特表2024-542093組換えヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを含む多価インフルエンザワクチン、並びにその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】組換えヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを含む多価インフルエンザワクチン、並びにその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/145 20060101AFI20241106BHJP
A61K 39/295 20060101ALI20241106BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20241106BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241106BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K39/145 ZNA
A61K39/295
A61K39/39
A61P31/16
A61P37/04
C07K14/11
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526572
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-06-13
(86)【国際出願番号】 US2022079274
(87)【国際公開番号】W WO2023081798
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/276,284
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517055195
【氏名又は名称】サノフィ パスツール インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー・アレファンティス
(72)【発明者】
【氏名】マリオ・バロ
(72)【発明者】
【氏名】アンソニー・バイヤーズ
(72)【発明者】
【氏名】グアダルペ・コルテス－ガルシア
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ－アレクサンドレ・ジルベール
(72)【発明者】
【氏名】ハロルド・クリーンサウス
(72)【発明者】
【氏名】アルマハン・ナイク
(72)【発明者】
【氏名】コンスタンティン・プガチョフ
(72)【発明者】
【氏名】サランヤ・シュリダー
(72)【発明者】
【氏名】トーステン・ヴォーゲル
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム・ワレン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA55
4C085BB11
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085FF30
4C085GG03
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本願で開示されているのは、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）、及び任意選択的なアジュバントを含む多価ワクチン又は免疫原性組成物である。同様に開示されているのは、このワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、前記複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、第１の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルス（ＨＡ）；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルス（ＮＡ）；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
を含む、免疫原性組成物。
【請求項2】
前記第１、第２、第３、及び第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、改変組換えインフルエンザウイルスＮＡである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
前記改変組換えインフルエンザウイルスＮＡは、４つの改変単量体ＮＡ分子であって、各々は、前記インフルエンザウイルスの前記ＮＡの頭部領域を含むが、前記インフルエンザウイルスの前記ＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いている、改変単量体ＮＡ分子を含む改変組換え四量体インフルエンザウイルスＮＡを含み、前記改変単量体ＮＡ分子は、宿主細胞中で発現された場合に、改変組換え四量体ＮＡを形成する、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
各改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種四量体化ドメインを含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
各改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種オリゴマー化ドメインを含まない、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
前記異種四量体化ドメインは、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラキオン四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質由来の四量体化ドメイン、又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、培養昆虫細胞中においてバキュロウイルス発現系により産生されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
前記免疫原性組成物は、不活性化インフルエンザビリオン又は生弱毒化インフルエンザビリオンを含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれ、及び／又は前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、標準治療インフルエンザ株に由来している、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
前記Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
前記Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又は前記Ｎ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
前記Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び前記Ｎ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡは、同一のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｈ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡは、同一のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
前記複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
からなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項16】
前記組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
前記アジュバントは、水中スクアレンアジュバント又はリポソームベースのアジュバントを含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項18】
前記水中スクアレンアジュバントは、ＡＦ０３を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
前記リポソームベースのアジュバントは、ＳＰＡ１４を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量で前記組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記組成物中に存在している、請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量で前記組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記組成物中に存在している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項22】
前記組成物は、筋肉内注射用に製剤化されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項23】
請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、及び医薬担体を含むワクチン。
【請求項24】
インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、請求項２３に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項25】
前記方法により、前記対象におけるインフルエンザウイルス感染が予防される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記方法により、前記対象における防御免疫反応が生じる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記防御免疫反応は、ＨＡ抗体反応、及び／又はＮＡ抗体反応を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記対象は、ヒトである、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ワクチンを、筋肉内投与するか、皮内投与するか、皮下投与するか、静脈内投与するか、鼻腔内投与するか、吸入により投与するか、又は腹腔内投与する、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記方法により、季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株のいずれか又は両方により引き起こされる疾患が処置されるか、又は予防される、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記対象は、ヒトであり、前記ヒトは、生後６ヶ月以上、１８歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳、又は少なくとも６５歳である、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
インフルエンザウイルス感染の１つ又は複数の症状を軽減する方法であって、請求項２３に記載のワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む方法。
【請求項33】
対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法であって、請求項２３に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含み、前記ワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、少なくとも約２０％、又は約４０％～約８０％、例えば、約４０％～約６０％の量のだけ増加する、方法。
【請求項34】
前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
２～６週間の間隔で、任意選択的には４週間の間隔で、前記ワクチンの２回の用量を前記対象に投与することを含む請求項２４～３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２７６，２８４号明細書の出願日の利益を主張するものであり、且つこの出願日に依拠するものであり、この明細書の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２７６，２８４号明細書の出願日の利益を主張するものであり、且つこの出願日に依拠するものであり、この明細書の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬフォーマットで電子的に提出されており且つその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＸＭＬコピー（２０２２年１０月１４日に作成）は、名称が０１７１＿００６７＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌであり、サイズが３，４５０バイトである。
本出願は、ＸＭＬフォーマットで電子的に提出されており且つその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＸＭＬコピー（２０２２年１０月１４日に作成）は、名称が０１７１＿００６７＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌであり、サイズが３，４５０バイトである。
【0003】
本開示の分野
本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）の両方に対する免疫を誘発するための多価組換えインフルエンザワクチン又は免疫原性組成物、並びにこの多価組換えインフルエンザワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法である。
本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）の両方に対する免疫を誘発するための多価組換えインフルエンザワクチン又は免疫原性組成物、並びにこの多価組換えインフルエンザワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法である。
【背景技術】
【0004】
インフルエンザは、鼻、咽喉、及び気管支を含む上気道を主に攻撃し、稀にまた肺も攻撃するウイルスによって引き起こされる。この感染は、通常、約１週間続く。それは、高熱、筋肉痛、頭痛、及び重度の倦怠感、乾性咳嗽、咽頭痛、並びに鼻炎の突然の発症を特徴とする。ほとんどの人は、いかなる治療も必要とせずに、１～２週間以内に回復する。しかしながら、非常に若い人、高齢者、及び肺疾患、糖尿病、癌、腎臓又は心臓の問題等の病状に苦しんでいる人々においては、インフルエンザは、深刻なリスクをもたらす。これらの人々では、この感染は、基礎疾患、肺炎、及び死亡の重度の合併症をもたらし得るが、健康な成人や年長の小児であっても同様に影響を受ける可能性がある。毎年の季節性インフルエンザの流行により、世界中で毎年、３００万～５００万人が重症化し、２５０，０００～５００，０００人が死亡すると考えられている。
【0005】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。インフルエンザウイルスには、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及びインフルエンザＣ型と呼ばれる３つの主なサブタイプがある。インフルエンザビリオンは、下記のタンパク質をコードするセグメント化されたマイナスセンスＲＮＡゲノムを含有する：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍ１）、プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、及びＭ２は、膜結合型であるが、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、及びＮＳ２は、ヌクレオカプシド結合型タンパク質である。ＨＡ及びＮＡタンパク質はエンベロープ糖タンパク質であり、それぞれ、細胞へのウイルスの付着及びウイルス粒子の侵入、並びに細胞からの放出に主に関与している。
【0006】
ある特定の既知の認可されたインフルエンザワクチン組成物は、全ビリオン、若しくは脂質を溶解する薬剤で処理したビリオン（「スプリット」ワクチン）、細胞培養において発現された糖タンパク質の精製物（「サブユニットワクチン」）を含有する不活化ワクチン、又は生弱毒化ウイルスワクチンである。ＲＮＡ／ＤＮＡベース、ウイルスベクターベース等の他のタイプのワクチンが開発中である。これらのワクチンは、部分的には、ＨＡ等のインフルエンザ抗原に対する抗体の産生を誘発することにより、防御を提供する。変異によるインフルエンザウイルスの抗原性の進化（抗原ドリフトとも称される）により、ＨＡが変化し、程度は低いがＮＡも変化する。そのため、ＨＡ及びＮＡを含むインフルエンザの主要な抗原のアミノ酸配列は、ある特定の群、サブタイプ、及び／又は株にわたって非常に変化しやすい。
【0007】
従って、利用可能なワクチンは、同一又は交差反応性のエピトープを含む表面糖タンパク質を有する株のみを防御し得る。より広範な抗原スペクトルを提供するために、従来のワクチンは、いくつかの異なるウイルス株からの構成成分を含み、例えば、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの両方の株からの構成成分を含む。現在の季節性インフルエンザワクチンで使用される株の選択は、抗原ドリフトを考慮するために、及び急速に進化しているウイルス株に適合するために、毎年再検討されており、且つ世界保健機関（ＷＨＯ）の推奨に基づいている。この推奨は、国際的な疫学的観察を反映している。
【0008】
ワクチン製造用の現在のインフルエンザウイルス種子は、製造に使用される高収量ウイルス株を生成するために使用される再集合手順のために、適切なＨＡ抗原を有していることを示さなければならない。しかしながら、現在、インフルエンザワクチン中のＮＡ含有量に関する要件又は制限は存在していない。ワクチン中のＮＡレベルにはかなりのばらつきがあるという証拠がある。Ｋｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ Ｕｎｐｒｉｍｅｄ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ １９８０；２９（３）：９６６－９７１により、様々なロットのＮＡ比活性には約４０倍の幅があり得ることが報告された。Ｋｅｎｄａｌ他はまた、６ヶ月の保管中でのＮＡ活性の急速な低下にも注目した。結果として、ＮＡに対する抗体反応の頻度は、ＨＡ反応（血清転換率６４％）と比較して低かった（平均血清転換率１８％）。
【0009】
さらに、ＮＡ特異的抗体がヒトの疾患に対する耐性と相関することを示す証拠が増えているにもかかわらず、現在のワクチン戦略は、組換えＨＡタンパク質を含むＦＬＵＢＬＯＫ（登録商標）四価ワクチンの場合のように、ほぼ完全にＨＡ抗原に焦点を当てているか、又は完全にＨＡ抗原に焦点を当てている。加えて、インフルエンザ感染中のＮＡに免疫学的反応に関して利用可能なデータは、特にＨＡに関するデータと比較して限られている（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｒｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ Ａｇｅ－ ａｎｄ Ｓｕｂｔｙｐｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２０２０；９４（７）：ｅ０１３８５－１９）。インフルエンザウイルスは、自然界では、ウイルス表面上のＮＡがＨＡと比較して約１０分の１であり、ＨＡ抗原を濃縮する確立されたプロセスでは、ＮＡを酵素的に活性な四量体構造で維持することには適していない場合がある。そのため、現在入手可能な不活化インフルエンザウイルスワクチンはＮＡを含み得るが、量及び品質が大きく異なり、均一ではない。
【0010】
さらに、ＮＡは、ＨＡと共に免疫系に提示される場合に免疫準優勢であると説明されている（Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ２０１９；１９：３８３－３９７）。換言すると、ＨＡは、ＮＡと比べて免疫優勢であることが知られている。Ｉｄ． 従来のインフルエンザワクチンで観察されるこの免疫優勢現象は、特に、ＨＡ等の免疫優勢タンパク質を含む多価ワクチンの場合に、及び／又はワクチン中の価数が増加するにつれて、複数種の抗原又はエピトープに対する多価免疫反応を成功裏に達成し得る多価ワクチンの開発に対する障害のままである（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｅｌｐ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｒａｒｅ－Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ＣＥＬＬ ＲＥＰＯＲＴＳ ２０１８；２５：３２１－２７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
そのため、ＨＡ及びＮＡの両方の免疫反応を誘発することにより、流行しているインフルエンザ株に対する防御の強化及び／又はより幅広い防御を付与し得る、ワクチン中のインフルエンザウイルスＨＡの、１種又は複数種インフルエンザウイルスＮＡタンパク質を補充する能力が望ましい。しかしながら、インフルエンザウイルスＨＡとインフルエンザウイルスＮＡとをワクチン組成物に組み合わせて、抗原競合なしに、流行しているインフルエンザ株に対する防御の強化及び／又は幅広い防御を付与する能力は、特に、多価ワクチン組成物において課題となる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示は、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物であって、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡと、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡとを含むか又はからなる、ワクチン又は免疫原性組成物を提供する。
【0013】
様々な実施形態では、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８種、又はより多くの組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と、１、２、３、４、５、６、７、８種、又はより多くの組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原とを含む。ある特定の実施形態では、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、４種のインフルエンザウイルスＨＡと、４種のインフルエンザウイルスＮＡとを含むか、又はからなる。ある特定の実施形態では、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡを含むか、又はからなる。
【0014】
本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物の様々な実施形態では、第１、第２、第３、及び第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、改変組換えインフルエンザウイルスＮＡである。ある特定の実施形態では、改変組換えインフルエンザウイルスＮＡは、４つの改変組換え単量体ＮＡ分子であって、各々は、インフルエンザウイルスのＮＡの頭部領域を含むが、インフルエンザウイルスのＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いている、改変組換え単量体ＮＡ分子を含む改変組換え四量体インフルエンザウイルスＮＡを含み、改変単量体ＮＡ分子は、宿主細胞中で発現された場合に、改変組換え四量体ＮＡを形成する。ある特定の実施形態では、各改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種四量体化ドメインを含み、ある特定の実施形態では、改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種オリゴマー化ドメインを含まない。
【0015】
本開示のある特定の実施形態では、異種四量体化ドメインは、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラキオン（Ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質由来の四量体化ドメイン、又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである。
【0016】
本開示の一態様では、組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、バキュロウイルス発現系により産生されており、例えば、培養昆虫細胞中においてバキュロウイルス発現系により産生されている。本開示の一態様では、組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生されている。
【0017】
本明細書で開示されている様々な実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、不活性化インフルエンザビリオン又は生弱毒化インフルエンザビリオンを含まず、様々な実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれ、及び／又は組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、標準治療インフルエンザ株に由来している。ある特定の実施形態では、Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又はＨ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来しており、ある特定の実施形態では、Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又はＮ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している。ある特定の実施形態では、Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来しており、Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及びＮ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している。ある特定の実施形態では、Ｈ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡは、同一のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、Ｈ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡは、同一のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している。
【0018】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含み、ある特定の実施形態では、このアジュバントは、水中スクアレンアジュバント（例えば、ＡＦ０３）又はリポソームベースのアジュバント（例えば、ＳＰＡ１４）を含む。
【0019】
本開示のある特定の態様では、組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量でワクチン又は免疫原性組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は５μｇ～約４５μｇの範囲の量でワクチン又は免疫原性組成物中に存在しており、ある特定の態様では、組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量でワクチン又は免疫原性組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量でワクチン又は免疫原性組成物中に存在している。ある特定の実施形態では、組成物は、筋肉内注射用に製剤化されている。
【0020】
別の態様では、本明細書で開示されているのは、本明細書で開示されている免疫原性組成物、及び医薬担体を含むワクチンである。
【0021】
同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、本明細書で開示されているワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含む方法である。同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法で使用される、本明細書で開示されているワクチンである。同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で開示されている免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、この方法又は使用により、対象におけるインフルエンザウイルス感染が予防され、ある特定の実施形態では、この方法又は使用により、対象における防御免疫反応（例えば、ＨＡ抗体反応及び／又はＮＡ抗体反応）が生じる。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトであり、ある特定の実施形態では、ワクチンを、筋肉内投与するか、皮内投与するか、皮下投与するか、静脈内投与するか、鼻腔内投与するか、吸入により投与するか、若しくは腹腔内投与するか、又はそのように投与するために調製されている。
【0022】
本開示の別の態様は、インフルエンザウイルス感染の１つ又は複数の症状を軽減する方法であって、本明細書で開示されているワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む方法である。同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルス感染の１つ又は複数の症状を軽減する方法で使用される、本明細書で開示されているワクチンである。同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルス感染の１つ又は複数の症状を軽減する方法で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で開示されている免疫原性組成物である。
【0023】
同様に本明細書で開示されているのは、対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法であって、本明細書で開示されているワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含み、このワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、約１０％～約２５％、又は約４０％～約８０％、又は約４０％～約６０％の量のだけ増加する、方法である。同様に本明細書で開示されているのは、対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法で使用される、本明細書で開示されているワクチンであって、この方法は、本明細書で開示されているワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含み、このワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、少なくとも約２０％、又は約４０％～約８０％、例えば、約４０％～約６０％の量のだけ増加する、ワクチンである。同様に本明細書で開示されているのは、対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で開示されている免疫原性組成物であって、この方法は、本明細書で開示されているワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含み、このワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、少なくとも約２０％、又は約４０％～約８０％、例えば、約４０％～約６０％の量のだけ増加する、免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である。ある特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む。
【0024】
様々な実施形態では、本明細書で開示されている方法又は使用、及び組成物により、季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株のいずれか又は両方により引き起こされる疾患が処置されるか、又は予防される。本明細書で開示されている方法又は使用のある特定の実施形態では、対象は、ヒトであり、このヒトは、生後６ヶ月以上、１８歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳、又は少なくとも６５歳である。ある特定の態様では、本明細書で開示されている方法又は使用は、２～６週間の間隔で、例えば４週間の間隔で、ワクチン又は免疫原性組成物の２回の用量を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ｒＴＥＴ－ＮＡ（配列番号２）の概略図及び部分的なアミノ酸配列である。配列番号２は、ＣＤ５シグナル配列、第１のリンカー配列、テトラブラキオン四量体化ドメイン、及び第２のリンカー配列を順に表す。配列番号２は、ＮＡ頭部領域のアミノ酸配列を含まない。
【図2】図２Ａは、実施例２で説明されている、マウスにおけるワクチン接種の実験デザインを示す概略である。図２Ｂは、実施例２で説明されている、ｒＴＥＴ－ＮＡ、生ウイルス由来ＮＡ（ＬＶＮＡ）、又は一価の不活性化インフルエンザワクチン（ＩＶ）（両方とも、アジュバント（ＡＦ０３）と共に又はなし）を使用してワクチン接種したマウスに関するＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｎ２）に対するＮＡ阻害のＩＣ５０を示すプロットである。○記号は、ＡＦ０３が付加されていないＩＣ５０ ＮＡ阻害価を表しており、■は、ＡＦ０３が付加されている群を表す。図２Ｃは、実施例２で説明されている、ｒＴＥＴ－ＮＡ又は一価の不活性化インフルエンザワクチン（両方とも、アジュバント（ＡＦ０３）と共に又はなし）を使用するマウスのワクチン接種に関するＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）に対するＮＡ阻害のＩＣ５０を示すプロットである。○記号は、ＡＦ０３が付加されていないＩＣ５０ ＮＡ阻害価を表しており、■は、ＡＦ０３が付加されている群を表す。
【図3-1】図３Ａは、実施例３で説明されている、０及び２１日目にワクチンサンプルの２回の筋肉内用量を投与し、４２日目に最終的に採血する、ナイーブフェレットにおけるワクチン接種の実験デザインを示す概略である。図３Ｂは、実施例３で論じられている、免疫前フェレット（０日目にウイルスで鼻腔内予備刺激した）でのワクチン接種の実験デザインを示す概略である。
【図3-2】図３Ｃは、実施例３で説明されている、下記の投与量のｒＴＥＴ－ＮＡで１回又は２回免疫化した後でのナイーブフェレットにおけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６（Ｎ２）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである：希釈液のみ（偽）、５μｇ＋ＡＦ０３；４５μｇ＋ＡＦ０３、及び４５μｇ。○記号は、１回目の用量後のＮＡＩ力価を表しており、■は、２回目の用量後のＮＡＩ力価を表す。図３Ｄは、実施例３で説明されている、希釈液（偽）、ｒＴＥＴ－ＮＡ １．８μｇ、９μｇ、及び４５μｇ、並びにＩＩＶ １．８μｇ及び９μｇの単回用量後の免疫前フェレットにおけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６（Ｎ２）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである。○記号は、鼻腔内ウイルス予備刺激後のＮＡＩ力価を表しており、■は、単回筋肉内ワクチンブースト後のＮＡＩ力価を表す。
【図3-3】図３Ｅは、実施例３で説明されている、希釈液（偽）、ｒＴＥＴ－ＮＡ １．８μｇ、９μｇ、及び４５μｇ、並びにＩＩＶ １．８μｇ及び９μｇの単回用量後の免疫前フェレットにおけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６（Ｎ２）に対するブースト／予備刺激のＮＡＩ比を示すグラフである。図３Ｆは、実施例３で説明されている、下記の投与量のｒＴＥＴ－ＮＡで１回又は２回免疫化した後でのナイーブフェレットにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである：希釈液（偽）、５μｇ＋ＡＦ０３；４５μｇ＋ＡＦ０３、及び４５μｇ。○記号は、１回目の用量後のＮＡＩ力価を表しており、■は、２回目の用量後のＮＡＩ力価を表す。
【図3-4】図３Ｇは、実施例３で説明されている、希釈液（偽）、ｒＴＥＴ－ＮＡ １．８μｇ、９μｇ、及び４５μｇ、並びにＩＩＶ １．８μｇ及び９μｇの単回用量後の免疫前フェレットにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである。○記号は、鼻腔内ウイルス予備刺激後のＮＡＩ力価を表しており、■は、単回筋肉内ワクチンブースト後のＮＡＩ力価を表す。図３Ｈは、実施例３で説明されている、希釈液（偽）、ｒＴＥＴ－ＮＡ ０．３６μｇ、１．８μｇ、９μｇ、及び４５μｇ、並びにＩＩＶ １．８μｇ及び９μｇの単回用量後の免疫前フェレットにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）に対するブースト／予備刺激のＮＡＩ比を示すグラフである。
【図4】実施例４で説明されている、下記の投与量のｒＴＥＴ－ＮＡで２回免疫化した後でのナイーブフェレットにおけるＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｎ２）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである：希釈液＋ＡＦ０３（偽）、０．２μｇ、３μｇ、４５μｇ、０．２μｇ＋ＡＦ０３、３μｇ＋ＡＦ０３、及び４５μｇ＋ＡＦ０３。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスによる感染後のＮＡＩ力価も示す（Ａ／ＰＥ／０９感染前）。
【図5】実施例４で説明されている、下記の投与量：希釈液＋ＡＦ０３（偽）、０．２μｇ、３μｇ、４５μｇ、０．２μｇ＋ＡＦ－０３、３μｇ＋ＡＦ０３、４５μｇ＋ＡＦ０３のｒＴＥＴ－ＮＡでの事前に免疫化、及びＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＥ／０９感染前）による感染後のフェレットにおけるチャレンジ後の体重変化（毎日及びＡＵＣ）、体温上昇（ピーク）、並びにウイルス排出（ＡＵＣ）を示すグラフである。
【図6A】実施例４で説明されている、ワクチン接種したフェレットにおける疾患重症度とＮＡＩ力価との間の逆相関を示すグラフであり、非重症疾患のフェレットにおけるＮＡＩ力価を、左側に示し、重症疾患のフェレットにおけるＮＡＩ力価を、右側に示す。
【図6B】実施例４で論じられている、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すＲＯＣ曲線モデルを示すグラフであり、ＡＵＣは、偶然と比べて有意に高い。
【図6C】実施例４で説明されている、４２日目にワクチン接種されたフェレットにおける疾患重症度とＮＡＩ力価との間の逆相関を示すグラフである。
【図7-1】図７Ａは、実施例５で論じられている、フェレットにおけるワクチン接種の実験デザインを示す概略である。図７Ｂは、実施例５で論じられている、フェレットにおける４×ｒＮＡ及び４×ｒＨＡワクチン株選択で使用されるインフルエンザウイルス株を示すチャートである。
【図7-2】図７Ｃは、左列は、実施例５で説明されている、（１）八価（４×ｒＨＡ＋４×ｒＮＡ）組換えワクチン組成物の４５μｇ／抗原又は５μｇ／抗原＋アジュバントの１回の用量、（２）四価（４×ｒＮＡ）組換えワクチン組成物の１回の用量、又は（３）四価（４×ｒＨＡ）組換えワクチン組成物の１回の用量によるワクチン接種後の、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６（Ｎ２）（最上部の行）；Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）（２行目）：Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７（３行目）；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（最下部の行）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである。右列は、実施例５で説明されている、（１）八価（４×ｒＨＡ＋４×ｒＮＡ）組換えワクチン組成物の４５μｇ／抗原又は５μｇ／抗原＋アジュバントのブースター用量、（２）四価（４×ｒＮＡ）組換えワクチン組成物のブースター用量、又は（３）四価（４×ｒＨＡ）組換えワクチンのブースター用量によるワクチン接種後の、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６（Ｎ２）（最上部の行）；Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）（２番目の行）；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７（３番目の行）；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（最下部の行）に対するＮＡＩ力価を示すプロットである。白抜きの四角形は、八価組換え組成物を投与した後のＮＡＩ力価を表しており、塗りつぶされた四角形は、四価（４×ｒＮＡ）組換え組成物を投与した後ＮＡＩ力価を表しており、三角形は、四価（４×ｒＨＡ）組換え組成物を投与した後のＮＡＩ力価を表す。
【図8-1】図８Ａは、実施例５で説明されている、（１）四価ｒＮＡ（塗りつぶされた四角形）；（２）四価ｒＨＡ（三角形）；又は（３）八価ｒＨＡ＋ｒＮＡ（白抜きの四角形）の４５μｇ／抗原又は５μｇ／抗原＋アジュバントのいずれかによるワクチン接種後のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６／２０１６ Ｈ３Ｎ２ウイルスに対するＨＡＩ力価を示すプロットである。
【図8-2】図８Ｂは、実施例６で説明されている、（１）八価ｒＨＡ＋ｒＮＡ（Ｙ軸）又は（２）四価ｒＨＡ（Ｘ軸）の４５μｇ／抗原によるワクチン接種後のＨ３ ｒＨＡビーズパネルに対する、抗体法医学により測定したＩｇＧ力価を示すプロットである。図８Ｃは、実施例６で説明されている、（１）八価ｒＨＡ＋ｒＮＡ（Ｙ軸）又は（２）四価ｒＨＡ（Ｘ軸）の５μｇ／抗原＋アジュバントによるワクチン接種後のＨ３ ｒＨＡビーズパネルに対する、抗体法医学により測定したＩｇＧ力価を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
いくつかのウイルスは、それらのエンベロープ糖タンパク質成分の構造を実質的に変化させ得る。例えば、インフルエンザウイルスは、そのエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列を絶えず変化させる。主要なアミノ酸変異（抗原シフト）又は軽微な変異（抗原ドリフト）が、新しいエピトープを生じさせ得、ウイルスが免疫系を回避することを可能にする。抗原変異は、インフルエンザの流行が繰り返されることが主な原因である。サブタイプ（例えば、Ｈ１又はＨ３）内の抗原変異体が出現し、優勢なウイルスとして徐々に選択される一方で、先行するウイルスは、集団において生じる特異的抗体によって抑制される。一般に、１つの変異体に対する抗体の中和は、連続的に変異体が生じるにつれて、効果が次第に低下する。サブタイプ内の変異体に対する免疫反応は、宿主の以前の経験に依存し得る。
【0027】
ＨＡ及びＮＡは、進化が全く異なる。例えば、サイレントヌクレオチド置換の速度は、ＨＡの遺伝子を含む、インフルエンザウイルスの全ての遺伝子のコードヌクレオチド置換の速度と比べて高いことが示されている（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＲＥＶＳ．１９９２；５６（１）：１５２－１７９）。しかしながら、ＨＡは、コード変化速度が内部タンパク質と比べてはるかに高い。他の遺伝子と比較してＨＡ遺伝子のコードヌクレオチド変化の速度が大きいことは、免疫選択がその進化の重要な要因であることの証拠と考えられている（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ，Ｂ，ａｎｄ Ｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ，ＳＣＩＥＮＣＥ１９８２；２１５（４５３９）：１４６８－７４）。あらゆる非特異的立体障害を排除するために再集合抗原を使用して、Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅらは、１０年間にわたってヒトから単離した疫学的に重要なＨＡ抗原及びＮＡ抗原の進化速度を研究しており、ＨＡがＮＡと比べて急速に進化すると決定した（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｐａｒａｔｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＮＡＳ １９９０；８７（２）：７８６－７９０）。このことは、Ａ型Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ウイルスの両方で示され、より最近の株を用いたその後の実験によって確認されている。進化速度が明らかに異なる理由は不明であるが、ＨＡに対する抗体がウイルスを中和して感染を予防するという事実に起因する可能性がある。これにより、部分的に免疫がある集団においてそれ自身が維持されるように、ＨＡにより選択的な圧力がかかる。そのため、ＮＡは、ＨＡと比較して緩やかな抗原ドリフトを受けることから、ＨＡ及びＮＡの両方を含むワクチン又は免疫原性組成物は、抗原的にドリフトしたＨＡ抗原を含むインフルエンザの株に対して（ＮＡ抗体の形で）より広範な防御を付与し得る。
【0028】
インフルエンザウイルスは、本来、ウイルス表面上で含まれるＮＡがＨＡと比べて約１０分の１であることから、且つＨＡ抗原を濃縮するために確立されたプロセスは、ＮＡをその酵素的に活性で四量体の高次構造で維持するのに適していない場合があることから、ワクチン組成物（例えば、不活性化ウイルスワクチン）中で検出可能なＮＡの量は、非常に多様であり得る。従って、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物への組換えＮＡの添加により、ワクチン又は免疫原性組成物に含まれるＮＡの量をより良好に制御することが可能となり得る。安定したＮＡを組換えにより生成してＨＡ抗原（例えば、組換えにより生成されたＨＡ抗原）に添加することにより、現在入手可能なワクチンと比較して、ワクチン又は免疫原性組成物を投与した対象におけるＨＡ免疫反応とＮＡ免疫反応との両方のバランスを良好に保つことが可能となり得、ひいては、流行しているインフルエンザ株に対する防御の増強及び／又は幅広い防御が可能となり得る。
【0029】
従って、本明細書で開示されているのは、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、及び複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ）を含む多価ワクチン又は免疫原性組成物である。
【0030】
定義
本開示をより容易に理解するために、最初に、ある特定の用語を下記で定義する。下記の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して記載され得る。下記に記載する用語の定義が、参照により組み込まれる出願又は特許中の定義と矛盾する場合には、この用語の意味は、本出願に記載の定義を使用して理解されるべきである。
本開示をより容易に理解するために、最初に、ある特定の用語を下記で定義する。下記の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して記載され得る。下記に記載する用語の定義が、参照により組み込まれる出願又は特許中の定義と矛盾する場合には、この用語の意味は、本出願に記載の定義を使用して理解されるべきである。
【0031】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照を含む。そのため、例えば、「方法」への言及は、本明細書で説明されているタイプの１つ又は複数の方法及び／又は工程を含み、且つ／或いはそれは本開示等を読めば当業者に明らかになるであろう。
【0032】
請求項の要素を変更するための請求項における「第１の」、「第２の」、「第３の」等の序数用語の使用は、それ自体、１つの請求項要素の別の請求項要素に対する重要度、優先度若しくは順序、又は方法の操作が実行される時間的順序を意味するものではなく、単に、請求項要素を区別するために、ある名称を有するある１つの請求項要素を、同じ名称を有する別の要素から区別する（但し、序数用語の使用のための）ラベルとして使用される。
【0033】
アジュバント：本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ワクチンの抗原成分に対する免疫反応を増強するために使用され得る物質又は物質の組み合わせを指す。
【0034】
抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、生物に曝露されたか又は投与された場合に、免疫反応を誘発する薬剤、並びに／或いは（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示された場合）又は抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生された）に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、生物において、体液性反応（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し、代替的に又は追加的に、いくつかの実施形態では、抗原は、生物において、細胞性反応（例えば、受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞が関与する）を誘発する。当業者であれば、特定の抗原が、標的生物（例えば、マウス、フェレット、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つ又はいくつかのメンバーにおいて免疫反応を誘発し得るが、標的生物種の全てメンバーで誘発し得るわけではないことは、理解していよう。いくつかの実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫反応を誘発する。いくつかの実施形態では、抗原は、抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合し、生物において特定の生理学的反応を誘発することもあれば誘発しないこともある。いくつかの実施形態では、例えば、抗原はインビトロで抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合し得、これは、そのような相互作用がインビボで生じるか否かにかかわらない。いくつかの実施形態では、抗原は、特定の体液性免疫又は細胞性免疫の産物と反応し、そのような産物には、異種免疫原によって誘発されるものも含まれる。抗原は、本明細書で説明されているＮＡ形態及びＨＡ形態を含む。
【0035】
およそ：本明細書で使用される場合、１つ又は複数の対象の値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。いくつかの実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された基準値のどちらの方向でも（それより大きい、又はそれより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満に入る範囲の値を指す（そのような数があり得る値の１００％を超える場合を除く）。
【0036】
担体：本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。いくつかの例示的な実施形態では、担体には、例えば、水及び油、例えば石油、動物油、植物油又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の滅菌液体が含まれる。いくつかの実施形態では、担体は、１つ又は複数の固体成分であるか、又はそれを含む。
【0037】
エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語には、免疫グロブリン（例えば、抗体又はＴ細胞受容体）結合成分によって全体的又は部分的に特異的に認識される部分が含まれる。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子又は化学基から構成されている。いくつかの実施形態では、そのような化学原子又は化学基は、抗原が関連する三次元構造をとる際に表面に露出される。いくつかの実施形態では、そのような化学原子又は化学基は、抗原がそのような構造をとるとき、空間内で物理的に互いに近接する。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかのそのような化学原子又は化学基は、抗原が選択的構造をとる（例えば、線状化される）場合には、互いに物理的に離れる。
【0038】
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の一貫性又は安定化効果を付与するか又はそれに寄与するために、医薬組成物に含まれ得る非治療薬を指す。好適な医薬品賦形剤として、下記が挙げられる：例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【0039】
Ｈ１：本明細書で使用される場合、「Ｈ１」は、インフルエンザウイルスサブタイプ１ヘマグルチニン（ＨＡ）を指す。Ａ型インフルエンザウイルスは、グループ１及びグループ２に分けられる。グループ１及びグループ２は、さらに、ウイルス表面上の２種のタンパク質ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分けられる。現在、１８種のＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）が認識されている。そのため、Ｈ１は、Ｈ２～Ｈ１８を含む他のＨＡサブタイプとは異なる。
【0040】
Ｈ３：本明細書で使用される場合、「Ｈ３」は、インフルエンザウイルスサブタイプ３ ＨＡを指す。そのため、Ｈ３は、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ４～Ｈ１８を含む他のＨＡサブタイプとは異なる。
【0041】
免疫反応：本明細書で使用される場合、「免疫反応」という用語は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は多形核球等の免疫系の細胞の、抗原、免疫原、又はワクチン等の刺激に対する反応を指す。免疫反応は、例えば、インターフェロン又はサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御反応に関与する身体のあらゆる細胞を含み得る。免疫反応として、自然免疫反応及び／又は適応免疫反応が挙げられるが、これらに限定されない。免疫反応を測定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞又はＴ細胞等）の増殖及び／又は活性の測定、サイトカイン又はケモカインの分泌の測定、炎症の測定、抗体産生の測定等が挙げられる。抗体反応又は体液性反応は、抗体が産生される免疫反応である。「細胞性免疫反応」は、Ｔ細胞及び／又は他の白血球によって媒介されるものである。
【0042】
免疫原：本明細書で使用される場合、「免疫原」又は「免疫原性」という用語は、適切な条件下で、動物に注入されるか又は吸収される組成物を含む、動物における抗体の産生又はＴ細胞反応等の免疫反応を刺激し得る化合物、組成物、又は物質を指す。本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」という用語は、防御免疫反応であってもなくてもよい免疫反応を生じる組成物を指す。本明細書で使用される場合、「免疫化する」とは、感染性疾患（例えば、インフルエンザ）に対する防御免疫反応を対象に誘発することを意味する。
【0043】
免疫学的有効量：本明細書で使用される場合、「免疫学的有効量」という用語は、対象を免疫化するのに十分な量を意味する。
【0044】
いくつかの実施形態では：本明細書で使用される場合、「いくつかの実施形態では」という用語は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、本開示の全ての態様の実施形態を指す。
【0045】
機械学習：本明細書で使用される場合、「機械学習」という用語は、経験を通して及び／又はデータの使用によって自動的に改善するアルゴリズムの使用を指す。機械学習は、予測モデルを通して候補抗原を選択するように設計されたアルゴリズムの使用を含む、データの予測を可能にするためのインフルエンザ抗原性のモデル等の予測モデルの構築を伴い得る。標的株を同定し、次に選択アルゴリズムを構築し得る。機械学習アルゴリズム及び方法の例を、例えば、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、及び国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）で見出し得、これらの両文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。機械学習にはまた、本明細書で使用される場合、データを分析し解釈するための計算ツール、例えば、系統発生解析等のバイオインフォマティクス解析の適用も含まれ得る。同様に、「機械学習インフルエンザウイルスＨＡ」は、機械学習により同定されているか又は設計されているインフルエンザウイルスＨＡを示し、「機械学習インフルエンザウイルスＮＡ」は、機械学習により同定されているか又は設計されているインフルエンザウイルスＮＡを示す。「機械学習モデル」は、候補抗原等のデータを予測するために、経験を通して、及び／又はデータの使用によって自動的に改善するアルゴリズムを使用するモデルを示す。
【0046】
改変：本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、タンパク質又は核酸の野生型と比較して異なるアミノ酸配列又は核酸配列を有するあらゆるタンパク質又は核酸を指す。例えば、改変インフルエンザＮＡ又はＨＡは、野生型のＮＡタンパク質又は核酸配列とは異なるアミノ酸配列又は核酸配列を有するインフルエンザＮＡ又はＨＡを指す。改変インフルエンザＮＡ又はＨＡは、野生型インフルエンザＮＡ又はＨＡに対して１つ又は複数のアミノ酸の欠失及び／又は置換を含み得る。
【0047】
単量体インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ：野生型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、４つの同一の単量体の四量体である。野生型インフルエンザＮＡの各ＮＡ単量体は、下記の４つの異なる構造ドメインからなる：酵素頭部領域、柄領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部。本明細書で使用される場合、「単量体インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ」という用語は、３つの他のＮＡ単量体と結合して四量体ＮＡを形成し得るＮＡ単量体を指す。本明細書で説明されているように、改変単量体インフルエンザウイルスノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域を含み得るが、異種四量体化ドメイン若しくはその一部を含み得、並びに／又は細胞質尾部、膜貫通領域、及び柄領域の内の１つ若しくは複数の少なくとも一部を欠き得る。
【0048】
Ｎ１：本明細書で使用される場合、「Ｎ１」は、インフルエンザウイルスサブタイプ１ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を指す。Ａ型インフルエンザウイルスは、グループ１及びグループ２に分けられる。グループ１及びグループ２は、さらに、ウイルス表面上の２種のタンパク質ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分けられる。現在、１１種のＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が認識されている。そのため、Ｎ１は、Ｎ２～Ｎ１１を含む他のＮＡサブタイプとは異なる。Ｎ２：本明細書で使用される場合、「Ｎ２」は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を指す。そのため、Ｎ２は、Ｎ１及びＮ３～Ｎ１１を含む他のＮＡサブタイプとは異なる。
【0049】
インフルエンザＢ株は、下記の２つの系統に分類される：Ｂ／山形及びＢ／ビクトリア。
【0050】
パンデミック株：「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団等の対象集団のパンデミック感染を引き起こしたか又は引き起こす能力を有するものである。いくつかの実施形態では、パンデミック株は、パンデミック感染を引き起こしている。いくつかの実施形態では、そのようなパンデミック感染は、複数の地域にわたるエピデミック感染を含み、いくつかの実施形態では、パンデミック感染は、感染が通常それらの間で伝わることがないように、（例えば、山によって、水域によって、別個の大陸の一部として等）互いに離れている地域にわたる感染を含む。
【0051】
予防：「予防」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の疾患、障害、又は病態（例えば、インフルエンザウイルスによる感染）の１つ又は複数の症状の予防、疾患発現の回避、発症の遅延、並びに／又は頻度及び／若しくは重症度の低減を指す。いくつかの実施形態では、予防は、集団ベースで評価され、疾患、障害、又は病態の１つ又は複数の症状の発生、頻度、及び／又は強度の統計的に有意な減少が、疾患、障害、又は病態に罹りやすい集団において観察される場合に、薬剤が特定の疾患、障害、又は病態を「予防する」と見なされる。
【0052】
組換え体：本明細書で使用される場合、「組換え体」という用語は、組換え手段によって設計されているか、操作されているか、調製されているか、発現されているか、作製されているか又は単離されているポリペプチド（例えば、本明細書で説明されているＨＡ及び／又はＮＡポリペプチド）、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されているポリペプチド、組換えコンビナトリアルポリペプチドライブラリから単離されているポリペプチド、又は選択された配列要素を互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製されているか、発現されているか、作製されているか又は単離されているポリペプチドを指すことが意図されている。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の内の１つ又は複数は、自然界で見出されている。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の内の１つ又は複数は、コンピュータで設計されている。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の内の１つ又は複数は、既知の配列要素の変異誘発（例えば、インビボ又はインビトロで）から生じており、例えば天然又は合成源から生じている。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の内の１つ又は複数は、天然には同じポリペプチドに存在していない複数の（例えば、２つ以上の）既知の配列要素（例えば、２つの別々のＨＡポリペプチド又は２つの別々のＮＡポリペプチドからの２つのエピトープ）の組み合わせから生じている。組換えＨＡは、ｒＨＡであり、組換えＮＡは、ｒＮＡである。
【0053】
季節性株：「季節性」インフルエンザ株は、ヒト集団等の対象集団の季節性感染（例えば、毎年のエピデミック）を引き起こしたか又は引き起こす能力を有するものである。いくつかの実施形態では、季節性株は、季節性感染を引き起こしている。
【0054】
配列同一性：アミノ酸又は核酸の配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表され、それ以外の場合、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、同一性（又は類似性若しくは相同性）のパーセンテージの観点から測定されることが多く、パーセンテージが大きいほど、２つの配列はより類似している。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。所与の遺伝子又はタンパク質の相同体又は変異体は、標準的な方法を用いてアラインさせた場合、比較的高度の配列同一性を有する。
【0055】
「％同一の」、「％同一性」という用語、又は類似の用語は特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計的であり、２つの配列間の差異は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしも分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメントの後に、セグメント又は「比較の窓」に関して前記配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手動で実行し得るか、又はＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４による類似性検索アルゴリズムを用いて、又は前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、及びＴＦＡＳＴＡ）を用いて実行し得る。
【0056】
同一性パーセンテージは、比較する配列が対応する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算し、この結果に１００を乗算することによって得られる。
【0057】
いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合には、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、又は約２００個のヌクレオチドについて与えられており、いくつかの実施形態では連続ヌクレオチドで与えられる。いくつかの実施形態において、同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。
【0058】
所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対してそれぞれ特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列の少なくとも１つの機能的及び／又は構造的特性を有し得、例えば、いくつかの例では、前記所与の配列と機能的及び／又は構造的に同等である。いくつかの実施形態では、所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列と機能的及び／又は構造的に同等である。
【0059】
標準治療株：世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）は、毎年、集中的なサーベイランス努力に基づいて、季節性ワクチン製剤に含まれるべきインフルエンザ株を選択する。本明細書で使用される場合、「標準治療株」又は「ＳＯＣ株」という用語は、季節性ワクチン製剤に含まれるために世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）によって選択されるインフルエンザ株を指す。標準治療株には、過去の標準治療株、現在の標準治療株、又は将来の標準治療株が含まれ得る。
【0060】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「対象」は、ヒトを指す。いくつかの実施形態では、「対象」は、非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、対象として、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／又は蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、フェレット、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。いくつかの実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、及び／又はクローンであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、成人、青年、又は乳児である。いくつかの実施形態では、「個体」又は「患者」という用語が使用され、「対象」と置き換え可能であることが意図されている
【0061】
四量体ＮＡ分子：本明細書で使用される場合、「四量体ＮＡ分子」という用語は、４つのＮＡ単量体ポリペプチド単位を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、所与の四量体ＮＡ化合物中のそれぞれの単量体ＮＡ分子として、球状頭部ドメイン、柄領域、疎水性膜貫通ドメイン、及び短いＮ末端細胞質ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、所与の単量体ＮＡ分子のこれらのドメイン又は領域の内の１つ又は複数は、参照野生型単量体ＮＡ分子と比較して、切り詰められているか、全く存在していないか、又は改変されている。
【0062】
四量体化ドメイン：本明細書で使用される場合、「四量体化ドメイン」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質の四量体集合を引き起こすドメインをコードするアミノ酸配列を指す。特定のタンパク質に対してネイティブではない四量体化ドメインは、人工四量体化ドメイン又は異種四量体化ドメインと称され得る。例示的な四量体化ドメインとして、テトラブラキオン（Ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）、ＧＣＮ４ロイシンジッパー、又は血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）からの配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
ワクチン組成物：本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」又は「ワクチン」という用語は、対象において防御免疫反応を生じさせる組成物を指す。本明細書で使用される場合、「防御免疫反応」は、感染から対象を保護する（感染を予防するか、若しくは感染に関連する疾患の発症を予防する）か又は感染（例えば、インフルエンザウイルスによる感染）の症状を軽減する免疫反応を指す。ワクチンは、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）（予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ））反応及び治療反応の両方を誘発し得る。投与方法はワクチンによって異なるが、接種、摂取、吸入、又は他の投与形態が挙げられ得る。接種は、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、又は筋肉内等の非経口を含む多くの経路のいずれかによって送達され得る。ワクチンは、免疫反応を増強するためにアジュバントと共に投与され得る。
【0064】
ワクチン接種する：本明細書で使用される場合、「ワクチン接種する」等の用語は、対象における防御免疫反応（例えば、インフルエンザウイルス等の疾患を引き起こす病原体に対する反応）を生成するためのワクチン組成物の投与を指す。ワクチン接種を、疾患を引き起こす病原体への曝露の前、間、及び／又は後に、並びに／或いは１つ又は複数の症状の発現の前、間、及び／又は後に、いくつかの実施形態では、病原体への曝露の前、間、及び／又は直後に行い得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン組成物の適切な時間間隔を置いての複数回の投与を含む。
【0065】
ワクチン有効性：本明細書で使用される場合、「ワクチン有効性（ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）」又は「ワクチン有効性（ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」という用語は、ワクチンを投与している対象における疾患の証拠の減少のパーセンテージに関する測定値を指す。例えば、５０％のワクチン有効性は、ワクチン接種されていない対象の群、又は異なるワクチンが投与されている対象の群と比較した、ワクチン接種された対象の群における疾患症例の数の５０％減少を示す。
【0066】
野生型（ＷＴ）：当該技術分野で理解されているように、「野生型」という用語は、一般に、天然に見出されるような正常な形態のタンパク質又は核酸を指す。例えば、野生型のＨＡポリペプチド及びＮＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然単離物中に見出される。様々な異なる野生型のＨＡ配列及びＮＡ配列を、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース中に見出し得る。
【0067】
インフルエンザウイルスの命名法
インフルエンザウイルスを分類するために使用される全ての命名法は、当業者によって一般的に使用されるものである。そのため、インフルエンザウイルスのタイプ、又はグループは、次の３つの主要なタイプのインフルエンザを指す：ヒトに感染する、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＣ型インフルエンザ。インフルエンザＡ及びＢは、毎年、かなりの罹患率及び死亡率を引き起こす。ウイルスの特定のタイプとしての指定が、それぞれのＭｌ（マトリックス）タンパク質又はＰ（核タンパク質）における配列の違いに関連することは、当業者に理解されている。Ａ型インフルエンザウイルスは、グループ１及びグループ２にさらに分けられる。これらのグループは、さらに、ウイルス表面の２種のタンパク質ＨＡ及びＮＡの配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分類される。現在、１８種の認識されたＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）及び１１種の認識されたＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が存在する。グループ１は、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、及びＮ８と、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８とを含む。グループ２は、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、及びＮ９と、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５とを含む。Ｎ１０及びＮ１１は、コウモリから単離されたインフルエンザ様ゲノムにおいて同定されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ Ｈ１７Ｎ１０ ａｎｄ Ｈ１８Ｎ１１，ＴＲＥＮＤＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２０１４，２２（４）：１８３－９１）。潜在的に１９８種の異なるインフルエンザＡサブタイプの組み合わせが存在するが、自然界では約１３１種のサブタイプしか検出されていない。季節的な大流行を引き起こす、ヒト集団において一般的に流行しているＡ型インフルエンザウイルスの現在のサブタイプとして、Ａ（Ｈ１Ｎ１）及びＡ（Ｈ３Ｎ２）が挙げられる。
インフルエンザウイルスを分類するために使用される全ての命名法は、当業者によって一般的に使用されるものである。そのため、インフルエンザウイルスのタイプ、又はグループは、次の３つの主要なタイプのインフルエンザを指す：ヒトに感染する、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＣ型インフルエンザ。インフルエンザＡ及びＢは、毎年、かなりの罹患率及び死亡率を引き起こす。ウイルスの特定のタイプとしての指定が、それぞれのＭｌ（マトリックス）タンパク質又はＰ（核タンパク質）における配列の違いに関連することは、当業者に理解されている。Ａ型インフルエンザウイルスは、グループ１及びグループ２にさらに分けられる。これらのグループは、さらに、ウイルス表面の２種のタンパク質ＨＡ及びＮＡの配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分類される。現在、１８種の認識されたＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）及び１１種の認識されたＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が存在する。グループ１は、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、及びＮ８と、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８とを含む。グループ２は、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、及びＮ９と、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５とを含む。Ｎ１０及びＮ１１は、コウモリから単離されたインフルエンザ様ゲノムにおいて同定されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ Ｈ１７Ｎ１０ ａｎｄ Ｈ１８Ｎ１１，ＴＲＥＮＤＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２０１４，２２（４）：１８３－９１）。潜在的に１９８種の異なるインフルエンザＡサブタイプの組み合わせが存在するが、自然界では約１３１種のサブタイプしか検出されていない。季節的な大流行を引き起こす、ヒト集団において一般的に流行しているＡ型インフルエンザウイルスの現在のサブタイプとして、Ａ（Ｈ１Ｎ１）及びＡ（Ｈ３Ｎ２）が挙げられる。
【0068】
インフルエンザＡサブタイプを、さらに、異なる遺伝「クレード」及び「サブクレード」に分類し得る。例えば、ＡサブタイプのＡ（Ｈ１Ｎ１）は、クレード６Ｂ．１及びサブクレード６Ｂ．１Ａを含む。ＡサブタイプのＡ（Ｈ３Ｎ２）は、クレード３Ｃ．２Ａ及び３Ｃ．３Ａ、並びにサブクレード３Ｃ．２Ａ１、３Ｃ．２Ａ２、３Ｃ２Ａ３、及び３Ｃ．２Ａ４を含む。同様に、Ｂサブタイプビクトリアは、クレードＶ１Ａ及びサブクレードＶ１Ａ．１、Ｖ１Ａ．２、及びＶ１Ａ．３を含み、一方、Ｂサブタイプ山形は、クレードＹ１、Ｙ２、及びＹ３を含む。最後に、株という用語は、ゲノムに小さな遺伝的変異を有するという点で互いに異なるサブタイプ内のウイルスを指す。
【0069】
便宜上、本明細書で説明されているタンパク質構築物及びその一部を指すために、ある特定の略語を使用し得る。例えば、ＨＡは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質を指し得る。Ｈ１は、インフルエンザサブタイプ１株由来のＨＡを指す。Ｈ３は、インフルエンザサブタイプ３株由来のＨＡを指す。同様に、ＮＡは、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質又はその一部を指し得る。Ｎ２は、インフルエンザサブタイプ２株由来のノイラミニダーゼを指す。ｔｅｔ－ＮＡ又はｒＴＥＴ－ＮＡという用語は、細胞中で発現される場合に四量体ＮＡを形成する異種四量体化ドメインを含む組換えＮＡを指す。ＨＡは、ヘマグルチニン又はその一部を指す。
【0070】
ヘマグルチニン（ＨＡ）
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ＮＡと共に、２つの主要なインフルエンザ表面タンパク質の内の１つである。ＮＡ及びＨＡの両方の機能には、細胞の表面上で発現される糖タンパク質又は糖脂質上の糖部分に結合している末端分子であるシアル酸との相互作用が含まれる。細胞表面上のシアル酸へのＨＡの結合により、細胞によるウイルスのエンドサイトーシスが誘発され、ウイルスが細胞に侵入し感染することが可能になる。シアル酸はまた、感染細胞内で起こるグリコシル化プロセスの一部としてＨＡ及びＮＡに付加される。
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ＮＡと共に、２つの主要なインフルエンザ表面タンパク質の内の１つである。ＮＡ及びＨＡの両方の機能には、細胞の表面上で発現される糖タンパク質又は糖脂質上の糖部分に結合している末端分子であるシアル酸との相互作用が含まれる。細胞表面上のシアル酸へのＨＡの結合により、細胞によるウイルスのエンドサイトーシスが誘発され、ウイルスが細胞に侵入し感染することが可能になる。シアル酸はまた、感染細胞内で起こるグリコシル化プロセスの一部としてＨＡ及びＮＡに付加される。
【0071】
ＨＡは、宿主細胞へのインフルエンザウイルスの付着、及び細胞へのウイルスの浸透の間のウイルス－細胞膜融合を媒介すると考えられている。ＨＡ分子における抗原性の変異は、インフルエンザの頻繁な流行、及び免疫化による感染の限られた制御の原因である。
【0072】
ＨＡは、成熟インフルエンザウイルス中に三量体として存在している。各ＨＡ単量体は、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド（ＨＡ１及びＨＡ２）からなる。これらのポリペプチドは、インフルエンザウイルスの成熟中の単一前駆体タンパク質ＨＡ０の開裂によって誘導される。一部には、これらの分子はしっかりと折り畳まれているので、ＨＡ０並びに成熟ＨＡ１及びＨＡ２は、立体構造及び抗原特性が僅かに異なる。さらに、ＨＡ０はより安定であり、変性及びタンパク質分解に対して耐性を示す。
【0073】
所望のＨＡ遺伝子をクローニングするためのインフルエンザウイルス株の単離、増殖、及び精製を、当該技術分野で既知の任意の方法で実施し得、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７６２，９３９号明細書で開示されている方法により実施し得る。
【0074】
組換えＨＡ抗原を、適切な宿主細胞中で発現させ得る。例えば、組換えＨＡを、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９２２８号明細書で開示されているように、微細藻類細胞中で発現させ得る。或いは、組換えＨＡを、昆虫細胞中で発現させ得る。他の好適な宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、又は酵母細胞）を使用して、組換えＨＡを発現させ得る。
【0075】
ある特定の実施形態では、組換えＨＡを、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７６，５５２号明細書で開示されているように、ウイルス－ＨＡベクター（例えば、バキュロウイルスベクター）に感染している昆虫細胞中で発現させる。組換えＨＡ０由来のバキュロウイルス／昆虫細胞培養物は、インフルエンザに対する防御免疫を付与することが知られている。バキュロウイルスは、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、主に鱗翅目の昆虫種（例えば、チョウ及びガ）に限定される狭い宿主範囲を有することが知られている。例えば、バキュロウイルスオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、感受性培養昆虫細胞において効率的に複製する。ＡｃＮＯＶは、約１３０，０００塩基対の二本鎖閉鎖環状ＤＮＡゲノムを有しており、且つ宿主範囲、分子生物学、及び遺伝学に関して十分に特徴付けられている。
【0076】
ＡｃＮＰＶを含む多くのバキュロウイルスは、感染細胞の核内に大きなタンパク質結晶性閉塞を形成する。ポリヘドリンと呼ばれる単一のポリペプチドは、これらの閉塞体のタンパク質質量の約９５％を占める。ポリヘドリンの遺伝子は、ＡｃＮＰＶウイルスゲノム中に単一コピーとして存在している。ポリヘドリン遺伝子は、培養細胞におけるウイルス複製に必要とされないので、外来遺伝子を発現するように容易に改変し得る。ポリヘドリンプロモーターの転写制御下に存在するように、外来遺伝子配列を、ＡｃＮＰＶ遺伝子のポリヘドリンプロモーター配列のちょうど３’に挿入し得る。次いで、組換えＨＡタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを含む組換えバキュロウイルスを、様々な昆虫細胞株において複製し得る。組換えＨＡタンパク質をまた、例えばエントモポックスウイルス（昆虫のポックスウイルス）、細胞質多角体病ウイルス（ＣＰＶ）、及び組換えＨＡ遺伝子による昆虫細胞の形質転換を含む、他の発現ベクター中でも発現させ得る。
【0077】
一次遺伝子産物は、プロセシングされていない完全長ＨＡ（ｒＨＡ０）であり、分泌されず、感染細胞の周辺膜と結合したままである。昆虫細胞において、このｒＨＡ０は、Ｎ結合高マンノース型グリカンでグリコシル化されており、ｒＨＡ０が翻訳後に三量体を形成し、その後に細胞質細胞膜に蓄積している証拠がある。
【0078】
非変性非イオン性界面活性剤で、或いは細胞（例えば、昆虫細胞）から組換えタンパク質を精製するための当該技術分野で既知の他の方法（例えば、アフィニティー若しくはゲルクロマトグラフィー、抗原結合、ＤＥＡＥイオン交換、又はレンチルレクチンアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、ｒＨＡ０は周辺膜から選択的に抽出し得る。次いで、精製ｒＨＡ０を、等張の緩衝溶液に再懸濁させ得る。ある特定の実施形態では、ｒＨＡ０は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％まで精製されている。
【0079】
本明細書で開示されている組換えインフルエンザウイルスＨＡを、単独で、又は他の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原及び／若しくは後述する組換えインフルエンザウイルスＨＡとの組み合わせで、製剤化して包装し得る。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、１、２、３、４、５、６、又は７種の追加の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と共に製剤化し、ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、１、２、３、４、５、６、又は７種の追加の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原と共に製剤化する。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と共に製剤化して、四価のワクチン又は免疫原性組成物を生成する。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と、４種の追加の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原と共に製剤化して、八価のワクチン又は免疫原性組成物を生成する。
【0080】
本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に存在している組換えインフルエンザウイルスＨＡは、標準治療インフルエンザウイルス株由来の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、及び／又は本明細書で開示されている機械学習インフルエンザウイルスＨＡの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡは、野生型インフルエンザＨＡ、改変インフルエンザＨＡ、季節性インフルエンザウイルス株若しくはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のＨＡ、及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の形態のインフルエンザＨＡであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているのは、組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、このＨＡは、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ１ ＨＡ、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ３ ＨＡ、Ｂ／ビクトリア系統の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡ、又はＢ／山形系統の標準治療インフルエンザウイルス由来のＨＡから選択される、組換えインフルエンザウイルスＨＡである。
【0081】
本明細書で開示されているある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡは、パンデミック株又はパンデミック潜在性を有する株（例えば、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、及び／又はＨ１０）に由来する。
【0082】
本明細書で開示されているある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡは、機械学習モデルから同定されているか又は設計されている分子配列を有する１種又は複数種の機械学習組換えインフルエンザウイルスＨＡである。ある特定の実施形態では、機械学習組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＨＡ、Ｂ／山形系統由来のＨＡ、又はこれらの組み合わせの内の１つ又は複数から選択され得る。
【0083】
１種又は複数種の機械学習インフルエンザウイルスＨＡを選択する場合には、任意の機械学習アルゴリズムを使用し得る。例えば、本明細書で想定されているのは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、米国仮出願第６３／３１９，６９２号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び米国仮出願第６３／３１９，７００号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている機械学習アルゴリズム及び方法の内のいずれかである。
【0084】
ある特定の実施形態では、インフルエンザ抗原性の予測機械学習モデルを構築して、動物モデル及び／又はヒトにおける抗体力価の予測を可能にし得る。ある特定の実施形態では、機械学習モデルは、トレーニングセットの入力データから特徴値を抽出し得、特徴は、入力データ項目が関連する特性を有するか否かにかかわらず、潜在的に関連すると見なされる変数である。入力データのための特徴の順序付きリストは、入力データのための特徴ベクトルと呼ばれ得る。ある特定の実施形態では、機械学習モデルは、次元削減を（例えば、線形判別分析（ＬＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、ニューラルネットワークからの学習された深層特徴等を介して）適用して、入力データの特徴ベクトル内のデータの量を、より小さく、より代表的なデータのセットに削減する。次いで、防御すべき一連のインフルエンザ配列（例えば、標的株）を同定し、選択アルゴリズムを構築し得る。
【0085】
当該技術分野で既知の技術（例えば、ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＡＩ））を使用して、ヘマグルチニン活性を測定し得る。ＨＡＩは、赤血球（ＲＢＣ）表面上のシアル酸受容体がインフルエンザウイルス（及びいくつかの他のウイルス）の表面上で見出されるヘマグルチニン糖タンパク質に結合し、ウイルス粒子に濃度依存的に生じる、相互接続されたＲＢＣ及びウイルス粒子のネットワーク又は格子構造を作り出す、赤血球凝集反応と呼ばれる赤血球凝集反応のプロセスを適用する。これは、体内の病原体を標的とする細胞上の類似のシアル酸受容体に結合するウイルスの機能に関する代用として取られる物理的測定である。別のウイルス（アッセイにおいてＲＢＣに結合するために使用されるウイルスと遺伝的に類似であり得るか又は異なり得る）に対するヒト又は動物の免疫反応において生じた抗ウイルス抗体の導入は、ウイルス－ＲＢＣ相互作用を妨害し、アッセイにおいて赤血球凝集が観察される濃度を変えるのに十分なウイルスの濃度を変化させる。ＨＡＩの１つの目標は、アッセイにおいて赤血球凝集を阻害するそれらの能力と比較して、抗体を含有する抗血清又は他の試料中の抗体の濃度を特徴付けることであり得る。赤血球凝集を防止する抗体の最も高い希釈は、ＨＡＩ力価（即ち、測定された反応）と呼ばれる。
【0086】
ＨＡ抗体反応を測定するための別のアプローチは、ヒト又は動物の免疫反応によって誘発され、ＨＡＩアッセイにおいて赤血球凝集に必ずしも影響を及ぼし得るわけではない潜在的により大きな抗体のセットを測定することである。このための一般的なアプローチは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を利用するものであり、ウイルス抗原（例えば、ヘマグルチニン）を固体表面に固定化し、次いで、抗血清由来の抗体を抗原に結合させる。リードアウトは、抗血清由来の抗体、又はそれ自体が抗血清の抗体に結合する他の抗体に複合化した外因性酵素の基質の触媒作用を測定する。基質の触媒作用により、容易に検出可能な生成物が生じる。この種のインビトロアッセイには、多くのバリエーションがある。そのようなバリエーションの１つは、抗体法医学（ＡＦ）と呼ばれ、これは多くの抗原に対して同時に単一の血清試料を測定することを可能にする多重ビーズアレイ技術である。これらの測定は、ＨＡＩ力価と比較して、濃度及び総抗体認識を特徴付けるものであり、これらはヘマグルチニン分子によるシアル酸結合の干渉とより特異的に関連すると考えられている。従って、抗血清の抗体は、場合によっては、別のウイルスのヘマグルチニン分子と比較して、１つのウイルスのヘマグルチニン分子について対応するＨＡＩ力価よりも比例的に高いか又は低い測定値を有し得；言い換えれば、これらの２つの測定値であるＡＦ及びＨＡＩは、一般に直線的に相関しない。
【0087】
ＨＡ抗体反応を測定する別の方法として、ウイルス中和アッセイ（例えば、マイクロ中和アッセイ）が挙げられ、このアッセイでは、ウイルスを抗体／血清サンプルの連続希釈物と共にインキュベートした後の許容培養細胞において、特異的中和アッセイ技術に応じて、プラーク、巣、及び／又は蛍光シグナルの減少により抗体力価が測定される。
【0088】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ＨＡと共に、２番目に主要なインフルエンザ表面タンパク質である。ＮＡは、細胞の糖タンパク質及び糖脂質から、さらには新生ビリオン上で新たに合成されたＨＡ及びＮＡから、シアル酸を除去する。ＮＡによるシアル酸の除去によって、ウイルス粒子の凝集が防止されて感染細胞の表面からのウイルス粒子の効率的な放出が促進される。また、ＨＡを介した、既に感染している瀕死の細胞へのウイルスの結合も防止され、ウイルス感染のさらなる拡大が促進される。ＮＡが、従来のワクチン中に又は無傷のビリオン上に免疫原性の形態で存在する場合には、少数成分であり、従って、免疫優位のＨＡとの抗原競合が継続する。競合メカニズムに起因して、ＮＡに対する免疫原性反応は、より頻繁に起こるＨＡ抗原に優先して部分的に抑制されるように見える（Ｊｏｈａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐｒｉｏｒ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１９８７；１３９（６）：２０１０－２０１４；及びＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９７６；１３４（４）：３８４－９４）。結果として、ＮＡ免疫の効果は、一般に、中和ＨＡ抗体により目立たない。
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ＨＡと共に、２番目に主要なインフルエンザ表面タンパク質である。ＮＡは、細胞の糖タンパク質及び糖脂質から、さらには新生ビリオン上で新たに合成されたＨＡ及びＮＡから、シアル酸を除去する。ＮＡによるシアル酸の除去によって、ウイルス粒子の凝集が防止されて感染細胞の表面からのウイルス粒子の効率的な放出が促進される。また、ＨＡを介した、既に感染している瀕死の細胞へのウイルスの結合も防止され、ウイルス感染のさらなる拡大が促進される。ＮＡが、従来のワクチン中に又は無傷のビリオン上に免疫原性の形態で存在する場合には、少数成分であり、従って、免疫優位のＨＡとの抗原競合が継続する。競合メカニズムに起因して、ＮＡに対する免疫原性反応は、より頻繁に起こるＨＡ抗原に優先して部分的に抑制されるように見える（Ｊｏｈａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐｒｉｏｒ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１９８７；１３９（６）：２０１０－２０１４；及びＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９７６；１３４（４）：３８４－９４）。結果として、ＮＡ免疫の効果は、一般に、中和ＨＡ抗体により目立たない。
【0089】
ａ．野生型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ
本明細書で開示されている組成物及び方法は、ある特定の実施形態では、野生型単量体ＮＡ分子の４つのコピーを含む四量体ＮＡポリペプチドの使用を伴い得る。ＮＡは、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、４つの同一の単量体からなる四量体として、ウイルス表面上で集合する。野生型単量体の分子量は、インフルエンザサブタイプにもよるが、典型的には約５５～７２ｋＤａであり；四量体の分子量は、インフルエンザサブタイプにもよるが、典型的には約２４０～２６０ｋＤａである。各単量体は、下記の４つの異なる構造ドメインからなる：酵素頭部領域、柄領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部。最大のドメインは、頭部領域であり、この頭部領域は、膜貫通領域につながる柄領域によりウイルス膜に繋がれており、最終的にはＮ末端の細胞質ドメインに繋がれている。
本明細書で開示されている組成物及び方法は、ある特定の実施形態では、野生型単量体ＮＡ分子の４つのコピーを含む四量体ＮＡポリペプチドの使用を伴い得る。ＮＡは、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、４つの同一の単量体からなる四量体として、ウイルス表面上で集合する。野生型単量体の分子量は、インフルエンザサブタイプにもよるが、典型的には約５５～７２ｋＤａであり；四量体の分子量は、インフルエンザサブタイプにもよるが、典型的には約２４０～２６０ｋＤａである。各単量体は、下記の４つの異なる構造ドメインからなる：酵素頭部領域、柄領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部。最大のドメインは、頭部領域であり、この頭部領域は、膜貫通領域につながる柄領域によりウイルス膜に繋がれており、最終的にはＮ末端の細胞質ドメインに繋がれている。
【0090】
Ｎ１及びＮ２等の様々なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ間の柄領域は、サイズ及びアミノ酸構造が顕著に異なり得る（Ｂｌｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ’ｓｔａｌｋ’ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｉｇｈｔ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ Ａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ１９８２，２１（１７）：４００１－４００７）。柄の長さの差違により、酵素頭部領域の距離が調節され、ＮＡが細胞表面受容体上のシアル酸にアクセスする能力が影響を受けると考えられており、柄領域が短いほどシアリダーゼ活性が低下することと相関している（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｙｐｅ １ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｓ Ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ｂｏｔｈ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｈｅａｄ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２０１３，２８８（１）：６４４－５３；及びＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２０１９，１０（３９））。様々なサブタイプの柄領域間でのばらつきにもかかわらず、ＮＡの柄領域はまた、少なくとも１つのシステイン残基、及び潜在的なグリコシル化部位等のいくつかの構造的特徴も共有する。システイン残基は、ＮＡ単量体間のジスルフィド結合の形成に関与して、安定化したＮＡ四量体の形成を助け得、グリコシル化部位は、四量体の安定化に寄与し得る（ＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。例えば、Ｎ２ＮＡのアミノ酸位置７８で保存されているシステイン残基は、四量体集合メカニズムで役割を果たすと考えられている（Ｓｈｔｙｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＡＣＴＡ ＮＡＴＵＲＡＥ ２００９；１（２）：２６－３２）。
【0091】
酵素頭部領域は、４つの単量体で構成されている。頭部の各単量体は、保存された６枚羽根のプロペラ構造を形成する。各羽根は、ジスルフィド結合により安定化されており且つ様々な長さのループにより接続されている４つの逆平行βシートを有している（ＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これらの単量体の四量体化は、活性部位の形成と、酵素活性ＮＡの合成とに重要である（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｔｈａｔ Ａｆｆｅｃｔ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｈ５Ｎ１ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２０１６，９０（２０）：９４５７－７０）。
【0092】
ＮＡのアミノ酸配列及び長さは、Ｎ１及びＮ２等の様々なＡ型インフルエンザウイルスＮＡサブタイプ間で顕著に異なり得、特に、様々なＡ型インフルエンザウイルスＮＡサブタイプのＮＡ茎領域間で顕著に異なり得るが、様々なインフルエンザ株由来のＮ２のアミノ酸配列の長さは、典型的には約４６９個のアミノ酸であり、いくつかの株は、典型的には頭部領域において、約１又は２個（又はより多く）のアミノ酸の挿入又は欠失を有する。野生型Ｎ２の特定のアミノ酸残基に言及する場合には、この特定のアミノ酸残基の番号は、当該技術分野で理解されるように、Ｎ２ナンバリングに基づいている。Ｎ末端の細胞質尾部は、典型的には、野生型Ｎ２配列のアミノ酸１～６に対応しており、膜貫通ドメインは、典型的には、野生型Ｎ２配列のアミノ酸７～３５に対応する。例えば、Ａ／ＰＥＲＴＨ／１６／２００９株の野生型ＮＡ配列（配列番号１）において、細胞質領域は、配列番号１のアミノ酸１～６に対応しており、膜貫通領域は、配列番号１のアミノ酸７～３５に対応する。Ｎ２柄領域の長さは、典型的には約４６個のアミノ酸の長さであり、野生型Ｎ２配列の約アミノ酸３６で始まり約アミノ酸８２で終わる。例えば、Ａ／ＰＥＲＴＨ／１６／２００９株の野生型ＮＡ配列（配列番号１）において、柄領域は、配列番号１のアミノ酸３６～約アミノ酸８２に対応する。しかしながら、Ｎ２柄領域の終わりとＮ２頭部領域の始まりとの間の正確な境界は、Ｘ線結晶構造解析により解明されていない。
【0093】
ｂ．組換え及び／又は改変インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ
本開示の方法及び組成物は、組換えＮＡの使用を伴う。ある特定の実施形態では、組換えＮＡは、宿主細胞中で発現された場合に可溶性の四量体ＮＡを形成する改変単量体ＮＡ分子の４つのコピーを含む。一態様では、改変単量体ＮＡ分子は、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域と、異種オリゴマー化ドメインとを含むが、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域、及び柄領域の内の１つ又は複数の少なくとも一部を欠いている。
本開示の方法及び組成物は、組換えＮＡの使用を伴う。ある特定の実施形態では、組換えＮＡは、宿主細胞中で発現された場合に可溶性の四量体ＮＡを形成する改変単量体ＮＡ分子の４つのコピーを含む。一態様では、改変単量体ＮＡ分子は、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域と、異種オリゴマー化ドメインとを含むが、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域、及び柄領域の内の１つ又は複数の少なくとも一部を欠いている。
【0094】
例えば、改変単量体ＮＡは、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域との内の１つ若しくは複数を置き換えるか又はインフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て若しくは実質的に全てとを置き換える異種四量体化ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、異種四量体化ドメインは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／００３４５７８号明細書で開示されている四量体化ドメインである。同様に、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ ＯＮＥ，２０１１，６（２）：ｅ１６２８４；Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１３，２８８（１）：６４４－５３；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０（２０）：９４５７－７０；Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８４（１９）：１０３６６－７４；Ｐｒｅｖａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＰＬｏｓ ＯＮＥ，１０（８）：ｅ０１３５４７４を参照されたい。他の実施形態では、異種四量体化ドメインは、国際公開第２０１６／０９７７６９号パンフレットで説明されているヤツメウナギＶＬＲ－Ｂ抗体の端のＣ末端で見出されるペプチド（即ち、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃにおいて「Ｃ－ＴＥＲＭ」と命名されているドメイン）であり、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０９７７６９号パンフレットの配列番号１又は配列番号２である。
【0095】
ある特定の実施形態では、改変単量体インフルエンザウイルスＮＡは、シグナルペプチド、異種四量体化ドメイン、及びインフルエンザウイルスＮＡの頭部領域を含み、宿主細胞中での改変単量体インフルエンザウイルスＮＡの発現により、四量体ＮＡが分泌される。
【0096】
野生型のＮＡタンパク質は、膜貫通ドメインを含む膜結合タンパク質である。可溶性ＮＡタンパク質を作るために、膜貫通ドメインを欠失させてシグナルペプチドを付加することが可能である。シグナルペプチドは、組換えＮＡタンパク質の標的を分泌経路とし、その結果、組換えＮＡタンパク質は、この組換えＮＡが発現されている宿主細胞から分泌される。改変単量体ＮＡ核酸が宿主細胞内でポリペプチドに翻訳される場合には、このポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。しかしながら、翻訳後プロセッシング中に、シグナルペプチドは開裂され、分泌されたポリペプチドは、もはやシグナルペプチドを含まない。従って、改変単量体ＮＡは、この改変単量体ＮＡの標的を分泌経路とするために翻訳後にシグナルペプチドを含み得るが、このシグナルペプチドは、翻訳後プロセッシングにより除去され、そのため、この改変単量体ＮＡを発現する宿主細胞から得られる可溶性四量体ＮＡは、もはやシグナルペプチドを含まない４つの改変ＮＡ単量体で構成されている。
【0097】
ある特定の実施形態では、例えば、四量体ＮＡは、改変単量体インフルエンザウイルスＮＡの４つのコピーを含み、改変単量体インフルエンザウイルスＮＡは、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域と、異種四量体化ドメインとを含む。
【0098】
ある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとは、シグナルペプチド及び異種四量体化ドメインに置き換えられ得る。異種四量体化ドメインを含む改変ＮＡは、ＮＡ柄領域全体を欠き得るか、又はＮＡ柄領域の実質的に全てを欠き得、即ち、改変ＮＡ構築物は、ＮＡ柄領域のＣ末端部分を含み得る。例えば、異種四量体化ドメインを含む改変ＮＡは、ＮＡ柄領域の最もＣ末端のアミノ酸の約１～１３個を含み得る。当該技術分野で理解されるように、柄領域の最もＣ末端のアミノ酸は、ＮＡ頭部領域にすぐ隣接する残基である。さらなる例として、異種四量体化ドメイン構築物を含む改変ＮＡは、ＮＡ柄領域の最もＣ末端のアミノ酸の１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１～２個を含み得る。さらなる例として、異種四量体化ドメイン構築物を含む改変ＮＡは、ＮＡ柄領域の最もＣ末端のアミノ酸の約８個を含み得る。
【0099】
ある特定の実施形態では、異種四量体化ドメインは、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラキオン四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質由来の四量体化ドメイン、又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである。
【0100】
さらなる例として、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０３９９８０号で開示されているように、柄ドメインの全て又は実質的に全てを欠いている改変単量体インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）は、たとえ異種四量体化ドメインが付加されなくても、細胞中で発現された場合に可溶性四量体ＮＡを形成し得ることが発見されている。柄ドメインの全て又は実質的に全てを欠いている全てのＮ２株が、検出可能な量で可溶性四量体ＮＡを産生したわけではないが、試験したＮ２株の大部分は、検出可能な量の可溶性四量体ＮＡを産生しており、このことは、切り詰められている柄の設計戦略が、様々なＮ２インフルエンザ株由来のＮＡタンパク質に広く適用可能であることを示している。使用されるＮ２株に応じて、この改変単量体ＮＡ設計戦略により、宿主細胞中で発現された場合に、主に四量体ＮＡが産生され得るか、又は単量体ＮＡと四量体との混合物で産生され得る。そのため、ある特定のＮ２株、及び特定のＮ２株のある特定の柄が欠失したバリアントは、細胞内で発現され場合に、可溶性の四量体ＮＡをより高収率で産生する。いずれの場合においても、そのような改変ＮＡ構築物が宿主細胞中で発現された場合に産生される四量体ＮＡを精製することが望ましい場合がある。
【0101】
本明細書で使用される場合、インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）の「柄領域の実質的に全て」とは、インフルエンザウイルスＮ２の柄領域のアミノ酸３６から少なくともアミノ酸６９を指す。そのため、細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の実質的に全てとを欠いている改変Ｎ２は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ ＮＡのアミノ酸１～７０、１～７１、１～７２、１～７３、１～７４、１～７５、１～７６、１～７７、１～７８、１～７９、１～８０、又は１～８１を欠き得る。換言すると、本明細書で説明されている改変Ｎ２は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ ＮＡの柄領域の最もＣ末端のアミノ酸の最大１３個を含み得、柄領域の最もＣ末端のアミノ酸は、典型的には、Ｎ２のアミノ酸７０～８２を指す。ある特定の実施形態では、細胞質尾部、膜貫通領域、及び柄領域全体（例えば、アミノ酸１～８２）が、改変Ｎ２から除去されている。
【0102】
いくつかの実施形態では、例えば、四量体ＮＡは、改変インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼの４つのコピーを含み、このノイラミニダーゼでは、改変インフルエンザウイルスノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの頭部領域を含み、且つインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いており、四量体ＮＡは、異種四量体化ドメインを含まない。これらの実施形態の内のいくつかでは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとが、シグナルペプチドに置き換えられている。シグナルペプチドは、通常、翻訳後プロセッシング中に開裂されており、そのため、分泌されたＮＡポリペプチドは、典型的には、シグナルペプチドを含まない。これらの実施形態の内のいくつかでは、例えば、野生型Ｎ２インフルエンザウイルスＮＡのアミノ酸１から少なくともアミノ酸７０～８２は、シグナルペプチドに置き換えられている。細胞質ドメインと、膜貫通ドメインと、柄領域の全て又は実質的に全てとがシグナルペプチドに置き換えられており、且つ細胞中で発現される場合には四量体ＮＡを形成するこれらの改変Ｎ２構築物はまた、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０３９９８０号でもさらに詳細に説明されている。
【0103】
これらの改変単量体ＮＡにより形成されている四量体ＮＡ分子は、一般に、流体サンプル中で実質的に可溶性であり、また、典型的には触媒的に活性である（例えば、ノイラミン酸のグリコシド結合を酵素的に開裂可能）。しかしながら、四量体ＮＡ分子はまた、例えば変異に起因して、触媒的に不活性でもあり得る。
【0104】
ノイラミニダーゼ活性を、例えば、ＭＵＮＡＮＡアッセイ、ＥＬＬＡアッセイ、又はＮＡ－Ｓｔａｒ（登録商標）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）等の当該技術分野で既知の技術を使用して測定し得る。ＭＵＮＡＮＡアッセイでは、基質として、２’－（４－メチルウンベリフェリル）－アルファ－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）が使用される。サンプル中に含まれるあらゆる酵素的に活性なノイラミニダーゼは、ＭＵＮＡＮＡ基質を開裂し、蛍光化合物である４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）が放出される。そのため、試験サンプル中のノイラミニダーゼ活性の量は、放出された４－ＭＵの量と相関しており、この４－ＭＵの量を、蛍光強度（ＲＦＵ、相対蛍光単位）を使用して測定し得る。
【0105】
本開示の可溶性四量体ＮＡのノイラミニダーゼ活性を決定する目的のために、ＭＵＮＡＮＡアッセイを、下記の条件を使用して実施すべきである：可溶性四量体ＮＡを緩衝液［３３．３ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）、４ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＢＳＡ］、及び基質（１００μＭ ＭＵＮＡＮＡ）と混合し、振盪しつつ３７℃で１時間にわたりインキュベートし；アルカリ性ｐＨ溶液（０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３）を添加することにより反応を停止させ；励起波長３５５ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍそれぞれを使用して蛍光強度を測定し；４ＭＵ参照に対する酵素活性を算出する。必要に応じて、同等のアッセイを使用して、ノイラミニダーゼ酵素活性を測定し得る。
【0106】
本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に存在する組換えインフルエンザウイルスＮＡは、標準治療インフルエンザウイルス株由来の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び／又は本明細書で開示されている機械学習インフルエンザウイルスＮＡの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＮＡは、野生型インフルエンザＮＡ、非野生型インフルエンザＮＡ、季節性インフルエンザウイルス株若しくはパンデミックインフルエンザウイルス株に由来するＮＡ、及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の形態のインフルエンザＮＡであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているのは、組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、このＮＡは、標準治療インフルエンザウイルス由来のＮ１ ＮＡ、標準治療インフルエンザウイルス由来のＮ２ ＮＡ、Ｂ／ビクトリア系統の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＮＡ、又はＢ／山形系統の標準治療インフルエンザウイルス由来のＮＡから選択される、組換えインフルエンザウイルスＮＡである。
【0107】
本明細書で開示されているある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＮＡは、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ７、及び／又はＮ９を含む、パンデミック株又はパンデミック潜在性を有する株に由来する
【0108】
本明細書で開示されているある特定の実施形態では、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、機械学習モデルを使用して同定されているか、又は設計されている（「組換え機械学習インフルエンザウイルスＮＡ」）。ある特定の実施形態では、機械学習組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＮＡ、Ｂ／山形系統のＮＡ、又はこれらの組み合わせの内の１つ又は複数から選択され得る。
【0109】
機械学習組換えインフルエンザウイルスＨＡに関して上記で開示されているように、１種又は複数種の機械学習組換えインフルエンザウイルスＮＡを選択する場合には、任意の機械学習アルゴリズムを使用し得る。例えば、本明細書で想定されているのは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、及び国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている機械学習アルゴリズム及び方法の内のいずれかである。
【0110】
ワクチン又は免疫原性組成物
ある特定の態様では、本明細書で開示されているのは、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＨＡと、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＮＡとを含む複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＨＡ、Ｂ／山形系統由来のＨＡ、又はこれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態では、異種四量体化ドメインを含む１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＮＡ、Ｂ／山形系統由来のＮＡ、又はこれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いており且つ異種四量体化ドメインを含まない１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである。
ある特定の態様では、本明細書で開示されているのは、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＨＡと、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＮＡとを含む複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＨＡ、Ｂ／山形系統由来のＨＡ、又はこれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態では、異種四量体化ドメインを含む１種又は複数種（例えば、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来のＮＡ、Ｂ／山形系統由来のＮＡ、又はこれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いており且つ異種四量体化ドメインを含まない１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである。
【0111】
ある特定の態様では、本明細書で開示されているのは、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物であって、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、（１）第１の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）であり、この第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（２）第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（３）第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（４）第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（５）第１の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、この第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；（６）第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；（７）第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び（８）第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡを含む、ワクチン又は免疫原性組成物である。様々な実施形態では、組換えＮＡの内の１つ又は複数は、本明細書で説明されているように改変されている。
【0112】
本明細書でさらに開示されているのは、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチン又は免疫原性組成物であって、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、（１）第１の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）であり、この第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（２）第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（３）第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（４）第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、この第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；（５）第１の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、この第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；（６）第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；（７）第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び（８）第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、この第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡからなる、ワクチン又は免疫原性組成物である。様々な実施形態では、組換えＮＡの内の１つ又は複数は、本明細書で説明されているように改変されている。
【0113】
ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物中の組換えインフルエンザウイルスＨＡの内の１つ又は複数（例えば、１、２、３、又は４つ）は、標準治療インフルエンザ株に由来しており、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物中の組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、標準治療インフルエンザ株に由来している。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物中の組換えインフルエンザウイルスＮＡの内の１つ又は複数（例えば、１、２、３、又は４つ）は、標準治療インフルエンザ株に由来しており、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物中の組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、標準治療インフルエンザ株に由来している。
【0114】
ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＮ１ ＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、Ｎ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＮ２ ＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、同一のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡを含み、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、同一のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、異なるＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡを含み、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、異なるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡを含む。
【0115】
ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡ、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡ、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＮ１ ＮＡ、及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＮ２ ＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、同一のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡを含み、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、同一のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、異なるＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡを含み、ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、異なるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡを含む。
【0116】
多価のワクチン又は免疫原性組成物中の組換えインフルエンザウイルスＨＡの内の１つ又は複数、及び組換えインフルエンザウイルスＮＡの内の１つ又は複数を、単独で、又は他の組換えＨＡ及び／若しくはＮＡ抗原との組み合わせで、製剤化して包装し得る。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、１、２、又は３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原（例えば、標準治療インフルエンザウイルス株由来の１、２、又は３種の追加の組換え抗原）と共に製剤化する。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨＡを、３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と共に製剤化して、四価のワクチン又は免疫原性組成物を生成する。
【0117】
ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＮＡを、１、２、又は３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原（例えば、標準治療インフルエンザウイルス株由来の１、２、又は３種の追加の組換え抗原）と共に製剤化する。ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＮＡを、３種の追加の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原と共に製剤化して、四価のワクチン又は免疫原性組成物を生成する。
【0118】
ある特定の実施形態では、１種又は複数種（例えば、１、２、又は３種）の組換えインフルエンザウイルスＮＡを、１種又は複数種（例えば、１、２、３、又は４種）の組換えインフルエンザウイルスＨＡと共に製剤化する。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、４種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と、４種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原とを含み、八価のワクチン又は免疫原性組成物を生成し得る。ある特定の実施形態では、４種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原、及び４種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原は、それぞれ、標準治療インフルエンザウイルス株に由来し得る。ある特定の実施形態では、４種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原と、４種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ抗原とを含む八価のワクチン又は免疫原性組成物は、１種若しくは複数種の機械学習インフルエンザウイルスＨＡ、及び／又は１種若しくは複数種の機械学習インフルエンザウイルスＮＡをさらに含む。
【0119】
ある特定の実施形態では、組換えインフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、組換えインフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／山形系統由来の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、組換えインフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、組換えインフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／ビクトリア系統由来の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び／又はＢ／山形系統由来の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、機械学習モデルから同定されているか又は設計されている分子配列を有している。
【0120】
ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、１種又は複数種の組換えＨＡと、１種又は複数種の組換えＮＡとを含む五価のワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、１種又は複数種の組換えＨＡと、１種又は複数種の組換えＮＡとを含む六価のワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、１種又は複数種の組換えＨＡと、１種又は複数種の組換えＮＡとを含む七価のワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、１種又は複数種の組換えＨＡと、１種又は複数種の組換えＮＡと（例えば、４種の組換えＨＡ、及び４種の組換えＮＡ）を含む八価のワクチン又は免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、８種超の異なるＨＡ分子及びＮＡ分子を含む多価のワクチン又は免疫原性組成物である。
【0121】
各組換えＨＡは、本明細書で開示されている組成物中に、この組成物が投与される対象において免疫反応を誘発するのに有効な量で存在し得る。ある特定の実施形態では、各組換えＨＡは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に、例えば、約０．１μｇ～約５００μｇの範囲の量で存在し得、例えば、約５μｇ～約１２０μｇ、約１μｇ～約６０μｇ、約１０μｇ～約６０μｇ、約１５μｇ～約６０μｇ、約４０μｇ～約５０μｇ、約４２μｇ～約４７μｇ、約５μｇ～約４５μｇ、約１５μｇ～約４５μｇ、約０．１μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約９０μｇ、約１０μｇ～約９０μｇ、又は約１５μｇ～約９０μｇの範囲の量で存在し得る。ある特定の実施形態では、各組換えＨＡは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、又は約９０μｇの量で存在し得る。
【0122】
各組換えＨＡは、本明細書で開示されている組成物中に、この組成物が投与される対象において免疫反応を誘発するのに有効な量で存在し得る。ある特定の実施形態では、各組換えＮＡは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に、例えば、約０．１μｇ～約５００μｇの範囲の量で存在し得、例えば、約５μｇ～約１２０μｇ、約１μｇ～約６０μｇ、約１０μｇ～約６０μｇ、約１５μｇ～約６０μｇ、約５μｇ～約４５μｇ、約１５μｇ～約４５μｇ、約０．１μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約９０μｇ、約１０μｇ～約９０μｇ、約１５μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約２５μｇ、又は約１０μｇ～約２０μｇ、又は約１２μｇ～１８μｇの範囲の量で存在し得る。ある特定の実施形態では、各組換えＮＡは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、又は約９０μｇの量で存在し得る。
【0123】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に存在している組換えインフルエンザＨＡ及びＮＡの総量は、約１５０μｇ～約４００μｇ、約１５０μｇ～約３００μｇ、約２００μｇ～約３００μｇ、約２００μｇ～約２５０μｇ、又は約２２５μｇ～約２４５μｇの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に存在している組換えインフルエンザＨＡ及びＮＡの総量は、約５００μｇ、４００μｇ、３５０μｇ、３００μｇ、２５０μｇ、２００μｇ、又は１５０μｇ未満である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物中に存在している組換えインフルエンザＨＡ及びＮＡの総量は、約５００μｇ、約４００μｇ、約３５０μｇ、約３００μｇ、約２９０μｇ、約２８０μｇ、約２７０μｇ、約２６０μｇ、約２５０μｇ、約２４０μｇ、約２３０μｇ、約２２０μｇ、約２１０μｇ、約２００μｇ、約１９０μｇ、約１８０μｇ、約１７０μｇ、約１６０μｇ、又は約１５０μｇである。
【0124】
本ワクチン又は免疫原性組成物はまた、アジュバントもさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫反応を非特異的に増強する物質又はビヒクルを指す。アジュバントとして、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム／オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩（ＡＡＨＳ）、及び／又は硫酸アルミニウムカリウム））の懸濁液；又は抗原溶液が鉱油中に乳化された油中水型エマルション（例えば、フロイントインコンプリートアジュバント）が挙げられ、抗原性をさらに増強するために、死滅マイコバクテリアが含まれることもある（フロイントコンプリートアジュバント）。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むもの等）もまた、アジュバントとして使用し得る（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号明細書；同第６，２０７，６４６号明細書；同第６，２１４，８０６号明細書；同第６，２１８，３７１号明細書；同第６，２３９，１１６号明細書；同第６，３３９，０６８号明細書；同第６，４０６，７０５号明細書；及び同第６，４２９，１９９号明細書を参照されたい）。アジュバントとしてはまた、脂質及び共刺激分子等の生体分子が挙げられる。例示的な生物学的アジュバンとして、ＡＳ０４（Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，ＡＳ０４，ａｎ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｓａｌｔ－ａｎｄ ＴＬＲ４ Ａｇｏｎｉｓｔ－Ｂａｓｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２００９，１８３：６１８６－６１９７）、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、及び４１ ＢＢＬが挙げられる。
【0125】
ある特定の実施形態では、アジュバントは、少なくともスクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤、及び疎水性非イオン性界面活性剤を含む水中油型アジュバントエマルションを含むスクアレンベースのアジュバントである。ある特定の実施形態では、エマルションは熱可逆性であり、任意選択的に、油滴の体積基準で集団の９０％が２００ｎｍ未満のサイズを有する。
【0126】
ある特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、式ＣＨ３－（ＣＨ２）ｘ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ（式中、ｎは１０～６０の整数であり、ｘは１１～１７の整数である）のものである。ある特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤は、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテルである。
【0127】
ある特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の９０％が１６０ｎｍ未満のサイズを有する。ある特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の９０％が１５０ｎｍ未満のサイズを有する。ある特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の５０％が１００ｎｍ未満のサイズを有する。ある特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の５０％が９０ｎｍ未満のサイズを有する。
【0128】
ある特定の実施形態では、アジュバントは、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールを含むがこれらに限定されない少なくとも１種のアルジトールをさらに含む。
【0129】
ある特定の実施形態では、親水性非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、１０以上である。ある特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは、９未満である。ある特定の実施形態では、親水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは、１０以上であり、疎水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは、９未満である。
【0130】
ある特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤は、ソルビタンモノオレアート等のソルビタンエステル、又はマンニドエステル界面活性剤である。ある特定の実施形態では、スクアレンの量は、５～４５％である。ある特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤の量は、０．９～９％である。ある特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤の量は、０．７～７％である。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ｉ）３２．５％のスクアレン、ｉｉ）６．１８％のポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル、ｉｉｉ）４．８２％のソルビタンモノオレアート、及びｉｖ）６％のマンニトールを含む。
【0131】
ある特定の実施形態では、アジュバントは、アルキルポリグリコシド及び／又は凍結防止剤、例えば糖、特にドデシルマルトシド及び／又はスクロースをさらに含む。
【0132】
ある特定の実施形態では、アジュバントは、Ｋｌｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＦ０３，ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｑｕａｌｅｎｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｊ．ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．２０１２，１０１（１２）：４４９０－４５００（この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されているようなＡＦ０３を含む。ある特定の実施形態では、アジュバントは、例えば、国際公開第２０２２／０９０３５９号パンフレット（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されているようなＳＰＡ１４等のリポソームベースのアジュバントを含む。ＳＰＡ１４は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト（Ｅ６０２０）及びサポニン（ＱＳ２１）を含むリポソームベースのアジュバントである。
【0133】
組換えＨＡ、組換えＮＡ、及び任意選択的なアジュバントに加えて、ワクチン又は免疫原性組成物はまた、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤もさらに含み得る。一般に、賦形剤の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的に且つ生理学的に許容される流体を含む注入可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、又はカプセル形態）では、従来の非毒性固体担体として、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを挙げ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるワクチン又は免疫原性組成物は、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、保存剤、安定剤、緩衝剤、糖、アミノ酸、及びｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート）を含み得る。
【0134】
典型的には、ワクチン又は免疫原性組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、又は筋肉内等の非経口投与用に製剤化された無菌の液体溶液である。ワクチン又は免疫原性組成物はまた、鼻腔内又は吸入投与用に製剤化され得る。ワクチン又は免疫原性組成物はまた、任意の他の意図される投与経路のために製剤化され得る。
【0135】
いくつかの実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、皮内注射、鼻腔内投与、又は筋肉内注射用に製剤化されている。いくつかの実施形態では、注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液として、注射前に液体の溶液若しくは懸濁液とするのに適した固体形態として、又はエマルションとして、従来の形態で調製されている。いくつかの実施形態では、注射溶液及び懸濁液は、滅菌された粉末又は顆粒から調製されている。これらの経路による投与のための医薬品の製剤化及び製造における一般的な考慮事項を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５（参照により本明細書に組み込まれる）に見出し得る。現在、経口又は経鼻スプレー又はエアロゾル経路（例えば、吸入による）は、治療薬を肺及び呼吸器系に直接送達するために最も一般的に使用される。いくつかの実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物を、このワクチン又は免疫原性組成物を定量送達するデバイスを使用して投与する。本明細書で説明されている皮内用医薬組成物の送達に使用するのに好適なデバイスとして、短針デバイス、例えば米国特許第４，８８６，４９９号明細書、同第５，１９０，５２１号明細書、同第５，３２８，４８３号明細書、同第５，５２７，２８８号明細書、同第４，２７０，５３７号明細書、同第５，０１５，２３５号明細書、同第５，１４１，４９６号明細書、同第５，４１７，６６２号明細書（これらの文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているものが挙げられる．皮内用組成物をまた、皮膚への針の有効な貫入長を制限するデバイス、例えば、国際公開第１９９９／３４８５０号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているもの、及びその機能的等価物によっても投与し得る。また、液体ジェット式注射器によって、又は角質層を穿孔し、真皮に到達するジェットを生成する針によって、液体ワクチンを真皮に送達するジェット式注射デバイスも好適である。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号明細書、同第５，５９９，３０２号明細書、同第５，３３４，１４４号明細書、同第５，９９３，４１２号明細書、同第５，６４９，９１２号明細書、同第５，５６９，１８９号明細書、同第５，７０４，９１１号明細書、同許第５，３８３，８５１号明細書、同第５，８９３，３９７号明細書、同第５，４６６，２２０号明細書、同第５，３３９，１６３号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，５０３，６２７号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第５，５２０，６３９号明細書、同第４，５９６，５５６号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，９４０，４６０号明細書、国際公開第１９９７／３７７０５号パンフレット、及び同第１９９７／１３５３７号パンフレット（これらの文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている。また、皮膚の外層を通って真皮まで粉末形態のワクチンを加速するために圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達デバイスも好適である。加えて、皮内投与の古典的なマントー法において、従来のシリンジが使用され得る。
【0136】
非経口投与のための製剤として、典型的には、滅菌した水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルがある。水性担体として、水、アルコール性／水性の溶液、乳液、又は懸濁液、例えば、生理食塩水、及び緩衝媒体が挙げられる。非経口用ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとして、流体及び栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルデキストロースをベースとしたもの）等が挙げられる。保存剤及び他の添加剤（例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等）も存在し得る。
【0137】
キット
本明細書でさらに開示されているのは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物のためのキットである。キットには、ワクチン若しくは免疫原性組成物を含む好適な容器、又はワクチン若しくは免疫原性組成物の種々の成分を含む複数の容器が、任意選択的に使用説明書と共に含まれ得る。
本明細書でさらに開示されているのは、本明細書で開示されているワクチン又は免疫原性組成物のためのキットである。キットには、ワクチン若しくは免疫原性組成物を含む好適な容器、又はワクチン若しくは免疫原性組成物の種々の成分を含む複数の容器が、任意選択的に使用説明書と共に含まれ得る。
【0138】
ある特定の実施形態では、キットは、複数の容器を含み得、例えば、本明細書で開示されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む第１の容器と、本明細書で開示されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡを含む第２の容器とを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているのは、（１）第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、この第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む第１の容器と、（２）第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、この第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡを含む第２の容器とを含むキットである。ある特定の実施形態では、キットは、任意選択的なアジュバントを含む第３の容器をさらに含み得、ある特定の実施形態では、第１及び／又は第２の容器は、組換えインフルエンザウイルス抗原に加えて、任意選択的なアジュバントを含み得る。
【0139】
ある特定の実施形態では、キットは、本明細書で開示されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれ、及び本明細書で開示されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれ、並びに任意選択的なアジュバントを含む単一の容器を含み得る。ある特定の実施形態では、この任意選択的なアジュバントは、別個の容器中に存在し得る。
【0140】
使用説明書は、投与前に第１及び第２の容器の内容物を組み合わせ得ること、又は第１及び第２の容器の内容物を、組み合わせ得ずに別々に投与することを示し得る。
【0141】
核酸、クローニング及び発現系
本開示は、本開示の組換えＨＡ及びＮＡをコードする人工核酸分子をさらに提供する。この核酸は、ＤＮＡを含むか又はＲＮＡを含んでよく、また全体が又は部分的に合成であっても組換えであってもよい。本明細書に記載されているヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈上別段の要求がない限り、ＵがＴ又はシュードウリジン等のその誘導体に置換されている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。他のヌクレオチド誘導体又は改変ヌクレオチドを、本開示のＨＡ及びＮＡをコードする人工核酸分子に組み込み得る。
本開示は、本開示の組換えＨＡ及びＮＡをコードする人工核酸分子をさらに提供する。この核酸は、ＤＮＡを含むか又はＲＮＡを含んでよく、また全体が又は部分的に合成であっても組換えであってもよい。本明細書に記載されているヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈上別段の要求がない限り、ＵがＴ又はシュードウリジン等のその誘導体に置換されている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。他のヌクレオチド誘導体又は改変ヌクレオチドを、本開示のＨＡ及びＮＡをコードする人工核酸分子に組み込み得る。
【0142】
本開示はまた、本明細書で開示されているＨＡ又はＮＡをコードする人工核酸分子を含むベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、転写又は発現カセット、人工染色体等）の形態の構築物も提供する。本開示は、さらに、上記の１つ又は複数の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【0143】
同様に提供されるのは、当該技術分野で既知の且つ上述した組換え技術を使用して、組換えＨＡポリペプチド又は組換えＮＡポリペプチドを製造する方法である。組換えタンパク質の生成及び発現は、当該技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ．２０１２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓで開示されているもの等の従来の手順を使用して実行し得る。例えば、ＨＡポリペプチド又はＮＡポリペプチドの発現を、本明細書で開示されているＨＡ又はＮＡをコードする人工核酸分子を含有する宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成し得る。例えば、組換えＨＡ又はＮＡポリペプチドの発現を、本明細書で開示されているＨＡ又はＮＡをコードする核酸分子を含有する宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成し得る。発現により生成後、任意の好適な技術を使用してＨＡ又はＮＡを単離し得、及び／又は精製し得、次いで、必要に応じて使用し得る。
【0144】
様々な異なる宿主細胞におけるクローニング及びポリペプチド発現のための系は、当該技術分野で公知である。本出願で開示されている構築物に適合する任意のタンパク質発現系（例えば、安定又は一過性）を使用して、本明細書で説明されているＨＡ又はＮＡを生成し得る。
【0145】
好適なベクターは、適切な調節配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列）を含むように選択され得るか、又は構築され得る。
【0146】
本明細書で開示されている組換えＨＡ及び／又は組換えＮＡを発現させるために、ＨＡをコードする核酸又はＮＡコードする核酸を、宿主細胞に導入し得る。この導入は、任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞では、好適な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、及びレトロウイルス若しくは他のウイルス（例えば、ワクシニア、又は昆虫細胞ではバキュロウイルス）を使用する形質導入が挙げられ得る。細菌細胞では、好適な技術として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられ得る。これらの技術は、当該技術分野で公知である。（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１０を参照されたい）。ＤＮＡ導入に続いて、ベクターを含有する細胞を選択する選択方法（例えば、抗生物質耐性）を行い得る。
【0147】
宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞、又は動物細胞であり得る。動物細胞は、無脊椎動物細胞（例えば、昆虫細胞）、非哺乳類脊椎動物細胞（例えば、鳥類、爬虫類、及び両生類）、並びに哺乳動物細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例として、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；マウスセルトリ細胞；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ）等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。
【0148】
機械学習
１種又は複数種の機械学習インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡを選択する際、任意の機械学習アルゴリズムを使用し得る。例えば、本明細書で想定されているのは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、及び同第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、米国仮出願第６３／３１９，６９２号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び同第６３／３１９，７００号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示されている機械学習アルゴリズム及び方法の内のいずれかである。
１種又は複数種の機械学習インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡを選択する際、任意の機械学習アルゴリズムを使用し得る。例えば、本明細書で想定されているのは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、及び同第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、米国仮出願第６３／３１９，６９２号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び同第６３／３１９，７００号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示されている機械学習アルゴリズム及び方法の内のいずれかである。
【0149】
ある特定の実施形態では、インフルエンザ抗原性の予測機械学習モデルを構築して、動物モデル及び／又はヒトにおける抗体力価の予測を可能にし得る。ある特定の実施形態では、機械学習モデルは、トレーニングセットの入力データから特徴値を抽出し得、この特徴は、入力データ項目が関連する特性を有するか否かにかかわらず、潜在的に関連すると見なされる変数である。入力データのための特徴の順序付きリストは、入力データのための特徴ベクトルと称され得る。ある特定の実施形態では、機械学習モデルは、次元削減を（例えば、線形判別分析（ＬＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、ニューラルネットワークからの学習された深層特徴等を介して）適用して、入力データの特徴ベクトル内のデータの量を、より小さく、より代表的なデータのセットに削減する。次いで、防御すべき一連のインフルエンザ配列（例えば、標的株）を同定して、選択アルゴリズムを構築し得る。
【0150】
ある特定の実施形態では、ワクチンを設計するためのシステムが提供される。このシステムは、１つ又は複数のプロセッサを含む。このシステムは、１つ又は複数のプロセッサによって実行される場合に、この１つ又は複数のプロセッサに１つ又は複数の操作を実行させる、実行可能なコンピュータ命令を保存するコンピュータストレージを含む。この１つ又は複数の操作は、１つ又は複数の分子配列を表す出力データを生成するように構成された複数のドライバモデルを第１の時系列データセットに適用することを含み、第１の時系列データセットは、１つ又は複数の分子配列、及び１つ又は複数の分子配列のそれぞれについて、その分子配列を天然抗原として含む病原性株の１回又は複数回の循環を示す。１つ又は複数の操作は、複数のドライバモデルのそれぞれについて、下記によってドライバモデルを訓練することを含む：ｉ）ドライバモデルから、受け取った第１の時系列データセットに基づく１つ又は複数の予測分子配列を表す出力データを受け取り、ｉｉ）予測された１つ又は複数の分子配列を表す出力データに、複数の並進軸についての分子配列に対する生物学的反応を予測するように構成された並進モデルを適用して、出力データの１つ又は複数の予測分子配列に基づいて複数の並進軸の特定の並進軸に対応する１つ又は複数の第１の並進応答を表す第１の並進応答データを生成し、ｉｉｉ）第１の並進応答データに基づいてドライバモデルの１つ又は複数のパラメータを調整し、ｉｖ）ステップｉ～ｉｉｉを多数回繰り返して、特定の並進軸に対応する１つ又は複数の訓練された並進応答を表す訓練された並進応答データを生成する。１つ又は複数の操作は、１つ又は複数の訓練された並進応答に基づいて、複数のドライバモデルの内の訓練されたドライバモデルのセットを選択することを含む。１つ又は複数の操作は、訓練されたドライバモデルのセットの各訓練されたドライバモデルについて、特定の季節のための１つ又は複数の予測分子配列を表す訓練された出力データを生成するために、訓練されたドライバモデルを第２の時系列データセットに適用し；複数の並進軸の各並進軸について、１つ又は複数の第２の並進応答を表す第２の並進応答データを生成するために、並進モデルを最終出力データに適用し；第２の並進応答データに基づいて、訓練されたドライバモデルのセットの訓練されたドライバモデルのサブセットを選択することを含む。
【0151】
複数のドライバモデルの内の少なくとも１つは、リカレントニューラルネットワークを含み得る。複数のドライバモデルの内の少なくとも１つは、長・短期記憶リカレントニューラルネットワークを含む。
【0152】
受信された第１の時系列データセットに基づく１つ又は複数の予測分子配列を表す出力データは、複数の病原性季節のそれぞれについての抗原を表す出力データを含み得る。複数の病原性季節のそれぞれについての抗原を表す出力データは、特定の季節の循中の全ての病原性株にわたって最大化された凝集生物学的反応を生成する分子配列を予測することによって決定される抗原を含み得る。複数の病原性季節のそれぞれについての抗原を表す出力データは、特定の季節の循環中の最大数のウイルスに対して効果的に免疫する反応を生成する分子配列を予測することによって決定される抗原を含み得る。
【0153】
複数の並進軸は、フェレット抗体法医学（ＡＦ）軸、フェレット赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）軸、マウスＡＦ軸、マウスＨＡＩ軸、ヒトレプリカＡＦ軸、ヒトＡＦ軸、又はヒトＨＡＩ軸の内の少なくとも１つを含み得る。反復回数は、所定の反復回数に基づき得る。反復回数は、所定の誤差値に基づき得る。１つ又は複数の第１の翻訳応答は、予測フェレットＨＡＩ力価、予測フェレットＡＦ力価、予測マウスＡＦ力価、予測マウスＨＡＩ力価、予測ヒトレプリカＡＦ力価、予測ヒトＡＦ力価、又は予測ヒトＨＡＩ力価の内の少なくとも１つを含み得る。
【0154】
複数のドライバモデルの内の訓練されたドライバモデルのセットを選択することは、複数のドライバモデルの各ドライバモデルをドライバモデルのクラスに割り当てることを含み得、各クラスは、そのドライバモデルを訓練するために使用される複数の並進軸の特定の並進軸に関連付けられている。複数のドライバモデルの内の訓練されたドライバモデルのセットを選択することは、複数のドライバモデルの内の各ドライバモデルについて、そのドライバモデルの内の１つ又は複数の訓練された並進応答を、そのドライバモデルと同じクラスに割り当てられた少なくとも１つの他のドライバモデルの内の１つ又は複数の訓練された並進応答と比較することを含み得る。
【0155】
操作は、訓練されたドライバモデルのサブセットの各訓練されたドライバモデルについて、その訓練されたドライバモデルに対応する第２の並進応答データを、観察された実験応答データと比較することによって、その訓練されたドライバモデルを検証し、その訓練されたドライバモデルの検証に応答して、その訓練されたドライバモデルに対応する訓練された出力データによって表される１つ又は複数の分子配列を含むワクチンを生成することをさらに含み得る。
【0156】
一態様では、システムが提供される。このシステムは、コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読メモリを含む。このシステムは、１つ又は複数の分子配列を予測するように訓練された少なくとも１つの機械学習モデルを含む実行可能ロジックを実行するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含み、その少なくとも１つのプロセッサがコンピュータ実行可能命令を実行している場合に、少なくとも１つのプロセッサは、１つ又は複数の操作を実行するように構成されている。１つ又は複数の操作は、１つ又は複数の分子配列を示す時系列データを受信すること、及び１つ又は複数の分子配列のそれぞれについて、天然抗原としてその分子配列を含む病原性株の１回又は複数回の循環を受信することを含む。１つ又は複数の操作は、機械学習モデルに含まれる実行可能ロジックの１つ又は複数の部分を保存する１つ又は複数のデータ構造を通して時系列データを処理し、この時系列データに基づいて１つ又は複数の分子配列を予測することを含む。
【0157】
時系列データに基づいて１つ又は複数の分子配列を予測することは、予測された１つ又は複数の分子配列が将来の使用に与える１つ又は複数の免疫学的特性を予測することを含み得る。時系列データに基づいて１つ又は複数の分子配列を予測することは、時系列データの全ての病原性株にわたって最大化された凝集生物学的反応を生成する１つ又は複数の分子配列を予測することを含み得る。時系列データに基づいて１つ又は複数の分子配列を予測することは、時系列データの最大数の病原菌株を効果的にカバーする生物学的反応を生成する１つ又は複数の分子配列を予測することを含み得る。予測された１つ又は複数の分子配列を使用して、時系列データの１回又は複数回の循環の後の時間に循環する病原性株のためのワクチンを設計し得る。
【0158】
機械学習モデルは、リカレントニューラルネットワークを含見える。
【0159】
ある特定の実施形態では、生物学的反応を予測するためのデータ処理システムが提供される。このシステムは、コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読メモリを含む。このシステムは、生物学的反応を予測するように訓練された少なくとも１つの機械学習モデルを含む実行可能ロジックを実行するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含み、その少なくとも１つのプロセッサがコンピュータ実行可能命令を実行している場合には、少なくとも１つのプロセッサは、１つ又は複数の操作を実行する。１つ又は複数の操作は、第１の分子配列の第１の配列データを受信することを含む。１つ又は複数の操作は、第２の分子配列の第２の配列データを受信することを含む。１つ又は複数の操作は、受信した第１及び第２の配列データに少なくとも部分的に基づいて、第２の分子配列に対する生物学的反応を予測することを含む。
【0160】
１つ又は複数の操作は、第１の分子配列及び第２の分子配列に対応する非ヒト生物学的反応データを受信することを含み得る。１つ又は複数の操作は、さらに非ヒト生物学的反応データに少なくとも部分的に基づいて生物学的反応を予測することを含み得る。１つ以上の操作は、第１の配列データ及び第２の配列データをアミノ酸ミスマッチとしてコードすることを含み得る。
【0161】
第１の分子配列は、候補抗原を含み得る。第２の分子配列は、既知のウイルス株を含み得る。
【0162】
生物学的反応を予測することは、ヒト生物学的反応を予測することを含み得る。生物学的反応を予測することは、少なくとも１つのヒト生物学的反応、及び少なくとも１つの非ヒト生物学的反応を予測することを含み得る。生物学的反応は、抗体力価を含み得る。機械学習モデルは、ディープニューラルネットワークを含み得る。
【0163】
機械学習法を使用して、偽陽性及び偽陰性の発生率が低下するように、生物学的反応を予測する機械学習モデルを訓練し得る。説明されているシステム及び方法の内の少なくともいくつかを使用して、従来の手法と比較した場合に、例えば、データの次元を削減することによって、本質的に疎なデータを効率的に処理し得る。説明されているシステム及び方法の内の少なくともいくつかは、受信データにおける非線形関係を利用して、従来の手法と比較して予測精度を高め得る。説明されているシステム及び方法の内の少なくともいくつかを使用して、ヒト生物学的反応及び非ヒト生物学的反応を同時に予測し得る。説明されているシステム及び方法の内の少なくともいくつかを使用して、実験的に観察されない結果を予測し得る。
【0164】
ある特定の実施形態では、１つ又は複数のコンピュータからなるシステムを、操作中にシステムに動作を実行させる、システムに搭載されたソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はこれらの組み合わせを有することによって、特定の操作又は動作を実行するように構成し得る。１つ又は複数のコンピュータプログラムを、データ処理装置によって実行される場合に、装置に動作を実行させる命令を含むことによって、特定の操作又は動作を実行するように構成し得る。一般的な一態様には、連続データアルゴリズムを使用することによってワクチンを製造する方法が含まれる。本方法は、複数の第１の離散値を含み得る離散データオブジェクトを受信することを含み、この離散データオブジェクトは、１つ又は複数のアミノ酸配列を含み得る。本方法はまた、離散データオブジェクトを、複数の第１の連続値を含み得る連続データオブジェクトに変換することも含む。本方法はまた、連続データオブジェクトに、連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含み得る連続結果オブジェクトを生成することも含む。本方法はまた、連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含み得る離散結果オブジェクトに変換することも含む。本方法はまた、ｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含み得るワクチンを製造することも含む。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、本方法の動作を実行するように構成されている。
【0165】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。１つ又は複数のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得る方法（第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれは、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む）。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成すること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）、各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成すること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）、及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成することを含み得る。各重みベクトルは、２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸の内の１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は、複数の第２の離散値を形成する。本方法は、さらに、複数の候補離散結果オブジェクトを生成すること、及び複数の候補離散結果オブジェクトから、製造可能性試験に失敗したアミノ酸を特定する少なくとも１つの離散結果オブジェクトを除外することを含み得る。連続結果オブジェクトを生成するための連続データアルゴリズムの適用は、複数の損失基準に基づいて損失値を決定する損失関数を用いた勾配降下法を適用することを含み得、損失関数には、２つのアミノ酸配列が与えられた免疫学的反応に基づく第１の損失基準；正しく折り畳まれないと予測される野生型配列又はサブ配列のデータセットに見出されないサブ配列の損失値を修正する第２の損失基準；及び各重みベクトルについて、第２の連続値における最大値に基づいて損失値を修正する第３の損失基準が含まれ得る。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0166】
一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成するためのシステムが含まれ、このシステムは、コンピュータメモリを含み得る。このシステムはまた、１つ又は複数のプロセッサも含み得る。このシステムはまた、プロセッサによって実行されるときに、操作をプロセッサに実行させる命令を記憶するコンピュータメモリも含み得、その操作には、複数の第１の離散値を含む離散データオブジェクトを受信すること（離散データオブジェクトは、１又は複数のアミノ酸配列を含む）；この離散データオブジェクトを複数の第１の連続値を含む連続データオブジェクトに変換すること；この連続データオブジェクトに連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含む連続結果オブジェクトを生成すること；この連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含む離散結果オブジェクトに変換すること、並びにｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義定されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含むワクチンを製造することが含まれ得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。
【0167】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。一実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれが、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む、システムがある。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成すること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）、各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成すること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）、及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成することを含む。各重みベクトルは、２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸のうちの１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は、複数の第２の離散値を形成する。この操作は、さらに：複数の候補離散結果オブジェクトを生成すること、及び複数の候補離散結果オブジェクトから、製造可能性試験に失敗したアミノ酸を特定する少なくとも１つの離散結果オブジェクトを除外することを含み得る。連続結果オブジェクトを生成するための連続データアルゴリズムの適用は、複数の損失基準に基づいて損失値を決定する損失関数を用いた勾配降下法を適用することを含み得、損失関数には、２つのアミノ酸配列が与えられた免疫学的反応に基づく第１の損失基準；正しく折り畳まれないと予測される野生型配列又はサブ配列のデータセットに見出されないサブ配列の損失値を修正する第２の損失基準；及び各重みベクトルについて、第２の連続値における最大値に基づいて損失値を修正する第３の損失基準が含まれ得る。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータがアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0168】
一般的な一態様は、１つ又は複数のプロセッサによって実行されると、１つ又は複数のプロセッサに、下記を含み得る操作を実行させる命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む：複数の第１の離散値を含む離散データオブジェクトを受信すること（離散データオブジェクトは、１つ又は複数のアミノ酸配列を含む）；この離散データオブジェクトを、複数の第１の連続値を含む連続データオブジェクトに変換すること；この連続データオブジェクトに連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含む連続結果オブジェクトを生成すること；この連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含む離散結果オブジェクトに変換すること、並びにｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含むワクチンを製造する。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれは、本方法の動作を実行するように構成されている。
【0169】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。１つ又は複数のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得る媒体（第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれは、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む）。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成すること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）、各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成すること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）、及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成することを含み得る。各重みベクトルは、２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸の内の１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は、複数の第２の離散値を形成する。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータがアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0170】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているのは、ワクチンとして使用するためのインフルエンザ抗原を生成し得るアルゴリズムである。一実装形態では、これには、下記が含まれ得る：１）次の２つのステップを使用する機械学習（例えば、変分オートエンコーダアーキテクチャ）によって、全ての野生型ヘマグルチニン配列の削減次元空間を生成する：
ａ）削減された空間に可変的に埋め込む（例えば、モデルが、予測された平均及び分散を有する正規分布から選択された埋め込まれた座標を用いて、入力配列から平均及び分散を予測する）；
ｂ）次いで、削減された空間位置「オートエンコーダ」損失関数から元の配列にデコードし、入力及び出力配列の類似性によって削減する。
ａ）削減された空間に可変的に埋め込む（例えば、モデルが、予測された平均及び分散を有する正規分布から選択された埋め込まれた座標を用いて、入力配列から平均及び分散を予測する）；
ｂ）次いで、削減された空間位置「オートエンコーダ」損失関数から元の配列にデコードし、入力及び出力配列の類似性によって削減する。
【0171】
２）削減次元空間における抗原（ワクチン候補）及びリードアウト株（標的配列）の位置に基づく免疫反応予測モデルを訓練する［入力：ステップ１のモデルにより埋め込まれた抗原及びリードアウト、出力：抗体力価等の免疫反応の尺度］。
【0172】
３）削減空間から候補ワクチン成分表現をサンプリングし、ステップ２で説明されているモデルを用いて標的配列に対する予測性能によって候補ワクチン成分表現をランク付けし、上位候補を特定する。
【0173】
４）上位候補表現をデコードして［ステップ１ｂからのモデルを使用する］、元の野生型セットで観察された可能性又は観察されなかった可能性のあるヘマグルチニン配列を放出する。
【0174】
１つ又は複数のコンピュータからなるシステムを、操作中にシステムに動作を実行させる、システムに搭載されたソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はこれらの組み合わせを有することによって、特定の操作又は動作を実行するように構成し得る。１つ又は複数のコンピュータプログラムを、データ処理装置によって実行されると、装置に動作を実行させる命令を含むことによって、特定の操作又は動作を実行するように構成し得る。一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成するための次元削減方法が含まれ、この方法は、１つ又は複数のコンピュータからなるシステムによって実行される。この方法は、複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信することを含む。この方法はまた、１つ又は複数のデータオブジェクトから、削減次元空間内の複数の削減次元配列を生成することを含み、各削減次元配列は野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含み、削減次元空間は野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する。この方法はまた、複数の削減次元配列を使用して、削減次元空間内に複数の候補配列を生成することを含む。この方法はまた、ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信することを含む。この方法はまた、削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成することを含む。この方法はまた、力価予測因子への入力として、候補配列のそれぞれ及び少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を提供することを含む。この方法はまた、力価予測因子からの出力として、候補配列のそれぞれについての候補スコアを受信することを含む。この方法はまた、候補配列の中から少なくとも１つの候補配列を選択することを含む。この方法はまた、選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成することを含む。この方法はまた、生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供することを含む。この方法はまた、生成されたアミノ酸配列のそれぞれが、それぞれのワクチンを製造するのに適している操作を含む。ワクチンには、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含み得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、この方法の動作を実行するように構成されている。
【0175】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。本方法は、複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得る操作を含む。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値のグループを含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列、及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し、出力として、候補スコアとして力価スコアを提供し、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義するように構成される。選択された候補配列として少なくとも１つの候補配列を選択することは、最も高い候補スコアを有するｎ個の候補配列を選択することを含み得る。この方法は、単一の候補配列が選択されるように、ｎが１の値である操作を含む。この方法は、複数の候補配列が選択されるように、ｎが１より大きい値である操作を含む。少なくとも１つの候補配列を、選択された候補配列として選択することは、それぞれの候補スコアが閾値よりも大きい候補配列を選択することを含み得る。生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、野生型アミノ酸配列のいずれとも異なる。候補配列の内の少なくとも１つは、複数の削減次元配列内にある。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータがアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0176】
一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成するためのシステムが含まれ、このシステムは、コンピュータメモリを含み得る。このシステムはまた、１つ又は複数のプロセッサを含む。このシステムはまた、プロセッサによって実行されるときに、操作をプロセッサに実行させる命令を記憶するコンピュータメモリを含み、その操作には、複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信すること、その１つ又は複数のデータオブジェクトから、削減次元空間において複数の削減次元配列を生成すること（ここで、各削減次元配列は、野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含み、削減次元空間は、野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する）；複数の削減次元配列を使用して削減次元空間内に複数の候補配列を生成すること；ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信すること；削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成すること；候補配列のそれぞれ及び削減次元ウイルス配列の内の少なくとも１つを力価予測因子に入力として提供すること；候補配列のそれぞれの候補スコアを力価予測子から出力として受信し、候補配列の中から少なくとも１つの候補配列を選択すること；選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成すること；及び生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供すること（ここで、生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含むそれぞれのワクチンを製造するのに好適である）が含まれる。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれは、この方法の動作を実行するように構成されている。
【0177】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得るシステム。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値のグループを含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列、及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し、出力として、候補スコアとして力価スコアを提供し、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義するように構成される。選択された候補配列として少なくとも１つの候補配列を選択することは、最も高い候補スコアを有するｎ個の候補配列を選択することを含み得る。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータがアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0178】
一般的な一態様は、１つ又は複数のプロセッサによって実行されると、１つ又は複数のプロセッサに、下記を含む操作を実行させる命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む：複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信すること、その１つ又は複数のデータオブジェクトから、削減次元空間において複数の削減次元配列を生成すること（ここで、各削減次元配列は、野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含み、削減次元空間は、野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する）；複数の削減次元配列を使用して削減次元空間内に複数の候補配列を生成すること；ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ又は複数のデータオブジェクトを受信すること；削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成すること；候補配列のそれぞれ及び削減次元ウイルス配列のうちの少なくとも１つを力価予測因子に入力として提供すること；候補配列のそれぞれの候補スコアを力価予測子から出力として受信し、候補配列の中から少なくとも１つの王甫配列を選択すること；選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成すること；及び生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供すること（ここで、生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの内の少なくとも１つを含むそれぞれのワクチンを製造するのに好適である）。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置、及び１つ又は複数のコンピュータストレージデバイスに記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、この方法の動作を実行するように構成されている。
【0179】
実装形態には、下記の特徴の内の１つ又は複数が含まれ得る。複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得る媒体。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値のグループを含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列、及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し、出力として、候補スコアとして力価スコアを提供し、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義するように構成される。説明されている手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータがアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。
【0180】
これら及び他の態様、特徴、及び実装形態を、方法、装置、システム、構成要素、プログラム製品、ビジネスを行う方法、機能を実行するための手段又はステップとして、及び他の方法で表すことができ、特許請求の範囲を含む下記の説明から明らかになるであろう。
【0181】
本開示の実装形態は、下記の利点を提供し得る。従来の手法と比較して、ワクチンを将来の病原性シーズンに向けて設計し、将来の病原性シーズンの少なくとも１つの病原性株に対する生物学的反応量の観点から、より多くの防御を付与し得る。従来の手法と比較して、ワクチンを将来の病原性シーズンに向けて設計し、将来の病原性シーズンの複数の病原性株を有効にカバーすることができる範囲の広さ（即ち、将来の病原性シーズンにおいて多くの病原性株に対し有効な免疫学的反応を誘発する）の観点から、より多くの防御を付与し得る。従来の手法とは異なり、まれに観察される株は、頻繁に観察される株と比べて多くの株と交差反応することから、「より多くの防御」を付与し得る。
【0182】
使用方法
本開示は、本明細書で説明されているワクチンを対象に投与する方法を提供する。この方法は、対象にインフルエンザウイルスのワクチン接種をするために使用され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種方法は、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを、必要な対象に、この対象にインフルエンザウイルスのワクチン接種をするのに有効な量で投与することを含む。同様に、本開示は、対象へのインフルエンザウイルスのワクチン接種で使用するための、本明細書で説明されている１種又は複数種のインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種のＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを提供する。同様に本明細書で開示されているのは、対象へのインフルエンザウイルスのワクチン接種で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを含む免疫原性組成物である。
本開示は、本明細書で説明されているワクチンを対象に投与する方法を提供する。この方法は、対象にインフルエンザウイルスのワクチン接種をするために使用され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種方法は、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを、必要な対象に、この対象にインフルエンザウイルスのワクチン接種をするのに有効な量で投与することを含む。同様に、本開示は、対象へのインフルエンザウイルスのワクチン接種で使用するための、本明細書で説明されている１種又は複数種のインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種のＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを提供する。同様に本明細書で開示されているのは、対象へのインフルエンザウイルスのワクチン接種で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを含む免疫原性組成物である。
【0183】
本開示はまた、インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含む方法も提供する。同様に、本開示は、インフルエンザウイルスに対する対象の免疫化で使用するための、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを提供する。同様に本明細書で開示されているのは、インフルエンザウイルスに対する対象の免疫化で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含む免疫原性組成物である。
【0184】
いくつかの実施形態では、本方法又は使用は、対象におけるインフルエンザウイルスによる感染又は疾患を予防する。いくつかの実施形態では、本方法又は使用は、対象における防御免疫反応を引き起こす。いくつかの実施形態では、この防御免疫反応は、抗体反応である。
【0185】
本明細書で提供されている免疫化の方法（又は関連する使用）は、１種又は複数種のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫反応を誘発し得る。従って、様々な実施形態では、本明細書で説明されている組成物は、様々なタイプのインフルエンザウイルスに対して広範な交差防御を提供し得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、トリ、ブタ、季節性、及び／又はパンデミックインフルエンザウイルスに対する交差防御を提供する。いくつかの実施形態では、免疫化の方法（又は関連する使用）は、１種又は複数種の季節性インフルエンザ株（例えば、標準治療株）に対し、改善された免疫反応を誘発し得る。例えば、改善された免疫反応は、改善された体液性免疫反応であり得る。いくつかの実施形態では、免疫化の方法（又は関連する使用）は、１種又は複数種のパンデミックインフルエンザ株に対して、改善された免疫反応を誘発し得る。いくつかの実施形態では、免疫化の方法（又は関連する使用）は、１種又は複数種の豚インフルエンザ株に対して、改善された免疫反応を誘発し得る。いくつかの実施形態では、免疫化の方法（又は関連する使用）は、１種又は複数種のトリインフルエンザ株に対して、改善された免疫反応を誘発し得る。
【0186】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法であって、本明細書で開示されているワクチンの免疫学的有効量をこの対象に投与することを含む方法である。同様に、本開示は、対象における防御免疫反応の増強又は拡大で使用される、本明細書で説明されているワクチンの内のいずれかであり、例えば、複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含むワクチンであり、この複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡと、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡとを含むか、又はからなる。同様に本明細書で開示されているのは、対象における防御免疫反応の増強又は拡大で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で説明されている免疫原性組成物である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、約１０％～約２５％、約２０％～約１００％、約１５％～約７５％、約１５％～約５０％、約２０％～約７５％、約２０％～約５０％、又は約４０％～約８０％、例えば、約４０％～約６０％、又は約６０％～約８０％の範囲の量だけ増加する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されているワクチンは、ワクチン有効性が、標準治療インフルエンザウイルスワクチンのワクチン有効性と比べて少なくとも５％高く、例えば、標準治療インフルエンザウイルスワクチンのワクチン有効性と比べて少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％高い。
【0187】
ある特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチンは、三価又は四価のＩＩＶ等の不活性化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）であり得る。典型的には、標準治療の不活化インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する不活化インフルエンザウイルスを含む。ある特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチンは、組換えインフルエンザウイルスＨＡを含み得、例えば、組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む三価又は四価ワクチン組成物を含み得る。典型的には、標準治療の組換えＨＡワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来するｒＨＡを含む。ワクチン有効性を、ワクチン接種された集団と、ワクチン接種されていない集団、又は異なるワクチンを投与された集団との間の疾患の減少の割合として表し得る。ある特定の実施形態では、ワクチン有効性を、下記式に従って、ワクチン接種されていない集団の罹患率からワクチン接種された集団の罹患率を減算し、ワクチン接種されていない集団の罹患率で除算することにより算出し得る：［（ワクチン接種されていない集団の罹患率）－（ワクチン接種された集団の罹患率）／（ワクチン接種されていない集団の罹患率）×１００］。
【0188】
同様に提供されるのは、対象におけるインフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、この対象におけるインフルエンザウイルス疾患を予防するのに有効な量で本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを、この対象に投与する方法である。同様に、本開示は、対象におけるインフルエンザウイルス疾患の予防で使用する、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルス、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを提供する。同様に本明細書で開示されているのは、対象におけるインフルエンザウイルス疾患の予防で使用されるワクチンを製造するための、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含む免疫原性組成物である。
【0189】
同様に提供されるのは、対象においてインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザＮＡに対する免疫反応を誘発する方法であって、明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンをこの対象に投与することを含む方法である。同様に、本開示は、対象におけるインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡに対する免疫反応の誘発で使用する、明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを提供する。同様に本明細書で提供されるのは、対象におけるインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡに対する免疫反応の誘発で使用されるワクチンを製造するための、明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含む免疫原性組成物である。
【0190】
本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを、インフルエンザ感染の１つ又は複数種の症状の発症前後に投与し得る。即ち、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されているワクチンを、インフルエンザ感染を予防するために、又は潜在的なインフルエンザ感染の症状を改善するために、予防的に投与し得る。いくつかの実施形態では、対象が、季節性インフルエンザウイルス若しくはパンデミックインフルエンザウイルスに感染していることが知られているか若しくは疑われる他の個体又は家畜（例えば、ブタ）と接触するような場合には、及び／又はインフルエンザ感染が知られているか又は流行しているか若しくはエンデミックであると考えられる地域に対象が存在している場合には、対象は、インフルエンザウイルスに感染するリスクがある。いくつかの実施形態では、ワクチンを、インフルエンザ感染に罹患している対象、又はインフルエンザ感染に一般に関連する１つ若しくは複数の症状を示している患者に投与する。いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されていることが分かっているか、又は曝露されていると考えられている。いくつかの実施形態では、対象がインフルエンザウイルスに曝露されていることが分かっているか又は曝露されていると考えられている場合には、対象は、インフルエンザに感染するリスクがあるか、又は感染しやすい。いくつかの実施形態では、対象が、パンデミックインフルエンザウイルスに感染していることが分かっているか若しくは疑われる他の個体若しくは家畜（例えば、ブタ）と接触している場合には、及び／又は対象が、インフルエンザ感染が知られているか又は流行しているか若しくはエンデミックであると考えられる地域に存在するか若しくは存在している場合には、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されていることが分かっているか、又は曝露されていると考えられる。本明細書で開示されているワクチンを使用して、季節性インフルエンザ株又はパンデミックインフルエンザ株により引き起こされるか又はその両方により引き起こされる疾患を処置し得るか、又は予防し得る。
【0191】
本開示によるワクチンを、所望の結果を達成するのに適切な任意の量又は用量で投与し得る。いくつかの実施形態では、所望の結果は、季節性株及びパンデミック株の両方を含む広範囲のインフルエンザ株に対する持続的適応免疫反応の誘発である。いくつかの実施形態では、所望の結果は、インフルエンザ感染の１つ又は複数の症状の強度、重症度、及び／若しくは頻度の低下、並びに／又は発症の遅延である。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重、及び全身状態、処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、及びその投与様式に応じて、対象毎に異なり得る。
【0192】
様々な実施形態では、本明細書で説明されているワクチン又は免疫原性組成物を対象に投与し、この対象は、動物界の任意のメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、鳥類（ａｖｉａｎ）（例えば、ニワトリ又はトリ（ｂｉｒｄ）、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／又は線虫である。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、フェレット、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。
【0193】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されているワクチン又は免疫原性組成物を、ヒト対象に投与する。特定の実施形態では、ヒト対象は、生後６ヶ月以上、生後６ヶ月～３５ヶ月、少なくとも２歳、少なくとも３歳、生後３６ヶ月～８歳、９歳以上、生後少なくとも６ヶ月及び５歳未満、生後少なくとも６ヶ月及び１８歳未満、又は少なくとも３歳及び１８歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、乳児（３６ヶ月未満）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、小児又は青年（１８歳未満）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、生後少なくとも６ヶ月及び５歳未満の小児である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、少なくとも５歳及び６０歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、少なくとも５歳及び６５歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、高齢者（少なくとも６０歳又は少なくとも６５歳）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、非高齢成人（少なくとも１８歳及び６５歳未満、又は少なくとも１８歳及び６０歳未満）である。
【0194】
典型的には、本明細書で説明されているワクチンの方法及び使用は、対象への単回用量（即ち、ブースター用量ではない）の投与を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されているワクチンの方法及び使用は、プライムブーストワクチン接種戦略を含む。プライムブーストワクチン接種は、プライミングワクチンを投与し、その後、ある期間が経過した後に、ブースティングワクチンを対象に投与することを含む。免疫反応は、プライミングワクチンの投与時に「プライミング」され、ブースティングワクチンの投与時に「ブースティング」される。プライミングワクチンは、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを含み得る。同様に、ブースティングワクチンは、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンを含み得る。プライミングワクチンは、ブースティングワクチンと同一であり得るが、同一である必要はない。ブースティングワクチンの投与は、一般に、プライミング組成物の投与から数週間乃至数ヶ月後であり、好ましくは約２～３週間後、又は４週間後、又は８週間後、又は１６週間後、又は２０週間後、又は２４週間後、又は２８週間後、又は３２週間後である。ある特定の実施形態では、プライムブーストワクチン接種のレシピエントは、ナイーブ対象であり、典型的には、ナイーブな乳児又は小児である。
【0195】
ワクチンを、上記のように、例えば非経口送達を含む、任意の好適な投与経路を使用して投与し得る。
【0196】
典型的には、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、本明細書で説明されている１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び任意選択的なアジュバントを、同一ワクチンの構成成分として一緒に投与する。しかしながら、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び／又は任意選択的なアジュバントを、同一ワクチンの一部として投与する必要はない。即ち、所望される場合には、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡ、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡ、及び／又は任意選択的なアジュバントを、別々に対象に投与し得る。例えば、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む第１のワクチンを、１種又は複数種の組換えインフルエンザウイルスＮＡを含む第２のワクチンとは別に対象に投与し得る。第１のワクチン及び第２のワクチンを別々に投与する場合には、第１のワクチン及び第２のワクチンを、異なる部位で対象に投与し得る。
【0197】
本開示の代表的な実施形態
１． 複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、前記複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、
第１の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
を含む、免疫原性組成物。
１． 複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、前記複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、
第１の組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）であり、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであり、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
を含む、免疫原性組成物。
【0198】
２． 前記第１、第２、第３、及び第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、改変組換えインフルエンザウイルスＮＡである、実施形態１に記載の免疫原性組成物。
【0199】
３． 前記改変組換えインフルエンザウイルスＮＡは、４つの改変単量体ＮＡ分子であって、各々は、前記インフルエンザウイルスの前記ＮＡの頭部領域を含むが、前記インフルエンザウイルスの前記ＮＡの細胞質尾部と、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを欠いている、改変単量体ＮＡ分子を含む改変組換え四量体インフルエンザウイルスＮＡを含み、前記改変単量体ＮＡ分子は、宿主細胞中で発現された場合に、改変組換え四量体ＮＡを形成する、実施形態２に記載の免疫原性組成物。
【0200】
４． 各改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種四量体化ドメインを含む、実施形態３に記載の免疫原性組成物。
【0201】
５． 各改変組換え単量体インフルエンザウイルスＮＡは、異種オリゴマー化ドメインを含まない、実施形態３に記載の免疫原性組成物。
【0202】
６． 前記異種四量体化ドメインは、スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラキオン四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質由来の四量体化ドメイン、又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである、実施形態４に記載の免疫原性組成物。
【0203】
７． 前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、培養昆虫細胞中においてバキュロウイルス発現系により産生されている、実施形態１～６のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0204】
８． 前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生されている、実施形態１～７のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0205】
９． 前記免疫原性組成物は、不活性化インフルエンザビリオン又は生弱毒化インフルエンザビリオンを含まない、実施形態１～８のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0206】
１０． 前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれ、及び／又は前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、標準治療インフルエンザ株に由来している、実施形態１～９のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0207】
１１． 前記Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0208】
１２． 前記Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び／又は前記Ｎ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0209】
１３． 前記Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、及び前記Ｎ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0210】
１４． 前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡは、同一のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に由来しており、前記Ｈ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡは、同一のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に由来している、実施形態１３に記載の免疫原性組成物。
【0211】
１５． 前記複数種の組換えインフルエンザウイルスタンパク質は、
第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
からなる、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ３ ＨＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＨＡ；
第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡである、第１の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ２ ＮＡである、第２の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；
第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／ビクトリア系統に由来する、第３の組換えインフルエンザウイルスＮＡ；及び
第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡであって、前記第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡは、Ｂ／山形系統に由来する、第４の組換えインフルエンザウイルスＮＡ
からなる、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0212】
１６． 前記組成物は、アジュバントをさらに含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0213】
１７． 前記アジュバントは、水中スクアレンアジュバント又はリポソームベースのアジュバントを含む、実施形態１６に記載の免疫原性組成物。
【0214】
１８． 前記水中スクアレンアジュバントは、ＡＦ０３を含む、実施形態１７に記載の免疫原性組成物。
【0215】
１９． 前記リポソームベースのアジュバントは、ＳＰＡ１４を含む、実施形態１７に記載の免疫原性組成物。
【0216】
２０． 前記組換えインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量で前記組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記組成物中に存在している、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0217】
２１． 前記組換えインフルエンザウイルスＮＡのそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量で前記組成物中に存在しており、任意選択的に、約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記組成物中に存在している、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0218】
２２． 前記組成物は、筋肉内注射用に製剤化されている、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の免疫原性組成物。
【0219】
２３． 請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、及び医薬担体を含むワクチン。
【0220】
２４． インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、請求項２３に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【0221】
２５． 前記方法により、前記対象におけるインフルエンザウイルス感染が予防される、実施形態２４に記載の方法。
【0222】
２６． 前記方法により、前記対象における防御免疫反応が生じる、実施形態２４又は２５に記載の方法。
【0223】
２７． 前記防御免疫反応は、ＨＡ抗体反応、及び／又はＮＡ抗体反応を含む、実施形態２６に記載の方法。
【0224】
２８． 前記対象は、ヒトである、実施形態２４～２７のいずれか一つに記載の方法。
【0225】
２９． 前記ワクチンを、筋肉内投与するか、皮内投与するか、皮下投与するか、静脈内投与するか、鼻腔内投与するか、吸入により投与するか、又は腹腔内投与する、実施形態２４～２８のいずれか一つに記載の方法。
【0226】
３０． 前記方法により、季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株のいずれか又は両方により引き起こされる疾患が処置されるか、又は予防される、実施形態２４～２９のいずれか一つに記載の方法。
【0227】
３１． 前記対象は、ヒトであり、前記ヒトは、生後６ヶ月以上、１８歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも生後６ヶ月及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳、又は少なくとも６５歳である、実施形態２４～３０のいずれか一つに記載の方法。
【0228】
３２． インフルエンザウイルス感染の１つ又は複数の症状を軽減する方法であって、実施形態２３に記載のワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む方法。
【0229】
３３． 対象における防御免疫反応を増強するか又は拡大する方法であって、実施形態２３に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含み、前記ワクチンにより、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン有効性が、約５％～約１００％の範囲の量だけ増加し、例えば、少なくとも約２０％、又は約４０％～約８０％、例えば、約４０％～約６０％の量のだけ増加する、方法。
【0230】
３４． 前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である、実施形態３３に記載の方法。
【0231】
３５． 標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／ビクトリア系統、及びＢ／山形系統に由来する組換えインフルエンザウイルスＨＡを含む、実施形態３３に記載の方法。
【0232】
３６． ２～６週間の間隔で、任意選択的には４週間の間隔で、前記ワクチンの２回の用量を前記対象に投与することを含む実施形態２４～３５のいずれか一つに記載の方法。
【0233】
本開示は、下記の実施例を参照することによってより深く理解されるであろう。
【実施例】
【0234】
下記の実施例は、例示的なものと見なされるべきであり、上記の開示の範囲を限定するものではない。
【0235】
動物実験は、実験動物の人道的管理と使用（Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に関する公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＰＨＳ）規範、及び実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に準拠して行い、Ｓａｎｏｆｉ動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）から承認された動物プロトコルで実施した。全ての動物を、特定の病原体を含まない条件下で、食物及び水を自由に与えて飼育した。
【0236】
インフルエンザウイルス：酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）で使用する再集合Ｈ６ウイルスは、逆遺伝学によって生成されたものであり、各再集合体は、標的とするＮＡ抗原、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／８１／２００２ Ｈ６Ｎ１由来のＨＡ、及びＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１（「ＰＲ８」）由来の内部遺伝子を発現していた。非コード領域を含むＨＡセグメント及びＮＡセグメントを、カスタム遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ）により生成し、ＰＲ８セグメントを、ウイルス単離体から得た。全てのセグメントを、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）Ｉプロモーター及びＰｏｌ ＩＩプロモーターの組込みにより、ｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）由来の双方向転写プラスミドにクローニングした。簡単に説明すると、２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ＣＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各インフルエンザウイルスセグメントを表す合計８種のプラスミドをトランスフェクトした。２４時間後、このトランスフェクトした細胞に、ＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＭＤＣＫ－ＡＴＬ細胞（ＡＴＣＣ）を添加して、インフルエンザウイルスの増殖を可能にした。インフルエンザウイルスを含む細胞培養上清を、ＭＤＣＫ添加後７日目に採取し、８～１０日齢の胚化鶏卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で継代させた。接種した卵を、４８時間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで１２時間にわたり４℃まで冷却し、採取し、低速遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２０分）で清澄化した。ウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞によるプラークアッセイで決定した。
【0237】
ＨＡＩ試験に含まれるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７（ビクトリア系統）、Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６（ビクトリア系統）、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（山形系統）の卵増殖ストックは、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ，ＰＡ）から提供された。フェレットの研究で使用される野生型インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）は、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から提供された。全てのウイルスを、使用するまで－６５℃未満で保存した。
【0238】
ワクチン抗原：組換え可溶性インフルエンザＮＡを発現させるために、構築物を設計した。四量体ＮＡ構築物及び単量体ＮＡ構築物の両方のデザインは、Ｎ末端ＣＤ５分泌シグナルペプチド、任意選択的な６ＨＩＳタグ（精製用）、及び球状ノイラミニダーゼ頭部ドメインを含む。四量体デザイン（ｒＴＥＴ－ＮＡ）はまた、多量体化のために、ＨＩＳタグと球状頭部と間にテトラブラキオンドメインも含む。定義されたアミノ酸配列を使用して、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＣＲ産物からコドン最適化合成遺伝子を構築し、この断片を、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に挿入した。このプラスミドＤＮＡを、形質転換細菌から精製し、トランスフェクションに適切な濃度になるように調整した。タンパク質発現を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞中で実施した。清澄化工程を実施して、分泌されたタンパク質を細胞から分離した。ＮＡタンパク質を、アフィニティー（ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑ ＨＰ－ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）、１０ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）への透析、及び０．２μｍ滅菌ろ過により、宿主細胞タンパク質から精製した。ＮＡワクチン調製物を、現行の優良研究慣行（ｇｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ｃＧＲＰ）に準拠して製造した。
【0239】
ＮＡＩ反応の酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）評価：ＮＡＩ抗体反応を、Ｃｏｕｚｅｎｓ，Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ，Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ２０１４，２１０：７－１４で既に説明されているＥＬＬＡにより、目的の株に由来するＮＡを含むＨ６再集合ウイルスに対して測定した。簡潔に説明すると、目的の株に由来するＮＡを含むＨ６再集合ウイルスを、フェチュインでコーティングされた９６ウェルプレート中で滴定し、最大ＮＡ酵素活性の７０％を提供する標準ウイルス量を決定した。血清中に存在するＮＡＩ抗体の滴定を、熱不活化した血清の２倍連続希釈を実施することにより行なった。次いで、希釈した血清合計５０μＬを、フェチュインでコーティングされたプレート中において、最大ＮＡ酵素活性の７０％に対応する希釈ウイルス５０μＬに添加した。血清－ウイルス混合物を、一晩３７℃でインキュベートした。このプレートを４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）と共にインキュベートし、再度洗浄した後に、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を添加して現像した。ウイルス対照に対するシグナルが低いか又は全くない場合には、ＮＡ特異的抗体の存在に起因するＮＡ活性の阻害が示されている。ＮＡＩ力価を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形４パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線で近似し、５０％最大阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。
【0240】
ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ：ＨＡＩアッセイの前に、血清を受容体破壊酵素（ＲＤＥ；Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ，Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）で処理して、非特異的阻害剤を不活性化した。ＲＤＥ処理した血清を、ｖ底マイクロタイタープレート中で連続的に希釈した（２倍希釈）。ＨＡＩリードアウトパネルからの各ウイルスの等量を、各ウェルに添加した（１ウェル当たり４赤血球凝集単位（ＨＡＵ））。本実施例では、別途示さない限り、同種ウイルスパネルには、卵中で増殖させたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７、又はＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６（ビクトリア系統）、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（山形系統）ウイルスが含まれていた。このプレートを覆い、２０分（又は４５～６０分間）にわたり室温でインキュベートし、続いて、ＰＢＳ中の、ニワトリ赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）；ＣＲＢＣ）の１％混合物、又はシチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の０．５％混合物を添加した。このプレートを、撹拌により混合し、覆い、ＲＢＣを、室温で約３０分～１時間にわたり静置した。ＨＡＩ力価を、非凝集ＲＢＣを含む最後のウェルの希釈率の逆数により決定した。
【0241】
抗体法医学アッセイ：抗体法医学法（ＡＦ）を使用して、蛍光色素を用いた磁気ビーズアレイ（ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を使用して、フェレット血清中の株特異的ｒＨＡ抗体を測定した。株特異的ｒＨＡへの抗体結合の強度を、生の蛍光強度シグナルに血清希釈率を乗算して算出した正規化平均蛍光強度単位（ｎＭＦＩ）で示した。磁気ビーズに結合したｒＨＡを、Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによるインフルエンザワクチンの組成に関する年次報告書及び中間報告書で公開された抗原性データに基づいて選択した。２０１８～２０１９年北半球推奨株に加えて、ｒＨ３パネルには、２０１３年から２０１６年シーズンまでの株が含まれており、Ｈ１パネルには、２００９年から２０１６年シーズンまでの株が包含されていた。個々のフェレット血清を分析し、その結果得られた４０種のＨ３株及び１８のＨ１株の抗体法医学データを評価した。
【0242】
ＨＩＮＴ ｍＮＴインフルエンザプロトコル：インフルエンザ株に対する中和価を、出典Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１１－２０１８，Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，２６７６（２０１９）の通りに測定した。簡潔に記載すると、ＲＤＥ処理された血清の１：２０～１：２，５６０の連続２倍希釈物を、等量のウイルス、約１０００病巣形成単位（ＦＦＵ）と混合し、３７℃で６０分にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞懸濁液を、ウイルス：血清混合物に添加し、約２２時間にわたりインキュベートした。単層を、メタノールで固定し、染色の準備をした。次いで、ウェルを、核タンパク質（ＮＰ）に対する抗インフルエンザモノクローナル抗体と共にインキュベートし、続いてＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＴＬ ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｖ２でプレートを走査した。プレートからのカウントを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送し、シグモイド曲線から５０％の病巣減少を達成する中和価を算出した。このアッセイは、トリプシンを含まず、血清を含まないウイルス投入対照ウェルと比較してウイルス侵入の阻害を測定する。カウントは、個々の感染細胞であり、このアッセイは、Ｈ１、Ｈ３、ＢＶｉｃ、及びＢＹａｍを含む全ての生ウイルスサブタイプに好適である。
【0243】
本明細書で開示されている抗体法医学アッセイでは、下記のｒＨＡを使用した：Ｈ３ ＡＦパネル：Ａ／ＵＲＵＧＵＡＹ／７１６／２００７、Ａ／ＶＩＣＴＯＲＩＡ／３６１／２０１１、Ａ／ＨＯＮＧＫＯＮＧ／４８０１／２０１４、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６、Ａ／ＢＲＩＳＢＡＮＥ／１０５９／２０１７、Ａ／ＥＴＨＩＯＰＩＡ／１８７７／２０１７、Ａ／ＫＥＮＹＡ／１０５／２０１７、Ａ／ＭＩＳＳＯＵＲＩ／３７／２０１７、Ａ／ＭＩＹＡＺＡＫＩ／８９／２０１７、Ａ／ＯＳＯＲＮＯ／６０５８０／２０１７、Ａ／ＳＡＰＰＯＲＯ／４６／２０１７、Ａ／ＳＨＡＮＧＨＡＩＸＵＨＵＩ／１３７３／２０１７、Ａ／ＳＹＤＮＥＹ／１０９３／２０１７、Ａ／ＳＹＤＮＥＹ／１０１３／２０１７、Ａ／ＡＫＳＡＲＡＹ／４０４８／２０１６、Ａ／ＡＬＢＡＮＩＡ／７１６５／２０１６、Ａ／ＡＮＫＡＲＡ／４１１０／２０１６、Ａ／ＢＲＥＴＡＧＮＥ／２８３６／２０１６、Ａ／ＢＲＩＳＢＡＮＥ／１００９／２０１６、Ａ／ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ／１６８／２０１６、Ａ／ＣＨＩＢＡ／３３／２０１６、Ａ／ＣＨＲＩＳＴＣＨＵＲＣＨ／５１３／２０１６、Ａ／ＧＵＡＮＧＸＩＱＩＸＩＮ／３２８／２０１６、Ａ／ＨＡＷＡＩＩ／６７／２０１６、Ａ／ＪＯＲＤＡＮ／Ｊ１６４２０３０１ＮＴ／２０１６、Ａ／ＫＡＷＡＳＡＫＩ／１４２／２０１６、Ａ／ＫＨＭＥＬＮＩＴＳＫＹ／７１９／２０１６、Ａ／ＬＡＯＳ／Ｆ２８８４／２０１６、Ａ／ＬＩＮＫＯＵ／００５１／２０１６、Ａ／ＬＩＳＢＯＡ／ＮＩＥＶＡ０６３／２０１６、Ａ／ＭＡＲＴＩＮＩＱＵＥ／５３１／２０１６、Ａ／ＭＡＲＹＬＡＮＤ／２４／２０１６、Ａ／ＭＥＫＮＥＳ／１６８／２０１６、Ａ／ＭＩＣＨＩＧＡＮ／８４／２０１６、Ａ／ＰＯＲＴＵＧＡＬ／ＭＳ６８／２０１６、Ａ／ＳＡＵＤＩＡＲＡＢＩＡ／１９２１５０／２０１６、Ａ／ＳＨＡＮＤＯＮＧＬＡＩＣＨＥＮＧ／１７６３／２０１６、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＧＰ２３６６／２０１６、Ａ／ＴＡＳＭＡＮＩＡ／９７／２０１６、Ａ／ＴＯＷＮＳＶＩＬＬＥ／５１／２０１６。
【0244】
Ｈ１ ＡＦパネル：Ａ／ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ／０７／２００９、Ａ／ＢＡＹＥＲＮ／６９／２００９、Ａ／ＨＯＮＧＫＯＮＧ／３４０７９／２００９、Ａ／ＨＯＮＧＫＯＮＧ／３３５９７／２００９、Ａ／ＬＶＩＶ／Ｎ６／２００９、Ａ／ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ／２０５１／２００９、Ａ／ＣＨＲＩＳＴＣＨＵＲＣＨ／１６／２０１０、Ａ／ＡＮＫＡＲＡ／ＴＲ４０／２０１１、Ａ／ＡＳＴＲＡＫＨＡＮ／１／２０１１、Ａ／ＨＯＮＧＫＯＮＧ／３９３４／２０１１、Ａ／ＧＯＴＥＢＯＲＧ／１／２０１１、Ａ／ＭＥＸＩＣＯ／２２０８／２０１１、Ａ／ＨＯＮＧ／ＫＯＮＧ／５６５９／２０１２、Ａ／ＳＴＯＣＫＨＯＬＭ／２５／２０１２、Ａ／ＩＳＲＡＥＬ／Ｑ５０４／２０１５、Ａ／ＭＩＣＨＩＧＡＮ／４５／２０１５、Ａ／ＨＵＮＧＡＲＹ／１２／２０１６、Ａ／ＢＲＡＴＩＳＬＡＶＡ／３４２／２０１６。
【0245】
下記の実施例では、組換えＨＡタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。簡潔に説明すると、精製されたＨＡタンパク質を、Ｓｆ９細胞に由来しており且つ無血清培地で増殖させた連続昆虫細胞株（ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋（登録商標））で産生させた。ＩＩＶを、胚化鶏卵で増殖させたインフルエンザウイルスから調製し、ホルムアルデヒドで不活化し、濃縮し、スクロース勾配でのゾーン遠心分離で精製し、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で分割し、さらに精製し、次いでリン酸緩衝等張塩化ナトリウム溶液に懸濁させた。調製物を、０．２μｍシリンジフィルタを使用して無菌ろ過した。生きているインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ（ＬＶＮＡ）を、胚化鶏卵中で増殖させたインフルエンザウイルスから単離した。ウイルスを、スクロース勾配超遠心分離で精製し、ＮＡを洗剤可溶化により抽出し、カラムクロマトグラフィーでさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液に懸濁させた。調製物を、０．２μｍシリンジフィルタを使用して無菌ろ過した。
【0246】
実施例１－ｒＴＥＴ－ＮＡの発現、精製、及びキャラクタリゼーション
現在流行している季節性インフルエンザウイルス中に存在する４つのサブタイプ全て（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５ Ｎ１；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｎ２；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７ビクトリア系統；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３山形系統）のＮＡに由来するｒＴＥＴ－ＮＡ構築物を、ＣＨＯ－Ｓ細胞中で発現させ、さらなるキャラクタリゼーションのために、ほぼ均質になるまで精製した。ｒＴＥＴ－ＮＡ構築物（例えば、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｎ２由来）の概略図及び部分的アミノ酸配列を、図１に示す。別途示さない限り、ＮＡ頭部領域が得られたインフルエンザウイルス株とは無関係に、下記の実施例で開示されている全てのｒＴＥＴ－ＮＡ構築物には、異種テトラブラキオン四量体化配列が存在している。しかしながら、当該技術分で既知であるように、テトラブラキオン四量体化配列の代わりに、任意の好適な異種四量体化ドメインを使用し得る。ｒＴＥＴ－ＮＡ構築物では、野生型インフルエンザノイラミニダーゼの細胞質ドメインと、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを、「分泌シグナル」ペプチド、異種テトラブラキオン四量体化ドメイン、及び任意選択的なヒスチジンタグに置き換えられており、これらは、ｒＴＥＴ－ＮＡの精製を容易にするために使用され得る。
現在流行している季節性インフルエンザウイルス中に存在する４つのサブタイプ全て（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５ Ｎ１；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｎ２；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７ビクトリア系統；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３山形系統）のＮＡに由来するｒＴＥＴ－ＮＡ構築物を、ＣＨＯ－Ｓ細胞中で発現させ、さらなるキャラクタリゼーションのために、ほぼ均質になるまで精製した。ｒＴＥＴ－ＮＡ構築物（例えば、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｎ２由来）の概略図及び部分的アミノ酸配列を、図１に示す。別途示さない限り、ＮＡ頭部領域が得られたインフルエンザウイルス株とは無関係に、下記の実施例で開示されている全てのｒＴＥＴ－ＮＡ構築物には、異種テトラブラキオン四量体化配列が存在している。しかしながら、当該技術分で既知であるように、テトラブラキオン四量体化配列の代わりに、任意の好適な異種四量体化ドメインを使用し得る。ｒＴＥＴ－ＮＡ構築物では、野生型インフルエンザノイラミニダーゼの細胞質ドメインと、膜貫通領域と、柄領域の全て又は実質的に全てとを、「分泌シグナル」ペプチド、異種テトラブラキオン四量体化ドメイン、及び任意選択的なヒスチジンタグに置き換えられており、これらは、ｒＴＥＴ－ＮＡの精製を容易にするために使用され得る。
【0247】
多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により、ｒＴＥＴ－ＮＡの効率的な四量体化が実証されており、全てのｒＴＥＴ－ＮＡは、四量体として形成されており、分子量（約２６０ｋＤａ）は、対照（エクトドメイン）単量体（約７４ｋＤａ）の約４倍であることが確認された（データは示さない）。サイズ排除クロマトグラフィーでは、ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ４０００ ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、移動相は、０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）であった。全ての検出器を、カラムの下流で一列に接続した。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ソフトウェアを使用して、クロマトグラム上のＵＶピーク面積を積分した。サンプルの純度を、特定のピーク面積／全ピーク面積の割合に基づいて算出した。ピーク中のタンパク質の分子量（ＭＷ）を、濃度検出器（ＲＩ又はＵＶ）による光散乱シグナルを使用して、ＡＳＴＲＡ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）ソフトウェアで決定した。
【0248】
ｒＴＥＴ－ＮＡ酵素活性を、２’－（４－メチルウンベリフェリル）－α－ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）アッセイで実証した。緩衝液（３３．３ｍＭ ２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸［ＭＥＳ，ｐＨ６．５］、４ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＢＳＡ）を使用して、９６ウェルプレート中において、２倍連続ｒＴＥＴ－ＮＡ希釈液を調製し、ＭＵＮＡＮＡ基質（１００μＭ）と混合し、振盪しつつ３７℃で１時間にわたりインキュベートした。この反応を、アルカリ性溶液（０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３）の添加により停止させた。ｒＴＥＴ－ＮＡとＭＵＮＡＮＡ基質との混合物からの蛍光強度（ＲＦＵ、相対蛍光単位）を、励起波長３５５ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍそれぞれを使用して測定した。標準曲線は、様々な濃度にて酵素緩衝液で希釈した４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）を使用して作成し；ｒＴＥＴ－ＮＡ酵素活性を、４ＭＵ基準に対して決定し、結果を、全ＮＡ活性に関してはμＭ／６０分で表し、特異的ＮＡ活性に関してはｎｍｏｌｅ／分／μｇで表した。
【0249】
加えて、ｒＴＥＴは、オセルタミビル－リン酸塩に結合することが示された。対照的に、酵素的に不活性な単量体Ｎ２エクトドメインバリアントは、オセルタミビル－リン酸塩に結合しなかった。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析をまた、様々なインフルエンザサブタイプ及び３４種の異なるＮ２株に由来するｒＴＥＴ－ＮＡに対しても実施し、ｒＴＥＴ－ＮＡの４量体化、及びオセルタミビル－リン酸塩への結合が、全ての場合で実証された。オセルタミビル結合アッセイを、下記の条件を使用して実施した：オセルタミビル－リン酸塩－ビオチンコンジュゲート（１ｘＫＢ緩衝液（ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ）中に５～１０μｇ／ｍｌ）を、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサの表面上で捕捉し；このバイオセンサを、組換えＮＡのサンプルの連続２倍希釈液（１ｘＫＢ中に０．１６～１０μｇ／ｍｌ）が入っているウェルに浸し；Ｏｃｔｅｔ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）の生体層干渉法（ＢＬＩ）技術を使用して、オセルタミビル－リン酸塩への組換えＮＡの結合動態を測定する。
【0250】
実施例２－マウスにおけるｒＴＥＴ－ＮＡ免疫原性の評価
マウスモデルを使用して、ｒＴＥＴ－ＮＡの免疫原性を評価した。６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹）に、ＡＦ０３（水中スクアレン）アジュバントと共に又はなしで（投与量は全て５０μＬであった）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６由来のＮ２ ｒＴＥＴ－ＮＡ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５由来のＮ１ ｒＴＥＴ－ＮＡ、一価不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）０．２μｇ若しくは１μｇ、又は生ウイルス由来ＮＡ（ＬＶＮＡ）０．２μｇのいずれかで２回ワクチン接種した。図２Ａに示すように、初回用量を、０日目に筋肉内投与し、ブースター用量を、２１日目に筋肉内投与した。最終用量の２週間後（３５日目）に、血清中におけるＮＡＩ抗体価を測定した。２匹の動物からの血清プールを生成し（必要な時まで－２０℃で保存した）、１群当たり合計４つのサンプルを得た。血清を、ＥＬＬＡで試験してＮＡＩ活性を評価したか、又はＥＬＩＳＡによりＮＡ結合抗体を得た。
マウスモデルを使用して、ｒＴＥＴ－ＮＡの免疫原性を評価した。６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹）に、ＡＦ０３（水中スクアレン）アジュバントと共に又はなしで（投与量は全て５０μＬであった）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６由来のＮ２ ｒＴＥＴ－ＮＡ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５由来のＮ１ ｒＴＥＴ－ＮＡ、一価不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）０．２μｇ若しくは１μｇ、又は生ウイルス由来ＮＡ（ＬＶＮＡ）０．２μｇのいずれかで２回ワクチン接種した。図２Ａに示すように、初回用量を、０日目に筋肉内投与し、ブースター用量を、２１日目に筋肉内投与した。最終用量の２週間後（３５日目）に、血清中におけるＮＡＩ抗体価を測定した。２匹の動物からの血清プールを生成し（必要な時まで－２０℃で保存した）、１群当たり合計４つのサンプルを得た。血清を、ＥＬＬＡで試験してＮＡＩ活性を評価したか、又はＥＬＩＳＡによりＮＡ結合抗体を得た。
【0251】
ｒＴＥＴ－ＮＡが、他のＮＡ含有ウイルス調製物に匹敵する免疫原性を有しており、この免疫原性は、ＡＦ０３アジュバントで顕著に増強されることが実証された。図２Ｂ及び２Ｃを参照されたい。図２Ｃに示すように、ｒＴＥＴ－ＮＡの免疫原性は、マウスで同様に試験したＮ１サブタイプ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ４５／２０１５株に関するＩＩＶと比べて高かった。理論に束縛されることを望まないが、このサブタイプ特異的な差違は、後者の分割不活化プロセスに起因している可能性があり、その結果、Ｎ２と比較して酵素活性が低下し、且つ免疫原性が喪失する。
【0252】
実施例３－フェレットにおけるｒＴＥＴ－ＮＡ免疫原性の評価
インフルエンザナイーブで免疫前のフェレットにおいて、ｒＴＥＴ－ＮＡの免疫原性を評価した。フェレットは、肺の生理機能及びインフルエンザに対する感受性がヒトと共有していることに基づいて、インフルエンザの研究で広く使用されている。
インフルエンザナイーブで免疫前のフェレットにおいて、ｒＴＥＴ－ＮＡの免疫原性を評価した。フェレットは、肺の生理機能及びインフルエンザに対する感受性がヒトと共有していることに基づいて、インフルエンザの研究で広く使用されている。
【0253】
１７～２１週齢のナイーブな非近交系の雄及び雌のＦｉｔｃｈフェレット（１群当たり６匹）に、５μｇ＋ＡＦ０３、４５μｇ＋ＡＦ０３、若しくはＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６由来のＮ２ ｒＴＥＴ－ＮＡ ４５μｇ（図３Ｃ）、又は５μｇ＋ＡＦ０３、４５μｇ＋ＡＦ０３、若しくはＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５由来のＮ１ ｒＴＥＴ－ＮＡ ４５μｇ（図３Ｆ）（５００μＬ／用量）のいずれかで、２１日間隔にて２回、筋肉内ワクチン接種した（試験概要を、図３Ａに示す）。図３Ｂに示すように、免疫前フェレットモデルにおいて、フェレットを、０日でにおいてインフルエンザウイルス（１，０００μＬ／用量、鼻孔に均等に分割）の経鼻投与により、最初に予備刺激した。予備免疫化後３週間（２１日目）で、フェレットに、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６由来のＮ２ ｒＴＥＴ－ＮＡ（１．８μｇ、９μｇ、若しくは４５μｇ）、ＩＩＶ（１．８μｇ若しくは９μｇ）、又はワクチン希釈液（偽）でワクチン接種したか（図３Ｄ）、又はＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５由来のＮ１ ｒＴＥＴ－ＮＡ（０．３６μｇ、１．８μｇ、９μｇ、若しくは４５μｇ）、ＩＩＶ（１．８μｇ若しくは９μｇ）、又はワクチン希釈液（偽）でワクチン接種した（図３Ｇ）。予備刺激及びブーストの３週間後に、血清中のＮＡＩ抗体値を測定した。
【0254】
ベースライン時、ブースターの１日前又は直前、及びブースターの３週間後に、鎮静下で、全てのフェレットから採血した。血清サンプル（必要な時まで－２０℃で保存した）をＥＬＬＡで試験して、ＮＡＩ活性を評価した。
【0255】
ｒＴＥＴ－ＮＡは、ナイーブフェレットにおいて、且つ免疫前フェレットにおいてブースターワクチンとして、高い免疫原性を示すことが実証された（図３Ｃ～３Ｈ）。ｒＴＥＴ－ＮＡは、単回用量後にナイーブフェレットにおいて高い免疫原性を示しており、２回目の用量でさらにブーストされ得た（図３Ｃ及び３Ｆ）。マウスモデルと同様に、ＮＡＩ力価は、アジュバントなし製剤と比較してＡＦ０３で増強された。アジュバントの添加により、用量が節約される（例えば、５μｇ＋ＡＦ０３は、アジュバントなしの４５μｇと比べて免疫原性が高い）。アジュバントなしのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６ Ｎ２ ｒＴＥＴ－ＮＡ又はＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５ Ｎ１ ｒＴＥＴ－ＮＡの単回用量による免疫前フェレットのワクチン接種により、一致させたＩＩＶ用量と比べて同等の又は優れたＮＡＩ反応のブーストが得られた（図３Ｄ及び３Ｇ）。
【0256】
ナイーブマウスと同様に、ｒＴＥＴ－Ｎ１は、試験した両方の用量でのナイーブフェレットモデルにおいてＩＩＶと比べて高い免疫原性を示しており、Ｎ１サブタイプに対するｒＮＡプラットフォームの利点が拡大したことが実証された（図３Ｇ）。免疫前フェレットモデルでは、感染後のＮＡＩ反応のブースト（ＮＡＩブースト／予備刺激比）もまた、評価した２つの最高用量（９μｇ及び４５μｇ）ではＮ２と比べてＮ１で大きかったが、評価した低用量（１．８μｇ）ではそうではなかった。図３Ｅ及び図３Ｈを参照されたい。
【0257】
実施例４－フェレットでのインフルエンザウイルスチャレンジ研究
インフルエンザウイルスチャレンジ研究のために、１７～２１週齢のナイーブの非近交系の雄のＦｉｔｃｈフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）（１群当たり１６匹）に、最初に、ＡＦ０３アジュバントと共に又はＡＦ０３アジュバントなしでのＡ／Ｐｅｒｔｈ／０９ Ｎ２ ＴＥＴ－ＮＡ（５００μＬ／用量、筋肉内）の同一の用量（０．２μｇ、３μｇ、又は４５μｇ）で、２１日間隔で２回ワクチン接種した。ブースターワクチン接種の３週間後、フェレットに、１０７ＰＦＵのＡ／Ｐｅｒｔｈ／０９ Ｈ３Ｎ２野生型インフルエンザＡチャレンジウイルス（１，０００μＬ／用量、鼻孔に均等に分割）を経鼻投与した。ウイルスの投与後１４日にわたり、この動物を、臨床症状及び体重の変化に関して１日１回モニタリングし、体温に関して１日２回モニタリングした。
インフルエンザウイルスチャレンジ研究のために、１７～２１週齢のナイーブの非近交系の雄のＦｉｔｃｈフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）（１群当たり１６匹）に、最初に、ＡＦ０３アジュバントと共に又はＡＦ０３アジュバントなしでのＡ／Ｐｅｒｔｈ／０９ Ｎ２ ＴＥＴ－ＮＡ（５００μＬ／用量、筋肉内）の同一の用量（０．２μｇ、３μｇ、又は４５μｇ）で、２１日間隔で２回ワクチン接種した。ブースターワクチン接種の３週間後、フェレットに、１０７ＰＦＵのＡ／Ｐｅｒｔｈ／０９ Ｈ３Ｎ２野生型インフルエンザＡチャレンジウイルス（１，０００μＬ／用量、鼻孔に均等に分割）を経鼻投与した。ウイルスの投与後１４日にわたり、この動物を、臨床症状及び体重の変化に関して１日１回モニタリングし、体温に関して１日２回モニタリングした。
【0258】
チャレンジ後１、３、５、及び７日目に、チャレンジした全ての動物から鼻洗浄液を回収し、サンプルを、ウイルス評価のために－６５℃以下で保存した。フェレットを、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、及びゲンタマイシン（５０μｇ）を含む滅菌ＰＢＳ ０．５ｍＬを各鼻孔に注射し、回収して－６５℃以下で保存した。鼻洗浄検体中のウイルスを、標準的な５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより滴定した。鼻洗浄液を解凍し、次いで遠心分離により清澄化した。得られた上清を、１０倍連続希釈し、次いで、滴定のためにＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌｓ（ＭＤＣＫ）細胞の単層を含む９６ウェルプレートの各ウェルに移した。
【0259】
ウイルス投与後１、３、６、及び１４日目に、ウイルス力価用に、肺の切片（左右の頭蓋葉、及び左右の尾肺葉）並びに鼻甲介を採取した。組織切片を秤量し、次いでエタノール／ドライアイス又は液体窒素中で急速に冷凍し、処理、及び上述した標準的なＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルス滴定のために、－６５℃以下で保存した。各群から選択されたフェレット（１～２匹）を、チャレンジ後１、３、６、及び１４日目に、安楽死させて剖検した。ウイルス力価及び病理組織学的分析のために、剖検されたフェレットから、肺及び鼻甲介を採取した。肺及び鼻甲介を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。病理組織学に予定された剖検は、認定された獣医病理学者が監督した。固定された肺葉及びＮＴ切片を、パラフィンに包埋させ、通常の組織学的方法で処理し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、無作為化し、認定された獣医病理学者により病理の存在及び重症度を等級付けした。
【0260】
上記でＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６に関して示したように、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ Ｎ２に基づくｒＴＥＴ－ＮＡは、ＡＦ０３によりブーストされる用量依存的なＮＡＩ力価を誘発した。ＡＦ０３で評価した最高のｒＴＥＴ－ＮＡ用量（４５μｇ）は、チャレンジ時のみでの感染と比べて優れた力価を誘発した（図４）。
【0261】
図５に示すように、ｒＴＥＴ－ＮＡワクチン接種により、体重減少、及び発熱、及び全体的なウイルス排出等の臨床症状の強度及び持続期間を減少させることにより、フェレットにおける相同Ｈ３Ｎ２チャレンジ後の疾患重症化が予防された。ＮＡ媒介防御は、ＡＦ０３による高ｒＴＥＴ－ＮＡ用量でのみ、感染前と同程度の用量及びアジュバントに依存的な全体的な体重減少及びピーク体温上昇の減少を特徴としていた。総ウイルス排出へのわずかな効果のみが観察され、用量依存的なパターンには従わないようであった（図５）。
【0262】
個々のフェレットのデータ解析から、偽ＡＦ０３群での症状の発現には、症状の強度だけでなくタイミングの点でもばらつきが示された。全体的なピーク症状は、チャレンジ後２日目に観察されたが、一部の動物は、チャレンジ後２週間目に遅発性症状を発症したか、又は症状の２番目のピークを生じたため、長期的な分析が困難であった。
【0263】
ｒＴＥＴ－ＮＡは、ウイルス排出に対して以前の感染ほど効率的ではないように見えたが、感染により、保存されたエピトープに対するＴ細胞免疫に加えて抗ＮＡ免疫及び抗ＨＡ免疫の両方がもたらされることから、この結果は予想されたものである。
【0264】
図６Ａ～Ｃに示すように、ワクチン接種後のＮＡＩ力価は、疾患重症度と逆相関しており、防御の相関として使用される予測力を有していた。重症の疾患を示す動物（ｎ＝２１）は、４２日目の平均Ｌｏｇ２ ＮＡＩ力価が５．２±２．８０であったが、非重症の疾患を示す動物（ｎ＝５５）は、４２日目の平均Ｌｏｇ３ ＮＡＩ力価が７．７±３．００であった（ｐ値＝０．００１４）（図６Ａ）。
【0265】
抗ＮＡ抗体反応と疾患重症度との関連を、ピーク症状及び全体的なウイルス排出に基づく疾患スコアリングシステムを開発することにより調べた。フェレットを、その合計重症度スコアに基づいて重症及び非重症に分類し、この二元疾患分類に従うＮＡＩ力価の分布を分析した。症状が重症のフェレットは、非重症と分類されたフェレットと比べて有意に低いＮＡＩ力価を示したが、一部の非反応フェレットも保護された（図６Ｃ）。防御バイオマーカーとしてＮＡＩをさらに評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を開発した。ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、偶然と比べて有意に高く（０．７３対０．５０、ｐ値＝０．０００２）、このことから、ＮＡＩ力価を使用してフェレットの疾患重症度を正確に予測し得ることが確認された（図６Ｂ）。ＲＯＣ分析を使用して、防御に必要なＮＡＩ力価閾値も決定した。
【0266】
実施例５－マウスにおける多価ＨＡ及びＮＡの免疫原性の評価
マウスに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブースターワクチンを注射した。１、２０、２２、及び３５日目に採血した。ＡＦ０３アジュバントを使用する場合には、抗原と１：１の比で混合した。下記の表１に示すように、Ｎ１、Ｎ２、Ｂ／ビクトリア系統由来のＮＡ、及びＢ／山形系統由来のＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡを含む四価ワクチン組成物を使用し（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／ビクトリア系統由来のＨＡ、及びＢ／山形系統由来のＨＡのそれぞれを有するｒＨＡを含む四価ワクチン組成物を使用した（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）。各群に関して、ｎ＝６のマウス。下記のインフルエンザウイルス株に関して、３５日目のＨＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３．結果を、下記の表１で報告する。
マウスに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブースターワクチンを注射した。１、２０、２２、及び３５日目に採血した。ＡＦ０３アジュバントを使用する場合には、抗原と１：１の比で混合した。下記の表１に示すように、Ｎ１、Ｎ２、Ｂ／ビクトリア系統由来のＮＡ、及びＢ／山形系統由来のＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡを含む四価ワクチン組成物を使用し（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／ビクトリア系統由来のＨＡ、及びＢ／山形系統由来のＨＡのそれぞれを有するｒＨＡを含む四価ワクチン組成物を使用した（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）。各群に関して、ｎ＝６のマウス。下記のインフルエンザウイルス株に関して、３５日目のＨＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３．結果を、下記の表１で報告する。
【0267】
【表1】
【0268】
同様に、下記の４種の株のインフルエンザウイルスにより、マウスにおいてＮＡＩ力価を同様に評価した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３。結果を、下記の表２に示す。
【0269】
【表2】
【0270】
表１及び２に示すように、４種のｒＴＥＴ－ＮＡ及び４種のｒＨＡを含む八価ワクチンによるワクチン接種では、４種の株の内の３種で四価ｒＨＡのＨＡＩの４倍以内であり且つＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６では４倍を超えるＨＡＩが示された。この八価ワクチンは、例えばＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６に対して１μｇ／株の投与量で、四価ｒＨＡ単独でのワクチン接種と比較してＨＡＩの改善を示した（１４０対２３．３）。同様に、４種のｒＴＥＴ－ＮＡ及び４種のｒＨＡを含む八価ワクチンによるワクチン接種では、４種の株の内の３種で四価ｒＨＡのＮＡＩの４倍以内であるＮＡＩが示されたが、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５でのＮＡＩは低下しており、この減少は４倍未満であった。
【0271】
実施例６－フェレットにおける多価ＨＡ及びＮＡの免疫原性の評価 パート１
図７Ａに示すように、多価ワクチンの免疫原性を評価するために使用するナイーブフェレットに、アジュバントと共に又はアジュバントなしでの４種のｒＴＥＴ－ＮＡ抗原及び／又は４種の組換えＨＡ抗原の混合物を含む八価ワクチン組成物で、２１日間隔で２回ワクチン接種した。この実験ではまた、一価ｒＴＥＴ－ＮＡ（即ち、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ－１６－００１９／２０１６のみに由来するｒＴＥＴ－ＮＡ）も評価した。完全な研究デザインを、表３に示す。
図７Ａに示すように、多価ワクチンの免疫原性を評価するために使用するナイーブフェレットに、アジュバントと共に又はアジュバントなしでの４種のｒＴＥＴ－ＮＡ抗原及び／又は４種の組換えＨＡ抗原の混合物を含む八価ワクチン組成物で、２１日間隔で２回ワクチン接種した。この実験ではまた、一価ｒＴＥＴ－ＮＡ（即ち、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ－１６－００１９／２０１６のみに由来するｒＴＥＴ－ＮＡ）も評価した。完全な研究デザインを、表３に示す。
【0272】
【表3】
【0273】
各ｒＴＥＴ－ＮＡ抗原は、四価の２０１８－１９季節性インフルエンザワクチンに含まれる標準治療株（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｎ２）、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｎ１）、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７（Ｂ／ビクトリア系統）、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ／山形系統））の内の１つに由来するＮＡ頭部ドメインを含む。同様に、各組換えＨＡは、下記の４種の株の内の１つに由来するＨＡを含む：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１）；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３）；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６（Ｂ／ビクトリア系統）；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ／山形系統）。図７Ｂ。
【0274】
全てのフェレットから、ベースライン、ブースターの１日前又は直前、ブースターワクチン接種時、及びブースターの３週間後（４２日目）に、鎮静下で採血した。血清サンプル（必要な時まで－２０℃で保存した）をＥＬＩＳＡで試験して、ＮＡＩ活性を評価した。加えて、血球凝集素阻害アッセイ（ＨＡＩ）及び抗体法医学も実施して、多価ワクチン接種後の血球凝集素抗原に対する抗体反応を評価した。
【0275】
フェレットにおける八価のＨＡ及びＮＡワクチン接種後に、ｒＴＥＴ－ＮＡがその免疫原性を保持することが実証された。これは、ＨＡ及びＮＡを含む完全組換え八価ワクチンの可能性を初めて実証したものである。組換え八価組成物で免疫化されたフェレットは、用量及びアジュバント依存的に、四価ｒＮＡ組成物単独で免疫化した動物と同程度のＮＡＩ抗体反応を発現した（図７Ｃ）。図７Ｃに示すように、ＨＡ抗原とＮＡ抗原の間に干渉は観察されず、最初のワクチン接種後のアジュバントなしの４５μｇ用量では、いくつかの相乗効果が検出された。２回目のワクチン接種後に、顕著なＮＡＩ力価の増加を観察した。ＮＡＩ力価（及びＮＡ ＥＬＩＳＡ）の誘発は、４種全てのＮＡサブタイプにわたって確認された。
【0276】
八価ワクチン接種したフェレットにおけるＨＡ特異的抗体反応は、ＨＡＩ及び多重抗体結合ＥＬＩＳＡ（抗体法医学、ＡＦ）により実証されているように、量と質の両方の点で、四価ｒＨＡワクチン単独で免疫化したフェレットと同等であった。図８に示すように、四価ｒＨＡ及び四価ｒＴＥＴ－ＮＡの補充は、Ｈ３（図８Ａ～Ｃ）又はＨ１（図８Ｄ～Ｆ）のいずれかに対して誘発される四価ｒＨＡ免疫反応の大きさ及び範囲を妨げない。結果は、２回目の免疫化（ブースト後）のみに対応する。上記のＮＡと同様の結果が実証され、ＨＡ抗原とＮＡ抗原との間には干渉がなく、５μｇ＋ＡＦ０３用量で明らかな相乗効果があり、ＡＦ０３の用量節約効果もあった。Ｈ１ ＨＡ及びＨ３ ＨＡのパネルに対して決定した場合での、四価ｒＨＡ及び八価製剤（４種のｒＨＡ＋４種のｒＮＡ）のＨＡ抗原により誘発される同様の応答の幅を示すＡＦデータを示す（図８Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ））。
【0277】
そのため、四価組換えインフルエンザＮＡワクチンの四価組換えインフルエンザＨＡワクチンへの添加により、強力なＨＡ特異的免疫を誘発する能力を妨げることなく、フェレットにおいて強力なＮＡ特異的体液性免疫が誘発された。
【0278】
組換え一価ＮＡ、四価ｒＮＡ、及び八価ｒＨＡ、及びｒＮＡタンパク質により誘発される抗体反応への、この実験におけるアジュバント（ＡＦ０３）の影響も評価し、結果を下記の表４に示す。
【0279】
【表4】
【0280】
ＡＦ０３アジュバントは、一価ＮＡワクチン及び多価ＮＡワクチンに対するＮＡＩ反応を増加させ、且つ用量節約効果を示す。四価ｒＮＡワクチン及び八価ｒＨＡ＋ｒＮＡワクチンの両方に関して、初回の用量後に用量効果を観察し、二回目の用量後に大きなＮＡＩブースト（例えば８倍超）を観察した。
【0281】
さらに、四価ｒＮＡへの４価ｒＨＡの添加により、用量及び／又はアジュバントに関係なく組換えＮＡの免疫原性は低下せず、アジュバントなしの四価ｒＮＡ（４５μｇ）と比較して、アジュバントなしの八価ｒＨＡ＋ｒＮＡ（４５μｇ）の初回の用量後に明らかな相乗効果を観察した。
【0282】
実施例７－フェレットにおける多価ＨＡ及びＮＡの免疫原性の評価 パート２
下記の表５に示すように、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物を、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物と組み合わせた。ｒＨＡと、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれとを含み且つアジュバントを含まない四価ワクチン組成物を、対照として使用した。各群に関して、ｎ＝６フェレット。ｍＮＴ（ＨＩＮＴ）力価を、下記のインフルエンザウイルス株に関して測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｉｏｗａ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３。結果を、下記の表５で報告する。フェレットに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブーストワクチンを注射した。－７、１、２０、２２、及び４２日目に採血した。アジュバントを使用する場合には、抗原と１：１の比で混合した。
下記の表５に示すように、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物を、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物と組み合わせた。ｒＨＡと、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれとを含み且つアジュバントを含まない四価ワクチン組成物を、対照として使用した。各群に関して、ｎ＝６フェレット。ｍＮＴ（ＨＩＮＴ）力価を、下記のインフルエンザウイルス株に関して測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｉｏｗａ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３。結果を、下記の表５で報告する。フェレットに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブーストワクチンを注射した。－７、１、２０、２２、及び４２日目に採血した。アジュバントを使用する場合には、抗原と１：１の比で混合した。
【0283】
【表5】
【0284】
上記で示したように、３種のアジュバント（ＡＦ０３、ＳＰＡ１４ＬＤ（低用量）、及びＳＰＡ１４ＨＤ（高用量））は全て、アジュバントを含まない組成物と比較して同等の又は改善された力価を示した。低用量であっても、アジュバント反応間に有意差を観察しなかった。アジュバントとの八価組換えワクチン投与により、アジュバントなしの最高用量３５μｇでの四価組換えＨＡワクチン投与と比較して同等の（４倍以内）又は高い（４倍超）反応が誘発された。
【0285】
同様に、ＮＡＩ力価を、インフルエンザウイルスの下記の４種の株によりフェレットで同様に評価した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３。結果を、下記の表６に示す。
【0286】
【表6】
【0287】
上記で示したように、３種のアジュバント（ＡＦ０３、ＳＰＡ１４ＨＤ、及びＳＰＡ１４ＬＤ）全てが、試験した４種の株のうち３種（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３））に対して、アジュバントなしよりもＮＡＩ反応を有意に改善することを観察した。
【0288】
さらに、下記の表７に示すように、ＳＰＡ１４ＨＤは、アジュバントなしよりもＮＡＩ反応の最も顕著な増加を誘発しており、且つ１回の免疫化後の低用量であってもＢ株ＮＡＩを有意に改善したことを観察しており、この免疫化により、ブースター用量を投与する前に、２０日目にＮＡＩ反応が生じる。
【0289】
【表7】
【0290】
実施例８－フェレットにおける多価ＨＡ及びＮＡワクチンイメージによる広範なＮＡＩ免疫原性の誘発
下記の表８に示すように、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物を、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物と組み合わせた。下記のインフルエンザウイルス株に関して、ＮＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ａ／Ｈａｔａｙ／４９９０／２０１６；Ａ／Ｓｗｅｄｅｎ／３／２０１７；Ａ／Ｌｏｕｉｓｉａｎａ／１３／２０１７；Ａ／Ｔｏｗｎｓｖｉｌｌｅ５１／２０１６；Ａ／Ａｋｓａｒａｙ／４０４８／２０１６；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９；及びＡ／Ｏｈｉｏ１３／２０１７。結果を、下記の表８で報告する。フェレットに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブーストワクチンを注射した。１、２０、２２、及び４２日目に採血した。
下記の表８に示すように、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物を、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）を含む四価ワクチン組成物と組み合わせた。下記のインフルエンザウイルス株に関して、ＮＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ａ／Ｈａｔａｙ／４９９０／２０１６；Ａ／Ｓｗｅｄｅｎ／３／２０１７；Ａ／Ｌｏｕｉｓｉａｎａ／１３／２０１７；Ａ／Ｔｏｗｎｓｖｉｌｌｅ５１／２０１６；Ａ／Ａｋｓａｒａｙ／４０４８／２０１６；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９；及びＡ／Ｏｈｉｏ１３／２０１７。結果を、下記の表８で報告する。フェレットに、０日目に予備刺激ワクチンを注射し、２１日目に同投与量のブーストワクチンを注射した。１、２０、２２、及び４２日目に採血した。
【0291】
【表8】
【0292】
上記で示したように、八価組換えワクチン組み合わせの投与後に、株間での幅広いＮＡＩ反応が実証された。試験した全ての異種Ｎ２株に対して、ＳＰＡ１４ＨＤアジュバントにより、より高い力価の傾向を観察した。
【0293】
実施例９－免疫前フェレットモデルにおける多価ＨＡ及びＮＡワクチンイメージ
インフルエンザ陰性ＨＡＩ状態の確認後、免疫前フェレットを、０日目に、下記の４種の生ウイルスインプリンティング株［１×１０５ｆｆｕ／株；鼻孔当たり０．５ｍＬ（合計１ｍＬ）］の混合物により、鼻腔内で事前免疫化した（ｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）：Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９；Ｂ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ３３０／２００１；及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６。２１日目に、下記の表９に示すように、フェレットを、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）と、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）とを含む八価組換えタンパク質ワクチン組成物で免疫化した。２０日目に採血してベースライン力価を確立し、４２日目（組換えタンパク質による免疫化後２１日目）に再度採血してＥＬＬＡ抗体反応を測定した。結果を、下記の表９に示し、各群に関する平均ＩＣ５０比を、下記の表１０に示す。
インフルエンザ陰性ＨＡＩ状態の確認後、免疫前フェレットを、０日目に、下記の４種の生ウイルスインプリンティング株［１×１０５ｆｆｕ／株；鼻孔当たり０．５ｍＬ（合計１ｍＬ）］の混合物により、鼻腔内で事前免疫化した（ｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）：Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９；Ｂ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ３３０／２００１；及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６。２１日目に、下記の表９に示すように、フェレットを、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）と、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）とを含む八価組換えタンパク質ワクチン組成物で免疫化した。２０日目に採血してベースライン力価を確立し、４２日目（組換えタンパク質による免疫化後２１日目）に再度採血してＥＬＬＡ抗体反応を測定した。結果を、下記の表９に示し、各群に関する平均ＩＣ５０比を、下記の表１０に示す。
【0294】
【表9】
【0295】
【表10】
【0296】
上記の表９及び表１０で示したように、組換え八価ワクチン組成物は、使用したアジュバントに関係なく、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７、及びＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６に対する強いＥＬＬＡ反応を誘発した。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９に対しては弱い（決定的ではない）反応を観察しており、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３に対する反応は、最初のベースラインが高いことから、検出することがより困難であった。従って、免疫前フェレットの感染により、八価２０１８／２０１９ ＳＯＣ株タンパク質ワクチンの単回投与によりブーストされる、ほとんどの２０１８／２０１９ ＳＯＣ株に対するある程度のレベルの交差反応性ＥＬＬＡ反応が誘発されることを観察した。
【0297】
加えて、ＨＡ中和価を、ＨＩＮＴ ｍＮＴプロトコルを使用して測定した。結果を、下記の表１１に示す。
【0298】
【表11】
【0299】
表１１に示したように、八価ワクチン組成物による免疫化後の全ての群にわたり、同様のＨＩＮＴ力価を観察した。
【0300】
実施例１０－相同Ｈ１Ｎ１及びドリフトされたＨ１Ｎ１に対する、マウスにおける多価組換えワクチンの保護
マウスを、０．２μｇ／株の投与量にて、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）と、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）とを含む組換え八価ワクチン組成物で、０日目に免疫化し（予備刺激）、且つ２１日目に免疫化した（ブースター）。対照マウスに、ＰＢＳを投与した。両方の群に関してＮ＝５。予備刺激の投与から３週間後、及びブースターの投与から３週間後に、採血した。マウスを、４２日目に、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９の５ＬＤ５０（５０％死亡率を誘発する致死用量の５倍）、又はＷｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９の５ＬＤ５０でチャレンジし、体重変化をモニタリングした。
マウスを、０．２μｇ／株の投与量にて、Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、及びＢｙＮＡのそれぞれを有するｒＴＥＴ－ＮＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）と、Ｈ１、Ｈ３、ＨＢｖ、及びＨＢｙのそれぞれを有するｒＨＡ（具体的には、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３株由来）とを含む組換え八価ワクチン組成物で、０日目に免疫化し（予備刺激）、且つ２１日目に免疫化した（ブースター）。対照マウスに、ＰＢＳを投与した。両方の群に関してＮ＝５。予備刺激の投与から３週間後、及びブースターの投与から３週間後に、採血した。マウスを、４２日目に、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９の５ＬＤ５０（５０％死亡率を誘発する致死用量の５倍）、又はＷｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９の５ＬＤ５０でチャレンジし、体重変化をモニタリングした。
【0301】
対照マウスと比較して、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９の５ＬＤ５０による感染後の２週間のモニタリング期間中に、マウスが体重減少から十分に保護されることが実証された。感染後８日目までに死亡率が１００％であった対照マウスと比較して、ワクチン接種されたマウスは、生存率が１００％であった
【0302】
さらに、対照マウスと比較して、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９の５ＬＤ５０の感染から最大２週間にわたり、マウスは体重減少がより良く保護されたが、ワクチン接種されたマウス及び対照マウスの両方の生存率は１００％であることが実証された。
【0303】
また、本開示及び添付の特許請求の範囲で使用される場合に、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。任意選択的な（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）又は任意選択的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、は、後に記載される事象又は状況が起こることも起こらないこともあることを意味し、説明は、事象又は状況が起こる場合も起こらない場合も含むことを意味する。例えば、組成物は任意選択的に組み合わせを含むことができる、というフレーズは、説明が組み合わせ及び組み合わせの非存在（即ち、組み合わせの個々のメンバー）の両方を含むように、組成物が異なる分子の組み合わせを含むことも、組み合わせを含まないこともあることを意味する。範囲は、本明細書においては、約１つの特定の値から、且つ／又は約別の特定の値までとして表すことができる。このような範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、且つ／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞を使用することによって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することは理解されよう。範囲のそれぞれの両端点が、他方の端点と関連して、及び他方の端点とは独立して、の両方の意味を有していることもさらに理解されよう。本開示において引用される全ての参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【配列表】
【国際調査報告】