特表 2024-542165 幹細胞分化および化学化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-13

(54)【発明の名称】幹細胞分化および化学化合物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20241106BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20241106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP

   C07K 14/495 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20241106BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20241106BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 31/501 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 38/28 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0735

C12N5/071 ZNA

C12N5/10

C07K14/495

A61K35/28

A61K35/545

A61K38/19

A61K31/4545

A61K31/4439

A61K31/506

A61K31/496

A61K31/5377

A61K31/501

A61K45/00

A61K38/28

A61P3/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527132

(86)(22)【出願日】2022-11-07

(85)【翻訳文提出日】2024-07-08

(86)【国際出願番号】 US2022079398

(87)【国際公開番号】W WO2023081884

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】63/277,092

(32)【優先日】2021-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】598032106

【氏名又は名称】バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】シエ，チュンフイ

(72)【発明者】

【氏名】ハーブ，ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】リュウ，エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】テセノ，ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】ファーラー，クリストファー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065BB05

4B065BB19

4B065BC50

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA44

4C084DA01

4C084DB34

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZC351

4C084ZC412

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC41

4C086BC42

4C086BC50

4C086BC82

4C086CB05

4C086CB07

4C086CB09

4C086CB27

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA10

4C086GA12

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZC35

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA22

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

幹細胞の膵細胞への分化に関する組成物および方法が本明細書で開示される。一部の態様では、本明細書で提供される方法は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する１つまたは複数の化学化合物の存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの膵β細胞、α細胞、δ細胞、およびＥＣ細胞の産生に関する。一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される方法に従って産生された細胞を含む医薬組成物、ならびにそれらを使用する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｓｏｘ１７陽性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項2】

幹細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

幹細胞、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項5】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される、請求項３または４に記載の組成物。

【請求項6】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む、請求項３または４に記載の組成物。

【請求項7】

多くとも約１００ｎｇ／ｍＬ、多くとも約８０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約６０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約２５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約２０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項２または６に記載の組成物。

【請求項8】

０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、または５ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項２または６に記載の組成物。

【請求項9】

約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項２または６に記載の組成物。

【請求項10】

幹細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項11】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、もしくはアピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

ＢＹＬ３１９、その類似体または誘導体を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ３１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０４μＭ、約０．０６μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、または約１μＭのＧＳＫ－６９０６９３を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤をさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤が、Ｗｎｔ３ａ、ＣＨＩＲ９９０２１、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびそれらの類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

０．５μＭ～５０μＭ、０．６μＭ～３０μＭ、０．８μＭ～２０μＭ、１μＭ～１０μＭ、または２μＭ～５μＭのＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

約０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、または３０μＭのＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

幹細胞が胚幹細胞を含む、請求項２から２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項２から２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

幹細胞がヒト細胞である、請求項２から３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

幹細胞が遺伝子修飾されている、請求項２から３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

Ｓｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団を含む、請求項１から３または６から３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

細胞の集団が、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

細胞の集団が、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５～約９０％、約８０％～約９０％、または約７５％～約８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項36】

複数のＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項37】

プロテインキナーゼＣ活性化剤、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

（ａ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、
（ｂ）ＬＤＮ１９３１８９もしくはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、
（ｃ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、
（ｄ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、
（ｅ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ならびに／または
（ｆ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤
をさらに含む、請求項３６に記載の組成物。

【請求項39】

形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項42】

多くとも約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項43】

多くとも約１０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約０．１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項44】

約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、または約０．１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項45】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞をさらに含む、請求項３６から４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項47】

線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。

【請求項48】

（ａ）インヒビン、アクチビン、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、
（ｂ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、
（ｃ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、
（ｄ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、
（ｅ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、
（ｆ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、ならびに／または
（ｇ）任意選択で、ＡＳ１８４２８５６である、ＦｏｘＯ１阻害剤
をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。

【請求項49】

組成物がノッチシグナル伝達阻害剤をさらに含み、任意選択で、ノッチシグナル伝達阻害剤がＸＸＩまたはＤＡＰＩである、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む、請求項５０に記載の組成物。

【請求項53】

多くとも約５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５０に記載の組成物。

【請求項54】

多くとも約２．５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約０．０５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５０に記載の組成物。

【請求項55】

約５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ、または約０．０５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５０に記載の組成物。

【請求項56】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞をさらに含む、請求項４６から５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項58】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む、請求項３６から５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む、請求項３６から５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項60】

ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む、請求項３６から５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む、請求項３６から６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

ＢＹＬ３１９、その類似体または誘導体を含む、請求項３６から６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ３１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項64】

ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項３６から６４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項66】

約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０４μＭ、０．０６μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１２μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、または１μＭのＧＳＫ－６９０６９３を含む、請求項３６から６４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項67】

約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む、請求項３６から６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項68】

水溶性合成ポリマーをさらに含む、請求項３６から６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

水溶性合成ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む、請求項６８に記載の組成物。

【請求項70】

水溶性合成ポリマーがポリビニルアルコールを含む、請求項６８に記載の組成物。

【請求項71】

水溶性合成ポリマーが、培地中に約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項72】

水溶性合成ポリマーが、培地中に約０．０４％～約０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項73】

水溶性合成ポリマーが、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項74】

水溶性合成ポリマーが、８５％未満が加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項６８から７３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項75】

水溶性合成ポリマーが、約８０％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項６８から７３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項76】

約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９を含む、請求項３６から７５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項77】

約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９を含む、請求項３６から７５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項78】

約５００ｍＬ～約５０Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約２Ｌ～約５Ｌ、約３Ｌ～約４Ｌ、約２Ｌ～約３０Ｌ、または約１０Ｌ～約２０Ｌの液体容積を有する、請求項１から７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項79】

約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５０ｍＬ、約３０ｍＬ～約４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３０ｍＬ、または約１０ｍＬ～約２０ｍＬの液体容積を有する、請求項１から７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項80】

複数の幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップを含む、方法。

【請求項81】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項83】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項84】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む、請求項８０から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む、請求項８０から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が、ＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項87】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ～約１μＭ，約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３と接触させるステップを含む、請求項８０から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０４μＭ、０．０６μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１２μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、または１μＭのＧＳＫ－６９０６９３と接触させるステップを含む、請求項８０から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む、請求項８０から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む、請求項８０から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、または約０．０７μＭ～約０．１５μＭのＧＳＫ－６９０６９３、および約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む、請求項８０から９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

接触させるステップが、複数の幹細胞を、約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む、請求項８０から９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させるステップを含む、請求項８０から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子が、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

複数の幹細胞を、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

複数の幹細胞を、約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、または５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と約２４時間～約９６時間、約３６時間～約８４時間、約４８時間～約８４時間、約６０時間～約８４時間、または約３日間接触させるステップを含む、請求項８０から９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

複数の幹細胞を、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤とも接触させるステップを含む、請求項８０から９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤が、Ｗｎｔ３ａ、ＣＨＩＲ９９０２１、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびこれらの任意の類似体または誘導体の１つまたは複数を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤がＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項101】

複数の幹細胞を、約０．５μＭ～約５０μＭ、約０．６μＭ～約３０μＭ、約０．８μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または２μＭ～約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させるステップを含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項102】

複数の幹細胞を、約０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、または３０μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させるステップを含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項103】

複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤を含む第１の組成物中で１２時間～４８時間、１２時間～３６時間、１８時間～３０時間、または約１日間培養するステップを含む、請求項９８から１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

第１の組成物中で培養するステップ後、得られた細胞の少なくとも一部を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む第２の組成物中で１２時間～７２時間、２４時間～７２時間、３６時間～７２時間、または約２日間培養するステップをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

第２の組成物が、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤を含まない、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

第２の組成物が、第１の組成物と同じ濃度のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む、請求項１０４または１０５に記載の方法。

【請求項107】

幹細胞が胚幹細胞を含む、請求項８０から１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項８０から１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

幹細胞がヒト細胞である、請求項８０から１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

幹細胞が遺伝子修飾されている、請求項８０から１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

複数の幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップが、Ｓｏｘ１７陽性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす、請求項８０から１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

細胞の集団が、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

細胞の集団が、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、または約７５％～約８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項114】

方法が、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらし、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

Ｓｏｘ１７陽性細胞を、膵β細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞；ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞；またはそれらの任意の組合せに分化させるステップをさらに含む、請求項１１１から１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

Ｓｏｘ１７陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子と接触させるステップをさらに含む、請求項１１１から１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子が、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

細胞の集団における細胞を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子を含む第３の組成物中で１～５日、または２～４日、または約１、２、３、４、もしくは５日間培養するステップを含む、請求項１１６または１１７に記載の方法。

【請求項119】

線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子と接触させるステップが、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす、請求項１１６から１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団が、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を有し、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化剤、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１１９または１２０に記載の方法。

【請求項122】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、
（ａ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、
（ｂ）インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、
（ｃ）ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、
（ｄ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、
（ｅ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、
（ｆ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ならびに／または
（ｇ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤
と接触させるステップを含む、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

方法が、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第４の組成物中で４～８日、または５～７日、または約４、５、６、７、もしくは８日間培養するステップを含み、第４の組成物が、プロテインキナーゼＣ活性化剤、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む、請求項１２１または１２２に記載の方法。

【請求項124】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を接触させるステップが、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団が、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を有し、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

方法が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＦｏｘＯ１阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１２４または１２５に記載の方法。

【請求項127】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、
（ａ）インヒビン、アクチビン、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、
（ｂ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、
（ｃ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、
（ｄ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、
（ｅ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、
（ｆ）任意選択で、ＡＳ１８４２８５６である、ＦｏｘＯ１阻害剤、
（ｇ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、ならびに／または
（ｈ）任意選択で、ＸＸＩもしくはＤＡＰＩである、ノッチシグナル伝達阻害剤
と接触させるステップを含む、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

方法が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第５の組成物中で４～８日、または５～７日、または約４、５、６、７、もしくは８日間培養するステップを含み、第５の組成物が、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＦｏｘＯ１阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。

【請求項129】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を接触させるステップが、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞への分化をもたらし、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団を産生する、請求項１２６から１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団が、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を有し、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、または第５の組成物が、水溶性合成ポリマーをさらに含む、請求項１０３から１０６、１１８、１２３、または１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

水溶性合成ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

水溶性合成ポリマーがポリビニルアルコールを含む、請求項１３１に記載の方法。

【請求項134】

水溶性合成ポリマーが、約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１３１から１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

水溶性合成ポリマーが、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１３１から１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

水溶性合成ポリマーが、８５％未満が加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項１３１から１３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項137】

水溶性合成ポリマーが、約８０％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項１３１から１３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１２９から１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、
（ａ）Ａｌｋ５ｉ ＩＩ、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、もしくはＳＢ－５０５１２４からなる群から選択されるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、
（ｂ）Ｔ３もしくはＧＣ－ｌを含む甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、
（ｃ）３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＧＳＫ１２６、ＥＰＺ６４３８、ＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択されるエピジェネティック修飾化合物、
（ｄ）ベータセルリンもしくはＥＧＦを含む上皮細胞成長因子ファミリーからの成長因子、
（ｅ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、
（ｆ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、
（ｇ）ＸＸＩもしくはＤＡＰＴを含むγ－セクレターゼ阻害剤、
（ｈ）スタウロスポリン、Ｒｏ－３１－８２２０、ビシンドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’－｛５”－［（メトキシカルボニル）アミノ］－２”－メチル｝－フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、もしくはスタラログを含むプロテインキナーゼ阻害剤、
（ｉ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、
（ｊ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、
（ｋ）ＬＤＮ１９３１８９もしくはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、ならびに／または
（ｌ）ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６を含むＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤
と接触させるステップを含む、請求項１３８に記載の方法。

【請求項140】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第６の組成物中で５～１０日、または６～９日、または約５、６、７、８、９、もしくは１０日間培養するステップを含み、第６の組成物が、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む、請求項１３８または１３９に記載の方法。

【請求項141】

第６の組成物が、アセチルＣｏＡ－関連代謝産物（例えば、酢酸塩）、ビタミン（例えば、ビオチン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）（例えば、β－ヒドロキシブチレート）、酸化還元ホメオスタシス調節剤（例えば、タウリン）、一炭素代謝経路中間体（例えば、ギ酸塩）、および／またはグルタミン（例えば、Ｌ－グルタミン）の１つまたは複数をさらに含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

細胞の集団における細胞を接触させるステップが、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす、請求項１３８から１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団が、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を有し、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を、膵β細胞を含む細胞の集団に分化させるステップをさらに含む、請求項１４２または１４３に記載の方法。

【請求項145】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む第７の組成物と接触させるステップを含む、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

膵β細胞を含む細胞の集団が、参照方法によって産生される細胞の集団における膵β細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージの膵β細胞を有し、参照方法が、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である、請求項１４４または１４５に記載の方法。

【請求項147】

第６の組成物または第７の組成物が、水溶性合成ポリマーをさらに含む、請求項１４０または１４５に記載の方法。

【請求項148】

水溶性合成ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

水溶性合成ポリマーがポリビニルアルコールを含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項150】

水溶性合成ポリマーが、約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１４７から１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

水溶性合成ポリマーが、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１４７から１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

水溶性合成ポリマーが、８５％を超えて加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項１４７から１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項153】

水溶性合成ポリマーが、約８７％～８９％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む、請求項１４７から１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

請求項１から７９のいずれか一項に記載の組成物、請求項１から７９のいずれか一項に記載の組成物から得られた細胞の集団、または請求項８０から１５３のいずれか一項に記載の方法により産生された細胞を含むデバイス。

【請求項155】

対象への移植時にインスリンを生成および放出するように構成されている、請求項１５４に記載のデバイス。

【請求項156】

細胞がカプセル化されている、請求項１５４または１５５に記載のデバイス。

【請求項157】

半透膜をさらに含み、半透膜が、細胞をデバイス内に保持し、インスリンの通過を可能にするように構成されている、請求項１５４から１５６のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項158】

長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、請求項１から７９のいずれか一項に記載の組成物、請求項１から７９のいずれか一項に記載の組成物から得られた細胞の集団、もしくは請求項８０から１５３のいずれか一項に記載の方法により産生された細胞を投与するステップ、または請求項１５４から１５７のいずれか一項に記載のデバイスを移植するステップを含む、方法。

【請求項159】

疾患が、糖尿病、任意選択で、Ｉ型糖尿病である、請求項１５８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２７７，０９２号の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

[0002]幹細胞由来β細胞の産生は、膵島および膵臓器官の産生に向けた潜在的に有用なステップを提供することができる。幹細胞由来組織によって治療可能な疾患の１つが糖尿病である。１型糖尿病は膵臓島におけるβ－細胞の自己免疫的破壊に起因する。２型糖尿病は末梢組織のインスリン抵抗性およびβ－細胞の機能異常に起因する。糖尿病患者、特に１型糖尿病を患っている患者は、新たなβ－細胞の移植によって治癒する可能性がある。死体ヒト膵島の移植を受けた患者は、この戦略によって５年またはそれ以上、インスリン依存性を脱することができるが、ドナー膵島の希少性およびその品質のために、このアプローチには限界がある。幹細胞からヒトβ－細胞の無制限な供給を産生できれば、この療法を数百万人の新たな患者に広げることができ、これは幹細胞の生物学を臨床に変換する重要なテストケースになり得る。

【0003】

参照による組込み
[0003]本明細書に記述する全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれていると具体的にかつ個別に示されていると同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。他に指示がなければ、本明細書に記述する刊行物、特許、および特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0004】

[0004]一部の態様では、Ｓｏｘ１７陽性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で提供される。一部の事例では、組成物が幹細胞をさらに含む。一部の事例では、組成物は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子をさらに含む。

【0005】

[0005]一部の態様では、幹細胞、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で提供される。

【0006】

[0006]一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む。

【0007】

[0007]一部の事例では、本明細書で提供される組成物は、多くとも約１００ｎｇ／ｍＬ、多くとも約８０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約６０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約２５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約２０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、または５ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。

【0008】

[0008]一部の態様では、幹細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で提供される。
[0009]一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、もしくはアピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む。一部の事例では、組成物は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＢＹＬ３１９、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ３１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０４μＭ、約０．０６μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、または約１μＭのＧＳＫ－６９０６９３を含む。一部の事例では、組成物は、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９を含む。一部の事例では、組成物は、約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９を含む。一部の事例では、組成物は、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤をさらに含む。一部の事例では、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ、ＣＨＩＲ９９０２１、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびそれらの類似体または誘導体の１つまたは複数を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む。一部の事例では、組成物は、０．５μＭ～５０μＭ、０．６μＭ～３０μＭ、０．８μＭ～２０μＭ、１μＭ～１０μＭ、または２μＭ～５μＭのＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。一部の事例では、組成物は、約０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、または３０μＭのＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。

【0009】

[0010]一部の事例では、幹細胞は胚幹細胞を含む。一部の事例では、幹細胞は人工多能性幹細胞を含む。一部の事例では、幹細胞はヒト細胞である。一部の事例では、幹細胞は遺伝子修飾されている。一部の事例では、組成物は、Ｓｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団を含む。一部の事例では、細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む。一部の事例では、細胞の集団は、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５～約９０％、約８０％～約９０％、または約７５％～約８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む。

【0010】

[0011]一部の態様では、複数のＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で提供される。一部の事例では、組成物は、プロテインキナーゼＣ活性化剤、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤をさらに含む。一部の事例では、組成物は、（ａ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、（ｂ）ＬＤＮ１９３１８９もしくはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、（ｃ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｄ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、（ｅ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ならびに／または（ｆ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む。一部の事例では、組成物は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む。一部の事例では、組成物は、多くとも約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、多くとも約１０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約０．１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、または約０．１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞をさらに含む。

【0011】

[0012]一部の態様では、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で提供される。一部の事例では、組成物は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤をさらに含む。一部の事例では、組成物は、（ａ）インヒビン、アクチビン、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、（ｂ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｃ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｄ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、（ｅ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、（ｆ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、ならびに／または（ｇ）任意選択で、ＡＳ１８４２８５６である、ＦｏｘＯ１阻害剤をさらに含む。一部の事例では、組成物は、ノッチシグナル伝達阻害剤をさらに含み、任意選択で、ノッチシグナル伝達阻害剤はＸＸＩまたはＤＡＰＩである。一部の事例では、組成物は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む。一部の事例では、組成物は、多くとも約５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、多くとも約２．５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、または多くとも約０．０５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、約５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ、または約０．０５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の事例では、組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞をさらに含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む。一部の事例では、組成物は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＢＹＬ３１９、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ３１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体、およびＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。

【0012】

[0013]一部の事例では、組成物は、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０４μＭ、０．０６μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１２μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、または１μＭのＧＳＫ－６９０６９３を含む。一部の事例では、組成物は、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９、またはその類似体もしくは誘導体を含む。一部の事例では、組成物は、約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９を含む。一部の事例では、組成物は、約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９を含む。

【0013】

[0014]一部の事例では、本明細書で提供される組成物は、水溶性合成ポリマーをさらに含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、培地中に約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、培地中に約０．０４％～約０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、８５％未満が加水分解されているポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、約８０％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む。

【0014】

[0015]一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５００ｍＬ～約５０Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約２Ｌ～約５Ｌ、約３Ｌ～約４Ｌ、約２Ｌ～約３０Ｌ、または約１０Ｌ～約２０Ｌの液体容積を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５０ｍＬ、約３０ｍＬ～約４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３０ｍＬ、または約１０ｍＬ～約２０ｍＬの液体容積を有する。

【0015】

[0016]一部の態様では、複数の幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップを含む、方法が本明細書で提供される。
[0017]一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体の１つまたは複数を含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体を含む。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９を含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ～約１μＭ，約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３と接触させるステップを含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０４μＭ、０．０６μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１２μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、または１μＭのＧＳＫ－６９０６９３と接触させるステップを含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、または約０．０７μＭ～約０．１５μＭのＧＳＫ－６９０６９３、および約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む。一部の事例では、接触させるステップは、複数の幹細胞を、約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップを含む。

【0016】

[0018]一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させるステップを含む。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、またはその両方を含む。一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、または５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるステップを含む。

【0017】

[0019]一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と約２４時間～約９６時間、約３６時間～約８４時間、約４８時間～約８４時間、約６０時間～約８４時間、または約３日間接触させるステップを含む。

【0018】

[0020]一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤とも接触させるステップを含む。一部の事例では、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ、ＣＨＩＲ９９０２１、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびこれらの任意の類似体または誘導体の１つまたは複数を含む。一部の事例では、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤はＧＳＫ３阻害剤を含む。一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、約０．５μＭ～約５０μＭ、約０．６μＭ～約３０μＭ、約０．８μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または２μＭ～約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、約０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、または３０μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤を含む第１の組成物中で１２時間～４８時間、１２時間～３６時間、１８時間～３０時間、または約１日間培養するステップを含む。

【0019】

[0021]一部の事例では、本方法は、第１の組成物中で培養するステップ後、得られた細胞の少なくとも一部を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む第２の組成物中で１２時間～７２時間、２４時間～７２時間、３６時間～７２時間、または約２日間培養するステップをさらに含む。一部の事例では、第２の組成物は、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤を含まない。一部の事例では、第２の組成物は、第１の組成物と同じ濃度のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む。

【0020】

[0022]一部の事例では、幹細胞は胚幹細胞を含む。一部の事例では、幹細胞は人工多能性幹細胞を含む。一部の事例では、幹細胞はヒト細胞である。一部の事例では、幹細胞は遺伝子修飾されている。

【0021】

[0023]一部の事例では、複数の幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、Ｓｏｘ１７陽性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす。一部の事例では、細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む。一部の事例では、細胞の集団は、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、または約７５％～約８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む。

【0022】

[0024]一部の事例では、本方法は、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらし、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。

【0023】

[0025]一部の事例では、本方法は、Ｓｏｘ１７陽性細胞を、膵β細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞；ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞；またはそれらの任意の組合せに分化させるステップをさらに含む。

【0024】

[0026]一部の事例では、本方法は、Ｓｏｘ１７陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される。一部の事例では、本方法は、細胞の集団における細胞を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子を含む第３の組成物中で１～５日、または２～４日、または約１、２、３、４、もしくは５日間培養するステップを含む。一部の事例では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子と接触させるステップは、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす。一部の事例では、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団は、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を有し、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。一部の事例では、本方法は、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化剤、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、（ａ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、（ｂ）インヒビン、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、（ｃ）ＬＤＮ１９３１８９もしくはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、（ｄ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｅ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、（ｆ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ならびに／または（ｇ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤と接触させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第４の組成物中で４～８日、または５～７日、または約４、５、６、７、もしくは８日間培養するステップを含み、第４の組成物は、プロテインキナーゼＣ活性化剤、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む。

【0025】

[0027]一部の事例では、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を接触させるステップは、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす。

【0026】

[0028]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団は、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を有し、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。

【0027】

[0029]一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＦｏｘＯ１阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、（ａ）インヒビン、アクチビン、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、Ｖｇ－１、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、成長分化因子８（ＧＤＦ８）、および成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）からなる群から選択される形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、（ｂ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ８Ｂからなる群から選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｃ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｄ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、（ｅ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、（ｆ）任意選択で、ＡＳ１８４２８５６である、ＦｏｘＯ１阻害剤、（ｇ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、ならびに／または（ｈ）任意選択で、ＸＸＩもしくはＤＡＰＩである、ノッチシグナル伝達阻害剤と接触させるステップを含む。

【0028】

[0030]一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第５の組成物中で４～８日、または５～７日、または約４、５、６、７、もしくは８日間培養するステップを含み、第５の組成物は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＦｏｘＯ１阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む。

【0029】

[0031]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞の集団における細胞を接触させるステップは、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞への分化をもたらし、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団を産生する。

【0030】

[0032]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団は、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を有し、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。

【0031】

[0033]一部の事例では、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、または第５の組成物は、水溶性合成ポリマーをさらに含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、８５％未満が加水分解されているポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、約８０％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む。

【0032】

[0034]一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、（ａ）Ａｌｋ５ｉ ＩＩ、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、もしくはＳＢ－５０５１２４からなる群から選択されるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、（ｂ）Ｔ３もしくはＧＣ－ｌを含む甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｃ）３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＧＳＫ１２６、ＥＰＺ６４３８、ＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択されるエピジェネティック修飾化合物、（ｄ）ベータセルリンもしくはＥＧＦを含む上皮細胞成長因子ファミリーからの成長因子、（ｅ）レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＲＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ２３１４からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、（ｆ）ＳＡＮＴ１、ＳＡＮＴ２、ＳＡＮＴ４、Ｃｕｒ６ｌ４ｌ４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤、（ｇ）ＸＸＩもしくはＤＡＰＴを含むγ－セクレターゼ阻害剤、（ｈ）スタウロスポリン、Ｒｏ－３１－８２２０、ビシンドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’－｛５”－［（メトキシカルボニル）アミノ］－２”－メチル｝－フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、もしくはスタラログ（ｓｔａｒａｌｏｇ）を含むプロテインキナーゼ阻害剤、（ｉ）チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２からなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤、（ｊ）ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、およびブリオスタチン１からなる群から選択されるプロテインキナーゼＣ活性化剤、（ｋ）ＬＤＮ１９３１８９もしくはＤＭＨ－１を含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤、ならびに／または（ｌ）ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６を含むＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させるステップを含む。

【0033】

[0035]一部の事例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、第６の組成物中で５～１０日、または６～９日、または約５、６、７、８、９、もしくは１０日間培養するステップを含み、第６の組成物は、プロテインキナーゼＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む。

【0034】

[0036]一部の事例では、第６の組成物は、アセチルＣｏＡ－関連代謝産物（例えば、酢酸塩）、ビタミン（例えば、ビオチン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）（例えば、β－ヒドロキシブチレート）、酸化還元ホメオスタシス調節剤（例えば、タウリン）、一炭素代謝経路中間体（例えば、ギ酸塩）、および／またはグルタミン（例えば、Ｌ－グルタミン）の１つまたは複数をさらに含む。

【0035】

[0037]一部の事例では、細胞の集団における細胞を接触させるステップは、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらす。
[0038]一部の事例では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団は、参照方法によって産生される細胞の集団におけるＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を有し、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。

【0036】

[0039]一部の事例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を、膵β細胞を含む細胞の集団に分化させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む細胞の集団における細胞を、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含む第７の組成物と接触させるステップをさらに含む。

【0037】

[0040]一部の事例では、膵β細胞を含む細胞の集団は、参照方法によって産生される細胞の集団における膵β細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージの膵β細胞を有し、参照方法は、複数の幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。

【0038】

[0041]一部の事例では、第６の組成物または第７の組成物は、水溶性合成ポリマーをさらに含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、またはポリアクリルアミドを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、約０．００５％～約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２％～約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０３％～約０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、培地中に約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、８５％を超えて加水分解されているポリビニルアルコールを含む。一部の事例では、水溶性合成ポリマーは、約８７％～８９％が加水分解されているポリビニルアルコールを含む。

【0039】

[0042]一部の態様では、本組成物または本明細書で開示される組成物から得られた細胞の集団、または本明細書で開示される方法により産生された細胞を含むデバイスが本明細書で提供される。一部の事例では、デバイスは、対象への移植時にインスリンを生成および放出するように構成されている。一部の事例では、細胞はカプセル化されている。一部の事例では、デバイスは半透膜をさらに含み、半透膜は、細胞をデバイス内に保持し、インスリンの通過を可能にするように構成されている。

【0040】

[0043]一部の態様では、長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、本組成物もしくは本明細書で開示される組成物から得られた細胞の集団、もしくは本明細書で開示される方法により産生された細胞を投与するステップ、または本明細書で開示されるデバイスを移植するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の事例では、疾患は、糖尿病、任意選択で、Ｉ型糖尿病である。

【0041】

[0044]本開示の特徴は、併記の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付図面を参照することによって得られる。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1A】[0045]膵β細胞分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置（ステージ１分化）の効果を示す図である。図１Ａは、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１００％ＡＡ」）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１０％ＡＡ」）、または５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「５％ＡＡ」）の処置によるステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｂは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡまたは５％ＡＡの処置によるステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｃは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｄは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、または５％ＡＡの処置によるステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果（上部）を示す。フローサイトメトリー解析によれば、１００％ＡＡ下では４１．１％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が、１０％ＡＡ下では４９．５％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が存在した。図１Ｅは、ステージ１での１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、または０ｎｇ／ｍＬ（０％）のアクチビンＡの処置によるＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。

【図1B】膵β細胞分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置（ステージ１分化）の効果を示す図である。図１Ａは、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１００％ＡＡ」）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１０％ＡＡ」）、または５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「５％ＡＡ」）の処置によるステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｂは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡまたは５％ＡＡの処置によるステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｃは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｄは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、または５％ＡＡの処置によるステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果（上部）を示す。フローサイトメトリー解析によれば、１００％ＡＡ下では４１．１％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が、１０％ＡＡ下では４９．５％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が存在した。図１Ｅは、ステージ１での１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、または０ｎｇ／ｍＬ（０％）のアクチビンＡの処置によるＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。

【図1C】膵β細胞分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置（ステージ１分化）の効果を示す図である。図１Ａは、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１００％ＡＡ」）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１０％ＡＡ」）、または５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「５％ＡＡ」）の処置によるステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｂは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡまたは５％ＡＡの処置によるステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｃは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｄは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、または５％ＡＡの処置によるステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果（上部）を示す。フローサイトメトリー解析によれば、１００％ＡＡ下では４１．１％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が、１０％ＡＡ下では４９．５％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が存在した。図１Ｅは、ステージ１での１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、または０ｎｇ／ｍＬ（０％）のアクチビンＡの処置によるＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。

【図1D】膵β細胞分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置（ステージ１分化）の効果を示す図である。図１Ａは、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１００％ＡＡ」）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１０％ＡＡ」）、または５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「５％ＡＡ」）の処置によるステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｂは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡまたは５％ＡＡの処置によるステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｃは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｄは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、または５％ＡＡの処置によるステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果（上部）を示す。フローサイトメトリー解析によれば、１００％ＡＡ下では４１．１％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が、１０％ＡＡ下では４９．５％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が存在した。図１Ｅは、ステージ１での１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、または０ｎｇ／ｍＬ（０％）のアクチビンＡの処置によるＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。

【図1E】膵β細胞分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置（ステージ１分化）の効果を示す図である。図１Ａは、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１００％ＡＡ」）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「１０％ＡＡ」）、または５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（「５％ＡＡ」）の処置によるステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｂは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡまたは５％ＡＡの処置によるステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｃは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１Ｄは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、または５％ＡＡの処置によるステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に得られた細胞クラスターの写真（下部）、ならびにＳ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果（上部）を示す。フローサイトメトリー解析によれば、１００％ＡＡ下では４１．１％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が、１０％ＡＡ下では４９．５％のＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞が存在した。図１Ｅは、ステージ１での１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、または０ｎｇ／ｍＬ（０％）のアクチビンＡの処置によるＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。

【図2A】[0046]ステージ１分化の完了時の例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図２Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ１Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図２Ｂは、Ｓ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図２Ｃは、これらの結果をまとめた棒グラフを示す。

【図2B】ステージ１分化の完了時の例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図２Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ１Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図２Ｂは、Ｓ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図２Ｃは、これらの結果をまとめた棒グラフを示す。

【図2C】ステージ１分化の完了時の例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図２Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ１Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図２Ｂは、Ｓ１Ｃ時の細胞におけるＯｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図２Ｃは、これらの結果をまとめた棒グラフを示す。

【図3A】[0047]ステージ３分化の完了時のステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図３Ａは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９によるステージ１処置後のＳ３Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｃにおける棒グラフで要約されている。図３Ｄは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｅにおける棒グラフで要約されている。

【図3B】ステージ３分化の完了時のステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図３Ａは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９によるステージ１処置後のＳ３Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｃにおける棒グラフで要約されている。図３Ｄは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｅにおける棒グラフで要約されている。

【図3C】ステージ３分化の完了時のステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図３Ａは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９によるステージ１処置後のＳ３Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｃにおける棒グラフで要約されている。図３Ｄは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｅにおける棒グラフで要約されている。

【図3D】ステージ３分化の完了時のステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図３Ａは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９によるステージ１処置後のＳ３Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｃにおける棒グラフで要約されている。図３Ｄは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｅにおける棒グラフで要約されている。

【図3E】ステージ３分化の完了時のステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図３Ａは、１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９によるステージ１処置後のＳ３Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＣｄｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｃにおける棒グラフで要約されている。図３Ｄは、Ｓ３Ｃ時の細胞におけるＰｄｘ１およびＳｏｘ２の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、これは図３Ｅにおける棒グラフで要約されている。

【図4A】[0048]ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図4B】ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図4C】ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図4D】ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図4E】ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図4F】ステージ５分化の完了時のステージ１での例示的化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図４Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によりＳ５Ｃ時に得られた細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｓ５Ｃ時の細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図４Ｃ～図４Ｄにおける棒グラフで要約されている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、Ｓ５Ｃ時の総細胞収量（図４Ｅ）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１＋）およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞（Ｉｓｌ１＋／Ｎｋｘ６．１－）の収量（図４Ｆ）をまとめた棒グラフを示す。

【図5A】[0049]例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン１」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図５Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図５Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図5B】例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン１」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図５Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図５Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図5C】例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン１」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図５Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図５Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図5D】例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン１」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図５Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図５Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図5E】例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン１」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図５Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図５Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図５Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図6A】[0050]異なる例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン２」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図６Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図６Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図6B】異なる例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン２」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図６Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図６Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図6C】異なる例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン２」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図６Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図６Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図6D】異なる例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン２」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図６Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図６Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図6E】異なる例示的なステージ６培地レジメン（「レジメン２」）に従う７日間のステージ６分化の完了時の細胞に対するステージ１での例示的な化合物による幹細胞の処置の効果を示す図である。図６Ａは、ステージ１での１００％ＡＡ、１０％ＡＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、ならびに１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の処置によるステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）でのＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果をまとめた棒グラフを示す。図６Ｃは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＣ－ペプチド（「Ｃ－ｐｅｐ」）およびグルカゴン（「ＧＣＧ」）の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｄは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるソマトスタチン（「ＳＳＴ」）およびＧＣＧの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Ｅは、Ｓ６ｄ７での細胞におけるＳＳＴおよびＣ－ｐｅｐの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

【図7A】[0051]図７Ａは、ステージ１での（ａ）１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡまたは（ｂ）０．１μＭのＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ６９０６９３」とも称される）および１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかによる、種々の培養条件下でのステージ５分化の完了（「Ｓ５Ｃ」）時の細胞組成物中のＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す図である。図７Ｂは、ステージ１での（ａ）１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡまたは（ｂ）０．１μＭのＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ６９０６９３」とも称される）および１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかによる、種々の培養条件下でのステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）での細胞組成物中のＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す図である。

【図7B】図７Ａは、ステージ１での（ａ）１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡまたは（ｂ）０．１μＭのＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ６９０６９３」とも称される）および１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかによる、種々の培養条件下でのステージ５分化の完了（「Ｓ５Ｃ」）時の細胞組成物中のＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す図である。図７Ｂは、ステージ１での（ａ）１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡまたは（ｂ）０．１μＭのＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ６９０６９３」とも称される）および１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかによる、種々の培養条件下でのステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）での細胞組成物中のＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

[0052]膵臓島移植は、糖尿病対象、例えばＩ型糖尿病を有する対象にとって有意な臨床的利益を達成することができる有望な療法である。ドナーの膵臓組織からの膵臓島源の供給は限られているため、幹細胞などの代替源から移植可能な膵島を産生ための改善された技法が必要とされる。膵島成分（例えば、ＳＣ－β細胞）を産生する改善された方法は、より有効な治療製品（例えば、機能性が改善されたＳＣ－β細胞）、ヒト治療用途用のＳＣ－膵島の製造の改善された方法（例えば、より低い製造コスト、および／もしくはより高い細胞収量）、またはそれらの組合せをもたらし得る。

【0044】

[0053]とりわけ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣ－β細胞の改善された生成のための組成物および方法が本明細書で提供される。本明細書で開示される薬剤のある特定の組成および組合せは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣ－β細胞の費用対効果の高い大規模な生成を促進する。例えば、本開示は、望ましい細胞集団の相対的なパーセンテージ（例えば、様々な分化ステージにおけるオンターゲット分化細胞および得られたＳＣ－β細胞）に対して同等またはさらには改善された細胞収量、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣ－β細胞の機能、移植後の生存率、機能、および免疫原性を維持しながら、ある特定の成長因子の代わりに小分子化合物を利用する新規製剤および分化方法を提供する。開示された組成物および方法は、ヒト治療用途用のＳＣ－膵島の大規模な製造にとって特に有利であり得る。本明細書で開示される組成物および方法における小分子化合物として、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤が挙げられる。

【0045】

[0054]本開示の様々な実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には自明であろう。多数の変化、変更、および置換が、本開示から逸脱することなく当業者に対して生じ得る。本明細書に記載した本開示の実施形態に対する様々な代替物が用いられ得ることが理解されるべきである。

【0046】

定義
[0055]本出願において単数形の使用は、特に他の記述がなければ、複数形を含む。本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって他が明確に記述されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。

【0047】

[0056]本出願において「または」の使用は、他の記述がなければ、「および／または」を意味する。本明細書で用いる用語「および／または」および「それらの任意の組合せ」ならびにそれらの文法的等価物は、相互交換可能に用いられ得る。これらの用語は、任意の組合せが具体的に意図されることを伝達することができる。説明目的のみのために、以下の語句、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」は、「個別にＡ、個別にＢ、個別にＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。用語「または」は、文脈によって特に離接的な使用が意味されない限り、接続的または離接的に用いられ得る。

【0048】

[0057]さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(include、includes)」および「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、限定的でない。
[0058]明細書中における「一部の実施形態」、「一実施形態(an embodiment、one embodiment)」、または「他の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記述された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態には含まれないことを意味する。

【0049】

[0059]本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単語「含む（comprising）」（ならびに「comprise」および「comprises」等のcomprisingの任意の形）、「有する(having)」（ならびに「have」および「has」等のhavingの任意の形）、「含む(including)」（ならびに「includes」および「include」等のincludingの任意の形）、または「含む(containing)」（ならびに「contains」および「contain」等のcontainingの任意の形）は包括的またはオープンエンドであり、言及されていない追加的な要素または方法ステップを排除しない。本明細書で論じる任意の実施形態は本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もそうであることが意図されている。さらに、本開示の組成物は本開示の方法を達成するために用いることができる。

【0050】

[0060]参照の数値に関連する用語「約」およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、その数値それ自体およびその数値のプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含み得る。

【0051】

[0061]用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、これは部分的にその値がどのようにして測定されまたは決定されたか、例えば測定システムの限界によることになる。例えば、「約」は当技術における慣例によって標準偏差の１倍以内または１倍を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。別の例では、「約１０」の量は、１０および９から１１までの任意の量を含む。さらに別の例では、参照数値に関連する用語「約」は、その値のプラスマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲をも含み得る。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関しては、用語「約」は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。出願および特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合には、他に記述がなければ、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を前提とすべきである。

【0052】

[0062]本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患を意味し得る。例えば、本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、それだけに限らないが、１型糖尿病、２型糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、外科的糖尿病、妊娠性糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病を含む全てまたは任意の型の糖尿病を意味し得る。一部の事例では、糖尿病は、遺伝性糖尿病の１形態であり得る。

【0053】

[0063]用語「内分泌細胞」は、特に特定しない限り、「膵島」、「膵島細胞」、「膵島同等物」、「膵島様細胞」、「膵臓島」、およびその文法的等価物等の、生体の膵臓に存在するホルモン生成細胞を意味し得る。一実施形態では、内分泌細胞は膵前駆細胞または前駆体から分化することができる。膵島細胞は、それだけに限らないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、および／または膵ε細胞を含む様々な型の細胞を含み得る。膵島細胞は細胞の群、細胞クラスター、その他をも意味し得る。

【0054】

[0064]用語「前駆細胞」および「前駆体」細胞は本明細書において相互交換可能に用いられ、分化によって生じることができる細胞と比較してより原始的な（例えば発生経路または発達において完全に分化した細胞よりも早いステップにある）細胞表現型を有する細胞を意味する。前駆細胞はまた、顕著なまたは極めて高い増殖可能性を有し得ることが多い。前駆細胞は発生経路および細胞が発生し分化する環境に応じて、多くの異なった分化細胞型または単一の分化細胞型を生じることができる。

【0055】

[0065]幹細胞由来膵細胞（例えば、ＳＣ－β細胞）に関連する用語としての「その前駆体」は、前駆細胞をインスリン陽性内分泌細胞に分化させるのに適した条件下で培養した場合にＳＣ－β細胞に分化させることが可能な、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌前駆細胞を含む任意の細胞を指し得る。

【0056】

[0066]用語「外分泌細胞」は本明細書で使用される場合、外分泌腺、即ち、管を介してその分泌物を排出する腺の細胞を指し得る。特定の実施形態では、外分泌細胞は、小腸に分泌される酵素を生成することができる膵細胞である膵分泌細胞を指し得る。これらの酵素は、食物が消化管を通過する際に食物を消化するのを助けることができる。膵外分泌細胞は、ランゲルハンス島としても知られており、インスリンおよびグルカゴンの２つのホルモンを分泌することができる。膵外分泌細胞は、いくつかの細胞型の１つであり得る；α－２細胞（これはホルモングルカゴンを生成することができる）、またはβ細胞（これはホルモンインスリンを製造することができる）、およびα－１細胞（これは制御因子ソマトスタチンを生成することができる）。非インスリン生成外分泌細胞は、その用語が本明細書で使用される場合、α－２細胞またはα－１細胞を指し得る。

【0057】

[0067]用語「幹細胞由来β細胞」、「ＳＣ－β細胞」、「機能性β細胞」、「機能性膵β細胞」、「成熟ＳＣ－β細胞」、「ＳＣ－膵島β細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えばＰＤＸ－１またはＮＫＸ６．１）を呈し、インスリンを分泌し、および内分泌成熟β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を提示する細胞（例えば非天然膵β細胞）を指し得る。一部の実施形態では、用語「ＳＣ－β細胞」および「非天然β細胞」は本明細書で使用される場合、相互交換可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ－β細胞」は成熟膵細胞を含む。本開示の方法は、任意の細胞を出発点として用いて、任意のインスリン陽性の内分泌細胞またはその前駆体からＳＣ－β細胞を誘導することが可能であるため、ＳＣ－β細胞は幹細胞から（例えば、直接）誘導される必要はないことを理解するべきである（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的に初期化された体細胞（例えば、人工多能性幹細胞とそれが由来する体細胞との間の中間状態に部分的に初期化された体細胞）、多能性細胞、全能性細胞、前述のいずれかの細胞のトランス分化バージョンなどを用いることができ、本発明はこのように限定されることを意図していない）。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は多重のグルコースチャレンジ（例えば少なくとも１回、少なくとも２回、もしくは少なくとも３回またはそれ以上の一連のグルコースチャレンジ）に対する、応答を呈する。一部の実施形態では、応答は多重のグルコースチャレンジに対する内因性膵島（例えばヒト膵島）の応答に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞の形態は内因性β細胞の形態に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｖｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のＧＳＩＳ応答を呈する。ＳＣ－β細胞のＧＳＩＳ応答は、ＳＣ－β細胞を宿主（例えば、ヒトまたは動物）に移植してから２週間以内に観察することができる。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はインスリンを分泌顆粒にパッケージする。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、カプセル化された結晶性のインスリン顆粒を示す。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は１．１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、２を超える刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、サイトカインに応答してサイトカイン誘導性アポトーシスを示す。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞からのインスリン分泌は、公知の抗糖尿病薬（例えば、分泌促進薬）に応答して増強される。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はモノホルモナルである。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は他のホルモン、例えばグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを異常に共発現しない。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は低い複製速度を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はグルコースに応答して細胞内Ｃａ２＋を増加させる。

【0058】

[0068]本明細書で用いる場合、用語「インスリン生成細胞」およびその文法的等価物は、膵前駆細胞またはその前駆体から分化し、インスリンを分泌する細胞を意味する。インスリン生成細胞は、その用語が本明細書に記載されているように、膵β細胞、ならびに構造的または誘導的な様式でインスリンを合成（例えばインスリン遺伝子を転写し、プロインスリンｍＲＮＡを翻訳し、およびプロインスリンｍＲＮＡを修飾してインスリンタンパク質に）し、発現（例えばインスリン遺伝子が運搬する表現型の形質を実現）し、または分泌（インスリンを細胞外スペースに放出）する膵β様細胞（例えばインスリン陽性内分泌細胞）を含み得る。例えば本開示の方法に従ってインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体をＳＣ－β細胞に分化させるステップによって生成されたインスリン生成細胞の集団は、膵β細胞またはβ様細胞（例えば内因性β細胞の少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つの特徴を有し、内因性成体β細胞に類似したグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を提示する細胞）であり得る。例えば本明細書に開示した方法によって生成されたインスリン生成細胞の集団は成熟した膵β細胞またはＳＣ－β細胞を含んでよく、非インスリン生成細胞（例えばインスリンを生成せずまたは分泌しないこと以外は細胞様表現型を有する細胞）を含んでもよい。

【0059】

[0069]用語「インスリン陽性β様細胞」、「インスリン陽性の内分泌細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカーを呈し、インスリンも発現するが、内因性β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を欠く細胞（例えば膵内分泌細胞）を意味し得る。

【0060】

[0070]用語「β細胞マーカー」は、限定なく、膵β細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味する。例示的なβ細胞マーカーには、それだけに限らないが、膵および十二指腸のホメオボックス１（Ｐｄｘ１、ＰＤＸ１）ポリペプチド、インスリン、ｃ－ペプチド、アミリン、Ｅ－カドヘリン、Ｈｎｆ３β、ＰＣＩ／３、Ｂ２、Ｎｋｘ２．２、ＧＬＵＴ２、ＰＣ２、ＺｎＴ－８、ＩＳＬ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、１ Ｉｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ－６、Ｈｎｆ－３ベータ、およびＭａｆＡ、ならびにZhangら、Diabetes. 50(10):2231-6 (2001)によって記載されたものが含まれる。一部の実施形態では、β細胞マーカーは核３細胞マーカーである。一部の実施形態では、β細胞マーカーはＰｄｘ１またはＰＨ３である。

【0061】

[0071]用語「膵内分泌マーカー」は、限定なく、膵内分泌細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味し得る。例示的な膵内分泌細胞マーカーには、それだけに限らないが、Ｎｇｎ－３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＩｓｌｅｔ－１が含まれる。

【0062】

[0072]用語「膵前駆細胞」、「膵内分泌前駆細胞」、「膵前駆体」、「膵内分泌前駆体」、およびそれらの文法的等価物は本明細書で相互交換可能に用いられ、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞、または膵導管細胞を形成することができる膵ホルモン発現細胞になることができる幹細胞を意味し得る。これらの細胞は少なくとも１つの型の膵細胞、例えばインスリンを生成するβ細胞、グルカゴンを生成するα細胞、ソマトスタチンを生成するδ細胞（またはＤ細胞）、および／または膵ポリペプチドを生成するＦ細胞に向けた分化に関与している。そのような細胞は以下のマーカー、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ－１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、またはＡＲＸのうち少なくとも１つを発現することができる。

【0063】

[0073]本明細書で用いる用語「Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞」は、膵β細胞等のＳＣ－β細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を意味し得る。Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はマーカーＰｄｘ１を発現する。その他のマーカーには、それだけに限らないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６もしくはＮＲｘ２．２が含まれる。Ｐｄｘ１の発現は、抗Ｐｄｘ１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。一部の事例では、Ｐｄｘ１陽性の膵前駆細胞はＮＫＸ６．１（またはＮｋｘ６．１）の発現を欠く。Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、それがＮＫＸ６．１の発現を欠くので、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞と称することもできる。一部の事例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は「膵前腸内胚葉細胞」と名付けることもできる。本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＸ１」、「Ｐｄｘ１」、および「ＰＤＸ－１」は等価で相互交換可能である。

【0064】

[0074]用語「Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性膵前駆細胞」は本明細書で使用される場合、膵β細胞などのインスリン生成細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指し得る。Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性の膵前駆細胞はマーカーＰｄｘ１およびＮＫＸ６－１を発現する。他のマーカーとしては、限定されないが、Ｃｄｃｐ１、Ｐｔｆ１ａ、ＨＮＦ６またはＮＲｘ２．２が含まれ得る。ＮＫＸ６－１の発現は、抗ＮＫＸ６－１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。本明細書で用いる場合、用語「Ｎｋｘ６．１」「ＮＫＸ６．１」および「ＮＫＸ６－１」は等価で相互交換可能である。一部の事例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性の膵前駆細胞は「膵前腸前駆体細胞」と名付けることもできる。

【0065】

[0075]用語「Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞」は本明細書で使用される場合、転写因子ニューロゲニン－３（Ｎｇｎ３）を発現する膵内分泌細胞の前駆体を指し得る。前駆細胞は万能性幹細胞よりも分化されており、少数の細胞型にのみ分化することができる。特に、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞は、５つの膵内分泌細胞型（α、β、δ、εおよびＰＰ）に分化する能力を有する。Ｎｇｎ３の発現は、抗Ｎｇｎ３抗体を使用した免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの当業者が既知の任意の方法によって評価され得る。

【0066】

[0076]用語「ＮｅｕｒｏＤ」および「ＮｅｕｒｏＤ１」は相互交換可能に用いられ、膵内分泌前駆細胞において発現するタンパク質およびそれをコードする遺伝子を特定する。
[0077]用語「エピジェネティクス」は、ＤＮＡ配列の変化を含まない遺伝子機能の遺伝性の変化を指す。エピジェネティクスは、遺伝子の活性および発現に影響する染色体の変化を意味することが最も多いが、ゲノムの修飾に由来しない任意の遺伝可能な表現型の変化について記載するために使用することもできる。細胞および生理学的な表現型の形質に対するそのような効果は、外的もしくは環境的な要因に起因することがあるか、または正常な発生プログラムの一部であることもある。エピジェネティクスはまた、ヌクレオチド配列の変化を含まないゲノムの機能的に関連する変化を指し得る。そのような変化を生成する機構の例としてはＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾があり、そのそれぞれは根底にあるＤＮＡ配列を改変せずに、遺伝子が発現される様式を改変する。遺伝子の発現はＤＮＡのサイレンサー領域に結合している抑制タンパク質の作用によって制御され得る。これらのエピジェネティック変化は、細胞の寿命の間の細胞分裂を通して持続することができ、これらが生命体の根底にあるＤＮＡ配列の変化を含まないとしても、多世代にわたって持続することもできる。真核細胞の生物学におけるエピジェネティック変化の１つの例として、細胞分化のプロセスがある。形態形成の間に全能性幹細胞が種々の多能性細胞になり、次いでこれが完全に分化した細胞になることができる。

【0067】

[0078]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクス変化を起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現（複数可）を変化させる化学化合物を指す。エピジェネティクス変化は、遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある特定の細胞、例えばベータ細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾などのエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制する。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要である。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し、これは分化の間に不活性化される。非限定的な例示的なエピジェネティック修飾化合物としては、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0068】

[0079]用語「分化された細胞」またはその文法的等価物は、その天然形においてその用語が本明細書において定義されるように多能性ではない任意の初代細胞を意味する。別の言い方では、用語「分化した細胞」は、細胞分化プロセスにおいて特殊性の低い細胞型（例えば人工多能性幹細胞等の幹細胞）の細胞から誘導された特殊性の高い細胞型の細胞を意味し得る。理論に限定されることは望まないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、最初に膵細胞およびその他の内胚葉細胞型を形成することができる内胚葉細胞に分化することができる。内胚葉細胞がさらに分化すると膵臓経路に至り、そこでは細胞の約９８％が外分泌細胞、管状細胞、またはマトリックス細胞となり、約２％が内分泌細胞となる。早期の内分泌細胞は膵島前駆細胞であり、次いでこれがさらに、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを分泌するインスリン生成細胞（例えば機能性内分泌細胞）に分化することができる。内胚葉細胞は内胚葉起源の他の細胞、例えば肺、肝臓、腸、胸腺等に分化することもできる。

【0069】

[0080]本明細書で用いる場合、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは反対に、生命体を形成する任意の細胞を意味し得る。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知である）は、受精の間に融合して接合子と呼ばれる細胞を生成する精子および卵子であり、接合子から哺乳動物の胚の全体が発生する。体細胞がそれから作られる細胞である精子および卵子（生殖母細胞）および未分化幹細胞は別として、哺乳動物の体内の全ての他の細胞型は体細胞である。内部器官、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て体細胞から作られている。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは胚に存在せずまたは胚から得られず、そのような細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に起因しない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは胚または胎児以外の生命体に存在しもしくはこれから得られ、またはそのような細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に起因する細胞を意味する。他に指示しなければ、少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体をインスリン生成性でグルコース応答性の細胞に変換するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で実施することができる（少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体が対象の中に存在する場合にはｉｎ ｖｉｖｏが実施され、単離され培地中に維持された少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏが実施される）。

【0070】

[0081]本明細書で用いる場合、用語「成体細胞」は胚発生の後で体内の至るところに見出される細胞を意味し得る。
[0082]本明細書で用いる場合、用語「内胚葉細胞」は極めて早期の胚の中の３つの一次胚細胞層のうちの１つからのものである細胞を意味し得る（他の２つの胚細胞層は中胚葉および外胚葉である）。内胚葉は３つの層のうち最も内側にある。内胚葉細胞が分化して、最初に胎児の腸が生じ、次に呼吸器および消化管（腸など）、肝臓および膵臓の内層を生じる。

【0071】

[0083]本明細書で用いる用語「内胚葉起源の細胞」は、内胚葉細胞から発生しまたは分化した任意の細胞を意味し得る。例えば、内胚葉起源の細胞には肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞が含まれる。理論に縛られることを望まないが、肝臓と膵臓の前駆細胞（膵前駆細胞と称することもできる）は、胚前腸の内胚葉細胞から発生する。これらが特定されてからすぐに、肝臓および膵の前駆細胞は全く異なった細胞機能および再生能力を急速に獲得する。これらの変化は、脊椎動物の間で高度に保存された誘起シグナルおよび遺伝子制御因子によって引き起こされる。臓器の発生および再生に対する興味は、肝不全およびＩ型糖尿病の治療処置における肝細胞および膵β細胞への強いニーズによって加速されてきた。多様なモデルの生命体およびヒトにおける研究によって、肝細胞および膵細胞の分化を引き起こし、多様な幹細胞および前駆細胞の型からの肝細胞およびβ細胞の分化をどのように促進するかについての指針を提供する進化的に保存された誘起シグナルおよび転写因子のネットワークが明らかになってきた。

【0072】

[0084]本明細書で用いる用語「胚体内胚葉」は、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ－β細胞（例えば膵β細胞）に分化することができる細胞を意味し得る。胚体内胚葉細胞はマーカーＳｏｘ１７を発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なその他のマーカーには、それだけに限らないが、ＭＩＸＬ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３Ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ－Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＣＭＫＯＲ１、およびＣＲＩＰ１が含まれる。特に、本明細書の胚体内胚葉細胞はＳｏｘ１７ならびに一部の実施形態ではＳｏｘ１７およびＨＮＦ３Ｂを発現し、顕著なレベルのＧＡＴＡ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＰＦ、またはＤＡＢは発現しない。胚体内胚葉細胞はマーカーＰｄｘ１については陽性ではない（例えばそれらはＰｄｘ１陰性である）。胚体内胚葉細胞は肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。Ｓｏｘ１７およびその他の胚体内胚葉のマーカーの発現は、例えば抗Ｓｏｘ１７抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。

【0073】

[0085]用語「膵内胚葉」は、膵β細胞を含む多重の膵臓系統に分化することができるが、非膵臓系統に分化する能力をもはや有しない内胚葉起源の細胞を意味し得る。
[0086]本明細書で使用される用語「原腸管細胞」、または「腸管細胞」とは、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ－β細胞（例えば、膵β細胞）に分化することができる細胞を指すことができる。原腸管細胞は以下のマーカー、ＨＮＦ１－β、ＨＮＦ３－β、またはＨＮＦ４－αのうち少なくとも１つを発現する。原腸管細胞は肺、肝臓、膵、胃、および腸の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。ＨＮＦ１－βおよびその他の原腸管のマーカーの発現は、例えば抗ＨＮＦ１－β抗体を用いる免疫化学等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。

【0074】

[0087]用語「幹細胞」は本明細書で使用される場合、増殖することができ、次に分化したまたは分化可能な娘細胞を生じることができる多数の母細胞を産生する能力を有するより多くの前駆細胞を生じる未分化の細胞を指し得る。娘細胞それ自体は、増殖し、続いて１つまたは複数の成熟細胞型に分化する子孫を生成するように誘導される一方、親の発生可能性を有する１つまたは複数の細胞を保持することもできる。用語「幹細胞」は、特定の状況下ではより特殊化されまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、ある特定の状況下では実質的に分化せずに増殖する能力を保持している前駆細胞のサブセットを指し得る。一実施形態では、幹細胞という用語は一般に、その子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ、ｐｒｏｇｅｎｙ）が、胚の細胞および組織の漸進的多様化で起こるように、分化によって、例えば完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に、特殊化する、天然に存在する母細胞を指す。細胞の分化は典型的には多くの細胞分裂を通して起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は万能性細胞由来であってよく、万能性細胞はそれ自体、万能性細胞由来、等々である。これらの万能性細胞のそれぞれは幹細胞であると考えられるが、それぞれが生じることができる細胞型の範囲はかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞はより大きな発生の可能性を有する細胞を生じる能力をも有する。そのような能力は天然であってもよく、種々の因子を用いる処置によって人工的に誘導してもよい。多くの生物学的な例では、幹細胞は２つ以上の異なった細胞型を有する子孫を生成することができるので「万能性」でもあるが、これは「幹細胞性」であるために必要ではない。「自己更新」は幹細胞の定義の他の古典的な部分であり、これは本書で用いるように重要である。理論的には、自己更新は２つの主な機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対称的に分裂され、１つの娘は幹細胞状態を保持し、他の娘はいくつかの異なった他の特定の機能および表現型を発現することができる。あるいは、集団における幹細胞のいくつかは２つの幹細胞に対称的に分裂することができ、それにより集団におけるいくつかの幹細胞は全体として維持される一方、集団における他の細胞は分化した子孫のみを生じる。形式的には、幹細胞として始まった細胞が分化した表現型に向かって進行するが、「逆行」し、幹細胞の表現型を逆発現することも可能である。これは当業者によって「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化」と称されることが多い。本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞」には、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞等が含まれる。

【0075】

[0088]用語「多能性」は本明細書で使用される場合、種々の条件下で２種以上の分化した細胞型に分化し、好ましくは３種全ての胚細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指し得る。多能性細胞は、一次的には例えばヌードマウスの奇形腫形成アッセイを用いて２種以上の細胞型、好ましくは３種全ての胚葉層に分化する能力によって特徴付けられる。多能性は胚幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性のための好ましい試験は３種の胚葉層のそれぞれの細胞に分化する能力を実証することである。そのような細胞を単に培養するだけではそれ自体、これらの細胞を多能性にするわけではないことに留意されたい。再プログラミングされた多能性細胞（例えば本明細書でその用語を定義するようにｉＰＳ細胞）は、一般には培養中に限られた回数の分裂のみの能力を有する初代親細胞と比較して、成長の可能性を失わずに延長された継代の能力を有することも特徴としている。

【0076】

[0089]本明細書で使用される場合、用語「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」は相互交換可能に用いられ、例えば１つまたは複数の遺伝子の強制的な発現を誘導することによって、非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から人工的に得られた（例えば誘導されたか、または完全な逆転による）多能性幹細胞を指し得る。

【0077】

[0090]用語「表現型」は、実際の遺伝子型に関わらず、環境条件および因子の特定の組のもとに細胞または生命体を定義する１つまたはいくつかの生物的特徴の全てを意味し得る。

【0078】

[0091]用語「対象」、「患者」、または「個体」は本明細書で相互交換可能に用いられ、それから細胞が得られ、および／または本明細書に記載した細胞を用いる予防的処置を含む処置がそれに提供される動物、例えばヒトを意味し得る。ヒト対象などの特定の動物に特異的な感染、病態、または疾患状態の処置については、対象という用語はその特定の動物を指し得る。本明細書で相互交換可能に用いられる「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類等の哺乳動物が含まれる。用語「対象」には、それだけに限らないが哺乳類、爬虫類、両生類、および魚類を含む任意の脊椎動物も包含される。しかし有利には、対象はヒト等の哺乳動物、または例えばイヌ、ネコ、ウマ、その他の家畜、もしくはウシ、ヒツジ、ブタ、その他の生産用哺乳動物等のその他の哺乳動物である。「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では糖尿病に限らず、例えば疾患または障害を有すると診断されたか、その疑いがある患者を意味する。

【0079】

[0092]本明細書で使用される、用語「投与すること」は、本明細書に記載した１つまたは複数の組成物を患者または対象に提供することを指し得る。例として限定せずに、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって実施することができる。一部の実施形態では、組成物のいずれかは肝門脈を介して投与され得る。１つまたは複数のそのような経路を採用することができる。非経口投与は、例えばボーラス注射または時間をかけた段階的潅流によるものでよい。あるいは、または同時に、投与は経口経路によるものでよい。さらに、投与は細胞のボーラスまたはペレットを手術で堆積してもよく、医用デバイスを位置決めしてもよい。一実施形態では、本開示の組成物は、増殖性障害を治療しまたは予防するために有効な量の本明細書に記載した核酸配列または本明細書に記載した少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを発現する操作された細胞または宿主細胞を含み得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載した細胞集団を含んでよい。そのような組成物は、中性緩衝食塩液、リン酸緩衝食塩液等の緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン、マンニトール等の炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン等のキレート化剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含んでもよい。

【0080】

[0093]用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、およびそれらの文法的等価物は、単離された細胞に適用される場合、細胞をあらゆる種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対してあらゆる種類の操作もしくは手順を実施することを含む。対象に適用される場合、その用語は、個体に医学的または外科的な注意、ケア、または管理を提供することを指す。個体は通常、病気であるか、もしくは怪我をしているか、または集団の平均的なメンバーと比較して病気になるリスクが高く、またそのような注意、ケア、もしくは管理を必要としている。

【0081】

[0094]本明細書で使用される場合、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の減少または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物を対象に投与することを指し得る。本発明の目的として、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（例えば、部分的または全体的）が挙げられる。処置することは、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存が延長されることを指し得る。よって、当業者は、処置が、疾患状態を改善することができるが、疾患に対する完全な治癒でなくてもよいことを理解する。本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防を含む。あるいは、処置は、疾患の進行が減少または停止される場合に「有効」である。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存が延長されることも意味し得る。処置を必要としているものは、すでに心臓疾患と診断されたもの、ならびに遺伝的感受性または体重、食事および健康などの他の要因に起因する心臓疾患を発症する可能性が高いものが挙げられる。

【0082】

[0095]用語「治療上有効な量」、「治療量」、またはその文法的等価物は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量での、および期間にわたる有効な量を指し得る。治療有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに本明細書に記載した組成物の、１または複数の対象において所望の応答を誘発する能力に応じて変化し得る。投与されるべき本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の病態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。

【0083】

[0096]あるいは、患者または対象に対する本明細書に記載した１つまたは複数の組成物の投与の薬理学的および／または生理学的効果は、「予防的」であってもよく、例えば、その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する。「予防上有効な量」は、所望の予防的結果（例えば、疾患発症の防止）を達成するのに必要な投与量での、および期間にわたる有効な量を指し得る。

【0084】

[0097]全体にわたって開示したいくつかの数値は、例えば「Ｘは少なくともまたは少なくとも約１００、または２００［または任意の数］である」と称される。この数値にはその数それ自体が含まれる。

【0085】

[0098]全体にわたって開示した数値によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての数値はこのように解釈すべきである。

【0086】

[0099]全体に開示した範囲は、例えば「Ｘは１～２日目もしくは約１～２日目に、または２～３日目もしくは約２～３日目に［または任意の数値範囲に］投与される」と称されることがある。この範囲にはその数それ自体（例えば範囲の終点）および列挙した範囲内の個々の数全てが含まれる。

【0087】

[00100]全体に開示した範囲によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての範囲はこのように解釈すべきである。

【0088】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤
[00101]一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、膵臓系統（例えば、Ｓｏｘ１７陽性胚体内胚葉細胞、ＦＯＸＡ２陽性原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞１細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞２細胞、インスリン陽性膵内分泌細胞、またはＳＣ－膵β細胞）における細胞の分化中のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤の使用に関する。

【0089】

[00102]ある特定の理論に縛られることは望まないが、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化は、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとしても知られている）をリン酸化して活性化する。Ａｋｔのリン酸化および活性化は、ｃＡＭＰ応答要素結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化、ｐ２７の阻害、細胞質におけるフォークヘッドボックスＯ（ＦＯＸＯ）の局在化、ＰｔｄＩｎｓ－３ｐｓの活性化、およびラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ、ラパマイシンの哺乳動物標的としても知られている）の活性化などの多くの下流効果を有し得る。本明細書で使用される場合、用語「ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤」は、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性、Ａｋｔタンパク質の活性、ｍＴＯＲタンパク質の活性、またはそれらの任意の組合せを阻害する薬剤を指す。用語「ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤」は、ＰＩ３ＫからＡｋｔおよびｍＴＯＲへの細胞内部で起こるシグナル伝達カスケードに対して阻害効果を有する薬剤のみに限定されると意図されない。代わりに、一部の事例では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＡｋｔもしくはｍＴＯＲの活性化に対していかなる即時的な効果もなくＰＩ３Ｋタンパク質の活性に対して、またはｍＴＯＲの活性化もしくはＰＩ３Ｋタンパク質の活性に対していかなる即時的な効果もなくＡｋｔタンパク質の活性に対して阻害効果を有する。一部の事例では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、Ａｋｔタンパク質の活性またはＰＩ３Ｋタンパク質の活性に対していかなる即時的な効果もなく、ｍＴＯＲタンパク質の活性を直接阻害する。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性、Ａｋｔタンパク質の活性、ｍＴＯＲタンパク質の活性、またはそれらの任意の組合せを直接阻害する。一部の事例では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性、Ａｋｔタンパク質の活性、ｍＴＯＲタンパク質の活性、またはそれらの任意の組合せを間接的に阻害する。

【0090】

[00103]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、クラスＩ ＰＩ３Ｋ、クラスＩＩ ＰＩ３Ｋ、またはクラスＩＩＩ ＰＩ３ＫなどのＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、１つよりも多いＰＩ３Ｋタンパク質、例えば、１つよりも多いクラスＩ、ＩＩ、もしくはＩＩＩのＰＩ３Ｋ、または１つよりも多いクラスにおけるＰＩ３Ｋを阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、事実上全てのタイプのＰＩ３Ｋを阻害する薬剤を含む。本明細書で論じたクラスＩ ＰＩ３Ｋとして、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＩＫ３Ｒ６が挙げられ得る。本明細書で論じたクラスＩＩ ＰＩ３Ｋとして、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｇが挙げられ得る。本明細書で論じたクラスＩＩＩ ＰＩ３Ｋとして、ＰＩＫ３Ｃ３が挙げられ得る。

【0091】

[00104]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、またはＡｋｔ３などのＡｋｔタンパク質の阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、１つよりも多いＡｋｔタンパク質、例えば、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２、Ａｋｔ１およびＡｋｔ３、またはＡｋｔ２およびＡｋｔ３を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤はＡｋｔ１を阻害するが、Ａｋｔ２またはＡｋｔ３に対しては最小限の効果を有するか、または全く影響がない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、Ａｋｔ２を阻害するが、Ａｋｔ１またはＡｋｔ３に対しては最小限の効果を有するか、または全く影響がない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤はＡｋｔ３を阻害するが、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２に対しては最小限の効果を有するか、または全く影響がない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、汎Ａｋｔ阻害剤、例えば、Ａｋｔタンパク質の実質的に３つ全てのタイプを阻害する薬剤を含む。

【0092】

[00105]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤はｍＴＯＲの阻害剤を含む。ある特定の理論に縛られることは望まないが、活性化されたｍＴＯＲタンパク質は他のタンパク質と結合し、２つの異なるタンパク質複合体、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）のコア成分として機能し、それらは異なる下流細胞シグナル伝達経路を有し、異なる細胞プロセスを規制することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１の形成を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１の活性を、したがって、ｍＴＯＲＣ１によって活性化される標的タンパク質および／または細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ２の形成を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ２の活性を、したがって、ｍＴＯＲＣ２によって活性化される標的タンパク質および／または細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方の形成を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を、したがって、ｍＴＯＲＣ１またはｍＴＯＲＣ２の両方によって活性化される標的タンパク質および／または細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部を阻害する。

【0093】

[00106]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤としては、以下に限定されないが、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、およびそれらの任意の類似体または誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体のうちの１つまたは複数である。

【0094】

[00107]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、式（Ｉ）：

【0095】

【化1】

【0096】

またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグ、組成物、もしくは混合物である。
[00108]一部の実施形態では、本開示は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤を提供し、阻害剤は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８０７６７６３号で開示される分子のいずれかである。例えば、一部の実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）：

【0097】

【化2】

【0098】

（式中、Ｘは、存在しないか、またはＯ、ＳおよびＣＲ^２０Ｒ^２１からなる群から選択され、ここでＲ^２０Ｒ^２１は独立して、水素、フッ素、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチル、置換シクロペンチル、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、および置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルから選択されるか、
またはＲ^２０Ｒ^２１はそれらが結合されている炭素と一緒になって、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチルもしくは置換シクロペンチルを形成し；
Ｒ^２Ｒ^２’は独立して、水素、フッ素、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチル、置換シクロペンチル、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、および置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルから選択されるか、
または、Ｒ^２Ｒ^２’はそれらが結合されている炭素と一緒になって、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチルもしくは置換シクロペンチルを形成し；
Ｒ^３は、水素、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチル、置換シクロペンチル、シクロプロピルメチル、置換シクロプロピルメチル、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、および置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルからなる群から選択され；
Ｒ^４Ｒ^４’は独立して、水素、フッ素、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチル、置換シクロペンチル、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、および置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルから選択されるか、またはＲ^４Ｒ^４’はそれらが結合されている炭素と一緒になって、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチルもしくは置換シクロペンチルを形成し；
Ｒ^５Ｒ^５’は独立して、水素、フッ素、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチル、置換シクロペンチル、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、および置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルから選択されるか、
またはＲ^５Ｒ^５’はそれらが結合されている炭素と一緒になって、シクロプロピル、置換シクロプロピル、シクロブチル、置換シクロブチル、シクロペンチルもしくは置換シクロペンチルを形成し；
Ｒ^１は、水素、－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルおよび置換－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルからなる群から選択され；
Ｘが存在しないか、またはＲ^２０Ｒ^２１である場合、Ｒ^１はさらに、フッ素であり得る）
の構造、ならびに／またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物およびプロドラッグを含むＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤を提供する。

【0099】

[00109]用語「－Ｃ_１～Ｃ_４アルキル」とは本明細書で使用される場合、１～４個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和または不飽和炭化水素鎖を意味する。－Ｃ_１～Ｃ_４アルキルの例として、本明細書で使用される場合、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ_２－ＣＦ_３、－Ｃ（ＣＨ_３）、－（ＣＨ_２）_３－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ－ＣＨ_２、および－Ｃ［同一］Ｃ－ＣＨ_３が挙げられる。

【0100】

[00110]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、式（ＩＩＩ）：

【0101】

【化3】

【0102】

またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグ、組成物、もしくは混合物である。
[00111]一部の実施形態では、本開示は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤を提供し、阻害剤は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０１０５７１１号で開示される分子のいずれかである。例えば、一部の実施形態では、本開示は、式（ＩＶ）：

【0103】

【化4】

【0104】

（式中、Ａはヘテロアリールを表し；
Ｒ^１は、（１）任意選択で置換されたアルキル、（２）任意選択で置換されたシクロアルキル、（３）任意選択で置換されたアリール、（４）任意選択で置換されたアミン、（５）任意選択で置換されたスルホニル、（６）ハロを表し；
Ｒ^２は、水素、重水素またはＲ^１について定義されるような置換基を表し；
Ｒ^３は、水素、ハロ、任意選択で置換されたアルキルを表すが、但し、（Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボン酸２－アミド１－（｛５－［２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－ピリミジン－４－イル］－４－メチルチアゾール－２－イル｝－アミド）を除く）
の構造を含むＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤を提供する。

【0105】

[00112]接頭辞「Ｃ_１～Ｃ_７」は、最大７個まで（７を含む）、特に最大４個まで（４を含む）炭素原子を有する基を意味し、当該基は、直鎖状または単一もしくは複数の分岐を伴う分岐状のいずれかである。

【0106】

[00113]「アルキル」は、直鎖または分岐鎖のアルキル基を指し、好ましくは直鎖または分岐鎖のＣ_１～１２アルキルを表し、特に好ましくは直鎖または分岐鎖のＣ_１～７アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－またはイソ－プロピル、ｎ－、イソ－、ｓｅｃ－またはｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシルを表し、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピルおよびｎ－ブチルおよびイソ－ブチルが特に好ましい。アルキルは、非置換であってもよく、または置換されてもよい。例示的な置換基としては、以下に限定されないが、重水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロおよびアミノが挙げられる。置換アルキルの例はトリフルオロメチルである。シクロアルキルもまた、アルキルの置換基であり得る。そのような場合の例は、部分（アルキル）－シクロプロピルまたはアルカンジイル－シクロプロイル（ｃｙｃｌｏｐｒｏｙｌ）、例えば、－ＣＨ２－シクロプロピルである。Ｃ１～Ｃ７－アルキルは、好ましくは、１から（１を含む）最大７まで（７を含む）を有するアルキルであり、好ましくは、１から（１を含む）最大４まで（４を含む）を有するアルキルであり、直鎖状または分岐状であり、好ましくは、低級アルキルは、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチルなどのブチル、ｎ－プロピルまたはイソプロピルなどのプロピル、エチル、または好ましくはメチルである。

【0107】

[00114]「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシカルボニル」、「アルコキシカルボニルアルキル」、「アルキルスルホニル」、「アルキルスルホキシル」、「アルキルアミノ」、「ハロアルキル」のような他の基の各アルキル部分は、「アルキル」の上述の定義に記載されているものと同じ意味を有する。

【0108】

[00115]「アルカンジイル」は、部分に２つの異なる炭素原子によって結合された直鎖または分岐鎖のアルカンジイル基を指し、それは好ましくは、直鎖または分岐鎖のＣ１～１２アルカンジイルを表し、特に好ましくは直鎖または分岐鎖のＣ１～６アルカンジイル、例えば、メタンジイル（－ＣＨ_２－）、１，２－エタンジイル（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）、１，１－エタンジイル（－ＣＨ（ＣＨ_３）－）、１，１－、１，２－、１，３－プロパンジイルおよび１，１－、１，２－、１，３－、１，４－ブタンジイルを表し、メタンジイル、１，１－エタンジイル、１，２－エタンジイル、１，３－プロパンジイル、１，４－ブタンジイルが特に好ましい。

【0109】

[00116]「アルケンジイル」は、分子に２つの異なる炭素原子によって結合された直鎖または分岐鎖のアルケンジイル基を指し、それは好ましくは、直鎖または分岐鎖のＣ２～６アルカンジイル、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（ＣＨ_３）Ｈ－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）－ＣＨ＝ＣＨ－を表し、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－が特に好ましい。アルケンジイルは、置換されてもよく、または非置換であってもよい。

【0110】

[00117]「シクロアルキル」は、飽和または部分的飽和の単環式、縮合多環式、またはスピロ多環式の、炭素環１個当たり３～１２個の環原子を有する炭素環を指す。シクロアルキル基の実例としては、下記の部分が挙げられる：シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシルクロヘキシル。シクロアルキルは、非置換であってもよく、または置換されてもよく、例示的な置換基は、アルキルについての定義において提供され、アルキル自体（例えば、メチル）も含む。（ＣＨ_３）シクロプロピルのような部分は、置換シクロアルキルとみなされる。

【0111】

[00118]「アリール」は、６個またはそれよりも多い炭素原子を有する芳香族同素環系（即ち、環形成原子として炭素のみ）を指し、アリールは、好ましくは６～１４個の環炭素原子を有する、より好ましくは６～１０個の環炭素原子を有する芳香族部分、例えば、フェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルである。アリールは、非置換でもあってよく、または以下に記載されるような非置換もしくは置換ヘテロシクリル、特に、ピロリジニル、例えばピロリジノ、オキソピロリジニル、例えばオキソピロリジノ、Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル－ピロリジニル、２，５－ジ（Ｃ_１～Ｃ_７アルキル）ピロリジニル、例えば２，５－ジ－（Ｃ_１～Ｃ_７アルキル）－ピロリジノ、テトラヒドロフラニル、チオフェニル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルキルピラゾリジニル、ピリジニル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルキルピペリジニル、ピペリジノ、アミノもしくはＮ－モノもしくはＮ，Ｎ－ジ－（低級アルキル、フェニル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカノイルおよび／もしくはフェニル低級アルキル）－アミノで置換されたピペリジノ、環炭素原子を介して結合された非置換もしくはＮ－低級アルキル置換ピペリジニル、ピペラジノ、低級アルキルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、Ｓ－オキソチオモルホリノもしくはＳ，Ｓ－ジオキソチオモルホリノ；Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、アミノ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、Ｎ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルカノイルアミノ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、Ｎ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルカンスルホニル－アミノ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、カルバモイル－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、［Ｎ－モノ－もしくはＮ，Ｎ－ジ－（Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル）－カルバモイル］Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカンスルフィニル－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカンスルホニル－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、フェニル、ナフチル、モノ－～トリ－［Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、ハロおよび／もしくはシアノ］－フェニルもしくはモノ～トリ［Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、ハロおよび／もしくはシアノ］－ナフチル；Ｃ_３～Ｃ_８－シクロアルキル、モノ－～トリ［Ｃ_１～Ｃ_７－アルキルおよび／もしくはヒドロキシ］－Ｃ３～Ｃ８－シクロアルキル；ハロ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級－アルコキシ－低級アルコキシ、（低級アルコキシ）－低級アルコキシ－低級アルコキシ、ハロ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルコキシ、フェノキシ、ナフチルオキシ、フェニルもしくはナフチル－低級アルコキシ；アミノ－Ｃ_１～Ｃ_７－アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、ナフトイルオキシ、ホルミル（ＣＨＯ）、アミノ、Ｎ－モノもしくはＮ，Ｎ－ジ－（Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル）－アミノ、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカノイルアミノ、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカンスルホニルアミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、例えば、フェニルもしくはナフチル－低級アルコキシカルボニル、例えばベンジルオキシカルボニル；Ｃ_１～Ｃ_７－アルカノイル、例えば、アセチル、ベンゾイル、ナフトイル、カルバモイル、Ｎ－モノ－もしくはＮ，Ｎ－二置換カルバモイル、例えばＮ－モノもしくはＮ，Ｎ－二置換カルバモイル（式中、置換基は、低級アルキル、（低級アルコキシ）－低級アルキルおよびヒドロキシ－低級アルキルから選択される）；アミジノ、グアニジノ、ウレイド、メルカプト、低級アルキルチオ、フェニルもしくはナフチルチオ、フェニルもしくはナフチル－低級アルキルチオ、低級アルキル－フェニルチオ、低級アルキル－ナフチルチオ、ハロ－低級アルキルメルカプト、スルホ（－ＳＯ_３Ｈ）、低級アルカンスルホニル、フェニルもしくはナフチルスルホニル、フェニルもしくはナフチル低級アルキルスルホニル、アルキルフェニルスルホニル、ハロ－低級アルキルスルホニル、例えばトリフルオロメタンスルホニル；スルホンアミド、ベンゾスルホンアミド、アジド、アジド－Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル、特にアジドメチル、Ｃ_１～Ｃ_７－アルカンスルホニル、スルファモイル、Ｎ－モノ－もしくはＮ，Ｎ－ジ－（Ｃ_１～Ｃ_７－アルキル）－スルファモイル、モルホリノスルホニル、チオモルホリノスルホニル、シアノおよびニトロからなる群から独立して選択される１個もしくは複数、好ましくは最大３個、より好ましくは最大２個の置換基で置換されてもよく、ここで置換アルキル（または。本明細書で述べた置換アリール、ヘテロシクリルなども）の置換基または置換基の一部として上述した各フェニルまたはナフチル（同様にフェノキシまたはナフトキシにおける）は、それ自体が非置換であるか、またはハロ、ハロ－低級アルキル、例えばトリフルオロメチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アジド、アミノ、Ｎ－モノもしくはＮ，Ｎ－ジ－（低級アルキルおよび／もしくはＣ_１～Ｃ_７－アルカノイル）－アミノ、ニトロ、カルボキシ、低級－アルコキシカルボニル、カルバモイル、シアノおよび／もしくはスルファモイルから独立して選択される１個もしくは複数、例えば、最大３個、好ましくは１個もしくは２個の置換基で置換される。

【0112】

[00119]「ヘテロシクリル」は、不飽和（＝環（複数可）中に考え得る最高数の共役二重結合を保有する）、飽和または部分的飽和であり、好ましくは単環式であるか、または本発明のより広い態様では二環式、三環式もしくはスピロ環式環であり、３個～２４個、より好ましくは４個～１６個、最も好ましくは５個～１０個、最も好ましくは５個もしくは６個の環原子を有するヘテロ環式基を指し、ここで、１個または複数、好ましくは１個～４個、特に１個または２個の環原子はヘテロ原子である（したがって、残りの環原子は炭素である）。結合環（即ち、分子に結合する環）は、４個～１２個、特に５個～７個の環原子を有することが好ましい。ヘテロシクリルという用語はまた、ヘテロアリールを含む。ヘテロ環式基（ヘテロシクリル）は、非置換であってもよく、または置換アルキルについて上記で定義した置換基からなる群から、および／もしくは下記の置換基：オキソ（＝Ｏ）、チオカルボニルイミノ（＝ＮＨ）、イミノ－低級アルキルのうちの１個もしくは複数から独立して選択される１個もしくは複数、特に１個～３個の置換基で置換されてもよい。さらに、ヘテロシクリルは、特に、オキシラニル、アジリニル、アジリジニル、１，２－オキサチオラニル、チエニル（＝チオフェニル）、フラニル、テトラヒドロフリル、ピラニル、チオピラニル、チアントレニル、イソベンゾフラニル、ベンゾフラニル、クロメニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリジニル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピラゾリジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ジチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、（Ｓ－オキソまたはＳ，Ｓ－ジオキソ）－チオモルホリノ、インドリジニル、アゼパニル、ジアゼパニル、特に１，４－ジアゼパニル、イソインドリル、３Ｈ－インドリル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、クマリル、インダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、プリニル、４Ｈ－キノリジニル、イソキノリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、オクタヒドロイソキノリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ジベンゾチオフェニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、ベータ－カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フラザニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、クロメニル、イソクロマニル、クロマニニル、ベンゾ［１，３］ジオキソル－５－イルおよび２，３－ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン－６－イルからなる群から選択されるヘテロシクリル基であり、これらの基はそれぞれ、非置換であるか、または置換アリールについて上述したものから、および／もしくは下記の置換基：オキソＯ）、チオカルボニルＳ）、イミノ（＝ＮＨ）、イミノ－低級アルキルのうちの１個もしくは複数から選択される１個もしくは複数、好ましくは最大３個の置換基で置換されている。

【0113】

[00120]「アリールアルキル」は、メチルまたはエチル基などのアルキル基を介して分子に結合されたアリール基、好ましくはフェネチルまたはベンジル、特にベンジルを指す。同様に、シクロアルキル－アルキルおよびヘテロシクリル－アルキルは、アルキル基を介して分子に結合されたシクロアルキル基またはアルキル基を介して分子に結合されたヘテロシクリル基を表す。いずれの場合でも、アリール、ヘテロシクリル、シクロアルキルおよびアルキルは、上記で定義したように置換され得る。

【0114】

[00121]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む組成物は、ＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、またはそれらの誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む。

【0115】

分化のステージ
[00122]一部の実施形態では、本明細書で開示されるような膵分化は、段階的に実行される。段階的な進行では、「ステージ１」または「Ｓ１」は、分化過程の第１のステージである、多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ＤＥ」、「ステージ１細胞」または「Ｓ１細胞」）に分化させることを指す。「ステージ２」は、第２のステージである、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ＧＴ」、「ステージ２細胞」または「Ｓ２細胞」）に分化させることを指す。「ステージ３」は、第３のステージである、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓前駆１細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ＰＰ１」、「ステージ３細胞」または「Ｓ３細胞」）に分化させることを指す。「ステージ４」は、第４のステージである、膵前駆細胞１細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞から膵前駆細胞２細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ＰＰ２」、「ステージ４細胞」または「Ｓ４細胞」）に分化させることを指す。「ステージ５」は、第５のステージである、膵前駆細胞２細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（例えば、ＰＤＸ．１＋、ＮＫＸ６．１＋）を、膵臓内胚葉細胞および／または膵臓内分泌前駆細胞（例えば、インスリン＋）に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ＥＮ」、「ステージ５細胞」または「Ｓ５細胞」）に分化させることを指す。「ステージ６」とは、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカー（例えば、インスリン）を発現する細胞を、膵内分泌β細胞（「ＳＣ－β細胞」）または膵内分泌α細胞（「ＳＣ－α細胞」）に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることを指す。しかしながら、特定の集団に含まれる全ての細胞が同じ速度でこれらのステージを進むわけではないこと、即ち、一部の細胞は、その集団に存在する大多数の細胞よりも分化経路の進行が少ないかまたは多い可能性があることを理解すべきである。例えば、一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、ステージ５の間、ステージ５の終了時、ステージ６の開始時などに同定することができる。ステージ１～６のいずれか１つの細胞を作製する方法の例は、例えば、米国特許第１０，０３０，２２９号、米国特許第１０，４４３，０４２号、米国特許公開第２０２００３３２２６２号、同第２０２１０１９８６３２Ａ１号、同第２０２２００９００２０号に提供され、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。

【0116】

再プログラミング
[00123]用語「再プログラミング」は本明細書で使用される場合、体細胞の分化状態を改変または逆行させるプロセスを指す。細胞は再プログラミングの前に部分的にまたは最終的に分化させることができる。再プログラミングは体細胞の分化状態の多能性細胞への完全な逆行を包含する。そのような分化の完全な逆行は人工多能性（ｉＰＳ）細胞を生成する。本明細書で使用される場合、再プログラミングは、細胞の分化状態の、例えば、多能性でも万能性でもないがそれが生じた分化した細胞の１つまたは複数の特定の特徴を失った細胞である万能性状態の細胞または体細胞への部分的な逆行、例えば分化した細胞の様々な体細胞型への直接的再プログラミングをも包含する。再プログラミングには一般に、接合子が成体に成長する際の細胞の分化の間に起こる核酸の修飾（例えばメチル化）、クロマチンの縮合、エピジェネティック変化、ゲノムの刷り込み等の遺伝可能なパターンの少なくともいくつかの改変、例えば逆行が含まれる。

【0117】

[00124]本明細書で使用される場合、用語「再プログラミング因子」は、細胞の「再プログラミング」、即ちそれによって細胞が異なった細胞型または表現型に変換される分化、および／または脱分化、および／または分化転換に関連する分子を指すと意図される。再プログラミング因子は一般に、細胞の分化、脱分化、および／または分化転換に関連する遺伝子の発現に影響する。転写因子は再プログラミング因子の例である。

【0118】

[00125]用語「分化」およびその文法的等価物は本明細書で使用される場合、特殊性の低い細胞（即ち、より高い細胞能力を有するよりナイーブな細胞）が特殊性の高い細胞型（即ち、より低い細胞能力を有するあまりナイーブでない細胞）になるプロセスを指し、用語「脱分化」は、特殊性の高い細胞が特殊性の低い細胞型（即ち、より高い細胞能力を有するよりナイーブな細胞）になるプロセスを指し、用語「分化転換」は、特定の細胞型の細胞がその「細胞能力」または「ナイーブさ」のレベルを顕著に変化させずに別の細胞型に変換されるプロセスを指す。理論に縛られることは望まないが、細胞がその「細胞能力」または「ナイーブさ」のレベルを顕著に変化させずに１つの系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型から別の系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型に変換された場合には、細胞は「分化転換」すると考えられる。

【0119】

[00126]本明細書で使用される場合、用語「細胞能力」は、細胞が異なる系統の細胞に分化する能力を指すと理解されたい。例えば、多能性細胞（例えば幹細胞）は、３つの胚葉層、即ち内胚葉（胃の内部ライニング、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）のいずれの細胞にも分化する可能性を有し、したがって高い細胞能力を有する。万能性細胞（例えば幹細胞またはある型の誘導された幹細胞）は多いが限られた数の系統（例えば造血幹細胞、心幹細胞、または神経幹細胞等）から細胞を生じる能力を有し、多能性細胞よりは比較的低い細胞能力を有している。特定の系統に関与し、または最終的に分化した細胞は、さらに低い細胞能力を有し得る。当技術で公知の分化転換の具体例には、例えば、線維芽ベータ細胞の、または膵外分泌細胞からベータ細胞への変換等が含まれる。

【0120】

[00127]したがって、細胞はよりナイーブな細胞に分化させることができ（例えば最終的に分化した細胞は万能性もしくは多能性に分化することができ）、または細胞はあまりナイーブでない細胞に脱分化させることができる（例えば万能性もしくは多能性の細胞は系統に関与する細胞もしくは最終的に分化した細胞に分化することができる）。しかしながら、一実施形態では、細胞は例えば同様の細胞能力レベルで１つの細胞型（または表現型）から別の細胞型（または表現型）に変換または分化転換させることができる。したがって、本開示の一実施形態では、本開示の誘導するステップは、本開示の細胞を再プログラミングして、分化し、脱分化し、および／または分化転換することができる。本開示の一実施形態では、本開示の誘導するステップは、細胞を再プログラミングして分化転換することができる。

【0121】

[00128]１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド再プログラミング因子を使用し、例えば分化、脱分化、および／または分化転換することによって特定の型の細胞を再プログラミングまたは誘導して別の型の細胞にする方法は、当業者には公知である。そのような方法は、細胞の再プログラミングに関連する１つまたは複数の転写因子またはその他のポリペプチドをコードする遺伝材料の導入に依拠し得る。例えば、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３およびＭａｆＡ、またはそれらの機能的断片は全て、本開示の細胞の細胞分化、脱分化、および／または分化転換を誘導することができるペプチドをコードしていることが知られている。当業者に公知のいくつかの方法では、再プログラミング遺伝子（上記の遺伝子等）によってコードされる外因性ポリペプチド（例えば組換えポリペプチド）が細胞と接触して、例えば本開示の細胞を誘導する。当業者であれば、他の遺伝子も細胞の再プログラミングに関連し、そのような遺伝子をコードする外因性分子（またはその機能的断片）およびコードされたポリペプチドもポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子（例えば、続いて細胞の再プログラミングに関連する別の遺伝子の発現レベルに影響するポリヌクレオチドまたはポリペプチド）であると考えられることを認識する。例えば、ｐ５３の不活性化を減少させる外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのエピジェネティック遺伝子サイレンサーの導入によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導する効率が上昇することが示されている。したがって、エピジェネティックサイレンサーをコードする外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および細胞の再プログラミングまたは細胞のプログラミング効率の上昇に直接または間接に関与し得るその他の遺伝子またはタンパク質は、外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子を構成すると考えられる。当業者であれば、細胞の再プログラミングの阻害に関与する遺伝子の発現をノックダウンすることができるＲＮＡｉ分子（またはＲＮＡｉ分子をコードする遺伝子材料）の導入等の、細胞の再プログラミングに影響する他の方法が存在することを認識する。したがって、細胞の再プログラミングに関連し、または細胞の再プログラミングを促進する任意の外因性のポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子は、本明細書に記載した外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子であると理解されたい。

【0122】

[00129]本開示の一部の実施形態では、本方法は、小分子ではない再プログラミング因子（複数可）の使用を排除する。しかしながら、本方法は、組織培養成分、例えば培地、血清、血清代用物、補充物、抗生物質等、例えば、ＲＰＭＩ、腎上皮細胞基本培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｆ１２、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－１（ジペプチド、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミン）、Ｂ２７、ヘパリン、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、セレン、エタノールアミン、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ノルマシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびアムホテリシン等を利用し得ることが認識される。これらの組織培養成分（および組織培養で日常的に使用されるその他の同様の組織培養成分）は、本開示の目的のための小分子の再プログラミング分子ではないことを理解されたい。実際に、これらの成分は本明細書で定義する小分子でも、および／または本明細書で定義する再プログラミング因子でもない。しかしながら、本明細書で開示される細胞培養成分および代謝産物は、本明細書で開示される細胞の再プログラミングおよび分化方法を増強するのに使用することができる。例えば、本明細書で開示される細胞培養成分／添加剤および代謝産物の組合せは、ＳＣ－β細胞の産生効率、およびそれらの機能を改善することができる。

【0123】

[00130]したがって、一実施形態では、本開示は、細胞を１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子とともに培養するステップを含まない。したがって、一実施形態では、本開示の方法は、誘導されたベータ細胞を産生すること、またはそうでなければ本開示の細胞を誘導して分化させ、脱分化させ、および／もしくは分化転換させることに関与する、例えばトランスポゾン、ウイルストランスジェニックベクター（レトロウイルスベクター等）、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、またはこれらの分子のいずれかの断片を導入することによる、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子の導入を含まない。

【0124】

[00131]即ち、一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子（例えば、アクチビンＡ）の非存在下で行われる。したがって、一実施形態では、本開示の方法では、ポリペプチド転写因子、分化、脱分化、および／または分化転換の誘導に特異的に関連するその他のポリペプチド因子、ポリペプチド転写因子をコードするポリヌクレオチド配列、分化、脱分化、および／または分化転換の誘導に特異的に関連するその他のポリペプチド因子をコードするポリヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ならびにそれらの断片を添加せずに、小分子を利用して細胞を再プログラミングすることを理解されたい。

【0125】

[00132]一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の小分子が、分化プロトコールにおけるアクチビンＡの使用を補い、置き換えて、および／または減少させる方法を提供する。

【0126】

幹細胞
[00133]用語「幹細胞」は、自己更新し、分化した細胞型を産生する能力を有する細胞（例えば植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指すのに本明細書で使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９９７年） Ｃｅｌｌ ８８：２８７～２９８頁）。細胞の個体発生の文脈では、「分化した」あるいは「分化しつつある」という形容詞は相対的な用語である。「分化した細胞」とは、比較される細胞よりもさらに発生経路を進んだ細胞のことである。このように、多能性幹細胞は、系統に制限のある前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、その前駆細胞はさらに系統に制限のある細胞（例えば、ベータ細胞前駆細胞）に分化することができ、その前駆細胞は、ある組織型において特徴的な役割を果たす終末期の細胞（即ち、終末分化細胞、例えば、ベータ細胞など）に分化することができ、さらに増殖する能力を保持することができたり、そうでなかったりする。幹細胞は特定のマーカー（例えばタンパク質、ＲＮＡ等）の存在および特定のマーカーの非存在によって特徴付けることができる。幹細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方の機能性アッセイ、特に多種の分化した子孫を生じる幹細胞の能力に関連するアッセイによっても同定することができる。一実施形態では、宿主細胞は成体幹細胞、体幹細胞、非胚幹細胞、胚幹細胞、造血幹細胞であり、多能性幹細胞、およびトロホブラスト幹細胞を含む。

【0127】

[00134]目的とする幹細胞には多能性幹細胞（ＰＳＣ）が含まれる。「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」という用語は、本明細書において、生物の全ての細胞型を生成することができる幹細胞を意味するために使用される。したがって、ＰＳＣは生物の全ての生殖細胞層（例えば脊椎動物の内胚葉、中胚葉、外胚葉）の細胞を生み出すことができる。多能性細胞は奇形腫を形成し、生体の外胚葉、中胚葉、内胚葉組織に寄与することがある。植物の多能性幹細胞は植物の全ての細胞型（例えば根、茎、葉、その他の細胞）を生じることができる。

【0128】

[00135]動物のＰＳＣはいくつかの異なった方式で誘導することができる。例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）は胚の内部細胞集塊から誘導される（Thomsonら、Science. 1998 Nov. 6; 282(5391):1145-7）。一方、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は体細胞から誘導される（Takahashiら、Cell. 2007 Nov. 30; 131(5):861-72；Takahashiら、Nat Protoc. 2007; 2(12):3081-9；Yuら、Science. 2007 Dec. 21; 318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov. 20）。用語ＰＳＣはその起源に関わらず多能性幹細胞を意味するので、用語ＰＳＣは用語ＥＳＣおよびｉＰＳＣ、ならびにＰＳＣの別の例である用語、胎児胚幹細胞（ＥＧＳＣ）をも包含する。ＰＳＣは確立された細胞株の形態であってよく、これらは初代胚組織から直接得ることができ、または体細胞から誘導することもできる。

【0129】

[00136]「胚幹細胞（ＥＳＣ）」は、胚から、典型的には胚盤胞の内部細胞集塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ株、例えばｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）がＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている。目的の幹細胞にはその他の霊長類からの胚幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞も含まれる。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２： １１４５頁；Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９５年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７８４４頁；Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９６年） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４頁；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １３７２６頁， １９９８年）。培養では、ＥＳＣは、典型的には、大きな核－細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長する。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、アルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ－１は発現しない。ＥＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，９１３号、同第５，８４３，７８０号、および同第６，２００，８０６号に見出すことができる。未分化の形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、それぞれが全体として本明細書に組み込まれるＷＯ第９９／２０７４１号、ＷＯ第０１／５１６１６号、およびＷＯ第０３／０２０９２０号に記載されている。

【0130】

[00137]「胎児胚幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胎児胚細胞」または「ＥＧ細胞」は、胚細胞および／または胚細胞前駆細胞、例えば原初胚細胞、即ち精子および卵子になることができる胚細胞から誘導されたＰＳＣを意味する。胎児胚細胞（ＥＧ細胞）は上記の胎児幹細胞と同様の特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，１５３，６８４号；Matsui, Y.ら、(1992) Cell 70:841；Shamblott, M.ら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113；Shamblott, M.ら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726；およびKoshimizu, U.ら、(1996) Development, 122:1235に見出すことができる。

【0131】

[00138]「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、ＰＳＣでない細胞から（即ちＰＳＣに対して分化した細胞から）誘導されたＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは最終的に分化した細胞を含む多種の異なった細胞型から誘導することができる。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様の形態を有し、大きな核－細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長する。さらに、ｉＰＳＣは、それだけに限らないがアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含む当業者には公知の１つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００４７２６３号、同第２００９／００６８７４２号、同第２００９／０１９１１５９号、同第２００９／０２２７０３２号、同第２００９／０２４６８７５号、および同第２００９／０３０４６４６号に見出すことができる。一般にｉＰＳＣを産生するためには、体細胞を再プログラミングして多能性幹細胞にする当技術で公知の再プログラミング因子（例えばＯｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、その他）を体細胞に提供する。

【0132】

[00139]一部の実施形態では、細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞から得られる。一部の実施形態では、幹細胞は、遺伝的に修飾されている。一部の実施形態では、幹細胞は、遺伝的に修飾されていない幹細胞に対して、ベータ－２ミクログロブリン、ＡＢＯ、ＦＵＴ１、ＣＸＣＬ１０、レナラーゼ、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数の発現が減少している。一部の実施形態では、幹細胞は、遺伝子修飾されていない幹細胞と比較して、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９および／またはＣＴＬＡのうちの１つまたは複数の発現が増加している。

【0133】

[00140]ある特定の例では、幹細胞は、本明細書で開示した方法による少なくとも１つのβ細胞成熟因子に曝露される前には未分化（例えば特定の系統に関わっていない細胞）であってよく、一方、他の例では、本明細書に記載した少なくとも１つの細胞成熟因子（複数可）に曝露する前に幹細胞を１つまたは複数の中間細胞型に分化することが望ましいことがある。例えば、幹細胞は未分化細胞の形態学的、生物学的、または物理的な特徴を呈することがあり、これらの特徴はこれらの細胞を胎児起源または成体起源の分化した細胞と区別するために用いることができる。一部の例では、未分化細胞は高い核／細胞質比および目立った核を有する細胞のコロニーにおいて微視的な二次元で現れ得る。幹細胞はそれ自体（例えば実質的に未分化細胞が何ら存在しない）であってよく、または分化細胞の存在下に使用してもよい。ある特定の例では、幹細胞は成長し、任意選択で分化し得るために、好適な栄養剤および任意選択で他の細胞の存在下で培養することができる。例えば、幹細胞の成長を補助するために、胎児線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が培養中に存在してもよい。線維芽細胞は幹細胞の成長の１つの段階の間に存在してよいが、必ずしも全ての段階に存在する必要はない。例えば、線維芽細胞は最初の培養段階で幹細胞の培養に添加し、１つまたは複数の引き続く培養段階では幹細胞の培養に添加しなくてもよい。

【0134】

[00141]本発明の全ての態様において使用する幹細胞は任意の種類の組織（例えば胎児もしくは前胎児の組織等の胚組織、または成体組織）から誘導される任意の細胞であってよく、これらの幹細胞は適切な条件下で種々の細胞型、例えば３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の全てまたは少なくとも１つの誘導体からなる子孫を生成する能力があるという特徴を有する。これらの細胞型は確立された細胞株の形態で提供することができ、または初代胚組織から直接得て、直ちに分化に使用することもできる。ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている細胞、例えばｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＦＩＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が含まれる。一部の実施形態では、成熟したインスリン陽性細胞への化学的に誘起された分化のために使用したヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源には、ヒト胚を破壊するステップは含まれていなかった。

【0135】

[00142]別の実施形態では、幹細胞は固体組織を含む組織から単離することができる。一部の実施形態では、組織は皮膚、脂肪組織（例えばアジポーズ組織）、筋肉組織、心臓または心臓組織である。他の実施形態では、組織は例えばそれだけに限らないが臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨である。

【0136】

[00143]目的の幹細胞には、種々の種類の胚細胞を含み、Ｔｈｏｍｓｏｎら， （１９９８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２： １１４５頁に記載されるヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）；他の霊長類由来の胚幹細胞、例えば、アカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら． （１９９５年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４頁）；マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら． （１９９６年） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４頁）；およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｆｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １３７２６頁， １９９８年）が例示される。また、中胚葉幹細胞およびその他の早期心臓発生細胞等の系統に関与する幹細胞も適用可能である（Ｒｅｙｅｓら、（２００１年） Ｂｌｏｏｄ ９８：２６１５～２６２５頁；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｂａｄｅｒ （１９９６年） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ７８（２）：２０５～１６頁などを参照されたい）。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる。一部の実施形態では、ヒト胚は本明細書に開示した方法および組成物に使用する多能性細胞の供給源のために破壊されなかった。

【0137】

[00144]内皮、筋肉、および／または神経幹細胞の適切な供給源からの細胞の混合物は、哺乳動物ドナーから当技術分野で公知である方法によって採取することができる。好適な供給源は造血微小環境である。例えば、好ましくは固定化された（即ち動員された）循環末梢血を対象から取り出すことができる。一実施形態では、幹細胞は再プログラミングされた幹細胞、例えば体細胞または分化した細胞から誘導された幹細胞であってよい。そのような実施形態では、脱分化された幹細胞は、例えばそれだけに限らないが新生物細胞、腫瘍細胞、およびがん細胞、あるいは人工多能性幹細胞もしくはｉＰＳ細胞等の、誘導され再プログラミングされた細胞であってよい。

【0138】

[00145]一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、毛髪細胞、ケラチノサイト、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン形成細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜角化細胞、網膜ムラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア細胞（例えば乏突起樹状細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えばＩ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、ゴブレット細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、ゴブレット細胞、パネス細胞、腸細胞、マイクロフォールド細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば中胚葉からのクッパー細胞）、胆嚢細胞、房心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えばＰＰ細胞）、膵ε細胞、甲状腺（例えば濾胞性細胞）、副甲状腺（例えば副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋サテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハル介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）、間質細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、テロサイト単純上皮細胞、有足細胞、腎近位細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ペッグ細胞、胚葉細胞、精子、卵子、リンパ球、ミエロイド細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中血管芽細胞、周皮壁細胞、脾細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、ミクロファージ、白血球）、トロホブラスト幹細胞、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数から得られ得る。

【0139】

β細胞の分化のための小分子化合物の使用
[00146]幹細胞の、小分子化合物、例えば、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（複数可）の使用を置換するか、または補うことができるものを含む膵臓系統の細胞への分化に関連する組成物および方法が本明細書で提供される。本明細書で開示される組成物および方法は、一部の事例では、幹細胞を、例えば、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）、ＦＯＸＡ２陽性細胞（例えば、原腸管細胞）、Ｐｄｘ１陽性細胞（膵前駆細胞、例えば、Ｐｄｘ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性膵前駆細胞１細胞、またはＰｄｘ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性膵前駆細胞２細胞）、インスリン陽性膵内分泌細胞、またはβ細胞（例えば、幹細胞由来β細胞、または非天然膵β細胞）への分化に関する。一部の実施形態では、小分子化合物は、ＧＳＫ６９０６９３またはその類似体などのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む。

【0140】

幹細胞の分化
[00147]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数の幹細胞（例えば、多能性幹細胞、例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップによる幹細胞の分化に関する。一部の実施形態では、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップは、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）を含む細胞の集団の産生をもたらす。

【0141】

[00148]一部の事例では、本明細書で開示される方法は、複数の幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の事例では、本明細書で開示される方法はまた、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤に加えて、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤と接触させるステップを含む。一部の事例では、本明細書で開示される方法は、幹細胞を、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させるステップを含む。

【0142】

[00149]本明細書で開示される方法は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含まない参照方法と比較した場合に、減少された量のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を利用することができる。例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の存在下で、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％または４０％の幹細胞の、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）への分化のためのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の多くとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％の濃度で適用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％または４０％の幹細胞の、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）への分化のためのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、または０％の濃度で適用することができる。

【0143】

[00150]本開示に従って幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、参照方法によって産生される細胞の集団に匹敵する細胞構成成分を有する細胞の集団の産生をもたらすことができ、参照方法は、幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤とは接触させないステップを含み、他の点は本方法と同一である。例えば、本開示に従って産生された細胞の集団は、参照方法によって産生された細胞の集団におけるＳｏｘ１７陽性細胞のパーセンテージ（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）と等価なパーセンテージのＳｏｘ１７陽性細胞を有し得る。一部の事例では、本開示に従って産生された細胞の集団は、参照方法によって産生された細胞の集団におけるＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞のパーセンテージと等価なパーセンテージのＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を有し得る。

【0144】

[00151]一部の事例では、本開示に従って幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらし得る。一部の事例では、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、または約７５％～約８５％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらし得る。一部の実施形態では、本開示に従って幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、５０～９０％、５０～８５％、５０～７５％、５０～６５％、６０～９０％、６０～８５％、６０～７５％、７０～９０％、７０～８５％、８０～８５％、または８０～９０％のＳｏｘ１７陽性、Ｏｃｔ４陰性細胞を含む細胞の集団の産生をもたらし得る。

【0145】

[00152]一部の事例では、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）は、幹細胞の集団を、ｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤、ならびに任意選択で、ｉｉｉ）本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＧＳＫ－６９０６９３および／またはＢＹＬ７１９）のいずれかのいずれか１つまたは複数と接触させて、幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉細胞への分化を誘導するステップによって得ることができ、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカー、例えば、Ｓｏｘ１７を発現する。

【0146】

[00153]幹細胞の、Ｓｏｘ１７陽性細胞への分化において使用することができるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤は、ＰＩ３Ｋの阻害剤、Ａｋｔタンパク質の阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む。例えば、ＧＳＫ－６９０６９３、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、ネミラリシブ、ＢＹＬ７１９、ＦＴ１１３、アピトリシブ、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体等の小分子化合物は、幹細胞の、Ｓｏｘ１７陽性細胞への分化に使用することができる。一部の事例では、本方法は、幹細胞を、ＰＩ３Ｋタンパク質の阻害剤およびＡｋｔタンパク質の阻害剤の両方、例えば、ＢＹＬ７１９およびＧＳＫ－６９０６９３と接触させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞を、Ａｋｔタンパク質の阻害剤（例えば、ＧＳＫ－６９０６９３）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。

【0147】

[00154]一部の実施形態では、本方法は、幹細胞の集団を適切な濃度のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。例えば、一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、約０．０７μＭ～約０．１５μＭ、または約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０４μＭ、０．０６μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１２μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、または１μＭのＧＳＫ－６９０６９３、その類似体または誘導体と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。

【0148】

[00155]一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を約１ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのＢＹＬ７１９、その類似体または誘導体と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。

【0149】

[00156]一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．０２μＭ～約０．８μＭ、約０．０５μＭ～約０．５μＭ、約０．０６μＭ～約０．２μＭ、または約０．０７μＭ～約０．１５μＭのＧＳＫ－６９０６９３、および約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、または約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と、例えば、約０．０８μＭ～約０．１２μＭのＧＳＫ－６９０６９３および約３５ｎＭ～約５０ｎＭのＢＹＬ７１９と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。

【0150】

[00157]一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を適切な濃度、例えば、約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、または約２００μＭのＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の集団を、０．５～１０μＭ、１～１０μＭ、１～７μＭ、１～５μＭ、２～４μＭ、または２．５～３．５μＭの適切な濃度のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触させるステップによって、幹細胞をＳｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）に分化させるステップを含む。

【0151】

[00158]幹細胞を（例えば、単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤および／もしくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。多能性幹細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子および／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができる任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、本明細書で提供する方法において使用することができる。一部の事例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ ６９３８６８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、またはＴＷＳ １１９を含む。一部の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の事例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質、またはその機能性バリアントを含む。

【0152】

[00159]一部の例では、本方法は、幹細胞の集団を、適切な濃度、例えば約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、もしくは約１００ｎｇ／ｍＬ、または約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップによって、幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるために、約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを使用することを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるために約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを使用することを含む。一部の事例では、本方法は、幹細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～４００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、１０～１２０ｎｇ／ｍＬ、９０～１２０ｎｇ／ｍＬ、９５～１０５ｎｇ／ｍＬ、１～２０ｎｇ／ｍＬ、５～２５ｎｇ／ｍＬ、５～５０ｎｇ／ｍＬ、１０～５０ｎｇ／ｍＬ、５～１５ｎｇ／ｍＬ、または８～１２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。

【0153】

[00160]一部の事例では、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）は、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む組成物中で約２４時間～約９６時間、約３６時間～約８４時間、約４８時間～約８４時間、約６０時間～約８４時間、例えば、約１日、約２日、または約３日間培養するステップによって得ることができる。一部の事例では、Ｓｏｘ１７陽性細胞（例えば、胚体内胚葉細胞）は、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）を含む組成物中で約２４時間～約９６時間、約３６時間～約８４時間、約４８時間～約８４時間、約６０時間～約８４時間、例えば約１日、約２日、約３日間培養するステップによって得ることができる。

【0154】

[00161]一部の事例では、本方法は、幹細胞を処置する２段階プロトコールを含む。例えば、本方法は、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤およびＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤を含む第１の組成物中で１２時間～４８時間、１２時間～３６時間、１８時間～３０時間、または約１日間培養するステップを含み得る。本方法は、第１の組成物中で培養するステップに続いて、得られた細胞集団を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含む第２の組成物中で１２時間～７２時間、２４時間～７２時間、または３６時間～７２時間、例えば、約１日、または約２日間培養するステップをさらに含み得る。

【0155】

[00162]一部の事例では、集団における少なくとも一部の幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップは、幹細胞の集団を、ｉ）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と適切な期間、例えば、約１日間接触させ、続いて得られた細胞の集団を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤と適切な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日間接触させて、集団における幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉細胞への分化を誘導するプロセスによって達成され、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカー、例えば、Ｓｏｘ１７を発現する。

【0156】

[00163]一部の事例では、集団における少なくとも一部の幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップは、幹細胞の集団を、ｉ）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤、ｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１、およびｉｉｉ）アクチビンＡと適切な期間、例えば、約１日間接触させ、続いて得られた細胞の集団を、ｉ）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの阻害剤、およびｉｉ）アクチビンＡと適切な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日間接触させて、集団における幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉細胞への分化を誘導するプロセスによって達成され、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカー、例えば、Ｓｏｘ１７を発現する。

【0157】

[00164]一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、Ｎｏｄａｌ、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｄｎ５、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、少なくとも１つのマーカーの発現は、それが由来される多能性幹細胞に対して、胚体内胚葉細胞において統計学的に有意な量で上方制御される。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、およびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが由来される多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、Ｚｉｃ１、Ｐａｘ６、Ｆｌｋ１、およびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが由来される多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、それが由来される多能性幹細胞に対して統計的に有意な量でより高いレベルのＳｍａｄ２のホスホリル化を有する。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腸管を形成する能力を有する。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞に分化することができ、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞は、ＦｏｘＡ２および／またはＣｌａｕｄｉｎ６を発現する。一部の事例では、本明細書で開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、内胚葉起源の細胞にさらに分化することができる。

【0158】

[00165]一部の事例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも、または分化の第１段階の間に、少なくとも１つのβ細胞分化因子の存在下に培養される。任意の多能性幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞もしくはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じた任意の多能性幹細胞もしくはその他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部の事例では、本明細書に記載したβ細胞分化因子は多能性幹細胞の集団の培地中に存在してよく、または多能性幹細胞の集団の成長（例えば複製または増加）の間に一度にまたは定期的に添加してよい。ある特定の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。他の例では、多能性幹細胞の集団は、分化の第１段階の間に少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。

【0159】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞の分化
[00166]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数のＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップによる、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞（例えば、原腸管細胞）の分化に関する。一部の実施形態では、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、ＰＤＸ１陽性細胞（例えば、ＰＤＸ１陽性細胞、ＮＫＸ６．１陰性細胞、例えば、膵前駆細胞１細胞）を含む細胞の集団の産生をもたらす。

【0160】

[00167]一部の事例では、本明細書で開示される方法は、複数のＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤ならびにｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させるステップを含む。一部の事例では、本明細書で開示される方法は、複数のＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞を、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を用いずに、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤ならびにｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるステップを含む。

【0161】

[00168]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させて、原腸管細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって、集団における原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができる。

【0162】

[00169]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができる。

【0163】

[00170]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができる。

【0164】

[00171]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤；およびｉｉｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させることによって得ることができる。

【0165】

[00172]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化誘導することによって得ることができる。

【0166】

[00173]一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞（例えば原腸管細胞）の、ＰＤＸ１陽性細胞への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含まない参照方法と比較した場合に、減少された量のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を利用する。例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の存在下で、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、培養物におけるＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞（例えば原腸管細胞）の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（例えば、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、または５０～６０％）の、ＰＤＸ１陽性細胞への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の多くとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％の濃度で適用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、培養物におけるＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性細胞（例えば原腸管細胞）の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（例えば、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、または５０～６０％）の、ＰＤＸ１陽性細胞への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、または０％の濃度で適用することができる。

【0167】

[00174]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させるように誘導することが可能なＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の成長因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せで）を使用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の事例では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はアクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２７ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約２９ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬなどの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の濃度は、５～５０ｎｇ／ｍＬ、１５～３０ｎｇ／ｍＬ、１２～２８ｎｇ／ｍＬ、１５～２５ｎｇ／ｍＬ、または１８～２２ｎｇ／ｍＬである。

【0168】

[00175]一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で、本方法は、原腸管細胞を、減少された濃度、例えば、多くとも約５ｎｇ／ｍＬ、多くとも約２．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、または０．０５ｎｇ／ｍＬ、例えば、約２．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、または０．０５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の濃度は、０．５～５ｎｇ／ｍＬ、１．５～３ｎｇ／ｍＬ、１．２～２．８ｎｇ／ｍＬ、１．５～２．５ｎｇ／ｍＬ、または１．８～２．２ｎｇ／ｍＬである。

【0169】

[00176]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せで）は、本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の事例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１１８９）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、約３．２５μＭ、約３．５μＭ、約３．７５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ－１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、５０～１０００ｎＭ、５０～５００ｎＭ、５０～３００ｎＭ、１００～３００ｎＭ、２００～３００ｎＭ、２００～５００ｎＭ、または２２５～２７５ｎＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ－１）と接触させるステップを含む。

【0170】

[00177]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能なＦＧＦファミリーからの任意の成長因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せで）を使用することができる。一部の事例では、少なくとも１つのＦＧＦファミリーからの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の事例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、２５～７５ｎｇ／ｍＬ、４０～６０ｎｇ／ｍＬ、または４５～５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させるステップを含む。

【0171】

[00178]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せで）を使用することができる。一部の事例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、５０～１０００ｎＭ、５０～５００ｎＭ、５０～３００ｎＭ、１００～３００ｎＭ、２００～３００ｎＭ、２００～５００μＭ、または２２５～２７５ｎＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させるステップを含む。

【0172】

[00179]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の事例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、０．２～５μＭ、０．８～３μＭ、０．８～２．５μＭ、１～２．５μＭ、１．５～２．２μＭ、１．８～２．２μＭ、または１．９～２．１μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0173】

[00180]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＰＫＣ活性化剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せで）を使用することができる。一部の事例では、ＰＫＣ活性化剤はＰｄＢＵを含む。一部の事例では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＢを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約１００μＭ、約１２０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１７５μＭ、約１８０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２４０μＭ、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２８０μＭ、約３００μＭ、約３２０μＭ、約３４０μＭ、約３６０μＭ、約３８０μＭ、約４００μＭ、約４２０μＭ、約４４０μＭ、約４６０μＭ、約４８０μＭ、約５００μＭ、約５２０μＭ、約５４０μＭ、約５６０μＭ、約５８０μＭ、約６００μＭ、約６２０μＭ、約６４０μＭ、約６６０μＭ、約６８０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、原腸管細胞を、１０ｎＭ～１ｍＭ、１０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～１μＭ、１０～８００ｎＭ、１００～９００ｎＭ、３００～８００ｎＭ、３００～６００ｎＭ、４００～６００ｎＭ、４５０～５５０ｎＭ、または約５００ｎＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、原腸管細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）で処置されない。

【0174】

[00181]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の事例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の事例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の事例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を０．２～５μＭ、０．８～３μＭ、１～４μＭ、１．５～４μＭ、１．８～３．５μＭ、２～３μＭ、２．４～２．６μＭなどの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させることを含む。

【0175】

[00182]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと適切な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、約４日間、１８～７２時間、３６～６０時間、４０～５４時間、または４４～５２時間接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップによって、得ることができる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと約２日間接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、少なくとも一部の原腸管細胞をＳ３培地中で分化させるステップによって得ることができる。

【0176】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の分化
[00183]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップによる、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）の分化に関する。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と接触させるステップは、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞（例えば、膵前駆細胞２細胞）を含む細胞の集団が産生をもたらす。

【0177】

[00184]一部の事例では、本明細書で開示される方法は、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤ならびにｉ）ＦＧＦファミリーから少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、任意選択で、ｖｉ）プロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させるステップを含む。一部の事例では、本明細書で開示される方法は、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）を、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を用いずに、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤ならびにｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、および任意選択で、ｖ）プロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0178】

[00185]一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞（例えば、膵前駆細胞２細胞）への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤を含まない参照方法と比較した場合に、減少された量のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を利用する。例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の存在下で、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、培養物におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（例えば、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、６０～９０％、６０～８０％、または７０～９０％）の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞（例えば、膵前駆細胞２細胞）への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の多くとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％の濃度で適用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）は、培養物におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞（例えば、膵前駆細胞１細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（例えば、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、６０～９０％、６０～８０％、または７０～９０％）の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞（例えば、膵前駆細胞２細胞）への分化のためにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤の非存在下で適用される濃度の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、または０％の濃度で適用することができる。

【0179】

[00186]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞から生成する方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば、細胞クラスター化を促進し、および／または細胞生存を促進する条件下で）、ａ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択で、ｃ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞分化因子と接触させて、集団における少なくとも１つのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップを含む。

【0180】

[00187]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって得られる。

【0181】

[00188]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させて、培養物におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（例えば、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、６０～９０％、６０～８０％、または７０～９０％）の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって得られる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）と接触される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０２１０２３８５５３Ａ１号、および米国特許出願公開第２０２２０１４３３７４Ａ１号を参照されたい。

【0182】

[00189]ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、および少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤との任意の組合せで）を本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の事例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の事例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、２５～７５ｎｇ／ｍＬ、４０～６０ｎｇ／ｍＬ、または４５～５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させるステップを含む。

【0183】

[00190]ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子との任意の組合せで）を本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の事例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、例えば、約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、例えば、５０～１０００ｎＭ、５０～５００ｎＭ、５０～３００ｎＭ、１００～３００ｎＭ、２００～３００ｎＭ、２００～５００ｎＭ、または２２５～２７５ｎＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させるステップを含む。

【0184】

[00191]ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の事例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、１～５００ｎＭ、５０～４００ｎＭ、５０～２５０ｎＭ、５０～１５０ｎＭ、８０～２００ｎＭ、７５～１２５ｎＭ、または９０～１１０ｎＭなどの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させることを含む。

【0185】

[00192]ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の事例では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、または１４－１１５２を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、０．２～５μＭ、０．８～３μＭ、１～４μＭ、１．５～４μＭ、１．８～３．５μＭ、２～３μＭ、２．４～２．６μＭなどの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させることを含む。

【0186】

[00193]ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の活性化剤を使用することができる。一部の事例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの活性化剤は、アクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の濃度、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２ｎｇ／ｍＬ、約１．４ｎｇ／ｍＬ、約１．６ｎｇ／ｍＬ、約１．８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２ｎｇ／ｍＬ、約２．４ｎｇ／ｍＬ、約２．６ｎｇ／ｍＬ、約２．８ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．２ｎｇ／ｍＬ、約３．４ｎｇ／ｍＬ、約３．６ｎｇ／ｍＬ、約３．８ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．２ｎｇ／ｍＬ、約４．４ｎｇ／ｍＬ、約４．６ｎｇ／ｍＬ、約４．８ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約５．２ｎｇ／ｍＬ、約５．４ｎｇ／ｍＬ、約５．６ｎｇ／ｍＬ、約５．８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６．２ｎｇ／ｍＬ、約６．４ｎｇ／ｍＬ、約６．６ｎｇ／ｍＬ、約６．８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、約５ｎｇ／ｍＬなどの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の濃度は、１～１５ｎｇ／ｍＬ、３～１２ｎｇ／ｍＬ、５～１２ｎｇ／ｍＬ、５～２０ｎｇ／ｍＬ、８～２０ｎｇ／ｍＬ、８～１５ｎｇ／ｍＬ、９～１１ｎｇ／ｍＬ、または８～１２ｎｇ／ｍＬである。

【0187】

[00194]一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で、本方法は、原腸管細胞を、例えば、多くとも約２０ｎｇ／ｍＬ、多くとも約１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、または０．１ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、または０．１ｎｇ／ｍＬの減少された濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の濃度は、０．１～１．５ｎｇ／ｍＬ、０．３～１．２ｎｇ／ｍＬ、０．５～１．２ｎｇ／ｍＬ、０．５～２．０ｎｇ／ｍＬ、０．８～２．０ｎｇ／ｍＬ、０．８～１．５ｎｇ／ｍＬ、０．９～１．１ｎｇ／ｍＬ、または０．８～１．２ｎｇ／ｍＬである。

【0188】

[00195]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡ、ならびに任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と５日または６日間または９６～１７０時間、１２０～１７０時間、１３０～１６０時間、または１４０～１５０時間接触させるステップによって得られる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡ、ならびに任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と５日または６日間または９６～１７０時間、１２０～１７０時間、１３０～１６０時間、または１４０～１５０時間接触させるステップによって得られる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦと５日または６日間または９６～１７０時間、１２０～１７０時間、１３０～１６０時間、または１４０～１５０時間接触させるステップによって得られる。一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、Ｓ４培地中でＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞と接触させるステップによって得られる。

【0189】

[00196]一部の事例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡ、ならびに任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤と５または６日間または９６～１７０時間、１２０～１７０時間、１３０～１６０時間、または１４０～１５０時間接触させるステップによって得られる。

【0190】

幹細胞由来β細胞を産生する方法
[00197]ＳＣ－β細胞（例えば、非天然膵β細胞）を産生する方法が本明細書で提供される。少なくとも１つのＳＣ－β細胞を提供するために幹細胞から内分泌細胞を生成する詳細なプロトコールの例は、それら各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５０２４０２１２号、米国特許出願公開第２０１５０２１８５２２号、米国特許出願公開第２０２１０１９８６３２Ａ１号、米国特許出願公開第２０２１０２３８５５３Ａ１号、および米国特許出願公開第２０２２０１４３３７４Ａ１号に記載されている。

【0191】

[00198]内胚葉は消化管および呼吸管、甲状腺、肝臓、ならびに膵を生じることができる。内胚葉系統の代表的な疾患としてはインスリンを生成するβ細胞の破壊に起因する１型糖尿病がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの機能性β細胞の産生は、１型糖尿病の置換細胞療法のための実際的で更新可能な細胞源になり得る。芽球段階の胚の内部細胞集塊から産生される胚幹（ＥＳ）細胞は、損傷された任意の細胞の移植または細胞に基づく療法のための有望な細胞源を表している。これらは培地中に維持され、それ自体で更新され、未分化ＥＳ細胞として無限に増殖することができる。ＥＳ細胞は外胚葉、中胚葉、および内胚葉の系統細胞または組織として、生体の全ての細胞型に分化することができる。ＥＳ細胞の主な利点は培地中での安定な自己更新および分化の可能性である。

【0192】

[00199]胚体内胚葉は胚発生の原腸形成のプロセスによってｉｎ ｖｉｖｏで内部細胞集塊から産生され、このプロセスで胚盤葉上層細胞が３つの胚葉を形成するように指令される。胚体内胚葉は膵β細胞、肝臓の肝細胞、肺の肺胞細胞、甲状腺、胸腺、ならびに栄養管および呼吸管の上皮ライニング等の生命臓器に寄与する多様な細胞および組織を生じることができる。これは、臓側および壁側内胚葉を生じることができる胚体外組織の原始内胚葉とは異なる。ＥＳ細胞から得られた胚体内胚葉は、理論的には任意の内胚葉誘導体になることができ、ＥＳ細胞を内胚葉系統に導くことは治療用の内胚葉誘導体を産生させるための必須要件である。

【0193】

[00200]胚体内胚葉の前後軸の正確なパターニングによって、最終的には原腸管が形成され得る。胚体内胚葉由来の原腸管は、前後軸に沿って咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、および大腸、ならびに膵、肺、甲状腺、胸腺、副甲状腺、および肝臓等の関連する臓器を誘導する。原腸管の前腸の前部は肺、甲状腺、食道、および胃になる。膵、肝臓、および十二指腸は、前腸の後部から起源する。原腸管の中腸および後腸は小腸および大腸を生じる。前腸の前部は発生マーカー、ＮＫ２ホメオボックス（ＮＫＸ２－１）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－ボックス２（ＳＯＸ２）を発現し、前腸の後部は造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、膵および十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）、ワンカットホメオボックス１（ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＦ６として公知である）、ならびに肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）を発現し、中腸／後腸は尾型ホメオボックス１（ＣＤＸ１）、尾型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、ならびに運動ニューロンおよび膵のホメオボックス１（ＭＮＸ１）を発現する。

【0194】

[00201]膵β細胞の分化の成功には、分化した細胞が生理学的に適切な量のインスリンを合成し分泌することが必要である。ｈＰＳＣ細胞分化を指向する例示的な段階的プロトコールが開発され、正常な膵内分泌発生の主要段階を反復する分化プロセスを伴う。ｈＰＳＣ細胞のホルモンを発現する膵内分泌細胞への分化は、胚発生の主要なステージ；中胚葉および胚体内胚葉への分化、原腸内胚葉の樹立、後部前腸のパターン形成、ならびに膵内胚葉および内分泌前駆体細胞の特定および成熟を通してｈＰＳＣ細胞を移行させることによって行われる。これらの段階を通じて、ｈＰＳＣ細胞は膵内分泌表現型およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグルコース応答インスリン分泌の能力を得ることができる。

【0195】

[00202]概して、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体、例えば、本明細書で開示される方法に従って生成される膵前駆細胞は、異なる細胞の混合物または組合せ、例えば、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞、ＰＤＸ１とＮＫＸ６－１を共発現する膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、もしくはβ様細胞）、および／または他の多能性もしくは幹細胞などの細胞の混合物を含み得る。

【0196】

[00203]少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階に分化する任意の適切な培養プロトコールに従って生成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、少なくとも１つの多能性細胞が少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体に分化するために適した時間および条件下で少なくとも１個の多能性細胞を培養するステップによって生成される。

【0197】

[00204]一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、実質的に純粋な膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団である。一部の実施形態では、膵臓α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は、多能性細胞または分化細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は胚幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないか、それらを欠いている。

【0198】

[00205]一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は、対象から、例えば組織生検、例えば皮膚生検として単離することができ、本明細書に記載した組成物および方法における使用のための少なくとも１つのＳＣ－β細胞またはその前駆体を生成するためのさらなる分化のための人工多能性幹細胞に再プログラミングすることができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって膵α、βおよび／またはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0199】

[00206]一部の実施形態では、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって膵α、βおよび／またはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0200】

[00207]さらに、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体、例えば、膵前駆体は、任意の哺乳動物種からのものであってもよく、非限定的な例には、ネズミ、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ単純にするため、本明細書における方法の説明は哺乳動物の少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体を指すが、本明細書に記載した方法の全ては少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の他の細胞型に容易に適用できることを理解されたい。一部の実施形態では、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、ヒト個体に由来する。

【0201】

胚体内胚葉細胞
[00208]本開示の態様には胚体内胚葉細胞が含まれる。本明細書で使用する胚体内胚葉細胞は、任意の供給源から得られるか、またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤などの小分子化合物の使用を含む本明細書で開示される方法を含む任意の適切なプロトコールに従って産生され得る。

【0202】

[00209]胚体内胚葉は胚発生の原腸形成のプロセスによってｉｎ ｖｉｖｏで内部細胞集塊から産生され、このプロセスで胚盤葉上層細胞が３つの胚葉層を形成するように指令される。胚体内胚葉は膵β細胞、肝臓の肝細胞、肺の肺胞細胞、甲状腺、胸腺、ならびに栄養管および呼吸管の上皮ライニング等の生命臓器に寄与する多様な細胞および組織を生じることができる。これは、臓側および壁側内胚葉を生じることができる胚体外組織の原始内胚葉とは異なる。ＥＳ細胞から得られた胚体内胚葉は、理論的には任意の内胚葉誘導体になることができる。

【0203】

[00210]胚体内胚葉の前後軸の正確なパターニングによって、最終的には原腸管が形成され得る。胚体内胚葉によって誘導された原腸管は、前後軸に沿って咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、および大腸、ならびに膵、肺、甲状腺、胸腺、副甲状腺、および肝臓等の関連する臓器を誘起する。原腸管の前腸の前部は肺、甲状腺、食道、および胃になる。膵、肝臓、および十二指腸は、前腸の後部から起源する。原腸管の中腸および後腸は小腸および大腸を生じる。前腸の前部は発生マーカー、ＮＫ２ホメオボックス（ＮＫＸ２－１）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－ボックス２（ＳＯＸ２）を発現し、前腸の後部は造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、膵および十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）、ワンカットホメオボックス１（ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＦ６として公知である）、および肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）を発現し、中腸／後腸は尾型ホメオボックス１（ＣＤＸ１）、尾型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、ならびに運動ニューロンおよび膵のホメオボックス１（ＭＮＸ１）（３、１９、２０）を発現する。

【0204】

[00211]本明細書の記載されるように、本明細書で使用する胚体内胚葉細胞は、任意の供給源に由来するか、または任意の適切なプロトコールに従って産生することができる。一部の態様では、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは内胚葉細胞に分化される。一部の態様では、内胚葉細胞（ステージ１）は、例えば、原腸管細胞（ステージ２）、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞（ステージ３）、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞（ステージ４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（ステージ５）にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘導されるかまたは成熟される（ステージ６）。

【0205】

[00212]一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、例えば、多能性細胞の集団をｉ）少なくとも１つのＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子およびｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させて多能性細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉細胞への分化を誘導するステップによって、集団における少なくとも一部の多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。

【0206】

[00213]多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤との組合せで）は、本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子との組合せで）は、本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤はＷｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。

【0207】

[00214]一部の実施形態では、集団における少なくとも一部の多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化するステップは、多能性細胞の集団をｉ）アクチビンＡ、およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と適切な期間、例えば約２日、約３日、約４日、または約５日間接触させて集団における多能性細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉細胞への分化を誘導するプロセスによって達成され、ここで、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。一部の実施形態では、本プロセスは、多能性細胞の集団を、アクチビンＡおよびＣＨＩＲ９９０２１と１日間、続いてアクチビンＡと（ＣＨＩＲ９９０２１の非存在下で）さらに１日または２日間接触させるステップを含む。

【0208】

[00215]一部の例では、本方法は、多能性細胞を、適切な濃度、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約７０～１３０ｎｇ／ｍｌ、８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、または９０～１１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。

【0209】

[00216]一部の例では、本方法は、多能性細胞を、適切な濃度、例えば、約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、または約２００μＭのＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させるステップによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約１～５μＭまたは２～４μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、多能性細胞の、胚体内胚葉細胞への分化のための約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。

【0210】

[00217]一部の実施形態では、細胞は、水溶性合成ポリマーとさらに接触される。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の事例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば、７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコールは、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解される。一部の実施形態では、ＰＶＡは８０％が加水分解されている。

【0211】

[00218]一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｎｏｄａｌ、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｄｎ５、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、少なくとも１つのマーカーの発現は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して、胚体内胚葉細胞において統計学的に有意な量で上方制御される。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、およびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成された胚体内胚葉細胞は、由来となった多能性幹細胞と比較して、Ｚｉｃ１、Ｐａｘ６、Ｆｌｋ１およびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを統計的に有意な量発現しない。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対してより高いレベルのＳｍａｄ２のホスホリル化を統計的に有意な量で有する。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腸管を形成する能力を有する。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞に分化することができ、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞はＦｏｘＡ２および／またはＣｌａｕｄｉｎ６を発現する。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、内胚葉起源の細胞にさらに分化することができる。

【0212】

[00219]一部の実施形態では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも、または分化の第１段階の間に、少なくとも１つのβ細胞分化因子の存在下で培養される。任意の多能性幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞もしくはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じた任意の多能性幹細胞もしくはその他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載したβ細胞分化因子は多能性幹細胞の集団の培地中に存在してよく、または多能性幹細胞の集団の成長（例えば複製または増加）の間に一度にまたは定期的に添加してよい。ある特定の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。他の例では、多能性幹細胞の集団は、分化の第１段階の間に少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。

【0213】

原腸管細胞
[00220]本開示の態様には原腸管細胞が含まれる。本明細書において使用する原腸管細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、胚体内胚葉細胞は原腸管細胞に分化される。一部の態様では、原腸管細胞は、例えばＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘導されまたは成熟する。

【0214】

[00221]一部の実施形態では、原腸管細胞は、例えば胚体内胚葉細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子と接触させて胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の、原腸管細胞への分化を誘導することによって、集団における少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、原腸管細胞は原腸管細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。

【0215】

[00222]胚体内胚葉細胞を（例えば単独で、または他の因子と組み合わせて）誘起して原腸管細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ８Ｂを含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ１０を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２１を含む。

【0216】

[00223]一部の実施形態では、原腸管細胞は、例えば胚体内胚葉細胞を、ＫＧＦとある特定の期間、例えば約１日、約２日、約３日、または約４日、２４～９６時間、５０～８０時間、６０～８０時間、または６５～７５時間接触させて、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の、原腸管細胞への分化を誘導することによって、集団における少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させるステップによって得ることができる。

【0217】

[00224]一部の実施形態では、本方法は、胚体内胚葉細胞を、適切な濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップによって胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。一部の実施形態では、本方法は、胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。

【0218】

[00225]一部の実施形態では、細胞をさらに水溶性合成ポリマーと接触させる。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは、８０％が加水分解されている。

【0219】

[00226]一部の実施形態では、細胞は、本明細書で開示されるようなＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤のいずれかと接触される。
ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞
[00227]本開示の態様にはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞が含まれる。本明細書で使用するＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、任意の供給源から得られまたはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤などの小分子化合物の使用を含む本明細書で開示される方法を含む任意の適切なプロトコールに従って産生され得る。

【0220】

[00228]一部の態様では、原腸管細胞はＰＤＸ１陽性膵前駆細胞（例えば、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６，１陰性細胞）へ分化される。一部の態様では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＮＫＸ６．１陰性であり、例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性の内分泌前駆細胞、インスリン陽性の内分泌細胞にさらに分化することができ、続いてＳＣ－β細胞への誘導または成熟を可能にする。

【0221】

[00229]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させて、原腸管細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0222】

[00230]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0223】

[00231]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0224】

[00232]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｉｉｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0225】

[00233]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて、原腸管細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができ、ここで、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0226】

[00234]原腸管細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、約３．２５μＭ、約３．５μＭ、約３．７５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ－１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、約２２０～２８０ｎＭ、約２３０～２７０ｎＭ、約２４０～２６０ｎＭ、または約２４５～２５５ｎＭなどの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を約２５０ｎＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１）と接触させることを含む。

【0227】

[00235]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能なＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の成長因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤との組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２７ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約２９ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、例えば、約１７～２３ｎｇ／ｍｌ、約１８～２２ｎｇ／ｍｌ、または約１９～２１ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。

【0228】

[00236]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性性の膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｍ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、約２０～８０ｎｇ／ｍｌ、約３０～７０ｎｇ／ｍｌ、約４０～６０ｎｇ／ｍｌ、または約４５～５５ｎｇ／ｍｌなどの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を約５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させることを含む。

【0229】

[00237]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、約２２０～２８０ｎＭ、約２３０～２７０ｎＭ、約２４０～２６０ｎＭ、または約２４５～２５５ｎＭなどの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させること含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を約２５０ｎＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させることを含む。

【0230】

[00238]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤との組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、例えば、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、約２μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0231】

[00239]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と任意に組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＰＫＣ活性化剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＰｄＢＵを含む。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＰＢを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、約１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約１００μＭ、約１２０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１７５μＭ、約１８０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２４０μＭ、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２８０μＭ、約３００μＭ、約３２０μＭ、約３４０μＭ、約３６０μＭ、約３８０μＭ、約４００μＭ、約４２０μＭ、約４４０μＭ、約４６０μＭ、約４８０μＭ、約５００μＭ、約５２０μＭ、約５４０μＭ、約５６０μＭ、約５８０μＭ、約６００μＭ、約６２０μＭ、約６４０μＭ、約６６０μＭ、約６８０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭなどの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、１０ｎＭ～１ｍＭ、１０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～１μＭ、１０～８００ｎＭ、１００～９００ｎＭ、３００～８００ｎＭ、３００～６００ｎＭ、４００～６００ｎＭ、４５０～５５０ｎＭ、または約５００ｎＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を約４５０～５５０ｍＭ、約４７５～５２５ｎＭ、約４９０～５１０ｎＭ、または約４９５～５０５ｎＭなどの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を約５００ｎＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、原腸管細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）で処理されない。

【0232】

[00240]原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤との組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、例えば、約２．２～２．８μＭ、約２．３～２．７μＭ、または約２．４～２．６μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸細胞を、約２．５μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。

【0233】

[00241]一部の実施形態では、細胞は、水溶性合成ポリマーとさらに接触される。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の事例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば、７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは８０％が加水分解されている
[00242]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと適切な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、または約４日接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと約２日間接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えば、原腸管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと１日間接触させるステップ、続く細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと１日間（ＤＭＨ－１の非存在下で）接触させるステップによって、集団における少なくとも一部の原腸管細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップによって得ることができる。

【0234】

ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞
[00243]本開示の態様にはＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞が含まれる。本明細書で使用するＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、任意の供給源から得られまたはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤などの小分子化合物の使用を含む本明細書で開示される方法を含む任意の適切なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化される。一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、例えば、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘導されるかまたは成熟される。

【0235】

[00244]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞から生成する方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば細胞クラスター化を促進しおよび／または細胞の生存を促進する条件下で）、ａ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択で、ｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞分化因子と接触させて、集団における少なくとも１つのＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップを含む。

【0236】

[00245]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって得られ、ここで、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現する。

【0237】

[00246]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させて、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘導するステップによって得られる。一部の実施形態では、３、４または５日の接触させるステップに続いて、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させるステップによって得られ、続いて細胞は、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触される。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。

【0238】

[00247]一部の実施形態では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む第１の細胞集団を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子のいずれか１つまたは組合せを含む培地中で約１、２、３、４または５日間（例えば、２～４日間、３～４日間、または４～５日間）培養し、それによって第２の細胞集団を産生する方法を提供する。一部の実施形態では、次に、第２の細胞集団は、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｖｉ）ＰＫＣ活性化剤、ｖｉｉ）ＦｏｘＯ１阻害剤、および任意選択でｖｉｉｉ）ノッチシグナル伝達阻害剤のうちのいずれか１つまたは組合せを含む組成物中で約１、２、または３日間（例えば、１～２日間、１～３日間、または２～３日間）インキュベートされる。

【0239】

[00248]一部の実施形態では、細胞の第１の集団を培養するための培地中に、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、約４５～５５ｎｇ／ｍｌ、約４６～５４ｎｇ／ｍｌ、約４７～５３ｎｇ／ｍｌ、約４８～５２ｎｇ／ｍｌ、または約４９～５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＳＨＨ経路阻害剤は、約２００～３００ｎＭ、約２２０～２８０ｎＭ、または約２４０～２６０ｎＭの濃度で存在し、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭの濃度で存在し、ＲＯＣＫ阻害剤は、約２～３μＭ、約２．２～２．８μＭ、または約２．４～２．６μＭの濃度で存在し、および／またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、約２～８ｎｇ／ｍｌ、約３～７ｎｇ／ｍｌまたは約４～６ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0240】

[00249]一部の実施形態では、細胞の第２の集団を培養するための培地中に、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、約４５～５５ｎｇ／ｍｌ、約４６～５４ｎｇ／ｍｌ、約４７～５３ｎｇ／ｍｌ、約４８～５２ｎｇ／ｍｌ、または約４９～５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＳＨＨ経路阻害剤は、約２００～３００ｎＭ、約２２０～２８０ｎＭ、または約２４０～２６０ｎＭの濃度で存在し、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭの濃度で存在し、ＲＯＣＫ阻害剤は、約２～３μＭ、約２．２～２．８μＭ、または約２．４～２．６μＭの濃度で存在し、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、約２～８ｎｇ／ｍｌ、約３～７ｎｇ／ｍｌまたは約４～６ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＰＫＣ活性化剤は、約０．２～０．８μＭ、約０．３～０．７μＭ、または約０．４～０．６μＭの濃度で存在し、ＦｏｘＯ１阻害剤は、約０．７～１．３μＭ、約０．８～１．２μＭ、または約０．９～１．１μＭの濃度で存在し、任意選択で、ノッチシグナル伝達阻害剤は、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭの濃度で存在し、または約１．９～２．１μＭの濃度で存在する。

【0241】

[00250]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は多能性細胞集団から生成される。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はｉＰＳ細胞集団から生成される。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＥＳＣ細胞集団から生成される。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、胚体内胚葉細胞集団から生成される。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、原腸管細胞集団から生成される。

【0242】

[00251]ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、および少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約２０～８０ｎｇ／ｍｌ、約３０～７０ｎｇ／ｍｌ、約４０～６０ｎｇ／ｍｌ、または約４５～５５ｎｇ／ｍｌなどの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦファミリーからの成長因子（例えば、ＫＧＦ）と接触させることを含む。

【0243】

[00252]ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約２２０～２８０ｎＭ、約２３０～２７０ｎＭ、約２４０～２６０ｎＭ、または約２４５～２５５ｎＭなどの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を約２５０ｎＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させることを含む。

【0244】

[00253]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子の任意の組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約７０～１３０ｎＭ、約８０～１２０ｎＭ、約９０～１１０ｎＭ、または約９５～１０５ｎＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、約１００ｎＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0245】

[00254]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能な任意のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子との組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約２．２～２．８μＭ、約２．３～２．７μＭ、または約２．４～２．６μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、約２．５μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させるステップを含む。

【0246】

[00255]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるよう誘導することが可能なＴＧＦ－βスーパーファミリーからの活任意の性化剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤との組合せで）を使用することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの活性化剤は、アクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２ｎｇ／ｍＬ、約１．４ｎｇ／ｍＬ、約１．６ｎｇ／ｍＬ、約１．８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２ｎｇ／ｍＬ、約２．４ｎｇ／ｍＬ、約２．６ｎｇ／ｍＬ、約２．８ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．２ｎｇ／ｍＬ、約３．４ｎｇ／ｍＬ、約３．６ｎｇ／ｍＬ、約３．８ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．２ｎｇ／ｍＬ、約４．４ｎｇ／ｍＬ、約４．６ｎｇ／ｍＬ、約４．８ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約５．２ｎｇ／ｍＬ、約５．４ｎｇ／ｍＬ、約５．６ｎｇ／ｍＬ、約５．８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６．２ｎｇ／ｍＬ、約６．４ｎｇ／ｍＬ、約６．６ｎｇ／ｍＬ、約６．８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約２～８ｎｇ／ｍｌ、約３～７ｎｇ／ｍｌ、約４～６ｎｇ／ｍｌ、または約４．５～５．５ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）と接触させるステップを含む。

【0247】

[00256]ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＰＫＣ活性化剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤と任意に組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＦｏｘＯ１阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＦｏｘＯ１阻害剤はＡＳ１８４２８５６である。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭなどの濃度のＦｏｘＯ１阻害剤（例えば、ＡＳ１８４２８５６）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約０．７～１．３μＭ、約０．８～１．２μＭ、約０．９～１．１μＭなどの濃度のＦｏｘＯ１阻害剤（ＡＳ１８４２８５６など）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を約１μＭなどの濃度のＦｏｘＯ１阻害剤（ＡＳ１８４２８５６など）と接触させることを含む。

【0248】

[00257]ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーシグナル伝達経路からの少なくとも１つの成長因子、ＦｏｘＯ１阻害剤、およびノッチシグナル伝達阻害剤と任意に組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のＰＫＣ活性化剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵである。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．２～０．８μＭ、約０．３～０．７μＭ、約０．４～０．６μＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、例えば、約０．５μＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）と接触させるステップを含む。

【0249】

[00258]ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＦｏｘＯ１阻害剤、およびＰＫＣ活性化剤と任意に組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることができる任意のノッチシグナル阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態では、ノッチシグナル伝達阻害剤はＸＸＩである。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭなどの濃度のノッチシグナル阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭなどの濃度のノッチシグナル阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を約２μＭなどの濃度のノッチシグナル阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させることを含む。

【0250】

[00259]一部の実施形態では、細胞をさらに水溶性合成ポリマーと接触させる。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは、８０％が加水分解されている。

【0251】

[00260]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡと５日または６日間接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと５または６日間接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦと５日間接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でＫＧＦと６日間接触させるステップによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、ａ）ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと３、４または５日間（例えば、４日間）接触させるステップ、続くｂ）ａ）の細胞を、ＰＤＢＵ、ＸＸＩ、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡ、および任意選択で、ＡＳ１８４２８５６と１、２または３日間（例えば、２日間）接触させるステップによって得られる。

【0252】

インスリン陽性の内分泌細胞
[00261]本開示の態様は、インスリン陽性の内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞）、およびインスリン陽性の内分泌細胞を産生する付加的な方法を伴う。本明細書において使用するインスリン陽性内分泌細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞はインスリン陽性内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞）に分化される。一部の態様では、インスリン陽性内分泌細胞は、例えばＳＣ－β細胞への誘起または成熟によってさらに分化される。

【0253】

[00262]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞からインスリン陽性の内分泌細胞を生成する方法は、ＮＫＸ６－ｌ陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を（例えば、細胞クラスター化を促進する条件下で）、ａ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｃ）ＢＭＰ経路阻害剤、および／またはｄ）プロテインキナーゼ阻害剤と接触させて、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導することを含み、インスリン陽性の内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の実施形態では、インスリン陽性内分泌細胞はＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、および／またはインスリンを発現する。

【0254】

[00263]ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えば甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ－βＩ型受容体キナーゼシグナル伝達を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１０．５μＭ、約１１μＭ、約１１．５μＭ、約１２μＭ、約１２．５μＭ、約１３μＭ、約１３．５μＭ、約１４μＭ、約１４．５μＭ、約１５μＭ、約１５．５μＭ、約１６μＭ、約１６．５μＭ、約１７μＭ、約１７．５μＭ、約１８μＭ、約１８．５μＭ、約１９μＭ、約１９．５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、または約５０μＭなどの濃度のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩなどのＡｌｋ５阻害剤）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約７～１３μＭ、約８～１２μＭ、約９～１１μＭなどの濃度のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩなどのＡｌｋ５阻害剤）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１０μＭなどの濃度のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩなどのＡｌｋ５阻害剤）と接触させることを含む。

【0255】

[00264]ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えばＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はトリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ－１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭなどの濃度の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、ＧＣ－１）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．７～１．３μＭ、約０．８～１．２μＭ、または約０．９～１．１μＭなどの濃度の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、ＧＣ－１）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を約１μＭなどの濃度の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、ＧＣ－１）と接触させることを含む。

【0256】

[00265]一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を少なくとも１つの追加因子と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｉｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、またはｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のうちの少なくとも１つと接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を少なくとも１つの追加因子と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤、またはｉｘ）ＰＫＣ活性化剤のうちの１つと接触させることを含む。

【0257】

[00266]一部の実施形態では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。

【0258】

[00267]一部の実施形態では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、培養中のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｘ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｘｉ）ＰＫＣ活性化剤、およびｘｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と１日、２日、または３日間（例えば、１～２日間、１～３日間、または２～３日間）接触させ、次に、培養中の細胞を、ｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｉｖ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｖｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｖｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と１、２、３、４、５、６、または７日間（例えば、１～７日間、１～５日間、１～３日間、３～７日間、３～５日間、５～７日間、または４～６日間）、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、および／または上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーの成長因子の非存在下で接触させることを含む。

【0259】

[00268]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を生成する方法において、分化因子のいくつかは分化のステップの間、最初の１日、２日、３日、４日、または５日間のみ存在する。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、およびＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子などの分化因子の一部は、培養の最初の１、２、または３日後に培地から除去される。

【0260】

[00269]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性の内分泌細胞にすることができる任意のγ－セクレターゼ阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約２．９μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．２μＭ、約５．４μＭ、約５．６μＭ、約５．８μＭ、約６μＭ、約６．２μＭ、約６．４μＭ、約６．６μＭ、約６．８μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、または約５０μＭの濃度のγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＸＸＩ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭなどの濃度のγ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２μＭなどの濃度のγ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させることを含む。

【0261】

[00270]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができるＥＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の実施形態では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はベータセルリンを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＥＧＦを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦファミリーからの成長因子（例えばベータセルリン）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１７～２３ｎｇ／ｍｌ、約１８～２２ｎｇ／ｍｌ、または約１９～２１ｎｇ／ｍｌなどの濃度のＥＧＦファミリーの成長因子（例えば、ベータセルリン）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２０ｎｇ／ｍｌなどの濃度のＥＧＦファミリーの成長因子（例えば、ベータセルリン）と接触させることを含む。

【0262】

[00271]ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はＲＡを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２０～８０ｎＭ、約３０～７０ｎＭ、または約４０～６０ｎＭなどの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約５０ｎＭなどの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、レチノイン酸）と接触させることを含む。

【0263】

[00272]ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の実施形態ではＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を約２２０～２８０ｎＭ、約２３０～２７０ｎＭ、約２４０～２６０ｎＭ、または約２４５～２５５ｎＭなどの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を約２５０ｎＭなどの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）と接触させることを含む。

【0264】

[00273]ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１１８９）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約７０～１３０ｎＭ、約８０～１２０ｎＭ、約９０～１１０ｎＭなどの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１１８９）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１００ｎＭなどの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１１８９）と接触させることを含む。

【0265】

[00274]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２．２～２．８μＭ、約２．３～２．７μＭ、または約２．４～２．６μＭなどの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２．５μＭなどの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビン）と接触させることを含む。

【0266】

[00275]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のエピジェネティック修飾化合物を使用することができる。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばＤＺＮｅｐを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤、例えばＫＤ５１７０を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のエピジェネティック修飾化合物（例えばＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約７０～１３０ｎＭ、約８０～１２０ｎＭ、または約９０～１１０ｎＭなどの濃度のエピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１００ｎＭなどの濃度のエピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）と接触させることを含む。

【0267】

[00276]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性の内分泌細胞にすることができる任意のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤はタンキラーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、タンキラーゼ阻害剤はＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６である。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約０．９５μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、または約５μＭなどの濃度のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６などのタンキラーゼ阻害剤）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１．７～２．３μＭ、約１．８～２．２μＭ、または約１．９～２．１μＭなどの濃度のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６などのタンキラーゼ阻害剤）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約２μＭなどの濃度のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６などのタンキラーゼ阻害剤）と接触させることを含む。

【0268】

[00277]集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）誘起してインスリン陽性の内分泌細胞にすることができる任意のＰＫＣ活性化剤を使用することができる。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＢまたはＰＤＢＵである。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．０１μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約０．９５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、または約２０μＭなどの濃度のＰＫＣ活性化剤（ＴＰＢまたはＰＤＢＵ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約４５０～５５０ｍＭ、約４７５～５２５ｎＭ、約４９０～５１０ｎＭ、または約４９５～５０５ｎＭなどの濃度のＰＫＣ活性化剤（ＴＰＢまたはＰＤＢＵ）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約５００ｎＭなどの濃度のＰＫＣ活性化剤（ＴＰＢまたはＰＤＢＵ）と接触させることを含む。

【0269】

[00278]一部の実施形態では、細胞の集団は任意選択でプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。一部の実施形態では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられない。一部の実施形態では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。集団中のＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のプロテインキナーゼ阻害剤を使用することができる。一部の実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、約２．０ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．２ｎＭ、約２．３ｎＭ、約２．４ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．６ｎＭ、約２．７ｎＭ、約２．８μＭ、約２．９ｎＭ、約３ｎＭ、約３．１ｎＭ、約３．２ｎＭ、約３．３ｎＭ、約３．４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３．６ｎＭ、約３．７ｎＭ、約３．８ｎＭ、約３．９ｎＭ、約４．０ｎＭ、約４．１ｎＭ、約４．２ｎＭ、約４．３ｎＭ、約４．４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４．６ｎＭ、約４．７ｎＭ、約４．８μＭ、約４．９ｎＭ、または約５ｎＭなどの濃度のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、約１～５ｎＭ、約２～４ｎＭ、または約２．５～３．５ｎＭなどの濃度のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）と接触させることを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を約３ｎＭなどの濃度のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）と接触させることを含む。

【0270】

[00279]一部の実施形態では、細胞をさらに水溶性合成ポリマーと接触させられる。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば、７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは８９％加水分解されている。

【0271】

[00280]一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ－１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、およびベータセルリン、ＰＤＢＵ、およびＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６と７日間接触させて、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導することを含み、インスリン陽性の内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の実施形態では、本方法は、細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ－１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、ベータセルリン、およびＬＤＮ１９３１８９と７日間接触させて集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分化因子がステージ５の一部で、例えばステージ５の期間の最初の１日、２日、３日、４日、５日、または６日にのみ、またはステージの期間の最後の１日、２日、３日、４日、５日、または６日に、添加される。一例では、細胞はステージ５の間、最初の２、３、４、または５日間だけ、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸、および／またはｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させられ、その後、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸、および／またはｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は培養液に含まれないかまたは培地から除去される。別の例では、細胞はＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の１日、２日、または３日にのみ接触させられ、その後、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は培地から除去される。

【0272】

[00281]一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を１つまたは複数の代謝産物と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を、アセチルＣｏＡ関連代謝産物、ビタミン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、酸化還元ホメオスタシス調節剤、一炭素代謝経路の中間体、および／またはグルタミンのうちの１つまたは複数と接触させることを含む。代謝産物の例としては、グルタミン、タウリン、酢酸塩、ベータ－ヒドロキシブチレート、ビオチン、およびギ酸塩が挙げられる。

【0273】

[00282]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、アセチルＣｏＡ関連代謝産物を含む。例示的なアセチルＣｏＡ関連代謝産物としては、限定されないが、酢酸塩、ピルビン酸塩、ケトン性アミノ酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、トリプトファン、脂肪酸、ＣｏＡ、イソバレリル－ＣｏＡ、β－ヒドロキシブチレートが挙げられる。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は酢酸塩である。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約８０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約８００ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約５００μＭ、約８００μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、または約１０ｍＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは本開示の組成物に添加される。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は、約０．０１～５０ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．５～５０ｍＭ、０．０１～２０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、０．０１～１０ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、０．５～１０ｍＭ、０．８～２５ｍＭ、０．８～１０ｍＭ、０．８～５ｍＭ、０．８～２ｍＭ、０．８～１．５ｍＭ、０．８～１．２ｍＭ、０．９～１．１ｍＭ、または０．９５～１．０５ｍＭである。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は、約１ｍＭの濃度で存在する酢酸塩である。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は、約５０～１０００ｎＭ、５０～８００ｎＭ、５０～５００ｎＭ、５０～３００ｎＭ、５０～２５０ｎＭ、１００～２００ｎＭ、または１２５～１７５ｎＭの濃度で存在する酢酸塩である。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は、約１６０ｎＭの濃度で存在する酢酸である。

【0274】

[00283]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、１つまたは複数のビタミンを含む。例示的なビタミンには、限定されないが、ビオチン、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、およびビタミンＢ１２（シアノコバラミン）が挙げられる。一部の実施形態では、ビタミンは脂肪酸合成を調節する。一部の実施形態では、ビタミンは分岐鎖アミノ酸代謝を調節する。一部の実施形態では、ビタミンはＴＣＡサイクルの補因子として、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼの補因子として調節するかまたは関与する。一部の実施形態では、ビタミンはビオチンである。一部の実施形態では、ビタミンは、約１００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約３μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、または約１００μＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは本開示の組成物に添加される。一部の実施形態では、ビタミンは、約８００ｎＭの濃度で存在するビオチンである。一部の実施形態では、ビタミンは、約１ｎＭ～５００μＭ、１ｎＭ～１００μＭ、１ｎＭ～１０μＭ、１ｎＭ～１μＭ、１ｎＭ～８００ｎＭ、１ｎＭ～６００ｎＭ、１ｎＭ～４００ｎＭ、１ｎＭ～３００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、２５ｎＭ～５００μＭ、２５ｎＭ～１００μＭ、２５ｎＭ～１０μＭ、２５ｎＭ～１μＭ、２５ｎＭ～８００ｎＭ、２５ｎＭ～６００ｎＭ、２５ｎＭ～４００ｎＭ、２５ｎＭ～３００ｎＭ、２５ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～５００μＭ、５０ｎＭ～１００μＭ、５０ｎＭ～１０μＭ、５０ｎＭ～１μＭ、５０ｎＭ～８００ｎＭ、５０ｎＭ～６００ｎＭ、５０ｎＭ～４００ｎＭ、５０ｎＭ～３００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～１０μＭ、１００ｎＭ～１μＭ、１００ｎＭ～８００ｎＭ、１００ｎＭ～６００ｎＭ、１００ｎＭ～４００ｎＭ、１００ｎＭ～３００ｎＭ、または１００ｎＭ～２００ｎＭの濃度で、本開示の組成物中に存在するか、または本開示の組成物に添加される。

【0275】

[00284]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含む。例示的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）としては、限定されないが、β－ヒドロキシブチレート、酪酸、クラスＩ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＡ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＢ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＩ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＶ ＨＤＡＣｉ、ＨＤＡＣ－１、ＨＤＡＣ－２、ＨＤＡＣ－３、ＨＤＡＣ－４、ＨＤＡＣ－５、ＨＤＡＣ－６、ＨＤＡＣ－７、ＨＤＡＣ－８、ＨＤＡＣ－９、ＨＤＡＣ－１０、ＨＤＡＣ－１１、サーチュイン、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ボリノスタット（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ、ＭＫ０６８３）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５、ＳＮＤＸ－２７５）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９、ＮＶＰ－ＬＢＨ５８９）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３、ＭＧ０１０３）、ＧＳＫ３１１７３９１（ＧＳＫ３１１７３９１Ａ、ＨＤＡＣ－ＩＮ－３）、ＢＲＤ３３０８、ＢＲＤ３３０８、ツバスタチンＡ ＴＦＡ（ツバスタチンＡトリフルオロ酢酸塩）、ツバスタチンＡ、ＳＩＳ１７、ＮＫＬ２２、ＢＭＬ－２１０（ＣＡＹ１０４３３）、ＴＣ－Ｈ １０６、ＳＲ－４３７０、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、ＮＳＣ７２６６３０、ＰＸ－１０５６８４）、ロミデプシン（ＦＫ２２８、デプシペプチド、ＦＲ９０１２２８、ＮＳＣ６３０１７６）、ＭＣ１５６８、ジビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ダシノスタット（ＬＡＱ８２４、ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４）、ＣＵＤＣ－１０１、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、プラシノスタット（ＳＢ９３９）、ＰＣＩ－３４０５１、ドロキシノスタット（ＮＳ４１０８０）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１、ＣＲＡ－０２４７８１）、ＲＧＦＰ９６６、ＡＲ－４２（ＨＤＡＣ－４２）、リコリノスタット（ＡＣＹ－１２１５、ロシリノスタット）、バルプロ酸ナトリウム塩（バルプロ酸ナトリウム）、タセジナリン（ＣＩ９９４、ＰＤ－１２３６５４、ＧＯＥ－５５４９、アセチルジナリン）、フィメピノスタット（ＣＵＤＣ－９０７）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、クルクミン、ジフェルロイルメタン、Ｍ３４４、ツバシン、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、レスミノスタット（ＲＡＳ２４１０）、ジバルプロエクスナトリウム、スクリプタイド（ＧＣＫ１０２６）、フェニル酪酸ナトリウム、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｎｃ ａｃｉｄ）（シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｃ ａｃｉｄ））、ＴＭＰ２６９、サンタクルザメートＡ（ＣＡＹ１０６８３）、ＴＭＰ１９５（ＴＦＭＯ２）、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ＵＦ０１０、タスキニモド（ＡＢＲ－２１５０５０）、ＳＫＬＢ－２３ｂｂ、イソグアノシン、ルフォラファン、ＢＲＤ７３９５４、シタリノスタット（ＡＣＹ－２４１、ＨＤＡＣ－ＩＮ－２）、スベロヒドロキサム酸、プリトマイシン、ＨＰＯＢ、ＬＭＫ－２３５、ビフェニル－４－スルホニルクロリド（ｐ－フェニルベンゼンスルホニル、４－ヘニルベンゼンスルホニル、ｐ－ビフェニルスルホニル）、ネクスツラスタットＡ、ＴＨ３４、ツシジノスタット（キダミド、ＨＢＩ－８０００、ＣＳ－０５５）、（－）－パルテノイド、ＷＴ１６１、ＣＡＹ１０６０３、ＡＣＹ－７３８、ラッドデアニンＡ、チノスタムスチン（ＥＤＯ－Ｓ１０１）、ドマチノスタット（４ＳＣ－２０２）、およびＢＧ４５が挙げられる。一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉはβ－ヒドロキシブチレートである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉは、約１００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約３μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、もしくは約１００μＭの濃度で、本開示の組成物中に存在するかまたは本開示の組成物に添加される。一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉは、β－ヒドロキシブチレートであり、約２００ｎＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉは、約１ｎＭ～５００μＭ、１ｎＭ～１００μＭ、１ｎＭ～１０μＭ、１ｎＭ～１μＭ、１ｎＭ～８００ｎＭ、１ｎＭ～６００ｎＭ、１ｎＭ～４００ｎＭ、１ｎＭ～３００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、２５ｎＭ～５００μＭ、２５ｎＭ～１００μＭ、２５ｎＭ～１０μＭ、２５ｎＭ～１μＭ、２５ｎＭ～８００ｎＭ、２５ｎＭ～６００ｎＭ、２５ｎＭ～４００ｎＭ、２５ｎＭ～３００ｎＭ、２５ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～５００μＭ、５０ｎＭ～１００μＭ、５０ｎＭ～１０μＭ、５０ｎＭ～１μＭ、５０ｎＭ～８００ｎＭ、５０ｎＭ～６００ｎＭ、５０ｎＭ～４００ｎＭ、５０ｎＭ～３００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～１０μＭ、１００ｎＭ～１μＭ、１００ｎＭ～８００ｎＭ、１００ｎＭ～６００ｎＭ、１００ｎＭ～４００ｎＭ、１００ｎＭ～３００ｎＭ、または１００ｎＭ～２００ｎＭの濃度で、本開示の組成物中に存在するか、または本開示の組成物に添加される。

【0276】

[00285]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、酸化還元ホメオスタシス調節剤を含む。例示的な酸化還元ホメオスタシス調節剤としては、限定されないが、タウリン、呼吸鎖調節物質、フリーラジカルスカベンジャー、ミトコンドリアタンパク質合成の制御因子、アリウム硫黄化合物、アントシアニン、ベータ－カロテン、カテキン、銅、クリプトキサンチン、フラボノイド、インドール、イソフラボノイド、リグナン、ルテイン、リコピン、アルファ－リポ酸、エラグ酸、マンガン、ポリフェノール、セレン、グルタチオン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、亜鉛、スーパーオキシドジスーターゼ、ＧＳＨＰｘ、Ｐｒｘ－Ｉ、カタラーゼ、およびコエンザイムＱ１０が挙げられる。一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤はタウリンである。一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤は、約１００ｎＭ、約５００ｎＭ、１μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１１０μＭ、約１５０μＭ、もしくは約２００μＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは本開示の組成物に添加される。一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤はタウリンである。一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤は、約９０μＭの濃度で存在するタウリンである。一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤中間体は、約１００ｎＭ～１ｍＭ、５００ｎＭ～１ｍＭ、１μＭ～１ｍＭ、１０μＭ～１ｍＭ、２０μＭ～１ｍＭ、３０μＭ～１ｍＭ、３０μＭ～１ｍＭ、４０μＭ～１ｍＭ、５０μＭ～１ｍＭ、６０μＭ～１ｍＭ、７０μＭ～１ｍＭ、８０μＭ～１ｍＭ、１００ｎＭ～２５０μＭ、５００ｎＭ～２５０μＭ、１μＭ～２５０μＭ、１０μＭ～２５０μＭ、２０μＭ～２５０μＭ、３０μＭ～２５０μＭ、３０μＭ～２５０μＭ、４０μＭ～２５０μＭ、５０μＭ～２５０μＭ、６０μＭ～２５０μＭ、７０μＭ～２５０μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、５００ｎＭ～１００μＭ、１μＭ～１００μＭ、１０μＭ～１００μＭ、２０μＭ～１００μＭ、３０μＭ～１００μＭ、４０μＭ～１００μＭ、５０μＭ～１００μＭ、６０μＭ～１００μＭ、７０μＭ～１００μＭ、もしくは８０μＭ～１００μＭの濃度で存在するかまたは添加される。

【0277】

[00286]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、培地）は、一炭素代謝経路中間体を含む。例示的な一炭素代謝経路中間体としては、限定されないが、ギ酸塩、テトラヒドロ葉酸塩（ＴＨＦ）、１０－ホルミルＴＨＦ；５，１０－ｍｅＴＨＦ；５，１０－ｍｅＴＨＦ；および１０－ホルミルＴＨＦが挙げられる。一部の実施形態では、一炭素代謝経路中間体は、約５０μＭの濃度で存在するギ酸塩である。一部の実施形態では、一炭素代謝経路中間体は、約１００ｎＭ～１ｍＭ、５００ｎＭ～１ｍＭ、１μＭ～１ｍＭ、１０μＭ～１ｍＭ、２０μＭ～１ｍＭ、３０μＭ～１ｍＭ、１００ｎＭ～２５０μＭ、５００ｎＭ～２５０μＭ、１μＭ～２５０μＭ、１０μＭ～２５０μＭ、２０μＭ～２５０μＭ、３０μＭ～２５０μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、５００ｎＭ～１００μＭ、１μＭ～１００μＭ、１０μＭ～１００μＭ、２０μＭ～１００μＭ、３０μＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～６０μＭ、５００ｎＭ～６０μＭ、１μＭ～６０μＭ、１０μＭ～６０μＭ、２０μＭ～６０μＭ、３０μＭ～６０μＭ、４０μＭ～６０μＭ、もしくは４５μＭ～５５μＭの濃度で存在するかまたは添加される。

【0278】

[00287]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、培地）はグルタミンを含む。したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、生物学的利用能が増大した形態のグルタミン、例えば、遊離グルタミン形態、例えば、非ジペプチド形態、非アラニン－グルタミンジペプチド形態（例えば、非アラニル－Ｌ－グルタミン型）、非グリシン－グルタミン型ジペプチド型（例えば、非グリシル－Ｌ－グルタミン型）、グルタミンが他のアミノ酸または安定化部分とコンジュゲートしていない形態、モノマー形態、遊離形態、またはそれらの組合せを利用する。一部の実施形態では、グルタミンは、タンパク質加水分解物として提供される。一部の実施形態では、グルタミンは、０．５～２０ｍＭ、０．５～１０ｍＭ、０．５～５ｍＭ、１～５ｍＭ、２～５ｍＭ、もしくは１ｍＭ～１０ｍＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは添加される。一部の実施形態では、グルタミンは、３．８～４．２ｍＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは添加される。一部の実施形態では、グルタミンは、１～１０、１～７、１～８、１～６、１～５、１～４、２～１０、２～７、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１０、３～７、３～８、３～６、３～５、３～４、３．５～４．５、３．８～４．２、もしくは３．９～４．１ｍＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは添加される。一部の実施形態では、グルタミンは、約４ｍＭの濃度で本開示の組成物中に存在するかまたは添加される。一部の実施形態では、グルタミンの少なくとも０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、または５ｍＭは、ジペプチドの形態ではない。一部の実施形態では、グルタミンの少なくとも５００μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも２．６ｍＭ、少なくとも２．７ｍＭ、少なくとも２．８ｍＭ、少なくとも２．９ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも３．１ｍＭ、少なくとも３．２ｍＭ、少なくとも３．３ｍＭ、少なくとも３．４ｍＭ、少なくとも３．５ｍＭ、少なくとも３．６ｍＭ、少なくとも３．７ｍＭ、少なくとも３．８ｍＭ、少なくとも３．９ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも５．５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも６．５ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも８．５ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも９．５ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭは、遊離形態である。

【0279】

[00288]一部の実施形態では、本方法は、培地中の細胞の集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）を培養し、集団における少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の、インスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するステップを含み、ここで、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。

【0280】

[00289]本開示の態様は、本明細書で開示される方法に従って産生された膵内分泌細胞の細胞集団におけるＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む細胞集団の、ＰＫＣ活性化剤および／またはＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤による処置を含み、これは、膵α細胞のパーセンテージの増加、膵δ細胞のパーセンテージの増加、膵β細胞のパーセンテージの増加、ＥＣ細胞のパーセンテージの減少、またはそれらの任意の組合せをもたらし得る。

【0281】

[00290]一部の実施形態では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を、ＦＯＸＯ１阻害剤、ノッチシグナル伝達阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と１～２日間接触させ、それにより、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を得るステップと、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ノッチシグナル伝達阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、レチノイン酸、およびＥＧＦファミリー成長因子、ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤、および／またはエピジェネティック修飾化合物と１～２日間接触させ、それにより、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性内分泌細胞を含む第２の形質転換細胞集団を得るステップとを含む。

【0282】

膵β細胞
[00291]本開示の態様は、膵β細胞（例えば、非天然膵β細胞）を産生するステップを含む。非天然膵β細胞は、一部の事例では、形態および機能において内因性成熟β細胞に類似しているが、それにもかかわらず、天然β細胞とは異なる。

【0283】

[00292]一部の事例では、本明細書で提供される方法を用いて産生されたインスリン陽性膵内分泌細胞は、単独で、または他の細胞型、例えば、その前駆体、例えば、幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞、またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞とともに、細胞クラスターを形成することができる。

【0284】

[00293]一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団は、いかなる外因性分化因子（例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリー、ＦＧＦファミリー、またはＥＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤）も添加せずに、ＳＣ－β細胞へ直接誘導または成熟され得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性内分泌細胞を含む細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および／またはエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性内分泌細胞を含む細胞集団を、ヒト血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性内分泌細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0285】

[00294]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞はＮＳ－ＧＦｓ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞は１０％ＦＢＳを補ったＣＭＲＬｓ培地中で成熟させることができる。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞は、０．０１～１％ＨＳＡ（例えば、０．０５％ＨＳＡ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で成熟され得る。一部の事例では、ＨＳＡは、水溶性合成ポリマーで置換される。一部の事例では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば、７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは、８９％が加水分解されている。他の例では、ＳＣ－β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団を、２％ＢＳＡを補ってもよいＭＣＤＢ１３１培地中で培養することによって得ることができる。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ－β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、本明細書に記載した小分子の因子を含まなくてよい。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ－β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、血清（例えばＦＢＳ）を含まなくてよい。他の例では、ＳＣ－β細胞は、０．０５％ＨＳＡおよびビタミンＣを補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中でインスリン陽性の内分泌細胞を含有する細胞集団を培養することによって得ることができる。一部の事例では、ＳＣ－β細胞は、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣおよびグルタミン（Ｇｌｎ、例えば、４ｍＭ）を補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中でインスリン陽性の内分泌細胞を含有する細胞集団を培養することによって得ることができる。一部の事例では、Ｓ６の間に培地の種類を変更することができる。例えば、Ｓ６細胞を、最初の２～４日間、０．０５％ＨＳＡおよびビタミンＣを補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中で培養し、次に、１％ＨＳＡを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養する。一部の事例では、追加の因子が培地に導入される。例えば、Ｓ６細胞は、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣ、およびグルタミン（Ｇｌｎ、例えば、４ｍＭ）を補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中で、４～１２日間培養することができ、その間、Ｓ６の第４日からＺｎＳＯ_４が導入される。

【0286】

[00295]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を多能性細胞から産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、少なくともＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と１日間、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子および任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）と１日間、ならびにｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＰＫＣ活性化剤、ｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの１つの因子、およびｖｉｉ）任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子、およびｖｉ）任意選択で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）ＰＫＣ活性化剤と２～３日間、ならびにｖ）ＴＧＦβスーパーシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、任意選択で、ｖｉｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｘ）プロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、およびｘｉ）エピジェネティック修飾因子（例えば、ＤＺＮＥＰ）と５～７日間接触させる接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性インスリン陽性内分泌細胞を、培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ここで、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。

【0287】

[00296]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を、多能性細胞から産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖｉｉ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子と２日間接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ－セクレターゼ阻害剤、および任意選択で、ｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、および任意選択で、ｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ここで、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。

【0288】

[00297]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を、多能性細胞から産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ－セクレターゼ阻害剤、および任意選択で、ｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ここで、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。

【0289】

[00298]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を、多能性細胞から産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５または６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ここで、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。

【0290】

[00299]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を、多能性細胞から産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５または６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を、ｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、ｉｖ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｖｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と５～７日間、５～７日間の最初の３日以内に接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ここで、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。

【0291】

[00300]一部の実施形態では、細胞をさらに水溶性合成ポリマーと接触させられる。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーはポリビニルアルコールである。一部の例では、ポリビニルアルコールは、少なくとも７８％が加水分解され、例えば、７９～８１％が加水分解され、８７～８９％が加水分解され、８７～９０％が加水分解され、または９９％が加水分解されている。一部の実施形態では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が加水分解されている。一部の実施形態では、ＰＶＡは８９％加水分解されている。

【0292】

[00301]一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を、多能性細胞から産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させるステップによって、集団における多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、少なくとも１つのＦＧＦファミリーからの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を、原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞を、細胞クラスター化を促進する条件下でｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択で、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択で、ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５または６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞をｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含む。

【0293】

[00302]第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養するのに使用される培地は、ゼノフリーであり得る。動物を起源とする細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物由来の生成物を有することができない。一部の事例では、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いずれの非ヒト動物由来の生成物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。例えば、培地は、約１％～約２０％、約５％～約１５％、約８％～約１２％、約９～約１１％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、約１０％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、小分子および／またはＦＢＳを含むことができない。例えば、培地は、２％のＢＳＡを補充したＭＣＤＢ１３１基礎培地を含むことができる。一部の事例では、培地は、血清を含まない。一部の例では、培地は、外因性小分子またはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ２１）からの成長因子、ソニックヘッジホッグアンタゴニスト（例えば、Ｓａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、またはこれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、またはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４－１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤（例えば、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、ブリオスタチン１、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦβスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２）、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＳＢ－５０５１２４、またはこれらの誘導体）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９またはこれらの誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３、ＧＣ－１またはこれらの誘導体）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の活性化剤（例えば、ＷＮＴ３ａまたはアクチビンＡ） 上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子（例えば、ベータセルリンまたはＥＧＦ）、広範囲のキナーゼ（例えば、スタウロスポリンまたはその誘導体）、非必須アミノ酸、ビタミンまたは酸化防止剤（例えば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、またはこれらの誘導体）、あるいはＮ－アセチルシステイン、硫酸亜鉛、またはヘパリンのような他の添加物を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部の事例では、再凝集培地は、他の細胞外マトリックス分子または材料、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、または、例えば、溶解された細胞膜調製物を含まない。

【0294】

[00303]当業者であれば、培地中に補充される血清アルブミンの濃度が変化し得ることを認識するであろう。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＢＳＡを含むことができる。他の事例では、培地は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＨＳＡを含むことができる。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、伝統的な基礎培地に見られない構成成分、例えば、微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、ならびに高レベルの一部のアミノ酸およびビタミンを含有することができる。これらの添加物によって、非常に低いレベルの血清または規定された構成成分が補充される培地を可能とすることができる。培地は、タンパク質および／または成長因子を含まなくてもよく、かつＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、および／またはグルタミンが補充されてもよい。培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含んでもよい。培地において使用される非限定的な例示的細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、バイグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部の事例では、培地は、ラミニン、例えば、ＬＮ－３３２を含む。一部の事例では、培地は、ヘパリンを含む。

【0295】

[00304]培地は、例えば、培地中の細胞に最適な環境を提供するために、培養中に定期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養する場合、培地は、少なくともまたは約４時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎、３日毎もしくは４日毎に交換することができる。例えば、培地は、約４８時間毎に交換することができる。

【0296】

[00305]一部の事例では、細胞は、動的条件下（例えば、細胞が、懸濁培養下にある間、一定の動きまたは撹拌に供される条件下）で培養することができる。細胞を動的培養するために、細胞は、制御ユニットに接続され、よって、制御された培養系を提供することができる容器（例えば、スピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ～３０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌの、１００ｍｌの、または１２５ｍｌのエルレンマイヤー中の）などの非接着性容器）、あるいは動的大規模バイオリアクター（例えば、５００ｍＬ～５０Ｌ、例えば、１Ｌ～１０Ｌ、２Ｌ～５Ｌ、３Ｌ～４Ｌ、２Ｌ～３０Ｌ、または１０Ｌ～２０Ｌ）中で培養することができる。一部の事例では、細胞は、それらの増殖能力を維持しながら、非動的条件（例えば、静的培養）下で培養することができる。細胞を非動的培養するために、細胞は、接着性培養ベッセル中で培養することができる。接着性培養ベッセルは、ベッセル表面の細胞への接着性を改良するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基質のいずれかでコーティングされてもよい。細胞接着のための基質は、（使用される場合）幹細胞またはフィーダー細胞を付着させることを意図する任意の材料であり得る。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解された細胞膜調製物が挙げられる。

【0297】

[00306]一部の事例では、本明細書で開示される細胞分化プロセスは、約５００ｍＬ～約５０Ｌ、例えば、約１Ｌ～約１０Ｌ、約２Ｌ～約５Ｌ、約３Ｌ～約４Ｌ、約２Ｌ～約３０Ｌ、または約１０Ｌ～約２０Ｌの液体容積を有する懸濁細胞培養液中で行われる。一部の事例では、本明細書で開示される細胞分化プロセスは、約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、例えば、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５０ｍＬ、約３０ｍＬ～約４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３０ｍＬ、または約１０ｍＬ～約２０ｍＬの液体容積を有する懸濁細胞培養液中で行われる。

【0298】

[00307]動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）中の培地は、撹拌され得る（例えば、スターラーによって）。スピン速度は、再凝集される第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似することができるように制御され得る。一部の事例では、スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが、約７５μｍ～約２５０μｍとなり得るように制御される。動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）のスピン速度は、１分当たり約２０回転（ｒｐｍ）～約１００ｒｐｍ、例えば、約３０ｒｐｍ～約９０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ～約５０ｒｐｍであり得る。一部の事例では、スピン速度は、約５０ｒｐｍであり得る。

【0299】

[00308]本明細書において提供されるステージ６の細胞は、本明細書に記載されているように、分離および再凝集プロセスに供されても供されなくてもよい。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞クラスターは再凝集され得る。細胞クラスターの再凝集により、インスリン陽性内分泌細胞を濃縮することができる。一部の事例では、細胞クラスター中のインスリン陽性内分泌細胞は、膵β細胞へとさらに成熟され得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、天然の膵島に似た、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈し得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈する非天然膵β細胞を含み得る。一部の実施形態では、再凝集プロセスは、全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０２００３３２２６２Ａ１号の開示に従って行うことができる。

【0300】

[00309]本明細書において提供される方法に従って得られるステージ６の細胞は、凍結保存および再凝集手順の後に、高い回収率を有することができる。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、このような処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ５の後の凍結保存後に、少なくとも約３５％、３７．５％、４０％、４２．５％、４５％、４７．５％、４８％、４９％、または５０％である回収率を有し得る。回収率は、凍結保存前の細胞と比較した、凍結保存、解凍および回収、ならびに再凝集手順後に生存し、再凝集した細胞クラスターを形成する細胞のパーセンテージとして計算することができる。

【0301】

[00310]一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される方法を使用して得られる非天然膵β細胞またはその前駆体（例えば、ステージ５後に得られたＮＫＸ６．１陽性、ＰＤＸ１陽性、インスリン陽性細胞）の凍結保存に関する。一部の実施形態では、非天然の膵β細胞を含む細胞集団は、凍結保存によって保存することができる。例えば、非天然のβ細胞を含む細胞集団、例えば、一部の事例では、ステージ６細胞は、細胞懸濁液、例えば、単一細胞の懸濁液中に分離されてもよく、細胞懸濁液は、凍結保存、例えば、凍結保存液中に凍結することができる。細胞の分離は、本明細書に与えられる技法のいずれか、例えば、酵素処理によって行うことができる。細胞は、最高－２０℃、最高－３０℃、最高－４０℃、最高－５０℃、最高－６０℃、最高－７０℃、最高－８０℃、最高－９０℃、最高－１００℃、最高－１１０℃、最高－１２０℃、最高－１３０℃、最高－１４０℃、最高－１５０℃、最高－１６０℃、最高－１７０℃、最高－１８０℃、最高－１９０℃、または細胞は最高－２００℃の温度で凍結することができる。一部の事例では、細胞は、約－８０℃の温度で凍結される。一部の事例では、細胞は、約－１９５℃の温度で凍結される。凍結保存に必要とされる低温をもたらすために、以下に限定されないが、電気冷凍庫、固体二酸化炭素、および液体窒素などの任意の冷却方法を使用することができる。一部の事例では、カスタムメイドと市販の溶液の両方を含む、当業者にとって利用可能な任意の凍結保存溶液を、低温での保存用に細胞をインキュベートするために使用することができる。例えば、凍結保護物質を含有する溶液を使用してもよい。凍結保護物質は、細胞を凍結による損傷から保護するために構成される薬剤であり得る。例えば、凍結保護物質は、凍結保存溶液のガラス転移温度を低下させることができる物質であり得る。使用することができる例示的な凍結保護物質として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール）、デキストラン（例えば、デキストラン－４０）、およびトレハロースが挙げられる。他の作用のために、追加の薬剤を凍結保存溶液に添加してもよい。一部の事例では、市販の凍結保存溶液、例えば、ＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（商標）、ｐＺｅｒｖｅ（商標）、Ｐｒｉｍｅ－ＸＶ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標） Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉａ、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標） ＦＲＳ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ、およびＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ（登録商標） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａを本明細書において提供される方法において使用することができる。

【0302】

[00311]分化プロセスの間に、細胞を本明細書で提供される照射処置に供することができる。一部の事例では、ステージ６における細胞集団、例えば、インスリン陽性内分泌細胞から膵β細胞へと分化される細胞を有する細胞集団または細胞クラスターは、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存からの回収後の再凝集後のステージ６の細胞集団は、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存された細胞（例えば、ステージ５の終わりに凍結保存された細胞）は、次の分化プロセスのために、解凍および回収前に、ある特定の期間照射される。

【0303】

[00312]一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陰性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、Ｃ－ペプチド陽性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞またはステージ６細胞の特徴を有する細胞は、ＮＳ－ＧＦ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中でインキュベートされる。一部の実施形態では、ステージ６細胞、またはステージ６細胞の特徴を有する細胞は、ビタミンもしくは抗酸化剤（例えば、ビタミンＣ）、ヒト血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－ベータ経路阻害剤（例えば、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（例えば、チアゾビビン）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＺＮＥＰ）、およびプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）のうちの１つまたは複数と接触させられる。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０２１０２１４６９０Ａ１号を参照されたい）と接触される。一部の実施形態では、ステージ６の細胞は、ＰＫＣ活性化剤と接触されない。

【0304】

[00313]一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団および脂質を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を脂質と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、脂質は飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、飽和脂肪酸はパルミチン酸塩である。一部の実施形態では、脂質は不飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、非飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、またはパルミトレイン酸である。

【0305】

[00314]一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団およびＭＣＤＢ １３１を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団をＭＣＤＢ １３１と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団およびＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団をＤＭＥＭ／Ｆ１２と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団および亜鉛を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を亜鉛と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団およびＺｎＳＯ_４を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団をＺｎＳＯ_４と接触させる方法を提供する。

【0306】

[00315]一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団および少なくとも１つの代謝産物を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を少なくとも１つの代謝産物と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの代謝産物は、グルタミン酸塩、酢酸塩、ｂ－ヒドロキシブタレート（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｒａｔｅ）、Ｌ－カルニチン、タウリン、ギ酸塩、またはビオチンである。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団、およびグルタミン酸塩、酢酸塩、β－ヒドロキシブタレート、Ｌ－カルニチン、タウリン、ギ酸塩、またはビオチンのうちの１、２、３、４、５、６または７個を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団をグルタミン酸塩、酢酸塩、β－ヒドロキシブタレート、Ｌ－カルニチン、タウリン、ギ酸塩、またはビオチンのうちの１、２、３、４、５、６または７個と接触させる方法を提供する。

【0307】

[00316]一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団および少なくとも１つのアミノ酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を少なくとも１つのアミノ酸と接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン、グルタミン酸塩、グリシン、プロリン、スレオニン、またはトリプトファンである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン酸塩、グリシン、プロリン、スレオニン、またはトリプトファンである。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団および少なくとも１つのビタミンを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を少なくとも１つのビタミンと接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのビタミンは、ビオチンまたはリボフラビンである。

【0308】

[00317]一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団およびモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）阻害剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、インスリン陽性細胞の集団を少なくとも１つのビタミンと接触させる方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＧＬＬ阻害剤は、ＪＪＫＫ０４８、ＫＭＬ２９、ＮＦ１８１９、ＪＷ６４２、ＪＺＬ１８４、ＪＺＬ１９５、ＪＺＰ３６１、プリスチメリン、もしくはＵＲＢ６０２、またはそれらの誘導体のいずれかである。

【0309】

分化因子
[00318]本開示の態様は、前駆細胞（例えば、幹細胞、例えば、ｉＰＳ細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞）を、１つまたは複数のβ細胞分化因子と接触させて、例えば、インスリン陽性内分泌細胞の成熟または他の前駆細胞の、ＳＣ－β細胞（例えば、成熟膵β細胞）への分化を誘導するステップに関する。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）の胚体内胚葉細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載した方法に従って、原腸管細胞の、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載した方法に従って、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵前駆細胞の、ＮＫＸ６－１陽性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載した方法に従って、ＮＫＸ６－１陽性膵前駆細胞の、インスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子（複数可）は、例えば、本明細書に記載される方法に従って、インスリン陽性の内分泌細胞のＳＣ－β細胞への成熟を誘導することができる。

【0310】

[00319]本明細書に記載の少なくとも１つの分化因子は、単独で、または他の分化作用剤と組み合わせて使用し、本明細書に開示されている方法に従って、ＳＣ－β細胞を産生することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の分化因子は、ＳＣ－β細胞を産生する方法において使用される。

【0311】

形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー
[00320]本開示の態様は、分化因子としての形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子の使用に関する。「ＴＧＦ－βスーパーファミリー」は、公知のＴＧＦβファミリーのメンバーの構造的および機能的特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＴＧＦβファミリーとしては、ＴＧＦβシリーズのタンパク質、インヒビン（インヒビンＡおよびインヒビンＢを含む）、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢを含む）、ＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｄｐｐ（デカペンタプレジック）、Ｖｇ－１、ＭＮＳＦ（モノクローナル非特異的抑制因子）などが挙げられる。このファミリーのタンパク質の活性は、様々な細胞型の特定の受容体への特異的結合に基づき得る。このファミリーのメンバーは、特にＣ末端において、それらの機能に相関する配列同一性の領域を共有することができる。ＴＧＦβファミリーは、１００を超える別々のタンパク質を含むことができ、これらは全て、アミノ酸配列同一性の少なくとも１つの領域を共有する。本明細書に開示されている方法において使用することができるファミリーのメンバーとしては、以下のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されず、以下のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ０７９９５、Ｐ１８３３１、Ｐ０８４７６、Ｑ０４９９８、Ｐ０３９７０、Ｐ４３０３２、Ｐ５５１０２、Ｐ２７０９２、Ｐ４２９１７、Ｐ０９５２９、Ｐ２７０９３、Ｐ０４０８８、Ｑ０４９９９、Ｐ１７４９１、Ｐ５５１０４、Ｑ９ＷＵＫ５、Ｐ５５１０３、Ｏ８８９５９、Ｏ０８７１７、Ｐ５８１６６、Ｏ６１６４３、Ｐ３５６２１、Ｐ０９５３４、Ｐ４８９７０、Ｑ９ＮＲ２３、Ｐ２５７０３、Ｐ３０８８４、Ｐ１２６４３、Ｐ４９００１、Ｐ２１２７４、Ｏ４６５６４、Ｏ１９００６、Ｐ２２００４、Ｐ２０７２２、Ｑ０４９０６、Ｑ０７１０４、Ｐ３０８８６、Ｐ１８０７５、Ｐ２３３５９、Ｐ２２００３、Ｐ３４８２１、Ｐ４９００３、Ｑ９０７５１、Ｐ２１２７５、Ｑ０６８２６、Ｐ３０８８５、Ｐ３４８２０、Ｑ２９６０７、Ｐ１２６４４、Ｑ９０７５２、Ｏ４６５７６、Ｐ２７５３９、Ｐ４８９６９、Ｑ２６９７４、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、Ｐ２７０９１、Ｏ４２２２２、Ｑ２４７３５、Ｐ２０８６３、Ｏ１８８２８、Ｐ５５１０６、Ｑ９ＰＴＱ２、Ｏ１４７９３、Ｏ０８６８９、Ｏ４２２２１、Ｏ１８８３０、Ｏ１８８３１、Ｏ１８８３６、Ｏ３５３１２、Ｏ４２２２０、Ｐ４３０２６、Ｐ４３０２７、Ｐ４３０２９、Ｏ９５３９０、Ｑ９Ｒ２２９、Ｏ９３４４９、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、Ｑ９ＢＤＷ８、Ｐ４３０２８、Ｑ７Ｚ４Ｐ５、Ｐ５０４１４、Ｐ１７２４６、Ｐ５４８３１、Ｐ０４２０２、Ｐ０１１３７、Ｐ０９５３３、Ｐ１８３４１、Ｏ１９０１１、Ｑ９Ｚ１Ｙ６、Ｐ０７２００、Ｑ９Ｚ２１７、Ｏ９５３９３、Ｐ５５１０５、Ｐ３０３７１、Ｑ９ＭＺＥ２、Ｑ０７２５８、Ｑ９６Ｓ４２、Ｐ９７７３７、ＡＡＡ９７４１５．１、ＮＰ－７７６７８８．１、ＮＰ－０５８８２４．１、ＥＡＬ２４００１．１、１ Ｓ４Ｙ、ＮＰ－００１００９８５６．１、ＮＰ－１－０３２４０６．１、ＮＰ－９９９１９３．１、ＸＰ－５１９０６３．１、ＡＡＧ１７２６０．１、ＣＡＡ４０８０６．１、ＮＰ－１－００１００９４５８．１、ＡＡＱ５５８０８．１、ＡＡＫ４０３４１．１、ＡＡＰ３３０１９．１、ＡＡＫ２１２６５．１、ＡＡＣ５９７３８．１、ＣＡＩ４６００３．１、Ｂ４０９０５、ＡＡＱ５５８１１．１、ＡＡＫ４０３４２．１、ＸＰ－５４０３６４．１、Ｐ５５１０２、ＡＡＱ５５８１０．１、ＮＰ－９９０７２７．１、ＣＡＡ５１１６３．１、ＡＡＤ５０４４８．１、ＪＣ４８６２、ＰＮ０５０４、ＢＡＢ１７６００．１、ＡＡＨ５６７４２．１、ＢＡＢ１７５９６．１、ＣＡＧ０６１８３．１、ＣＡＧ０５３３９．１、ＢＡＢ１７６０１．１、ＣＡＢ４３０９１．１、Ａ３６１９２、ＡＡＡ４９１６２．１、ＡＡＴ４２２００．１、ＮＰ－７８９８２２．１、ＡＡＡ５９４５１．１、ＡＡＡ５９１６９．１、ＸＰ－５４１０００．１、ＮＰ－９９０５３７．１、ＮＰ－１－００２１８４．１、ＡＡＣ１４１８７．１、ＡＡＰ８３３１９．１、ＡＡＡ５９１７０．１、ＢＡＢ１６９７３．１、ＡＡＭ６６７６６．１、ＷＦＰＧＢＢ、１２０１２７８Ｃ、ＡＡＨ３００２９．１、ＣＡＡ４９３２６．１、ＸＰ－３４４１３１．１、ＡＡ－１４８８４５．１、ＸＰ－１－１４８９６６．３、１４８２３５、Ｂ４１３９８、ＡＡＨ７７８５７．１、ＡＡＢ２６８６３．１、１７０６３２７Ａ、ＢＡＡ８３８０４．１、ＮＰ－５７１１４３．１、ＣＡＧ００８５８．１、ＢＡＢ１７５９９．１、ＢＡＢ１７６０２．１、ＡＡＢ６１４６８．１、ＰＮ０５０５、ＰＮ０５０６、ＣＡＢ４３０９２．１、ＢＡＢ１７５９８．１、ＢＡＡ２２５７０．１、ＢＡＢ１６９７２．１、ＢＡＣ８１６７２．１、ＢＡＡ１２６９４．１、ＢＡＡ０８４９４．１、Ｂ３６１９２、Ｃ３６１９２、ＢＡＢ１６９７１．１、ＮＰ－０３４６９５．１、ＡＡＡ４９１６０．１、ＣＡＡ６２３４７．１、ＡＡＡ４９１６１．１、ＡＡＤ３０１３２．１、ＣＡＡ５８２９０．１、ＮＰ－００５５２９．１、ＸＰ－５２２４４３．１、ＡＡＭ２７４４８．１、ＸＰ－５３８２４７．１、ＡＡＤ３０１３３．Ｉ、ＡＡＣ３６７４１．１、ＡＡＨ１０４０４．１、ＮＰ－０３２４０８．１、ＡＡＮ０３６８２．１、ＸＰ－５０９１６１．１、ＡＡＣ３２３１１．１、ＮＰ－６５１９４２．２、ＡＡＬ５１００５．１、ＡＡＣ３９０８３．１、ＡＡＨ８５５４７．１、ＮＰ－５７１０２３．１、ＣＡＦ９４１１３．１、ＥＡＬ２９２４７．１、ＡＡＷ３０００７．１、ＡＡＨ９０２３２．１、Ａ２９６１９、ＮＰ－００１００７９０５．１、ＡＡＨ７３５０８．１、ＡＡＤＯ２２０１．１、ＮＰ－９９９７９３．１、ＮＰ－９９０５４２．１、ＡＡＦ１９８４１．１、ＡＡＣ９７４８８．１、ＡＡＣ６００３８．１、ＮＰ９８９１９７．１、ＮＰ－５７１４３４．１、ＥＡＬ４１２２９．１、ＡＡＴ０７３０２．１、ＣＡＩ１９４７２．１、ＮＰ－０３１５８２．１、ＡＡＡ４０５４８．１、ＸＰ－５３５８８０．１、ＮＰ－１－０３７２３９．１、ＡＡＴ７２００７．１、ＸＰ－４１８９５６．１、ＣＡＡ４１６３４．１、ＢＡＣ３０８６４．１、ＣＡＡ３８８５０．１、ＣＡＢ８１６５７．２、ＣＡＡ４５０１８．１、ＣＡＡ４５０１９．１、ＢＡＣ２８２４７．１、ＮＰ－０３１５８１．１、ＮＰ－９９０４７９．１、ＮＰ－９９９８２０．１、ＡＡＢ２７３３５．１、Ｓ４５３５５、ＣＡＢ８２００７．１、ＸＰ－５３４３５１．１、ＮＰ－０５８８７４．１、ＮＰ－０３１５７９．１、１ＲＥＷ、ＡＡＢ９６７８５．１、ＡＡＢ４６３６７．１、ＣＡＡ０５０３３．１、ＢＡＡ８９０１２．１、ＩＥＳ７、ＡＡＰ２０８７０．１、ＢＡＣ２４０８７．１、ＡＡＧ０９７８４．１、ＢＡＣ０６３５２．１、ＡＡＱ８９２３４．１、ＡＡＭ２７０００．１、ＡＡＨ３０９５９．１、ＣＡＧＯ１４９１．１、ＮＰ－５７１４３５．１、１ＲＥＵ、ＡＡＣ６０２８６．１、ＢＡＡ２４４０６．１、Ａ３６１９３、ＡＡＨ５５９５９．１、ＡＡＨ５４６４７．１、ＡＡＨ９０６８９．１、ＣＡＧ０９４２２．１、ＢＡＤ１６７４３．１、ＮＰ－０３２１３４．１、ＸＰ－５３２１７９．１、ＡＡＢ２４８７６．１、ＡＡＨ５７７０２．１、ＡＡＡ８２６１６．１、ＣＡＡ４０２２２．１、ＣＡＢ９０２７３．２、ＸＰ－３４２５９２．１、ＸＰ－５３４８９６．１、ＸＰ－５３４４６２．１、１ＬＸＩ、ＸＰ－４１７４９６．１、ＡＡＦ３４１７９．１、ＡＡＬ７３１８８．１、ＣＡＦ９６２６６．１、ＡＡＢ３４２２６．１、ＡＡＢ３３８４６．１、ＡＡＴ１２４１５．１、ＡＡ０３３８１９．１、ＡＡＴ７２００８．１、ＡＡＤ３８４０２．１、ＢＡＢ６８３９６．１、ＣＡＡ４５０２１．１、ＡＡＢ２７３３７．１、ＡＡＰ６９９１７．１、ＡＡＴＩ２４１６．１、ＮＰ－５７１３９６．１、ＣＡＡ５３５１３．１、ＡＡ０３３８２０．１、ＡＡＡ４８５６８．１、ＢＡＣ０２６０５．１、ＢＡＣ０２６０４．１、ＢＡＣ０２６０３．１、ＢＡＣ０２６０２．１、ＢＡＣ０２６０１．１、ＢＡＣ０２５９９．１、ＢＡＣ０２５９８．１、ＢＡＣ０２５９７．１、ＢＡＣ０２５９５．１、ＢＡＣ０２５９３．１、ＢＡＣ０２５９２．１、ＢＡＣ０２５９０．１、ＡＡＤ２８０３９．１、ＡＡＰ７４５６０．１、ＡＡＢ９４７８６．１、ＮＰ－００１４８３．２、ＸＰ－５２８１９５．１、ＮＰ－５７１４１７．１、ＮＰ－００１００１５５７． Ｉ、ＡＡＨ４３２２２．１、ＡＡＭ３３１４３．１、ＣＡＧ１０３８１．１、ＢＡＡ３１１３２．１、ＥＡＬ３９６８０．１、ＥＡＡ１２４８２．２、Ｐ３４８２０、ＡＡＰ８８９７２．１、ＡＡＰ７４５５９．１、ＣＡＩ１６４１８．１、ＡＡＤ３０５３８．１、ＸＰ－３４５５０２．１、ＮＰ－１－０３８５５４．１、ＣＡＧ０４０８９．１、ＣＡＤ６０９３６．２、ＮＰ－０３１５８４．１、Ｂ５５４５２、ＡＡＣ６０２８５．１、ＢＡＡ０６４１０．１、ＡＡＨ５２８４６．１、ＮＰ－０３１５８０．１、ＮＰ－１－０３６９５９．１、ＣＡＡ４５８３６．１、ＣＡＡ４５０２０．１、Ｑ２９６０７、ＡＡＢ２７３３６．１、ＸＰ－５４７８１７．１、ＡＡＴ１２４１４．１、ＡＡＭ５４０４９．１、ＡＡＨ７８９０１．１、ＡＡ０２５７４５．１、ＮＰ－５７０９１２．１、ＸＰ－３９２１９４．１、ＡＡＤ２０８２９．１、ＡＡＣ９７１１３．１、ＡＡＣ６１６９４．１、ＡＡＨ６０３４０．１、ＡＡＲ９７９０６．１、ＢＡＡ３２２２７．１、ＢＡＢ６８３９５．１、ＢＡＣ０２８９５．１、ＡＡＷＳ １４５１．１、ＡＡＦ８２１８８．１、ＸＰ－５４４１８９．１、ＮＰ－９９０５６８．１、ＢＡＣ８０２１１．１、ＡＡＷ８２６２０．１、ＡＡＦ９９５９７．１、ＮＰ－５７１０６２．１、ＣＡＣ４４１７９．１、ＡＡＢ９７４６７．１、ＡＡＴ９９３０３．１、ＡＡＤ２８０３８．１、ＡＡＨ５２１６８．１、ＮＰ－００１００４１２２．１、ＣＡＡ７２７３３．１、ＮＰ－０３２１３３．２、ＸＰ－３９４２５２．１、ＸＰ－２２４７３３．２、ＪＨ０８０１、ＡＡＰ９７７２１．１、ＮＰ－９８９６６９．１、Ｓ４３２９６、Ｐ４３０２９、Ａ５５４５２、ＡＡＨ３２４９５．１、ＸＰ－５４２９７４．１、ＮＰ－０３２１３５．１、ＡＡＫ３０８４２．１、ＡＡＫ２７７９４．１、ＢＡＣ３０８４７．１、ＥＡＡ１２０６４．２、ＡＡＰ９７７２０．１、ＸＰ－５２５７０４．１、ＡＡＴ０７３０１．１、ＢＡＤ０７０１４．１、ＣＡＦ９４３５６．１、ＡＡＲ２７５８１．１、ＡＡＧ１３４００．１、ＡＡＣ６０１２７．１、ＣＡＦ９２０５５．１、ＸＰ－５４０１０３．１、ＡＡ０２０８９５．１、ＣＡＦ９７４４７．１、ＡＡＳ０１７６４．１、ＢＡＤ０８３１９．１、ＣＡＡ１０２６８．１、ＮＰ－９９８１４０．１、ＡＡＲ０３８２４．１、ＡＡＳ４８４０５．１、ＡＡＳ４８４０３．１、ＡＡＫ５３５４５．１、ＡＡＫ８４６６６．１、ＸＰ－３９５４２０．１、ＡＡＫ５６９４１．１、ＡＡＣ４７５５５．１、ＡＡＲ８８２５５．１、ＥＡＬ３３０３６．１、ＡＡＷ４７７４０．１、ＡＡＷ２９４４２．１、ＮＰ－７２２８１３．１、ＡＡＲＯ８９０１．１、ＡＡＯ １５４２０．２、ＣＡＣ５９７００．１、ＡＡＬ２６８８６．１、ＡＡＫ７１７０８．１、ＡＡＫ７１７０７．１、ＣＡＣ５１４２７．２、ＡＡＫ６７９８４．１、ＡＡＫ６７９８３．１、ＡＡＫ２８７０６．１、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、ＣＡＧ０２４５０．１、ＡＡＣ４７５５２．１、ＮＰ－００５８０２．１、ＸＰ－３４３１４９．１、ＡＷ３４０５５．１、ＸＰ－５３８２２１．１、ＡＡＲ２７５８０．１、ＸＰ－１２５９３５．３、ＡＡＦ２１６３３．１、ＡＡＦ２１６３０．１、ＡＡＤ０５２６７．１、Ｑ９Ｚ１ Ｗ４、ＮＰ－１－０３１５８５．２、ＮＰ－５７１０９４．１、ＣＡＤ４３４３９．１、ＣＡＦ９９２１７．１、ＣＡＢ６３５８４．１、ＮＰ－７２２８４０．１、ＣＡＥ４６４０７．１、ＸＰ－１－４１７６６７．１、ＢＡＣ５３９８９．１、ＢＡＢ１９６５９．１、ＡＡＭ４６９２２．１、ＡＡＡ８１１６９．


１、ＡＡＫ２８７０７．１、ＡＡＬ０５９４３．１、ＡＡＢ１７５７３．１、ＣＡＨ２５４４３．１、ＣＡＧ１０２６９．１、ＢＡＤ１６７３１．１、ＥＡＡ００２７６．２、ＡＡＴ０７３２０．１、ＡＡＴ０７３００．１、ＡＡＮ１５０３７．１、ＣＡＨ２５４４２．１、ＡＡＫ０８１５２．２、２００９３８８Ａ、ＡＡＲ１２１６１．１、ＣＡＧＯ１９６１．１、ＣＡＢ６３６５６．１、ＣＡＤ６７７１４．１、ＣＡＦ９４１６２．１、ＮＰ－４７７３４０．１、ＥＡＬ２４７９２．１、ＮＰ－１－００１００９４２８．１、ＡＡＢ８６６８６．１、ＡＡＴ４０５７２．１、ＡＡＴ４０５７１．１、ＡＡＴ４０５６９．１、ＮＰ－０３３８８６．１、ＡＡＢ４９９８５．１、ＡＡＧ３９２６６．１、Ｑ２６９７４、ＡＡＣ７７４６１．１、ＡＡＣ４７２６２．１、ＢＡＣ０５５０９．１、ＮＰ－０５５２９７．１、ＸＰ－５４６１４６．１、ＸＰ－５２５７７２．１、ＮＰ－０６０５２５．２、ＡＡＨ３３５８５．１、ＡＡＨ６９０８０．１、ＣＡＧ１２７５１．１、ＡＡＨ７４７５７．２、ＮＰ－０３４９６４．１、ＮＰ－０３８６３９．１、０４２２２１、ＡＡＦ０２７７３．１、ＮＰ－０６２０２４．１、ＡＡＲ１８２４４．１、ＡＡＲ１４３４３．１、ＸＰ－２２８２８５．２、ＡＡＴ４０５７３．１、ＡＡＴ９４４５６．１、ＡＡＬ３５２７８．１、ＡＡＬ３５２７７．１、ＡＡＬ１７６４０．１、ＡＡＣ０８０３５．１、ＡＡＢ８６６９２．１、ＣＡＢ４０８４４．１、ＢＡＣ３８６３７．１、ＢＡＢ１６０４６．１、ＡＡＮ６３５２２．１、ＮＰ－５７１０４１．１、ＡＡＢ０４９８６．２、ＡＡＣ２６７９１．１、ＡＡＢ９５２５４．１、ＢＡＡ１１８３５．１、ＡＡＲ１８２４６．１、ＸＰ－５３８５２８．１、ＢＡＡ３１８５３．１、ＡＡＫ１８０００．１、ＸＰ－１－４２０５４０．１、ＡＡＬ３５２７６．１、ＡＡＱ９８６０２．１、ＣＡＥ７１９４４．１、ＡＡＷ５０５８５．１、ＡＡＶ６３９８２．１、ＡＡＷ２９９４１．１、ＡＡＮ８７８９０．１、ＡＡＴ４０５６８．１、ＣＡＤ５７７３０．１、ＡＡＢ８１５０８．１、ＡＡＳ００５３４．１、ＡＡＣ５９７３６．１、ＢＡＢ７９４９８．１、ＡＡＡ９７３９２．１、ＡＡＰ８５５２６．１、ＮＰ－９９９６００．２、ＮＰ－８７８２９３．１、ＢＡＣ８２６２９．１、ＣＡＣ６０２６８．１、ＣＡＧ０４９１９．１、ＡＡＮ１０１２３．１、ＣＡＡ０７７０７．１ ＡＡＫ２０９１２．１、ＡＡＲ８８２５４．１、ＣＡＣ３４６２９．１、ＡＡＬ３５２７５．１、ＡＡＤ４６９９７． Ｉ、ＡＡＮ０３８４２．１、ＮＰ－５７１９５１．２、ＣＡＣ５０８８１．１、ＡＡＬ９９３６７．１、ＡＡＬ４９５０２．１、ＡＡＢ７１８３９．１、ＡＡＢ６５４１５．１、ＮＰ－６２４３５９．１、ＮＰ－９９０１５３．１、ＡＡＦ７８０６９．１、ＡＡＫ４９７９０．１、ＮＰ－９１９３６７．２、ＮＰ－００１１９２．１、ＸＰ－５４４９４８．１、ＡＡＱ１８０１３．１、ＡＡＶ３８７３９．１、ＮＰ－８５１２９８．１、ＣＡＡ６７６８５．１、ＡＡＴ６７１７１．１、ＡＡＴ３７５０２．１、ＡＡＤ２７８０４．１、ＡＡＮ７６６６５．１、ＢＡＣ１１９０９．１、ＸＰ－１－４２１６４８．１、ＣＡＢ６３７０４．１、ＮＰ－０３７３０６．１、Ａ５５７０６、ＡＡＦ０２７８０．１、ＣＡＧ０９６２３．１、ＮＰ－０６７５８９．１、ＮＰ－０３５７０７．１、ＡＡＶ３０５４７．１、ＡＡＰ４９８１７．１、ＢＡＣ７７４０７．１、ＡＡＬ８７１９９．１、ＣＡＧ０７１７２．１、Ｂ３６１９３、ＣＡＡ３３０２４．１、ＮＰ－１－００１００９４００．１、ＡＡＰ３６５３８．１、ＸＰ－５１２６８７．１、ＸＰ－５１００８０．１、ＡＡＨ０５５１３．１、１ＫＴＺ、ＡＡＨ１４６９０．１、ＡＡＡ３１５２６．１によって特定される。

【0312】

[00321]本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、天然に得ることができるかまたは組換え体であり得る。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡを含む。用語「アクチビンＡ」は、アクチビンＡの断片および誘導体を含み得る。アクチビンＡの非限定的な例示的な配列を表１に列挙する。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、配列番号１の配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、配列番号２～１５のいずれか１つの配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。

【0313】

[00322]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。用語「ＧＤＦ８」は、ＧＤＦ８の断片および誘導体を含み得る。ＧＤＦ８ポリペプチドの配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＡＸ１０８８０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0314】

[00323]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ＧＤＦ８に密接に関連する成長因子、例えば、成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ１１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＦ２１６３０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0315】

[00324]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する薬剤と置き換えることができる。ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する例示的な薬剤としては、限定されないが、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２が挙げられる。

【0316】

骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤
[00325]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。ＢＭＰシグナル伝達ファミリーは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの多様なサブセットである（Ｓｅｂａｌｄら Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８５：６９７～７１０頁、２００４年）。２０種を超える公知のＢＭＰリガンドは、３つの異なるＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａ、およびＡｃｔＲＩＩｂ）および少なくとも３つのＩ型（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６）受容体によって認識される。二量体のリガンドは、受容体ヘテロマーのアセンブリーを促進し、構成的に活性なＩＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼにＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼをリン酸化させる。活性化Ｉ型受容体は、ＢＭＰ応答性（ＢＲ－）ＳＭＡＤエフェクター（ＳＭＡＤ１、５、および８）をリン酸化して、ＴＧＦシグナル伝達も促進するｃｏ－ＳＭＡＤであるＳＭＡＤ４との複合体における核移行を促進する。さらに、ＢＭＰシグナルは、ＳＭＡＤに依存しない手法で、ＭＡＰＫ ｐ３８などの細胞内エフェクターを活性化し得る（Ｎｏｈｅら Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １６：２９１～２９９頁、２００４年）。可溶性ＢＭＰアンタゴニスト、例えば、ノギン、コーディン、グレムリン、およびフォリスタチンは、リガンド隔離によってＢＭＰシグナル伝達を制限する。

【0317】

[00326]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ－１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：

【0318】

【化5】

【0319】

[00327]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ１９３１８９、１０６２３６８－２４－４、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭ ３１８９、ＤＭ－３１８９、ＩＵＰＡＣ名：４－［６－（４－ピペラジン－１－イルフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノロンとしても公知）を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：

【0320】

【化6】

【0321】

[00328]一部の事例では、ＤＭＨ－１はＬＤＮ１９３１８９と比較してより選択的である。本開示の一部の実施形態では、ＤＭＨ－１は本明細書で提供される方法に特に有用である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＬＤＮ１９３１８９の使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を産生するために、ＬＤＮ１９３１８９、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を産生するための、ＤＭＨ－１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用に関する。

【0322】

[00329]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９の類似体または誘導体、例えば、ＬＤＮ１９３１８９の塩、水和物、溶媒、エステル、またはプロドラッグを含む。一部の実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９の誘導体（例えば、塩）は、ＬＤＮ１９３１８９ヒドロクロリドを含む。

【0323】

[00330]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１１／００５３９３０号からの式Ｉの化合物を含む。

【0324】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤
[00331]本開示の態様は、細胞分化因子としてのＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。

【0325】

[00332]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ－β ＲＩ）シグナル伝達を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２、ＲｅｐＳｏｘとしても公知であるＴＧＦ－Ｂ ＲＩキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤、ＩＵＰＡＣ名：２－［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。

【0326】

[00333]一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体（「ＡＬＫ５ｉ」とも称される）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００２１５１９号に記載されている式Ｉの化合物である。

【0327】

[00334]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２６７７３１号に記載されているＴＧＦ－β受容体阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００９／０１８６０７６号および同第２００７／０１４２３７６号に記載されているＡＬＫ５阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ ８３－０１である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ ８３－０１ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ａ ８３－０１を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ４３１５４２である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ４３１５４２ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ４３１５４２を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ ４４７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ ４４７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ｄ ４４７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ７８８３８８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ３６４９４７である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ３６４９４７ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ ３６４９４７を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ５８０２７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ５８０２７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ ５８０２７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５２５３３４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５２５３３４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ５２５３３４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５０５１２４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５０５１２４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ５０５１２４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ ２０８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ ２０８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＤ ２０８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ６６０４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ６６０４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ６６０４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ７８８３８８を除外する。

【0328】

[00335]上記化合物のコレクションから、以下のものを様々な供給源から得ることができる：Ｓｉｇｍａ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １４５０８， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ６３１７８－９９１６から入手可能なＬＹ－３６４９４７、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、およびＳＢ－５０５１２４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．），４８０ Ｓ． Ｄｅｍｏｃｒａｔ Ｒｏａｄ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， Ｎ．Ｊ．， ０８０２７から入手可能な６１６４５２および６１６４５３；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ， ９８０ Ｇｒｅａｔ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＴＷ８ ９ＧＳ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能なＧＷ７８８３８８およびＧＷ６６０４；Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ． ４６２８５から入手可能なＬＹ５８０２７６；ならびにＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １４６２７， ５０００ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， Ｎ．Ｃ．， ２７７０９－４６２７から入手可能なＳＭ１６。

【0329】

ＷＮＴシグナル伝達経路
[00336]本開示の態様は、細胞分化因子としてのＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤の使用に関する。

【0330】

[00337]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１の誘導体、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の塩、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１のトリヒドロクロリド、ヒドロクロリド塩を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定されないが、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびこれらのいずれかの類似体または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤を除外する。

【0331】

[00338]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤を含まない。
[00339]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤の使用に関する。

【0332】

[00340]一部の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤は、少なくとも１つのタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）タンパク質の発現または活性を阻害するタンキラーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つのタンキラーゼタンパク質はタンキラーゼ１またはタンキラーゼ２である。一部の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤は、タンニラーゼタンパク質のニコチンアミドサブサイトもしくはアデノシンサブサイト、またはその両方への基質の結合を阻害する。一部の実施形態では、タンキラーゼ阻害剤は、ＡＺ６１０２、ＪＷ５５、ＭＮ６４、ＩＷＲ－ｌ－エンド、ＴＣ－Ｅ５００１、ＷＩＫＩ４、ＴＮＫＳ２２、ＴＮＫＳ４９、２Ｘ－１２１（Ｅ７４４９）、ＸＡＶ－９３９（ＸＡＶ）、Ｇ００７－ＬＫ．ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６、デセルノチニブ、（ＶＸ－５０９）、ビスモデギブ（ＧＤＣ－０４４９）、ＩＭ－１２、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＩＮＯ－１００１、オフロキサシン、ＴＧ１０１２０９、ＦＧ－４５９２、１－ＢＥＴ－７６２、ＬＹ２１５７２９９、ＭＫ－０７５２、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＭＣ１５６８、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ＳＢ４１５２８６、ドロシノスタット、ＩＷＲ－ｌ－エンド、ノルフロキサシン、ＳＨ－４－５４、ネクスツラスタットＡ、ＳＢ２１６７６３、ＵＮＣＯ７９、デフネチン、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＲｅｐＳｏｘ、ソトラスタウリン、ＳＢ４３１５４２、トファシチニブ（ＣＰ－６９０５５０、タソシチニブ）、ＡＧ－１４３６１、ＣＩ９９４（タセシナリン）、メシル酸Ｒｏ３１－８２２０、レスベラトロール、ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６、またはＹＯ－０１０２７である。一部の実施形態では、上記タンキラーゼ阻害剤は、ＡＺ６１０２、ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６、またはＩＷＲ－ｌ－エンドである。一部の実施形態では、タンキラーゼ阻害剤はＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６（ＮＶＰ）である。一部の実施形態では、タンニラーゼ阻害剤は、タンニラーゼ２よりもタンニラーゼ１を選択的に阻害する。一部の実施形態では、タンニラーゼ阻害剤は、タンニラーゼ１よりもタンニラーゼ２を選択的に阻害する。

【0333】

[00341]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤を含まない。
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー
[00342]本開示の態様は、細胞分化因子としてのＦＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。

【0334】

[00343]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。ＫＧＦのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＫＧＦポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ２１４３１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、配列番号１６の配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0335】

[00344]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ＦＧＦ２を含む。ＦＧＦ２のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００１９９７）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0336】

[00345]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。ＦＧＦ８Ｂのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ８Ｂポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ４０９５４）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0337】

[00346]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ１０を含む。ＦＧＦ１０のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＧ４６４８９）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0338】

[00347]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２１を含む。ＦＧＦ２１のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ８９４４４．１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0339】

ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路
[00348]本開示の態様は、細胞分化因子としてのＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。

【0340】

[00349]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ２を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ３を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ４を含む。一部の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｃｕｒ６１４１４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、フォースコリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トマチジンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＹ９９４４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トリパラノールを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、化合物Ａまたは化合物Ｂを含む（米国特許出願公開第２００４／００６０５６８号に開示されている）。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００６／０２７６３９１号に開示されているヘッジホッグシグナル伝達にアンタゴナイズするステロイダルアルカロイド（例えば、シクロパミンまたはその誘導体）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤を除外する。

【0341】

Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路
[00350]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）の使用に関する。

【0342】

[00351]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の例では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：

【0343】

【化7】

【0344】

[00352]一部の事例では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：

【0345】

【化8】

【0346】

[00353]本明細書において提供される方法および組成物において使用することができるＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル/ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、リパスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、オレフィン、イソキノリン、インダゾール、およびピリジンアルケン誘導体、ＲＯＫα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキサミド、Ｒｈｏｓｔａｔｉｎ、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、ＢＡ－２１５、ＢＡ－２８５、ＢＡ－１０３７、Ｋｉ－２３０９５、ＶＡＳ－０１２、ならびにキナゾリンが挙げられる。

【0347】

レチノイン酸シグナル伝達経路
[00354]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターの使用に関する。

【0348】

[00355]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の活性化剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸受容体アゴニストを含む。本明細書において提供される方法および組成物における例示的なレチノイン酸受容体アゴニストとしては、限定されないが、ＣＤ １５３０、ＡＭ ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、ＢＭＳ ９６１、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ ２３１４が挙げられる。

【0349】

[00356]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の阻害剤を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢ（ＩＵＰＡＣ名：２－［２－（ジエチルアミノ）エトキシ］３－プロパ－２－エニルベンズアルデヒド）を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢの類似体または誘導体を含む。

【0350】

[00357]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニストを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸受容体アンタゴニストは、（Ｅ）－４－［２－（５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－フェニル－２－ナフタレニル）エテニル］安息香酸、（Ｅ）－４－［［（５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－フェニルエチニル）－２－ナフタレニル］エテニル］安息香酸、（Ｅ）－４－［２－［５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－（２－ナフタレニル）－２－ナフタレニル］エテニル］－安息香酸、および（Ｅ）－４－［２－［５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－（４－メトキシフェニル）－２－ナフタレニル］エテニル］安息香酸を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＢＭＳ １９５６１４（ＣＡＳ番号２５３３１０－４２－８）、ＥＲ ５０８９１（ＣＡＳ番号１８７４００－８５－７）、ＢＭＳ ４９３（ＣＡＳ番号１７０３５５－７８－９）、ＣＤ ２６６５（ＣＡＳ番号１７０３５５－７８－９）、ＬＥ １３５（ＣＡＳ番号１５５８７７－８３－１）、ＢＭＳ ４５３（ＣＡＳ番号１６６９７７－４３－１）、またはＭＭ １１２５３（ＣＡＳ番号３４５９５２－４４－５）を含む。

【0351】

[00358]ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターを除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤を除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤を除外する。

【0352】

プロテインキナーゼＣ活性化剤
[00359]本開示の側面は、細胞分化因子としてのプロテインキナーゼＣ活性化剤の使用に関する。プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最も大きなファミリーのうちの１つであり、種々のアイソフォームから構成される。従来のアイソフォームとしては、ａ、βＩ、βＩＩ、γが挙げられ；新規アイソフォームとしては、δ、ε、η、Θが挙げられ；および非典型的アイソフォームとしては、ξ、およびι／λが挙げられる。ＰＫＣ酵素は、主にサイトゾルであるが、活性化されると膜に移動する。細胞質では、ＰＫＣは他のキナーゼによってリン酸化されるかまたは自己リン酸化される。活性化されるために、一部のＰＫＣアイソフォーム（例えば、ＰＫＣ－ε）は、ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位またはホスファチジルセリン（「ＰＳ」）結合部位に結合するために分子を必要とする。他のものは、いずれの二次的結合メッセンジャーも必要とせず活性化され得る。ＤＡＧ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、ブリオスタチン、ピコローグ（ｐｉｃｏｌｏｇｕｅ）、ホルボールエステル、アプリシアトキシン、およびグニジマクリンが挙げられる。ＰＳ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、多価不飽和脂肪酸およびその誘導体が挙げられる。単独でまたは１つまたは複数の他のβ細胞分化因子と組み合わせて、少なくとも１つのインスリンを産生する内分泌細胞またはその前駆体の、ＳＣ－β細胞への分化を誘導することが可能である任意のプロテインキナーゼＣ活性化剤を本明細書に記載の方法、組成物、およびキットにおいて使用することができることが企図される。

【0353】

[00360]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＰｄＢＵを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＢを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、米国特許公開第２０１４０３１５９９０Ａ１号に記載されているように、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ－１８）、インスリン成長因子、ホルモン、および成長因子活性化剤を含む。一部の実施形態では、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｉｎ）は、ブリオスタチン－１、ブリオスタチン－２、ブリオスタチン－３、ブリオスタチン－４、ブリオスタチン－５、ブリオスタチン－６、ブリオスタチン－７、ブリオスタチン－８、ブリオスタチン－９、ブリオスタチン－１０、ブリオスタチン－１１、ブリオスタチン－１２、ブリオスタチン－１３、ブリオスタチン－１４、ブリオスタチン－１５、ブリオスタチン－１６、ブリオスタチン－１７、またはブリオスタチン－１８を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼＣ活性化剤を除外する。

【0354】

γ－セクレターゼ阻害剤
[00361]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのγ－セクレターゼ阻害剤の使用に関する。

【0355】

[00362]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ－セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。本明細書において提供される方法および組成物における追加の例示的なγ－セクレターゼ阻害剤としては、限定されないが、米国特許第７，０４９，２９６号、同第８，４８１，４９９号、同第８，５０１，８１３号、および米国特許公開第２０１４０２４３３７４Ａ１号に記載のγ－セクレターゼ阻害剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、γ－セクレターゼ阻害剤を除外する。

【0356】

甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤
[00363]本開示の態様は、β細胞分化因子としての甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の使用に関する。

【0357】

[00364]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、ＧＣ－１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３またはＧＣ－１の類似体または誘導体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるＴ３の例示的な類似体としては、以下に限定されないが、選択的および非選択的甲状腺ホルモン模倣物（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ＴＲβ選択的アゴニスト－ＧＣ－１、ＧＣ－２４、４－ヒドロキシ－ＰＣＢ １０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４，３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ－βアゴニスト ＧＣ－１；３－ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５－トリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンチロキシンの生物活性代謝産物（Ｔ（４）））；ＫＢ－２１１５およびＫＢ－１４１；チロナミン；ＳＫＦ Ｌ－９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’－ＡＣ－Ｔ２；テトラヨードサイロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン［Ｔ４］およびトリヨードチロニン［Ｔ３］アラニン鎖の酸化的脱アミノ化および脱炭酸化による）、３，３’，５’－トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化による）、３，３’－ジヨードチロニン（３，３’－Ｔ２）および３，５－ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化による）、および３－ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化およびアミノ酸脱炭酸化による）、ならびにＴＨの構造的類似体として、例えば、３，５，３’－トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５－ジブルモ－３－ピリダジノン－１－チロニン（Ｌ－９４０９０１）、Ｎ－［３，５－ジメチル－４－（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルフェノキシ）－フェニル］－オキサミン酸（ＣＧＳ ２３４２５）、３，５－ジメチル－４－［（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルベンジル）－フェノキシ］酢酸（ＧＣ－１）、３，５－ジクロロ－４－［（４－ヒドロキシ－３－イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ－１４１）、および３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられる。

【0358】

[00365]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えば、Ｔ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ－３，５，３’，５’－テトラヨードチロニン）を含む。

【0359】

[00366]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１６３，９１８号に記載されたヨードチロニン組成物である。

【0360】

上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリー
[00367]本開示の態様は、細胞分化因子としてのＥＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。

【0361】

[00368]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ベータセルリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦを含む。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、大きな膜内在性タンパク質前駆体からタンパク質分解によって切断された５３アミノ酸のサイトカインである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、バリアントＥＧＦポリペプチド、例えば、米国特許第７，０８４，２４６号に開示されているように、ヒト野生型ＥＧＦポリペプチド配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する単離された上皮細胞成長因子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、米国特許第８，２４７，５３１号に開示されているように、ＥＧＦ受容体に結合し、これをアゴナイズする、操作されたＥＧＦ突然変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦファミリーのシグナル伝達経路を活性化する薬剤と置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、ＥＧＦを模倣する化合物を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＥＧＦファミリーからの成長因子を除外する。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物および方法において使用されるＥＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトベータセルリンアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ２５４５２．１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物および方法において使用されるＥＧＦファミリーからの成長因子は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物および方法において使用されるＥＧＦファミリーからの成長因子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。

【0362】

【表1-1】

【0363】

【表1-2】

【0364】

【表1-3】

【0365】

【表1-4】

【0366】

エピジェネティック修飾化合物
[00369]本開示の態様は、細胞分化因子としてのエピジェネティック修飾化合物の使用に関する。

【0367】

[00370]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクスを起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現を変化させる化合物を意味し得る。エピジェネティクスは遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある種の細胞、例えばβ－細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制することができる。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要であり得る。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し得、これは分化の間に不活性化される。非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

【0368】

[00371]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサーの阻害剤である。ＥＺＨ２はヒストン－リシン Ｎ－メチルトランスフェラーゼ酵素である。本明細書で提供される方法において使用できるＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例には、３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ６４３８、ＥＰＺ００５６８７（Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤）、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、およびＵＮＣ１９９９が含まれる。ＤＺＮｅｐは全てのタンパク質メチルトランスフェラーゼの生成物系阻害剤であるＳ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）の加水分解を阻害してＳＡＨの細胞内濃度の上昇を導き、これが次にＥＺＨ２を阻害することができる。ＤＺＮｅｐはＥＺＨ２に特異的ではなく、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをも阻害することができる。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ１の１５０倍の選択性を有するＳＡＭ競合性ＥＺＨ２阻害剤である。ＵＮＣ１９９９はＧＳＫ１２６の類似体であり、その相当物であるＧＳＫ１２６より選択性が低い。

【0369】

[00372]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０（メルカプトケトン系ＨＤＡＣ阻害剤）、ＭＣ１５６８（クラスＩＩａ ＨＤＡＣ阻害剤）、ＴＭＰ１９５（クラスＩＩａ ＨＤＡＣ阻害剤）、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタット、ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）、チダミド、パノビノスタット（ファリダク）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）、ＳＢ９３９、レスミノスタット（４ＳＣ－２０１）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＨＢＩ－８０００（ベンザミドＨＤＩ）、ケベトリン、ＣＵＤＣ－１０１、ＡＲ－４２、ＣＨＲ－２８４５、ＣＨＲ－３９９６、４ＳＣ－２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ－１２１５、ＭＥ－３４４、スルホラファン、またはそれらの任意の変異体である。

【0370】

[00373]例示的なヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤としては、以下に限定されないが、例えば、３－デアザネプラノシンＡ塩酸塩（ＤＺＮｅｐ－（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）－３－（ヒドロキシメチル）シクロペンタ－３－エン－１，２－ジオール）；Ｂｉｘ－０１２９４、ＵＮＣ０６３８、ＢＲＤＤ４７７０、ＥＰＺ００４７７７、ＡＺ５０５、ＰＤＢ４ｅ４７、アルプロ酸（ａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、ボリノスタット、ロミデプシン、エンチノスタット、アベキシノスタット、ジビノスタット、およびモセチノスタット、ブチレート、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）ファミリーの成員が挙げられ得る。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、以下の構造を有する：

【0371】

【化9】

【0372】

[00374]一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤の濃度は、約０．１～１１０ｎΜ、０．１～１００ｎＭ、または０．１～５０ｎＭである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤の濃度は約１００ｎＭである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐであり、阻害剤の濃度は約１００ｎＭである。

【0373】

[00375]一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭであり得る。

【0374】

プロテインキナーゼ阻害剤
[00376]本開示の態様は、細胞分化因子としてのプロテインキナーゼ阻害剤の使用に関する。

【0375】

[00377]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンの類似体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるスタウロスポリンの例示的な類似体としては、限定されないが、Ｒｏ－３１－８２２０、ビシインドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’－｛５”－［（メトキシカルボニル）アミノ］－２”－メチル｝－フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、スタラログ（例えば、Ｌｏｐｅｚら、「Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｒｏａｄｅｎ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ａｎａｌｏｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１３年；１３５（４８）：１８１５３～１８１５９頁を参照されたい。）、およびｃｇｐ４１２５１が挙げられる。

【0376】

[00378]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、ＰＫＣβの阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、以下の構造を有するＰＫＣβの阻害剤、または以下のような化合物の誘導体、類似体もしくはバリアントである：

【0377】

【化10】

【0378】

[00379]一部の実施形態では、ＰＫＣβの阻害剤は、以下の構造を有するＧＳＫ－２化合物、または以下のような化合物の誘導体、類似体、またはバリアントである：

【0379】

【化11】

【0380】

[00380]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣの阻害剤は、ビスインドリルマレイミドである。例示的なビスインドリルマレイミドとしては、限定されないが、ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩｌｌ、ヒドロクロリド、またはその誘導体、類似体もしくはバリアントが挙げられる。

【0381】

[00381]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、シュードヒペリシン、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、インドルビン－３－モノオキシム（ｉｎｄｏｒｕｂｌｉｎ－３－ｍｏｎｏｘｉｍｃ）、５－ヨードまたはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼ阻害剤を除外する。

【0382】

フォークヘッドボックスＯ１（ＦｏｘＯ１）阻害剤
[00382]本開示の態様は、分化因子としてのフォークヘッドボックスＯ１（ＦｏｘＯ１）阻害剤の使用に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物および方法において使用されるＦｏｘＯ１阻害剤は、式（ＸＩＩ）：

【0383】

【化12】

【0384】

の化合物
[00383]またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグ、組成物、もしくは混合物であり、式中、
Ｒ^１は、水素、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または酸素保護基であり；
Ｒ^２は、水素、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または窒素保護基であり；
Ｒ^３の各々の例は、独立して、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または窒素保護基であるか；または任意選択で、Ｒ^３の２つの例は、それらの介在原子と一緒になって、置換もしくは非置換のヘテロ環式または置換もしくは非置換のヘテロアリール環を形成し；
Ｒ^４の各々の例は、独立して、ハロゲン、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヘテロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、－ＯＲ^ｃ１、－ＮＯ_２、－Ｎ（Ｒ^ｃ２）_２、－ＳＲ^ｃ１、－ＣＮ、または－ＳＣＮであり；
Ｒ^５は、水素、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または窒素保護基であり；
Ｒ^６の各々の例は、独立して、ハロゲン、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヘテロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、－ＯＲ^ｃ１、－ＮＯ_２、－Ｎ（Ｒ^ｃ２）_２、－ＳＲ^ｃ１、－ＣＮ、または－ＳＣＮであり；
Ｒ^ｃ１は、水素、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、酸素原子に結合している場合の酸素保護基、または硫黄原子に結合している場合の硫黄保護基であり；
Ｒ^ｃ２の各々の例は、独立して、水素、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または窒素保護基であるか；または任意選択で、Ｒ^ｃ２の２つの例は、それらの介在原子と一緒になって、置換もしくは非置換のヘテロ環式または置換もしくは非置換のヘテロアリール環を形成し；
ｘは、０、１、または２であり；
ｙは、０または１であり、
ｚは、原子価が許す限り、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0385】

[00384]一部の実施形態では、化合物は、式（ＸＩＩ－Ａ）：

【0386】

【化13】

【0387】

またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグ、組成物、もしくは混合物であり、式中、
Ｒ^１は、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルであり；
Ｒ^２は、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルであり；
Ｒ^３の各々の例は、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルであり；
Ｒ^４は、ハロゲン、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヘテロアルキル、任意選択で置換されたアルケニルであり；
Ｒ^５は、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルである。

【0388】

[00385]一部の実施形態では、Ｒ^１は水素である。一部の実施形態では、Ｒ^２は、任意選択で置換されたアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ^２はエチルである。一部の実施形態では、Ｒ^３の少なくとも１つの例は水素である。一部の実施形態では、Ｒ^３の両方の例は水素である。一部の実施形態では、Ｒ^４の少なくとも１つの例はハロゲンである。一部の実施形態では、Ｒ^４の少なくとも１つの例はフッ素である。一部の実施形態では、ｘは１である。一部の実施形態では、Ｒ^５は水素である。一部の実施形態では、ｙは１である。一部の実施形態では、ｚは０である。

【0389】

[00386]一部の実施形態では、化合物は、式（ＸＩＩ－Ｂ）：

【0390】

【化14】

【0391】

またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグ、組成物、もしくは混合物である。
[00387]一部の実施形態では、化合物はＡＳ１８４２８５６である。

【0392】

[00388]一部の実施形態では、本明細書に記載した培地は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含まない。
アセチルＣｏＡ関連代謝産物
[00389]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、培地）は、アセチルＣｏＡ関連代謝産物を含む。アセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）の代謝は、エネルギー生成、脂質合成、タンパク質のアセチル化を含む多くの代謝機能を付与することができる。

【0393】

[00390]例示的なアセチルＣｏＡ関連代謝産物としては、限定されないが、酢酸塩、ピルビン酸塩、ケトン性アミノ酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、トリプトファン、脂肪酸、ＣｏＡ、イソバレリル－ＣｏＡ、およびβ－ヒドロキシブチレートが挙げられる。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は酢酸塩である。一部の実施形態では、本開示の組成物は、２つ以上の異なるアセチルＣｏＡ関連代謝産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるアセチルＣｏＡ関連代謝産物を含有する。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ関連代謝産物は酢酸塩である。

【0394】

[00391]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、アセチルＣｏＡ関連代謝産物を含まない（例えば、酢酸塩を含まない）。
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）
[00392]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含む。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＨＤＡＣ酵素の活性を阻害することにより、ヒストンタンパク質上のリジン残基ならびに他の非ヒストンタンパク質のアセチル化を増加させる化合物の一種である。

【0395】

[00393]例示的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）としては、限定されないが、β－ヒドロキシブチレート、酪酸、クラスＩ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＡ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＢ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＩＩ ＨＤＡＣｉ、クラスＩＶ ＨＤＡＣｉ、ＨＤＡＣ－１、ＨＤＡＣ－２、ＨＤＡＣ－３、ＨＤＡＣ－４、ＨＤＡＣ－５、ＨＤＡＣ－６、ＨＤＡＣ－７、ＨＤＡＣ－８、ＨＤＡＣ－９、ＨＤＡＣ－１０、ＨＤＡＣ－１１、サーチュイン、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ボリノスタット（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ、ＭＫ０６８３）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５、ＳＮＤＸ－２７５）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９、ＮＶＰ－ＬＢＨ５８９）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３、ＭＧ０１０３）、ＧＳＫ３１１７３９１（ＧＳＫ３１１７３９１Ａ、ＨＤＡＣ－ＩＮ－３）、ＢＲＤ３３０８、ＢＲＤ３３０８、ツバスタチンＡ ＴＦＡ（ツバスタチンＡトリフルオロ酢酸塩）、ツバスタチンＡ、ＳＩＳ１７、ＮＫＬ２２、ＢＭＬ－２１０（ＣＡＹ１０４３３）、ＴＣ－Ｈ １０６、ＳＲ－４３７０、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、ＮＳＣ７２６６３０、ＰＸ－１０５６８４）、ロミデプシン（ＦＫ２２８、デプシペプチド、ＦＲ９０１２２８、ＮＳＣ６３０１７６）、ＭＣ１５６８、ジビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ダシノスタット（ＬＡＱ８２４、ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４）、ＣＵＤＣ－１０１、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、プラシノスタット（ＳＢ９３９）、ＰＣＩ－３４０５１、ドロキシノスタット（ＮＳ４１０８０）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１、ＣＲＡ－０２４７８１）、ＲＧＦＰ９６６、ＡＲ－４２（ＨＤＡＣ－４２）、リコリノスタット（ＡＣＹ－１２１５、ロシリノスタット）、バルプロ酸ナトリウム塩（バルプロ酸ナトリウム）、タセジナリン（ＣＩ９９４、ＰＤ－１２３６５４、ＧＯＥ－５５４９、アセチルジナリン）、フィメピノスタット（ＣＵＤＣ－９０７）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、クルクミン、ジフェルロイルメタン、Ｍ３４４、ツバシン、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、レスミノスタット（ＲＡＳ２４１０）、ジバルプロエクスナトリウム、スクリプタイド（ＧＣＫ１０２６）、フェニル酪酸ナトリウム、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｎｃ ａｃｉｄ）（シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｃ ａｃｉｄ））、ＴＭＰ２６９、サンタクルザメートＡ（ＣＡＹ１０６８３）、ＴＭＰ１９５（ＴＦＭＯ２）、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ＵＦ０１０、タスキニモド（ＡＢＲ－２１５０５０）、ＳＫＬＢ－２３ｂｂ、イソグアノシン、ルフォラファン、ＢＲＤ７３９５４、シタリノスタット（ＡＣＹ－２４１、ＨＤＡＣ－ＩＮ－２）、スベロヒドロキサム酸、プリトマイシン、ＨＰＯＢ、ＬＭＫ－２３５、ビフェニル－４－スルホニルクロリド（ｐ－フェニルベンゼンスルホニル、４－ヘニルベンゼンスルホニル、ｐ－ビフェニルスルホニル）、ネクスツラスタットＡ、ＴＨ３４、ツシジノスタット（キダミド、ＨＢＩ－８０００、ＣＳ－０５５）、（－）－パルテノイド、ＷＴ１６１、ＣＡＹ１０６０３、ＡＣＹ－７３８、ラッドデアニンＡ、チノスタムスチン（ＥＤＯ－Ｓ１０１）、ドマチノスタット（４ＳＣ－２０２）、およびＢＧ４５が挙げられる。

【0396】

[00394]一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉは、β－ヒドロキシブチレートである。β－ヒドロキシブチレートはケトン体であり、酪酸とともにＧｉ／ｏカップリングしたＧＰＣＲであるヒドロキシカルボン酸受容体２（ＨＣＡ２）のアゴニストである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣｉ阻害剤は、ヒドロキシカルボン酸受容体２のアゴニストである。

【0397】

[00395]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、ＨＤＡＣｉを含まない（例えば、β－ヒドロキシ酪酸塩を含まない）。
酸化還元ホメオスタシス調節剤
[00396]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、酸化還元ホメオスタシス調節剤を含む。

【0398】

[00397]例示的な酸化還元ホメオスタシス調節剤としては、限定されないが、タウリン、呼吸鎖調節物質、フリーラジカルスカベンジャー、ミトコンドリアタンパク質合成の制御因子、アリウム硫黄化合物、アントシアニン、ベータ－カロテン、カテキン、銅、クリプトキサンチン、フラボノイド、インドール、イソフラボノイド、リグナン、ルテイン、リコピン、アルファリポ酸、エラグ酸、マンガン、ポリフェノール、セレン、グルタチオン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、亜鉛、スーパーオキシドジスーターゼ、ＧＳＨＰｘ、Ｐｒｘ－Ｉ、カタラーゼ、コエンザイムＱ１０が挙げられる。

【0399】

[00398]一部の実施形態では、酸化還元ホメオスタシス調節剤はタウリンである。
[00399]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、酸化還元ホメオスタシス調節剤を含まない。

【0400】

[00400]タウリンは非タンパク質性のβ－アミノスルホン酸であり、メチオニンおよびシステインの代謝に由来し得る。一部の実施形態では、タウリンは呼吸鎖内のＲＯＳ産生を阻害することができる。

【0401】

[00401]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、酸化還元ホメオスタシス調節剤を含まない（例えば、タウリンを含まない）。
一炭素代謝経路中間体
[00402]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）は、一炭素代謝経路中間体を含む。葉酸塩補因子を介する一炭素代謝は、アミノ酸ホメオスタシス（メチオニン、グリシンおよびセリン）、ヌクレオチド（プリン、チミジン）の生合成、エピジェネティクスの維持、酸化還元防御を含む複数の生理学的プロセスを支える。

【0402】

[00403]例示的な一炭素代謝経路中間体としては、限定されないが、ギ酸塩、テトラヒドロ葉酸塩（ＴＨＦ）、１０－ホルミルＴＨＦ；５，１０－ｍｅＴＨＦ；５，１０－ｍｅＴＨＦ；および１０－ホルミルＴＨＦが挙げられる。

【0403】

[00404]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、一炭素代謝経路中間体を含まない（例えば、ギ酸塩を含まない）。
グルタミン
[00405]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば培地）はグルタミンを含む。グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）はアルファ－アミノ酸である。グルタミンはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養内では必須アミノ酸であり得る。グルタミンは、エネルギー需要が高く、大量のタンパク質や核酸を合成する細胞を含む、細胞の成長を支える。それは、急速に分裂する細胞、およびグルコースを非効率的に使用する細胞の代替エネルギー源である。

【0404】

[00406]一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、生物学的利用能が増加した形態のグルタミンを利用する。Ｌ－グルタミンは化学的に不安定であり、細胞の成長および機能にとって重要であるため、Ｌ－グルタミンの送達は、各々の固有の細胞培養プロセスに合わせて調整することが重要である。遊離型のグルタミン（例えば、Ｌ－グルタミン）は、液体培地中の生理的ｐＨでは不安定であり、多くの細胞培養および生物製造用途で問題となる速度でアンモニウムおよびピログルタミン酸塩に分解される。したがって、多くの細胞培養培地には、アラニル－Ｌ－グルタミンおよびグリシル－Ｌ－グルタミンなどのジペプチド形態を含む、安定化形態のグルタミンが含有される。しかしながら、Ｌ－グルタミンのより安定な形態はまた、例えば、細胞表面ペプチダーゼなどの酵素によるプロセッシングが必要なため、生物学的利用能が制限されることがある。したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、生物学的利用能が増加した形態のグルタミン、例えば、遊離グルタミン形態、例えば、非ジペプチド形態、非アラニン－グルタミンジペプチド形態（例えば、非アラニル－Ｌ－グルタミン形態）、非グリシン－グルタミンジペプチド形態（例えば、非グリシル－Ｌ－グルタミン形態）、グルタミンが別のアミノ酸または安定化部分とコンジュゲートしていない形態、モノマー形態、遊離形態、またはそれらの組合せを利用する。一部の実施形態では、グルタミンはタンパク質加水分解物として提供される。

【0405】

[00407]一部の実施形態では、基礎培地はグルタミンを含有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される形態のグルタミンは、すでにグルタミンを含有する培地に添加される。一部の実施形態では、本明細書に開示される形態のグルタミンは、グルタミンを含有しないかまたは低レベルのグルタミンしか含まない基礎培地に添加されて、グルタミンの生物学的利用能を増加させる。

【0406】

[00408]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地はグルタミンを含まない。
グルタミン酸塩
[00409]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、培地）は、グルタミン酸塩（例えば、Ｌ－グルタミン酸塩）を含む。グルタミン酸塩は、例えば、ｇ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、オルニチン、２－オキソグルタル酸塩、グルコースまたはグルタチオンに変換され得る。グルタミン酸塩およびそこから産生される代謝産物は、例えば、酸化還元ホメオスタシス、細胞シグナル伝達、窒素同化、アミン異化、アミノ酸生合成、ヌクレオシド生合成、および補因子生成に寄与することができる。

【0407】

[00410]一部の実施形態では、細胞をグルタミン酸塩と接触させることは、例えば、グルタミン酸塩を欠くか、またはより低濃度のグルタミン酸塩を含有する組成物と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣ－β細胞の生成を改善し、例えば、より高い細胞収率および回収率、ＳＣ－β細胞の数および相対的なパーセンテージの増加、ＳＣ－β細胞の安定性および保存性の増大、サイズの減少および均一性の改善などの有利な特徴を有するＳＣ－膵島クラスター、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣ－β細胞の機能の改善、細胞生存率の改善、細胞機能の改善、移植後の免疫原性の低減、またはそれらの組合せを提供することができる。

【0408】

[00411]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、グルタミン酸塩を含まない。
ビタミン
[00412]一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、培地）は、１つまたは複数のビタミンを含む。

【0409】

[00413]例示的なビタミンとしては、限定されないが、ビオチン、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）およびビタミンＢ１２（シアノコバラミン）が挙げられる。一部の実施形態では、ビタミンは脂肪酸合成を調節する。一部の実施形態では、ビタミンは分岐鎖アミノ酸代謝を調節する。一部の実施形態では、ビタミンはＴＣＡサイクルの補因子として、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼの補因子として調節または関与する。一部の実施形態では、ビタミンはビオチンである。一部の実施形態では、本開示の組成物は、２つ以上の異なるビタミン、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるビタミンを含有する。

【0410】

[00414]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地はビタミンを含まない。
水溶性合成ポリマー
[00415]本明細書に記載される水溶性ポリマーは、親水性を有し、室温で水溶液に可溶な任意のポリマーを指す。水溶性ポリマーは、天然に存在するものであるかまたは合成のものであり得る。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、アルブミンタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミン）である。一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、水溶性合成ポリマーである。本明細書に記載される水溶性合成ポリマーは、親水性特性を有し、室温で水溶液に可溶性である任意の合成ポリマーを指すことができる。主題の方法および組成物に適用可能な水溶性合成ポリマーには、限定されないが、ポロキサマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリアクリルアミドが含まれる。水溶性合成ポリマーは、理想化された化学式を有することができるポリマー化合物またはポリマー化合物の混合物を指すことができるが、適用可能な製造方法に依存して、理想化された式の種々の誘導体および／または前駆体を指すことができる。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーは、細胞分化、例えば、膵β細胞またはそれらの前駆細胞の分化において典型的に利用される血清または血清アルブミン、例えば、ＢＳＡまたはＨＳＡを少なくとも部分的に置換するために使用される。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーは、細胞分化、例えば、膵β細胞またはそれらの前駆細胞の分化に典型的に利用される血清アルブミン、例えば、ＢＳＡまたはＨＳＡを１００％置換する。一部の実施形態では、水溶性合成ポリマーは、血清アルブミン、例えば、ＢＳＡまたはＨＳＡの量を、細胞分化、例えば膵β細胞またはその前駆細胞の分化において通常利用される量の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少させる。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される任意の細胞（例えば、多能性幹細胞；内胚葉細胞；原腸細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；インスリン陽性細胞；および／または膵臓ベータ細胞）の集団を含む組成物、および水溶性ポリマーを提供し、組成物中の水溶性ポリマーの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、９０％、９５％または９９％は、水溶性合成ポリマー（例えば、本明細書で開示されるＰＶＡ分子のいずれか）であり、残りの水溶性ポリマーはヒト血清アルブミンポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される任意の細胞（例えば、多能性幹細胞；内胚葉細胞；原腸細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；インスリン陽性細胞；および／または膵臓ベータ細胞）の集団を含む組成物、ならびに水溶性ポリマーを提供し、水溶性ポリマーの１％、２％、３％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９９％以下は天然に存在する水溶性ポリマー（例えば、ＨＳＡまたはＢＳＡ）である。一部の実施形態では、組成物中の水溶性ポリマーの９０％、９５％、９９％超、および最大１００％は水溶性合成ポリマー（例えば、ＰＶＡ）である。

【0411】

[00416]一部の実施形態では、主題の組成物および方法に適用可能な水溶性合成ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む。本明細書に記載されるポリビニルアルコールは、理想化式［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］ｎを有する水溶性合成ポリマーを指すことができ、これは部分的または完全に加水分解することができる。一部の実施形態では、ポリビニルアルコールは、ポリ酢酸ビニルを部分的または完全に加水分解して酢酸塩基を除去することによって製造される。一部の実施形態では、ポリビニルアルコールは、多くとも８５％が加水分解され、例えば８０％が加水分解されている。加水分解のパーセンテージは、ポリ酢酸ビニル前駆体ポリマー中で加水分解される酢酸残基のおよそのパーセンテージ（例えば、平均パーセンテージ）を測定する。一部の実施形態では、ポリビニルアルコールは、少なくとも８５％加水分解され、例えば、８７～８９％加水分解され、８７～９０％加水分解され、または９９％加水分解される。一部の実施形態では、ポリビニルアルコールは、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％加水分解される。ある種の理論に拘束されることを望まないが、ポリビニルアルコールは、培地中の担体－分子の機能を推定することができ、典型的には、血清または血清アルブミン、例えば、ＨＳＡによって行われる。ポリビニルアルコールの加水分解のパーセンテージは、ポリビニルアルコールを生成するために利用される製造方法、例えば、ポリビニルアセテート前駆体ポリマーがどのようにしてポリビニルアルコールに変換されるか、例えば、エタノールによる塩基触媒エステル交換による変換によって決定することができる。一部の実施形態では、主題の方法において使用されるか、または主題の組成物中に存在する水溶性合成ポリマー調製物、例えば、ポリビニルアルコールは、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはほぼ１００％の純度を有する。ポリビニルアルコールの純度は、任意のパーセンテージの加水分解のポリビニルアルコールを含む、調製中の理想化された式［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］ｎを有する合成ポリマーのパーセンテージを測定する。ポリビニルアルコール調製の不純物は、理想化された式［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］ｎを有さない他のポリマー材料、または他の有機無機材料を含むことができる。

【0412】

[00417]一部の実施形態では、本明細書に記載される培地は、水溶性合成ポリマーを含まない。
幹細胞由来のベータ細胞の細胞クラスター
[00418]一部の実施形態では、内因性の膵臓島の機能および特徴に類似した細胞クラスターが本明細書で提供される。このような細胞クラスターは、対象の代謝、例えば、グルコース代謝を調節する際に、内因性の膵臓島の機能を模倣することができる。したがって、細胞クラスターは、膵島機能不全に起因する疾患、例えば糖尿病を処置するために対象に移植することができる。用語「クラスター」と「凝集体」は互換的に用いることができ、細胞間が密接に接触している細胞群を指し、一部の事例では、クラスター内の細胞は互いに付着することができる。

【0413】

[00419]細胞クラスターは複数の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも２５００個、少なくとも３０００個、少なくとも３５００個、少なくとも４０００個、少なくとも４５００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも３０，０００個、または少なくとも５０，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、１０～１０，０００個、５０～１０，０００個、１００～１０，０００個、１００～１０，０００個、１，０００～１０，０００個、５００～１０，０００個、５００～５，０００個、５００～２、５００個、５００～２，０００個、１，０００～１００，０００個、１，０００～５０，０００個、１，０００～４０，０００個、１，０００～２０，０００個、１，０００～１０，０００個、１，０００～５，０００個、および１，０００～３，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは少なくとも５００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは少なくとも１，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは少なくとも２，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは少なくとも５，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、１００，０００個以下、９０，０００個以下、８０，０００個以下、７０，０００個以下、６０，０００個以下、５０，０００個以下、４０，０００個以下、３０，０００個以下、２０，０００個以下、１０，０００個以下、７，０００個以下、５，０００個以下、３，０００個以下、２，０００個以下、または１，０００個以下の細胞を含む。

【0414】

[00420]本明細書における細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然細胞、例えば、非天然膵β細胞を含み得る。非天然細胞（例えば、非天然膵β細胞）は、内因性細胞（例えば、内因性成熟膵β細胞）の特徴を共有することができるが、ある特定の態様（例えば、遺伝子発現プロファイル）が異なる。非天然細胞は、遺伝子修飾された細胞であり得る。非天然細胞は、前駆細胞、例えば幹細胞から分化した細胞であり得る。幹細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。一部の事例では、非天然細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆細胞から分化した細胞であり得る。一部の事例では、非天然細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで前駆細胞から分化した細胞であり得る。例えば、細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含むことができる。非天然膵β細胞は、それらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５０２４０２１２Ａ１号および同第２０１５０２１８５２２Ａ１号に記載されるものであり得る。細胞クラスターは、複数の非天然膵β細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％の細胞が、非天然膵β細胞である。細胞クラスターは、１つまたは複数の天然細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターは、１つまたは複数の初代細胞、例えば、内因性膵島由来の初代細胞を含むことができる。

【0415】

[00421]細胞クラスターは、内因性細胞、例えば、内因性成熟膵β細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する１つまたは複数の細胞を含むことができる。用語「マーカー」は、観察または検出され得る分子を指し得る。例えば、マーカーは、以下に限定されないが、特定遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質、または小分子が挙げられ得る。多くの例では、マーカーは、特定の細胞型に特徴的であり得る分子を指すことができ、その結果、マーカーは、細胞型のマーカーと呼ぶことができる。例えば、インスリン遺伝子は、β細胞のマーカーと称され得る。一部の事例では、マーカーは遺伝子である。内因性成熟膵β細胞の非限定的なマーカーとして、インスリン、Ｃ－ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＭＡＦＡ、ＺＮＴ８、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＬＣ２Ａ、ＰＣＳＫ１、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ８、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＮＡＰ２５、ＲＡＢ３Ａ、ＧＡＤ２、およびＰＴＰＲＮが挙げられる。

【0416】

[00422]細胞クラスターは、内因性細胞、例えば、内因性成熟膵β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する１つまたは複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターは、内因性細胞、例えば、内因性成熟膵β細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個のマーカー（複数可）を共発現する１つまたは複数の細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含み、それらはともに、β細胞のマーカーであり得る。

【0417】

[00423]細胞クラスターは、内因性細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の細胞が、内因性細胞の少なくとも１つのマーカーを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、内因性細胞のマーカーを発現することができる。一部の事例では、内因性細胞は、膵細胞、例えば、膵β細胞（単数）、膵α細胞、膵β細胞（複数）、膵δ細胞、または膵γ細胞であり得る。本明細書で提供される細胞クラスターは、細胞の不均一群、例えば、異なる型の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターは、膵β細胞のマーカーとなり得るインスリン／Ｃ－ペプチドを発現する細胞、膵α細胞のマーカーとなり得るグルカゴンを発現する細胞、膵δ細胞のマーカーとなり得るソマトスタチンを発現する細胞、膵ポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

【0418】

[00424]例えば、本明細書における細胞クラスターは、内因性成熟膵β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、内因性成熟膵β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現することができる。

【0419】

[00425]細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する複数の細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞がＣＨＧＡを発現する。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約８５％の細胞がＣＨＧＡを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約９０％のＣＨＧＡを発現する細胞を含むことができる。一部の例では、細胞クラスターは、約９５％のＣＨＧＡを発現する細胞を含むことができる。一部の例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、ＣＨＧＡを発現することができる。

【0420】

[00426]細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１を発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の細胞が、ＮＫＸ６．１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約５０％の細胞がＮＫＸ６．１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、ＮＫＸ６．１を発現することができる。

【0421】

[00427]細胞クラスターは、ＩＳＬ１を発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の細胞が、ＮＫＸ６．１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約５０％の細胞が、ＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、ＩＳＬ１を発現することができる。

【0422】

[00428]細胞クラスターは、Ｃ－ペプチドを発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、Ｃ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約６０％の細胞が、Ｃ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、Ｃ－ペプチドを発現することができる。

【0423】

[00429]細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの両方を発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、Ｃ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約４０％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約６０％のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約７５％のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含むことができる。一部の例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。

【0424】

[00430]細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１の両方を発現する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１０％、２０％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約４０％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約６０％のＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約７５％のＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現する細胞を含むことができる。一部の実例では、細胞クラスターにおける細胞は全て、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。

【0425】

[00431]細胞クラスターは、限られた比率のＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１の両方に関して陰性の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターは、多くとも２％、多くとも４％、多くとも６％、多くとも８％、多くとも１０％、多くとも１２％、多くとも１４％、多くとも大１６％、多くとも１８％、多くとも２０％、多くとも２２％、多くとも２２％、多くとも２５％、または多くとも３０％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含むことができる。

【0426】

[00432]細胞クラスターは、ごく少数の幹細胞または前駆細胞、例えば、膵前駆細胞を含むことができるか、またはそれらを全く含むことができない。例えば、本明細書で提供されるような細胞クラスターは、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％の細胞のＬＩＮ２８を発現する細胞を含むことができるか、またはそれらを全く含むことができない。一部の事例では、本明細書で提供されるような細胞クラスターは、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％の細胞のＫｉ６７を発現する細胞を含むことができるか、またはそれらを全く含むことができない。

【0427】

[00433]一部の事例では、細胞クラスターは、多くとも３％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含むことができるか、またはそれらを含むことができない。一部の事例では、細胞クラスターは、約１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約０．６％のＳＯＸ２を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約０．３％のＳＯＸ２を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約０．１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含むことができる。

【0428】

[00434]一部の例では、細胞クラスターは、多くとも１０％の細胞、多くとも約８％の細胞、多くとも約６％の細胞、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％のＳＯＸ９を発現する細胞を含むことができるか、またはそれらを含むことができない。一部の事例では、細胞クラスターは、約２％のＳＯＸ９を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約６％のＳＯＸ９を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約１．２％のＳＯＸ９を発現する細胞を含むことができる。

【0429】

[00435]本明細書における細胞クラスターは、グルコースチャレンジ（複数可）に曝露された場合にｉｎ ｖｉｔｒｏで１つまたは複数のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答（複数可）を提示することができる。ＧＳＩＳ応答は、内因性膵島のＧＳＩＳ応答に類似している可能性がある。一部の事例では、細胞クラスターは、グルコースチャレンジに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、細胞クラスターは、逐次グルコースチャレンジなどの複数のグルコースチャレンジに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳ応答を示す。例えば、細胞クラスターは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回の逐次グルコースチャレンジに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳ応答を提示し得る。

【0430】

[00436]本明細書で提供されるような細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳを提示する少なくとも１つの細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも１つの細胞は、成熟膵β細胞と称され得る。一部の事例では、少なくとも１つの細胞は、非天然膵β細胞である。一部の事例では、少なくとも１つの細胞は、天然／内因性β細胞に類似した膵β細胞である。一部の事例では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を提示する。一部の事例では、少なくとも１つの細胞は、少なくとも１回のグルコースチャレンジに対してＧＳＩＳ応答を提示する。一部の事例では、細胞は、少なくとも２回の逐次グルコースチャレンジに対してＧＳＩＳ応答を提示する。一部の例では、細胞は、少なくとも３回の逐次グルコースチャレンジに対してＧＳＩＳ応答を提示する。

【0431】

[00437]本明細書で提供されるように、細胞クラスターは、内因性膵島に類似したＧＳＩＳ刺激指数を提示することができる。細胞クラスターまたは細胞の刺激指数は、低グルコース濃度と比較した、高グルコース濃度に応答して分泌されるインスリンの割合によって特徴付けることができる。例えば、本明細書で提供されるような細胞クラスターまたは細胞の刺激指数は、２０ｍＭのグルコース刺激に応答して分泌されるインスリン対２．８ｍＭのグルコース刺激に応答して分泌されるインスリンの比として算出することができる。一部の例では、本明細書で提供されるような細胞クラスターまたは細胞の刺激指数は、１よりも大きいかもしくは１に等しく、または１．１よりも大きいかもしくは１．１に等しく、または１．３よりも大きいかもしくは１．３に等しく、または２よりも大きいかもしくは２に等しく、または２．３よりも大きいかもしくは２．３に等しく、または２．６よりも大きいかもしくは２．６に等しい。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、サイトカインに応答してサイトカイン誘導性アポトーシスを呈する。一部の事例では、サイトカインは、インターロイキンβ（ＩＬ－β）、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞からのインスリン分泌は、抗糖尿病薬に応答して増強される。一部の事例では、抗糖尿病薬は、インクレチン模倣物、スルホニル尿素、メグリチニド、およびそれらの組合せからなる群から選択される分泌促進薬を含む。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞はモノホルモナルである。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、内因性成熟膵β細胞の形態に類似した形態を呈する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、内因性成熟膵β細胞のインスリン顆粒に類似した、電子顕微鏡下のカプセル化された結晶性インスリン顆粒を呈する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、低い割合の複製を呈する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、内因性成熟膵β細胞のＧＳＣＦに類似したグルコース刺激Ｃａ^２＋フラックス（ＧＳＣＦ）を提示する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも１回のグルコースチャレンジに対してＧＳＣＦ応答を提示する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも２回のグルコースチャレンジに対してＧＳＣＦ応答を提示する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも３回のグルコースチャレンジに対してＧＳＣＦ応答を提示する。一部の事例では、細胞クラスターまたは細胞は、カルシウムフラックスの増加を提示する。一部の事例では、カルシウムフラックスの増加は、流入量または高グルコース濃度に対する低グルコース濃度での流入の割合の増加を含む。

【0432】

[00438]本明細書で提供されるような細胞クラスターは、内因性膵島、例えばヒト膵島に類似した高グルコース濃度刺激に応答して二相性インスリン分泌を提示することができる。二相性インスリン分泌は、内因性膵島、例えばヒト膵島に特徴的な現象であり得る。一部の実施形態では、高グルコース濃度チャレンジ、例えば、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または３０ｍＭに対する応答して、本明細書で提供されるような細胞クラスター、例えば、再凝集した膵細胞クラスターは、ピーク値に至るインスリン分泌の一過性の増加、続く比較的上昇されたインスリン分泌レベル、例えば、より低いグルコース濃度に応答したインスリン分泌レベルよりも高いレベル、例えば、２．８ｍＭのグルコースへの急速な減少を提示することができる。このような一過性の増加および減少プロセスは、二相性インスリン分泌パターンの第１段階と称され得る。したがって、持続的な高グルコースチャレンジで、第１段階は第２に続いてもよく、ここで、細胞クラスターによるインスリン分泌は、比較的高いレベルで維持することができる。第２段階は、長期間、例えば、高グルコース濃度チャレンジが続く限り、または第１段階よりも比較的長く続く可能性がある。このような二相性インスリン分泌パターンは、成熟天然膵β細胞に特徴的な固有の細胞シグナル伝達の変化に起因し得る。

【0433】

[00439]一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞集団および／または細胞クラスターのいずれも、健常な対照成体対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりもより低レベルのＭＡＦＡを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、健常対照成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高レベルでＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、健常対照成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高レベルでＳＩＸ２、ＨＯＰＸ、ＩＡＰＰおよび／またはＵＣＮ３を発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、ＭＡＦＡを発現しないＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、ＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。

【0434】

[00440]一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞集団および／または細胞クラスターのいずれも、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、ここで、上記破壊は、上記遺伝子配列によってコードされたタンパク質の発現を減少または排除する。一部の実施形態では、上記細胞は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、上記破壊は、上記遺伝子配列によってコードされるタンパク質の発現を減少させるか、または除去する。一部の実施形態では、上記細胞は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、上記破壊は、上記遺伝子配列によってコードされるタンパク質の発現を減少させるか、または除去する。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞のいずれか（例えば、ＳＣ由来のベータ細胞、または本明細書に開示されるクラスターのいずれかにおける細胞のいずれか）は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、上記破壊は、上記遺伝子配列によってコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除外する。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの遺伝子配列は、ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子をコードする。一部の実施形態では、前記ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃをコードする。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの遺伝子配列は、ＣＩＩＴＡをコードする。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂをコードする遺伝子におけるゲノム破壊を含むが、ＨＬＡ－Ｃをコードする遺伝子におけるゲノム破壊を含まない。一部の実施形態では、前記細胞は、ナチュラルキラー細胞活性化リガンド遺伝子におけるゲノム破壊を含む。一部の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞活性化リガンド遺伝子は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）をコードする。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子修飾されていない幹細胞と比較して、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡＤＲのうちの１つまたは複数の発現が減少している。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子修飾されていない幹細胞と比較して、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＴＬＡの発現が増加している。特定の実施形態では、本明細書に開示される膵島細胞（例えば、ＳＣ－ベータ細胞）は、健常対照対象由来の内因性膵島細胞と比較して、ＰＤＬ１の発現が増加している。特定の実施形態では、本明細書に開示される膵島細胞（例えば、ＳＣ－ベータ細胞）は、健常対照対象由来の内因性膵島細胞と比較して、ＣＤ４７の発現が増加している。一部の実施形態では、ゲノム破壊は、遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ技術の使用によって誘導される。

【0435】

[00441]一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞のいずれか（例えば、本明細書に開示される幹細胞のいずれか）は、「安全スイッチ」を含む。一部の実施形態では、安全スイッチは、誘導的に細胞死を引き起こすかまたは細胞増殖を停止させるスイッチタンパク質をコードする核酸構築物である。一部の実施形態では、安全スイッチは、操作された細胞のゲノム中の、定義された特定の標的遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に、通常は標的遺伝子座の両方の対立遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡｃｔＢまたはＣＬＹＢＬなどのセーフハーバー遺伝子座である。一部の実施形態では、スイッチタンパク質は、臨床的に許容されるオルソログ小分子の有効量と接触させることによって活性化される。一部の実施形態では、活性化された場合、安全スイッチは、一部の実施形態では細胞のアポトーシスを活性化することによって、細胞の増殖を停止させる。一部の実施形態では、スイッチタンパク質はヘルペス－シンプレックス－チミジンキナーゼを含む。一部の実施形態では、スイッチタンパク質は、ヒトカスパーゼタンパク質、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４などを含む。ある特定の実施形態では、タンパク質はヒトカスパーゼ９である。一部の実施形態では、カスパーゼタンパク質は、化学的に誘導された二量体化（ＣＩＤ）を提供する配列に融合され、二量体化はオルソログ活性化剤の存在下でのみ起こる。１つまたは複数のＣＩＤドメインがカスパーゼタンパク質に融合され得、例えば、２つの異なるＣＩＤドメインがカスパーゼタンパク質に融合され得る。一部の実施形態では、ＣＩＤドメインは、ラパマイシン類似体を用いて活性化される、ｍＴＯＲのＦＫＢＰまたはＦＲＢ（ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合）ドメインの二量体化ドメインである。一部の実施形態では、安全スイッチは、国際出願公開第ＷＯ２０２１／１７３４４９号およびＪｏｎｅｓら、２０１４年， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ５（２５４）：１～８頁に記載される安全スイッチのいずれかであり、これらの各々はその全体が本明細書に組み込まれる。

【0436】

[00442]対象に移植されると、細胞クラスターは、グルコースチャレンジ（複数可）に曝露された場合に１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳ応答を提示することができる。本明細書における細胞クラスターは、対象に移植された後の短期間内にｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳ応答を提示することが可能であり得る。例えば、細胞クラスターは、移植後の約６時間、１２時間、または２４時間以内にｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳを提示することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、移植後の約２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３５日、または４２日以内にｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳを提示する。細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、内因性膵島と同等であり得るか、またはそれよりも高くてもよい。本出願を通じて使用されるような参照数値に関する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、量「約１０」は、９から１１までの量を含む。例えば、参照数値に関連する用語「約」はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％の値の範囲を含むことができる。

【0437】

[00443]細胞クラスターは、対象に移植された後に一定期間、ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳ応答を提示する能力を維持することができる。例えば、細胞クラスターのｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳ応答は、細胞クラスターの、対象（例えばヒト）への移植後の最大少なくとも２週、３週、４週、５週、１０週、１５週、２０週、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、２０年、３０年、４０年、６０年、８０年、または１００年間観察することができる。

【0438】

[00444]細胞クラスターのＧＳＩＳは、刺激指数によって測定することができる。細胞クラスターの刺激指数は、低グルコース濃度に応答して分泌されたインスリンと比較した、高グルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの割合に同等であり得る。細胞クラスターは、内因性膵島と類似した刺激指数を有することができる。一部の例は、細胞クラスターは、少なくとも１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０の刺激指数を有する。

【0439】

[00445]グルコースチャレンジ（例えば、２０ｍＭなどの高濃度のグルコース）に応答した細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、約０．１μＩＵ／１０^３の細胞～約５μＩＵ／１０^３の細胞、約０．２μＩＵ／１０^３の細胞～約４μＩＵ／１０^３の細胞、約０．２μＩＵ／１０^３の細胞～約３μＩＵ／１０^３の細胞、または約０．２３μＩＵ／１０^３の細胞～約２．７μＩＵ／１０^３の細胞の範囲であり得る。一部の事例では、グルコースチャレンジ（例えば、２０ｍＭなどの高濃度のグルコース）に応答して細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、少なくとも０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３μＩＵ／１０^３の細胞である。

【0440】

[00446]細胞クラスターは、プロインスリンおよびインスリンの両方を分泌することができる。例えば、細胞クラスターは、内因性膵島によって分泌されたインスリンに対するプロインスリンの割合と実質的に同じプロインスリン対インスリンの割合でプロインスリンおよびインスリンを分泌することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約０．０１～約０．０５、約０．０２～約０．０４、約０．０２～約０．０３、または０．０２９～約０．０３１のプロインスリン対インスリンの割合でプロインスリンおよびインスリンを分泌する。一部の事例では、細胞クラスターは、約０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、または０．０４のプロインスリン対インスリンの割合でプロインスリンおよびインスリンを分泌する。

【0441】

[00447]細胞クラスターは、内因性の膵臓島に類似した大きさであり得る。例えば、細胞クラスターは内因性の膵臓島に類似した直径を有することができる。細胞クラスターの直径とは、細胞クラスターの表面上の２点間の最大の直線距離を指すことができる。一部の事例では、細胞クラスターの直径は、多くとも３００μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、または４０μｍである。細胞クラスターの直径は、約７５μｍ～約２５０μｍであり得る。細胞クラスターの直径は、多くとも１００μｍであり得る。

【0442】

[00448]一部の実施形態では、細胞クラスターの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、約５０μｍ～約２５０μｍ、約７５μｍ～約２５０μｍ、または約１００μｍ～約２００μｍの直径を有する。

【0443】

[00449]一部の実施形態では、細胞クラスターの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、約８０～１５０、約１００～１５０、約１２０～１５０、約１４０～１５０、約８０～１３０、約１００～１３０、約１２０～１３０、約８０～１２０、約９０～１２０、または約１００～１２０μｍの直径を有する。

【0444】

[00450]一部の実施形態では、細胞クラスターは、多くとも１２０、多くとも１３０、多くとも１４０、多くとも１５０、多くとも１６０、または多くとも１７０μｍの平均または中央直径を有する。

【0445】

[00451]一部の実施形態では、細胞クラスターは、約８０～１５０、約１００～１５０、約１２０～１５０、約１４０～１５０、約８０～１３０、約１００～１３０、約１２０～１３０、約８０～１２０、約９０～１２０、または約１００～１２０μｍの平均または中央直径を有する。

【0446】

[00452]一部の実施形態では、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％が、１５０μｍ未満の直径を有する。

【0447】

[00453]一部の実施形態では、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％が、１４０μｍ未満の直径を有する。
[00454]一部の実施形態では、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％は、１３０μｍ未満の直径を有する。

【0448】

[00455]細胞クラスターは、ごく少数の死細胞を含むことができるか、またはそれらを全く含むことができない。細胞クラスターは、周囲の環境から細胞クラスターのコアへの分子（例えば、栄養および気体）の有効な拡散を可能にするサイズで存在し得る。拡散された分子は、コアにおける細胞の生存および機能にとって重要であり得る。一部の実例では、細胞クラスターは、死細胞、例えばそのコアにおいて約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％未満の死細胞を有することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、死細胞を全く有することができない。死細胞は、アポトーシス細胞、麻薬細胞（ｎａｒｃｏｔｉｃ）、またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0449】

[00456]細胞クラスターは、１つまたは複数の細胞型を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、１つまたは複数の膵細胞型を含む。例えば、細胞クラスターは、１つまたは複数の膵β細胞、膵α細胞、膵Δ細胞、膵γ細胞、およびそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の事例では、膵細胞は、非天然膵細胞、例えば、ＥＳＣおよび／またはｉＰＳ細胞などの幹細胞に由来する細胞であり得る。一部の事例では、細胞クラスターはまた、ｉＰＳ細胞、ＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、およびそれらの任意の組合せを含む、成熟膵細胞の１つまたは複数の前駆細胞を含むことができる。

【0450】

[00457]一部の実施形態では、細胞クラスターは、サイトカインに応答してサイトカイン誘導性アポトーシスを呈することができる。例えば、細胞クラスターは、インターロイキン－１β（ＩＬ－β）、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、およびそれらの組合せなどのサイトカインに応答してサイトカイン誘導性アポトーシスを呈し得る。

【0451】

[00458]本明細書における細胞クラスターからのインスリン分泌は、抗糖尿病薬（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで膵β細胞に作用する抗糖尿病薬）によって増強され得る。本開示は、任意の既知の抗糖尿病薬を意図し得る。一部の実例では、細胞クラスターからのインスリン分泌は、分泌促進薬によって増強され得る。分泌促進薬は、インクレチン模倣物、スルホニル尿素、メグリチニド、およびそれらの組合せであり得る。

【0452】

[00459]細胞クラスターは、モノホルモナルを含むことができる。例えば、細胞クラスターは、モノホルモナルである膵細胞（例えば、膵β細胞（単数）、膵α細胞、膵β細胞（複数）、膵Δ細胞、または膵γ細胞）を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、モノホルモナルであるインスリン分泌非天然膵細胞を含む。細胞クラスターは、ポリホルモナルを含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、モノホルモナル細胞およびポリホルモナル細胞を含む。

【0453】

[00460]細胞クラスターは、内因性成熟膵β細胞の形態に類似した形態を有する細胞（例えば、非天然膵細胞）を含むことができる。一部の事例では、細胞クラスターは、例えば、電子顕微鏡によって検出されるような、内因性成熟膵β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒をカプセル化した細胞を含むことができる。細胞クラスターは、内因性成熟膵β細胞の形態に類似した形態を有する複数の細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の細胞が、内因性成熟膵β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒をカプセル化することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける１００％の細胞が、内因性成熟膵β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒をカプセル化する。

【0454】

[00461]細胞クラスターは、１回または複数のグルコースチャレンジに対してグルコース刺激カルシウム（Ｃａ^２＋）フラックスを提示することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、内因性膵島のＧＳＣＦに類似したグルコース刺激Ｃａ^２＋フラックス（ＧＳＣＦ）を提示する。一部の例では、細胞クラスターは、複数のグルコースチャレンジに対する内因性膵島のＧＳＣＦ応答に類似した様式で、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、または１０回の逐次グルコースチャレンジに対してＧＳＣＦ応答を提示する。細胞クラスターは、グルコースチャレンジに曝露された場合にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＣＦ応答を提示することができる。

【0455】

[00462]細胞クラスターは、任意の種に由来する細胞を含むことができる。例えば、細胞クラスターは、哺乳動物種由来の細胞を含むことができ、非限定的な例として、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒト細胞が挙げられる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも１つの細胞はヒト細胞である。

【0456】

[00463]本出願を通じて開示された細胞クラスターを含む組成物もまた、本明細書で提供される。細胞クラスターに加えて、組成物は、細胞クラスターを対象に移植するのに使用することができるスキャフォールドまたはマトリックスをさらに含むことができる。スキャフォールドは、細胞クラスターが接着するための構造を提供することができる。細胞クラスターは、スキャフォールドとともに対象に移植することができる。スキャフォールドは生分解性であり得る。一部の事例では、スキャフォールドは、生分解性ポリマーを含む。生分解性ポリマーはまた、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、および生分解性ポリウレタンなどの合成ポリマーであり得る。生分解性ポリマーは、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、および多糖類（例えば、アルギン酸塩、ヘパリン、および糖単位の他の天然に存在する生分解性ポリマー）などの天然ポリマーであってもよい。あるいは、スキャフォールドは、非生分解性であり得る。例えば、スキャフォールドは、ポリアクリレート、エチレン－酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースおよびその誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、およびポリエチレンオキシドなどの非生分解性ポリマーを含むことができる。

【0457】

幹細胞由来のベータ細胞の細胞クラスターを作製するための解離した細胞組成物および方法
[00464]さらに、内因性組織または細胞クラスター、例えば、内因性膵島の機能および特徴に類似した細胞クラスターを作製する方法が本明細書で開示される。

【0458】

[00465]本方法は、第１の細胞クラスターを解離するステップと、解離した細胞を第２の細胞クラスターへ再凝集させるステップとを含むことができ、ここで、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、内因性組織または細胞クラスター、例えば、内因性膵島の機能および特徴により密接に類似している。用語「再凝集させること」およびその文法的等価物は本明細書で使用される場合、クラスターがより小さなクラスターまたは単一細胞に解離される場合に、解離した細胞が、新たな細胞間接触を形成し、新たなクラスターを形成することを指し得る。本方法は、ａ）第１の細胞クラスターから複数の細胞を解離するステップと、ｂ）ａ）由来の複数の細胞を培地中で培養し、それにより複数の細胞が第２の細胞クラスターを形成するのを可能にするステップとによって、細胞クラスターをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するのに使用することができる。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞クラスターである。第１の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞クラスター、例えば、培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏでの単一細胞の懸濁液によって形成されたクラスターであり得る。一部の事例では、第１の細胞クラスターは、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞クラスター、例えば、生きた生物の体内で形成され、上記生物から単離された細胞クラスターであり得る。例えば、本明細書で提供される方法が適用可能である第１の細胞クラスターは、ヒト膵島であり得る。一部の事例では、第１の細胞クラスターは、死体膵島であり得る。一部の実施形態では、解離した細胞は、以前に凍結されていた。

【0459】

[00466]本明細書で提供される方法は、細胞クラスターにおける膵細胞、例えば、膵β細胞、内分泌細胞、または内分泌前駆細胞を濃縮することができる。一部の事例では、本方法は、幹細胞もしくは膵前駆細胞を細胞クラスターから減少または排除することができる。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より高いパーセンテージのクロモグラニンＡを発現する細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より高いパーセンテージのＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より高いパーセンテージのＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現する細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より低いパーセンテージのＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドにとって陰性の細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より低いパーセンテージのＳＯＸ２を発現する細胞を含む。一部の事例では、一部の事例では、第２のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較した場合、より低いパーセンテージのＳＯＸ９を発現する細胞を含む。

【0460】

[00467]一部の事例では、培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤を含む。一部の事例では、培地は、ａ）血清、およびｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の一方または両方を含む。一部の事例では、本明細書で提供されるような再凝集用の培地（再凝集培地）は、小分子化合物を含むことができない。例えば、再凝集培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含まないか、またはほんの微量のＴ３を含むにすぎない。再凝集培地は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、Ａｌｋ５阻害剤（Ａｌｋ５ｉ）を含まないか、またはほんの微量のＡｌｋ５ｉを含むにすぎない。

【0461】

[00468]一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、細胞が解離され、続いて再凝集された後の細胞回収率または終了を改善する。細胞回収率の増加は、生存細胞の数またはパーセンテージの増加を含み得る。細胞回収率の増加は、目的の集団（例えば、ＩＳＬ１陽性およびＮＫＸ６．１陽性細胞または本明細書で開示される別の集団）の数またはパーセンテージの増加を含み得る。一部の実施形態では、細胞回収率の増加は、細胞を、本明細書で開示される薬剤の組合せと接触させた後に達成される。一部の実施形態では、細胞回収率は、細胞を解離に先立って薬剤と接触させた場合に増加する。一部の実施形態では、細胞回収率は、細胞を解離後に薬剤と接触させた場合に増加する。

【0462】

[00469]一部の実施形態では、解離前に存在する総生存細胞の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％が、再凝集後に評価した場合、例えば、解離の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に、または解離されて凍結保存した細胞の解凍の約１日、２日、３日、日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に評価した場合に生存細胞として回収される。

【0463】

[00470]一部の実施形態では、本開示の方法によって得られた総生存細胞の収量は、本明細書で開示されるような薬剤または薬剤の組合せを利用しない方法と比較して、再凝集後に、例えば、解離の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に、または解離されて凍結保存した細胞の解凍の約１日、２日、３日、日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に評価した場合に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高い。一部の実施形態では、総生存細胞の収量は、細胞を、先のクラスターの解離に先立って本開示の薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。一部の実施形態では、総生存細胞の収量は、細胞を、先のクラスターの解離後に本開示の薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。

【0464】

[00471]一部の実施形態では、解離前に存在する本開示の集団の細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性およびＩＳＬ１陽性細胞、または本明細書で開示される別の集団）の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％が、再凝集後に評価した場合、例えば、解離の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に、または解離されて凍結保存した細胞の解凍の約１日、２日、３日、日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に評価した場合に生存細胞として回収される。

【0465】

[00472]一部の実施形態では、本開示の方法によって得られた本開示の集団の細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性およびＩＳＬ１陽性細胞、または本明細書で開示される別の集団）の収量は、本明細書で開示されるような薬剤または薬剤の組合せを利用しない方法と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高い。

【0466】

[00473]一部の実施形態では、本開示の方法によって得られた本開示の集団の細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性およびＩＳＬ１陽性細胞、または本明細書で開示される別の集団）の収量は、本明細書で開示されるような薬剤または薬剤の組合せを利用しない方法と比較して、再凝集後に、例えば、解離の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に、または解離されて凍結保存した細胞の解凍の約１日、２日、３日、日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日後に評価した場合に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高い。一部の実施形態では、収量は、細胞を、先のクラスターの解離に先立って薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。一部の実施形態では、収量は、細胞を、先のクラスターの解離後に薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。

【0467】

[00474]一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、解離および再凝集後にＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１の両方を発現するクラスターにおける細胞のパーセントを増加させる。例えば、細胞クラスターにおける少なくとも約１０％、２０％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、本明細書で開示されるような解離および再凝集後にＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約３８％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約４０％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約４５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターにおける少なくとも約５０％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１を発現することができる。一部の実施形態では、ＮＫＸ６．１およびＩＳＬ１の両方を発現する再凝集されたクラスターにおける細胞のパーセントは、細胞を、先のクラスターの解離に先立って本開示の薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。一部の実施形態では、再凝集されたクラスターにおける細胞のパーセントは、細胞を、先のクラスターの解離後に本開示の薬剤または薬剤の組合せと接触させた場合に増加する。

【0468】

[00475]第１の細胞クラスターの解離は、当該技術分野において既知の方法を用いて実施することができる。細胞クラスターを解離する非限定的な例示的な方法として、物理的な力（例えば、細胞スクレーパー、狭口径ピペットによる粉砕、穿刺吸引、ボルテックス脱凝集および微細なナイロンまたはステンレス鋼メッシュに通した強制濾過などの機械的解離）、トリプシン、コラゲナーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）などの酵素を用いた酵素解離、またはそれらの組合せが挙げられる。解離後、第１の細胞クラスター由来の細胞は、細胞懸濁液、例えば、単一細胞懸濁液中に存在し得る。用語「懸濁液」は本明細書で使用される場合、細胞が固体支持体に結合されていない細胞培養状態を指し得る。懸濁液中で増殖する細胞は、当業者に既知の装置を使用して増殖させながら撹拌することができる。

【0469】

[00476]一部の実施形態では、本開示は、解離した細胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、解離した細胞はＮｇｎ３陽性である。一部の実施形態では、解離した細胞はＰＤＸ．１陽性である。一部の実施形態では、解離した細胞はＮＫＸ６．１陽性である。一部の実施形態では、本開示は、解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）およびＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、もしくはＨ－１１５２、またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）およびヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、３－デアザネプラノシンＡ塩酸塩、またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）および亜鉛を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、亜鉛は、ＺｎＳＯ_４の形態で存在する。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）およびモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）阻害剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＭＧＬＬ阻害剤は、ＪＪＫＫ０４８、ＫＭＬ２９、ＮＦ１８１９、ＪＷ６４２、ＪＺＬ１８４、ＪＺＬ１９５、ＪＺＰ３６１、プリスチメリン、もしくはＵＲＢ６０２、または前述のいずれかの誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離した細胞（例えば、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞）および脂質を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、脂質は飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、飽和脂肪酸はパルミチン酸塩である。一部の実施形態では、脂質は不飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、またはパルミトレイン酸である。

【0470】

[00477]本明細書で提供される組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されていない単離されたインスリン陽性内分泌細胞の相当する集団と比較して、モノグリセリド対遊離脂肪酸の割合の増加を示す、単離されたインスリン陽性内分泌細胞を含む組成物が本明細書で提供される。

【0471】

[00478]ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されていない単離されたインスリン陽性内分泌細胞の相当する集団と比較して、遊離脂肪酸対モノグリセリドの割合の減少を示す、単離されたインスリン陽性内分泌細胞を含む組成物である。

【0472】

[00479]ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されていない単離されたインスリン陽性内分泌細胞の対応する集団と比較して、遊離脂肪酸のレベルの減少を示す、単離されたインスリン陽性内分泌細胞を含む組成物が、本明細書で提供される。

【0473】

[00480]ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）の発現または機能を阻害する薬剤と接触されていない単離されたインスリン陽性内分泌細胞の相当する集団と比較して、モノグリセリドのレベルの増加を示す、単離されたインスリン陽性内分泌細胞を含む組成物が、本明細書で提供される。

【0474】

[00481]インスリン陽性内分泌細胞の集団およびモノグリセリドリパーゼの、遊離脂肪酸への変換を阻害する薬剤を含む組成物が、本明細書で提供される。
[00482]一部の実施形態では、組成物は、血清アルブミンタンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、血清アルブミンタンパク質は、ヒト血清アルブミンタンパク質である。一部の実施形態では、組成物は、０．０１％～１％、０．０３～１％、０．０３～０．９％、０．０３～０．０８％、０．０３～０．０６％、０．０３～０．０５％、０．０４～０．８％、０．０４～０．７％、０．０４～０．６％、０．０４～０．５％、０．０４～０．４％、０．０４～０．３％、０．０４～０．２％、０．０４～０．１％、０．０４～０．０９％、０．０４～０．８％、０．０４～０．０７％、０．０４～０．０６％、０．０４～０．０５％、０．０５～１％、０．０５～０．９％、０．０５～０．８％、０．０５～０．７％、０．０５～０．６％、０．０５～０．５％、０．０５～０．４％、０．０５～０．３％、０．０５～０．２％、０．０５～０．１％、０．０５～０．０９％、０．０５～０．８％、０．０５～０．０７％、または０．０５～０．０６％の血清アルブミンタンパク質を含む。一部の実施形態では、組成物中の細胞の９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が、細胞クラスターで存在する。一部の実施形態では、組成物は、ＴＧＦ－β経路阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β経路阻害剤は、Ａｌｋ５ｉ（ＳＢ５０５１２４）、またはその誘導体である。一部の実施形態では、組成物は甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含む。一部の実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、ＧＣ－１もしくはＴ３、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、組成物はＲＯＣＫ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。一部の実施形態では、組成物は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はデアザネプラノシンＡ塩酸塩である。一部の実施形態では、組成物は、プロテインキナーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンである。一部の実施形態では、組成物はビタミンＣを含む。特定の実施形態では、組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する。一部の実施形態では、組成物は、γセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ）を含まない。一部の実施形態では、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞は、以前に凍結されていた。

【0475】

[00483]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、組成物中の細胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養状態で１１日後に生存可能である。

【0476】

[00484]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、組成物中の細胞クラスターの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、直径９０～１４０μｍ、９０～１３０μｍ、９０～１２０μｍ、９０～１１０μｍ、１００～１４０μｍ、１００～１３０μｍ、１００～１２０μｍ、１００～１１０μｍである。

【0477】

[00485]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、約８０～１５０、約１００～１５０、約１２０～１５０、約１４０～１５０、約８０～１３０、約１００～１３０、約１２０～１３０、約８０～１２０、約９０～１２０、または約１００～１２０μｍの直径を有する。

【0478】

[00486]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供すし、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターは、多くとも１２０、多くとも１３０、多くとも１４０、多くとも１５０、多くとも１６０、もしくは多くとも１７０μｍの平均または中央直径を有する。

【0479】

[00487]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターは、約８０～１５０、約１００～１５０、約１２０～１５０、約１４０～１５０、約８０～１３０、約１００～１３０、約１２０～１３０、約８０～１２０、約９０～１２０、もしくは約１００～１２０μｍの平均または中央直径を有する。

【0480】

[00488]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％が、１５０μｍ未満の直径を有する。

【0481】

[00489]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％が、１４０μｍ未満の直径を有する。

【0482】

[00490]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、細胞クラスターの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％が、１５０μｍ未満の直径を有する。

【0483】

[00491]一部の実施形態では、本開示は、複数の細胞クラスターを含む組成物を提供し、ここで、細胞クラスターはインスリン陽性細胞を含み、組成物中の細胞クラスターの少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、１．５～４．５、１．５～４．０、１．５～３．５、１．５～３．０、１．５～２．５、１．５～２．０、２．０～４．５、２．０～４．０、２．０～３．５、２．０～３．０、２．０～２．５、２．５～４．５、２．５～４．０、２．５～３．５、２．５～３．０、３．０～４．５、３．０～４．０、３．０～３．５、３．５～４．５、３．５～４．０、または４．０～４．５のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を提示する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、Ｃ－ペプチド陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、ソマトスタチン陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、グルカゴン陽性細胞を含む。一部の実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養状態で１１日後に生存可能である。

【0484】

[00492]一部の実施形態では、組成物中の細胞クラスターの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、直径９０～１４０μｍ、９０～１３０μｍ、９０～１２０μｍ、９０～１１０μｍ、１００～１４０μｍ、１００～１３０μｍ、１００～１２０μｍ、１００～１１０μｍである。

【0485】

[00493]一部の実施形態では、組成物中の細胞クラスターの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、１．５～４．５、１．５～４．０、１．５～３．５、１．５～３．０、１．５～２．５、１．５～２．０、２．０～４．５、２．０～４．０、２．０～３．５、２．０～３．０、２．０～２．５、２．５～４．５、２．５～４．０、２．５～３．５、２．５～３．０、３．０～４．５、３．０～４．０、３．０～３．５、３．５～４．５、３．５～４．０、または４．０～４．５のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を提示する。一部の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００、１０００、１００００、１０００００、または１００００００個の細胞クラスター。一部の実施形態では、組成物は、本明細書で開示される方法のいずれかに従って調製される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される細胞組成物のいずれかを含むデバイスを提供する。一部の実施形態では、本開示は、長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患（例えば、糖尿病）を有する対象を処置する方法を提供し、本方法は、本明細書で開示される組成物のいずれかまたは本明細書で開示されるデバイスのいずれかを対象に投与するステップを含む。

【0486】

[00494]一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、もしくはＨ－１１５２、またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞をヒス、トンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、３－デアザネプラノシンＡ塩酸塩、またはその誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、亜鉛と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、亜鉛は、ＺｎＳＯ_４の形態で存在する。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＬ）阻害剤と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＧＬＬ阻害剤は、ＪＪＫＫ０４８、ＫＭＬ２９、ＮＦ１８１９、ＪＷ６４２、ＪＺＬ１８４、ＪＺＬ１９５、ＪＺＰ３６１、プリスチメリン、もしくはＵＲＢ６０２、または前述のいずれかの誘導体である。一部の実施形態では、本開示は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、脂質と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、脂質は飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、飽和脂肪酸はパルミチン酸塩である。一部の実施形態では、脂質は不飽和脂肪酸である。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、またはパルミトレイン酸である。

【0487】

[00495]一部の実施形態では、本方法は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、血清アルブミンタンパク質はヒト血清アルブミンタンパク質である。一部の実施形態では、組成物は、０．０１％～１％、０．０３～１％、０．０３～０．９％、０．０３～０．０８％、０．０３～０．０６％、０．０３～０．０５％、０．０４～０．８％、０．０４～０．７％、０．０４～０．６％、０．０４～０．５％、０．０４～０．４％、０．０４～０．３％、０．０４～０．２％、０．０４～０．１％、０．０４～０．０９％、０．０４～０．８％、０．０４～０．０７％、０．０４～０．０６％、０．０４～０．０５％、０．０５～１％、０．０５～０．９％、０．０５～０．８％、０．０５～０．７％、０．０５～０．６％、０．０５～０．５％、０．０５～０．４％、０．０５～０．３％、０．０５～０．２％、０．０５～０．１％、０．０５～０．０９％、０．０５～０．８％、０．０５～０．０７％、または０．０５～０．０６％の血清アルブミンタンパク質を含む。一部の実施形態では、組成物中の細胞の９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が細胞クラスターで存在する。一部の実施形態では、本方法は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、ＴＧＦ－β経路阻害剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β経路阻害剤は、Ａｌｋ５ｉ（ＳＢ５０５１２４）、またはその誘導体である。一部の実施形態では、本方法は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、ＧＣ－１もしくはＴ３、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、本方法は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンである。一部の実施形態では、本方法は、複数の解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞を、ビタミンＣと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の解離されたインスリン陽性内分泌前駆細胞を、γセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ）と接触させるステップを含まない。一部の実施形態では、解離したインスリン陽性内分泌前駆細胞は、以前に凍結されていた。一部の実施形態では、本方法は、１～１０日、１～９日、１～８日、１～７日、１～６日、１～５日、１～４日、１～３日、１～２日、２～１０日、２～９日、２～８日、２～７日、２～６日、２～５日、２～４日、２～３日、３～１０日、３～９日、３～８日、３～７日、３～６日、３～５日、３～４日、４～１０日、４～９日、４～８日、４～７日、４～６日、または４～５日にわたって実施される。一部の実施形態では、本方法は、解離した細胞の、複数の細胞クラスターへの再凝集をもたらす。一部の実施形態では、複数の細胞クラスターの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、約５０μｍ～約２５０μｍ、約７５μｍ～約２５０μｍ、または約１００μｍ～約２００μｍの直径を有する。一部の実施形態では、第２の細胞集団の複数の細胞クラスターの細胞の少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％が生存可能である。一部の実施形態では、本方法は、解離した細胞の、少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００、１０００、１００００、１０００００、または１００００００個の細胞クラスターへの再凝集をもたらす。

【0488】

[00496]一部の事例では、本明細書で提供される方法は、能動的な細胞選別プロセス、例えば、フローサイトメトリーを含まない。一部の事例では、本明細書に記載したような細胞クラスターは、選別されていない細胞クラスターであり得る。一部の事例では、本明細書で提供される方法は、第１の細胞クラスターにおける特定の細胞型の濃縮または排除のための能動的な細胞選別に依存しない。一部の事例では、方法は単に、第１の細胞クラスターを解離するステップと、第１の細胞クラスターから解離された複数の細胞を培地中で培養し、それにより第２の細胞クラスターの形成を可能にするステップとを要する。

【0489】

[00497]一部の事例では、本明細書で提供される方法は、細胞クラスターを解離し、複数回新たなクラスターへ再凝集させるのに適用することができる。例えば、第１の細胞クラスターは、本明細書で提供される方法に従って、解離および再凝集されて第２の細胞クラスターを形成することができ、第２の細胞クラスターは、さらに解離および再凝集されて第３の細胞クラスターを形成すること、などができる。本明細書で提供されるような再凝集は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回、細胞クラスターに対して順次実施することができる。

【0490】

[00498]本明細書に記載したような細胞選別は、細胞サイズ、形状（形態）、表面タンパク質発現、内因性シグナルタンパク質発現、またはそれらの任意の組合せの差に依存するステップによって、細胞群を複数の細胞から単離するプロセスを指し得る。一部の事例では、細胞選別は、細胞をフローサイトメトリーに付すステップを含む。フローサイトメトリーは、レーザーまたはインピーダンスベースの生物物理学的技術であり得る。フローサイトメトリー中に、細胞を液体流中に懸濁させ、それらを電子検出装置に通すことができる。フローサイトメトリーの１つのタイプである蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）では、細胞の光学特性の１つまたは複数のパラメーター（例えば、レーザー励起時の発光波長）に基づいて、フローサイトメトリーを使用して目的の細胞を物理的に分離し、それにより精製することができる。本明細書に記載したように、選別されていない細胞クラスターは、能動的な細胞選別プロセス、例えば、フローサイトメトリーを受けていない複数の細胞によって形成された細胞クラスターであり得る。一部の事例では「再凝集された細胞クラスター」と称される選別されていない細胞クラスターは、既存の細胞クラスターから解離された複数の細胞によって形成することができ、新たな細胞クラスターへのそれらの再凝集の前に、本明細書で提供されるように、再凝集のために１つまたは複数の特定の細胞型を単離するための能動的な細胞選別プロセス、例えば、フローサイトメトリーまたは他の方法は存在し得ない。一部の事例では、本明細書で論じたようなフローサイトメトリーは、細胞において発現された１つまたは複数のシグナルペプチドに基づき得る。例えば、細胞クラスターは、シグナルペプチド（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、シグナルペプチドは、細胞におけるインスリン発現の指標として発現される。例えば、細胞クラスターは、インスリンプロモーターの制御下でＧＦＰをコードする外因性核酸配列を有する細胞を含むことができる。インスリンプロモーターは、内因性または外因性のプロモーターであり得る。一部の事例では、これらの細胞におけるＧＦＰの発現は、上記細胞におけるインスリン発現を示し得る。したがって、ＧＦＰシグナルは、膵β細胞のマーカーとなり得る。一部の事例では、本明細書に記載したような細胞選別は、磁気活性化フローサイトメトリーを含むことができ、ここで、磁気抗体または他のリガンドは、異なる細胞型を標識するのに使用され、磁気特性の差を、細胞選別に使用することができる。

【0491】

[00499]第１の細胞クラスターから解離された細胞は、第２の細胞クラスターへ再凝集させるために培地中で培養することができる。培地は、Ｃｏｎｎｏｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ １０６６補充膵島培地（ＣＭＲＬＳ）を含むことができる。一部の事例では、適切な培地は、ＣＭＲＬＳの構成成分（例えば、追加亜鉛）を含む。ＣＭＲＬＳは、例えば、血清（例えば、ヒト血清、ヒト血小板溶解物、ウシ胎児血清、またはノックアウト血清置換などの血清置換）を補うことができる。

【0492】

[00500]培地は、細胞におけるある特定のシグナル伝達経路を規制する１つまたは複数の化合物を含むことができる。例えば、培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路阻害剤、またはその両方を含むことができる。

【0493】

[00501]本明細書で使用される培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）であり得る。一部の事例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３の類似体または誘導体であり得る。Ｔ３の非限定的な例示的な類似体として、選択的および非選択的甲状腺ホルモン模倣物（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ＴＲβ選択的アゴニスト－ＧＣ－１、ＧＣ－２４、４－ヒドロキシ－ＰＣＢ １０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４、３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ－βアゴニスト ＧＣ－１；３－ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５－トリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンチロキシンの生物活性代謝産物（Ｔ（４）））；ＫＢ－２１１５およびＫＢ－１４１；チロナミン；ＳＫＦ Ｌ－９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’－ＡＣ－Ｔ２；テトラヨードサイロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン（Ｔ４）およびトリヨードチロニン（Ｔ３）アラニン鎖の酸化的脱アミノ化および脱炭酸化による）、３，３’，５’－トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化による）、３，３’－ジヨードチロニン（３，３’－Ｔ２）および３，５－ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化による）、および３－ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化およびアミノ酸脱炭酸化による）、ならびにＴＨの構造的類似体として、例えば、３，５，３’－トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５－ジブルモ－３－ピリダジノン－１－チロニン（Ｌ－９４０９０１）、Ｎ－［３，５－ジメチル－４－（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルフェノキシ）－フェニル］－オキサミン酸（ＣＧＳ ２３４２５）、３，５－ジメチル－４－［（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルベンジル）－フェノキシ］酢酸（ＧＣ－１）、３，５－ジクロロ－４－［（４－ヒドロキシ－３－イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ－１４１）、および３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられる。一部の事例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えば、Ｔ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ－３，５，３’，５’－テトラヨードチロニン）である。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１６３，９１８号に記載されているヨードチロニン組成物であり得る。

【0494】

[00502]培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達活性化剤の濃度は、細胞凝集に適した範囲で存在し得る。一部の事例では、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の濃度は、約０．１μＭ～約１０μＭ、例えば、約０．５μＭ～約２μＭ、約０．８μＭ～約１．５μＭ、約０．９μＭ～約１．５μＭ、約０．９μＭ～約１．２μＭ、または約０．９μＭ～約１．２μＭである。一部の事例では、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の濃度は、少なくとも約０．１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または１０μＭである。一部の事例では、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３）の濃度は、約１μＭである。

【0495】

[00503]本発明における培地中で使用されるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ－β ＲＩ）シグナル伝達の阻害剤であり得る。ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ－５（Ａｌｋ５）阻害剤、例えば、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２、ＴＧＦ－β ＲＩキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤、ＲｅｐＳｏｘとしても既知、ＩＵＰＡＣ名：２－［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン）であり得る。一部の事例では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００２１５１９号、同第２０１０／０２６７７３１号、同第２００９／０１８６０７６号、および同第２００７／０１４２３７６号に記載されるものを含む、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。一部の事例では、本明細書における培地中で使用することできるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の例としてはまた、Ｄ４４７６、ＳＢ４３１５４２、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－ｌＨ－ピラゾール－１－カルボチオアミドとしても知られるＡ－８３－０１；２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－ｌＨ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８（－（４－［３－（ピリジン－２－イル）－ｌＨ－ピラゾール－４－イル］ピリドム－２－イル）－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド）、ＳＭＩ ６、ΓΝ－１ １３０（３－（（５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（キノキサリン－６－イル）－ｌＨ－イミダゾール－２－イル）メチル）ベンズアミド）、ＧＷ６６０４（２－フェニル－４－（３－ピリジン－２－イル－ｌＨ－ピラゾール－４－イル）ピリジン）、ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［ｌ，３］ジオキソル－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩）、ＳＵ５４１６、レルデリムマブ（ＣＡＴ－１５２）、メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２）、ＧＣ－１００８、ＩＤ１ １、ＡＰ－１２００９、ＡＰ－１ １０１４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＤ－２０８、ＳＭ１６、ＮＰＣ－３０３４５、ΚＩ２６８９４、ＳＢ－２０３５８０、ＳＤ－０９３、ＡＬＸ－２７０－４４８、ＥＷ－７１９５、ＳＢ－５２５３３４、ΓΝ－１２３３、ＳＫＩ２１６２、Ｇｌｅｅｖｅｃ、３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフィアボン（Ｍｏｒｉｎ）、アクチビン－Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ、ピリミジン誘導体およびインドリノンが挙げられる。ＴＧＦ－β／アクチビン経路の阻害は、類似した効果を有し得る。したがって、ＴＧＦ－β／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流）は、本明細書に記載したようなＴＧＦ－β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、またはＴＧＦ－／ＡＬＫ５阻害剤の代わりに使用することができる。例示的なＴＧＦ－β／アクチビン経路阻害剤として、以下に限定されないが、ＴＧＦ－β受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３およびＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化剤／アゴニストが挙げられる。さらに、本明細書に記載した分類は、単に組織的な目的のためのものであり、当化合物が経路内の１つまたは複数の点に影響を及ぼし得ること、したがって、化合物が１つよりも多い規定のカテゴリーで機能し得ることは当業者に理解されよう。ＴＧＦ－β受容体阻害剤は、全般にＴＧＦシグナル伝達の任意の阻害剤、またはＴＧＦ－β受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤を含んでもよく、それらはＴＧＦ－β受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブバリアント、ならびにその発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含み得る。

【0496】

[00504]培地中のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、細胞凝集に適した範囲で存在し得る。一部の事例では、培地中のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、約１μＭ～約５０μＭ、例えば、約５μＭ～約１５μＭ、約８μＭ～約１２μＭ、または約９μＭ～約１１μＭである。一部の事例では、培地中のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、少なくとも約１μＭ、５μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭである。一部の事例では、培地中のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ）の濃度は、約１０μＭである。

【0497】

[00505]第１の細胞クラスターから解離された細胞を培養するのに使用される培地は、ゼノフリーであり得る。動物を起源とする細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物由来の産物を有することができない。一部の事例では、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いずれの非ヒト動物由来の産物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。例えば、培地は、約１％～約２０％、約５％～約１５％、約８％～約１２％、約９～約１１％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、約１０％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、小分子および／またはＦＢＳを含まなくてもよい。例えば、培地は、２％のＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１基礎培地を含むことができる。特定の実施形態では、培地は無血清である。一部の例では、培地は、外因性小分子またはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞成長因子ファミリーからの成長因子（ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ２１）、ソニックヘッジホッグアンタゴニスト（例えば、Ｓａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、またはそれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、またはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、および１４－１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤（例えば、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、ブリオスタチン１、またはそれらの誘導体）、ＴＧＦベータスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２）、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＳＢ－５０５１２４、またはそれらの誘導体）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９またはそれらの誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３またはその誘導体）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、またはそれらの誘導体）、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の活性化剤（例えば、ＷＮＴ３ａまたはアクチビンＡ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子（例えば、ベータセルリンまたはＥＧＦ）、広範囲のキナーゼ（例えば、スタウロスポリンまたはその誘導体）、非必須アミノ酸、ビタミンまたは酸化防止剤（例えば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、またはそれらの誘導体）、あるいはＮ－アセチルシステイン、硫酸亜鉛、またはヘパリンのような他の添加物を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部の事例では、再凝集培地は、他の細胞外マトリックス分子または材料、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、または、例えば、溶解された細胞膜調製物を含まない。

【0498】

[00506]当業者であれば、培地中に補ったＢＳＡの濃度が必要に応じて変化し得ることを認識するであろう。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＢＳＡを含むことができる。特定の実施形態では、培地は、いかなるＢＳＡも含まない。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、伝統的な基礎培地には見出されない構成成分、例えば、微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、ならびに高レベルの一部のアミノ酸およびビタミンを含有することができる。これらの添加物によって、培地を、非常に低いレベルの血清または規定された構成成分で補うことを可能とし得る。培地は、タンパク質および／または成長因子を含まなくてもよく、かつＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、および／またはグルタミンを補ってもよい。

【0499】

[00507]培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含んでもよい。培地中で使用される非限定的な例示的な細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、バイグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部の事例では、培地は、ラミニン、例えば、ＬＮ－３３２を含む。一部の事例では、培地はヘパリンを含む。

【0500】

[00508]培地は、例えば、培地中の細胞に最適な環境を与えるために、培養中に定期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから分離された細胞を培養する場合、培地は、少なくともまたは約４時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎、３日毎もしくは４日毎に交換することができる。例えば、培地は、約４８時間毎に交換することができる。

【0501】

[00509]第１の細胞クラスターから解離された細胞は、再凝集のために容器中に播種することができる。播種密度は、再凝集された第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。播種密度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似し得るように制御することができる。一部の事例では、播種密度は、第２の細胞クラスターのサイズが約７５μｍ～約２５０μｍであり得るように制御される。第１の細胞クラスターから解離された細胞は、約１０万細胞／ｍＬ～約１０００万細胞／ｍＬの密度で、例えば、約５０万細胞／ｍＬ～約１５０万細胞／ｍＬ、約８０万細胞／ｍＬ～約１２０万個の細胞／ｍＬ、約９０万細胞／ｍＬ～約１１０万細胞／ｍＬ、約２００万細胞／ｍＬ～約３００万細胞／ｍＬの密度で播種することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、１ｍＬあたり約１００万細胞の密度で播種することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、１ｍＬ当たり約１５０万細胞の密度で播種することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、１ｍＬ当たり約２００万細胞の密度で播種することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、１ｍＬ当たり約２５０万細胞の密度で播種することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、１ｍＬ当たり約３００万個細胞の密度で播種することができる。

【0502】

[00510]第１の細胞クラスターから解離された細胞は、培養ベッセル中で培養することができる。培養ベッセルは、細胞の培養の懸濁液を培養するのに適切であり得る。本明細書における細胞または細胞クラスターを培養するのに使用される培養ベッセルは、以下に限定されないが、その中で細胞を培養することが可能である限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、シャーレ、ペトリ皿、組織培養用シャーレ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、およびローラーボトル、撹拌タンクバイオリアクター、またはポリマー（例えば、生体高分子またはゲル）カプセル化を挙げることができる。細胞および／または細胞クラスターは、培養の必要性に応じて、少なくともまたは約０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、２０００ｍｌ、３０００ｍｌ、またはその中の誘導可能な任意の範囲の容積で培養することができる。

【0503】

[00511]一部の事例では、細胞は、動的条件下（例えば、細胞が、懸濁培養下にある間、一定の動きまたは撹拌に供される条件下）で培養することができる。細胞を動的培養するために、細胞は、制御ユニットに接続され、よって、制御された培養系を提供することができる容器（例えば、スピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ～３０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌの；１００ｍｌの；または１２５ｍｌのエルレンマイヤー中の）などの非接着性容器）中で培養することができる。一部の事例では、細胞は、それらの増殖能力を維持しながら、非動的条件（例えば、静的培養）下で培養することができる。細胞を非動的培養するために、細胞は、接着性培養ベッセル中で培養することができる。接着性培養ベッセルは、ベッセル表面の細胞への接着性を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基質のいずれかでコーティングされてもよい。細胞接着のための基質は、幹細胞またはフィーダー細胞を付着させることを意図する任意の材料（使用される場合）であり得る。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにそれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解された細胞膜調製物が挙げられる。

【0504】

[00512]動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）中の培地は、撹拌され得る（例えば、スターラーによって）。スピン速度は、再凝集される第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似し得るように制御され得る。

【0505】

[00513]第１の細胞クラスターから解離された細胞は、それらが再凝集するのを可能にするために一定期間培養することができる。第１の細胞クラスターから解離された細胞は、少なくとも１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、または３０日間培養することができる。一部の事例では、第１の細胞クラスターから解離された細胞は、少なくとも４日間培養することができる。

【0506】

[00514]本明細書における方法はまた、細胞クラスターにおける内因性細胞に類似した細胞、例えば、内因性成熟膵β細胞を濃縮するのに使用することができる。本方法は、第１の細胞クラスターを解離するステップと、細胞を第１のクラスターから第２のクラスターへ再凝集させるステップとを含み得る。第２のクラスターは、第１のクラスターと比較して、より多くの、内因性成熟膵β細胞に類似した細胞を含み得る。解離および再凝集は、本出願を通じて開示される任意の方法および試薬を使用して実施することができる。

【0507】

[00515]再凝集後、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より多くの、内因性細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する細胞を含み得る。例えば、第２のクラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より多くの、内因性成熟膵β細胞の１つまたは複数のマーカー、インスリン、Ｃ－ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＭＡＦＡ、ＺＮＴ８、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＬＣ２Ａ、ＰＣＳＫ１、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ８、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＮＡＰ２５、ＲＡＢ３Ａ、ＧＡＤ２、およびＰＴＰＲＮを含むマーカーを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２のクラスターは、より多くの、ＣＨＧＡを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２のクラスターは、より多くの、ＮＫＸ６．１を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２のクラスターは、より多くの、Ｃ－ペプチドを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２のクラスターは、より多くの、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２のクラスターは、より多くの、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含み得る。

【0508】

[00516]再凝集後、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より小さいサイズ（例えば、より小さな直径）を有し得る。サイズが小さいほど、細胞クラスターと周囲の環境との間の分子のより良好な交換が可能となり得る。例えば、サイズが小さいほど、培地から細胞クラスターにおける細胞への分子（例えば、試薬、気体および／または栄養素）のより良好な拡散が可能となり得る。したがって、サイズが小さいと、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より効率的な様式で分子を周囲の環境と交換することができる。したがって、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より少ない死細胞（例えば、不十分な栄養素および／または気体に起因して死滅した細胞）を有することができる。

【0509】

[00517]本明細書で提供される方法は、内分泌細胞、例えば、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現する細胞を濃縮することができる。例えば、クロモグラニンＡを発現する第２の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージは、クロモグラニンＡを発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージよりも少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、または少なくとも１．５倍高い。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のＣＨＧＡを発現する細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターにおける少なくとも約８５％の細胞がＣＨＧＡを発現することができる。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約９０％のＣＨＧＡを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約９５％のＣＨＧＡを発現する細胞を含み得る。ある特定の事例では、第２の細胞クラスターにおける細胞は全て、ＣＨＧＡを発現することができる。

【0510】

[00518]本明細書で提供される方法は、膵β細胞を産生または濃縮することができる。例えば、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの膵β細胞、例えば、少なくとも１つの非天然膵β細胞を含む。例えば、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの両方を発現する第２の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージは、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの両方を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージよりも少なくとも１．５、少なくとも１．７５、または少なくとも２倍高い。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含む。一部の事例では、第２の細胞クラスターにおける少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、細胞クラスターは、約６０％のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約７５％のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターにおける細胞は全て、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現することができる。一部の事例では、第２の細胞クラスターにおける少なくとも１つの非天然膵β細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによって測定された場合にクロモグラニンＡを発現する。一部の事例では、第２の細胞クラスターにおける少なくとも１つの非天然膵β細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによって測定された場合にＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する。

【0511】

[00519]本明細書で提供される方法は、膵内分泌細胞の幹細胞もしくは前駆細胞を減少または排除することができる。一部の事例では、ＳＯＸ２を発現する第２の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージは、ＬＩＮ２８、Ｋｉ６７、ＳＯＸ２、またはＳＯＸ９を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージよりも少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、または少なくとも１０倍低い。例えば、第２の細胞クラスターは、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％、多くとも約０．０１％のＬＩＮ２８を発現する細胞を含み得るか、またはそれらを全く含むことができない。一部の事例では、本明細書で提供されるような第２の細胞クラスターは、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％、多くとも約０．０１％のＫｉ６７を発現する細胞を含み得るか、またはそれらを全く発現する細胞を含むことができない。例えば、第２の細胞クラスターは、多くとも３％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％の細胞、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含み得るか、またはそれらを全く含むことができない。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約０．６％のＳＯＸ２を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約０．３％のＳＯＸ２を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約０．１％のＳＯＸ２を発現する細胞を含み得る。例えば、第２の細胞クラスターは、多くとも１０％の細胞、多くとも約８％の細胞、多くとも約６％の細胞、多くとも約５％の細胞、多くとも約２％の細胞、多くとも約１％の細胞、多くとも約０．５％、多くとも約０．１％の細胞、多くとも約０．０５％の細胞、多くとも約０．０１％のＳＯＸ９を発現する細胞を含み得るか、またはそれらを発現する細胞を全く含むことができない。一部の事例では、一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約２％のＳＯＸ９を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約６％のＳＯＸ９を発現する細胞を含み得る。一部の事例では、第２の細胞クラスターは、約１．２％のＳＯＸ９を発現する細胞を含み得る。

【0512】

[00520]第２の細胞クラスターはまた、第１の細胞クラスターと比較して、内因性膵島により類似して機能し得る。第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターよりも高いインスリン含有量、例えば、第１の細胞クラスターと比較した場合に、少なくとも１．１、少なくとも１．２５または少なくとも１．５倍高いインスリン含有量を有し得る。第２のクラスターは、刺激指数によって測定された場合、第１の細胞クラスターよりも大きいｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳを提示することができる。第２のクラスターはまた、刺激指数によって測定された場合、第１の細胞クラスターよりも大きいｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳを提示することができる。一部の事例では、第２のクラスターは、刺激指数によって測定された場合、第１の細胞クラスターと比較して、より大きいｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳおよびより大きいｉｎ ｖｉｖｏ ＧＳＩＳを提示することができる。例えば、第２の細胞クラスターは、同じ刺激条件下で、第１の細胞クラスターよりも多くのインスリンを分泌することができる。第２の細胞クラスターはまた、カリウムチャレンジ（Ｋ^＋）、例えば、ＫＣｌの濃度、例えば３０ｍＭ ＫＣｌに対するインスリン分泌応答を提示することができる。

【0513】

[00521]一部の事例では、本明細書で提供される方法は、第２の細胞クラスターにおける第１の細胞クラスター由来の細胞、例えば、膵β細胞または内分泌細胞の大きいパーセンテージを保持することができる。例えば、第１の細胞クラスターにおいてＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、第２のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞クラスターにおいて保持され得る。一部の事例では、第１の細胞クラスターにおいてＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの両方を発現する細胞の多くとも約５％、多くとも約２％、多くとも約１％、多くとも約０．５％、または多くとも約０．１％が、解離および再凝集プロセス中に損失される。

【0514】

[00522]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＳＣ－β細胞の集団に安定性または貯蔵寿命の増加を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示の方法は、培養状態で４日、７日、または１０日後に、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を有する細胞の集団を提供する。

【0515】

[00523]一部の事例では、本明細書に記載した細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで任意の出発細胞集団から産生される。例えば、出発細胞として、以下に限定されないが、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、クロモグラニンＡ陽性細胞）またはその任意の前駆体、例えば、Ｎｋｘ６．１陽性膵前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、および多能性幹細胞、胚幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられ得る。一部の事例では、本方法は、再プログラミングされた細胞、部分的に再プログラミングされた細胞（例えば、体細胞、例えば人工多能性幹細胞とそれが由来した体細胞との間の中間状態で存在するように部分的に再プログラミングされた線維芽細胞）、分化転換細胞の分化を含む。一部の事例では、本明細書で開示される膵β細胞を含む細胞クラスターは、インスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることができる。一部の事例では、細膵β細胞を含む細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される前駆体からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化される。一部の事例では、多能性幹細胞は、胚幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。上記で論じたように、非天然膵β細胞はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞に由来する可能性があるため、幹細胞由来β細胞（ＳＣ－β細胞）とも称され得る。一部の事例では、ＳＣ－β細胞またはＳＣ－β細胞が由来する多能性幹細胞はヒトである。一部の事例では、ＳＣ－β細胞はヒトである。

【0516】

[00524]本開示の１つの態様は、非天然膵β細胞を産生する方法を提供する。一部の事例では、本方法は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開特許出願公開第２０１５－０２４０２１２号、同第２０１５－０２１８５２２号および同第２０２１－０２３８５５３号に記載されているものなどの任意の現在利用可能なプロトコールであり得る。本開示の態様は、胚体内胚葉細胞を包含する。本明細書における使用の胚体内胚葉細胞は、任意の供給源から得られまたは任意の適切なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは内胚葉細胞に分化される。一部の態様では、内胚葉細胞（ステージ１）は、例えば、原腸管細胞（ステージ２）、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞（ステージ３）、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞（ステージ４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（ステージ５）にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘導されるかまたは成熟される（ステージ６）。

【0517】

医薬組成物
[00525]一部の実施形態では、本開示は、疾患（例えば、糖尿病）の処置のための様々な方法において、非天然膵ベータ細胞集団ならびに細胞成分および産物を利用することができる医薬組成物を提供する。ある特定の事例は、生細胞（例えば、単独のまたは他の細胞型と混合した非天然膵ベータ細胞）を含む医薬組成物を包含する。他の事例は、非天然膵ベータ細胞成分（例えば、細胞溶解物、可溶性細胞画分、条件培地、ＥＣＭ、または前述のいずれかの成分）または産物（例えば、非天然膵ベータ細胞によってまたは遺伝子修飾によって生成された栄養因子および他の生体因子、非天然膵ベータ細胞の培養からの条件培地）を含む医薬組成物を包含する。いずれかの事例では、医薬組成物は、他の活性剤、例えば、当業者に既知の抗炎症剤、外因性小分子アゴニスト、外因性小分子アンタゴニスト、抗アポトーシス剤、酸化防止剤、および／または成長因子をさらに含んでもよい。

【0518】

[00526]本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、媒質または賦形剤）とともに製剤化された、非天然膵ベータ細胞、またはその成分もしくは産物を含むことができる。薬学的に許容される担体（または媒体）という用語は、生物学的に適合性の担体または媒体という用語と交換可能に使用することができ、治療上投与される細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症を有することなく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのにも好適である、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、リンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンを挙げることができる。このような調製物は、滅菌され、所望の場合、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、および着色剤などの補助剤と混合され得る。生細胞以外の細胞の構成成分または生成物を含む医薬組成物は、液体として製剤化することができる。生きた非天然膵ベータ細胞を含む医薬組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル、ゲルカプセル、またはリポソーム）または固体（例えば、マトリックス、スキャフォールドなど）として製剤化することができる。

【0519】

[00527]医薬組成物は、当業者によく知られているように、補助化合物を含むことができる。例えば、医薬組成物は、使用される酸化防止剤の種類に応じて変わる範囲内で、酸化防止剤を含有し得る。通常使用される酸化防止剤の合理的な範囲は、約０．０１質量対容量％～約０．１５質量対容量％のＥＤＴＡ、約０．０１質量対容量％～約２．０質量対容量％の亜硫酸ナトリウム、および約０．０１質量対容量％～約２．０質量対容量％のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のそれぞれについて、約０．１質量対容量％の濃度を使用し得る。他の代表的な化合物として、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ－アセチルシステイン、ベータ－メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似種が挙げられるが、腎投与に適した他の酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸ナトリウムもまた、用いられ得る。

【0520】

[00528]緩衝剤は、標的組織における刺激を最小限にするために、約４．０～８．０の範囲で製剤のｐＨを維持するのに使用され得る。直接腹腔内注射について、製剤は、ｐＨ７．２～７．５、好ましくはｐＨ７．３５～７．４５であるべきである。組成物はまた、腎臓への投与に適した等張化剤を含んでもよい。これらの中でも、製剤を血液とほぼ等張にさせるために、塩化ナトリウムが適している。

【0521】

[00529]ある特定の事例では、医薬組成物は、粘度増強剤を用いて製剤化される。例示的な薬剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要である場合に添加される共溶媒を有してもよい。適切な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを挙げることができる。保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸もしくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、またはメチルもしくはプロピルパラベンも含まれてもよい。

【0522】

[00530]細胞、細胞成分または細胞産物を含む医薬組成物は、当該技術分野で既知のいくつかの送達方法のうちの１つまたは複数で、患者の腎臓に送達されてもよい。一部の事例では、組成物は、腎臓に送達される（例えば、腎被膜の上および／または腎被膜の下に）。別の実施形態では、組成物は、周期的な腹腔内または腎内注射によって、腎臓内の様々な位置に送達されてもよい。あるいは、組成物は、当業者に公知の他の剤形で、例えば、事前に形成されたかまたはｉｎ ｓｉｔｕで形成されたゲルまたはリポソームで適用されてもよい。

【0523】

[00531]半固体または固体担体中の生細胞を含む医薬組成物は、腎被膜上または腎被膜下への外科的移植のために製剤化され得る。液体組成物も外科的手段で投与されてもよいことが認識されるべきである。特定の事例では、半固体または固体の医薬組成物は、非生分解性または生分解性であってもよい半透過性ゲル、格子、細胞スキャフォールドなどを含むことができる。例えば、ある特定の事例では、外因性細胞を、その周辺から隔離し、さらに、細胞が生物学的分子（例えば、インスリン）を周辺細胞または血流に対して分泌および送達できるようにすることが、望ましいかまたは適切である場合がある。これらの事例では、細胞は、移植された細胞を宿主組織と物理的に分離する、非分解性で、選択的に透過性の障壁により囲まれた生非天然膵ベータ細胞または非天然膵ベータ細胞を含む細胞集団を含む自律性インプラントとして製剤化されてもよい。このような移植片は、薬理学的に誘導された免疫抑制がない場合、免疫細胞および高分子が移植細胞を死滅させるのを防ぐ能力があるため、「免疫保護的」と称することがある。

【0524】

[00532]他の事例では、様々な分解性ゲルおよびネットワークを、本開示の医薬組成物に使用することができる。例えば、持続放出製剤に特に好適な分解性材料としては、生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどが挙げられる。

【0525】

[00533]他の事例では、生分解性、好ましくは、生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅまたはｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）のスキャフォールドまたはマトリックス上またはその中に細胞を送達するのが望ましいかまたは適切であり得る。これらの典型的な三次元生体材料は、スキャフォールドに付着した、スキャフォールド内に分散した、またはスキャフォールドに捕捉された細胞外マトリックスに組み込まれた生細胞を含有する。一旦、身体の標的領域に移植されると、これらの移植片は宿主組織と一体となり、移植細胞が次第に確立されてくる。

【0526】

[00534]本開示において使用することができるスキャフォールドまたはマトリックス（「フレームワーク」と総称されることがある）材料の例としては、不織マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、例えば、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマー、発泡体、および／またはポリ（イプシロン－カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含む繊維を使用して形成されてもよい。

【0527】

[00535]他の実施形態では、フレームワークはフェルトであり、このフェルトは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から製造されたマルチ糸から構成され得る。この糸は、クリンピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を使用してフェルトにされる。別の実施形態では、細胞を混成構造であり得る発泡体スキャフォールド上に播種する。前記実施形態の多くでは、フレームワークは、有用な形状に成型することができる。さらに、非天然膵ベータ細胞は、プレフォーム型の、非分解性外科用または移植用デバイス上で、培養することができると認識される。

【0528】

[00536]マトリックス、スキャフォールドまたはデバイスは、細胞の接着を増強するために、細胞の接種前に処理することができる。例えば、接種前に、ナイロンマトリックスは、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、このナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンも硫酸を使用して同様に処理することができる。また、フレームワークの外面は、細胞の接着または成長および組織の分化を向上させるために、例えば、フレームワークの血漿コーティングまたは１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン－４－硫酸、コンドロイチン－６－硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、および／または、以下に限定されないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの他の材料の添加などにより修飾することができる。

【0529】

[00537]一態様では、本開示は、少なくとも１つの膵β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスを提供した。本明細書で提供されるデバイスは、対象へ移植された場合に、インスリンを生成および放出するように構成され得る。デバイスは、少なくとも１つの膵β細胞、例えば、非天然膵β細胞を含む細胞クラスターを含み得る。デバイス中の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳを提示し得る。デバイスは、半透膜をさらに含むことができる。半透膜は、細胞クラスターをデバイス内に保持し、細胞クラスターによって分泌されたインスリンの通過を可能にするように構成され得る。デバイスの一部の事例では、細胞クラスターは、半透膜によってカプセル化され得る。カプセル化は、当業者に利用可能な任意の技法によって実施され得る。半透膜は、当業者が認識し、検証するように、任意の好適な材料から作製することもできる。例えば、半透膜は、多糖またはポリカチオンから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン－酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、またはそれらの任意の組合せから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、アルギネートを含む。一部の事例では、細胞クラスターは半透膜に囲まれたアルギン酸コアを含むマイクロカプセルに封入される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）と共有結合によりコンジュゲートしたオリゴペプチドを有するアルギネートコアを含むスキャフォールドを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、安定性の向上した、化学酵素的に操作されたアルギネートを有する、共有結合によって強化されたマイクロカプセルを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、アクリレート官能化されたリン脂質のｉｎ－ｓｉｔｕ重合によってアセンブルされた膜模倣フィルムを生成するために改変される。一部の事例では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して、酵素によって改変されたアルギネートから構成される。一部の事例では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接する層間に共有結合を含む。一部の実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分で連結したアルギネートを含むサブシーブカプセルを含む。一部の事例では、マイクロカプセルは、アルギネート－アガロースを含むスキャフォールドを含む。一部の事例では、ＳＣ－β細胞は、アルギネート内にカプセル化される前にＰＥＧで修飾される。一部の事例では、単離された細胞、例えば、ＳＣ－β細胞の集団は、光反応性リポソームおよびアルギン酸中にカプセル化される。マイクロカプセル中に用いられるアルギネートは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キトサン、ポリエステル中空繊維、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＯＤを含むデキストラン、ＢＨＤおよびポリエチレングリコール－ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（ＭＰＣ－コ－ｎ－ブチルメタクリレート－コ－４－ビニルフェニルボロン酸）（ＰＭＢＶ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、ならびにこれらの多層の事例を含む他の好適な生体材料で置き換えることができると認識される。

【0530】

[00538]一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物は、対象に移植されるデバイスに収容される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物は、対象への移植に適したデバイスに収容される。一部の実施形態では、対象に移植されたデバイスは、細胞をデバイス内に保持しながらインスリンを放出し、デバイス内およびデバイス周囲の組織脈管形成を促進する。例示的なデバイスは、例えば、米国特許公開第２０１９０２０１３２３Ａ１号、同第２０２００２８９４０７Ａ１号、同第２０２１００１６０７３Ａ１号、同第２０２２０１４３３７４Ａ１号、および同第２０２２０１７５５１１Ａ１号に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。一部の実施形態では、対象は、デバイスの移植中または血管新生中に免疫抑制剤を投与されない。一部の実施形態では、デバイスは少なくとも約３００ｐｍの厚さを有する。一部の実施形態では、デバイスは、複数のフィブリルによって相互接続された複数のノードを含む膜を備える。

【0531】

[00539]一部の実施形態では、デバイスは、複数のチャネルを含む第１の表面と、第１の表面に対向する複数の第２の表面とを有する第１の膜；および第１の膜の複数の第２の表面に対向して取り付けられた第２の膜を備え、第１の膜と第２の膜が、少なくとも約４０ｃｍ－ｌの表面積対容積比を有する密閉区画を形成し、密閉区画がデバイス内に細胞を収容するための容積を提供する。

【0532】

[00540]一部の実施形態では、密閉区画は、単一の連続した開放チャンバーを備える。一部の実施形態では、容積は約８μＬ～約１，０００μＬである。一部の実施形態では、デバイスは、約０．２５ｃｍから約３ｃｍの長さと幅の少なくとも一方を有する。一部の実施形態では、デバイスは、少なくとも約３００ｐｍの厚さを有する。

【0533】

[00541]一部の実施形態では、複数のチャネルは第１の膜に対して概ね垂直である。一部の実施形態では、複数のチャネルは直線状に配置される。一部の実施形態では、複数のチャネルは極アレイ状に配置される。一部の実施形態では、チャネルは約４００ｐｍ～約３，０００ｐｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、直径はチャネルの最狭部で測定される。一部の実施形態では、各チャネルの中心は、別のチャネルの中心から約７５ｐｍから約５００ｐｍの距離だけ離れている。一部の実施形態では、チャネルは、少なくとも約０．２の高さ対直径の比を有する。一部の実施形態では、デバイスは横断面に沿った面積当たりのチャネル数を有し、一部の実施形態では、その数は約５０／ｃｍ２より大きい。

【0534】

[00542]一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも一方は、複数のフィブリルによって相互接続された複数のノードを含む。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも一方は、ＰＶＤＦ、ＰＴＦＥ、ｅＰＴＦＥ、ＰＣＬ、ＰＥ／ＰＥＳ、ＰＰ、ＰＳ、ＰＭＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、デバイスは、チャネル内の第１の膜および／または第２の膜を貫通する開口部をさらに備える。一部の実施形態では、開口部は、チャネルに対して、最大でもチャネルの直径の約２５％の同心度を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるデバイスを受けるように構成されたフレームである。一部の実施形態では、フレームは複数の細胞収容デバイスを受けるように構成される。一部の実施形態では、フレームは、細胞収容デバイスの座屈を防止するように構成された屈曲機構を備える。

【0535】

処置の方法
[00543]対象における疾患を処置または予防する方法がさらに本明細書で提供される。内因性膵島に類似した細胞クラスターを含む組成物は、対象の膵機能の度合を回復させるために、対象へと投与することができる。例えば、内因性膵島に類似した細胞クラスターを対象に移植して、糖尿病を処置することができる。

【0536】

[00544]一部の実施形態では、本明細書で開示される方法に従って調製された細胞クラスターを含む組成物は、対象に投与されると、改善された臨床転帰を達成する。例えば、一部の事例では、移植された膵島の生存率は、代替組成物（例えば、代替的な方法によって調製された）と比較して増加する。一部の実施形態では、免疫浸潤の減少は、代替組成物（例えば、代替的な方法によって調製された）と比較して、移植片に応答して観察される。一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞のいずれかも、デバイス（例えば、本明細書で開示されるデバイスのいずれか）において投与される。

【0537】

[00545]本方法は、本出願で開示される細胞クラスターを対象、例えば、移植を必要とする対象に移植するステップを含み得る。用語「移植するステップ」および「投与するステップ」は、交換可能に使用され、所望の部位に導入された細胞または細胞クラスターの少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞もしくは細胞クラスター、その細胞もしくは細胞クラスターの任意の部分、またはその細胞、細胞クラスターもしくは任意の部分を含む任意の組成物の、対象への配置を指し得る。細胞または細胞クラスターは、膵臓に直接移植されるか、またはあるいは、移植された細胞の少なくとも一部または細胞が生存可能なままである対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞または細胞クラスターの生存期間は、数時間、例えば、２４時間程度の短さから数日まで、数年ほどの長期であってもよい。一部の例では、細胞もしくは細胞クラスター、またはその細胞もしくは細胞クラスターの任意の部分はまた、例えば、移植した細胞または細胞クラスターを移植片の位置に維持し、遊走を回避するために、カプセル（例えば、マイクロカプセル）で、膵臓以外の位置、例えば、肝臓内または皮下に経投与されてもよい。

【0538】

[00546]本明細書における方法によって処置され得る対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の事例では、対象は哺乳動物であり得る。対象の例としては、以下に限定されないが、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー（bamboo）、またはヒトが挙げられる。一部の事例では、対象は、ヒトである。対象は、以下に限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどを含む非霊長類の動物であってもよい。一部の事例では、処置を受ける対象は、処置を必要とする対象、例えば、処置を必要とするヒトである。

【0539】

[00547]本明細書で使用される場合、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物（例えば、細胞クラスターまたはその一部）を対象に投与することを指し得る。この開示の目的として、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（例えば、部分的または全体的）が挙げられる。処置することは、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存が延長されることを指し得る。よって、当業者は、処置が、疾患状態を改善することができるが、疾患に対する完全な治癒でなくてもよいことを理解する。本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防を含む。

【0540】

[00548]本明細書で提供される方法および組成物は、疾患を有しているか、または疾患を発症するリスク（例えば、リスクの増加）を有する対象を治療するのに使用され得る。一部の事例では、疾患は、以下に限定されないが、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、１．５型糖尿病、前糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、外科的糖尿病、妊娠糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病を含む糖尿病である。疾患はまた、心臓および血管の疾患、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、足の損傷、および聴覚障害を含む糖尿病合併症である可能性もある。

【0541】

[00549]本方法は、当該技術分野の任意の手段を使用して、細胞クラスターを対象に移植するステップを含み得る。例えば、方法は、腹腔内空間、腎被膜下、腎被膜、大網、皮下空間を介して、または膵床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｄ）注入を介して、細胞クラスターを移植するステップを含み得る。例えば、移植するステップは、被膜下移植、筋肉内移植、または門脈内移植、例えば、門脈内注入であり得る。免疫防御性カプセル化は、細胞クラスターに免疫防御性を与えるために実行され得る。

【0542】

[00550]一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞、クラスター、または組成物のいずれも、処置方法以外の方法で利用され得る。一部の実施形態では、細胞、クラスター、または組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの幹細胞、多能性細胞、万能性細胞、または単能性細胞の発生を評価するための有用性を有する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、試薬に応答する細胞における効果（例えば、特定遺伝子の発現）を研究するために、細胞（例えば、ＰＤＸ．１^＋；ＮＫＸ６．１＋膵前駆細胞またはインスリン^＋膵内分泌前駆細胞）および本明細書で開示される試薬のいずれか１つまたは複数（例えば、本明細書で開示される代謝産物のいずれか１つまたは複数）を含む組成物を提供する。

【0543】

デバイス
[00551]一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される細胞、クラスターまたは組成物のいずれかを含むデバイスを提供する。例示的なデバイスは、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９０２０１３２３Ａ１号、同第２０２００２８９４０７Ａ１号、同第２０２１００１６０７３Ａ１号、同第２０２２０１４３３７４Ａ１号、および同第２０２２０１７５５１１Ａ１号に記載されている。

【0544】

[00552]一部の実施形態では、デバイスは、対象に移植されると、インスリンを生成および放出するように構成されている。一部の実施形態では、デバイスは半透膜であり、ここで、半透膜は、本明細書で開示される細胞のいずれかをデバイス内に保持し、細胞によって産生されたインスリンのデバイスの外への通過を可能にするように構成されている。

【0545】

[00553]ある特定の態様では、複数のチャネルを含む第１の表面、および第１の表面に対向する複数の第２の表面を有する第１の膜；および第１の膜の複数の第２の表面に対向して取り付けられる第２の膜を含む細胞収容デバイスが本明細書に記載され、ここで、第１の膜および第２の膜は、少なくとも約４０ｃｍ^－１の表面積対容積比を有する密閉区画を形成し、密閉区画は、デバイス内に細胞を収容するための容積を提供する。

【0546】

[00554]一部の実施形態では、区画は、単一の連続した開放スペースを含む。一部の実施形態では、容積は、約８μＬ～約１，０００μＬである。一部の実施形態では、デバイスは、約０．２５ｃｍ～約３ｃｍの長さおよび幅の少なくとも１つを有する。一部の実施形態では、デバイスは、少なくとも約３００μｍの厚さを有する。一部の実施形態では、複数のチャネルは概して、第１の膜に対して垂直である。一部の実施形態では、複数のチャネルは、直線状に配置される。一部の実施形態では、複数のチャネルは、極アレイ上に配置される。一部の実施形態では、チャネルは、約４００μｍ～約３，０００μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、直径は、チャネルの最狭部で測定される。一部の実施形態では、各チャネルの中心は、別のチャネルの中心から約７５μｍ～約５００μｍの距離だけ離れている。一部の実施形態では、チャネルは、少なくとも約０．２の高さ対直径の比を有する。一部の実施形態では、デバイスは、約５０／ｃｍ^２よりも大きい横断面に沿った面積当たりのチャネル数を有する。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも１つは、複数のフィブリルによって相互接続された複数のノードを含む。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも１つは、ＰＶＤＦ、ＰＴＦＥ、ｅＰＴＦＥ、ＰＣＬ、ＰＥ／ＰＥＳ、ＰＰ、ＰＳ、ＰＭＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、デバイスは、チャネル内の第１の膜および第２の膜を貫通する開口部をさらに備える。一部の実施形態では、開口部は、チャネルに対して、チャネルの直径の多くとも２５％の同心度を有する。一部の実施形態では、デバイスは、デバイスを受けるように構成されたフレームをさらに備える。一部の実施形態では、フレームは、複数の細胞収容デバイスを受けるように構成される。一部の実施形態では、フレームは、細胞収容デバイスの座屈を防止するように構成された屈曲機構を備える。一部の実施形態では、デバイスは、細胞集団をさらに含む。一部の実施形態では、細胞集団は、インスリン分泌集団である。一部の実施形態では、細胞集団は、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）が可能な幹細胞由来細胞である。一部の実施形態では、デバイスは、親水性ポリマーを含むコーティングをさらに含む。一部の実施形態では、デバイスは、約２×１０^－６ｃｍ^２／ｓ～約１×１０^－５ｃｍ^２／ｓのインスリン拡散係数を有する。一部の実施形態では、デバイスは、約１５０μｍ未満の最大インスリン拡散距離を有する。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜は、少なくとも約０．４Ｎの融着剥離力で融着される。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも１つは半透膜である。一部の実施形態では、第１の膜、第２の膜、またはその両方の半透性は、細胞を免疫攻撃から防御するように構成される。一部の実施形態では、第１の膜、第２の膜、またはその両方の半透膜性は、免疫抑制療法の非存在下で細胞を免疫攻撃から防御するように構成されている。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも１つは、デバイス内の細胞の血管新生を可能にするように構成されている。一部の実施形態では、第１の膜および第２の膜の少なくとも１つは、免疫抑制療法の非存在下でデバイス内の細胞の血管新生を可能にするように構成されている。

【0547】

[00555]本明細書で提供される別の態様は、複数のチャネルを含む第１の表面、および第１表面に対向する複数の第２の表面を有する第１の膜；ならびに第１の膜の複数の第２の面に対向して取り付けられる第２の膜を含む細胞収容デバイスであり、ここで、第１の膜および第２の膜は、密閉区画を形成し、密閉区画は、デバイス内に１００万～１０億個のインスリン生成細胞を収容するための容積を提供し、上記膜は、デバイス内にインスリン生成細胞を保持しながら、デバイスからのインスリンの拡散を可能にする。

【0548】

[00556]一部の実施形態では、デバイスは、移植可能なマイクロカプセル化デバイスである。一部の実施形態では、移植可能なマクロカプセル化デバイスは、第１の外膜；第２の外膜と；および第１の外膜と第２の外膜との間に取り付けられた第１の半透膜を含み、ここで、第１の半透膜および第１の外膜は、細胞の集団を収容するための一次区画を提供するように構成された一次区画を形成するために接続され、第１の半透膜および第２の外膜は、二次区画を形成するために接続され、細胞の集団は、膵前駆細胞、内分泌細胞、もしくはベータ細胞、またはそれらの任意の組合せを含み、デバイスは、第１の外膜、第２の外膜、および第１の半透膜を貫通する複数の貫通孔を含む。一部の実施形態では、第１の外膜、第２の外膜、および第１の半透膜は、上記細胞の集団のデバイス外への通過を遮断するように構成されている。

【0549】

[00557]一部の実施形態では、デバイスは、第１の半透膜と第２の外膜との間に取り付けられた第２の半透膜をさらに備え、一次区画と二次区画との間に三次区画を形成する。一部の実施形態では、第１の半透膜の透水性は、第１の外膜の透水性、第２の外膜の水透水性、またはその両方よりも大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の透水性は、第１の外膜の透水性、第２の外膜の透水性、またはその両方よりも少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の透水性は、第２の半透膜の透水性よりも大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の透水性は、第２の半透膜の透水性よりも小さい。一部の実施形態では、第１の半透膜の多孔性は、第１の外膜の多孔性、第２の外膜の多孔性、またはその両方よりも大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の多孔性は、第１の外膜の多孔性、第２の外膜の多孔性、またはその両方よりも少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の多孔性は、第２の半透膜の多孔性よりも大きい。一部の実施形態では、第１の半透膜の多孔性は、第２の半透膜の多孔性よりも小さい。一部の実施形態では、所与の材料およびバイアス（例えば、濃度勾配および／または圧力差）に対する第１の半透膜のフラックスは、同じ材料およびバイアスについて、第１の外膜のフラックス、第２の外膜のフラックス、またはその両方よりも大きい。一部の実施形態では、所与の材料およびバイアス（例えば、濃度勾配および／または圧力差）に対する第１の半透膜のフラックスは、同じ材料およびバイアスについて、第１の外膜のフラックス、第２の外膜のフラックス、またはその両方よりも少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、所与の材料およびバイアス（例えば、濃度勾配および／または圧力差）に対する第１の半透膜のフラックスは、同じ材料およびバイアスについて、第２の半透膜のフラックスよりも大きい。一部の実施形態では、所与の材料およびバイアス（例えば、濃度勾配および／または圧力差）に対する第１の半透膜のフラックスは、同じ材料およびバイアスについて、第２の半透膜のフラックスよりも小さい。一部の実施形態では、デバイスは、一次区画と流体連通する一次ポート、二次区画と流体連通する二次ポート、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。一部の実施形態では、デバイスは、一次区画と流体連通する一次ポート、二次区画と流体連通する二次ポート、三次区画と流体連通する三次ポート、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。一部の実施形態では、一次ポート、二次ポート、または三次ポートの少なくとも１つは、密閉可能または再密閉可能である。

【0550】

[00558]本明細書で提供される別の態様は、１つまたは複数の細胞を収容するように構成された一次区画、および二次区画を含む移植可能なマクロカプセル化デバイスであって、ここで、一次区画および二次区画は、第１の半透膜によって分離され、二次区画および第１の半透膜は、ｉ）濾液を一次区画から濾過するように、またはｉｉ）補助剤を一次区画内の１つまたは複数の細胞に提供するように、またはｉ）およびｉｉ）の両方になるように構成されており；１つまたは複数の細胞は、容積１μＬ当たり約１０^３～約１０^６細胞の範囲で上記デバイス内にカプセル化されている。

【0551】

[00559]一部の実施形態では、デバイスは三次区画をさらに含み、ここで、三次区画および二次区画は、第２の半透膜によって分離され、第２の半透膜は、ｉ）濾液を三次区画から濾過するように、またはｉｉ）補助剤を三次区画内の１つまたは複数の細胞に提供するように、またはｉ）とｉｉ）の両方になるように構成されている。一部の実施形態では、デバイスは、一次区画と流体連通する一次ポート、または二次区画と流体連通する二次ポートの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、デバイスは、一次区画と流体連通する一次ポート、二次区画と流体連通する二次ポート、または三次区画と流体連通する三次ポートの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、一次ポート、二次ポート、または三次ポートの少なくとも１つは、密閉可能または再密閉可能である。一部の実施形態では、デバイスは、層状膜を通じてデバイスの方側から反対側まで伸びる複数の貫通孔を含む。

【0552】

[00560]一部の実施形態では、貫通孔の１つまたは複数は、シールを形成するために膜の結合部分によって囲まれている。一部の実施形態では、デバイスは、３つまたはそれよりも多いシールを含む。一部の実施形態では、デバイスは、２つまたはそれよりも多い自己交差シールを含む。一部の実施形態では、デバイスは、２つまたは複数の楕円形シールを含む。一部の実施形態では、シールは、接着剤、エポキシ、溶接、それらの任意の組合せ、および／または任意の他の適切な結合方法によって形成される。一部の実施形態では、第１の半透膜は、上記１つまたは複数の細胞の通過を遮断するように構成されている。一部の実施形態では、一次区画および二次区画は、上記１つまたは複数の細胞の通過を遮断するように構成されている。一部の実施形態では、一次区画、二次区画、および三次区画は、上記１つまたは複数の細胞の通過を遮断するように構成されている。

【0553】

[00561]本明細書で提供される別の態様は、１つまたは複数の細胞を収容するように構成された一次区画、および二次区画を含むマクロカプセル化デバイスを提供するステップ（ここで、一次区画および二次区画は、第１の半透膜によって分離され、二次区画および半透膜は、ｉ）濾液を一次区画から濾過するように、またはｉｉ）補助剤を一次区画内の１つまたは複数の細胞に提供するように、またはｉ）およびｉｉ）；の両方になるように構成されている）と；マクロカプセル化デバイスを予め血管形成するステップと；１つまたは複数の細胞を一次区画に負荷するステップと；圧力を二次区画に印可して、濾液を一次区画から除去するステップとを含む方法である。

【0554】

[00562]一部の実施形態では、濾液は一次区画から除去される。一部の実施形態では、本方法は、補助剤を一次区画、二次区画、またはその両方に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、補助剤は、薬物、酸素発生物質、抗凝固剤、栄養素、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、補助剤を投与するステップは、陰圧を二次区画に印加するステップ後に実施されるが、マクロカプセル化デバイスの別の区画に対する二次区画の所望の圧力差を提供する任意の方法も使用され得る。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、またはその両方を膨張させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、一次区画、二次区画、またはその両方を膨張させるステップは、マクロカプセル化デバイスを予め血管形成するステップの前に実施される。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、またはその両方を密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次ポート、二次ポート、またはその両方を再密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、収容するステップは、第２の半透膜によって二次区画と分離された三次区画をさらに含み、ここで、本方法は、１つまたは複数の細胞を三次区画に負荷するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、補助剤を一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せに投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せを膨張させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せを密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次ポート、二次ポート、三次区画、またはそれらの任意の組合せを再密閉するステップをさらに含む。

【0555】

[00563]本明細書で提供される別の態様は、第１の外膜；第２の外膜；および第１の外膜と第２の外膜との間に取り付けられた第１の半透膜を含むマクロカプセル化デバイスを提供するステップ（ここで、第１の半透膜および第１の外膜は、細胞の集団を収容するように構成された一次区画を形成するように接続され、第１の半透膜および第２の外膜は、二次区画を形成するように接続される）と；マクロカプセル化デバイスを予め血管形成するステップと；１つまたは複数の細胞を一次区画に負荷するステップと；圧力差を二次区画に印加して、濾液を一次区画から除去するステップとを含む方法である。

【0556】

[00564]一部の実施形態では、濾液は一次区画から除去される。一部の実施形態では、本方法は、補助剤を一次区画、または二次区画、またはその両方に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、補助剤は、薬物、酸素発生物質、抗凝固剤、栄養素、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、補助剤を投与するステップは、陰圧または他の圧力差を二次区画に印加するステップ後に実施される。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、または二次区画、またはその両方を膨張させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、一次区画、二次区画、またはその両方を膨張させるステップは、マクロカプセル化デバイスを予め血管形成するステップ前に実施される。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、またはその両方を密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次ポート、二次ポート、またはその両方を再密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、マクロカプセル化デバイスは、第２の半透膜によって二次区画と分離された三次区画をさらに含み、ここで、本方法は、１つまたは複数の細胞を三次区画に負荷するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、補助剤を一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せに投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、濾液は一次区画から除去される。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せを膨張させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次区画、二次区画、もしくは三次区画、またはそれらの任意の組合せを密閉するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、一次ポート、二次ポート、三次区画、またはそれらの任意の組合せを再密閉するステップをさらに含む。

【実施例】

【0557】

[00565]これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明において与えられる請求項の範囲を限定するものではない。
実施例１．膵β細胞の分化に対するアクチビンＡ濃度の効果
[00566]本実施例は、膵β細胞の、幹細胞からの分化に対する種々の濃度のアクチビンＡによる幹細胞の処置の効果を実証する。

【0558】

[00567]本開示による例示的なベース分化プロトコール、バージョンＡを、ヒト幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース負荷に応答してインスリンを放出することが可能な成熟β細胞に分化するのに使用した。

【0559】

[00568]バージョンＡプロトコールは、６ステージの段階的なプロトコールである。バージョンＡプロトコールを用いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０２２００９００２０Ａ１号の実施例１に記載されるバージョンＡに類似した方法で、幹細胞を試薬で処置した。一部の実験では、以下に記載するように、ステージ１の１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを、種々の濃度のアクチビンＡで置き換えるようにバージョンＡを修正した。

【0560】

[00569]実験の１つでは、バージョンＡプロトコールを使用して、スピナーフラスコ中で幹細胞の分化を開始し、ステージ１の３日間全体にわたって適用された３つの異なる濃度のアクチビンＡ（「ＡＡ」）、１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、および５ｎｇ／ｍＬ（５％）を検査した一方で、残りの分化ステップは同じに保たれた。ＱＣの日に、例えば、ステージ１の完了（「Ｓ１Ｃ」）、ステージ３の完了（「Ｓ３Ｃ」）、またはステージ５の完了（「Ｓ５Ｃ」）時に、細胞を、それらの形態および細胞構成成分について調べた。具体的には、細胞クラスター懸濁溶液５ｍＬをスピナーフラスコから取り出し、懸濁液１ｍＬを２４ウェルプレートに分注した。２４ウェルプレートにおける細胞クラスターの写真を明視野顕微鏡下で撮影した。残りの懸濁液４ｍＬ中の細胞クラスターを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；１２，６０４，０１３）で３７℃にて２０分間分散させ、４％ＰＦＡで４℃にて２０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中５％ロバ血清および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－１００）中で室温にて１時間ブロックし、細胞マーカーに対する各種抗体で染色した。次に、染色した細胞をＡｃｃｕｒｉ ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。

【0561】

[00570]図１Ａに示されるように、ステージ１分化の完了時に、減少された濃度のアクチビンＡ、１０％または５％で得られた細胞クラスターは、１００％アクチビンＡで得られた細胞クラスターと比較して形態が変化しており、丸い形状および滑らかな縁を有する代わりに、これらの条件下で得られた細胞クラスターは、不規則な形状および粗い縁を有する傾向がある。フローサイトメトリー解析（図１Ａおよび表２）により、Ｏｃｔ４染色について陰性およびＳｏｘ１７染色に対して陽性（「Ｏｃｔ４陰性、Ｓｏｘ１７陽性」、または「Ｏｃｔ４^－／Ｓｏｘ１７^＋」）の細胞のパーセンテージについて、３つの条件間で有意差は見られないことが示された。

【0562】

[00571]図１Ｂに示されるように、ステージ３分化の完了時に、ステージ１での減少されたアクチビンＡ条件（１０％または５％）下の細胞クラスターは、１００％アクチビンＡと比較した場合に形態が変化され続けた。フローサイトメトリー解析により、減少された濃度のアクチビンＡ下で、より多くの細胞がＣｄｘ２を発現し、より少ない細胞がＳｏｘ２を発現することが示された（図１Ｂ～図１Ｃおよび表２）。

【0563】

[00572]図１Ｄは、ステージ５分化の完了時の細胞クラスターの写真、ならびに細胞におけるＮｋｘ６．１およびＩｓｌ１発現の代表的なフローサイトメトリー解析を示す。１０％アクチビンＡ条件下の細胞クラスターは、この時点で１００％アクチビンＡと比較した場合、類似した形態を有したのに対して、５％アクチビンＡ下の細胞クラスターは、形態が変化され続けた。フローサイトメトリー解析（図１Ｄおよび表２）により、１０％アクチビンＡ条件下で得られた細胞と、１００％ＡアクチビンＡ条件下で得られた細胞との間で、類似したパーセンテージのＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陰性細胞およびＮｋｘ６．１陽性、Ｉｓｌ１陽性細胞が見られるのに対して、５％アクチビンＡ条件下では、減少されたパーセンテージのＮｋｘ６．１陽性細胞の割合が見られることが示された。

【0564】

【表2】

【0565】

[00573]別の実験では、幹細胞の分化に対するステージ１での種々の濃度のアクチビンＡの効果を調べるために、用量応答検査を行った。５つの異なる濃度のアクチビンＡを検査した：１００ｎｇ／ｍＬ（１００％）、２０ｎｇ／ｍＬ（２０％）、１０ｎｇ／ｍＬ（１０％）、５ｎｇ／ｍＬ（５％）、および０ｎｇ／ｍＬ（０％）。図１Ｅは、５つの異なる条件下でのＳ１Ｃ時のＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陽性細胞（「Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋」）、およびＳｏｘ７陰性、Ｏｃｔ４陰性細胞（「二重陰性」）のパーセンテージをまとめた棒グラフおよび表を示す。これらのデータにより、Ｓｏｘ１７－／Ｏｃｔ４＋細胞のパーセンテージは、アクチビンＡ濃度を１００％から２０％、１０％、または５％に減少した場合には有意に変化しなかったが、１００％アクチビンＡによる処置を用いた場合の１％以下から、アクチビンＡなしの場合の２０％超に有意に増加し、減少されたアクチビンＡ（２０％、１０％、５％）を用いた場合、二重陰性細胞のパーセンテージの増加が見られたのに対して、アクチビンＡなし場合では、パーセンテージは類似したままであったことが示されている。

【0566】

実施例２．膵β細胞の分化に対する２つの例示的な化合物の効果
[00574]本実施例は、膵β細胞の、幹細胞からの分化に対する本開示による２つの例示的化合物、ＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９による幹細胞の処置の効果を実証する。

【0567】

[00575]実施例１と同じ例示的なベース分化プロトコール、バージョンＡを、以下に記載される実験について修正して使用した。
[00576]実験の１つでは、ステージ１分化に関する４つの異なる条件を検査した：１００％アクチビンＡ、１０％アクチビンＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ」）、または１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９（「ＢＹＬ」）。細胞形態および細胞成分の特徴付けは、実施例１に記載したのと同様に行った。実験は４回繰り返した。表３は、Ｓ１Ｃ、Ｓ３Ｃ、およびＳ５Ｃ時でのフローサイトメトリー解析結果の定量化、ならびに４回の実行に関するＳ５Ｃ時での総生存細胞収量をまとめている。４回の実行全てにおいて、０．１μＭのＧＳＫ－６０９０６３または０．０４μＭのＢＹＬ７１９をステージ１の３日間に適用したが、但し、最後の２回の実行、Ｒｕｎ４およびＲｕｎ５では、０．０４μＭのＢＹＬ７１９は２日間（Ｓ１ｄ１およびＳ１ｄ２の日）のみに適用した。

【0568】

【表3】

【0569】

[00577]図２Ａは、ステージ１の完了時の６つの異なる条件下での細胞クラスターの写真を示す。図２Ｂは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現に関するＳ１ｃ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それは図２Ｃの棒グラフにまとめられている。

【0570】

実施例３．例示的な化合物の組合せ
[00578]本実施例は、膵β細胞の、幹細胞からの分化に対する２つの例示的化合物、ＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９の組合せによる幹細胞の処置の効果を実証する。

【0571】

[00579]実施例１と同じ例示的なベース分化プロトコール、バージョンＡを、以下に記載される実験について修正して使用した。
[00580]実験の１つでは、ステージ１分化に関する６つの異なる条件を検査した：１００％アクチビンＡ、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３、１０％アクチビンＡとＢＹＬ７１９、１０％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９、または１００％アクチビンＡとＧＳＫ－６９０６９３およびＢＹＬ７１９。細胞形態および細胞成分の特徴付けは、実施例１に記載したのと同様に行った。図２Ａ～図５Ｅおよび表４は、異なるステージにおける６つの分化条件下で得られた細胞の特徴付けをまとめている。

【0572】

[00581]図２Ａは、ステージ１の完了時の６つの異なる条件下での細胞クラスターの写真を示す。図２Ｂは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ１７の発現に関するＳ１Ｃ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらは図２Ｃの棒グラフにまとめられている。

【0573】

[00582]図３Ａは、Ｓ３Ｃ時の細胞クラスターの写真を示す。図３Ｂおよび図３Ｄは、Ｃｄｘ２、Ｓｏｘ２、およびＰｄｘ１の発現に関するＳ３Ｃ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、それらはそれぞれ図３Ｃおよび図３Ｅの棒グラフにまとめられている。

【0574】

[00583]図４Ａは、Ｓ５Ｃ時の細胞クラスターの写真を示す。図４Ｂは、Ｎｋｘ６．１およびＩｓｌ１の発現に関するＳ５Ｃ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示し、図４Ｃ～図４Ｄの棒グラフにまとめられている。図４Ｅ～図４Ｆは、それぞれ、６つの異なる条件下でのＳ５Ｃ時の生細胞収量およびＩｓｌ１陽性細胞の収量をまとめた棒グラフを示す。

【0575】

【表4】

【0576】

[00584]別の実験では、ステージ６分化に対する、ステージ１分化に関する前述の６つの異なる条件の効果を、２つのステージ６レジメン：レジメン１（表５）およびレジメン２（表６）下で検査した。

【0577】

[00585]図５Ａ、図５Ｃ～図５Ｅは、レジメン１下でのステージ６の７日目（Ｓ６ｄ７）での細胞のフローサイトメトリー解析の結果、およびβ細胞（Ｎｋｘ６．１およびＩｓｌ１、図５Ａ）、α細胞（グルカゴンおよびＣ－ペプチド、図５Ｃ～５Ｄ）、およびδ細胞（ソマトスタチン、図５Ｄ～５Ｅ）を染色するためのマーカーのそれら各々の発現に関する６つの分化条件を示す。図５Ｂは、６つの分化条件下でのＳ６ｄ７でのＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞、およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞のパーセンテージをまとめた棒グラフを示す。

【0578】

[00586]図６Ａ、図６Ｃ～図６Ｅは、レジメン２下でのステージ６の７日目（Ｓ６ｄ７）での細胞のフローサイトメトリー解析の結果、およびβ細胞（Ｎｋｘ６．１およびＩｓｌ１、図６Ａ）、α細胞（グルカゴンおよびＣ－ペプチド、図６Ｃ～図６Ｄ）、およびδ細胞（ソマトスタチン、図６Ｄ～図６Ｅ）を染色するためのマーカーのそれら各々の発現に関する６つの分化条件を示す。図６Ｂは、６つの分化条件下でのＳ６ｄ７でのｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陽性細胞およびＩｓｌ１陽性、Ｎｋｘ６．１陰性細胞のパーセンテージをまとめた棒グラフを示す。

【0579】

【表5】

【0580】

【表6】

【0581】

【表7】

【0582】

実施例４．膵β細胞分化に関する小分子化合物の検討
[00587]本実施例は、膵β細胞の、幹細胞からの分化に対する、本開示による例示的な化合物を含む多数の低分子化合物の効果を実証する。

【0583】

[00588]実験の１つでは、小分子ケモゲノミクスライブラリー由来の２１００個を超える小分子化合物（「検査化合物」）を、幹細胞からＳｏｘ１７陽性胚体内胚葉細胞へのステージ１分化に対する効果について検査した。幹細胞を３８４ウェルプレートに、ウェル１つ当たり４５ｋ細胞の密度で播種し、実施例１のバージョンＡプロトコールと同じであるが、但し、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（１００％ＡＡ；「陽性対照」）、ＡＡを用いない修正ステージ１条件（「陰性条件」）、１０ｎｇ／ｍＬのＡＡを用いた修正ステージ１（１０％ＡＡ；「中間条件」）、または１０ｎｇ／ｍＬのＡＡおよび検査化合物の１つを用いた修正ステージ１条件（「検査条件」）で処置した。各検査化合物は、約８つの異なる濃度で検査した。次に、各ウェルにおける得られた細胞集団を、免疫染色および画像解析によって調べ、Ｓｏｘ１７および／またはＯｃｔ１４を発現する細胞のパーセンテージ（Ｓｏｘ１７およびＯｃｔ １４の免疫染色による）および総細胞数（ＤＡＰＩ染色による）を決定した。合計２１００個超の検査化合物のうち、５６個の検査化合物が以下の判断基準を満たし、活性化合物とみなされた：（ａ）得られた細胞集団は、１００％ＡＡ条件と比較した場合に、５０％を超えるＳｏｘ１７陽性細胞を有し、（ｂ）得られた細胞集団は、刺激剤制御（即ち、１００％ＡＡ）の３ユニット内のＤＡＰＩ染色のＺスコアを有する。最初の５６の活性化合物のうち、１５個（１５）の上位活性化合物：ＧＳＫ－６９０６９３、ＢＡＹ ４１－２２７２、ＳＣＨＥＭＢＬ１２１１４７０５、ＩＰＩ－３０６３、ＡＺＤ８０５５、オミパリシブ、ＧＮＥ－４７７、ＶＳ－５５８４、ＤＤＲ１－ＩＮ－１、ＩＷＲ－１－エンド、ＢＹＬ３１９、ＹＭ２０１６３６、ＰＩ４ＫＩＩＩベータ－ＩＮ－１０、およびネミラリシブ。これら１５個の上位活性化合物は、ともに用量応答性様式でＳｏｘ１７チャネルにおけるシグナルを増加させ、Ｏｃｔ ４チャネルシグナルを減少させることが分かり、また目視検査では、得られた細胞集団に核ブレビングを誘導しないことが分かった。定量閾値は、染色シグナルに相当し、低、正常、または高と定義した。低は、低閾値がＳｏｘ１７＋染色の検出に関して設定されたことを示し（即ち、Ｓｏｘ１７＋を検出しやすい）ことを示し、高は、最も高く発現するＳｏｘ１７＋細胞のみが検出されることを示す。表８は、これらの活性化合物のうち１０個を示し、Ｓｏｘ１７陽性細胞のパーセンテージは、１００ｎｇ／ｍＬ ＡＡを用いた場合のパーセンテージで正規化される。理論に縛られることは望まないが、表中の各活性化合物の「標的／経路」は、各々の化合物が標的とし得るシグナル（例えば、示されたシグナル伝達経路の活性を阻害する）。伝達経路の１つを示す。

【0584】

[00589]別の実験では、１５個の上位活性化合物のうち１１個を３Ｄ培養条件下で幹細胞の分化について検査した。３８４ウェルプレート実験と同様に、バージョンＡプロトコールを使用して、アクチビンＡの濃度を１００ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬに減少し、検査化合物の１つを２つの検査濃度で添加するという修正で細胞を処置した。１１個の化合物のうち３個の化合物が、ＤＥ集団についてＱＣ基準に合格し（ステージ１完了）、３個の化合物のうち３個の化合物が、ＰＰ１集団についてＱＣに合格し（ステージ３完了）、３個の化合物中のうち２個化合物が、ＳＣ－β細胞についてＱＣ基準に合格した（ステージ５完了）。ＱＣ合格基準は、バージョンＡプロトコールとの類似性に基づいて決定した。

【0585】

【表8】

【0586】

実施例５．幹由来膵細胞の組成物
[00590]本実施例は、本開示の一部の実施形態による種々の分化プロトコール後の幹細胞由来膵細胞の組成物を示す。

【0587】

[00591]幹細胞の、膵細胞への分化を誘導するのに２つの異なるプロトコールを利用した：バージョンＢ（ＶＢ）および修正バージョンＢ．１（ＶＢ．１）。プロトコールはともに、６ステージプロトコールである。バージョンＢプロトコールでは、以下の表９に従って、ステージ１（合計で３日間、ステージ１の１日目（「Ｓ１Ｄ１」）からステージ１の３日目（「Ｓ１Ｄ３」）まで）から、ステージ２（合計で３日間）、ステージ３（合計で２日間）、ステージ４（合計で４日間）、ステージ５（合計で７日間）まで、試薬を培地に添加する。ＶＢのステージ６条件は、上記の表６に記載したような「レジメン２」に従った。ＶＢ．１プロトコールは、ＶＢプロトコールと同一であるが、但し、ＶＢ．１プロトコールのステージ１では、０．１μＭのＧＳＫ－６９０６９３（「ＧＳＫ６９０６９３」とも称される）および１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが、ＶＢプロトコールのアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を置き換えるのに使用されている。

【0588】

【表9-1】

【0589】

【表9-2】

【0590】

【表9-3】

【0591】

[00592]両方の分化プロトコールを、異なるスケールの細胞培養で検査した：３つの異なるベッセル、Ｂｉｏｔｔ（登録商標）バイオリアクター（「Ｂｉｏｔｔ」、容積３０ｍＬ）、スピナー（「Ｓｐｉｎｎｅｒ」、容積３００ｍＬ）、および大規模バイオリアクター（「バイオリアクター」、容積３Ｌ）を使用した。

【0592】

[00593]図７Ａは、種々の培養条件下でのステージ５分化の完了（「Ｓ５Ｃ」）時の細胞組成物中のＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す。図に示したように、検査した培養ベッセル全てにおいて、ＳＣ膵島β細胞（ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞）のパーセンテージおよびＳＣ膵島非β細胞（ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞）のパーセンテージは、ＶＢプロトコールを使用して産生されたＳ５Ｃ組成物と、ＶＢ．１プロトコールを使用して産生されたＳ５Ｃ組成物との間で類似していた。Ｂｉｏｔｔでは、ＶＢプロトコール下で、平均してＳ５Ｃ細胞の約３０％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約３０％がＳＣ膵島非β細胞であり、ＶＢ．１プロトコール下では、平均してＳ５Ｃ細胞の約２５％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約３０％がＳＣ膵島非β細胞であった。Ｓｐｉｎｎｅｒでは、ＶＢプロトコール下で、平均してＳ５Ｃ細胞の約２７％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約２８％がＳＣ膵島非β細胞であり、ＶＢ．１プロトコール下では、平均してＳ５Ｃ細胞の約２６％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約３４％がＳＣ膵島非β細胞であった。バイオリアクターでは、ＶＢプロトコール下で、平均してＳ５Ｃ細胞の約２５％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約４２％が平均してＳＣ膵島非β細胞であり、ＶＢ．１プロトコールで、平均してＳ５Ｃ細胞の約２０％がＳＣ膵島β細胞であり、平均して約３８％がＳＣ膵島非β細胞であった。

【0593】

[00594]図７Ｂは、ステージ６の７日目（「Ｓ６ｄ７」）での細胞組成物におけるＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージをまとめたグラフを示す。この実験では、バイオリアクターを使用して産生されたＳ６ｄ７細胞のみを調べた。図に示したように、Ｓ６ｄ７組成物におけるＳＣ－膵島β細胞のパーセンテージおよびＳＣ－膵島非β細胞のパーセンテージは、ＶＢプロトコールを使用して産生されたＳ６ｄ７細胞組成物と、ＶＢ．１プロトコールを使用して産生されたＳ６ｄ７細胞組成物との間で類似していた。ＶＢプロトコール下で、平均してＳ５Ｃ細胞の約５０％がＳＣ－膵島β細胞であり、平均して約３７％がＳＣ－膵島非β細胞であり、ＶＢ．１プロトコール下では、平均してＳ５Ｃ細胞の約４４％がＳＣ－膵島β細胞であり、平均して約３８％が膵島－非β細胞であった。

【0594】

[00595]本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、そのような実施形態が単に一例として提供されることは当業者には明らかであろう。ここで、多数の変形、変更、および置換が、本開示から逸脱することなく当業者に浮かぶであろう。本開示の実施形態に対する各種代替案が、本開示の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。併記の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、特許請求の範囲によって網羅されていると意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

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【国際調査報告】