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特表2024-542061ネクロトーシス関連疾患の治療剤としてのアポモルヒネの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ネクロトーシス関連疾患の治療剤としてのアポモルヒネの用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/473 20060101AFI20241106BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241106BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241106BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241106BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241106BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20241106BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241106BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K31/473
A61K9/08
A61K47/02
A61K47/10
A61P43/00 105
A61P9/10
A61P37/06
A61P1/04
A61P31/04
A61P11/00
A61P1/00
A61P13/12
A61P1/16
A61P1/18
A61P7/00
A61K47/12
A61K47/18
A61K47/20
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525975
(86)(22)【出願日】2022-11-02
(85)【翻訳文提出日】2024-05-01
(86)【国際出願番号】 KR2022017018
(87)【国際公開番号】W WO2023080628
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】10-2021-0148543
(32)【優先日】2021-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524047534
【氏名又は名称】ヨンセイ・ユニバーシティ，インダストリー－アカデミック・コーオペレイション・ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＹＯＮＳＥＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】シン，ジョンス
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ミョンギル
(72)【発明者】
【氏名】パク，インホ
(72)【発明者】
【氏名】クァク，マンソプ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076CC07
4C076CC11
4C076CC14
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC32
4C076DD22Z
4C076DD31
4C076DD37
4C076DD41
4C076DD51
4C076DD57
4C076FF12
4C076FF61
4C086BC27
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZA51
4C086ZA59
4C086ZA60
4C086ZA66
4C086ZA68
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZB08
4C086ZB22
4C086ZB35
(57)【要約】
本発明は、ネクロトーシス関連疾患の予防または治療のためのアポモルヒネの新規用途を提供する。本発明は、アポモルヒネまたはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含むネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アポモルヒネまたはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、ネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
アポモルヒネがＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｋｅ ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）と結合してオリゴマー化を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記ネクロトーシス関連疾患は、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難障害（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、輸血関連急性肺障害（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ）、移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、大動脈瘤（ａｏｒｔｉｃ ａｎｅｕｒｙｓｍ）、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、回腸末端炎（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｌｅｉｔｉｓ）、急性腎不全（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、腎臓虚血－再灌流損傷（ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、肝損傷（ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ）、脂肪肝炎（ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）または骨髄不全（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆａｉｌｕｒｅ）である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記ネクロトーシス関連疾患は炎症性腸疾患である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記炎症性腸疾患は、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）または潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記薬学的に許容される塩は、無機酸塩、有機酸塩、アミノ酸塩、スルホン酸塩、金属塩及びアンモニウムイオン塩からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記薬学的組成物は、アポモルヒネ塩酸塩を含むものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記薬学的組成物は、注射剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
前記注射剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、ベンジルアルコール、塩酸及び水酸化ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）関連疾患を治療するためのアポモルヒネ（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）及びその用途に関し、具体的には、アポモルヒネまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含むネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞の適切な死滅は、生命体の生活において非常に重要な細胞作用中の一つの現象であり、不適切な細胞死滅は、がん、退行性疾患、免疫疾患、不適切な発生現象などのヒト疾患に非常に密接な関係がある。このような理由から、細胞死滅現象と細胞死滅を調節する現象、及び不適切な調節によって生じるヒト疾患とそれを克服する治療法の開発などは、生命科学分野で最も多く研究されている分野としてよく知られている。
【0003】
一般に、細胞死滅は、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の２つがある。細胞の自然死は、発達及び生理細胞回転率で調節されるプログラミングされた細胞死である。ネクローシスは、外部由来の物理的、化学的ストレス（熱、浸透圧、圧力、温度差による衝撃など）によって現れる直接的かつ高速な細胞死滅であり、このようなネクローシスは調節されず、プログラム化されていない偶然の原因に起因し、細胞膜の流失、細胞の崩壊などが起こるのが特徴である。また、細胞膜が流失されると、細胞内の物質が炎症を引き起こす。しかし、最近、多くの研究結果から、ネクローシスも偶然の事故による細胞死滅ではなく、アポトーシスと同様にプログラムされている細胞死滅メカニズムであることが明らかになっており、これを説明するために、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓまたはｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）という言葉が生まれた。
【0004】
ネクロトーシス（ｎｅｃｒｐｔｏｓｉｓ）は、細胞のプログラム化された細胞死滅（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｍｏｄｅ）である。細胞死滅に関する研究の大半は、プログラム化された細胞死滅であるアポトーシスに集中しており、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）という酵素が発見されたことで、多くの製薬会社は、カスパーゼ阻害剤を用いた薬物開発を過去１０年間進めてきた。しかし、未だにＦＤＡの承認を受けた薬物はほとんどないのが実状であり、これはアポトーシスが生理的状況で起こる細胞死滅であって、体内の恒常性を維持させる防御機序に起因する可能性が大きいからである。
【0005】
これとは対照的に、ネクロトーシスは、主に病的な状況で起こる細胞死滅であり、ほとんどの場合、炎症反応を伴う特徴を有している。ネクロトーシスによって誘発される疾患は、虚血性（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）、及び炎症性（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）疾患が代表的である。
【0006】
前記ネクロトーシスは、病的な状況における非調節的事故死であり、その作用機序、分子ターゲット及びシグナル伝達体系などがほとんど研究されていないため、ネクロトーシスが原因となる疾患を治療し、ネクロトーシスの生物学的、病理的原因を明らかにするために、このようなネクロトーシス阻害物質を発見して開発することは非常に緊急事項であるにもかかわらず、未だにこのようなネクロトーシス性疾患の適切な治療剤は報告されていない。
【0007】
一方、アポモルヒネ（ＡＰＯ）は、化学式Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ２の化合物であり、モルヒネをミネラル強酸と反応させて合成される麻薬性製剤の誘導体で、ドーパミンＤ２様受容体の活性を通じてパーキンソン病の治療に日常的に使用されるＦＤＡ承認薬物である。構造的にドーパミンと類似しており、ドーパミン性神経細胞に位置するドーパミン自己受容体を興奮させて作用する。具体的に、アポモルヒネは、黒質線条体路、辺縁系、視床下部及び脳下垂体でドーパミン受容体を活性化し、運動機能向上などの効果を誘発する。
【0008】
従来技術は、アポモルヒネを嘔吐誘発、勃起不全、パーキンソン病の治療に使用してきた。また、アポモルヒネが心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）治療剤（特許文献０００１参照）、神経変性疾患のうち運動ニューロン疾患（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＰＬＳ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の治療剤（特許文献０００２参照）、虚血性疾患のうち、虚血性脳卒中（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｐｏｐｌｅｘｙ）、虚血性脳血栓症（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、虚血性脳塞栓症（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｅｍｂｏｌｉｓｍ）、低酸素－虚血性脳症（ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、虚血性心臓疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、虚血性腸疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、末梢虚血疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｄｉｓｅａｓｅ）、虚血性再灌流誘発不整脈（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）の治療剤（特許文献０００３参照）として使用できることが開示された先行文献は存在するが、これらの文献はいずれもアポモルヒネのネクロトーシス死阻害作用については明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】ＣＮ公開特許第１０５７５３８７９ Ａ号
【特許文献2】ＵＳ公開特許第２０２１－０２１４３１０ Ａ１号
【特許文献3】ＵＳ公開特許第７２９４７１５ Ｂ２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ネクロトーシスを阻害する機能を有する薬物の提供を目的とする。
【0011】
また、本発明は、ネクロトーシス関連疾患の治療効能を有する薬物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
前記課題を解決するために、本発明者らは、ネクロトーシスを阻害する機能を有する物質を明らかにするための薬物スクリーニングを行い、その結果、アポモルヒネのネクロトーシス阻害機能及びネクロトーシス関連疾患の治療効能を明らかにした。
【0013】
したがって、本発明は、アポモルヒネまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含むネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【0014】
本発明は、アポモルヒネを有効成分として含む薬学的組成物を提供し、ネクロトーシス関連疾患の予防及び治療に有用に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1a】図１ａは、ヒト単核球細胞株ＴＨＰ－１細胞にＴＢＺ＋アポモルヒネ（ＡＰＯ）を処理した場合、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）吸収量を確認したグラフである。データは、２つの実験の平均値で表示される。（ＴＢＺ：ＴＮＦ－α（ＡＴＧｅｎ、ＴＮＦ０５０１）＋ＢＶ６（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｂ１３３２－５）＋Ｚ－ＶＡＤ（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｔｌｒｌ－ｖａｄ））
【図1c】図１ｃは、ＴＢＺ、ネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１）、ＡＰＯ処理された細胞を細胞質及び粗膜画分に分別した後、サンプルを表示された抗体でウエスタンブロットした写真である。ＬＤＨは細胞質マーカーであり、ＬＡＭＰ１は膜マーカーであり、データは、２つの独立した実験の平均として提示される。
【図2a】図２ａは、指示された時間の間に各分子を処理した細胞を細胞質画分と膜画分に分離し、非還元または還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した後、特定の抗体で調査した写真である。ＬＤＨは細胞質マーカーであり、ＬＡＭＰ１は膜マーカーである。
【図3b】図３ｂは、Ｆｌａｇ－ＭＬＫＬの膜／細胞質信号強度の倍数増加に対するグラフである。（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ、５μｍ、平均±ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ ＴＢＺ単独群対比、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ．）
【図4】図４は、ＴＢＺを処理したＴＨＰ－１細胞にＡＰＯを濃度依存的処理（１、５、２０、８０、３２０μＭ）した後、上澄み液を濃縮してＨＭＧＢ１抗体でウエスタンブロッティングを通じて確認した写真及びグラフである。データは、３つの独立した実験の平均値で表示される。（平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１ ＴＢＺ単独群対比、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ．）
【図6c】図６ｃは、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインに結合する酸化、還元形態のＡＰＯ（２５０、１２５、６２．５、３１．１２、１５．５６、７．８８、３．４４、１．７２、０．８６、０μｇ／ｍｌ）の表面プラズモンを分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、アポモルヒネを有効成分として含むネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【0017】
本明細書で使用される用語の「ネクロトーシス（Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）」とは、プログラム化された細胞死滅、ネクロトーシス、細胞壊死、壊死の意味として使用される。前記ネクロトーシスは、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出につながり、細胞外環境のＤＡＭＰ（ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ）は、代表的にＨＭＧＢ１があり、これは免疫系の活性化を誘発し、炎症を誘発する。細胞のプログラム化された細胞死滅であるネクロトーシスは、細胞質内のＲＩＰ１、ＲＩＰ３、ＭＬＫＬの順次的なシグナル伝達を通じて行われ、そのうち最後の段階であるＭＬＫＬ分子は、リン酸化時に細胞膜でオリゴマー化され、細胞膜に気孔を形成する。具体的には、リン酸化されたＭＬＫＬ（ｐ－ＭＬＫＬ）は、オリゴマー化を通じて４量体を形成する。２つの４量体は相互作用して８量体を形成し、細胞膜に気孔が形成される。これに関して、より詳細な情報は、Ｓｕｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４ Ｄｅｃ；３９（１２）：５８７－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１４．１０．００３．ＰＭＩＤ：２５４５５７５９をさらに参照してもよい。
【0018】
これに関連して、本発明では、アポモルヒネがネクロトーシスの最終媒介物質（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ）であるＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｋｅ ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）の細胞膜気孔（ｐｏｒｅ）の形成を特異的に阻害する特異性があることを確認した。
【0019】
本発明のアポモルヒネは、酸化反応が起こってＭＬＫＬと直接的な結合が増加することにより、ＭＬＫＬオリゴマー化が阻害され、これにより、最終的にネクロトーシスが阻害される。
【0020】
そこで、本発明は、ネクロトーシス関連疾患の予防または治療のためのアポモルヒネの新規用途を提供する。
【0021】
本発明のネクロトーシスに関連した疾患には、虚血性（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）、及び炎症性（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）疾患を含む。具体的には、前記ネクロトーシス関連疾患は、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難障害（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、輸血関連急性肺障害（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ）、移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、大動脈瘤（ａｏｒｔｉｃ ａｎｅｕｒｙｓｍ）、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、回腸末端炎（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｌｅｉｔｉｓ）、急性腎不全（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、腎臓虚血－再灌流損傷（ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、肝損傷（ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ）、脂肪肝炎（ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、骨髄不全（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆａｉｌｕｒｅ）などを含む。関連内容は、Ｋｈｏｕｒｙ ＭＫ、Ｇｕｐｔａ Ｋ、Ｆｒａｎｃｏ ＳＲ、Ｌｉｕ Ｂ．Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０２０ Ｆｅｂ；１９０（２）：２７２－２８５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１９．１０．０１２．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｎｏｖ ２６．ＰＭＩＤ：３１７８３００８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６９８３７２９；Ｗａｒｅ ＬＢ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ：ａ ＤＡＭＰ ｄｅａｔｈ？ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１４ Ｄｅｃ １５；１９０（１２）：１３３１－２．ｄｏｉ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１４１１－２０４７ＥＤ．ＰＭＩＤ：２５４９６０９７．；Ｌｅｅｐｅｒ ＮＪ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．ＪＡＣＣ Ｂａｓｉｃ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ．２０１６ Ｏｃｔ；１（６）：５４８－５５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｂｔｓ．２０１６．０８．００２．ＰＭＩＤ：２８４８０３３８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５４１９６８９．；Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｉ Ｅ，Ｗｉｔｔｋｏｐｆ Ｎ，Ａｍａｎｎ Ｋ，Ｗｅｉｇｍａｎｎ Ｂ，Ｎｅｕｍａｎｎ Ｈ，Ｗａｌｄｎｅｒ ＭＪ，Ｈｅｄｒｉｃｋ ＳＭ，Ｔｅｎｚｅｒ Ｓ，Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｃ．Ｃａｓｐａｓｅ－８ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＴＮＦ－α－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｌｅｉｔｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｓｅｐ １４；４７７（７３６４）：３３５－９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０４００．ＰＭＩＤ：２１９２１９１７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３３７３７３０．；Ｊｕｎ Ｗ，Ｂｅｎｊａｎｕｗａｔｔｒａ Ｊ，Ｃｈａｔｔｉｐａｋｏｒｎ ＳＣ，Ｃｈａｔｔｉｐａｋｏｒｎ Ｎ．Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ：Ａ ｍａｊｏｒ ｍｏｄｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ？Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０２０ Ａｕｇ １５；６８９：１０８４３３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂｂ．２０２０．１０８４３３．Ｅｐｕｂ ２０２０ Ｍａｙ ２６．ＰＭＩＤ：３２４７０４６１．；Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ Ｊ，Ｖｕｃｕｒ Ｍ，Ｌｕｅｄｄｅ Ｔ．Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１５ Ｍａｒ １２；１（３）：２６４－２６５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｍｇｈ．２０１５．０２．００１．ＰＭＩＤ：２８２１０６７９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５３０１１８９．；Ｒｏｄｅｒｉｃｋ ＪＥ，Ｈｅｒｍａｎｃｅ Ｎ，Ｚｅｌｉｃ Ｍ，Ｓｉｍｍｏｎｓ ＭＪ，Ｐｏｌｙｋｒａｔｉｓ Ａ，Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ Ｍ，Ｋｅｌｌｉｈｅｒ ＭＡ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ＲＩＰＫ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆａｉｌｕｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ＲＩＰＫ３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４ Ｏｃｔ ７；１１１（４０）：１４４３６－４１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４０９３８９１１１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｓｅｐ ２２．ＰＭＩＤ：２５２４６５４４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２０９９８９．をさらに参考してもよい。
【0022】
前記炎症性腸疾患には、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）または潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）が含まれてもよい。前記自己免疫疾患には、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）または関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）が含まれてもよい。
【0023】
本発明者らは、下記の実施例のＤＳＳ誘発大腸炎実験を通じて、アポモルヒネが炎症性腸疾患の症状の改善に効果があることを明らかにした。
【0024】
したがって、本発明は、アポモルヒネまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物、ネクロトーシス関連疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造のためのアポモルヒネまたはその薬学的に許容可能な塩の用途及び治療上有効量のアポモルヒネまたはその薬学的に許容可能な塩を対象体に投与することを含むアポトーシス壊死関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【0025】
本発明において薬学的に許容可能な塩は、当技術分野で通常の方法によって製造できるもので、例えば、塩酸、臭素酸、硫酸、硫酸水素ナトリウム、リン酸、硝酸、炭酸などの無機酸塩、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、コハク酸、安息香酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、酒石酸、グルコン酸、乳酸、ゲンチシン酸、フマル酸、ラクトビオン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸、またはアセチルサリチル酸(アスピリン)などの有機酸塩、グリシン、アラニン、バニリン、イソロイシン、セリン、システイン、シスチン、アスパラジン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、チロシン、プロリンなどのアミノ酸塩、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸などのスルホン酸塩、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との反応による金属塩、またはアンモニウムイオンとの塩などを含む。薬学的に許容可能な塩は、薬剤に使用できる限り、特に制限されるものではない。
【0026】
本発明の一具体例において、アポモルヒネは、塩の形態であってもよい。これに制限されるものではないが、本発明の薬学的組成物は、有効成分としてアポモルヒネ塩酸塩を含んでもよい。より具体的には、本発明において、アポモルヒネは、アポモルヒネ塩酸塩半水和物（ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ）であってもよい。
【0027】
本発明の薬学的組成物は、有効成分に加えて薬学的に許容可能な担体を少なくとも１種含む。本明細書において、「薬学的に許容可能な担体」とは、投与用薬学的活性化合物を剤形化する場合に有用であり、使用条件下で事実上、非毒性及び非敏感性である公知の薬学的添加剤を意味する。このような賦形剤の正確な比率は、活性化合物の溶解度と化学的特性、選ばれた投与経路だけでなく、標準薬剤学的慣行によって決定される。
【0028】
本発明の薬学的組成物は、適切で生理学的に許容される賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤などの添加剤を使用して所望の投与方法に適した形態で製剤化されてもよい。
【0029】
前記薬学的組成物は、これに制限されるものではないが、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、注射剤、フィルム剤または液剤の形態で製剤化されてもよい。
【0030】
薬学組成物の剤形及び薬剤学的に許容される担体は、当業界で公知の技術によって適切に選ばれてもよく、例えば、下記の文献を参照してもよい［Ｕｒｑｕｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１６：３６７，１９８０］；［Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ－ＤＩＳＰＥＲＳＥ ＳＹＳＴＥＭＳ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．３，１９９８］；［Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，７ｔｈ ｅｄ．，２０００］；［Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，ＴＨＥ ＥＸＴＲＡ ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＥＩＡ，３１ｓｔ ｅｄ．］；［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６ｔｈ－２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎｓ］；［ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，９ｔｈ ｅｄ．，１９９６］；［Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｓｖｏｌｄｓ’ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｄｅｌｇａｄｏ ａｎｄ Ｒｅｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，１０ｔｈ ｅｄ．，１９９８］。また、薬学組成物を製剤化する原理は、例えば、下記文献［Ｐｌａｔｔ，Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ，７：２８９－９９，１９８７］；［Ａｕｌｔｏｎ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＯＦ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭ ＤＥＳＩＧＮ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＮＹ，１９８８］；［ＥＸＴＥＭＰＯＲＡＮＥＯＵＳ ＯＲＡＬ ＬＩＱＵＩＤ ＤＯＳＡＧＥ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，ＣＳＨＰ，１９９８］，［「Ｄｒｕｇ Ｄｏｓａｇｅ，」Ｊ Ｋａｎｓ Ｍｅｄ Ｓｏｃ，７０（１）：３０－３２，１９６９］などを参照してもよい。
【0031】
これに制限されるものではないが、一具体例において、本発明の薬学的組成物は注射剤として製剤化されてもよい。注射剤は、静脈注射剤または皮下注射剤として製剤化されてもよい。非経口用注射剤の場合、一般的な注射剤組成物に含まれる成分を含んでもよい。例えば、注射剤組成物は、滅菌水、注射用水、生理食塩水などの液状担体を含む。さらに、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、電解質、ｐＨ調整剤、安定化剤、浸透圧調整剤及び溶解補助剤からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分をさらに含んでもよい。
【0032】
現在、アポモルヒネは皮下注射剤として開発され、商品名「アポキン（Ａｐｏｋｙｎ）」として市販されている。アポキンは、１日３回～５回皮下注射されるように開発されているが、本発明の薬学的組成物も必要に応じてアポキンなどの剤形として製剤化されてもよい。例えば、本発明の薬学的組成物は、皮下注射剤であってもよく、この場合、アポモルヒネの他に添加剤としてメタ重亜硫酸ナトリウム、ベンジルアルコール、塩酸、水酸化ナトリウムなどを含んでもよい。
【0033】
一具体例において、本発明の薬学的組成物は、舌下錠またはフィルム剤として製剤化してもよい。前記組成物が錠剤として製剤化された場合、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、抗酸化剤、乳化剤、増粘剤、固結防止剤、着香剤、着色剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、徐放化剤、安定化剤及びコーティング剤からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分をさらに含んでもよい。本発明の一実施例において、前記添加剤は、エデト酸ナトリウム、アスコルビン酸、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、クエン酸、微結晶セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、クールミントオレンジ（ＷＯＮＦ ＷＬ－２８４９９）、赤色３０酸化鉄（Ｅ１７２）、アセスルファムカリウム及びマンニトールを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0034】
前記組成物がフィルム剤として製剤化された場合、結合剤、安定化剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、コーティング剤、着香剤、甘味剤及びｐＨ調整剤をさらに含んでもよい。前記添加剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、二ナトリウムＥＤＴＡ、二水和物、グリセロール、グリセリルモノステアレート、ヒドロキシエチルセルロース、ヒプロメロース、マルトデキストリン、（－）－メントール、ピリドキシン塩酸塩、ナトリウム水酸化物、スクラロース及び白色インキを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0035】
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選ばれてもよい。しかし、好ましい効果のために、本発明の組成物は、１回１００μｇ～２００ｍｇ、例えば、２００μｇ～１００ｍｇ、例えば、２ｍｇ～６ｍｇ投与可能である。投与は１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。したがって、前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【0036】
本発明において「対象体」とは、疾患の予防または治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ネクロトーシス関連疾患の予防または治療を必要とするヒトまたは非ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの哺乳類を意味する。
【0037】
本発明の組成物は、様々な経路で投与されてもよい。投与のすべての方式は予想できるが、例えば、経口、経皮、舌下、直腸または静脈、筋肉、皮下、鼻腔内、子宮内硬膜または脳血管（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）内で投与されてもよい。
【0038】
本発明の好ましい実施形態において、前記薬学的組成物は、皮下注射によって投与されてもよい。
【0039】
本発明の利点と特徴、及びそれらを達成する方法は、詳細に後述する実施例を参照すれば明らかになるだろう。しかし、本発明は、以下に開示する実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態で具現されてもよく、ただ、本実施例は、本発明の開示が完全に行われるようにし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明のカテゴリを完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項のカテゴリによって定義されるのみである。
【実施例】
【0040】
実験方法
１－１．細胞株、培養及び形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１及びヒト結腸癌細胞株ＨＴ－２９を２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加された１０％ＦＢＳ－Ｒｏｓｗｅｌｌ ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で維持させた。ＴＨＰ－１細胞を３時間５００ｎＭ ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地でマクロファージに分化させた。ヒト Ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＬＫＬ）－Ｆｌａｇプラスミド（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＧ１２８１０－ＣＦ）形質移入は、ＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒ－ｍｉｎｉ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ）のエレクトロポレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。
１－１．細胞株、培養及び形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１及びヒト結腸癌細胞株ＨＴ－２９を２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加された１０％ＦＢＳ－Ｒｏｓｗｅｌｌ ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で維持させた。ＴＨＰ－１細胞を３時間５００ｎＭ ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地でマクロファージに分化させた。ヒト Ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＬＫＬ）－Ｆｌａｇプラスミド（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＧ１２８１０－ＣＦ）形質移入は、ＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒ－ｍｉｎｉ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ）のエレクトロポレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。
【0041】
１－２．動物実験
動物実験は、６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に延世医科大学動物実験室動物研究所動物管理委員会（ＹＬＡＲＣ、２０１８－００２４）により承認された手順に従って行った。マウスは一定温度及び湿度の下で、ケージ当たり最大４匹のポリプロピレンケージに収容され、明暗周期は１２時間毎に変わった。すべてのマウスは参加前に少なくとも７日間の適応期間を与えられた。
動物実験は、６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に延世医科大学動物実験室動物研究所動物管理委員会（ＹＬＡＲＣ、２０１８－００２４）により承認された手順に従って行った。マウスは一定温度及び湿度の下で、ケージ当たり最大４匹のポリプロピレンケージに収容され、明暗周期は１２時間毎に変わった。すべてのマウスは参加前に少なくとも７日間の適応期間を与えられた。
【0042】
１－３．ＤＳＳ誘発大腸炎のマウスモデル
デキストラン硫酸ナトリウム塩（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ、３６－５０ｋＤａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）誘発大腸炎のために、マウスに７日間飲料水に２．５％ＤＳＳを投与した。マウスをランダムに次の８つのグループに分けた。
デキストラン硫酸ナトリウム塩（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ、３６－５０ｋＤａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）誘発大腸炎のために、マウスに７日間飲料水に２．５％ＤＳＳを投与した。マウスをランダムに次の８つのグループに分けた。
【0043】
１）対照群
２）アポモルヒネ処理（＝ＡＰＯ；ＳＴＫ０８８４７７、Ｖｉｔａｓ－Ｍ、１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
３）ＡＰＯ処理（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
４）ＤＳＳ処理
５）ＤＳＳ及びネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、１８６４－５、１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
６）ＤＳＳ及びＡＰＯ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
７）ＤＳＳ及びＡＰＯ（１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
８）ＤＳＳ及びＡＰＯ（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
２）アポモルヒネ処理（＝ＡＰＯ；ＳＴＫ０８８４７７、Ｖｉｔａｓ－Ｍ、１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
３）ＡＰＯ処理（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
４）ＤＳＳ処理
５）ＤＳＳ及びネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、１８６４－５、１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
６）ＤＳＳ及びＡＰＯ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
７）ＤＳＳ及びＡＰＯ（１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
８）ＤＳＳ及びＡＰＯ（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内注射）
【0044】
マウスの体重及び疾患活性指数（ＤＡＩ）スコアを毎日記録した。ＤＡＩは体重減少（０点＝なし、１点＝１％－５％体重減少、２点＝５％－１０％体重減少、３点＝１０％－１５％体重減少、４点＝１５％以上の体重減少）、大便の粘稠度／下痢（０点＝正常、２点＝水っぽい便、４点＝水下痢）及び出血（０点＝出血なし、２点＝若干の出血、４点＝総出血）のスコアを足して計算した。実験が終了すると、マウスを犠牲にした後に大腸を摘出し、大腸の長さの変化を確認し、体重減少を測定した。
【0045】
本実験において、ＮＥＣ－１はＲＩＰ１リン酸化を阻害する物質として使用され、アポモルヒネの効果を確認するための対照群として使用された。
【0046】
１－４．組織サンプルの準備
実験終了後、マウスを犠牲にして、（盲腸のない）結腸を除去した。除去された結腸は、長さの測定前に、冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｗｅｌｌｇｅｎｅ、ＬＢ００１－０２）で洗浄した。測定された結腸は、腸間膜ラインに沿って腸分節を切断し、ＰＢＳで洗浄してさらなる分析のために準備した。その後、腸分節をペトリ皿に入れ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｏｕｉｎ’ｓ ｆｉｘａｔｉｖｅ（５０％ ｅｔｈａｎｏｌ／５％ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｄＨ２Ｏ）で固定した。内腔（Ｌｕｍｅｎ）側は片手にはフォーセップ（ｆｏｒｃｅｐｓ）で、もう片方の手にはつまようじで筋胃の端をつかみ、上に向けて維持し、結腸の平らな開いた端をトングで引っ張った後、筋胃の端をつまようじに巻いた。大腸の全体を包み、カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）に入れて４％パラホルムアルデヒド（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、ＰＣ２０３１－１００－００）に４℃で一晩浸した。
実験終了後、マウスを犠牲にして、（盲腸のない）結腸を除去した。除去された結腸は、長さの測定前に、冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｗｅｌｌｇｅｎｅ、ＬＢ００１－０２）で洗浄した。測定された結腸は、腸間膜ラインに沿って腸分節を切断し、ＰＢＳで洗浄してさらなる分析のために準備した。その後、腸分節をペトリ皿に入れ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｏｕｉｎ’ｓ ｆｉｘａｔｉｖｅ（５０％ ｅｔｈａｎｏｌ／５％ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｄＨ２Ｏ）で固定した。内腔（Ｌｕｍｅｎ）側は片手にはフォーセップ（ｆｏｒｃｅｐｓ）で、もう片方の手にはつまようじで筋胃の端をつかみ、上に向けて維持し、結腸の平らな開いた端をトングで引っ張った後、筋胃の端をつまようじに巻いた。大腸の全体を包み、カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）に入れて４％パラホルムアルデヒド（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、ＰＣ２０３１－１００－００）に４℃で一晩浸した。
【0047】
１－５．ネクロトーシス誘導
細胞をＺ－ＶＡＤ（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｔｌｒｌ－ｖａｄ）及び化合物で１時間前処理した後、ＴＮＦ－α（ＡＴＧｅｎ、ＴＮＦ０５０１）及びＢＶ６（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｂ１３３２－５）で指示された時間の間壊死を誘導した。準備された細胞は、分析に従って適切に処理された（Ｚ－ＶＡＤ：ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ－ｖａｌｙｌ－ａｌａｎｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ、ＴＮＦ－α：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α、ＢＶ６：４，４’－（１，６－ｈｅｘａｎｅｄｉｙｌ）ｂｉｓ［Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－（２Ｓ）－２－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ－β－ｐｈｅｎｙｌ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ）
細胞をＺ－ＶＡＤ（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｔｌｒｌ－ｖａｄ）及び化合物で１時間前処理した後、ＴＮＦ－α（ＡＴＧｅｎ、ＴＮＦ０５０１）及びＢＶ６（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｂ１３３２－５）で指示された時間の間壊死を誘導した。準備された細胞は、分析に従って適切に処理された（Ｚ－ＶＡＤ：ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ－ｖａｌｙｌ－ａｌａｎｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ、ＴＮＦ－α：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α、ＢＶ６：４，４’－（１，６－ｈｅｘａｎｅｄｉｙｌ）ｂｉｓ［Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－（２Ｓ）－２－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ－β－ｐｈｅｎｙｌ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ）
【0048】
１－６．ウェスタンブロット解析
細胞を薬物候補で処理し、４℃、１５００ｘｇで５分間遠心分離を使用して得た。上澄み液を再び４℃、１，５００ｘｇで５分間遠心分離して残った破片を除去し、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－０．５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ １０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０９６）を使用して４℃、１４，０００ｘｇで３０分間濃縮させて保管した。得られた細胞は、１Ｘプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｐ３１００－００１）及びホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８６２４９５）を含む１ｘ放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｒ４１００－０１０）を使用して溶解した。次に、細胞溶解物を４℃、２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して破片を除去した。抽出されたタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２５）を用いて測定した。濃縮して保管していた上澄み液と抽出したタンパク質は、非還元性または還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（８％～１２％）で処理し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ニトロセルロース膜に移した。トリス緩衝生理食塩水－１％ツイン２０（ＴＢＳ－Ｔ）で５％ ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋで膜を遮断し、ＭＬＫＬ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４９９３Ｓ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＭＬＫＬ（Ｓ３５８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９１６８９Ｓ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ、ＬＦ－ＰＡ００１８）、ｐｈｓｐｈｏ－ＲＩＰ１（Ｓ１６６）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６５７４６Ｓ）、ＲＩＰ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ７２１３９）、ＬＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２Ｓ）、ＬＡＭＰ１（Ａｂｃａｍ，ａｂ２４１７０）、ＨＭＧＢ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２３１０）に特異的な抗体で調査した。
細胞を薬物候補で処理し、４℃、１５００ｘｇで５分間遠心分離を使用して得た。上澄み液を再び４℃、１，５００ｘｇで５分間遠心分離して残った破片を除去し、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－０．５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ １０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０９６）を使用して４℃、１４，０００ｘｇで３０分間濃縮させて保管した。得られた細胞は、１Ｘプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｐ３１００－００１）及びホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８６２４９５）を含む１ｘ放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｒ４１００－０１０）を使用して溶解した。次に、細胞溶解物を４℃、２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して破片を除去した。抽出されたタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２５）を用いて測定した。濃縮して保管していた上澄み液と抽出したタンパク質は、非還元性または還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（８％～１２％）で処理し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ニトロセルロース膜に移した。トリス緩衝生理食塩水－１％ツイン２０（ＴＢＳ－Ｔ）で５％ ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋで膜を遮断し、ＭＬＫＬ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４９９３Ｓ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＭＬＫＬ（Ｓ３５８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９１６８９Ｓ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ、ＬＦ－ＰＡ００１８）、ｐｈｓｐｈｏ－ＲＩＰ１（Ｓ１６６）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６５７４６Ｓ）、ＲＩＰ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ７２１３９）、ＬＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２Ｓ）、ＬＡＭＰ１（Ａｂｃａｍ，ａｂ２４１７０）、ＨＭＧＢ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２３１０）に特異的な抗体で調査した。
【0049】
１－７．細胞下の画分
得られた細胞を１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１Ｘプロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤が補充された２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に再懸濁し、３０分間氷で培養した。細胞を２２ゲージ針に３０回通し、５００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を再び２０，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、細胞質画分として保管した。残ったペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、２０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、粗膜画分（ｃｒｕｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）として保存した。
得られた細胞を１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１Ｘプロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤が補充された２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に再懸濁し、３０分間氷で培養した。細胞を２２ゲージ針に３０回通し、５００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を再び２０，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、細胞質画分として保管した。残ったペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、２０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、粗膜画分（ｃｒｕｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）として保存した。
【0050】
１－８．気孔形成細胞のＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）吸収測定のためのマイクロプレートリーダー
細胞を平らで底が透明な、黒い壁の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにプレーティングした後、７時間の化学処理及び壊死誘導の後、ＰＩ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を最終濃度５０μｇ／ｍｌで添加した。元の培養条件下で１０分間培養した後、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ ３００１プレートリーダーでリアルタイム蛍光モニタリングし、５３０ｎｍで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）後、６１７ｎｍの放出波長を測定した。データ収集は、３７℃で行った。（図１ａ）
細胞を平らで底が透明な、黒い壁の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにプレーティングした後、７時間の化学処理及び壊死誘導の後、ＰＩ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を最終濃度５０μｇ／ｍｌで添加した。元の培養条件下で１０分間培養した後、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ ３００１プレートリーダーでリアルタイム蛍光モニタリングし、５３０ｎｍで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）後、６１７ｎｍの放出波長を測定した。データ収集は、３７℃で行った。（図１ａ）
【0051】
１－９．免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
細胞を細胞培養処理されたガラスチャンバースライドに接種した。これらの細胞をＺ－ＶＡＤ、ＢＶ６及び指示された化合物で１時間前処理した後、一晩ＴＮＦ－α及びＢＶ６で処理した。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＰＢＳの０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間培養する前に、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。細胞をＰＢＳの５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間遮断し、抗－Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７４２５－２ＭＧ）抗体を使用して染色した。核はＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－４９５９－５２）で染色した。イメージは共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００）を使用してキャプチャした。
細胞を細胞培養処理されたガラスチャンバースライドに接種した。これらの細胞をＺ－ＶＡＤ、ＢＶ６及び指示された化合物で１時間前処理した後、一晩ＴＮＦ－α及びＢＶ６で処理した。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＰＢＳの０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間培養する前に、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。細胞をＰＢＳの５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間遮断し、抗－Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７４２５－２ＭＧ）抗体を使用して染色した。核はＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－４９５９－５２）で染色した。イメージは共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００）を使用してキャプチャした。
【0052】
１－１０．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＭＬＫＬとアポモルヒネ（＝ＡＰＯ）の相互作用は、ＧＥヘルスケアのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用したＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析を通じて感知された。ｐＨスカウティングのために、ｐＨ４．０～６．０ １０ｍＭ酢酸ナトリウムからなる緩衝液を使用した。スカウトされたバッファ条件としてＭＬＫＬタンパク質（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４１４５３）、及び実験室で精製したＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍ（１－１５４アミノ酸）タンパク質をセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に固定化した。Ｒｌｉｇａｎｄ値を導出するために、ＭＬＫＬ、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメイン（ＭＷリガンド）とＡＰＯ（ＭＷ分析物質）の分子量を基準としてカップリング過程を行った。酸化（２４ｈｒ、ＲＴ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、還元（＋ＤＴＴ（ＤＬ－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ））形態のＡＰＯを２５℃でｐＨ ７．４１０ｍＭ ＨＥＰＥＳからなる実行緩衝液（１０μｌ／ｍｉｎ流速）に注入した。センサーグラムはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムで提供される制御ソフトウェアを使用してリアルタイムで記録及び分析された。６つ以上の濃度のＡＰＯを結合に使用し、それぞれのＫＤ値を導出した。すべての実行データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して計算された。
ＭＬＫＬとアポモルヒネ（＝ＡＰＯ）の相互作用は、ＧＥヘルスケアのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用したＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析を通じて感知された。ｐＨスカウティングのために、ｐＨ４．０～６．０ １０ｍＭ酢酸ナトリウムからなる緩衝液を使用した。スカウトされたバッファ条件としてＭＬＫＬタンパク質（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４１４５３）、及び実験室で精製したＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍ（１－１５４アミノ酸）タンパク質をセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に固定化した。Ｒｌｉｇａｎｄ値を導出するために、ＭＬＫＬ、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメイン（ＭＷリガンド）とＡＰＯ（ＭＷ分析物質）の分子量を基準としてカップリング過程を行った。酸化（２４ｈｒ、ＲＴ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、還元（＋ＤＴＴ（ＤＬ－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ））形態のＡＰＯを２５℃でｐＨ ７．４１０ｍＭ ＨＥＰＥＳからなる実行緩衝液（１０μｌ／ｍｉｎ流速）に注入した。センサーグラムはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムで提供される制御ソフトウェアを使用してリアルタイムで記録及び分析された。６つ以上の濃度のＡＰＯを結合に使用し、それぞれのＫＤ値を導出した。すべての実行データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して計算された。
【0053】
１－１１．組織学的評価
実験後、犠牲になったマウスから収集した結腸組織を一晩４％パラホルムアルデヒドに固定した。スイス－圧延及び固定結腸標本をパラフィンに包埋した。５μｍのセクションを切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。全体の結腸の長さによる大腸炎病変の組織学的評価は、陰窩構造（ｃｒｙｐｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）損傷の程度（０～３）、炎症細胞の浸潤の程度（０～３）、及び粘膜下浮腫（０～３）のスコアシステムを参照して行った。
実験後、犠牲になったマウスから収集した結腸組織を一晩４％パラホルムアルデヒドに固定した。スイス－圧延及び固定結腸標本をパラフィンに包埋した。５μｍのセクションを切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。全体の結腸の長さによる大腸炎病変の組織学的評価は、陰窩構造（ｃｒｙｐｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）損傷の程度（０～３）、炎症細胞の浸潤の程度（０～３）、及び粘膜下浮腫（０～３）のスコアシステムを参照して行った。
【0054】
１－１２．免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）及び過ヨウ素酸－シッフ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ；ｐＡＳ）
５μｍの切断パラフィンセクションは、５％ＢＳＡが補充されたＴＢＳ－Ｔで遮断し、その後、セクションと１次抗体を４℃で一晩共同培養を行った。２次抗体を添加し、１時間培養した。生成されたセクションをＤＡＢ（３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）キットとともに１０分間培養した。ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）染色は、標準プロトコルに従って行われた。
５μｍの切断パラフィンセクションは、５％ＢＳＡが補充されたＴＢＳ－Ｔで遮断し、その後、セクションと１次抗体を４℃で一晩共同培養を行った。２次抗体を添加し、１時間培養した。生成されたセクションをＤＡＢ（３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）キットとともに１０分間培養した。ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ）染色は、標準プロトコルに従って行われた。
【0055】
１－１３．統計分析
実験データの分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。データは、個別図面の凡例に示すように、平均値とＳＤ、ＳＥＭを示す。差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１のときに統計的に有意であるとみなされた。
実験データの分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。データは、個別図面の凡例に示すように、平均値とＳＤ、ＳＥＭを示す。差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１のときに統計的に有意であるとみなされた。
【0056】
実験例１：アポモルヒネ処理時の細胞膜気孔形成能力の確認
最初のスクリーニング過程としてＰＩ吸収を測定（実験方法１－８）し、細胞膜インテグリティの変化を調べるために、ＰＩ吸収をＴＢＺで処理されたシグナル強度の３０％未満に減少させた化合物を選択した。
最初のスクリーニング過程としてＰＩ吸収を測定（実験方法１－８）し、細胞膜インテグリティの変化を調べるために、ＰＩ吸収をＴＢＺで処理されたシグナル強度の３０％未満に減少させた化合物を選択した。
【0057】
ＴＢＺ＋ＡＰＯを処理したＴＨＰ－１細胞にＰＩを１０分間処理した後、細胞に吸収されたＰＩをマイクロプレートリーダーで測定した。阻害剤対照群としてネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１）を使用した。データは、２つの実験の平均値で表示される。（ＴＢＺ：ＴＮＦ－α＋ＢＶ６＋Ｚ－ＶＡＤ）
【0058】
その結果、アポモルヒネ（＝ＡＰＯ）は、ＰＩ吸収量を効果的に減少させ、選択された化合物が細胞膜気孔の形成を減少させる能力を減少させた（図１ａ）。
【0059】
実験例２：アポモルヒネのＭＬＫＬリン酸化阻害の有無の確認
２次スクリーニングプロセスとしてＭＬＫＬのリン酸化の程度を機能的分析のためにウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）で測定して行った（実験方法１－６、図１ｂ）。表示された抗体を使用したウェスタンブロッティングは、ＴＢＺ＋ＡＰＯで処理された細胞においてＭＬＫＬのリン酸化の変化を示す。データは、２つの独立した実験の平均値で表示される。
２次スクリーニングプロセスとしてＭＬＫＬのリン酸化の程度を機能的分析のためにウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）で測定して行った（実験方法１－６、図１ｂ）。表示された抗体を使用したウェスタンブロッティングは、ＴＢＺ＋ＡＰＯで処理された細胞においてＭＬＫＬのリン酸化の変化を示す。データは、２つの独立した実験の平均値で表示される。
【0060】
その結果、ＡＰＯは、ＭＬＫＬのリン酸化を阻害しなかった。すなわち、前記実験例１から確認したように、ＡＰＯは、細胞膜気孔の形成を減少させるが、これはＡＰＯがＭＬＫＬのリン酸化から細胞膜気孔形成までの過程に影響を与えて壊死を阻害したことが分かる。
【0061】
実験例３：アポモルヒネに関連した壊死経路の確認
アポモルヒネが壊死経路のどの段階に影響を及ぼすかを確認するために、ＴＢＺ、ＮＥＣ－１、ＡＰＯ処理された細胞を細胞質及び粗膜画分に分別した後、サンプルを表示された抗体でウエスタンブロットを行った。
アポモルヒネが壊死経路のどの段階に影響を及ぼすかを確認するために、ＴＢＺ、ＮＥＣ－１、ＡＰＯ処理された細胞を細胞質及び粗膜画分に分別した後、サンプルを表示された抗体でウエスタンブロットを行った。
【0062】
その結果、細胞の細胞質及び膜の画分化により、壊死経路の媒介体であるＲＩＰ１及びＭＬＫＬのリン酸化、及び細胞質から膜画分への前記分子の電位が確認された（図１ｃ）。また、最大阻害の５０％を誘発する薬物の阻害濃度（ＩＣ ５０）は、ＡＰＯ（ＩＣ ５０＝５．７μｍ）の濃度依存的方式で細胞膜完全性の変化を測定して確認した（図１ｄ）。
【0063】
実験例４：アポモルヒネのＭＬＫＬオリゴマー化阻害の確認
細胞膜の気孔形成のためのｐ－ＭＬＫＬの４量体及び８量体の形成がアポモルヒネ（＝ＡＰＯ）によって阻害されるかどうかをテストするために、指示された時間にわたって各分子を処理した細胞を細胞質画分と膜画分に分離し、非還元または還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、特定の抗体で調査した（実験方法１－６）。ここで、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は細胞質マーカーであり、ＬＡＭＰ１（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は膜マーカーである。
細胞膜の気孔形成のためのｐ－ＭＬＫＬの４量体及び８量体の形成がアポモルヒネ（＝ＡＰＯ）によって阻害されるかどうかをテストするために、指示された時間にわたって各分子を処理した細胞を細胞質画分と膜画分に分離し、非還元または還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、特定の抗体で調査した（実験方法１－６）。ここで、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は細胞質マーカーであり、ＬＡＭＰ１（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は膜マーカーである。
【0064】
その結果、ＡＰＯを処理した場合にＭＬＫＬの４量体及び８量体のバンド強度が減少したことが確認できた（図２）。すなわち、ＡＰＯは、ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害する。特に、図２ｂにおいて、壊死誘導後にＭＬＫＬのオリゴマー化が経時的に確認された。
【0065】
実験例５：アポモルヒネの細胞膜へのＭＬＫＬ電位遮断の確認
形質移入したＴＨＰ－１細胞をＴＢＺまたはＮＥＣ－１、ＡＰＯで処理し、ＤＡＰＩ及びＡｌｅｘａ ４８８で染色した。共焦点顕微鏡を使用してＭＬＫＬ－ｆｌａｇタンパク質の発現を通じて、形質移入したＴＨＰ－１細胞においてＭＬＫＬの細胞内位置を追跡した（実験方法１－９）。
形質移入したＴＨＰ－１細胞をＴＢＺまたはＮＥＣ－１、ＡＰＯで処理し、ＤＡＰＩ及びＡｌｅｘａ ４８８で染色した。共焦点顕微鏡を使用してＭＬＫＬ－ｆｌａｇタンパク質の発現を通じて、形質移入したＴＨＰ－１細胞においてＭＬＫＬの細胞内位置を追跡した（実験方法１－９）。
【0066】
壊死を誘導するためにＴＢＺで処理した細胞は、ＭＬＫＬのリン酸化及び原形質膜へのｐ－ＭＬＫＬの転位を示した。Ｆｌａｇ－ＭＬＫＬシグナルは、生理学的条件下で細胞の全体に分布し、一方、ＴＢＺを処理した細胞は、細胞膜においてｄｏｔ ｌｉｋｅ Ｆｌａｇ－ＭＬＫＬシグナルの分布を示した。
【0067】
Ｆｌａｇ－ＭＬＫＬシグナルは、ＲＩＰ１リン酸化阻害剤であるＮＥＣ－１及びＴＢＺ刺激を受けたものと同様に、ＡＰＯ及びＴＢＺ刺激を受けた細胞の細胞質内に大部分分布した。
【0068】
これにより、細胞質において、ＡＰＯが、ＭＬＫＬが細胞膜に集中分布されるのを阻害することが確認できる。
【0069】
実験例６：アポモルヒネの濃度依存的処理によるＨＭＧＢ１分泌阻害の確認
ＴＢＺ処理で壊死を誘導したＴＨＰ－１細胞にＡＰＯを処理して壊死の特徴の一つであるＤａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎの中で代表的なＨＭＧＢ１の分泌が阻害されるかどうかをテストするために、８時間ＡＰＯを濃度依存的処理（１、５、２０、８０、３２０μＭ）した後、上澄み液をすべて濃縮させて、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、ＨＭＧＢ１抗体で調査した（実験方法１－６）。阻害剤対照群としてネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１）を使用し、データは、３つの独立した実験の平均値で表示される。
ＴＢＺ処理で壊死を誘導したＴＨＰ－１細胞にＡＰＯを処理して壊死の特徴の一つであるＤａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎの中で代表的なＨＭＧＢ１の分泌が阻害されるかどうかをテストするために、８時間ＡＰＯを濃度依存的処理（１、５、２０、８０、３２０μＭ）した後、上澄み液をすべて濃縮させて、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、ＨＭＧＢ１抗体で調査した（実験方法１－６）。阻害剤対照群としてネクロスタチン－１（ＮＥＣ－１）を使用し、データは、３つの独立した実験の平均値で表示される。
【0070】
その結果、ＴＢＺのみを処理したグループを基準としてＡＰＯを濃度依存的処理することにより、上澄み液として分泌されるＨＭＧＢ１の量が減少することを確認した（図４）。これにより、ＡＰＯ処理により壊死過程を通じて分泌されるＨＭＧＢ１を減少させて壊死が阻害されることが確認できる。
【0071】
実験例７：アポモルヒネのＭＬＫＬ結合による壊死経路阻害の確認
前記実験例を通じて、ＡＰＯがｐ－ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害し、細胞膜ｐｏｒｅの形成が阻害されることを確認した。本実施例では、ＡＰＯがＭＬＫＬ、その中でもＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインへの直接的な結合を通じて阻害が達成されるかを確認した。
前記実験例を通じて、ＡＰＯがｐ－ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害し、細胞膜ｐｏｒｅの形成が阻害されることを確認した。本実施例では、ＡＰＯがＭＬＫＬ、その中でもＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインへの直接的な結合を通じて阻害が達成されるかを確認した。
【0072】
ＡＰＯとＭＬＫＬタンパク質との間の相互作用パターンを分析するために、ＳＰＲ分析を用いた（実験方法１～１０）。ＭＬＫＬとＡＰＯの結合において、１．２７２Ｅ－８ＭのＫＤ値が得られ、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍとＡＰＯの結合では６．２５４Ｅ－８ＭのＫＤ値が得られた。ここで、ＣＭ５チップに固定されたＭＬＫＬ、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインタンパク質と６つの濃度のＡＰＯを結合させて分析した。
【0073】
すなわち、ＡＰＯを処理する場合、ＭＬＫＬのＮ－ｔｅｒｍドメインに高い親和力で直接結合してＭＬＫＬオリゴマー化が阻害されることが確認できる。
【0074】
実験例８：アポモルヒネの酸化反応によるＭＬＫＬのオリゴマー化阻害の確認
ＡＰＯは、光と空気の存在下で時間が経つにつれて自発的に酸化反応が起こることは、すでによく知られている事実である。本実施例では、ＡＰＯの酸化度によって細胞内のＭＬＫＬとの結合が増加することにより、ＭＬＫＬのオリゴマー化が減少するかどうかをテストするために、ＡＰＯを常温で２４時間保管することにより酸化形態を準備し、実験直前に溶かしたＡＰＯにＤＴＴ処理して還元された形態を準備し、指示された時間の間、各分子を処理した細胞を溶解し、非還元または還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、特定の抗体で調査した（実験方法１－６）。
ＡＰＯは、光と空気の存在下で時間が経つにつれて自発的に酸化反応が起こることは、すでによく知られている事実である。本実施例では、ＡＰＯの酸化度によって細胞内のＭＬＫＬとの結合が増加することにより、ＭＬＫＬのオリゴマー化が減少するかどうかをテストするために、ＡＰＯを常温で２４時間保管することにより酸化形態を準備し、実験直前に溶かしたＡＰＯにＤＴＴ処理して還元された形態を準備し、指示された時間の間、各分子を処理した細胞を溶解し、非還元または還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、特定の抗体で調査した（実験方法１－６）。
【0075】
その結果、酸化されたＡＰＯを処理した場合にＭＬＫＬの４量体と８量体バンドの強度が減少し、還元されたＡＰＯを処理した場合には変化がないことが確認できた（図６ａ）。これにより、ＡＰＯの酸化反応によってＭＬＫＬのオリゴマー化が阻害されることを確認し、これはＡＰＯの酸化程度によってＭＬＫＬとの結合が増加することによって起こることを確認するために、ＭＬＫＬとＡＰＯの酸化反応による相互作用パターンをＳＰＲで分析した（実験方法１－１０）。
【0076】
その結果、ＭＬＫＬタンパク質と酸化されたＡＰＯの結合が４．９９８Ｅ－９Ｍ、還元されたＡＰＯの結合が２．４４２Ｅ－７Ｍ（図６ｂ）、及びＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインと酸化されたＡＰＯの結合が１．３１２Ｅ－６Ｍ、還元されたＡＰＯの結合は１．１４Ｅ－３ＭのＫＤ値が得られた（図６ｃ）。ここで、ＣＭ５チップに固定されたＭＬＫＬ、ＭＬＫＬ Ｎ－ｔｅｒｍドメインタンパク質と６つ以上の濃度のサンプルを結合させて分析した。
【0077】
すなわち、ＡＰＯの酸化反応が起こることにより、ＭＬＫＬとの直接的な結合が増加し、ＭＬＫＬのオリゴマー化が阻害されることを確認した。
【0078】
実験例９：アポモルヒネのＤＳＳ誘発大腸炎改善の確認
生体内のＡＰＯの効果を確認するために、ヒト大腸炎の症状を模倣したＤＳＳ誘導大腸炎マウスモデルを行った。マウスにおいて大腸炎の症状の緩和は、体重とＤＡＩスコアで毎日測定し、結腸の長さ、Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ染色、免疫反応及び完了後のマウスの粘膜障壁の損傷を測定して比較した。
生体内のＡＰＯの効果を確認するために、ヒト大腸炎の症状を模倣したＤＳＳ誘導大腸炎マウスモデルを行った。マウスにおいて大腸炎の症状の緩和は、体重とＤＡＩスコアで毎日測定し、結腸の長さ、Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ染色、免疫反応及び完了後のマウスの粘膜障壁の損傷を測定して比較した。
【0079】
図７ａに示すように、ＤＳＳグループのマウスは、大腸炎による陰窩構造（ｃｒｙｐｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の損傷、炎症細胞の浸潤及び粘膜下浮腫を示した。粘液物質もＰＡＳ染色において有意に減少し、これはＩＢＤ患者において一般的に観察される結腸粘液の分泌が有意に減少したことを示す。ＡＰＯを０．１５、１．５、１５ｍｇ／ｋｇ注入した群では、Ｈ＆Ｅ染色とＰＡＳ染色において観察できる大腸炎の特徴的な症状が濃度依存的に緩和された。ＡＰＯ処理は、さらにＨＩスコア（図７ａ）、結腸短縮の量（図７ｂ）及びＤＡＩスコア（図７ｃ）を減少させることが示された。
【0080】
要約すると、ＡＰＯ単独処理による差異はなく、ＤＳＳ処理の有害な効果は、ＡＰＯの濃度依存的処理によって改善された。すなわち、これらの結果は、ＡＰＯがＤＳＳ誘発大腸炎に対する保護効果があることを示す。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【国際調査報告】