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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ＸＸＩＩ型コラーゲンアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20241106BHJP
G01N 33/577 20060101ALI20241106BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A ZNA
G01N33/577 B
C07K16/18
C12N15/13
C12M1/34 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526602
(86)(22)【出願日】2022-11-07
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2022080910
(87)【国際公開番号】W WO2023079130
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】2116008.0
(32)【優先日】2021-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522403778
【氏名又は名称】ノルディック バイオサイエンス エー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】マドセン，エミリー アルブレヒト
(72)【発明者】
【氏名】ソーラシウス‐ウッシング，ジェッペ
(72)【発明者】
【氏名】ウィルムセン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】カルスダル，モルテン アッサー
【テーマコード（参考）】
4B029
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB17
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA51
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、イムノアッセイ、特には患者においてがんを検出するかつ／もしくは監視するためのイムノアッセイ、ならびに／または上記イムノアッセイの実行に使用するためのモノクローナル抗体およびイムノアッセイキットに関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者におけるがんを検出するかつ／または監視するためのイムノアッセイの方法であって、ｉ）患者由来のサンプルをＣ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることと、
ｉｉ）前記サンプル中の前記モノクローナル抗体とペプチドの間の結合の量を検出するかつ決定すること
を含む、方法。
【請求項2】
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定された前記モノクローナル抗体の結合の量を正常な健常対象と関連した値と、および／または既知の疾患重症度と関連した値と、および／または以前の時点で前記患者から得た値と、および／または所定のカットオフ値と相関させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんが、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または胃がんである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記がんが、膵がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
全生存期間の予後を提供することをさらに含む請求項４に記載の方法であって、既知の膵がん患者と関連した中央値を超えるステップｉｉ）で決定された前記モノクローナル抗体の結合の量が、不十分な全生存期間と関連する、方法。
【請求項6】
前記モノクローナル抗体が、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３）である前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長されたバージョンに特異的に結合しない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記モノクローナル抗体が、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４）である前記Ｃ末端アミノ酸配列のトランケートされたバージョンに特異的に結合しない、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記サンプルが、血液、血清、または血漿から選択される生体液サンプルである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体と、ストレプトアビジンでコートされたウェルプレート、
Ｌが任意選択的なリンカーである、ビオチン化されたペプチド ビオチン－Ｌ－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５）、
サンドイッチイムノアッセイにおける使用のための二次抗体、
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を含むキャリブレータータンパク質、
抗体ビオチン化キット、
抗体ＨＲＰラベリングキット、
抗体放射標識キット、および
アッセイ可視化キット
の少なくとも１つ
を含むイムノアッセイキット。
【請求項13】
前記モノクローナル抗体が、ＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３）である前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長されたバージョンに特異的に結合しない、請求項１２に記載のイムノアッセイキット。
【請求項14】
前記モノクローナル抗体が、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４）である前記Ｃ末端アミノ酸配列のトランケートされたバージョンに特異的に結合しない、請求項１２または１３に記載のイムノアッセイキット。
【請求項15】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項16】
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項17】
前記モノクローナル抗体が、ＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３）である前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長されたバージョンに特異的に結合しない、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項18】
前記モノクローナル抗体が、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４）である前記Ｃ末端アミノ酸配列のトランケートされたバージョンに特異的に結合しない、請求項１６または１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項19】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イムノアッセイ、特には患者においてがんを検出するかつ／もしくは監視するためのイムノアッセイ、ならびに／または上記イムノアッセイの実行に使用するためのモノクローナル抗体およびイムノアッセイキットに関する。
【背景技術】
【0002】
がんは、世界的に主要な健康上の問題であり、米国単独で２０２１年に６００．０００超のがん死亡をもたらすと推定されている［１］。継続的な研究および進歩にもかかわらず、がんの負担は持続している。がん患者に対する火急のニーズの１つは、良好で非侵襲的な診断用および予後診断用のバイオマーカーである。従来の組織ベースの手法とは対照的に、血液ベースのバイオマーカーは、組織生検を必要とせず、それほど侵襲性でなく、その結果不快感および合併症が少ない［２］，［３］。
【0003】
腫瘍内微小環境は、がんの発達に複雑に関わっており、近年、がんの従来の特徴と並び認識されている［４］。腫瘍内微小環境は、がん細胞および周囲の間質を含む。間質の中には、免疫系の様々な細胞および繊維芽細胞がある。繊維芽細胞は、大部分の組織の大きな非細胞性構成要素である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の鍵となる成分である、コラーゲンの産生に寄与している。ＥＣＭは、腫瘍の周辺に蓄積し、増殖を封入するマトリックスの周囲層を形成し得、がんに挑む免疫細胞または薬物の能力を阻害し得る［５］。健常な組織では、ＥＣＭの成分は、常に産生され、微細な均衡にて分解される。しかしながらがんでは、この代謝回転の均衡は歪められている［６］，［７］。
【0004】
コラーゲンは、今日まで２８種が同定されており、ラミニン、プロテオグリカン、および糖タンパク質と併せてＥＣＭの主要な構成要素である。コラーゲンは、上皮細胞および内皮細胞の基底側の基底膜（ＢＭ）から間質内マトリックス（ＩＭ）内へ広がる。ＢＭとＩＭの間の界面における基底膜領域には、ＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）などのいわゆる希少コラーゲンがいくつか存在する。コラーゲンのＦＡＣＩＴファミリーは、それらがコラーゲンの繊維と他のＥＣＭ成分の間の相互作用を媒介するため、架橋として機能すると提案されている。このようにして、それらは、ＥＣＭの組織化および安定性を支援する［７］，［８］。ＸＸＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２２）は、希少コラーゲンであり、コラーゲンのＥＡＣＩＴファミリーのメンバーである。ＣＯＬ２２は、筋肉、軟骨、心臓、皮膚の組織接合部の部位で発現され、血管の安定性の維持に関連していることが知られている［９］，［１０］。ＣＯＬ２２はまた、頭頸部の扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）における予後上の価値を有しており、ここでＣＯＬ２２Ａ１のｍＲＮＡ発現は、リンパ節の転移を有する事例において有意に増大していた。さらに、ｍＲＮＡ発現レベルは、早期疾患再発に有意に関連しており、ＣＯＬ２２Ａ１ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、無病生存期間の減少に関連していた［１１］。個別に、ＣＯＬ２２は、皮膚由来細胞および肺由来細胞（腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞（ｂａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、Ａ５４９細胞を含む）の両方を使用して、トランスフォーミング増殖因子βに対する早期応答遺伝子として、ヒトのｅｘ ｖｉｖｏモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて同定された。ＣＯＬ２２Ａ１のこの誘導は、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方で有意に増大された［１２］。いくつかのＦＡＣＩＴについて、これらのうち特にＸＶＩ、ＸＸ、およびＸＸＩＩ型コラーゲンは、それらが発達および／または組織修復のあいだにより顕著であることが観察されている［１３］，［１４］，［１５］。
【0005】
がんにおけるＣＯＬ２２の役割は、本発明者らにより調査されており、いくつかの類似点が、がんと発達、ならびに組織修復の間で存在することが示唆されている。
【発明の概要】
【0006】
本出願人はここで、血液中のＸＸＩＩ型コラーゲンのバイオマーカー（本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２２」と呼ばれる）の存在を定量化するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。本アッセイは、がん患者および健常対照の血清中の循環するＸＸＩＩ型コラーゲンのレベルを決定するために、最適化され、検証され、および使用された。本アッセイは、ＸＸＩＩ型コラーゲンに対する特異性に関して、ならびに健常対照および疾患（がん）を有する患者の両方におけるレベルを検出するための感受性に関して、非常に強力であることが見いだされた。データは、ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルが、健常対照と比較してがん患者の血清において有意に高いことを示している。
【0007】
よって、第１の態様では、本発明は、イムノアッセイの方法を提供し、方法は、
ｉ）患者由来のサンプルをＣ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）（Ｃ末端アミノ酸配列は、本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２２」および／または「標的配列」と呼ばれ、上記Ｃ末端アミノ酸配列からなるかまたはこれを含むペプチドもまた、本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２２」および／または「標的配列」と呼ばれる）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることと、
ｉｉ）前記サンプル中の前記モノクローナル抗体とペプチドの間の結合の量を検出することかつ決定すること
を含む。
ｉ）患者由来のサンプルをＣ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）（Ｃ末端アミノ酸配列は、本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２２」および／または「標的配列」と呼ばれ、上記Ｃ末端アミノ酸配列からなるかまたはこれを含むペプチドもまた、本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２２」および／または「標的配列」と呼ばれる）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることと、
ｉｉ）前記サンプル中の前記モノクローナル抗体とペプチドの間の結合の量を検出することかつ決定すること
を含む。
【0008】
本方法は好ましくは、患者において疾患を検出するかつ／または監視するためのイムノアッセイの方法である。本方法は好ましくは、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定された上記モノクローナル抗体の結合の量を、正常な健常対象と関連した値と、および／または既知の疾患重症度と関連した値と、および／または以前の時点で上記患者から得た値と、および／または所定のカットオフ値と相関させること
をさらに含む。
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定された上記モノクローナル抗体の結合の量を、正常な健常対象と関連した値と、および／または既知の疾患重症度と関連した値と、および／または以前の時点で上記患者から得た値と、および／または所定のカットオフ値と相関させること
をさらに含む。
【0009】
好ましい実施形態では、疾患は、がんである。がんは、たとえば膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または胃がんである。好ましくは、がんは、膵がんである。
【0010】
患者が膵がんを有する場合、本方法は、全生存期間の予後を提供するために使用され得る。よって、本方法は、全生存期間の予後を提供することを含んでよく、既知の膵がん患者と関連した中央値（５０パーセンタイル）を超えるステップ（ｉｉ）で決定された上記モノクローナル抗体の結合の量が、不十分な全生存期間と関連する。中央値（５０パーセンタイル）未満の結合量は、改善された全生存期間と関連する。
【0011】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＸ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２）（Ｘは任意のアミノ酸である）である、標的配列の伸長されたバージョン（すなわちアミノ酸の付加によりそのＣ末端で伸長されたＰＲＯ－Ｃ２２標的配列のバージョン）に特異的に結合しない。好ましくは、ＸはＡであり、標的配列の伸長されたバージョンは、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３）（すなわちアラニンの付加によりそのＣ末端で伸長されたＰＲＯ－Ｃ２２標的配列のバージョン）である。好ましくは、ＰＲＯ－Ｃ２２標的配列に対する上記抗体の親和性対標的配列の伸長されたバージョンに対する上記抗体の親和性の比率は、少なくとも１０対１、より好ましくは少なくとも２０対１または少なくとも３０対１である。
【0012】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４）である、標的配列のトランケートされたバージョン（すなわち、最後のプロリン残基の除去によりトランケートされたＰＲＯ－Ｃ２２標的配列のバージョン）に特異的に結合しない。好ましくは、ＰＲＯ－Ｃ２２標的配列に対する上記抗体の親和性対標的配列のトランケートされたバージョンに対する上記抗体の親和性の比率は、少なくとも１０対１、より好ましくは少なくとも２０対１または少なくとも３０対１である。
【0013】
好ましくは、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を有する合成ペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体である。
【0014】
疾患が患者で検出されると、本方法は、患者に対し適切な処置を行うステップをさらに含み得る。たとえば、当該疾患ががんである場合、そのがんに関して既知の処置、たとえば化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、幹細胞移植、外科手術、標的療法、またはそれらの組み合わせが、行われ得る。
【0015】
サンプルは好ましくは、生体液である。生体液は、限定するものではないが、血液、血清、血漿、尿、または細胞もしくは組織培養物由来の上清であり得る。好ましくは、生体液は、血液、血清、または血漿である。
【0016】
イムノアッセイは、限定するものではないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得る。イムノアッセイは、たとえば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり得る。このようなアッセイは、当業者に既知の技術である。
【0017】
本明細書中で使用される、用語ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）は、サンプル中に存在する標的ペプチド（もし存在する場合）が、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素に連結された抗体を使用して検出される、イムノアッセイを表す。酵素の活性はよって、測定可能な産物を産生する基質とのインキュベーションにより評価される。サンプル中の標的ペプチドの存在および／または量はそれにより、検出されかつ／または定量化され得る。ＥＬＩＳＡは、当業者に既知の技術である。
【0018】
本明細書中使用される、用語「競合ＥＬＩＳＡ」は、競合酵素結合免疫吸着測定法を表す。「競合ＥＬＩＳＡ」において、サンプル中に存在する標的ペプチド（もし存在する場合）は、抗体を結合することに関して、標的のペプチドの既知の量（それは、たとえば固定された基質に結合されるまたは標識される）と競合し、当業者に既知の技術である。
【0019】
本明細書中使用される、用語「サンドイッチイムノアッセイ」は、サンプル中の抗原の検出のための少なくとも２つの抗体の使用を表し、当業者に既知の技術である。
【0020】
本明細書中使用される、用語「結合の量」は、患者のサンプル中のモノクローナル抗体とペプチドの間の結合の定量化を表す。上記定量化はたとえば、それに対し抗体が特異的に結合するペプチドの既知の濃度を含む標準サンプル中で測定された結合の値を使用して作成された検量線に対し、患者のサンプル中で測定された結合の値を比較することにより決定され、それにより患者のサンプル中でそれに対し抗体が特異的に結合するペプチドの量を決定し得る。以下に記載される実施例では、ＥＬＩＳＡ法が使用され、ここでは分光光度的な解析を使用して患者のサンプル中の結合の量および検量線を作成する場合の結合の量を測定する。しかしながら、任意の適切な方法を使用できる。
【0021】
本明細書中使用される、用語「所定のカットオフ値」は、統計上のカットオフ値以上である患者のサンプル中の標的ペプチドの測定された値が、疾患またはその特定の重症度の存在の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも７５％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、より好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、および最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応する点で、患者における上記疾患またはその特定の重症度の高い尤度を表すと統計的に決定される結合の量を意味する。
【0022】
本明細書中使用される、用語「正常な健常対象と関連した値」は、健常である、すなわち疾患を有しないとみなされる対象由来のサンプルについて上述の方法により決定された結合の標準化された量を意味し、用語「既知の疾患の重症度または予後と関連した値」は、既知の重症度の疾患を有すると知られている患者由来のサンプルについて上述の方法により決定された結合の標準化された量を意味する。
【0023】
本明細書中使用される、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端での、すなわちポリペプチドのＣ末端の端部でのＣ末端ペプチド配列を表し、その一般的な方向での意味として解釈すべきではない。
【0024】
本明細書中使用される、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、同意語として使用される。
【0025】
本明細書中使用される、用語「モノクローナル抗体」は、全抗体および全抗体の結合特異性を保持するそのフラグメント、たとえばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、または当業者に既知の他のこのようなフラグメント、の両方を表す。よく知られているように、全抗体は通常、各対が１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖から構成される、同一の２対のポリペプチド鎖である「Ｙ字型の」構造を有する。各軽鎖および重鎖のＮ末端領域は、可変領域を含み、一方で重鎖および軽鎖のそれぞれのＣ末端部は、定常領域を構成する。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、それらは主に、抗原認識に寄与する。定常領域は、抗体が免疫系の細胞および分子を動員できるようにする。結合特異性を保持する抗体フラグメントは、少なくともＣＤＲおよび上記結合特異性を保持するために十分な可変領域の残りの部分を含む。
【0026】
本発明の方法では、当該分野で既知のいずれかの定常領域を含むモノクローナル抗体が、使用され得る。ヒト定常軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖と分類される。重鎖定常領域は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、それぞれｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧアイソタイプは、限定するものではないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。モノクローナル抗体は好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれかを含む、ＩｇＧアイソタイプであり得る。
【0027】
抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら［１８］により記載されるものなどの、当該分野で既知の方法を使用して決定され得る。抗体は、実施例に記載されるようにＢ細胞のクローンから作製され得る。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、またはＩｇＡのアイソタイプ、またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のサブクラスに特異的なＥＬＩＳＡにより決定され得る。作製された抗体のアミノ酸配列は、標準的な技術を使用して決定され得る。たとえば、ＲＮＡは、細胞から単離され、逆転写によりｃＤＮＡを作製するために使用され得る。ｃＤＮＡは次に、抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマーを使用するＰＣＲに供される。たとえば、全てのＶＨ（可変重鎖）配列に対するリーダー配列に特異的なプライマーは、以前に決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用され得る。軽鎖は、ＶκまたはＶλリーダー配列にアニールするプライマーと共に、κ鎖またはλ鎖の３´末端に結合するプライマーを使用して増幅され得る。完全長の重鎖および軽鎖が、作製されおよび配列決定され得る。
【0028】
第２の態様では、本発明は、Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、本発明の第１の態様に係るイムノアッセイでの使用に適しており、本発明の第２の態様に係るモノクローナル抗体の好ましい実施形態および他の任意選択的な実施形態は、本発明の第１の態様ならびにその好ましい実施形態および他の任意選択的な実施形態での使用のためのモノクローナル抗体の上記の論述から明らかである。
【0029】
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当該分野で既知のいずれかの適切な技術を介して作製され得る。たとえば、モノクローナル抗体は、たとえばげっ歯類（または他の適切な哺乳類）を、任意選択で免疫原性担体タンパク質（たとえばキーホールリンペットヘモシアニン）に連結され得る、配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）からなる合成ペプチドで免疫処置すること、単一の抗体産生細胞を単離することかつクローニングすること、および得られたモノクローナル抗体をアッセイしてこれらが望ましい特異性を有することを確かめることにより、アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を有する合成ペプチドに対して産生され得る。Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための例示的なプロトコルは、以下に記載される。
【0030】
好ましくは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは好ましくは、
ＣＤＲ－Ｌ１： ＫＡＳＱＤＩＹＳＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５）
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＮＲＬＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６）および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＱＹＤＤＦＰＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７）
ＣＤＲ－Ｈ１： ＴＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）
ＣＤＲ－Ｈ２： ＡＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＰＡＦＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９）および
ＣＤＲ－Ｈ３： ＲＳＴＬＦＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０）
から選択される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
ＣＤＲ－Ｌ１： ＫＡＳＱＤＩＹＳＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５）
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＮＲＬＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６）および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＱＹＤＤＦＰＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７）
ＣＤＲ－Ｈ１： ＴＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）
ＣＤＲ－Ｈ２： ＡＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＰＡＦＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９）および
ＣＤＲ－Ｈ３： ＲＳＴＬＦＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０）
から選択される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【0031】
好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、少なくとも２、３、４、５、または６つの上に列挙されたＣＤＲ配列を含む。
【0032】
好ましくは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＤＲ配列
ＣＤＲ－Ｌ１： ＫＡＳＱＤＩＹＳＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５）
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＮＲＬＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６）および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＱＹＤＤＦＰＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７）
を含む軽鎖可変領域を有する。
ＣＤＲ－Ｌ１： ＫＡＳＱＤＩＹＳＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５）
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＮＲＬＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６）および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＱＹＤＤＦＰＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７）
を含む軽鎖可変領域を有する。
【0033】
好ましくは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＤＲ間にフレームワーク配列を含む軽鎖を有し、上記フレームワーク配列は、以下の軽鎖配列のＣＤＲ間のフレームワーク配列と実質的に同一であるまたは実質的に類似している（ここではＣＤＲは太字および下線により示され、フレームワーク配列はイタリック体で示される）。
【化1】
【0034】
好ましくは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＤＲ配列
ＣＤＲ－Ｈ１： ＴＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）
ＣＤＲ－Ｈ２： ＡＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＰＡＦＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９）および
ＣＤＲ－Ｈ３： ＲＳＴＬＦＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０）
を含む重鎖可変領域を有する。
ＣＤＲ－Ｈ１： ＴＹＧＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）
ＣＤＲ－Ｈ２： ＡＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＰＡＦＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９）および
ＣＤＲ－Ｈ３： ＲＳＴＬＦＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０）
を含む重鎖可変領域を有する。
【0035】
好ましくは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＤＲ間にフレームワーク配列を含む重鎖を有し、ここで上記フレームワーク配列は、以下の重鎖配列のＣＤＲ間のフレームワーク配列と実質的に同一であるまたは実質的に類似している（ここではＣＤＲは太字および下線により示され、フレームワーク配列はイタリック体で示される）。
【化2】
【0036】
本明細書中使用される、抗体のＣＤＲ間のフレームワークアミノ酸配列は、それらが少なくとも７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％の類似性または同一性を有する場合、別の抗体のＣＤＲ間のフレームワークアミノ酸配列と実質的に同一であるまたは実質的に類似している。類似のまたは同一のアミノ酸は、連続的または非連続であり得る。
【0037】
フレームワーク配列は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含み得る。アミノ酸の置換は、保存的であり得、これは置換されたアミノ酸が元のアミノ酸と類似の化学的特性を有することを意味する。当業者は、どのアミノ酸が類似の化学的な特性を共有するかを理解している。たとえば、以下のアミノ酸のグループは、大きさ、電荷、および極性などの類似の化学的な特性を共有する：グループ１ Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；グループ２ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；グループ３ Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；グループ４ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；グループ ５ Ｐｈｅ Ｔｈｙ Ｔｒｐ。
【0038】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムが、アミノ酸配列を比較するために使用され得る。このプログラムは、適宜いずれかの配列中にスペースを挿入することによりアミノ酸配列を比較し最適なアライメントを見出す。最適なアライメントのためアミノ酸の同一性または類似性（同一性＋アミノ酸のタイプの保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似の配列の最長の範囲を整列し、値を適合に割り当てる。よって、それぞれが異なるスコアを有する、類似するいくつかの領域が見いだされる比較を得ることが可能である。両方の種類の解析が、本発明で企図される。同一性または類似性は好ましくは、フレームワーク配列の全長にわたり計算される。
【0039】
特定の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変領域配列：
【化3】
【化4】
【0040】
第３の態様では、本出願は、第２の態様に係るモノクローナル抗体と、
ストレプトアビジンでコートされたウェルプレート、
Ｌが任意選択的なリンカーである、ビオチン化されたペプチド ビオチン－Ｌ－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５）、
サンドイッチイムノアッセイでの使用のための二次抗体、
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を含むキャリブレータータンパク質、
抗体ビオチン化キット、
抗体ＨＲＰラベリングキット、
抗体放射標識キット、および
アッセイ可視化キット
の少なくとも１つ
を含むイムノアッセイキットに関する。
ストレプトアビジンでコートされたウェルプレート、
Ｌが任意選択的なリンカーである、ビオチン化されたペプチド ビオチン－Ｌ－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５）、
サンドイッチイムノアッセイでの使用のための二次抗体、
Ｃ末端アミノ酸配列ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を含むキャリブレータータンパク質、
抗体ビオチン化キット、
抗体ＨＲＰラベリングキット、
抗体放射標識キット、および
アッセイ可視化キット
の少なくとも１つ
を含むイムノアッセイキットに関する。
【0041】
ここで本発明を、以下の図面を参照する実施例で記載する。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】図１は、ＰＲＯ－Ｃ２２ ＥＬＩＳＡの特異性を示す。ビオチン化されたコーティングペプチド（ビオチン－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５））の用量依存的な阻害、ならびにそれぞれ３０（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））および１０（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １））のアミノ酸残基（ＡＡ）の標準ペプチドに特異的なアッセイによるモノクローナル抗体の相互作用。Ｃ末端からペプチド配列をトランケート（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４））または伸長（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３））した場合、阻害は観察されなかった。ナンセンスな３０ＡＡペプチドＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰＧＧＰＧＳＤＧＫＰＧＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７）は、阻害効果を有さず、アッセイ特異的な３０ＡＡの標準ペプチドと組み合わせたナンセンスコーティングペプチドＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ－ビオチン （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １８）の付加は、相互作用に関して効果を呈しなかった。エラーバーは、がん患者の血清中の標準ＰＲＯ－Ｃ２２を表す。
【図2】図２は、健常対照（ｎ＝３３）、ならびに膀胱がん（ｎ＝２０）、乳がん（ｎ＝２０）、結腸直腸がん（ｎ＝２０）、頭頸部がん（ｎ＝２０）、腎臓がん（ｎ＝２０）、肺がん（ｎ＝２０）、メラノーマ（ｎ＝２０）、卵巣がん（ｎ＝２０）、膵がん（ｎ＝２０）、前立腺がん（ｎ＝２０）、および胃がん（ｎ＝２０）の血清中のＰＲＯ－Ｃ２２の定量化を示す。ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルは、個々に提示され、バーは、散布図としての平均値を付す。ＬＬＯＱ未満を測定したサンプルには、ＰＲＯ－Ｃ２２の検証で決定されたＬＬＯＱ値を与えた。＊＊＊＊は、０．０００１未満の値を表す。＊＊＊は０．００１未満。＊＊は０．０１未満。
【発明を実施するための形態】
【0043】
実施例
本発明の開示される実施形態は、以下の実施例で記載され、これは、本開示の理解を支援するように記載され、本明細書中以下に続く特許請求の範囲に定義される開示の範囲をいかなる方法によっても限定するように解釈すべきではない。以下の実施例は、記載の実施形態の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提示され、本開示の範囲を限定するようには意図されず、以下の実験が全てであるかまたは最適な実験が行われたことを表すようには意図されない。使用される数（たとえば量、温度など）に関する正確性を保つよう試みがなされているが、いくらかの実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。他の記載がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は、大気圧付近である。
本発明の開示される実施形態は、以下の実施例で記載され、これは、本開示の理解を支援するように記載され、本明細書中以下に続く特許請求の範囲に定義される開示の範囲をいかなる方法によっても限定するように解釈すべきではない。以下の実施例は、記載の実施形態の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提示され、本開示の範囲を限定するようには意図されず、以下の実験が全てであるかまたは最適な実験が行われたことを表すようには意図されない。使用される数（たとえば量、温度など）に関する正確性を保つよう試みがなされているが、いくらかの実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。他の記載がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は、大気圧付近である。
【0044】
材料および方法
ＰＲＯ－Ｃ２２を標的とするモノクローナル抗体の作製
ＸＩＩ型コラーゲン（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＦＷ１）のＣ末端に対応する１０アミノ酸ペプチド１６１６ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ１６２６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）から購入し、免疫処置のため使用した。
ＰＲＯ－Ｃ２２を標的とするモノクローナル抗体の作製
ＸＩＩ型コラーゲン（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＦＷ１）のＣ末端に対応する１０アミノ酸ペプチド１６１６ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ１６２６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）から購入し、免疫処置のため使用した。
【0045】
６週齢の雌性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、乳化したＫＬＨ－ＣＧＧコンジュゲート免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＣＧＧ－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １９））を皮下注射した。これを、スルホスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ， ｃａｔ．ｎｏ． ２２３２２）を使用して、標的ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質に共有結合的に架橋することにより作製した。グリシン残基およびシステイン残基をＮ末端に付加して、担体タンパク質の正しい連結を確実にした。Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｉｇｍａ ｃａｔ． Ｎｏ． Ｓ６３２２）と混合した１００μｇの免疫原性ペプチドを含む２００μｌの乳化した抗原を使用する免疫処置を、安定な血清力価のレベルが達成されるまで２週間間隔で行った。最も高い力価を有したマウスを、４週間休息させ、次に静脈内に００μｇの免疫原性ペプチドを含む０．９％のＮａＣｌ溶液１００μｌをブーストし、終了させた。
【0046】
ハイブリドーマ細胞を、以前に記載されるように（Ｇｅｆｔｅｒ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｆｆ， １９７７）、脾臓細胞をＳＰ２／０メラノーマ細胞と融合することにより産生した。得られたハイブリドーマ細胞を次に、９６ウェルのマイクロタイタープレートで培養し、サブクローニングを、細胞の限界希釈の間に行った。選択されたモノクローナル細胞を、２４ウェルプレートに播種し、次にＴ２５フラスコ、次いでＴ７５フラスコ中で、最後にＴ１５０フラスコ中で増殖させ、その後、上清を回収した。約５００ｍＬを、製造社の指示（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， ＵＫ， ｃａｔ． ＃１７－０４０４－０１）にしたがいタンパク質Ｇカラムを使用して、回収しおよび精製した。
【0047】
作製した抗体を配列決定し、ＣＤＲを決定した。総ＲＮＡを、ＲＮＡ－ｅａｓｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔの技術的マニュアルに従い、ハイブリドーマ細胞から単離した。総ＲＮＡを次に、、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅの技術的マニュアルに従いアイソタイプに特異的なアンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを使用してｃＤＮＡへと逆転写した。ＶＨおよびＶＬの抗体フラグメントを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）の標準作業手順書（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ：（ＳＯＰ）にしたがい増幅した。増幅した抗体フラグメントを、別々に標準的なクローニングベクター中にクローニングした。コロニーＰＣＲを行って、正確な大きさのインサートを有するクローンをスクリーニングした。正確な大きさのインサートを有する５以上のコロニーを、各フラグメントに関して配列決定した。異なるクローンの配列を整列し、これらクローンのコンセンサス配列を提供した。
【0048】
鎖の配列は、以下の通りである（ＣＤＲ：太字；フレームワーク配列：イタリック体；定常領域：下線）。
【化5】
【0049】
【化6】
【0050】
ＰＲＯ－Ｃ２２ ＥＬＩＳＡのプロトコル
最終的なＰＲＯ－Ｃ２２のプロトコルを、以下のように行った：９６ウェルのストレプトアビジンでコートしたＥＬＩＳＡプレートを、アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＢＳ、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｗ／ｖ）、２ｇ／ＬのＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解した２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化されたＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ビオチン－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５））ペプチドで１００μｌ／ウェルにてコートし、３００ＲＰＭにて振とうしながら２０℃で３０分間インキュベートした。洗浄バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した後、２０μＬ／ウェルのサンプルを、二連で添加し、その後、アッセイバッファー中３５ｎｇ／ｍＬのＨＲＰで標識したモノクローナル抗体を、１００μｌ／ウェルで添加し、３００ＲＰＭにて振とうしながら４℃で２０時間インキュベートした。第２の洗浄サイクルを行い、１００μＬ／ウェルの３，３´，５，５´－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、３００ＲＰＭにて振とうしながら２０℃の暗室にてインキュベートした。この反応を、１％のＨ２ＳＯ４を１００μｌ／ウェルにて添加することにより停止させた。吸光度を、参照として６５０ｎｍを用いて４５０ｎｍで測定した。標準曲線を、２倍に段階希釈された１２５ｎｇ／ｍＬのＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６）標準ペプチドを２０μｌ／ウェルにて使用することにより作製した。４パラメーターロジスティック回帰モデルを使用して曲線を適合させた。各プレートは、アッセイバッファー中のペプチドである２つのキット対照、ならびに１つのヒト血清サンプル、１つのブタ血清サンプル、および１つの滑液サンプルを含む３つのクオリティコントロールサンプルを含んだ。
最終的なＰＲＯ－Ｃ２２のプロトコルを、以下のように行った：９６ウェルのストレプトアビジンでコートしたＥＬＩＳＡプレートを、アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＢＳ、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｗ／ｖ）、２ｇ／ＬのＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解した２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化されたＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ビオチン－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５））ペプチドで１００μｌ／ウェルにてコートし、３００ＲＰＭにて振とうしながら２０℃で３０分間インキュベートした。洗浄バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した後、２０μＬ／ウェルのサンプルを、二連で添加し、その後、アッセイバッファー中３５ｎｇ／ｍＬのＨＲＰで標識したモノクローナル抗体を、１００μｌ／ウェルで添加し、３００ＲＰＭにて振とうしながら４℃で２０時間インキュベートした。第２の洗浄サイクルを行い、１００μＬ／ウェルの３，３´，５，５´－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、３００ＲＰＭにて振とうしながら２０℃の暗室にてインキュベートした。この反応を、１％のＨ２ＳＯ４を１００μｌ／ウェルにて添加することにより停止させた。吸光度を、参照として６５０ｎｍを用いて４５０ｎｍで測定した。標準曲線を、２倍に段階希釈された１２５ｎｇ／ｍＬのＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６）標準ペプチドを２０μｌ／ウェルにて使用することにより作製した。４パラメーターロジスティック回帰モデルを使用して曲線を適合させた。各プレートは、アッセイバッファー中のペプチドである２つのキット対照、ならびに１つのヒト血清サンプル、１つのブタ血清サンプル、および１つの滑液サンプルを含む３つのクオリティコントロールサンプルを含んだ。
【0051】
ＰＲＯ－Ｃ２２ ＥＬＩＳＡの技術的バリデーション
抗体の特異性を、シグナル阻害により評価した。２つのバージョンの選択ペプチド、１０アミノ酸（ＡＡ）バージョンＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １））および３０ＡＡバージョン（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））を使用し、これらをトランケートされたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４））および伸長されたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３））と比較し、ナンセンスなビオチン化ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰ－ビオチン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２））およびナンセンスな標準ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰＧＧＰＧＳＤＧＫＰＧＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７））を試験した。
抗体の特異性を、シグナル阻害により評価した。２つのバージョンの選択ペプチド、１０アミノ酸（ＡＡ）バージョンＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １））および３０ＡＡバージョン（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））を使用し、これらをトランケートされたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４））および伸長されたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３））と比較し、ナンセンスなビオチン化ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰ－ビオチン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２））およびナンセンスな標準ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰＧＧＰＧＳＤＧＫＰＧＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７））を試験した。
【0052】
アッセイの線形範囲の濃度限度として定義される、測定範囲の下限および上限（ＬＬＭＲおよびＵＬＭＲ）を、１０個の独立した実行を通して決定した。これらの実行から、アッセイ間およびアッセイ内のバリエーションを、ＬＬＭＲ－ＵＬＭＲの測定範囲をカバーする１０のサンプルに基づき決定した。１０のサンプルは、２つのキット対照および３つのクオリティコントロールのサンプルに加え、３つのヒト血清サンプル、２つのアッセイバッファー中のペプチドを含んだ。アッセイ内のバリエーションを、プレート内の平均変動係数（ＣＶ％）として計算した。アッセイ間のバリエーションを、プレート間の平均ＣＶ％として計算した。１０の実行から、定量の上限（ＵＬＯＱ）を、この回収率（ＲＥ％）およびＣＶ％に基づき最も高い許容される標準点として決定した。許容性の基準は、ＣＶ％≦２０％かつ８０～１２０％内のＲＥ％であった。定量の下限（ＬＬＯＱ）を、その濃度でＣＶ％が、５つの独立した実行にわたり６連で測定された低い解析物濃度を有する４つのヒト血清サンプルに基づき、大部分のサンプルで２０％を超える、濃度として決定した。
【0053】
線形性および平行性を、４つの健常なヒト血清サンプルを２倍に段階希釈すること、および３つの独立した実行を介してＣＶ％を計算することにより試験した。ＲＥ％を、１：２の希釈した値と比較して計算した。ＣＶ％の許容基準は、≦２０％であり、ＲＥ％の許容基準は、８０～１２０％内であった。
【0054】
正確性を、３０ＡＡの標準ペプチドを３つのヒト血清サンプル中にスパイクすること、およびＲＥ％を計算することにより評価した。平均ＲＥ％の許容基準は、８０～１２０％であった。正確性をさらに、３セットの血清サンプルを異なる量で混合（たとえば２５％の血清Ａ＋７５％の血清Ｂ、５０％の血清Ａ＋５０％の血清Ｂなど）すること、および個々の参照血清サンプルの値に対しＲＥ％を計算することにより評価した。各スパイク比のＲＥ％は、８０～１２０％内であった。一般に干渉する物質のビオチン、脂質、およびヘモグロビンの効果を、３つの血清サンプルを使用して、異なる濃度（ビオチン低：５ｎｇ／ｍＬ、高：１００ｎｇ／ｍＬ；脂質低：１．５ｍｇ／ｍＬ、高：５ｍｇ／ｍＬ；ヘモグロビン：０．５ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍまでの範囲の１０の濃度、０．５ｍｇ／ｍＬずつ変動）により試験した。干渉を、ＲＥ％により評価し、８０～１２０％の範囲内で許容した。
【0055】
解析物の安定性を、４℃および２０℃で、２、４、２４、または４８時間の間、３つの血清サンプルのアリコートをインキュベートすることにより評価した。ＲＥ％を、解析後に解凍された対照血清サンプルと比較して計算し、ＲＥ％を、８０～１２０％内で許容した。安定性をさらに、血清サンプルの反復した凍結融解サイクル：最大で５ラウンドの凍結融解サイクルを介して評価した。凍結融解の安定性を、解析の前の単回の解凍を経たサンプルに対するＲＥ％に基づき計算し、ＲＥ％が８０～１２０％内であった場合に許容した。アッセイの技術的な安定性を、２０℃で２４時間インキュベートしたキット試薬を使用してアッセイを３回実行すること、および凍結保存から試薬を使用して測定した１０のサンプルのＲＥ％を計算することにより評価した。ここでＲＥ％の許容基準は、８０～１２０％内であった。
【0056】
患者のサンプル
第１のコホートは、２２３のがんサンプルおよび３３の健常サンプルを含んだ。これは、それぞれ膵がん、結腸直腸がん、腎臓がん、胃がん、乳がん、膀胱がん、肺がん、メラノーマ、頭頚部がん、前立腺がん、および卵巣がんの患者である２０名の患者、ならびに３３名の年齢の一致した健常対照を含んだ。全てのがんサンプルを、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）から入手し、健常対照を、ＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ， ＵＳＡ）から入手した。第１のコホートの特徴の概要を、表１で見出すことができる。
第１のコホートは、２２３のがんサンプルおよび３３の健常サンプルを含んだ。これは、それぞれ膵がん、結腸直腸がん、腎臓がん、胃がん、乳がん、膀胱がん、肺がん、メラノーマ、頭頚部がん、前立腺がん、および卵巣がんの患者である２０名の患者、ならびに３３名の年齢の一致した健常対照を含んだ。全てのがんサンプルを、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）から入手し、健常対照を、ＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ， ＵＳＡ）から入手した。第１のコホートの特徴の概要を、表１で見出すことができる。
【0057】
【表1】
【0058】
第２のコホートは、２０名の健常なドナーおよび３９名の浸潤性膵管癌（ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＰＤＡＣ）を有する患者を含んだ。全ての患者は、デンマークのＢＩＯＰＡＣ試験“ＢＩＯｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ”（ＮＣＴ０３３１１７７６）由来であった。患者を、２００８年１２月から２０１７年９月まで６つのデンマークの病院から動員した。ＰＣ患者は、組織学的に確認された腫瘍を有した。ＰＣ患者を、国のガイドライン（ｗｗｗ．ｇｉｃａｎｃｅｒ．ｄｋ）にしたがい様々な種類の化学療法で処置した。試験を、健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会（（Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ ｏｎ Ｄａｎｉｓｈ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の提言にしたがい行った。ＢＩＯＰＡＣのプロトコルは、健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会（ＶＥＫ ｒｅｆ． ＫＡ－２００６０１１３）およびデータ保護機関（ｊ．ｎｒ． ２００６－４１－６８４８）により承認された。血液サンプルを、診断時または実施の前に入手した。全ての対象は、ヘルシンキ宣言にしたがい記載済のインフォームドコンセントを提供した。
【0059】
【表2】
【0060】
統計
ＰＲＯ－Ｃ２２レベルの比較を、クラスカル＝ウォリス検定、次いでＤｕｎｎの多重比較検定を使用して行い、各固形がんのタイプを健常対照のグループと比較した。この後に、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）によりＰＲＯ－Ｃ２２の診断の正確性を試験した。ＢＩＯＰＡＣコホートを使用して、カットポイントとして中央値を使用して全生存期間（ＯＳ）との関連を評価し、高いＰＲＯ－Ｃ２２レベルを有するグループを定義した。カプラン・マイヤー曲線解析および単変量Ｃｏｘ回帰解析を使用して、ＰＲＯ－Ｃ２２とＯＳの間の関連を評価した。アスタリスクは、以下の有意性のレベルを表す：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
ＰＲＯ－Ｃ２２レベルの比較を、クラスカル＝ウォリス検定、次いでＤｕｎｎの多重比較検定を使用して行い、各固形がんのタイプを健常対照のグループと比較した。この後に、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）によりＰＲＯ－Ｃ２２の診断の正確性を試験した。ＢＩＯＰＡＣコホートを使用して、カットポイントとして中央値を使用して全生存期間（ＯＳ）との関連を評価し、高いＰＲＯ－Ｃ２２レベルを有するグループを定義した。カプラン・マイヤー曲線解析および単変量Ｃｏｘ回帰解析を使用して、ＰＲＯ－Ｃ２２とＯＳの間の関連を評価した。アスタリスクは、以下の有意性のレベルを表す：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0061】
結果
ＰＲＯ－Ｃ２２のＥＬＩＳＡの開発
ＥＬＩＳＡの開発プロセスを介して、最適化ステップを行って、適切なアッセイバッファー、インキュベーション時間、および温度、ならびに抗体およびペプチドの濃度を見出し、アッセイにとって最良の競合状況を提供した。競合イムノアッセイＰＲＯ－Ｃ２２は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したｍＡｂ（ＨＲＰ－ｍＡｂ）を使用して、血清サンプル中のＣＯＬ２２の量を定量化した。このアッセイは、標準ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））を含み、これは離れて競合すること（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｗａｙ）により、ＨＲＰ－ｍＡｂとペプチドのビオチン化バージョン（ビオチン－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５））の間の相互作用を使用して、血清中のＣＯＬ２２の循環量を定量化した。特異性を、ＨＲＰ－ｍＡｂに競合を全く示さないペプチドのトランケートしたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４））および伸長したバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３））を使用して試験した。ナンセンコーター（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰ－ビオチン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２））およびナンセンス３０ＡＡ標準ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰＧＧＰＧＳＤＧＫＰＧＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７））をまた、競合を妨害する特質に関して評価したが、これらはいずれの効果も示さなかった（図１）。対照的に、１０ＡＡの配列選択ペプチド（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １））および３０ＡＡ配列標準ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））は、用量依存的に相互作用をうまく阻害した（図１）。
ＰＲＯ－Ｃ２２のＥＬＩＳＡの開発
ＥＬＩＳＡの開発プロセスを介して、最適化ステップを行って、適切なアッセイバッファー、インキュベーション時間、および温度、ならびに抗体およびペプチドの濃度を見出し、アッセイにとって最良の競合状況を提供した。競合イムノアッセイＰＲＯ－Ｃ２２は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したｍＡｂ（ＨＲＰ－ｍＡｂ）を使用して、血清サンプル中のＣＯＬ２２の量を定量化した。このアッセイは、標準ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））を含み、これは離れて競合すること（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｗａｙ）により、ＨＲＰ－ｍＡｂとペプチドのビオチン化バージョン（ビオチン－ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５））の間の相互作用を使用して、血清中のＣＯＬ２２の循環量を定量化した。特異性を、ＨＲＰ－ｍＡｂに競合を全く示さないペプチドのトランケートしたバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４））および伸長したバージョン（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３））を使用して試験した。ナンセンコーター（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰ－ビオチン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２））およびナンセンス３０ＡＡ標準ペプチド（ＰＧＭＲＧＭＰＧＳＰＧＧＰＧＳＤＧＫＰＧＰＰＧＳＱＧＥＳＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７））をまた、競合を妨害する特質に関して評価したが、これらはいずれの効果も示さなかった（図１）。対照的に、１０ＡＡの配列選択ペプチド（ＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １））および３０ＡＡ配列標準ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＱＣＤＰＳＱＣＡＹＦＡＳＬＡＡＲＰＧＮＶＫＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６））は、用量依存的に相互作用をうまく阻害した（図１）。
【0062】
線形測定の範囲を、１．０－５３．０ｎｇ／ｍＬであると決定し、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱを、それぞれ、１．９５および１２５．０ｎｇ／ｍＬであると決定した。バリエーション内（Ｉｎｔｒａ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）試験およびバリエーション間（ｉｎｔｒａ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）試験を介して、アッセイの精度を決定した。バリエーション内およびバリエーション間はいずれも、３．６％であると決定された。血清のＭＲＤ（最小必要希釈濃度 ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を、アッセイにおいて２倍に希釈された健常血清サンプルの線形性により評価した。これは、ＭＲＤとして１：２（１＋１）を決定し、希釈を、健常血清サンプルの１：４（１＋３）に限定した。これは、１０３．７％の平均ＲＥ％に基づいた。
【0063】
正確性を、スパイク回収試験（ｓｐｉｋｉｎｇ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｔｅｓｔ）により決定し、ここで血清におけるペプチドの平均ＲＥ％は、１０５．１％であり、血清における血清の平均ＲＥ％は、１０３．５％であった。基質であるビオチン、脂質、およびヘモグロビンを、異なる濃度において干渉について試験した。５ｎｇ／ｍｌの低濃度のビオチンは、３つの異なるサンプルにおいて９９．１の平均ＲＥ％を有し、１００ｎｇ／ｍｌの高濃度は、８５．５％の平均ＲＥ％を有することが見いだされた。３つの血清サンプルにおいて１．５ｍｇ／ｍＬの低い脂質濃度は、１０４．６％の平均ＲＥ％を有し、５ｍｇ／ｍＬの高濃度は、１０２．３％の平均ＲＥ％を有した。ヘモグロビンの干渉カットオフを、０．５０ｍｇ／ｍＬ～５．０ｍｇ／ｍＬの範囲のヘモグロビンで０．５ｍｇ／ｍＬずつ変動する濃度を使用して決定した。３．０ｍｇ／ｍＬで、３つの血清サンプルの平均ＲＥ％は、１２６．６％であり、ＲＥ％の許容範囲（８０～１２０％）を超えた。よってカットオフを、１１２．５％の平均ＲＥ％に基づき２．５ｍｇ／ｍＬの濃度であると決定した。
【0064】
安定性を、解析物およびキット試薬の安定性の両方に関して評価した。５回の凍結融解サイクルを経た３つの血清サンプルの平均ＲＥ％は、１０３．１％であった。４℃で最大４８時間インキュベートされた血清サンプルは、１０７．２％のＲＥ％を有し、２０℃で最大４８時間インキュベートされたサンプルでは１０６．１％であった。キット試薬（バッファー、ビオチン化ペプチド、およびＨＲＰ－ｍＡｂ）を、２０℃で２４時間のインキュベーションの後に評価した。試薬の安定性を、バリエーション内およびバリエーション間で使用された同じ１０のサンプルを測定すること、およびＲＥ％を計算することにより評価した。３つの個々の実行で測定された１０のサンプルは、９４．４％の平均ＲＥ％を示した。
【0065】
技術的バリエーションの概要を、表３に示す。
【0066】
【表3】
【0067】
がん患者の血清中のＰＲＯ－Ｃ２２
コホート１において、ＰＲＯ－Ｃ２２は、対照と比較して全ての固形がんのタイプにおいて有意に高かった（図２）。このことは、ＰＲＯ－Ｃ２２、すなわちＣＯＬ２２の循環レベルが、様々なタイプの固形腫瘍に罹患している患者由来の血清において高いことを示唆する。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を使用してがん患者と健常対照を区別するＰＲＯ－Ｃ２２の能力を評価した（表４）。
コホート１において、ＰＲＯ－Ｃ２２は、対照と比較して全ての固形がんのタイプにおいて有意に高かった（図２）。このことは、ＰＲＯ－Ｃ２２、すなわちＣＯＬ２２の循環レベルが、様々なタイプの固形腫瘍に罹患している患者由来の血清において高いことを示唆する。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を使用してがん患者と健常対照を区別するＰＲＯ－Ｃ２２の能力を評価した（表４）。
【0068】
【表4】
【0069】
ＡＵＲＯＣの範囲は０．８８６－０．９７６で様々であり、これは、ＰＲＯ－Ｃ２２が、がん患者と健常対照を見事に区別することを表している（０．８超のＡＵＲＯＣ）。ＰＲＯ－Ｃ２２は、第２の（ＢＩＯＰＡＣ）コホートにおいて膵がん患者で高められることが検証された（図３）。全生存期間（ＯＳ）を評価しこれと関連づける場合、高いＰＲＯ－Ｃ２２（中央値：５０パーセンタイル超）は、低いレベルを有する患者と比較して３．９８７のハザード比（９５％ＣＩ：１．７２４－８．８０６）を有する膵がんの不十分なＯＳと有意に関連していた。同様に、ＯＳ時間の中央値は、ＰＲＯ－Ｃ２２が高い患者では１６２日間であり、ＰＲＯ－Ｃ２２が低い患者では１３６３日間であった（ログランクＰ値＝０．００１１）。
【0070】
結論
この試験において、血液中のＸＸＩＩ型コラーゲンの存在を定量化するためのＥＬＩＳＡを、うまく開発し、最適化し、および検証した。ＰＲＯ－Ｃ２２ＥＬＩＳＡは、技術的に強力であり、正確でかつ感度がよい。循環ＸＸＩＩ型コラーゲンのレベルは、がん患者および健常対照の血清において評価でき、ここでＰＲＯ－Ｃ２２のレベルは、健常対照と比較して試験された全てのがんにおいて有意に高かった。ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルは、がん患者および健常対照を区別するために使用され得、ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルはまた、膵がんの全生存期間に関する予後を提供するために使用され得る。
この試験において、血液中のＸＸＩＩ型コラーゲンの存在を定量化するためのＥＬＩＳＡを、うまく開発し、最適化し、および検証した。ＰＲＯ－Ｃ２２ＥＬＩＳＡは、技術的に強力であり、正確でかつ感度がよい。循環ＸＸＩＩ型コラーゲンのレベルは、がん患者および健常対照の血清において評価でき、ここでＰＲＯ－Ｃ２２のレベルは、健常対照と比較して試験された全てのがんにおいて有意に高かった。ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルは、がん患者および健常対照を区別するために使用され得、ＰＲＯ－Ｃ２２のレベルはまた、膵がんの全生存期間に関する予後を提供するために使用され得る。
【0071】
本明細書において、特段他の意味が明記されない限り、単語「または（ｏｒ）」は、状態の一つのみが合致することを必要とする操作詞（ｏｐｅｒａｔｏｒ）「排他的または（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｏｒ）」とは反対に、記載される状態のいずれかまたは両方が合致する場合の真の値を選出する操作詞の意味で使用される。単語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「～を含むまたは～からなる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｒ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を意味するように使用される。上記で認められた全ての従来技術は、本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書中の全ての公開済みの先行文献は、本明細書の日付においてオーストラリアまたは他の場所において共通する一般的な知識であると承認されたものとみなされるべきではない。
【0072】
参照文献
［１］ Ｒ． Ｌ． Ｓｉｅｇｅｌ， Ｋ． Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｅ． Ｆｕｃｈｓ， ａｎｄ Ａ． Ｊｅｍａｌ， “Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２０２１，” ＣＡ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ．， ｖｏｌ． ７１， ｎｏ． １， ｐｐ． ７‐３３， Ｊａｎ． ２０２１， ｄｏｉ： １０．３３２２／ｃａａｃ．２１６５４．
［２］ Ｓ． Ｍ． Ｈａｎａｓｈ， Ｃ． Ｓ． Ｂａｉｋ， ａｎｄ Ｏ． Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ， “Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ－ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃａｎｃｅｒ，” Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ｖｏｌ． ８， ｎｏ． ３， ｐｐ． １４２‐１５０， Ｍａｒ． ２０１１， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１０．２２０．
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［６］ Ｎ． Ｉ． Ｎｉｓｓｅｎ， Ｍ． Ｋａｒｓｄａｌ， ａｎｄ Ｎ． Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ， “Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ３８， ｎｏ． １， ｐ． １１５， Ｄｅｃ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１３０４６－０１９－１１１０－６．
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［８］ Ｌ． Ｍ． Ｓｈａｗ ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｏｌｓｅｎ， “ＦＡＣＩＴ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ： ｄｉｖｅｒｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ，” Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． １６， ｐｐ． １９１‐１９４， Ｊａｎ． １９９１， ｄｏｉ： １０．１０１６／０９６８－０００４（９１）９００７４－６．
［９］ Ｍ． Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ， ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＸＩＩ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７９， ｎｏ． ２１， ｐｐ． ２２５１４‐２２５２１， Ｍａｙ ２００４， ｄｏｉ： １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４００５３６２００．
［１０］ Ｑ． Ｖ． Ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＣＯＬ２２Ａ１ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＣＯＬ２２Ａ１ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ａｎｅｕｒｙｓｍｓ，” Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌ． Ｍｅｃｈ．， ｖｏｌ． １１， ｎｏ． １２， Ｄｅｃ． ２０１８， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｍｍ．０３３６５４．
［１１］ Ｋ． ＭＩＳＡＷＡ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｙｐｅ ＸＸＩＩ ａｎｄ ＸＸＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｍｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ｖｏｌ． ２， ｎｏ． ２， ｐｐ． ２８５‐２９１， Ｍａｒ． ２０１４， ｄｏｉ： １０．３８９２／ｍｃｏ．２０１３．２３３．
［１２］ Ｔ． Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， “Ａ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＣＯＬ２２Ａ１ ａｓ ａ ＴＧＦβ Ｅａｒｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅ ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｔｏ Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，” Ｇｅｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ）．， ｖｏｌ． １０， ｎｏ． ２， ｐ． ７５， Ｊａｎ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．３３９０／ｇｅｎｅｓ１００２００７５．
［１３］ Ｒ． Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｇｌｉｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，” Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７， ｎｏ． ３‐４， ｐｐ． ２１７‐２２６， ２０１１， ｄｏｉ： １０．１１５９／０００３２７９４７．
［１４］ Ｍ． Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， “α１（ＸＸ） Ｃｏｌｌａｇｅｎ， ａ Ｎｅｗ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ， Ｆｉｂｒｉｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７６， ｎｏ． ２５， ｐｐ． ２３１２０‐２３１２６， Ｊｕｎ． ２００１， ｄｏｉ： １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ００９９１２２００．
［１５］ Ｂ． Ｃｈａｒｖｅｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｃｏｌ２２ａ１ ｇｅｎｅ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ．，” Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． １４０， ｎｏ． ２２， ｐｐ． ４６０２‐４６１３， Ｎｏｖ． ２０１３， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｅｖ．０９６０２４．
［１６］ Ａ． Ｙ． Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｊ． Ｌ． Ｗｈｉｔｅｄ， “Ｐａｒａｌｌｅｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ， ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，” Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． １４７， ｎｏ． １， Ｊａｎ． ２０２０， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｅｖ．１８１６３６．
［１７］ Ｇ． Ｍａｎｚｏ， “Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｇｇｅｓｔ Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｖｉｅｗ，” Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ７， Ｍａｒ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｃｅｌｌ．２０１９．０００２０．
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［２］ Ｓ． Ｍ． Ｈａｎａｓｈ， Ｃ． Ｓ． Ｂａｉｋ， ａｎｄ Ｏ． Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ， “Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ－ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃａｎｃｅｒ，” Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ｖｏｌ． ８， ｎｏ． ３， ｐｐ． １４２‐１５０， Ｍａｒ． ２０１１， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１０．２２０．
［３］ Ｍ． Ｓｕｎｄ ａｎｄ Ｒ． Ｋａｌｌｕｒｉ， “Ｔｕｍｏｒ ｓｔｒｏｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．， ｖｏｌ． ２８， ｎｏ． １‐２， ｐｐ． １７７‐１８３， Ｊｕｎ． ２００９， ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１０５５５－００８－９１７５－２．
［４］ Ｄ． Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， “Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ： Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，” Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ． １４４， ｎｏ． ５， ｐｐ． ６４６‐６７４， Ｍａｒ． ２０１１， ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０２．０１３．
［５］ Ｎ． Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ， Ｌ． Ｂ． Ｔｈｏｍｓｅｎ， Ｃ． Ｌ． Ｂａｇｅｒ， Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ａ． Ｋａｒｓｄａｌ， “Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｉｎ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ： ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｍｏｐｌａｓｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｎｉｃｈｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ｖｏｌ． ６７， ｎｏ． １， ｐｐ． １‐１２， Ｊａｎ． ２０１８， ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ００２６２－０１７－２０７４－ｚ．
［６］ Ｎ． Ｉ． Ｎｉｓｓｅｎ， Ｍ． Ｋａｒｓｄａｌ， ａｎｄ Ｎ． Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ， “Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ３８， ｎｏ． １， ｐ． １１５， Ｄｅｃ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１３０４６－０１９－１１１０－６．
［７］ Ｓ． Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｆｒｏｍ ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｂｅｄｓｉｄｅ，” Ｊ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．， ｖｏｌ． １７， ｎｏ． １， ｐ． ３０９， Ｄｅｃ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１２９６７－０１９－２０５８－１．
［８］ Ｌ． Ｍ． Ｓｈａｗ ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｏｌｓｅｎ， “ＦＡＣＩＴ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ： ｄｉｖｅｒｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ，” Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． １６， ｐｐ． １９１‐１９４， Ｊａｎ． １９９１， ｄｏｉ： １０．１０１６／０９６８－０００４（９１）９００７４－６．
［９］ Ｍ． Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ， ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＸＩＩ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７９， ｎｏ． ２１， ｐｐ． ２２５１４‐２２５２１， Ｍａｙ ２００４， ｄｏｉ： １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４００５３６２００．
［１０］ Ｑ． Ｖ． Ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＣＯＬ２２Ａ１ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＣＯＬ２２Ａ１ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ａｎｅｕｒｙｓｍｓ，” Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌ． Ｍｅｃｈ．， ｖｏｌ． １１， ｎｏ． １２， Ｄｅｃ． ２０１８， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｍｍ．０３３６５４．
［１１］ Ｋ． ＭＩＳＡＷＡ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｙｐｅ ＸＸＩＩ ａｎｄ ＸＸＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｍｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ｖｏｌ． ２， ｎｏ． ２， ｐｐ． ２８５‐２９１， Ｍａｒ． ２０１４， ｄｏｉ： １０．３８９２／ｍｃｏ．２０１３．２３３．
［１２］ Ｔ． Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， “Ａ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＣＯＬ２２Ａ１ ａｓ ａ ＴＧＦβ Ｅａｒｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅ ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｔｏ Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，” Ｇｅｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ）．， ｖｏｌ． １０， ｎｏ． ２， ｐ． ７５， Ｊａｎ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．３３９０／ｇｅｎｅｓ１００２００７５．
［１３］ Ｒ． Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｇｌｉｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，” Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７， ｎｏ． ３‐４， ｐｐ． ２１７‐２２６， ２０１１， ｄｏｉ： １０．１１５９／０００３２７９４７．
［１４］ Ｍ． Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， “α１（ＸＸ） Ｃｏｌｌａｇｅｎ， ａ Ｎｅｗ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ， Ｆｉｂｒｉｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２７６， ｎｏ． ２５， ｐｐ． ２３１２０‐２３１２６， Ｊｕｎ． ２００１， ｄｏｉ： １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ００９９１２２００．
［１５］ Ｂ． Ｃｈａｒｖｅｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｃｏｌ２２ａ１ ｇｅｎｅ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ．，” Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． １４０， ｎｏ． ２２， ｐｐ． ４６０２‐４６１３， Ｎｏｖ． ２０１３， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｅｖ．０９６０２４．
［１６］ Ａ． Ｙ． Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｊ． Ｌ． Ｗｈｉｔｅｄ， “Ｐａｒａｌｌｅｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ， ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，” Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． １４７， ｎｏ． １， Ｊａｎ． ２０２０， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｅｖ．１８１６３６．
［１７］ Ｇ． Ｍａｎｚｏ， “Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｇｇｅｓｔ Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｖｉｅｗ，” Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ７， Ｍａｒ． ２０１９， ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｃｅｌｌ．２０１９．０００２０．
［１８］ Ｋａｂａｔ ＥＡ， Ｗｕ ＴＴ， Ｂｉｌｏｆｓｋｙ Ｈ， Ｒｅｉｄ－Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ， Ｐｅｒｒｙ Ｈ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． Ｂａｔｈｅｓｄａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ； １９８３
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】