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特表2024-542125アミロイド病変に対する治療アプローチとしてのＡＰＰ発現のＣＲＩＳＰＲ媒介性操作
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】アミロイド病変に対する治療アプローチとしてのＡＰＰ発現のＣＲＩＳＰＲ媒介性操作
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241106BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/09 110
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/113 Z
A61K48/00
A61P25/28
A61P43/00 111
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K35/76
A61P25/00
A61P9/00
C12N15/864 100Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526778
(86)(22)【出願日】2022-10-28
(85)【翻訳文提出日】2024-06-25
(86)【国際出願番号】 CN2022128123
(87)【国際公開番号】W WO2023072225
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,689
(32)【優先日】2021-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/334,650
(32)【優先日】2022-04-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】598082547
【氏名又は名称】ザ・ホンコン・ユニバーシティー・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
(71)【出願人】
【識別番号】524163579
【氏名又は名称】ホンコン センター フォー ニュロウディジェナラティヴ ディジージズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イップ、ナンシー ユク ユイ
(72)【発明者】
【氏名】フー、キット ユイ
(72)【発明者】
【氏名】トアン、ヤンヤン
(72)【発明者】
【氏名】イェー、タオ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084MA52
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA161
4C084ZA361
4C084ZC412
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA17
4C086MA23
4C086MA28
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C086ZC41
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA52
4C087MA59
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA16
4C087ZC41
(57)【要約】
アルツハイマー病などのアミロイド病変の治療又は予防のための組成物及び方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミロイド病変の治療又はアミロイド病変のリスク低減を必要とする個人においてアミロイド病変を治療する又はアミロイド病変のリスクを低減させるための方法であって、前記個人に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ゲノム配列を破壊する組成物の有効量を投与するステップを含む、
前記方法。
【請求項2】
前記投与するステップの前に、前記個人のゲノムの少なくとも一部分のシーケンシングを行うことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記個人のＡＰＰゲノム配列が少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの変異が、スウェーデン型変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ型変異（Ｉ７１６Ｖ）、ロンドン型変異（Ｖ７１７Ｉ）、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの変異がスウェーデン型変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記アミロイド病変が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症、又はダウン症である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ＡＤが、家族性ＡＤ又は弧発性ＡＤである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記個人がＡＤと診断されているか、又は前記個人がまだＡＤと診断されていないがＡＤの既知のリスク因子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記組成物が、前記ＡＰＰゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記組成物が、（１）前記ＡＰＰゲノム配列内の位置を標的とするスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ；及び
（２）前記ｓｇＲＮＡ
をコードする１つ又は複数のベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ｓｇＲＮＡが、前記ＡＰＰゲノム配列内の、前記少なくとも１つの変異を含む領域又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位を含む領域を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（好ましくは化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９））と１つのｓｇＲＮＡとをコードする１つのベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記１つ又は複数のベクターが、１つのウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセル剤の形態で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
アミロイド病変の治療又はアミロイド病変のリスク低減を必要とする個人においてアミロイド病変を治療する又はアミロイド病変のリスクを低減させるためのキットであって、ＡＰＰゲノム配列を破壊する組成物を収容する容器を含む、
前記キット。
【請求項17】
前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のため、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
前記組成物が、前記ＡＰＰゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項19】
前記組成物が、（１）前記ＡＰＰゲノム配列内の１つの位置を標的とするスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ；及び
（２）前記ｓｇＲＮＡ
をコードする１つ又は複数のベクターを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項20】
前記ｓｇＲＮＡが、前記ＡＰＰゲノム配列内の、前記少なくとも１つの変異を含む領域又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位を含む領域を標的とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（好ましくは、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９））と１つのｓｇＲＮＡとをコードする１つのベクターを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項22】
前記１つ又は複数のベクターが、１つ又は複数のウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１９～請求項２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項23】
前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される、請求項１６に記載のキット。
【請求項24】
前記個人のゲノムの少なくとも一部分のシーケンシングを行うための薬剤を収容する第２の容器をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項25】
前記組成物の投与のための取扱説明をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年１０月２８日に出願された米国特許仮出願第６３／２７２，６８９号及び２０２２年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／３３４，６５０号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、その全体が参照によりあらゆる目的のために本明細書に取り込まれる。
本出願は、２０２１年１０月２８日に出願された米国特許仮出願第６３／２７２，６８９号及び２０２２年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／３３４，６５０号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、その全体が参照によりあらゆる目的のために本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患及び神経炎症性障害などの脳疾患は、人口の多くが罹患する破壊的な病状である。そのような疾患の多くは不治で、高度に衰弱性であり、多くの場合、脳の構造及び機能の経時的な進行性の低下をもたらす。また、高齢者はこれらの病状を発症するリスクが高いため、世界的な高齢化人口の増大により疾患有病率も急速に高まっている。現在、多くの神経変性疾患及び神経炎症性障害は、そのような疾患の病理生理学の理解が限られているため診断するのが困難である。一方、現在行なわれている治療は有効でなく、市場の需要、すなわち、ますます増大する高齢化人口により年々有意に高まっている需要は満たされていない。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）は、学習及び記憶の緩徐だが進行性の低下が顕著であり、高齢者の死亡の主な原因である。ＡＤの有病率の高まりが、より良好でより早期の診断のための必要性及び需要を後押ししている。国際アルツハイマー病協会によると、この疾患は現在、全世界で４６８０万人が罹患しているが、症例数は次の３０年間で３倍になると予想されている。高齢人口の増加が最も速い国の１つは中国である。人口予測に基づくと、２０３０年までに４人に１人が６０歳を超え、ＡＤを発症するリスクがある人がかなりの割合となる。実際、中国のＡＤ症例数は、１９９０年から２０１０年までで３７０万人から９２０万人に倍増し、この国では２０５０年までに２２５０万例になると予想されている。香港の人口も急速に高齢化している。６５歳以上の高齢者が２０２５年までに人口の２４％を、２０５０年までに人口の３９．３％を構成すると推計されている。ＡＤ症例数は、２０３９年までに３３２，６８８例まで上昇すると予想されている。そのため、この壊滅的な病状に苦しんでいるＡＤ患者を有効に治療するための新たな方法を開発する早急な必要性が存在している。本発明は、この疾患の有効な治療に有用であり潜在的に治癒をもたらす新規な組成物及び方法を開示することにより、この必要性及び他の関連する必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
第１の態様において、本発明により、個人のアミロイド病変（アルツハイマー病など）を治療するため、又は個人において後に病変が発症するリスクを低減させるための方法を提供する。本願方法は、個人に、ＡＰＰ遺伝子コード配列を含むゲノム配列又は転写物を破壊する組成物の有効量を投与するステップを含む。
【0004】
いくつかの実施形態では、本願方法は、投与するステップの前に、個人のゲノムの少なくとも一部分のシーケンシングを行うことを含む。いくつかの実施形態では、個人のＡＰＰゲノム配列は、少なくとも１つの変異、例えば、スウェーデン型変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ型変異（Ｉ７１６Ｖ）、ロンドン型変異（Ｖ７１７Ｉ）、又はこれらの任意の組合せ、並びにアミロイドプラークの形成に関連する変異又は対立遺伝子バリアントを有する他の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、変異はスウェーデン型変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、アミロイド病変は、アルツハイマー病（ＡＤ、家族性ＡＤ及び弧発性ＡＤの両方を含む）、脳アミロイド血管症、又はダウン症である。いくつかの実施形態では、個人はＡＤと診断されているが、他の実施形態では、個人はまだＡＤと診断されていないがＡＤの既知のリスク因子を有する、例えば、ＡＤのリスクを高めることがわかっているある特定の遺伝子変異を有するか、又はＡＤ、特に早期発症型ＡＤ（例えば、６０歳若しくは７０歳より前）の家族歴を有する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＡＰＰゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を用いて実施される。いくつかの実施形態において、前記方法では、（１）ＡＰＰゲノム配列内の位置を標的とするスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ；及び（２）前記ｓｇＲＮＡ、をコードする１つ又は複数のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ組成物が利用される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＡＰＰゲノム配列内の、既知の変異（例えば、スウェーデン型変異）を含む領域又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位を含む領域を標的とし、例えば、標的とされるエンドヌクレアーゼ切断部位は、前記変異又はセクレターゼ切断部位から上流又は下流の２ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９））と１つのｓｇＲＮＡとをコードする１つのベクターを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡは、当技術分野で知られているか又は本明細書において開示される神経細胞特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターに作動可能に連結されており、前記組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のベクターの各々は、１つのウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセル剤の形態で投与される。
【0005】
第２の態様において、本発明は、ＡＰＰＰゲノム配列を破壊する有効量の１種又は複数種の薬剤、及び１種又は複数種の生理学的に許容可能な非薬効成分（excipient）を含む組成物を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＰＰゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記方法では、（１）ＡＰＰゲノム配列内の位置を標的とするスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ；及び（２）前記ｓｇＲＮＡ、をコードする１つ又は複数のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ組成物が利用される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＡＰＰゲノム配列内の、既知の変異（例えば、スウェーデン型変異）を含む領域又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位を含む領域を標的とし、例えば、標的とされるエンドヌクレアーゼ切断部位は、前記変異又はセクレターゼ切断部位から上流又は下流の２ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９））と１つのｓｇＲＮＡとをコードする１つのベクターを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡは、当技術分野で知られているか又は本明細書において開示される神経細胞特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターに作動可能に連結されており、前記組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のベクターの各々は、１つのウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセル剤の形態で投与される。
【0007】
第３の態様において、本発明は、個人のアミロイド病変（アルツハイマー病など）を治療する又は個人において後に前記疾患／病状が発症するリスクを低減させるためのキットを提供する。前記キットは、ＡＰＰゲノム配列を破壊する組成物を収容する第１の容器を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のため、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＰＰゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（１）スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼをコードする１つ又は複数のベクター、及び（２）ＡＰＰゲノム配列内の１つ（又は２つの位置）、例えば、ＡＰＰゲノム配列内の、事前に選択された変異（例えば、スウェーデン型変異）又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位に極めて近接しており、対象のエンドヌクレアーゼ切断部位が前記変異又はセクレターゼ切断部位から上流又は下流の２ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内に存在するような、小領域内の１つ（又は２つの位置）を標的とする１つのｓｇＲＮＡ（又は２つのｓｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９））と１つ又は複数のｓｇＲＮＡとをコードする１つの単独のベクターを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡ（群）は２つの別々のベクターにコードされ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースにして構築されたものなどのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される。いくつかの実施形態では、キットは、個人のゲノムの少なくとも一部分（例えば、ＡＰＰ遺伝子、並びにプレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）、及びＡＰＯＥ－ε４などの、アミロイド病原性の一因であることが知られている変異又はバリアントを有し得る他の遺伝子）のシーケンシングを行うための薬剤を収容する第２の容器をさらに含む。所望により、キットはまた、組成物の投与のための取扱説明も含む。
【0009】
本発明のこの態様に関して、（１）アミロイド病変（例えば、アルツハイマー病）を治療するための医薬の製造のための；及び／又は（２）アミロイド病変（例えば、アルツハイマー病）を治療するための医薬が含まれているキットの製造のための、ＡＰＰゲノム配列を破壊する１種又は複数種の薬剤の使用が、本明細書における開示によりさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】変異ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集のデザイン及び検証を示す図である。ａ，ＡＰＰスウェーデン型（ＡＰＰｓｗｅ）二塩基変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）はβ－セクレターゼ部位に近接して存在している。ＡＰＰｓｗｅ変異を標的とするための２つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＳＷ１及びＳＷ２を、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）を用いてデザインした。ＰＡＭ，プロトスペーサー隣接モチーフ。矢頭はＳａＣａｓ９切断部位を示す。ｂ，インビトロでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの編集効率を解析するために使用したＥＧｘｘＦＰシステムの模式図。ＡＰＰＷＴ配列及びＡＰＰｓｗｅ配列を別々にＥＧＦＰ断片間にオーバーラップアームとともに挿入した。ＳａＣａｓ９（青）編集により相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ＤＮＡ修復及びＥＧＦＰ発現カセットの再構成がもたらされ、ＧＦＰシグナルが生成された。ｃ，ＥＧｘｘＦＰシステムを用いた対立遺伝子特異的編集のインビトロ検証。Ｃａｓ９－ＳＷ１及びＣａｓ９－ＳＷ２を、それぞれＡＰＰＷＴ又はＡＰＰｓｗｅを含むＥＧｘｘＦＰレポータープラスミド（ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰＷＴ又はＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰｓｗｅ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時遺伝子導入した。スケールバー：１００μｍ。ｄ，海馬内注射のための単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１を構築し、ＨＡタグ付きＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ ＳＷ１を発現させた。ＥＦＳ，伸長因子１－アルファショートプロモーター；ｐＡ，ポリ（Ａ）テール；Ｕ６，ヒトＵ６プロモーター；ＩＴＲ，末端逆位反復配列。ｅ，５ＸＦＡＤマウスのウイルス形質導入海馬におけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集のＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ。矢頭はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ＤＮＡ断片を示す。Ｃｏｎ，５ＸＦＡＤマウスの非形質導入海馬領域。ｆ，挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）変異の割合。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によりｉｎｄｅｌ変異の形成がもたらされた。ｉｎｄｅｌの割合は編集効率を示す。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝３匹のマウス／群；＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立両側ｔ検定）。
【0011】
【図2】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイドプラーク負荷が減少することを示す図である。３か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内注射によりアミロイドベータ（Ａβ）のレベル及び沈着が低減された。ａ～ｃ，Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内注射後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの背側海馬ホモジネート中の可溶性Ａβ及び不溶性Ａβの含有量。ａ，ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた可溶性Ａβ及び不溶性Ａβの代表的なウエスタンブロット（ｎ＝３匹のマウス／群）。ｂ，ｃ，ＥＬＩＳＡによる可溶性及び不溶性のＡβｘ－４０及びＡβｘ－４２の定量分析。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝５匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立両側ｔ検定）。ｄ～ｋ，アミロイドプラーク沈着は、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１を発現する５ＸＦＡＤマウスの海馬領域において減少した。Ａβ（４Ｇ８；緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。６か月（ｄ，ｅ）及び９か月（ｈ，ｉ）の５ＸＦＡＤマウスの別個の海馬領域（すなわち、アンモン角及び海馬台）の代表的な画像。ＨＡタグの発現はＣａｓ９発現を示す。スケールバー：５０μｍ。アンモン角（ｆ，ｊ）及び海馬台（ｇ，ｋ）におけるＡβ陽性領域の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対応両側ｔ検定）。
【0012】
【図3】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいてグリオーシスが減少することを示す図である。ａ，ｂ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスの海馬におけるミクログリオーシスが減少した。６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＩｂａ１（赤）、アミロイドベータ（Ａβ、４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。ａ，海馬台の代表的な画像。スケールバー：５０μｍ（左）、１０μｍ（右）。ｂ，Ｉｂａ１陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝３匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。ｃ～ｅ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスの海馬における星状細胞の活性化が低減された。６か月齢の５ＸＦＡＤマウスのＧＦＡＰ（赤）、Ａβ（４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。ｃ，海馬台の代表的な画像。スケールバー：５０μｍ（左）、１０μｍ（右）。ｄ，ｅ，５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により星状細胞の数は変化しなかったが星状細胞の活性化は低減された。ｄ，ＧＦＡＰ陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；対応両側ｔ検定）。ｅ，ＧＦＡＰ陽性領域の割合。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。
【0013】
【図4】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいて神経機能が改善することを示す図である。ａ，ｂ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて長期増強（ＬＴＰ）の低減が逆転された。海馬ＣＡ１領域におけるＬＴＰを４連発のシータバースト刺激によって誘発した。ＷＴ，野生型。ａ，ベースラインに対して正規化された野の興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ；平均±ＳＥＭ）の傾きの平均。（挿入図）ＬＴＰ誘導前の５分間（１，灰色）及びＬＴＰ誘導後の５５分間（２，黒）に記録されたｆＥＰＳＰの例。ｂ，ＬＴＰ誘導後、最後の１０分間の記録時のｆＥＰＳＰの平均の傾きの定量。値は平均±ＳＥＭである（ＷＴ Ｃｏｎ ｎ＝６匹のマウスからの９つの切片；５ＸＦＡＤ Ｃｏｎ ｎ＝４匹のマウスからの９つの切片；５ＸＦＡＤ ＳＷ１ ｎ＝５匹のマウスからの９つの切片；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立両側ｔ検定）。ｃ～ｅ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１注射により、９か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬台における興奮性シナプス（ＰＳＤ－９５［緑］及びシナプトフィジン［赤］の染色）の減少が低減された。ｃ，代表的な画像。スケールバー：５μｍ。ｄ，ｅ，海馬台におけるＰＳＤ－９５の斑点（puncta）、シナプトフィジンの斑点、及びシナプトフィジン－ＰＳＤ－９５共局在斑点の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。ｆ～ｉ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスの海馬台において神経突起変性及びニューロン脱落が減少した。アミロイドベータ（Ａβ、４Ｇ８；緑）、核（青）、及び６か月齢の５ＸＦＡＤマウスではＬＡＭＰ１（神経突起変性のマーカー；赤）（ｆ）又は９か月齢の５ＸＦＡＤマウスではＮｅｕＮ（赤）（ｇ）の共染色。スケールバー：５０μｍ（ｆ）、２００μｍ（ｇ）。ｈ，ＬＡＭＰ１陽性変性神経突起の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝３匹のマウス／群；対応両側ｔ検定）。ｉ，ＮｅｕＮ陽性細胞密度の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。
【0014】
【図5】Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内ＡＡＶ媒介性送達によりＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてアルツハイマー病関連病変が減少することを示す図である。９か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内注射によりアミロイドベータ（Ａβ）沈着及びグリオーシスが減少した。ａ～ｄ，アミロイドプラーク沈着は、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１を発現するＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬領域において減少した。ａ，ｂ，１５か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡβ（４Ｇ８；緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。スケールバー：５０μｍ。アンモン角（ｃ）及び海馬台（ｄ）におけるＡβ陽性プラーク領域の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対応両側ｔ検定）。ｅ～ｈ，ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬台においてグリオーシスが減少した。ｅ，ミクログリアマーカーＩｂａ１（赤）、Ａβ（４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。スケールバー：５０μｍ（左）、１０μｍ（右）。ｆ，Ｉｂａ１陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。ｇ，ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける星状細胞マーカーＧＦＡＰ（赤）、Ａβ（４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。スケールバー：５０μｍ（左）、１０μｍ（右）。ｈ，ＧＦＡＰ陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。ｉ，ＧＦＡＰ陽性領域の割合。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；対応両側ｔ検定）。
【0015】
【図6】ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイドプラーク負荷が全域的に減少することを示す図である。ａ，脳全域での（brain-wide）ＡＰＰｓｗｅ編集の図。ＳＷ１－Ｓｙｎ：：ＨＡタグ付きＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ ＳＷ１を発現させるためのＣａｓ９－ｍＷＰＲＥと表示する全身投与のための単一のＡＡＶベクターを、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢカプシドを用いてデザインした。ＩＴＲ，末端逆位反復配列；Ｕ６，ヒトＵ６プロモーター；Ｓｙｎ，ヒトシナプシン１プロモーター；ｍＷＰＲＥ，切断型ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；ｐＡ，ポリ（Ａ）テール。ｂ～ｄ，３か月齢の５ＸＦＡＤマウスへのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身注射により脳のアミロイドベータ（Ａβ）陽性プラーク領域が全域的に減少した。ｂ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ：ＳＷ１－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥを注射後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるアミロイドプラーク（すなわち、４Ｇ８）の染色の代表的な画像。皮質（ｃ）及び海馬（ｄ）におけるアミロイドプラーク領域の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；独立両側ｔ検定）。ｅ～ｌ，Ｘ３４標識アミロイドプラーク負荷の減少は脳内のＣａｓ９発現と関連していた。ｅ，ｆ，ｉ，ｊ，６か月齢の５ＸＦＡＤマウスのアンモン角（ｅ）、海馬台（ｆ）、皮質（ｉ）、及び延髄（ｊ）におけるＸ３４（緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。ＨＡタグの発現はＣａｓ９発現を示す。スケールバー：５０μｍ。ｇ，ｈ，ｋ，ｌ，Ｘ３４標識されたプラーク領域の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；独立両側ｔ検定）。
【0016】
【図7】ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリオーシス及び神経突起変性が減少し、認知能力が改善することを示す図である。ａ，ｂ，３か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により海馬台におけるミクログリオーシスが減少した。ａ，６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＩｂａ１（赤）、アミロイドベータ（Ａβ、４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。スケールバー：５０μｍ（左）、１０μｍ（右）。ｂ，Ｉｂａ１陽性ミクログリアの定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；独立両側ｔ検定）。ｃ，ｄ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいて神経突起変性が減少した。ｃ，６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬台におけるＬＡＭＰ１（神経突起変性のマーカー；赤）、Ａβ（４Ｇ８；緑）、及び核（青）の染色を示す代表的な画像。スケールバー：１０μｍ。ｄ，ＬＡＭＰ１陽性変性神経突起の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊＊Ｐ＜０．０１；独立両側ｔ検定）。ｅ～ｇ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスの認知能力が改善された。ｅ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達によりオープンフィールド（ＯＦ）探索試験での馴化が改善された。訓練初日の移動距離に対する移動距離の変化の割合。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ）。ｆ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により自発的交替Ｙ迷路試験において空間作業記憶が改善された。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；独立両側ｔ検定）。ｇ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ－Ｃａｓ９－ＳＷ１を全身送達すると、５ＸＦＡＤマウスはオープンアームで有意に少ない時間を過ごした。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；＊Ｐ＜０．０５；独立両側ｔ検定）。
【0017】
【図8】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び５ＸＦＡＤマウスにおける対立遺伝子特異的編集の検証を示す図である。ａ，ｂ，Ｃａｓ９－ＳＷ１及びＣａｓ９－ＳＷ２はＡＰＰＷＴを標的としなかった。ａ，ＡＰＰＷＴ対立遺伝子を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集のＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイ。ＷＴ１及びＷＴ２は、それぞれＳＷ１及びＳＷ２のものと同じ遺伝子座のＡＰＰＷＴ対立遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ｂ，挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）率を標的ディープシーケンシングによって調べた。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝５連／群；＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立スチューデントｔ検定）。ｃ，ｄ，Ｃａｓ９－ＳＷ１のオフターゲット解析。ｃ，ヒトゲノムにおける上位５つの予測されたオフターゲット部位の配列。ｄ，ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における上位５つの予測されたオフターゲット部位のＴ７ＥＩアッセイ。Ｔ７ＥＩによる切断バンドがないことは、Ｃａｓ９－ＳＷ１のオフターゲット活性が１％未満であったことを示す。ｅ～ｇ，インビボでのＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集の検証。ｅ，標的ディープシーケンシングによって測定されたＣａｓ９－ＳＷ１注射５ＸＦＡＤマウス脳からの最も豊富に存在する１０個のＡＰＰｓｗｅ配列。変異部位を青色の文字で示す。割合は改変ＡＰＰｓｗｅ配列の頻度である。編集事象は“＃”で表示される。ｆ，全ゲノムシーケンシングによって検出された体細胞変異の数。同じマウスのウイルス形質導入海馬領域（ＳＷ１）及び非形質導入脳領域（Ｃｏｎ）を全ゲノムシーケンシングに供し、体細胞変異を検出した。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝２匹のマウス）。ｇ，潜在的オフターゲット変異の同定のためのワークフロー。
【0018】
【図9】５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスにおける海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＣａｓ９発現脳領域内のアミロイドプラーク沈着が減少することを示す図である。ａ，ｂ，３か月齢時においてＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１（ＥＦＳ：：ＳａＣａｓ９－ＳＷ１）を海馬内注射後の６か月齢又は９か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡβ（４Ｇ８；緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。ＨＡ染色はＣａｓ９発現を示す。ａ，対照（Ｃｏｎ）及びウイルス注射（ＳＷ１）５ＸＦＡＤマウス脳の矢状断切片の代表的な画像。スケールバー：１ｍｍ。ｂ，それぞれ６か月齢のマウス及び９か月齢のマウスの海馬、アンモン角（ＣＡ）、及び海馬台の代表的な画像。スケールバー：２００μｍ。
【0019】
【図10】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスの海馬台においてグリオーシスが減少することを示す図である。ａ，ｂ，ミクログリア（ａ）及び星状細胞（ｂ）におけるアミロイドプラーク沈着の免疫組織化学的解析。６か月齢のマウス（ウイルス注入後３か月目）において、それぞれＩｂａ１（赤；ａ）又はＧＦＡＰ（赤；ｂ）と共にＡβ（４Ｇ８；緑）及び核（青）を染色。スケールバー：１００μｍ。ＷＴ，野生型。
【0020】
【図11】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいて神経突起変性が減少することを示す図である。ａ，ｂ，６か月目（ａ）及び９か月目（ｂ）の５ＸＦＡＤマウスの海馬台におけるＬＡＭＰ１（赤）、Ａβ（４Ｇ８；緑）、及び核（青）の免疫組織化学。スケールバー：２００μｍ。
【0021】
【図12】海馬内ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスのＣａｓ９発現脳領域内のアミロイドプラーク沈着が減少することを示す図である。ａ，ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのウイルス形質導入海馬におけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集のＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ。矢頭はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集されたＤＮＡ断片を示す。Ｃｏｎ，ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの非形質導入海馬領域。ｂ，挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）変異の割合。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立両側ｔ検定）。ｃ，ｄ，１５か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ウイルス注入後６か月目）におけるＡβ（４Ｇ８；緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。ＨＡ染色はＣａｓ９発現を示す。ｃ，ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳の矢状断切片の代表的な画像。スケールバー：１ｍｍ。ｄ，ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳の海馬、アンモン角（ＣＡ）、及び海馬台の代表的な画像。スケールバー：２００μｍ。
【0022】
【図13】中枢神経系における遺伝子導入の向上及びロバストな発現のためのＡＡＶコンストラクトの最適化を示す図である。ａ，全身送達用の２つのＡＡＶベクターの図解的比較（ｍＷＰＲＥエレメントの挿入あり、又はなし）。ＩＴＲ，末端逆位反復配列；Ｕ６，ヒトＵ６プロモーター；Ｓｙｎ，ヒトシナプシン１プロモーター；ｍＷＰＲＥ，切断型ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；ｐＡ，ポリ（Ａ）テール。ｂ，ＨＡ（緑）の免疫組織化学は、ＳＷ１－Ｓｙｎ：：ＳａＣａｓ９（－ｍＷＰＲＥ）又はＳＷ１－Ｓｙｎ：：ＳａＣａｓ９－ｍＷＰＲＥ（＋ｍＷＰＲＥ）を１×１０１２ｖｇ／マウスの用量で注射されたＣ５７マウスにおけるＣａｓ９発現を示す。スケールバー：３００μｍ。
【0023】
【図14】ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイドプラーク負荷が全域的に減少することを示す図である。ａ，５ＸＦＡＤマウスの複数の脳領域におけるＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集のＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ。矢頭はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集されたＤＮＡ断片を示す。ＨＰ，海馬；Ｓｕｂ，海馬台；ＣＡ，アンモン角；ＤＧ，歯状回；ＣＸ、皮質。ｂ，挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）変異の割合。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によりｉｎｄｅｌ変異の形成がもたらされた。ｉｎｄｅｌの割合は編集効率を示す。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝３匹のマウス／群）。ｃ，ｄ，Ｃａｓ９－ＳＷ１（ＳＷ１－Ｓｙｎ：：ＳａＣａｓ９－ｍＷＰＲＥ）の全身投与後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＸ３４（緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。ＨＡ染色はＣａｓ９発現を示す。ｃ，ウイルス注入後３か月目の５ＸＦＡＤマウス脳の矢状断切片の代表的な画像。スケールバー：１ｍｍ。ｄ，５ＸＦＡＤマウス脳の海馬、アンモン角（ＣＡ）、海馬台、及び歯状回（ＤＧ）の代表的な画像。スケールバー：２００μｍ。
【0024】
【図15】ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達はＷＴマウス又は５ＸＦＡＤマウスにおいて有害効果を誘発しないことを示す図である。ａ～ｃ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達は野生型（ＷＴ）マウスにおいて行動上の有害効果を誘発しなかった。Ｕｎｉｎｊｅｃｔ，未注射。ａ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達時、オープンフィールド探索試験においてマウスの歩行運動活動に変化はなかった。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；独立両側ｔ検定）。ｂ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達でオープンフィールド（ＯＦ）探索試験において馴化に変化はなかった。訓練初日の移動距離に対する移動距離の変化の割合。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；独立両側ｔ検定）。ｃ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達は自発的交替Ｙ迷路試験において空間作業記憶に影響を及ぼさなかった。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２匹のマウス／群；独立両側ｔ検定）。ｄ～ｆ，ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介性Ｃａｓ９－Ｃｏｎの全身送達はＷＴマウスにおいてグリオーシスを誘発しなかった。ｄ，６か月齢のＷＴマウスにおけるＨＡ（赤、左パネル）、Ｉｂａ１（赤、中央パネル）、ＧＦＡＰ（赤、右パネル）、及び核（青）の免疫組織化学スケールバー：５０μｍ。ｅ，Ｉｂａ１陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群；独立両側ｔ検定）。ｆ，ＧＦＡＰ陽性細胞の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝４匹のマウス／群）。ｇ，ｈ，Ｃａｓ９－Ｃｏｎ（Ｃｏｎ－Ｓｙｎ：：ＳａＣａｓ９－ｍＷＰＲＥ）の全身投与後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＸ３４（緑）、ＨＡ（赤）、及び核（青）の免疫組織化学。ＨＡタグの発現はＣａｓ９発現を示す。スケールバー：１ｍｍ（ｇ）、２００μｍ（ｈ）。ｉ，６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬におけるＸ３４標識プラーク領域の定量。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝３匹のマウス／群；独立両側ｔ検定）。
【0025】
【図16】ＡＰＰのＣＲＩＳＰＲ標的範囲を示す図である。Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体はＡＰＰのエクソン１４～１７における切断部位を特異的に破壊する。図はＡｌｚｆｏｒｕｍから採用した。３’ＵＴＲ、３’非翻訳領域；ＡＤ，アルツハイマー病；ＡＰＰ，アミロイド前駆体タンパク質；Ｅｘ，エクソン。
【0026】
【図17】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰの効率的な欠失を示す図である。ａ，ＡＰＰＷＴ対立遺伝子を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集のＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイ。ＷＴ１及びＷＴ２は、ＡＰＰＷＴ対立遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ＳＷ１及びＳＷ２は、ＡＰＰスウェーデン型変異を標的とするｓｇＲＮＡである（ｓｇＲＮＡ対照としての役割を果たす；本発明に無関係）。ｂ，挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）率を標的ディープシーケンシングによって調べた。値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝５連／群；＊＊＊Ｐ＜０．００１；独立スチューデントｔ検定）。ＡＰＰ、アミロイド前駆体タンパク質；Ｃｏｎ，対照。
【0027】
【図18】β－セクレターゼ部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡＰＰ発現及びＡβ産生が低減されることを示す図である。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを用いたＡＰＰの代表的なウエスタンブロット。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＡＰＰ発現コンストラクト及びＣａｓ９／ｇＲＮＡコンストラクトを用いて同時遺伝子導入した。Ｌ，分子サイズラダー；ｃｏｎ，対照；ｕｎｔ，非形質導入。
【発明を実施するための形態】
【0028】
定義
用語「ＡＰＰ」は、アミロイド前駆体タンパク質又はこのタンパク質をコードする遺伝子を示す。ヒトＡＰＰ遺伝子はヒト染色体２１ｑ１１．２－ｑ２１に存在し、本明細書において配列番号：２として示す例示的なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
用語「ＡＰＰ」は、アミロイド前駆体タンパク質又はこのタンパク質をコードする遺伝子を示す。ヒトＡＰＰ遺伝子はヒト染色体２１ｑ１１．２－ｑ２１に存在し、本明細書において配列番号：２として示す例示的なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【0029】
本明細書において使用する場合、用語「アミロイド病変」は、個人の関連組織及び解剖学的部位、例えば、神経系（脳など）、血管壁、及び種々の器官における過剰な量のアミロイドプラークの蓄積によって引き起こされるか、又は悪化する疾患又は病状を示す。「アミロイド病変」の例としては、限定されないが、家族性及び弧発性のアルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症、ダウン症、並びに種々のアミロイドーシスが挙げられる。
【0030】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びその一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のポリマーを示す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に記載のない限り、具体的な核酸配列は、明示された配列のみならず、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補配列もまた黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ又は複数の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することによって得られ得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子にコードされたｍＲＮＡと互換的に使用される。
【0031】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡセグメントを意味する。これには、コード領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれ得る。
【0032】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の機能を果たすアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を示す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードにコードされたもの、並びに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを示す。そのような類似体は、修飾されたＲ基を有する（例えば、ノルロイシン）か、又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の機能を果たす化学物質化合物を示す。
【0033】
非天然のアミノ酸誘導体又は類似体のポリペプチド鎖への部位特異的な組み込みを可能にする種々の方法が当該技術分野において知られており、例えば、ＷＯ０２／０８６０７５を参照のこと。
【0034】
アミノ酸は、本明細書において、一般的に知られた３文字表記、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された１文字表記のいずれかで示され得る。ヌクレオチドも同様に、一般的に認知された１文字コードで示され得る。
【0035】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを示すために互換的に使用される。この３つの用語はすべて、１個又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において使用する場合、これらの用語は、完全長のタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含しており、ここで、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって連結されている。
【0036】
本明細書において使用する場合、「ＡＰＰゲノム配列を破壊する組成物」は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするゲノム配列の転写又は翻訳抑制又は消失させることができる１種又は複数種の薬剤を含む任意の組成物を示し、前記抑制又は消失は、ＡＰＰゲノム配列の少なくとも一部分の直接的な欠失若しくは交換によって（例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）システムなどのゲノム編集手法によって）行なわれ得るか、又はＡＰＰ発現の低減からそのタンパク質発現の消失に至るまでの結果が最終的に得られるような、低分子の阻害性のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又は他の酵素（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡなどの低分子の阻害性ＲＮＡ、及びリボザイムなど）の作用による、前記ゲノム配列から転写されたｍＲＮＡの低減若しくは消失によって行なわれ得る。
【0037】
用語「標的とする」とは、阻害性オリゴヌクレオチド又は遺伝子編集システムを用いて負に調節されるゲノム配列との関連において阻害性オリゴヌクレオチド（低分子の阻害性ＲＮＡ若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）又はｓｇＲＮＡを説明する状況で使用されている場合、オリゴヌクレオチド又はｓｇＲＮＡの少なくとも一部分とゲノム配列間に、前記ｓｇＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドと前記ゲノム配列又はそのｍＲＮＡ転写物間の特異的ハイブリダイゼーションが可能となり、それにより続いて、所定の位置での（例えば、前記ＡＰＰゲノム配列内の事前に選択された変異又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位付近の位置、例えば、前記変異又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位から上流又は下流の３ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、又は２０ヌクレオチド以内の位置での）前記ゲノム配列の切断、或いはそのｍＲＮＡ転写物の破壊がもたらされるような、ワトソン・クリック塩基対合原理に基づいた十分な配列相補性、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又はそれより高い割合のヌクレオチド配列相補性があることを示す。
【0038】
用語「組換え」とは、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用する場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくは異種タンパク質の導入又は天然状態の核酸若しくはタンパク質の変化によって改変されていること、或いは細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、この細胞の天然状態の（非組換え）形態にはみられない遺伝子を発現するか、又は本来は異常発現されるか、低発現であるか、若しくは全く発現されない天然状態の遺伝子を発現する。
【0039】
「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の転写を指示する一連の核酸制御配列と定義される。本明細書において使用する場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントなどの、転写開始部位付近に必要なポリヌクレオチド配列を含む。プロモーターはまた、所望により、転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在する場合もあり得る遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件及び発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的制御又は発生的制御下で活性であるプロモーターである。用語「作動可能に連結される」とは、ポリヌクレオチド発現制御配列（プロモーター、又は一連の転写因子結合部位など）と第２のポリヌクレオチド配列間の機能的連結を示し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に相当するポリヌクレオチド配列の転写を指示するものである。
【0040】
「発現カセット」は、宿主細胞内での特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする指定された一連のポリヌクレオチドエレメントを用いて、組換え又は合成により産生される核酸コンストラクトである。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノム、又は核酸断片の一部であり得る。通常は、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるポリヌクレオチドを含む。
【0041】
用語「異種の」とは、２つのエレメントの対応する位置を説明する状況で使用されている場合、ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーターとｍＲＮＡコード配列若しくはタンパク質／ポリペプチドコード配列）又はポリペプチド配列（例えば、融合タンパク質内の融合パートナーとしての２つのペプチド）などの２つのエレメントが、天然状態では対応する同じ位置にみられないことを示す。したがって、コード配列の「異種プロモーター」は、天然状態ではコード配列に作動可能に連結されていないプロモーターを示す。同様に、特定のタンパク質又はそのコード配列の「異種ポリペプチド」又は「異種ポリヌクレオチド」は、特定のタンパク質とは異なる起源に由来するもの、又は同じ起源に由来するが天然状態では特定のタンパク質又はそのコード配列に同様に連結されていない場合である。あるポリペプチド（又はそのコード配列）と異種ポリペプチド（又はポリヌクレオチド配列）との融合では、自然界にみられ得る長鎖のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列はもたらされない。
【0042】
語句「～に特異的にハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチド配列と別のポリヌクレオチド配列が複合混合物（例えば、全細胞内又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在する場合の、ワトソン・クリックヌクレオチド塩基対合に基づいたストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での前記配列同士の結合、二重鎖形成、又はハイブリダイゼーションを示す。語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、核酸（例えば、ポリヌクレオチドプローブ）が、通常は核酸複合混合物中において、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を示す。ストリンジェント条件は配列依存性であり、環境が異なると異なることになる。配列が長いほどより高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲にわたる手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)を参照のこと。一般に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度ｐＨで特定の配列に対して、熱融解温度（Ｔｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が前記標的の配列にハイブリダイズして平衡状態である温度である（標的配列は過剰に存在するため、Ｔｍでは、５０％のプローブが占有されていて平衡状態である）。ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、通常は、ｐＨ７．０～８．３において約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩類）であり、温度が短鎖プローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長鎖プローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても得られ得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件としては：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで４２℃でインキュベーション又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で６５℃での洗浄を伴う条件が挙げられる。
【0043】
「宿主細胞」により、発現ベクターを内包し、前記発現ベクターの複製又は発現を支持する細胞を意図する。宿主細胞は、大腸菌などの原核生物細胞、又は酵母、昆虫、両生類などの真核生物細胞、又はＣＨＯ及びＨｅＬａなどの哺乳動物細胞、例えば、培養細胞、外植片、並びにインビボの細胞であり得る。
【0044】
用語「阻害する」又は「阻害」は、本明細書において使用する場合、阻害剤が対象の生物学的プロセス、例えば、ＡＰＰタンパク質の発現、ＡＤ患者の脳内におけるアミロイドβ（Ａβ）プラークの形成、ＡＤ患者の認知力低下、タンパク質のリン酸化、細胞シグナル伝達、タンパク質合成、細胞増殖、腫瘍形成性、及び転移潜在能などに対して有する任意の検出可能なマイナスの効果を示す。通常は、阻害は、阻害剤に曝露されていない対照と比較した場合、対象のプロセス（例えば、ＡＰＰタンパク質の発現若しくはＡβプラークの蓄積）、又は上記の下流パラメータのいずれか１つの１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、又は５０％以上の減少に反映される。同様に、用語「増大する」又は「増大」は、促進剤が、前記促進剤なしの対照と比較した場合、対象の生物学的プロセスに対して有する、２５％以上、５０％以上、７５％以上、１００％以上、又は２倍高い、３倍高い、４倍高い、５倍高い、或いは最大１０倍高い若しくは最大２０倍高い、正の変化などの任意の検出可能な正の効果を示すため使用する。逆に、用語「実質的に変わらない」とは、正の変化又は負の変化が１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、又はそれより低い状態を示す。
【0045】
用語「有効量」は、本明細書において使用する場合、物質を投与することに対して意図される効果がもたらされるのに十分な量を示す。効果としては、生物学的プロセスにおける望ましい変化（例えば、ＡＤ患者における、ＡＰＰ発現の検出可能な減少、Ａβプラークの形成の低減、又は認知力低下の減速）、並びに疾患／病状及び関連合併症の症状の任意の検出可能な程度までの予防、回復、又は進行の阻止が挙げられ得る。所望の効果が得られるのに「有効な」厳密な量は、治療用薬剤の性質、投与様式、及び治療目的に依存し、当業者が既知の手法を用いて確認することができる（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；及びPickar, Dosage Calculations (1999)を参照のこと）。
【0046】
本明細書において使用する場合、用語「治療」又は「治療する」は、疾患若しくは病状の存在、又はそのような疾患若しくは病状が後の時点で発症するリスクに対処するために取られる治療的措置及び予防的措置の両方を含む。前記用語は、現在起こっている症状を緩和させるための治療的措置若しくは予防的措置、疾患進行の抑制若しくは遅滞、症状の発現の遅延、又はそのような疾患若しくは病状によって引き起こされる副作用の消失若しくは低減を包含する。本文脈における予防的措置及びその変化形は、事象の発生の１００％消失を必要とするものではなく、むしろ、これは、そのような発生の尤度若しくは重症度の抑制若しくは低減又はそのような発生の遅延を示す。
【0047】
「薬学的に許容可能な」又は「薬理的に許容可能な」非薬効成分（excipient）は、生物学的に有害でない物質であるか又は望ましくないものでない物質であり、すなわち、非薬効成分は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく生物活性剤とともに個体に投与され得るものである。非薬効成分はいずれも、その非薬効成分が含まれている組成物のいずれの成分とも有害に相互作用しないと思われるものである。
【0048】
用語「非薬効成分」は、本発明の組成物の最終の投薬形態中に存在し得る、本質的に補助的な任意の物質を示す。例えば、用語「非薬効成分」には、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、滑沢剤、流動促進剤（流動性向上剤）、圧縮助剤、着色剤、甘味剤、保存剤、懸濁剤／分散剤、皮膜形成剤／コーティング、着香剤、及び印刷用インクが含まれる。
【0049】
用語「本質的に～からなる」は、１種類の活性成分又は複数種の活性成分を含む組成物を説明する状況で使用されている場合、前記組成物には、前記活性成分（群）の生物学的活性と同様の若しくは関連する任意の生物学的活性を有するか、又は前記活性を向上若しくは抑制することができる、他の成分は含まれていないが、一方で、生理学的に許容可能な非薬効成分又は薬学的に許容可能な非薬効成分などの１種又は複数種の不活性な成分は前記組成物中に存在していてもよいという事実を示す。例えば、本質的に、ＡＰＰゲノム配列を破壊するのに有効な、又は対象のゲノム配列から転写されたｍＲＮＡを抑制するのに有効な活性薬剤（群）から本質的になる組成物は、同じ標的プロセスに対して任意の検出可能な正の効果若しくは負の効果を有し得る、又は前記組成物投与されている対象中の疾患の発生若しくは症状を測定可能な任意の程度に増大若しくは低減させ得る、任意の他の薬剤が含まれていない組成物である。
【0050】
用語「約」は、所定の値の＋／－１０％の範囲を表す。例えば、「約１０」は、１０の９０％～１１０％の範囲、すなわち９～１１と設定される。
【0051】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
異常なアミロイドプラーク蓄積とアルツハイマー病（ＡＤ）などの種々の病変間の相関性は長い間、観察され、理解されてきている。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集を使用して、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のゲノム配列内の（例えば、事前に選択された変異部位又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位に極めて近接している範囲内の）１つ又は複数の特定の部分領域を標的とすることにより、これまでで初めてアミロイドプラーク蓄積の抑制の達成に成功したが、オフターゲット編集はほとんど検出されなかった。したがって、ＡＰＰゲノム配列のそのような破壊は、疾患の発症及び進行にアミロイドプラークが重要な役割を果たすさまざまな病変（ＡＤなど）における脳内及び他の器官内のアミロイドプラークの過剰な蓄積に苦しむ患者の治療における治療上の有益性、並びにまだそのような疾患と診断されていないがＡＤの家族歴などの既知のリスクを有し得る個体のこの疾患の予防又はリスク低減における予防上の有益性をもたらすことが実証された。
Ｉ．序論
異常なアミロイドプラーク蓄積とアルツハイマー病（ＡＤ）などの種々の病変間の相関性は長い間、観察され、理解されてきている。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集を使用して、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のゲノム配列内の（例えば、事前に選択された変異部位又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位に極めて近接している範囲内の）１つ又は複数の特定の部分領域を標的とすることにより、これまでで初めてアミロイドプラーク蓄積の抑制の達成に成功したが、オフターゲット編集はほとんど検出されなかった。したがって、ＡＰＰゲノム配列のそのような破壊は、疾患の発症及び進行にアミロイドプラークが重要な役割を果たすさまざまな病変（ＡＤなど）における脳内及び他の器官内のアミロイドプラークの過剰な蓄積に苦しむ患者の治療における治療上の有益性、並びにまだそのような疾患と診断されていないがＡＤの家族歴などの既知のリスクを有し得る個体のこの疾患の予防又はリスク低減における予防上の有益性をもたらすことが実証された。
【0052】
ＩＩ．一般的な組換え技術
組換え遺伝学の分野における一般的な方法及び手法を開示する基本テキストとしては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990)；及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)が挙げられる。
組換え遺伝学の分野における一般的な方法及び手法を開示する基本テキストとしては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990)；及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)が挙げられる。
【0053】
核酸について、サイズはキロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで示す。これらは、アガロースゲル電気泳動若しくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、又は公開されているＤＮＡ配列から算出される推定値である。タンパク質について、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基数で示す。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来するアミノ酸配列から、又は公開されているタンパク質配列から推定される。
【0054】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、最初にBeaucage&Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)に報告された固相ホスホロアミダイトトリエステル法により、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載のような自動合成装置を用いて化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、当該技術分野で広く認められている任意の手段、例えば、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動、又はPearson&Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載のようなアニオン交換ＨＰＬＣを用いて行なわれる。
【0055】
目的の遺伝子の配列、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、及び合成のオリゴヌクレオチドの配列は、クローニング又はサブクローニング後、例えば、二本鎖鋳型のシーケンシングのためのWallace et al., Gene 16:21-26 (1981)の鎖伸長停止法を用いて検証され得る。
【0056】
ＩＩ．ゲノム配列を破壊する組成物
本発明者らなどによる先の研究により、アルツハイマー病の発症におけるＡＰＰ及びその変異の関与が説明された。最新の発見により、特に、事前に選択された変異（例えば、スウェーデン型変異）又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位に近接したＡＰＰゲノム配列を破壊することにより、脳内におけるＡＰＰ発現及びＡβプラーク蓄積が有効かつ有意に低減され得ることが明らかになっている。これが明らかになったことにより、このゲノム配列を破壊する組成物が、アルツハイマー病と既に診断されている患者において前記疾患を治療するため、並びにまだ診断を受けていないが例えば家族歴又は既知の遺伝的背景のため高度のアルツハイマー病リスク状態にある個体（例えば、１つ又は２つのＡＰＯＥ ε４対立遺伝子、２１番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするゲノム配列における点変異、１４番染色体上のプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）をコードするゲノム配列における点変異、及び１番染色体上のプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）をコードするゲノム配列における点変異の保有者）において前記疾患が後に発症するのを予防するため／そのリスクを低減させるために治療的及び予防的に使用されることにつながり、前記組成物は、特定の変異又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位の事前に選択されたゲノム遺伝子座、或いは前記ゲノム遺伝子座に近接する周囲において完全ゲノム配列のレベルで作用するものであってもよく、又は前記ゲノム配列から転写されるｍＲＮＡのレベルで作用するものであってもよい。異なる機序によって（例えば、ゲノム編集又はｍＲＮＡ抑制によって）作用する種々のカテゴリーの考えられ得る薬剤が、ＡＰＰゲノム配列の破壊のためのそのような組成物を製剤化するのに有用であり、以下に論考する。
本発明者らなどによる先の研究により、アルツハイマー病の発症におけるＡＰＰ及びその変異の関与が説明された。最新の発見により、特に、事前に選択された変異（例えば、スウェーデン型変異）又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位に近接したＡＰＰゲノム配列を破壊することにより、脳内におけるＡＰＰ発現及びＡβプラーク蓄積が有効かつ有意に低減され得ることが明らかになっている。これが明らかになったことにより、このゲノム配列を破壊する組成物が、アルツハイマー病と既に診断されている患者において前記疾患を治療するため、並びにまだ診断を受けていないが例えば家族歴又は既知の遺伝的背景のため高度のアルツハイマー病リスク状態にある個体（例えば、１つ又は２つのＡＰＯＥ ε４対立遺伝子、２１番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするゲノム配列における点変異、１４番染色体上のプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）をコードするゲノム配列における点変異、及び１番染色体上のプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）をコードするゲノム配列における点変異の保有者）において前記疾患が後に発症するのを予防するため／そのリスクを低減させるために治療的及び予防的に使用されることにつながり、前記組成物は、特定の変異又はβ－セクレターゼ切断部位若しくはγ－セクレターゼ切断部位の事前に選択されたゲノム遺伝子座、或いは前記ゲノム遺伝子座に近接する周囲において完全ゲノム配列のレベルで作用するものであってもよく、又は前記ゲノム配列から転写されるｍＲＮＡのレベルで作用するものであってもよい。異なる機序によって（例えば、ゲノム編集又はｍＲＮＡ抑制によって）作用する種々のカテゴリーの考えられ得る薬剤が、ＡＰＰゲノム配列の破壊のためのそのような組成物を製剤化するのに有用であり、以下に論考する。
【0057】
Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＡＰＰゲノム配列を破壊するのに有用な薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ遺伝子を含むゲノム配列から転写されるＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に相補的（又はアンチセンス）である比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常はＲＮＡベースであるが、ＤＮＡベースであってもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くの場合、その安定性が高まるように改変される。
いくつかの実施形態において、ＡＰＰゲノム配列を破壊するのに有用な薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ遺伝子を含むゲノム配列から転写されるＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に相補的（又はアンチセンス）である比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常はＲＮＡベースであるが、ＤＮＡベースであってもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くの場合、その安定性が高まるように改変される。
【0058】
理論に拘束されないが、これらの比較的短いオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに結合すると、内因性ＲＮＡ分解酵素によるこのメッセンジャーの分解を誘発する二本鎖のＲＮＡ鎖が誘導されると考えられる。さらに、場合によっては、このオリゴヌクレオチドは、コード配列のプロモーター付近に結合するように特異的にデザインされ、そのような環境下では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、ｍＲＮＡの翻訳も干渉し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能を果たす具体的な機構に関係なく、これを細胞又は組織に投与することにより、ＡＰＰ遺伝子を含むゲノム配列から転写されるＲＮＡの分解が可能になる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノム配列からのコードされた産物の発現及び／又は活性を低下させる。
【0059】
オリゴヌクレオチドは、本鎖若しくは二本鎖の、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそのキメラ混合物、誘導体、若しくは修飾型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖鎖部分、又はリン酸基主鎖が修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的とするための）、或いは細胞膜を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556；Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652；ＷＯ８８／０９８１０参照）若しくは血液脳関門を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、ＷＯ８９／１０１３４参照）、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976参照）、又はインターカレート剤（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549参照）などの他の付属基を含んでいてもよい。この目的のため、オリゴヌクレオチドは別の分子に複合体化されてもよい。
【0060】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られた標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなど市販されているものなど）の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al.（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、孔径制御型多孔性ガラスポリマー支持体（Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451）の使用によって調製され得る。
【0061】
アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを細胞に送達するためのいくつかの方法が開発されており、例えば、アンチセンス分子は直接、標的の解剖学的部位内に注射され得るか、又は所望の細胞を標的とするようにデザインされた修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現された受容体若しくは抗原に特異的に結合するペプチド若しくは抗体に連結されたアンチセンス）が体系的に投与され得る。
【0062】
内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分な細胞内アンチセンス濃度を達成することは、一部の例では困難であり得る。したがって、別のアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌ ＩＩＩ又はｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に配置した組換えＤＮＡコンストラクトを利用するものである。例えば、ベクターが、細胞に取り込まれてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するようにインビボで導入され得る。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡが生成し得る限り、エピソーム性のままであってもよく、染色体に組み込まれた状態であってもよい。そのようなベクターは、当該技術分野において標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞内での複製及び発現のために使用されるプラスミド、ウイルス系、又は当該技術分野において知られた他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において作用する当該技術分野において知られた任意のプロモーターによるものであり得る。そのようなプロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。そのようなプロモーターとしては、限定されないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’長鎖末端反復配列内に含まれているプロモーター（Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）などが挙げられる。任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、又はウイルスベクターが、標的組織部位内に直接導入され得る組換えＤＮＡコンストラクトを調製するために使用され得る。あるいはまた、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターが使用され得、この場合、投与は別の経路によって（例えば、体系的に）行なわれ得る。
【0063】
Ｂ．低分子干渉ＲＮＡ
いくつかの実施形態において、前記薬剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉコンストラクトは、標的遺伝子の発現を特異的にブロックし得る二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」は、当初は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を特異的に、かつ転写後にブロックする現象に適用された用語である。ＲＮＡｉにより、遺伝子発現をインビトロ又はインビボで阻害する有用な方法が提供される。ＲＮＡｉコンストラクトとしては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びインビボで切断されてｓｉＲＮＡを形成し得る他のＲＮＡ種が挙げられ得る。本明細書におけるＲＮＡｉコンストラクトにはまた、細胞内でｄｓＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡを形成する転写物をもたらすことができる発現ベクター（「ＲＮＡｉ発現ベクター」）、及び／又はインビボでｓｉＲＮＡを生成し得る転写物も包含される。
いくつかの実施形態において、前記薬剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉコンストラクトは、標的遺伝子の発現を特異的にブロックし得る二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」は、当初は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を特異的に、かつ転写後にブロックする現象に適用された用語である。ＲＮＡｉにより、遺伝子発現をインビトロ又はインビボで阻害する有用な方法が提供される。ＲＮＡｉコンストラクトとしては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びインビボで切断されてｓｉＲＮＡを形成し得る他のＲＮＡ種が挙げられ得る。本明細書におけるＲＮＡｉコンストラクトにはまた、細胞内でｄｓＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡを形成する転写物をもたらすことができる発現ベクター（「ＲＮＡｉ発現ベクター」）、及び／又はインビボでｓｉＲＮＡを生成し得る転写物も包含される。
【0064】
ＲＮＡｉ発現ベクターは、このコンストラクトが発現される細胞内でｓｉＲＮＡ部分を生成するＲＮＡを発現する（転写する）。そのようなベクターは、（１）遺伝子発現の調節的役割を有する遺伝因子（群）（例えば、プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー）、（２）（１）に作動可能に連結されており、転写されて二本鎖ＲＮＡ（細胞内でアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する２つのＲＮＡ部分、又はプロセシングされてｓｉＲＮＡになり得る単一のヘアピンＲＮＡ）を生成する「コード」配列、及び（３）適切な転写開始配列及び転写終結配列とのアセンブリを含む転写単位を含む。プロモーター及び他の調節エレメントの選択は一般的に、対象の宿主細胞に応じて異なる。
【0065】
ＲＮＡｉコンストラクトは、阻害対象の遺伝子のｍＲＮＡ転写物（すなわち、ＡＰＰ遺伝子を含むゲノム配列から転写されるＲＮＡ）の少なくとも一部分のヌクレオチド配列に細胞の生理的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。二本鎖ＲＮＡに必要とされることは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然のＲＮＡと十分に類似していることだけである。したがって、本発明は、遺伝子変異、系統多型性、又は進化的分岐により予測され得る配列多様性を許容できるという利点を有する。標的配列とＲＮＡｉコンストラクトの配列との間で許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対に１つ以下、１０塩基対に１つ以下、２０塩基対に１つ以下、又は５０塩基対に１つ以下である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心部のミスマッチが最も重要であり、標的ＲＮＡの切断が本質的に無効となる場合があり得る。対照的に、標的ＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは標的認識の特異性に有意に寄与しない。
【0066】
ＲＮＡｉコンストラクトの作製は、化学合成方法によって、又は組換え核酸手法によって行なわれ得る。処理された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼがインビボで転写を媒介する場合もあり得、又はクローニングしたＲＮＡポリメラーゼをインビトロで転写に使用してもよい。ＲＮＡｉコンストラクトはリン酸基－糖鎖主鎖又はヌクレオシドのいずれかに対して、例えば、細胞内ヌクレアーゼに対する感受性を低減させるため、バイオアベイラビリティを改善するため、製剤化特性を改善するため、及び／又は他の薬物動態学的特性を変化させるための修飾を含んでいてもよい。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合が、窒素ヘテロ原子又はイオウヘテロ原子のうちの少なくとも１個を含むように修飾され得る。ＲＮＡ構造の修飾は、ｄｓＲＮＡに対する一般的な応答は回避されるが特異的遺伝子阻害は可能となるように個別調整され得る。同様に、塩基を、アデノシンデアミナーゼの活性が阻害されるように修飾してもよい。ＲＮＡｉコンストラクトは酵素的に、又は部分的／完全に有機合成によって作製され得、任意の修飾リボヌクレオチドはインビトロで酵素的合成又は有機合成によって導入され得る。
【0067】
特定の実施形態では、対象ＲＮＡｉコンストラクトは「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。そのような核酸は、１９～３０ヌクレオチド長程度、さらにより好ましくは２１～２３ヌクレオチド長、例えば、長鎖二本鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ「ダイシング（dicing）」によって生じる断片に対応する長さである。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を標的ｍＲＮＡに、特異的配列と対合することによって動員して前記複合体をガイドすると理解されている。その結果、標的ｍＲＮＡはタンパク質複合体内のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、２１～２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含む。
【0068】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは低分子ヘアピン構造の形態（ｓｈＲＮＡと称する）である。ｓｈＲＮＡは外生的に合成してもよく、又はインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより転写することによって形成してもよい。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためのそのようなヘアピンＲＮＡの作製及び使用の例は、例えば、Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16:948-58；McCaffrey et al., Nature, 2002, 418:38-9；Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:6047-52)に記載されている。多くの場合、そのようなｓｈＲＮＡは細胞内又は動物において所望の遺伝子の連続的かつ安定な抑制が確実になるように設計される。ｓｉＲＮＡが細胞内でのヘアピンＲＮＡのプロセシングによって産生され得ることは当該技術分野において知られている。
【0069】
プラスミドは、例えば転写産物としての二本鎖ＲＮＡを送達するために使用され得る。そのような実施形態において、プラスミドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の各々の「コード配列」を含むようにデザインされる。コード配列は、例えば逆向きのプロモーターによって挟まれた、同じ配列であってもよく、各々が別々のプロモーターの転写制御下にある２つの別々の配列であってもよい。コード配列が転写された後、相補的なＲＮＡ転写物が塩基対合して二本鎖ＲＮＡを形成する。
【0070】
Ｃ．リボザイム
いくつかの実施形態において、薬剤はリボザイムである。ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するようにデザインされたリボザイム分子もまた、ｍＲＮＡを破壊し、その下流効果を抑制するために使用される（例えば、ＷＯ９０／１１３６４；Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225及び米国特許第５，０９３，２４６号参照）。特定のｍＲＮＡを破壊するためにｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断するリボザイムが使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが５’－ＵＧ－３’の２個塩基配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は当該技術分野においてよく知られており、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591にさらに十分に記載されている。
いくつかの実施形態において、薬剤はリボザイムである。ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するようにデザインされたリボザイム分子もまた、ｍＲＮＡを破壊し、その下流効果を抑制するために使用される（例えば、ＷＯ９０／１１３６４；Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225及び米国特許第５，０９３，２４６号参照）。特定のｍＲＮＡを破壊するためにｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断するリボザイムが使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが５’－ＵＧ－３’の２個塩基配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は当該技術分野においてよく知られており、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591にさらに十分に記載されている。
【0071】
本発明における使用のためのリボザイムは、天然状態で繊毛虫テトラヒメナに存在するもの（ＩＶＳ、又はＬ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）などのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼもまた含んでいてもよく（以下、本明細書において、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）、Thomas Cech及び共同研究者らにより多岐にわたって報告されている（Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578；Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433；ＷＯ８８／０４３００；Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対の活性部位を有する。本発明は、８塩基対の活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【0072】
アンチセンスアプローチの場合のように、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドで構成されていてもよく（例えば、改善された安定性、標的化などのため）、細胞にインビトロ又はインビボ送達され得る。好ましい送達方法の一例は、遺伝子導入された細胞が、標的とされるｍＲＮＡを破壊してその効果が阻害されるのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター又はｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下のリボザイム「をコードする」ＤＮＡコンストラクトの使用を含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり触媒的であるため、効率性に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【0073】
現在、ＤＮＡ酵素には２つの基本型があり、これらはどちらもSantoro及びJoyceによって同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号参照）。１０－２３ ＤＮＡ酵素は、２つのアームを連結するループ構造を含む。この２つのアームは特定の標的核酸配列を認識することによって特異性をもたらし、一方、ループ構造は生理学的条件下で触媒機能をもたらす。
【0074】
簡潔には、標的核酸を特異的に認識して切断する理想的なＤＮＡ酵素をデザインするため、当業者はまず、標的ユニーク配列を特定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて概略を示したものと同じアプローチを用いて行なわれ得る。好ましくは、この固有の又は実質的な配列はおよそ１８～２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチなものである。高Ｇ／Ｃ含有量は、ＤＮＡ酵素と標的配列間のより強力な相互作用を確実にするのを補助する。
【0075】
ＤＮＡ酵素を合成する場合、この酵素をメッセンジャーに標的化し得る特異的アンチセンス認識配列は、このＤＮＡ酵素の２つのアームを含むように分割され、この２つの特異的アーム間にＤＮＡ酵素ループが配置される。
【0076】
ＤＮＡ酵素を作製及び投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を参照のこと。同様に、インビトロ又はインビボでのＤＮＡリボザイムの送達方法としては、上記に詳細に概略を示したようなＲＮＡリボザイムの送達方法が挙げられる。さらに、当業者には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、ＤＮＡ酵素は、所望により、安定性を改善するため、及び分解に対する抵抗性を改善するために修飾され得ることが認識されよう。
【0077】
Ｄ．ゲノム編集
ＡＰＰ発現の阻害は、このタンパク質のコード配列を含む遺伝子配列の破壊によって行なわれ得る。標的化された遺伝子切断の有効な手段の一例はＣＲＩＳＰＲシステムである。
ＡＰＰ発現の阻害は、このタンパク質のコード配列を含む遺伝子配列の破壊によって行なわれ得る。標的化された遺伝子切断の有効な手段の一例はＣＲＩＳＰＲシステムである。
【0078】
ＣＲＩＳＰＲという用語は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔの略語であり、当初は、細菌及び古細菌に最初に見出された短い反復塩基配列を含む原核生物ＤＮＡセグメントに関して創られた用語である。回文リピートにおいて、ヌクレオチドの配列は両方向で同じである。各リピート部の後に、外来ＤＮＡ（例えば、ウイルスのＤＮＡ）への以前の曝露に由来するスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子の小さいクラスターがＣＲＩＳＰＲ配列の隣に存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来遺伝因子、特にウイルス起源のものに対する抵抗性を付与し、それにより獲得型の免疫をもたらす原核生物の免疫システムであることが後に認識された。スペーサー配列を有するＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質が外来性ＤＮＡを認識して切断するのを補助する。他のＲＮＡ誘導型Ｃａｓタンパク質は外来ＲＮＡを切断する。ＣＲＩＳＰＲは、配列決定された細菌ゲノムのおよそ５０％、及び配列決定された古細菌のほぼ９０％にみられ、最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物細胞における標的化された遺伝子編集における使用のために適合されている。例えば、Ledford (2016), Nature 531 (7593):156-9を参照のこと。
【0079】
シンプルな型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノム編集のために改変されてきた。１つ又は複数の合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成されたＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞内に、通常は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（群）をコードする１つ又は複数の発現ベクターを用いて細胞に遺伝子導入することによって送達することにより、細胞のゲノムが、事前に選択された１つ又は複数の位置で切断され、標的遺伝子（例えば、ｒｓ１９２１６２２を有するゲノム配列）が除去されること、及び／又は新しい配列で置換されることが可能となり得る。
【0080】
この場合、ＡＰＰゲノム配列の標的対象の部分領域に特異的な１つ又は複数のｇＲＮＡのコード配列を担持する発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス又はＡＡＶベクターなどのウイルスベクター）が、内因性のＡＰＰゲノム配列をノックアウトすべき細胞内（例えば、神経細胞内）に導入され得る。同じ発現ベクターに、任意に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又は同等物のコード配列もまた担持させてもよい。別の場合では、別個の発現ベクターを使用して、標的細胞内で発現させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼコード配列を導入してもよい。いくつかの場合では、標的のゲノム配列（例えば、ＡＰＰコード配列を含むもの）の除去及び／又は置き換えを確実にするために１つより多くの（例えば、２つの）相違するｇＲＮＡが使用される。
【0081】
本発明の実施に使用され得るさらなる遺伝子編集システムとしては、ＴＡＬＥＮ（転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、及び塩基編集、並びにホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼ（ＭｅｇＮ）（ＤＮＡ配列を標的として切断する）及びプライム編集（遺伝子改変のためのＲＮＡ鋳型を生成させる）などの新しく開発された手法が挙げられる。
【0082】
ＩＩＩ．医薬組成物及び投与
本発明により、予防的適用及び治療的適用の両方において、本発明の方法に有用な１種又は複数種の薬剤を有効量で含む医薬組成物又は生理学的組成物もまた提供する。そのような医薬組成物又は生理学的組成物としては、１種又は複数種の薬学的又は生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体もまた挙げられる。例えば、本発明の一例の例示的な組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又は同等物及び１種類又は２種類のｓｇＲＮＡ）をコードする１つ又は複数の発現ベクターに加えて、１種又は複数種の生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体を含むか、又は本質的にこれらからなる。本発明の別の例示的な組成物は、１つ又は複数の阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、低分子阻害性ＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド）をコードする１つ又は複数の発現ベクターに加えて、１種又は複数種の生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体を含むか、又は本質的にこれらからなる。本発明の医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムにおける使用に適している。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)を参照のこと。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照のこと。
本発明により、予防的適用及び治療的適用の両方において、本発明の方法に有用な１種又は複数種の薬剤を有効量で含む医薬組成物又は生理学的組成物もまた提供する。そのような医薬組成物又は生理学的組成物としては、１種又は複数種の薬学的又は生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体もまた挙げられる。例えば、本発明の一例の例示的な組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又は同等物及び１種類又は２種類のｓｇＲＮＡ）をコードする１つ又は複数の発現ベクターに加えて、１種又は複数種の生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体を含むか、又は本質的にこれらからなる。本発明の別の例示的な組成物は、１つ又は複数の阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、低分子阻害性ＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド）をコードする１つ又は複数の発現ベクターに加えて、１種又は複数種の生理学的に許容可能な非薬効成分又は担体を含むか、又は本質的にこれらからなる。本発明の医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムにおける使用に適している。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)を参照のこと。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照のこと。
【0083】
本発明の医薬組成物は種々の経路によって、例えば、経口、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、又は頭蓋内に投与され得る。医薬組成物の投与の好ましい経路は、レシピエントの標的疾患と関連する器官又は組織への所定の１日用量での局所送達である。適切な用量は単回の１日用量で、又は適切な間隔で、例えば１日あたり２回、３回、４回若しくはそれより多くの細分用量として提示される分割用量として投与され得る。
【0084】
本発明の１種又は複数種の活性薬剤を含む医薬組成物の調製には、不活性な薬学的に許容可能な担体もまた使用される。通常は、医薬用担体は固形又は液状のいずれかであり得る。固形形態の調製物としては、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が挙げられる。固形担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、又は錠剤崩壊剤としての機能も果たし得る１種又は複数種の物質であり得；また、カプセル封入材であってもよい。
【0085】
散剤では、担体は一般的に、微粉化された活性成分との混合物の状態である微粉化固形物である。錠剤では、活性成分は、必要な結合特性を有する担体と適当な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮成形される。
【0086】
坐剤の形態の医薬組成物の調製では、脂肪酸グリセリドとココアバターの混合物などの低融点ワックスをまず溶融させ、これに活性成分を、例えば撹拌することによって分散させる。次いで、均一な溶融混合物を簡便な大きさの鋳型内に注入し、冷却して固化させる。
【0087】
散剤及び錠剤は、好ましくは約５重量％～約７０重量％の活性成分を含む。好適な担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、及びココアバターなどが挙げられる。
【0088】
医薬組成物は、活性薬剤（群）と、カプセル剤をもたらす担体としてのカプセル封入材との製剤を含み得、カプセル剤は、担体が薬剤（群）に結合するように、（他の担体を伴う又は伴わない）薬剤（群）が担体に囲まれている。同様に、カシェ剤も含まれ得る。錠剤、散剤、カシェ剤、及びカプセル剤は、経口投与に適した固形投薬形態として使用され得る。
【0089】
液状医薬組成物としては、例えば、経口投与又は非経口投与に適した液剤、懸濁剤、及び経口投与に適したエマルジョン剤が挙げられる。活性成分（群）の滅菌水の液剤又は水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、又はプロピレングリコールを含む溶媒中の活性成分（群）の滅菌された液剤は、非経口投与に適した液状組成物の例である。組成物は、必要に応じて、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤など、生理学的条件に近づけるための薬学的に許容可能な補助物質を含んでいてもよい。
【0090】
滅菌された液剤は、活性成分（群）を所望の溶媒系に溶解させ、次いで、得られた溶液を、これを滅菌するための膜フィルターに通すことによって、或いはまた、滅菌された成分（群）を、事前に滅菌した溶媒中に滅菌条件下で溶解させることによって調製され得る。得られた水性液剤は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、又は凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は投与前に、滅菌水性担体と合わされる。調製物のｐＨは、通常は３～１１、より好ましくは５～９、最も好ましくは７～８である。
【0091】
１種又は複数種の活性薬剤を含む医薬組成物は予防的治療及び／又は治療的治療のために投与され得る。治療的適用では、組成物は、既にアルツハイマー病に苦しんでいる患者に、疾患の発症、進行、持続期間、及び重症度などの、疾患及びその合併症の症状を予防、治癒、逆転、又は少なくとも一部において遅滞若しくは停止させるのに十分な量で投与される。これが達成されるのに十分な量を「治療有効用量」と定義する。この使用のために有効な量は、疾患の重症度、患者の体重及び全身状態、並びに活性薬剤（群）の性質に依存する。
【0092】
予防的適用では、１種又は複数種の活性薬剤を含む医薬組成物は、アルツハイマー病に罹患しやすいか、或いはアルツハイマー病を発症するリスクがある患者に、症状の発現が遅延又は抑制されるのに十分な量で投与される。そのような量が「予防的有効用量」であると定義する。この使用において、活性薬剤（群）の厳密な量は、この場合も患者の健康状態及び体重、並びに活性薬剤（群）の性質に依存する。
【0093】
前記組成物の単回投与又は反復投与は、治療担当医によって選択される用量レベル及びパターンを用いて行なわれ得る。任意の事象において、この医薬用製剤により、患者においてＡＰＰ発現及びＡβプラークの形成が有効に抑制されるのに十分な量の薬剤（群）が治療的又は予防的のいずれかでもたらされるはずである。
【0094】
ＩＶ．核酸を用いた治療的適用
コード配列が転写されて、ポリペプチド薬剤若しくはオリゴヌクレオチド薬剤が細胞内で産生されるように、ＡＰＰゲノム配列を破壊する１種若しくは複数種の薬剤をコードする核酸、又はＡＰＰゲノム配列にコードされたｍＲＮＡを阻害する核酸（アンチセンス若しくはｍｉＲＮＡ、又はＣａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡなど）を細胞内に導入することを含む治療アプローチにより、さまざまな病状が治療され得る。遺伝性疾患及び後天的疾患の治療に対する遺伝子治療の適用に関する論考については、Miller Nature 357:455-460 (1992)；及びMulligan Science 260:926-932 (1993)を参照のこと。
コード配列が転写されて、ポリペプチド薬剤若しくはオリゴヌクレオチド薬剤が細胞内で産生されるように、ＡＰＰゲノム配列を破壊する１種若しくは複数種の薬剤をコードする核酸、又はＡＰＰゲノム配列にコードされたｍＲＮＡを阻害する核酸（アンチセンス若しくはｍｉＲＮＡ、又はＣａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡなど）を細胞内に導入することを含む治療アプローチにより、さまざまな病状が治療され得る。遺伝性疾患及び後天的疾患の治療に対する遺伝子治療の適用に関する論考については、Miller Nature 357:455-460 (1992)；及びMulligan Science 260:926-932 (1993)を参照のこと。
【0095】
Ａ．遺伝子送達のためのベクター
細胞又は生物体への送達のため、１種又は複数種の活性薬剤をコードするポリヌクレオチドがベクター内に組み込まれ得る。そのような目的に使用されるベクターの例としては、標的細胞内での核酸の発現を指示することができる発現プラスミドが挙げられる。他の場合では、ベクターが、ポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に組み込まれた、標的細胞に遺伝子導入することができるウイルスベクター系である。ある実施形態では、コードポリヌクレオチドは、所望の標的宿主細胞内でのポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現を指示することができる発現制御配列に作動可能に連結され得る。多くの場合、コード配列は、プロモーター及び所望により少なくとも１つの転写エンハンサーエレメントの制御下で転写される。そのようなプロモーターは、本質的に構成的（すなわち、コード配列の転写の指示に対して常に活性である）であってもよく、また本質的に誘導性（すなわち、特異的シグナルがあるとコード配列の転写の指示に対して活性となる）であってもよく、これは好ましくは、送達標的の特定の組織型又は細胞型における転写を特異的に指示するプロモーターである。例えば、神経細胞特異的プロモーターは好ましくは、中枢神経系内、例えば脳内の解剖学的部位への送達が意図されるベクターに使用される。したがって、ポリペプチド系阻害剤又はオリゴヌクレオチド系阻害剤の発現は標的細胞内において適切な条件下で行なわれ得る。
細胞又は生物体への送達のため、１種又は複数種の活性薬剤をコードするポリヌクレオチドがベクター内に組み込まれ得る。そのような目的に使用されるベクターの例としては、標的細胞内での核酸の発現を指示することができる発現プラスミドが挙げられる。他の場合では、ベクターが、ポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に組み込まれた、標的細胞に遺伝子導入することができるウイルスベクター系である。ある実施形態では、コードポリヌクレオチドは、所望の標的宿主細胞内でのポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現を指示することができる発現制御配列に作動可能に連結され得る。多くの場合、コード配列は、プロモーター及び所望により少なくとも１つの転写エンハンサーエレメントの制御下で転写される。そのようなプロモーターは、本質的に構成的（すなわち、コード配列の転写の指示に対して常に活性である）であってもよく、また本質的に誘導性（すなわち、特異的シグナルがあるとコード配列の転写の指示に対して活性となる）であってもよく、これは好ましくは、送達標的の特定の組織型又は細胞型における転写を特異的に指示するプロモーターである。例えば、神経細胞特異的プロモーターは好ましくは、中枢神経系内、例えば脳内の解剖学的部位への送達が意図されるベクターに使用される。したがって、ポリペプチド系阻害剤又はオリゴヌクレオチド系阻害剤の発現は標的細胞内において適切な条件下で行なわれ得る。
【0096】
Ｂ．遺伝子送達システム
ＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を破壊するポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現に有用なウイルスベクター系としては、例えば、天然に存在するウイルスベクター系又は組換えウイルスベクター系が挙げられる。具体的な適用にもよるが、好適なウイルスベクターとしては、複製可能なウイルスベクター、複製欠陥ウイルスベクター、及び条件複製型ウイルスベクターが挙げられる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス又はウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、並びにレトロウイルス（限定されないが、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる）、並びにＭｏＭＬＶのゲノムに由来するものであり得る。通常は、目的のコード配列（例えば、本発明のポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードするもの）は、そのようなベクター内に、通常はウイルスＤＮＡの付随を伴う、遺伝子コンストラクトのパッケージング、続いて感受性の宿主細胞の感染及び目的のコード配列の発現が可能となるように挿入される。
ＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を破壊するポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現に有用なウイルスベクター系としては、例えば、天然に存在するウイルスベクター系又は組換えウイルスベクター系が挙げられる。具体的な適用にもよるが、好適なウイルスベクターとしては、複製可能なウイルスベクター、複製欠陥ウイルスベクター、及び条件複製型ウイルスベクターが挙げられる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス又はウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、並びにレトロウイルス（限定されないが、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる）、並びにＭｏＭＬＶのゲノムに由来するものであり得る。通常は、目的のコード配列（例えば、本発明のポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードするもの）は、そのようなベクター内に、通常はウイルスＤＮＡの付随を伴う、遺伝子コンストラクトのパッケージング、続いて感受性の宿主細胞の感染及び目的のコード配列の発現が可能となるように挿入される。
【0097】
本明細書において使用する場合、「遺伝子送達システム」は、標的細胞への目的のポリヌクレオチド配列の送達のための任意の手段を示す。本発明のいくつかの実施形態では、核酸を、取込み（例えば、コーテッドピットの陥入及びエンドソームのインターナリゼーション）促進のための細胞受容体リガンドに、ＤＮＡ連結部分などの適切な連結部分を介して（Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988)；ＷＯ９２／０６１８０）、又は超音波－マイクロバブル送達システムによって（Lan HY et al., J. Am Soc. Nephrol. 14:1535-1548）複合体化させる。例えば、核酸は、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体リガンドであるアシアロ－オロオロソムコイドにポリリシン部分を介して連結され得る。
【0098】
同様に、目的の核酸を含む遺伝子コンストラクトをパッケージングするために使用されるウイルス外被を、特定の細胞内での受容体媒介性エンドサイトーシスが可能になるように、受容体リガンド又は受容体に特異的な抗体の付加によって修飾してもよい（例えば、ＷＯ９３／２０２２１、ＷＯ９３／１４１８８、及びＷＯ９４／０６９２３参照）。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡコンストラクトは、エンドサイトーシスを促進するために、アデノウイルス粒子などのウイルスタンパク質に連結される（Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8850-8854 (1991)）。他の実施形態において、本発明の活性薬剤は、微小管阻害剤（ＷＯ／９４０６９２２）、インフルエンザウイルスヘマグルチニンを模倣する合成ペプチド（Plank et al., J. Biol. Chem. 269:12918-12924 (1994)）、及びＳＶ４０ Ｔ抗原（ＷＯ９３／１９７６８）などの核局在化シグナルを含み得る。
【0099】
レトロウイルスベクターもまた、本発明のポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤のコード配列を標的細胞又は標的組織内に導入するのに有用であり得る。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスを遺伝子操作することによって産生される。レトロウイルスのウイルスゲノムはＲＮＡである。感染すると、このゲノムＲＮＡはＤＮＡコピーに逆転写され、ＤＮＡのコピーが形質導入細胞の染色体ＤＮＡ内に高度に安定的かつ効率的に組み込まれる。組み込まれたＤＮＡコピーはプロウイルスと称され、任意の他の遺伝子の場合と同様に娘細胞に受け継がれる。野生型レトロウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは３つの遺伝子であるｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を有し、これらは２つの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）配列に挟まれている。ｇａｇ遺伝子は、内部の構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードしており；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードしており；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルス外被糖タンパク質をコードする。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進させる機能を果たす。５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子内への効率的な封入に必要な配列（Ｐｓｉ部位）が存在する（Mulligan, In:Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye (ed), 155-173 (1983)；Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)；Cone and Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81:6349-6353 (1984)参照）。
【0100】
レトロウイルスベクターのデザインは当業者によく知られている。簡単には、カプシド形成（又はレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオン内へのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムにない場合、結果は、ゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げるシス作用性欠陥となる。しかしながら、得られる変異は依然としてすべてのビリオンタンパク質の合成を指示することができる。これらの配列が欠失されたレトロウイルスゲノム、並びに染色体に安定的に組み込まれた変異ゲノムを含む細胞株は当該技術分野においてよく知られており、レトロウイルスベクターを構築するために使用される。レトロウイルスベクターの調製及びその使用は、例えば、欧州特許出願公開ＥＰＡ ０ １７８ ２２０；米国特許第４，４０５，７１２号；Gilboa Biotechniques 4:504-512 (1986)；Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)；Cone and Mulligan Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353 (1984)；Eglitis et al. Biotechniques 6:608-614 (1988)；Miller et al. Biotechniques 7:981-990 (1989)；Miller (1992)上掲；Mulligan (1993)、上掲；及びＷＯ９２／０７９４３を含む多くの刊行物に記載されている。
【0101】
レトロウイルスベクター粒子は、所望のヌクレオチド配列を組換えによりレトロウイルスベクター内に挿入し、パッケージング細胞株の使用によってベクターを、レトロウイルスカプシドタンパク質を用いてパッケージングすることにより調製される。得られるレトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞内で複製することができないが、宿主細胞のゲノム内に、所望のヌクレオチド配列を含むプロウイルス配列として組み込まれることが可能である。その結果、患者は、例えば、本発明の方法において有用なポリペプチド系活性薬剤又はポリヌクレオチド系活性薬剤の生成が可能となり、したがって標的細胞（例えば、脳の内皮細胞）が正常な表現型に回復する。
【0102】
レトロウイルスベクター粒子を調製するために使用されるパッケージング細胞株は、通常は、パッケージングに必要とされる必要なウイルス構造タンパク質を産生するが感染性ビリオンを産生させることはできない組換え哺乳動物組織培養細胞株である。一方、使用される欠陥レトロウイルスベクターは、これらの構造遺伝子を欠くがパッケージングに必要な残りのタンパク質をコードするものである。パッケージング細胞株を調製するため、パッケージング部位を欠失させた所望のレトロウイルスの感染性クローンが構築され得る。このコンストラクトを含む細胞はすべてのウイルス構造タンパク質を発現するが、導入されるＤＮＡがパッケージングされることはない。あるいはまた、パッケージング細胞株は、細胞株を、適切なコアタンパク質及び外被タンパク質をコードする１つ又は複数の発現プラスミドを用いて形質転換することによって産生され得る。これらの細胞において、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子は同じレトロウイルスに由来するものであっても異なるレトロウイルスに由来するものであってもよい。
【0103】
本発明に適したいくつかのパッケージング細胞株が先行技術においても入手可能である。これらの細胞株の例としては、Ｃｒｉｐ、ＧＰＥ８６、ＰＡ３１７、及びＰＧ１３が挙げられる（Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)参照）。他のパッケージング細胞株の例は、Cone and Mulligan Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81:6349-6353 (1984)；Danos and Mulligan Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85:6460-6464 (1988)；Eglitis et al. (1988)、上掲；及びMiller (1990)、上掲に記載されている。
【0104】
キメラ外被タンパク質を有するレトロウイルスベクター粒子を産生することができるパッケージング細胞株を使用してもよい。あるいはまた、ＰＡ３１７パッケージング細胞株及びＧＰＸパッケージング細胞株によって産生されるものなどの両種指向性又は異種指向性の外被タンパク質を、レトロウイルスベクターをパッケージングするために使用してもよい。
【0105】
Ｃ．医薬用製剤
製薬目的に使用される場合、ポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードする核酸は一般的に、適切な緩衝液中にて製剤化され、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及びGood et al. Biochemistry 5:467 (1966)に記載された緩衝液などの当業者に知られた他の緩衝液など、任意の薬学的に許容可能な緩衝液であり得る。
製薬目的に使用される場合、ポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードする核酸は一般的に、適切な緩衝液中にて製剤化され、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及びGood et al. Biochemistry 5:467 (1966)に記載された緩衝液などの当業者に知られた他の緩衝液など、任意の薬学的に許容可能な緩衝液であり得る。
【0106】
組成物は、安定剤、エンハンサー、又は他の薬学的に許容可能な担体若しくはビヒクルをさらに含んでいてもよい。薬学的に許容可能な担体は、例えば、本発明の核酸及び任意の関連ベクターを安定化させる機能を果たす生理学的に許容可能な化合物を含み得る。生理学的に許容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの糖質、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは非薬効成分が挙げられ得る。他の生理学的に許容可能な化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、又は微生物の増殖若しくは作用を抑制するのに特に有用な保存剤が挙げられる。種々の保存剤がよく知られており、例えば、フェノール及びアスコルビン酸が挙げられる。担体、安定剤、又は補助剤の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)を参照のこと。
【0107】
Ｄ．製剤の投与
ポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む製剤は、当業者に知られた任意の送達方法を用いて標的組織又は標的器官に送達され得る。本発明のいくつかの実施形態において、コードポリヌクレオチド配列は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、若しくは腹腔内注射のため、経口摂取／鼻吸入のため、又は局所適用のために製剤化される。
ポリペプチド系活性薬剤又はオリゴヌクレオチド系活性薬剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む製剤は、当業者に知られた任意の送達方法を用いて標的組織又は標的器官に送達され得る。本発明のいくつかの実施形態において、コードポリヌクレオチド配列は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、若しくは腹腔内注射のため、経口摂取／鼻吸入のため、又は局所適用のために製剤化される。
【0108】
目的の核酸を含む製剤は、通常、細胞に直接投与される。細胞は、循環系の一部としての赤血球など、組織の一部として、又は組織培養中など、単離された細胞として提供され得る。細胞は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで提供され得る。
【0109】
製剤は目的の組織内にインビボ又はエクスビボで、さまざまな方法によって導入され得る。本発明のいくつかの実施形態において、目的の核酸は細胞内に、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合、超音波、エレクトロポレーション、又はバイオリスティックなどの方法によって導入される。さらなる実施形態では、核酸は、治療されている疾患又は病状と関連する標的組織又は標的器官によって直接取り込まれ、例えば、標的細胞が脳の内皮細胞である場合、頭蓋内注射が適切である。
【0110】
本発明のいくつかの実施形態では、目的の核酸は、患者から外植された細胞又は組織にエクスビボで投与され、次いで、その患者に戻される。治療用遺伝子コンストラクトのエクスビボ投与の例としては、Nolta et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 93(6):2414-9 (1996)；Koc et al., Seminars in Oncology 23(1):46-65 (1996)；Raper et al., Annals of Surgery 223(2):116-26 (1996)；Dalesandro et al., J. Thorac. Cardi. Surg., 11(2):416-22 (1996)；及びMakarov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):402-6 (1996)が挙げられる。
【0111】
製剤の有効投薬量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及び投与されている他の薬を含む多くの異なる要素に応じて異なる。したがって、治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために用量設定される必要がある。投与されるベクターの有効量の決定において、医師は、使用される具体的な核酸、診断されている疾患状態；患者の年齢、体重、及び全身状態、循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行、並びに抗ベクター抗体の産生を評価するべきである。用量サイズはまた、具体的なベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。例えば、１～１０００ｍｇ、１０～２００ｍｇ、又は２０～１００ｍｇの量のアンチセンスオリゴヌクレオチドが患者に、静脈内注射によって毎週、隔週、又は毎月の頻度の投与で少なくとも１か月間～３か月間、又はより長い期間にわたって送達され得る。ＡＰＰゲノム領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集では、別の例として、それぞれ５×１０５個の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はニューロン起源の細胞）に、１対のｓｇＲＮＡと共にＣａｓ９をコードする遺伝子を担持する０．５～５０μｇ；１～２０μｇ；又は２～１０μｇのベクターを用いて遺伝子導入される。ヒト患者のＡＰＰゲノム領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集では、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとを担持する脂質ナノ粒子の用量は、ｉ．ｖ．注射により１～４週間の期間にわたって１～３回送達される、体重１ｋｇ当たり０．０１～２ｍｇ；０．０２～１．０ｍｇ；０．０５～０．５ｍｇ；又は０．１０～０．３０ｍｇの範囲内である。
【0112】
Ｖ．キット
本発明はまた、アミロイド病変（アルツハイマー病など）の治療、又はアミロイド病変（アルツハイマー病など）のリスクの低減を、それを必要とする個人において、本発明の方法により行うためのキットを提供する。キットは、通常、（１）ＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を破壊すること、及び／又は前記ゲノム配列から転写されたｍＲＮＡを抑制することができる１種又は複数種の活性薬剤を有効量で有する医薬組成物；並びに（２）治療され得る患者のタイプ（例えば、アルツハイマー病を患っているか、又は前記疾患のリスクが高いヒト患者）、スケジュール（例えば、用量及び頻度）、及び投与経路などの記載を含む、医薬組成物の調剤方法に関する使用説明を含む情報資料を収容する容器を含む。いくつかの場合では、キットは、各々が、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ若しくは同等物及び１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡ）をコードするか、又はＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を標的とするｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするベクター又はベクター群などの少なくとも１種の活性薬剤を有効量で含む、複数の医薬組成物を提供するための２つ以上の容器を含む。所望により、キットは、各々に、個人のゲノムの少なくとも一部分、特に、目的の部分領域（群）を含むＡＰＰゲノム配列、例えば、スウェーデン型変異などの既知の変異の１つ又は複数の部位を含むＡＰＰゲノム配列のシーケンシングを行うのに有用である少なくとも１種の薬剤が収容される、１つ又は複数の追加の容器をさらに含む。
本発明はまた、アミロイド病変（アルツハイマー病など）の治療、又はアミロイド病変（アルツハイマー病など）のリスクの低減を、それを必要とする個人において、本発明の方法により行うためのキットを提供する。キットは、通常、（１）ＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を破壊すること、及び／又は前記ゲノム配列から転写されたｍＲＮＡを抑制することができる１種又は複数種の活性薬剤を有効量で有する医薬組成物；並びに（２）治療され得る患者のタイプ（例えば、アルツハイマー病を患っているか、又は前記疾患のリスクが高いヒト患者）、スケジュール（例えば、用量及び頻度）、及び投与経路などの記載を含む、医薬組成物の調剤方法に関する使用説明を含む情報資料を収容する容器を含む。いくつかの場合では、キットは、各々が、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ若しくは同等物及び１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡ）をコードするか、又はＡＰＰコード配列を含むゲノム配列を標的とするｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉｎｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするベクター又はベクター群などの少なくとも１種の活性薬剤を有効量で含む、複数の医薬組成物を提供するための２つ以上の容器を含む。所望により、キットは、各々に、個人のゲノムの少なくとも一部分、特に、目的の部分領域（群）を含むＡＰＰゲノム配列、例えば、スウェーデン型変異などの既知の変異の１つ又は複数の部位を含むＡＰＰゲノム配列のシーケンシングを行うのに有用である少なくとも１種の薬剤が収容される、１つ又は複数の追加の容器をさらに含む。
【実施例】
【0113】
以下の実施例は例示として示しているにすぎず、限定として示しているのではない。当業者には、変更又は修正されて本質的に同様の結果をもたらし得る、重要でないさまざまなパラメータが容易に認識されよう。
【0114】
実施例１：スウェーデン型変異を標的とするＡＰＰのＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊
家族性アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１、及びプレセニリン２をコードする遺伝子内の優性変異によって引き起こされる。細胞外アミロイドプラーク及び細胞内神経原線維変化を含む病変学特徴が複数の脳領域に存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集を用いた変異を標的とすることは有望な疾患修飾治療方法であるが、このアプローチを用いたアルツハイマー病表現型の脳全域での軽快は実証されていない。ここに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の単回投与によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、ヒトＡＰＰスウェーデン型変異を担持するトランスジェニックマウスモデルにおいて変異ＡＰＰが効率的かつ選択的に破壊され、注射後の少なくとも６か月間、アミロイドベータ関連病変の緩和がもたらされることを示す。重要なことに、血液脳関門を通過することができる改変ＡＡＶ－Ｃａｓ９の静脈内送達により、アミロイドベータ関連の脳病変及び認知能力の障害が低減される。したがって、脳全域での遺伝子編集に関する本発明者らの研究により、家族性アルツハイマー病、及び複数の脳領域を冒す他の単一遺伝子疾患のための、非侵襲性の単回投与による疾患修飾治療の開発に対する新規なアプローチが提供される。
家族性アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１、及びプレセニリン２をコードする遺伝子内の優性変異によって引き起こされる。細胞外アミロイドプラーク及び細胞内神経原線維変化を含む病変学特徴が複数の脳領域に存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集を用いた変異を標的とすることは有望な疾患修飾治療方法であるが、このアプローチを用いたアルツハイマー病表現型の脳全域での軽快は実証されていない。ここに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の単回投与によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、ヒトＡＰＰスウェーデン型変異を担持するトランスジェニックマウスモデルにおいて変異ＡＰＰが効率的かつ選択的に破壊され、注射後の少なくとも６か月間、アミロイドベータ関連病変の緩和がもたらされることを示す。重要なことに、血液脳関門を通過することができる改変ＡＡＶ－Ｃａｓ９の静脈内送達により、アミロイドベータ関連の脳病変及び認知能力の障害が低減される。したがって、脳全域での遺伝子編集に関する本発明者らの研究により、家族性アルツハイマー病、及び複数の脳領域を冒す他の単一遺伝子疾患のための、非侵襲性の単回投与による疾患修飾治療の開発に対する新規なアプローチが提供される。
【0115】
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も広く一般にみられる神経変性疾患のうちの１つであり、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着及び過剰にリン酸化されたタウタンパク質で構成される神経原線維変化の存在を特徴とする。家族性ＡＤと称される遺伝性形態のＡＤはＡＤ症例の３～５％を占めているが１，２，３、その有病率はハンチントン病４及び筋萎縮性側索硬化症５などの他の神経系の疾患に匹敵する。家族性ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、並びにγ－セクレターゼ複合体の触媒構成要素であるプレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）をコードする遺伝子における完全浸透性の常染色体優性変異によって引き起こされる２。γ－セクレターゼによるＡＰＰプロセシングの調節異常によってＡβペプチドの蓄積が引き起こされ、これがこの疾患の病因の主要因である６。家族性ＡＤの遺伝子的原因の我々の理解が大きく進展したにもかかわらず、現在、有効な疾患修飾治療は存在しない。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も広く一般にみられる神経変性疾患のうちの１つであり、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着及び過剰にリン酸化されたタウタンパク質で構成される神経原線維変化の存在を特徴とする。家族性ＡＤと称される遺伝性形態のＡＤはＡＤ症例の３～５％を占めているが１，２，３、その有病率はハンチントン病４及び筋萎縮性側索硬化症５などの他の神経系の疾患に匹敵する。家族性ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、並びにγ－セクレターゼ複合体の触媒構成要素であるプレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）をコードする遺伝子における完全浸透性の常染色体優性変異によって引き起こされる２。γ－セクレターゼによるＡＰＰプロセシングの調節異常によってＡβペプチドの蓄積が引き起こされ、これがこの疾患の病因の主要因である６。家族性ＡＤの遺伝子的原因の我々の理解が大きく進展したにもかかわらず、現在、有効な疾患修飾治療は存在しない。
【0116】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集は潜在的に特定の変異を標的とすることができる強力なツールである７．しかしながら、疾患修飾性の家族性ＡＤ療法のための標的ゲノム編集アプローチとしてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の開発は、脳における広範なゲノム編集の必要性に対処することを必要とする。ほとんどの脳障害と同様、ＡＤは、皮質及び海馬を含む複数の脳領域を冒す８，９。脳障害に対する現在使用されているゲノム編集手段は脳実質内注射によって送達されるが１０、限られた脳領域に作用し、有益な結果は限定的である。したがって、成体脳において使用することができる効率的で網羅的なゲノム編集方法が早急に必要である。静脈内送達後の広範な中枢神経系への形質導入が可能にする、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）バリアントが最近開発された１１、１２、１３、１４。それに伴い、ＢＢＢ通過ウイルスによって送達されるタンパク質の脳全域での過剰発現により虚血性脳卒中後の回復が促進されることが老齢マウスにおいて示されている１４。したがって、ＢＢＢ通過ウイルスの投与によって中枢神経系の疾患変更遺伝子（群）（disease-modifier gene(s)）の発現を改変することは、家族性ＡＤなどの疾患に対する治療方法としての開発の潜在的可能性を有する。しかしながら、そのようなウイルスがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集構成要素を送達して疾患表現型を軽快させる能力はまだインビボで試験されたことがない。
【0117】
家族性ＡＤのほとんどの症例が単一遺伝子変異によって引き起こされることを考慮し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集は、家族性ＡＤ変異を破壊又は修正してインビトロでのＡβ産生を減少させる能力が実証されている１５，１６。家族性ＡＤのほとんどの患者はヘテロ接合性の疾患原因変異を有し２、１コピーのＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、又はＰＳＥＮ２を生来有するヒトは明白な神経学的症状を示さない１７，１８。したがって、成体段階の家族性ＡＤ患者における疾患原因対立遺伝子の破壊は、家族性ＡＤに対する合理的で実現可能な疾患修飾治療法である。家族性ＡＰＰ変異の中でも、ＡＰＰスウェーデン型（ＡＰＰｓｗｅ）変異（ＫＭ６７０／６７１）は、ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位をコードする配列に存在し、変異ＡＰＰを酵素的切断に対してより利用可能にし、より高いＡβ産生をもたらす１９，２０，２１。最近の研究により、ＡＰＰ変異担持トランスジェニックマウスのＡＰＰｓｗｅ変異をゲノム編集によって破壊することの実現可能性が報告されているが、３％未満という低いゲノム編集効率が、この変異を破壊する潜在的な疾患修飾効果の評価を妨げている１６。
【0118】
本研究において、ＡＰＰｓｗｅ変異を特異的に標的とするＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの成体海馬内へのＡＡＶ媒介性送達によって効率的なゲノム編集がもたらされ、Ａβ沈着トランスジェニックマウスモデルにおいて複数のＡβ関連病変が緩和されることを示す。注目すべきことに、このＣＲＩＳＰＲ媒介性の有益効果はトランスジェニックマウスにおいて少なくとも６か月間持続する。さらに、ＡＰＰｓｗｅ変異を標的とするＢＢＢ通過ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターの単回全身投与により脳全体におけるＡβ病変が軽快する。したがって、本発明者らの結果は、単回用量で投与される全身性ＡＡＶが、家族性ＡＤに対する疾患修飾治療介入の開発のための有望なアプローチであることを実証している。さらに、そのような方法は、常染色体優性変異によって引き起こされる、複数の脳領域を冒す他の中枢神経系の障害にも適用可能となり得る。
【0119】
結果
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集によりＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子が特異的に破壊される
まずＡＰＰｓｗｅ二塩基変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）を、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’）と直接隣接する最初の８個のヌクレオチドの範囲内にこの変異部位が位置する２種類のｓｇＲＮＡであるＳＷ１及びＳＷ２をデザインすることにより標的とした（図１ａ）。この領域は、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡの認識及びＣａｓ９ヌクレアーゼの活性に重要な「シード配列」領域であると考えられる２２。ｓｇＲＮＡとシード配列内に存在する野生型（ＷＴ）配列との間のミスマッチはＣａｓ９による許容性が低いため２３、ＳＷ１及びＳＷ２が変異ＡＰＰ配列をＷＴ配列から区別すると予測した。ｓｇＲＮＡの標的特異性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧｘｘＦＰレポーターシステム２４を使用することによって検証した（図１ｂ）。蛍光強化型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、ＳＷ１及びＳＷ２はいずれも、ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰｓｗｅレポーター内のＡＰＰｓｗｅ配列を切断し、ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰＷＴレポーター内のＡＰＰＷＴ配列は切断しないことが示された（図１ｃ）。これは、ＳＷ１及びＳＷ２のいずれにもＡＰＰｓｗｅ変異に対する高い対立遺伝子特異性があったことを示す。ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰｓｗｅレポーターにおいてＳＷ１の方が高いゲノム編集効率を示すこと、及びＳＷ１媒介性ゲノム編集によってＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位が破壊されるであろうということを考慮し、ＳＷ１を後続のゲノム編集実験に選択した。ＳＷ１及びＳＷ２の対立遺伝子特異性が、これらがＡＰＰＷＴ対立遺伝子を編集できないことによるものでないことを確認するため、それぞれＳＷ１及びＳＷ２に対応する同じ遺伝子座のＡＰＰＷＴ対立遺伝子を標的とする、別の２種類のｓｇＲＮＡであるＷＴ１及びＷＴ２を作成した。ＷＴ１及びＷＴ２のゲノム編集効率は５０％を超えたが、ＳＷ１もＳＷ２も、ＡＰＰＷＴ対立遺伝子を担持するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において観察可能なゲノム編集を誘導せず（図８ａ、ｂ）、ＳＷ１及びＳＷ２はＡＰＰｓｗｅ変異を特異的に標的とすることが示された。さらに、コンピュータ予測による上位５つのオフターゲット部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイによる潜在的オフターゲット効果の試験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてオフターゲット活性は検出されなかった（図８ｃ、ｄ）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集によりＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子が特異的に破壊される
まずＡＰＰｓｗｅ二塩基変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）を、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’）と直接隣接する最初の８個のヌクレオチドの範囲内にこの変異部位が位置する２種類のｓｇＲＮＡであるＳＷ１及びＳＷ２をデザインすることにより標的とした（図１ａ）。この領域は、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡの認識及びＣａｓ９ヌクレアーゼの活性に重要な「シード配列」領域であると考えられる２２。ｓｇＲＮＡとシード配列内に存在する野生型（ＷＴ）配列との間のミスマッチはＣａｓ９による許容性が低いため２３、ＳＷ１及びＳＷ２が変異ＡＰＰ配列をＷＴ配列から区別すると予測した。ｓｇＲＮＡの標的特異性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧｘｘＦＰレポーターシステム２４を使用することによって検証した（図１ｂ）。蛍光強化型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、ＳＷ１及びＳＷ２はいずれも、ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰｓｗｅレポーター内のＡＰＰｓｗｅ配列を切断し、ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰＷＴレポーター内のＡＰＰＷＴ配列は切断しないことが示された（図１ｃ）。これは、ＳＷ１及びＳＷ２のいずれにもＡＰＰｓｗｅ変異に対する高い対立遺伝子特異性があったことを示す。ＥＧｘｘＦＰ－ＡＰＰｓｗｅレポーターにおいてＳＷ１の方が高いゲノム編集効率を示すこと、及びＳＷ１媒介性ゲノム編集によってＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位が破壊されるであろうということを考慮し、ＳＷ１を後続のゲノム編集実験に選択した。ＳＷ１及びＳＷ２の対立遺伝子特異性が、これらがＡＰＰＷＴ対立遺伝子を編集できないことによるものでないことを確認するため、それぞれＳＷ１及びＳＷ２に対応する同じ遺伝子座のＡＰＰＷＴ対立遺伝子を標的とする、別の２種類のｓｇＲＮＡであるＷＴ１及びＷＴ２を作成した。ＷＴ１及びＷＴ２のゲノム編集効率は５０％を超えたが、ＳＷ１もＳＷ２も、ＡＰＰＷＴ対立遺伝子を担持するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において観察可能なゲノム編集を誘導せず（図８ａ、ｂ）、ＳＷ１及びＳＷ２はＡＰＰｓｗｅ変異を特異的に標的とすることが示された。さらに、コンピュータ予測による上位５つのオフターゲット部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイによる潜在的オフターゲット効果の試験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてオフターゲット活性は検出されなかった（図８ｃ、ｄ）。
【0120】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがインビボでＡＰＰｓｗｅ変異を破壊する能力を調べるため、ｓｇＲＮＡ ＳＷ１を、伸長因子１－アルファショート（ＥＦＳ）プロモーターによって駆動されるＣａｓ９と共に単一のＡＡＶ９ベクターであるＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１内にパッケージングし、このウイルスを３か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬内に注射した（図１ｄ）。この５ＸＦＡＤマウスは、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ［スウェーデン型］変異、Ｉ７１６Ｖ［フロリダ型］変異、及びＶ７１７Ｉ［ロンドン型］変異を有するヒトＡＰＰ ｃＤＮＡを有する。ＡＰＰスウェーデン型変異のＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集では完全長の変異ＡＰＰの発現が無効になり、ＡＰＰ変異の効果を破壊することができる。注射後４週目、ゲノム解析のためにマウス脳を採取した。Ｃａｓ９－ＳＷ１のＡＡＶ媒介性インビボ送達によりウイルス形質導入脳領域のＡＰＰｓｗｅ変異が効率的に編集された（２７％のゲノム編集効率；図１ｅ、ｆ、及び図８ｅ）。これは、Ｃａｓ９－ＳＷ１のＡＡＶ媒介性投与によってＡＰＰｓｗｅ変異がインビボで効率的に破壊されたことを示唆する。
【0121】
次いで、Ｃａｓ９－ＳＷ１ゲノム編集によって誘発される潜在的オフターゲット事象を、全ゲノムシーケンシングを行うことによって調べた。個々のマウス脳のウイルス形質導入領域及び非形質導入領域の両方において同様の数の変異（約３５，０００）が検出され（ｎ＝２；図８ｆ及び表１）、Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によって誘発されるオフターゲット事象は稀であることが示唆された。続いて、４６個の遺伝子に存在する２５７個の体細胞変異を潜在的オフターゲット事象と同定した（図８ｇ）。特に、エクソン又は非翻訳領域内に、遺伝子の発現、したがって機能の調節に影響を及ぼすかもしれない２３個の体細胞変異によって特徴付けられる１７個の遺伝子を同定した（表２）。注目すべきことには、細胞型特異的トランスクリプトーム解析により、３つの遺伝子、すなわち、Ｓｐ１１０、Ｓｐ１４０、及びＡｂｃｇ２のみが、マウス脳において発現されることが示唆された２５。とはいえ、これらの３個の遺伝子はニューロンにおいて著明に発現されなかったため２５、同定された変異がマウス脳において生物学的機能に影響を及ぼす可能性は低い。
【0122】
Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイドプラーク負荷が減少する
５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＰＰｓｗｅ変異の破壊によってＡβ関連病変が低減され得るかどうかを調べるため、ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１をＡＡＶ注入により、Ａβプラークが蓄積し始めているが明らかな機能欠損が引き起こされていない時期である２６３か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬内に送達した。６か月までに、５ＸＦＡＤマウスは、Ａβレベルの上昇、Ａβプラーク沈着、グリオーシス、及び神経機能障害を特徴とする重度のＡβ関連病変を発症する（図２～４）２６，２７，２８，２９。Ｃａｓ９－ＳＷ１媒介性遺伝子編集の３か月後、背側海馬領域内のジエチルアミン抽出可溶性Ａβ及びギ酸抽出不溶性Ａβの両方の含有量が減少し（図２ａ）、Ａβｘ－４０種及びＡβｘ－４２種の両方のレベルが６０％超低下した（図２ｂ、ｃ）。
５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＰＰｓｗｅ変異の破壊によってＡβ関連病変が低減され得るかどうかを調べるため、ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１をＡＡＶ注入により、Ａβプラークが蓄積し始めているが明らかな機能欠損が引き起こされていない時期である２６３か月齢の５ＸＦＡＤマウスの海馬内に送達した。６か月までに、５ＸＦＡＤマウスは、Ａβレベルの上昇、Ａβプラーク沈着、グリオーシス、及び神経機能障害を特徴とする重度のＡβ関連病変を発症する（図２～４）２６，２７，２８，２９。Ｃａｓ９－ＳＷ１媒介性遺伝子編集の３か月後、背側海馬領域内のジエチルアミン抽出可溶性Ａβ及びギ酸抽出不溶性Ａβの両方の含有量が減少し（図２ａ）、Ａβｘ－４０種及びＡβｘ－４２種の両方のレベルが６０％超低下した（図２ｂ、ｃ）。
【0123】
続いて、Ｃａｓ９－ＳＷ１のＡＡＶ媒介性発現がアミロイドプラーク沈着に影響を及ぼすかどうかを調べた。Ｃａｓ９－ＳＷ１の注射の３か月間後、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスはウイルス形質導入海馬の部分領域において、未注射側の対応する部分領域と比較した場合、有意に低いＡβプラーク負荷を示した。ゲノム編集されると、Ａβ陽性領域は、アンモン角（ＣＡ）領域において７２．９％減少し（図２ｄ、ｆ、及び図９）、海馬台において７７．９％減少した（図２ｅ、ｇ、及び図９）。アミロイドプラーク負荷は９か月齢の５ＸＦＡＤマウス（すなわち、注射後６か月目）において低いままであり；Ａβ陽性領域は、ＣＡ領域において７４．３％減少し（図２ｈ、ｊ、及び図９）、海馬台において８３．６％減少した（図２ｉ、ｋ、及び図９）。これらの結果は、アミロイド病変に対するＣａｓ９－ＳＷ１媒介性編集の効果が単回投与後、少なくとも６か月間持続したことを実証する（図２ｈ～ｋ及び図９）。
【0124】
Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいてグリオーシスが減少する
５ＸＦＡＤマウスにおいて、Ａβ病変は、アミロイドプラーク周囲の活性化されたミクログリア及び星状細胞の数の増大を特徴とするグリオーシスを伴う２６。したがって、５ＸＦＡＤマウスにおいてゲノム編集後に観察される低アミロイドプラーク負荷がグリオーシスの減少と関連しているかどうかを調べた。最も重度のアミロイドプラーク沈着を示す５ＸＦＡＤマウスの海馬台において（図９）、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりミクログリオーシス及びアストログリオーシスの減少がもたらされた。具体的には、５ＸＦＡＤマウスにおいて、ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子の破壊により、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）によって標識されたミクログリアの割合が６４．９％まで減少した（図３ａ、ｂ、及び図１０ａ）。ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に陽性の星状細胞の数は変化しなかった（図３ｃ、ｄ、及び図１０ｂ）が、ＧＦＡＰ陽性領域の減少が観察された（図３ｃ、ｅ、及び図１０ｂ）。ミクログリアの低減及び星状細胞の活性化の低減によって示されるように、これらの所見は総合的に、Ａβのレベル及び沈着の低減とともに、家族性ＡＤ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、グリオーシスの減少がもたらされたことを示唆する。
５ＸＦＡＤマウスにおいて、Ａβ病変は、アミロイドプラーク周囲の活性化されたミクログリア及び星状細胞の数の増大を特徴とするグリオーシスを伴う２６。したがって、５ＸＦＡＤマウスにおいてゲノム編集後に観察される低アミロイドプラーク負荷がグリオーシスの減少と関連しているかどうかを調べた。最も重度のアミロイドプラーク沈着を示す５ＸＦＡＤマウスの海馬台において（図９）、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりミクログリオーシス及びアストログリオーシスの減少がもたらされた。具体的には、５ＸＦＡＤマウスにおいて、ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子の破壊により、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）によって標識されたミクログリアの割合が６４．９％まで減少した（図３ａ、ｂ、及び図１０ａ）。ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に陽性の星状細胞の数は変化しなかった（図３ｃ、ｄ、及び図１０ｂ）が、ＧＦＡＰ陽性領域の減少が観察された（図３ｃ、ｅ、及び図１０ｂ）。ミクログリアの低減及び星状細胞の活性化の低減によって示されるように、これらの所見は総合的に、Ａβのレベル及び沈着の低減とともに、家族性ＡＤ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、グリオーシスの減少がもたらされたことを示唆する。
【0125】
Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により５ＸＦＡＤマウスにおいて神経機能が改善する
ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の単回注射によって５ＸＦＡＤマウスにおいて海馬シナプスの可塑性障害が逆転し得るかどうかを判断するため、長期増強（ＬＴＰ）の形成を測定した。ＷＴマウスと比べて、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスではシェファー側枝－ＣＡ１シナプスのＬＴＰは有意に障害されており；ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＬＴＰの低減が９０％逆転された（図４ａ、ｂ）。さらに、シナプス前マーカーであるシナプトフィジンとシナプス後マーカーであるシナプス後肥厚９５（ＰＳＤ－９５）を共染色することによって明示されるように、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により、５ＸＦＡＤマウスの海馬台における興奮性シナプスの数が４３．９％増加することを実証した（図４ｃ～ｅ）。これらの結果は、ゲノム編集によってトランスジェニックマウスにおけるシナプス損失が低減されたことを示す。
ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１の単回注射によって５ＸＦＡＤマウスにおいて海馬シナプスの可塑性障害が逆転し得るかどうかを判断するため、長期増強（ＬＴＰ）の形成を測定した。ＷＴマウスと比べて、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスではシェファー側枝－ＣＡ１シナプスのＬＴＰは有意に障害されており；ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＬＴＰの低減が９０％逆転された（図４ａ、ｂ）。さらに、シナプス前マーカーであるシナプトフィジンとシナプス後マーカーであるシナプス後肥厚９５（ＰＳＤ－９５）を共染色することによって明示されるように、ＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により、５ＸＦＡＤマウスの海馬台における興奮性シナプスの数が４３．９％増加することを実証した（図４ｃ～ｅ）。これらの結果は、ゲノム編集によってトランスジェニックマウスにおけるシナプス損失が低減されたことを示す。
【0126】
アミロイドプラークの周囲に存在する膨張した神経突起の突起（neuritic process）である変性神経突起もまた、ＡＤにおけるシナプス障害の一因である。具体的には、リソソームタンパク質ＬＡＭＰ１によって標識され得るこのような神経突起におけるリソソームの凝集が軸索輸送及びシナプス放出特性を改変させ、結果としてシナプス連絡が破壊される３０，３１，３２。したがって、５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集により、海馬台において、ＬＡＭＰ１陽性変性神経突起がおよそ５０％減少し（図４ｆ、ｈ、及び図１１）、ＮｅｕＮ陽性ニューロンの数が増加し（図４ｇ、ｉ）、ゲノム編集によりニューロン脱落が減少することが示唆された。
【0127】
Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によりＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＡβ病変が減少する
進行した疾患状態のトランスジェニックマウスにおけるＡＰＰｓｗｅ変異のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊の有効性を調べるため、ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１を、５ＸＦＡＤマウスと比べて疾患表現型の発症時間が異なるＡβ病変のトランスジェニックマウスモデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬内に注射した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルでは、Ａβプラーク沈着及びグリオーシスはおよそ４か月目に現れ始め３３，３４；ＬＴＰ障害及び認知障害はそれぞれ、６か月目及び１２か月目に観察される３５，３６。したがって、ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１を９か月齢で（Ａβ関連病変及び海馬シナプス機能障害が十分に表れているときに）注射し、脳を６か月後に採取した。ゲノム編集効率はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて２４％であり（図１２ａ、ｂ）、これは５ＸＦＡＤマウスにおいて観察された２７％と同等である。さらに、Ｃａｓ９－ＳＷ１投与後、アミロイドプラーク負荷は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのウイルス形質導入海馬領域において非形質導入領域より低かった。具体的には、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡ及び海馬台におけるアミロイドプラーク負荷がそれぞれ３１．７％及び４９．２％減少した（図５ａ～ｄ及び図１２ｃ、ｄ）。Ａβ沈着の減少とともに、Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によってＩｂａ１標識ミクログリアの数がほぼ半減した（図５ｅ、ｆ）。また、ＧＦＡＰ標識星状細胞が少ないこと（図５ｇ、ｈ）及びＧＦＡＰ陽性領域が小さいことを観察した（図５ｇ、ｉ）。これらの結果は総合的に、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、十分に進展した疾患関連表現型を有するトランスジェニックマウスにおいてアミロイド沈着及びグリオーシスが減少したことを示唆する。
進行した疾患状態のトランスジェニックマウスにおけるＡＰＰｓｗｅ変異のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊の有効性を調べるため、ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１を、５ＸＦＡＤマウスと比べて疾患表現型の発症時間が異なるＡβ病変のトランスジェニックマウスモデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬内に注射した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルでは、Ａβプラーク沈着及びグリオーシスはおよそ４か月目に現れ始め３３，３４；ＬＴＰ障害及び認知障害はそれぞれ、６か月目及び１２か月目に観察される３５，３６。したがって、ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１を９か月齢で（Ａβ関連病変及び海馬シナプス機能障害が十分に表れているときに）注射し、脳を６か月後に採取した。ゲノム編集効率はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて２４％であり（図１２ａ、ｂ）、これは５ＸＦＡＤマウスにおいて観察された２７％と同等である。さらに、Ｃａｓ９－ＳＷ１投与後、アミロイドプラーク負荷は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのウイルス形質導入海馬領域において非形質導入領域より低かった。具体的には、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡ及び海馬台におけるアミロイドプラーク負荷がそれぞれ３１．７％及び４９．２％減少した（図５ａ～ｄ及び図１２ｃ、ｄ）。Ａβ沈着の減少とともに、Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によってＩｂａ１標識ミクログリアの数がほぼ半減した（図５ｅ、ｆ）。また、ＧＦＡＰ標識星状細胞が少ないこと（図５ｇ、ｈ）及びＧＦＡＰ陽性領域が小さいことを観察した（図５ｇ、ｉ）。これらの結果は総合的に、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集により、十分に進展した疾患関連表現型を有するトランスジェニックマウスにおいてアミロイド沈着及びグリオーシスが減少したことを示唆する。
【0128】
Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスにおいてＡβ病変が全域的に減少する
ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内注射によりウイルス形質導入領域におけるＡβ関連病変が減少したことを考慮し（図２～４）、脳全体におけるＣａｓ９－ＳＷ１媒介性ゲノム編集が実現する可能性を検討した。最近のＢＢＢ通過ＡＡＶ９バリアントＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ１１の開発により、Ｃａｓ９－ＳＷ１を成体脳に全身投与によって効率的に送達ことが可能になった。したがって、ニューロン特異的ヒトシナプシン１（Ｓｙｎ）プロモーターＳＷ１－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９によって駆動されるＢＢＢ通過ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターを作成した（図１３ａ）。このＡＡＶベクターの全身投与ではマウス脳においてＣａｓ９の限定的な発現しかもたらされなかったことを考慮し（図１３ｂ）、インビボでＣａｓ９の発現の増強をもたらすであろうウイルスコンストラクトを作成した。具体的には、切断型ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）３７をＡＡＶコンストラクト内に挿入すると（ＳＷ１－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥ；図６ａ）、海馬及び皮質におけるＣａｓ９発現が劇的に増大し；このコンストラクトのサイズはＡＡＶの約５ｋｂのパッケージング容量の範囲内に維持された３８（図１３ａ）。このような最適化により、この新たなＢＢＢ通過ニューロン特異的ゲノム編集システムによって海馬内注射によるものと同等の脳内ゲノム編集効率が実現された（図１４ａ、ｂ）。
ＡＡＶ－ＥＦＳ：：Ｃａｓ９－ＳＷ１の海馬内注射によりウイルス形質導入領域におけるＡβ関連病変が減少したことを考慮し（図２～４）、脳全体におけるＣａｓ９－ＳＷ１媒介性ゲノム編集が実現する可能性を検討した。最近のＢＢＢ通過ＡＡＶ９バリアントＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ１１の開発により、Ｃａｓ９－ＳＷ１を成体脳に全身投与によって効率的に送達ことが可能になった。したがって、ニューロン特異的ヒトシナプシン１（Ｓｙｎ）プロモーターＳＷ１－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９によって駆動されるＢＢＢ通過ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターを作成した（図１３ａ）。このＡＡＶベクターの全身投与ではマウス脳においてＣａｓ９の限定的な発現しかもたらされなかったことを考慮し（図１３ｂ）、インビボでＣａｓ９の発現の増強をもたらすであろうウイルスコンストラクトを作成した。具体的には、切断型ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）３７をＡＡＶコンストラクト内に挿入すると（ＳＷ１－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥ；図６ａ）、海馬及び皮質におけるＣａｓ９発現が劇的に増大し；このコンストラクトのサイズはＡＡＶの約５ｋｂのパッケージング容量の範囲内に維持された３８（図１３ａ）。このような最適化により、この新たなＢＢＢ通過ニューロン特異的ゲノム編集システムによって海馬内注射によるものと同等の脳内ゲノム編集効率が実現された（図１４ａ、ｂ）。
【0129】
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢによる５ＸＦＡＤマウスへのＣａｓ９－ＳＷ１の全身送達により脳全体におけるＨＡタグ付きＣａｓ９の広範な発現（図１４ｃ）及び種々の脳領域におけるアミロイドプラーク沈着の減少（図６ｂ～ｄ）がもたらされた。特に、アミロイドプラーク負荷は、海馬のＣＡ及び海馬台においてだけでなく（図６ｅ～ｈ及び図１４ｄ）、皮質（図６ｉ、ｋ）及び脳幹の延髄を含む他の脳領域においても（図６ｊ、ｌ及び図１４ｃ）減少した。一方、対照としてスクランブルｓｇＲＮＡ（すなわち、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ：Ｃｏｎ－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥ）を用いたＣａｓ９の全身注射では、ＷＴマウス又は５ＸＦＡＤマウスのいずれにおいても明らかな有害効果は引き起こされなかった。具体的には、対照ウイルスでは、ＷＴマウスにおいてグリオーシスも行動欠損も誘発されなかった（図１５ａ～ｆ）。さらに、対照ウイルスは５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイドプラーク負荷に影響を及ぼさなかった（図１５ｇ～ｉ）。したがって、本発明者らの結果は総合的に、Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身投与によって５ＸＦＡＤマウスの複数の脳領域においてＡβ病変が減少したことを実証している。
【0130】
Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリオーシス及び神経突起変性が減少し、認知能力が改善する
全身性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集の後、５ＸＦＡＤマウスは、海馬台においてＩｂａ１標識ミクログリア（図７ａ、ｂ）及びＬＡＭＰ１陽性変性神経突起（図７ｄ、ｅ）の低減を示し、Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により、５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリオーシス及び神経突起変性を含むＡβ関連表現型が全域的に減少することが示唆された。
全身性Ｃａｓ９－ＳＷ１編集の後、５ＸＦＡＤマウスは、海馬台においてＩｂａ１標識ミクログリア（図７ａ、ｂ）及びＬＡＭＰ１陽性変性神経突起（図７ｄ、ｅ）の低減を示し、Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達により、５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリオーシス及び神経突起変性を含むＡβ関連表現型が全域的に減少することが示唆された。
【0131】
これまでの研究で、Ａβ沈着トランスジェニックマウスモデルは馴化及び作業記憶の障害、並びにリスクテイキング行動の増加を示すことが報告されている２６，３５，３９，４０。Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達によってアミロイド関連病変が全域的に減少したことを考慮し、５ＸＦＡＤマウスの馴化能力、作業記憶、及びリスクテイキング行動に対するその有益効果を、それぞれオープンフィールド探索試験、Ｙ迷路自発的交替行動試験、及び高架式十字迷路試験を使用することによって評価した。
オープンフィールド試験において、５ＸＦＡＤマウスは、３日間の訓練課程中、新規な試験環境に対してＷＴマウスより有意に遅い馴化を示した。未注射５ＸＦＡＤマウスとは対照的に、Ｃａｓ９－ＳＷ１を投与されたマウスは試験環境に対して有意に改善された馴化を示した（図７ｅ）。
オープンフィールド試験において、５ＸＦＡＤマウスは、３日間の訓練課程中、新規な試験環境に対してＷＴマウスより有意に遅い馴化を示した。未注射５ＸＦＡＤマウスとは対照的に、Ｃａｓ９－ＳＷ１を投与されたマウスは試験環境に対して有意に改善された馴化を示した（図７ｅ）。
【0132】
Ｙ迷路試験では、マウスに迷路の３つのアームを探索させることによってマウスの作業記憶を測定する。マウスが自身の進入するアームを交替することができるには、（前にどのアームに行ったかを覚えておくための）完全な作業記憶が必要とされる。ＷＴマウスと比べて、５ＸＦＡＤマウスは、全進入において有意に低い割合の自発的交替行動を示した（図７ｆ）。一方、Ｃａｓ９－ＳＷ１を投与された５ＸＦＡＤマウスは、Ｃａｓ９－ＳＷ１を投与されなかったマウスより有意に高い割合の自発的交替行動を示した（図７ｆ）。
【0133】
一方、高架式十字迷路試験では、マウスのリスクテイキング行動及び探索意欲を、不安を惹起するオープンエリアの探索を評価することによって調べる３９，４０。５ＸＦＡＤマウスはＷＴマウスより長い時間をオープンアームで過ごしたが、Ｃａｓ９－ＳＷ１を投与された５ＸＦＡＤマウスは未注射５ＸＦＡＤマウスと比べて有意に少ない時間をオープンアームで過ごした（図７ｇ）。これらの結果は総合的に、Ｃａｓ９－ＳＷ１の全身送達によって５ＸＦＡＤマウスの認知能力が改善されたことを示唆する。
【0134】
考察
本研究では、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターの単回注射によってヒトＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子がインビボで選択的かつ効率的に編集され、Ａβ沈着トランスジェニックマウスモデルにおいてＡβ関連病変が緩和されたことを示す。改善されたＢＢＢ通過ＡＡＶベクターであるＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ１１を利用することにより、トランスジェニックマウスにおけるこのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの全身投与によって複数の脳領域で効率的なゲノム編集が実現され、全域的な有益効果が奏され、Ａβ沈着、ミクログリオーシス、及び神経突起変性が軽快するとともに、認知機能が改善する。本発明者らが知る限り、これは、効率的な脳全域でのゲノム編集をもたらし、結果として脳全体における疾患表現型が緩和された、成体段階において疾患原因変異を標的とする全身性ＡＡＶ送達の最初の実証である。
本研究では、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターの単回注射によってヒトＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子がインビボで選択的かつ効率的に編集され、Ａβ沈着トランスジェニックマウスモデルにおいてＡβ関連病変が緩和されたことを示す。改善されたＢＢＢ通過ＡＡＶベクターであるＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ１１を利用することにより、トランスジェニックマウスにおけるこのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの全身投与によって複数の脳領域で効率的なゲノム編集が実現され、全域的な有益効果が奏され、Ａβ沈着、ミクログリオーシス、及び神経突起変性が軽快するとともに、認知機能が改善する。本発明者らが知る限り、これは、効率的な脳全域でのゲノム編集をもたらし、結果として脳全体における疾患表現型が緩和された、成体段階において疾患原因変異を標的とする全身性ＡＡＶ送達の最初の実証である。
【0135】
家族性ＡＤ変異の中でも、ＡＰＰｓｗｅ変異は、選択的な標的認識を可能にするＳａＣａｓ９の「シード配列」内に存在する二重点変異であり；また、これにより、ｓｇＲＮＡと「シード配列」領域内のゲノムＤＮＡとの間のミスマッチはＣａｓ９ヌクレアーゼによってあまり許容されないため２２、対立遺伝子特異的編集の理想的な候補となる。ＡＰＰｓｗｅの変異対立遺伝子の選択的破壊はＡβ沈着トランスジェニックマウスモデルの海馬において、それぞれＡＰＰｓｗｅ特異的ｓｇＲＮＡ及び化膿レンサ球菌のＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９、１，３６８アミノ酸）を発現する２つのＡＡＶを利用することによって実現されているが、家族性ＡＤ変異対立遺伝子に対するこのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのゲノム編集率は３％未満であった１６。したがって、Ｃａｓ９編集効率を高めるため、ＳｐＣａｓ９の場合の２つのベクター４１の代わりに、より小型のＳａＣａｓ９（１，０５３アミノ酸）とそのｓｇＲＮＡを有するオールインワンＡＡＶベクターにパッケージングされ得るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用した。したがって、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのインビボ編集効率を３０％程度まで改善することに成功した。家族性ＡＤ症例に占めるＡＰＰｓｗｅ変異は少数割合にすぎないが、ＰＳＥＮ１ Ｌ１６６Ｐなどの他の家族性ＡＤ変異もまた、対立遺伝子特異的遺伝子破壊に適している。ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、及びＰＳＥＮ２において２００を超える疾患原因優性変異がこれまでに同定されている４２。さらに、択一的ＰＡＭ適合性を有するＳａＣａｓ９バリアントの開発により４３、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的範囲が拡大され、それにより対立遺伝子特異的破壊の対象となる家族性ＡＤ変異の候補ヌクレオチド配列の範囲が広がる。家族性ＡＤは全ＡＤ症例のおよそ３～５％を占めているにすぎないが１，２，３、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子アプローチは、依然として、家族性ＡＤの治療薬開発に対する計り知れない潜在的可能性を有する。
【0136】
最近の２つの研究により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいた手段によってトランスジェニックマウスモデルにおいてＡβ関連表現型が軽快し得ることが実証されているが、これらを臨床に変換できるかは難題を伴い得る。ある研究では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてＡＰＰノックインマウスの生殖細胞系列におけるＡＰＰ発現を減少させるとアミロイドプラーク負荷が緩和された４４。しかしながら、生殖細胞系列の編集をＡＤに対する介入手段に変換することは可能であるとはいえない。他の研究では、Ａβ関連病変を緩和させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集を用いて成体トランスジェニックマウスの海馬においてβ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）をノックアウトした４５。しかしながら、ＢＡＣＥ１は、その阻害によってシナプス機能及び認知行動の障害などの有害な効果が引き起こされ得るため、臨床適用の良好な標的ではない４６，４７，４８。本研究では、ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性破壊によりＡβ沈着トランスジェニックマウスモデルにおいてアミロイドプラーク沈着だけでなくグリオーシス、シナプス機能障害、及び認知機能障害も軽快させることを示す。したがって、成体段階の家族性ＡＤ患者における疾患原因対立遺伝子の破壊は家族性ＡＤに対する有望な疾患修飾手段である。
【0137】
また、本発明者らの研究は、ＡＤの治療のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを開発するという大きな課題の１つである、脳全域でのゲノム編集の必要性に有効に対処する。ＡＤは複数の脳領域に影響を及ぼすが、現在使用されている成体脳内への送達方法（ウイルス系及び非ウイルス系の両方）は脳実質内注射を必要とし１０、これによりＣａｓ９編集領域が限定される。ＡＡＶ９の単一部位への海馬内注射では海馬の一部にしか感染しない。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの不十分な送達によりその潜在的な有益効果が無効となり得る。したがって、ゲノム編集構成要素の効率的な脳全域での送達が、家族性ＡＤのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの治療薬開発のために早急に必要である。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ１１ ＢＢＢ通過ウイルスをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを有するように改変し、ＡＰＰ遺伝子をインビボで編集した。重要なことに、Ａβが主にＡＰＰ発現ニューロンによって産生されるため、ニューロン特異的プロモーターを用いてＣａｓ９の発現を駆動させてニューロン特異的ゲノム編集を行なった。このシステムはニューロンにおける変異ＡＰＰのみを破壊し、これにより、有糸分裂後のニューロンは分裂できないためＣａｓ９編集によって引き起こされる潜在的な安全性への懸念が軽減される。Ｃａｓ９発現コンストラクトの最適化（すなわち、Ｃａｓ９発現を増強するためのＡＡＶベクターコンストラクト内への切断型ＷＰＲＥエレメントの挿入）により、本発明者らのＰＨＰ．ｅＢ媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで、海馬内局所注射によるものと同等の脳内全域的編集率が実現された。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢは特定の系統のマウスに限定的であるが、ＢＡＬＢ／ｃなどのこれまでは抵抗性の系統、及びマーモセットなどの他の種に形質導入することができる新たな改変操作ベクターが開発されている４９，５０。このような進行中の開発を考慮し、本発明者らの研究は、全身送達ベクターを用いたゲノム編集治療に対する概念実証である。
【0138】
ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集の治療薬開発を強化するためには、ゲノム編集によって誘発される潜在的オフターゲット事象を評価することが重要である。本明細書において、動物個体におけるウイルス形質導入脳領域と非形質導入脳領域の全ゲノムシーケンシングデータの比較により、ウイルス形質導入領域の変異の数が非形質導入領域における基底数に近かったため、Ｃａｓ９－ＳＷ１編集によって誘発されるオフターゲット事象は稀であることが示唆された。ゲノムの位置及び対応する遺伝子の脳内発現に従って変異に優先順位をつけた後、Ｃａｓ９－ＳＷ１の潜在的オフターゲット事象を、脳内で発現され、発現レベルが影響を受けるであろう３つの遺伝子であるＳｐ１１０、Ｓｐ１４０、及びＡｂｃｇ２に絞った。特に、Ｓｐ１１０及びＳｐ１４０は核小体タンパク質ファミリーに属し、潜在的に遺伝子転写を調節し５１、一方、Ａｂｃｇ２はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータースーパーファミリーに属し、生体異物排出トランスポーターとしての機能を果たす５２。注目すべきことに、これらの遺伝子はニューロンにおいて著明に発現されない２５。シナプシン駆動型Ｃａｓ９システムはニューロンのみを標的とすることができるため、これらの変異がニューロンにおいてこれらの遺伝子の発現、したがって機能に影響を及ぼす可能性は低い。したがって、これらの潜在的オフターゲット変異の生物学的効果は最小限である可能性が高い。さらに、本発明者らの所見により、全ゲノムシーケンシングなどの、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子治療の開発のための潜在的オフターゲット事象の公平で包括的な解析の重要性が強調される。
【0139】
要約すると、本発明者らは、ＢＢＢ通過ＡＡＶ媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいた手段を、疾患原因対立遺伝子をインビボで選択的かつ効率的に編集するために適用した。本発明者らの概念実証の研究は、変異ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子の脳全域での編集がＡβ関連病変の緩和を含む持続性の有益効果をインビボでもたらしたことで、さらなる開発のための有望な手段となることを実証している。したがって、本発明者らのＡＡＶ媒介性の単回用量での非侵襲性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、家族性ＡＤ、並びに複数の脳領域を冒す優性変異によって引き起こされる他の形態の脳疾患に対する治療選択肢の欠如に対処するための有望なアプローチである。
【0140】
方法
分子クローニング及びＧＦＰレポーターアッセイ
ｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６１５９１）４１由来のＡＡＶパッケージングコンストラクトを適合させた。海馬内注射のため、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＥＦＳのプロモーターに置き換えた。全身注射のため、プロモーターをヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ）遺伝子プロモーターに置き換え、Ｃａｓ９発現を増強するために切断型ＷＰＲＥカセット（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６１４６３）を付加した３７修飾ｐＸ６０１コンストラクトを使用した。さらに、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡを合成ポリ（Ａ）（ｓｐＡ）に置き換えた。ｓｇＲＮＡをコンストラクト内にＢｓａＩ部位によって挿入した。ｓｇＲＮＡの配列を表３に示す。
分子クローニング及びＧＦＰレポーターアッセイ
ｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６１５９１）４１由来のＡＡＶパッケージングコンストラクトを適合させた。海馬内注射のため、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＥＦＳのプロモーターに置き換えた。全身注射のため、プロモーターをヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ）遺伝子プロモーターに置き換え、Ｃａｓ９発現を増強するために切断型ＷＰＲＥカセット（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６１４６３）を付加した３７修飾ｐＸ６０１コンストラクトを使用した。さらに、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡを合成ポリ（Ａ）（ｓｐＡ）に置き換えた。ｓｇＲＮＡをコンストラクト内にＢｓａＩ部位によって挿入した。ｓｇＲＮＡの配列を表３に示す。
【0141】
ＧＦＰレポーターコンストラクトｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５０７１６）２４はイカワマサヒト氏の厚意により提供され、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡのゲノム編集効率を評価した。ＡＰＰｓｗｅ対立遺伝子及びＡＰＰＷＴ対立遺伝子をオリゴのライゲーションによりＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位内に挿入した。１μｇのＣａｓ９－ｓｇＲＮＡを１μｇのｐＣＡＧ－ＥＧｘＦＰ－ＡＰＰと混合し、この混合物でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入後１２時間に、得られたＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡検査によって調べた。
【0142】
マウス
５つの家族性ＡＤ変異（ＡＰＰ Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ［スウェーデン型］、Ｉ７１６Ｖ［フロリダ型］、Ｖ７１７Ｉ［ロンドン型］、並びにＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖ）を有する５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス２６、並びにＡＰＰ Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン型）変異及びＰＳＥＮ１エクソン９欠失を有するＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス３３をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（それぞれ、ストック番号００８７３０及び００４４６２）から入手した。実験はすべて、雄の５ＸＦＡＤマウス又は雌のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて実施した。マウスはすべて、香港科技大学の動植物ケア施設（Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に収容した。動物実験はすべて、香港科技大学の動物倫理委員会により承認を受けた。
５つの家族性ＡＤ変異（ＡＰＰ Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ［スウェーデン型］、Ｉ７１６Ｖ［フロリダ型］、Ｖ７１７Ｉ［ロンドン型］、並びにＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖ）を有する５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス２６、並びにＡＰＰ Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン型）変異及びＰＳＥＮ１エクソン９欠失を有するＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス３３をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（それぞれ、ストック番号００８７３０及び００４４６２）から入手した。実験はすべて、雄の５ＸＦＡＤマウス又は雌のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて実施した。マウスはすべて、香港科技大学の動植物ケア施設（Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に収容した。動物実験はすべて、香港科技大学の動物倫理委員会により承認を受けた。
【0143】
ＡＡＶの海馬内注射及び全身注射
海馬内注射に使用するＡＡＶのため、ＡＡＶ９－Ｃａｓ９－ＳＷ１を、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のベクターコアによって作成し、ドットブロットによって力価測定した。３か月齢のマウスにイソフルランを用いて麻酔し、動物１匹あたり６×１０１０個のベクターゲノム（ｖｇ）ウイルス（２μＬの３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を注射した。以下の座標（ブレグマを基準にして）：前後（ＡＰ）、－２．０ｍｍ；内外（ＭＬ）、－１．７ｍｍ；背腹（ＤＶ）、－１．４ｍｍを用いて海馬のＣＡ１領域を標的とした５３。空ＡＡＶ９ベクターの海馬内注射ではマウスにおいて有害効果は生じない５４，５５，５６ことを考慮し、同じマウスの未注射側を対照として使用する。マウスをウイルス注入後３か月目又は６か月目に屠殺した。
海馬内注射に使用するＡＡＶのため、ＡＡＶ９－Ｃａｓ９－ＳＷ１を、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のベクターコアによって作成し、ドットブロットによって力価測定した。３か月齢のマウスにイソフルランを用いて麻酔し、動物１匹あたり６×１０１０個のベクターゲノム（ｖｇ）ウイルス（２μＬの３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を注射した。以下の座標（ブレグマを基準にして）：前後（ＡＰ）、－２．０ｍｍ；内外（ＭＬ）、－１．７ｍｍ；背腹（ＤＶ）、－１．４ｍｍを用いて海馬のＣＡ１領域を標的とした５３。空ＡＡＶ９ベクターの海馬内注射ではマウスにおいて有害効果は生じない５４，５５，５６ことを考慮し、同じマウスの未注射側を対照として使用する。マウスをウイルス注入後３か月目又は６か月目に屠殺した。
【0144】
全身送達に使用するＡＡＶに関し、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ：Ｃａｓ９－Ｃｏｎ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ：Ｃａｓ９－ＳＷ１を既報５７のとおりにして作成し、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって力価測定した。３か月齢のマウスに麻酔し、ウイルスを１×１０１３ｖｇ／動物（１００μＬの１×１０１４ｖｇ／ｍＬ）の用量で眼窩後静脈注射した。マウスを６か月齢又は９か月齢時に屠殺し、Ａβ関連病変を解析した。
【0145】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイを行ない、編集効率を解析した。簡単には、３００μｍ厚の海馬切片から海馬台領域及びアンモン角領域を解剖し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＱＥ０９０５０）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。増幅されたＤＮＡを変性させて９５℃から室温まで再アニーリングさせた。続いて、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０２）を添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。産物を、２．５％アガロースゲル電気泳動で可視化することによって解析した。次に、酵素切断バンド及び酵素未切断バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて定量した。最後に、編集効率を以下のとおりに計算した。
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイを行ない、編集効率を解析した。簡単には、３００μｍ厚の海馬切片から海馬台領域及びアンモン角領域を解剖し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＱＥ０９０５０）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。増幅されたＤＮＡを変性させて９５℃から室温まで再アニーリングさせた。続いて、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０２）を添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。産物を、２．５％アガロースゲル電気泳動で可視化することによって解析した。次に、酵素切断バンド及び酵素未切断バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて定量した。最後に、編集効率を以下のとおりに計算した。
【数1】
【0146】
ゲノムシーケンシング及びバイオインフォマティクス解析
ゲノムＤＮＡを、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ． Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ）を用いて抽出し、これを全ゲノムシーケンシング（５０×）のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）に供した。ｒａｗ ｒｅａｄ（１５０ｂｐのペアエンド）を、低品質リードのトリミング及びフィルタリングのためにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（バージョン０．３２）に供した。品質管理に合格したリードを、ヒトＡＰＰ及びＰＳＥＮ１の配列をさらに含む修正バージョンのマウス参照ゲノム（ＵＣＳＣ ｍｍ１０）に、ＢＷＡ ｍｅｍ（バージョン０．７．１２－ｒ１０３９）を用いてマッピングした。生殖細胞系列変異及び体細胞変異を、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ）Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（バージョン４．１．２．０）に従ってデフォルト設定を用いて遺伝子型判定した。具体的には、ＢＡＭファイル処理の際にＰＣＲ重複リードをマークし、Ｂａｓｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ Ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ（ＢＱＳＲ）を行なった。複数のレーンからのリードを統合（merge）することによって得られた最終のＢＡＭファイルをバリアントコールに供した。生殖細胞系列変異及び体細胞変異を、それぞれＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ（バージョン４．１．２．０）及びＭｕＴｅｃｔ２（バージョン４．１．２．０）を用いて検出した。
ゲノムＤＮＡを、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ． Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ）を用いて抽出し、これを全ゲノムシーケンシング（５０×）のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）に供した。ｒａｗ ｒｅａｄ（１５０ｂｐのペアエンド）を、低品質リードのトリミング及びフィルタリングのためにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（バージョン０．３２）に供した。品質管理に合格したリードを、ヒトＡＰＰ及びＰＳＥＮ１の配列をさらに含む修正バージョンのマウス参照ゲノム（ＵＣＳＣ ｍｍ１０）に、ＢＷＡ ｍｅｍ（バージョン０．７．１２－ｒ１０３９）を用いてマッピングした。生殖細胞系列変異及び体細胞変異を、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ）Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（バージョン４．１．２．０）に従ってデフォルト設定を用いて遺伝子型判定した。具体的には、ＢＡＭファイル処理の際にＰＣＲ重複リードをマークし、Ｂａｓｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ Ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ（ＢＱＳＲ）を行なった。複数のレーンからのリードを統合（merge）することによって得られた最終のＢＡＭファイルをバリアントコールに供した。生殖細胞系列変異及び体細胞変異を、それぞれＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ（バージョン４．１．２．０）及びＭｕＴｅｃｔ２（バージョン４．１．２．０）を用いて検出した。
【0147】
本発明者らは、どちらのマウスの非形質導入領域内にも検出されない両方のマウスのウイルス形質導入領域内の変異がゲノム編集によって誘発されている潜在的可能性が大きいと考えた。生殖細胞系列変異を検出するため、１８のマウス系統から検出されたゲノムバリアントを含む５８バージョン３のＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）コール及び挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）コールを用いてＢａｓｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ Ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ（ＢＱＳＲ）を適用した。各ゲノムＤＮＡ試料の対応する部位における編集事象の頻度を、ＶＣＦファイルに保存された修飾対立遺伝子及び非修飾対立遺伝子のリード数に基づいて推定した。Ｒプログラミング（Ｒ ｓｔｕｄｉｏ；バージョン１．３．１０５６）を使用し、反復エレメント内に存在する変異（ＵＣＳＣ ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ ｍｍ１０）、及び生殖細胞系列変異と重複する変異をフィルタリングした。ＢｉｏＭａｒｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｂｉｏｍａｒｔ）から得られるＥｎｓｅｍｂｌｅデータベースの遺伝子本体における遺伝子バリアントの存在をアノテーションした。さらに、エクソン及び非翻訳領域に存在する体細胞変異をデザインした。続いて、脳細胞における関連遺伝子の発現レベルを、細胞型特異的トランスクリプトームデータセット（Ｂｒａｉｎ ＲＮＡ－Ｓｅｑ）２５を検索することによって調べた。遺伝子は少なくとも１つの脳細胞型においてＦＰＫＭが１より大きい場合、脳内で発現されるとみなした。
【0148】
Ａβ抽出、ウエスタンブロット解析、及びＥＬＩＳＡ
背側海馬の可溶性画分及び不溶性画分からＡβペプチドを順次抽出した３５。まず凍結海馬組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む組織ホモジネーションバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＥＧＴＡ）中でホモジナイズした。順次、可溶性Ａβ及び不溶性Ａβを、それぞれジエチルアミン及びギ酸を使用することによって抽出した。可溶性Ａβ及び不溶性Ａβのレベルをウエスタンブロット解析によって解析した。さらに、可溶性のＡβｘ－４０及びＡβｘ－４２を、Ｖ－ＰＬＥＸ Ａβ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐａｎｅｌ １ （６Ｅ１０） Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用することによって解析した。
背側海馬の可溶性画分及び不溶性画分からＡβペプチドを順次抽出した３５。まず凍結海馬組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む組織ホモジネーションバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＥＧＴＡ）中でホモジナイズした。順次、可溶性Ａβ及び不溶性Ａβを、それぞれジエチルアミン及びギ酸を使用することによって抽出した。可溶性Ａβ及び不溶性Ａβのレベルをウエスタンブロット解析によって解析した。さらに、可溶性のＡβｘ－４０及びＡβｘ－４２を、Ｖ－ＰＬＥＸ Ａβ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐａｎｅｌ １ （６Ｅ１０） Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用することによって解析した。
【0149】
免疫組織化学
マウスにペントバルビタールを用いて麻酔し、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を用いて経心腔的灌流を行なった。マウス脳を解剖し、４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、フリーフローティングビブラトーム（ＶＴ１０００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を使用して免疫組織化学のための３０μｍの矢状断脳スライドに切片化した。４Ｇ８免疫染色のため、７０％ギ酸を用いて抗原賦活化を行なった。次いで脳切片をＤＰＢＳで３回洗浄し、２％ヤギ血清及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＤＰＢＳを用いて５９室温で６０分間ブロックし、次いで一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。
マウスにペントバルビタールを用いて麻酔し、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を用いて経心腔的灌流を行なった。マウス脳を解剖し、４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、フリーフローティングビブラトーム（ＶＴ１０００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を使用して免疫組織化学のための３０μｍの矢状断脳スライドに切片化した。４Ｇ８免疫染色のため、７０％ギ酸を用いて抗原賦活化を行なった。次いで脳切片をＤＰＢＳで３回洗浄し、２％ヤギ血清及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＤＰＢＳを用いて５９室温で６０分間ブロックし、次いで一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。
【0150】
以下の一次抗体、すなわち、抗ＨＡタグ抗体（１：５０；＃３７２４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗Ａβ、１７－２４抗体（１：１，０００、クローン４Ｇ８、８００７０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；抗Ｉｂａ１抗体（１：５００、０１９－１９７４１、Ｗａｋｏ）；抗ＧＦＡＰ抗体（１：５，０００、＃３６７０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗ＰＳＤ－９５抗体（１：５００、ａｂ２７２３、Ａｂｃａｍ）；抗シナプトフィジン１抗体（１：５００、１０１０１１、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗ＬＡＭＰ－１抗体（１：５００、１Ｄ４Ｂ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）；及び抗ＮｅｕＮ抗体（１：１００、ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。
【0151】
切片を一次抗体とともにインキュベートした後、これをＤＰＢＳ及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＤＰＢＳＴ）で３回洗浄した。次いで、切片を二次抗体（すなわち、抗ウサギ、抗マウス、又は抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５４６、５６８、又は６４７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にブロックバッファー中で室温にて１２０分間インキュベートした。対応する二次抗体を適用した後、脳切片を核染色色素（４’，６－ジアミジン－２－フェニルインドール［ＤＡＰＩ、５μｇ／ｍＬ］又はＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ［１：３０，０００、Ｓ７０２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）で染色した後、スライド上にマウントした。
【0152】
Ｘ３４でのアミロイドプラーク染色のため、脳切片を１μＭのＸ３４含有Ｘ３４染色バッファー（４０％エタノール／６０％ＤＰＢＳミックス［ｐＨを１０に調整］）中で室温にて１０分間インキュベートした。次いでＸ３４染色バッファーで３回洗浄した６０。
【0153】
Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００ Ｂ複合顕微鏡システム及びＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点システムを用いてイメージングを行なった。
【0154】
電気生理学
マウスを屠殺し、脳を解剖し、脳を即座に氷冷酸素添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）人工脳脊髄液バッファーに移した。続いて、ビブラトーム（ＨＭ６５０Ｖ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３００μｍの脳切片を調製し、人工脳脊髄液中に３２℃で少なくとも１時間回復させた。ＣＡ１野興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を、ＭＥＤ－Ｐ２１０Ａプローブ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を１００μｍの電極間距離で使用することによって記録した。ベースラインを３０分間記録した後、４連発のシータバースト刺激（１００Ｈｚの４つのパルスからなる１０発の短いバースト）によってＬＴＰを誘発した６１，６２。ｆＥＰＳＰを６０分間記録し続けた。最後に、ＬＴＰの大きさをＬＴＰ誘導後５０分から６０分までのｆＥＰＳＰの傾きの平均の変化の割合として定量した。
マウスを屠殺し、脳を解剖し、脳を即座に氷冷酸素添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）人工脳脊髄液バッファーに移した。続いて、ビブラトーム（ＨＭ６５０Ｖ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３００μｍの脳切片を調製し、人工脳脊髄液中に３２℃で少なくとも１時間回復させた。ＣＡ１野興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を、ＭＥＤ－Ｐ２１０Ａプローブ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を１００μｍの電極間距離で使用することによって記録した。ベースラインを３０分間記録した後、４連発のシータバースト刺激（１００Ｈｚの４つのパルスからなる１０発の短いバースト）によってＬＴＰを誘発した６１，６２。ｆＥＰＳＰを６０分間記録し続けた。最後に、ＬＴＰの大きさをＬＴＰ誘導後５０分から６０分までのｆＥＰＳＰの傾きの平均の変化の割合として定量した。
【0155】
行動試験
動物の行動試験のため、マウスに対してオープンフィールド試験及びＹ迷路自発的交替行動試験を行ない、次いで２か月間休息させ、最後に高架式十字迷路試験を行なった。
動物の行動試験のため、マウスに対してオープンフィールド試験及びＹ迷路自発的交替行動試験を行ない、次いで２か月間休息させ、最後に高架式十字迷路試験を行なった。
【0156】
オープンフィールド試験では、フォトビーム活動システム及びソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてマウスの歩行運動活動を記録した３５。各マウスをオープントップチャンバー（４１×４１×３８ｃｍ）の中心に置き、マウスにチャンバを毎日１５分間、３日間連続で探索させた。移動距離をフォトビームによって記録した。
【0157】
自発的交替行動Ｙ迷路試験では、マウスの自発的交替行動能力を、対称的なＹ迷路（長さ３０ｃｍ×高さ２０ｃｍ×幅８ｃｍ）を用いて調べる６３。試験の１日前、各マウスをＹ迷路環境に馴化させた。試験日、各マウスをＹ迷路の中心に入れ、８分間探索させた。進入したアームの順番及び総アーム進入回数を、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴ７（Ｎｏｌｄｕｓ）を用いて記録した。交替行動の割合を、３つのアームすべてに連続して進入した回数を総アーム進入回数－２で除算することによって計算した。解析で、同じアームへの再進入はカウントしなかった。
【0158】
最後に、高架式十字迷路試験では、リスクテイキング行動を、床から６０ｃｍの高さにある十字型の迷路を用いて測定する。２つのオープンアームと１５ｃｍの高さの壁を有する２つのクローズアームとを含む４つのアーム（長さ３０ｃｍ×幅５ｃｍ）が中央プラットフォームから延びている。各マウスをオープンアームに向けて中央プラットフォームに置き、迷路を５分間、自由に探索させた３９。マウスが各ゾーン（すなわち、クローズアーム、オープンアーム、又はセンターエリア）で過ごした時間を、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴ７（Ｎｏｌｄｕｓ）を用いて記録した。
【0159】
統計解析
データはすべて、平均±ＳＥＭとして示し、ｎの値は個々の実験又はマウスの数を示す。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０１）を用いて行なった。差の有意性は、図の説明文に示したとおりの対応両側スチューデントｔ検定又は独立両側スチューデントｔ検定及び二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって評価した。比較が単一のマウスの海馬の未注射側と注射側間におけるものであったため、対応両側ｔ検定を用いて海馬内注射を解析した。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群比較としてオープンフィールド試験における馴化を解析するために行ない；他の場合は独立両側ｔ検定を行なった。群間の差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１の場合に統計学的に有意とみなした。サンプルサイズの事前決定には統計学的方法は使用しなかった。マウスを異なる実験群に無作為に割り付けた。免疫組織化学試験、電気生理学試験、及び行動試験を実施する試験担当者にマウスの遺伝子型及び注射条件は知らされなかった。
データはすべて、平均±ＳＥＭとして示し、ｎの値は個々の実験又はマウスの数を示す。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０１）を用いて行なった。差の有意性は、図の説明文に示したとおりの対応両側スチューデントｔ検定又は独立両側スチューデントｔ検定及び二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって評価した。比較が単一のマウスの海馬の未注射側と注射側間におけるものであったため、対応両側ｔ検定を用いて海馬内注射を解析した。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群比較としてオープンフィールド試験における馴化を解析するために行ない；他の場合は独立両側ｔ検定を行なった。群間の差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１の場合に統計学的に有意とみなした。サンプルサイズの事前決定には統計学的方法は使用しなかった。マウスを異なる実験群に無作為に割り付けた。免疫組織化学試験、電気生理学試験、及び行動試験を実施する試験担当者にマウスの遺伝子型及び注射条件は知らされなかった。
【表1】
【表2】
【表3】
【0160】
実施例２：β－セクレターゼ切断部位及びγ－セクレターゼ切断部位を標的とするＡＰＰの破壊
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も広く一般にみられる神経変性疾患のうちの１つであり、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着及び過剰にリン酸化されたＴａｕタンパク質で構成される神経原線維変化の存在を特徴とする。ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）は、ＡＤの特徴の１つであるＡβの前駆体タンパク質である。ＡＰＰ遺伝子におけるミスセンス変異又はコピー数重複は、早期発症型ＡＤが引き起こされるのに十分である。Ａβは主に、ニューロン内でＡＰＰが切断されると産生する。したがって、ＡＰＰ遺伝子を減少させることは、Ａβの産生が低減され得、ＡＤの治療に対する潜在的治療法となり得よう。ＡＰＰは、ニューロン移動及びシナプス可塑性を含む神経の発達において生理学的役割を有する。したがって、成体段階におけるＡＰＰのニューロン特異的モジュレーションは、ＡＤを最小限の有害効果で治療するための有益なアプローチとなり得る。
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も広く一般にみられる神経変性疾患のうちの１つであり、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着及び過剰にリン酸化されたＴａｕタンパク質で構成される神経原線維変化の存在を特徴とする。ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）は、ＡＤの特徴の１つであるＡβの前駆体タンパク質である。ＡＰＰ遺伝子におけるミスセンス変異又はコピー数重複は、早期発症型ＡＤが引き起こされるのに十分である。Ａβは主に、ニューロン内でＡＰＰが切断されると産生する。したがって、ＡＰＰ遺伝子を減少させることは、Ａβの産生が低減され得、ＡＤの治療に対する潜在的治療法となり得よう。ＡＰＰは、ニューロン移動及びシナプス可塑性を含む神経の発達において生理学的役割を有する。したがって、成体段階におけるＡＰＰのニューロン特異的モジュレーションは、ＡＤを最小限の有害効果で治療するための有益なアプローチとなり得る。
【0161】
ＡＰＰは、アミロイドプラークの主要構成成分であるＡβの前駆体タンパク質である。ＡＰＰは、アミロイド形成性及び非アミロイド形成性のタンパク質分解経路を受け得る。アミロイド形成経路では、ＡＰＰはまずβ－セクレターゼによって切断され、可溶性の分泌型形態のＡＰＰ（ｓＡＰＰβ）及びＣ末端断片（βＡＰＰ－ＣＴＦ）を形成する。βＡＰＰ－ＣＴＦは、γ－セクレターゼによって順次切断され、ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）、並びにシナプス毒性の４０残基のペプチド（Ａβ１－４０）及び４２残基のペプチド（Ａβ１－４２）を含むさまざまな長さのＡβペプチドの産生がもたらされる。非アミロイド形成経路、すなわちα－セクレターゼ媒介性切断経路はＡβの産生を阻害する。この経路において、α－セクレターゼによるＡＰＰの切断はＡβ配列内であり、これによりＡβ形成が抑制される。
【0162】
ほとんどの家族性ＡＤ原因変異は、α－セクレターゼ切断部位、β－セクレターゼ切断部位、及びγ－セクレターゼ切断部位において、又は前記切断部位付近でクラスター形成し、β－セクレターゼ及びγ－セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングが有利になることによってＡβ形成が促進される。これにより全Ａβレベル又はＡβ４２レベルの増大がもたらされ、Ａβのアミロイドプラークへの自己凝集が促進される。したがって、ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位及びγ－セクレターゼ切断部位を破壊することによってＡＰＰのアミロイド形成タンパク質分解経路が阻害され、毒性Ａβの産生が抑制され得る。微生物のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集は、β－セクレターゼ及びγ－セクレターゼの両方をコードするゲノム配列を破壊する強力なツールであり、ＡＤ治療のための大きな潜在的可能性を有する。
【0163】
本発明において、ＡＰＰ遺伝子のエクソン１４～１７を特異的に標的とするためのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、ニューロン特異的プロモーター（表Ｃ）を用いてデザインし（図１６及び表Ａ、Ｂ）、編集効果をインビトロで解析した（図１７）。特定の変異部位（すなわち、ＡＰＰスウェーデン型変異）を標的とするものと比べて、ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位のＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失は、野生型ＡＰＰ、並びにほとんどの家族性ＡＰＰ変異を有するＡＰＰにおけるＡＰＰ発現を減少させるために使用され得る（図１８、表Ｄ）。したがって、このアプローチは、ほとんどの家族性ＡＤ症例の治療に対して開発することができる。ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位のＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失によってＡβ分泌が有意に低減されることを実証した（図１８）。そのようなデータは総合的に、ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断部位及びγ－セクレターゼ切断部位を標的とすることは、Ａβ産生を低減させるための実現可能なアプローチであり、家族性ＡＤ変異を有するほとんどの患者の治療に適用することが可能であり得ることを示す。
【0164】
方法
プラスミド
ＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ｓｇＲＮＡ内にＢｓａＩ部位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介してｓｇＲＮＡを挿入した。次いで、分子クローニングのために、このライゲーション生成物でＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ． Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｉ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ）を製造業者の使用説明に従って用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ラージスケールプラスミドを、エンドトキシンフリー条件でＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
プラスミド
ＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ｓｇＲＮＡ内にＢｓａＩ部位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介してｓｇＲＮＡを挿入した。次いで、分子クローニングのために、このライゲーション生成物でＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ． Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｉ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ）を製造業者の使用説明に従って用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ラージスケールプラスミドを、エンドトキシンフリー条件でＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
【0165】
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％の熱非働化処理済みウシ胎児血清（ｖ／ｖ、ＧＩＢＣＯ）＋１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の使用説明に従って用いて遺伝子導入した。遺伝子導入後４８時間目に細胞を回収し、培地及び細胞ペレットを収集した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％の熱非働化処理済みウシ胎児血清（ｖ／ｖ、ＧＩＢＣＯ）＋１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の使用説明に従って用いて遺伝子導入した。遺伝子導入後４８時間目に細胞を回収し、培地及び細胞ペレットを収集した。
【0166】
ゲノムＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡを細胞ペレットから、製造業者の使用説明に従ってＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（登録商標） ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて抽出した。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミド及びｐｃＤＮＡ３－ＡＰＰプラスミドを用いて同時遺伝子導入した２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅は、９８℃で３０秒間の変性後、（９８℃で２０秒、６５℃で２０秒、及び７２℃で３０秒）を３０サイクル；並びに最終伸長サイクルとして７２℃で２分間であった。
ゲノムＤＮＡを細胞ペレットから、製造業者の使用説明に従ってＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（登録商標） ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて抽出した。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミド及びｐｃＤＮＡ３－ＡＰＰプラスミドを用いて同時遺伝子導入した２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅は、９８℃で３０秒間の変性後、（９８℃で２０秒、６５℃で２０秒、及び７２℃で３０秒）を３０サイクル；並びに最終伸長サイクルとして７２℃で２分間であった。
【0167】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ
編集効率を解析するためにＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイを行なった。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０２）をＰＣＲ産物に添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。産物を、２．５％アガロースゲル電気泳動で可視化することによって解析した。次に、酵素切断バンド及び酵素未切断バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて定量した。最後に、編集効率を以下のとおりに計算した。
編集効率を解析するためにＴ７エンドヌクレアーゼＩミスマッチアッセイを行なった。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０２）をＰＣＲ産物に添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。産物を、２．５％アガロースゲル電気泳動で可視化することによって解析した。次に、酵素切断バンド及び酵素未切断バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて定量した。最後に、編集効率を以下のとおりに計算した。
【数2】
【0168】
分泌されたＡβの定量
分泌されたＡβを、ＭＳＤ Ｈｕｍａｎ （６Ｅ１０） Ａｂｅｔａ３－Ｐｌｅｘ Ｋｉｔｓ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を製造業者の使用説明に従って用いることによって定量した。分泌されたＡβレベルを、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定された全タンパク質レベルに対して正規化した。
分泌されたＡβを、ＭＳＤ Ｈｕｍａｎ （６Ｅ１０） Ａｂｅｔａ３－Ｐｌｅｘ Ｋｉｔｓ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を製造業者の使用説明に従って用いることによって定量した。分泌されたＡβレベルを、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定された全タンパク質レベルに対して正規化した。
【表4】
【表5-1】
【表5-2】
【表6】
【表7-1】
【表7-2】
【0169】
考察
本研究において、まずアミロイドベータの産生を、ＡＰＰ内のアミロイド形成タンパク質分解経路に関与する切断部位を破壊することによって減少させる。ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）中のβ－セクレターゼ切断部位及びγ－セクレターゼ切断部位を無効にすることにより、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴の１つであるアミロイドベータ（Ａβ）の産生の低減がもたらされる。このアプローチはＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、及びＰＳＥＮ２に変異を有するあらゆる家族性ＡＤ症例に、並びにＡβの産生の増大と関連する弧発性ＡＤを有する人に一般的に適用することができる。
本研究において、まずアミロイドベータの産生を、ＡＰＰ内のアミロイド形成タンパク質分解経路に関与する切断部位を破壊することによって減少させる。ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）中のβ－セクレターゼ切断部位及びγ－セクレターゼ切断部位を無効にすることにより、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴の１つであるアミロイドベータ（Ａβ）の産生の低減がもたらされる。このアプローチはＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、及びＰＳＥＮ２に変異を有するあらゆる家族性ＡＤ症例に、並びにＡβの産生の増大と関連する弧発性ＡＤを有する人に一般的に適用することができる。
【0170】
ＡＰＰ発現は成体段階で操作される。ＡＰＰは、動物の発達において；例えば、ニューロン移動及びシナプス可塑性において生理学的役割を有する。したがって、成体段階での脳におけるＡＰＰ発現の特異的操作によって有益な転帰が示され、（ゲノム編集ツールのオフターゲット効果による）潜在的副作用が低減される。
【0171】
ＡＰＰのニューロン特異的又はニューロンサブタイプ特異的な操作を行う。Ａβはニューロン内でのＡＰＰの切断より産生される。したがって、プロモーター特異的駆動型ゲノム編集によるニューロンにおけるＡＰＰ発現の特異的操作により、他の細胞型において生じる潜在的オフターゲット効果を回避することができよう。さらに、ゲノム編集は、特定のニューロン亜集団（すなわち、抑制性ニューロン、興奮性ニューロン）における任意の潜在的副作用を低減又は消失させるために実施することができる。
【0172】
脳全域でのゲノム編集の効果が検討される。ゲノム編集構成要素の非侵襲的送達は静脈内投与によって行なわれる。全ゲノムシーケンシングを行ない、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡによってオフターゲット事象は導入されないことが示される。
【0173】
本出願において挙げた全ての特許、特許出願、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む他の刊行物は、その全体が参照によりあらゆる目的のために本明細書に取り込まれる。
【0174】
参考文献
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【0175】
配列表
配列番号：１ ｓｇＲＮＡ－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥコンストラクトであるＩＴＲ－Ｕ６－ＳＷ１－Ｓｙｎ－ＳａＣａｓ９－ＨＡ－ｍＷＰＲＥ－ｐＡ－ＩＴＲのヌクレオチド配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCgTCTCTGAAGTGAATCTGGATGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTCTAGAAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGgccaccATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAAGAATTCCGCTCGAGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
配列番号：１ ｓｇＲＮＡ－Ｓｙｎ：：Ｃａｓ９－ｍＷＰＲＥコンストラクトであるＩＴＲ－Ｕ６－ＳＷ１－Ｓｙｎ－ＳａＣａｓ９－ＨＡ－ｍＷＰＲＥ－ｐＡ－ＩＴＲのヌクレオチド配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCgTCTCTGAAGTGAATCTGGATGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTCTAGAAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGgccaccATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAAGAATTCCGCTCGAGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0176】
配列番号：２ ＡＰＰアミノ酸配列（αセクレターゼ部位を太字、βセクレターゼ部位を下線、及びγセクレターゼ部位を二重下線で示す）
【化1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】