特表 2024-542108 核酸配列を編集する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-13

(54)【発明の名称】核酸配列を編集する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241106BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/09 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024526648

(86)(22)【出願日】2022-11-03

(85)【翻訳文提出日】2024-06-26

(86)【国際出願番号】 EP2022080675

(87)【国際公開番号】W WO2023078997

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】2115820.9

(32)【優先日】2021-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518160355

【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】ザーカー ジェローム エフ

(72)【発明者】

【氏名】ファンケ ルイーズ エフ エイチ

(72)【発明者】

【氏名】クレーフエルト アスカー エー

(72)【発明者】

【氏名】ビルンバウム ジェイコブ

(72)【発明者】

【氏名】フレデンス ジュリウス

(72)【発明者】

【氏名】スピンク マーティン

(72)【発明者】

【氏名】チン ジェイソン ダブリュー

(57)【要約】

一態様では、本発明は、所望の配列を標的核酸に導入する方法に関する。本発明はまた、所望の配列を標的核酸に導入する方法を繰り返すことを含む、核酸配列をアセンブルする方法、並びに、より多くの量の異種核酸をコードするレプリコンのアセンブリにも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

所望の配列を標的核酸に導入する方法であって、
ａ）宿主細胞を提供するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、
前記エピソームレプリコンが骨格配列及びドナー核酸配列を含み、
前記ドナー核酸配列が、５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を順に含み、
前記骨格配列が、相同組換え配列１の隣に位置する第１の切除部位及び相同組換え配列２の隣に位置する第２の切除部位を含み、
前記宿主細胞が標的核酸をさらに含む、前記ステップ、
ｂ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
ｃ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｄ）前記第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び前記第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、前記ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ、
ｅ）前記ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、並びに
ｆ）インキュベートを行って、前記切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間で組換えを起こすステップ
を含む、前記方法。

【請求項2】

ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼであり、第１のＲＮＡ分子が、第１の切除部位に特異的なスペーサーを含み、第２のＲＮＡ分子が、第２の切除部位に特異的なスペーサーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

第１のＲＮＡ分子及び／又は第２のＲＮＡ分子がエピソームレプリコンによってコードされる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

切除された核酸の各末端が、骨格配列に由来する核酸配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

切除されたドナー核酸が、各末端で、骨格配列に由来する核酸配列の６個又は５個以下の塩基対を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

エピソームレプリコンが細菌人工染色体である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

エピソームレプリコンが接合伝達によって宿主細胞に送達される、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

標的核酸が宿主細胞のゲノムである、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

宿主細胞が原核細胞である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

原核細胞が大腸菌である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

核酸配列をアセンブルする方法であって、
（ｉ）請求項１～１１のいずれかに記載のステップを行って、第１のドナー核酸配列を第１の標的核酸に導入し、それによって第２の標的核酸を作製するステップ、及び
（ii）請求項１～１１のいずれかに記載のステップを行って、第２のドナー核酸配列を第２の標的核酸に導入し、それによって第３の標的核酸を作製するステップ
を含む、前記方法

【請求項13】

パート（ｉ）及びパート（ii）が繰り返される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

パート（ｉ）のための第１のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一であり、及び／又はパート（ｉ）のための第２のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一であり、
パート（ii）のための第１のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一であり、及び／又はパート（ii）のための第２のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

（iii）請求項１～１１のいずれかに記載のステップを行って、第３のドナー核酸配列を第３の標的核酸に導入し、それによって第４の標的核酸を作製するステップ、
パート（ｉ）、（ii）、及び（iii）を繰り返すステップ
をさらに含み、
パート（iii）のための第１のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一であり、及び／又はパート（iii）のための第２のＲＮＡ分子の配列が各繰り返しで同一である、請求項１２～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

パート（ｉ）が、第１の骨格配列を含む、ドナー核酸配列をコードするエピソームレプリコンの使用を含み、パート（ii）が、第２の骨格配列を含む、ドナー核酸配列をコードするエピソームレプリコンの使用を含み、
前記第１の骨格配列が、第１のマーカー又はマーカーセットを含み、前記第１の骨格配列内の第１の切除部位に特異的な第１のＲＮＡ分子をコードし、並びに、前記第１の骨格配列内の第２の切除部位に特異的な第２のＲＮＡ分子をコードし、
前記第２の骨格配列が、第２のマーカー又はマーカーセットを含み、前記第２の骨格配列内の第１の切除部位に特異的な第１のＲＮＡ分子をコードし、並びに、前記第２の骨格配列内の第２の切除部位に特異的な第２のＲＮＡ分子をコードし、
前記第１のマーカー又はマーカーセットが、前記第２のマーカー又はマーカーセットと異なる、請求項１２～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

エピソームレプリコンを構築するための方法であって、
ａ）ドナーエピソームレプリコンを提供するステップであって、前記レプリコンが、
ユニバーサルスペーサー配列を含む骨格、組み込みステップｎに特異的な第１の相同性領域ＨＲｎ、及び第２のユニバーサルな相同性領域ｕＨＲ、ＨＲｎの隣に位置する第１の切除部位及びｕＨＲの隣に位置する第２の切除部位、
ドナー核酸ＤＮＡｎ、
ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセット
を含む、前記ステップ、
ｂ）ＨＲｎ及びｕＨＲが隣接する、ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセットを含む、アセンブリエピソームレプリコンを含む、宿主細胞を提供するステップであって、前記アセンブリレプリコン内の前記ダブルセレクションカセットが、前記ドナーレプリコン内の前記セレクションカセットと異なるマーカーを含む、前記ステップ、
ｃ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパクを提供するステップ、
ｃ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｄ）前記第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び前記第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、前記ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ、
ｅ）前記宿主細胞において、前記ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎの切除を誘導するステップ、並びに
ｆ）インキュベートを行って、前記切除されたドナー核酸と前記アセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、前記核酸ＤＮＡｎを含む第２のアセンブリレプリコンを形成するステップ
を含む、前記方法。

【請求項18】

ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼであり、第１のＲＮＡ分子が、第１の切除部位に特異的なスペーサーを含み、第２のＲＮＡ分子が、第２の切除部位に特異的なスペーサーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

第１のＲＮＡ分子及び／又は第２のＲＮＡ分子がドナーエピソームレプリコンによってコードされる、請求項１７～１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

切除された核酸の各末端が、骨格配列に由来する核酸配列を含む、請求項１７～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

切除されたドナー核酸が、各末端で、骨格配列に由来する核酸配列の６個又は５個以下の塩基対を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

エピソームレプリコンが細菌人工染色体である、請求項１７～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

エピソームレプリコンが接合伝達によって宿主細胞に送達される、請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

エピソームレプリコンがドナー宿主細胞に含まれ、アセンブリレプリコンがレシピエント宿主細胞に含まれ、前記ドナーレプリコンが接合伝達によって前記レシピエント宿主細胞に送達され、前記ドナー宿主細胞が、伝達不可能なＦ’プラスミドを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

宿主細胞が原核細胞である、請求項１７～２５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

原核細胞が大腸菌である、請求項１７～２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

ドナー核酸ＤＮＡｎが相同性領域ＨＲｎ＋１を含み、方法が、第２のドナー核酸ＤＮＡｎ＋１を含むさらなるドナーエピソームレプリコンを宿主細胞に導入するステップ、前記宿主細胞における、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎ＋１の切除を誘導するステップ、及びインキュベートを行って、前記切除されたドナー核酸ＤＮＡｎ＋１と前記第２のアセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、核酸ＤＮＡｎ及び核酸ＤＮＡｎ＋１を含む第３のアセンブリレプリコンを形成するステップをさらに含む、請求項１７～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

繰り返し反復される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

請求項１～１１のいずれかに記載のステップのエピソームレプリコンが、請求項１７～２９のいずれかに記載の方法に従って構築される、請求項１２～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

宿主細胞がコンピテントなｒｅｃＡ及び／又はｒｅｃＯを欠いている、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

宿主細胞がｒｅｃＡを欠いている（ΔｒｅｃＡ）、請求項３１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

一態様では、本発明は、所望の配列を標的核酸に導入する方法に関する。本発明はまた、所望の配列を標的核酸に導入する方法を繰り返すことを含む、核酸配列をアセンブルする方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

ゲノムＤＮＡを合成ＤＮＡで置き換えるための戦略（非特許文献１～１２）は、ゲノムの改変を可能にし、そして、編集方法論のみによっては作製することができない全体的に合成のゲノムを作製するための強力な技術の基礎を提供する。ゲノム合成は、２つの生物で合成ゲノムを作製するために使用されており、これら生物は、ゲノム最小化を調べるために使用されているマイコプラズマ（１Ｍｂ）（非特許文献１３）、及びリコードされた生物を作製するために使用されている大腸菌（E. coli）（４Ｍｂ）（非特許文献１４）である。大腸菌における研究は、１８０００を超える同義コドンを除去して、カノニカルなアミノ酸をコードするためにわずか６１個のコドンしか使用しない、遺伝子コードが圧縮された生物を作製した。遺伝子コードが圧縮された、リコードされた大腸菌は、ウイルス耐性細胞を作製するための、並びに、非カノニカルなアミノ酸の組み込み及びコードされる非カノニカルなポリマーの合成のためのセンスコドンの再割り当てのための基礎を提供する（非特許文献１５）。他のゲノムを合成するための試み、及びゲノムをリコードする、最小化する、又はリアレンジするための戦略が、現在行われている（非特許文献９、１０、１６～１８）。

【0003】

大腸菌のゲノム合成は、レプリコン切除強化型組換え（ＲＥＸＥＲ（Replicon Excision Enhanced Recombination））に基づくものであった（非特許文献５）。ＲＥＸＥＲ（図１ａ）では、ダブルセレクションカセット（ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーから構成される）が隣接している所望の合成ＤＮＡとゲノムに相同な５０～１５２ｂｐの領域とから構成されるインサートを有している細菌人工染色体（ＢＡＣ、bacterial artificial chromosome）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びラムダレッド組換え機構をコードするヘルパープラスミドを有する細胞に形質転換される。正確なＢＡＣを有する１つのクローンが単離され、コンピテント化され、次いで、ＢＡＣからの、合成ＤＮＡを有するインサートのＣａｓ９介在性の切除を活性化するために、スペーサーアレイがコンピテント細胞に導入される。スペーサー配列は、スペーサーＲＮＡがインサートの相同性領域内の固有の配列と塩基対合し、インサートとＢＡＣ骨格との間の連結を正確に切断するように設計されている（図１ｂ）。正確に切除されたインサートは次いで、合成ＤＮＡを、対応するゲノムＤＮＡの代わりにゲノムに挿入するために、ラムダレッド組換え機構によって使用される。ゲノム及び合成ＤＮＡ内の別々のダブルセレクションカセットは、所望の組み込みを選択するために使用される（図１ａ）。適切にマークされたゲノムを有する細胞から開始して、ＲＥＸＥＲ後の寒天プレート上でクローンコロニーを得るまでには４日間を要する。

【0004】

１ステップのＲＥＸＥＲが、最大１３６ｋｂのゲノムを合成のリコードされたＤＮＡで置き換えるために使用されている。１ステップのＲＥＸＥＲから得られたゲノムは次のＲＥＸＥＲラウンドのための鋳型を提供し、ＲＥＸＥＲの繰り返し（ゲノム交換段階的合成（ＧＥＮＥＳＩＳ、Genome interchange stepwise synthesis））は、より大きな大腸菌ゲノムセクションを合成ＤＮＡで置き換えることを可能にする。３８回のＲＥＸＥＲステップが、これは各ステップがカスタムメイドのスペーサー対の設計、合成、クローニング、及び検証を要するものであるが、大腸菌ゲノム全体（７つの株にわたる）を合成のリコードされたＤＮＡで置き換えるために使用された。リコードされたＤＮＡは次いで、接合によって１つの株にまとめられて、リコードされた生物が作製された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Santos, C. N., Regitsky, D. D. & Yoshikuni, Y. Implementation of stable and complex biological systems through recombinase-assisted genome engineering. Nat Commun 4, 2503, doi:10.1038/ncomms3503 (2013)

【非特許文献2】Santos, C. N. & Yoshikuni, Y. Engineering complex biological systems in bacteria through recombinase-assisted genome engineering. Nat Protoc 9, 1320-1336, doi:10.1038/nprot.2014.084 (2014)

【非特許文献3】Krishnakumar, R. et al. Simultaneous non-contiguous deletions using large synthetic DNA and site-specific recombinases. Nucleic Acids Res 42, e111, doi:10.1093/nar/gku509 (2014)

【非特許文献4】Wang, G. et al. CRAGE enables rapid activation of biosynthetic gene clusters in undomesticated bacteria. Nat Microbiol 4, 2498-2510, doi:10.1038/s41564-019-0573-8 (2019)

【非特許文献5】Wang, K. et al. Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64, doi:10.1038/nature20124 (2016)

【非特許文献6】Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M. & Fujita, K. Combining two genomes in one cell: stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15971-15976, doi:10.1073/pnas.0503868102 (2005)

【非特許文献7】Lau, Y. H. et al. Large-scale recoding of a bacterial genome by iterative recombineering of synthetic DNA. Nucleic Acids Res 45, 6971-6980, doi:10.1093/nar/gkx415 (2017)

【非特許文献8】Lartigue, C. et al. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. Science 325, 1693-1696, doi:10.1126/science.1173759 (2009)

【非特許文献9】Ostrov, N. et al. Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome. Science 353, 819-822, doi:10.1126/science.aaf3639 (2016)

【非特許文献10】Dymond, J. S. et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature 477, 471-476, doi:10.1038/nature10403 (2011)

【非特許文献11】Gibson, D. G. et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 329, 52-56, doi:10.1126/science.1190719 (2010)

【非特許文献12】Wang, K., de la Torre, D., Robertson, W. E. & Chin, J. W. Programmed chromosome fission and fusion enable precise large-scale genome rearrangement and assembly. Science 365, 922-926, doi:10.1126/science.aay0737 (2019)

【非特許文献13】Hutchison, C. A., 3rd et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 351, aad6253, doi:10.1126/science.aad6253 (2016)

【非特許文献14】Fredens, J. et al. Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518, doi:10.1038/s41586-019-1192-5 (2019)

【非特許文献15】de la Torre, D. & Chin, J. W. Reprogramming the genetic code. Nat Rev Genet 22, 169-184, doi:10.1038/s41576-020-00307-7 (2021)

【非特許文献16】Mercy, G. et al. 3D organization of synthetic and scrambled chromosomes. Science 355, doi:10.1126/science.aaf4597 (2017)

【非特許文献17】Richardson, S. M. et al. Design of a synthetic yeast genome. Science 355, 1040-1044, doi:10.1126/science.aaf4557 (2017)

【非特許文献18】Venetz, J. E. et al. Chemical synthesis rewriting of a bacterial genome to achieve design flexibility and biological functionality. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 8070-8079, doi:10.1073/pnas.1818259116 (2019)

【非特許文献19】Lovett, S. T. The DNA Damage Response. Bacterial Stress Responses, 341 2nd Edition, 205-228 (2011).

【非特許文献20】Anstey-Gilbert, C. S. et al. The structure of Escherichia coli ExoIX--implications for DNA binding and catalysis in flap endonucleases. Nucleic Acids Res 41, 8357-8367, doi:10.1093/nar/gkt591 (2013).

【非特許文献21】Liu, Y., Kao, H. I. & Bambara, R. A. Flap endonuclease 1: a central component of DNA metabolism. Annu Rev Biochem 73, 589-615, doi:10.1146/annurev.biochem.73.012803.092453 (2004).

【非特許文献22】Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157, doi:10.1038/s41586-019-1711-4 (2019).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

大腸菌のゲノムへの合成ＤＮＡの導入をさらに単純化し、短時間にするための戦略は、将来的な大規模ゲノム改変、及びゲノム合成の試みの鍵となるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様では、所望の配列を標的核酸に導入する方法であって、
ａ）宿主細胞を提供するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、
前記エピソームレプリコンが骨格配列及びドナー核酸配列を含み、
前記ドナー核酸配列が、５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を順に含み、
骨格配列が、相同組換え配列１の隣に位置する第１の切除部位及び相同組換え配列２の隣に位置する第２の切除部位を含み、
前記宿主細胞が標的核酸をさらに含む、前記ステップ、
ｂ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
ｃ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｄ）前記第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び前記第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、第１及び第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ、
ｅ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、並びに
ｆ）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間で組換えを起こさせるステップ
を含む、前記方法が提供される。

【0008】

ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼであり得、第１のＲＮＡ分子は第１の切除部位に特異的なスペーサーを含み得、そして第２のＲＮＡ分子は第２の切除部位に特異的なスペーサーを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９であり得る。第１のＲＮＡ分子及び／又は第２のＲＮＡ分子は、エピソームレプリコンによってコードされていてよい。

【0009】

一実施形態では、切除された核酸の各末端は、骨格配列に由来する核酸配列を含む。切除されたドナー核酸は、各末端で、骨格配列に由来する核酸配列の６つ又は５つ以下の塩基対を含み得る。

【0010】

一実施形態では、エピソームレプリコンは細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome）である。エピソームレプリコンは、接合伝達によって宿主細胞に送達され得る。

【0011】

標的核酸は、宿主細胞のゲノムであり得る。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）であり得る。

【0012】

本発明の一態様では、核酸配列をアセンブルする方法であって、
（ｉ）本発明の、所望の配列を標的核酸に導入する方法のステップを行って、第１のドナー核酸配列を第１の標的核酸に導入し、それによって第２の標的核酸を作製するステップ、及び
（ii）本発明の、所望の配列を標的核酸に導入する方法のステップを行って、第２のドナー核酸配列を第２の標的核酸に導入し、それによって第３の標的核酸を作製するステップ
を含む方法が提供される。パート（ｉ）及びパート（ii）は繰り返してもよい。

【0013】

一実施形態では、パート（ｉ）のための第１のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一であり、及び／又は、パート（ｉ）のための第２のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一であり、パート（ii）のための第１のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一であり、及び／又はパート（ii）のための第２のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一である。

【0014】

一実施形態では、本方法は、
（iii）本発明の、所望の配列を標的核酸に導入する方法のステップを行って、第３のドナー核酸配列を第３の標的核酸に導入し、それによって第４の標的核酸を作製するステップ、
パート（ｉ）、（ii）、及び（iii）を繰り返すステップ
をさらに含み、
パート（iii）のための第１のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一であり、及び／又はパート（iii）のための第２のＲＮＡ分子の配列は各繰り返しで同一である。

【0015】

特定の実施形態では、パート（ｉ）は、第１の骨格配列を含む、ドナー核酸配列をコードするエピソームレプリコンの使用を含み、またパート（ii）は、第２の骨格配列を含む、ドナー核酸配列をコードするエピソームレプリコンの使用を含み、
第１の骨格配列は、第１のマーカー又はマーカーセットを含み、前記第１の骨格配列内の第１の切除部位に特異的な第１のＲＮＡ分子をコードし、並びに、前記第１の骨格配列内の第２の切除部位に特異的な第２のＲＮＡ分子をコードし、
第２の骨格配列は、第２のマーカー又はマーカーセットを含み、前記第２の骨格配列内の第１の切除部位に特異的な第１のＲＮＡ分子をコードし、並びに、前記第２の骨格配列内の第２の切除部位に特異的な第２のＲＮＡ分子をコードし、
第１のマーカー又はマーカーセットは、第２のマーカー又はマーカーセットと異なる。

【0016】

本発明のさらなる態様では、エピソームレプリコンを構築するための方法であって、
ａ）ドナーエピソームレプリコンを提供するステップであって、前記レプリコンが、
ユニバーサルスペーサー配列を含む骨格、
組み込みステップｎに特異的な第１の相同性領域ＨＲｎ、及び第２のユニバーサルな相同性領域ｕＨＲ、
ＨＲｎの隣に位置する第１の切除部位及びｕＨＲの隣に位置する第２の切除部位、
ＨＲｎとｕＨＲとの間に位置するドナー核酸ＤＮＡｎ、並びに
ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセット
を含む、前記ステップ、
ｂ）ＨＲｎ及びｕＨＲが隣接する、ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセットを含む、アセンブリエピソームレプリコンを含む、宿主細胞を提供するステップであって、アセンブリレプリコン内のダブルセレクションカセットが、ドナーレプリコン内のセレクションカセットと異なるマーカーを含む、前記ステップ、
ｃ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
ｄ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｅ）第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、第１及び第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ、
ｆ）宿主細胞において、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎの切除を誘導するステップ、並びに
ｇ）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記アセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、核酸ＤＮＡｎを含む第２のアセンブリレプリコンを形成するステップ
を含む、前記方法が提供される。

【0017】

ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼであり得、第１のＲＮＡ分子は第１の切除部位に特異的なスペーサーを含み得、また、第２のＲＮＡ分子は第２の切除部位に特異的なスペーサーを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９であり得る。第１のＲＮＡ分子及び／又は第２のＲＮＡ分子は、エピソームレプリコンによってコードされていてよい。

【0018】

一実施形態では、切除された核酸の各末端は、骨格配列に由来する核酸配列を含む。切除されたドナー核酸は、各末端で、骨格配列に由来する核酸配列の１２個、１０個、８つ、６つ、４つ、又は２つの塩基対を含み得る。好ましくは、切除されたドナー核酸は、各末端で、骨格配列に由来する核酸配列の６又は５以下の塩基対を含む。

【0019】

一実施形態では、エピソームレプリコンは細菌人工染色体である。エピソームレプリコンは、接合伝達によって宿主細胞に送達され得る。

【0020】

本発明の好ましい態様では、ドナーエピソームレプリコンはドナー宿主細胞内に含まれ、細胞アセンブリレプリコンはレシピエント宿主細胞内に含まれる。ドナー宿主細胞とレシピエント宿主細胞との間の接合で、ドナーエピソームレプリコンがレシピエント宿主細胞に有利に伝達され得る。ドナー宿主細胞は、好ましくは、伝達不可能なＦ’プラスミドを含み、その結果、Ｆ’プラスミドはレシピエント宿主細胞に伝達されない。好ましくは、Ｆ’プラスミドは、ｏｒｉＴの欠失によって伝達不可能となっている。ドナーエピソームは伝達可能であり、ｏｒｉＴを有し得る。

【0021】

宿主細胞の選択は、組み換えられたドナーに存在するポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカー並びにアセンブリレプリコンＤＮＡを利用することを除いて、記載されているように行うことができる。

【0022】

標的核酸は、宿主細胞のゲノムであり得る。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌であり得る。

【0023】

一実施形態では、ドナー核酸は相同性領域ＨＲｎ＋１を含み、本方法は、ドナー核酸ＤＮＡｎ＋１を含むさらなるドナーエピソームレプリコンを宿主細胞に導入するさらなるステップ（ｈ）、及び宿主細胞における、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎ＋１の切除を誘導するステップ、及びインキュベートを行って、切除されたドナー核酸ＤＮＡｎ＋１と前記第２のアセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、核酸ＤＮＡｎ及び核酸ＤＮＡｎ＋１を含む第３のアセンブリレプリコンを形成するステップをさらに含む。

【0024】

前記方法ステップは、繰り返し反復することができる。

【0025】

本発明のこの態様で提供されるレプリコンは、核酸配列をアセンブルする方法を記載している前述の態様で使用してもよい。

【0026】

本発明の全ての態様の有利な実施形態では、宿主細胞は、コンピテントなｒｅｃＡ及び／又はｒｅｃＯを欠いている。好ましくは、宿主細胞は、ｒｅｃＡを欠いている（ΔｒｅｃＡ）。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】相同性領域（ＨＲ、homology region）に特異的なスペーサーを使用する、大腸菌ゲノムへの約１００ｋｂの合成ＤＮＡのＲＥＸＥＲ介在性の組み込みにおけるステップ、及びＨＲ特異的なスペーサーによって指向される切断とユニバーサルスペーサーによって指向される切断との間の関係を示す図である。ａ：ＲＥＸＥＲは、ゲノムＤＮＡの置き換え（本明細書で示される）を介するか又はゲノムへの挿入による、ゲノム内への１００ｋｂを超える合成ＤＮＡ（ピンク）の組み込みを可能にする。所望の合成ＤＮＡを有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）が、適切にマークされたゲノムを有するコンピテント細胞にエレクトロポレーションされ、この細胞もまた、Ｃａｓ９タンパク質及びラムダレッド組換え成分をコードするヘルパープラスミドを有する。細胞は次いで、アラビノースで、ヘルパープラスミド遺伝子を発現するように誘導され、再びエレクトロコンピテント化される。ＨＲ特異的なスペーサーアレイ（示されているようにプラスミドベースであるか、又は直鎖状ＤＮＡとしての）が次いで、細胞にエレクトロポレーションされ、その結果、ＢＡＣからの、ダブルセレクションカセットとゲノムに対するＨＲとが隣接する合成ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性のインビボ切除が生じる。ラムダレッド組換え機構は次に、ＨＲを使用して、ゲノム内への切除されたＤＮＡの組み込みを指向する。三角は、合成ＤＮＡに隣接するＨＲ（灰色の四角）にあるＣａｓ９切断部位を示す。＋１、青はｋａｎ^Ｒであり、－１、黄色はｒｐｓＬであり、＋２、緑はｃａｔであり、－２、ピンクはｓａｃＢであり、＋３、暗い青はｔｅｔ^Ｒであり、－３、紫はｐｈｅＳ^＊であり、＋４、オレンジはａｍｐ^Ｒである。ｂ：これまでに、本発明者らは、組換え対象の遺伝子座に隣接する各ＨＲに特異的なスペーサーＲＮＡを設計した。合成ＤＮＡインサートに隣接するＢＡＣ配列は、一定のＰＡＭ配列（黒の四角）を有する。ＨＲ特異的なスペーサーＲＮＡを伴うＣａｓ９を指向させることで、ＨＲ１及びＨＲ２の末端での合成ＤＮＡの正確な切除が可能となる。ｃ：ユニバーサルスペーサーＲＮＡは、Ｃａｓ９をＢＡＣ骨格の定常配列に向かわせる。ＲＥＸＥＲ遺伝子座に依存しない、あらゆるＢＡＣのためのユニバーサル切断部位を作成するために、Ｃａｓ９は、ＨＲのすぐ隣にあるＰＡＭ配列に向けられる。これは、切除されたＤＮＡ断片の両端に、追加の６ｂｐの非相同配列を付加する。

【図2-1】～

【図2-3】ユニバーサルスペーサーでのＲＥＸＥＲが大きな合成ＤＮＡ断片のスカーレスな(scarless)ゲノム組み込みをもたらすことを示す図である。ａ：大腸菌ゲノムの全合成に使用したＢＡＣ骨格。奇数ＢＡＣ及び偶数ＢＡＣと呼ばれる２つのＢＡＣは、異なるポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセットを有し、これによってＲＥＸＥＲが繰り返される。本発明者らは、全て奇数のＢＡＣのためのユニバーサル１スペーサー及び全て偶数のＢＡＣのためのユニバーサル２スペーサーを設計した（表３、並びに配列番号２４及び２５）。１つのユニバーサルスペーサーＲＮＡ（青）は、ＢＡＣ骨格内の配列を５’からインサートまで標的化する。この配列は両骨格で共通である。ユニバーサルスペーサーＲＮＡは、ＢＡＣ骨格を３’からインサートまで標的化する。これらの３’配列は２つの骨格で異なり、したがって、２つの異なるスペーサー配列（それぞれ黄色及び赤）を設計した。切断部位は色の付いた三角形で示されており、ＰＡＭ配列は黒の四角で示されており、セレクションカセットは色の付いた矢印で示されており、そして合成ＤＮＡはピンクで示されている。ｂ：５つの遺伝子座での、ユニバーサルスペーサーを使用するＲＥＸＥＲの後の５’及び３’ゲノム組み込み部位のゲノタイピングによる検証。５’遺伝子座では、ＲＥＸＥＲによる置き換えが成功すると、ダブルセレクションカセットがゲノムから除去され、一方で別のダブルセレクションカセットが３’遺伝子座に挿入される。１１のＲＥＸＥＲ後のクローンを各実験でゲノタイピングした。三角形は、ＲＥＸＥＲの前（白）及び後（黒）の、各遺伝子座での予想されるＰＣＲ産物のサイズを示す。ｃ：ユニバーサルスペーサーＲＮＡを使用するＲＥＸＥＲの後の組み込み部位の末端の配列検証。ＨＲ及び６ｂｐの非相同配列（傾いている箇所）が隣接する切除された合成ＤＮＡが、スカーレスな（傷のない）組み込みが期待される配列の上に示されている。５つのＲＥＸＥＲ後のクローンを各実験でシーケンシングした。本発明者らは、いずれのクローンでも非相同末端の組み込みを観察せず、また、いかなる点変異も現れなかった。色の付いた三角形は、パネルａに記載されているそれぞれのスペーサー配列によるＣａｓ９切断部位を示している。ｄ：ＨＲ特異的なスペーサー及びユニバーサルスペーサーをそれぞれ用いるＲＥＸＥＲのリコードの状況をまとめたものである。本発明者らは、ＲＥＸＥＲを行って、９５．６ｋｂの野生型ゲノムＤＮＡを合成ＤＮＡ（１００ｋ２４）で置き換えた。合成ＤＮＡは、４１０のコドンが同義コドンで置き換えられていることを除いて、対応するゲノムＤＮＡに大部分が相同である（非特許文献１４）。Ｃａｓ９切断を、ＨＲ特異的なスペーサーＲＮＡ又はユニバーサルスペーサーＲＮＡで開始した。１０個のＲＥＸＥＲ後のクローンを各実験でＮＧＳによって完全にシーケンシングした（２つの独立した反復実験から全部で２０個）。リコードの状況をまとめたグラフは、各リコードされたコドンが遺伝子座の全体で組み込まれた平均頻度を示している。全体として、ユニバーサルスペーサーＲＮＡを用いたＲＥＸＥＲでは、４１０のコドンの全てが完全に置き換えられた８つのクローンが得られ、一方、ＨＲ特異的なスペーサーＲＮＡを用いたＲＥＸＥＲでは、この領域で４つの完全にリコードされたクローンが得られた（図５の個々のクローンのリコードの状況）。

【図3】強化型組換え（ＣＯＮＥＸＥＲ、Conjugaion coupled with programmed excision for enhanced recombination）のためのプログラムされた切除と組み合わされた接合を示す図である。エピソーム伝達と、ユニバーサルスペーサーでの合成ＤＮＡの切除と、相同性によって導かれる組換えとの組み合わせによって、大規模なゲノム改変及びゲノム合成のための迅速で、単純で、標準化された方法が得られる。ａ：ユニバーサルスペーサーアレイ（灰色のバー）及びｏｒｉＴ配列（赤の矢印）を有するＢＡＣが、伝達不可能なＦ’プラスミドを利用して、接合伝達を介して１時間にわたり、ドナー細胞からレシピエント細胞に伝達される。レシピエント細胞は、ヘルパープラスミド、及び適切にマークされたゲノムを有している（ＲＥＸＥＲにおけるように）。ＢＡＣを得たレシピエント細胞が次いで選択され、＋３及び＋１の両方についての選択によってドナー細胞が除去される（Ｃａｓ９及びラムダレッド成分を誘導するためにアラビノースで１．５時間、その後、さらなる発現を停止させるためにグルコースで２．５時間）。－２の喪失についてさらに選択することによって、合成ＤＮＡでのゲノムＤＮＡの置き換えが次いで選択される。－３の喪失の選択は、ＢＡＣ骨格の喪失を確実にする。セレクタブルマーカーは、＋１、青、ｋａｎ^Ｒ；－１、黄色、ｒｐｓＬ；＋２、緑、ｃａｔ；－２、ピンク、ｓａｃＢ；＋３、暗い青、ｔｅｔ^Ｒ；－３、紫、ｐｈｅＳ^＊である。ｂ：１００ｋ２４を用いるＣＯＮＥＸＥＲで得られた８４個のクローンのリコードの状況をまとめたものである（図２ｄに類似）。

【図4】ゲノムマップを示す図である。

【図5-1】～

【図5-4】ＨＲ特異的なスペーサー及びユニバーサルスペーサーをそれぞれ用いたＲＥＸＥＲのリコードの状況をまとめた図である。個々のクローンのリコードの状況が示されている。

【図6-1】～

【図6-2】ＢＡＣの段階的挿入合成（ＢＡＳＩＳ、BAC Stepwise Insertion Synthesis）を示す図である。ＢＡＣ内での大きなＤＮＡの繰り返しアセンブリのための、ＢＡＣの段階的挿入合成（ＢＡＳＩＳ）。ａ：ドナーＢＡＣは、レシピエントＢＡＣに相同なＨＲｎ及びｕＨＲを有する。ＢＡＣ骨格は、ｏｒｉＴ及びユニバーサルスペーサーを有する。ｕＨＲは、挿入の全ステップでのユニバーサル相同性領域である。ＨＲｎは、挿入のｎ番目のステップに特異的である。ＢＡＣインサートはＨＲｎ＋１を有しており、これは、（ｎ＋１）番目のステップでのＨＲｎとして機能する。ＢＡＣは、示されているダブルセレクションカセット、－３、＋３を有している。アセンブリＢＡＣは、ＨＲｎ及びｕＨＲが隣接する、示されている異なるダブルセレクションカセット、－１、＋１を有している。このＤＮＡインサートはドナーＢＡＣから切除され、レシピエント細胞のアセンブリＢＡＣに挿入される。緑の三角形は、Ｃａｓ９切除のための切断部位を示している。本明細書では、ＨＲｎはＨＲ１と記載されていることに留意されたい。示されている例では、セレクタブルマーカーは、＋１、青、ｋａｎＲ；－１、黄色、ｒｐｓＬ；＋３、紫、ｈｙｇｒｏＲ；－２、オレンジ、ＰｈｅＳ；＋４、ペトロール、ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＲである。ｂ：ＢＡＳＩＳのワークフロー。ドナーＢＡＣは、接合によって、アセンブリＢＡＣを有しＣａｓ９及びラムダレッド成分を発現するレシピエント細胞に送達される。（ａ）に示したように、インサートはドナーＢＡＣから切除され、レシピエントＢＡＣに挿入される。交互のマーカーセットを使用するこのプロセスの繰り返しによって、ｎ個のＤＮＡ断片をアセンブリＢＡＣに挿入することが可能となる。ｃ：ＣＦＴＲ遺伝子のセグメントをコードする３つのＢＡＣを酵母内でアセンブルした。完全なＣＦＴＲ遺伝子配列を、繰り返しＢＡＳＩＳを介して再構成し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ、next generation sequencing）によって検証した。ｄ：２１番染色体の示された領域をカバーするヒトＢＡＣを、次に続くアセンブリのための基質として利用した。中間アセンブリ産物及び最終アセンブリ産物をＮＧＳによって検証した。最終的な５０３ＫｂｐのＢＡＣは、４９５ＫｂｐのヒトＤＮＡインサートを有していた。このＢＡＣは、さらなる繰り返し挿入のための基質として機能し得、そのため、はるかに長いヒトＤＮＡをエピソーム内でアセンブルすることを可能にする。

【図7】宿主ゲノムからのｒｅｃＡの欠失が、ＣＯＮＥＸＥＲ介在性のゲノム置き換えにおける完全にリコードされたクローンの頻度を増大させることを示す図である。ａ：ゲノム断片１００ｋ２４のＣＯＮＥＸＥＲ介在性の置き換えにおける、完全にリコードされたクローンの頻度の増大についてのＫＯ株のスクリーニングは、ｒｅｃＡ及びｒｅｃＯの欠失が合成ＤＮＡのインタクトな組み込みを改善することを明らかにしている。ｂ：ｒｅｃＡが欠失すると、ＣＯＮＥＸＥＲ介在性のゲノム置き換えの後の完全にリコードされたクローンの頻度は、全ての試験した断片（１００ｋ２４～１００ｋ２８）で増大している。これらの実験で記録されたコロニー形成単位（ＣＦＵ、Colony forming units）を図９に示す。

【図8】連続的なゲノム合成を示す図である。ａ：接合送達されエピソーム切除された合成ＤＮＡは、適切にマークされたゲノム（ＬＳ２３にある－２／＋２）の大きな断片（１００ｋ２４）を置き換えることにより組み換えられる。選択によって、－２／＋２（ＬＳ２３にある）を喪失し－１／＋１（ＬＳ２４にある）を組み込んだ細胞のみが生存することが確実になる。選択で得られたクローンをプールし、これに、次のラウンドの、ＣＯＮＥＸＥＲ介在性のゲノム置き換えを行った（１００ｋ２５）。選択によって、－１／＋１（ＬＳ２４にある）を喪失し－２／＋２（ＬＳ２５にある）を組み込んだ細胞のみが生存することが確実になる。このプロセスを、－１／＋１（ＬＳ２８にある）を有する細胞の集団が得られるまでさらに３回（１００ｋ２６、１００ｋ２７、及び１００ｋ２８）、全部で５回反復した。これらの細胞のサブセットは、５００Ｋｂｐの領域全体にわたって、連続的に組み込まれた合成ＤＮＡを有すると予想される。セレクタブルマーカーは、＋１、青、ｋａｎＲ；－１、黄色、ｒｐｓＬ；＋２、緑、ｃａｔ；－２、ピンク、ｓａｃＢである。ｂ：１００ｋ２４～１００ｋ２８の連続的ゲノム合成から得られた１８２のクローンのリコードの状況をまとめたものである。１８２個のシーケンシングされたクローンのうち１９個が、５００Ｋｂｐのゲノムセクション全体にわたって完全にリコードされていた。

【図9】異なるゲノムバックグラウンドでの、ＣＯＮＥＸＥＲ介在性のゲノム置き換えのためのコロニー形成単位を示す図である。ゲノムセクション１００ｋ２４のＣＯＮＥＸＥＲ介在性の置き換えでのＫＯ株のスクリーニング。各実験で得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）が示されている。ｒｅｃＡの欠失はＣＦＵの低減をもたらす。

【図10】５００Ｋｂｐの大腸菌ゲノムの連続的な合成を示す図である。合成ＤＮＡでの１００Ｋｂｐのゲノムセクションの接合強化型の置き換えは、連続的ゲノム合成を可能にする（図５）。エピソーム切除された合成ＤＮＡは、適切にマークされたゲノム（ＬＳ２３にある－２／＋２）の大きなセクション（１００ｋ２４）を置き換えることにより組み換えられる。選択によって、－２／＋２（ＬＳ２３にある）を喪失し－１／＋１（ＬＳ２４にある）を組み込んだ細胞のみが生存することが確実になる。選択で得られたクローンをプールし、これに、次のラウンドの、ＣＯＮＥＸＥＲ介在性のゲノム置き換えを行った（１００ｋ２５）。選択によって、－１／＋１（ＬＳ２４にある）を喪失し－２／＋２（ＬＳ２５にある）を組み込んだ細胞のみが生存することが確実になる。このプロセスを、－１／＋１（ＬＳ２８にある）を有する細胞の集団が得られるまでさらに３回繰り返した（１００ｋ２６、１００ｋ２７、及び１００ｋ２８）。これらの細胞のサブセットは、５００Ｋｂｐの領域全体にわたって、連続的に組み込まれた合成ＤＮＡを有すると予想される。セレクタブルマーカーは、＋１、青、ｋａｎ^Ｒ；－１、黄色、ｒｐｓＬ；＋２、緑、ｃａｔ；－２、ピンク、ｓａｃＢである。ＣＯＮＥＸＥＲによる１００Ｋｂｐを超える合成ＤＮＡの組み込みの各ステップは２日間を要する。５００Ｋｂｐの連続的な合成は、したがって、１０日間で行うことができる。

【発明を実施するための形態】

【0028】

先行技術で開示されている方法、例えばＲＥＸＥＲには、標的化されている各遺伝子座についてクローニングされるべき相同性領域（ＨＲ）特異的なスペーサーの新たなセットが必要である。これらのスペーサーはクローニングが困難であり得、スペーサーのクローニングは、高価で時間のかかるものであり得る。例えば、最近の大腸菌ゲノム合成では、７８個の固有のスペーサーのクローニングが必要であった。新たなスペーサーセットの各々は、標的核酸の望ましくない切断を避けるように設計されなくてはならない。加えて、スペーサー配列の変化は切除効率に影響し得、これは、異なる遺伝子座でのＲＥＸＥＲの効率の違いの原因であり得る。ＨＲ特異的なスペーサーＲＮＡが必要であることはワークフローを複雑にし、ＲＥＸＥＲのスケーラビリティーを制限し得る。

【0029】

本発明者らは、インサートではなく、エピソームレプリコン骨格内の配列が、エピソームレプリコンからのインサートの切除を指向する（direct）ために使用され得るとすれば、同一のスペーサー対、すなわち「ユニバーサルスペーサー」を使用して、所与のエピソームレプリコン骨格を用いて任意の標的遺伝子座でＲＥＸＥＲを行うことができると仮説を立てた。これは、標的核酸、例えば大腸菌ゲノムへの合成ＤＮＡの導入を大幅に単純化し、大規模ゲノム改変及び全ゲノム合成のための短時間の方法を可能にする。しかし、これまでの方法は、Ｃａｓ９のためのスペーサーを使用しており、これは、これらスペーサーがインサート内で特異的に結合していない限り、エピソームレプリコン骨格とインサートとの間の連結の正確な切断を指向することができない。実際、骨格内で結合し、骨格とインサートとの間の連結からの切断部位の距離を最小にする、スペーサーの配置は、各末端での骨格の６つの塩基対が隣接しているインサートの切除をもたらす（図１ｃ）。これらの６ｂｐの配列は、インサートに相補的な領域に隣接する標的核酸の領域に対して共通して相同ではない。したがって、ユニバーサルスペーサーを使用したＲＥＸＥＲの誘導体が機能するかどうか、及びそれが望ましくない挿入又は欠失をもたらすかどうかは不明であった。

【0030】

本明細書で示されるように、本発明者らは、ユニバーサルスペーサーを提供し、これらのスペーサーが標的核酸内への合成ＤＮＡのスカーレスな組み込みに使用され得ることを実証している。さらに、本発明者らは、１００ｋｂの合成ＤＮＡを細胞のゲノムに１日で導入することができる、ゲノムＤＮＡを合成ＤＮＡで置き換えるための短時間のプロトコルを開発している。このアプローチは、（Wang et al.（Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding, Nature 2016 November 03; 539(7627):59-64, doi:10.1038/nature20124）及び国際公開第２０１８／０２０２４８号パンフレット（これらの各々は参照によって組み込まれる）で開示されているＲＥＸＥＲアプローチに基づいている。実施例では、本発明者らは、ＲＥＸＥＲベースの全ゲノム合成に使用する２つのＢＡＣ骨格のためのユニバーサルスペーサーを開発している。

【0031】

これらの実験は、切除された合成ＤＮＡ上の短い非相同末端の存在が組換え及び組み込み効率を妨げず、スカーレスな組み込みが依然として達成されることを明らかにしている。特定の理論には拘束されないが、本発明者らは、ＢＡＣ内のＤＮＡの非相同末端が、真核生物のＦＥＮ１について記載されているメカニズムと同様に、組換えの前にエキソヌクレアーゼによって、又は組換えの最中にEcoIXなどのフラップエンドヌクレアーゼによって除去され得ることを示唆している。したがって、本発明者らは、切断部位が厳密にドナー核酸とエピソームレプリコンの骨格との間の連結にある必要はないことを発見した。

【0032】

この発見は重要であり、それは、実際の切断部位の両側に隣接する配列の認識が、ＲＮＡによってガイドされる多くのＤＮＡエンドヌクレアーゼの要件であるためである。したがって、正確に連結で切断するために、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼが、エピソームレプリコンの骨格の部分及びドナー核酸の部分を認識することが必要である。本発明者らは驚くべきことに、切除されたドナー核酸が組換えに影響することなく骨格配列の領域を許容し得ることを発見したが、このことは、「切除部位」、すなわち、実際の切断部位及び所要のフランキング配列の組み合わせの全体が骨格配列内に位置することを可能にする。したがって、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼが、方法のラウンド間で変化するドナー核酸配列のいずれをも認識する必要がないため、プロセスの複雑性が低減する。

【0033】

したがって、本発明の一実施形態では、所望の配列を標的核酸に導入する方法であって、
ａ）宿主細胞を提供するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、
前記エピソームレプリコンが骨格配列及びドナー核酸配列を含み、
前記ドナー核酸配列が、５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を順に含み、
骨格配列が、相同組換え配列１の隣に位置する第１の切除部位及び相同組換え配列２の隣に位置する第２の切除部位を含み、
前記宿主細胞が標的核酸をさらに含む、前記ステップ、
ｂ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
ｃ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｄ）前記第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び前記第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、第１及び第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ
ｅ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、並びに
ｆ）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間で組換えを起こすステップ
を含む、前記方法が提供される。

【0034】

ステップａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）は順に行われる必要はなく、また、別々のステップとして行われる必要もない。例えば、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼは、前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質が提供される前に提供されてよい。エンドヌクレアーゼ及び関連するＲＮＡは、個別に、異なる時点で、及び任意の順序で提供することができる。しかし、切除に必要な全ての成分、例えばエンドヌクレアーゼ及び関連するＲＮＡは、切除の誘導の前に提供される。加えて、核酸の組換えを補助し得る全てのヘルパータンパク質は、組換えを行わせるためのインキュベーションの前に提供される。ステップａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）は、同時に行ってよい。

【0035】

エピソームレプリコンは骨格配列及びドナー核酸配列を含み、骨格配列はドナー核酸配列とオーバーラップしていない。したがって、定常な骨格配列は、複数の異なるドナー核酸配列の導入に使用することができる。本発明の方法を繰り返すことによって複数のドナー核酸が標的に導入される実施形態では、２つ以上のタイプの骨格配列が使用され得る。例えば、異なるマーカー、例えばセレクションマーカーを含む骨格が使用され得、その結果、所望の配列の成功裏の導入が各ステップで同定され得る。

【0036】

第１及び第２の切除部位は、エピソームレプリコンを切断して、ドナー核酸配列を切除することを可能にする。切除部位は、エンドヌクレアーゼによる認識及び切断に必要な全ての核酸配列を提供し、したがって、切断を生じさせるために、相同組換え配列１又は相同組換え配列２のどの部分も認識されることはない。このことは先行技術（図１ｂ）と対照的であり、先行技術では、相同組換え配列１及び相同組換え配列２が、切断を可能にするために認識される配列を提供している。

【0037】

切除部位は、ドナー核酸の相同組換え配列に隣接している。好ましくは、各切除部位は相同組換え配列と連続している。このような実施形態では、切除に必要な配列と相同組換え配列との間に塩基対は存在しない。他の実施形態では、１、２、３、又は４塩基対の介在配列が許容され得る。

【0038】

エピソームレプリコンが切断される部位と相同組換え配列との間のいずれの骨格配列も、切除された核酸の一部として存在する。したがって、切除された核酸は、骨格配列の第１の部分、ドナー核酸、及び骨格配列の第２の部分を含み得る。したがって、一実施形態では、切除された核酸の各末端は、骨格配列に由来する核酸配列を含む。

【0039】

骨格配列の第１の部分及び第２の部分は、１０、９、８、７、６、又は５以下の塩基対長であり得る。特定の実施形態では、骨格配列の第１及び／又は第２の部分は、６塩基対長である。この実施形態は、切断が、３塩基対のＰＡＭの３塩基対上流を切断し得るＣａｓ９によって行われる場合に、特に関連する。

【0040】

本発明の方法は、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼに第１の切除部位を認識させることに寄与する第１のＲＮＡ分子、及びＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼに第２の切除部位を認識させることに寄与する第２のＲＮＡ分子の提供を含む。第１及び第２のＲＮＡ分子は、全体が骨格配列内に含まれるエピソームレプリコンの領域に特異的である。第１及び第２のＲＮＡ分子は、ドナー核酸配列内の配列も相同組換え配列内の配列も認識しない。第１及び第２のＲＮＡ分子は、同一の配列のものであっても、異なる配列のものであってもよい。

【0041】

ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼである。このような実施形態では、第１のＲＮＡ分子は、第１の切除部位に特異的なスペーサーを含み得、第２のＲＮＡ分子は、第２の切除部位に特異的なスペーサーを含み得る。本明細書で論じられる通り、第１及び第２のＲＮＡ分子のスペーサーは、全体が骨格配列内に含まれるエピソームレプリコンの領域に特異的である。スペーサーがそれに対して特異的であるエピソームレプリコンの領域は、プロトスペーサーと呼ぶことができる。したがって、第１の切除部位は、第１のＲＮＡ分子のスペーサーと同族のプロトスペーサー全体を含み、第２の切除部位は、第２のＲＮＡ分子のスペーサーと同族のプロトスペーサー全体を含む。第１及び第２のＲＮＡ分子のスペーサーは、ドナー核酸配列内の配列も相同組換え配列内の配列も認識しない。第１及び第２のＲＮＡ分子のスペーサーは、同一の配列のものであっても、異なる配列のものであってもよい。

【0042】

したがって、切断がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによって行われる実施形態では、切除部位は、スペーサーＲＮＡと同族のプロトスペーサーを含む。切除部位はまた、ＰＡＭも含む。

【0043】

特定の実施形態では、第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は、エピソームレプリコンによってコードされ、骨格配列の一部である。ＲＥＸＥＲでは、ＲＮＡ分子は、ドナー核酸配列の相同領域に特異的なスペーサーをコードするが、スペーサー配列は導入対象のドナー核酸配列に応じて変化する必要があるため、スペーサーは、エピソームレプリコンの骨格によってコードされていてはならない。本発明はそのようには限定されておらず、したがって、本方法は、切除を指向するためのＲＮＡ分子がドナー核酸配列も含むエピソームレプリコンによってコードされ得るため、短時間になり得る。このことは、関連するスペーサーが各骨格によって直接コードされ得るため、２以上のタイプの骨格配列が使用される繰り返し方法にとって特に有利である。

【0044】

一部の実施形態では、核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質、並びに／又は、第１及び／若しくは第２の切除部位を切断し得る少なくとも１つのエンドヌクレアーゼは、エピソームレプリコン上でコードされる。一部の実施形態では、核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質、並びに／又は、第１及び／若しくは第２の切除部位を切断し得る少なくとも１つのエンドヌクレアーゼは、個別のエピソームレプリコン、例えばプラスミド上でコードされる。この個別のエピソームレプリコンは、ヘルパーエピソームレプリコン又はヘルパープラスミドとして公知であり得る。

【0045】

特定の実施形態では、方法であって、
１）宿主細胞を提供するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコン、例えばＢＡＣを含み、
前記エピソームレプリコンが骨格配列及びドナー核酸配列を含み、
前記ドナー核酸配列が、５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を順に含み、
骨格配列が、相同組換え配列１の隣に位置する第１の切除部位及び相同組換え配列２の隣に位置する第２の切除部位を含み、第１の切除部位が第１のプロトスペーサーを含み、第２の切除部位が第２のプロトスペーサーを含み、
前記宿主細胞が標的核酸、例えば宿主細胞のゲノムをさらに含む、前記ステップ、
２）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
３）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼを提供するステップ、
４）第１のプロトスペーサーに特異的なスペーサーを含む第１のＲＮＡ分子、及び第２のプロトスペーサーに特異的なスペーサーを含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップ、
５）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、並びに
６）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間で組換えを起こすステップ
を含む方法が提供される。

【0046】

ステップ１）、２）、３）、及び４）は順に行われる必要はなく、また、別々のステップとして行われる必要もない。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質が提供される前に提供されてよい。加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ並びに第１及び第２のＲＮＡ分子は、個別に、異なる時点で、及び任意の順序で提供することができる。しかし、切除に必要な全ての成分は、切除の誘導の前に提供される。加えて、核酸の組換えを補助し得る全てのヘルパータンパク質は、組換えを行わせるためのインキュベーションの前に提供される。ステップ１）、２）、３）、及び４）は、同時に行ってよい。

【0047】

エピソームレプリコンは、接合によって宿主細胞に提供され得る。したがって、本方法は、接合伝達によってエピソームレプリコンを宿主細胞に送達するステップをさらに含み得る。エピソームレプリコン、例えばＢＡＣは、伝達のためのドナー細胞に含まれていてよい。エピソームレプリコンは、伝達開始点（ｏｒｉＴ）を含み得る。ドナー細胞は、伝達不可能なＦ’プラスミドを含み得る。

【0048】

本発明の方法は、大きな合成核酸配列をアセンブルするための繰り返しに特に適している。例えば、人工ゲノムの構築のためである。したがって、本発明の一態様では、核酸配列をアセンブルする方法であって、
（ｉ）本発明の任意の方法のステップを行って、第１のドナー核酸配列を第１の標的核酸に導入して、第２の標的核酸を作製する工程、及び
（ii）本発明の任意の方法のステップを行って、第２のドナー核酸配列を第２の標的核酸に導入して、第３の標的核酸を作製する工程
を含む方法が提供される。

【0049】

パート（ｉ）及び（ii）は複数回繰り返してもよい。これによって、第１のドナー核酸、第２のドナー核酸、第３のドナー核酸、及び潜在的にさらなるドナー核酸の導入が可能となる。この技術が繰り返されると、本発明の方法の１ラウンドの産物が次のラウンドの核酸導入のための標的核酸配列として機能し得る。

【0050】

第１のＲＮＡ分子は、本発明の方法の各繰り返しの間、同一の配列のものであり得、及び／又は、第２のＲＮＡ分子は、本発明の方法の各繰り返しの間、同一の配列のものであり得る。或いは、第１のＲＮＡ分子対及び第２のＲＮＡ分子対は、本発明の繰り返しの間、交互の様式で使用され得、その結果、第１の対は全ての奇数の繰り返しに使用され、第２の対は全ての偶数の繰り返しに使用される。第１のＲＮＡ分子対は、第２のＲＮＡ分子対と同一の配列のものであってよい。第１のＲＮＡ分子対は、第２の対にあるＲＮＡ分子と同一の１つのＲＮＡ分子と、第２の対にあるＲＮＡ分子と配列が異なる１つのＲＮＡ分子とを含んでいてよい。第１のＲＮＡ分子対は各々、第２の対のＲＮＡ分子の各々と配列が異なっていてよい。

【0051】

他の実施形態では、さらなるＲＮＡ分子対、例えば第３の対が、繰り返しのパターンの一環として使用され得る。したがって、本方法は、パート（ｉ）、（ii）、及び（iii）を繰り返すステップであって、パート（iii）が、本発明の任意の方法のステップを行って、第３のドナー核酸配列を第３の標的核酸に導入し、それによって第４の標的核酸を作製する工程を含み、パート（iii）が、第３のＲＮＡ分子対の使用を含む、ステップをさらに含み得る。このパターンは必要に応じて延長してもよい。

【0052】

エピソームレプリコンの骨格配列は、パート（ｉ）の間及びパート（ii）の間で異なっていてよい。例えば、エピソームレプリコンは、所望の配列の成功裏の導入の同定又は選択を可能にするための１つ又は複数のマーカーを含み得る。同定又は選択を含む核酸導入のラウンドを可能にするために、パート（ｉ）のエピソームレプリコンは第１のマーカー又はマーカーセットを含み得、パート（ii）のエピソームレプリコンは第２のマーカー又はマーカーセットを含み得る。パート（ｉ）及び（ii）が繰り返される実施形態では、これは、第１のマーカー又はマーカーセットが全ての奇数の選択に使用され、第２のマーカー又はマーカーセットが全ての偶数の選択に使用されることを意味し得る。他の実施形態では、さらなるマーカー、例えば第３のマーカー又はマーカーセットが、繰り返しのパターンの一環として使用され得る。選択を可能にするためには、核酸導入の各ラウンドのための１又は複数のマーカーは、前のラウンドで使用された１又は複数のマーカーと異なっていなくてはならない。

【0053】

パート（ｉ）の間のエピソームレプリコンの骨格配列は、第１のマーカー又はマーカーセットを含む第１の骨格配列であり得、本明細書で記載される第１のＲＮＡ分子対をコードし得る。パート（ii）の間のエピソームレプリコンの骨格配列は、第２のマーカー又はマーカーセットを含む第２の骨格配列であり得、本明細書で記載される第２のＲＮＡ分子対をコードし得る。このパターンは繰り返しの間維持され得、その結果、第１の骨格配列は全ての奇数の繰り返しの間に存在し、第２の骨格配列は全ての偶数の繰り返しの間に存在する。繰り返しのパターンはまた、さらなるマーカー又はマーカーセットを含み、さらなるＲＮＡ分子対をコードする、さらなる骨格配列、例えば第３の骨格配列を含んでいてもよい。第１のマーカー又はマーカーセット及び第２のマーカー又はマーカーセットは互いに異なり、その結果、組換えのラウンドの際に各成功裏の核酸導入の選択が可能となる。各骨格配列によってコードされるＲＮＡ分子は、コードしている骨格の切断を可能にする。

【0054】

さらなる態様において、ＣＯＮＥＸＥＲ用に確立された原理は、大腸菌のエピソームへのメガベースのＤＮＡの繰り返し挿入を介して、スカーレスなアセンブリ及びクローニングの実現に拡張することができる。本発明はしたがって、その中にＤＮＡを繰り返し挿入しアセンブルするためのアセンブリエピソームレプリコンに関する（図６ａ）。実施形態では、このレプリコンは、次の挿入配列の一方の末端に相同なおよそ５０ｂｐの配列（ＨＲ１）を有する。このすぐ後には、ポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセット、並びに、挿入対象の配列の他方の末端に相補的なユニバーサル相同性領域（ｕＨＲ）が続く。１０の数乗ｋｂの配列ほどに長い、より長い相同性もまた、利用することができる。

【0055】

本発明はまた、ユニバーサルスペーサー及びｏｒｉＴを有する、ＣＯＮＥＸＥＲ骨格を有するドナーエピソームレプリコンも提供する（図６ａ）。ドナーレプリコンにおいて、ＨＲ１は、レシピエントＢＡＣに挿入される次のＤＮＡ配列の一方の末端内にある。このＤＮＡ配列の後には、異なるポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセット及びユニバーサル相同性領域が続く。各アセンブリステップ（図６ａ、ｂ）は、アセンブリレプリコンを有するレシピエント細胞へのドナーレプリコンの接合、ドナーレプリコンからのＨＲ１からｕＨＲまでの配列のヌクレアーゼ介在性の切除、及びアセンブリレプリコンへのこの配列の組換え介在性の挿入によって進められる。アセンブリレプリコン上でのネガティブセレクションマーカーの喪失、及びドナーレプリコンから切除された配列からのポジティブマーカーの獲得についての選択は、挿入が正確なアセンブリレプリコンを有する細胞を選択する。新たなアセンブリレプリコンを有する細胞は、次の挿入ステップのためのインプットを提供する。このアプローチは、ＢＡＣの段階的挿入合成（ＢＡＳＩＳ）と名付けられた。

【0056】

したがって、本発明のさらなる態様では、複数のアセンブリステップを含む、エピソームレプリコンを構築するための方法であって、ステップｎが、
ａ）ドナーエピソームレプリコンを提供するステップであって、前記レプリコンが、
ユニバーサルスペーサー配列を含む骨格、組み込みステップｎに特異的な第１の相同性領域ＨＲｎ、及び第２のユニバーサルな相同性領域ｕＨＲ、ＨＲｎの隣に位置する第１の切除部位、及びｕＨＲの隣に位置する第２の切除部位、
アセンブリステップｎ＋１に特異的な相同性領域ＨＲｎ＋１を含むドナー核酸ＤＮＡｎ、
ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセット
を含む、前記ステップ、
ｂ）ＨＲｎ及びｕＨＲが隣接する、ポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーを含むダブルセレクションカセットを含む、アセンブリエピソームレプリコンを含む宿主細胞を提供するステップであって、アセンブリレプリコン内のダブルセレクションカセットが、ドナーレプリコン内のセレクションカセットと異なるマーカーを含む、前記ステップ、
ｃ）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供するステップ、
ｃ）ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
ｄ）第１の切除部位に特異的な配列を含む第１のＲＮＡ分子及び第２の切除部位に特異的な配列を含む第２のＲＮＡ分子を提供するステップであって、第１及び第２のＲＮＡ分子が、切除の際の、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼの指向に関与する、前記ステップ、
ｅ）宿主細胞において、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎの切除を誘導するステップ、並びに
ｆ）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記アセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、核酸ＤＮＡｎを含む第２のアセンブリレプリコンを形成するステップ
を含む、前記方法が提供される。

【0057】

ドナー核酸を有するアセンブリレプリコンは次に、第２のステップのアセンブリレプリコンとして使用することができ、この場合、相同性領域ＨＲｎ＋１及びｕＨＲ並びに第２のドナー核酸ＤＮＡｎ＋１を含む第２のドナーレプリコンは、第１のステップで生じたアセンブリレプリコンに第２のドナー核酸を導入するために利用される。

【0058】

交互のポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカーのセットによって、無数のステップを繰り返し行うことが可能となり、任意の所望のサイズのエピソームレプリコンがアセンブルされる。好ましくは、行われるステップの数は、少なくとも２つ、及び１００個以下、５０個以下、２５個以下、最も好ましくは約１０個、９つ、８つ、７つ、６つ、又は５つであり得る。

【0059】

アセンブルされるレプリコンのサイズは、好ましくは１～１００Ｍｂの間である。好ましくは、このサイズは、２～５０Ｍｂ、３～２５Ｍｂ、４～１５Ｍｂ、又は５～１０Ｍｂである。

【0060】

したがって、一実施形態では、本発明は、ドナー核酸ＤＮＡｎ＋１を含むさらなるドナーエピソームレプリコンを宿主細胞に導入するステップ、及び宿主細胞において、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列ＤＮＡｎの切除を誘導するステップ、及びインキュベートを行って、切除されたドナー核酸ＤＮＡｎ＋１と前記アセンブリレプリコンとの間の組換えを起こし、核酸ＤＮＡｎ及び核酸ＤＮＡｎ＋１を含む第２のアセンブリレプリコンを形成するステップをさらに含む、本発明の上記の態様の方法を行う工程を含む。

【0061】

本発明のこの実施形態のステップを繰り返し行って、ドナー核酸ＤＮＡｎ＋２、ｎ＋３、ｎ＋４などをアセンブリエピソームレプリコンに挿入してもよい。

【0062】

ＢＡＳＩＳは、連続的ゲノム合成（ＣＧＳ、continuous genome synthesis）に有用なエピソーム又は他のＤＮＡベクター又はセグメントを作製するために使用することができる。ＢＡＳＩＳはまた、それ自体、連続的ゲノム合成（ＣＧＳ）を進めるために_、エピソーム、ゲノム、細菌、又は他の遺伝子及びＤＮＡを問わず人工ＤＮＡの連続的な産生のために、シーケンシングステップを伴わずに連続的に適用することができる。本発明者らはまず、ＢＡＳＩＳによる２０８Ｋｂｐのヒト嚢胞性線維症膜貫通調節因子遺伝子のアセンブリを実証した。ＣＦＴＲ遺伝子を、３ステップのＢＡＳＩＳで、およそ７０Ｋｂｐの遺伝子断片を有するドナーＢＡＣＳとアセンブルした。

【0063】

ＢＡＳＩＳは、エクソン領域、イントロン領域、及び遺伝子間領域を含むヒトゲノムＤＮＡの大きなセクションを１つのエピソームにアセンブルするために使用することができる。

【0064】

１つのＣＯＮＥＸＥＲに由来するクローンのシーケンシングされていないプールを次のＣＯＮＥＸＥＲのためのインプットとして直接使用することによって、ＣＯＮＥＸＥＲの迅速な繰り返しを可能にするために、各クローンを検証するためのシーケンシングステップを取り除くことが望ましい。したがって、ＣＯＮＥＸＥＲの１つのステップでゲノムＤＮＡが合成ＤＮＡで完全に置き換えられているクローンの画分を実質的に増大させる因子を調べた。

【0065】

ｒｅｃＡ及びｒｅｃＯの両方が、完全に合成の配列を有するクローンの画分を増大させる因子として同定されている（図７ａ、図９）。ｒｅｃＡの欠失（ΔｒｅｃＡ）は、１００ｋ２４では、完全に合成のＤＮＡの画分を２０％からおよそ８０％まで増大させた（図７ａ）。いくつかの他の１００Ｋｂｐの領域で同様の劇的な増大が見られ、これらの所見の普遍性を裏付けている（図７ｂ）。

【0066】

連続的ゲノム合成は、１ラウンドのＣＯＮＥＸＥＲから得られたアウトプットを、個々の完全にリコードされたクローンをシーケンシングによって同定することは伴わずに、次のラウンドのＣＯＮＥＸＥＲのためのインプットとして直接使用することによって、行うことができる。

【0067】

したがって、本発明の態様で使用される宿主細胞は、有利には、コンピテントなｒｅｃＡ及び／又はｒｅｃＯを欠いている。好ましくは、宿主細胞は、ｒｅｃＡを欠いている（ΔｒｅｃＡ）。

【0068】

エピソームレプリコン
本発明の実施形態は、ドナー核酸配列を含むエピソームレプリコンを含む。ドナー核酸はＤＮＡであり得る。

【0069】

「エピソーム」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、例えば、自律的に存在し得るか又は染色体と共に組み込まれ得る任意のアクセサリー染色体外複製遺伝子エレメントである。

【0070】

エピソームレプリコンは、前記宿主細胞内で機能し得るそれ自体の複製起点を有する、エピソーム性の核酸である。

【0071】

エピソームレプリコンは、プラスミドであり得る。プラスミドは、小さな環状核酸（一般にはＤＮＡ、最も一般には二本鎖ＤＮＡ）分子を意味する。細胞内のプラスミドは、ＤＮＡなどのあらゆる染色体核酸から物理的に離れており、独立して複製することができる。プラスミドについては、「小さな」は、それらが典型的には１０ｋｂを越える大きさではないことを意味する。適切には、本発明で有用なプラスミドは、以下の遺伝子エレメントを有する：宿主細胞と同族の複製起点、及び少なくとも１つのセレクションマーカー。

【0072】

エピソームレプリコンは、ＢＡＣであり得る。ＢＡＣは、以下の遺伝子エレメントを含み得る：宿主細胞に同族の複製起点、及び少なくとも１つのセレクションマーカー。

【0073】

ＢＡＣ及びプラスミドは、それらの複製起点が互いに異なる。ＢＡＣは特別な複製起点を有し、これは、典型的には、ＢＡＣを各細胞内で１つのコピーとし、また、ＢＡＣがより大きなサイズ（最大数百ｋｂ）を維持することを助ける。プラスミドはプラスミド複製起点を有し、これは、典型的には、プラスミドを各細胞内で複数のコピーとし（細胞当たり数コピーから数百コピーの範囲）、典型的には最大およそ１０ｋｂのサイズにする。

【0074】

エピソームレプリコンは、酵母人工染色体（ＹＡＣ、yeast artificial chromosome）であり得る。ＹＡＣは、以下の遺伝子エレメントを含み得る：宿主細胞に同族の複製起点、及び少なくとも１つのセレクションマーカー。

【0075】

同一の細胞内で同一の単一の核酸に対して活性な複数の複製起点は、通常望ましいものではない。このことは、例えば、マルチコピーエピソーム核酸、例えばプラスミドがドナー核酸を有している場合に特に当てはまり、このシナリオでは、プラスミドの複製起点を（例えば）ＢＡＣ又は宿主ゲノムに組み込むことは明らかに望ましくない。したがって、適切には、前記切除された直鎖状ドナー核酸は、複製起点を含まない。適切には、標的核酸配列は複製起点を含む。

【0076】

適切には、ドナー配列を有するエピソームレプリコン上の複製起点は、宿主、例えば全ての原核生物宿主と適合しなくてはならない。適切には、標的を含むエピソームレプリコン上及びドナー配列を含むエピソームレプリコン上の複製起点は、宿主、例えば全ての原核生物宿主と適合しなくてはならない。

【0077】

適切には、ドナー配列を有するエピソームレプリコンは、原核生物複製起点を有する。適切には、標的配列を含むレプリコンは、原核生物複製起点を有する。適切には、標的配列を含むレプリコンはエピソームレプリコンであり、原核生物複製起点を有する。適切には、宿主細胞は原核生物宿主細胞である。適切には、合成ゲノムは合成原核生物ゲノムである。

【0078】

標的核酸
標的核酸は、ドナー核酸配列の導入に適切な任意ものであり得る。特に、標的核酸は、ドナーＤＮＡ分子の導入に適切なＤＮＡ分子であり得る。

【0079】

標的核酸は、相同組換え配列１及び相同組換え配列２を含み得る。標的核酸は１又は複数のセレクションマーカーを含み得、当該セレクションマーカーには相同組換え配列が隣接していてよい。例えば、標的核酸はネガティブセレクションマーカーを含み得る。

【0080】

標的核酸は、宿主細胞内で機能し得るそれ自体の複製起点も有する核酸領域であり得る。標的核酸はプラスミドであり得る。標的核酸はＢＡＣであり得る。標的核酸はＹＡＣであり得る。特定の実施形態では、標的核酸は宿主細胞のゲノムである。

【0081】

本発明がゲノムに適用される場合、適切には、ゲノムは非ヒトゲノムであり、適切には非哺乳動物ゲノムである。適切には、ゲノムは原核生物ゲノムであり、適切には細菌ゲノムである。特に、ゲノムは大腸菌ゲノムであり得る。

【0082】

特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子を含むエピソームレプリコンはＢＡＣであり、標的核酸は大腸菌細胞のゲノムである。

【0083】

相同組換え
理論上は、任意のヌクレオチド配列を相同組換え配列のための部位として選択することができる。

【0084】

相同組換えのためのヌクレオチド配列は固有であり得る。例えば、相同組換えのためのヌクレオチド配列は、ドナー配列をその中で組み換えるための標的配列内で固有であり得る。他の実施例では、相同組換え配列１及び／又は相同組換え配列２は、ドナー配列をその中で組み換えるための標的配列内で固有であり得る。

【0085】

或いは、相同組換え配列１及び／又は相同組換え配列２は、ドナー配列をその中で組み換えるための標的配列内で固有でなくてもよい。このような実施例では、所望の部位への所望の配列の成功裏の導入を同定するために選択が使用され得る。例えば、オフターゲット組み込みは、ネガティブセレクションマーカーの除去若しくは破壊を生じさせないか、又はオフターゲット組み込みは、導入部位で誘導された二本鎖切断を修復しない。

【0086】

適切には、相同組換えのための配列は、非反復的である。

【0087】

適切には、相同組換えのための配列は、少なくとも３０ヌクレオチド長である。３０ヌクレオチド程の短い相同組換え配列は、低い効率をもたらし得る。したがって、高い効率のためには、適切には、相同組換え配列は、少なくとも４０ヌクレオチド長、適切には少なくとも５０ヌクレオチド、適切には５０～１００ヌクレオチド、最も適切には５０～６５ヌクレオチドである。

【0088】

相同組換えのための配列は標的配列に応じて選択され、ドナー配列に導入される。したがって、ドナー配列上の相同組換え配列１（ＨＲ１）及び相同組換え配列２（ＨＲ２）は、標的配列上のＨＲ１及びＨＲ２に対して１００％の配列同一性を示す。

【0089】

ラムダレッド組換えの使用によって、上記で概説したように、短いヌクレオチド配列を相同組換えに使用することが可能となる。他の組換え補助システムを使用してもよい。例えば、ＲｅｃＢＣＤシステムが使用され得る。ＲｅｃＢＣＤシステムが使用される場合、適切には、「前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質を提供する」ステップは、宿主細胞内でのＲｅｃＢＣＤシステムの発現を誘導する又は可能にすることからなる。

【0090】

ＲｅｃＢＣＤシステム又は他の組換え補助システムを使用する場合、当業者は、相同組換えに選択された配列に対するこれらのシステムの要件に注意を払うことになる。例えば、ＲｅｃＢＣＤシステムは、３～１０ｋｂ長などの、より長い相同組換え配列を必要とし得る。

【0091】

より詳細には、ＲｅｃＢＣＤは、３つの成分ＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ、及びＲｅｃＤからなる天然の大腸菌組換えシステムである。３つのサブユニットは、大腸菌における形質導入及び接合の過程の間の相同組換えと二本鎖切断の修復との両方に必須の、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ複合体を形成している。大腸菌ＤＮＡにおいて二本鎖切断をインビボで誘導する研究は、二本鎖切断の修復（ＤＳＢＲ、double-strand break repair）が２つの組換え経路の一方を介して進み得ることを示している。どちらの経路もＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡを必要とするが、一方はリゾルバーゼ酵素ＲｕｖＡＢＣに依存し、その一方で、他方はリゾルバーゼ酵素ＲｕｖＡＢＣに依存せず、その代わりにＲｅｃＧに依拠する。ｒｅｃＢ遺伝子及びｒｅｃＤ遺伝子はオペロンを形成し、一方、ｒｅｃＣはすぐ近くに位置しているが、それ自体のプロモーターを有している。３つの遺伝子産物は、エキソヌクレアーゼＶとしても公知のヘテロトリマーを形成する。何らかのさらなるガイダンスが必要なケースでは、詳細は、例えば大腸菌のＫ１２－ＭＧ－１６５５株についての、「ＲｅｃＢＣＤ」という公開されているEcoCycデータベースで見ることができる（Keseler et al. (2013), “EcoCyc: fusing model organism databases with systems biology”, Nucleic Acids Research 41: D605-12）。

【0092】

したがって、この実施形態に従って組換えを補助するためには、少なくともＲｅｃＢＣＤが宿主細胞で発現されるべきである。

【0093】

ＲｅｃＡもまた必要であり得る。したがって、さらに適切には、この実施形態に従って組換えを補助するためには、少なくともＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡが宿主細胞で発現されるべきである。最も適切には、この実施形態に従って組換えを補助するためには、ＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡが宿主細胞で発現されるべきである。

【0094】

ラムダレッドシステムに代わる別の代替は、ＲｅｃＥＴシステムである。ＲｅｃＥ及びＲｅｃＴは、ファージ由来の大腸菌遺伝子である。ＲｅｃＥはラムダレッドアルファを模倣し、ＲｅｃＴはラムダレッドベータを模倣する（Muyrers, J.P., Zhang, Y., Buchholz, F. & Stewart, A. F. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Dev. 14, 1971-1982 (2000)）。ＲｅｃＥＴの組み合わせは、ラムダレッドアルファ／ベータの組み合わせよりも比較的良く機能する。ラムダレッドアルファ及びベータは、組換えを実行する実際の成分であり、一方、ラムダレッドガンマは、ＲｅｃＢＣＤシステムの阻害剤である。

【0095】

適切には、組換えの補助は、ラムダレッドシステムを介して、例えば、Gene Bridges社から市販されているpRed/ETプラスミドから提供される（Gene Bridges GmbH社、Im Neuenheimer Feld 584、69120、ハイデルベルク、ドイツの「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」）。

【0096】

この設定のこのシステムは、ここで参照によって特にラムダレッドシステムの詳細について本明細書に組み込まれる、Datsenko et al 2000 （Datsenko K. A. & Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000)）で最初に記載されている。

【0097】

本発明者らは、pRed/ETプラスミドが、Datsenko et al 2000におけるpKD46プラスミドに基づいており（配列同一性によって判断された）、したがって、pKD46プラスミドがラムダレッドシステムの構築のためにＰＣＲを行うための鋳型として使用され得ることを教示する。

【0098】

核酸の組換えを補助し得る前記ヘルパータンパク質がラムダレッドタンパク質を含む場合、適切には、以下のタンパク質が前記宿主細胞で発現される：

【表1】

【0099】

相同組換え配列
相同組換え配列を選択するために、以下のステップを使用することができる：
－ 細菌のゲノム又はプラスミド骨格などの改変対象の核酸（標的核酸）の配列内の所望の位置にある５０～１００ヌクレオチドを選択する。
－ 標的核酸に対する選択された配列のBLASTサーチを行う。
－ BLASTサーチでの最も近いマッチと比較した、選択された配列のＥ値を考慮する。典型的には、１０^－２０を超える、標的核酸のどこかにある望ましくない標的部位と比較したＥ値は、高すぎることになる。これが見つかったら、適切には、別の相同組換え配列が選択される。

【0100】

適切には、標準的なBLASTツールが、相同組換え（ＨＲ、homologous recombination）配列のＥ値の計算に使用される。１つのこのようなオンラインツールは、http://biocyc.org/ECOLI/blast.htmlにある。適切には、Ｅ値によって判断したところ所与のＨＲ配列がいかに固有であるかということに焦点が当てられる。適切には、親和性を考慮する／計算する必要はない。原理的には、従来の組換えで機能し得る全ての配列は、本発明でより良好に機能する。

【0101】

より詳細には、ＨＲ配列が従来の組換えで機能し得るなら、これらは、本発明でより良好に機能する。適切には、本発明のためのＨＲ配列は、ラムダレッドシステムを使用する従来の組換えについての正確な原理及び要件に従って選択される。例えば、本発明者らは、典型的には、５０～７０ｂｐ長のＨＲを設計し、１０^－２０未満の予想値について、大腸菌ゲノムに対してblastを行う。（所与の配列がいかに固有であるかの測定値であるＥ値；Ｅ値が小さいほど配列は固有である。計算のための任意の適切なツール、例えば、ＨＲ配列のＥ値を計算するための標準的なBLASTツールを使用することができる。１つのこのようなオンラインツールは、http://biocyc.org/ECOLI/blast.htmlにある）。１０^－２０のＥ値よりも小さい値は不要であると予想されるが、当然のことながら、値が小さい配列も依然として本発明では有用である。

【0102】

Ｅ値は、所与の配列がいかに固有であるかの測定値である。従来の組換えは相同領域の特異性にのみ依拠しているため、これは、１０^－２０などの、比較的ストリンジェントなＥ値のカットオフを必要とする。本発明の方法は、相同領域の特異性によるのみではなく、同時のネガティブセレクションマーカーの喪失及びポジティブセレクションマーカーの獲得によっても、遺伝子座の特異性を高めることができるため、本方法は、原理上は、あまりストリンジェントではないＥ値（例えば、あまりストリンジェントではない相同性領域）を許容し得る。しかし、実際には、ストリンジェントなＥ値を有する相同性領域を作成することは非常に簡単であり、したがって、適切には、１０^－２０のＥ値カットオフが使用される。

【0103】

セレクタブルマーカー
本発明の方法のいずれも、ドナー核酸が標的核酸に組み込まれている組換え体を選択するさらなるステップを含み得る。このステップは、組換えを引き起こすための誘導ステップの後に行われる。

【0104】

所望の配列は、ポジティブセレクタブルマーカーを含み得る。このようなマーカーとしては、マーカーを含む細胞の同定又は選択を可能にする任意のマーカーが含まれる。

【0105】

標的核酸は、５’－相同組換え配列１－ネガティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’を順に含み得る。

【0106】

前記ドナー核酸が前記標的核酸に組み込まれている組換え体の選択は、ドナー核酸のポジティブセレクタブルマーカーの獲得及び標的核酸のネガティブセレクタブルマーカーの喪失の選択を含み得る。適切には、ドナー核酸のポジティブセレクタブルマーカーの獲得及び標的核酸のネガティブセレクタブルマーカーの喪失の選択は、同時に行われる。他の実施形態では、組換え体を選択するステップは、ポジティブマーカー及びネガティブマーカーの連続的な選択、又はネガティブマーカー及びポジティブマーカーの連続的な選択を含む。

【0107】

所望の配列は、ポジティブセレクタブルマーカー及びネガティブセレクタブルマーカーの両方を含み得る。

【0108】

本発明の方法は、
標的核酸配列内で少なくとも１つの二本鎖切断を誘導するステップであって、前記二本鎖切断が前記相同組換え配列１と前記相同組換え配列２との間にある、ステップをさらに含み得る。

【0109】

適切には、少なくとも２つの二本鎖切断が標的核酸配列内で誘発され、各前記二本鎖切断は、前記相同組換え配列１と前記相同組換え配列２との間である。

【0110】

エピソームレプリコンは、ドナー核酸配列に依存しないネガティブセレクタブルマーカーを含み得る。適切には、前記方法は、ドナー核酸配列に依存しない前記ネガティブセレクタブルマーカーの喪失について選択することによる、エピソームレプリコンの喪失について選択するさらなるステップを含む。

【0111】

本発明の一部の方法は、ポジティブマーカーとネガティブマーカーの喪失とを伴うコンビナトリアル選択アプローチを含む。この「ダブルセレクション」スキームの使用は、実際、部位特異性にも役立つ。例えば、組換えイベントが不適切な部位で起こると、ポジティブセレクタブルマーカーが獲得され得る。しかし、ポジティブマーカーとネガティブマーカーの喪失との同時の選択を使用することによって、核酸が不適切な部位で標的核酸に組み込まれていても（これによってポジティブマーカーが付与される）、このような分子は依然として選択されず、それは、これら分子が不適切な部位に組み換えられていれば、これら分子はネガティブマーカーの喪失を同時には生じさせないためである。したがって、それ自体で有用な選択であることと同時に、これは実際、ドナー配列の獲得だけではなく、除去される／置き換えられる配列の同時の欠失も選択することによって、部位特異性において補助するという技術的利益をも付加する。

【0112】

適切なセレクタブルマーカーの例を、以下の表（表２）に示す。さらに、任意の適切な抗生物質マーカーを使用してもよい。このような抗生物質マーカーの例としては、ＴｅｔＲ、ＡｍｐＲ、ＨｙＲ、及びＥｒｍＲが含まれ、これらは、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はエリスロマイシン耐性をそれぞれ含む選択スキームを可能にする。

【表2】

【0113】

したがって、一実施形態では、ネガティブセレクタブルマーカーは、ｓａｃＢ（ショ糖感受性）及びｒｐｓＬ（Ｓ１２リボソームタンパク質－ストレプトマイシン感受性）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ポジティブセレクタブルマーカーは、ＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性）及びＫａｎＲ（カナマイシン耐性）からなる群から選択される。

【0114】

二本鎖切断の切除／導入
本発明の方法は、二本鎖切断を切除／導入するためのメカニズムを含む。適切には、切除は、直鎖状ドナー核酸を生じさせるために行われる。

【0115】

特定の実施形態では、システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。しかし、この機能をもたらす他のシステムも公知である。

【0116】

例えば、オリジナルのストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に代わる代替的なＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼについて、３つの公開された論文が存在する（Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191 (2015)、Zetsche, B. et al. Cpfl is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 ＣＲＩＳＰＲ-Cas system. Cell 163, 759-771 (2015)、Lee, C. M., Cradick, T. J. & Bao, G. The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Editing in Mammalian Cells. Mal. Ther. 24, 645-654 (2016)）。これらは全て、本発明でのインビボ切除をガイドするために使用することができる。これらの参考文献は、本明細書で使用される二本鎖切断／切除の導入のための代わりのシステムについての教示について、参照することによって具体的に本明細書に明確に組み込まれる。

【0117】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配列
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Jiang et al 2013 (Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013))において記載されている。

【0118】

概略では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡとの間の単一の融合ＲＮＡを指す。適切には、本明細書で論じられる通り、一定のｔｒａｃｒＲＮＡと異なるスペーサーＲＮＡとの組み合わせが本発明で使用される。これらのｔｒａｃｒＲＮＡスペーサーＲＮＡの組み合わせは、複数の異なるガイドＲＮＡで置き換えられていてもよい。

【0119】

当技術分野では、ガイドＲＮＡは、１つのＲＮＡとしての、ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡとの融合体のみを指し、ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡとの二重ＲＮＡ複合体は意味しない。

【0120】

ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif）を表す。これは、典型的には、３ヌクレオチドのモチーフである。典型的なガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド長である。ガイドＲＮＡは、典型的には、２７ヌクレオチドの標的配列及び３ヌクレオチドのＰＡＭ配列を含む。

【0121】

適切には、Jiang et al 2013と同一の、個別のｔｒａｃｒＲＮＡ／スペーサーＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ設定を、本発明で使用してよい。或いは、例えば当技術分野で公知の、１つのガイドＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ設定を使用してもよい（Le Cong et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)を参照されたい）。

【0122】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する場合に切除を補助するためには、適切には、核酸切除を補助し得るヘルパータンパク質は、最低でも、関連するＲＮＡ（スペーサーＲＮＡガイド、ｔｒａｃｒＲＮＡ（以下を参照されたい））と共に、Ｃａｓ９（例えば、以下を参照されたい）及びRNAseIII（例えばｒｎｃ、EcoCycの受託ＩＤ ＥＧ１０８５７）を含む。

【0123】

典型的な配列を以下に示す。
Ｃａｓ９（配列番号１０）
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA
ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１１）
AAAAAGTTTAAATTAAATCCATAATGATTTGATGATTTCAATAATAGTTTTAATGACCTCCGAAATTAGTTTAATATGCTTTAATTTTTCTTTTTCAAAATATCTCTTCAAAAAATATTACCCAATACTTAATAATAAATAGATTATAACACAAAATTCTTTTAAAAAGTAGTTTATTTTGTTATCATTCTATAGTATTAAGTATTGTTTTATGGCTGATAAATTTCTTTGAATTTCTCCTTGATTATTTGTTATAAAAGTTATAAAATAATCTTGTTGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGATACTTCTATTCTACTCTGACTGCAAACCAAAAAAACAAGCGCTTTCAAAACGCTTGTTTTATCATTTTTAGGGAAATTAATCTCTTAATCCTTTT

【0124】

Ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡの実際の配列は、典型的には、全ての実験を通して一定のままである。スペーサーＲＮＡ配列は、正確なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位に応じて変化する。本明細書で論じられる通り、本発明の方法は、本発明の繰り返しで一定なままであるユニバーサルスペーサーの使用を可能にする。例えば、スペーサーは、本発明の全ての奇数の繰り返しで一定であり得、別のスペーサーセットは、本発明の全ての偶数の繰り返しで一定であり得る。

【0125】

適切には、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びスペーサーＲＮＡは、切除が起こる細胞（すなわち宿主細胞）に共に提供される。適切には、これらのエレメントの３つ全てが、効率的な切除に必須である。

【0126】

一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは宿主細胞で構成的に発現される。Ｃａｓ９は、核酸の組換えを補助し得るヘルパータンパク質（例えば、ラムダレッドアルファ／ベータ／ガンマ）と共に誘導される。スペーサーＲＮＡは、スペーサーＲＮＡを発現する小さなプラスミドで細胞を形質転換することによって宿主細胞に提供され得る。或いは、好ましい実施形態では、スペーサーＲＮＡは、ドナー核酸配列を含むエピソームレプリコンによってコードされる。３つ成分の全てが細胞内に存在する場合に切除が生じる。

【0127】

別の実施形態では、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びスペーサーＲＮＡを発現するための核酸（例えばＤＮＡ）配列は、細胞に共に提供され得るが、３つの成分（の一部）の実際の発現は抑制され得る（誘導されない／サイレント）。適切な時点で発現は誘導され得、したがって、切除を誘導する。

【0128】

一実施形態では、切除を引き起こすために、ｔｒａｃｒＲＮＡは常に（構成的に）発現され、Ｃａｓ９の発現は誘導され、そしてスペーサーＲＮＡは最後に提供される。

【0129】

発現の誘導は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、所望の配列（例えばＣａｓ９）は、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。そのプロモーターの活性は、必要に応じて誘導される。例えば、アラビノースの存在下で誘導される周知のアラビノース（ｐＡｒａ）プロモーターが使用され得る。同様に、当業者は、構成的発現に適した周知のプロモーターの広大なアレイから必要に応じて構成的プロモーターを選択してもよい。

【0130】

ＣＲＩＳＰＲシステムの操作に関して周知のように、スペーサーＲＮＡの配列は、標的部位ごとに異なる。適切なスペーサーＲＮＡの選択は、十分に当業者の領域内である。

【表3】

【表4】

【0131】

ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡとの組み合わせは、個別に提供することができるか、又はｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡとの融合体である１つのガイドＲＮＡとして提供することができる。

【0132】

ＣＲＩＳＰＲシステムの異なるエレメントには異なるモチーフが必要であることが留意されるべきである。Ｃａｓ９では、ＰＡＭはNGGである。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲシステムの代替的な実装がオペレーターの選択に応じて使用されてもよく、例えば、代替的なＰＡＭをもたらす実装が使用される。より詳細には、NGGをＰＡＭとして天然に認識するストレプトコッカス・ピオゲネスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、変化したＰＡＭを認識するように改変され得ることが実証されている（Kleinstiver, B. P. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature (2015). doi:10.1038/nature14592）。Ran 2015、Zetsche 2015、及びLee 2016（上記を参照されたい）で記載されている、３つの代替的なＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼシステムは、異なるＰＡＭを天然に有する。

【0133】

当業者には、ＣＲＩＳＰＲシステムの代替的な成分が本発明で利用されるかどうかが分かり、その後、対応する代替の同族ＰＡＭ配列が使用されるべきである。これは、十分に当業者の領域の範囲内である。何らかのさらなるガイダンスが必要なケースでは、以下の表が、ＣＲＩＳＰＲシステムの代替的なエレメントと、それらのＰＡＭ配列を共に示している。

【表5】

【0134】

切除の制御のためのＰＡＭ部位の操作
本発明を実施する際、標的配列上のＰＡＭを、標的に導入予定のドナー核酸（例えばｓＤＮＡ）上のＰＡＭと比較し、ＰＡＭ配列がドナー核酸（例えばｓＤＮＡ）及び標的核酸（例えばゲノムＤＮＡ）にマッチするならば、必要であれば、二重切除の問題（例えば、相同組換え配列を偶発的に含む切除）を避けるように変異させることができる。これは、本明細書で教示するような順でエレメントを配置する際に、当業者によって容易に行われる。

【0135】

エピソームレプリコン上のドナー核酸（例えば合成ＤＮＡ）に隣接する相同領域には、AvrII部位（CCTAGG）がさらに隣接していてもよい。AGG又はCCTは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって必要とされるNGG ＰＡＭ配列に対応する（方向に応じて）が、補足的なCCT又はAGGは、プロトスペーサーの最後の３つのヌクレオチドを構成する。プロトスペーサーの最後の３つのヌクレオチド及び／又はNGG ＰＡＭのＧのいずれかの任意の置換は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の認識及び／又は切断を不能にする。

【0136】

一部の実施形態は、そこにドナー核酸を組み換えようとしている標的核酸に二本鎖切断を導入するステップを含む。このような実施形態では、改変対象の核酸（標的核酸）に存在する配列上で利用されるＰＡＭの選択で注意が必要である。なぜなら、ドナー核酸上の配列（例えば、標的核酸に導入しようとしているＤＮＡ）は標的核酸上のＰＡＭにマッチしないためである。もしこれらがマッチするとすれば、本発明の方法の切除ステップは、標的核酸の不適切な位置にも二本鎖切断を導入してしまう。したがって、適切には、標的核酸（例えば、そこにドナーＤＮＡを導入しようとしているゲノム又はプラスミド又はＢＡＣ）上のＰＡＭは、ドナー核酸を有するエピソームレプリコン上のＰＡＭと比較されるべきである。ＰＡＭ配列がマッチすることが分かったら、これら配列は、考えられる問題を避けるために、改変対象の標的核酸上で変異させられる。これは、十分に当業者の領域の範囲内である。より詳細には、これらの実施形態では、エピソームレプリコン上の２つの切断部位は、上記で開示したものと同一の様式で、標的核酸上の相同領域の対応する末端と区別される。標的核酸上の相同領域の内側にある２つのさらなる切断部位は、標的核酸上の相同領域の境界を規定するNGGモチーフを探すことによって同定する必要がある。標的核酸上の相同領域の内側にある２つのさらなる切断部位のNGG ＰＡＭはまた、「二重切除」を避けるために、ドナー核酸を有するエピソームレプリコンの相同領域の対応する末端には存在しない必要がある。これは非常に容易に達成され得るが、それは、挿入のための配列が標的核酸（例えばゲノム）上の切断部位と天然に異なるためである。これは、ドナー核酸（例えば合成ＤＮＡ）が標的核酸（例えば野生型ゲノムＤＮＡ）に類似の配列を有する場合、慎重に配列されるべきである。これは、ドナー核酸（例えば合成ＤＮＡ）内の対応するNGG及び／又はNGGのすぐ次にある他のプロトスペーサー内の最後の３つのヌクレオチドを変更することによる置き換えで達成される。このようにして、本発明者らは、標的核酸（例えばゲノム）位置のみに対して切断部位をマークする。

【0137】

一実施形態では、組換え体の選択を補助するために、標的核酸の切断を誘導することが望ましい場合がある。この実施形態では、適切には３つの切断が存在し、２つは、ドナー核酸を切除するためにエピソームレプリコン上にあり、１つは、選択を補助するために標的核酸上にある。したがって、適切には、前記標的核酸は、５’－相同組換え配列１－切断部位－相同組換え配列２－３’を順に含む。

【0138】

適切には、前記標的核酸は、
ａ）５’－相同組換え配列１－切断部位－相同組換え配列２－３’、
ｂ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ポジティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｃ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ネガティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｄ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ポジティブセレクタブルマーカー－ネガティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｅ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ネガティブセレクタブルマーカー－ポジティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’
を順に含む。

【0139】

本発明を複数のラウンドで適用する場合、第１のラウンドのドナー核酸は、次のラウンドの標的核酸に関与し得る／次のラウンドの標的核酸の一部となり得る。したがって、適切には、所望の配列は、
ａ）５’－相同組換え配列１－切断部位－相同組換え配列２－３’
ｂ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ポジティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｃ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ネガティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｄ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ポジティブセレクタブルマーカー－ネガティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’、
ｅ）前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位をさらに含む、５’－相同組換え配列１－ネガティブセレクタブルマーカー－ポジティブセレクタブルマーカー－相同組換え配列２－３’
を順に含み得る。

【0140】

適切には、標的核酸又は所望の配列上の切断部位は、エピソームレプリコン／ドナー核酸上の切除部位と異なる。

【0141】

前記切断部位は、前記ポジティブ／ネガティブセレクタブルマーカーの間にあっても、前記ポジティブ／ネガティブセレクタブルマーカーの中にあってもよい。適切には、前記標的核酸は、２つのこのような切断部位を含む。適切には、前記切断部位は、前記相同組換え配列の１つに隣接している。適切には、前記２つの切断部位は、前記相同組換え配列１に隣接した第１の切断部位、及び前記相同組換え配列２に隣接した第２の切断部位を含む。

【0142】

適用
本発明は、標的核酸への所望の配列の導入を伴う。「所望の配列の導入」は、本明細書で使用する場合、得られた核酸配列が所望の配列を含むように、所望の配列を標的核酸に組み込むことを意味する。これは、標的核酸内への所望の配列の組み込みとも記載され得る。

【0143】

標的核酸への所望の配列の導入は、所望の配列での標的核酸配列の一部の置き換えを含み得る。したがって、置き換えの後、得られた核酸配列は、所望の配列、及び標的核酸のオリジナルの配列の一部のみを含む。例えば、ゲノムが標的核酸配列である実施形態では、ゲノム配列の一部は、本発明の方法の繰り返しの間に、導入される所望の配列によって置き換えられてもよい。所望の配列は、所望の配列よりも小さい、所望の配列と同じサイズの、又は所望の配列よりも大きい標的核酸内の領域を置き換え得る。

【0144】

所望の配列の導入は、標的核酸内への所望の配列の挿入を含み得る。本明細書で使用する場合、「挿入」は、得られた核酸配列が標的核酸のオリジナルの配列の全てを有し、また挿入された所望の配列も含むように、所望の配列が標的核酸内の部位に導入されることを意味する。

【0145】

本発明の方法は、複数のステップを含み得、これによると、セレクションマーカーを例えばコードするドナー核酸が標的核酸に導入され、次いで所望の配列によって置き換えられる。

【0146】

例えば、本発明の方法は、新たに挿入された所望の配列に加えてゲノムの全てのオリジナルの配列が残るようにゲノム又は他の標的核酸内に所望の配列を挿入するために使用することができる。別の実施例では、本発明の方法は、ゲノムの全体のサイズが変化しないようにゲノム又は他の標的核酸の一部を所望の配列で置き換えるために使用することができる。さらなる他の実施例では、本発明の方法は、得られた核酸がオリジナルのゲノム配列の一部のみを有し、またゲノムの全体のサイズが増大するように、ゲノム又は他の標的核酸の一部を、置き換えられる領域よりも長い所望の配列で置き換えるために使用することができる。

【0147】

本発明は、プラスミドの構築において有用である。本発明は、宿主ゲノムの改変において有用である。本発明は、ＢＡＣなどの人工染色体の構築において有用である。

【0148】

本発明は、大きなサイズの核酸構築物の作製において特に用途がある。本発明は、多様性が高いライブラリーの作製において特に用途がある。この点に関して、現在の形質転換技術を使用するとおよそ１０^８の形質転換効率が達成可能である。しかし、１０^１０又はそれを超える形質転換効率は非常に困難である、及び／又は不確実である。本発明によると、第１のハーフライブラリーが作製され得、第１の宿主細胞（宿主細胞の集団）に形質転換され得る。この第１のハーフライブラリーに、次いで、第２のハーフライブラリーをコードする核酸が形質転換される。本発明による組換えを使用することによって、これら２つのハーフライブラリーが次いでインビボで組み合わされ、１０^１０の多様性を有するライブラリーが得られるが、このライブラリーは、１０^５の形質転換効率を使用しさえすれば有利に得られた。

【0149】

宿主細胞
適切には、宿主細胞は原核細胞である。適切には、宿主細胞は細菌細胞である。

【0150】

一実施形態では、宿主細胞は、インビトロ、すなわち、実験室内にある。本発明の一実施形態では、本方法は、インビトロでの方法である。一部の実施形態では、本方法は、インビボでは実施されない。適切には、宿主細胞は、生存しているヒト又は動物の身体の一部ではない。適切には、宿主細胞は、以下の実施例で使用される宿主細胞の１つから選択される。

【0151】

宿主細胞は、任意のグラム陰性細菌であり得る。宿主細胞は大腸菌であり得る。宿主細胞は、任意の大腸菌株（ＭＧ１６５５若しくはＢＬ２１など）、又はこれらに由来する細胞であり得る。

【0152】

MG1655は、大腸菌の野生型株であるとみなされる。この株のゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ ＩＤは、Ｕ０００９６（出願日の時点ではＵ０００９６．３）である。ＢＬ２１は広く市販されている。

【0153】

大腸菌などの宿主生物は、天然の修復メカニズムを阻害して、二本鎖修復が非存在であること又は二本鎖修復の可能性が非常に低いことが確実となるように、選択又は改変されていてよい。例えば、宿主細胞内の核酸組換えを補助し得る適切なヘルパータンパク質、例えば、本明細書で記載されるラムダレッドタンパク質又は他の適切な組換え補助タンパク質が、ＲｅｃＢＣＤの代わりに存在しているという条件で、ＲｅｃＢＣＤシステムが変異しているか又は阻害されていてよい。例えば、一実施形態では、ＲｅｃＢＣＤはラムダレッド成分に干渉する可能性があり、ラムダレッド成分によって行われる短い相同性領域（例えばおよそ５０ｂｐ）（ＲｅｃＢＣＤシステムによって分解される）を有する二本鎖ＤＮＡを使用する組換えの効率を低減させるため、ＲｅｃＢＣＤは阻害されてよい。しかし、長い相同性領域（例えば、およそ３～５ｋｂ）が使用されるならば、ＲｅｃＢＣＤは、組換え補助タンパク質としてのラムダレッド成分に代わる、組換え補助タンパク質としての代替となり得る。

【0154】

任意の追加のステップ又は特徴
一実施形態では、本発明は、従来の技術によって行われる第１の組換えステップを伴い得る。これは、逆セレクタブルマーカーの標的部位への導入を可能にするという利点を有する。

【0155】

本発明は、本明細書で開示されている方法によって又は従来の組換えによって行われ得る最終組換えの最終ステップを含んでいてもよい。例えば、これは、それらの目的を果たし、本明細書で開示されている方法のさらなる繰り返しにはもはや必要ではないセレクタブルマーカーの除去において、有利であり得る。

【0156】

一部の実施形態では、本明細書で開示されている繰り返し方法は、第１の従来の相同組換えイベントを伴わずに開始及び継続される。

【0157】

一実施形態では、切除機構、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、組換えイベントによって置き換えようとしている部位での切断に利用され、これによって、切断（組み換えられていない）標的核酸に対する選択圧、すなわち、二本鎖切断によるネガティブセレクションが生じる。別の実施形態では、標的配列内での二本鎖切断によるこのネガティブセレクションは、３つの二本鎖切断の実施形態での選択を改良するために使用される（ドナー核酸の切除のための２つの二本鎖切断、及び標的核酸上のＨＲ１配列とＨＲ２配列との間の１つの二本鎖切断で、全部で３つのＤＳ破壊／切断となる）。

【0158】

特定の実施形態では、所望の配列を標的核酸に導入する方法であって、
１）標的核酸を含むゲノムを含む大腸菌宿主細胞を提供するステップ、
２）接合伝達によってＢＡＣを宿主細胞に送達するステップであって、
前記ＢＡＣが、骨格配列及びドナー核酸配列を含み、
前記ドナー核酸配列が、５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を順に含み、
骨格配列が、相同組換え配列１の隣に位置する第１の切除部位及び相同組換え配列２の隣に位置する第２の切除部位を含み、第１の切除部位が第１のプロトスペーサーを含み、第２の切除部位が第２のプロトスペーサーを含み、
骨格配列が、第１のプロトスペーサーに特異的なスペーサーを含む第１のＲＮＡ分子、及び第２のプロトスペーサーに特異的なスペーサーを含む第２のＲＮＡ分子をコードする、前記ステップ、
３）前記宿主細胞における核酸の組換えを補助し得るラムダレッドタンパク質を提供するステップ、
４）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを提供するステップ、
５）Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、
６）インキュベートを行って、切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間で組換えを起こすステップ、並びに
７）前記ドナー核酸が前記標的核酸に組み込まれた組換え体を選択するステップ
を含む、前記方法が提供される。本明細書で議論されるこの方法の特徴の代替のいずれかを、この方法の対応する特徴の代わりに使用することができる。例えば、ＢＡＣはエピソームレプリコンであり得、標的核酸は任意の標的核酸であり得、ラムダレッドタンパク質を、目的に適した任意のものの代わりに使用することができる、などである。

【0159】

本明細書で議論される通り、ステップ１）～４）は、任意の順序で又は同時に行ってよい。

【0160】

別の実施形態では、本方法は、核酸配列のアセンブリのためのものであり、ステップ１）～７）を行って、第１のドナー核酸配列を第１の標的核酸に導入し、それによって第２の標的核酸を作製する工程、次いでステップ１）～７）を行って、第２のドナー核酸配列を第２の標的核酸に導入し、それによって第３の標的核酸を作製する工程を含む。このプロセスは繰り返してもよく、各繰り返しの産物は、次の繰り返しの標的である。第１の骨格配列を含むＢＡＣは各奇数の繰り返しに使用することができ、第２の骨格配列を含むＢＡＣは各偶数の繰り返しに使用することができる。第１の骨格配列及び第２の骨格配列は異なるスペーサーをコードしてよく、異なるセレクションマーカーを含んでいてよい。

【0161】

本明細書で記載される特徴の全て（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面を含む）、並びに／又は、開示された任意の方法若しくはプロセスのステップの全ては、このような特徴及び／又はステップの少なくとも一部が相互排他的である組み合わせを除いて、上記の態様のいずれかと任意の組み合わせで組み合わせることができる。

【0162】

本発明をより良く理解するため、及び本発明の実施形態がいかにして行われ得るかを示すために、ここで実施例を参照するが、これら実施例は、本発明を限定するためのものでは決してない。
［実施例］

【0163】

方法
この研究で使用された株及びプラスミド
本発明者らは、ゲノムの低減した、ストレプトマイシン耐性の大腸菌（Ｍｄｓ４２、Scarab Genomics社）を、ＲＥＸＥＲ及びＣＯＮＥＸＥＲの開始株として使用した。同一の株を、ＢＡＳＩＳによるヒトＣＦＴＲ遺伝子のアセンブリに使用した。ヒトゲノムの大きなセクションを、同一株のΔｒｅｃＡ変異体とアセンブルした。全てのクローニング手順を、大腸菌ＤＨ１０ｂで行った。本発明者らは、株ＢＹ４７４１において酵母アセンブリを行った。

【0164】

本発明者らは、この研究で、以下のＢＡＣ：１００ｋ１３、１００ｋ２２、１００ｋ２４、１００ｋ２５、１００ｋ２６、１００ｋ２７、１００ｋ２８、及び１００ｋ３７ａを使用した（非特許文献１４）。各ＢＡＣは、２つのセリンコドン（TCG及びTCA）並びに停止コドン（TAG）が、規定されたリコードルール（TCGをAGCに、TCAをAGTに、及びTAGをTAAに）を介して置き換えられる、規定された同義コドン圧縮スキームを伴う、約１００ｋｂの合成ＤＮＡを有する。

【0165】

本発明者らは、ＲＥＸＥＲ及びＣＯＮＥＸＥＲにおいて、以下のポジティブセレクションマーカー及びネガティブセレクションマーカー：ｓａｃＢ（ショ糖感受性を付与する）、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）、ｒｐｓＬ（ストレプトマイシン感受性）、ｋａｎ^Ｒ（カナマイシン耐性）、ｐｈｅ^{ＳＴ２５１ａ＿ａ２９４Ｇ}（ｐｈｅＳ^＊）（４－クロロフェニルアラニン（４－ＣＰ、4-chloro-phenylalanine）感度）、及びＨｙｇ^Ｒ（ハイグロマイシン耐性）を使用した（非特許文献１４）。ＲＥＸＥＲでは、本発明者らは、組み込み部位の上流末端（遺伝子座^０）にゲノムダブルセレクションカセットを有する、ゲノムが減少したストレプトマイシン耐性の大腸菌株（Ｍｄｓ４２）を使用した：１００ｋ１３及び１００ｋ３７ａでのＲＥＸＥＲではｒｐｓＬ－ｋａｎ^R、１００ｋ２２、１００ｋ２４、及び１００ｋ２８でのＲＥＸＥＲではｓａｃＢ－ｃａｔ。ＣＯＮＥＸＥＲでは、本発明者らは、レシピエント細胞の組み込み部位の上流末端（遺伝子座^０）にゲノムダブルセレクションカセットを有する、ゲノムが減少したストレプトマイシン耐性の大腸菌（示されているように、ＷＴ又はΔｒｅｃＡ）株を使用した：１００ｋ２５及び１００ｋ２７でのＣＯＮＥＸＥＲではｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒ、１００ｋ２４、１００ｋ２６、及び１００ｋ２８でのＣＯＮＥＸＥＲではｓａｃＢ－ｃａｔ。

【0166】

本発明者らは、ＲＥＸＥＲ及びＣＯＮＥＸＥＲでの切除及び組換えを可能にするために、ヘルパープラスミドpKW20（Wang, K. et al. Nature 539, 59-64, doi:10.1038/nature20124 (2016)）を使用した。pKW20は、ｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにアラビノース誘導性プロモーターの制御下にあるｃａｓ９及びラムダレッド成分を構成的に発現する。さらに、本発明者らは、Ｃａｓ９の発現を伴わないラムダレッド組換えを可能にするために、ｃａｓ９を有さない誘導体プラスミドを作製し、これを、ＣＯＮＥＸＥＲのためのＢＡＣの修飾に利用した（以下を参照されたい）。これは、pKW20の残り部分のＰＣＲ増幅と、その後の、NEBuilder HiFi ＤＮＡアセンブリによって行った。

【0167】

ヒト２１番染色体の大きな領域のアセンブリのためのＢＡＣ（図３Ｃ）は、３２ｋ－ヒトＢＡＣライブラリー（BACPACKゲノミクス）のＢＡＣに基づく。これらを、ＣＯＮＥＸＥＲのためのＢＡＣの構築において記載されているようなラムダレッド組換えを使用するＣＯＮＥＸＥＲに適用した。

【0168】

宿主遺伝子の欠失では、本発明者らは、スペーサー配列を有するプラスミド及びpKW20を使用した。スペーサープラスミドは、ガイドをコードするｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いるpMB1プラスミド骨格への制限ライゲーションによって構築した。全てのスペーサー配列を、表３ａ及び表３ｂに示す。

【0169】

スペーサーアレイの構築
この研究で、本発明者らは、２つの異なる設計（偶数及び奇数でそれぞれ標識されている）のＢＡＣからの合成ＤＮＡのゲノム組み込みを行うが、これは、それぞれのユニバーサルスペーサー（ユニバーサル１及びユニバーサル２）のセットを必要とする。ヒトＢＡＣライブラリーに由来するＣＯＮＥＸＥＲ ＢＡＣのためのスペーサーは、第３の設計（ユニバーサル３）に基づく。本方法をさらに単純化するために、１つのユニバーサルスペーサーＲＮＡが全てのＢＡＣにおいて５’及び３’の両方を切除するように、一連のＢＡＣが設計され得ることに留意されたい。

【0170】

ＲＥＸＥＲのための全てのスペーサーＲＮＡは、アンピシリン耐性マーカー、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びスペーサーアレイを有するプラスミドpKW3_MB1amp_tracr_スペーサー（表１５）から発現する。本発明者らは、２ラウンドのＰＣＲを介して、オーバーラップしているオリゴヌクレオチドから各アレイを構築し、AccI及びEcoRIでのpKW3の制限消化によって骨格を準備した（非特許文献１４）。本発明者らは、NEBuilder HiFi ＤＮＡアセンブリによって骨格と各アレイとを組み合わせ、その後、サンガーシーケンシングによって検証した。全てのスペーサー配列及びオリゴヌクレオチド配列を、表５～表１５に示す。

【0171】

ＣＯＮＥＸＥＲのためのＢＡＣの構築
本発明者らは、接合による伝達を可能にするための伝達起点（ｏｒｉＴ）の配列、及びユニバーサルスペーサーアレイ（ユニバーサル２）をＢＡＣ骨格に組み込むことによって、ＣＯＮＥＸＥＲのための偶数のＢＡＣを修飾した（表５）。この目的のために、本発明者らは、ｏｒｉＴ配列及びスペーサーアレイ配列をセレクションマーカーａｍｐ^Ｒに結合した。本発明者らは、ＰＣＲによって各配列を増幅した。プラスミドpKW3_MB１amp_tracr_ユニバーサル２はａｍｐ^Ｒの鋳型として機能し、pRK24（addgene番号５１９５０）はｏｒｉＴの鋳型として機能し、そしてpKW3_MB１amp_tracr_ユニバーサル２はスペーサーアレイの鋳型として機能した。本発明者らは、２回の連続するＰＣＲのＰＣＲ産物を繋ぎ合わせて、ｐｈｅＳ^＊に対する５０ｂｐの相同性領域を生じさせるプライマー及びＢＡＣ骨格を有する最終のａｍｐ^Ｒ－ｏｒｉＴ－ユニバーサル２カセットを作製した。本発明者らは、ｃａｓ９を有さないヘルパープラスミドpLF118を使用して、ラムダレッド組換えを開始し、アンピシリンで、ＢＡＣへのカセットの組み込みについて選択した。カセットの完全な組み込みをサンガーシーケンシングによってまず検証し、成功裏に修飾されたＢＡＣ １００ｋ２４を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってさらに検証して、合成ＤＮＡインサート全体の完全性を確認した。全てのオリゴヌクレオチド配列を、表５～表１４に示す。

【0172】

奇数のＢＡＣは、ＣＯＮＥＸＥＲでは類似の方法で修飾することができる。対応するユニバーサルスペーサーアレイであるユニバーサル１を、上記のpKW3_Mb1amp_tracr_ユニバーサル１プラスミドから増幅した。対応するオリゴヌクレオチド配列を表８に列挙する。

【0173】

奇数及び偶数のＣＯＮＥＸＥＲ ＢＡＣは、ＣＯＮＥＸＥＲプロトコルを用いて大腸菌ゲノムの任意の点で合成ＤＮＡを組み込むための、単純で迅速な基礎を提供する。この目的では、ＢＡＣと他の合成ＤＮＡとのサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisae）を介するアセンブリのために、ＢＡＣ骨格を、記載されているＢＡＣを鋳型として使用して直接増幅してもよい（非特許文献１４、５）。Robertson, W. E. et al. Nat Protoc 16, 2345-2380, doi:10.1038/s41596-020-00464-3 (2021)。

【0174】

ヒトライブラリー由来のＢＡＣを、ｏｒｉＴ配列、ユニバーサルスペーサーアレイ、ユニバーサル相同性領域、及びダブルセレクションカセットの組み込みによって、ＣＯＮＥＸＥＲに適用した。この目的のために、本発明者らは、全ての成分を有するプラスミドを、ギブソンアセンブリを介して正確な方向でクローニングした。これらのプラスミドはＰＣＲの鋳型として機能し、ここで、本発明者らは、ＢＡＣに組み込まれる配列全体を１つの直鎖状のＤＮＡ片として増幅する。本発明者らは、ラムダレッド組換えを開始するために、ｃａｓ９を有さないヘルパープラスミドpLF118を使用し、適切な抗生物質（使用したダブルセレクションカセットのタイプに応じて、ハイグロマイシン又はカナマイシン）で、ＢＡＣへのカセットの組み込みについて選択した。カセットの完全な組み込みを、カセットの両端での連結をゲノタイピングすることによってまず検証した。成功裏に修飾されたＢＡＣを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってさらに検証して、合成ＤＮＡインサート全体の完全性を確認した。

【0175】

ＣＦＴＲ遺伝子のアセンブリのためのＢＡＣを、酵母内の断片からアセンブルした（Robertson, W. E. et al. Nature Protocols 16, doi:10.1038/s41596-020-00464-3 (2021)）。ＰＣＲ増幅を介して断片を作製した。ＣＯＮＥＸＥＲ ＢＡＣ １００ｋ２５は、ＢＡＣ骨格断片（複製起点、ユニバーサル相同性領域、ｏｒｉＴ、及びユニバーサルスペーサーアレイを有する）の増幅のための鋳型として機能した。ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１細胞から精製されたゲノムＤＮＡは、本発明者らがアセンブリに使用したＣＦＴＲ遺伝子の断片のＰＣＲ増幅のための鋳型として機能した。

【0176】

ＲＥＸＥＲ
本発明者らはＲＥＸＥＲを行った（非特許文献１４、５）。Robertson, W. E. et al. Nat Protoc 16, 2345-2380, doi:10.1038/s41596-020-00464-3 (2021)。ヘルパープラスミドpKW20_CDFtet_pAraRedCas9_tracrRNA及びゲノムダブルセレクションカセットを有する、ゲノムが減少したストレプトマイシン耐性の大腸菌細胞から開始して、本発明者らは、関連するＢＡＣで細胞を形質転換し、ヘルパープラスミドについての選択（５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン）、ＢＡＣについての選択（１８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール又は５０μｇ／ｍＬのカナマイシンのいずれか）、並びにＣａｓ９及びラムダレッドの発現の抑制（２％グルコース）を有するＬＢ寒天に播種した。本発明者らは、単離されたコロニーを、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及びＢＡＣについての抗生物質選択を有するＬＢ培地に接種し、培養物を、振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。細胞を誘導し、コンピテント化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及びＢＡＣについての抗生物質選択を有する培地に、一晩培養物を１：５０で希釈した。細胞がＯＤ_６００≒０．２に達したら（通常は２時間後）、本発明者らは、アラビノースを最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）まで添加することによってラムダレッド及びＣａｓ９の発現を誘導し、振とうしながら３７℃でさらに１時間インキュベーションを続けた。本発明者らは細胞を採取し、これらをエレクトロコンピテント化した（Fredens, et al., 2019; Robertson et al., 2021）。

【0177】

ＲＥＸＥＲによる合成ＤＮＡのゲノム組み込みでは、本発明者らは、エレクトロコンピテントな誘導された細胞を、スペーサーＲＮＡをコードする２μｇのプラスミドpKW3_MB1amp_tracr_スペーサーで形質転換した。３７℃で振とうしながら４ｍＬのＳＯＢ培地中に１時間回収した後、本発明者らは、培養物を、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを有する５０ｍＬのＬＢ培地に移し、スペーサーＲＮＡについて選択し（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）、ＢＡＣについて抗生物質選択をし、そして、振とうしながら３７℃で３時間インキュベーションを続けた。本発明者らは、培養物を、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、ＢＡＣについての抗生物質選択、並びにゲノム上のネガティブマーカー及びＢＡＣ骨格上のネガティブマーカーについて選択する薬剤（ｒｐｓＬに対する２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、ｓａｃＢに対する７．５％ショ糖、及び／又はｐｈｅＳ^＊に対する２．５ｍＭの４－ＣＰ）を有するＬＢ寒天に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、本発明者らは、１０個～１１個のコロニーを採取し、これらを３０μＬの水に溶解した。本発明者らは、各クローンを、コロニーＰＣＲによって、上流のゲノムダブルセレクションカセット（遺伝子座^０）の喪失、及び下流のダブルセレクション（遺伝子座^１）のゲノム組み込みについて評価した。本発明者らは、コロニーＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングによって、最初の５つのクローンをさらに検証した。全てのオリゴヌクレオチド配列を表５～１４に示す。

【0178】

ＣＯＮＥＸＥＲ
ＣＯＮＥＸＥＲは、コンピテントドナー細胞とレシピエント細胞との接合の準備を必要とする。ドナー細胞は、伝達不可能な接合性プラスミドpJF146（受託番号ＭＫ８０９１５４．１、（Fredens, et al., 2019））、並びに組み込みのための合成ＤＮＡ、ｏｒｉＴ配列、及びユニバーサルスペーサーアレイを有するＢＡＣを有する。ｏｒｉＴの方向は、レシピエント細胞におけるＣａｓ９切断の早すぎる開始による部分的切除のリスクを最小にするために、スペーサーアレイがレシピエント細胞に最後に入ることを確実にする。レシピエント細胞は、組み込み部位の上流末端をマークする遺伝子座^０のゲノムダブルセレクションカセット、並びに、Ｃａｓ９及びラムダレッド成分の誘導性発現のためのヘルパープラスミドpKW20を有している。奇数及び偶数のＢＡＣは、基本的にはＲＥＸＥＲ及びＧＥＮＥＳＩＳについて記載されているような交互選択戦略での、繰り返しＣＯＮＥＸＥＲステップにおける隣接したゲノム領域の置き換えのために、交互であり得る（非特許文献１４、５）。

【0179】

ここで、本発明者らは、１００ｋｂの合成ＤＮＡインサート及びＢＡＣ骨格上のｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒ（又はｓａｃＢ－ｃａｔ）とそれに続くｐｈｅＳ^＊（又はｒｐｓＬ）を有する偶数（又は奇数）のＢＡＣを有するドナー株、並びに遺伝子座^０にゲノムｓａｃＢ－ｃａｔ（又はｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒ）セレクションカセットを有するレシピエント株での、ＣＯＮＥＸＥＲを記載する。本発明者らは、ドナー株を、飽和するまで、pJF146についての選択（５０μｇ／ｍＬのアプラマイシン）及びＢＡＣについての選択（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）を有する２５ｍＬのＬＢ培地中で一晩増殖させた。本発明者らは、レシピエント株を、飽和するまで、ヘルパープラスミドについての選択（５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン）、ゲノムダブルセレクションカセット（２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール又は５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）、並びにＣａｓ９及びラムダレッドの発現の抑制（２％グルコース）を有する２５ｍＬのＬＢ培地中で一晩増殖させた。本発明者らは、各培養物から遠心分離によって細胞を採取し、ペレットを１ｍＬのＬＢ培地中で３回洗浄した。最終の洗浄の後、本発明者らは、ペレットを８００μｌのＬＢ中に再懸濁した。本発明者らは、１６０μｌのレシピエントを６４０μｌのドナーと混合し、混合物をＬＢ寒天プレートにスポットし、スポットが乾燥したら、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。接合の後、本発明者らは、細胞をプレートから洗い流し、全てを、ヘルパープラスミド（５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン）及びＢＡＣ（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）を有するレシピエント細胞についての選択を有する、２５０ｍＬの事前に温めたＬＢ培地に移し、Ｃａｓ９及びラムダレッドの発現を誘導した（０．５％Ｌ－アラビノース）。振とうしながら３７℃で１．５時間インキュベートした後、本発明者らは、細胞を遠心分離によって採取し、全てを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（又は２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、並びにＣａｓ９及びラムダレッドの発現を抑制することによって組換えを終わらせるための２％グルコースを有する、２５０ｍｌ事前に温めたＬＢにすぐに移した。振とうしながら３７℃でさらに２．５時間インキュベートした後、本発明者らは、培養物を遠心分離によって回転させ、ペレットを２ｍＬのMilli-Q濾水に再懸濁した。細胞懸濁液を、ヘルパープラスミドについての選択（５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン）、遺伝子座^１でのダブルセレクションカセットの組み込みについての選択（５０μｇ／ｍｌのカナマイシン又は２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）、遺伝子座^０でのダブルセレクションカセットの喪失についての選択（７．５％ショ糖又は２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）、及びＢＡＣ骨格の喪失についての選択（２．５ｍＭの４－ＣＰ又は２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン［このケースでは、骨格上のセレクションマーカーは遺伝子座^０のセレクションマーカーに等しいため、追加では添加されない］）を有するＬＢ寒天プレートに、連続希釈で広げた。ショ糖を有さないセレクションプレートでは、本発明者らは、Ｃａｓ９及びラムダレッドの発現を抑制するために２％グルコースを添加した。

【0180】

（最初のスクリーニングとは別の）ΔｒｅｃＡ宿主における実験では、本発明者らは、細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（又は２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、並びにＢＡＣを受け取った細胞をＣａｓ９及びラムダレッドの発現の１．５時間の誘導の前に増殖させるための２％グルコースを有する、２５０ｍｌの事前に温めたＬＢ中で２～８時間増殖させた。これによって、成功裏の組換え体の数がＣＯＮＥＸＥＲ実験から増大した。

【0181】

エピソームにおけるヒトＤＮＡのアセンブリのために、一部のＢＡＣを、ヒトＤＮＡインサートの後のｐｈｅＳ^＊－ＨｙｇＲダブルセレクションカセット及び骨格上のｒｐｓＬを使用した。ｐｈｅＳ^＊－ＨｙｇＲダブルセレクションカセットの維持について選択するために、本発明者らは、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを使用した。ｐｈｅＳ^＊－ＨｙｇＲダブルセレクションカセットの喪失について選択するために、本発明者らは、２．５ｍＭの４－ＣＰを添加した。ＢＡＣ骨格の喪失について選択するために、本発明者らは、２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを使用した。

【0182】

３７℃で一晩インキュベートした後、本発明者らは、１６～２４のコロニーを採取し、これらを３０μＬの水に溶解した。本発明者らは、ＲＥＸＥＲについて記載したように、各クローンを、コロニーＰＣＲによって、遺伝子座^０のｓａｃＢ－ｃａｔカセットの喪失、及び遺伝子座^１のｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの組み込みについて評価した。本発明者らは、ＮＧＳによる全ゲノムシーケンシングのために、遺伝子型が検証された５個～１６個のコロニーを選択した。全てのオリゴヌクレオチド配列を表５～表１４に示す。

【0183】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及びシーケンシングデータの分析
ＢＡＣＳ及びゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ、genomic DNA）を、QIAprep Spin Miniprepキット及びDNEasy Blood and Tissueキット（QIAGEN社製）をそれぞれ使用して、大腸菌の一晩の培養物から抽出した。ＮＧＳのための調製物は以前に記載されている（非特許文献１４、５）、Robertson, W. E. et al. Nat Protoc 16, 2345-2380, doi:10.1038/s41596-020-00464-3 (2021)。多くのゲノムの調製のために、自動ワークフローを以下のようにBiomek FXp（Beckman Coulter社）で行った：大腸菌培養物（５００μＬ）を１．２ｍＬの９６ウェルプレート内で一晩増殖させ、その後、ＡＴＬバッファー（QIAGEN社製、９０μＬ）及びプロテイナーゼＫ（１０μＬ）中に再懸濁し、そして５６℃で２時間インキュベートした。AMPure XP（Beckman Coulter社製、１００μＬ）を各ウェルに添加し、プレートをボルテックスした（１０００ｒｐｍ、６分間）。ビーズを磁化し（５分間）、上清を除去し、そして７０％ＥｔＯＨで洗浄し（３×４００μＬ）、その後、ｇＤＮＡをバッファーＡＥ（QIAGEN社製、１００μＬ）で溶出した。ｇＤＮＡを次いでＨ_２Ｏに１：１０で希釈し、検量線及び９６ウェルプレート内で１００μＬの総容積（ｅｘ／ｅｍ：５０２／５３２）を使用して、接続された蛍光プレートリーダー（Molecular Devices SpectraMAX I3）に適合したQubit（商標）dsDNA HSアッセイキット（Thermofisher社製）を使用して定量した。このデータをオンボードで処理し、０．２５ｎｇ／μＬまでのｇＤＮＡの直後の希釈に使用した。最後に、本発明者らは、Nextera XT DNA Library Preparationキット（Illumina社製）を、容積を減らした以外は製造者のプロトコルに従って用いて、ペアエンドシーケンシングライブラリーを準備した：インプットｇＤＮＡ（０．２～０．２５ｎｇ／μＬ、２μＬ）、ＴＤバッファー（３μＬ）、ＡＴＭ（２μＬ）、ＮＴバッファー（１．５μＬ）、インデックス（１μＬ）、ＮＰＭ（３．５μＬ）。インデックス配列を、Biomers社から購入した「Illumina Adapter Sequences」サポートドキュメント（Nextera DNAインデックス、第１６頁、２０２０年６月）から作製し、１０μＭで使用した。ライブラリーを次いで、AMPure XP磁気ビーズ（Beckman Coulter社製）を製造者の指示に従って用いて（７：１４のビーズ：反応物の容積比）精製し、Qubit（Thermofisher社製）によって定量し、プールし、そして製造者の指示に従って変性させた。

【0184】

ライブラリーを、MiSeq（Illumina社製、試薬キットv3（６００サイクル））、Illumina HiSeq2500（２００サイクル）、又はNextSeq 2000（Illumina社製、P2試薬キットv3（１００／２００サイクル））でペアエンドシーケンスした。下流のシーケンシング分析は、以前に詳述されているようにカスタムPythonスクリプトで行った（非特許文献１４）、Robertson et al., 2021。標的ゲノム領域全体のリコードの状況を作成するために、本発明者らは、以前に詳述されているようにカスタムPythonスクリプトを使用した（非特許文献１４）、Robertson et al., 2021。アウトプットは、対象のゲノム領域全体でプロットされた各標的コドンでのリコードの頻度である。

【0185】

宿主因子ＫＯ株の作製
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性の切断による遺伝子欠失及びラムダレッドリコンビニアリングのために、本発明者らは、Jiang et al. (2013) (Jiang, W., et al. Nat Biotechnol 31, 233-239, doi:10.1038/nbt.2508 (2013))の手順を採用した。本発明者らは、ガイドをコードするｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いるpMSP43骨格への制限ライゲーションによって、スペーサー配列を有するスペーサープラスミドをクローニングした。簡潔に述べると、本発明者らは、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをT4 PNK（NEB社製）でリン酸化し、アニーリングし、そしてpMSP43骨格とライゲーションした。本発明者らは、得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ１０ｂに形質転換し、配列をサンガーシーケンシングによって検証した。宿主因子の単一の欠失を、ヘルパープラスミドpKW20を有するＬＳ２３にｓａｃＢ－ｃａｔダブルセレクションカセットが組み込まれた、ゲノムが減少したストレプトマイシン耐性の大腸菌で行った。本発明者らは、培養物をＬＢ中でＯＤ_６００＝０．２まで増殖させ、次いで、Ｌ－アラビノース（０．５％）を添加して、Ｃａｓ９及びラムダレッドを誘導した。１．５時間のアラビノース誘導の後、細胞を採取し、氷冷したMilli-Q水の中の２０％（ｗ／ｖ）グリセロール５０ｍＬで３回洗浄することによってエレクトロコンピテント化した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性の切断では、標的特異的なスペーサー配列（スペクチノマイシン耐性を付与する）を発現するさらなるヘルパープラスミドを、２つの終止コドン及びフレームシフト変異を標的遺伝子に導入する修復ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとコエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、３７℃で１時間、１ｍｌのＳＯＢ中に培養物を回収し、次いで、選択ＬＢ寒天プレート（７５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及びＣａｓ９活性の継続のための０．５％Ｌ－アラビノース）に播種した。翌日、本発明者らは、コロニーを選択プレートから採取し、標的化された遺伝子領域をコロニーＰＣＲによって増幅した。欠失をサンガーシーケンシングによって確認した。その後、反復継代によって、欠失株のヘルパープラスミド（ｓｐｅｃＲを有するpHFXX）を除去した。除去はフェノタイピングによって確認した。

【0186】

連続的ゲノム合成
連続的ゲノム合成のために、ＣＯＮＥＸＥＲ １００ｋ２４をまず、ＬＳ２３にｓａｃＢ－ｃａｔダブルセレクションカセットを有する、ゲノムが減少したストレプトマイシン耐性の大腸菌ΔｒｅｃＡで行った。翌日、４０個のクローンをセレクションプレートから採取し、個別に増殖させた。本発明者らは、各クローンを、ＲＥＸＥＲについて記載したように、フェノタイピングによって、ＬＳ２３でのｓａｃＢ－ｃａｔカセットの喪失及びＬＳ２４でのｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの組み込みについて評価した。正しい表現型を有するクローン（３９個）を、その後、等しい比率で２５ｍＬの総容積までプールした。この細胞プールは、ＣＯＮＥＸＥＲ １００ｋ２５のためのレシピエント培養物として機能した。セレクションプレートから９６個のクローンを採取し、個別に増殖させた。ここでも、本発明者らは、各クローンを、フェノタイピングによって、ＬＳ２４でのｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの喪失及びＬＳ２５でのｓａｃＢ－ｃａｔカセットの組み込みについて評価した。正しい表現型を有するクローン（７２個）を、その後、等しい比率で２５ｍＬの総容積までプールした。この細胞プールは、ＣＯＮＥＸＥＲ １００ｋ２６のためのレシピエント培養物として機能した。セレクションプレートから９６個のクローンを採取し、個別に増殖させた。ここでも、本発明者らは、各クローンを、フェノタイピングによって、ＬＳ２５でのｓａｃＢ－ｃａｔカセットの喪失及びＬＳ２６でのｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの組み込みについて評価した。正しい表現型を有するクローン（５３個）を、その後、等しい比率で２５ｍＬの総容積までプールした。この細胞プールは、ＣＯＮＥＸＥＲ １００ｋ２７のためのレシピエント培養物として機能した。翌日、セレクションプレートから９６個のクローンを採取し、個別に増殖させた。ここでも、本発明者らは、各クローンを、フェノタイピングによって、ＬＳ２６でのｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの喪失及びＬＳ２７でのｓａｃＢ－ｃａｔカセットの組み込みについて評価した。正しい表現型を有するクローン（７７個）を、その後、等しい比率で２５ｍＬの総容積までプールした。この細胞プールは、ＣＯＮＥＸＥＲ １００ｋ２８のためのレシピエント培養物として機能した。翌日、セレクションプレートから２８８個のクローンを採取し、個別に増殖させた。ここでも、本発明者らは、各クローンを、フェノタイピングによって、ＬＳ２７でのｓａｃＢ－ｃａｔカセットの喪失及びＬＳ２８でのｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの組み込みについて評価した。正しい表現型を有するクローン（２８４個）の全ての中から、１８２個をＮＧＳによってシーケンシングした。

【0187】

連続的ゲノム合成における、完全にリコードされたクローンの予想される頻度を計算するために、本発明者らは、ＣＯＮＥＸＥＲの各ステップの完全にリコードされたクローンの実験的に決定された頻度を掛け合わせた。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

［実施例１］

【0188】

大腸菌においてカスタム合成ゲノムを作製するための迅速かつ一般的な方法
概要
全ゲノム合成及び大規模ゲノム改変は、生物の機能を理解するため、生合成経路を大規模に改変するため、及び天然で見られる機能よりも優れた機能を有する生物を作製するための強力なアプローチを提供するために有望である。ゲノムＤＮＡを合成ＤＮＡで置き換えるための単純な、ロバストな、短時間のスケーラブルな方法は、ゲノム合成及び大規模ゲノム改変をより短時間にする。

【0189】

ここで、本発明者らは、大腸菌ゲノムへの１００ｋｂを超える合成ＤＮＡの導入を単純化する及び短時間にするアプローチを報告する。本発明者らの方法は、迅速な（１日の）プロトコルを使用してこれを達成し、このプロトコルは、さらに大きな合成ＤＮＡ配列を導入するために繰り返してもよい。重要なことに、本方法は、全ての必要な成分を標準化及び一体化し、その結果、ユーザーが行う必要があるのは、所望の合成ＤＮＡを細菌人工染色体にクローニングし、次いで標準的なプロトコルを実行するだけである。

【0190】

結果
本明細書で議論される通り、ユニバーサルスペーサーを使用したＲＥＸＥＲは、切除されたドナー核酸の末端に存在する非相同配列を生じさせるため、ユニバーサルスペーサーを使用したＲＥＸＥＲの誘導体が機能するかどうかは不明であった。これが望ましくない挿入又は欠失をもたらすかどうかについては不明であった。

【0191】

ユニバーサルスペーサーでのＲＥＸＥＲの効率及び忠実度を調べるために、本発明者らはまず、本発明者らがＲＥＸＥＲ及びＧＥＮＥＳＩＳを介する大腸菌ゲノム合成に使用したＢＡＣ骨格の各々に結合し、当該ＢＡＣ骨格内の切断を指向する、２つのスペーサーＲＮＡ対（ユニバーサル１及びユニバーサル２）（表３、並びに配列番号２４及び２５）を設計し、クローニングした（図２ａ）。ユニバーサル１及びユニバーサル２は、奇数及び偶数でそれぞれ指定されているゲノムセクションに使用したＢＡＣ骨格を標的化する（図４）。

【0192】

本発明者らはまず、合成ＤＮＡが、ＢＡＣからのユニバーサルスペーサーＲＮＡを介するＣａｓ９切除の結果生じる両端の非相同配列にもかかわらず、スカーレスにゲノムに組み込まれることを実証した。本発明者らは、リコードされた合成ＤＮＡ １００ｋ１３、１００ｋ２２、１００ｋ２４、１００ｋ２８、及び１００ｋ３７を用いて、ＲＥＸＥＲを複数の遺伝子座で試験した（非特許文献１４）（図４及び表３）。ＲＥＸＥＲでは、合成ＤＮＡのゲノム組み込みは、ＢＡＣ内のゲノム組み込み部位の上流末端及び合成ＤＮＡインサートの下流末端に位置する抗生物質耐性マーカーでの同時のポジティブ及びネガティブセレクションによって、選択される（図１ａ）。成功裏の組換えは、組み込み部位の５’末端（遺伝子座^０）でのゲノムセレクションカセットの喪失、及び３’末端（遺伝子座^１）でのセレクションカセットの組み込みをもたらす。本発明者らは、試験した５つの遺伝子座の各々での１１／１１のＲＥＸＥＲ後のクローンの成功裏の組み込みを確認した（図２ｂ）。

【0193】

本発明者らは、ＲＥＸＥＲ後のクローンにおける組換えについて相同性領域の周辺の配列を検証し、全てのクローンが６ｂｐの非相同配列を喪失していることを確認した（図２ｃ）。したがって、両ユニバーサルスペーサーセットによって作製されたミスマッチ配列は、試験した５つの遺伝子座全てで、ＲＥＸＥＲ実験において効率的かつ確実に除去されている。本発明者らは、ユニバーサルスペーサーがゲノム内への大きな合成ＤＮＡのスカーレスな組み込みを可能にすると結論付ける。

【0194】

次に、本発明者らは、ＲＥＸＥＲへのユニバーサルスペーサーの使用が、合成ＤＮＡでの置き換えについて標的化されている１００ｋｂのゲノム領域全体にわたる組換えに影響するかどうかを評価した。ＢＡＣからの合成ＤＮＡインサートと、置き換えについて標的化されている対応するゲノムＤＮＡとの間のＲＥＸＥＲは、組換えによる交差（crossover）の結果生じるキメラ配列を生じさせ得る（非特許文献５）。これらの交差は、リコードされたＤＮＡと野生型ＤＮＡとの間の相同性の程度が高いと促進される：大腸菌ゲノム全体にわたり同義コドン圧縮を行うために本発明者らが使用した合成ＤＮＡと、対応する天然のゲノムＤＮＡ配列との間には、およそ９８．５％の配列同一性がある（非特許文献１４）。本発明者らはこれまでに、ＲＥＸＥＲから生じたキメラが、細胞によって許容されない合成ＤＮＡにおける配列の同定及び固定に非常に有用であり得ることを示している。本発明者らがＲＥＸＥＲで観察した交差頻度は、合成ＤＮＡが対応するゲノムＤＮＡを完全に置き換えている（細胞が合成ＤＮＡ配列全体を許容していると推測される）８つのクローンのうち少なくとも１つを得るために十分に低いため、理想的である。同時に、交差頻度は、許容されない合成ＤＮＡ配列内の領域（個々のコドン位置を含む）を効率的に特定できるほどに十分に高い。これは、いくつかのＲＥＸＥＲ後のクローン又はＲＥＸＥＲ後のクローンのプールのシーケンシング、並びに各コドン位置でのリコードの頻度の分析を介して行われ（非特許文献１４、５）、各コドン位置でのリコードの頻度は、シーケンシングデータに基づいてリコードの状況をまとめることによって可視化することができる（図２ｄ）。一度もリコードされていないコドン位置は、試験中のスキームによるリコードを許容しない可能性がある。

【0195】

本発明者らはまず、９６．５ｋｂの大腸菌ゲノムを置き換えるための、同一のリコードされた合成ＤＮＡ １００ｋ２４でのＲＥＸＥＲで、ユニバーサルスペーサーＲＮＡの使用とＨＲ特異的なスペーサーＲＮＡの使用とを比較した。以前のＲＥＸＥＲ実験から、本発明者らは、全ての設計された同義コドンの置き換えがこの領域で許容されることが分かっている（非特許文献１４）。まとめられた状況は同様であるが、ユニバーサルスペーサーＲＮＡで開始されたＲＥＸＥＲは、２倍多くの、合成ＤＮＡが完全に組み込まれたクローンと、４０％の完全にリコードされたＲＥＸＥＲ後のクローンをもたらした（図２ｄ及び図５）。したがって、切除された合成ＤＮＡに短い非相同末端が存在しているにもかかわらず、本発明者らは、より高い頻度の交差を観察していない。驚くべきことに、ユニバーサルスペーサーでのＲＥＸＥＲの全体的な効率は、ＨＲ特異的なスペーサーでの場合と少なくとも同様に良好である。

【0196】

本発明者らは、組換えのための鋳型上での末端ミスマッチの生成が組換え及び組み込みの効率を妨げないと結論付ける。本発明者らは、真核生物のＦＥＮ１について記載されているメカニズムと同様に（非特許文献２１、２２）、ＢＡＣ内のＤＮＡの非相同末端が組換えの前にエキソヌクレアーゼによって（非特許文献１９）、又は組換えの間にEcoIXなどのフラップエンドヌクレアーゼによって（非特許文献２０）除去され得ることを示唆する。

【0197】

ＲＥＸＥＲは、コンピテント細胞の調製及びエレクトロポレーションからなる２つの連続的なラウンドを必要とし、これは、適切にマークされたゲノムを有する細胞から開始して、ＲＥＸＥＲ後の寒天プレート上でのクローンコロニーを得るまでに４日間を要する。ゲノムへの合成ＤＮＡの導入を短時間にし、単純化するために、本発明者らは、ユニバーサルスペーサーアレイ及びｏｒｉＴ配列がＢＡＣ骨格に組み込まれているＢＡＣを作製した（図３、並びに配列番号２６及び２７）。これらの新たなＢＡＣ（合成ＤＮＡインサートを有する）及び伝達不可能なＦ’プラスミドを有する「ドナー細胞」と所望の「レシピエント細胞」とを混合したら、本発明者らは、接合伝達を介するレシピエントへのＢＡＣ伝達について選択した。本発明者らは、アラビノースで１．５時間、レシピエントにおけるヘルパープラスミドからのＣａｓ９タンパク質及びラムダレッド組換え成分の発現をオンにし、その後、グルコースで２．５時間、それらの発現をオフにした。スペーサーはＢＡＣから発現された。本発明者らは、ネガティブセレクションマーカーがゲノムから喪失しておりポジティブセレクションマーカーがＢＡＣから獲得されているレシピエント細胞について選択した。この１日のユニバーサルプロトコルを使用して、本発明者らは、レシピエント細胞において、対応するゲノムＤＮＡの代わりに合成ＤＮＡ（完全にリコードされた断片２４、９６ｋｂ）を導入した。クローンの１９％で、合成ＤＮＡは対応するゲノム配列を完全に置き換えた（図３ｂ）。本発明者らは、本発明者らの短時間のアプローチをＣＯＮＥＸＥＲ（強化型組換えのためのプログラムされた切除と組み合わされた接合、CONjugation coupled with programmed EXcision for Enhanced Recombination）と名付けた。
［実施例２］

【0198】

エピソームにおけるＭｂｐサイズのヒトＤＮＡのアセンブリ
エピソーム内での大きなＤＮＡのアセンブリは、ゲノム構築のための基礎的な技術を提供する。全体的に合成のマイコプラズマゲノムは、マイコプラズマへの伝達の前に酵母内でアセンブルされている。植物及び動物のＧｂｐサイズのゲノムを数十から数百Ｍｂｐの長さの染色体で合成するには、妥当な数のステップの、染色体内のＤＮＡを置き換えるために使用することができる、ＭｂｐサイズのＤＮＡをアセンブルするための技術が必要である。

【0199】

特に、本質的に完全なヒトゲノムのシーケンシングに使用されるヒトＤＮＡは、大腸菌内のＢＡＣに主にキャプチャーされた。多くの、ヒト、動物、及び作物のゲノム配列の反復的性質によって、大腸菌は、合成のＧｂｐサイズのゲノムを構築するためのＤＮＡをアセンブルするための魅力的な宿主である。本発明者らは、ＣＯＮＥＸＥＲについて本発明者らが確立した原理を、大腸菌内エピソームへのメガベースサイズのＤＮＡの繰り返し挿入を介するスカーレスなアセンブリ及びクローニングの実現に拡張することができると仮定した。

【0200】

本発明者らは、その中にＤＮＡを繰り返し挿入しアセンブルするためのアセンブリＢＡＣを設計した（図６ａ）。このＢＡＣは、次に挿入される配列の一方の末端に相同なおよそ５０ｂｐの配列（ＨＲ１）を有する。このすぐ後には、ポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセット、並びに、挿入される配列の他方の末端に相補的なユニバーサル相同性領域（ｕＨＲ）が続く。本発明者らはまた、ユニバーサルスペーサー及びｏｒｉＴを有する、ＣＯＮＥＸＥＲ骨格を有するドナーＢＡＣを設計した（図６ａ）。ドナーＢＡＣでは、ＨＲ１は、レシピエントＢＡＣに挿入される次のＤＮＡ配列の一方の末端内にある。このＤＮＡ配列の次には、異なるポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセット、並びにユニバーサル相同性領域が続く。アセンブリの各ステップ（図６ａ、図６ｂ）は、アセンブリＢＡＣを有するレシピエント細胞へのドナーＢＡＣの接合、ドナーＢＡＣからのＨＲ１からユニバーサル相同性領域までの配列のＣａｓ９介在性の切除、及びアセンブリＢＡＣへのこの配列のラムダレッド介在性の挿入によって進められる。アセンブリＢＡＣ上でのネガティブセレクションマーカーの喪失、及びドナーＢＡＣから切除された配列からのポジティブマーカーの獲得についての選択は、挿入が正確なアセンブリＢＡＣを有する細胞を選択する。新たなアセンブリＢＡＣを有する細胞は、次の挿入ステップのためのインプットを提供する。本発明者らは、本発明者らのアプローチを、ＢＡＣの段階的挿入合成（ＢＡＳＩＳ）と名付けた。

【0201】

本発明者らはまず、ＢＡＳＩＳによる２０８Ｋｂｐのヒト嚢胞性線維症膜貫通調節因子遺伝子のそのアセンブリを実証した。本発明者らは、各々がおよそ７０Ｋｂｐの遺伝子断片を有する２つのドナーＢＡＣＳ及び１つのレシピエントエピソームでの３ステップのＢＡＳＩＳでＣＦＴＲ遺伝子をアセンブルした。本発明者らは、次世代シーケンシングによって各中間ステップアセンブリ及び最終アセンブリを検証した（図６ｃ）。

【0202】

次に、本発明者らは、ＢＡＳＩＳを、エクソン領域、イントロン領域、及び遺伝子間領域を含むヒトゲノムＤＮＡの大きなセクションを１つのエピソームにアセンブルするために使用することができることを実証した。本発明者らは、ヒトゲノムの本質的に完全なシーケンシングに使用したヒトＢＡＣのライブラリーで開始した。これらのヒトＢＡＣの各々はおよそ１００ＫｂｐのヒトＤＮＡを有しており、ヒトＢＡＣ配列間にはかなりのオーバーラップが存在する。

【0203】

本発明者らは、１ステップのラムダレッド組換えを使用して、２１番染色体の領域をカバーするヒトＢＡＣライブラリーのメンバーを、ＢＡＳＩＳのためのドナーＢＡＣに変換した。このステップは、ポジティブセレクションカセット及びネガティブセレクションカセット、ｕＨＲ、ｏｒｉＴ、並びにユニバーサルスペーサーを導入した。本発明者らは、３ステップのＢＡＳＩＳを行って、４９５ＫｂｐのヒトＤＮＡを有する５０３Ｋｂｐのエピソームをアセンブルした。本発明者らは、正確にアセンブルされたクローンをシーケンシングによって同定し、これらのクローンをＢＡＳＩＳの次のステップのためのインプットとして使用し、最終アセンブリもシーケンシングによって検証した（図６ｄ）。
［実施例３］

【0204】

交差の最小化
本発明者らの大腸菌ゲノム合成において、ＲＥＸＥＲの各ステップの後にゲノムシーケンシングを行って、次のＲＥＸＥＲラウンドのためのインプットとして使用することができる１つの正確なクローンを同定した。１００ＫｂｐのゲノムＤＮＡの全てを合成ＤＮＡで置き換えた各ステップからのクローンはおよそ２０％のみであったため、進行に使用するための正確な中間クローンを同定することが必要であった。したがって、各ステップでの正確なクローンの同定を伴わない場合、５つのステップで得られる完全にリコードされたクローンの頻度は３×１０^－４以下であり、したがって、正確な配列を有する１つのクローンを同定するためには、何万ものクローンをシーケンシングする必要がある。したがって、ＲＥＸＥＲの各ステップの後のシーケンシングが、合成を完了するために必要であったが、これは合成を大きく遅延させ、その費用を増大させた。

【0205】

本発明者らは、１つのＣＯＮＥＸＥＲに由来するクローンのシーケンシングされていないプールを次のＣＯＮＥＸＥＲのためのインプットとして直接使用することによってＣＯＮＥＸＥＲを繰り返すことを構想した。このために、本発明者らは、１ステップのＣＯＮＥＸＥＲでゲノムＤＮＡが合成ＤＮＡで完全に置き換えられているクローンの画分を実質的に増大させる因子を同定することにした。

【0206】

本発明者らは、ＤＮＡの修復、複製、及び組換えに関与する２０個の因子を同定して、ＣＯＮＥＸＥＲへのそれらの寄与を試験した。本発明者らは、大腸菌内でこれらの因子の各々を欠失させ、得られた欠失株において１００ｋ ２４でＣＯＮＥＸＥＲを行った。これらの実験は、ｒｅｃＡ及びｒｅｃＯを、完全に合成の配列を有するクローンの画分を増大させる因子として同定した（図６ａ、図９）。ｒｅｃＡの欠失（ΔｒｅｃＡ）は、１００ｋ ２４で、完全に合成のＤＮＡの画分を２０％からおよそ８０％まで増大させた（図７ａ）。本発明者らは、いくつかの他の１００Ｋｂｐの領域で類似の劇的な増大を観察し、これは本発明者らの観察結果の普遍性を明確に示している（図７ｂ）。
［実施例５］

【0207】

迅速かつ連続的なゲノム合成
本発明者らが観察した、１ステップのＣＯＮＥＸＥＲにおける合成ＤＮＡでのゲノムＤＮＡでの完全な置き換えの増大に後押しされて、本発明者らは、１ラウンドのＣＯＮＥＸＥＲのアウトプットを、個々の完全にリコードされたクローンをシーケンシングによって同定することなく、次のラウンドのＣＯＮＥＸＥＲのためのインプットとして直接使用することができるかどうかを調べた。

【0208】

本発明者らはまずＣＯＮＥＸＥＲを行って、そのゲノムのランディング部位（ＬＳ、landingsite）２３に＋２／－２セレクションカセットを有するΔｒｅｃＡ大腸菌において、ＬＳ２３とＬＳ２４との間で、大腸菌ゲノムを合成のリコードされたＤＮＡで置き換えた（図８ａ、図１０）。本発明者らは、ゲノムからのネガティブ７マーカーの喪失（ＬＳ２３にある＋２／－２カセットにおける）及び合成ＤＮＡに関連するポジティブマーカーの獲得（ＬＳ２４にある＋１／－１カセットにおける）について選択した。本発明者らは、クローンをセレクションプレートから採取し、これらを一晩増殖させた。一晩の増殖と並行して、本発明者らは、クローンをセレクティブ寒天上にスタンプして、これらクローンが正確なＣＯＮＥＸＥＲ後表現型を確実に有するようにした。翌日、ＬＳ２４とＬＳ２５との間のゲノムＤＮＡが合成ＤＮＡで置き換えられている正確な表現型のクローンをプールし、次のラウンドのＣＯＮＥＸＥＲのための直接的なインプットとして使用した（１００ｋ２５）（図８ａ）。本発明者らは、ゲノムからのネガティブマーカーの喪失（ＬＳ２４にある＋１／－１カセットにおける）及び合成ＤＮＡに関連するポジティブマーカーの獲得（ＬＳ２５にある＋２／－２カセットにおける）について選択した。本発明者らは、基本的には記載されている通りに、前ラウンドのＣＯＮＥＸＥＲからクローンを採取し、プールし、そして、得られたプールを次のラウンドのＣＯＮＥＸＥＲのためのインプットとして使用した（１００ｋ２６）。本発明者らは、５ラウンドのＣＯＮＥＸＥＲを行って、大腸菌ゲノムのＬＳ２３とＬＳ２８との間の０．５Ｍｂｐのセクションを合成ＤＮＡで置き換えた（図８ａ）。プロセス全体は１０日間を要した。シーケンシングによって、５ラウンドのＣＯＮＥＸＥＲの後、標的化された０．５Ｍｂｐのゲノム領域全体で１０パーセントのクローン（１８２のうち１９）が完全にリコードされたことが明らかになった（図５ｂ）。本発明者らは、本発明者らが迅速かつ連続的なゲノム合成（ＧＣＳ、continuous genome synthesis）のための方法を開発したと結論付ける。

【0209】

考察
本発明者らは、少なくとも１００Ｋｂｐの合成ＤＮＡを大腸菌ゲノムに導入するための、１ステップの、１日の、ユニバーサルプロトコルを実現した。本発明者らは、宿主ゲノムと合成ＤＮＡとの間の交差を最小化し、連続的ゲノム合成を可能にする、宿主因子ノックアウトを同定した。本発明者らは、０．５Ｍｂｐの大腸菌ゲノムセクションをＢＡＣから１０日間で構築するための、連続的ゲノム合成を実証した。この方法は並列化可能であるため、７～８株で、ゲノムをカバーしている合成ＤＮＡを約１０日間で構築することが可能であろう。この利点を、０．５Ｍｂｐの合成のリコードされたセクションを１つの株にまとめるために得られた迅速で正確な方法と組み合わせることによって（非特許文献１４、１２）、本発明者らは、本発明者らの利点が、大腸菌ゲノムを合成するためのタイムスケールを数年から数週間まで減少させると予測する。さらに、本発明者らは、本発明者らのアプローチが多くのゲノムの並行した構築を可能にして、ゲノムレベルの仮説を大規模で試験すること及び新たな細胞機能を発見するためにゲノムライブラリーを作製することを可能にすると予測する。

【0210】

本発明者らが大腸菌ゲノム合成について確立した原理を拡張することによって、本発明者らは、大きなヒトゲノム領域を有するエピソームのスカーレスなアセンブリを実現した。本発明者らは、ヒトＢＡＣ由来の天然配列のアセンブリを介してこの原理を例示してきたが（Osoegawa, K. et al. Genome Res 11, 483-496, doi:10.1101/gr.169601 (2001)）、このアプローチはまた、合成ＤＮＡ断片をアセンブルするためにも使用することができる。さらに、ヒト、動物、又は植物の細胞におけるよりもはるかに迅速に、アセンブルされたヒトＤＮＡの大きな領域を編集するために、大腸菌におけるマルチプレックス編集のための多くの方法（Wang, H. H. et al. Nature 460, 894-898, doi:10.1038/nature08187 (2009)、Tong, Y., et al. Nat Commun 12, 5206, doi:10.1038/s41467-021-25541-3 (2021)、Jiang, W., et al., Nat Biotechnol 31, 233-239, doi:10.1038/nbt.2508 (2013)、Farzadfard, F. & Lu, T. K. Science 346, 1256272, doi:10.1126/science.1256272 (2014)）をアセンブリと組み合わせてもよい。これらの方法を、大きなエピソーム性のＤＮＡを動物細胞内に移動させるため（Waters, V. L. Nat Genet 29, 375-376, doi:10.1038/ng779 (2001)、Litzkas, P., Jha, K. K. & Ozer, H. L. Mol Cell Biol 4, 2549-2552, doi:10.1128/mcb.4.11.2549-2552.1984 (1984)）、及び動物染色体への合成ＤＮＡの繰り返し組換えのため（Martella, A., et al. ACS Synth Biol 6, 1380-1392, doi:10.1021/acssynbio.7b00016 (2017)、Lee, E. C. et al. Nat Biotechnol 32, 356-363, doi:10.1038/nbt.2825 (2014)、Macdonald, L. E. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 5147-5152, doi:10.1073/pnas.1323896111 (2014)）のアプローチと組み合わせてもよい。

【0211】

全体として、エピソームにおいて大きなＤＮＡを迅速にアセンブルする能力、及び連続的ゲノム合成方法の開発は、迅速かつスケーラブルなゲノム合成のための基礎を提供する。

【0212】

（参考文献）
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【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】