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特表2024-542158ヒト広域交差反応性インフルエンザモノクローナル抗体及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ヒト広域交差反応性インフルエンザモノクローナル抗体及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/10 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C07K16/10 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/46
C12N15/63 Z
A61K39/395 S
A61P31/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527075
(86)(22)【出願日】2022-11-07
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 US2022049142
(87)【国際公開番号】W WO2023081471
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/276,374
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．Ｌｉｎｕｘ
(71)【出願人】
【識別番号】399052796
【氏名又は名称】デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】524168699
【氏名又は名称】アビロ リミテッド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】マラスコ ウェイン エイ．
(72)【発明者】
【氏名】ラムステット ハンス アーバン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA14
4C085AA16
4C085AA21
4C085BB11
4C085BB36
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のステムドメインへの結合に重要な構造的決定因子、及びこれらの決定因子に基づく高親和性中和インフルエンザウイルス抗体の産生のためのその使用の方法を提供する。本発明は更に、インフルエンザウイルスワクチンの有効性を決定するためのツールを提供する。本発明は更に、対象におけるインフルエンザウイルスワクチンの有効性を決定するのに有用な、又はワクチン若しくはインフルエンザウイルス感染に対する以前の免疫学的曝露若しくは抗原応答性を予測するのに有用な分子シグネチャーを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インフルエンザウイルスを中和する、単離されたモノクローナル抗体であって、ａ．ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びに
ＳＳＮＩＧＧＮＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖；
ｂ．ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びに
ＳＳＮＩＧＧＮＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＮＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖；又は
ｃ．ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びに
ＳＳＮＩＧＸＮＴ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖
を含み、
Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を更に含む、
前記単離されたモノクローナル抗体。
【請求項2】
ａ．配列番号２のＶＨアミノ酸配列及び配列番号４のＶＬアミノ酸配列；又はｂ．配列番号２のＶＨアミノ酸配列及び配列番号６のＶＬアミノ酸配列
を含み、
Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を更に含む、
前記単離されたモノクローナル抗体。
【請求項3】
前記Ｆｃ領域における前記少なくとも１つの変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｓ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＮ２９７Ｑアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項4】
変異した前記Ｆｃ領域が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項5】
Ｘがグリシンではない、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項6】
Ｘがセリンである、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項7】
脱グリコシル化されている、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項8】
前記インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域に結合する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項9】
前記インフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
Ａ型インフルエンザウイルスのグループＩ及びグループＩＩ株を中和する、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
前記ＩｇＧ４が、安定化されたＩｇＧ４を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項13】
治療剤又は診断剤に結合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
前記治療剤が、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、又はサイトカインである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はモザイク抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項16】
請求項１に記載の抗体と、第２の抗原に免疫特異的に結合する抗体とを含む、二重特異性抗体。
【請求項17】
第２の抗原に免疫特異的に結合する前記抗体が、抗Ｂ型インフルエンザＨＡ又は抗Ａ型インフルエンザＮＡを含む、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項19】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、組成物。
【請求項20】
請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体をコードする、核酸配列。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項22】
請求項２１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項23】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、ナノ粒子。
【請求項24】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、前記疾患又は障害に罹患するリスクがある対象に、治療有効量の請求項１若しくは２に記載の抗体、又は請求項１９に記載の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項25】
前記対象に抗ウイルス剤を投与する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記抗体又は組成物が、前記対象に静脈内投与される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２７６，３７４号からの優先権の利益を主張する国際出願であり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付時点での当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照により本出願に組み込まれる。
【0003】
本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に表れているような特許文書又は特許開示をいかなる者がファクシミリ複製することにも異議はないが、それ以外では、あらゆる全ての著作権を留保する。
【0004】
発明の分野
本発明は、インフルエンザ中和抗体及びその使用方法に関する。
本発明は、インフルエンザ中和抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0005】
発明の背景
インフルエンザパンデミックは、ヒトの健康に対する最大の急性感染脅威の１つである。ワクチン接種は、依然として季節性及びパンデミックインフルエンザ、並びにその合併症を予防する主要な手段のままである。インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対する広域の免疫を誘導する「ユニバーサル」インフルエンザワクチンは、医学研究において長い間求められてきた目標である。ＨＡのステム上の高度に保存された疎水性ポケットに結合するヒト広域中和「ヘテロサブタイプ」抗体（ｓＢｎＡｂ）の最近の発見は、そのようなワクチンを開発するための努力を再燃させた。しかしながら、季節性インフルエンザ若しくはＨ５Ｎ１ワクチンの血清中、又は市販の静脈内免疫グロブリン（intravenous immunoglobulin、ＩＶＩＧ）調製物中には、非常に低濃度のｓＢｎＡｂしか検出されない。
インフルエンザパンデミックは、ヒトの健康に対する最大の急性感染脅威の１つである。ワクチン接種は、依然として季節性及びパンデミックインフルエンザ、並びにその合併症を予防する主要な手段のままである。インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対する広域の免疫を誘導する「ユニバーサル」インフルエンザワクチンは、医学研究において長い間求められてきた目標である。ＨＡのステム上の高度に保存された疎水性ポケットに結合するヒト広域中和「ヘテロサブタイプ」抗体（ｓＢｎＡｂ）の最近の発見は、そのようなワクチンを開発するための努力を再燃させた。しかしながら、季節性インフルエンザ若しくはＨ５Ｎ１ワクチンの血清中、又は市販の静脈内免疫グロブリン（intravenous immunoglobulin、ＩＶＩＧ）調製物中には、非常に低濃度のｓＢｎＡｂしか検出されない。
【0006】
インフルエンザウイルスに対する免疫療法のためのモノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）及び薬物を産生するための継続的な努力が存在する。具体的には、様々なインフルエンザ株の全てを中和する治療化合物の開発に努力が向けられる。現在、この目標を達成することができる少数のｍＡｂのみが報告されている。これらのｍＡｂは、ファージ抗体ライブラリをパニングすることによって、及びワクチン接種されたボランティアからのＢ細胞をスクリーニングすることによって単離された。しかしながら、広域中和インフルエンザ抗体の特徴の理解の増加は、中和インフルエンザ抗体の広域パネルの発見及び産生のためのより合理的な設計アプローチにおいてある特定の構造的決定因子を組み込むのに有用であり得る。
【0007】
したがって、インフルエンザウイルスを広域に中和し得る更なるモノクローナル抗体、及び合理的な設計アプローチを介してそのような抗体の親和性又は有効性を増加させるための方法に対する大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【0008】
本発明の態様は、インフルエンザウイルスを中和する単離されたモノクローナル抗体に向けられる。例えば、インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスである。例えば、本発明の単離されたモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループＩ及びグループＩＩ株を中和する。
【0009】
実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びにＳＳＮＩＧＧＮＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖；ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びにＳＳＮＩＧＧＮＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＮＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖；又はＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＩＳＦＤＧＳＫＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＫＬＰＳＰＹＹＦＤＳＲＦＶＷＶＡＡＳＡＦＨＦＷ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖、並びにＳＳＮＩＧＸＮＴ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＴＮＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及びＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＦ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖、を含み、単離されたモノクローナル抗体は、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を更に含む。実施形態では、Ｘはグリシンではない。実施形態では、Ｘはセリンである。
【0010】
本発明の態様はまた、単離されたモノクローナル抗体であって、当該抗体が、配列番号２のＶＨアミノ酸配列及び配列番号４のＶＬアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２のＶＨアミノ酸配列及び配列番号６のＶＬアミノ酸配列を含み、単離されたモノクローナル抗体が、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を更に含む、単離されたモノクローナル抗体にも向けられる。例えば、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｓ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＮ２９７Ｑアミノ酸置換を含む。例えば、変異したＦｃ領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換を含む。
【0011】
実施形態では、抗体は、脱グリコシル化されている。
【0012】
実施形態では、抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域に結合する。
【0013】
実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。例えば、ＩｇＧ４は、安定化されたＩｇＧ４を含む。
【0014】
実施形態では、抗体は、治療剤又は診断剤に連結される。例えば、治療剤は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、又はサイトカインである。
【0015】
実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はモザイク抗体を含む。
【0016】
本発明の態様は、多重特異性抗体にも向けられる。例えば、多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。例えば、二重特異性抗体は、第１の抗原に結合する本明細書に記載の抗体と、第２の抗原に免疫特異的に結合する抗体とを含む。例えば、第２の抗原に免疫特異的に結合する抗体は、抗Ｂ型インフルエンザＨＡ又は抗Ａ型インフルエンザＮＡを含む。
【0017】
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体を産生する細胞にも向けられる。
【0018】
より更に、本発明の態様は、本明細書に記載の抗体、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む組成物に向けられる。
【0019】
更なる態様は、本明細書に記載の単離されたモノクローナル抗体をコードする核酸配列、その核酸配列を含むベクター、及び／又はそのベクターを含む細胞に向けられる。
【0020】
また、本発明の態様は、本明細書に記載の抗体を含むナノ粒子にも向けられる。
【0021】
本発明の態様は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患又は障害を予防又は治療する方法に向けられる。実施形態では、本方法は、当該疾患又は障害に罹患するリスクがある対象に、治療有効量の本明細書に記載の抗体又はそれを含む組成物を投与する工程を含む。実施形態は、対象に抗ウイルス剤を投与する工程を更に含むことができる。実施形態では、抗体又は組成物は、対象に静脈内投与される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】ヒト記憶Ｂ細胞レパートリーからのインフルエンザウイルスに対する広域中和Ａｂの単離を示す概略図である。代表的な蛍光標識細胞選別（fluorescence-labeled cell sorting、ＦＡＣＳ）データも提示する。ＦＡＣＳデータは、全ＰＢＭＣから単離されたＨ３反応性記憶Ｂ細胞の頻度を示す。
【図1B】アミノ酸配列に基づくＡ型インフルエンザウイルスの１８個のＨＡサブタイプの系統発生ツリーを示す。グループ１のサブタイプ及びグループ２のサブタイプを概略図に示す。アミノ酸距離スケールバーは、０．１の距離を示す。
【図2-1】図２は、広範囲のグループ１及びグループ２のＨＡへの３Ｉ１４結合を示す一連のＦＡＣＳグラフである。２９３Ｔ細胞を異なるＨＡ発現プラスミドで一過的にトランスフェクトし、続いて精製ｓｃＦｖＦｃ抗体及びＡＰＣ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体で染色した。３Ｉ１４（赤色の線）、Ｆ１０（グループ１に特異的、緑色の線）、ＣＲ８０２０（グループ２に特異的、青色の線）、ＦＩ６ｖ３（グループ１及び２に特異的、紫色の線）、ＣＲ９１１４（グループ１及び２に特異的、オレンジ色の線）、及び無関係なｍＡｂ Ｆｍ－６（抗ＳＡＲＳウイルス、灰色で塗られたヒストグラム）の結合をフローサイトメトリーによって分析した。
【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、グループ１（赤色）又はグループ２（青色）のサブタイプの代表である組換えＨＡへの３Ｉ１４ ＩｇＧ１（Ａ）結合（Ｋｄ値）又はｓｃＦｖＦｃ Ａｂ（Ｂ）結合（Ｋｄ値）を示す一連のグラフである。
【図4】図４Ａ及び図４Ｂは、グループ１（赤色）又はグループ２（青色）のサブタイプの感染性ウイルスの３Ｉ１４ ＩｇＧ１中和（Ａ）（ＩＣ５０値）又は３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃ Ａｂ中和（ＩＣ５０値）を示す一連のグラフである。３Ｉ１４は、四角で表し、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０は、三角形で表した。ＩＣ５０値に使用されるグラフは、２～３回の独立した実験の中和力価を平均することによって決定した。
【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、グループ１又はグループ２のサブタイプを代表する偽ウイルスの３Ｉ１４ ＩｇＧ１中和（Ａ）（ＩＣ５０値）又は３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃ中和（Ｂ）（ＩＣ５０値）を示すグラフである。これらのデータは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を表す。図５Ｂでは、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０ ｓｃＦｖＦｃを参照のために使用した。
【図6A-1】図６Ａは、インフルエンザウイルスに曝露され、精製ＩｇＧを５、２０、又は２５ｍｇの濃度のうちの１つで腹腔内投与されたマウスの生存率（Ａ）を示す一連のグラフである。図６Ｂは、インフルエンザウイルスに曝露され、示される特定の抗体濃度を投与されたマウスにおける体重組成の変化を示す一連のグラフである。これらのアッセイのために、５匹のマウスのグループを、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９、Ｈ７Ｎ９－ＡＨ１３、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７、又はＨ５Ｎ１－ＶＮ０４インフルエンザウイルス（約１０ＬＤ５０）のｉ．ｎ．接種による致死チャレンジの２４時間前に腹腔内に与えられた２０／２５又は５ｍｇ／ｋｇ用量の精製ＩｇＧで処置した。ｂｎＡｂ ３Ｉ１４（赤色）及びグループ１の対照ｍＡｂ Ｆ１０（黒色）で処置したマウスの（ａ）生存（％）及び（ｂ）体重変化（％）。
【図7】抗体なし、３Ｉ１４、又はＦｍ－６（ＩｇＧ１対照）を使用したトリプシン切断阻害アッセイからの結果を示すゲルである。このアッセイのために、０．４μｇの組換えＨ３－ヒスチジン（Ｈ３－ＢＲ０７）を、２．５μｇの３Ｉ１４若しくはＦｍ－６ ＩｇＧ１の存在下、又は抗体の非存在下で、１００μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ－ｕｌｔｒａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有するｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、３７℃でインキュベートした。トリプシン消化は、１％ＢＳＡの添加によっていくつかの時点で阻害された。試料を１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ＨｉｓＰｒｏｂｅ－ＨＲＰ抗体を使用してブロットした。
【図8】３Ｉ１４ ＩｇＧ１が、表面発現されたＨ３－Ａ２６８及びＨ３－ＢＲ０７上での低ｐＨ誘発性立体構造再配置を防止したことを示す一連の概略図及びグラフである。表面発現されたＨ３の立体構造再配置を、３Ｉ１４（黒棒）及びヘッド結合対照ｍＡｂ Ｅ７３０（白棒）のＦＡＣＳ染色によって検出した。結合は、未処置ＨＡ（ＨＡ０）への結合のパーセンテージとして表される。この抗体阻害アッセイのために、切断されたＨＡをｐＨ４．９に曝露する前に、ｍＡｂなしで、３Ｉ１４で、又は対照Ａｂ、Ｆｍ－６ ＩｇＧ１でＨ３を事前処置した。データは、３つの独立した実験の平均＋ＳＤを表す。
【図9A】図９Ａ及び図９Ｂは、３Ｉ１４が抗体依存性細胞傷害（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を媒介することを実証する。図９Ａは、ＡＤＣＣベースのアッセイの結果を示すグラフである。３Ｉ１４並びに他の抗ステムｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０は、Ｈ３及びＨ５発現された２９３Ｔ細胞においてＡＤＣＣを誘導した。これらのアッセイのために、１×１０４個／ウェルのＨ３又はＨ５発現された２９３Ｔ細胞をアッセイ前にプレートに付着させ、次いで培地を低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液（０．５％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）と交換した。異なるｂｎＡｂを５、１、０．２、及び０．０４μｇ ｍｌ－１の濃度で各ウェルに添加した。１時間後、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を６．０×１０４個の細胞／ウェルで低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液中のアッセイプレートに添加し、６時間インキュベートした。上清を回収し、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。図９Ｂは、３Ｉ１４並びに他の抗ステムｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０がＨ３及びＨ５発現された２９３Ｔ細胞においてＡＤＣＣを誘導したことを示す一連のグラフである。２×１０４個／ウェルのＨ３又はＨ５発現された２９３Ｔ細胞をアッセイ前にプレートに付着させ、次いで培地を低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液（０．５％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）と交換した。異なるｂｎＡｂを１０、５、２．５、及び１．２５μｇ ｍｌ－１の濃度で各ウェルに添加した。１時間後、ＰＢＭＣを１．２×１０５細胞／ウェルで低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液中のアッセイプレートに添加し、６時間インキュベートした。上清を回収し、ＬＤＨ細胞傷害性分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。実験を３回行い、同様の結果が得られた。データは、１つの独立した実験の代表であり、１つのグループ当たり３回反復した。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｆは、Ｈ３又はＨ５への他の抗ステムｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０の結合のために３Ｉ１４が交差競合することを示す一連のグラフである。これらのアッセイのために、５μｇ／ｍｌのＨ３－ＢＲ０７又はＨ５－ＶＮ０４タンパク質をＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、８０ｎＭ～０．３ｎＭの濃度範囲の３Ｉ１４ Ｆａｂの２倍連続希釈物とともにインキュベートし、これらを５ｎＭの他のｓｃＦｖＦｃ Ａｂと更に混合した。ｓｃＦｖＦｃ Ａｂの結合を、ＨＲＰコンジュゲートされた抗ヒトＣＨ２抗体を使用して検出した。
【図11-1】図１１は、３Ｉ１４及び他の生殖系列重鎖（Ａ、Ｃ）又は軽鎖領域（Ｂ、Ｄ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。対応するＶ、Ｄ、及びＪ配列を、ＩＭＧＴデータベースを使用して決定し、比較のために示す。
【図12A】図１２Ａ及び図１２Ｂは、３つのＶＨ３－３０ ＢｎＡｂ、３９．２９（４ＫＶＮから）、ＦＩ６（３ＺＴＪから）、及びＭａｂ３．１（４ＰＹ８）との３Ｉ１４モデルの重ね合わせを示す一連の概略図である。重鎖及び軽鎖、並びに３Ｉ１４抗体の重鎖ＣＤＲの相対的な配置を示すタンパク質モデルの概略図を示す。重鎖は、緑色で示され、軽鎖は、灰色で示される。図１２の重鎖ＣＤＲは、以下のように色分けされている：３Ｉ１４ ＨＣＤＲは青色であり、他のＢｎＡｂのＨＣＤＲ１は赤色であり、ＨＣＤＲ２はマゼンタであり、ＨＣＤＲ３はシアンである。ｂｎＡｂは、リボン描写で表示される。図１２Ｂにおいて、重鎖は青色であり、軽鎖はシアンである。ＨＣＤＲ３は、赤色の３Ｉ１４、マゼンタのＦＩ６ｖ３、黄色の３９．２９、及び緑色のＭＡｂ ３．１で強調されている。
【図13A】図１３Ａ～図１３Ｄは、３Ｉ１４のモデリング及びＨ３／Ｈ５とのドッキングを示す一連の概略図である。Ｈ３三量体モデルのストーク上の３Ｉ１４エピトープ構造を図１３Ａに示す。図１３Ｂは、ＨＡを有するＩＧＶＨ３－３０由来のｂｎＡｂの複合体構造を示す。ＨＡ上のエピトープ残基は、表面描写で示され、ｂｎＡｂのＣＤＲループは、リボンとして示される。ＨＡモノマーのＨＡ１はウィートで、ＨＡ２はサーモンで、エピトープ残基は赤色でラベル付けされている。重要な残基Ｌ３８及びＫ３９は、黄色に色付けされている。ｂｎＡｂの重鎖ＣＤＲは青色であり、軽鎖ＣＤＲはシアンである。３Ｉ１４を、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅにおいて抗体モデリングモジュールを使用して相同性モデリングし、モデルを、ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋとドッキングする前にＨ３／ＦＩ６ｖ３複合体構造に重ね合わせた。他の３つのＩＧＨＶ３－３０ ｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、３９．２９、及びＭＡｂ ３．１は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋからダウンロードした。図１３Ｃは、３Ｉ１４中のＤ９４とＨ３／Ｈ５との相互作用を示す。Ｈ３はシアンで示され、Ｋ３９はスティックとして示され、Ｈ５は緑色で示され、Ｅ３９はスティックで示され、３Ｉ１４は、Ｈ３／３Ｉ１４モデルにおいてオレンジ色で示され、Ｈ５／３Ｉ１４モデルにおいて黄色で示され、Ｄ９４はスティックとして示される。図１３Ｄは、Ｈ３／３Ｉ１４複合体モデルにおけるＨ３と３Ｉ１４軽鎖のＧ３１との相互作用を示す。Ｈ３のＨＡ２ドメインのヘリックスＡは、シアンのリボンとして示され、３Ｉ１４の軽鎖は、オレンジ色のリボンとして示され、Ｇ３１の主鎖原子は、スティックで示され、Ｈ３ ＨＡ２のＱ４２及びＤ４６の側鎖原子は、スティックで示され、Ｇ３１とＨ３との間の距離は、緑色の破線によって示され、黒色でラベル付けされている。（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．９９ ｒｃ６ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）。
【図15A】図１５Ａ～図１５Ｆは、組換えＨ５－ＶＮ０４（Ａ）及びＨ３－ＰＥ０９（Ｂ）に結合する３Ｉ１４ ＷＴ及びＶＬＤ９４Ｎ ＩｇＧ１バリアントのＫｄ結合値を示すグラフ及び表である。緑色又は青色の曲線は、バイオレイヤー干渉法実験から得られた実験トレースであり、赤色の曲線は、Ｋｄ値を計算するために使用されるデータに対する最良の全体的適合である。結合曲線についての親和性測定値（Ｋｄ値）を表４に報告する。３Ｉ１４ ＷＴは、１．１５ｎＭのＫｄ値で精製Ｈ５－ＶＮ０４に結合したが、３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎ変異体は、０．１９ｎＭで、１０倍高い親和性でＨ５－ＶＮ０４に結合した。図１５Ｃ～図１５Ｆは、組換えＨａへの３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃ結合を示す一連のグラフである。
【図16-1】図１６Ａ～図１６Ｄは、偽型ウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４及び感染性ウイルスＨ３Ｎ２－ＢＲ０７とのインキュベーション後の３Ｉ１４ ＷＴ及びＶＬＤ９４Ｎ変異体ＩｇＧ１の中和値を示す一連のグラフである。図１６Ｃ及び図１６Ｄに示されるように、３Ｉ１４（黒色）及びＶＬＤ９４Ｎバリアント（赤色）は、偽型ウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４（Ｃ）及びＨ３Ｎ２－ＢＲ０７ウイルス（Ｄ）を中和した。このデータは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を表す。
【図17-1】図１７は、３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃ Ａｂがインフルエンザウイルス感染及びＨＡ偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスを中和したことを示す一連のグラフである。ｍＡｂ ３Ｉ１４（黒色）及び抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０（赤色）は、感染性ウイルス及び偽型ウイルスの異なる株を中和した。データは、２～３回の独立した実験からの平均中和力価を表す。
【図18】Ｈ５への操作された３Ｉ１４酵母－ＣＤＲライブラリの結合と比較した３Ｉ１４－ＷＴ酵母の結合を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。３Ｉ１４酵母－ＣＤＲライブラリを、Ｈ５への結合を増加させるバリアントについて酵母ディスプレイを使用して操作した。
【図19】組換えＨ３－ＰＥ０９の全長又はＨＡ１への３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃ Ａｂ結合を示すグラフである。
【図20-1】図２０は、組換えＨ１、Ｈ３、及びＨ５への３Ｉ１４ ＩｇＧ１バリアントの結合を示す一連のグラフである。青色の曲線は、バイオレイヤー干渉法実験から得られた実験トレースであり、赤色の曲線は、表７に示されるＫｄを計算するために使用されるデータに対する最良の全体的適合である。
【図21】３Ｉ１４ ＬＡＬＡと３Ｉ１４とのインビトロでの比較を示す。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ、３Ｉ１４、及び対照についてのウイルス力価（Ｌｏｇ１０）のグラフ。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４ ｍＡｂによるＡ型インフルエンザ／ＰＲ８／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）の中和を示す。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は３Ｉ１４（０．１μｇ ｍＡｂ）を、ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞を使用する中和アッセイにおいて比較した。
【図22】ＢＡＬＢ／ｃ Ｈ１Ｎ１マウスモデルにおける３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４有効性のグラフを示す。Ａ型インフルエンザ／Texas／３６／１９９１（Ｈ１Ｎ１）での鼻腔内チャレンジの１時間前に腹腔内注射を介した３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は３Ｉ１４を有するＢＡＬＢ／ｃマウスについての用量反応曲線を示す。
【図23】マウスにおけるインフルエンザＡＤＥ研究を示す。マウスにおけるインフルエンザ抗体依存性感染増強研究における３Ｉ１４（左）及び３Ｉ１４ ＬＡＬＡ（右）における肺ウイルス負荷対用量のグラフ。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ型インフルエンザ／Texas／３６／１９９１（Ｈ１Ｎ１）での鼻腔内チャレンジの１時間前に、腹腔内注射を介して３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は３Ｉ１４で処置した。チャレンジ後４日目に、肺を収集し、均質化し、ウイルスレベルを２つの独立した研究におけるプラークアッセイによって定量し、３Ｉ１４（左）又は３Ｉ１４ ＬＡＬＡ（ＬＡＬＡを有する、右）を対照と比較した。
【図24】マウスにおけるインフルエンザＨ１Ｎ１に対する３Ｉ１４ ＬＡＬＡの予防的（左）及び治療的（右）防御についての、生存（％）対曝露後日数のグラフを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ型インフルエンザ／Texas／３６／１９９１での鼻腔内チャレンジの１時間前（左）又は２４時間後（右）のいずれかに、腹腔内注射を介して３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は対照で処置し、１４日間観察した。１４日間の観察後の生存結果を示す。
【図25】マウスにおけるインフルエンザＨ３Ｎ２に対する３Ｉ１４ ＬＡＬＡ予防的（左）及び治療的（右）防御についての、生存（％）対曝露後日数のグラフを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ型インフルエンザ／Hong Kong／１／１９６８での鼻腔内チャレンジの１時間前（左）又は２４時間後（右）のいずれかに、腹腔内注射を介して３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又はＰＢＳ対照で処置した。１４日間の観察後の生存結果を示す。
【図26】３Ｉ１４ ＬＡＬＡによるＩＮＦＶ－Ａ Ｈ５Ｎ１に対する予防的防御を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でチャレンジする前に、１０、２５、４０ｍｇ ｋｇ－１の３Ｉ１４ ＬＡＬＡ用量で処置した。生存曲線を示す。カプラン・マイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。
【図27】３Ｉ１４ ＬＡＬＡによるＩＮＦＶ－Ａ Ｈ５Ｎ１に対する治療的防御を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でのチャレンジの２４時間後に、１０、２５、４０ｍｇ ｋｇ－１の３Ｉ１４ ＬＡＬＡ用量で処置した。生存曲線を示す。カプラン・マイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な説明
本発明は、修飾されたＦｃ領域を含む改良されたヒトインフルエンザモノクローナル抗体を発見し、その結果、改良された抗体は、Ｆｃガンマ受容体に結合しない（したがって、エフェクター機能を排除する）が、依然としてインフルエンザに対する有効性を保持する一方で、抗体依存性感染増強を防止する。例えば、ｍＡｂ ３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、インフルエンザに対する有効性を保持する一方で、抗体依存性感染増強を防止する。Ｆｃを修飾することがインフルエンザに対する有効性の喪失をもたらすということが一般に予想されたので、この知見は予想外であった。ＤｉＬｉｌｌｏ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．「Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓｔａｌｋ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ＦｃγＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．」Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０．２（２０１４）：１４３－１５１、Ｖａｎｄｅｒｖｅｎ，Ｈｉｌｌａｒｙ Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．Ｋｅｎｔ．「Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｆｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９８．４（２０２０）：２５３－２６３を参照されたい。）
本発明は、修飾されたＦｃ領域を含む改良されたヒトインフルエンザモノクローナル抗体を発見し、その結果、改良された抗体は、Ｆｃガンマ受容体に結合しない（したがって、エフェクター機能を排除する）が、依然としてインフルエンザに対する有効性を保持する一方で、抗体依存性感染増強を防止する。例えば、ｍＡｂ ３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、インフルエンザに対する有効性を保持する一方で、抗体依存性感染増強を防止する。Ｆｃを修飾することがインフルエンザに対する有効性の喪失をもたらすということが一般に予想されたので、この知見は予想外であった。ＤｉＬｉｌｌｏ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．「Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓｔａｌｋ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ＦｃγＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．」Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０．２（２０１４）：１４３－１５１、Ｖａｎｄｅｒｖｅｎ，Ｈｉｌｌａｒｙ Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．Ｋｅｎｔ．「Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｆｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９８．４（２０２０）：２５３－２６３を参照されたい。）
【0024】
Ａ型インフルエンザは、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、１０個のタンパク質をコードする８セグメントゲノムを有する。それは、ヌクレオカプシド及びマトリックスタンパク質の抗原性によって定義されるようなインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、及びＣ型の属を含むオルトミクソウイルス科に属する。一般に、Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒトにおけるより重篤な疾患に関連する。Ａ型インフルエンザウイルスは更に、２つの表面タンパク質、細胞侵入のためにビリオンを宿主細胞に付着させる赤血球凝集素（hemagglutinin、ＨＡ）、及び子孫ウイルス又は細胞表面に付着した宿主シアル酸を切断することによって子孫ウイルスの拡散を促進するノイラミニダーゼ（neuraminidase、ＮＡ）によってサブタイプ化される。
【0025】
１６個のＨＡサブタイプ及び９個のＮＡサブタイプが存在し、これらは、ＨＡ及びＮＡの様々な組合せによってＡ型インフルエンザウイルスの全てのサブタイプを構成する。１６個のＨＡ及び９個のＮＡウイルスサブタイプの全ての組み合わせは、水鳥において見られる。トリＡ型インフルエンザウイルスの数百の株のうち、４つのみがヒト感染を引き起こしたことが知られている（Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７及びＨ９Ｎ２）。一般に、これらのウイルスによるヒト感染は、症状軽快及び非常にわずかな重症疾患をもたらし、Ｈ７Ｎ７によって引き起こされた肺炎の１つの致死的症例のみが存在した。しかしながら、例外は非常に病原性の高いＨ５Ｎ１ウイルスであり、これに対して、ヒトにおいて自然免疫は存在しない。ＲＮＡポリメラーゼの非忠実度（infidelity）及び宿主免疫の選択圧は、これらのタンパク質の変異の蓄積及び表面抗原性の変化をもたらし得る。この抗原性変化は、抗原ドリフトと呼ばれる。加えて、そのセグメント化されたゲノムの結果として、Ａ型インフルエンザウイルスの２つの異なるサブタイプが同じ細胞に感染する場合、遺伝子セグメントのシャッフリングが起こり得る。例えば、ヒトＨ３Ｎ２ウイルス及びトリＨ５Ｎ１ウイルスがヒト又は哺乳動物種の他のメンバーに同時感染する場合、そのような事象は、新規Ｈ５Ｎ２を産生し得る。ほとんどの遺伝子セグメントの全てがヒトウイルスに由来するので、この新規ウイルスは、次いでヒトからヒトへ効率的に伝達され得る。そのような遺伝子再集合は、大きな抗原変化、いわゆる抗原シフトをもたらし、これは、世界人口の大部分が再集合体ウイルスに対する中和抗体を全く有していないことを意味するであろう。そのような状況は、インフルエンザＨ５Ｎ１肺炎の高い死亡率と相まって、公衆衛生の分野で最も恐れられているシナリオのうちの１つである。
【0026】
インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスの最も可変的な抗原であり、細胞へのウイルス侵入に関与する。これは、三量体前駆体ポリペプチドＨＡ０として合成され、これは、翻訳後に切断されて、単一のジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチドＨＡ１及びＨＡ２になる。ＨＡのＨＡ１鎖は、細胞表面へのウイルスの付着に関与する。ＨＡ２は、エンドソームにおけるウイルス及び細胞膜の融合を媒介し、リボヌクレオタンパク質複合体の細胞質への放出を可能にする。ＨＡ１とは対照的に、ＨＡ２分子は、ＨＡの比較的保存された部分を表す。第２の免疫原性インフルエンザタンパク質は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。この四量体糖タンパク質は、プロデューサー細胞上の表面シアル酸からのビリオンの放出に関与し、気道における標的細胞への接近を促進する役割も有し得る。ＮＡに対する中和抗体は動物及びヒトにおいて防御的であるが、それらの作用メカニズムに関するデータは不足している。Ｎ１ノイラミニダーゼの結晶構造に関する最近の報告は、抗体を含む新しい抗インフルエンザ薬を開発するために利用され得る、その活性部位に隣接する空洞の存在を実証した。この知見は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するオセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）に対する薬物耐性の出現の報告を考慮すると、特に重要である。
【0027】
２０年以上前に、Ｈ３サブタイプのＨＡは、抗原ドリフトバリアント及びエスケープ変異体のＨＡを配列決定することによって特徴付けられ、抗原エピトープは、ＨＡの三次元構造上にマッピングされた。それ以来、トリ病原性ウイルスのＨ１、Ｈ２、及びＨ５上の抗原部位が、Ｈ３の三次元構造上にマッピングされた。１９９７年に香港でヒトにＨ５Ｎ１感染が発生し、１９９９年にヒト症例からＨ９Ｎ２ウイルスが単離された後、両方のタンパク質のＸ線構造が解明された。しかしながら、構造を解明するために使用された１９９７ブタ単離物（Ａ／Duck／Singapore／３／９７）、及びより最近単離された高病原性株の抗原ドリフトは、重要である。実際、ブタ単離物（Ａ／Duck／Singapore／３／９７）とＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１株（Ａ／Vietnam１２０３／０４）との間には２８個の小さな変化及び２つの潜在的に大きな変化がある。
【0028】
２００４～２００５年の大発生からのＨ５ ＨＡ遺伝子の系統発生分析は、クレード１及び２と呼ばれるＨＡ遺伝子の２つの異なる系統を示した。ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１株（Ａ／Vietnam１２０３／０４）は、クレード１のメンバーである。これらのクレードの各々におけるウイルスは、アジアの重複しない地理的領域に分布している。インドシナからのＨ５Ｎ１ウイルスは、クレード１内に密にクラスター化されているが、いくつかの周辺国から単離されたＨ５Ｎ１は、クレード１単離物とは異なり、より多様なクレード２に属する。クレード１ウイルスは、ベトナム、タイ、及びカンボジアのヒト及びトリから単離されたが、ラオス及びマレーシアのトリからのみ単離された。クレード２ウイルスは、中国、インドネシア、日本、及び韓国のトリから独占的に単離されたウイルスにおいて見られた。最近の疫学的研究では、インドネシア及びベトナム全体の家禽から単離された８２個のＨ５Ｎ１ウイルス、並びに南部ベトナムからの１１個のヒト単離物を、公的データベースで入手可能な配列データとともに分析して、ウイルス導入、内因性、及び進化に関連する問題に取り組んだ３６。系統発生分析は、インドネシアからの全てのウイルスが、Ｈ５Ｎ１遺伝子型Ｚウイルスの別個のサブ系統を形成することを示し、この大発生が、過去２年間の国全体にわたる拡散を介した単一の導入から生じた可能性が高いことを示唆した。インドネシアにおける継続的なウイルス活動は、トリの移動による反復導入によるのではなく、国内での家禽の移動を介する伝染に起因した。インドネシア及びベトナム内で、Ｈ５Ｎ１ウイルスは、時間の経過とともに各国内の地理的に異なる群に進化してきた。
【0029】
最近、Ａ／Vietnam１２０３／４からのＨＡの構造が解明された。そのアミノ酸配列と、クレード１及び２ウイルスからのＨＰＡＩ ２００４及び２００５単離物からのＨＡ遺伝子との比較により、主に受容体結合ドメインの周りにクラスター化され、残りは前庭エステラーゼドメイン内にある抗原変異の１３個の位置が識別された。抗原変異の領域は、Ｈ１及びＨ３血清型において識別されている。Ｈ１については、これらの部位は、Ｓａ、Ｓｂ、Ｃａ、及びＣｂと称され、Ｈ３については、部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称される。Ｈ５ ＨＡのエスケープ変異体は、以下の３つのエピトープにクラスター化することができる；部位１：Ｈ３の抗原部位Ａ及びＨ２のＣａ２と重複する露出ループ（ＨＡ１ １４０～１４５）、部位２：Ｈ３血清型における抗原部位Ｂに対応するＨＡ１残基１５６及び１５７、並びに３）Ｈ１ ＨＡ及びＨ９血清型におけるＳａ部位に制限されるＨＡ１ １２９～１３３。Ｓｍｉｔｈによる最近の研究において、アミノ酸レベルでのポジティブ選択の検出は、ＨＡタンパク質中の８つの残基がポジティブ選択下にあったことを示した。これらの残基には、抗原部位Ａ及びＥ（８３、８６、１３８、１４０、及び１４１位）における５つ、受容体結合に関与する２つ（１２９位及び１７５位）が含まれ、１５６位は、受容体結合部位の近くにある潜在的なＮ結合型グリコシル化のための部位である。結果は更に、ＨＡ中の３つの残基（Ｖａｌ ８６、Ｓｅｒ １２９、及びＴｈｒ １５６）がニワトリ又はアヒル単離物よりもヒト単離物においてより頻繁に観察され、おそらくヒトへのＨ５Ｎ１遺伝子型Ｚの初期適応を表すことを明らかにした。これらの研究からの別の重要な知見は、インドネシア亜系統とベトナム亜系統との間の系統発生的差異が、これらの２つのウイルス群の間の抗原交差反応性における著しい差異にも反映されたことである。具体的には、インドネシアからのウイルスは、Ａ／Vietnam１２０３／０４に対するフェレット抗血清と反応せず、ベトナムからの代表的なウイルスは、インドネシアウイルスＩＤＮ／５／０６及びＤｋ／ＩＤＮ／ＭＳ／０４に対するフェレット抗血清と反応しなかった。これらの知見は、これらの株が系統発生的に異なるだけでなく抗原的にも異なるという、免疫ヒト血清並びにヒト１９９７及び２００３ Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いた以前の研究と一致する。したがって、天然のバリエーション並びにエスケープ変異体は、ウイルスの継続した進化が、どの株が受動免疫及び能動免疫化のために使用されるべきかについての決定に影響を与えるはずであることを示唆する
【0030】
ｓｃＦｖ及びモノクローナル抗体の識別及び特徴付け
高親和性、クロスサブタイプ、広域中和ヒト抗ＨＡ ｍＡｂが識別されている。抗原特異的記憶Ｂ細胞を、四量体化Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／２００７）赤血球凝集素（ＨＡ）三量体を使用してヒトＰＢＭＣから単離した。Ｈ３反応性単一記憶Ｂ細胞をプレートに選別し、インビトロで刺激した。選別されたＢ細胞の４０％以上が、１４日後に、上清中に平均２００ｎｇ／ｍｌのＩｇＧを産生した。拡大増殖させたＢ細胞からの上清を、それらのヘテロサブタイプ結合特異性及び中和活性について、ＭＳＤ又は高感度中和アッセイによって測定した。選択的クローンからの抗体遺伝子を、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって回収した。
高親和性、クロスサブタイプ、広域中和ヒト抗ＨＡ ｍＡｂが識別されている。抗原特異的記憶Ｂ細胞を、四量体化Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／２００７）赤血球凝集素（ＨＡ）三量体を使用してヒトＰＢＭＣから単離した。Ｈ３反応性単一記憶Ｂ細胞をプレートに選別し、インビトロで刺激した。選別されたＢ細胞の４０％以上が、１４日後に、上清中に平均２００ｎｇ／ｍｌのＩｇＧを産生した。拡大増殖させたＢ細胞からの上清を、それらのヘテロサブタイプ結合特異性及び中和活性について、ＭＳＤ又は高感度中和アッセイによって測定した。選択的クローンからの抗体遺伝子を、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって回収した。
【0031】
７人の個体からの２６８８個の記憶Ｂクローンのスクリーニングを通して、１１％のクローン化可能な記憶Ｂ細胞がＨ３赤血球凝集素と反応性であった。それらの中で、Ｈ３／Ｈ７、Ｈ３／Ｈ７／Ｈ１、及びＨ３／Ｈ７／Ｈ１／Ｂ型インフルエンザヘテロサブタイプ結合集団は、それぞれ１６％、６．９％、及び０．３５％であった。新しい広域中和Ａｂ、３Ｉ１４が識別された。３Ｉ１４は特徴付けられ、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスの両方に対する交差反応性結合及び中和活性を有することが示された。これは、グループ１又はグループ２のＡ型インフルエンザウイルスのいずれかを中和するＦ１０、ＣＲ６２６１、ＭＡｂ ３．１、及びＣＲ８０２０などの他の公知の抗インフルエンザ抗体とは対照的である。抗インフルエンザ抗体ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．３９、ＭＡｂ １．１２、及びＣＴ１４９のみが、グループ１及びグループ２の両方からのヒトＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる。ヒト形質細胞、形質芽細胞、及びＣＤ１３８＋ＨＡ特異的抗体分泌細胞の培養物から単離されたＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．３９、ＭＡｂ １．１２、及びＣＴ１４９とは対照的に、本発明の抗体、例えば、３Ｉ１４は、記憶Ｂ細胞から単離された。ウイルス再感染及びワクチン接種に応答して、長寿命の形質細胞は、中和抗体を産生し、特に元のウイルスをリコールするが、記憶Ｂ細胞は、胚中心に再び入ることによってバリアントウイルスに特異的な高親和性中和抗体を産生することによって寄与する。更に、記憶Ｂ細胞の体細胞変異は、抗体分岐及び選択のサイクルを繰り返すことによって、より高齢の個体において蓄積され得る。したがって、記憶Ｂ細胞は、長寿命の形質細胞よりも広い抗原特異性のレパートリーを有する。記憶Ｂ細胞の安定な集団を開発し、強力なｂｎＡｂ応答を誘発することは、長く持続する広く有効なワクチンにとって必須であると考えられる。したがって、本発明の抗体は、他の公知の抗インフルエンザ抗体よりも大きな治療的有用性を有する。
【0032】
本発明の抗体は、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１４、及びＨ１５）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、及びＨ１６）のＡ型インフルエンザの両方の血清型にわたって表面発現ＨＡに結合する。具体的には、本発明の抗体の結合親和性（Ｋｄ）は、約１ｐＭ～１μＭ、約１ｐＭ～１ｎＭ、又は約１ｎＭ～１μＭである。例えば、抗体は、グループ１（Ｈ１、Ｈ５、及びＨ９）及びグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１７）に対して約１ｐＭ～１μＭの結合親和性を有する。好ましくは、グループ１（Ｈ１、Ｈ５、及びＨ９）及びグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１７）に対する結合親和性Ｋｄは、約０．０１ｎＭ～１０ｎＭである。いくつかの実施形態では、抗体は、グループ２のＡ型インフルエンザウイルスに関して、グループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に対して１ｐＭ～１μＭの結合親和性を有する。好ましくは、グループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に対する結合親和性Ｋｄは、１ｎＭ未満である。
【0033】
具体的には、３Ｉ１４は、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ５、及びＨ９）に属する異なるサブタイプの精製ＨＡタンパク質に０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）で結合し、全ての試験したグループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に高い親和性で結合した（平均Ｋｄ＜０．１ｎＭ）。加えて、３Ｉ１４は、グループ１のＨ１サブタイプ（Ｈ１－ＣＡ０９、Ｈ１－ＳＩ０６、及びＨ１－ＰＲ８）に高い親和性で結合したが、他のグループ１のサブタイプ（Ｈ５－ＶＮ０４、Ｈ５－ＩＮ０５、及びＨ９－ＨＫ９９）に対するその親和性は、より低かった（それぞれ平均Ｋｄ＝１．０２、１．０５、及び５．２３ｎＭ）。Ｈ５インフルエンザウイルスサブタイプに対するこのより低い結合親和性は、ＦＩ６ｖ３及び３９．２９などの以前に記載された他の広域中和抗体とは異なる。
【0034】
本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する。「中和する」又は「中和」とは、ウイルス粒子への抗体の結合によってウイルス感染性の低減を引き起こし、したがってウイルスにコードされた転写又は合成に先行するウイルスの複製サイクルにおける段階を遮断することを意味する。抗体は、様々なメカニズムによってウイルスを中和することができ、例えば、抗体は、受容体へのビリオン結合に干渉することによってウイルスを中和し、細胞への取り込みを遮断し、エンドソームにおけるゲノムの脱外被を防止することができるか、又はウイルス粒子を凝集させるか、若しくは溶解させることができる。
【0035】
本発明の抗体は、グループ２及びグループ１のＡ型インフルエンザウイルスの両方の血清型にわたって中和する。本発明の抗体は、約０．００１～５μｇ／ｍＬ－１、約０．００１～４μｇ／ｍＬ－１、又は約０．００１～３μｇ／ｍＬ－１の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。好ましくは、抗体は、約０．０３～２μｇ／ｍＬ、約０．０３～１．０μｇ／ｍＬ－１のＩＣ５０を有する。更により好ましくは、抗体は、約０．００１～０．５μｇ／ｍＬ－１、約０．００１～０．０５μｇ／ｍＬ－１、又は約０．００１～０．０３μｇ／ｍＬ－１のＩＣ５０を有する。更により好ましくは、抗体は、約０．０１～０．５μｇ／ｍＬ－１、約０．１～０．５μｇ／ｍＬ－１、及び約０．２～０．５μｇ／ｍＬ－１のＩＣ５０を有する。好ましくは、抗体は、約０．０５～０．００８μｇ／ｍＬ－１、約０．０４～０．００８μｇ／ｍＬ－１のＩＣ５０を有する。最も好ましくは、抗体は、約０．０３～１．０８μｇ／ｍＬ－１、約０．００７～０．０２７μｇ ｍｌ－１、約０．２２５～０．４１３μｇ ｍｌ－１、又は約０．０４０～０．００８μｇ ｍｌ－１のＩＣ５０を有する
【0036】
特に、本発明の抗体は、グループ２のウイルス（例えば、Ｈ３、Ｈ７、Ａ／Wisconsin／６７／０５（ＨＡ、ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４、及びＡ／Aichi／２／６８（ＨＡ、ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４、及びＨ７Ｎ９－ＡＨ１３）を中和する。本発明の抗体はまた、偽ウイルスＨ７Ｎ１－ＦＰＮ及びＨ７Ｎ１－ＮＬ２１９株を中和する。加えて、本発明の抗体は、グループ１のＨ１株（Ｈ１－ＣＡ０９及びＨ１－ＰＲ８）並びに偽ウイルスＨ５－ＶＮ０４及びＨ５－ＨＫ９７を中和する
【0037】
本発明の抗体は、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスの両方に対してインビボで予防的有効性を有する。本発明の抗体は、ウイルス感染に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の予防的防御を提供する。具体的には、本発明の抗体は、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９又はＨ７Ｎ９－ＡＨ１３チャレンジから完全に防御し、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７チャレンジに対して８０％防御し、Ｈ５Ｎ１－ＶＮ０４チャレンジに対して６０％防御する。
【0038】
本発明の抗体は、未成熟ＨＡ０の切断を防止する。ＨＡ１及びＨＡ２を形成するためにＨＡ０タンパク質が切断されない場合、ウイルス－宿主膜融合は起こり得ない。したがって、切断されていないＨＡを有するインフルエンザウイルスは、感染性ではない。したがって、本発明の抗体は、インフルエンザ感染を遮断するのに有用であり、例えば、タミフルなどの他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用することができる。
【0039】
重要なことに、本発明の抗体は、切断されていないＨＡ前駆体（ＨＡ０）タンパク質、並びに２つの成熟形態ＨＡ１タンパク質及びＨＡ２タンパク質に結合する
【0040】
加えて、本発明の抗体は、低ｐＨで誘発されるＨＡ立体構造再配置を防止する。
【0041】
抗体は、Ｆｃ依存性ウイルスクリアランスを媒介する。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する。代替として、抗体は、インビボ防御のためのＦｃ依存性免疫媒介性メカニズムに関与する。
【0042】
本発明の抗体の可変重鎖は、ＩＧＨＶ３－３０生殖系列遺伝子によってコードされる。抗体の可変軽鎖は、ＩＧＬＶ１－４４生殖系列遺伝子によってコードされる。ＩＧＨＶ３－３０抗体は、ＨＣＤＲ３を使用して、ＨＡ結合に寄与する疎水性コアを形成する。抗体は、例えば、長い相補性決定領域３（complementarity determining region 3、ＨＣＤＲ３）を産生するように、再配置された重鎖を有する。長いＨＣＤＲ３の長さは、約１２～３０個のアミノ酸（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であり得る。好ましい実施形態では、長いＨＣＤＲ３は、約２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、長いＨＣＤＲ３は、ＶＨ接合部及びＩＧＨＪ４＊０２接合部の両方で大きなＮ付加が隣接するＩＧＨＤ３－２２＊０１ ＤＨセグメントを使用する。
【0043】
抗体は、可変重鎖及び／又は可変軽鎖において体細胞変異を有する。可変重鎖における体細胞変異の数は、約２～３０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であり得る。いくつかの実施形態では、可変重鎖における体細胞変異の数は、約１５である。可変軽鎖における体細胞変異の数は、約２～１５（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）であり得る。いくつかの実施形態では、体細胞変異の数は、約７である。
【0044】
エピトープマッピング及び競合アッセイは、ＨＡステムに位置する高度に保存されたエピトープを明らかにした。例えば、本発明の抗体は、配列番号１８に従って番号付けされた場合、ＨＡ２のアミノ酸残基１８、１９、２０、２１、３６、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４９、及び５３によって定義される立体構造エピトープに結合する。代替として、本発明の抗体は、配列番号１８に従って番号付けされた場合、ＨＡ２のアミノ酸残基１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０によって定義される立体構造エピトープに結合する。任意選択で、抗体は、ＨＡ１に結合する。
【0045】
保存されたエピトープ残基配列は、ペプチド残基によって定義される。
【0046】
３Ｉ１４を最適化して、そうでなければ中程度のサブタイプＨＡ株に対するその効力を改善するために、構造ベースの抗体操作が使用されている。３Ｉ１４のこの高親和性バリアントは、本明細書において３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎと称され、アミノ酸９位での３Ｉ１４ ＶＨにおけるアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸置換によって産生された。
【0047】
ＶＬＤ９４Ｌ置換は、Ｈ５への抗体の結合を可能にするか、又は増加させる。Ｈ５に対する結合親和性の増加は、野生型３Ｉ１４と比較して約５～１５倍である。Ｈ５－ＶＮ０４に対する３Ｉ１４ＶＬＤ９４ＮのＫｄは、約０．２ｎＭ未満である。
【0048】
追加の構造ベースの操作は、Ｈ５に対する結合親和性を増加させることができ、具体的には、Ｈ５に対する結合親和性の増加は、ＬＣＤＲ１における残基３１のグリシン（Ｇ）を別のアミノ酸で置換することによって達成される。例えば、残基３１のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）で置換することができる。
【0049】
本発明による中和インフルエンザ抗体の核酸及びアミノ酸配列を以下に示す。
【0050】
（表１Ａ）抗体３Ｉ１４可変領域の核酸配列
【0051】
（表１Ｂ）抗体３Ｉ１４可変領域のアミノ酸配列
【0052】
（表１Ｃ）抗体３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎ可変領域の核酸配列
【0053】
（表１Ｄ）抗体３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎ可変領域のアミノ酸配列
【0054】
（表８）ＩＧＨＶ３－０３＊１８及びＩＧＬＶ１－４４＊０１の核酸配列
【0055】
３Ｉ１４及び３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎ中和インフルエンザ抗体の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列を以下の表２に示す。
【0056】
（表２）
１Ｘは、グリシン以外の任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、Ｘは、セリンである。
【0057】
（表９）赤血球凝集素の核酸配列及びアミノ酸配列
【0058】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指すことができる。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル、モノクローナル（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性（例えば、二重特異性抗体）、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、抗体断片、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖｓ、並びにＦａｂ発現ライブラリを含み得るが、これらに限定されない。抗体は、それらが生物学的活性を示す限り、抗体断片を含み得る。
【0059】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指すことができる。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５－４９７（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２２，５８１－５９７（１９９１）に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離され得る。モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物から単離することができる
【0060】
本明細書のモノクローナル抗体には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含めることができ、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、そのような抗体の断片と同様に、その重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８１，６８５１－６８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４－６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２－４５４（１９８５）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照されたい）。
【0061】
「ヒト化抗体」は、ドナー抗体結合特異性、すなわち、ヒトフレームワーク配列上に移植されたドナー抗体のＣＤＲ領域を含む抗体を指すことができる。「ヒト化抗体」は、ドナー抗体と同じエピトープに結合することができる。実施形態では、ヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する。例えば、ヒト抗体の超可変領域からの残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域からの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（framework region、ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体には見られない残基を含み得る。これらの変更は、抗体の性能を更に向上させるために行われる。実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、超可変ループのうちの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基のうちの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３－３２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２，５９３－５９６（１９９２）、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0062】
ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマ、ヒトファージディスプレイライブラリ、又はヒト抗体配列を発現するトランスジェニックマウスから得ることができるような、完全ヒト配列を有する任意の抗体を指すことができる。
【0063】
本発明の抗体はまた、モザイク抗体を産生するように修飾され得る。モザイク抗体は、１つの種の抗体の外部アミノ酸残基が、第２の種の抗体の外部アミノ酸残基によって合理的に置き換えられるか、又は「モザイク化」され、その結果、第１の種の抗体が第２の種において免疫原性でなくなり、それによって抗体の免疫原性が低減する抗体である。タンパク質の抗原性は、主にその表面特性に依存するので、抗体の免疫原性は、別の哺乳動物種の抗体において典型的に見られるものとは異なる露出した残基を置換することによって低減され得る。この外部残基の妥当な置換は、内部ドメイン又はドメイン間接触にほとんど又は全く影響を及ぼさないはずである。したがって、変化は、可変領域フレームワーク残基に限定されるので、リガンド結合特性は、影響を受けないはずである。このプロセスは、抗体の外表面又はスキンのみが変更され、支持残基は影響を受けないままであるため、「モザイク現象」と呼ばれる。
【0064】
「モザイク化」プロセスは、利用可能なＫａｂａｔら（１９８７年）のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、このデータベースに対する更新、並びに他のアクセス可能な米国及び外国のデータベース（核酸及びタンパク質）がまとめたヒト抗体可変ドメインについての配列データを利用する。モザイク抗体を生成するための方法の非限定的な例としては、欧州特許第５１９５９６号、米国特許第６，７９７，４９２号が挙げられ、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ，１９９１に記載されている。
【0065】
「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の関連又は非関連標的又は抗原に結合することができる抗体若しくは抗体様分子又はその断片を指すことができる。抗体特異性は、抗原の特定のエピトープ又はアミノ酸配列に対する抗体の選択的認識を指すことができる。例えば、天然抗体は、単一特異性である。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を指すことができる。したがって、三重特異性抗体は、３つの異なる抗原結合特異性を有する本開示の抗体である。本開示による四重特異性抗体は、４つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。例えば、二重特異性抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域に結合し、かつＢ型インフルエンザＨＡ又はＡ型インフルエンザＮＡにも免疫特異的に結合する抗体を含むことができる。例えば、三重特異性抗体は、Ａ型インフルエンザのＨＡ、Ｂ型インフルエンザのＨＡ、及びＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザのＮＡに結合する抗体を含むことができる。
【0066】
一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合的に連結されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体であり、これは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る。（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９－５８８３を参照されたい）。抗体Ｖ領域からの自然に凝集されるが、化学的に分離された、軽及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるであろう、ｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、５，１３２，４０５、及び４，９４６，７７８を参照されたい。
【0067】
非常に大きなナイーブヒトｓｃＦｖライブラリは、多量の標的分子に対して再配置された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために作製されており、作製することができる。疾患特異的抗体を単離するために、感染性疾患を有する個体からより小さなライブラリを構築することができる。（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３３９－４３（１９９２）、Ｚｅｂｅｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３１７５－７９（１９９２）を参照されたい）。
【0068】
ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのクラスのいずれかに関連することができ、これらは、分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる。ある特定のクラスは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのサブクラスも有する。更に、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖であり得る。実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【0069】
抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、成熟抗体重鎖を生殖系列軽鎖と対合させる（ｍＨｇＬ）ことによってか、又は生殖系列重鎖を成熟軽鎖と対合させる（ｇＨｍＬ）ことによって産生される。キメラ抗体は、野生型（wild type、ＷＴ）抗体と比較して増加した結合親和性（Ｋｄ）を有する。例えば、ある特定のウイルス（例えば、Ｈ１－ＣＡ０９）に対するｍＨｇＬ及びｇＨｍＬキメラバリアントの結合親和性は、約０．００１ｎＭ未満の結合親和性を有し得る。代替として、ｍＨｇＬ及びｇＨｍＬキメラバリアントの結合親和性（Ｋｄ）は、ＷＴで見られるよりも低い（例えば、ウイルスＨ５－ＶＮ０４及びＨ３－ＰＥ０９に対する）。任意選択で、ｍＨｇＬ及びｇＨｍＬキメラバリアントの結合親和性は、ＷＴの結合親和性とほぼ同じである。
【0070】
「抗原結合部位」又は「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なる区間は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られるより保存された隣接区間の間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間、及びそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「complementarity-determining region、ＣＤＲ」と呼ばれる。
【0071】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含むことができる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対してもたらされ得る。
【0072】
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指すことができる。免疫学的結合相互作用の強度、又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表すことができ、Ｋｄが小さいほど、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、両方の「オン速度定数」（Ｋｏｎ）及び「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度並びに会合及び解離の実際の速度の計算によって決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係のない全てのパラメータをキャンセルすることができ、解離定数Ｋｄに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照されたい）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に公知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定して、平衡結合定数（Ｋｄ）が１μＭ、好ましくは１００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、及び最も好ましくは１００ｐＭ～約１ｐＭである場合に、インフルエンザエピトープに特異的に結合すると言われている。
【0073】
本発明のインフルエンザタンパク質（例えば、ＨＡ又はノイラミニダーゼ）、又はその誘導体、断片、類似体、相同体、若しくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成における免疫原として利用することができる。
【0074】
当業者であれば、過度の実験をせずに、ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者のインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質への結合を防止するかどうかを確認することによって決定することができることを認識するであろう。本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、２つのモノクローナル抗体が同じ、又は密接に関連するエピトープに結合する可能性が高い。
【0075】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、この抗体が通常反応性であるインフルエンザＨＡタンパク質とプレインキュベートし、次いで、試験されるヒトモノクローナル抗体を添加して、試験されるヒトモノクローナル抗体がＨＡタンパク質に結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、おそらく、それは、本発明のモノクローナル抗体と同じ、又は機能的に同等のエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングもまた、インフルエンザウイルスを利用し、試験モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスを中和することができるかどうかを決定することによって実施できる。
【0076】
当技術分野内で既知の様々な手順は、本発明のタンパク質に対して、又はその誘導体、断片、類似体、相同体、若しくはオルソログに対して向けられたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の産生に使用することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい）。
【0077】
抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の技法によって精製することができ、これらは主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する。その後、又は代替として、求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原、又はそのエピトープをカラムに固定化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（Ａｐｒｉｌ１７，２０００），ｐｐ．２５－２８）によって論じられている。
【0078】
本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物及び特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含有する抗体分子の集団を指すことができる。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する特有の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【0079】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤で免疫化して、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、又は産生することができるリンパ球を誘導する。代替として、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。
【0080】
免疫剤は、典型的には、タンパク質抗原、その断片、又はその融合タンパク質を含むであろう。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合は末梢血リンパ球が使用されるか、又は非ヒト哺乳動物源が所望される場合は脾臓細胞若しくはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ、及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合、不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する、好適な培地において培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase、ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【0081】
実施形態では、不死化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。より好ましい不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができるマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１－６３）を参照されたい）。
【0082】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってか、又はラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay、ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸収アッセイ（enzyme-linked immunoabsorbent assay、ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。そのような技法及びアッセイは、当技術分野で既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。更に、モノクローナル抗体の治療用途では、標的抗原に対して高度の特異性及び高い結合親和性を有する抗体を特定することが重要である。
【0083】
所望のハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３を参照されたい）。この目的のための好適な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。他の実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで成長させることができる。
【0084】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地又は腹水液から単離又は精製することができる。
【0085】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、これは次いでサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）を参照されたい）か、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て若しくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって修飾され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用することができるか、又は本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用して、キメラ二価抗体を作製することができる。
【0086】
完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む、軽鎖及び重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書では「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照されたい）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５のＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）を使用することによって調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ，１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８０：２０２６－２０３０を参照されたい）か、又はインビトロでエプスタインバーウイルスによりヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５のＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照されたい）産生することができる。
【0087】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む、追加の技術を使用して産生することができる。（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）を参照されたい）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジ後、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再配置、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含む、全ての態様においてヒトに見られるものと非常によく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、並びにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５－５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）、及びＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５－９３（１９９５）に記載されている。
【0088】
ヒト抗体はまた、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように修飾されるトランスジェニック非ヒト動物を使用して産生することができる。（国際公開第９４／０２６０２号を参照されたい）。非ヒト宿主における重鎖及び軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、無力化されており、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座は、宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を使用して、組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物は、改変の完全な相補体よりも少ない相補体を含有する中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、国際公開第９６／３３７３５号及び同第９６／３４０９６号に開示されるように、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として、目的の免疫原での免疫化後、直接動物から、又は代替として、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの、動物に由来する不死化Ｂ細胞から得ることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、回収及び発現されて、抗体を直接得ることができるか、又は更に修飾されて、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子などの抗体の類似体を得ることができる。
【0089】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く、マウスとして例示される非ヒト宿主を産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。これは、遺伝子座の再配置を防止し、再配置された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止するために、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失することであって、欠失が、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有する標的化ベクターによって行われる、欠失することと、胚性幹細胞からトランスジェニックマウスを産生することであって、その体細胞及び生殖細胞が、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有する、産生することと、を含む、方法によって得ることができる。
【0090】
ヒト抗体などの目的の抗体を産生するための１つの方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを培養物中の１つの哺乳動物宿主細胞へ導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞へ導入し、２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成することを含む。ハイブリッド細胞は、重鎖及び軽鎖を含有する抗体を発現する。
【0091】
この手順の更なる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを特定するための方法、及び関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関方法は、国際公開第９９／５３０４９号に開示されている。
【0092】
抗体は、上記の一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターによって発現させることができる。
【0093】
これらには、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどが含まれる。ベクターには、標的化部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）、及び核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有する、国際公開第９３／６４７０１号に記載されるものなどの化学的コンジュゲート、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含有する融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（国際公開第９５／２２６１８号）に記載されるものなどの融合タンパク質、プラスミド、ファージなどが含まれる。ベクターは、染色体、非染色体、又は合成であり得る。
【0094】
実施形態では、ベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質、及び化学的コンジュゲートが含まれ得る。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックス又はアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（herpes simplex I virus、ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）、Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，のＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，７６０３（１９９３）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１１４９（１９９０）を参照されたい）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ３：２１９（１９９３）、Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）を参照されたい）、及びアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照されたい）が含まれる。
【0095】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間のみの発現をもたらす。核酸を神経細胞に導入するためには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターが好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも短期間の発現（約２ヶ月）をもたらし、ひいてはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞及び治療される状態に依存するであろう。導入は、標準的な技術、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入、又は形質転換によるものであり得る。遺伝子導入の様式の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、及びウイルスベクターが挙げられる。
【0096】
ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的化するために使用することができる。例えば、定位注入を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に方向付けることができる。加えて、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプ注入システムを使用した脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達することができる。対流と呼ばれるバルク流に基づく方法は、脳の拡張領域に大きな分子を送達するのに効果的であることも証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る。（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６－２０８０（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２－３０５（１９９４）を参照されたい）。使用することができる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、及び皮下注射、並びに経口又は他の既知の投与経路が含まれる。
【0097】
これらのベクターは、様々な方法で使用することができる多量の抗体を発現させるために使用することができる。例えば、試料におけるインフルエンザウイルスの存在を検出するため。インフルエンザウイルス細胞膜融合に結合させ、破壊させることを試みるために、抗体を使用することもできる。
【0098】
本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために技術を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。加えて、方法は、タンパク質、又はその誘導体、断片、類似体、若しくは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効果的な識別を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に方法を適合させ得る（例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１を参照されたい）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体断片は、当技術分野で公知の技術によって産生され得、以下が挙げられるが、これらに限定されない。（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）抗体分子をパパイン及び還元剤で処置することによって生成されるＦａｂ断片、並びに（ｉｖ）Ｆｖ断片。
【0099】
実施形態はまた、ヘテロコンジュゲート抗体を含み得る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するために（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい）、及びＨＩＶ感染症の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、同第９２／２００３７３号、欧州特許第０３０８９号参照されたい）提案されている。抗体は、架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製することができることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的のための好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル－４－メルカプトブチルイミデート、並びに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
【0100】
実施形態では、本発明の抗体は、エフェクター機能に関して修飾することができる。「エフェクター機能」という用語は、天然配列Ｆｃ領域の１つ以上の機能を指すことができる。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、B cell receptor、ＢＣＲ）の下方調節を含むことができる。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とする場合があり、例えば、様々なアッセイを使用して評価することができる。抗体エフェクター機能は、体液性免疫応答の一部であり、タンパク質及びＦｃ受容体と相互作用することができる抗体のＦｃ定常領域を介して誘導することができる。本明細書で使用される場合、「体液性免疫応答」という用語は、抗原刺激に応答して抗体分子が産生される免疫の形態を指すことができる。受容体に応じて、Ｆｃ定常領域とＦｃ受容体との間のこれらの相互作用は、活性化経路又は阻害経路を誘導することができる（ｖａｎ Ｅｒｐ，（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：５４８）。これらのＦｃ受容体は、例えば、Ｂ細胞及び自然免疫細胞上に見ることができる。本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」という用語は、Ｆｃ受容体又はリガンドとのＦｃドメインの相互作用から生じる生化学的事象を指すことができる。例えば、エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＡＤＥ、及びＣＤＣが含まれ得るが、これらに限定されない。
【0101】
例えば、本発明の抗体は、エフェクター機能を調節するように修飾され得る。「調節する」という用語は、エフェクター機能の変化又は変更、例えば、増加又は減少を指すことができる。例えば、エフェクター機能は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、又は１００％調節され得る。
【0102】
例えば、エフェクター機能は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、１００％、又は１００％を超えて増加され得る。
【0103】
例えば、エフェクター機能は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、又は１００％減少され得る。
【0104】
実施形態では、エフェクター機能を調節する修飾は、抗体のＦｃ領域へのアミノ酸変異などの少なくとも１つのアミノ酸変異を含むことができる。例えば、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑとのＦｃドメイン上の相互作用部位を識別し、結合を減少させて排除するように変異させることができる。そのようなアミノ酸変異の非限定的な例は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0105】
例えば、２３４位及び２３５位のロイシンをＦｃ領域のアラニン（alanine、ＬＡＬＡ）に変異させることによって、Ｆｃガンマ受容体への結合が減少する／完全に排除されるが、インフルエンザに対する有効性は、抗体依存性感染増強（antibody-dependent enhancement、ＡＤＥ）を防止しながら維持されることが見出された。Ｈｅｓｓｅｌｌ，Ａｎｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．「Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ．」Ｎａｔｕｒｅ ４４９．７１５８（２００７）：１０１－１０４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍａｒｊａｎ，ｅｔ ａｌ．「Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ａ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５．２４（２００１）：１２１６１－１２１６８、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔｉｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．「Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２９．１０（２０１６）：４５７－４６６。したがって、本明細書の実施形態は、インフルエンザに対する有効性を維持し、抗体依存性感染増強を防止しながら、Ｆｃガンマ受容体への結合の低減及び／又は排除を実証する修飾されたＦｃ領域を含む抗体を含む。
【0106】
例えば、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの組合せは、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合を低減又は排除する（Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ ７５（２４）：１２１６１－１２１６８）。同様に、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓの組み合わせは、結合を低減又は排除する（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００８ Ｊｕｎ １：６４（Ｐｔ ６）：７００－７０４）。加えて、Ｆｃドメイン上のグリコシル化の修飾、例えば、Ｎ２９７Ａは、結合を減少又は排除した（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．９，ｐｇｓ．６５９１－６６０４）。
【0107】
表１：Ｆｃ領域のアミノ酸配列を示す。ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は実線の下線によって示され、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは斜線の下線によって示され、影付きボックスは、エフェクター機能を減少又は排除するために置換され得るアミノ酸である。黄色で強調表示され、四角で囲まれたアミノ酸は、野生型配列に対して行われた変異を示す。
【0108】
（表１）Ｆｃ領域のアミノ酸配列
【0109】
実施形態では、修飾はまた、翻訳後修飾を含み得る。本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」という用語は、タンパク質合成後のタンパク質の修飾を指すことができる。例えば、翻訳後修飾は、活性、安定性、局在化、及び／又は相互作用パートナー分子の変化をもたらし得る。翻訳後修飾の非限定的な例は、リン酸化、水酸化、ＳＵＭＯ化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ニトロシル化、グリコシル化、脂質化、ジスルフィド結合の形成、及び／又は本明細書に列挙される任意の修飾の逆転を含む。例えば、Ｆｃ領域の修飾は、グリコシル化又は脱グリコシル化、例えばＦｃ領域のアスパラギン２９７の脱グリコシル化を含むことができる。
【0110】
本発明はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）などの細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗体、又は放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート）を含むイムノコンジュゲートに関する。
【0111】
使用することができる酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。ラジオコンジュゲートされた抗体の産生には、様々な放射性核種が利用可能である。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。
【0112】
抗体及び細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate、SPDP）、イミノチオラン（iminothiolane、ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタレルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）など）、ジイソシアネート（トリエン２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（methyldiethylene triaminepentaacetic acid、ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。（国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。
【0113】
当業者は、多種多様な可能な部分が、得られた抗体又は本発明の他の分子に結合され得ることを認識するであろう。（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたい。
【0114】
結合は、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合するであろう任意の化学反応によって達成することができる。この結合は、多くの化学的メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成を含むことができる。しかしながら、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合によって、又は外部架橋分子の組み込みによって達成することができる。多くの二価又は多価結合剤は、本発明の抗体などのタンパク質分子を他の分子に結合するのに有用である。例えば、代表的な結合剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、及びヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含むことができる。このリストは、当技術分野で既知の様々なクラスの結合剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的な結合剤の例示である。（Ｋｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）、及びＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照されたい）。好ましいリンカーは、文献に記載されている。（例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）は、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載している）。オリゴペプチドリンカーを介して抗体に結合されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。特に好ましいリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミド塩酸塩、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ（２１５５８Ｇ）、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピアンアミド（ｐｒｏｐｉａｎａｍｉｄｅ）］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５－Ｇ）、及び（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートされたスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２４５１０）が挙げられる。
【0115】
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含有し、よって異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、カルボン酸アルキルのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボン酸塩のスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ－エステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。更に、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含有し、向上した安定性を有するコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合は、一般に、他の結合よりも安定性が低く、これはジスルフィド結合がインビトロで切断され、利用可能なコンジュゲートが少なくなるためである。特に、スルホ－ＮＨＳは、カルボジミド結合の安定性を増強することができる。カルボジミド結合（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと組み合わせて使用されると、カルボジミド結合反応単独よりも加水分解に対してより耐性のあるエステルを形成する。
【0116】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されるものなど、当技術分野で公知の方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【0117】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-derivatized phosphatidylethanolamine、ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。
【0118】
インフルエンザウイルスに対する抗体の使用
所望の特異性を有する抗体のスクリーニングのための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当該分野で公知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
所望の特異性を有する抗体のスクリーニングのための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当該分野で公知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【0119】
ＨＡ（又はその断片）などのインフルエンザウイルスタンパク質に対する抗体は、インフルエンザウイルスタンパク質の局在化及び／又は定量化に関連する当技術分野で公知の方法で使用することができる（例えば、適切な生理学的試料内のインフルエンザウイルスタンパク質のレベルの測定における使用、診断法における使用、タンパク質の画像化における使用のために）。所与の実施形態では、抗体由来の抗原結合ドメインを含有する、インフルエンザウイルスタンパク質、又はその誘導体、断片、類似体、若しくは相同体に特異的な抗体は、薬理学的に活性な化合物（以下、「治療薬」と呼ばれる）として利用される。
【0120】
本発明のインフルエンザウイルスタンパク質に特異的な抗体を使用して、免疫親和性、クロマトグラフィー、又は免疫沈降などの標準的な技術によってインフルエンザウイルスポリペプチドを単離することができる。インフルエンザウイルスタンパク質（又はその断片）に対する抗体は、診断的に使用して、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターし、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定することができる。検出は、抗体を検出可能物質に結合（すなわち、物理的に連結）することによって促進することができる。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、及び放射性材料が含まれる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。
【0121】
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化及び完全ヒト抗体を含む、本発明の抗体は、治療剤として使用することができる。そのような薬剤は一般に、対象におけるインフルエンザウイルス関連疾患又は病態（例えば、鳥インフルエンザ）を治療又は予防するために使用される。抗体調製物、好ましくはその標的抗原について高い特異性及び高い親和性を有するものが対象に投与され、一般に、標的との結合による効果を有するであろう。抗体の投与は、細胞内へのウイルスの内在化を抑止又は阻害又は干渉し得る。この場合、抗体は標的に結合し、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし、それによって細胞膜へのウイルスの融合をブロックし、ウイルスの内在化を遮断する。
【0122】
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要な量に関する。上記のように、これは、ある特定の場合には、標的の機能を干渉する、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与する必要のある量は更に、その特異的な抗原についての抗体の結合親和性に依存し、また、投与された抗体が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。本発明の抗体又は抗体断片の治療上有効な投与のための一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回～１週間に１回の範囲であり得る。
【0123】
本発明の、インフルエンザウイルスタンパク質又はその断片に特異的に結合する抗体、並びに本明細書に開示されるスクリーニングアッセイによって識別される他の分子は、インフルエンザウイルス関連障害の治療のために、薬学的組成物の形態で投与され得る。そのような組成物を調製することに関与する原理及び考慮事項、並びに成分の選択におけるガイダンスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５、Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４、及びＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供される。
【0124】
抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、かつ／又は組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照されたい）。製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有することができる。代替として、又は加えて、組成物は、例えば、細胞傷害性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤などの、その機能を増強する薬剤を含むことができる。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【0125】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）における、又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入することができる。
【0126】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【0127】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸及びγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたる分子の放出を可能にするが、ある特定のヒドロゲルは、より短い時間にわたってタンパク質を放出する。
【0128】
本明細書の実施形態はまた、本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用を含む。抗体にコンジュゲートされたナノ粒子は、治療用途及び診断用途の両方に使用することができる。抗体にコンジュゲートされたナノ粒子、並びに調製及び使用の方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９）に詳述されている。ナノ粒子を開発し、薬学的組成物に含有される抗体にコンジュゲートさせて、細胞を標的化することができる。薬物送達のためのナノ粒子はまた、例えば、米国特許第８，２５７，７４０号又は同第８，２４６，９９５号に記載されている。
【0129】
本明細書の実施形態は、本発明の抗体を送達するためのゲノム修飾Ｂ細胞の使用を更に含む。Ｂ細胞は、大量のタンパク質を抗体の形態で分泌する能力のために、遺伝子治療の機会を提供し、形質細胞として生物の生涯にわたって存続する。例えば、本明細書における実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系を利用して、本発明の抗体を分泌させるように、初代ヒトＢ細胞を操作することができる。例えば、Ｆｕｓｉｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｌｌｏｗｉｎｇ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ Ｂ－ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｕｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３，１７３４－１７４７（２０１５）、Ｌｕｏ，Ｘ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ １１３，１４２２－１４３１（２００９）を参照されたい。
【0130】
本発明による抗体は、試料中のインフルエンザウイルス（又はそのタンパク質若しくはそのタンパク質断片）の存在を検出するための薬剤として使用することができる。好ましくは、抗体は、検出可能標識を含有する。抗体は、ポリクローナル、又はより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷抗体、又はその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）２）を使用することができる。プローブ又は抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能物質をプローブ又は抗体に結合（すなわち、物理的に結合）することによるプローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが含まれる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、及び生体液、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び生体液を含むことを意図する。したがって、「生物学的試料」という用語の使用には、血液、及び血清、血漿、又はリンパ液を含む、血液の画分又は成分が含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ及びインビボで生物学的試料中の被検体ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、被検体ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。被検体タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光が挙げられる。被検体ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６、及び「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。更に、被検体タンパク質を検出するためのインビボ技術は、標識された抗被検体タンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準的な画像化技法によって検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【0131】
薬学的組成物
本発明の抗体又は薬剤（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、並びにそれらの誘導体、断片、類似体、及び相同体は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、抗体又は薬剤及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。好適な担体は、当該分野の標準的な参照テキストであり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
本発明の抗体又は薬剤（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、並びにそれらの誘導体、断片、類似体、及び相同体は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、抗体又は薬剤及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。好適な担体は、当該分野の標準的な参照テキストであり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
【0132】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の、無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度を調整するための薬剤、の成分を含むことができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス若しくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。
【0133】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であるべきである。製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物において等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって達成することができる。
【0134】
無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分及びその以前に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【0135】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤又は可食性担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、又は錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、洗口剤としての使用のための流体担体を使用して調製することができ、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で回され、吐き出されるか、又は飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、及び／又はアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の、微結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテスなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味剤の成分、又は同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる。
【0136】
吸入による投与について、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガス、又はネブライザーを含有する加圧容器又はディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【0137】
全身投与はまた、経粘膜的又は経皮的手段によるものであり得る。経粘膜又は経皮投与について、浸透させる障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当技術分野で一般に既知の軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに製剤化される。
【0138】
化合物はまた、直腸送達のための、坐剤（例えば、カカオバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを有する）又は停留浣腸の形態で調製することができる。
【0139】
一実施形態では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【0140】
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与量単位形態で経口又は非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与量単位形態の仕様は、活性化合物の特有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個体の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定付けられ、これらに直接依存する。
【0141】
薬学的組成物は、投与の指示とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【0142】
スクリーニング方法
本発明は、細胞膜へのインフルエンザウイルスの融合を調節するか、又はそうでなければ干渉するモジュレーター、すなわち、候補又は試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、又は他の薬物）を識別するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。インフルエンザ感染を治療するのに有用な化合物を識別する方法も提供される。本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用した識別される化合物を包含する。
本発明は、細胞膜へのインフルエンザウイルスの融合を調節するか、又はそうでなければ干渉するモジュレーター、すなわち、候補又は試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、又は他の薬物）を識別するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。インフルエンザ感染を治療するのに有用な化合物を識別する方法も提供される。本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用した識別される化合物を包含する。
【0143】
例えば、本発明は、インフルエンザウイルスと細胞膜との間の相互作用を調節する候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのうちのいずれかを使用して得ることができ、以下が含まれる：生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法。生物学的ライブラリアプローチは、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリに適用可能である。（例えば、Ｌａｍ，１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １２：１４５を参照されたい）。
【0144】
本明細書で使用される「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指すことを意味する。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、又は他の有機若しくは無機分子であり得る。真菌、細菌、又は藻類抽出物などの化学的及び／又は生物学的混合物のライブラリは、当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのうちのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。
【0145】
分子ライブラリの合成のための方法の例は、当技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、Ｅｒｂ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、及びＧａｌｌｏｐ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７／１２３３に見ることができる。
【0146】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２－４２１を参照されたい）、又はビーズ上（Ｌａｍ，１９９１．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４を参照されたい）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３．Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５－５５６を参照されたい）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号を参照されたい）、胞子（米国特許第５，２３３，４０９号を参照されたい）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５－１８６９を参照されたい）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０、Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－４０６、Ｃｗｉｒｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８－６３８２、Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－３１０、及び米国特許第５，２３３，４０９号を参照されたい）に存在し得る。
【0147】
一実施形態では、候補化合物は、抗体－抗原複合体に導入され、候補化合物が抗体－抗原複合体を破壊するかどうかを決定し、この複合体の破壊は、候補化合物がインフルエンザウイルスと細胞膜との間の相互作用を調節することを示す。
【0148】
別の実施形態では、少なくとも１つのＨＡタンパク質が提供され、これは、少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に曝露される。抗体－抗原複合体の形成が検出され、１つ以上の候補化合物が複合体に導入される。１つ以上の候補化合物の導入後に抗体－抗原複合体が破壊される場合、候補化合物は、インフルエンザウイルス関連疾患又は障害、例えば、鳥インフルエンザを治療するのに有用である。例えば、少なくとも１つのインフルエンザウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス分子として提供され得る。
【0149】
試験化合物の抗体－抗原複合体を干渉又は破壊する能力を決定することは、例えば、試験化合物を放射性同位体又は酵素標識と結合させることによって達成され得、その結果、抗原又はその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合は、複合体中の標識された化合物を検出することによって決定され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接又は間接的に標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出される。代替として、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が、生成物への適切な基質の変換の決定によって検出される。
【0150】
一実施形態では、アッセイは、抗体－抗原複合体を試験化合物と接触させることと、試験化合物が抗原と相互作用するか、又はそうでなければ既存の抗体－抗原複合体を破壊する能力を決定することと、を含む。この実施形態では、試験化合物が抗原と相互作用し、かつ／又は抗体－抗原複合体を破壊する能力を決定することは、抗体と比較して、試験化合物が抗原又はその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を決定することを含む。
【0151】
別の実施形態では、アッセイは、抗体－抗原複合体を試験化合物と接触させることと、試験化合物が抗体－抗原複合体を調節する能力を決定することと、を含む。試験化合物が抗体－抗原複合体を調節する能力を決定することは、例えば、試験化合物の存在下で、抗原が抗体と結合又は相互作用する能力を決定することによって達成することができる。
【0152】
当業者は、本明細書に開示されるスクリーニング方法のうちのいずれかにおいて、抗体がインフルエンザウイルス中和抗体であり得ることを認識するであろう。加えて、抗原は、ＨＡタンパク質又はその一部であってもよい。本明細書に記載のアッセイのうちのいずれかにおいて、候補化合物が本発明のモノクローナル抗体とＨＡタンパク質との間の結合を干渉する能力は、候補化合物がインフルエンザウイルスと細胞膜との融合を干渉又は調節することができるであろうということを示す。更に、細胞へのＨＡタンパク質の結合が、細胞へのインフルエンザウイルス侵入の原因であるので、そのような候補化合物はまた、インフルエンザウイルス関連疾患又は障害、例えば、鳥インフルエンザの治療において有用である。
【0153】
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、細胞ベースのアッセイとして、又は無細胞アッセイとして実施され得る。本発明の無細胞アッセイは、ＨＡタンパク質及びその断片の可溶性形態又は膜結合形態の両方の使用に適している。膜結合形態のＨＡタンパク質を含む無細胞アッセイの場合、膜結合形態のタンパク質が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎ－オクチルグルコシド、ｎ－ドデシルグルコシド、ｎ－ドデシルマルトシド、オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミド、デカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、３－（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、又は３－（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。
【0154】
２つ以上の実施形態では、抗体又は抗原のいずれかを固定化して、候補化合物の導入後の一方又は両方の複合体化されていない形態からの複合体化された形態の分離を容易にし、並びにアッセイの自動化に適応させることが所望され得る。候補化合物の存在下及び非存在下での抗体－抗原複合体の観察は、反応物を含有するのに好適な任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微量遠心管が挙げられる。一実施形態では、タンパク質の一方又は両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ－抗体融合タンパク質又はＧＳＴ－抗原融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いで、これを試験化合物と組み合わせ、混合物を、複合体形成につながる条件下（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件で）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を直接又は間接的に決定する。代替として、複合体は、マトリックスから解離され得、抗体－抗原複合体形成のレベルは、標準的な技術を使用して決定され得る。
【0155】
マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、抗体又は抗原のいずれか（例えば、ビオチン及びストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。ビオチン化された抗体又は抗原分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）を使用してビオチン－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）から調製され得、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化され得る。代替として、目的の抗体又は抗原と反応性であるが、目的の抗体－抗原複合体の形成を干渉しない他の抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない抗体又は抗原は、抗体コンジュゲーションによってウェルに捕捉され得る。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体について上記された方法に加えて、抗体又は抗原と反応性のそのような他の抗体を使用する複合体の免疫検出を含む。
【0156】
本発明は更に、前述のスクリーニングアッセイのうちのいずれかによって識別される新規薬剤、及び本明細書に記載の治療のためのその使用に関する。
【0157】
診断アッセイ
本発明の抗体は、適切なアッセイ、例えば、従来型のイムノアッセイによって検出することができる。例えば、インフルエンザタンパク質（例えば、ＨＡ１、ＨＡ２、又はノイラミニダーゼ）又はその断片が固相に固定されるアッセイを行うことができる。インキュベーションは、試料中の抗体を、固相上の固定化ポリペプチドに結合させるのに十分な時間維持される。この最初のインキュベーションの後、固相を試料から分離する。固相を洗浄して、非結合物質、及び試料中に存在し得る非特異的タンパク質などの干渉物質を除去する。続いて、固定化されたポリペプチドに結合した目的の抗体を含有する固相を、ビオチン又はアビジンなどのカップリング剤に結合した第２の標識抗体又は抗体とともにインキュベートする。この第２の抗体は、別の抗インフルエンザ抗体又は別の抗体であってもよい。抗体のための標識としては、当技術分野で周知であり、放射性核種、酵素（例えば、マレエート（maleate）デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）、フッ素（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレスカミン）、ビオチンなどが挙げられる。標識抗体を固体とともにインキュベートし、固相に結合した標識を測定する。これら及び他のイムノアッセイは、当業者によって容易に実施され得る。
本発明の抗体は、適切なアッセイ、例えば、従来型のイムノアッセイによって検出することができる。例えば、インフルエンザタンパク質（例えば、ＨＡ１、ＨＡ２、又はノイラミニダーゼ）又はその断片が固相に固定されるアッセイを行うことができる。インキュベーションは、試料中の抗体を、固相上の固定化ポリペプチドに結合させるのに十分な時間維持される。この最初のインキュベーションの後、固相を試料から分離する。固相を洗浄して、非結合物質、及び試料中に存在し得る非特異的タンパク質などの干渉物質を除去する。続いて、固定化されたポリペプチドに結合した目的の抗体を含有する固相を、ビオチン又はアビジンなどのカップリング剤に結合した第２の標識抗体又は抗体とともにインキュベートする。この第２の抗体は、別の抗インフルエンザ抗体又は別の抗体であってもよい。抗体のための標識としては、当技術分野で周知であり、放射性核種、酵素（例えば、マレエート（maleate）デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）、フッ素（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレスカミン）、ビオチンなどが挙げられる。標識抗体を固体とともにインキュベートし、固相に結合した標識を測定する。これら及び他のイムノアッセイは、当業者によって容易に実施され得る。
【0158】
インフルエンザウイルスの存在又は非存在（生物学的試料中の）を検出するための例示的な方法は、試験対象から生物学的試料を得ることと、インフルエンザウイルスの存在が生物学的試料中において検出されるように、生物学的試料を本発明による標識されたモノクローナル抗体又はｓｃＦｖ抗体と接触させることと、を含む。
【0159】
本明細書で使用される場合、プローブ又は抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能物質をプローブ又は抗体に結合（すなわち、物理的に結合）することによるプローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが含まれる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、及び生体液、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び生体液を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ及びインビボで、生物学的試料中のインフルエンザウイルス検出するために使用され得る。例えば、インフルエンザウイルスの検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光が挙げられる。更に、インフルエンザウイルスの検出のためのインビボ技術には、標識された抗インフルエンザウイルス抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準的な画像化技法によって検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【0160】
一実施形態では、生物学的試料は、試験対象からのタンパク質分子を含有する。１つの好まれる生物学的試料は、従来の手段によって対象から単離された末梢血白血球試料である。
【0161】
本発明は、生物学的試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生物学的試料中のインフルエンザウイルスを検出することができる標識された化合物又は薬剤（例えば、抗インフルエンザｓｃＦｖ又はモノクローナル抗体）、試料中のインフルエンザウイルスの量を決定するための手段、及び試料中のインフルエンザウイルスの量を標準と比較するための手段、を含むことができる。化合物又は薬剤は、好適な容器に包装することができる。キットは、試料中のインフルエンザウイルスを検出するためにキットを使用するための使用説明書を更に含むことができる。
【0162】
受動免疫化
受動免疫化は、ウイルス性疾患の予防及び治療のための有効かつ安全な戦略であることが証明されている。（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６０２－１４（２０００）、Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１４（２００２）、Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２０４－１０（１９９９）、及びＩｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２１１－１６（１９９９）を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。中和ヒトモノクローナル抗体を使用する受動免疫化は、鳥インフルエンザなどのインフルエンザの緊急予防及び治療のための即時治療戦略を提供することができ、一方で、ワクチン及び新薬の代替的かつより時間のかかる開発が進行中である。
受動免疫化は、ウイルス性疾患の予防及び治療のための有効かつ安全な戦略であることが証明されている。（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６０２－１４（２０００）、Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１４（２００２）、Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２０４－１０（１９９９）、及びＩｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２１１－１６（１９９９）を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。中和ヒトモノクローナル抗体を使用する受動免疫化は、鳥インフルエンザなどのインフルエンザの緊急予防及び治療のための即時治療戦略を提供することができ、一方で、ワクチン及び新薬の代替的かつより時間のかかる開発が進行中である。
【0163】
サブユニットワクチンは、従来の免疫原を超える著しい利点を潜在的に提供する。それらは、従来の死滅又は弱毒化された全病原体ワクチンの製造、流通、及び送達に固有の安全性の危険を回避する。更に、それらは、確認された防御エピトープのみを含むように合理的に設計することができ、それによって抑制性Ｔエピトープ（Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６６８（１９９５））、又は無益な非防御応答を誘導することによって免疫系を破壊する免疫優性Ｂエピトープ（例えば、「デコイ」エピトープ）を回避する。（Ｇａｒｒｉｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２７９（１９９７）を参照されたい）。
【0164】
更に、当業者は、多くの異なるウイルス、チャレンジ経路、及び動物モデルに関して、良好な相関が、インビトロでの抗体中和活性とインビボでの防御との間に存在することを認識する。（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｎａｔｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７０６－１３（２００２）、Ｐａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７７：１９５－２６２（２００１）を参照されたい）。本明細書中に示されるデータは、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、及びＨ９８ヒトモノクローナル抗体が、更に開発され、インビボ動物研究において試験されて、インフルエンザの緊急予防及び治療のための強力なウイルス侵入阻害剤としてのその臨床的有用性を決定し得ることを示す。
【0165】
ワクチン接種における抗原－Ｉｇキメラ
最初の抗体が、免疫系に対する抗原決定基の効率的な提示のための足場として使用されて以来、１０年以上経った。（Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４７６－７７（１９９２）、Ｚａｇｈｏｕａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３１－３５（１９９５）を参照されたい）。ペプチドがＩｇＧ分子（例えば、本明細書に記載の１１Ａ又は２５６ ＩｇＧ１モノクローナル抗体）の不可欠な部分として含まれる場合、ペプチドエピトープの抗原性及び免疫原性は、遊離ペプチドと比較して大幅に増強される。そのような増強は、おそらく、抗原－ＩｇＧキメラのより長い半減期、より良好な提示、及びそれらの自然構造を模倣する、拘束された立体構造に起因する。
最初の抗体が、免疫系に対する抗原決定基の効率的な提示のための足場として使用されて以来、１０年以上経った。（Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４７６－７７（１９９２）、Ｚａｇｈｏｕａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３１－３５（１９９５）を参照されたい）。ペプチドがＩｇＧ分子（例えば、本明細書に記載の１１Ａ又は２５６ ＩｇＧ１モノクローナル抗体）の不可欠な部分として含まれる場合、ペプチドエピトープの抗原性及び免疫原性は、遊離ペプチドと比較して大幅に増強される。そのような増強は、おそらく、抗原－ＩｇＧキメラのより長い半減期、より良好な提示、及びそれらの自然構造を模倣する、拘束された立体構造に起因する。
【0166】
更に、抗原－Ｉｇキメラを使用することの更なる利点は、抗原－Ｉｇキメラの可変領域又はＦｃ領域のいずれかが、プロフェッショナル抗原提示細胞（antigen-presenting cell、ＡＰＣ）を標的化するために使用され得ることである。今日まで、重鎖可変遺伝子（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、Ｂ細胞又はＴ細胞によって認識される様々な抗原性ペプチドで置き換えられた組換えＩｇが生成されている。そのような抗原－Ｉｇキメラは、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘導するために使用されている。（Ｂｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９：１２６－３３（１９９８）を参照されたい）。
【0167】
ＣＤＲ３ループに生着された特異的エピトープを有するキメラは、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０ Ｖ３－ループ、又はヒトＣＤ４受容体の第１の細胞外ドメイン（Ｄ１）のいずれかに対する体液性応答を誘導するために使用されている。（Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１６８３－８７（１９９３）、Ｚａｇｈｏｕａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３１－３５（１９９５）を参照されたい）。免疫血清は、ＨＩＶ－１ＭＮ（抗ｇｐ１２０ Ｖ３Ｃ）によるＣＤ４ ＳｕｐＴ１細胞の感染を予防するか、又はシンシチウム形成（抗ＣＤ４－Ｄ１）を阻害することができた。ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、ペプチドエピトープで同時に置き換えられ得、挿入されるペプチドの長さは、最大１９個のアミノ酸長であり得る。
【0168】
代替として、１つのグループは、ペプチド抗原がＩｇ定常（Ｃ）領域のループにおいて提示され、キメラの可変領域が、Ｂ細胞の表面上のＩｇＤ又はＢ細胞、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）、及びマクロファージを含むプロフェッショナルＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子を標的化するために使用され得る、「トロイ体（troybody）」戦略を開発した。（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００－６（２００２）を参照されたい）。
【0169】
抗原－Ｉｇキメラは、抗原をＩｇＧ分子のＦｃ部分と直接融合させることによって作製することもできる。Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３７０４－１１（２００１）は、この方法を使用して、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する非常に高レベルの抗体を含む、特異的免疫応答の全てのアームを得ることができた。
【0170】
ＤＮＡワクチン接種
ＤＮＡワクチンは安定しており、抗原に自然に処理される機会を提供することができ、より長く持続する応答を誘導することができる。非常に魅力的な免疫化戦略であるが、ＤＮＡワクチンは、免疫応答を誘導する効力が非常に限られていることが多い。樹状細胞（ＤＣ）などのプロフェッショナルＡＰＣによる注射されたＤＮＡの不十分な取り込みが、そのような制限の主な原因であり得る。抗原－Ｉｇキメラワクチンと組み合わせて、ＡＰＣ抗原提示の増強に基づく有望な新しいＤＮＡワクチン戦略が報告されており（Ｃａｓａｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２９－３６（１９９７）、Ｇｅｒｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：８７６－８１（１９９７）、Ｇｅｒｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６１１－２５（１９９７）、Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３７０４－１１（２００１）を参照されたい）、これは、ＤＣの表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲｓ）の存在を利用する。
ＤＮＡワクチンは安定しており、抗原に自然に処理される機会を提供することができ、より長く持続する応答を誘導することができる。非常に魅力的な免疫化戦略であるが、ＤＮＡワクチンは、免疫応答を誘導する効力が非常に限られていることが多い。樹状細胞（ＤＣ）などのプロフェッショナルＡＰＣによる注射されたＤＮＡの不十分な取り込みが、そのような制限の主な原因であり得る。抗原－Ｉｇキメラワクチンと組み合わせて、ＡＰＣ抗原提示の増強に基づく有望な新しいＤＮＡワクチン戦略が報告されており（Ｃａｓａｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２９－３６（１９９７）、Ｇｅｒｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：８７６－８１（１９９７）、Ｇｅｒｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６１１－２５（１９９７）、Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３７０４－１１（２００１）を参照されたい）、これは、ＤＣの表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲｓ）の存在を利用する。
【0171】
抗原（Ａｇ）－ＩｇキメラをコードするＤＮＡワクチンを生成することが可能である。免疫すると、Ａｇ－Ｉｇ融合タンパク質が発現され、ＤＮＡ分子を取り込んだ細胞によって分泌されることになる。分泌されたＡｇ－Ｉｇ融合タンパク質は、Ｂ細胞応答を誘導する一方で、ＤＣ表面上のＦｃγＲとのＦｃ断片の相互作用によって捕捉及び内在化され得、これは、効率的な抗原提示を促進し、抗原特異的免疫応答を大いに増強するであろう。同じ原理を適用して、機能的な抗ＭＨＣ ＩＩ特異的ｓｃＦｖ領域遺伝子を担持する抗原－ＩｇキメラをコードするＤＮＡはまた、ＡＰＣの３つ全ての型に対する免疫原を標的とし得る。免疫応答は、必要に応じて、インビトロで生成された同じタンパク質抗原の使用によって更にブーストされ得る（すなわち、「プライム及びブースト」）。この戦略を用いて、インフルエンザウイルスの感染に対する特異的細胞性及び体液性免疫応答を、ＤＮＡワクチンの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を介して達成した。（Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２９－３６（１９９７）を参照されたい）。
【0172】
ワクチン組成物
治療的又は予防的組成物が本明細書で提供され、これは一般に、１つ以上のモノクローナル抗体又はＳｃＦｖの混合物、及びそれらの組み合わせを含む。予防的ワクチンは、インフルエンザウイルス感染を予防するために使用することができ、治療的ワクチンは、インフルエンザウイルス感染後の個体を治療するために使用することができる。予防的使用には、ワクチン接種対象におけるインフルエンザウイルスに対する増加した抗体力価の提供が含まれる。このようにして、インフルエンザに罹患するリスクが高い対象に、インフルエンザウイルスに対する受動免疫を提供することができる
治療的又は予防的組成物が本明細書で提供され、これは一般に、１つ以上のモノクローナル抗体又はＳｃＦｖの混合物、及びそれらの組み合わせを含む。予防的ワクチンは、インフルエンザウイルス感染を予防するために使用することができ、治療的ワクチンは、インフルエンザウイルス感染後の個体を治療するために使用することができる。予防的使用には、ワクチン接種対象におけるインフルエンザウイルスに対する増加した抗体力価の提供が含まれる。このようにして、インフルエンザに罹患するリスクが高い対象に、インフルエンザウイルスに対する受動免疫を提供することができる
【0173】
これらのワクチン組成物は、補助的な免疫調節剤とともに投与することができる。例えば、サイトカイン、リンホカイン、及びケモカインは、ＩＬ－２、修飾ＩＬ－２（Ｃｙｓ１２５→Ｓｅｒ１２５）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、γ－インターフェロン、ＩＰ－１０、ＭＩＰ１β、及びＲＡＮＴＥＳを含むが、これらに限定されない。
【0174】
免疫化の方法
本発明のワクチンは、他の抗ウイルスワクチンよりも優れた免疫防御及び免疫治療特性を有する
本発明のワクチンは、他の抗ウイルスワクチンよりも優れた免疫防御及び免疫治療特性を有する
【0175】
本発明は、対象の免疫化の方法、例えば、免疫応答を誘導する方法を提供する。対象は、病原性エンベロープウイルスの膜融合タンパク質を含有する組成物を対象に投与することによって免疫化される。融合タンパク質は、コーティングされるか、又は生物学的に適合性のマトリックス中に包埋される。
【0176】
融合タンパク質は、グリコシル化され、例えば、炭水化物部分を含有する。炭水化物部分は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、又はそれらの誘導体（例えば、スルホ又はリン置換された）の形態であってもよい。炭水化物は、直鎖状又は分枝状である。炭水化物部分は、ポリペプチドに対してＮ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型グリコシル化は、アスパラギン側鎖のアミド窒素に対するものであり、Ｏ結合型グリコシル化は、セリン及びスレオニン側鎖のヒドロキシ酸素に対するものである。
【0177】
炭水化物部分は、ワクチン接種される対象に対して内因性である。代替として、炭水化物部分は、ワクチン接種される対象にとって外因性である。炭水化物部分は、典型的には、ワクチン接種される対象のポリペプチド上に発現されない炭水化物部分である。例えば、炭水化物部分は、植物特異的炭水化物である。植物特異的炭水化物部分としては、例えば、コア結合α１，３フコース又はコア結合β１，２キシロースを有するＮ結合型グリカンが挙げられる。代替として、炭水化物部分は、ワクチン接種される対象のポリペプチド又は脂質上に発現される炭水化物部分である。例えば、多くの宿主細胞は、ヒト様糖結合を有するヒトタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。
【0178】
例えば、融合タンパク質は、三量体赤血球凝集素タンパク質である。任意選択で、赤血球凝集素タンパク質は、植物細胞などの非哺乳動物細胞において産生される。
【0179】
対象は、ウイルス感染を発症するリスクがあるか、又はウイルス感染に罹患している。エンベロープウイルスとしては、例えば、エプスタインバーウイルス、単純疱疹ウイルス１型及び２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、及び風疹ウイルスが挙げられる。
【0180】
本明細書に記載される方法は、ウイルス感染の重症度の低減又は１つ以上の症状の緩和をもたらす。感染は、典型的には医師によって標準的な方法論を使用して診断及び／又はモニタリングされる。免疫化を必要とする対象は、当技術分野で既知の方法によって識別される。例えば、対象は、ＣＤＣのＧｅｎｅｒａｌ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ（５１（ＲＲ０２）ｐｐ１－３６）に概説されているように免疫化される。がんは、例えば、身体検査、生検、血液検査、又はＸ線によって診断される。
【0181】
対象は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、魚、又はトリである。治療は、感染の診断前に施される。代替として、治療は、診断後に施される。
【0182】
治療の有効性は、特定の障害又は感染を診断又は治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。障害の１つ以上の症状の緩和は、化合物が臨床的利益を与えることを示す。
【0183】
ワクチンについての抗原タンパク質断片（Antigenic Protein Fragment、ＡＰＦ）の評価
体液性免疫を標的とするワクチン候補は、成功するために以下の少なくとも３つの基準を満たさなければならない：それは、強い抗体応答（「免疫原性」）を誘発しなければならない；それが誘発する抗体のかなりの割合が、病原体と交差反応しなければならない（「免疫原性適合性」）；それが誘発する抗体は、防御的でなければならない。免疫原性は、しばしば、アジュバント又は担体を使用して増強され得るが、免疫原性適合性及び防御を誘導する能力（中和によって証明されるような）は、ワクチン成分としてのその抗原の成功を最終的に決定するであろう抗原の固有の特性である。
体液性免疫を標的とするワクチン候補は、成功するために以下の少なくとも３つの基準を満たさなければならない：それは、強い抗体応答（「免疫原性」）を誘発しなければならない；それが誘発する抗体のかなりの割合が、病原体と交差反応しなければならない（「免疫原性適合性」）；それが誘発する抗体は、防御的でなければならない。免疫原性は、しばしば、アジュバント又は担体を使用して増強され得るが、免疫原性適合性及び防御を誘導する能力（中和によって証明されるような）は、ワクチン成分としてのその抗原の成功を最終的に決定するであろう抗原の固有の特性である。
【0184】
免疫原性適合性の評価
「免疫原性適応度」は、病原体と交差反応する抗原によって誘導される抗体の割合として定義される。（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：８３７（２００２）を参照されたい）。これは、病原体と交差反応しない抗体を含む、抗原によって誘導される全ての抗体の力価によって測定される免疫原性とは異なる。不適切な免疫原性適合性は、おそらく、今日までのペプチドワクチンの期待外れの追跡記録に寄与してきた。高い親和性で抗体に結合し、高い抗体力価を誘発するペプチドは、頻繁に適切な免疫原性適合性を欠き、したがって、それらは潜在的なワクチン成分として失敗する。したがって、インフルエンザワクチン候補を選択するための基準の１つとして免疫原性適合性を含めることが重要である。
「免疫原性適応度」は、病原体と交差反応する抗原によって誘導される抗体の割合として定義される。（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：８３７（２００２）を参照されたい）。これは、病原体と交差反応しない抗体を含む、抗原によって誘導される全ての抗体の力価によって測定される免疫原性とは異なる。不適切な免疫原性適合性は、おそらく、今日までのペプチドワクチンの期待外れの追跡記録に寄与してきた。高い親和性で抗体に結合し、高い抗体力価を誘発するペプチドは、頻繁に適切な免疫原性適合性を欠き、したがって、それらは潜在的なワクチン成分として失敗する。したがって、インフルエンザワクチン候補を選択するための基準の１つとして免疫原性適合性を含めることが重要である。
【0185】
乏しい免疫原性適合性についての一般的な説明は、ほとんどの短いペプチドの立体構造の柔軟性である。具体的には、柔軟なペプチドは、患者からの抗体によく結合し、投薬を受けていない対象においてかなりの抗体力価を誘発し得る。しかしながら、ペプチドが立体構造の大きなレパートリーを有する場合、投薬を受けていない対象においてそれが誘導する抗体の優勢は、インタクトな病原体上の対応する天然エピトープと交差反応できない可能性がある。
【0186】
短いペプチドと同様に、いくつかのＡＰＦは、非常に柔軟である可能性があり、したがってワクチン成分として機能しない可能性がある。最も免疫原的に適合するＡＰＦは、タンパク質全体の文脈外で本質的に拘束されている自己折り畳みタンパク質サブドメインからなる可能性が高い。
【0187】
免疫原性適合性は、主にＡＰＦ自体の特性であり、応答する免疫系の特性ではないので、最終的にＡＰＦがヒトにおいて機能しなければならないとしても、免疫原性適合性を動物モデルにおいて（例えば、マウスにおいて）評価することができる。
【0188】
ＡＰＦによって達成される免疫原性適合性は、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：８３７（２００２）に記載される手順と同様の手順で、精製されたスパイク又は膜タンパク質を有する抗ＡＰＦ血清の免疫吸着によって評価される。ＩｇＧは、免疫化されたマウスから収集した血清から精製される。精製されたビオチン化タンパク質（必要に応じて、マウスを免疫化した特定のＡＰＦに依存する）をマウスＩｇＧと混合し、インキュベートする。次いで、ストレプトアビジンでコーティングされたセファロースビーズを十分な量で添加して、任意の結合ＩｇＧとともにビオチン化タンパク質の全てを捕捉する。ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを微量遠心機において１３０００ｒｐｍで遠心分離することによって除去し、それぞれタンパク質に対する抗体が枯渇したＩｇＧを残す。モック免疫吸着は、ビオチン化ＢＳＡがモック吸着剤としてインフルエンザタンパク質の代わりに置換されることを除いて、同じ方法で並行して行われる。
【0189】
ＡＰＦの免疫原性適合性を測定するために、吸収された抗体及びモック吸収された抗体を、免疫ＡＰＦに対するＥＬＩＳＡにおいて並行して力価測定する。ファージディスプレイＮＰＬから選択されたＡＰＦ親和性について、これらのＥＬＩＳＡのための抗原は、精製されたＡＰＦ－ＧＳＴ融合タンパク質であろう。ＮＰＬを提示する哺乳動物細胞からの潜在的にグリコシル化されたＡＰＦについては、これらのＥＬＩＳＡのための抗原は、哺乳動物細胞によって分泌され、プロテインＡで精製されたＡＰＦ－Ｆｃ融合タンパク質であろう。モック吸着抗体と比較して、吸着抗体の抗ＡＰＦ力価の減少率は、ＡＰＦの免疫原性適合性の尺度を提供する。
【0190】
治療方法
本発明は、インフルエンザウイルス関連疾患又は障害のリスクがある（又は感受性がある）対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。そのような疾患又は障害としては、例えば、鳥インフルエンザが挙げられるが、これに限定されない。
本発明は、インフルエンザウイルス関連疾患又は障害のリスクがある（又は感受性がある）対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。そのような疾患又は障害としては、例えば、鳥インフルエンザが挙げられるが、これに限定されない。
【0191】
予防的方法
一態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはｓｃＦｖ抗体又は本発明の方法に従って識別された薬剤を対象に投与することによって、対象におけるインフルエンザウイルス関連疾患又は障害を予防するための方法を提供する。例えば、ｓｃＦｖ及び／又はモノクローナル抗体は、治療有効量で投与することができる。任意選択で、２つ以上の抗インフルエンザ抗体が同時投与される。
一態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはｓｃＦｖ抗体又は本発明の方法に従って識別された薬剤を対象に投与することによって、対象におけるインフルエンザウイルス関連疾患又は障害を予防するための方法を提供する。例えば、ｓｃＦｖ及び／又はモノクローナル抗体は、治療有効量で投与することができる。任意選択で、２つ以上の抗インフルエンザ抗体が同時投与される。
【0192】
インフルエンザウイルス関連疾患又は障害のリスクがある対象には、感染者と接触した患者、又は何らかの他の方法でインフルエンザウイルスに曝露された患者が含まれる。予防剤の投与は、疾患又は障害が予防されるか、代替としてその進行が遅延されるように、インフルエンザウイルス関連疾患又は障害に特徴的な症状が現れる前に行うことができる。
【0193】
適切な薬剤は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。代替として、又は加えて、投与される薬剤は、本発明の方法に従って識別されたインフルエンザウイルスを中和するｓｃＦｖ又はモノクローナル抗体である。
【0194】
治療的方法
本発明の別の態様は、患者におけるインフルエンザウイルス関連疾患又は障害を治療する方法に関する。一実施形態では、本方法は、インフルエンザを中和する薬剤（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって識別される薬剤及び／又は本発明の方法に従って識別されるｓｃＦｖ抗体若しくはモノクローナル抗体）又は薬剤の組合せを、疾患又は障害に罹患している患者に投与することを含む。例えば、本発明の抗体は、例えば、タミフルなどの他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用することができる。
本発明の別の態様は、患者におけるインフルエンザウイルス関連疾患又は障害を治療する方法に関する。一実施形態では、本方法は、インフルエンザを中和する薬剤（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって識別される薬剤及び／又は本発明の方法に従って識別されるｓｃＦｖ抗体若しくはモノクローナル抗体）又は薬剤の組合せを、疾患又は障害に罹患している患者に投与することを含む。例えば、本発明の抗体は、例えば、タミフルなどの他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用することができる。
【0195】
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の例に更に記載される。
【実施例】
【0196】
実施例１：単一記憶Ｂ細胞の培養物からのインフルエンザウイルスに対するｂｎＡｂの単離
広域中和抗体（ＢｎＡｂ）単離手順の概略図を図１に示す。ヒト記憶Ｂ細胞レパートリーからインフルエンザウイルスに対するｂｎＡｂを単離するために、本発明者らは、インビトロでのヒト記憶Ｂ細胞活性化及び分化を可能にする迅速かつ信頼性のある培養方法を確立した。抗原特異的ヒト記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）を、四量体化Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／０７）三量体を使用して、７人の健常ドナーの末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離し、記憶Ｂ細胞の０．１９％～１．０８％のみがＨ３と反応性であった（表３）。これらのＢ細胞を１つのウェル当たり１つの細胞の密度で３８４ウェルプレートに選別し、照射ＣＤ４０Ｌトランスフェクト細胞の存在下で培養した。１４日後、７人のドナーに由来する１０５１個（２６８８個の培養物中３９．１％）の培養上清がＩｇＧ又はＩｇＭを分泌することが見出され、Ｂ型インフルエンザのＨ３（Ａ／Brisbane／１０／０７）、Ｈ７（Ａ／Canada／ＲＶ４４４／０４）、Ｈ１（Ａ／California／０４／０９）、及びＨＡ（Ｂ／Malaysia／２５０６／０４）との反応性について順次試験した。このスクリーニングを通して、２３７個（２２．５５％）の拡大増殖された記憶Ｂ細胞が、Ｈ３に結合するＩｇを分泌することが見出された（表３）。このインビトロ拡大増殖工程は、選別及びＲＴ－ＰＣＲのみによる０．６１％の回収と比較して、Ｈ３反応性Ｂ細胞回収において３７倍の増加をもたらした（データは示さず）。グループ２の株Ｈ３／Ｈ７内の交差反応性クローンの平均パーセンテージは、１８．１４％であった。注目すべきことに、Ｈ３結合クローンの１３．０８％及び８．４４％が、それぞれグループ１のＨ１株及びＨ７／Ｈ１株へのヘテロサブタイプ結合を示した。３．３８％のＨ３反応性（Ｈ３＋）クローンのみが、Ｂ型インフルエンザにも結合することが見出された。次に、ヘテロサブタイプ結合を示した記憶Ｂ細胞クローンの上清を、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Brisbane／１０／０７）に対するマイクロ中和について試験した。Ｈ３／Ｈ７／Ｈ１交差反応性及び中和を示したドナー３に由来する１つのｂｎＡｂ、３Ｉ１４を更に特徴付けた。
広域中和抗体（ＢｎＡｂ）単離手順の概略図を図１に示す。ヒト記憶Ｂ細胞レパートリーからインフルエンザウイルスに対するｂｎＡｂを単離するために、本発明者らは、インビトロでのヒト記憶Ｂ細胞活性化及び分化を可能にする迅速かつ信頼性のある培養方法を確立した。抗原特異的ヒト記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）を、四量体化Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／０７）三量体を使用して、７人の健常ドナーの末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離し、記憶Ｂ細胞の０．１９％～１．０８％のみがＨ３と反応性であった（表３）。これらのＢ細胞を１つのウェル当たり１つの細胞の密度で３８４ウェルプレートに選別し、照射ＣＤ４０Ｌトランスフェクト細胞の存在下で培養した。１４日後、７人のドナーに由来する１０５１個（２６８８個の培養物中３９．１％）の培養上清がＩｇＧ又はＩｇＭを分泌することが見出され、Ｂ型インフルエンザのＨ３（Ａ／Brisbane／１０／０７）、Ｈ７（Ａ／Canada／ＲＶ４４４／０４）、Ｈ１（Ａ／California／０４／０９）、及びＨＡ（Ｂ／Malaysia／２５０６／０４）との反応性について順次試験した。このスクリーニングを通して、２３７個（２２．５５％）の拡大増殖された記憶Ｂ細胞が、Ｈ３に結合するＩｇを分泌することが見出された（表３）。このインビトロ拡大増殖工程は、選別及びＲＴ－ＰＣＲのみによる０．６１％の回収と比較して、Ｈ３反応性Ｂ細胞回収において３７倍の増加をもたらした（データは示さず）。グループ２の株Ｈ３／Ｈ７内の交差反応性クローンの平均パーセンテージは、１８．１４％であった。注目すべきことに、Ｈ３結合クローンの１３．０８％及び８．４４％が、それぞれグループ１のＨ１株及びＨ７／Ｈ１株へのヘテロサブタイプ結合を示した。３．３８％のＨ３反応性（Ｈ３＋）クローンのみが、Ｂ型インフルエンザにも結合することが見出された。次に、ヘテロサブタイプ結合を示した記憶Ｂ細胞クローンの上清を、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Brisbane／１０／０７）に対するマイクロ中和について試験した。Ｈ３／Ｈ７／Ｈ１交差反応性及び中和を示したドナー３に由来する１つのｂｎＡｂ、３Ｉ１４を更に特徴付けた。
【0197】
（表３）７人の健常ドナーにおける拡大増殖された記憶Ｂ細胞（ｍＢ）
＊クローン化可能なｍＢのパーセントは、１０５１個のＩｇ陽性培養物からのものである。＊＊クローン化可能なｍＢのパーセントは、２３７個のＨ３陽性培養物からのものである
【0198】
３Ｉ１４は、高度に変異したＩＧＨＶ３－３０コード抗体である
親和性成熟に対する体細胞変異の寄与を評価するために、本発明者らは、３Ｉ１４ ＶＨ及びＶＬ生殖系列バージョン（３Ｉ１４－ＧＬ）、並びに生殖系列（ｇ）軽鎖と対になった成熟（ｍ）３Ｉ１４重鎖（３Ｉ１４－ｍＨｇＬ）及びその逆（３Ｉ１４－ｇＨｍＬ）によって形成されるキメラ抗体を作製した（図１１）。３Ｉ１４バリアント抗体をヒトＩｇＧ１として発現させ、Ｈ１、Ｈ５、及びＨ３に対するそれらの結合親和性を評価した（表４及び図２０）。注目すべきことに、３Ｉ１４－ＧＬバリアントは、ｎＭ及びサブｎＭ範囲で依然としてＨ３及びＨ１に結合したが、それぞれ、Ｈ３に対する結合親和性の１５倍超の減少及びＨ１に対する結合親和性の４．７倍の増加を示した（表４）。Ｈ３及びＨ１に対する３Ｉ１４－ＧＬ結合親和性のこれらの変化は、主に、それぞれ１３．９倍又は７．５倍のＫｏｆｆの増加及び減少によって引き起こされた。興味深いことに、３Ｉ１４－ＧＬは、これらのアッセイ条件下でＨ５に結合しなかった。
親和性成熟に対する体細胞変異の寄与を評価するために、本発明者らは、３Ｉ１４ ＶＨ及びＶＬ生殖系列バージョン（３Ｉ１４－ＧＬ）、並びに生殖系列（ｇ）軽鎖と対になった成熟（ｍ）３Ｉ１４重鎖（３Ｉ１４－ｍＨｇＬ）及びその逆（３Ｉ１４－ｇＨｍＬ）によって形成されるキメラ抗体を作製した（図１１）。３Ｉ１４バリアント抗体をヒトＩｇＧ１として発現させ、Ｈ１、Ｈ５、及びＨ３に対するそれらの結合親和性を評価した（表４及び図２０）。注目すべきことに、３Ｉ１４－ＧＬバリアントは、ｎＭ及びサブｎＭ範囲で依然としてＨ３及びＨ１に結合したが、それぞれ、Ｈ３に対する結合親和性の１５倍超の減少及びＨ１に対する結合親和性の４．７倍の増加を示した（表４）。Ｈ３及びＨ１に対する３Ｉ１４－ＧＬ結合親和性のこれらの変化は、主に、それぞれ１３．９倍又は７．５倍のＫｏｆｆの増加及び減少によって引き起こされた。興味深いことに、３Ｉ１４－ＧＬは、これらのアッセイ条件下でＨ５に結合しなかった。
【0199】
（表４）３Ｉ１４生殖系列バリアントの結合親和性
（Δ）は、ＷＴと比較した倍増加又は（－Δ）倍減少を示す。
＊ｎは、結合が検出されないことを示す。＊＊は、検出可能な解離がないことを示す。
＊ｎは、結合が検出されないことを示す。＊＊は、検出可能な解離がないことを示す。
【0200】
２つのキメラ形態を野生型（ＷＴ）３Ｉ１４と比較すると、３Ｉ１４のＶＨ及びＶＬの両方に存在する体細胞変異は、Ｈ３結合に同等に寄与するようである（Ｋｄ：０．６５８ｎＭ対０．７３３ｎＭ）。加えて、重鎖キメラ及び軽鎖キメラの両方は、１．０Ｅ－７ｓ－１未満のＫｏｆｆでＨ１への本質的に不可逆的な結合をもたらした。しかしながら、Ｈ５の場合、ＶＬ変異は、Ｋｏｆｆがそれぞれ５．２倍及び２．２倍減少するため、ＶＨ変異よりも親和性の増加に寄与する（７．５倍対１．９倍）。これらの研究から、本発明者らは、３Ｉ１４－ＧＬが、Ｈ１に対するより高い親和性結合及びＨ３に対する中程度の親和性を示し、Ｋｏｆｆの変化が、３Ｉ１４－ＷＴと比較して、動力学的差異に大きく関与していると結論付ける。Ｈ５結合について、３Ｉ１４における体細胞変異は、ＶＨ変化よりも結合に大きく寄与するＶＬ変異との結合に絶対的に必要とされる。Ｈ１、Ｈ３、及びＨ５への結合親和性の全ての変化は、主に解離速度（Ｋｏｆｆ）定数の変化の結果である。
【0201】
ＲＴ－ＰＣＲを使用して、拡大増殖された単一細胞培養物から重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の配列を回収した。３Ｉ１４は、ＩＧＨＶ３－３０＊１８及びＩＧＬＶ１－４４＊０１生殖系列遺伝子によってコードされる。再配置された重鎖は、長い相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）（２３個のアミノ酸）を有し、ＶＨ接合部及びＩＧＨＪ４＊０２接合部の両方で大きなＮ付加が隣接するＩＧＨＤ３－２２＊０１ ＤＨセグメントを使用する（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。３Ｉ１４ ｍＡｂは、フレームワーク及びＣＤＲの両方において観察されるプライマー隣接領域を除いて、１５個の可変重鎖及び７個の可変軽鎖体細胞変異を有する。
【0202】
実施例２：３Ｉ１４は、グループ１及びグループ２のインフルエンザウイルスの両方に結合及び中和を付与する
３Ｉ１４は、フローサイトメトリーによって、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１４、及びＨ１５）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、及びＨ１６）のＡ型インフルエンザウイルスの両方の血清型にわたって細胞表面発現ＨＡに結合した（図２）。３Ｉ１４はまた、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ５、及びＨ９）に属する異なるサブタイプの精製ＨＡタンパク質に、０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）で結合した（図３及び図１５Ｃ）。３Ｉ１４は、全ての試験したグループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に高い親和性（平均Ｋｄ＜０．１ｎＭ）で結合した。加えて、３Ｉ１４は、グループ１のＨ１サブタイプ（Ｈ１－ＣＡ０９、Ｈ１－ＳＩ０６、及びＨ１－ＰＲ８）に高い親和性で結合したが、他のグループ１のサブタイプ（Ｈ５－ＶＮ０４、Ｈ５－ＩＮ０５、及びＨ９－ＨＫ９９）に対するその親和性は低かった（それぞれ平均Ｋｄ＝１．０２、１．０５、及び５．２３ｎＭ）。
３Ｉ１４は、フローサイトメトリーによって、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１４、及びＨ１５）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、及びＨ１６）のＡ型インフルエンザウイルスの両方の血清型にわたって細胞表面発現ＨＡに結合した（図２）。３Ｉ１４はまた、グループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）及びグループ１（Ｈ１、Ｈ５、及びＨ９）に属する異なるサブタイプの精製ＨＡタンパク質に、０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）で結合した（図３及び図１５Ｃ）。３Ｉ１４は、全ての試験したグループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に高い親和性（平均Ｋｄ＜０．１ｎＭ）で結合した。加えて、３Ｉ１４は、グループ１のＨ１サブタイプ（Ｈ１－ＣＡ０９、Ｈ１－ＳＩ０６、及びＨ１－ＰＲ８）に高い親和性で結合したが、他のグループ１のサブタイプ（Ｈ５－ＶＮ０４、Ｈ５－ＩＮ０５、及びＨ９－ＨＫ９９）に対するその親和性は低かった（それぞれ平均Ｋｄ＝１．０２、１．０５、及び５．２３ｎＭ）。
【0203】
３Ｉ１４は、２つの再集合体ウイルス株（Ａ／Wisconsin／６７／０５（ＨＡ、ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４及びＡ／Aichi／２／６８（ＨＡ、ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４）及び新規Ｈ７Ｎ９－ＡＨ１３株を含む、多数のグループ２（Ｈ３及びＨ７）のウイルスを強力に中和し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値は、０．０３２～１．０７４μｇ ｍｌ－１の範囲であった（図４及び図１７）。それはまた、偽ウイルスＨ７Ｎ１－ＦＰＮ及びＨ７Ｎ１－ＮＬ２１９株を中和し、ＩＣ５０値は、０．００７～０．０２７μｇ ｍｌ－１の範囲であった（図５Ｂ及び図１７）。加えて、３Ｉ１４は、それぞれ、０．２２５及び０．４１３μｇ ｍｌ－１のＩＣ５０値でグループ１のＨ１染色（Ｈ１－ＣＡ０９及びＨ１－ＰＲ８）を（図５Ｂ及び図１０）、０．０４０及び０．００８μｇ ｍｌ－１のＩＣ５０値で偽ウイルスＨ５－ＶＮ０４及びＨ５－ＨＫ９７を中和した（図５Ｂ及び図１７）。
【0204】
実施例３：３Ｉ１４ ＩｇＧ１結合（ＫＤ値）
組換えＨＡ三量体へのｂｎＡｂ結合の動態分析を、２５℃でＯｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を使用する生体層干渉法で行った。５ｎＭのｂｎＡｂ ＩｇＧ１を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質フリーブロッキング緩衝液（Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）中の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃバイオセンサー上に１８０秒間捕捉した。組換え全長ＨＡを、６．２５～１００ｎＭの範囲の濃度で装填した。全ての実験は、ＨＡと抗ヒトＩｇＧ Ｆｃとの間の潜在的な非特異的相互作用について試験する追加の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体バイオセンサーを含んだ。ｋ－ｏｎの測定のために、センサーを最大２０の濃度のＨＡに曝露することによって、３Ｉ１４ ＩｇＧ１の会合を６００秒間測定した。ｋ－ｏｆｆの測定のために、３Ｉ１４ ＩｇＧ１の解離を９００秒間測定した。親和定数（Ｋｄ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０ソフトウェアを使用して計算した。
組換えＨＡ三量体へのｂｎＡｂ結合の動態分析を、２５℃でＯｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を使用する生体層干渉法で行った。５ｎＭのｂｎＡｂ ＩｇＧ１を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質フリーブロッキング緩衝液（Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）中の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃバイオセンサー上に１８０秒間捕捉した。組換え全長ＨＡを、６．２５～１００ｎＭの範囲の濃度で装填した。全ての実験は、ＨＡと抗ヒトＩｇＧ Ｆｃとの間の潜在的な非特異的相互作用について試験する追加の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体バイオセンサーを含んだ。ｋ－ｏｎの測定のために、センサーを最大２０の濃度のＨＡに曝露することによって、３Ｉ１４ ＩｇＧ１の会合を６００秒間測定した。ｋ－ｏｆｆの測定のために、３Ｉ１４ ＩｇＧ１の解離を９００秒間測定した。親和定数（Ｋｄ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０ソフトウェアを使用して計算した。
【0205】
３Ｉ１４は、グループ１（Ｈ１及びＨ５）及びグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）に属する異なるサブタイプの精製ＨＡタンパク質に結合し、Ｋｄ値は、０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲であった（図３）。３Ｉ１４は、グループ２のＨＡ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１４）のほとんどに高い親和性（平均Ｋｄ＜０．１ｎＭ）で結合した。対照的に、３Ｉ１４は、高い親和性でＨ１サブタイプ（Ｈ１－ＣＡ４０９、Ｈ１－ＳＩ０６、及びＨ１－ＰＲ８）に結合したが、他のグループ１のサブタイプ（Ｈ５－ＶＮ０４及びＨ５－ＩＮ０５）に対するその親和性は、かなり低かった（平均Ｋｄ＞１ｎＭ）。
【0206】
Ｈ１サブタイプ Ａ／California／０４／０９（Ｈ１－ＣＡ４０９）、Ａ／Solomon Island／３／０６（Ｈ１－ＳＩ０６）、及びＡ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ１－ＰＲ８）；Ｈ３サブタイプ Ａ／Perth／１６／０９（Ｈ３－ＰＥ０９）、Ａ／Uruguay／７１６／０７（Ｈ３－ＵＹ０７）、Ａ／Wisconsin／６７／０５（Ｈ３－ＷＩ０５）、Ａ／Brisbane／１０／０７（Ｈ３－ＢＲ０７）、Ａ／New York／５５／０４（Ｈ３－ＮＹ０４）、及びＡ／Victoria／３４１／１１（Ｈ３－ＶＩＣ１１）；Ｈ５ Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５－ＶＮ０４）、Ａ／Hong Kong／２１３／０３（Ｈ５－ＨＫ０３）、及びＡ／Indonesia／０５／０５（Ｈ５－ＩＤ０５）；Ｈ７ Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７－ＮＬ２１９）、Ａ／Canada／ＲＶ４４４／０４（Ｈ７－ＣＡ４４４）、及びＡ／Anhui／１／１３（Ｈ７－ＡＨ１３）の組換え全長ＨＡタンパク質（ｒＨＡ）は、ＮＩＨ ＢＥＩＲ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ）から入手した。組換え全長Ｈ３ Ａ／Wisconsin／１２／２０１０（Ｈ３－ＷＩ１０）は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＩＲＲ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳＡ）から入手した。サブタイプＨ３ Ａ／Aichi／２／６８（Ｈ３－Ａ２６８）、Ｈ４ Ａ／mallard／Netherlands／２／０５（Ｈ４－ＮＬ０５）、及びＨ１４ Ａ／mallard／Astrakhan／２６３／８２（Ｈ１４－ＡＳ８２）の組換え全長ＨＡは、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ（Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）から快く贈与された。
【0207】
実施例４．３Ｉ１４ ＩｇＧ１中和（ＩＣ５０値）
ＩＣ５０グラフは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を示す。３Ｉ１４を四角で表し、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０ ＩｇＧ１（三角で表す）を対照として使用した（図４及び図５）。
ＩＣ５０グラフは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を示す。３Ｉ１４を四角で表し、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０ ＩｇＧ１（三角で表す）を対照として使用した（図４及び図５）。
【0208】
ＭＤＣＫ細胞（１．５×１０４個の細胞／ウェル）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍＬのトリプシン及び０．５％ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ中でインキュベートした。１００ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを、９６ウェルプレート中で、Ａｂ又は抗体含有上清の２倍連続希釈物と等体積で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｂ－ウイルス混合物をコンフルエントなＭＤＣＫ単層に二連で移し、続いて３７℃で２１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、アセトン中で固定し、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質（Nucleoprotein、ＮＰ）に対するｍＡｂ（クローンＡ３、ＢＥＩ）を用いた間接ＥＬＩＳＡによってウイルス抗原を検出した。５０％阻害濃度（half maximal inhibitory concentration）（ＩＣ５０）は、バックグラウンドを差し引いた後にウイルス対照を含有するウェルと比較して、有効性が５０％低下したＡｂ濃度である。
【0209】
３Ｉ１４は、グループ１（Ｈ１）及びグループ２（Ｈ３及びＨ７）のウイルスをインビトロで中和した。３Ｉ１４は、異なるＨ１、Ｈ３、及びＨ７ウイルスを強力に中和し、ＩＣ５０値は、０．０３２～１．３３６μｇ／ｍｌの範囲であった（図４及図５）。
【0210】
実施例５．グループ１及びグループ２のサブタイプを代表する偽ウイルスの３Ｉ１４ ＩｇＧ１中和（ＩＣ５０値）。
ＩＣ５０グラフは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を示す。３Ｉ１４を四角で表し、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０ ＩｇＧ１（三角で表す）を対照として使用した。
ＩＣ５０グラフは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を示す。３Ｉ１４を四角で表し、抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０ ＩｇＧ１（三角で表す）を対照として使用した。
【0211】
３Ｉ１４は、Ｈ７Ｎ１－ＦＰＮ及びＨ７Ｎ１－ＮＬ２１９を強力に中和し、その両方がグループ２の偽ウイルスであり、ＩＣ５０値は、０．０３２～１．３３６μｇ／ｍｌの範囲であった。それはまた、グループ１の偽ウイルスＨ５－ＶＮ０４及びＨ５－ＨＫ９７を、それぞれ２．１３７及び４．６０１μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値で中和した（図５）。
【0212】
実施例６．マウスにおけるグループ２及びグループ１のインフルエンザウイルスに対する３Ｉ１４の予防的有効性
本発明者らは、３Ｉ１４を全長ヒトＩｇＧ１に変換して、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、及びＨ７Ｎ９感染に対する防御的有効性を評価した（図６）。抗グループ１のＡｂ、Ｆ１０１２を染色特異的対照として使用した。致死用量のＨ７Ｎ７－ＮＬ２１９、Ｈ７Ｎ９－ＡＨ１３、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７－ｍａ、及びＨ５Ｎ１－ＶＮ０４ウイルスでチャレンジする１日前に、マウスを様々な用量の３Ｉ１４及びＦ１０ ＩｇＧ１で処置した。５ｍｇ ｋｇ－１の３Ｉ１４ ＩｇＧ１を使用する予防は、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９又はＨ７Ｎ９－ＡＨ１３チャレンジ後にマウスを死亡から完全に防御し、１４～１８日目に最小限の体重減少を伴った（図６Ａ）。２５ｍｇ ｋｇ－１の用量で、３Ｉ１４ ＩｇＧ１は、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７に対して８０％の防御及びＨ５Ｎ１－ＶＮ０４に対して６０％の防御を示した。全ての生存マウスは、観察期間の終わりまでに体重減少の逆転を示した（図６ｂ）。５匹のマウスのグループを、Ｈ３Ｎ２ ＢＲ０７、Ｈ５Ｎ１ ＶＮ０４、Ｈ７Ｎ９ ＡＵ１３、又はＨ７Ｎ７ ＮＬ２１９インフルエンザウイルスのｉ．ｎ．接種によって致死チャレンジする２４時間前に、２５又は５ｍｇ／ｋｇの精製ＩｇＧで腹腔内処置した。（Ａ）マウスの生存率（％）、並びに（Ｂ）ｂｎＡｂ ３Ｉ１４（赤色）、グループ１の対照ｍＡｂ Ｆ１０（黒色）、及びグループ２の対照ｍＡｂ Ａ５３３（青色）で処置した体重変化（％）。
本発明者らは、３Ｉ１４を全長ヒトＩｇＧ１に変換して、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＨ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、及びＨ７Ｎ９感染に対する防御的有効性を評価した（図６）。抗グループ１のＡｂ、Ｆ１０１２を染色特異的対照として使用した。致死用量のＨ７Ｎ７－ＮＬ２１９、Ｈ７Ｎ９－ＡＨ１３、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７－ｍａ、及びＨ５Ｎ１－ＶＮ０４ウイルスでチャレンジする１日前に、マウスを様々な用量の３Ｉ１４及びＦ１０ ＩｇＧ１で処置した。５ｍｇ ｋｇ－１の３Ｉ１４ ＩｇＧ１を使用する予防は、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９又はＨ７Ｎ９－ＡＨ１３チャレンジ後にマウスを死亡から完全に防御し、１４～１８日目に最小限の体重減少を伴った（図６Ａ）。２５ｍｇ ｋｇ－１の用量で、３Ｉ１４ ＩｇＧ１は、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７に対して８０％の防御及びＨ５Ｎ１－ＶＮ０４に対して６０％の防御を示した。全ての生存マウスは、観察期間の終わりまでに体重減少の逆転を示した（図６ｂ）。５匹のマウスのグループを、Ｈ３Ｎ２ ＢＲ０７、Ｈ５Ｎ１ ＶＮ０４、Ｈ７Ｎ９ ＡＵ１３、又はＨ７Ｎ７ ＮＬ２１９インフルエンザウイルスのｉ．ｎ．接種によって致死チャレンジする２４時間前に、２５又は５ｍｇ／ｋｇの精製ＩｇＧで腹腔内処置した。（Ａ）マウスの生存率（％）、並びに（Ｂ）ｂｎＡｂ ３Ｉ１４（赤色）、グループ１の対照ｍＡｂ Ｆ１０（黒色）、及びグループ２の対照ｍＡｂ Ａ５３３（青色）で処置した体重変化（％）。
【0213】
実験の１日前に、５匹の雌８～１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、３Ｉ１４、Ｆ１０、及びＡ５３３－ＩｇＧ１を５ｍｇ／ｋｇの低濃度及び２０又は２５ｍｇ／ｋｇの高濃度で、それぞれ０．５ｍＬ容量で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により注射した。６つのグループのマウスを、１０ ＬＤ５０のマウス適合Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Brisbane／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）、又はＡ／Anhui／１／１３（Ｈ７Ｎ９）のいずれかで鼻腔内感染させた。ウイルスチャレンジの日にマウスの体重を測定し、次いで生存についてモニターし、１４日間又は１８日間毎日体重を測定した。承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルに従って動物研究を行った。
【0214】
致死量のＨ５Ｎ１－ＶＮ０４、Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９、及びＨ７Ｎ９－ＡＵ１３ウイルスでチャレンジする１日前に、マウスを様々な用量の３Ｉ１４、Ｆ１０（グループ１の対照Ａｂ）及びＡ５３３（グループ２の対照Ａｂ）ＩｇＧ１で処置した。５ｍｇ／ｋｇ以上の３Ｉ１４ ＩｇＧ１を使用する予防は、Ｈ７Ｎ７－ＮＬ２１９又はＨ７Ｎ９－ＡＵ１３チャレンジ後にマウスを死亡から完全に防御し、観察期間中の体重減少は最小限であった。これらの結果は、３Ｉ１４ ＩｇＧ１が、致死用量のＨ３Ｎ２－ＢＲ０７でチャレンジした場合にマウスを効果的に防御し（６０～８０％）、致死用量のＨ５Ｎ１－ＶＮ０４を受けたマウスを部分的に防御した（２０～６０％）ことを示す（図６Ａ）。５ｍｇ／ｋｇの３Ｉ１４ ＩｇＧ１の用量は、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１によって引き起こされる病的状態を予防するために部分的にのみ防御的であったが、全ての生存マウスは、５又は２５ｍｇ／ｋｇの用量では、観察期間の終わりに体重減少の逆転を示した（図６Ｂ）。
【0215】
実施例７：３Ｉ１４は、トリプシン媒介性ＨＡ成熟及びｐＨ依存性立体構造変化を遮断する
ステム指向性ｂｎＡｂは、ＨＡのｐＨ依存性立体構造変化及び膜融合に干渉することが知られている１２、１４、１６。前駆体ＨＡ０の切断は、酸性エンドソーム環境における膜融合のその後の活性化のためにＨＡをプライミングする。未成熟ＨＡ０は、通常、呼吸器上皮細胞上の表面プロテアーゼによってＨＡ１及びＨＡ２に処置され２８、２９、これは、トリプシンによるＨＡ０の処置によって実験的に模倣される３０。３Ｉ１４は、ＨＡ０切断部位及びＨＡ２ Ｎ末端融合ペプチドを含むＨＡのステムドメインを標的とするので、本発明者らは、３Ｉ１４がＨＡ０のトリプシン切断活性化を遮断するか、又はＨＡ媒介性ウイルス－宿主膜融合を干渉妨害することもできるかどうかを試験した。図７は、３Ｉ１４ ＩｇＧ１は未成熟ＨＡ０の切断を防止したが、対照抗ＳＡＲＳ ＩｇＧ１（Ｆｍ－６）は防止しなかったことを示す。本発明者らはまた、表面発現されたＨ３－Ａ２／６８及びＨ３－ＢＲ０７を使用して、低ｐＨで誘発される立体構造再配置の３Ｉ１４による防止を分析した。図８（上）は、３Ｉ１４が、トリプシン活性化単独の後（左中央）又は低ｐＨトリガーが続く場合（右中央）のいずれかで、未切断ＨＡ前駆体（ＨＡ０）（左）及び２つの成熟形態（ＨＡ）の両方に結合することを示す。対照的に、それは、ＤＴＴ還元によって媒介された解離ＨＡ２に結合しなかった（右）。３Ｉ１４が、低ｐＨトリガーの前に成熟ＨＡに事前に結合される場合、抗体は、ＤＴＴ処置後に結合を維持し（図８、４番目のパネル）、３Ｉ１４がｐＨ依存性ＨＡ再配置を阻害することを示す（図８、下）。加えて、Ｅ７３０ Ａｂ（抗ＨＡ１）の結合がＤＴＴ処置後に保存されたので、３Ｉ１４の事前結合は、ＨＡ１－ＨＡ２解離を防止した（図８、下）。これらのデータから、本発明者らは、ＨＡステムエピトープへの３Ｉ１４結合が、ＨＡ０切断及びｐＨ依存性立体構造変化の阻害をもたらすと結論付ける。
ステム指向性ｂｎＡｂは、ＨＡのｐＨ依存性立体構造変化及び膜融合に干渉することが知られている１２、１４、１６。前駆体ＨＡ０の切断は、酸性エンドソーム環境における膜融合のその後の活性化のためにＨＡをプライミングする。未成熟ＨＡ０は、通常、呼吸器上皮細胞上の表面プロテアーゼによってＨＡ１及びＨＡ２に処置され２８、２９、これは、トリプシンによるＨＡ０の処置によって実験的に模倣される３０。３Ｉ１４は、ＨＡ０切断部位及びＨＡ２ Ｎ末端融合ペプチドを含むＨＡのステムドメインを標的とするので、本発明者らは、３Ｉ１４がＨＡ０のトリプシン切断活性化を遮断するか、又はＨＡ媒介性ウイルス－宿主膜融合を干渉妨害することもできるかどうかを試験した。図７は、３Ｉ１４ ＩｇＧ１は未成熟ＨＡ０の切断を防止したが、対照抗ＳＡＲＳ ＩｇＧ１（Ｆｍ－６）は防止しなかったことを示す。本発明者らはまた、表面発現されたＨ３－Ａ２／６８及びＨ３－ＢＲ０７を使用して、低ｐＨで誘発される立体構造再配置の３Ｉ１４による防止を分析した。図８（上）は、３Ｉ１４が、トリプシン活性化単独の後（左中央）又は低ｐＨトリガーが続く場合（右中央）のいずれかで、未切断ＨＡ前駆体（ＨＡ０）（左）及び２つの成熟形態（ＨＡ）の両方に結合することを示す。対照的に、それは、ＤＴＴ還元によって媒介された解離ＨＡ２に結合しなかった（右）。３Ｉ１４が、低ｐＨトリガーの前に成熟ＨＡに事前に結合される場合、抗体は、ＤＴＴ処置後に結合を維持し（図８、４番目のパネル）、３Ｉ１４がｐＨ依存性ＨＡ再配置を阻害することを示す（図８、下）。加えて、Ｅ７３０ Ａｂ（抗ＨＡ１）の結合がＤＴＴ処置後に保存されたので、３Ｉ１４の事前結合は、ＨＡ１－ＨＡ２解離を防止した（図８、下）。これらのデータから、本発明者らは、ＨＡステムエピトープへの３Ｉ１４結合が、ＨＡ０切断及びｐＨ依存性立体構造変化の阻害をもたらすと結論付ける。
【0216】
実施例８：３Ｉ１４ ＩｇＧ１は、表面発現されたＨ３－Ａ２６８及びＨ３－ＢＲ０７上の低ｐＨで誘発される立体構造再配置を防止した。
表面発現されたＨ３の立体構造再配置を、３Ｉ１４（黒棒）及びヘッド結合対照ｍＡｂ Ｅ７３０（白棒）のＦＡＣＳ染色によって検出した（図８）。様々な立体配座が対応するグラフの上に示され、以下のとおりであった。未切断前駆体（ＨＡ０）；トリプシン活性化、切断（ＨＡ）；低ｐＨトリガー、切断（ｐＨ４．９）；及びＤＴＴ還元三量体ＨＡ２（ｔＨＡ２）。結合は、未処置ＨＡ（ＨＡ０）への結合のパーセンテージとして表される。抗体阻害アッセイのために、Ｈ３を、切断されたＨＡをｐＨ４．９に曝露する前にｍＡｂなしで、３Ｉ１４で、又は対照Ａｂ、Ｆｍ－６で前処理した。データは、３つの独立した実験の平均＋ＳＤを表す。
表面発現されたＨ３の立体構造再配置を、３Ｉ１４（黒棒）及びヘッド結合対照ｍＡｂ Ｅ７３０（白棒）のＦＡＣＳ染色によって検出した（図８）。様々な立体配座が対応するグラフの上に示され、以下のとおりであった。未切断前駆体（ＨＡ０）；トリプシン活性化、切断（ＨＡ）；低ｐＨトリガー、切断（ｐＨ４．９）；及びＤＴＴ還元三量体ＨＡ２（ｔＨＡ２）。結合は、未処置ＨＡ（ＨＡ０）への結合のパーセンテージとして表される。抗体阻害アッセイのために、Ｈ３を、切断されたＨＡをｐＨ４．９に曝露する前にｍＡｂなしで、３Ｉ１４で、又は対照Ａｂ、Ｆｍ－６で前処理した。データは、３つの独立した実験の平均＋ＳＤを表す。
【0217】
図８に示すように、３Ｉ１４は、トリプシン活性化及び低ｐＨトリガー後に未切断ＨＡ前駆体（ＨＡ０）及び成熟形態（ＨＡ）の両方に結合したが、ＤＴＴ還元によって媒介された解離ＨＡ２には結合しなかった。３Ｉ１４は、低ｐＨトリガー前に成熟ＨＡに事前結合していたが、抗体は、ＤＴＴ処置後も結合したままであり、３Ｉ１４がｐＨ依存性ＨＡ再配置及びその後の膜融合を阻害することが示された。加えて、Ｅ７３０ Ａｂ（抗ＨＡ１）の結合がＤＴＴ処置後に保存されたので、３Ｉ１４の事前結合は、ＨＡ２からのＨＡ１の解離を防止した。
【0218】
ＭＤＣＫ細胞を、全長組換えＡ型インフルエンザｐｃＤＮＡ３．１－Ｈ３－Ａ２６８及びＨ３－ＢＲ０７プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの約３０時間後、０．２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを使用して細胞をプラスチック支持体から剥離した。異なるＨＡ構造形態及び立体構造へのｍＡｂ結合を測定するために、細胞試料を分割し、各処理ステップ後に３Ｉ１４又はＥ７３０ ＩｇＧ１（抗Ｈ３ヘッド）で染色した。細胞を剥離し、続いてトリプシン（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｇｉｂｃｏ）で、室温で５分間処置し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、クエン酸－リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．９中で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５０ｍＭのジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）とともに室温で２０分間インキュベートした。代替として、５μｇの３Ｉ１４又はＦｍ－６ ＩｇＧ１を低ｐＨ工程の前に添加した。その後の処置の試料をＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）で染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ ＩＩを使用して分析した。
【0219】
実施例９：３Ｉ１４は、Ｆｃ依存性ウイルスクリアランスを媒介する
抗ステムｂｎＡｂは、インフルエンザウイルス感染細胞のＦｃγＲ－依存性細胞傷害を効率的に媒介することが報告されており３１、これは、ｍＡｂ媒介抗ウイルスクリアランスの主要なメカニズムであると考えられる。３Ｉ１４及び他の抗ステムｂｎＡｂによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の特性を調査するために、本発明者らは、ヒトＦｃγＩＩＩａを安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔエフェクター細胞、及び活性化Ｔ細胞の核因子（nuclear factor of activated T-cells、ＮＦＡＴ）誘導性ルシフェラーゼ３２を、標的としてのＨＡ発現２９３Ｔ細胞と一緒に使用して、サロゲートレポーターベースのＡＤＣＣアッセイをインビトロで行った。Ｈ３発現２９３Ｔ標的細胞とのインキュベーション後、３Ｉ１４は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞において、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、及びグループ２のｍＡｂ ＣＲ８０２０を含む他の抗ステムｂｎＡｂに用量依存的な様式で、かつ匹敵するレベルで著しいルシフェラーゼ応答を誘導した（図９）。このアッセイの特異性は、抗グループ１のｍＡｂ、Ｆ１０からの応答の欠如によって実証された。３Ｉ１４はまた、Ｈ５発現２９３Ｔ細胞に対するルシフェラーゼ応答を特異的に誘導したが、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、及びＦ１０よりも低いレベルであった。本発明者らは、Ｈ５発現２９３Ｔ標的細胞に対するＣＲ８０２０の低い反応性を観察した（図９）。これらのデータは、３Ｉ１４がインビボ防御のためのＦｃ依存性免疫媒介メカニズムに関与する可能性も高いことを支持する。
抗ステムｂｎＡｂは、インフルエンザウイルス感染細胞のＦｃγＲ－依存性細胞傷害を効率的に媒介することが報告されており３１、これは、ｍＡｂ媒介抗ウイルスクリアランスの主要なメカニズムであると考えられる。３Ｉ１４及び他の抗ステムｂｎＡｂによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の特性を調査するために、本発明者らは、ヒトＦｃγＩＩＩａを安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔエフェクター細胞、及び活性化Ｔ細胞の核因子（nuclear factor of activated T-cells、ＮＦＡＴ）誘導性ルシフェラーゼ３２を、標的としてのＨＡ発現２９３Ｔ細胞と一緒に使用して、サロゲートレポーターベースのＡＤＣＣアッセイをインビトロで行った。Ｈ３発現２９３Ｔ標的細胞とのインキュベーション後、３Ｉ１４は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞において、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、及びグループ２のｍＡｂ ＣＲ８０２０を含む他の抗ステムｂｎＡｂに用量依存的な様式で、かつ匹敵するレベルで著しいルシフェラーゼ応答を誘導した（図９）。このアッセイの特異性は、抗グループ１のｍＡｂ、Ｆ１０からの応答の欠如によって実証された。３Ｉ１４はまた、Ｈ５発現２９３Ｔ細胞に対するルシフェラーゼ応答を特異的に誘導したが、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、及びＦ１０よりも低いレベルであった。本発明者らは、Ｈ５発現２９３Ｔ標的細胞に対するＣＲ８０２０の低い反応性を観察した（図９）。これらのデータは、３Ｉ１４がインビボ防御のためのＦｃ依存性免疫媒介メカニズムに関与する可能性も高いことを支持する。
【0220】
実施例１０．３Ｉ１４は、Ｈ３又はＨ５への結合について、他の抗ストークｂｎＡｂ、ＦＩ６、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０と交差競合する。
ＥＬＩＳＡプレート上に固定された５μｇ／ｍｌのＨ３－ＢＲ０７又はＨ５－ＶＮ０４タンパク質を、８０ｎＭ～０．３ｎＭの範囲の３Ｉ１４ Ｆａｂの２倍連続希釈物とともにインキュベートし、５ｎＭの他のｓｃＦｖＦｃ Ａｂと混合した。１時間の共インキュベーション後、ｓｃＦｖＦｃ Ａｂの結合を、ＨＲＰ結合抗ヒトＣＨ２抗体を使用して検出した。３Ｉ１４ Ｆａｂは、Ｈ３－ＢＲ０７への結合について、ＣＲ８０２０、ＣＲ９１１４、ＦＩ６、及び３９．２９を含む他の抗ストークＡｂと交差競合したが、抗ＨＡ１抗体であるＥ７３０とは競合しなかった（図１０Ａ～図１０Ｄ）。３Ｉ１４はまた、Ｈ５－ＶＮ０４への３９．２９及びＦ１０の結合を阻害したが、抗ヘッド抗体２Ａの結合を阻害しなかった（図１０Ｅ～図１０Ｆ）。これらの結果は、３Ｉ１４が、他の抗ストークｂｎＡｂの既知のエピトープと重複するか、又はそれに非常に近いＨＡステム領域中のエピトープを標的とすることを示唆する。
ＥＬＩＳＡプレート上に固定された５μｇ／ｍｌのＨ３－ＢＲ０７又はＨ５－ＶＮ０４タンパク質を、８０ｎＭ～０．３ｎＭの範囲の３Ｉ１４ Ｆａｂの２倍連続希釈物とともにインキュベートし、５ｎＭの他のｓｃＦｖＦｃ Ａｂと混合した。１時間の共インキュベーション後、ｓｃＦｖＦｃ Ａｂの結合を、ＨＲＰ結合抗ヒトＣＨ２抗体を使用して検出した。３Ｉ１４ Ｆａｂは、Ｈ３－ＢＲ０７への結合について、ＣＲ８０２０、ＣＲ９１１４、ＦＩ６、及び３９．２９を含む他の抗ストークＡｂと交差競合したが、抗ＨＡ１抗体であるＥ７３０とは競合しなかった（図１０Ａ～図１０Ｄ）。３Ｉ１４はまた、Ｈ５－ＶＮ０４への３９．２９及びＦ１０の結合を阻害したが、抗ヘッド抗体２Ａの結合を阻害しなかった（図１０Ｅ～図１０Ｆ）。これらの結果は、３Ｉ１４が、他の抗ストークｂｎＡｂの既知のエピトープと重複するか、又はそれに非常に近いＨＡステム領域中のエピトープを標的とすることを示唆する。
【0221】
実施例１１．インビトロでの構造に基づく親和性成熟
Ｈ３及びＨ５への等しくない結合強度についての分子的基礎を特徴付け、並びにＨ５Ｎ１株に対する改善された親和性を有する３Ｉ１４を操作するために、本発明者らは、最初に、３Ｉ１４構造のインシリコシミュレーションのための抗体構造予測プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ３３を使用した。他の３つのＩＧＨＶ３－３０ｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、３９．２９、及びＭＡｂ ３．１との３Ｉ１４モデルの重ね合わせを図１２Ｂに示す。これらの抗体間の主な違いは、ＨＡと接触するループ構造を形成するＦＩ６ｖ３のより長いＬＣＤＲ１を除いて、ＨＣＤＲ３の立体構造であることが明らかである。
Ｈ３及びＨ５への等しくない結合強度についての分子的基礎を特徴付け、並びにＨ５Ｎ１株に対する改善された親和性を有する３Ｉ１４を操作するために、本発明者らは、最初に、３Ｉ１４構造のインシリコシミュレーションのための抗体構造予測プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ３３を使用した。他の３つのＩＧＨＶ３－３０ｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、３９．２９、及びＭＡｂ ３．１との３Ｉ１４モデルの重ね合わせを図１２Ｂに示す。これらの抗体間の主な違いは、ＨＡと接触するループ構造を形成するＦＩ６ｖ３のより長いＬＣＤＲ１を除いて、ＨＣＤＲ３の立体構造であることが明らかである。
【0222】
次に、３Ｉ１４モデルを、ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋサーバーを用いてＨ３三量体構造にドッキングした３４。３Ｉ１４は、Ｈ３及びＨ５への結合についてＦＩ６ｖ３及び３９．２９と競合し、ＭＡｂ３．１は、ＦＩ６ｖ３及び３９．２９と同じ保存されたエピトープを占有するので１８、本発明者らは、３Ｉ１４が、Ｈ３／Ｈ５と相互作用するために、ＦＩ６ｖ３、３９．２９、及びＭＡｂ３．１と同様のスキームを採用すると仮定した。これらの３つのＡｂ－ＨＡ共結晶構造について、ＨＣＤＲ３は、融合ペプチド及びヘリックスＡとの疎水性コアの形成において主要な役割を果たす１５、１７、１８。ＨＡと著しい相互作用をするのではなく、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２は、結合を促進するためにＨＣＤＲ３ループを安定化するようである。親水性軽鎖ＣＤＲ残基はまた、ＨＡと相互作用し、疎水性コアを取り囲むが、軽鎖の配向は、保存されず、残基も結合に関与しない。これらの観察は、軽鎖が、エピトープと相互作用するのに最適な位置にＨＣＤＲ３を配向させることによって結合に主に寄与することを示唆する。
【0223】
（表５）Ｈ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４界面での接触残基
【0224】
これらの解明された共結晶構造に基づいて、本発明者らは、１０００個のデコイから、３Ｉ１４／Ｈ３（図１３Ｂ）及び３Ｉ１４／Ｈ５複合体（図示せず）の最も類似した結合モデルを選択した。なぜ３Ｉ１４がＨ５よりも強くＨ３／Ｈ１に結合するかを理解するために、２つの複合体の界面の徹底的な分析を行った（表５）。エネルギー計算３５は、Ｈ３モデルにおける３Ｉ１４軽鎖のＤ９４とＫ３９との間の非常に好ましい結合寄与を示し、これは、電気的反発に起因してＨ５／３Ｉ１４モデルにおいてＥ３９がＤ９４から離れて回転している間に塩橋を形成し得、Ｈ５結合に好ましくない可能性がある（図１３Ｃ）。Ｈ５に加えて、Ｅ３９アミノ酸変化は、グループ１のＨ２、Ｈ６、Ｈ１１、及びＨ１３染色においても見出される（表６）。別の顕著な変異は、Ｈ３位置Ｌ３８であり、この残基は、いくつかのグループ１の株のためにＫ／Ｒ３８に変化している（表６）。しかしながら、結合寄与は、Ｌ／Ｋ３８が、両方のモデルにおいて、ＨＣＤＲ３残基Ｙ１０４、Ｆ１０５、及びＦ１０９と、好ましい～非常に好ましい結合（全好ましい自由エネルギーの約７０％）で接触することを示しており、したがって、本発明者らは、これらの残基が、両方のＨＡへの結合に対して正の効果を有すると考えた。
【0225】
（表６）１６個のＨＡサブタイプ間の３Ｉ１４エピトープの配列比較
＊表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）バイオセンサーによって決定されたＫｄ（図１Ｂ）。＊＊フローサイトメトリー（図２）及び参照１６によって決定された相対Ｋｄ。
正に荷電した側鎖を有する残基はオレンジ色でラベル付けされ、負に荷電した側鎖残基は青色でラベル付けされている。
正に荷電した側鎖を有する残基はオレンジ色でラベル付けされ、負に荷電した側鎖残基は青色でラベル付けされている。
【0226】
実施例１２：Ｈ３三量体モデルのストーク上の３Ｉ１４エピトープの構造。
図１３は、Ｈ３のストーク上の３Ｉ１４エピトープの模式図である。模式図において、３Ｉ１４の重鎖は、青色で示され、軽鎖は、マゼンタで示される。Ｈ３三量体のストークは、サーモン、緑色、及びシアンのような色である。残基の番号付けは、完全にＨ３又はＡｂ配列に基づく。
図１３は、Ｈ３のストーク上の３Ｉ１４エピトープの模式図である。模式図において、３Ｉ１４の重鎖は、青色で示され、軽鎖は、マゼンタで示される。Ｈ３三量体のストークは、サーモン、緑色、及びシアンのような色である。残基の番号付けは、完全にＨ３又はＡｂ配列に基づく。
【0227】
３Ｉ１４／Ｈ３ドッキング
３Ｉ１４モデルを、本発明者らのＬｉｎｕｘマシンにインストールされたスタンドアローンソフトウェアとしてのＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋを用いて、Ｈ３三量体構造にドッキングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋは、局所高分解能ドッキングを処理し、追加の回転異性体及びループ再配置を可能にするその能力のために選択される。ドッキング前に、３Ｉ１４モデルをＨ３／３９．２９複合体構造内の３９．２９に重ね合わせた。追加の側鎖回転異性体を加え、高分解能のみのプロトコルを実行した。１０００個のデコイを生成し、最良スコアを有するクラスター化モデルを、ＰｙＭｏｌを用いて徹底的に分析した。３Ｉ１４がＨ３への結合についてＦＩ６と競合することを考慮して、本発明者らは、３Ｉ１４が、Ｈ３と相互作用するために、３９．２９、ＦＩ６及びＭａｂ３．１と同じスキームを採用すると仮定した。したがって、最終モデルを選択する際に、以下の基準を適用した：ＨＣＤＲ３、並びに融合ペプチド及びＨ３のＨＡ２のヘリックスＡ上の疎水性残基は、密接に接触して、界面に疎水性コアを形成しなければならない；ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ１残基は、他の複合体と同様にＨＣＤＲ３と相互作用する；軽鎖ＣＤＲは、主にＨ３と親水性相互作用する。１０００個のデコイからの上位１０個のモデルのうち、６つのモデルがこれらの基準に適合し、それらは互いに非常に類似している。したがって、６の中で最良のスコアを有するものを更なる分析のために選択した。
３Ｉ１４モデルを、本発明者らのＬｉｎｕｘマシンにインストールされたスタンドアローンソフトウェアとしてのＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋを用いて、Ｈ３三量体構造にドッキングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋは、局所高分解能ドッキングを処理し、追加の回転異性体及びループ再配置を可能にするその能力のために選択される。ドッキング前に、３Ｉ１４モデルをＨ３／３９．２９複合体構造内の３９．２９に重ね合わせた。追加の側鎖回転異性体を加え、高分解能のみのプロトコルを実行した。１０００個のデコイを生成し、最良スコアを有するクラスター化モデルを、ＰｙＭｏｌを用いて徹底的に分析した。３Ｉ１４がＨ３への結合についてＦＩ６と競合することを考慮して、本発明者らは、３Ｉ１４が、Ｈ３と相互作用するために、３９．２９、ＦＩ６及びＭａｂ３．１と同じスキームを採用すると仮定した。したがって、最終モデルを選択する際に、以下の基準を適用した：ＨＣＤＲ３、並びに融合ペプチド及びＨ３のＨＡ２のヘリックスＡ上の疎水性残基は、密接に接触して、界面に疎水性コアを形成しなければならない；ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ１残基は、他の複合体と同様にＨＣＤＲ３と相互作用する；軽鎖ＣＤＲは、主にＨ３と親水性相互作用する。１０００個のデコイからの上位１０個のモデルのうち、６つのモデルがこれらの基準に適合し、それらは互いに非常に類似している。したがって、６の中で最良のスコアを有するものを更なる分析のために選択した。
【0228】
実施例１３ Ｈ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４モデルの配列アラインメント及び構造重ね合わせ。
図１４Ａは、Ｈ３、Ｈ５、及びＢ型インフルエンザのステムエピトープの配列アラインメントを示す。図１４Ｂは、残基３８及び３９でのＨ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４モデルの構造重ね合わせを示す。Ｈ３はシアンとして示され、Ｈ５は黄色として示され、Ｈ３／３Ｉ１４モデルからの３Ｉ１４は青色（重鎖）及び黄色（軽鎖）として示され、Ｈ５／３Ｉ１４モデルからの３Ｉ１４はオレンジ色として示される。Ｈ３残基Ｌｅｕ３８及びＬｙｓ３９は、ラベル付けされている。重鎖からの残基Ｆ１００Ｆ及び軽鎖からのＤ９３は、それぞれ３８及び３９と相互作用し、同様にラベル付けされている。
図１４Ａは、Ｈ３、Ｈ５、及びＢ型インフルエンザのステムエピトープの配列アラインメントを示す。図１４Ｂは、残基３８及び３９でのＨ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４モデルの構造重ね合わせを示す。Ｈ３はシアンとして示され、Ｈ５は黄色として示され、Ｈ３／３Ｉ１４モデルからの３Ｉ１４は青色（重鎖）及び黄色（軽鎖）として示され、Ｈ５／３Ｉ１４モデルからの３Ｉ１４はオレンジ色として示される。Ｈ３残基Ｌｅｕ３８及びＬｙｓ３９は、ラベル付けされている。重鎖からの残基Ｆ１００Ｆ及び軽鎖からのＤ９３は、それぞれ３８及び３９と相互作用し、同様にラベル付けされている。
【0229】
３Ｉ１４／Ｈ５ドッキング
Ｈ５／３Ｉ１４及びＢ型インフルエンザ／３Ｉ１４複合体を、３Ｉ１４／Ｈ３複合体と同じ方法でモデリングした。３Ｉ１４モデル及びＨ５三量体又はＨ３三量体の両方をＨ３／３９．２９複合体構造に重ね合わせ、２つの構造ファイルをドッキングのための初期モデルとして１つの３Ｉ１４／Ｈ５複合体又は３Ｉ１４／Ｂ型インフルエンザ複合体にマージした。興味深いことに、Ｈ３／３Ｉ１４複合体モデルについて選択されたものと類似のモデルは、Ｈ５／３Ｉ１４及びＢ型インフルエンザ／３Ｉ１４複合体の両方についての最良のモデルの中にある。したがって、これらの類似モデルを、更なる分析のための最終モデルとして選択した。
Ｈ５／３Ｉ１４及びＢ型インフルエンザ／３Ｉ１４複合体を、３Ｉ１４／Ｈ３複合体と同じ方法でモデリングした。３Ｉ１４モデル及びＨ５三量体又はＨ３三量体の両方をＨ３／３９．２９複合体構造に重ね合わせ、２つの構造ファイルをドッキングのための初期モデルとして１つの３Ｉ１４／Ｈ５複合体又は３Ｉ１４／Ｂ型インフルエンザ複合体にマージした。興味深いことに、Ｈ３／３Ｉ１４複合体モデルについて選択されたものと類似のモデルは、Ｈ５／３Ｉ１４及びＢ型インフルエンザ／３Ｉ１４複合体の両方についての最良のモデルの中にある。したがって、これらの類似モデルを、更なる分析のための最終モデルとして選択した。
【0230】
より良好なＨ５結合のための３Ｉ１４操作
なぜ３Ｉ１４がＨ５よりも強くＨ３に結合するかを理解するために、Ｈ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４界面の徹底的な分析を行った。全てのエピトープ残基の配列アラインメントにより、最も顕著な変異は、Ｈ３におけるＬ３８－Ｋ３９がＨ５においてＫ３８－３９Ｅになることであることが示された（図１４Ａ）。Ｌ３８は、Ｈ３／３Ｉ１４モデルにおける疎水性コアの一部であり、３Ｉ１４のＨＣＤＲ３からのＦ１００Ｆと相互作用する（図１４Ｂ）。驚くべきことに、Ｈ５／３Ｉ１４モデルにおけるＫ３８は、帯電したアミン基を溶媒中に向け、脂肪族鎖をＦ１００Ｆに向けて残すことによって同じ接触を行うことができる。モデルによれば、この変異は、結合親和性に影響を及ぼすことができないようである。対照的に、Ｋ３９は、Ｈ３／３Ｉ１４モデルにおいて３Ｉ１４の軽鎖からのＤ９４と接触するが、Ｅ３９は、電気的反発に起因してＨ５／３Ｉ１４モデルにおいてＤ９４から離れて回転している（図１４Ｂ）。明らかに、Ｋ３９Ｅ変異はＨ５結合に好ましくなく、おそらくこれが、３Ｉ１４がＨ３と比較して弱いＨ５への弱い結合を有する理由である。この仮説を試験するために、異なるサブタイプからのＨＡの３８～３９位の残基を、３Ｉ１４に結合するそれらの能力と比較して調べた。Ｌ３８及びＫ３９を有するＨＡは、３Ｉ１４に強く結合し、Ｋ３８及びＥ３９を有するＨＡは、より弱い結合を有するという強い相関を明らかにすることができる。まとめると、本発明者らは、３Ｉ１４の軽鎖におけるＤ９４Ｋ変異が、Ｈ５に対する３Ｉ１４の結合優先性を逆転させ、Ｈ３に対する結合親和性を低下させるであろうと仮定する。加えて本発明者らは、Ｄ９４Ｎ ３Ｉ１４バリアントがＨ３及びＨ５の両方に等しく十分に結合するであろうと仮定する。相互作用の主要な駆動力がＨＣＤＲ３からの疎水性相互作用であるため、本発明者らは、Ｄ９４Ｎ変異がＨ３結合の弱化をもたらすであろうとは予想していない。この位置での相互作用が反発的でない限り、それは、親和性に著しく影響しないはずである。
なぜ３Ｉ１４がＨ５よりも強くＨ３に結合するかを理解するために、Ｈ３／３Ｉ１４及びＨ５／３Ｉ１４界面の徹底的な分析を行った。全てのエピトープ残基の配列アラインメントにより、最も顕著な変異は、Ｈ３におけるＬ３８－Ｋ３９がＨ５においてＫ３８－３９Ｅになることであることが示された（図１４Ａ）。Ｌ３８は、Ｈ３／３Ｉ１４モデルにおける疎水性コアの一部であり、３Ｉ１４のＨＣＤＲ３からのＦ１００Ｆと相互作用する（図１４Ｂ）。驚くべきことに、Ｈ５／３Ｉ１４モデルにおけるＫ３８は、帯電したアミン基を溶媒中に向け、脂肪族鎖をＦ１００Ｆに向けて残すことによって同じ接触を行うことができる。モデルによれば、この変異は、結合親和性に影響を及ぼすことができないようである。対照的に、Ｋ３９は、Ｈ３／３Ｉ１４モデルにおいて３Ｉ１４の軽鎖からのＤ９４と接触するが、Ｅ３９は、電気的反発に起因してＨ５／３Ｉ１４モデルにおいてＤ９４から離れて回転している（図１４Ｂ）。明らかに、Ｋ３９Ｅ変異はＨ５結合に好ましくなく、おそらくこれが、３Ｉ１４がＨ３と比較して弱いＨ５への弱い結合を有する理由である。この仮説を試験するために、異なるサブタイプからのＨＡの３８～３９位の残基を、３Ｉ１４に結合するそれらの能力と比較して調べた。Ｌ３８及びＫ３９を有するＨＡは、３Ｉ１４に強く結合し、Ｋ３８及びＥ３９を有するＨＡは、より弱い結合を有するという強い相関を明らかにすることができる。まとめると、本発明者らは、３Ｉ１４の軽鎖におけるＤ９４Ｋ変異が、Ｈ５に対する３Ｉ１４の結合優先性を逆転させ、Ｈ３に対する結合親和性を低下させるであろうと仮定する。加えて本発明者らは、Ｄ９４Ｎ ３Ｉ１４バリアントがＨ３及びＨ５の両方に等しく十分に結合するであろうと仮定する。相互作用の主要な駆動力がＨＣＤＲ３からの疎水性相互作用であるため、本発明者らは、Ｄ９４Ｎ変異がＨ３結合の弱化をもたらすであろうとは予想していない。この位置での相互作用が反発的でない限り、それは、親和性に著しく影響しないはずである。
【0231】
実施例１４：３Ｉ１４ ＷＴ及びＶＬＤ９４Ｎ変異 組換えＨ５－ＶＮ０４（Ａ）及びＨ３－ＰＥ０９（Ｂ）へのＩｇＧ１結合（ＫＤ値）。
３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎバリアントは、Ｈ５に対する結合及び中和活性を改善する
Ｅ３９及びＤ９４の提唱された反発効果を排除するために、本発明者らは、部位における負電荷の喪失をもたらす単一のＡｓｐからＡｓｎ（ＤからＮ）への変異が、Ｈ３及びＨ５の両方に等しく十分に結合するであろうと仮定した。この構造に基づく修飾を調べるために、本発明者らはまず、ＷＴ ３Ｉ１４及びＶＬＤ９４ＮバリアントＩｇＧ１の両方の結合親和性を評価した。表３に示されるように、ＶＬＤ９４Ｎバリアントは、Ｈ５への結合親和性をほぼ１０倍増加させたが、Ｈ３への結合の任意の著しい変化を引き起こさなかった。興味深いことに、Ｈ５へのより高い親和性はまた、解離速度の減少によるものであったが、会合速度は等しかった（表７及び図１５）。
３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎバリアントは、Ｈ５に対する結合及び中和活性を改善する
Ｅ３９及びＤ９４の提唱された反発効果を排除するために、本発明者らは、部位における負電荷の喪失をもたらす単一のＡｓｐからＡｓｎ（ＤからＮ）への変異が、Ｈ３及びＨ５の両方に等しく十分に結合するであろうと仮定した。この構造に基づく修飾を調べるために、本発明者らはまず、ＷＴ ３Ｉ１４及びＶＬＤ９４ＮバリアントＩｇＧ１の両方の結合親和性を評価した。表３に示されるように、ＶＬＤ９４Ｎバリアントは、Ｈ５への結合親和性をほぼ１０倍増加させたが、Ｈ３への結合の任意の著しい変化を引き起こさなかった。興味深いことに、Ｈ５へのより高い親和性はまた、解離速度の減少によるものであったが、会合速度は等しかった（表７及び図１５）。
【0232】
（表７）３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎバリアントの結合親和性
【0233】
本発明者らはまた、中和アッセイを実施して、Ｈ５偽型ウイルス又はＨ３感染性ウイルスに対する３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎバリアントの活性を評価した（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）。３Ｉ１４と比較して、ＶＬＤ９４Ｎバリアントは、１０倍高い効力でＨ５－ＶＮ０４偽ウイルスを中和した（ＩＣ５０：８．６５ｎｇ ｍｌ－１対８１．５８ｎｇ ｍｌ－１）（図１６Ｃ）。一方、Ｈ３－ＢＲ０７に対する中和活性は、無傷のＶＬＤ９４Ｎバリアントのままであった（ＩＣ５０：３３６．６ｎｇ ｍｌ－１対３０５．４ｎｇ ｍｌ－１）（図１６Ｄ）。これらの結果は、最適化された３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎバリアントが、Ｈ３に対するその有効性を維持しながら、Ｈ５に対する結合及び中和能力の増加をもたらすことを実証する。
【0234】
更なる実験は、３Ｉ１４が１．９６ｎＭのＫｄ値でＨ３－ＰＥ０９に結合する一方で、Ｈ３－ＰＥ０９への３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎ変異体の親和性は同様であることを実証した（平均Ｋｄ＝２．３４ｎＭ）。Ｄ９４Ｎ変異は、Ｈ３結合の弱化をもたらさないが、Ｈ５への結合親和性の増加をもたらす（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。
【0235】
実施例１５：３Ｉ１４ ＷＴ及びＶＬＤ９４Ｎ変異体ＩｇＧ１は、偽型化するウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４及び感染性ウイルスＨ３Ｎ２－ＢＲ０７を中和する。
図１６は、Ｈ５Ｎ１－ＶＮ０４及びＨ３Ｎ２－ＢＲ０７感染ウイルスの中和を示す一連のグラフである。３Ｉ１４ ＷＴ（黒色）及びＶＬＤ９４Ｎ変異体（赤色）は、偽型化するウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４（Ａ）及びＨ３Ｎ２ ＢＲ０７ウイルス（Ｂ）を中和した。抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０（青色）を対照として使用した。これらのデータは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を表す。
図１６は、Ｈ５Ｎ１－ＶＮ０４及びＨ３Ｎ２－ＢＲ０７感染ウイルスの中和を示す一連のグラフである。３Ｉ１４ ＷＴ（黒色）及びＶＬＤ９４Ｎ変異体（赤色）は、偽型化するウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４（Ａ）及びＨ３Ｎ２ ＢＲ０７ウイルス（Ｂ）を中和した。抗グループ１のｍＡｂ Ｆ１０（青色）を対照として使用した。これらのデータは、２～３回の独立した実験の平均中和力価を表す。
【0236】
３Ｉ１４ ＶＬＤ９４Ｎ変異体ＩｇＧ１は、偽ウイルスＨ５Ｎ１－ＶＮ０４を、３Ｉ１４ ＷＴよりも高いＩＣ５０値で中和したが、それはまた、Ｈ３Ｎ２ウイルスを同様のＩＣ５０値で中和した。
【0237】
実施例１６：Ｈ５への増加した結合を有する３Ｉ１４バリアントの単離のための操作された酵母ディスプレイ。
７つの酵母ディスプレイライブラリを、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、及びＬＣＤＲ４の残基を無作為化することによって作成した。これらの酵母ディスプレイライブラリを使用して、単鎖３Ｉ１４バリアントのプールを作製し、これは、選択され、酵母ディスプレイベクターｐＣＴＣＯＮ２にクローニングされるであろう。単離された構築物は、提示のためのマーカーとして役立つように、抗体のＣ末端にｃ－Ｍｙｃタグを結合するであろう。抗体発現及び表面ディスプレイは、ライブラリをＳＧＣＡＡ培地中で、２０℃で２４～４８時間成長させることによって誘導されるであろう。３Ｉ１４バリアントの首尾よい提示は、抗ｃ－Ｍｙｃ ＦＩＴＣ標識によって検出されるであろう。Ｈ５ ＨＡは、蛍光標識で標識され、染色に１時間添されるであろう。未結合の試薬は、洗い流され、標識されたライブラリは、Ｈ５ ＨＡ陽性クローンについて選別されるであろう。
７つの酵母ディスプレイライブラリを、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、及びＬＣＤＲ４の残基を無作為化することによって作成した。これらの酵母ディスプレイライブラリを使用して、単鎖３Ｉ１４バリアントのプールを作製し、これは、選択され、酵母ディスプレイベクターｐＣＴＣＯＮ２にクローニングされるであろう。単離された構築物は、提示のためのマーカーとして役立つように、抗体のＣ末端にｃ－Ｍｙｃタグを結合するであろう。抗体発現及び表面ディスプレイは、ライブラリをＳＧＣＡＡ培地中で、２０℃で２４～４８時間成長させることによって誘導されるであろう。３Ｉ１４バリアントの首尾よい提示は、抗ｃ－Ｍｙｃ ＦＩＴＣ標識によって検出されるであろう。Ｈ５ ＨＡは、蛍光標識で標識され、染色に１時間添されるであろう。未結合の試薬は、洗い流され、標識されたライブラリは、Ｈ５ ＨＡ陽性クローンについて選別されるであろう。
【0238】
図１８に示されるように、３Ｉ１４ ＷＴ－酵母及びＣＤＲ－ライブラリの両方は、ＦＡＣＳ分析によって実証されるように、Ｃ－ｍｙｃ及びＨ５について陽性であった。二重陽性Ｈ５及びｃ－ｍｙｃ陽性集団は、３Ｉ１４－ＷＴ－酵母ライブラリと比較して、３Ｉ１４酵母ＣＤＲライブラリにおいて０．０３９％から０．０９０％に増加した。
【0239】
将来の研究では、陽性クローンを成長させ、再度３回選別して、陽性集団を濃縮するであろう。陽性クローンは、ＦＡＣＳ分析によって検証され、配列決定によって識別されるであろう。ＦＡＣＳ選別と組み合わせた酵母ディスプレイは、抗体操作に成功することが証明されており、Ｂ型インフルエンザＨＡに結合することができる３Ｉ１４バリアントクローンを単離するために使用されるであろう。Ｂ型インフルエンザＨＡへの最初の結合剤が識別されると、その後の回のスクリーニングが、多色選別を用いて実施され、すなわち、Ｈ３、Ｈ５、及びＢ型インフルエンザＨＡは、異なる蛍光標識で標識され、三重陽性３Ｉ１４バリアントが選別されるであろう。
【0240】
実施例１７：エピトープマッピング及び結合競合
３Ｉ１４認識のためのＨＡのエピトープを調査するために、本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６装置において全長ＨＡ又はＨＡ１サブユニットのいずれかへのその結合活性を評価した。３Ｉ１４は、三量体全長Ｈ３株、Ａ／Perth／１６／０９（ＰＥ－０９）に結合したが、そのＨＡ１サブユニットには結合しなかった（図１９）。本発明者らは更に、３Ｉ１４と他のステム指向性ｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０との間の結合競合アッセイを行った（図２）。３Ｉ１４ Ｆａｂは、Ｈ３－ＢＲ０７への他の抗ステムＡｂ ＣＲ９１１４、ＦＩ６ｖ３、及び３９．２９の結合を強く阻害するが、ヘッド指向性抗Ｈ３ ｍＡｂ Ｅ７３０（未発表の抗体配列）では阻害しない（図１０）。３Ｉ１４はまた、より膜近位のエピトープ１４に対して指向されるＣＲ８０２０と競合する。３Ｉ１４は、Ｈ５－ＶＮ０４への３９．２９及びＦ１０の結合を部分的に阻害するが、抗Ｈ５ヘッド抗体２Ａ１２の結合を阻害しない（図２ｅ、ｆ）。これらの結果は、３Ｉ１４が、他のｂｎＡｂの既知のステムエピトープと重複しているか、又は非常に近接していることを実証する。加えて、３Ｉ１４は、Ｈ３の強力な阻害剤であり、Ｈ５の中程度の阻害剤である。これらの結果は、Ｈ３及びＨ５への３Ｉ１４結合の親和性測定と一致する。
３Ｉ１４認識のためのＨＡのエピトープを調査するために、本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６装置において全長ＨＡ又はＨＡ１サブユニットのいずれかへのその結合活性を評価した。３Ｉ１４は、三量体全長Ｈ３株、Ａ／Perth／１６／０９（ＰＥ－０９）に結合したが、そのＨＡ１サブユニットには結合しなかった（図１９）。本発明者らは更に、３Ｉ１４と他のステム指向性ｂｎＡｂ、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、３９．２９、Ｆ１０、及びＣＲ８０２０との間の結合競合アッセイを行った（図２）。３Ｉ１４ Ｆａｂは、Ｈ３－ＢＲ０７への他の抗ステムＡｂ ＣＲ９１１４、ＦＩ６ｖ３、及び３９．２９の結合を強く阻害するが、ヘッド指向性抗Ｈ３ ｍＡｂ Ｅ７３０（未発表の抗体配列）では阻害しない（図１０）。３Ｉ１４はまた、より膜近位のエピトープ１４に対して指向されるＣＲ８０２０と競合する。３Ｉ１４は、Ｈ５－ＶＮ０４への３９．２９及びＦ１０の結合を部分的に阻害するが、抗Ｈ５ヘッド抗体２Ａ１２の結合を阻害しない（図２ｅ、ｆ）。これらの結果は、３Ｉ１４が、他のｂｎＡｂの既知のステムエピトープと重複しているか、又は非常に近接していることを実証する。加えて、３Ｉ１４は、Ｈ３の強力な阻害剤であり、Ｈ５の中程度の阻害剤である。これらの結果は、Ｈ３及びＨ５への３Ｉ１４結合の親和性測定と一致する。
【0241】
実施例１８：材料及び方法
細胞
最近の季節性インフルエンザ予防接種がないと報告された７人の健常な成人の新鮮なＰＢＭＣを、ＩＲＢ承認ヒトプロトコルの下で２０１２年１２月にＤＦＣＩ Ｋｒａｆｔ Ｆａｍｉｌｙ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｃｅｎｔｅｒで白血球除去輸血中に収集された廃棄「首輪」を使用して得た。メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（Madin-Darby cainine kidney、ＭＤＣＫ）細胞、２９３Ｔ細胞、及び２９３Ｆ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した
細胞
最近の季節性インフルエンザ予防接種がないと報告された７人の健常な成人の新鮮なＰＢＭＣを、ＩＲＢ承認ヒトプロトコルの下で２０１２年１２月にＤＦＣＩ Ｋｒａｆｔ Ｆａｍｉｌｙ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｃｅｎｔｅｒで白血球除去輸血中に収集された廃棄「首輪」を使用して得た。メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（Madin-Darby cainine kidney、ＭＤＣＫ）細胞、２９３Ｔ細胞、及び２９３Ｆ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した
【0242】
組換え赤血球凝集素の調製
Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／２００７）の細胞外ドメイン、残基１７～５３１は、Ａｖｉｔａｇ（アミノ酸配列：ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、トロンビン切断部位、三量体化Ｔ４フィブリチンｆｏｌｄｏｎドメイン、及び６つのヒスチジン残基を含有するＣ末端ペプチドを含む融合タンパク質として発現された。融合タンパク質Ｈ３－ＡＴＴＨを２９３Ｆ細胞において発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。精製した組換えＨＡタンパク質を、トロンビン酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって切断し、次いで、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ａｕｒｏｒａ、ＣＯ）を用いて製造業者の説明書に従ってビオチン化した。
Ｈ３（Ａ／Brisbane／１０／２００７）の細胞外ドメイン、残基１７～５３１は、Ａｖｉｔａｇ（アミノ酸配列：ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、トロンビン切断部位、三量体化Ｔ４フィブリチンｆｏｌｄｏｎドメイン、及び６つのヒスチジン残基を含有するＣ末端ペプチドを含む融合タンパク質として発現された。融合タンパク質Ｈ３－ＡＴＴＨを２９３Ｆ細胞において発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。精製した組換えＨＡタンパク質を、トロンビン酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって切断し、次いで、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ａｕｒｏｒａ、ＣＯ）を用いて製造業者の説明書に従ってビオチン化した。
【0243】
Ａ／New York／１８／０９（Ｈ１－ＮＹ０９）、Ａ／Texas／０５／０９（Ｈ１－ＴＸ０９）、Ａ／Japan／３０５／５７（Ｈ２－ＪＰ５７）、Ａ／Aichi／２／６８（Ｈ３－Ａ２／６８）、Ａ／Brisbane／１０／０７（Ｈ３－ＢＲ０７）、Ａ／Netherlands／２／２００５（Ｈ４－ＮＬ０５）、Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５－ＶＮ０４）、Ａ／Hongkong／１０７３／９９（Ｈ５－ＨＫ９９）、Ａ／chicken／New York／１４６７７－１３／９８（Ｈ６－ＮＹ９８）、Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７－ＮＬ２１９）、Ａ／turkey／Ontario／６１１８／６８（Ｈ８－ＯＮ６８）、Ａ／HongKong／１０７３／９９（Ｈ９－ＨＫ９９）、Ａ／duck／Memphis／５４６／７４（Ｈ１１－ＭＥＭ７４）、Ａ／duck／Alberta／６０／７６（Ｈ１２－ＡＢ７６）、Ａ／mallard／Astrakhan／２６３／１９８２（Ｈ１４－ＡＳ８２）、Ａ／shearwater／West Australia／２５７６／７９（Ｈ１５－ＷＡ７９）及びＡ／black-headed gull／Sweden／２／９９（Ｈ１６－ＳＥ０６）の全長ＨＡ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、２９３Ｔ／１７細胞にトランスフェクトして、細胞表面発現ＨＡを産生した。
【0244】
Ｈ１サブタイプＡ／California／０４／０９（Ｈ１－ＣＡ０９）、Ａ／Solomon Islands／３／０６（Ｈ１－ＳＩ０６）、及びＡ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ１－ＰＲ８）の組換え全長ＨＡタンパク質；Ｈ３ Ａ／Perth／１６／０９（Ｈ３－ＰＥ０９）、Ａ／Uruguay／７１６／０７（Ｈ３－ＵＹ０７）、及びＡ／Victoria／３４１／１１（Ｈ３－ＶＩＣ１１）；Ｈ５ Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５－ＶＮ０４）及びＡ／Indonesia／０５／０５（Ｈ５－ＩＤ０５）；Ｈ７ Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７－ＮＬ２１９）、Ａ／Canada／ＲＶ４４４／０４（Ｈ７－ＣＡ４４４）、及びＡ／Anhui／１／１３（Ｈ７－ＡＨ１３）；Ｈ９ Ａ／Hong Kong／１０７３／９９（Ｈ９－ＨＫ９９）は、ＮＩＨ ＢＥＩＲ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＩＨ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。サブタイプＨ４ Ａ／mallard／Netherlands／２／０５（Ｈ４－ＮＬ０５）及びＨ１４ Ａ／mallard／Astrakhan／２６３／８２（Ｈ１４－ＡＳ８２）の組換え全長ＨＡは、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ（Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）から快く贈与された。
【0245】
インフルエンザウイルス及びＨＡ偽型ウイルスの調製
野生型インフルエンザウイルスＡ／California／４／０９（Ｈ１Ｎ１－ＣＡ０９）、Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ１Ｎ１－ＰＲ８）、Ａ／Perth／１６／０９（Ｈ３Ｎ２－ＰＥ０９）、Ａ／Aichi／２／６８（Ｈ３Ｎ２－Ａ２／６８）、Ａ／Hong kong／８／６８（Ｈ３Ｎ２－ＨＫ６８）、Ａ／Sydney／５／９７（Ｈ３Ｎ２－ＳＹ９７）、Ａ／Brisbane／１０／０７（Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７）、Ａ／Wisconsin／６７／０５（ＨＡ，ＮＡ）ｘ Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Aichi／２／６８（ＨＡ，ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ３Ｎ２）、及びＡ／Nanchang／９９３／９５（Ｈ３Ｎ２－ＮＣ９５）をＮＩＨ ＢＥＩＲ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＩＨ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、標準的なウイルス培養技術によってメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞中で成長させた。動物チャレンジ研究において使用されるＡ／Brisbane／１０／２００７－ｍａ（Ｈ３Ｎ２）は、ＰＲ８再集合体ウイルスｘ－１７１に由来するマウス適合ウイルスである４６。
野生型インフルエンザウイルスＡ／California／４／０９（Ｈ１Ｎ１－ＣＡ０９）、Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ１Ｎ１－ＰＲ８）、Ａ／Perth／１６／０９（Ｈ３Ｎ２－ＰＥ０９）、Ａ／Aichi／２／６８（Ｈ３Ｎ２－Ａ２／６８）、Ａ／Hong kong／８／６８（Ｈ３Ｎ２－ＨＫ６８）、Ａ／Sydney／５／９７（Ｈ３Ｎ２－ＳＹ９７）、Ａ／Brisbane／１０／０７（Ｈ３Ｎ２－ＢＲ０７）、Ａ／Wisconsin／６７／０５（ＨＡ，ＮＡ）ｘ Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Aichi／２／６８（ＨＡ，ＮＡ）×Ａ／Puerto Rico／８／３４（Ｈ３Ｎ２）、及びＡ／Nanchang／９９３／９５（Ｈ３Ｎ２－ＮＣ９５）をＮＩＨ ＢＥＩＲ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＩＨ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、標準的なウイルス培養技術によってメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞中で成長させた。動物チャレンジ研究において使用されるＡ／Brisbane／１０／２００７－ｍａ（Ｈ３Ｎ２）は、ＰＲ８再集合体ウイルスｘ－１７１に由来するマウス適合ウイルスである４６。
【0246】
Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５－ＶＮ０４）、Ａ／Hong Kong／１５６／９７（Ｈ５－ＨＫ９７）、Ａ／Netherlands／２１９／０７（Ｈ７－ＮＬ２１９）、Ａ／ＦＰＶ／Rostock／１９３４（Ｈ７－ＦＰＶ）の全長ＨＡ遺伝子及びＨ５－ＶＮ０４のノイラミニダーゼ遺伝子Ｎ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ８０７２３）を、別々にｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。Ｅｎｖ偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスを、以前に記載されたように１２、２９３Ｔ／１７細胞中で産生した。簡単に述べると、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｈ５－ＶＮ０４、Ｈ５－ＨＫ９７、Ｈ７－ＮＬ２１９、又はＨ７－ＦＰＶプラスミドを、Ｎ１発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｎ１－ＶＮ０４、ＨＩＶパッケージングベクターｐＣＭＶＲ８．２、及びレポーターベクターｐＨＩＶ－Ｌｕｃとともに２９３Ｔ／１７細胞に別々に同時トランスフェクトした。ウイルス上清をトランスフェクションの４８時間後に採取した。ウイルス力価測定は、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定することによって評価した。
【0247】
Ｈ３結合記憶細胞のＦＡＣＳ選別
新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）の使用によって、収集した血液から単離した。ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋Ｂ細胞を、ビオチン化Ｈ３－ＡＴＴＨ及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジンで染色した。単一のＨ３反応性記憶Ｂ細胞を３８４ウェルプレートに選別した。１４日間の拡大増殖後、上清を、組換えＨ１（Ｈ１－ＣＡ０９）、Ｈ３（Ｈ３－ＢＲ０７）、及びＨ７（Ｈ７－ＣＡ４４４）ＨＡタンパク質に対する反応性について試験し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって分析した。続いて、反応上清のＨ３Ｎ２－ＢＲ０７に対する中和活性をインビトロで測定した。全てのＨ３Ｎ２中和抗体を、以前に記載されたように４７プライマーを使用して単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによってレスキューした。
新鮮なＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）の使用によって、収集した血液から単離した。ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋Ｂ細胞を、ビオチン化Ｈ３－ＡＴＴＨ及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジンで染色した。単一のＨ３反応性記憶Ｂ細胞を３８４ウェルプレートに選別した。１４日間の拡大増殖後、上清を、組換えＨ１（Ｈ１－ＣＡ０９）、Ｈ３（Ｈ３－ＢＲ０７）、及びＨ７（Ｈ７－ＣＡ４４４）ＨＡタンパク質に対する反応性について試験し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって分析した。続いて、反応上清のＨ３Ｎ２－ＢＲ０７に対する中和活性をインビトロで測定した。全てのＨ３Ｎ２中和抗体を、以前に記載されたように４７プライマーを使用して単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによってレスキューした。
【0248】
３Ｉ１４ ｓｃＦＶ及びＩｇＧ抗体の発現及び精製
本発明者らは、迅速な単一段階のクローニング手順を使用して、最初に３Ｉ１４ ＡｂをｐｃＤＮＡ３．１－ヒンジｓｃＦｖＦｃミニボディ発現ベクターに移動させ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを有する融合産物としてｓｃＦｖを生成する１２。精製した３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃを使用して、複数のＨＡ及び異なるサブタイプのウイルスに対する結合及び中和活性を評価した（図１Ａ～図１Ｂ及び図２）。全ヒトＩｇＧ１については、ｓｃＦｖの遺伝子断片をヒトＩｇＧ１発現ベクターＴＣＡＥ６に別々にサブクローニングした４８。ｓｃＦｖＦｃ又はＩｇＧ１を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｆ細胞において発現させ、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
本発明者らは、迅速な単一段階のクローニング手順を使用して、最初に３Ｉ１４ ＡｂをｐｃＤＮＡ３．１－ヒンジｓｃＦｖＦｃミニボディ発現ベクターに移動させ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを有する融合産物としてｓｃＦｖを生成する１２。精製した３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃを使用して、複数のＨＡ及び異なるサブタイプのウイルスに対する結合及び中和活性を評価した（図１Ａ～図１Ｂ及び図２）。全ヒトＩｇＧ１については、ｓｃＦｖの遺伝子断片をヒトＩｇＧ１発現ベクターＴＣＡＥ６に別々にサブクローニングした４８。ｓｃＦｖＦｃ又はＩｇＧ１を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｆ細胞において発現させ、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【0249】
速度論的及びＫｄ決定
本発明者らは、迅速な単一段階のクローニング手順を使用して、最初に３Ｉ１４ ＡｂをｐｃＤＮＡ３．１－ヒンジｓｃＦｖＦｃミニボディ発現ベクターに移動させ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを有する融合産物としてｓｃＦｖを生成する１２。精製した３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃを使用して、複数のＨＡ及び異なるサブタイプのウイルスに対する結合及び中和活性を評価した（図１Ａ～図１Ｂ及び図２）。全ヒトＩｇＧ１については、ｓｃＦｖの遺伝子断片をヒトＩｇＧ１発現ベクターＴＣＡＥ６に別々にサブクローニングした４８。ｓｃＦｖＦｃ又はＩｇＧ１を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｆ細胞において発現させ、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
本発明者らは、迅速な単一段階のクローニング手順を使用して、最初に３Ｉ１４ ＡｂをｐｃＤＮＡ３．１－ヒンジｓｃＦｖＦｃミニボディ発現ベクターに移動させ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを有する融合産物としてｓｃＦｖを生成する１２。精製した３Ｉ１４ ｓｃＦｖＦｃを使用して、複数のＨＡ及び異なるサブタイプのウイルスに対する結合及び中和活性を評価した（図１Ａ～図１Ｂ及び図２）。全ヒトＩｇＧ１については、ｓｃＦｖの遺伝子断片をヒトＩｇＧ１発現ベクターＴＣＡＥ６に別々にサブクローニングした４８。ｓｃＦｖＦｃ又はＩｇＧ１を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｆ細胞において発現させ、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【0250】
マイクロ中和アッセイ
実験の前に、ＭＤＣＫ細胞（１つのウェル当たり１．５×１０４個の細胞）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで２μｇ／ｍＬのトリプシン及び０．５％ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。１００ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを、９６ウェルプレート中でＡｂ又は抗体含有上清の２倍連続希釈物と等体積で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｂ－ウイルス混合物をコンフルエントなＭＤＣＫ単層に二連で移し、続いて３７℃で２１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、８０％アセトン中で固定し、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に対するｍＡｂ（クローンＡ３、ＢＥＩ）を用いた間接ＥＬＩＳＡによってウイルス抗原を検出した。
実験の前に、ＭＤＣＫ細胞（１つのウェル当たり１．５×１０４個の細胞）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで２μｇ／ｍＬのトリプシン及び０．５％ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。１００ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを、９６ウェルプレート中でＡｂ又は抗体含有上清の２倍連続希釈物と等体積で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｂ－ウイルス混合物をコンフルエントなＭＤＣＫ単層に二連で移し、続いて３７℃で２１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、８０％アセトン中で固定し、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に対するｍＡｂ（クローンＡ３、ＢＥＩ）を用いた間接ＥＬＩＳＡによってウイルス抗原を検出した。
【0251】
マウスにおける予防的研究
ウイルスチャレンジ接種の２４時間前に、５匹の雌８～１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの接種グループに、３Ｉ１４及びＦ１０ ＩｇＧ１を低用量（５ｍｇ ｋｇ－１）又は高用量（２０又は２５ｍｇ ｋｇ－１）で、それぞれ０．５ｍＬ容量で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により注射した。マウスの全てのグループ（ｎ＝６）を、Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Brisbane／１０／０７－ｍａ（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）、又はＡ／Anhui／１／１３（Ｈ７Ｎ９）の１０ ＬＤ５０（５０％致死量）で鼻腔内感染させた。ウイルスチャレンジの日にマウスの体重を測定し、次いで、臨床徴候についてモニターし、体重を１４日間又は１８日間毎日記録した。初期体重に対して２５％以上の体重減少、又は臨床徴候（無反応性、又は後麻痺肢、運動失調などの重度の神経学的症状）指数に対する４のスコアを生存エンドポイントとして使用した。承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルに従って動物研究を行った。
ウイルスチャレンジ接種の２４時間前に、５匹の雌８～１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの接種グループに、３Ｉ１４及びＦ１０ ＩｇＧ１を低用量（５ｍｇ ｋｇ－１）又は高用量（２０又は２５ｍｇ ｋｇ－１）で、それぞれ０．５ｍＬ容量で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により注射した。マウスの全てのグループ（ｎ＝６）を、Ａ／Vietnam／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Brisbane／１０／０７－ｍａ（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Netherlands／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）、又はＡ／Anhui／１／１３（Ｈ７Ｎ９）の１０ ＬＤ５０（５０％致死量）で鼻腔内感染させた。ウイルスチャレンジの日にマウスの体重を測定し、次いで、臨床徴候についてモニターし、体重を１４日間又は１８日間毎日記録した。初期体重に対して２５％以上の体重減少、又は臨床徴候（無反応性、又は後麻痺肢、運動失調などの重度の神経学的症状）指数に対する４のスコアを生存エンドポイントとして使用した。承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルに従って動物研究を行った。
【0252】
抗体結合競合
ＥＬＩＳＡプレート上に固定された５μｇ／ｍｌのＨ３－ＢＲ０７又はＨ５－ＶＮ０４タンパク質を、８０ｎＭ～０．３ｎＭの範囲の３Ｉ１４ Ｆａｂの２倍連続希釈物とともにインキュベートし、５ｎＭの他のｓｃＦｖＦｃ Ａｂと混合した。１時間の共インキュベーション後、ｓｃＦｖＦｃ Ａｂの結合を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＣＨ２抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して検出し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でＳｕｐｅｒ ＡｑｕａＢｌｕｅ ＥＬＩＳＡ基質（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して測定した。
ＥＬＩＳＡプレート上に固定された５μｇ／ｍｌのＨ３－ＢＲ０７又はＨ５－ＶＮ０４タンパク質を、８０ｎＭ～０．３ｎＭの範囲の３Ｉ１４ Ｆａｂの２倍連続希釈物とともにインキュベートし、５ｎＭの他のｓｃＦｖＦｃ Ａｂと混合した。１時間の共インキュベーション後、ｓｃＦｖＦｃ Ａｂの結合を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＣＨ２抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して検出し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でＳｕｐｅｒ ＡｑｕａＢｌｕｅ ＥＬＩＳＡ基質（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して測定した。
【0253】
トリプシン切断阻害アッセイ
０．４μｇの組換えＨ３－ヒスチジン（Ｈ３－ＡＴＴＨ）タンパク質を、２．５μｇの３Ｉ１４若しくは抗ＳＡＲＳ Ｆｍ－６ ＩｇＧ１の存在下、又は抗体の非存在下で、１００μｇ ｍｌ－１のＴｒｙｐｓｉｎ－ｕｌｔｒａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有するｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、３７℃でインキュベートした。トリプシン消化は、１％ＢＳＡの添加によっていくつかの時点で阻害された。試料を還元条件下で１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ＨｉｓＰｒｏｂｅ－ＨＲＰ及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ ＨｉｓＰｒｏｂｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してブロットした。
０．４μｇの組換えＨ３－ヒスチジン（Ｈ３－ＡＴＴＨ）タンパク質を、２．５μｇの３Ｉ１４若しくは抗ＳＡＲＳ Ｆｍ－６ ＩｇＧ１の存在下、又は抗体の非存在下で、１００μｇ ｍｌ－１のＴｒｙｐｓｉｎ－ｕｌｔｒａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有するｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、３７℃でインキュベートした。トリプシン消化は、１％ＢＳＡの添加によっていくつかの時点で阻害された。試料を還元条件下で１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ＨｉｓＰｒｏｂｅ－ＨＲＰ及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ ＨｉｓＰｒｏｂｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してブロットした。
【0254】
立体構造変化ＦＡＣＳアッセイ
２９３Ｔ／１７細胞を、全長組換えＡ型インフルエンザｐｃＤＮＡ３．１－Ｈ３－Ａ２／６８及びＨ３－ＢＲ０７プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの約３０時間後に、０．２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して細胞を培養容器から剥離した。異なるＨＡ構造的立体構造へのｍＡｂ結合を測定するために、細胞試料を異なる処置に曝露し、アリコートに分け、３Ｉ１４又はＥ７３０ ｓｃＦｖＦｃ Ａｂで染色した。剥離した細胞を、室温で５分間トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で連続的に処置し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、クエン酸－リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．９中で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いでＰＢＳ中の５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とともに室温で２０分間インキュベートした。代替として、５μｇの３Ｉ１４又は抗ＳＡＲＳ Ａｂ Ｆｍ－６ ＩｇＧ１を、低ｐＨ工程の前に添加した。連続処置の試料をＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＹ）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩを使用して分析した。
２９３Ｔ／１７細胞を、全長組換えＡ型インフルエンザｐｃＤＮＡ３．１－Ｈ３－Ａ２／６８及びＨ３－ＢＲ０７プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの約３０時間後に、０．２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して細胞を培養容器から剥離した。異なるＨＡ構造的立体構造へのｍＡｂ結合を測定するために、細胞試料を異なる処置に曝露し、アリコートに分け、３Ｉ１４又はＥ７３０ ｓｃＦｖＦｃ Ａｂで染色した。剥離した細胞を、室温で５分間トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で連続的に処置し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、クエン酸－リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．９中で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いでＰＢＳ中の５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とともに室温で２０分間インキュベートした。代替として、５μｇの３Ｉ１４又は抗ＳＡＲＳ Ａｂ Ｆｍ－６ ＩｇＧ１を、低ｐＨ工程の前に添加した。連続処置の試料をＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＹ）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩを使用して分析した。
【0255】
抗体依存性細胞傷害アッセイ
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、エフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体を安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｖ１５８（高親和性）バリアント、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを使用する（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＡＤＣＣにおける抗体生物学的活性は、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されるルシフェラーゼを介して定量化され、エフェクター細胞におけるルシフェラーゼ活性を発光読み出しで定量化する。標的細胞として、１×１０４個／ウェルのＨ３又はＨ５発現２９３Ｔ細胞をアッセイ前に平底９６ウェルプレートに付着させ、次いで、培地を低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液（０．５％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）と交換した。ｓｃＦｖＦｃ抗体を、１、０．２、及び０．０４μｇ ｍｌ－１の最終濃度で各ウェルに添加した。１時間後、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を、低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液中のアッセイプレートに６．０×１０４個／ウェルで添加し、６時間インキュベートした。上清を３００×ｇでの遠心分離によって回収し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって４９０ｎｍでＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して測定した。
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、エフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体を安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｖ１５８（高親和性）バリアント、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを使用する（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＡＤＣＣにおける抗体生物学的活性は、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されるルシフェラーゼを介して定量化され、エフェクター細胞におけるルシフェラーゼ活性を発光読み出しで定量化する。標的細胞として、１×１０４個／ウェルのＨ３又はＨ５発現２９３Ｔ細胞をアッセイ前に平底９６ウェルプレートに付着させ、次いで、培地を低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液（０．５％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）と交換した。ｓｃＦｖＦｃ抗体を、１、０．２、及び０．０４μｇ ｍｌ－１の最終濃度で各ウェルに添加した。１時間後、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を、低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液中のアッセイプレートに６．０×１０４個／ウェルで添加し、６時間インキュベートした。上清を３００×ｇでの遠心分離によって回収し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって４９０ｎｍでＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して測定した。
【0256】
図９Ｂについての追加のＡＤＣＣ方法を以下に記載する。ＡＤＣＣアッセイを、健常なヒトドナー由来の新鮮なＰＢＭＣを用いて、ＨＡ発現２９３Ｔ細胞に対して行った。ＡＤＣＣ活性を、ラクトースデヒドロゲナーゼ（lactose dehydrogenase、ＬＤＨ）放出アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。収集した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）の使用によって、エフェクター細胞としての新鮮なＰＢＭＣを単離した。標的細胞として、２×１０４個／ウェルのＨ３又はＨ５発現２９３Ｔ細胞をアッセイ前に固体丸底９６ウェルプレートに付着させ、次いで、培地を低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液（０．５％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）と交換した。ｓｃＦｖＦｃ抗体を１０、５、２．５、及び１．２５μｇ ｍｌ－１の最終濃度で各ウェルに添加した。１時間後、ＰＢＭＣを、低ＩｇＧ血清アッセイ緩衝液中のアッセイプレートに１．２×１０５個／ウェルで添加し、６時間インキュベートした。上清を３００×ｇでの遠心分離によって回収し、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって４９０ｎｍ及び６８０ｎｍでＬＤＨ細胞傷害アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。ＬＤＨ活性を、４９０ｎｍの吸光度読み取り値から６８０ｎｍの吸光度値（バックグラウンド）を差し引くことによって決定した。細胞傷害性のパーセントを、％細胞傷害性＝１００×（Ｅ－ＳＥ－ＳＴ）／（Ｍ－ＳＴ）として計算した。Ｅ、抗体を含むＥ／Ｔ培養物から放出されたＬＤＨ；ＳＥ、エフェクターから自発的に放出されたＬＤＨ；ＳＴ、標的から自発的に放出されたＬＤＨ；Ｍ、溶解した標的から放出された最大ＬＤＨ。データは、３回の独立した実験からの代表的な実験を表し、全ての試験を３回実施した。データは、３回の独立した実験からの代表的な実験を表し、全ての試験を３回実施した。
【0257】
配列分析
全長Ａ型インフルエンザＨＡ配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースのインフルエンザウイルスリソースからダウンロードした。系統発生（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ、ＰＨＹＭＬ）ツリーは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用するそれらのアミノ酸配列比較に基づく。新しいｂｎＡｂである３Ｉ１４を、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）を使用して、生殖系列遺伝子使用、体細胞変異、Ｎヌクレオチド挿入、並びに同族可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子対について分析した。単一又は複数の生殖系列変異が生殖系列に復帰した抗体バリアントを合成（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によって産生し、配列決定によって確認した。Ｆ１０、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２０、及び３９．２９のＶＨ及びＶＫ配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢアクセッションコード）を通じて入手し、対応する遺伝子を合成し、一過性トランスフェクションによって発現させた。
全長Ａ型インフルエンザＨＡ配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースのインフルエンザウイルスリソースからダウンロードした。系統発生（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ、ＰＨＹＭＬ）ツリーは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用するそれらのアミノ酸配列比較に基づく。新しいｂｎＡｂである３Ｉ１４を、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）を使用して、生殖系列遺伝子使用、体細胞変異、Ｎヌクレオチド挿入、並びに同族可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子対について分析した。単一又は複数の生殖系列変異が生殖系列に復帰した抗体バリアントを合成（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によって産生し、配列決定によって確認した。Ｆ１０、ＦＩ６ｖ３、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２０、及び３９．２９のＶＨ及びＶＫ配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢアクセッションコード）を通じて入手し、対応する遺伝子を合成し、一過性トランスフェクションによって発現させた。
【0258】
インシリコ構造モデリング
３Ｉ１４を、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ中の抗体モデリングモジュールを使用して相同性モデリングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋとドッキングする前に、モデルをＨ３／ＦＩ６複合体構造に重ね合わせた。側鎖及びループ再配置を可能にして、高分解能ドッキングのみを行う。１０００個のデコイを各ドッキングについて生成し、ＲＭＳＤ値に基づいてクラスター化した。最終モデルを、クラスターサイズ及び結果セッションに記載された基準に基づいて選択した。
３Ｉ１４を、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ中の抗体モデリングモジュールを使用して相同性モデリングした。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋとドッキングする前に、モデルをＨ３／ＦＩ６複合体構造に重ね合わせた。側鎖及びループ再配置を可能にして、高分解能ドッキングのみを行う。１０００個のデコイを各ドッキングについて生成し、ＲＭＳＤ値に基づいてクラスター化した。最終モデルを、クラスターサイズ及び結果セッションに記載された基準に基づいて選択した。
【0259】
実施例１９：改善された安全性のためのインフルエンザモノクローナル抗体の抗体操作
インフルエンザに対する有効性を保持しながら、Ｆｃ操作を使用して安全性を改善するための抗体修飾が、本明細書において報告される。
インフルエンザに対する有効性を保持しながら、Ｆｃ操作を使用して安全性を改善するための抗体修飾が、本明細書において報告される。
【0260】
例えば、図２１は、ＩＮＦＶ Ａ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）（２０１８）のインビトロ中和を示す。図２２は、ＢＡＬＢ／ｃ Ｈ１Ｎ１モデル（２０１８）におけるマウスのインビボ防御を示す。図２３は、マウスにおける抗体依存性感染増強研究を示す（ウイルス負荷）（２０１９）。図２４は、マウス対Ｈ１Ｎ１（予防的－２０１９、治療的－２０２０）の予防的及び治療的防御を示す。図２５は、マウス対Ｈ３Ｎ２（２０２０）の予防的及び治療的防御を示す。
【0261】
ｍＡｂ ３Ｉ１４などの抗体は、インフルエンザを中和し、インフルエンザに対する防御を提供する（例えば、国際公開第２０１６／１６４８３５号を参照されたい）。本明細書において、本発明者らは、ｍＡｂ ３Ｉ１４が、Ｆｃガンマ受容体に結合しない変異したＦｃ領域を有することによって、例えば、２３４位及び２３５位におけるロイシンのアラニンへの修飾（ＬＡＬＡ修飾）によって修飾され得ることを記載する。ｍＡｂ ３Ｉ１４の修飾バージョンは、インフルエンザに対する有効性を保持する一方で、抗体依存性感染増強を防止する。これらは驚くべき結果であり、なぜなら、Ｆｃを修飾することがインフルエンザに対する有効性の喪失をもたらすであろうということが一般に予想されていたからである。３Ｉ１４の修飾バージョンは、インフルエンザに対するｍＡｂ治療薬及び予防薬を開発するための新規の改善されたアプローチを表す。
【0262】
３Ｉ１４のＦｃ修飾バージョンは、Ａ型インフルエンザ感染を治療（療法）及び防止（予防）するための対策として開発することができる。
【0263】
実施例２０：ｍＡｂ ３Ｉ１４ ＬＡＬＡ抗体
理論に束縛されることを望むものではないが、３Ｉ１４から開発される実用的かつ安全な生成物は、２３４～２３５位のロイシンからアラニンへの置換（ＬＡＬＡ置換）で操作されたバージョンであり得る。ＬＡＬＡ置換は、Ｆｃγ受容体への抗体の結合を防止し、それによってインフルエンザの抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を防止する。ＡＤＥは、抗体のサブ中和レベルがＦｃ媒介性エンドサイトーシスを介して感染を増強する効果である。ＡＤＥは、インフルエンザを含む多数のウイルスについて観察されており、インフルエンザ抗体生成物に関する安全上の懸念である。ＬＡＬＡ操作バージョンは、この安全性リスクを回避する。
理論に束縛されることを望むものではないが、３Ｉ１４から開発される実用的かつ安全な生成物は、２３４～２３５位のロイシンからアラニンへの置換（ＬＡＬＡ置換）で操作されたバージョンであり得る。ＬＡＬＡ置換は、Ｆｃγ受容体への抗体の結合を防止し、それによってインフルエンザの抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を防止する。ＡＤＥは、抗体のサブ中和レベルがＦｃ媒介性エンドサイトーシスを介して感染を増強する効果である。ＡＤＥは、インフルエンザを含む多数のウイルスについて観察されており、インフルエンザ抗体生成物に関する安全上の懸念である。ＬＡＬＡ操作バージョンは、この安全性リスクを回避する。
【0264】
以前に、ＬＡＬＡ修飾を有する広域結合ＨＡ抗体が、Ａ型インフルエンザのグループ１及びグループ２の両方からのインフルエンザウイルスに対する防御を達成することができることは、以前に示されていなかった。
【0265】
実施例２１
追加の抗体Ｆｃ操作。３Ｉ１４は、Ｆｃγ受容体への結合を防止し、ＩＮＦＶの中和又は有効性を低下させることなくＩＮＦＶの抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を回避するために、Ｆｃ領域中の２３４位及び２３５位における２つのロイシン－アラニン置換（ＬＡＬＡ置換）で操作した［１］［２］［３］［４］［５］［６］［７］。この操作された抗体を３Ｉ１４ ＬＡＬＡと命名する。野生型３Ｉ１４抗体を３Ｉ１４と命名する。
追加の抗体Ｆｃ操作。３Ｉ１４は、Ｆｃγ受容体への結合を防止し、ＩＮＦＶの中和又は有効性を低下させることなくＩＮＦＶの抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を回避するために、Ｆｃ領域中の２３４位及び２３５位における２つのロイシン－アラニン置換（ＬＡＬＡ置換）で操作した［１］［２］［３］［４］［５］［６］［７］。この操作された抗体を３Ｉ１４ ＬＡＬＡと命名する。野生型３Ｉ１４抗体を３Ｉ１４と命名する。
【0266】
３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、前臨床スクリーニングにおいて安全である。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ薬物動態（pharmacokinetics、ＰＫ）及び生物学的利用能を、ＩＶ及びＩＰ経路の両方について評価した。ＩＶ及びＩＰ経路による３Ｉ１４ ＬＡＬＡのｔ１／２は、それぞれ９８時間及び２３２時間であった。ＩＶ及びＩＰ経路による３Ｉ１４ ＬＡＬＡのＴｍａｘは、それぞれ０．０８３時間及び２４時間であった。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ ＩＶ及びＩＰのＣｍａｘは、１８．４μｇ／ｍＬ及び８．４μｇ／ｍＬであった。生物学的利用能ＩＶ及びＩＰ経路は、１，３７６μｇ／ｍＬ＊時間及び１，８０４μｇ／ｍＬ＊時間であった。
【0267】
ＡＤＥの回避。抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、抗体のサブ中和レベルがＦｃ媒介性エンドサイトーシスを介して感染を増強する、十分に研究された現象である［３］［４］［８］［９］［１０］［１１］［１２］［１３］［６］［１４］［１５］。いくつかのｍＡｂの第２相臨床ＩＮＦＶチャレンジ研究は、ＡＤＥの可能性を示し、したがって、新しい候補の必要性を示す［１６］［１７］。モノクローナル抗体は、抗体用量及びウイルスチャレンジ株に依存してＡＤＥを媒介することができ、これは、疾患を悪化させ、重篤なインフルエンザで入院している患者を治療する場合に安全性リスクをもたらし得る。
【0268】
ＡＤＥの現象は、インフルエンザ、コロナウイルスなどを含む多数のウイルスにとってより大きな関心事であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ大発生及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックが起こった今、研究は、抗体が疾患を悪化させる可能性を支持する［１８］［１９］［２０］［２１］。したがって、ＡＤＥを回避するためのアプローチは、パンデミック対策としての受動免疫療法及びワクチンの開発及び展開中に強く考慮されるべきである［２２］。３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、任意の潜在的なインビボＡＤＥ活性の回避を可能にするためにＦｃ領域に導入されたＬＡＬＡ置換を有する安全設計を有する。これは、他の臨床候補とは対照的である。
【0269】
本発明者らの３Ｉ１４ ＬＡＬＡ抗体は、Ｆｃγ受容体への結合を防止するためにＦｃ領域にＬＡＬＡ置換を作製することによって３Ｉ１４から操作されたており、これによって、効力を低下させることなくＡＤＥを回避する。インビトロ及び動物研究からのデータは、３Ｉ１４ ＬＡＬＡが３Ｉ１４と同様の効力を有することを示す。インビボデータは更に、３Ｉ１４ ＬＡＬＡによるＡＤＥの回避を示す。マウスにおける本発明者らの研究において、肺組織における約２倍増加したウイルス力価を、３Ｉ１４ ＬＡＬＡと比較して、中程度の低用量レベルの３Ｉ１４で処置された動物において測定した。
【0270】
３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を回避する。Ｈ１Ｎ１感染マウスのウイルス負荷研究において、３Ｉ１４ ＬＡＬＡでの処置は、対照と比較して肺におけるウイルスレベルの増加を示さなかった。しかしながら、３Ｉ１４で処置したマウスは、ウイルスレベルが、ＡＤＥに典型的なパターンで、中程度の低用量レベルで約２倍増加したことを示した。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４は両方とも、予想通り、５ｍｇ／ｋｇ以上の高用量でウイルスレベルの低下を示した。
【0271】
３Ｉ１４ ＬＡＬＡの効力、広範囲の活性、並びにＡＤＥ及びウイルス耐性の回避は、他のＩＮＦＶ抗体候補と比較して有利である。例えば、ＶｉｓｔｅｒｒａのＶＩＳ４１０は、Ｈ７Ｎ９に対する有効性が限定されている［２３］［２４］［２５］。加えて、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるヒトＩｇＧモノクローナル抗体を評価する最近のヒト臨床研究は、いくつかの場合において、３．６又は８．４ｇまでの非常に高用量の試験抗体を用いて、ＡＤＥがインビボで役割を果たし得ることを示した。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＭＥＤＩ８８５２は、７５０ｍｇ用量で投与された場合にウイルス排出の増加を示し［１６］、ＡＤＥに対する潜在的な感受性を示した。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅは、２０１９年後半に、インフルエンザ感染に対する単剤療法及びオセルタミビル併用療法第２相試験を中止した。
【0272】
臨床試験におけるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ｍＡｂ ８１．３９ａ ＭＨＡＡ４５４９Ａ／Ｇｅｄｉｖｕｍａｂは、４００及び３６００ｍｇでウイルス量の低減を示したが、１２００ｍｇでウイルス量の増加を示した［１７］。この研究の著者らは、これが患者応答における不均一性及び研究された小集団に関連し得ると主張するが、別の仮説は、中間用量レベルでのＡＤＥとの抗ウイルス効果の競合であり得る。ＭＨＡＡ４５４９Ａ（Ｇｅｄｉｖｕｍａｂ）は、１６８人の参加者による最近の第２相試験［２６］において、最大８４００ｍｇのＭＨＡＡ４５４９Ａと組み合わせたオセルタミビルを評価し、抗体グループが、Ｏ２又は人工呼吸支援の増加、任意の原因によるより高い死亡率、抗体を伴う又は伴わない同様のウイルス負荷、及び抗グループにおけるウイルス排出期間の増加を必要としたことを示した。抗体は、会社のパイプラインに列挙されておらず、Ｑ１ ２０２０で中止されている可能性がある。グループからの他のＩＮＦＶ ｍＡｂもまた、以前に臨床試験において好ましくない結果に遭遇した［２６］。Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＧｅｎｅｔｉｃｓのＦＧＩ－１０１－１Ａ６及びＴｈｅｒａｃｌｏｎｅの（Ａｌｔｉｍｍｕｎｅより入手）ＴＣＮ－０３２は、保留状態であることが示されている。Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ（韓国）のＣＴ－２７抗ＨＡ幹抗体候補は、６０ｋｇの個体において５，０００ｍｇを超える非常に高い用量（９０ｍｇ／ｋｇ）で使用されたが、症状及び熱緩和の時間が約２日短縮されたと発表された第２ｂ相に達している。
【0273】
Ｖｉｓｔｅｒｒａ／Ｔａｋｅｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素のステム領域に結合するように操作されたヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである抗体ＶＩＳ４１０についての共同研究を発表した。最近の第２ａ相臨床チャレンジ研究では、２３００ｍｇ又は４６００ｍｇのＶＩＳ４１０の安全性、忍容性、薬物動態、及び抗ウイルス活性が、Ａ／California／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスに感染した他の点では健常な成人ボランティアにおいて評価された［２７］。全症状の消散までの時間は、ＶＩＳ４１０処置対象とプラセボ処置対象との間で同様であり、ＶＩＳ４１０処置では消散までの時間がより速くなる傾向があった。更に、インフルエンザ様症状は、抗体とプラセボとの間で等しく起こり、何人かのレシピエントは、重度の痙攣、下痢、又はその両方を経験し、経口ラニチジン（１５０ｍｇ）、モンテルカスト（１０ｍｇ）、又はイブプロフェン（６００ｍｇ）のいずれかの単回用量と組み合わせた抗ヒスタミンベースのレジメンによる前処置予防の組み込みをもたらした。急性炎症応答は、ＶＩＳ４１０処置がＩＬ－８及びＴＮＦαのより高い血清濃度と関連していることを示した。半減期は、比較的短かった（１１．５日）。Ｖｉｓｔｅｒｒａは、Ａ型インフルエンザと診断された入院患者において２０１８年１１月に第２相試験を完了し、オセルタミビル単独と比較したＶＩＳ４１０＋オセルタミビルの２つの用量レベルを評価した［２８］。
【0274】
これらの他の抗体はいずれも、３Ｉ１４ ＬＡＬＡのＦｃバリアントを有さない。３Ｉ１４ ＬＡＬＡはまた、ＨＡステム上の疎水性溝内の５つ全てのサブポケットを認識する際に特有の結合パターンを有する。３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、第２のＨＡプロトマーの大きな表面積に及ぶ軽鎖フレームワーク領域（light chain framework region、ＬＦＲ）３領域を含み、グループ１及びグループ２のＨＡの両方を同様に認識する。３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、約１０００Å２の総界面面積を埋め込み、３Ｉ１４ ＬＡＬＡ重鎖と軽鎖との間に均一に広がり、隣接するプロトマーにも結合するＬＦＲ３によって独自に寄与される。
【0275】
ＡＤＥの回避の必要性。抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、抗体のサブ中和レベルがＦｃ媒介性エンドサイトーシスを介して感染を増強する、十分に研究された現象である［３］［４］［８］［９］［１０］［１１］。様々なウイルスが、宿主細胞を感染させるための代替的な方法として、免疫媒介性感染、特にＡＤＥを利用することが知られている。例としては、デング熱、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ、ＦＣｏＶ、及びインフルエンザが挙げられる［２９］［３０］［３１］［３２］［３３］［３４］［３５］［３６］。ＦＤＡ／Ｓｃｒｉｐｐｓによるインフルエンザチャレンジ研究において、異なる用量のモノクローナル抗体で前処置され、続いてＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスでチャレンジされたマウスは、抗体用量依存的様式で、増強された肺病理の形態でＡＤＥを示した［３７］。
【0276】
ワクチン接種のレシピエントに関連する２００９年のＨ１Ｎ１インフルエンザパンデミック発生の間に、及び歴史的なＨ３Ｎ２発生から保持された肺組織試料において、他の点では健常な成人における重度の疾患の証拠が観察され、その結果は、致死的症例の肺における交差反応性低アビディティ非防御抗体及び補体活性化を示唆している［３］。ＩＮＦＶ ＡＤＥの証拠は、ワクチン接種されたブタにおける抗ＨＡ２抗体の誘導がウイルス融合及び疾患の増強をもたらすことを示す研究によって更に支持された［４］。
【0277】
新規の２００９ Ｈ１Ｎ１ブタＡ型インフルエンザウイルスは、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃｏｕｎｔｙにおける軍事受益者の間で重大な大発生を引き起こし、これには、過去１２ヶ月間に一致しないインフルエンザ予防接種を受けた海軍船上の重大な症例群が含まれる。Ｈ１Ｎ１ウイルス感染を有するメンバーは、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染を有さないメンバーよりもインフルエンザ予防接種を受けた可能性が高かった［１２］。同様に、別の研究において、２００８－０９のミスマッチＴＩＶ（Trivalent inactivated influenza vaccine、三価不活化インフルエンザワクチン）の以前の受容が、カナダにおける２００９年の春から夏の間に受診要するｐＨ１Ｎ１疾患のリスクの増加と関連していたことが報告された［１３］。
【0278】
いくつかのｍＡｂの第２相臨床ＩＮＦＶチャレンジ研究の公開された結果は、ＡＤＥの可能性を示唆し得、したがって、新しい候補の必要性を例示する［１６］［１７］。Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）ｍＡｂ ＭＥＤＩ８８５２は、７５０ｍｇ用量で投与された場合、ウイルス排出のわずかな増加を示した［１６］。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ｍＡｂ ＭＨＡＡ４５４９Ａ／Ｇｅｄｉｖｕｍａｂは、４００及び３６００ｍｇでウイルス量の低減を示し、ウイルス量は１２００ｍｇで増加した［１７］。
【0279】
０．０１ＭＯＩのＩＮＦＶ Ａ／ＰｏｒｔＣｈａｍｂｅｒｓ／１／７３（Ａ／ＰＣ、Ｈ３Ｎ２）を中和濃度未満のマウス抗Ａ／ＰＣ免疫血清と混合した後、Ｆｃ－ｒｅｃ陽性マウスＰ３８８Ｄ細胞のインフルエンザ感染の２５倍増加が実証された。Ｆｃドメインを欠く抗体Ｆ（ａｂ’）２断片は、ウイルス感染のＦｃγ受容体媒介性ＡＤＥと一致して、用量依存的な感染の増加なしに細胞防御をもたらした［６］。健常な成体マウスへのＨ１Ｎ２抗Ｅｎｖエピトープ［１４］マウス血清の受動移入を含む研究は、ウイルスチャレンジ後のレシピエントの生存の減少をもたらし、Ｈ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１ Ａ／California／０４／２００９）ウイルスチャレンジ後の防御効果よりもむしろ死亡促進効果を示唆した［１５］。
【0280】
コロナウイルス（ＣｏＶ）を含む他のウイルスによるＡＤＥに注目した同様の報告が公開されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ処理されたマクロファージを有する死亡したＳＡＲＳ患者からの血清は、サイトカインの産生の増加を引き起こしたが、血清単独で処置した細胞では増加を引き起こさなかった。この産生は、ＦｃγＲ遮断抗体の存在下で著しく低減した［１８］。抗Ｓ－ＩｇＧは、中国マカクのＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染中の急性肺損傷において有害であることが示され、ＳＡＲＳワクチンを与えられたマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶによるその後のチャレンジ後に病的肺損傷をもたらした［１９］［２０］。
【0281】
いくつかのエピトープに対するモノクローナル抗体は、防御的であることが報告されているが、他のエピトープを標的とするｍＡｂは、ＡＤＥをもたらし得る［３８］［３４］［３９］［４０］［３７］。したがって、抗ウイルス治療剤としてｍＡｂを開発する間、注意が払われるべきである。モノクローナル抗体は、抗体用量及びウイルスチャレンジ株に依存してＡＤＥを媒介し得、これは、重篤なインフルエンザで入院している患者を治療する場合、潜在的に疾患増悪及び安全性リスクをもたらし得る［３７］。
【0282】
データ：
Ｈ５Ｎ１株Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でチャレンジされたマウスは、１０～４０ｍｇ／ｋｇの３Ｉ１４ ＬＡＬＡ予防的（チャレンジ前）用量で７０～９０％の生存率を有した。ウイルスチャレンジの２４時間後に３Ｉ１４ ＬＡＬＡで治療的に処置されたマウスは、１０～４０ｍｇ／ｋｇの用量で７０～１００％の生存率を示した。
Ｈ５Ｎ１株Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でチャレンジされたマウスは、１０～４０ｍｇ／ｋｇの３Ｉ１４ ＬＡＬＡ予防的（チャレンジ前）用量で７０～９０％の生存率を有した。ウイルスチャレンジの２４時間後に３Ｉ１４ ＬＡＬＡで治療的に処置されたマウスは、１０～４０ｍｇ／ｋｇの用量で７０～１００％の生存率を示した。
【0283】
ＩＮＦＶ単離物の３Ｉ１４ ＬＡＬＡ中和
Ａ）３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４を、ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞におけるインフルエンザＡ／ＰＲ８／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のインビトロ中和について比較した。このアッセイにおいて、０．１μｇの３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は３Ｉ１４は、８．６（Ｌｏｇ１０）ＰＦＵのウイルスの９９％超を中和することができた。
Ａ）３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４を、ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞におけるインフルエンザＡ／ＰＲ８／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のインビトロ中和について比較した。このアッセイにおいて、０．１μｇの３Ｉ１４ ＬＡＬＡ又は３Ｉ１４は、８．６（Ｌｏｇ１０）ＰＦＵのウイルスの９９％超を中和することができた。
【0284】
Ｂ）ＩＮＦＶ－Ａのグループ１及びグループ２のウイルス株に対する３Ｉ１４ ＬＡＬＡ中和の幅及び効力を、プラーク低減中和アッセイを使用して追加のインビトロ研究において試験した。これらの最近の研究において評価された株は、Ｈ１Ｎ１、グループ１のウイルス：Ａ／Mississipp1／０３／２００１、Ａ／Perth／２６１／２００９、Ａ／Texas／３６／１９９１、及びＨ３Ｎ２、グループ２のウイルス：Ａ／Hong Kong／０１／１９６８、Ａ／Philippines／０２／１９８２、Ａ／Victoria／０３／１９７５であった。結果：より最近の単離物を含む、評価したＩＮＦＶ－Ａの株は、インビトロでのＡＶ－１中和に対して感受性である。ＡＶ－１は、これらの研究において、０．１９５～０．９９１μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、試験した全てのウイルスの５０％中和を示した（それぞれ、Ｈ１Ｎ１ ０．２３１、０．４１９、０．３３６、及びＨ３Ｎ１ ０．００５、０．９９１、０．１９６μｇ／ｍＬ）
【0285】
Ｃ）３Ｉ１４ ＬＡＬＡを、オセルタミビル感受性ｗｔウイルス、及びノイラミニダーゼ糖タンパク質の２７４位（２７４Ｙ）にチロシンを担持する－すなわち、Ｈ２７４Ｙ置換を担持する耐性バリアントウイルス（以前の季節性Ｈ１Ｎ１；Ａ／New Caledonia／２０／９９様）として入手可能な、ＩＮＦＶ株Ａ／Mississipi／３／２００１を中和する能力について試験した［９２］。３Ｉ１４ ＬＡＬＡは、以下の表に示すように、感受性株及び耐性株の両方を等しいレベルで中和する。
【0286】
【0287】
ＡＤＥの回避
本発明者らは、３Ｉ１４ ＬＡＬＡがＡＤＥを回避することを示した。Ｈ１Ｎ１のマウスウイルス血症研究において、３Ｉ１４ ＬＡＬＡで処置したマウスは、対照と比較して、肺におけるウイルスレベルの増加を示さなかった。しかしながら、３Ｉ１４で処置したマウスは、ウイルスレベルが、ＡＤＥに典型的なパターンで、中程度の低用量レベルで約２倍増加したことを示した。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４は両方とも、予想通り、５ｍｇ／ｋｇ以上の用量でウイルスレベルの低下を示した。データを以下の図に示す。
本発明者らは、３Ｉ１４ ＬＡＬＡがＡＤＥを回避することを示した。Ｈ１Ｎ１のマウスウイルス血症研究において、３Ｉ１４ ＬＡＬＡで処置したマウスは、対照と比較して、肺におけるウイルスレベルの増加を示さなかった。しかしながら、３Ｉ１４で処置したマウスは、ウイルスレベルが、ＡＤＥに典型的なパターンで、中程度の低用量レベルで約２倍増加したことを示した。３Ｉ１４ ＬＡＬＡ及び３Ｉ１４は両方とも、予想通り、５ｍｇ／ｋｇ以上の用量でウイルスレベルの低下を示した。データを以下の図に示す。
【0288】
高病原性ＩＮＦＶ Ａに対する３Ｉ１４ ＬＡＬＡの治療有効性
Ｈ５Ｎ１：予防的処置を、高病原性ＩＮＦＶ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４の鼻腔内（ＩＮ）チャレンジの１時間前に腹腔内（ＩＰ）注射を介して施した。研究は、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの４つのグループ（ｎ＝１０）からなった。０日目に、全てのマウスを、鼻腔内（ＩＮ）経路を介してＨ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でチャレンジして、平均生存によって測定される予防的用量反応を決定した。３Ｉ１４ ＬＡＬＡで処置したマウスは、１０、２５、又は４０ｍｇ／ｋｇの用量で７０～９０％の生存率を示した。
Ｈ５Ｎ１：予防的処置を、高病原性ＩＮＦＶ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４の鼻腔内（ＩＮ）チャレンジの１時間前に腹腔内（ＩＰ）注射を介して施した。研究は、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの４つのグループ（ｎ＝１０）からなった。０日目に、全てのマウスを、鼻腔内（ＩＮ）経路を介してＨ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４でチャレンジして、平均生存によって測定される予防的用量反応を決定した。３Ｉ１４ ＬＡＬＡで処置したマウスは、１０、２５、又は４０ｍｇ／ｋｇの用量で７０～９０％の生存率を示した。
【0289】
Ｈ５Ｎ１：治療的処置を、高病原性ＩＮＦＶ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ＶＮ／１２０３／０４の鼻腔内（ＩＮ）チャレンジの２４時間後に腹腔内（ＩＰ）注射を介して施した。研究は、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの４つのグループ（ｎ＝１０）からなった。３Ｉ１４ ＬＡＬＡで処置したマウスは、１０、２５、又は４０ｍｇ／ｋｇの用量で７０～１００％の生存率を示した。
【0290】
これらの研究は、ＩＮＦＮ－Ａ Ｈ５Ｎ１からの防御のために予防的又は治療的に投与された３Ｉ１４ ＬＡＬＡ後の好ましい有効性を示す。
【0291】
本発明者らは、３Ｉ１４ ＬＡＬＡ対ＩＮＦＶ Ｈ７Ｎ９のマウス研究を、ＩＮＦＶ－Ａ Ｈ５Ｎ１と同じ研究設計を用いて完了するであろう。
【0292】
この実施例で引用されている参考文献
【0293】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【図1A】
【図1B】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6A-3】
【図6B-1】
【図6B-2】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】