Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析)に、アポトーシス標的の単回局所投与を受けた。
【0030】
【図8a-1】
図8: Slc7a11 KOエフェロサイトーシス性樹状細胞における遺伝子発現パターン a、代謝およびミトコンドリア機能、タンパク質合成、ER恒常性、転写調節、シグナル伝達、創傷治癒、細胞周期、遊走、および他のトランスポータに関連する遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを示す、エフェロサイトーシス性Slc7a11 KOとWT樹状細胞とを比較するヒートマップ。データは3～4回の独立した実験反復からのものである。Gdf15は、代謝機能および再生の転写プログラムに該当し、赤色で強調表示されている。
【図8a-2】a.代謝およびミトコンドリア機能、タンパク質合成、ER恒常性、転写調節、シグナル伝達、創傷治癒、細胞周期、遊走、および他のトランスポータに関連する遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを示す、エフェロサイトーシス性Slc7a11 KOとWT樹状細胞とを比較するヒートマップ。データは3～4回の独立した実験反復からのものである。Gdf15は、代謝機能および再生の転写プログラムに該当し、赤色で強調表示されている。
【0031】
【0032】
【図9c】c、指し示された阻害剤DONまたはUK5099で処置したWT BMDCによるエフェロサイトーシスの動態学。全ての生細胞画像化データは、n=3の平均±SEMとして表現される(*p＜0.05;ns:Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析で有意でない)。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明の詳細な記載
本発明は、特定の態様に関して、およびある特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるあらゆる参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当然のことながら、本発明のいずれかの特定の態様に従って必ずしも全ての側面または利点が達成され得るとは限らないことを理解されたい。このようにして、例えば、当業者は、本発明が、本明細書において教示または示唆され得る他の側面または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される1つの利点または利点群を達成または最適化するように具体化または行われ得ることを認識するであろう。本発明は、その特徴および利点と共に、添付の図面と併せて読まれるとき以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。本発明の側面および利点は、本明細書において以下に記載される態様(複数可)を参照して明らかになり、解明されるであろう。この明細書を通じた「一態様」または「態様」への言及は、態様に関して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも1つの態様に包含されることを意味する。このようにして、この明細書全体の様々な箇所における「一態様において」または「態様において」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ態様を指しているわけではないが、そうであり得る。同様に、本発明の例示的な態様の説明において、本発明の様々な特徴は、本開示を合理化し、様々な本発明の側面の1以上の理解を助ける目的で、単一の態様、図、またはその説明にまとめられることがあることを理解されたい。しかしながら、この開示方法は、特許請求される発明が各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。
本発明は、特定の態様に関して、およびある特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるあらゆる参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当然のことながら、本発明のいずれかの特定の態様に従って必ずしも全ての側面または利点が達成され得るとは限らないことを理解されたい。このようにして、例えば、当業者は、本発明が、本明細書において教示または示唆され得る他の側面または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される1つの利点または利点群を達成または最適化するように具体化または行われ得ることを認識するであろう。本発明は、その特徴および利点と共に、添付の図面と併せて読まれるとき以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。本発明の側面および利点は、本明細書において以下に記載される態様(複数可)を参照して明らかになり、解明されるであろう。この明細書を通じた「一態様」または「態様」への言及は、態様に関して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも1つの態様に包含されることを意味する。このようにして、この明細書全体の様々な箇所における「一態様において」または「態様において」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ態様を指しているわけではないが、そうであり得る。同様に、本発明の例示的な態様の説明において、本発明の様々な特徴は、本開示を合理化し、様々な本発明の側面の1以上の理解を助ける目的で、単一の態様、図、またはその説明にまとめられることがあることを理解されたい。しかしながら、この開示方法は、特許請求される発明が各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。
【0034】
単数名詞を指すとき不定冠詞または定冠詞(例として、「a」または「a」、「the」)が使用される場合、何か他のことが具体的に記載されていない限り、これはその名詞の複数を包含する。「含む(comprising)」という用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素または工程を排除するものではない。更に、明細書および特許請求の範囲における第1、第2、第3という用語、およびその他同種類の用語は、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時系列的な順序を説明するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下において交換可能であり、本明細書において記載される本発明の態様は、本明細書において記載または図示されている以外の順序での動作が可能であることを理解されたい。以下の用語または定義は、単に本発明の理解を助けるために提供される。本明細書において具体的に定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の当業者にとって同じ意味を有する。専門家は、特に、当該技術分野の定義および用語について、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2012);およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)に向けられる。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者(例として、分子生物学、生化学、構造生物学、および/または計算生物学における)によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0035】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成類似体を指すために本明細書において更に互換的に使用される。「ペプチド」はまた、実例としてはトリプシン消化後の、その元のタンパク質に由来する部分アミノ酸配列とも称されてもよい。したがって、これらの用語は、1以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーと、天然に存在するアミノ酸ポリマーと、に適用される。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化、およびアセチル化などのポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。アミノ酸配列および修飾に基づいて、ポリペプチドの原子または分子の質量または重量は、(キロ)ダルトン(kDa)で表される。「タンパク質ドメイン」は、タンパク質中の別個の機能的および/または構造的単位である。通常、タンパク質ドメインは、特定の機能または相互作用を担い、タンパク質の全体的な役割に寄与する。ドメインは、種々の生物学的状況で存在してもよく、ここで類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質において見出されることができる。
【0036】
「単離された」または「精製された」とは、その天然の状態で通常付随するコンポーネントを実質的または本質的に含まない材料を意味する。
【0037】
タンパク質の「ホモログ(単数)」、「ホモログ(複数)」は、問題の未修飾タンパク質と比較して、アミノ酸の置換、欠失、および/または挿入を有し、かつそれらが由来する未修飾タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を内包する。本明細書において使用される「アミノ酸同一性」という用語は、配列が比較ウィンドウにわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。このようにして、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両配列において同一のアミノ酸残基(例として、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMetもまた、本明細書において1文字コードで指し示される)が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、その結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算される。本明細書において使用される「置換」または「突然変異」または「バリアント」は、親タンパク質またはその断片のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる1以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置き換えから生じる。タンパク質またはその断片は、タンパク質の活性に実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。
【0038】
世界中で10人に1人に影響を与える糖尿病の主な合併症のうち1つは、慢性の非治癒性創傷の発症である。調節不全の組織修復に寄与する因子は、炎症を持続させる創傷中の死亡細胞の継続的な存在である。本発明では、本発明者らは、膜トランスポータSlc7a11を、死亡細胞が除去されるプロセスである、エフェロサイトーシスに対する新規な分子「ブレーキ」として同定した。本発明では、本発明者らは、Slc7a11阻害が糖尿病性創傷治癒を加速することができることを示す。最初に、アポトーシス細胞を貪食する樹状細胞のトランスクリプトミクスを介して、本発明者らは、Slc7遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーのアップレギュレーションに注目した。その後の機能研究において、シスチン/グルタミン酸アンチポータSlc7a11は、樹状細胞によるアポトーシス細胞取り込みを増強するSlc7a11の薬理学的阻害、siRNAノックダウン、または遺伝子欠失を伴って、エフェロサイトーシスの負の調節因子として出現した。興味深いことに、Slc7a11は皮膚樹状細胞において最も高度に発現され、炎症を起こした皮膚のscRNAseqは、自然免疫細胞におけるSlc7a11のアップレギュレーションを示した。切除皮膚創傷のマウスモデルにおいて、本発明者らは、Slc7a11発現の喪失またはサイレンシングが治癒動力学を加速し、創傷におけるアポトーシス細胞ロードを減少させることを見出した。機構研究は、Slc7a11、グルコース恒常性、および糖尿病の間の関係を指摘した:最初に、Slc7a11欠損樹状細胞は、それらの改善されたエフェロサイトーシス性のためにグリコーゲンストア由来好気性解糖に依存していた;そして、第2に、エフェロサイトーシス性Slc7a11欠損樹状細胞のトランスクリプトミクスは、糖新生および糖尿病に関連する遺伝子を同定した。本発明者らが糖尿病状態に関連する遅延創傷治癒におけるSlc7a11の役割を試験した場合、Slc7a11発現は糖尿病db/dbマウスの皮膚でアップレギュレートされ、Slc7a11阻害はdb/dbマウスの創傷治癒を加速させた。このより速い治癒は、創傷におけるアポトーシス細胞除去の改善、およびエフェロサイトーシス性樹状細胞からのTGF-βファミリーメンバーGDF15の放出に関連していた。まとめると、本発明者らのデータは、エフェロサイトーシスの負の調節因子としてSlc7a11を同定し、この障害物を除去することは、創傷治癒を改善することができ、糖尿病性創傷治癒などの慢性創傷治癒に有意な影響を及ぼすことができる。
【0039】
溶質担体ファミリー7メンバー11(Slc7A11と略す)遺伝子は、システインおよびグルタミン酸に非常に特異的である、ヘテロマーなナトリウム非依存性のアニオン性アミノ酸輸送システムのメンバーをエンコードする。Xc(-)と称されるこのシステムでは、システインのアニオン形態がグルタミン酸と交換で輸送される。Slc7a11の別名は、溶質担体ファミリー7(アニオン性アミノ酸トランスポータ軽鎖、Xc-システム、メンバー11、カルシウムチャネル遮断薬耐性タンパク質CCBR1、アミノ酸輸送system Xc-、XCT、およびシスチン/グルタミン酸トランスポータである。
【0040】
誤解を避けるために、ヒトSlc7a11タンパク質のアミノ酸配列が配列番号1に描写される。
配列番号1-ヒトScl7a11タンパク質のアミノ酸配列
NH2-mvrkpvvstiskggylqgnvngrlpslgnkeppgqekvqlkrkvtllrgvsiiigtiigagifispkgvl qntgsvgmsltiwtvcgvlslfgalsyaelgttikksgghytyilevfgplpafvrvwvelliirpaata vislafgryilepffiqceipelaiklitavgitvvmvlnsmsvswsariqifltfckltailiiivpgvmqlikgqtqnfkdafsgrdssitrlplafyygmyayagwfylnfvteevenpektiplaicismaivtigyvltnvayfttinaeelllsnavavtfserllgnfslavpifvalscfgsmnggvfavsrlfyvasreghlpeilsmihvrkhtplpavivlhpltmimlfsgdldsllnflsfarwlfiglavagliylrykcpdmhrpfkvplfipalfsftclfmvalslysdpfstgigfvitltgvpayylfiiwdkkprwfrimsekitrtlqiilevvpeedkl-COOH
配列番号1-ヒトScl7a11タンパク質のアミノ酸配列
NH2-mvrkpvvstiskggylqgnvngrlpslgnkeppgqekvqlkrkvtllrgvsiiigtiigagifispkgvl qntgsvgmsltiwtvcgvlslfgalsyaelgttikksgghytyilevfgplpafvrvwvelliirpaata vislafgryilepffiqceipelaiklitavgitvvmvlnsmsvswsariqifltfckltailiiivpgvmqlikgqtqnfkdafsgrdssitrlplafyygmyayagwfylnfvteevenpektiplaicismaivtigyvltnvayfttinaeelllsnavavtfserllgnfslavpifvalscfgsmnggvfavsrlfyvasreghlpeilsmihvrkhtplpavivlhpltmimlfsgdldsllnflsfarwlfiglavagliylrykcpdmhrpfkvplfipalfsftclfmvalslysdpfstgigfvitltgvpayylfiiwdkkprwfrimsekitrtlqiilevvpeedkl-COOH
【0041】
このようにして、第1の態様において、本発明は、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せを提供する。
更に別の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せを提供する。
更に別の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せを提供する。
【0042】
更に別の態様において、本発明は、創傷治癒を処置するために使用するための、Slc7a11の阻害剤とアポトーシス細胞との組合せを提供する。
更に別の態様において、本発明は、哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤のために提供する。
更に別の態様において、本発明は、哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤のために提供する。
【0043】
本明細書において使用される場合、「創傷部」という用語は、例えば、急性、遅延性、または治癒困難な創傷、および慢性創傷を包含する、あらゆる組織に対する損傷を包含する。創傷の例には、開放創傷および閉鎖創傷の両方が包含されてもよい。創傷は、例えば、熱傷、切開、切除、裂傷、擦過傷、貫通創傷への穿刺、外科的創傷、挫傷、血腫、圧潰、および潰瘍を包含する。糖尿病ペイシェント(patients)で予想されるように、予想される速度で治癒しない創傷もまた包含される。「創傷部」という用語はまた、例えば、異なる方法(例として、長期の床上安静による褥瘡、および外傷によって誘導される創傷)で開始され、様々な特徴を有する、皮膚性および皮下組織への傷害を包含してもよい。創傷は、創傷の深さに応じて4つのグレードのうち1つへと分類されてもよい:(i)グレードI:上皮に限定された創傷;(ii)グレードII:真皮へと広がる創傷;(iii)グレードIII:皮下組織内へと広がる創傷;および、(iv)グレードIV(または全層創傷):骨が露出している創傷(例として、大転子または仙骨などの骨圧点)。
【0044】
「中間層損傷(partial thickness wound)」という用語は、グレードI～グレードIIIを内包する創傷を指し;中間層損傷の例は、褥瘡、静脈鬱血性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を包含する。本発明は、遅延治癒創傷、不完全治癒創傷、および慢性創傷を包含する、予想される速度で治癒しないタイプの全ての創傷を処置することを企図する。
【0045】
「予想される速度で治癒しない創傷」とは、創傷治癒の遅延または困難(遅延または不完全な治癒創傷を包含する)および慢性創傷を包含する、予想されるまたは典型的な時間枠内で治癒しないあらゆる組織に対する損傷を意味する。予想される速度で治癒しない創傷の例は、糖尿病性潰瘍、血管炎性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、熱傷性潰瘍、感染性潰瘍、外傷誘導性潰瘍、圧迫潰瘍、褥瘡性潰瘍、壊疽性膿皮症に関連する潰瘍形成、および混合性潰瘍などの潰瘍を包含する。予想される速度で治癒しない他の創傷には、裂開創傷(dehiscent wound)が包含される。
【0046】
本明細書において使用される場合、創傷治癒の遅延または困難は、例えば、(1)長期の炎症期、(2)ゆっくりと形成する細胞外マトリックス、および/または(3)上皮化もしくは閉鎖の速度の低減を、少なくとも部分的に特徴とする、創傷が包含されてもよい。
【0047】
「慢性創傷」という用語は、治癒していない創傷を指す。例えば、6週間以内に治癒しない創傷は、慢性的であると考慮される。慢性創傷は、例えば、圧迫潰瘍、褥瘡性潰瘍、糖尿病性足病変および下腿潰瘍を包含する糖尿病性潰瘍、ゆっくりとしたまたは治癒しない静脈性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、動脈性潰瘍、血管炎性潰瘍、熱傷性潰瘍、外傷誘導性潰瘍、感染性潰瘍、混合性潰瘍、および壊疽性膿皮症を包含する。慢性創傷は、完全または部分的な動脈閉塞から生じる潰瘍を含む、動脈性潰瘍であってもよい。慢性創傷は、静脈弁の機能不全および関連する血管疾患にから生じる潰瘍を含む、静脈または静脈鬱血性潰瘍であってもよい。
【0048】
本明細書において使用される場合、「裂開創傷(dehiscent wound)」という用語は、破裂または開裂した開口部、通常は外科的創傷を指す。ある特定の態様において、創傷が離開によって特徴付けられる、予想される速度で治癒しない創傷を処置する方法が提供される。
【0049】
以前に提供された定義に加えて、「創傷」という用語はまた、例えば、異なる方法(例として、長期の床上安静による褥瘡、および外傷によって誘導される創傷)で開始され、様々な特徴を有する、皮膚性および皮下組織への傷害を包含してもよい。
【0050】
特定の態様において、哺乳動物における慢性創傷治癒を処置するために使用するための阻害剤は、slc7a11を標的とする、小化合物か、抗体か、ギャップマーか、shRNAか、合成siRNAか、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、もしくはモルホリノから選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドか、CRISPRか、TALENか、またはジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。
【0051】
更なる態様において、慢性創傷治癒は、糖尿病性創傷治癒、動脈もしくは静脈の創傷治癒、または圧迫創傷である。
慢性創傷の大部分は、3つの主なカテゴリー:静脈性潰瘍および動脈性潰瘍、圧迫潰瘍、ならびに糖尿病性潰瘍へと分類される(Zhao R.et al(2016)Int.J.Mol.Sci.17,2085を参照されたい)。
更に別の態様において、本発明は、慢性創傷を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤を含む、医薬組成物を提供する。
慢性創傷の大部分は、3つの主なカテゴリー:静脈性潰瘍および動脈性潰瘍、圧迫潰瘍、ならびに糖尿病性潰瘍へと分類される(Zhao R.et al(2016)Int.J.Mol.Sci.17,2085を参照されたい)。
更に別の態様において、本発明は、慢性創傷を処置するために使用するためのSlc7a11の阻害剤を含む、医薬組成物を提供する。
【0052】
system Xc-は、当該分野で公知の多くの小分子によって阻害されることができる。エラスチン、スルファサラジン、およびソラフェニブなどの小化学分子は、system Xc-機能を阻害し、フェロトーシスを誘導することができる。Xc-を阻害すると記載されている他の分子(いくつかの条件について承認されている)は、リルゾール、シスチン、グルタミン酸、およびアセチルシステインである。system Xc-を阻害する更に他の小分子は、欧州特許第3066089B1号の特許請求の範囲に記載されている置換されたN-アセチル-L-システイン誘導体である。
【0053】
Xc-systemの阻害剤の効果をモニターするための細胞アッセイは、例えば、シスチン取り込みの測定である。シスチン取り込みレベルは、Slc7A11活性の阻害をモニターするための簡便なアッセイとして測定されることができる。シスチン取り込みは、例えば、Y.Gu et al(2017)Mol.Cell 67,128-138.e7(2017)により以前に記載されたニトロプルシドナトリウムベースのプロトコルに従って分析されることができる。任意には、シスチン取り込みのモニターは、例えばPromegaによって販売されているGlutamate-Glo assayなどの種々のアッセイを用いて定量化されることができるグルタミン酸分泌を測定することによって、並行して行われる。
【0054】
哺乳動物は、ヒト、ペット(例として、イヌおよびネコ)、獣医学動物(例として、ウマ、ブタ、ウシ)、家畜、および研究動物を包含する。
【0055】
Slc7a11遺伝子のDNAおよびRNA阻害剤
特定の態様において、本発明の目的は、Slc7A11標的遺伝子の機能的発現の阻害剤を提供することである。そのような阻害剤は、DNAレベルで、RNA(すなわち、遺伝子産物)レベルで作用することができる。
特定の態様において、本発明の目的は、Slc7A11標的遺伝子の機能的発現の阻害剤を提供することである。そのような阻害剤は、DNAレベルで、RNA(すなわち、遺伝子産物)レベルで作用することができる。
【0056】
阻害がDNAレベルで達成されるべきである場合、これは、Slc7A11標的遺伝子をノックアウトまたは破壊するために遺伝子治療法を用いて行われてもよい。本明細書において使用される場合、「ノックアウト」とは、遺伝子ノックダウンであることができるか、または、レトロウイルス遺伝子転移を包含するがこれに限定されない当技術分野で公知の技術による、点突然変異、挿入、欠失、フレームシフト、もしくはミスセンス突然変異などの突然変異によって遺伝子がノックアウトされることができる。遺伝子がノックアウトされることができる別の手法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によるものである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(Zinc-finger nuclease)(ZFN)は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA開裂ドメインへ融合することによって産生される人工の制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の特有の配列を標的化することを可能にする、所望のDNA配列を標的化するように遺伝子操作されることができる。内因性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬は、使用されることで、高等生物のゲノムは正確に改変されることができる。遺伝子をノックアウトするために使用されることができるゲノムカスタマイズのための他の技術は、メガヌクレアーゼおよびTALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN、Cellectis bioresearch)である。TALEN(登録商標)は、二重ストランド切断(double strand break)(DSB)を導入するエンドヌクレアーゼの触媒ドメインへ融合された配列特異的認識のためのTALE DNA結合ドメインから構成される。TALEN(登録商標)のDNA結合ドメインは、大きな認識部位(実例としては、17bp)を高精度で標的化することが可能である。メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、およびいくつかの植物オルガネラなどの種々の単一細胞生物に起源を持つ、天然に存在する「DNAハサミ」である配列特異的エンドヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは12～30塩基対の長い認識部位を有する。天然メガヌクレアーゼの認識部位は、天然ゲノムDNA配列(内因性遺伝子など)を標的とするために修飾されることができる。
【0057】
別の最近のゲノム編集技術はCRISPR/Casシステムであり、これは、RNAガイドゲノム編集を達成するために使用されることができる。CRISPR妨害は、原核生物細胞および真核生物細胞における遺伝子発現の配列特異的制御を可能にする、遺伝子技術である。CRISPR妨害は、細菌免疫システム由来のCRISPR(クラスタ化された規則的な間隔のパリンドローム反復)経路に基づく。
【0058】
遺伝子不活性化、すなわち遺伝子の機能発現の阻害はまた、実例としては、アンチセンスRNAを発現するトランスジェニック生物の作製を通じて、またはアンチセンスRNAを対象へ投与することによって達成されてもよい。アンチセンス構築物は、例えば発現プラスミドとして送達されることができ、これは、細胞内で転写された場合、細胞のSlc7a11 RNAの少なくとも特有の部分に相補的なRNAを生成する。
【0059】
遺伝子発現の阻害のためのより迅速な方法は、DNAからなるより短いアンチセンスオリゴマー、またはホスホロチオアート、2'-0-アルキルリボヌクレオチドキメラ、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、もしくはモルホリノなどの他の合成構造型の使用に基づく。RNAオリゴマー、PNA、およびモルホリノを除いて、他の全てのアンチセンスオリゴマーは、RNase H媒介標的開裂の機序を介して真核生物細胞において作用する。PNAおよびモルホリノは、相補的なDNAおよびRNA標的に高い親和性および特異性で結合し、このようにしてRNA翻訳機構の単純な立体的遮断を通じて作用し、かつヌクレアーゼ攻撃に対して完全に耐性であるように見える。「アンチセンスオリゴマー」とは、少なくとも約10ヌクレオチド長のオリゴマーを含むアンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。態様において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも15個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、または50個のヌクレオチドを含む。アンチセンスアプローチは、Slc7a11のポリヌクレオチド配列によってエンコードされるRNAに相補的な、オリゴヌクレオチド(DNAもしくはRNA、またはそれらの誘導体のいずれか)の設計に関与する。アンチセンスRNAは、細胞へと導入されて、それに対する塩基対形成、および翻訳機構の物理的妨害によって相補的mRNAの翻訳が阻害されてもよい。したがって、この効果は化学量論的である。絶対的な相補性は、好ましいが、必要とされてはいない。本明細書において言及されるRNAの一部分に対する配列「相補性」とは、RNAとハイブリダイズすることが可能であり、安定な二重ストランドを形成するのに充分な相補性を有する配列を意味し;このようにして、二重ストランドアンチセンスポリヌクレオチド配列のケースでは、二重鎖DNAの単一ストランドが試験されてもよいか、または三重鎖形成がアッセイされてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンスポリヌクレオチド配列の長さの両方に依存する。概して、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が長いほど、それが含有してもよいRNAとの塩基ミスマッチが多くなり、それでもなお安定な二重鎖(または、三重鎖であってもよい)を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順を使用することによって、許容可能な程度のミスマッチを確認することができる。アンチセンスオリゴマーは、少なくとも10ヌクレオチド長であるべきであり、かつ好ましくは15ヌクレオチド長～約50ヌクレオチド長の範囲にわたるオリゴマーである。ある特定の態様において、オリゴマーは、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも18ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも30ヌクレオチド長、少なくとも35ヌクレオチド長、少なくとも40ヌクレオチド長、または少なくとも50ヌクレオチド長である。
【0060】
関連する方法は、アンチセンスRNAの代わりにリボザイムを使用する。リボザイムは、特異的RNA配列を標的とするように設計されることができる酵素様開裂特性を有する触媒RNA分子である。リボザイムを用いた、時間的および組織特異的な遺伝子不活性化を包含する標的遺伝子不活性化の成功は、マウス、ゼブラフィッシュ、およびショウジョウバエにおいて報告されている。RNA干渉(RNA interference)(RNAi)は、転写後遺伝子サイレンシングの一形態である。RNA干渉の現象は、Caenorhabditis elegansで最初に観察および記載され、ここでは、外因性二重ストランドRNA(double-stranded RNA)(dsRNA)が、標的RNAの急速な分解を誘導する機序を通じて相同配列を含有する遺伝子の活性を特異的かつ強力に破壊することが示された。いくつかの報告は、植物種(Arabidopsis thaliana)、原生動物種(Trypanosoma brucei)、無脊椎動物種(Drosophila melanogaster)、および脊椎動物種(Danio rerioおよびXenopus laevis)を包含する、遺伝子不活性化の空間的制御および/または時間的制御を実証する実験を包含する、他の生物における同じ触媒現象について記載している。配列特異的メッセンジャーRNA分解のメディエータは、より長いdsRNAからリボヌクレアーゼIII開裂によって産生される低分子干渉RNA(small interfering RNA)(siRNA)である。概して、siRNAの長さは、20～25ヌクレオチドである(Elbashir et al.(2001)Nature 411,494 498)。siRNAは、典型的には、標準的なワトソン・クリック塩基対形成相互作用(本明細書中の以下において、「塩基対形成」)によって共にアニーリングされた、センスRNAストランドおよび相補的アンチセンスRNAストランドを含む。センスストランドは、標的mRNA内に含有される標的配列と同一の核酸配列を含む。本発明のsiRNAのセンスストランドおよびアンチセンスストランドは、2つの相補的な単一ストランドRNA分子を含むことができ、または2つの相補的な部分が塩基対形成され、かつ単一ストランド「ヘアピン」区域(しばしば、shRNAと称される)によって共有結合している、単一分子を含むことができる。「単離された」という用語は、ヒトの介入によって天然状態から改変または除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在するsiRNAは「単離され」ていないが、合成siRNA、または共存材料のその天然状態から部分的または完全に分離されたsiRNAは、「単離され」ている。単離されたsiRNAは、実質的に精製された形態で存在することができるか、または非ネイティブ(non-native)的環境(例えば、siRNAが送達された細胞など)で存在することができる。
【0061】
本発明のsiRNAは、部分的に精製されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、または組換え生成されたRNA、ならびに1以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または改変によって天然に存在するRNAとは異なる改変RNAを含むことができる。そのような改変は、ヌクレアーゼ消化に対してsiRNA耐性とさせる修飾を包含する、siRNAの末端(両端)またはsiRNAの1以上の内部ヌクレオチドなどへの、非ヌクレオチド材料の添加を包含することができる。
【0062】
本発明のsiRNAの一方または両方のストランドは、3'オーバーハングもまた含むことができる。「3'オーバーハング」とは、RNAストランドの3'末端から延びる少なくとも1つの不対ヌクレオチドを指す。このようにして、一態様において、本発明のsiRNAは、1ヌクレオチド長～約6ヌクレオチド長(リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを包含する)、好ましくは1ヌクレオチド長～約5ヌクレオチド長、より好ましくは1ヌクレオチド長～約4ヌクレオチド長、特に好ましくは約1ヌクレオチド長～約4ヌクレオチド長の、少なくとも1つの3'オーバーハングを含む。
【0063】
siRNA分子の両方のストランドが3'オーバーハングを含む態様において、オーバーハングの長さは、各ストランドについて同じまたは異なることができる。最も好ましい態様において、3'オーバーハングは、siRNAの両ストランドに存在し、かつ2ヌクレオチド長である。本発明のsiRNAの安定性を増強するために、3'オーバーハングはまた、分解に対して安定化されることもできる。一態様において、オーバーハングは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを包含することによって安定化される。
【0064】
あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例として3'オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの2'デオキシチミジンによる置換は、許容され、かつRNAi分解の有効性に影響を及ぼさない。特に、2'デオキシチミジンに2'ヒドロキシルが非存在であることが、組織培養培地中の3'オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
【0065】
本発明のsiRNAは、標的Slc7a11 RNA配列(「標的配列」)のいずれかの中のおよそ19～25個の連続するヌクレオチドのあらゆるストレッチへ標的とされることができ、その例は、本出願に与えられている。siRNAの標的配列を選択する技術は当技術分野で周知である。このようにして、本発明のsiRNAのセンスストランドは、標的mRNA中の約19～約25ヌクレオチドのあらゆる連続ストレッチと同一のヌクレオチド配列を含む。
【0066】
本発明のsiRNAは、当業者に公知のいくつかの技術を用いて得られることができる。例えば、siRNAは、当技術分野で公知の方法を用いて化学合成または組換え生成されることができる。好ましくは、本発明のsiRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のDNA/RNA合成機を用いて化学的に合成される。siRNAは、2つの別個の相補的RNA分子として、または2つの相補的領域を有する単一のRNA分子として合成されることができる。合成RNA分子または合成試薬の市販供給業者は、Proligo(Hamburg、Germany)、Dharmacon Research(Lafayette、Colo.、USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部門、Rockford,Ill.、USA)、Glen Research(Sterling,Va.、USA)、ChemGenes(Ashland,Mass.、USA)、およびCruachem(Glasgow、UK)を包含する。
【0067】
あるいは、siRNAはまた、あらゆる好適なプロモータを用いて、組換え環状または線状DNAプラスミドから発現させられることができる。本発明のsiRNAをプラスミドから発現させるための好適なプロモータは、例えば、U6またはH1 RNA pol IIIプロモータ配列およびサイトメガロウイルスプロモータを包含する。他の好適なプロモータの選択は当技術分野の範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定の組織または特定の細胞内環境におけるsiRNAの発現のための誘導性プロモータまたは調節性プロモータを含むことができる。組換えプラスミドから発現されるsiRNAは、標準的な技術によって培養細胞発現システムから単離されることができるか、または細胞内、例として乳房組織もしくはニューロンで発現されることができるかのいずれかである。
【0068】
本発明のsiRNAはまた、組換えウイルスベクターから細胞内に発現されることもできる。組換えウイルスベクターは、本発明のsiRNAをエンコードする配列と、siRNA配列を発現させるためのあらゆる好適なプロモータと、を含む。好適なプロモータは、例えば、U6またはH1 RNA pol IIIプロモータ配列およびサイトメガロウイルスプロモータを包含する。他の好適なプロモータの選択は当技術分野の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターはまた、腫瘍が局在する組織におけるsiRNAの発現のための誘導性プロモータまたは調節性プロモータを含むことができる。
【0069】
本明細書において使用される場合、siRNAの「有効量」とは、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすのに充分な量、または対象における転移の進行を阻害するのに充分な量である。標的mRNAのRNAi媒介性分解は、上記のようにmRNAまたはタンパク質を単離および定量化するための標準的な技術を用いて、対象の細胞中の標的mRNAまたはタンパク質のレベルを測定することによって検出されることができる。
【0070】
当業者は、対象のサイズおよび重量などの因子を考慮することによって、所与の対象へと投与される本発明のsiRNAの有効量;疾患浸透の程度;対象の年齢、健康状態、および性別;投与経路;ならびに、投与が領域性または全身性かどうかを容易に決定することができる。概して、本発明のsiRNAの有効量は、約1ナノモル(nM)～約100nM、好ましくは約2nM～約50nM、より好ましくは約2.5nM～約10nMの細胞内濃度を含む。より多いまたはより少ない量のsiRNAが投与されることができるものと企図される。
【0071】
最近、ゼブラフィッシュおよびカエルにおけるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase Hの低ストリンジェンシー要件によって引き起こされる他のmRNA分子の非標的特異的開裂に起因する多数の非特異的効果を包含する、RNase H適格性アンチセンスオリゴヌクレオチドの限界を克服することが示されている。したがって、モルホリノオリゴマーは、重要な新規クラスのアンチセンス分子を表す。本発明のオリゴマーは、当技術分野で公知の標準的な方法によって合成されてもよい。例としては、ホスホロチオアートオリゴマーは、Stein et al.(1988)Nucleic Acids Res.16,3209 3021)の方法によって合成されてもよく、メチルホスホナートオリゴマーは、制御細孔ガラスポリマー支持体(Sarin et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,7448-7451)を使用することによって調製されることができる。モルホリノオリゴマーは、SummertonおよびWellerの米国特許第5,217,866号および同第5,185,444号の方法によって合成されてもよい。
【0072】
アンチセンスRNA戦略の別の特別な形態はギャップマーである。ギャップマーとは、RNase H開裂を誘導するのに充分な長さのデオキシヌクレオチドモノマーの中心ブロックを含有する、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマーの中心ブロックは、2'-O修飾リボヌクレオチドのブロック、またはヌクレアーゼ分解から内部ブロックを保護する架橋核酸(bridged nucleic acid)(BNA)などの他の人工的に修飾されたリボヌクレオチドモノマーに隣接する。ギャップマーは、ホスホロチオアート連結の数を減少させながら、標的RNAのRNase-H媒介性開裂を得るために使用されてきた。ホスホロチオアートは、未修飾DNAと比較してヌクレアーゼに対する耐性の増加を保有している。しかしながら、ホスホロチオアートはいくつかの欠点を有する。これらは、相補的核酸に対する低い結合能力、およびその適用を制限する毒性副作用を引き起こすタンパク質に対する非特異的結合を包含する。非特異的結合がオフターゲット効果を共に引き起こす毒性副作用の発生は、毒性副作用を呈さずにin vivoで効率的かつ特異的なアンチセンス活性を提供する、修飾オリゴヌクレオチドの開発のための新規人工核酸の設計を刺激した。RNase Hを動員することによって、ギャップマーは標的オリゴヌクレオチドストランドを選択的に開裂する。このストランドの開裂はアンチセンス効果を開始させる。このアプローチは、遺伝子機能の阻害における強力な方法であることを証明しており、かつアンチセンス療法の一般的なアプローチとして浮上している。ギャップマーは商業的に提供され、例として、ExiqonによるLNA longRNA GapmeR、またはIsis pharmaceuticalsによるMOEギャップマーが提供される。MOEギャップマーまたは「2'MOEギャップマー」は、15～30ヌクレオチドのアンチセンスホスホロチオアートオリゴヌクレオチドであり、ここで、骨格連結の全てが、非架橋酸素(ホスホロチオアート)に硫黄を付加することによって修飾され、かつ少なくとも10の連続するヌクレオチドのストレッチが修飾されないままであり(デオキシ糖)、そして残りのヌクレオチドは2'位(MOE)にO'-メチルO'-エチル置換を含有する。
【0073】
Slc7A11の活性を阻害する抗体
Slc7a1に特異的に結合する抗体、特にSlc7a11の細胞外領域へ結合する抗体は、Slc7a11の活性を阻害することができ、そのような抗体は、哺乳動物における創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するためのものである。
Slc7a1に特異的に結合する抗体、特にSlc7a11の細胞外領域へ結合する抗体は、Slc7a11の活性を阻害することができ、そのような抗体は、哺乳動物における創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するためのものである。
【0074】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、Slc7a11へ、好ましくはSlc7a11の細胞外ドメインで特異的に結合する、免疫グロブリン(Ig)分子、または免疫グロブリン(Ig)ドメインを含む分子を指す。「抗体」は更に、天然源または組換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、かつインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。「活性抗体断片」という用語は、それ自体が抗原決定基またはエピトープに対して高い親和性を有し、そのような特異性を説明する1以上のCDRを含有する、あらゆる抗体または抗体様構造の一部を指す。非限定的な例とは、免疫グロブリンドメイン、Fab、F(ab)'2、scFv、重鎖-軽鎖二量体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ、ドメイン抗体、および完全軽鎖または完全重鎖などの一本鎖構造を包含する。Slc7a11の細胞外エピトープへ特異的に結合し、Slc7a11の活性を阻害する抗体の例は、国際公開第2018/204278号および国際公開第2020/227640号に教示されている。
【0075】
組合せ
特定の態様において、Slc7a11の阻害剤と、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための他の分子との組合せが想定される。
Slc7a11の阻害が治療効果を達成するために、すなわち創傷治癒、特に慢性創傷治癒を達成するために充分であるとしても、Slc7a11の阻害剤および増殖因子GDF-15の両方が投与された場合、より強い相乗効果が達成されることが添付の例の節で本明細書において示される。相乗効果は、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するための、同時、併用、別個、または逐次の使用によって得られえることができる。
特定の態様において、Slc7a11の阻害剤と、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための他の分子との組合せが想定される。
Slc7a11の阻害が治療効果を達成するために、すなわち創傷治癒、特に慢性創傷治癒を達成するために充分であるとしても、Slc7a11の阻害剤および増殖因子GDF-15の両方が投与された場合、より強い相乗効果が達成されることが添付の例の節で本明細書において示される。相乗効果は、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するための、同時、併用、別個、または逐次の使用によって得られえることができる。
【0076】
更に別の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、Slc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
更に別の態様において、本発明は、哺乳動物における創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための、Slc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
更に別の態様において、本発明は、哺乳動物における創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための、Slc7a11およびGDF-15の阻害剤からなる組成物を提供する。
【0077】
医薬組成物
本発明はまた、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための本発明の1以上の化合物を含有する、医薬組成物に関する。これらの組成物は、所望の薬理学的効果を、それを必要とするペイシェントなどの哺乳動物への投与によって達成するために利用されることができる。本発明の目的のために、ペイシェントは、特定の状態または疾患の処置を必要とするヒトを包含する哺乳動物である。したがって、本発明は、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための、薬学的に許容される担体と、薬学的有効量の本発明の化合物またはその塩と、から構成される、医薬組成物を包含する。薬学的に許容される担体とは、好ましくは、活性成分の有効な活性と一致する濃度でペイシェントにとって比較的非毒性かつ無害であり、そのため、担体に起因するあらゆる副作用が活性成分の有益な効果を無効にしない、担体である。化合物の薬学的有効量とは、好ましくは、処置される特定の状態に結果をもたらすかまたは影響を及ぼす量である。本発明の化合物は、即時放出調製物、徐放調製物、および時限放出(timed release)調製物を包含する、あらゆる有効な従来の投与単位形態(dosage unit form)を用いて、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と共に、経口、非経口、局所、経鼻、眼科的、光学的、舌下、直腸、膣、およびその他同種類のもので投与されることができる。
本発明はまた、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための本発明の1以上の化合物を含有する、医薬組成物に関する。これらの組成物は、所望の薬理学的効果を、それを必要とするペイシェントなどの哺乳動物への投与によって達成するために利用されることができる。本発明の目的のために、ペイシェントは、特定の状態または疾患の処置を必要とするヒトを包含する哺乳動物である。したがって、本発明は、創傷治癒、特に慢性創傷治癒を処置するために使用するための、薬学的に許容される担体と、薬学的有効量の本発明の化合物またはその塩と、から構成される、医薬組成物を包含する。薬学的に許容される担体とは、好ましくは、活性成分の有効な活性と一致する濃度でペイシェントにとって比較的非毒性かつ無害であり、そのため、担体に起因するあらゆる副作用が活性成分の有益な効果を無効にしない、担体である。化合物の薬学的有効量とは、好ましくは、処置される特定の状態に結果をもたらすかまたは影響を及ぼす量である。本発明の化合物は、即時放出調製物、徐放調製物、および時限放出(timed release)調製物を包含する、あらゆる有効な従来の投与単位形態(dosage unit form)を用いて、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と共に、経口、非経口、局所、経鼻、眼科的、光学的、舌下、直腸、膣、およびその他同種類のもので投与されることができる。
【0078】
特に好ましい態様において、投与は、局所投与である。
本発明で採用されることができる別の製剤は、経皮送達装置(「パッチ」）である。そのような経皮パッチは、制御された量のSlc7a11の1以上の阻害剤の連続的または不連続的な注入を提供するために使用されてもよい。医薬剤を送達するための経皮パッチの構築および使用は、当技術分野で周知されている(例えば、米国特許第5,023,252号を参照のこと)。そのようなパッチは、医薬剤の連続的な、拍動性の、またはオンデマンドの送達のために構築されてもよい。
本発明で採用されることができる別の製剤は、経皮送達装置(「パッチ」）である。そのような経皮パッチは、制御された量のSlc7a11の1以上の阻害剤の連続的または不連続的な注入を提供するために使用されてもよい。医薬剤を送達するための経皮パッチの構築および使用は、当技術分野で周知されている(例えば、米国特許第5,023,252号を参照のこと)。そのようなパッチは、医薬剤の連続的な、拍動性の、またはオンデマンドの送達のために構築されてもよい。
【0079】
用量および投与:
本明細書において引用される疾患の処置に有用な化合物を評定するために公知の標準的な実験室技術、標準的な毒性試験、および哺乳動物において上記で同定された状態の処置を決定するための標準的な薬理学的アッセイ、ならびにこれらの結果とこれらの状態を処置するために使用される既知の医薬品の結果との比較に基づいて、本発明の化合物の有効投与量は、本明細書において引用される適応症の処置のために容易に決定されることができる。処置において投与される活性成分の量は、採用される特定の化合物および投与量単位、投与方式、処置期間、処置されるペイシェントの年齢および性別、ならびに処置される状態の性質および程度などの考慮事項に従って広く変化することができる。
本明細書において引用される疾患の処置に有用な化合物を評定するために公知の標準的な実験室技術、標準的な毒性試験、および哺乳動物において上記で同定された状態の処置を決定するための標準的な薬理学的アッセイ、ならびにこれらの結果とこれらの状態を処置するために使用される既知の医薬品の結果との比較に基づいて、本発明の化合物の有効投与量は、本明細書において引用される適応症の処置のために容易に決定されることができる。処置において投与される活性成分の量は、採用される特定の化合物および投与量単位、投与方式、処置期間、処置されるペイシェントの年齢および性別、ならびに処置される状態の性質および程度などの考慮事項に従って広く変化することができる。
【0080】
投与される活性成分の総量は、概して、1日あたり約0.001mg/kg～約200mg/kg体重、好ましくは1日あたり約0.01mg/kg～約50mg/kg体重の範囲にわたる。臨床的に有用な投与スケジュールは、1日に1回～3回の投与から4週間に1回の投与までの範囲にわたる。くわえて、ペイシェントがある特定の期間薬物を投与されない「休薬期間」は、薬理学的効果と許容性との間の全体的なバランスに有益であってもよい。単位投与量は、約0.5mg～約1500mgの活性成分を含有してもよく、かつ1日に1回以上、または1日に1回未満投与されることができる。静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、および非経口注射を包含する注射による投与、ならびに注入技術の使用のための平均1日投与量は、好ましくは、0.01～200mg/kgの総体重となる。平均1日直腸投与レジメンは、好ましくは、0.01～200mg/kgの総体重となる。平均1日膣投与レジメンは、好ましくは、0.01～200mg/kgの総体重となる。平均1日局所投与レジメンは、好ましくは、1日に1回～4回投与される0.1～200mgとなる。経皮濃度は、好ましくは、0.01～200mg/kgの1日用量を維持するために必要とされるものとなる。平均1日吸入投与レジメンは、好ましくは、総体重の0.01～100mg/kgとなる。平均1日経口投与レジメンは、好ましくは、0.01～100mg/kgの総体重となる。
【0081】
各ペイシェントに対する特定の初期および継続的な投与レジメンが、担当診断医によって決定される状態の性質および重症度、採用される特定の化合物の活性、ペイシェントの年齢および全身状態、投与時間、投与経路、薬物の排泄速度、薬物の組合せ、およびその他同種類のものに従って変化することは、当業者にとって明らかである。本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルもしくは組成物の所望の処置方式および投与回数は、従来の処置試験を用いて当業者によって確認されることができる。
【0082】
特定の態様、特定の構成、ならびに材料および/または分子が、本発明による細胞および方法について本明細書において論じられているが、この発明の範囲および精神から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更または修正が行われる可能性があることを理解されたい。以下の例は、特定の態様をよりよく説明するために提供されており、これらは本出願を限定するものと見なされるべきではない。本出願は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0083】
例
1．アポトーシス細胞を貪食する樹状細胞におけるアミノ酸トランスポータのアップレギュレーション
エフェロサイトーシス中に樹状細胞で開始される遺伝子サインは、まだ定義されておらず、カーゴを摂取する代謝チャレンジに対する樹状細胞の適応は不明のままである。これに対処するために、本発明者らは、初代マウス骨髄樹状細胞(BMDC食細胞)をアポトーシスヒトJurkat細胞とインキュベートし、エフェロサイトーシス性樹状細胞を精製し、RNAseq分析を実施した(図1a)。本発明者らは、この交差種アプローチを使用して、マウス食作用性RNAをあらゆるアポトーシスカーゴ由来RNAから容易に区別した。本発明者らはまた、食作用を制御するための標的としてプレーンビーズを使用した。本発明者らの分析では、本発明者らは、樹状細胞が、摂取されたアポトーシスカーゴをどのように認知および解釈するかに関して他の食細胞とは異なる分子的特徴を有してもよいという初期仮説に基づいて、「トランスポータ」活性に関連する差次的に発現された遺伝子に焦点を当てた。本発明者らは、イオン、脂質、およびアミノ酸を通過させるものを包含する、多様な機能を有する膜トランスポータをエンコードする遺伝子において有意な改変を見出した(図1b)。興味深いことに、遺伝子の溶質担体(Slc)ファミリーは、エフェロサイトーシス性樹状細胞において差次的に発現されるトランスポータの29％を表した(図1c)。SLCは、(GPCRの後の)ヒトゲノムにおいて2番目に大きい遺伝子ファミリーを表し、細胞膜を横切る代謝産物および溶質の輸送を媒介する膜タンパク質から構成される。SLCは、100を超えるヒト疾患に関係し、小分子による標的化に適しており、他の食細胞21によるエフェロサイトーシスに関係づけられる(図1c)。SLCのうち、アミノ酸代謝および炭水化物異化をコードするものは、エフェロサイトーシス性樹状細胞においてアップレギュレートされたが、一方で酸化的リン酸化(OXPHOS)および脂肪酸輸送に関係するSLCは、ダウンレギュレートされた(図5a)。
1．アポトーシス細胞を貪食する樹状細胞におけるアミノ酸トランスポータのアップレギュレーション
エフェロサイトーシス中に樹状細胞で開始される遺伝子サインは、まだ定義されておらず、カーゴを摂取する代謝チャレンジに対する樹状細胞の適応は不明のままである。これに対処するために、本発明者らは、初代マウス骨髄樹状細胞(BMDC食細胞)をアポトーシスヒトJurkat細胞とインキュベートし、エフェロサイトーシス性樹状細胞を精製し、RNAseq分析を実施した(図1a)。本発明者らは、この交差種アプローチを使用して、マウス食作用性RNAをあらゆるアポトーシスカーゴ由来RNAから容易に区別した。本発明者らはまた、食作用を制御するための標的としてプレーンビーズを使用した。本発明者らの分析では、本発明者らは、樹状細胞が、摂取されたアポトーシスカーゴをどのように認知および解釈するかに関して他の食細胞とは異なる分子的特徴を有してもよいという初期仮説に基づいて、「トランスポータ」活性に関連する差次的に発現された遺伝子に焦点を当てた。本発明者らは、イオン、脂質、およびアミノ酸を通過させるものを包含する、多様な機能を有する膜トランスポータをエンコードする遺伝子において有意な改変を見出した(図1b)。興味深いことに、遺伝子の溶質担体(Slc)ファミリーは、エフェロサイトーシス性樹状細胞において差次的に発現されるトランスポータの29％を表した(図1c)。SLCは、(GPCRの後の)ヒトゲノムにおいて2番目に大きい遺伝子ファミリーを表し、細胞膜を横切る代謝産物および溶質の輸送を媒介する膜タンパク質から構成される。SLCは、100を超えるヒト疾患に関係し、小分子による標的化に適しており、他の食細胞21によるエフェロサイトーシスに関係づけられる(図1c)。SLCのうち、アミノ酸代謝および炭水化物異化をコードするものは、エフェロサイトーシス性樹状細胞においてアップレギュレートされたが、一方で酸化的リン酸化(OXPHOS)および脂肪酸輸送に関係するSLCは、ダウンレギュレートされた(図5a)。
【0084】
アミノ酸輸送は栄養供給の基本であり、樹状細胞24を包含する免疫細胞22、23の重要な機能を支持する。このようにして、本発明者らは、いくつかのSlc7ファミリーメンバーに注目することを選んだ。本発明者らは、いくつかのSlc7メンバー25の細胞膜局在化に付き添う(chaperone)/細胞膜局在化を推進するのに役立つ、カチオン性(Slc7a1～Slc7a4)およびヘテロ二量体アミノ酸トランスポータ(Slc7a5～Slc7a11)、ならびにSlc3a2を調べた。Slc7ファミリーメンバーの中で、エフェロサイトーシス性樹状細胞は、Slc7a5およびSlc7a11の増加が最も大きかった(図1d)。
【0085】
2．Slc7a11アンチポータは、樹状細胞によるエフェロサイトーシスのブレーキとして作用する
エフェロサイトーシス性BMDCにおいてアップレギュレートされたこれらのアミノ酸トランスポータの関連性を試験するために、本発明者らは、BMDCにおいてsiRNA媒介性ノックダウンを実施し、続いてフローサイトメトリーベースのアッセイ、および経時的なアポトーシス細胞取り込みのための独立した生細胞画像化アッセイを介してエフェロサイトーシス性を実施した。本発明者らがsiRNAを介して標的としたSlc7ファミリーメンバーの中で、Slc7a11発現を妨害すると、樹状細胞によるエフェロサイトーシスの増加が一貫して有意に増加した(図1e)。文献ではxCTとしてもまた知られているSlc7a11は、細胞内グルタミン酸の細胞外シスチンへの交換を調節するシスチン-グルタミン酸アンチポータsystem Xc-の特異的サブユニットであり、後者は抗酸化グルタチオン(GSH)の合成の律速前駆体である。Slc7a11はまた、臨床試験で試験されたSlc7a11を標的とする薬物を用いて、神経疾患26～28、29、30、ウイルス感染31、32、33、および複数のがん34、35、36に関係する。これらの条件下において、Slc7a1のノックダウンはBMDCエフェロサイトーシスに影響を及ぼさなかったが、一方でSlc7a5のノックダウンまたは薬理学的阻害は、よりエフェロサイトーシスに向かう傾向を示しただけで、統計学的に有意ではなかった(図5b～図5e)。本発明者らは、Slc7a11が、その発現がエフェロサイトーシス中に強く上昇するので、エフェロサイトーシスの負の調節因子として作用することに当初驚いた。したがって、本発明者らは、樹状細胞のエフェロサイトーシスにおけるSlc7a11の役割に対処するために、追加的な薬理学的および遺伝的アプローチをとった。薬物エラスチン37によるSlc7a11の阻害は、エフェロサイトーシスの劇的なブーストを引き起こした(図1f);対照的に、エラスチンは、樹状細胞によるE.coli生体粒子の食作用に影響を及ぼさなかった(図6a)。エラスチンは、がん細胞におけるフェロトーシス誘導剤として記載されている38、39、40にもかかわらず、樹状細胞における増強されたエフェロサイトーシスは、フェロトーシスと関係しておらず、別の既知のフェロトーシス誘導化合物として、ML-16238は、エフェロサイトーシスを増強しなかった(図6b)。エラスチン処置は細胞内グルタチオンレベルを減少させたが(図6c)、一方で、脂質ROS蓄積をわずかに増加させただけであり(図6e)、樹状細胞の生存率に影響を及ぼさなかった(図6d)。エラスチンの効果はまた、過剰なグルタミン酸を添加してSlc7a11を介したシスチン取り込みを「ブロック」することによって模倣されることができ、これはまた、エフェロサイトーシスをブーストした(延長図2f)。
エフェロサイトーシス性BMDCにおいてアップレギュレートされたこれらのアミノ酸トランスポータの関連性を試験するために、本発明者らは、BMDCにおいてsiRNA媒介性ノックダウンを実施し、続いてフローサイトメトリーベースのアッセイ、および経時的なアポトーシス細胞取り込みのための独立した生細胞画像化アッセイを介してエフェロサイトーシス性を実施した。本発明者らがsiRNAを介して標的としたSlc7ファミリーメンバーの中で、Slc7a11発現を妨害すると、樹状細胞によるエフェロサイトーシスの増加が一貫して有意に増加した(図1e)。文献ではxCTとしてもまた知られているSlc7a11は、細胞内グルタミン酸の細胞外シスチンへの交換を調節するシスチン-グルタミン酸アンチポータsystem Xc-の特異的サブユニットであり、後者は抗酸化グルタチオン(GSH)の合成の律速前駆体である。Slc7a11はまた、臨床試験で試験されたSlc7a11を標的とする薬物を用いて、神経疾患26～28、29、30、ウイルス感染31、32、33、および複数のがん34、35、36に関係する。これらの条件下において、Slc7a1のノックダウンはBMDCエフェロサイトーシスに影響を及ぼさなかったが、一方でSlc7a5のノックダウンまたは薬理学的阻害は、よりエフェロサイトーシスに向かう傾向を示しただけで、統計学的に有意ではなかった(図5b～図5e)。本発明者らは、Slc7a11が、その発現がエフェロサイトーシス中に強く上昇するので、エフェロサイトーシスの負の調節因子として作用することに当初驚いた。したがって、本発明者らは、樹状細胞のエフェロサイトーシスにおけるSlc7a11の役割に対処するために、追加的な薬理学的および遺伝的アプローチをとった。薬物エラスチン37によるSlc7a11の阻害は、エフェロサイトーシスの劇的なブーストを引き起こした(図1f);対照的に、エラスチンは、樹状細胞によるE.coli生体粒子の食作用に影響を及ぼさなかった(図6a)。エラスチンは、がん細胞におけるフェロトーシス誘導剤として記載されている38、39、40にもかかわらず、樹状細胞における増強されたエフェロサイトーシスは、フェロトーシスと関係しておらず、別の既知のフェロトーシス誘導化合物として、ML-16238は、エフェロサイトーシスを増強しなかった(図6b)。エラスチン処置は細胞内グルタチオンレベルを減少させたが(図6c)、一方で、脂質ROS蓄積をわずかに増加させただけであり(図6e)、樹状細胞の生存率に影響を及ぼさなかった(図6d)。エラスチンの効果はまた、過剰なグルタミン酸を添加してSlc7a11を介したシスチン取り込みを「ブロック」することによって模倣されることができ、これはまた、エフェロサイトーシスをブーストした(延長図2f)。
【0086】
遺伝的アプローチとして、本発明者らは、Slc7a11欠損マウスからの異なるタイプの樹状細胞を試験した。対照マウスおよびSlc7a11欠損マウスからの精製した初代脾臓従来樹状細胞を比較すると、本発明者らは、Slc7a11欠損cDC1による取り込みの増強を認めたが、cDC2による取り込みの増強は認めなかった。同様に、Slc7a11を欠くex vivo産生BMDCは、対照と比較してより大きなエフェロサイトーシスを提示した(図1g、図1h、図1i)。Slc7a11欠損樹状細胞によるこの増強されたエフェロサイトーシスは、pH非感受性(TAMRA)またはpH感受性(CypHer5E)レポータ色素のいずれかで標識されたアポトーシス標的を用いて見られ(図1i)、これは、サイトカラシンDで細胞骨格再配列をブロックすることによって抑止された(図1h、図1i)。これらのアッセイでスコア化された取り込みの増加は、Slc7a11欠損樹状細胞が野生型樹状細胞と同様の(アポトーシス細胞のCellTrace Violet標識化によって測定された)死体分解を示したので、アポトーシス死体の不完全な消化に起因するものではなかった(図5f)。このアッセイにおけるSlc7a11に対するエラスチンの効果に対する特異性を支持して、エラスチンで処置したSlc7a11欠損樹状細胞のエフェロサイトーシス性能力の相加的増加はなかった(図1h)。興味深いことに、Slc7a11欠損マウスからの骨髄由来マクロファージも、エラスチンで処置した野生型マウスからの腹膜マクロファージも、これらの条件下において増強されたエフェロサイトーシスを示さなかった(図5g～図5h)。最後に、Slc7a11欠損樹状細胞は「生」細胞の取り込みの増強を示さなかった(図1i)。これらのデータは、まとめると、Slc7a11が樹状細胞のエフェロサイトーシスに対するブレーキとして作用することを示唆している。
【0087】
3．皮膚創傷治癒は、Slc7a11遮断の状況で加速される
未洗浄アポトーシス細胞の存在は慢性炎症に関係することが多いので41、本発明者らは、Slc7a11の喪失または阻害に起因する増強されたエフェロサイトーシスの生理学的関連性に対処したいと考えた。最初に、本発明者らは、脾臓、肺、または皮膚の常在樹状細胞サブセットにおけるSLCの遺伝子発現プロファイルを評価した。公的に入手可能なデータセット(ImmGen)および三重比較(Tri-wise comparison)によりマイニングすることで、Slc7a11遺伝子は、脾臓または肺からのDCと比較して、皮膚常在樹状細胞で最も高度に発現される(図2a)。対照的に、Slc7a5は脾臓および肺DCでより多く発現される。以前の研究は、(表皮に位置する)Langerin＋細胞の枯渇が皮膚性創傷治癒を増強する42が、一方で、(真皮に位置する)皮膚CD11c＋樹状細胞の枯渇が創傷閉鎖を遅延させることを示唆した43。よって、本発明者らは次に、皮膚再生中のSlc7a11と樹状細胞との間の関係に対処した。本発明者らが、Slc7a11欠損マウスの耳から単離された精製皮膚樹状細胞を試験した場合、cDC1細胞は、野生型マウスからのエフェロサイトーシスと比較して、増強されたエフェロサイトーシスを示した;比較すると、ランゲルハンス細胞およびcDC2はex vivoでは不充分な貪食者であり、それらの食作用能力は、Slc7a11欠損によって変化しなかった(図2b、図7a)。CD64陽性マクロファージはアポトーシス細胞取り込みにおいて強力であったが、一方で、Slc7a11欠損はそれらの取り込みを改変しなかった(図2b)。創傷皮膚組織生検の組織学的分析では、Slc7a11はDCマーカCD11cと共局在していたが(図2c)、線維芽細胞とは共局在していなかった(図7b)。そのうえ、CD11c＋樹状細胞は、開裂型カスパーゼ-3＋染色によって示されるように、アポトーシス死体に近位であり、かつアポトーシス死体を捕捉するように見えた(図2d)。本発明者らはまた、Tgfb1およびTnfなどの創傷に関係する遺伝子の発現の増加と一緒に、全層創傷後の全皮膚溶解物中のSlc7a11発現の増加にも注目した(図2f)。
未洗浄アポトーシス細胞の存在は慢性炎症に関係することが多いので41、本発明者らは、Slc7a11の喪失または阻害に起因する増強されたエフェロサイトーシスの生理学的関連性に対処したいと考えた。最初に、本発明者らは、脾臓、肺、または皮膚の常在樹状細胞サブセットにおけるSLCの遺伝子発現プロファイルを評価した。公的に入手可能なデータセット(ImmGen)および三重比較(Tri-wise comparison)によりマイニングすることで、Slc7a11遺伝子は、脾臓または肺からのDCと比較して、皮膚常在樹状細胞で最も高度に発現される(図2a)。対照的に、Slc7a5は脾臓および肺DCでより多く発現される。以前の研究は、(表皮に位置する)Langerin＋細胞の枯渇が皮膚性創傷治癒を増強する42が、一方で、(真皮に位置する)皮膚CD11c＋樹状細胞の枯渇が創傷閉鎖を遅延させることを示唆した43。よって、本発明者らは次に、皮膚再生中のSlc7a11と樹状細胞との間の関係に対処した。本発明者らが、Slc7a11欠損マウスの耳から単離された精製皮膚樹状細胞を試験した場合、cDC1細胞は、野生型マウスからのエフェロサイトーシスと比較して、増強されたエフェロサイトーシスを示した;比較すると、ランゲルハンス細胞およびcDC2はex vivoでは不充分な貪食者であり、それらの食作用能力は、Slc7a11欠損によって変化しなかった(図2b、図7a)。CD64陽性マクロファージはアポトーシス細胞取り込みにおいて強力であったが、一方で、Slc7a11欠損はそれらの取り込みを改変しなかった(図2b)。創傷皮膚組織生検の組織学的分析では、Slc7a11はDCマーカCD11cと共局在していたが(図2c)、線維芽細胞とは共局在していなかった(図7b)。そのうえ、CD11c＋樹状細胞は、開裂型カスパーゼ-3＋染色によって示されるように、アポトーシス死体に近位であり、かつアポトーシス死体を捕捉するように見えた(図2d)。本発明者らはまた、Tgfb1およびTnfなどの創傷に関係する遺伝子の発現の増加と一緒に、全層創傷後の全皮膚溶解物中のSlc7a11発現の増加にも注目した(図2f)。
【0088】
次に、本発明者らは、Slc7a11機能を妨害することが皮膚の創傷治癒動力学に影響を及ぼしてもよいかどうかを試験した。本発明者らは、全層皮膚創傷後(0日目～2日目)のマウスへ、代謝的に安定で水溶性のバージョンのエラスチン(IKEと呼ばれる)45、46を局所投与した。しかしながら、創傷部位でのSlc7a11を阻害するためのエラスチン単独の投与は、創傷治癒を改善しなかった(図7f)。多くの群からの以前の研究は、エフェロサイトーシス性食細胞が炎症の抑制において多くの有益な因子を提供することを示唆しているので2、3、4、5、本発明者らは、エラスチンと一緒にいくつかの初期段階のアポトーシス細胞を同時投与することが有益であってもよいかどうかを求めた。注目すべきことに、0日目および2日目のエラスチンと一緒の0日目のアポトーシス細胞(アポトーシスJurkat細胞の形態)の創傷部位への単回投与(以下、「エラスチンレジメン」と称される)は、創傷治癒を著しく加速させ(図2g、図7e)、初期創傷のより迅速かつ完全な閉鎖をもたらした(図2h)。エラスチン処置マウスにおける創傷閉鎖は、創傷後4日目に創傷閉鎖の50％に達し、それぞれの対照よりもほぼ2日早くなった(図2g)。重要なことに、エラスチンを用いずにアポトーシス細胞単独を投与しても、創傷閉鎖の動力学は改善されなかった(図7f)。開裂型カスパーゼ-3について陽性に染色された細胞がより少ないことによって証明されるように、エラスチンレジメンを介したSlc7a11阻害は、創傷部におけるアポトーシス細胞負荷を大きく低減させた(図2i)。このようにして、創傷治癒の加速は、初期段階アポトーシス細胞のボーラスとエラスチンを介したSlc7a11阻害との併用が必要であり、後者は創傷部位でのエフェロサイトーシスを改善する。フェロトーシス誘導剤RSL340、47(アポトーシス細胞と共に与えられる)は創傷治癒を改善しなかったので、このエラスチンレジメンの利益は、皮膚におけるフェロトーシスの誘導と関連しなかった(図7g)。既存の創傷に対するエラスチンレジメンを試験するために、本発明者らは創傷後2日目～4日目にエラスチンを投与し、これもまた、皮膚創傷後のより速い治癒をもたらした(図2j)。
【0089】
上記の研究を遺伝的アプローチで補完するために、本発明者らはSlc7a11欠損マウス(図2k)を試験した。Slc7a11欠損マウスはまた、創傷治癒動力学の加速を示し、これには、創傷後0日目にアポトーシス細胞の同時投与もまた必要であった。Slc7a11ヌルマウスの創傷閉鎖もまた、それぞれの対照よりもほぼ2日早く創傷閉鎖の50％に達した(図2gおよび図2k)。これらのデータは、アポトーシス細胞の存在下におけるSlc7a11機能の妨害が、皮膚の創傷治癒を加速することができることを強く示唆している。
【0090】
4．樹状細胞におけるグリコーゲン貯蔵および好気性解糖燃料増強エフェロサイトーシス
本発明者らは、Slc7a11阻害とアポトーシス細胞との組合せが皮膚性創傷治癒を加速したが、それらのいずれも単独では有意な効果をあまり有しなかったという考えに興味を持った。Slc7a11の喪失/阻害がアポトーシス細胞とどのように相乗作用するかをよりよく理解するために、本発明者らは、対照、およびアポトーシス細胞を貪食するSlc7a11欠損樹状細胞のRNAseq分析を実施した(図3a)。WT樹状細胞とSlc7a11 KO樹状細胞との間で遺伝子発現の基礎的な差はほとんどなかったが、一方で、エフェロサイトーシス性Slc7a11欠損樹状細胞は、対照のエフェロサイトーシス性樹状細胞と比較して、191個の差次的に発現した遺伝子(125個のアップレギュレーションおよび66個のダウンレギュレーション)を有していた。特定の経路との関連についてのこれらの遺伝子の文献分析は、差次的に発現される遺伝子が、代謝、タンパク質合成、ミトコンドリアおよびER機能、転写調節、ならびに創傷治癒を包含する生物学的プロセスを表すことを指し示した(図3b、図8a)。代謝機能は、WTエフェロサイトーシス性樹状細胞と比較して、Slc7a11欠損で開始された最も代表的な転写プログラムであり、糖新生(Gpt2、Dyrk1b、Hlcs、Pck2)48、49、糖尿病および肥満(Gdf15、Pck2)50、51、52、アミノ酸合成(Asns、Phgdh)、グルタミン酸代謝(Aldh18a1、Psat1、Gpt2、Got1)、ならびに脂質代謝(Cyb5r1、Soat2、Acaa1b、Cd5l)に関連する遺伝子を内包した。
本発明者らは、Slc7a11阻害とアポトーシス細胞との組合せが皮膚性創傷治癒を加速したが、それらのいずれも単独では有意な効果をあまり有しなかったという考えに興味を持った。Slc7a11の喪失/阻害がアポトーシス細胞とどのように相乗作用するかをよりよく理解するために、本発明者らは、対照、およびアポトーシス細胞を貪食するSlc7a11欠損樹状細胞のRNAseq分析を実施した(図3a)。WT樹状細胞とSlc7a11 KO樹状細胞との間で遺伝子発現の基礎的な差はほとんどなかったが、一方で、エフェロサイトーシス性Slc7a11欠損樹状細胞は、対照のエフェロサイトーシス性樹状細胞と比較して、191個の差次的に発現した遺伝子(125個のアップレギュレーションおよび66個のダウンレギュレーション)を有していた。特定の経路との関連についてのこれらの遺伝子の文献分析は、差次的に発現される遺伝子が、代謝、タンパク質合成、ミトコンドリアおよびER機能、転写調節、ならびに創傷治癒を包含する生物学的プロセスを表すことを指し示した(図3b、図8a)。代謝機能は、WTエフェロサイトーシス性樹状細胞と比較して、Slc7a11欠損で開始された最も代表的な転写プログラムであり、糖新生(Gpt2、Dyrk1b、Hlcs、Pck2)48、49、糖尿病および肥満(Gdf15、Pck2)50、51、52、アミノ酸合成(Asns、Phgdh)、グルタミン酸代謝(Aldh18a1、Psat1、Gpt2、Got1)、ならびに脂質代謝(Cyb5r1、Soat2、Acaa1b、Cd5l)に関連する遺伝子を内包した。
【0091】
以前に、グルコースの好気性解糖が、初期取り込み、および追加的なアポトーシス死体の継続的な取り込みに重要であることが、マクロファージにおいて示されている21。樹状細胞は、細胞内グリコーゲン貯蔵を保有するという点で食細胞の中で特有の特徴を有し53、興味深いことに、糖新生に関連する遺伝子(すなわち、グルコースの産生)が、WT樹状細胞と比較して、Slc7a11欠損のエフェロサイトーシス性樹状細胞のRNAseqにおいてトップヒットのうち1つとして浮上した。このようにして、本発明者らは、Slc7a11欠損樹状細胞が、それらのグリコーゲン貯蔵の一部を変換してより多くのグルコースを産生する能力を増加させ、これが今度は好気性解糖に使用され、増加したエフェロサイトーシスが達成されてもよいという興味深い可能性を考慮した。本発明者らはまず、対照樹状細胞とSlc7a11欠損樹状細胞との間、およびエラスチン処置前後のWT樹状細胞との間でグリコーゲン貯蔵が異なるかどうかを評価した。Slc7a11欠損BMDCおよびエラスチン処置野生型cDC1の両方が、細胞内グリコーゲンの減少を示した(図3c)。重要なことに、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤CP-91149の添加は、エラスチン処置BMDCのグリコーゲンレベルをDMSO対照に対してほぼ逆転させた(図3d)。次いで、本発明者らは、グリコーゲン分解がSlc7a11阻害後の増加したエフェロサイトーシスにとって重要であるかどうかを求めた。CP-91149の添加は、エフェロサイトーシスにおけるエラスチン依存性の増加を強く抑止し(図3d)、グリコーゲン分解がより大きなDCエフェロサイトーシスに寄与するという考えを支持した。
【0092】
次に、本発明者らは、好気性解糖が樹状細胞のエフェロサイトーシスにとって重要であるかどうかを求めた。Seahorse分析では、Slc7a11欠損またはエラスチン処置樹状細胞は、より大きな好気性解糖(ECAR)および低減した酸素消費速度(ミトコンドリア酸化的リン酸化を示唆するOCR)を示し、予備呼吸能(spare respiratory capacity)の有意な減少を伴った(図3eおよび図9a)。エフェロサイトーシスの間、WTおよびエラスチン処置樹状細胞の両方が、より大きな好気性解糖(ECAR)およびより少ないOCRを示した(図3e)。好気性解糖がSlc7a11欠損樹状細胞による増強されたエフェロサイトーシスに役割を果たすかどうかを試験するために、本発明者らは、いくつかの薬理学的阻害剤を使用した。第1に、非代謝性グルコース類似体である2-デオキシグルコース(2-deoxyglucose:2-DG)は、Slc7a11阻害に起因する増強したエフェロサイトーシスを抑止した(図3f)。更に、ヘキソキナーゼ-II媒介解糖(図3f)の阻害剤として作用する、細胞透過性ピルビン酸誘導体3-ブロモピルビン酸(3-bromopyruvate:3-BP)もまた、エラスチン処置に起因する阻害の増強を抑制した。本発明者らがグルタミンまたはピルビン酸などの代替燃料基質がSlc7a11阻害樹状細胞によって使用されることができたかどうかを求めた場合、これは当てはまらないようであった:グルタミンアンタゴニスト(glutamine antagonist:DON)は、エラスチン媒介性の増大したエフェロサイトーシスをわずかに低減させたが、一方で(薬物UK5099を介して)ミトコンドリアへのピルビン酸の移入を阻害することは、エフェロサイトーシスに影響を及ぼさなかった(図9c)。注目すべきことに、阻害剤のいずれも樹状細胞の生存率を妨害しなかった(図9b)。まとめると、これらのデータは、樹状細胞に保存されているグリコーゲンのグルコースへの変換、およびその後の好気性解糖が、Slc7a11欠損樹状細胞による増強されたエフェロサイトーシスに寄与することを示唆している。
【0093】
5．Slc7a11阻害およびrGDF15は、糖尿病マウスの創傷治癒を推進する
非治癒性慢性創傷は、糖尿病ペイシェントの生活の質に有意に影響を及ぼす深刻な合併症である54。糖尿病の状況における創傷治癒に対するSlc7a11の関連性を試験するために、本発明者らは、肥満および高血糖を伴うヒト2型糖尿病のモデルを表すレプチン受容体欠損db/dbマウスを使用した。本発明者らは、創傷治癒が皮膚切除モデルにおいてdb/dbマウスで損なわれていることを最初に確認した;db/dbマウスにおける創傷の治癒は、最大半量閉鎖に達するまでほぼ3日遅延した(図4a、および参照番号55)。本発明者らがSlc7a11発現のレベルを調べた場合、注目すべきことに、正常血糖C57B/6マウスと比較して、db/dbマウスの創傷において4日目には200倍高かった(図4b)。次に、本発明者らは、創傷後のdb/dbマウスを、エラスチン単独で、およびエラスチンレジメン(アポトーシス細胞同時投与)で処置することによって、Slc7a11阻害が糖尿病性創傷治癒に影響を及ぼしてもよいかどうかを試験した。非糖尿病性創傷とは異なり、エラスチンのみで処置した糖尿病性創傷は、おそらく糖尿病性創傷中に充分な未洗浄アポトーシス細胞が存在するので、閉鎖の加速を提示した(図4c)。実際、C57B/6マウスの創傷は、4日目に平均400個のアポトーシス細胞(開裂型カスパーゼ3＋)に達し(図2i)、かつ13日目に50個まで低下したが、糖尿病性創傷は、アポトーシスロードの増加を反映して13日目に平均400のスコアを付けた(図4c)。アポトーシス細胞を用いたエラスチンレジメンはまた、創傷後2日目という早い時期に有意な改善を提供し、これは13日目までの完全な閉鎖まで継続した。特に、エラスチンレジメンを介して処置したdb/dbマウスの創傷は、対照マウスよりも2～3日早く初期創傷の50％の閉鎖に達した(図4d)。
非治癒性慢性創傷は、糖尿病ペイシェントの生活の質に有意に影響を及ぼす深刻な合併症である54。糖尿病の状況における創傷治癒に対するSlc7a11の関連性を試験するために、本発明者らは、肥満および高血糖を伴うヒト2型糖尿病のモデルを表すレプチン受容体欠損db/dbマウスを使用した。本発明者らは、創傷治癒が皮膚切除モデルにおいてdb/dbマウスで損なわれていることを最初に確認した;db/dbマウスにおける創傷の治癒は、最大半量閉鎖に達するまでほぼ3日遅延した(図4a、および参照番号55)。本発明者らがSlc7a11発現のレベルを調べた場合、注目すべきことに、正常血糖C57B/6マウスと比較して、db/dbマウスの創傷において4日目には200倍高かった(図4b)。次に、本発明者らは、創傷後のdb/dbマウスを、エラスチン単独で、およびエラスチンレジメン(アポトーシス細胞同時投与)で処置することによって、Slc7a11阻害が糖尿病性創傷治癒に影響を及ぼしてもよいかどうかを試験した。非糖尿病性創傷とは異なり、エラスチンのみで処置した糖尿病性創傷は、おそらく糖尿病性創傷中に充分な未洗浄アポトーシス細胞が存在するので、閉鎖の加速を提示した(図4c)。実際、C57B/6マウスの創傷は、4日目に平均400個のアポトーシス細胞(開裂型カスパーゼ3＋)に達し(図2i)、かつ13日目に50個まで低下したが、糖尿病性創傷は、アポトーシスロードの増加を反映して13日目に平均400のスコアを付けた(図4c)。アポトーシス細胞を用いたエラスチンレジメンはまた、創傷後2日目という早い時期に有意な改善を提供し、これは13日目までの完全な閉鎖まで継続した。特に、エラスチンレジメンを介して処置したdb/dbマウスの創傷は、対照マウスよりも2～3日早く初期創傷の50％の閉鎖に達した(図4d)。
【0094】
次に本発明者らは、db/dbマウスにおける、アポトーシス細胞クリアランスと、エラスチン処置に起因する創傷閉鎖の加速との関係を試験した。ex vivo分析では、糖尿病マウスからの樹状細胞は、野生型対照と比較して減少したエフェロサイトーシスを示し、ここで、その差は、糖尿病マウスからのマクロファージによって見られる不完全なエフェクター細胞増加と同様に、より早い時点でより顕著であった(図4e)13。驚くべきことに、エラスチン処置は、糖尿病db/db樹状細胞(図4e)の不完全なエフェロサイトーシスを、エラスチンで処置した野生型樹状細胞のレベルまで「救出(rescued)」した。このex vivo表現型と一致して、エラスチンレジメンは、db/dbマウスの創傷における未開裂カスパーゼ3＋アポトーシス細胞の数を実質的に減少させた(図4f)。
【0095】
Slc7a11阻害と創傷へのアポトーシス細胞の添加との組合せが、最も効率的な創傷治癒を提供し、エフェロサイトーシス性食細胞もまた組織に有益な効果を提供することが知られている因子を分泌するので56、本発明者らは、エフェロサイトーシス性Slc7a11欠損樹状細胞からの分泌因子が治癒の加速に寄与してもよいかどうかを求めた。本発明者らは、エフェロサイトーシス性野生型およびSlc7a11 KO樹状細胞から上清を精製し、これらの外因性上清を切除創傷へ添加した。エフェロサイトーシス性Slc7a11欠損樹状細胞からのエフェロサイトーシス性上清で処置したマウスは、WT樹状細胞と比較して、より速い創傷閉鎖を呈した(図4g)。
【0096】
TGF-βスーパーファミリーのメンバー(TGF-β 1-3)を包含する可溶性因子は、エフェロサイトーシス性食細胞によって生成され、創傷治癒の様々な段階で重要な役割を果たすことが知られている57。本発明者らがTGF-βスーパーファミリーメンバーのためのエフェロサイトーシス性Slc7a1欠損樹状細胞のトランスクリプトームを見つけたとき、本発明者らは、Gdf15が特異的にアップレギュレートされたことに注目した(図4h)。GDF15はまた、野生型同腹子の上清と比較して、Slc7a11欠損マウスからのエフェロサイトーシス性樹状細胞の上清において有意に増加した(図4h)。増殖分化因子-15(Growth differentiation factor-15:GDF15)は、肥満、糖尿病、がん、心血管、および腎臓障害に関連しているトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーの最近発見されたメンバーである50、58、59。皮膚性創傷治癒中、GDF15レベルは、未創傷皮膚と比較して、切除皮膚創傷後2日目に増加し(2～5倍)、治癒プロセスの後期段階(8日目)でも高いままであった(図4i)。本発明者らは、次に、切除皮膚生検モデルにおいてGDF15欠損マウスを試験した。GDF15ノックアウトマウスは、同腹子対照マウスと比較して2日目に大きな創傷を提示し(図4j)、これは、創傷におけるより大きなSlc7a11発現と相関していた(図4b)。GDF15が下流でのエフェロサイトーシスを生成するという考えと一致して、GDF15欠損樹状細胞は、対照と同等のエフェロサイトーシスを示した(図10a)。本発明者らは、次に、組換えGDF15(recombinant GDF15:rGDF15)の添加が糖尿病db/dbマウスの創傷治癒にもまた役立ってもよいかどうかを求めた。実際、rGDF15の適用は、db/dbマウスの創傷治癒を有意に改善した(図4k)。まとめると、これらのデータは、創傷部位でのSlc7a11阻害が、少なくとも2つのモダリティを介して:樹状細胞による損なわれた細胞クリアランスを逆転させることによって、および創傷治癒を促進するエフェロサイトーシス性細胞によるGDF15などの因子の分泌を介して、糖尿病性創傷治癒を改善することができることを示唆している。
【0097】
6．考察
本発明で提示されるデータは、in vitro、ex vivo、およびin vivoアプローチの組合せを用いて、樹状細胞媒介性のエフェロサイトーシスおよび組織再生/創傷治癒に対するその関連性に関する新しい概念を進歩させる。最初に、本発明者らは、樹状細胞によるアポトーシス細胞貪食中に複数の膜タンパク質およびトランスポータの発現が調節されることを実証する。これらの膜タンパク質のうち、アミノ酸トランスポータSlc7a11は、エフェロサイトーシスの負の調節因子として作用する。Slc7a11の阻害または喪失は、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスの両方において創傷治癒の改善をもたらすので、このエフェロサイトーシスの負の調節因子が創傷後にアップレギュレートされる理由は不明である。それにもかかわらず、負および正の調節因子(すなわち、「アクセル」と「ブレーキ」との同時押圧)の同様の同時アップレギュレーションが、抗原受容体シグナル伝達中のT細胞、増殖因子刺激中の線維芽細胞、およびFcR媒介食作用中のマクロファージで見られ、そしてin vivoでの精密にバランスのとれたシグナル伝達調節の一部である可能性が高い。機構的には、Slc7a11欠損樹状細胞における増強されたエフェロサイトーシスは、食細胞の中で樹状細胞にやや特有の特徴である、より大きな好気性解糖(グルコースの供給源がグリコーゲン保存に由来する)によって部分的に燃料供給される。
本発明で提示されるデータは、in vitro、ex vivo、およびin vivoアプローチの組合せを用いて、樹状細胞媒介性のエフェロサイトーシスおよび組織再生/創傷治癒に対するその関連性に関する新しい概念を進歩させる。最初に、本発明者らは、樹状細胞によるアポトーシス細胞貪食中に複数の膜タンパク質およびトランスポータの発現が調節されることを実証する。これらの膜タンパク質のうち、アミノ酸トランスポータSlc7a11は、エフェロサイトーシスの負の調節因子として作用する。Slc7a11の阻害または喪失は、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスの両方において創傷治癒の改善をもたらすので、このエフェロサイトーシスの負の調節因子が創傷後にアップレギュレートされる理由は不明である。それにもかかわらず、負および正の調節因子(すなわち、「アクセル」と「ブレーキ」との同時押圧)の同様の同時アップレギュレーションが、抗原受容体シグナル伝達中のT細胞、増殖因子刺激中の線維芽細胞、およびFcR媒介食作用中のマクロファージで見られ、そしてin vivoでの精密にバランスのとれたシグナル伝達調節の一部である可能性が高い。機構的には、Slc7a11欠損樹状細胞における増強されたエフェロサイトーシスは、食細胞の中で樹状細胞にやや特有の特徴である、より大きな好気性解糖(グルコースの供給源がグリコーゲン保存に由来する)によって部分的に燃料供給される。
【0098】
本発明はまた、皮膚性損傷中にアポトーシス細胞をクリアリングする際の関連するプレイヤーとして樹状細胞を明らかにする。最も驚くべきことに、アポトーシス細胞と共にSlc7a11の遮断を組み合わせることは、創傷治癒動態学を大幅に改善することができる。この加速された創傷治癒は、野生型マウスだけでなく、より重要なことには糖尿病の傾向のあるdb/dbマウスでも見られる。抗炎症性可溶性因子は、エフェロサイトーシス性食細胞から放出されることが知られているが、一方でSlc7a11欠損樹状細胞のトランスクリプトミクス分析により、GDF15は、Slc7a11の下流での創傷閉鎖を推進する1つの重要な細胞外メディエータとして同定された。このようにして、Slc7a11機能の阻害およびある特定の可溶性下流因子(例として、GDF15)の添加は、糖尿病状態における皮膚性創傷治癒を改善することができる。
【0099】
まとめると、本発明は、エフェロサイトーシス性樹状細胞の不偏トランスクリプトミクスから出発して、樹状細胞食作用および機構研究に対するブレーキとしてSlc7a11を同定することにより、皮膚性創傷治癒を改善するための新しいアプローチを明らかにする。この戦略は糖尿病性創傷治癒などの慢性創傷治癒管理に関連する。
【0100】
方法
ネズミ科組織プロセシング。先に記載したように、Slc7a11 KO同腹子および対照同腹子の耳からの細胞が単離された60。手短に言えば、耳皮膚試料が、耳の付け根で切断することによって収集され、細胞の手動切断および単離を推進にするために、200μg/mLのDispase II(Bacillusポリメラーゼグレード2;Roche、Basel、Switzerlandより)と共に4℃で一晩インキュベートされた。小さな皮膚片が、HEPESを緩衝し、2％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地中において、1.5mg/mLコラゲナーゼ4型(Worthington、Lakewood、NJ)および10 U DNase(Roche)で更に消化された。懸濁液が、30分ごとに再懸濁され、新鮮な消化緩衝液が37℃で合計90分間にわたり提供された。消化後、細胞懸濁液が濾過されて破片および血餅が除去された。脾臓単一細胞懸濁液では、脾臓は、0.01U/mLのDNase I(Roche)および0.02mg/mLのLiberase(Roche)を補充したRPMI培地中で30分間にわたり消化された。赤血球が、RBC溶解緩衝液(Biolegend;#420301)の1倍溶液で除去された。骨髄前駆細胞については、骨髄が、8週齢～12週齢のマウスの大腿骨および脛骨から単離された。
ネズミ科組織プロセシング。先に記載したように、Slc7a11 KO同腹子および対照同腹子の耳からの細胞が単離された60。手短に言えば、耳皮膚試料が、耳の付け根で切断することによって収集され、細胞の手動切断および単離を推進にするために、200μg/mLのDispase II(Bacillusポリメラーゼグレード2;Roche、Basel、Switzerlandより)と共に4℃で一晩インキュベートされた。小さな皮膚片が、HEPESを緩衝し、2％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地中において、1.5mg/mLコラゲナーゼ4型(Worthington、Lakewood、NJ)および10 U DNase(Roche)で更に消化された。懸濁液が、30分ごとに再懸濁され、新鮮な消化緩衝液が37℃で合計90分間にわたり提供された。消化後、細胞懸濁液が濾過されて破片および血餅が除去された。脾臓単一細胞懸濁液では、脾臓は、0.01U/mLのDNase I(Roche)および0.02mg/mLのLiberase(Roche)を補充したRPMI培地中で30分間にわたり消化された。赤血球が、RBC溶解緩衝液(Biolegend;#420301)の1倍溶液で除去された。骨髄前駆細胞については、骨髄が、8週齢～12週齢のマウスの大腿骨および脛骨から単離された。
【0101】
細胞単離。消化した耳および脾臓の単一細胞懸濁液が、リンパ球集団を枯渇させることによって食細胞について更に富化された。枯渇が、CD3e(145-2C11、#13-0031-82 eBioscience(商標))、CD19(eBio1D3-1D3、#13-0193-82 eBioscience(商標))、NK1.1(PK136、#13-5941-82 eBioscience(商標))に対するモノクローナルビオチン連結抗体を用いて実施され、続いてMagniSort(商標)ストレプトアビジン陰性選択ビーズ(#MSNB-6002-74 ThermoFisher)を用いて非枯渇細胞が収集された。骨髄由来樹状細胞およびマクロファージが、骨髄前駆細胞を、それぞれGM-CSF補充培地中で10日間およびM-CSF補充培地中で6日間にわたり培養することによって、ならびに以前に記載されたように61、マウスから産生された。
【0102】
フローサイトメトリーおよび細胞選別。マウス皮膚または脾臓の免疫表現型検査が単一細胞懸濁液に対して実施された。細胞は、以下の抗マウスモノクローナル蛍光色素連結抗体で染色された:CD24-AF488または-eFluor450(M1/69;##101816もしくは#48-0242-82)、CD11b-BV605(M1/70;#563015)、CD26-FITCまたは-BV650(H194-112;#559652もしくは#740474)、CD11c-BV711(HL3;#563048)、F4/80-BV785(BM8;#123141)、CD45-AF700(30-F11;#56-0451-82)、MHCII(I-A/I-E)-eFluor780(M5/114.15.2;#47-5321-82)、CD172a(SIRPアルファ)-PerCP-eFluor710(P84;#46-1721-82)、CD103-BUV395(M290;#740238)、CD64-BV421または-PE/Cy7(X54-5/7.1;#139309もしくは#139314)、XCR1-BV650(ZET;#148220)、およびFc受容体ブロッキング抗体CD16/CD32(クローン2.4G2、#553142)。生存細胞はFixable Viability Dye eFluor 506(#65-0866-18)を用いて識別された。測定の前に、計数ビーズ(#01-1234-42)がいくつかの実験のために細胞へ添加された。測定は、BD LSR Fortessaサイトメータで実施され、FlowJo10 software(TreeStar)を用いて分析された。細胞選別はFACS ARIAIIおよびIII(BD Biosciences)で実施された。
【0103】
フェロトーシスの特徴付け。フェロトーシスを評価するために、本発明者らは、以前に記載されたように62、酸化の際に蛍光特性を変化させるBODIPY(商標)581/591(C11-BODIPY)およびジヒドロローダミン123(DHR123)プローブを利用した。手短に言えば、樹状細胞は、測定の1時間前に蛍光プローブ:0.5μM C11-BODIPY(#D3861、ThermoFisher)または1μM DHR-123(#85100、Chemical、MI、USA)および0.5μM DRAQ7細胞死染色液(#DR70250、BioStatus、Shepshed、UK)を添加する前に、5μMエラスチン(#S7242、Bio-Connect B.V.)もしくは1μM ML-162(#AOB1514)またはDMSO対照で処置された。
【0104】
グリコーゲン濃度の決定。グリコーゲン濃度は、Glycogen Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(#GENT-K646-10、BioVision)を製造業者の説明書に従って用いて測定された。
【0105】
グルタチオンレベルの決定。グルタチオンは、エラスチン処置の2時間後に、GSH/GSSG-Glo Assayルミネセンスベースのシステムを製造業者の説明書(#V6611、Promega)に従って用いて、樹状細胞中において定量化された。GSH/GSSG比は、発光測定(相対光単位、RLU)および標準曲線からのグルタチオン濃度の内挿後に計算される。グリコーゲンおよびグルタチオンの両方のデータは、DMSO(ビヒクル)処置細胞またはWT細胞からの倍率変化として報告されている。
【0106】
Seahorse分析。100000のBMDCがSeahorse 96ウェル組織培養プレート(Agilent Technologies)に播種された。プレートは、30分間静置されて細胞が沈降された後、インキュベータ中に一晩置かれた。接着した細胞は、5μMのエラスチン(#S7242、Bio-Connect B.V)または200μMのCP-91149(#S2717、Bio-Connect B.V.)で処置された。Seahorse分析の2時間前。細胞は、製造業者の説明書に従ってアッセイの前に無血清Seahorse培地へと切り替えられた。基礎ECARおよびOCRについては、細胞は、XFリアルタイムATPレートキット(#103592-100、Agilent Technologies)に供された。呼吸能力の評価のために、細胞が、XF Cell Mito Stress Test Kit(#103015-100、Agilent Technologies)に供された。オリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/アンチマイシンAの逐次注射は、それぞれ、1.5μM、1.0μM、および0.5μMで行われた。
【0107】
エフェロサイトーシスアッセイ。アポトーシスの誘導のために、ヒトJurkat T細胞は、CypHer5E(#PA15401、GE Healthcare)、またはTAMRA(#C-1171、Invitrogen)、またはpHrodo(商標)Green STP Ester(#P35369、ThermoFisher)で染色され、5％ウシ胎児血清を有するRPMIに再懸濁され、150mJ/cm2の紫外線C照射(Stratalinker)で処置され、5％CO2により37℃で4時間インキュベートされた。樹状細胞は、表示時間にわたり1:5の食細胞:標的比でアポトーシス標的と共にインキュベートされた。食作用は、フローサイトメトリーベースのアッセイ21またはIncucyte Live-cell imagingによって評価された。食作用のための代替標的として、樹状細胞は、pHrodo(商標)Green E.coli BioParticles(商標)(#P35366、ThermoFisher)またはStreptavidin Fluoresbrite(登録商標)YG Microspheres、2.0μm(簡潔には、ビーズ)と共に、1:5の食細胞:標的比で表示時間にわたりインキュベートされた。適用可能な場合、細胞は、標的を添加する前に、5μMのエラスチン(#S7242、Bio-Connect B.V)、200μMのCP-91149(#S2717、Bio-Connect B.V.)、0.2mMの2-DG(2-デオキシ-D-グルコース;#D8375-1G、Sigma)、5μMのUK5099(#PZ0160、Sigma)、40μMのDON(6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン;#D2141-5MG、Sigma)、10μMの3-BP(3-ブロモ-2-オキソプロピオン酸、#376817-M、Sigma)、10mMのグルタミン酸(#6106-04-3、Sigma)で、1時間にわたり前処置された。
【0108】
siRNA実験。樹状細胞は、Dharmacon製のSMARTpool:Accell Slc7a11 siRNA(#E-047420-00-0010)、Accell Slc7a1 siRNA(#E-042922-00-0005)、Accell Slc7a5 siRNA(#E-041166-00-0010)またはAccell Non-targeting siRNA#1(#D-001910-01-05)、およびAccell Non-targeting siRNA#4(#D-001910-04-05)で、製造者の指示に従って、貪食アッセイの2日前に処置された。
【0109】
qRT-PCR。全RNAは、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて細胞から抽出され、cDNAは、Sensifast cDNA Synthesis Kit(#BIO-650504)を用いて製造業者の説明書に従って合成された。マウス遺伝子の定量的遺伝子発現分析は、Roche Lightcycler 480-384で実行される、ヒト配列と非交差反応性であるマウス配列特異的Taqmanプローブ(Applied Biosystems)を用いて実施された。
【0110】
ELISA。GDF15レベルは、マウス/ラットGDF-15 Quantikine ELISA Kit(#MGD150、R&D Systems)を用いることによって、樹状細胞または全皮膚溶解物の上清中において測定された。皮膚溶解物については、全部(剃毛した皮膚)は、Precellys 24組織ホモジナイザーを用いて50mM Tris-HCl(pH8,5)中に溶解され、試料あたり25μgの溶解物がELISAに使用された。
【0111】
RNA配列決定。野生型またはSlc7a11欠損BMDCは、アポトーシスJurkat細胞と4時間にわたり共培養され、未結合Jurkat細胞は、PBSで洗浄することによって除去され、貪食BMDCは、BD FACSAria(商標)III Cell Sorterで選別することによって単離された。総RNAが抽出され、mRNAライブラリが、Novogene製のIlluminaNovoseq6000platformを用いて調製された。HISAT2が選択されて、フィルタリングされた配列決定リードが参照ゲノムへとマッピングされた。マッピング結果を含有するBAMファイルは、RパッケージRsubreadの特徴カウント関数を用いて計数された。計数が比較のためにマウスゲノムとヒトゲノムの両方を用いて実施されたが、下流の分析はマウスデータに対してのみ実施された。次いで、DEG分析は、FDR≦0.05および0.58≦Log2FC≦-0.58を有する全ての遺伝子を考慮するDESeq2を用いて実施された分析から得られた全ての遺伝子は、文献検索、およびUniProtによる機能決定(既知または予測)を包含する複数の方法を用いてキュレートされた。
【0112】
scRNA配列決定および分析。対照野生型(WT:Cre陰性OTULINfl/fl;n＝1)皮膚、ならびに病変(L;n＝3)および非病変(NL;n＝2)ΔKerOTULIN皮膚から選別した生細胞上の単一細胞RNA配列決定(scRNAseq)データセットは、Hoste et al.,(Nature Communications,2021,In Press)に完全に記載されている。
【0113】
バイオインフォマティクス分析。遺伝子セットは、一方向性富化について試験され、Triwiseパッケージを用いて視覚化された。RStudio Version 1.2.1335で分析され、ImmGen Microarray V1データセット「GSE15907」から抽出された3つの樹状細胞(dendritic cell:DC)集団(肺、皮膚、および脾臓)の各々の正規化遺伝子計数の平均値に基づいた、遺伝子発現データセット。
【0114】
マウス。以下のマウス系統が使用された:C57BL/6J、Slc7a11 KO63および同腹子野生型、B6.BKS(D)-Leprdb/J(db/db)、ならびにPDGFRα-H2B-eGFPレポータマウス65。GDF15 KOマウスについては、ES細胞(参照番号64と同様)は、EUCOMMから入手され、本発明者らのトランスジェニックマウスコア施設で新たに産生された。マウスを、特定の病原体を含まない動物施設において、VIB炎症研究センターの個別に換気されたケージに収容した。マウスに対する全ての実験は施設、国、および欧州の動物規制に従って行われた。動物プロトコルはGhent Universityの倫理委員会によって承認された。
【0115】
皮膚創傷およびエラスチンレジメン。全層創傷は先に記載したように65、66作製された。簡潔には、創傷は、8週齢の雌C57BL/6J、B6.BKS(D)-Leprdb/J(db/db)、GDF15KO、Slc7a11KO、および対照同腹子において、鎮痛および全身麻酔下において8mmのパンチ生検針(Stiefel Instruments)を用いることによって、剃毛した背部皮膚に作製された。創傷治癒実験の場合、10～15％の標準偏差を仮定すると、両側対応のT検定を用いて、n＝10の実験群が、90％の統計的検出力(有意レベル0.05)を得て、平均20％の差を検出するために必要とされる。いかなる動物も実験から除外しなかった。
【0116】
局所適用のために、マウスは、創傷時および2日間連続して、イミダゾールケトンエラスチン(100μLのPBS中20mg kg-1のIKE;MedChemExpress、#HY-114481)または組換えヒトGDF-15(100μLのPBS中0.7mg kg-1;R&D Systems、#9279-GD-050)またはRSL3(100μLのPBS中20mg kg-1;Sellechem、#S8155)またはそれぞれのビヒクル対照(100μLのPBS溶中DMSOまたは4mM HCl)を皮内に注射された。「エラスチンレジメン」またはビヒクルレジメンとして指し示される実験では、500万個のアポトーシスJurkat細胞が、全層切除生検の直後に、背部皮膚上の50μLのPBS中で0日目に1回投与された。エフェロサイトーシス性樹状細胞からの上清を皮内注射したマウスについて、アポトーシスJurkat細胞と共に16時間にわたり培養された樹状細胞からの上清は、収集され、遠心分離されて壊死組織片が排出され、凍結または凍結乾燥して保存された。
【0117】
組織学および免疫組織化学。皮膚生検は、4％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定された。脱水工程後、試料は、パラフィンに包埋され、厚さ10μmで切片化された。脱脂(Dewaxed)パラフィン皮膚切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色されるか、または熱媒介性抗原賦活化(クエン酸緩衝液;pH＝6)に供され、アポトーシス細胞は、開裂型カスパーゼ-3抗体(1:100;Cell Signaling Technology#9664)で評価された。スライドが二次抗体とインキュベートされた後、ペルオキシダーゼ活性が、ジアミノベンジジン(DAB)基質キット(Cell signaling、#8059P)で検出された。核はヘマトキシリン染色で対比染色された。開裂型カスパーゼ-3＋陽性細胞は、ZeissによるZenソフトウェアを用いて手動で計数された。開裂型カスパーゼ-3＋の定量化は、遺伝子型または処置を知らされていない独立した研究者によって行われた細胞であった。
【0118】
免疫蛍光法。脱脂(Dewaxed)パラフィン皮膚切片は、熱媒介性抗原賦活化(クエン酸緩衝液;pH＝6)に供され、0.5％魚皮膚ゼラチン、PBS中4％BSAでブロックされ、ビオチン抗CD11c Ab(1:200、BD Pharmingen#553800)、および抗Slc7a11 Ab(1:200,自社開発67)または開裂型カスパーゼ-3抗体(1:100;Cell Signaling Technology#9664)で標識された。二次抗体として、ストレプトアビジン594 AlexaFluor(1:2000)およびロバ抗ウサギDyLight 488(1:2000)は、DAPIと組み合わせて使用された。
【0119】
統計分析。統計的有意性は、対応のないスチューデントの両側t検定、一元配置分散分析、または二元配置分散分析を用いて、GraphPad Prism 9を用いて決定された。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001は、有意と見なされた。
【0120】
参考文献
【表1】
【0121】
【表2】
【0122】
【表3】
【0123】
【表4】
【0124】
【表5】
【0125】
【表6】
【図1a-1】
【図1a-2】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e-g】
【図1h】
【図1i】
【図2a-c】
【図2d】
【図2e-f】
【図2g】
【図2h-i】
【図2j-k】
【図3a-b】
【図3c-d】
【図3e】
【図3f】
【図4a-c】
【図4d-f】
【図4g-h】
【図4i-k】
【図5a-b】
【図5c-f】
【図5g-h】
【図6a-d】
【図6e-f】
【図7a】
【図7b-e】
【図7f-g】
【図8a-1】
【図8a-2】
【図9a-b】
【図9c】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】