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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞の生成法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
C12N15/85 Z
C12N15/13
C12N15/63 Z
A61K35/17
A61P35/00
A61P33/00
A61P31/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526983
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-06-27
(86)【国際出願番号】 EP2022080831
(87)【国際公開番号】W WO2023079082
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】21306548.5
(32)【優先日】2021-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22306137.5
(32)【優先日】2022-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516039480
【氏名又は名称】エーピーエイチピー（アシスタンス パブリック－オピトークス ド パリ）
(71)【出願人】
【識別番号】524167832
【氏名又は名称】インサーム（インスティテュート ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】519293553
【氏名又は名称】フォンダシオン イマジン－アンスティチュ デ マラディー ジェネティーク
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー，イザベラ
(72)【発明者】
【氏名】デビ モイランテム，ランジタ
(72)【発明者】
【氏名】ソヘイリ，テイエベ－シャビ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AA92Y
4B065AA93X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA02
4B065BB19
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB63
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZB37
(57)【要約】
本発明は、ＮＫ細胞を取得するための新規方法に関する。本発明はさらに、ＮＫ細胞集団、及び癌を含む疾患の治療のためのその使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法であって、ａ）ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下でＣＤ３４＋細胞を培養する、それにより細胞の第１の集団を取得する工程、及び
ｂ）サイトカイン含有培地中で工程ａ）で得られた細胞の集団を培養する工程
を含む、インビトロの方法。
【請求項2】
工程ａ）で、前記細胞が、５日より長く９日未満の間、好ましくは約７日間ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項3】
前記ノッチリガンドが、デルタ様４リガンド又はその断片、好ましくはデルタ様４リガンドの可溶性ドメインである、請求項１又は請求項２に記載のインビトロの方法。
【請求項4】
工程ａ）で、前記細胞がまた、ＲＧＤＳ、連結セグメント１（ＣＳ－１）、及び／又はヘパリン結合ドメインを含むフィブロネクチン断片に曝露され、好ましくは前記フィブロネクチン断片が、ＣＨ－２９６である、請求項１～３のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項5】
前記ＣＤ３４＋細胞が、成人ドナーから又は臍帯血細胞から単離された、請求項１～４のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項6】
工程（ｂ）のサイトカイン含有培地が、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及びＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）からなる群から選択される少なくとも３種の、好ましくは５種のサイトカインを含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項7】
工程ｂ）で、前記細胞が、７日より長く２１日未満の間サイトカイン含有培地中で培養される、請求項１～６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項8】
好ましくは工程（ａ）の最中又はその前に、ベクターで細胞を形質導入する追加の工程を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項9】
前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項８に記載のインビトロの方法。
【請求項10】
前記細胞の６０％超が、ＣＤ３－ＣＤ５６＋である、請求項１～９のいずれか一項に記載のインビトロの方法により得られる可能性が高いＮＫ細胞集団。
【請求項11】
前記細胞が、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３、及びＫＬＲＧ１を含む群から選択される少なくとも１種の抑制性受容体を発現しない、請求項１０に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項12】
前記細胞が、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを含む群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する、請求項１０又は請求項１１に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項13】
ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫＧ２Ｄを発現し、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＤＬ３、ＫＬＲＧ１を発現しない、ＮＫ細胞集団。
【請求項14】
医薬としての使用のための、特にそれを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項15】
癌、持続性ウイルス感染症、及び寄生虫性疾患を治療するための、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、特にそれを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための、並びに癌及び感染症を治療するためのＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を生成するための方法、ＮＫ細胞集団、及び医薬としてのその使用に関する。
本発明は、特にそれを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための、並びに癌及び感染症を治療するためのＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を生成するための方法、ＮＫ細胞集団、及び医薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ＮＫ細胞は、細胞傷害性であり、腫瘍又は感染細胞を死滅させる役割を果たす、自然免疫細胞である。ＮＫ細胞は、造血幹細胞から骨髄で産生される。ＮＫ細胞の前駆体は、ＣＤ３－ＣＤ１６１＋ＣＤ５６－であり、ＣＤ３－ＣＤ１６１＋ＣＤ５６＋を発現する未熟なＮＫ細胞へと分化する。未熟なＮＫ細胞の成熟は主に骨髄で起こるが、未熟なＮＫ細胞はまた、骨髄を出て二次リンパ器官へと成熟し得る。成熟中に、ＮＫ細胞は、膜受容体発現の特異的プロファイルを獲得し、上記発現プロファイルは、機能的なＮＫ細胞と関連付けられる。
ＮＫ細胞は、細胞傷害性であり、腫瘍又は感染細胞を死滅させる役割を果たす、自然免疫細胞である。ＮＫ細胞は、造血幹細胞から骨髄で産生される。ＮＫ細胞の前駆体は、ＣＤ３－ＣＤ１６１＋ＣＤ５６－であり、ＣＤ３－ＣＤ１６１＋ＣＤ５６＋を発現する未熟なＮＫ細胞へと分化する。未熟なＮＫ細胞の成熟は主に骨髄で起こるが、未熟なＮＫ細胞はまた、骨髄を出て二次リンパ器官へと成熟し得る。成熟中に、ＮＫ細胞は、膜受容体発現の特異的プロファイルを獲得し、上記発現プロファイルは、機能的なＮＫ細胞と関連付けられる。
【0003】
ＮＫ細胞は、それらの膜で発現される受容体（すなわち、活性化する受容体及び抑制性の受容体）を介して腫瘍細胞及び感染細胞を認識する。抑制性の受容体は、体の全ての細胞（すなわち自己細胞）により発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を認識する。活性化する受容体は、自己又は非自己細胞（例えば、腫瘍細胞又は感染細胞）のいずれかにより発現される非自己分子を認識できる。抑制性受容体及び／又は活性化受容体を介して受けとられるシグナルに応じて、ＮＫ細胞は次いで、細胞内顆粒（例えば、パーフォリン及びグランザイムを含む）の成分を放出し、及び／又は標的細胞上の対応するそれらの受容体に結合するＴＮＦ受容体リガンドであるＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦ及びＴＲＡＩＬを発現し、及び／又は炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α及びＩＦＮγ）を産生し、次いで標的細胞（例えば癌細胞及び感染細胞を含む）を溶解する。
【0004】
キメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球は今日、腫瘍細胞を標的化する及び死滅させるための有望な治療手段である。しかし、大規模な二次的影響は、例えば、サイトカインストーム及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、これらのＴ細胞ベースの免疫療法と関連付けられ得る。これらの欠点のため、新しい治療方針を調べる必要がある。サイトカインストーム及びＧＶＨＤを引き起こさないＮＫ細胞は、興味深いＴ細胞の代替手段である。
【0005】
ＮＫ細胞を取得するためのインビトロ法は、当技術分野で説明されている。しかし、得られるＮＫ細胞の収量及び純度は通常低く、そのため、インビボ注入に先立ち細胞の選別工程を必要とする。さらに、これらの方法は通常、ＮＫ細胞を生成するために約１ヶ月を要する。加えて、ＮＫ細胞は通常、活性化受容体をうまく発現せず、老化を示し、遺伝的に改変することが困難である。
【0006】
そのため、短期間で高品質のＮＫ細胞を生成する新しい方法を開発する必要がある。本発明において、出願者らは、約２週間の短期間で活性化促進受容体を発現し、いくつかの抑制性受容体の発現を欠く機能的な細胞傷害性ＮＫ細胞を取得することを可能にする、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法を提供する。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、
ａ）ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下でＣＤ３４＋細胞を培養する、それにより細胞の第１の集団を取得する工程、及び
ｂ）サイトカイン含有培地中で工程ａ）で得られた細胞の集団を培養する工程
を含む、ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法に関する。
ａ）ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下でＣＤ３４＋細胞を培養する、それにより細胞の第１の集団を取得する工程、及び
ｂ）サイトカイン含有培地中で工程ａ）で得られた細胞の集団を培養する工程
を含む、ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法に関する。
【0008】
一実施形態では、工程ａ）で、細胞は、５日より長く９日未満の間、好ましくは約７日間、ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される。
【0009】
一実施形態では、工程ａ）で、ノッチリガンドは、デルタ様４リガンド又はその断片、好ましくはデルタ様４リガンドの可溶性ドメインである。
【0010】
一実施形態では、工程ａ）で、細胞はまた、ＲＧＤＳ、連結セグメント１（ＣＳ－１）及び／又はヘパリン結合ドメインを含むフィブロネクチン断片に曝露され、好ましくはフィブロネクチン断片は、ＣＨ－２９６である。
【0011】
一実施形態では、上記ＣＤ３４＋細胞は、成人ドナーから又は臍帯血細胞から単離されている。
【0012】
一実施形態では、工程（ｂ）のサイトカイン含有培地は、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）からなる群から選択される少なくとも３種の、好ましくは５種のサイトカインを含有する。
【0013】
一実施形態では、工程ｂ）で、細胞は、７日より長く２１日未満の間サイトカイン含有培地中で培養される。
【0014】
一実施形態では、インビトロの方法は、好ましくは工程（ａ）の最中又はその前に、ベクターで細胞を形質導入する追加の工程を含む。
【0015】
一実施形態では、ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。
【0016】
本発明の別の目的は、本発明のインビトロの方法によって得られる可能性が高いＮＫ細胞集団であり、ここで細胞の６０％超が、ＣＤ３－ＣＤ５６＋である。
【0017】
一実施形態では、ＮＫ細胞集団の細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＬＲＧ１を含む群から選択される少なくとも１種の抑制性受容体を発現しない。
【0018】
一実施形態では、ＮＫ細胞集団の細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＣＤ１６１、並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを含む群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。一実施形態では、ＮＫ細胞集団の細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
【0019】
一実施形態では、ＮＫ細胞集団の細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、ＣＤ１６１、並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を高レベルで発現する。
【0020】
一実施形態では、ＮＫ細胞集団の細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であり、上記ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の少なくとも８５％が、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを含む群から選択される少なくとも１つの活性化受容体を発現する。
【0021】
本発明はさらに、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１及びＮＫＧ２Ｄを発現し、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＤＬ３、ＫＬＲＧ１を発現しないＮＫ細胞集団に関する。
【0022】
本発明の別の目的は、医薬としての使用のための本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。本発明の別の目的は、それを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための、本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。
【0023】
本発明の別の目的は、癌、持続性ウイルス感染及び寄生虫性疾患を治療するための本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。
【0024】
一実施形態では、癌は、白血病（すなわち、急性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂリンパ腫）、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、黒色腫、子宮癌、腎臓癌、肉腫、癌腫、非小細胞肺癌、口腔癌及び中咽頭癌、メチルコラントレン誘発肉腫及び結腸直腸癌を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【0025】
一実施形態では、癌は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫）、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、子宮頸癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、甲状腺癌、黒色腫、子宮癌、腎臓癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、肉腫、癌腫（例えば、腎細胞癌、乳癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、小児固形腫瘍、ＣＤ１３３＋癌幹細胞、ＮＫＧＤＬ＋癌細胞、ＰＤ－Ｌ１＋癌細胞、口腔癌及び中咽頭癌（例えば、舌癌、食道癌、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ））、メチルコラントレン誘発肉腫及び結腸直腸癌を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【0026】
一実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス－１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））インフルエンザ、レトロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス（例えば、コクサッキーＢ３ウイルス）を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【0027】
一実施形態では、寄生虫性疾患は、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症及びマラリアを含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【0028】
定義
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
【0029】
量、時間的な期間などの測定可能な値に言及する場合の「約」という用語は、そのような変動が開示された方法を実施するために適切であるように、指定された値から±２０％又は場合によっては±１０％、又は場合によっては±５％、又は場合によっては±１％、又は場合によっては±０.１％の変動を包含することを意味する。
【0030】
「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、自然免疫において重要な役割を果たす細胞傷害性リンパ球を指す。ＮＫ細胞は常に、他の細胞と接触している。ＮＫ細胞は、それらの細胞表面で活性化受容体と抑制性受容体を発現する。このメカニズムは、ＮＫ細胞が、ある細胞が排除されるべき（例えば、腫瘍細胞又は感染細胞など）かどうかを認識することを可能にする。一実施形態では、ＮＫ細胞は、「未熟な」（未熟なＮＫ細胞は一般に、ＣＤ１６及びＫＩＲ受容体の発現の不在により定義される）、又は「成熟した」（成熟したＮＫ細胞は一般に、ＣＤ１６及びＫＩＲ受容体の発現により定義される）と定義され得る。成熟ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞を含む。
【0031】
用語「医薬的に許容される賦形剤」（「医薬的に許容される担体」とも称され得る）は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不快な反応を生じない賦形剤を指す。それは、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の製剤補助剤を指す。ヒトへの投与の場合、調製物は、ＦＤＡ又はＥＭＡなどの規制当局が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たす必要がある。
【0032】
「発現する」、「陽性の」、又は「＋」及び「発現しない」、「陰性の」、又は「－」という用語は、当技術分野で周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは、高い又は中程度又は低い（すなわち、その細胞マーカーは、細胞表面で発現される又は存在する）であり、「－」に対応する細胞マーカーの発現レベルは無い（すなわち、その細胞マーカーは、細胞表面で発現されないか、又は存在しない）である。
【0033】
「対象」という用語は、その中で免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物、特にヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジなど）を含むことを意図する。一実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療処置を受けることを待っているか、又は医療を受けているか、又は医療処置の対象であった／である／その予定であるか、又は例えば、癌もしくは感染症（例えば、持続性ウイルス感染又は寄生虫性疾患）などの標的疾患又は状態の発症について監視される温血動物、好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成人（例えば、１８歳を超えている対象）である。別の実施形態では、対象は、子供（例えば、１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は、男性である。別の実施形態では、対象は、女性である。一実施形態では、対象は、例えば、癌、感染症（例えば、持続性ウイルス感染もしくは寄生虫性疾患）などの標的疾患又は状態に罹患しており、好ましくはそれと診断される。一実施形態では、対象は、例えば、癌、感染症（例えば、持続性ウイルス感染又は寄生虫性疾患）などの標的疾患もしくは状態を発症するリスクがある。危険因子の例は、遺伝的素因、又は標的疾患又は状態の家族歴を含むが、これらに限定されない。
【0034】
用語「治療的有効量」は、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載の細胞又は組成物の量を指す。そのため、「治療的有効量」という用語は、標的に重大な負の又は有害な副作用を引き起こすことなく、（１）標的疾患もしくは状態の発症を遅らせるか又は予防すること；（２）標的疾患もしくは状態の１以上の症状の進行、重症化、もしくは悪化を遅らせるか又は停止すること；（３）標的疾患もしくは状態の症状の改善をもたらすこと；（４）標的疾患もしくは状態の重症度又は発生率を低下させること；又は（５）標的疾患もしくは状態を治癒すること、を目的とする、組成物のレベルもしくは量又は細胞の数を意味する。治療的有効量は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）作用のために、標的疾患もしくは状態の発症前に投与されてよい。或いは、又はそれに加えて、治療的有効量は、治療作用のために、標的疾患もしくは状態の開始後に投与されてよい。
【0035】
「トランスフェクション」又は「形質導入」という用語は、それにより外因性核酸が宿主細胞中に移送又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞であり、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【0036】
「治療」又は「治療する」という用語は、治療的処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指し、目的は、標的疾患もしくは状態を予防するか又は減速させる（軽減する）ことである。治療が必要なものは、すでにこの状態にあるもの、及びその状態になりやすいもの、又は状態を予防されるものを含む。対象は、本明細書に記載の細胞又は組成物の治療量を受けた後に、対象が以下のこと：病原性細胞数の低下；病原性である全細胞の割合の低下；特定の状態と関連付けられる１以上の症状のある程度の緩和；罹患率と死亡率の低下、及び／又は生活の質の問題の改善、の１以上において観察可能な及び／又は測定可能な改善を示す場合、疾患もしくは状態についてうまく「治療され」る。良好な治療と状態における改善を評価するための上記のパラメータは、医師に馴染みのある日常的な手順により容易に測定可能である。
【0037】
詳細な説明
出願者らは以前に、ＴＮＦ－α及びノッチリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養することが、培養の７日後にＣＤ３４－ＣＤ７＋前駆細胞Ｔ細胞を生成することを可能にすることを観察した（ＷＯ２０１８／１４６２９７）。しかし、図８に示されるように、これらの細胞は、リンパ造血過程におけるＴ細胞が関与してから特異的にスイッチがオンになることが当技術分野で知られている転写因子、すなわち、ＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂを強く発現する。この発現パターンを考慮すると、これらの細胞のＮＫ細胞発生は、先験的に予想されない可能性がある。しかし、本発明において、出願者らは驚くべきことに、第１の工程で、ＣＤ３４＋細胞がＴＮＦ－α及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される、ＮＫ細胞のインビトロ産生のための方法を提供した。
出願者らは以前に、ＴＮＦ－α及びノッチリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養することが、培養の７日後にＣＤ３４－ＣＤ７＋前駆細胞Ｔ細胞を生成することを可能にすることを観察した（ＷＯ２０１８／１４６２９７）。しかし、図８に示されるように、これらの細胞は、リンパ造血過程におけるＴ細胞が関与してから特異的にスイッチがオンになることが当技術分野で知られている転写因子、すなわち、ＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂを強く発現する。この発現パターンを考慮すると、これらの細胞のＮＫ細胞発生は、先験的に予想されない可能性がある。しかし、本発明において、出願者らは驚くべきことに、第１の工程で、ＣＤ３４＋細胞がＴＮＦ－α及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される、ＮＫ細胞のインビトロ産生のための方法を提供した。
【0038】
本発明の第１の目的はそのため、
ａ）ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下でＣＤ３４＋細胞を培養する、それにより細胞の第１の集団を取得する工程、並びに
ｂ）サイトカイン含有培地中で細胞の第１の集団を培養する工程
を含む、ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法である。
ａ）ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下でＣＤ３４＋細胞を培養する、それにより細胞の第１の集団を取得する工程、並びに
ｂ）サイトカイン含有培地中で細胞の第１の集団を培養する工程
を含む、ＮＫ細胞を生成するためのインビトロの方法である。
【0039】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯血細胞から単離される。
【0040】
一実施形態では、ＣＤ３４＋は、成人ドナーから回収される。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、成人ドナーの末梢血の骨髄穿刺から取得される。ＣＤ３４＋細胞の数は成人末梢血中で少ない（すなわち、細胞の０．１５％）ので、ＣＤ３４＋細胞を、骨髄から末梢（例えば、血液）に動員して、末梢血中のＣＤ３４＋細胞の数を増加させてよい。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を動員するために、成人ドナーは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び／又はプレリキサフォル、好ましくはＧ－ＣＳＦで処置され得る。動員剤の他の例は、ＣＸＣＲ２のアゴニスト（例えば、ＭＧＴＡ １４５）、及びプレリキサフォルの類似体を含むが、これらに限定されない。
【0041】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、動員された末梢血から単離される。
【0042】
ＣＤ３４＋細胞を単離するための方法は、当技術分野で周知であり、限定されないが、ＣＤ３４を認識する抗体でコートされたビーズを用いる方法を含む。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、間接ＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単離される。
【0043】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるＣＤ３４＋細胞集団は、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％純粋である。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、成熟細胞のマーカーを発現せず、好ましくはＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４／１５、ＣＤ１１ｂを含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現せず、より好ましくはＣＤ３４＋細胞は、これらのマーカーの全てを発現しない。
【0044】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）に由来する。ｉＰＳＣ細胞からＣＤ３４＋細胞を誘導するための方法の例は、当業者に知られており、例えば、２０２０年にＪｏｈｎ Ｆ．Ｔｉｓｄａｌｅ（多能性幹細胞からの造血幹細胞：臨床の可能性、課題、及び将来の展望（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ, ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９巻，１２号，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０２０，ページ１５４９－１５５７）により及びＲａｏら（多能性幹細胞からの造血細胞：遺伝性血液疾患の治療に対する希望と見込み（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｈｏｐｅ ａｎｄ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）．Ｃｅｌｌｓ ２０２２，１１，５５７）により説明されている。
【0045】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、約１０６～１０７細胞／ｍＬ培地の範囲の濃度で播種される。
【0046】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、約５,０００～約３０,０００細胞／ｃｍ２培地の範囲の濃度で、好ましくは約１０,０００～約３０,０００細胞／ｃｍ２の範囲の濃度で播種される。
【0047】
一実施形態では、工程（ａ）の開始時に、ＣＤ３４＋細胞は、約１０６～１０７細胞／ｍＬ培地の範囲の濃度で播種される。
【0048】
一実施形態では、工程（ａ）の開始時に、ＣＤ３４＋細胞は、約５０００～約３００００細胞／ｃｍ２培地の範囲の濃度で、好ましくは約１０,０００～約３０,０００細胞／ｃｍ２の範囲の濃度で播種される。
【0049】
一実施形態では、培養容器は、６～９６ウェルの培養プレート、ペトリ皿、フラスコ、攪拌機ボトル、マイクロタイタープレート、試験管、中空糸装置、細胞フォーム及びバッグを含む（これらに限定されない）従来の培養容器から選択される。播種される細胞の量は、使用する培養容器に応じて、当業者により適合され得る。
【0050】
一実施形態では、工程（ａ）及び工程（ｂ）で使用される培地は、異なる。
【0051】
一実施形態では、本発明の方法の工程ａ）で使用される培地は、ＣＤ３４＋細胞の培養用に適合される。ＣＤ３４＋細胞の培養用に適合される培地の例は、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＩＭＤＭ、ＢＭＥ、マッコイ５Ａ、ＳＦＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地、フィッシャー培地及びＸ－ＶＩＶＯＴＭ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、α－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で培養される。
【0052】
一実施形態では、本発明で使用される培地（特に、工程（ａ）の培地及び／又は工程（ｂ）の培地）は、フィーダー細胞を含まない。特に、本発明の一実施形態では、本発明で使用される培地（特に、工程（ａ）の培地及び／又は工程（ｂ）の培地）は、ＯＰ－９フィーダー細胞を含まない。
【0053】
一実施形態では、本発明で使用される培地（特に、工程（ａ）の培地及び／又は工程（ｂ）の培地）は、無血清である。一実施形態では、本発明で使用される培地（特に、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）の培地）は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）を補充される。
【0054】
一実施形態では、ＴＮＦ－αは、例えば配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ０１３７５）の配列を有する、ヒトＴＮＦ－αである。
【0055】
配列番号１
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
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【0056】
ＴＮＦ－αは主に、安定なホモ二量体に配置されるＩＩ型膜貫通タンパク質として産生され、各モノマーは、ヒトでは２３３個のアミノ酸を含む。ヒトにおいて、ヒトＴＮＦ－αの可溶性部分は、配列番号１のアミノ酸７７～２３３で構成される。
【0057】
一実施形態では、第１の培地（すなわち、工程（ａ）の培地）は、全長ＴＮＦ－α又はその可溶性断片を含み、ここでその上記可溶性断片は、配列番号１のアミノ酸７７～２３３を含むか、又はそれからなり得る。
【0058】
一実施形態では、ＴＮＦ－α又はその断片は、培養の０日目に添加される。一実施形態では、ＴＮＦ－α又はその断片は、０日目から、及び少なくとも約１、２、３、４、５、６又は７日間、培地中に存在する。一実施形態では、ＴＮＦ－α又はその断片は、工程（ａ）の０日目から工程（ａ）の終了まで培地中に存在する。
【0059】
一実施形態では、ＴＮＦ－α又はその断片は、例えば、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は３００ｎｇ／ｍＬなどの、約１～約３００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用される。一実施形態では、ＴＮＦ－α又はその断片は、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。しかし、約５、１０、２０又は５０ｎｇ／ｍＬなどの他の濃度も適している。
【0060】
ノッチタンパク質は、多数の環境シグナルに対する細胞応答を調節する膜貫通受容体である。哺乳類では、４つのノッチ受容体（ノッチ１～４）と５つのリガンド（デルタ様１、デルタ様３、デルタ様４、Ｊａｇｇｅｄ－１及びＪａｇｇｅｄ－２）が報告されている（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２０００：１０：３６３－３６９）。
【0061】
一実施形態では、培地は、デルタ様４、好ましくはヒトデルタ様４（ＤＬ－４としても知られる、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９ＮＲ６１、配列番号２）、又はその断片を含む。
【0062】
配列番号２
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVAVSLGVGLAVLLVLLGMVAVAVRQLRLRRPDDGSREAMNNLSDFQKDNLIPAAQLKNTNQKKELEVDCGLDKSNCGKQQNHTLDYNLAPGPLGRGTMPGKFPHSDKSLGEKAPLRLHSEKPECRISAICSPRDSMYQSVCLISEERNECVIATEV
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVAVSLGVGLAVLLVLLGMVAVAVRQLRLRRPDDGSREAMNNLSDFQKDNLIPAAQLKNTNQKKELEVDCGLDKSNCGKQQNHTLDYNLAPGPLGRGTMPGKFPHSDKSLGEKAPLRLHSEKPECRISAICSPRDSMYQSVCLISEERNECVIATEV
【0063】
一実施形態では、本発明で使用される培地、好ましくは工程（ａ）で使用される培地は、少なくとも１つのノッチリガンドの可溶性ドメインを含む。一実施形態では、ノッチリガンドの可溶性ドメインは、上記リガンドの細胞外部分を表す。
【0064】
一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片（好ましくはノッチリガンドの可溶性ドメイン）をタンパク質に融合させ、ノッチリガンドが支持体上に固定化されることを可能にする。
【0065】
一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片（好ましくはノッチリガンドの可溶性ドメイン）は、ビオチンに融合される。
【0066】
一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片（好ましくはノッチリガンドの可溶性ドメイン）は、例えば、ヒトＩｇＧタンパク質などの、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域に融合される。一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片（好ましくはノッチリガンドの可溶性ドメイン）は、ヒトＩｇＧ２タンパク質などの、ＩｇＧ２タンパク質のＦｃ領域に融合される（ＮＣＢＩ受入番号：４ＨＡＦ＿Ａ、配列番号３）。
【0067】
配列番号３
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【0068】
一実施形態では、本発明で使用される培地、好ましくは工程（ａ）で使用される培地は、ＤＬ－４又はその断片、好ましくはＤＬ－４の可溶性ドメインを含むか又はそれからなる断片を含む。
【0069】
一実施形態では、ＤＬ－４の可溶性ドメインは、配列番号２のアミノ酸１～５２６を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ＤＬ－４の可溶性ドメインは、配列番号２のアミノ酸１～５２５を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ＤＬ－４の可溶性ドメインは、配列番号２のアミノ酸１～５２４を含むか又はそれからなる。
【0070】
一実施形態では、ＤＬ－４又はその可溶性ドメインは、ＩｇＧタンパク質（例えば、ヒトＩｇＧタンパク質など）、特にＩｇＧ２タンパク質、好ましくはヒトＩｇＧ２のＦｃ受容体領域に融合される。ヒトＩｇＧ２タンパク質のＦｃ受容体領域に融合されるＤＬ－４の可溶性ドメインを含むタンパク質の一例は、配列番号４である。
【0071】
配列番号４
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSTMVRSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSTMVRSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【0072】
ＩｇＧ１タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１タンパク質など）のＦｃ受容体領域に融合されたＤＬ－４の可溶性ドメインを含むタンパク質の例は、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたヒトＤＬＬ４（全長ＤＬＬ４受入番号ＮＰ＿０６１９４７．１）の細胞外ドメイン（Ｍｅｔ １－Ｐｒｏ ５２４）を含む市販製品（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）である。
【0073】
一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片は、培養に使用される培養容器に固定化される（すなわち、固体支持体に結合される）が、特定の要素が溶液中に見出され得る可能性がある。一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片は、培養容器の表面、好ましくは内面に固定化される。いかなる理論にも縛られることなく、出願者らは、ノッチリガンド又はその断片の固定化は、ＣＤ３４＋細胞との相互作用を促進し、ひいてはＣＤ３４＋細胞のノッチ受容体の活性化を可能にするために、それを安定化させ得ることを示唆する。別の実施形態では、ノッチリガンド又はその断片は、培地中に存在する、ビーズ、好ましくはマイクロビーズ、又はポリマー又は磁気ビーズ（直径が一般に１～５μｍで構成される）などの表面に固定化される。
【0074】
ノッチリガンド又はその断片の（例えば、ビーズへの又は培養容器の表面への）結合は、共有結合であってもよいし、そうでなくてもよい。ノッチリガンドの結合は、ノッチリガンド又はその断片が培養容器又はビーズの表面に吸着されることを可能にすることにより非共有結合的に行われ得る。タンパク質又はペプチドをビーズ又は培養容器に付着させるための方法は、当技術分野で公知であり、限定されないが、免疫グロブリン分子（例えば、ヒトＩｇＧなど）の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域；及びビオチン－ストレプトアビジン／ニュートラアビジン／アビジンコンジュゲーション法；及びクリックケミストリーコンジュゲーション法を含む。
【0075】
培養容器又はビーズをノッチリガンドでコートする方法は、ＷＯ２０１６／０５５３９６に開示されている。一実施形態では、ＷＯ２０１６／０５５３９６により、ノッチリガンド、特にＤＬ－４の約７５％は、５μｇ／ｍｌを使用した場合、培養容器表面に又はビーズ表面に付着する。一実施形態では、ノッチリガンドで培養容器又はビーズをコートするために使用される組成物は、１.２５μｇ／ｍｌ以上、及び好ましくは２.５及び５μｇ／ｍｌの範囲のノッチリガンドの濃度を含む。
【0076】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、サイトカインをさらに含む。
【0077】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ（幹細胞因子）、Ｆｌｔ３－Ｌ（Ｆｌｔ３リガンド）、及びＩＬ－７を含むか又はそれからなる群から選択される少なくとも１、２又は３種のサイトカインを含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ヒトＳＣＦ、ヒトＦｌｔ３－Ｌ、及びヒトＩＬ－７を含むか又はそれからなる群から選択される少なくとも１、２又は３種のサイトカインを含む。
【0078】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ（幹細胞因子）、Ｆｌｔ３－Ｌ（Ｆｌｔ３リガンド）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）及びＩＬ－７（インターロイキン７）を含むか又はそれからなる群から選択される少なくとも１、２、３又は４種のサイトカインを含む。
【0079】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ｈＳＣＦ（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ２１５８３に対応する、幹細胞因子）、ｈＦｌｔ３－Ｌ（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ４９７７１に対応する、Ｆｌｔ３リガンド）、ｈＴＰＯ（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ４０２２５に対応する、トロンボポエチン）及びｈＩＬ－７（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ１３２３２に対応する、ヒトインターロイキン７）を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１、２、３又は４種のサイトカインを含む。ｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３－Ｌ、ｈＴＰＯ及びｈＩＬ－７は、例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社により提供される。
【0080】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ、（好ましくはｈＳＣＦ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。
【0081】
一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＦｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、工程（ａ）で使用される培地は、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。
【0082】
一実施形態では、培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）を含む。一実施形態では、培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。
【0083】
一実施形態では、培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。
【0084】
一実施形態では、ｈＳＣＦの濃度は、約２～約３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約４０～約２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0085】
一実施形態では、ｈＦｌｔ３－Ｌの濃度は、約２～約３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約４０～約２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0086】
一実施形態では、ｈＴＰＯの濃度は、約２～約３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約４０～約２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0087】
一実施形態では、ｈＩＬ－７の濃度は、約２～約３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約４０～約２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0088】
一実施形態では、工程（ａ）の培地は、ＩＬ－３を含まない。
【0089】
一実施形態では、培地は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片を含む（フィブロネクチンは、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ０２７５１、配列番号５に対応する配列を有し得る）。一実施形態では、フィブロネクチン断片は、ＲＧＤＳモチーフ、連結セグメント１（ＣＳ－１）モチーフ及び／又はヘパリン結合ドメインを含むか又はそれらからなり、好ましくは、フィブロネクチン断片は、ＲＧＤＳモチーフ、ＣＳ－１モチーフ及びヘパリン結合ドメインを含むか又はそれらからなる。
【0090】
フィブロネクチンは、タンパク質であり、それは、その天然形態で長さ１００ｎｍ及び４６０ｋＤａのＶ字型の大きな二量体である。２つのモノマーは、それらのＣ末端で２つのジスルフィド架橋により連結される。「フィブロネクチン」又は「フィブロネクチン断片」という用語は、天然のフィブロネクチンタンパク質（すなわち、選択的スプライシングにより産生される任意のアイソフォーム）だけでなく、このタンパク質のモノマー、又はこのタンパク質の断片（特に指定される場合、ＲＧＤＳモチーフ、ＣＳ－１モチーフ及びヘパリン結合部位を含有する）も意味すると理解される。
【0091】
本明細書に開示されるプロセスを実行するのに特に適しているフィブロネクチン断片の例は、レトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）（登録商標）である。このタンパク質は、ヒトフィブロネクチンの断片（ＣＨ－２９６断片、Ｋｉｍｉｚｕｋａら，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１ Ａｕｇ．１１０（２）：２８４－９１，Ｃｈｏｎｏら，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００１ Ｓｅｐ １３０（３）：３３１－４）に相当し、細胞結合Ｃドメイン（ＲＧＤＳモチーフ、ヘパリン結合ドメイン及びＣＳ－１モチーフを含む）を含有する。このタンパク質は、特に会社Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社（Ｓｈｉｇａ, Ｊａｐａｎ）、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｔｅｒｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ、ノボネクチン（ＮｏｖｏＮｅｃｔｉｎ）（登録商標）とも呼ばれる）及びＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ－Ｓｔａｔｅｓ）により販売されている。
【0092】
「ＲＧＤＳモチーフ」という用語は、それがインテグリンＶＬＡ－５に結合できるように、ＲＧＤＳ（配列番号６）パターンを含有する任意のペプチド又はタンパク質を指すことを意図する。そのようなペプチド又はタンパク質は、当技術分野で公知であり報告されている方法により、ＶＬＡ－５インテグリンを結合するその能力について試験できる。ＲＧＤＳモチーフは、ＣＤ４９ｅ（アルファ５）とＣＤ２９（ベータ１）で構成される二量体であるインテグリンＶＬＡ－５（Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－５）に結合する。
【0093】
ヘパリン結合ドメインは、当技術分野で公知であり、ヘパリンに結合する多数のタンパク質中に存在する。それらの配列は一般に、ＸＢＢＸＢＸ又はＸＢＢＢＸＸＢＸ（Ｂ＝塩基性アミノ酸；Ｘ＝ハイドロパシーアミノ酸；Ｃａｒｄｉｎ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏl．１９８９；９：２１－３２、配列番号７及び配列番号８）である。そのようなヘパリン結合ドメインの存在は、ＣＤ３４＋細胞が、それらを形質導入し、導入遺伝子を発現するＴ細胞前駆細胞を取得するために、ウイルス（特にレトロウイルス）ベクターに曝露される場合に特に好ましい。
【0094】
ＣＳ－１モチーフは、Ｗａｙｎｅｒら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９：１３２１により記載されるような、２５個のアミノ酸ペプチド（ＤＥＬＰＱＬＶＴＬＰＨＰＮＬＨＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ、配列番号９）である。ＣＳ－１モチーフは、ＶＬＡ－４（Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－４）受容体に結合する。ＶＬＡ－４は、ＣＤ４９ｄ（アルファ４）とＣＤ２９（ベータ１）で構成される、二量体インテグリンである。
【0095】
一実施形態では、フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片は、固定化される（すなわち、固体支持体に結合される）。フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片の結合（例えば、ビーズへの又は培養容器の表面への）は、共有結合であってもよいし、そうでなくてもよい。一実施形態では、フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片は、培養容器の内面に固定化される（しかし、特定の要素が溶液中に見出され得る可能性がある）。別の実施形態では、フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片は、ビーズ、好ましくはマイクロビーズ、又はポリマー又は磁気ビーズ（一般に１～５μｍで構成される直径を有する）などの表面に固定化される。一実施形態では、ノッチリガンド又はその断片とフィブロネクチン又はその断片は、同じビーズ上に固定化される。別の実施形態では、ノッチリガンド又はその断片及びフィブロネクチン又はその断片は、別々のビーズ上に固定化される。
【0096】
一実施形態では、フィブロネクチン又はフィブロネクチン断片の固定化は、フィブロネクチン又はその断片が培養容器の内面上に又はビーズの表面に吸着されることを可能にすることにより、非共有結合的に行われる。ビーズに又は培養容器の表面にタンパク質又はペプチドを付着させるための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に列挙されている。
【0097】
フィブロネクチン又はその断片で培養容器又はビーズをコートする方法は、ＷＯ２０１６／０５５３９６に開示されている。一実施形態では、フィブロネクチン又はその断片で培養容器又はビーズをコートするために使用される組成物は、１０～１００μｇ／ｍｌの範囲で、好ましくは約２５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン又はその断片の濃度を含む。
【0098】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、少なくとも約４、５、６、７、８、９又は１０日の間、好ましくは少なくとも約５又は６日の間、ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、約４、５、６、７、８、９又は１０日の間、好ましくは約７日の間ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される。一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、最大で約１０日の間ＴＮＦ－αの又はその断片の、及びノッチリガンド又はその断片の存在下で培養される。
【0099】
一実施形態では、工程（ａ）で得られた細胞の集団は、成熟ＮＫ細胞を生成するためにヒト対象にインビボで注入されてよい。
【0100】
一実施形態では、本発明の方法の工程ｂ）に使用されるサイトカイン含有培地は、ＮＫ細胞前駆細胞の培養用に適合される。一実施形態では、培地は、ＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、無血清ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地（Ｂｉｏｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｇｌｙｃｏｓｔｅｍ Ｂａｓａｌ成長培地（Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｅｒｎｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）及びアルファＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）、好ましくはＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む群から選択される。
【0101】
一実施形態では、工程（ｂ）で使用されるサイトカイン含有培地は、フィーダー細胞を含まない。
【0102】
一実施形態では、工程（ｂ）で使用されるサイトカイン含有培地は、無血清である。一実施形態では、工程（ｂ）で使用されるサイトカイン含有培地は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％の、好ましくは約１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）を補充される。
【0103】
一実施形態では、工程（ｂ）で、サイトカイン含有培地は、ＴＮＦ－α又はその断片を含まない。一実施形態では、工程（ｂ）で、サイトカイン含有培地は、ノッチリガンド又はその断片を含まない。一実施形態では、工程（ｂ）で、サイトカイン含有培地は、ＴＮＦ－α又はその断片も、ノッチリガンド又はその断片も含まない。
【0104】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５、好ましくはｈＩＬ－１５を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ、好ましくはｈＳＣＦを含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ、好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌを含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－７、好ましくはｈＩＬ－７を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－２、好ましくはｈＩＬ－２を含む。
【0105】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－７、及びＩＬ－２を含むか又はそれらからなる群から選択される１、２、３、４又は５種のサイトカインを含む。
【0106】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ｈＩＬ－１５（例えば、受託番号：Ｐ４０９３３に対応し、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社により提供され得るヒトインターロイキン１５）、ｈＳＣＦ（幹細胞因子）、ｈＦｌｔ３－Ｌ、ｈＩＬ－７、及びｈＩＬ－２（例えば、受入番号：Ｐ６０５６８に対応し、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社により提供され得るヒトインターロイキン－２）を含むか又はそれらからなる群から選択される１、２、３、４又は５種のサイトカインを含む。
【0107】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＦｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５を含む（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＦｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。
【0108】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＦｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びｈＩＬ－２を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。
【0109】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）及びＩＬ－２（好ましくはｈＩＬ－２）を含む。
【0110】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５、ＳＣＦ（幹細胞因子）、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－７、及びＩＬ－２を含む。
【0111】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ｈＩＬ－１５、ｈＳＣＦ（幹細胞因子）、ｈＦｌｔ３－Ｌ、ｈＩＬ－７、及びｈＩＬ－２を含む。
【0112】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはヒトＩＬ－１２）及び／又はＩＬ－１８（好ましくはヒトＩＬ－１８）を含まない。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはヒトＩＬ－１２）又はＩＬ－１８（好ましくはヒトＩＬ－１８）を含まない。
【0113】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２、好ましくはヒトＩＬ－１２をさらに含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１８、好ましくはヒトＩＬ－１８をさらに含む。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはヒトＩＬ－１２）及びＩＬ－１８（好ましくはヒトＩＬ－１８）をさらに含む。
【0114】
一実施形態では、サイトカイン含有培地は、インターロイキン－７（好ましくはｈＩＬ－７）、幹細胞因子（好ましくはｈＳＣＦ）、インターロイキン－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、インターロイキン－２（好ましくはｈＩＬ－２）、インターロイキン－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）、インターロイキン－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）及びＦｌｔ３リガンド（好ましくはｈＦＬＴ３Ｌ）を含むか又はそれらからなる群から選択される１、２、３、４、５、６又は７種のサイトカインを含有する。一実施形態では、サイトカイン含有培地は、インターロイキン－７（好ましくはｈＩＬ－７）、幹細胞因子（好ましくはｈＳＣＦ）、インターロイキン－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、インターロイキン－２（好ましくはｈＩＬ－２）、インターロイキン－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）、インターロイキン－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）及びＦｌｔ３リガンド（好ましくはｈＦＬＴ３Ｌ）を含む。
【0115】
一実施形態では、サイトカインｈＳＣＦの濃度は、約１０～約２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【0116】
一実施形態では、サイトカインｈＦｌｔ３－Ｌの濃度は、約１０～約２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【0117】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－７の濃度は、約１０～約２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【0118】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１５の濃度は、約１０～約２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【0119】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－２の濃度は、約２００ＩＵ／ｍＬ～約１０００ＩＵ／ｍＬの範囲であり、好ましくは約５００ＩＵ／ｍＬである。
【0120】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１２の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ又は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬである。
【0121】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１８の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0122】
一実施形態では、工程（ｂ）で、細胞は、少なくとも約、又は約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１日間、好ましくは約７～約１４日間の範囲の期間、より好ましくは約１０、１１、１２、１３、又は１４日間培養され、それによりＮＫ細胞を取得する。
【0123】
一実施形態では、工程（ｂ）の開始時に、ＣＤ３４＋細胞は、約１０６～１０７細胞／１ｍＬサイトカイン含有培地の範囲の濃度で播種される。
【0124】
一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｂ）の終わりに得られた細胞の洗浄工程をさらに含む。
【0125】
一実施形態では、工程（ｂ）で得られたＮＫ細胞は、当技術分野で公知の方法に従って凍結される。一実施形態では、ＮＫ細胞は、遠心分離され（例えば、１５００ｒｐｍで５分間）、凍結培地（例えば、９０％ｖ／ｖのＦＢＳ及び１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む）中に再懸濁される。
【0126】
一実施形態では、工程（ｂ）で得られたＮＫ細胞は、使用前に、例えば水槽中で３７℃にて、解凍される。
【0127】
一実施形態では、本発明の方法は、患者への注射用のパウチ中で工程（ｂ）で得られたＮＫ細胞を順化する工程も含み得る。一実施形態では、ＮＫ細胞は、アルブノルム（ａｌｂｕｎｏｒｍ）（商標）５％ ５０ｇ／Ｌ（Ｏｃｔｏｐｈａｒｍａ，Ｌｉｎｇｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）などの５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で再順化される。
【0128】
一実施形態では、本発明の方法の工程（ｂ）の間に又は後で、細胞は、ＮＫ細胞の成熟に適合された培地中でさらに培養され得る。そのため、一実施形態では、本発明の方法は、成熟培地中での工程（ｂ）の間に又は後で細胞の培養の工程（ｂ’）をさらに含む。
【0129】
一実施形態では、工程（ｂ’）は、工程（ｂ）の後に行われる。
【0130】
一実施形態では、工程（ｂ’）は、工程（ｂ）の間に行われ、工程（ｂ）が、
－サイトカイン含有培地中での細胞の培養の工程（ｂ１）
－成熟培地中での細胞の培養の工程（ｂ’）、及び
－サイトカイン含有培地中での細胞の培養の工程（ｂ２）
を含むことを意味する。
－サイトカイン含有培地中での細胞の培養の工程（ｂ１）
－成熟培地中での細胞の培養の工程（ｂ’）、及び
－サイトカイン含有培地中での細胞の培養の工程（ｂ２）
を含むことを意味する。
【0131】
一実施形態では、工程（ｂ’）で、細胞は、成熟培地中で少なくとも約又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０時間、好ましくは約６～約１２時間の範囲の期間中、より好ましくは約６時間培養され、それにより成熟ＮＫ細胞を取得する。
【0132】
一実施形態では、工程（ｂ’）は、成熟培地中で少なくとも約又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０時間の間、好ましくは約１２時間の間、予備活性化培養工程としての工程（ｂ）の前に行われる。
【0133】
一実施形態では、工程（ｂ１）で、細胞は、サイトカイン含有培地中で少なくとも約又は約４、５、６、７、８日の間、好ましくは約４～約７日の範囲の期間中、より好ましくは約７日間培養される。
【0134】
一実施形態では、工程（ｂ２）で、細胞は、サイトカイン含有培地中で少なくとも約又は約４、５、６、７、８日の間、好ましくは約４～約７日の範囲の期間中、より好ましくは約７日間培養される。
【0135】
一実施形態では、成熟培地は、ＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、無血清ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地（Ｂｉｏｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｇｌｙｃｏｓｔｅｍ Ｂａｓａｌ成長培地（Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｅｒｎｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）及びアルファＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）、好ましくはＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む群から選択される。
【0136】
一実施形態では、成熟培地は、フィーダー細胞を含まない。
【0137】
一実施形態では、成熟培地は、無血清である。一実施形態では、成熟培地は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％の、好ましくは約１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）を補充される。
【0138】
一実施形態では、工程（ｂ’）で、成熟培地は、ＴＮＦ－α又はその断片を含まない。一実施形態では、工程（ｂ’）で、成熟培地は、ノッチリガンド又はその断片を含まない。一実施形態では、工程（ｂ’）で、成熟培地は、ＴＮＦ－αもしくはその断片も、ノッチリガンドもしくはその断片も含まない。
【0139】
一実施形態では、成熟培地は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１８を含む。
【0140】
一実施形態では、成熟培地は、ｈＩＬ－１２（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ２９４５９及びＰ２９４６０に対応するｐ３５及びｐ４０タンパク質の二量体を含み得るヒトインターロイキン－１２）、ｈＩＬ－１５及び／又はｈＩＬ－１８（例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ１４１１６に対応するヒトインターロイキン－１８）を含む。ｈＩＬ１２は、例えばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈにより提供され、ｈＩＬ１８は、例えば、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＲ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供され得る。
【0141】
一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）を含む。一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）を含む。一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）を含む。
【0142】
一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）及びＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）を含む。一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）及びＩＬ－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）を含む。一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＩＬ－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）を含む。
【0143】
一実施形態では、成熟サイトカイン含有培地は、ＩＬ－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＩＬ－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）を含む。
【0144】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１２の濃度は、約５～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬである。
【0145】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１２の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ又は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬである。
【0146】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１５の濃度は、約１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【0147】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１８の濃度は、約１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【0148】
一実施形態では、サイトカインｈＩＬ－１８の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【0149】
一実施形態では、成熟培地は、インターロイキン－７（好ましくはｈＩＬ－７）、幹細胞因子（好ましくはｈＳＣＦ）、インターロイキン－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、インターロイキン－２（好ましくはｈＩＬ－２）、Ｆｌｔ３リガンド（好ましくはｈＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）及びインターロイキン－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）を含む。一実施形態では、成熟培地のサイトカインの濃度は、サイトカイン含有培地中に存在するサイトカインの濃度と同等であり、上の本明細書で詳述されている。
【0150】
一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｂ’）又は（ｂ２）の終わりに得られた細胞の洗浄工程をさらに含む。
【0151】
一実施形態では、工程（ｂ’）又は（ｂ２）で得られたＮＫ細胞は、当技術分野で公知の方法に従い凍結される。一実施形態では、ＮＫ細胞は、遠心分離され（例えば、１５００ｒｐｍで５分間）、凍結培地（例えば、９０％ｖ／ｖのＦＢＳ及び１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ）中に再懸濁される。
【0152】
一実施形態では、工程（ｂ’）又は（ｂ２）で得られたＮＫ細胞は、例えば、水槽中で３７℃にて、使用の前に解凍される。
【0153】
一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｂ’）又は（ｂ２）で得られたＮＫ細胞（好ましくは成熟ＮＫ細胞）を患者への注射用のパウチ中で順化する工程も含み得る。一実施形態では、ＮＫ細胞は、アルブノルム（ａｌｂｕｎｏｒｍ）（商標）５％ ５０ｇ／Ｌ（Ｏｃｔｏｐｈａｒｍａ，Ｌｉｎｇｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）などの５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で再順化される。
【0154】
一実施形態では、本発明の方法は、遺伝子改変工程をさらに含む。一実施形態では、本発明の方法は、１以上の遺伝子改変工程（複数可）をさらに含む。
【0155】
一実施形態では、遺伝子改変工程（複数可）は、遺伝子破壊工程、遺伝子修正工程又は遺伝子追加工程、好ましくは遺伝子追加工程に対応する。一実施形態では、遺伝子改変工程（複数可）は、トランスフェクション、形質導入又は遺伝子編集を含む群から選択されるが、これらに限定されない方法である／方法により行われる。
【0156】
本発明で使用され得る遺伝子編集の方法の例は、改変されたヌクレアーゼに基づく方法、組換えアデノ随伴ウイルス（すなわちＡＡＶ）に基づく方法、トランスポゾンに基づく方法（例えば、スリーピングビューティートランスポゾンシステム）、相同組換えに基づく方法、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ及びＦｌｐ－ＦＲＴシステム）を用いるコンディショナルターゲティング、及びマルチプレックス自動ゲノム工学（ＭＡＧＥ）を含むが、これらに限定されない。本発明で使用され得る遺伝子編集の方法の他の例は、ニッカーゼに基づく方法を含むが、これに限定されない。
【0157】
改変されたヌクレアーゼの非限定的な例は、クラスター化され規則的に間隔をあけられた短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ｍｎ、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる）、又はｍｅｇａＴＡＬ（ＴＡＬエフェクターとｍｎ切断ドメインを組み合わせた）を含むが、これに限定されない。改変されたヌクレアーゼの他の非限定的な例としては、塩基エディター又はプライムエディターが挙げられる。
【0158】
一実施形態では、目的の遺伝子を発現する外因性核酸配列が、好ましくは本方法の工程（ａ）の前に又は最中に、細胞中に導入される。
【0159】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の形質導入又はトランスフェクションは、本発明の方法の工程（ａ）の前に行われる。
【0160】
一実施形態では、本方法の工程（ａ）の前に、ＣＤ３４＋細胞は、形質導入される前に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０時間、好ましくは一晩、事前活性化される。一実施形態では、本方法の工程（ａ）の前に、ＣＤ３４＋細胞は、形質導入される前に、少なくとも約１日間、事前活性化される。一実施形態では、事前活性化は、工程（ａ）の培地と同等であるがＴＮＦ－α又はその断片を欠く培地中での細胞培養を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、事前活性化は、工程（ａ）の培地と同等の培地中での細胞培養を含むか又はそれからなる。この実施形態によれば、遺伝子改変工程と工程ａ）の組み合わせの期間は、少なくとも約４、５、６、７、８、９又は１０日、好ましくは少なくとも約５又は６日である。一実施形態では、遺伝子改変工程と工程ａ）の組み合わせの期間は、約４、５、６、７、８、９又は１０日、好ましくは約７日である。
【0161】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の形質導入又はトランスフェクションは、本発明の方法の工程（ａ）中に行われる。
【0162】
一実施形態では、形質導入は、ＤＬ－４及びフィブロネクチンの不在下で実施される。一実施形態では、形質導入は、ＤＬ－４及びフィブロネクチンの存在下で実施される。一実施形態では、形質導入は、ＴＮＦ－α又はその断片の存在下で実施される。一実施形態では、形質導入は、ＴＮＦ－α又はその断片の不在下で実施される。
【0163】
一実施形態では、形質導入は、工程（ａ）の培地中で実施される。一実施形態では、形質導入は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）、ｈＩＬ３を含むか又はそれらからなる群から選択されるサイトカインの少なくとも１種の存在下で、より好ましくは３種のサイトカインを伴い実施される。一実施形態では、形質導入は、ＳＣＦ（好ましくはｈＳＣＦ）、ＴＰＯ（好ましくはｈＴＰＯ）、Ｆｌｔ３－Ｌ（好ましくはｈＦｌｔ３－Ｌ）、及びＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）、ｈＩＬ３を含むか又はそれらからなる群から選択されるサイトカインの少なくとも１種の存在下で、より好ましくは４種のサイトカインを伴い実施される。一実施形態では、形質導入は、ｈＳＣＦ、ｈＴＰＯ、ｈＦｌｔ３－Ｌ、ｈＩＬ－７、ｈＩＬ３を含む群から選択されるサイトカインの少なくとも１種の存在下で、より好ましくは５種のサイトカインを伴い実施される。一実施形態では、サイトカインは、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用され、より好ましくは、サイトカインは、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は３００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【0164】
一実施形態では、形質導入は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０時間の間、好ましくは少なくとも６時間の間実施される。
【0165】
一実施形態では、形質導入工程のために、ＣＤ３４＋細胞は、約１０６～１０７細胞／ｍＬの範囲の濃度で播種される。
【0166】
一実施形態では、形質導入後に、ＣＤ３４＋細胞は、洗浄され、次いで本発明の方法の工程（ａ）が、実施される。
【0167】
一実施形態では、細胞中に導入される外因性核酸配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。ＣＡＲは、例えば、標的細胞により特異的に発現される細胞表面タンパク質（例えば、癌細胞又は感染細胞により発現される）などの、抗原を認識する細胞表面タンパク質である。
【0168】
一実施形態では、細胞中に導入される外因性核酸配列は、サイトカインもしくはサイトカイン受容体又はそれらの変異体（例えば、安定性を高めたサイトカイン又はサイトカイン受容体の変異体など）を含むか又はそれらからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一実施形態では、外因性核酸配列は、キメラサイトカイン受容体又は直交サイトカイン－受容体対をコードする。
【0169】
一実施形態では、外因性核酸配列は、ＩＬ－１５又はその変異体をコードする。
【0170】
一実施形態では、細胞中に導入される外因性核酸配列は、ＣＤ１６又はその変異体（例えば、ＣＤ１６の切断抵抗性変異体など）をコードする。
【0171】
一実施形態では、遺伝子改変工程（複数可）は、特異的遺伝子の発現を減少させる又は廃止することを目的とする、遺伝子破壊工程である。除去され得る遺伝子の例は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、サイトカイン誘導性ＳＴＡＴ阻害因子（ＣＩＳ）及びシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）を含むか又はそれらからなる群からの遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【0172】
一実施形態では、遺伝子改変工程（複数可）は、特異的遺伝子の発現を減させる少又は廃止することを目的とする、遺伝子破壊工程である。除去され得る遺伝子の例は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＢ２、サイトカイン誘導性ＳＴＡＴ阻害因子（ＣＩＳ）及びシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）を含むか又はそれらからなる群からの遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【0173】
本発明の別の目的は、本発明のインビトロの方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞集団である。
【0174】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞である。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を含む。
【0175】
一実施形態では、本発明の方法により生成されるＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％の純度を有し、すなわち、工程ｂ）の終わりに回収される細胞の６０％超が、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞である。
【0176】
ＮＫ細胞は、活性化受容体及び抑制性受容体を含む、それらの細胞表面膜で発現される受容体により腫瘍細胞及び感染細胞を認識する。
【0177】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＫＩＲＤＳ１／Ｓ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲｓ、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＴＢＡ及びＮＫｐ８０を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つの活性化受容体を発現する。
【0178】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であるか又はそれを含み、ここで上記ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％（例えば、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）は、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。
【0179】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であるか又はそれを含み、ここで上記ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％（例えば、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）は、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
【0180】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ１６１、ＣＤ６２Ｌ、並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ６２Ｌを発現する。
【0181】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％は、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％は、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
【0182】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約５０、５５、６０、６５又は７５％は、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約５０、５５、６０、６５又は７５％は、ＣＤ１６１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
【0183】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＤ６２Ｌを発現する。一実施形態では、ＮＫ細胞の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５％は、ＣＤ６２Ｌを発現する。
【0184】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＣＣＲ５を発現する。一実施形態では、ＮＫ細胞の少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９５％は、ＣＣＲ５を発現する。
【0185】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＲ－１、ＫＬＲＧ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃ－３、－７、－９、ＬＡＩＲ－１及びＣＤ３００Ａを含むか又はそれらからなる群から選択される抑制性受容体の少なくとも１つを発現しない。
【0186】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＫＬＲＧ－１を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つの抑制性受容体を発現しない。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、又はＫＬＲＧ－１を発現しない。
【0187】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％未満は、ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＫＬＲＧ－１を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つの抑制性受容体を発現する。
【0188】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％未満は、ＣＤ１６を発現する。
【0189】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５％未満は、ＣＤ１６を発現する。
【0190】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約３５、４０又は４５％は、ＣＤ９４及び／又はＮＫＧ２Ａを発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約１５、２０、２５又は３０％は、ＣＤ９４及び／又はＮＫＧ２Ａを発現する。一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０又は７５％は、ＣＤ９４及び／又はＮＫＧ２Ａを発現する。
【0191】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、未熟なＮＫ細胞である（又はそれらを含む）。未熟なＮＫ細胞は、例えばＫＩＲ受容体及び／又はＣＤ１６の発現を欠く。
【0192】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、成熟したＮＫ細胞である。成熟したＮＫ細胞は、例えばＣＤ１６及び／又はＫＩＲ受容体を発現し得る。
【0193】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、例えば、メモリー様ＮＫ細胞などの成熟したＮＫ細胞である（又はそれらを含む）。
【0194】
一実施形態では、本発明の方法により取得される可能性が高い又は取得されるＮＫ細胞は、未熟なＮＫ細胞及び成熟したＮＫ細胞（例えば、メモリー様ＮＫ細胞）を含む。
【0195】
本発明はさらに、ＮＫ細胞集団に関し、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６１、ＤＮＡＭ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄを発現し、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＤＬ３、ＫＬＲＧ１を発現しない。一実施形態では、上記ＮＫ細胞集団は、単離される。
【0196】
本発明はさらに、ＮＫ細胞集団に関し、ここでＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞であるか又はそれを含み、ここで上記ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％（例えば、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）は、ＣＤ１６１並びにＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを含むか又はそれらからなる群から選択される活性化受容体から選択される少なくとも１つの分子を発現する。
【0197】
一実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ６２Ｌを発現する。
【0198】
本発明はさらに、ＣＤ１６１、ＤＮＡＭ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄを発現し、ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＤＬ３、ＫＬＲＧ－１を発現しないＮＫ細胞に関する。一実施形態では、上記ＮＫ細胞は、単離される。
【0199】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団の細胞の少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％は、ＣＤ１６１並びに活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団の細胞の少なくとも約５０、５５、６０、６５又は７５％は、ＣＤ１６１並びに活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１及びＮＫＧ２Ｄを発現する。
【0200】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＣＣＲ５を発現する。一実施形態では、集団のＮＫ細胞の少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９５％は、ＣＣＲ５を発現する。
【0201】
一実施形態では、集団のＮＫ細胞の最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％、より好ましくは、最大約２％は、抑制性受容体ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＬＲＧ－１を発現する。
【0202】
一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％は、ＣＤ１６を発現する。
【0203】
一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％未満は、ＣＤ１６を発現する。
【0204】
一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０％未満は、ＣＤ１６を発現する。
【0205】
一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の約４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５％未満は、ＣＤ１６を発現する。
【0206】
一実施形態では、集団のＮＫ細胞の少なくとも約３５、４０又は４５％は、ＣＤ９４を発現する。一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の少なくとも約１５、２０、２５又は３０％は、ＣＤ９４を発現する。
【0207】
一実施形態では、集団のＮＫ細胞の少なくとも約３５、４０又は４５％は、ＮＫＧ２Ａを発現する。一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の少なくとも約１５、２０、２５又は３０％は、ＮＫＧ２Ａを発現する。一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０及び７５％は、ＮＫＧ２Ａを発現する。
【0208】
一実施形態では、本発明の集団のＮＫ細胞の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％未満は、ＮＫＧ２Ａを発現する。
【0209】
一実施形態では、集団のＮＫ細胞の少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０又は４５％は、ＮＫＧ２Ａ及びＣＤ９４を発現する。
【0210】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、未熟なＮＫ細胞である。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団は、未熟なＮＫ細胞を含む。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、成熟したＮＫ細胞（例えば、メモリー様ＮＫ細胞）である。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団は、成熟したＮＫ細胞（例えば、メモリー様ＮＫ細胞）を含む。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団は、未熟なＮＫ細胞及び成熟したＮＫ細胞（例えば、メモリー様ＮＫ細胞）を含む。
【0211】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞（例えば、本発明の方法により取得され得る）は、機能的である、すなわち、細胞傷害活性を有することができる。
【0212】
ＮＫ細胞の機能は、当技術分野で公知の従来の方法により検証され得る。そのような方法の例は、限定されないが、細胞傷害性アッセイ、ＩＦＮγ又はＴＮＦ－αの分泌の測定、並びにパーフォリン及びグランザイムの生成（及び脱顆粒の能力）の測定を含む。そのような方法の例は、実験の部分で提示される。
【0213】
一実施形態では、ＮＫ細胞は、試験Ａの条件において、インビトロで細胞傷害性である。
【0214】
実際には、試験Ａは、フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイであり、以下のように行われる：標的細胞（例えば、Ｋ５６２細胞又はＴＨＰ１細胞）を、標的細胞をエフェクターＮＫ細胞と区別するために、３７℃で１０分間、１μＭの色素とインキュベートすることにより、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識する。標識した標的細胞を次いで、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて５時間、１０％のＦＢＳ及び３０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ培地中で、異なるエフェクター対標的の比でＮＫ細胞とインキュベートする。５時間のインキュベーション後に、細胞を７－ＡＡＤで染色して、ＮＫ細胞により死滅された標的細胞を区別する。自発的な標的細胞の死の効果を、ＮＫ細胞なしに標的細胞のみをインキュベートする１つの条件を含めることにより、正規化する（エフェクター細胞の存在下での標的細胞死の割合（％）から、エフェクター細胞なしの自発的な標的細胞の死の割合（％）を減算することにより）。一実施形態では、試験Ａにおいて、陽性対照条件は、標的細胞を、例えば、ＰＢＳで約０．２％に希釈したＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤に曝露し、それにより総標的細胞死を測定する、条件に相当する。
【0215】
一実施形態では、標的細胞中の死細胞の割合が少なくとも１つのエフェクター対標的細胞の比において少なくとも約１０％であり、以下の基準：標的細胞の自然死の割合が約５％以下である、全標的細胞死の割合が約９９％以上である；及び反復間の変動係数が約２０％以下である、が満たされる場合、細胞は、試験Ａの条件で細胞傷害性である。
【0216】
一実施形態では、１.２５：１のエフェクター：標的の比率で、少なくとも約５、１０又は１５％の細胞傷害性の割合が、用量依存的応答と共に測定される場合、細胞は、試験Ａの条件で細胞傷害性であり、エフェクター：標的細胞の比率が重大であるほど、ＮＫ細胞の細胞傷害性が高くなることを意味する。
【0217】
一実施形態では、１.２５：１のエフェクター：標的の比率で、少なくとも約２０％の細胞傷害性の割合が、用量依存的応答と共に測定される場合、細胞は、試験Ａの条件において細胞傷害性であり、エフェクター：標的細胞の比率が重大であるほど、ＮＫ細胞の細胞傷害性が高くなることを意味する。
【0218】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、サイトカインもしくはサイトカイン受容体又はそれらの変異体（例えば、安定性が増大したサイトカイン又はサイトカイン受容体の変異体など）を含むか又はそれらからなる群から選択されるタンパク質を発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、キメラサイトカイン受容体又は直交サイトカイン－受容体対を発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＩＬ－１５又はその変異体を発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＣＤ１６又はその変異体（例えば、ＣＤ１６の切断抵抗性変異体など）を発現する。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、サイトカイン誘導ＳＴＡＴ阻害因子（ＣＩＳ）及びシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現しない。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＢ２、サイトカイン誘導ＳＴＡＴ阻害因子（ＣＩＳ）及びシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現しない。
【0219】
本発明はさらに、ＴＮＦ－α又はその断片、ノッチリガンド又はその断片、及びインターロイキン－７（好ましくはｈＩＬ－７）、幹細胞因子（好ましくはｈＳＣＦ）、インターロイキン－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）、インターロイキン－２（好ましくはｈＩＬ－２）及びＦｌｔ３リガンド（好ましくはｈＦＬＴ３Ｌ）を含むか又はそれらからなる群から選択される少なくとも３種の（例えば、３、４又は５種、好ましくは５種の）サイトカインを含む本発明の方法を実施するためのキットに関する。一実施形態では、本発明の方法を実施するためのキットは、ＩＬ－７（好ましくはｈＩＬ－７）、ＳＣＦ（好ましくは、ｈＳＣＦ）、ＩＬ－１５（好ましくはｈＩＬ－１５）及びＦＬＴ３－Ｌ（好ましくはｈＦＬＴ３Ｌ）を含み得る。一実施形態では、キットは、フィブロネクチン又はその断片をさらに含む。一実施形態では、キットは、ＩＬ－１２（好ましくはｈＩＬ－１２）及び／又はＩＬ－１８（好ましくはｈＩＬ－１８）をさらに含む。
【0220】
このようなキットは、本明細書に開示される方法を実施するために特に適合され及び設計される。
【0221】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための、又は増加させることにおける使用のための本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。
【0222】
本発明の別の目的は、例えば「既製」治療法などの、治療法における使用のための本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。
【0223】
本発明の別の目的は、医薬としての使用のための本明細書に記載のＮＫ細胞集団である。
【0224】
本発明はさらに、対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための医薬の製造用の、本明細書に記載のＮＫ細胞集団の使用に関する。
【0225】
本発明はさらに、本明細書に記載のＮＫ細胞集団（特に、本明細書に記載の治療的有効量のＮＫ細胞）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＮＫ細胞の数を増加させるための方法に関する。
【0226】
本発明はさらに、本発明によるＮＫ細胞集団を含む、それから本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。
【0227】
一実施形態では、組成物は、医薬組成物であり、少なくとも１種の医薬として許容される賦形剤をさらに含む。したがって、本発明はさらに、医薬組成物に関する。
【0228】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明によるＮＫ細胞集団及び少なくとも１種の医薬として許容される賦形剤を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【0229】
本発明の医薬組成物で使用され得る医薬として許容される賦形剤は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸塩など、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及びウール油脂を含むが、これらに限定されない。
【0230】
一実施形態では、本発明の組成物は、医薬である、又は医薬としての使用のためのものである。したがって、本発明はさらに、医薬に関する。
【0231】
一実施形態では、医薬は、本発明によるＮＫ細胞集団を含む、含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
【0232】
本明細書で使用される、組成物、医薬組成物又は医薬に関して「から本質的になる」という用語は、本発明のＮＫ細胞が、上記組成物、医薬組成物又は医薬中で生物学的活性を有する唯一の治療薬又は薬剤であることを意味する。
【0233】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞集団、組成物、医薬組成物又は医薬は、癌又は感染症を治療するためのものである。
【0234】
本発明はそのため、癌又は感染症を治療するためのＮＫ細胞、ＮＫ細胞集団、組成物、医薬組成物又は医薬に関する。
【0235】
本発明はさらに、癌又は感染症を治療するための医薬の製造のための、本明細書に開示されるＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団の使用に関する。
【0236】
本発明はさらに、本明細書に記載のＮＫ細胞集団（特に、本明細書に記載の治療的有効量のＮＫ細胞）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌又は感染症を治療するための方法に関する。
【0237】
一実施形態では、対象は、ヒトである。
【0238】
一実施形態では、対象は、癌に罹患している、好ましくは癌と診断される。
【0239】
癌の例は、白血病（すなわち、急性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂリンパ腫）、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、黒色腫、子宮癌、腎臓癌、肉腫、癌腫、非小細胞肺癌、口腔癌及び中咽頭癌、メチルコラントレン誘発肉腫及び結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。
【0240】
癌の例は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂリンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫）、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、子宮頸癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、甲状腺癌、黒色腫、子宮癌、腎臓癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、肉腫、癌腫（例えば、腎細胞癌、乳癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、小児固形腫瘍、ＣＤ１３３＋癌幹細胞、ＮＫＧＤＬ＋癌細胞、ＰＤ－Ｌ１＋癌細胞、口腔癌及び中咽頭癌（例えば、舌癌、食道癌、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ））メチルコラントレン誘発肉腫及び結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。
【0241】
一実施形態では、対象は、感染症に罹患し、好ましくは感染症と診断される。
【0242】
一実施形態では、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス－１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））インフルエンザ、レトロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス（例えば、コクサッキーＢ３ウイルス）を含むか又はそれらからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされるウイルス持続感染に罹患し、好ましくはウイルス持続感染症と診断される。
【0243】
一実施形態では、対象は、寄生虫感染に罹患し、好ましくは寄生虫感染症と診断される。寄生虫感染症の例は、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症及びマラリアを含むが、これらに限定されない。
【0244】
本発明の一実施形態では、治療対象は、本明細書上記の組成物の治療的有効量を少なくとも１回投与される。
【0245】
一実施形態では、本発明のＮＫ細胞の単回用量が、対象に投与される。別の実施形態では、本発明のＮＫ細胞の複数回用量が、ある期間にわたり投与される。
【0246】
一実施形態では、治療的有効量のＮＫ細胞が、治療対象に投与されるか、投与されるためのものか、又は投与される予定である。一実施形態では、治療的有効量は、約０．５×１０７～約３×１０７細胞／ｋｇ体重の範囲である。
【0247】
一実施形態では、対象に注入され得るＮＫ細胞の数は、約０．５×１０７～約３×１０７細胞／ｋｇ体重の範囲である。
【0248】
一実施形態では、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞集団、本発明の組成物、医薬組成物又は医薬は、膀胱内投与、膣内投与、骨内投与、腹腔内投与、子宮内投与、眼内投与、皮内投与、動脈内投与、脳内投与、鼻腔内投与、経腸投与、頬側投与、鼻腔内投与、経口投与、直腸投与、又は吸入により投与される（又は投与される予定である、又は投与するためのものである）。
【0249】
一実施形態では、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞集団、本発明の組成物、医薬組成物又は医薬は、限定されないが、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む注射により投与される（又は投与される予定である、又は投与するためのものである）。
【0250】
注射に適合された形態の例は、例えば、無菌水溶液などの溶液、ゲル、分散液、エマルジョン、懸濁液、例えば粉末などの、使用前の液体の添加時に溶液又は懸濁液を調製するために使用するのに適する固体形態、リポソーム形態などを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0251】
【図1】図１は、ＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養系を用いるＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからのＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の生成を示すドットプロット及びヒストグラムの組み合わせである。（Ａ）図１Ａは、ＤＬ－４／ＴＮＦ－α培地中で、その後、示された時点でＤＬ－４／ＴＮＦ－αのないＮＫ細胞分化培地中で７日間培養した後に生成されたＮＫ細胞の表現型を表すドットプロットの組み合わせである。（Ｂ、Ｃ）図１Ｂ及び図１Ｃは、１４日目（薄い灰色）及び２１日目（濃い灰色）におけるＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の平均頻度（Ｂ）及びＣＤ３４＋細胞あたりの数（Ｃ）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）を示すグラフの組み合わせである。
【図2】図２は、ＣＢ又はｍＰＢ ＨＳＰＣ（ＤＬ－４／ＴＮＦ－α曝露）由来のＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）によるＮＫ細胞受容体及び転写因子の発現を示すヒストグラム及びグラフの組み合わせである。（Ａ、Ｂ）図２Ａ及び図２Ｂは、培養２１日後に生成されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞によるＮＫ細胞受容体の発現率（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２又は３）（Ａ）及び転写因子（Ｅｏｍｅｓ、Ｔ－ｂｅｔ及びＩＤ－２）の発現率（Ｂ）をグラフで表したものである。発現レベルを、対照である一晩活性化した末梢血（ＰＢ）－ＮＫ細胞の（ｈＩＬ－２及びＩＬ１５の存在下での）発現レベルと比較した。
【図3】図３は、ＣＢ ＮＫ細胞又はｍＰＢ ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）による細胞傷害性分子の発現、及びＫ５６２細胞による刺激後のそれらのサイトカイン発現を示すドットプロットの組み合わせである。（Ａ）図３Ａは、生成されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞による細胞傷害性顆粒（パーフォリン及びグランザイムＢ）の発現を示す代表的なドットプロットの組み合わせである。（Ｂ、Ｃ）図３Ｂ及び図３Ｃは、１：２のエフェクター（ＮＫ）：標的（Ｋ５６２）の比でＫ５６２細胞により６時間刺激したときの、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞による脱顆粒（細胞表面でのＣＤ１０７ａの発現）（Ｂ）、及びＴＮＦ－α及びＩＦＮｇの発現（Ｃ）を示す代表的なドットプロットの組み合わせである。
【図4】図４は、ＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養系を用いるＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからの形質導入されたＮＫ細胞の生成を示すドットプロット及びヒストグラムの組み合わせである。（Ａ）図４Ａは、形質導入された（ＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋）ＮＫ細胞の生成を示す代表的なドットプロットの組み合わせである。（Ｂ、Ｃ）図４Ｂ及び図４Ｃは、形質導入されたＮＫ細胞の生成培養後１４日目（薄い灰色）及び２１日目（濃い灰色）に生成された形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の平均頻度（Ｂ）及びＣＤ３４＋細胞あたりの数（Ｃ）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）を示すヒストグラムである。
【図6】図６は、Ｋ５６２細胞による刺激後の形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞の脱顆粒及びサイトカイン発現を示すドットプロットの組み合わせである。図６Ａ及びＢは、脱顆粒（細胞表面でのＣＤ１０７ａの発現）（Ａ）、ＴＮＦ－α及びＩＦＮｇ発現の誘導（Ｂ）、並びに細胞傷害性顆粒（グランザイムＢ及びパーフォリン）の分泌を示す代表的なドットプロットの組み合わせである。
【図7】図７は、インビトロで生成された形質導入されたＮＫ細胞の細胞傷害性を示すグラフの組み合わせである。（Ａ）図７Ａは、示されたエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で５時間共インキュベーションした後の、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（エフェクター細胞）によるＫ５６２細胞（標的細胞）の死滅をグラフで表したものである（１つの代表的な実験）。（Ｂ）図７Ｂは、示されたエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で５時間共インキュベートした後の形質導入されたＣＢ ＮＫ細胞（エフェクター細胞）によるＴＨＰ１細胞（標的細胞）の死滅をグラフで表したものである（１つ代表的な実験）。
【図9】図９は、ＤＬ－４／ＴＮＦα培養系を用いるＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからの機能的に有望なＣＡＲ ＮＫ細胞の生成を示すグラフの組み合わせである。（Ａ）図９Ａは、７日間のＤＬ－４／ＴＮＦα培養の第１の工程と、フィーダー細胞もＤＬ－４／ＴＮＦαも含まない８日間のＮＫ細胞分化の第２の工程の間の、ＣＤ１９－ＣＡＲをコードするレンチウイルスでの形質導入を含む、ＮＫ細胞生成培養後のＣＡＲ（ＣＡＲ＋ＣＤ５６＋）ＮＫ細胞の生成を示す代表的なＦＡＣＳプロットである。（Ｂ）図９Ｂは、示されたエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で５時間共インキュベートした後のＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞（ＮＡＬＭ－６）の死滅をグラフで表したものである。
【0252】
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
【0253】
実施例１：機能性ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の生成
材料と方法
ＣＤ３４＋細胞
臍帯血（ＣＢ）試料は、インフォームドコンセントの提供後にセントルイス病院（フランス、パリ）でドナーから倫理的に承認された手順により収集された。使用した動員末梢血（ｍＰＢ）試料は、顆粒球コロニー刺激因子で動員され研究使用のためにインフォームドコンセントを提供した健康なドナーからの移植片の未使用画分であった。ｍＰＢ試料は、フランス研究省が認可したコレクションの一部であった（参照：ＤＣ－２０１４－２２７２、２０１５年３月２３日付）。臍帯血又はｍＰＢ ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、製造業者の説明書に従い、Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＢ及びｍＰＢ試料から磁気により濃縮された。使用したＣＤ３４＋細胞の単離画分の純度は、９４％超であった。
材料と方法
ＣＤ３４＋細胞
臍帯血（ＣＢ）試料は、インフォームドコンセントの提供後にセントルイス病院（フランス、パリ）でドナーから倫理的に承認された手順により収集された。使用した動員末梢血（ｍＰＢ）試料は、顆粒球コロニー刺激因子で動員され研究使用のためにインフォームドコンセントを提供した健康なドナーからの移植片の未使用画分であった。ｍＰＢ試料は、フランス研究省が認可したコレクションの一部であった（参照：ＤＣ－２０１４－２２７２、２０１５年３月２３日付）。臍帯血又はｍＰＢ ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、製造業者の説明書に従い、Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＢ及びｍＰＢ試料から磁気により濃縮された。使用したＣＤ３４＋細胞の単離画分の純度は、９４％超であった。
【0254】
インビトロＮＫ細胞分化アッセイ
ＮＫ細胞のインビトロ生成を、合計２１日間で、２つの工程で実施した。
ＮＫ細胞のインビトロ生成を、合計２１日間で、２つの工程で実施した。
【0255】
第１の工程は、ＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養系におけるヒトＣＤ３４＋細胞の７日間培養からなった。ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて７日間培養した。
【0256】
第２の工程は、ＮＫ細胞を生成するために、ヒトサイトカインカクテルを含むがＤＬ－４及びＴＮＦ－αを含まない、フィーダー細胞のない培養系での第１の工程から得られた前駆細胞（特定の細胞集団の選別を伴わない全集団）の１４日間の培養からなった。第１の工程からの前駆細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を補充したＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で及びＴＮＦ－αの不在下で、１４日間非コートウェル（ＤＬ－４なし）中で培養して、ＮＫ細胞生成物を取得した。
【0257】
フローサイトメトリー
ヒトＣＤ５６－ＡＰＣＶｉｏ７７０／ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１９６）、ＣＤ１６１－ＰＥＶｉｏ７７０（クローン１９１Ｂ８）、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ１５９ｃ）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２０５）、ＫＬＲＧ１－ＰＥ（クローンＲＥＡ２６１）、ＣＤ１５８ｅ／ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ９７０）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３）－ＡＰＣ（クローンＤＸ２７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７９７）、ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａ）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１０）、ＣＤ９４－ＰＥ（クローンＲＥＡ１１３）、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１６３）、ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ８２３）、ＣＤ１６－Ｖｉｏｂｌｕｅ（クローンＲＥＡ４２３）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１０４０）、Ｔ－ｂｅｔ－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ１０２）、ＣＤ１０７ａ－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ７９２）、ＴＮＦ－α－ＰＥ（クローンＲＥＡ６５６）、ＩＦＮｇ－ＡＰＣ（クローン４５－１５）、パーフォリン－ＰＥ（クローンＲＥＡ１０６１）、グランザイムＢ－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２２６）及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）に対する抗体を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。抗ヒトＣＤ７－ＰＥ（クローンＭＴ７０１）及びＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン９Ｅ２／ＮＫｐ４６（９－Ｅ２））を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から取得した。抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１（ＵＣＨＴ１）を、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。ヒトＣＣＲ５（ＣＤ１９５）－ＡＰＣ（クローンＪ４１８ＦＩ）に対する抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)から取得した。抗ヒトＥｏｍｅｓ－ＰＥ（クローンＷＤ１９２８）及びＩＤ２－ＰＥＣｙ７（クローンＩＬＣＩＤ２）を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。
ヒトＣＤ５６－ＡＰＣＶｉｏ７７０／ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１９６）、ＣＤ１６１－ＰＥＶｉｏ７７０（クローン１９１Ｂ８）、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ１５９ｃ）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２０５）、ＫＬＲＧ１－ＰＥ（クローンＲＥＡ２６１）、ＣＤ１５８ｅ／ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ９７０）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３）－ＡＰＣ（クローンＤＸ２７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７９７）、ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａ）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１０）、ＣＤ９４－ＰＥ（クローンＲＥＡ１１３）、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１６３）、ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ８２３）、ＣＤ１６－Ｖｉｏｂｌｕｅ（クローンＲＥＡ４２３）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１０４０）、Ｔ－ｂｅｔ－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ１０２）、ＣＤ１０７ａ－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ７９２）、ＴＮＦ－α－ＰＥ（クローンＲＥＡ６５６）、ＩＦＮｇ－ＡＰＣ（クローン４５－１５）、パーフォリン－ＰＥ（クローンＲＥＡ１０６１）、グランザイムＢ－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２２６）及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）に対する抗体を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。抗ヒトＣＤ７－ＰＥ（クローンＭＴ７０１）及びＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン９Ｅ２／ＮＫｐ４６（９－Ｅ２））を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から取得した。抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１（ＵＣＨＴ１）を、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。ヒトＣＣＲ５（ＣＤ１９５）－ＡＰＣ（クローンＪ４１８ＦＩ）に対する抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)から取得した。抗ヒトＥｏｍｅｓ－ＰＥ（クローンＷＤ１９２８）及びＩＤ２－ＰＥＣｙ７（クローンＩＬＣＩＤ２）を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。
【0258】
表面染色のために、細胞を、適切な抗体と氷中で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
【0259】
細胞内染色のために、細胞を、表面マーカーについて前もって染色し、固定／透過処理溶液キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のいずれかを使用して固定及び透過処理し、次いで、適切な抗体と室温で３０分間インキュベートした。細胞を次いで、洗浄し、分析前にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【0260】
全てのフローサイトメトリーデータを、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０.２，Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して解析した。ＦＡＣＳ解析中に、全てのゲーティングを、生細胞で行った（７－ＡＡＤ色素の除外により測定される）。
【0261】
脱顆粒及びサイトカイン誘導アッセイ
得られたＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来のＮＫ細胞（ＣＢ ＨＳＰＣ－ＮＫ又はｍＰＢ ＨＳＰＣ－ＮＫ）を、サイトカインなしにＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、１：２のエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）比で一緒にインキュベートすることにより、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞株）で刺激した。抗ヒトＣＤ １０７ａ抗体を、インキュベーション時に添加（２０μｌ／ｍｌ）し、次いで、１時間インキュベートした。１時間後に、ブレフェルジン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（４μｌ／ｍｌ）及びモネンシン（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）（１μｌ／ｍｌ）を添加し、５時間さらにインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を、収集し、洗浄し、ＣＤ３及びＣＤ５６について表面染色した。それらをさらに、ＴＮＦ－α及びＩＦＮｇについて細胞内染色した。染色された細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターで取得した。
得られたＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来のＮＫ細胞（ＣＢ ＨＳＰＣ－ＮＫ又はｍＰＢ ＨＳＰＣ－ＮＫ）を、サイトカインなしにＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、１：２のエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）比で一緒にインキュベートすることにより、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞株）で刺激した。抗ヒトＣＤ １０７ａ抗体を、インキュベーション時に添加（２０μｌ／ｍｌ）し、次いで、１時間インキュベートした。１時間後に、ブレフェルジン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（４μｌ／ｍｌ）及びモネンシン（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）（１μｌ／ｍｌ）を添加し、５時間さらにインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を、収集し、洗浄し、ＣＤ３及びＣＤ５６について表面染色した。それらをさらに、ＴＮＦ－α及びＩＦＮｇについて細胞内染色した。染色された細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターで取得した。
【0262】
細胞傷害性アッセイ
フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを、標的細胞としてＫ５６２細胞を用いることにより実施した。標的細胞（Ｋ５６２又はＴＨＰ１）を、３７℃で１０分間１μＭの色素とそれらをインキュベートすることによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識して、標的細胞とエフェクターＮＫ細胞を区別した。標識された標的細胞を次いで、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて５時間１０％ ＦＢＳ及び３０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ培地中で、エフェクターと標的の異なる比率でエフェクターＮＫ細胞とインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を７－ＡＡＤで染色して、エフェクターＮＫ細胞により死滅された標的細胞を区別した。自発的な標的細胞の死の効果を、エフェクター細胞なしに標的細胞のみをインキュベートする１つの条件を含めることにより正規化した（エフェクター細胞の存在下での標的細胞死の割合（％）から、エフェクター細胞なしの自発的な標的細胞の死の割合（％）を減算することにより）。末梢血由来のＮＫ細胞を、インビトロで生成されたＮＫ細胞と並行して、陽性対照エフェクター細胞として使用した。
フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを、標的細胞としてＫ５６２細胞を用いることにより実施した。標的細胞（Ｋ５６２又はＴＨＰ１）を、３７℃で１０分間１μＭの色素とそれらをインキュベートすることによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識して、標的細胞とエフェクターＮＫ細胞を区別した。標識された標的細胞を次いで、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて５時間１０％ ＦＢＳ及び３０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ培地中で、エフェクターと標的の異なる比率でエフェクターＮＫ細胞とインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を７－ＡＡＤで染色して、エフェクターＮＫ細胞により死滅された標的細胞を区別した。自発的な標的細胞の死の効果を、エフェクター細胞なしに標的細胞のみをインキュベートする１つの条件を含めることにより正規化した（エフェクター細胞の存在下での標的細胞死の割合（％）から、エフェクター細胞なしの自発的な標的細胞の死の割合（％）を減算することにより）。末梢血由来のＮＫ細胞を、インビトロで生成されたＮＫ細胞と並行して、陽性対照エフェクター細胞として使用した。
【0263】
全ての実験について、２つの対照を使用した。第２の工程の培地（ＣＢ ＣＤ３４＋、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αなし）及び末梢血由来のＮＫのみで処理したＣＢ ＣＤ３４＋細胞を、ＩＬ－２及びＩＬ－１５（ＰＢ－ＮＫ）で一晩活性化した。
【0264】
結果
ＮＫ ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の生成
ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからのＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養物を用いてＮＫ細胞生成の能力を試験するために、ＣＤ３４＋細胞を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルで７日間培養し、続いて、培養の最初の７日間の後に得られた細胞（ＣＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）又はｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α））を、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αなしでＮＫ細胞分化培養した。並行して、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露されていないＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣもまた、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αのないＮＫ細胞分化培地で培養した。培養物を、ＮＫ細胞へのそれらの分化（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞として識別される）について全培養の１４日及び２１日後に分析した。ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞）の分化は、ＣＢ ＣＤ３４＋（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）については非常に低い（最大３％）が、ＤＬ－４に曝露したＨＳＰＣ、ＣＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４）又はｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４）は、１４日及び２１日の短期間内でＴＮＦ－α曝露条件と非曝露条件の両方について、Ｔ細胞混入なしにＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞へと効率的に分化できた。興味深いことに、ＮＫ細胞の割合は、ＴＮＦ－αの存在下で１４日目以降、最大９０％に達した（図１のＡ及びＢ）。生成されたＮＫ細胞の純度は、特に成人ｍＰＢ細胞（ｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４））についてＴＮＦ－α曝露条件でより均一であった（図１Ｂ）。重要なことに、総ＮＫ細胞収量の分析は、ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの最初の７日間のＤＬ－４曝露中のＴＮＦ－αの添加が、培養２１日後にＣＢ及びｍＰＢについてそれぞれ８倍及び１８倍、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣあたり得られるＮＫ細胞の数を増加させることを示した（図１Ｃ）。しかし、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露しないＣＢ ＣＤ３４＋細胞から得られたＮＫ細胞の数は、図１Ｃに示すように、著しく少ないままであった。さらに、異なるＣＤ３４＋ＨＳＰＣドナー由来の＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α培養を使用するＮＫ細胞生成の解析は、単一のＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、ＴＮＦ－α曝露条件下で、１４日目にＣＢについて平均２４８８±１８３２（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞及びｍＰＢについて平均８７９±８０５（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞を生じさせ、２１日目にＣＢについて平均６３８９±３７２３（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞及びｍＰＢについて平均１８８１±１４５８（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞を生じさせることができたことを示した（図１Ｃ）。これらのデータは、＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－αの存在下での７日間の第１の培養工程とＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まない培地での第２の培養工程の組み合わせが、１４～２１日間の短い培養期間中に高い割合と数のＮＫ細胞を生成できることを実証する。
ＮＫ ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の生成
ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからのＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養物を用いてＮＫ細胞生成の能力を試験するために、ＣＤ３４＋細胞を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルで７日間培養し、続いて、培養の最初の７日間の後に得られた細胞（ＣＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）又はｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α））を、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αなしでＮＫ細胞分化培養した。並行して、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露されていないＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣもまた、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αのないＮＫ細胞分化培地で培養した。培養物を、ＮＫ細胞へのそれらの分化（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞として識別される）について全培養の１４日及び２１日後に分析した。ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞）の分化は、ＣＢ ＣＤ３４＋（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）については非常に低い（最大３％）が、ＤＬ－４に曝露したＨＳＰＣ、ＣＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４）又はｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４）は、１４日及び２１日の短期間内でＴＮＦ－α曝露条件と非曝露条件の両方について、Ｔ細胞混入なしにＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞へと効率的に分化できた。興味深いことに、ＮＫ細胞の割合は、ＴＮＦ－αの存在下で１４日目以降、最大９０％に達した（図１のＡ及びＢ）。生成されたＮＫ細胞の純度は、特に成人ｍＰＢ細胞（ｍＰＢ ＣＤ３４＋（＋ＤＬ－４））についてＴＮＦ－α曝露条件でより均一であった（図１Ｂ）。重要なことに、総ＮＫ細胞収量の分析は、ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの最初の７日間のＤＬ－４曝露中のＴＮＦ－αの添加が、培養２１日後にＣＢ及びｍＰＢについてそれぞれ８倍及び１８倍、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣあたり得られるＮＫ細胞の数を増加させることを示した（図１Ｃ）。しかし、ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露しないＣＢ ＣＤ３４＋細胞から得られたＮＫ細胞の数は、図１Ｃに示すように、著しく少ないままであった。さらに、異なるＣＤ３４＋ＨＳＰＣドナー由来の＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α培養を使用するＮＫ細胞生成の解析は、単一のＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、ＴＮＦ－α曝露条件下で、１４日目にＣＢについて平均２４８８±１８３２（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞及びｍＰＢについて平均８７９±８０５（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞を生じさせ、２１日目にＣＢについて平均６３８９±３７２３（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞及びｍＰＢについて平均１８８１±１４５８（平均±ＳＥＭ）のＮＫ細胞を生じさせることができたことを示した（図１Ｃ）。これらのデータは、＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－αの存在下での７日間の第１の培養工程とＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まない培地での第２の培養工程の組み合わせが、１４～２１日間の短い培養期間中に高い割合と数のＮＫ細胞を生成できることを実証する。
【0265】
生成されたＮＫ細胞の特性評価
生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＮＫ細胞の表現型特性評価は、ＮＫ細胞が、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１を発現し、ＣＤ１６１を発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ－１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しないことを示した（図２Ａ及び表１）。重要なことに、それらはまた、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞よりもさらに高いレベルでケモカイン受容体ＣＣＲ５を発現した。しかし、これらの細胞のわずかな低い割合（約５～約８％の範囲）は、ＣＤ１６発現を示し、それらの約５０％が、ＮＫＧ２Ａ（約４５％～約６３％の範囲の割合を発現する）とＣＤ９４（約５０％～約６６％の範囲の割合を発現する）を発現する（図２Ａ及び表１）。ＣＤ３４＋（ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露していない）由来のＮＫは、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）のものと比較してより低い発現レベルの活性化受容体を発現した。活性化されたＰＢ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の枯渇マーカーであるＫＬＲＧ１の、ある程度のレベルの発現を示した。そのため、生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）中で非常に低いレベルで発現されたか、又は発現されなかったＣＤ１６、ＫＩＲ及びＫＬＲＧ１の発現に関して、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞とは表現型が異なっていた（図２Ａ及び表１）。特に、ＮＫｐ４４は、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞によりうまく発現されなかったが、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、ＮＫｐ４４を高発現した（図２Ａ及び表１）。ＣＤ５６の均一な発現（図１Ａ）と組み合わせた、ＫＩＲ及びＫＬＲＧ１の発現の欠如、及びＣＤ１６の非常に低い発現（図２Ａ及び表１）は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の未熟な表現型を示唆した。興味深いことに、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞と同様に、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）細胞もまた、ＮＫ細胞の分化と機能に必須であることが知られている転写因子Ｅｏｍｅｓ、Ｔ－ｂｅｔ、及びＩＤ２（図２Ｂ）を発現する。
生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＮＫ細胞の表現型特性評価は、ＮＫ細胞が、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１を発現し、ＣＤ１６１を発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ－１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しないことを示した（図２Ａ及び表１）。重要なことに、それらはまた、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞よりもさらに高いレベルでケモカイン受容体ＣＣＲ５を発現した。しかし、これらの細胞のわずかな低い割合（約５～約８％の範囲）は、ＣＤ１６発現を示し、それらの約５０％が、ＮＫＧ２Ａ（約４５％～約６３％の範囲の割合を発現する）とＣＤ９４（約５０％～約６６％の範囲の割合を発現する）を発現する（図２Ａ及び表１）。ＣＤ３４＋（ＤＬ－４／ＴＮＦ－αに曝露していない）由来のＮＫは、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）のものと比較してより低い発現レベルの活性化受容体を発現した。活性化されたＰＢ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の枯渇マーカーであるＫＬＲＧ１の、ある程度のレベルの発現を示した。そのため、生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）中で非常に低いレベルで発現されたか、又は発現されなかったＣＤ１６、ＫＩＲ及びＫＬＲＧ１の発現に関して、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞とは表現型が異なっていた（図２Ａ及び表１）。特に、ＮＫｐ４４は、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞によりうまく発現されなかったが、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、ＮＫｐ４４を高発現した（図２Ａ及び表１）。ＣＤ５６の均一な発現（図１Ａ）と組み合わせた、ＫＩＲ及びＫＬＲＧ１の発現の欠如、及びＣＤ１６の非常に低い発現（図２Ａ及び表１）は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の未熟な表現型を示唆した。興味深いことに、活性化ＰＢ－ＮＫ細胞と同様に、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）細胞もまた、ＮＫ細胞の分化と機能に必須であることが知られている転写因子Ｅｏｍｅｓ、Ｔ－ｂｅｔ、及びＩＤ２（図２Ｂ）を発現する。
【0266】
表１：ＣＢ－ＮＫ細胞、ｍＰＢ－ＮＫ細胞及びＰＢ－ＮＫ表現型の比較（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２又はｎ＝３）
【表1】
【0267】
生成されたＮＫ細胞は機能的である
脱顆粒及びパーフォリンとグランザイムの発現
生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞の機能性を決定するために、最初にそれらを、ＮＫ細胞により構成的に発現されることが知られており、標的細胞の殺傷を誘導するために重要である細胞傷害性分子のパーフォリン及びグランザイムＢの発現について分析した。活性化されたＰＢ－ＮＫ細胞と同様に、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（ＴＮＦ－αに曝露されない又はＴＮＦ－αに曝露された）は、パーフォリンとグランザイムＢの両方を発現し（図３Ａ）、それらの標的細胞に対し細胞傷害性であるそれらの能力を反映している。しかし、ＣＢ ＣＤ３４＋－ＮＫ（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）細胞は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）及びＰＢ－ＮＫ細胞よりも低いレベルのパーフォリン及びグランザイムＢを発現した（図３Ａ）。
脱顆粒及びパーフォリンとグランザイムの発現
生成されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞の機能性を決定するために、最初にそれらを、ＮＫ細胞により構成的に発現されることが知られており、標的細胞の殺傷を誘導するために重要である細胞傷害性分子のパーフォリン及びグランザイムＢの発現について分析した。活性化されたＰＢ－ＮＫ細胞と同様に、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（ＴＮＦ－αに曝露されない又はＴＮＦ－αに曝露された）は、パーフォリンとグランザイムＢの両方を発現し（図３Ａ）、それらの標的細胞に対し細胞傷害性であるそれらの能力を反映している。しかし、ＣＢ ＣＤ３４＋－ＮＫ（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）細胞は、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）及びＰＢ－ＮＫ細胞よりも低いレベルのパーフォリン及びグランザイムＢを発現した（図３Ａ）。
【0268】
次に、ＮＫ細胞を、それらの標的細胞での刺激時に脱顆粒（これは、標的細胞を殺すために細胞傷害性分子を分泌する重要なプロセスである）を受ける、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）及びＴＮＦ－α（アポトーシスを誘導することにより標的細胞の死滅を媒介できる）の発現を誘導する、それらの能力について評価した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞で刺激すると、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）細胞は、それらの細胞表面でのＣＤ１０７の検出により示され活性化ＰＢ－ＮＫ細胞のものに匹敵した、脱顆粒を示した（図３Ｂ）。脱顆粒のレベルは、特にｍＰＢについて、それらの非曝露条件と比較して、ＴＮＦ－α曝露条件で高かった。低いパーフォリンとグランザイムＢの発現（前述の通り）に加えて、脱顆粒レベルもまた、ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）と比較して、ＣＢ ＣＤ３４＋－ＮＫ細胞（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）で低かった（図３Ｂ）。ＩＦＮｇ及びＴＮＦ－αは、ＣＢ ＣＤ３４＋－ＮＫ細胞（ＤＬ－４なし／ＴＮＦ－αなし）を除く全ての条件下で、Ｋ５６２細胞による刺激時に誘導された（図３Ｃ）。しかし、重要なことに、ＴＮＦ－α曝露条件に由来するＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞は、それらのＴＮＦαに曝露されない対応物よりも高いＴＮＦ－α誘導を示した。さらに、特にｍＰＢについて、ＩＦＮｇ誘導は、ＴＮＦαに曝露しない条件で低かった（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、本発明の方法により生成されたＮＫ細胞が機能的であることを示唆する。
【0269】
細胞傷害性
ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の細胞傷害活性を、標的細胞として使用したＫ５６２細胞とＮＫ細胞をインキュベートすることにより試験した。ＣＢ及びｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞を効率的に死滅させることができた（データ示さず）。これらのデータは、本発明の方法で生成されたＮＫ細胞が細胞傷害性能を保有し、インビトロで標的細胞を死滅させることができることを示唆する。
ＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の細胞傷害活性を、標的細胞として使用したＫ５６２細胞とＮＫ細胞をインキュベートすることにより試験した。ＣＢ及びｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞を効率的に死滅させることができた（データ示さず）。これらのデータは、本発明の方法で生成されたＮＫ細胞が細胞傷害性能を保有し、インビトロで標的細胞を死滅させることができることを示唆する。
【0270】
実施例２：ＣＤ３４＋細胞は、効率的に形質導入され、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞へと分化できる
材料と方法
形質導入プロトコル
７日間の第１の培養工程の間、ヒト（ｈ）サイトカイン－３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下及びＴＮＦ－α（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＧＦＰレポータータンパク質をコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下、同じ事前活性化培地中で６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
材料と方法
形質導入プロトコル
７日間の第１の培養工程の間、ヒト（ｈ）サイトカイン－３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下及びＴＮＦ－α（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＧＦＰレポータータンパク質をコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下、同じ事前活性化培地中で６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
【0271】
第２の工程は、ＮＫ細胞を生成するために、ヒトサイトカインカクテルを含むがＤＬ－４及びＴＮＦ－αを含まない、フィーダー細胞のない培養系で第１の工程から得られた前駆細胞（特定の細胞集団のいかなる選別も伴わない全集団）の１４日間の培養からなった。第１の工程の前駆細胞を、１４日間１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ)を補充したＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で、ＴＮＦ－αの不在下で、１４日間非コートウェル（ＤＬ－４なし）で培養して、ＮＫ細胞生成物を取得した。
【0272】
結果
形質導入されたＮＫ ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の生成
形質導入されたＮＫ細胞が本方法を使用することにより生成できるかどうかを試験するために、ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞を、形質導入サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて一晩事前活性化し、次いで、ＧＦＰ発現ＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで６時間形質導入した。形質導入後に、形質導入された細胞を、培養サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにてＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日までさらに培養した。これに続いて、最初の７日間の培養後に得られた細胞のＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まないＮＫ細胞分化培養を行った。培養物を、形質導入されたＮＫ細胞（ＣＤ３－ＧＦＰ＋ＣＤ５６＋細胞として同定）へのそれらの分化について、培養の１４日及び２１日後に分析した。図４のＡ及びＢに示すように、形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が、１４日及び２１日の短い培養期間内に観察され、２１日目の平均頻度はＣＢについて５８±４.５（平均±ＳＥＭ）、ｍＰＢについて３３±７.５（平均±ＳＥＭ）であった。形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の総収量の分析は、単一のＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、１４日目ではＣＢについて平均１６００±１４４２（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞及びｍＰＢについて３１８±３６５（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞、並びに２１日目ではＣＢについて平均３８５７±２５３７（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞及びｍＰＢについて７７０±６６４（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞を生じることができたことを示した（図４Ｃ）。これらのデータは、本培養法が１４～２１日の短い培養期間内に多数の形質導入ＮＫ細胞を生成できることを実証する。
形質導入されたＮＫ ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の生成
形質導入されたＮＫ細胞が本方法を使用することにより生成できるかどうかを試験するために、ＣＢ又はｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞を、形質導入サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて一晩事前活性化し、次いで、ＧＦＰ発現ＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで６時間形質導入した。形質導入後に、形質導入された細胞を、培養サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにてＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日までさらに培養した。これに続いて、最初の７日間の培養後に得られた細胞のＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まないＮＫ細胞分化培養を行った。培養物を、形質導入されたＮＫ細胞（ＣＤ３－ＧＦＰ＋ＣＤ５６＋細胞として同定）へのそれらの分化について、培養の１４日及び２１日後に分析した。図４のＡ及びＢに示すように、形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が、１４日及び２１日の短い培養期間内に観察され、２１日目の平均頻度はＣＢについて５８±４.５（平均±ＳＥＭ）、ｍＰＢについて３３±７.５（平均±ＳＥＭ）であった。形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の総収量の分析は、単一のＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、１４日目ではＣＢについて平均１６００±１４４２（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞及びｍＰＢについて３１８±３６５（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞、並びに２１日目ではＣＢについて平均３８５７±２５３７（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞及びｍＰＢについて７７０±６６４（平均±ＳＥＭ）の形質導入されたＮＫ細胞を生じることができたことを示した（図４Ｃ）。これらのデータは、本培養法が１４～２１日の短い培養期間内に多数の形質導入ＮＫ細胞を生成できることを実証する。
【0273】
生成されたＮＫ細胞の特性評価
本発明の方法により生成された非形質導入ＮＫ細胞（図２Ａ）と同様に、形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋のＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１を発現し、ＣＤ１６１を発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ－１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しない（図５）。重要なことに、それらはまた、ケモカイン受容体ＣＣＲ５も発現する。それらは、非常に低いＣＤ１６を発現し、ＮＫＧ２ＡとＣＤ９４は、細胞の５０％しか発現されなかった（図５）。このデータは、形質導入条件が形質導入されたＮＫ細胞のＮＫ受容体の発現に影響を与えなかったことを示唆する。
本発明の方法により生成された非形質導入ＮＫ細胞（図２Ａ）と同様に、形質導入されたＧＦＰ＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋のＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１を発現し、ＣＤ１６１を発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ－１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しない（図５）。重要なことに、それらはまた、ケモカイン受容体ＣＣＲ５も発現する。それらは、非常に低いＣＤ１６を発現し、ＮＫＧ２ＡとＣＤ９４は、細胞の５０％しか発現されなかった（図５）。このデータは、形質導入条件が形質導入されたＮＫ細胞のＮＫ受容体の発現に影響を与えなかったことを示唆する。
【0274】
生成されたＮＫ細胞は機能的である
脱顆粒及びパーフォリンとグランザイムの発現
生成された形質導入されたＮＫ細胞の機能的能力を評価するために、脱顆粒及びサイトカイン誘導アッセイを、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）をＫ５６２細胞で刺激することにより実施した。刺激時に、形質導入されたＣＢ 又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）は、それらの細胞表面でのＣＤ１０７の検出により示されるように脱顆粒を示した。（図６Ａ）。脱顆粒のレベルは、特にｍＰＢについて、それらの非曝露対応物と比較してＴＮＦ－α曝露条件で高かった（図６Ａ）。ＩＦＮｇ及びＴＮＦ－αの発現もまた、Ｋ５６２細胞による刺激時に、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）で誘導された（図６Ｂ）。興味深いことに、ＴＮＦ－α曝露条件からの形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞は、それらのＴＮＦ－αに曝露されない対応物よりも高いＴＮＦ－α誘導を示した。さらに、ＩＦＮｇ誘導は、特にｍＰＢについて、ＴＮＦαに曝露しない条件で低かった（図６Ｂ）。最後に、グランザイムＢ及びパーフォリン発現は、Ｋ５６２細胞による刺激時に、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む）でも誘導された（データ示さず）。これらのデータは、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞が依然としてそれらの機能的能力を保持することを示唆する。
脱顆粒及びパーフォリンとグランザイムの発現
生成された形質導入されたＮＫ細胞の機能的能力を評価するために、脱顆粒及びサイトカイン誘導アッセイを、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）をＫ５６２細胞で刺激することにより実施した。刺激時に、形質導入されたＣＢ 又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）は、それらの細胞表面でのＣＤ１０７の検出により示されるように脱顆粒を示した。（図６Ａ）。脱顆粒のレベルは、特にｍＰＢについて、それらの非曝露対応物と比較してＴＮＦ－α曝露条件で高かった（図６Ａ）。ＩＦＮｇ及びＴＮＦ－αの発現もまた、Ｋ５６２細胞による刺激時に、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む又は含まない）で誘導された（図６Ｂ）。興味深いことに、ＴＮＦ－α曝露条件からの形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞は、それらのＴＮＦ－αに曝露されない対応物よりも高いＴＮＦ－α誘導を示した。さらに、ＩＦＮｇ誘導は、特にｍＰＢについて、ＴＮＦαに曝露しない条件で低かった（図６Ｂ）。最後に、グランザイムＢ及びパーフォリン発現は、Ｋ５６２細胞による刺激時に、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含む）でも誘導された（データ示さず）。これらのデータは、形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞が依然としてそれらの機能的能力を保持することを示唆する。
【0275】
細胞傷害性
形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の細胞傷害活性を、標的細胞としてＫ５６２細胞又はＴＨＰ１細胞とＮＫ細胞をインキュベートすることにより試験した。図７Ａに示されるように、本発明の方法により得られた形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、非形質導入（モック）条件又はＰＢ－ＮＫのものと同様のレベルでＫ５６２細胞を効率的に死滅させることができ、形質導入は形質導入されたＮＫ細胞の細胞傷害性能力に影響を与えなかったことを示唆する。さらに、本発明の方法により得られた形質導入されたＣＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）もまた、ＴＨＰ１細胞を効率的に死滅させることができた（図７Ｂ）。これらのデータは、本発明の方法で生成された形質導入されたＮＫ細胞は、インビトロでそれらの標的細胞を効率的に死滅させることができることを示唆する。
形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）の細胞傷害活性を、標的細胞としてＫ５６２細胞又はＴＨＰ１細胞とＮＫ細胞をインキュベートすることにより試験した。図７Ａに示されるように、本発明の方法により得られた形質導入されたＣＢ又はｍＰＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）は、非形質導入（モック）条件又はＰＢ－ＮＫのものと同様のレベルでＫ５６２細胞を効率的に死滅させることができ、形質導入は形質導入されたＮＫ細胞の細胞傷害性能力に影響を与えなかったことを示唆する。さらに、本発明の方法により得られた形質導入されたＣＢ ＮＫ細胞（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α）もまた、ＴＨＰ１細胞を効率的に死滅させることができた（図７Ｂ）。これらのデータは、本発明の方法で生成された形質導入されたＮＫ細胞は、インビトロでそれらの標的細胞を効率的に死滅させることができることを示唆する。
【0276】
実施例３：ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣからの機能的に有望なＣＡＲ ＮＫ細胞の生成
材料と方法
形質導入プロトコル
７日間の第１の培養工程の間、ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ヒト（ｈ）サイトカイン：３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で及びＴＮＦ－α（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）でＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下にて同じ事前活性化培地中で６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下にて２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
材料と方法
形質導入プロトコル
７日間の第１の培養工程の間、ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ヒト（ｈ）サイトカイン：３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で及びＴＮＦ－α（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）でＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下にて同じ事前活性化培地中で６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下にて２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
【0277】
第２の工程は、ＮＫ細胞を生成するために、ヒトサイトカインカクテルを含むがＤＬ－４及びＴＮＦ－αを含まない、フィーダー細胞のない培養系で第１の工程から得られた前駆細胞（特定の細胞集団のいかなる選別も伴わない全集団）の８日間の培養からなった。第１の培養工程後に得られた前駆細胞を、ＴＮＦ－αの不在下で、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ)を補充したＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、非コートウェル（ＤＬ－４なし）で８日間培養して、ＮＫ細胞生成物を取得した。
【0278】
細胞傷害性アッセイ
フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを、標的細胞としてＮＡＬＭ－６（Ｂ細胞前駆体白血病細胞株）の細胞を用いることにより実施した。ＮＡＬＭ－６標的細胞を、３７℃で１０分間１μＭの色素とそれらをインキュベートすることによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識して、標的細胞とエフェクターＮＫ細胞を区別した。標識された標的細胞を次いで、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて５時間１０％ ＦＢＳ及び３０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ培地中で、エフェクターと標的の異なる比率でエフェクターＮＫ細胞とインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を、７－ＡＡＤで染色して、エフェクターＮＫ細胞により死滅された標的細胞を区別した。自発的な標的細胞の死の効果を、エフェクター細胞なしに標的細胞のみのインキュベーションの１つの条件を含めることにより、正規化した（エフェクター細胞の存在下での標的細胞死の割合（％）から、エフェクター細胞なしの自発的な標的細胞の死の割合（％）を減算することにより）。
フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイを、標的細胞としてＮＡＬＭ－６（Ｂ細胞前駆体白血病細胞株）の細胞を用いることにより実施した。ＮＡＬＭ－６標的細胞を、３７℃で１０分間１μＭの色素とそれらをインキュベートすることによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識して、標的細胞とエフェクターＮＫ細胞を区別した。標識された標的細胞を次いで、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて５時間１０％ ＦＢＳ及び３０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ培地中で、エフェクターと標的の異なる比率でエフェクターＮＫ細胞とインキュベートした。５時間のインキュベーション後に、細胞を、７－ＡＡＤで染色して、エフェクターＮＫ細胞により死滅された標的細胞を区別した。自発的な標的細胞の死の効果を、エフェクター細胞なしに標的細胞のみのインキュベーションの１つの条件を含めることにより、正規化した（エフェクター細胞の存在下での標的細胞死の割合（％）から、エフェクター細胞なしの自発的な標的細胞の死の割合（％）を減算することにより）。
【0279】
結果
ＮＫ細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本方法を使用することにより生成できるかどうかを試験するために、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を、形質導入サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて一晩、事前活性化し、次いで、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで６時間形質導入した。形質導入後に、形質導入された細胞を、ＤＬ－４培養サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日までさらに培養した。これに続いて、フィーダー細胞と、最初の７日間の培養後に得られた前駆細胞のＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まないＮＫ細胞の分化培養を行った。培養物を、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＡＲ＋ＣＤ５６＋細胞として同定）へのそれらの分化について８日後に分析した。図９Ａに示すように、ＣＡＲ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が、４６．５％の頻度で、１５日の短い培養期間内に観察された。これらのデータは、本培養法が１５日の短い培養期間内にＣＡＲ ＮＫ細胞を生成できることを実証する。
ＮＫ細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本方法を使用することにより生成できるかどうかを試験するために、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を、形質導入サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて一晩、事前活性化し、次いで、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで６時間形質導入した。形質導入後に、形質導入された細胞を、ＤＬ－４培養サイトカインカクテル中でＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルにて、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日までさらに培養した。これに続いて、フィーダー細胞と、最初の７日間の培養後に得られた前駆細胞のＤＬ－４／ＴＮＦ－αを含まないＮＫ細胞の分化培養を行った。培養物を、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＡＲ＋ＣＤ５６＋細胞として同定）へのそれらの分化について８日後に分析した。図９Ａに示すように、ＣＡＲ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が、４６．５％の頻度で、１５日の短い培養期間内に観察された。これらのデータは、本培養法が１５日の短い培養期間内にＣＡＲ ＮＫ細胞を生成できることを実証する。
【0280】
生成されたＣＤ１９を標的とするＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害活性を、標的細胞としてＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９を発現するＢ細胞前駆体白血病細胞株）の細胞とＮＫ細胞をインキュベートすることにより試験した。図９Ｂに示すように、ＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ細胞は、標的ＮＡＬＭ－６細胞を死滅させることができなかったモックＮＫ細胞とは対照的に、ＮＡＬＭ－６細胞を効率的に死滅させることができた。これらのデータは、本方法で生成されたＣＡＲ ＮＫ細胞が、インビトロで特異的標的細胞を効率的に死滅させることができることを示唆する。
【0281】
実施例４：ＩＬ－１２及びＩＬ１８と共に又はなしで生成されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞の表現型特性評価
材料と方法
インビトロＮＫ細胞分化アッセイ
ＮＫ細胞のインビトロ生成を、合計１４日にて、２つの工程で実施した。
材料と方法
インビトロＮＫ細胞分化アッセイ
ＮＫ細胞のインビトロ生成を、合計１４日にて、２つの工程で実施した。
【0282】
第１の工程は、ＤＬ－４／ＴＮＦ－α培養系におけるヒトＣＤ３４＋細胞の７日間培養からなった。ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、７日間ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて培養した。
【0283】
第２の工程は、ＮＫ細胞を生成するために、ヒトサイトカインカクテルを含むがＤＬ－４及びＴＮＦ－αを含まない、フィーダー細胞のない培養系での第１の工程から得られた前駆細胞（特定の細胞集団のいかなる選別も伴わない全集団）の１４日間の培養からなった。第１の工程からの前駆細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－１８（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に又はなしで１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を補充したＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で１４日間、及び７日間ＴＮＦ－αの不在下で非コートウェル（ＤＬ－４なし）にて培養して、ＮＫ細胞生成物を取得した。
【0284】
フローサイトメトリー
ヒトＣＤ５６－ＡＰＣＶｉｏ７７０／ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１９６）、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ１５９ｃ）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２０５）、ＫＬＲＧ１－ＰＥ（クローンＲＥＡ２６１）、ＣＤ１５８ｅ／ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ９７０）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３）－ＡＰＣ（クローンＤＸ２７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７９７）、ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａ）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１０）、ＣＤ９４－ＰＥ（クローンＲＥＡ１１３）、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１６３）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１０４０）及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）に対する抗体を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。抗ヒトＣＤ７－ＰＥ（クローンＭＴ７０１）、ＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン９Ｅ２／ＮＫｐ４６（９－Ｅ２））及びＣＤ６２Ｌ－ＢＶ４２１（クローンＭ－Ｔ７０１）を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から取得した。抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１／ＢＶ５１０（ＵＣＨＴ１）を、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。抗ヒトＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）－ＢＶ４２１（クローンＤＲＥＧ－５６）及びＣＤ１６－ＢＶ５１０（３Ｇ８）を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)から取得した。
ヒトＣＤ５６－ＡＰＣＶｉｏ７７０／ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１９６）、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ１５９ｃ）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ２０５）、ＫＬＲＧ１－ＰＥ（クローンＲＥＡ２６１）、ＣＤ１５８ｅ／ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ９７０）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３）－ＡＰＣ（クローンＤＸ２７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７９７）、ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａ）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１０）、ＣＤ９４－ＰＥ（クローンＲＥＡ１１３）、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１１６３）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）－ＰＥＶｉｏ７７０（クローンＲＥＡ１０４０）及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）に対する抗体を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。抗ヒトＣＤ７－ＰＥ（クローンＭＴ７０１）、ＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン９Ｅ２／ＮＫｐ４６（９－Ｅ２））及びＣＤ６２Ｌ－ＢＶ４２１（クローンＭ－Ｔ７０１）を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から取得した。抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１／ＢＶ５１０（ＵＣＨＴ１）を、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。抗ヒトＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）－ＢＶ４２１（クローンＤＲＥＧ－５６）及びＣＤ１６－ＢＶ５１０（３Ｇ８）を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)から取得した。
【0285】
表面染色のために、細胞を、氷中で１５分間適切な抗体とインキュベートし、洗浄し、次いでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
【0286】
全てのフローサイトメトリーデータを、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０.２，Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ解析中に、全てのゲーティングを、生細胞で行った（７－ＡＡＤ色素の除外により測定される）。
【0287】
形質導入プロトコル
７日間の第１の培養工程の間、ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ヒト（ｈ）サイトカイン：３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下及びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＺｓＧレポータータンパク質をコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで、４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で同じ事前活性化培地中にて６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
７日間の第１の培養工程の間、ＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ヒト（ｈ）サイトカイン：３００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、３００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下及びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の不在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度でＤＬ－４－Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標）（２５μｇ／ｍｌ）でコートしたウェルにて一晩、事前活性化した。事前活性化された細胞を次いで、１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＺｓＧレポータータンパク質をコードするＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスで、４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で同じ事前活性化培地中にて６時間形質導入した。形質導入の６時間後に、形質導入された細胞を、α－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、形質導入培地を、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７を補充したα－ＭＥＭ培地に置き換え、７日までＤＬ－４及びレトロネクチンでコートしたウェルでさらに培養した。
【0288】
第２の工程は、ＮＫ細胞を生成するために、ヒトサイトカインカクテルを含むがＤＬ－４及びＴＮＦαを含まない、フィーダー細胞のない培養系で第１の工程から得られた前駆細胞（特定の細胞集団のいかなる選別も伴わない全集団）の８日間の培養からなった。第１の培養工程後に得られた前駆細胞を、ＴＮＦ－αの不在下で、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－１２と１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－１８と共に又はなしで、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ)を補充したＲＰＭＩ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、非コートウェル（ＤＬ－４なし）にて８日間培養して、ＮＫ細胞生成物を取得した。
【0289】
結果
ＩＬ－１２及びＩＬ１８と共に又はなしで生成されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＮＫ細胞及びＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞の表現型特性評価は、ＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞が活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１及びＣＤ６２Ｌを発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しないことを示した（表２）。ＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞はまた、抑制性受容体ＣＤ９６及びＮＫＧ２Ａを発現する。さらに、ｈＩＬ－１２及びｈＩＬ１８の存在下で生成されたＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞は、ｈＩＬ－１２及びｈＩＬ－１８なしで生成されたＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞と比較して、より高い割合のＣＤ６２Ｌ（４％に対しそれぞれ１６と１９％）及びＣＤ１６（２２と１５％に対しそれぞれ５０及び４４％）の活性化受容体、並びにより高い割合のＣＤ９４（１６と１３％に対しそれぞれ２６と３０％）及びＮＫＧ２Ａ（１１と１０％に対しそれぞれ２４と２８％）の阻害受容体を発現する（表２）。
ＩＬ－１２及びＩＬ１８と共に又はなしで生成されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＮＫ細胞及びＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（＋ＤＬ－４／＋ＴＮＦ－α曝露）由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞の表現型特性評価は、ＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞が活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１及びＣＤ６２Ｌを発現するが、抑制性受容体ＫＬＲＧ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＬ２を発現しないことを示した（表２）。ＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞はまた、抑制性受容体ＣＤ９６及びＮＫＧ２Ａを発現する。さらに、ｈＩＬ－１２及びｈＩＬ１８の存在下で生成されたＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞は、ｈＩＬ－１２及びｈＩＬ－１８なしで生成されたＮＫ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞と比較して、より高い割合のＣＤ６２Ｌ（４％に対しそれぞれ１６と１９％）及びＣＤ１６（２２と１５％に対しそれぞれ５０及び４４％）の活性化受容体、並びにより高い割合のＣＤ９４（１６と１３％に対しそれぞれ２６と３０％）及びＮＫＧ２Ａ（１１と１０％に対しそれぞれ２４と２８％）の阻害受容体を発現する（表２）。
【0290】
表２：１４日目のｈＩＬ－１２及びｈＩＬ１８と共に又なしで培養したＮＫ細胞とＣＡＲ－ＮＫ細胞の表現型の比較（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】