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特表2024-542192ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241106BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241106BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P43/00 121
A61P35/00
A61K51/10
A61K47/68
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529415
(86)(22)【出願日】2022-11-17
(85)【翻訳文提出日】2024-07-04
(86)【国際出願番号】 CN2022132422
(87)【国際公開番号】W WO2023088337
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】202111359665.8
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521530738
【氏名又は名称】普米斯生物技術（珠海）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＨＥＵＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｂ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ ４， ＮＯ １ ＫＥＪＩ ７ＴＨ ＲＯＡＤ， ＴＡＮＧＪＩＡＷＡＮ ＴＯＷＮ， ＸＩＡＮＧＺＨＯＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＺＨＵＨＡＩ， ＧＵＡＮＧＤＯＮＧ ５１９０８０， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】戴 爽
(72)【発明者】
【氏名】▲ジャイ▼ 天 航
(72)【発明者】
【氏名】黄 威 鋒
(72)【発明者】
【氏名】彭 紹 崗
(72)【発明者】
【氏名】孫 左 宇
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C084ZC752
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA19
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085KA04
4C085KA26
4C085KA27
4C085KA29
4C085KB82
4C085LL18
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、生物医薬の分野に属し、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物およびその使用に関する。本発明の二重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域およびＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含み、ここで、第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片であり、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む。本発明の二重特異性抗体は、二重の標的、すなわち、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－Ｌ１に対する高い親和性を有し、良好な応用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域、およびＴＩＧＩＴとは異なる標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む、二重特異性抗体であって、
前記第１のタンパク質機能性領域が、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの軽鎖可変領域が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記第１のタンパク質機能性領域および前記第２のタンパク質機能性領域が、直接的に結合するか、またはリンカーを介して結合し、好ましくは、前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、前記リンカーのアミノ酸配列は、配列番号２に示す、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１のタンパク質機能性領域および前記第２のタンパク質機能性領域の数が、独立的に１、２または２より大きい数である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記第１のタンパク質機能性領域が、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、前記第２のタンパク質機能性領域が、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする単一ドメイン抗体または一本鎖抗体であり、好ましくは、前記単一ドメイン抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、
好ましくは、前記一本鎖抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体である、請求項１から３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記第１のタンパク質機能性領域が、抗ＴＩＧＩＴ一本鎖抗体であり、前記第２のタンパク質機能性領域が、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、好ましくは、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする前記免疫グロブリンが、抗ＰＤ－Ｌ１免疫グロブリンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が、１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が、配列番号３に示される、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖可変領域が、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有し、前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの軽鎖可変領域が、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有し、好ましくは、
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖が、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの軽鎖が、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの定常領域、またはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする前記免疫グロブリンの定常領域が、ヒト抗体に由来し、好ましくは、前記定常領域が、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖定常領域、またはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする前記免疫グロブリンの重鎖定常領域が、ヒトＩｇガンマ１鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）またはヒトＩｇガンマ４鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）であり、軽鎖定常領域が、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）であり、好ましくは、前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖定常領域が、ＥＵ付番方式によるＬ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記単一ドメイン抗体または前記一本鎖抗体が、前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンのＣ末端またはＮ末端に結合し、例えば、前記単一ドメイン抗体または前記一本鎖抗体の数が、２であり、各単一ドメイン抗体または一本鎖抗体の一端が、前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの２つの重鎖のＣ末端またはＮ末端にそれぞれ結合する、請求項４および６から９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
前記単一ドメイン抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、前記単一ドメイン抗体を前記抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンに結合させることにより得られるペプチド鎖が、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項４および６から１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
２つの同一の第１のペプチド鎖および２つの同一の第２のペプチド鎖により形成される四量体であり、前記第１のペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列番号４に示され、前記第２のペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列番号５に示される、請求項４および６から１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の単離核酸分子を含む、ベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の単離核酸分子または請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項16】
請求項１５に記載の宿主細胞を適する条件下で培養するステップと、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収するステップとを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法。
【請求項17】
二重特異性抗体およびカップリング部分を含む、コンジュゲートであって、前記二重特異性抗体が、請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、前記カップリング部分が、検出可能な標識であり、好ましくは、前記カップリング部分が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、コンジュゲート。
【請求項18】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートを含む、キットであって、好ましくは、前記キットが、前記二重特異性抗体に特異的に結合可能な第２の抗体をさらに含み、任意選択で、前記第２の抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キット。
【請求項19】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物であって、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項20】
悪性腫瘍の治療または予防のための医薬の製造における、請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートの使用であって、好ましくは、前記悪性腫瘍が、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、使用。
【請求項21】
悪性腫瘍の治療または予防における使用のための、請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートであって、好ましくは、前記悪性腫瘍が、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、二重特異性抗体またはコンジュゲート。
【請求項22】
有効量の請求項１から１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のカップリング剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、悪性腫瘍を治療または予防するための方法であって、好ましくは、前記悪性腫瘍が、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、方法。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
技術分野
本発明は、医薬の分野に属し、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物、およびその使用に関する。
本発明は、医薬の分野に属し、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物、およびその使用に関する。
【0002】
背景技術
ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ；ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３、ＶＳＩＧ９としても公知）は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ならびに濾胞性ヘルパーＴ細胞により発現する新型の免疫抑制受容体である。
ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ；ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３、ＶＳＩＧ９としても公知）は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ならびに濾胞性ヘルパーＴ細胞により発現する新型の免疫抑制受容体である。
【0003】
ＴＩＧＩＴは、複数の免疫抑制受容体（例えば、ＣＤ９６／ＴＡＣＴＩＬＥ、ＣＤ１１２Ｒ／ＰＶＲＩＧ）、競合的同時刺激受容体（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）および複数のリガンド（例えば、ＣＤ１５５（ＰＶＲ／ＮＥＣＬ－５）、ＣＤ１１２（Ｎｅｃｔｉｎ－２／ＰＶＲＬ２））を含む、腫瘍免疫における複雑な制御ネットワークに関与する。ＤＮＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ９６は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に発現し、ＣＤ１５５をリガンドの形態で共有する。
【0004】
腫瘍免疫抑制におけるＴＩＧＩＴの役割は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の役割に類似している。現在の研究では、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞がＴＩＧＩＴを媒介して阻害されるいくつかの機構が提唱されている。（１）Ｔ／ＮＫ細胞表面上でＴＩＧＩＴがＣＤ１５５に結合することにより、ＴＩＧＩＴ細胞において免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）がリン酸化され、阻害シグナルが直接的に伝達される。（２）ＴＩＧＩＴがＤＣ上でＣＤ１５５に結合することにより、免疫寛容性ＤＣの産生が促進され、インターロイキン（ＩＬ）１２の産生が減少し、ＩＬ－１０が増加して、Ｔ細胞応答が間接的に阻害される。（３）阻害作用を有するＴＩＧＩＴが、同時刺激受容体ＣＤ２２６の親和性よりも高い親和性でＣＤ１５５に競合的に結合し、これによりＣＤ２２６を媒介する活性化が制限され、加えて、ＴＩＧＩＴがＣＤ２２６にも細胞上でシス様式で直接的に結合し、これによりＴＩＧＩＴがＣＤ１５５のホモ二量体に結合する能力が破壊される。（４）ＴＩＧＩＴを発現するＴｒｅｇが高度に阻害性であるため、ＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇが活性化されるとＩＬ－１０およびフィブリノゲン様タンパク質２（Ｆｇｌ２）を産生し、これによりＴ細胞の阻害が媒介される。（５）フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum、結腸直腸がんと関連づけられる嫌気性グラム共生細菌）由来のＦａｐ２タンパク質は、ＴＩＧＩＴに直接的に結合可能であるが、ＣＤ２２６には結合しないため、ＮＫ細胞およびＴ細胞によって媒介される腫瘍免疫が阻害され、自然免疫応答が調節される。
【0005】
ＣＤ２７４としても公知である、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、ＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、計２９０個のアミノ酸を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、１つのＩｇＶ様領域、１つのＩｇＣ様領域、１つの疎水性膜貫通領域、および３０個のアミノ酸からなる１つの細胞内領域を含む。他のＢ７ファミリー分子とは異なり、ＰＤ－Ｌ１は、免疫応答を負に調節する作用を有する。研究により、ＰＤ－Ｌ１が、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞において主に発現することが見出された。リンパ球に加えて、ＰＤ－Ｌ１は、他の種々の組織、例えば、胸腺、心臓、胎盤等の皮内細胞、および種々の型の非リンパ球系細胞、例えば、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、頭頸部がん等の細胞においても発現する（Akintunde Akinleye & Zoaib Rasool, Journal of Hematology & Oncology 12巻, Article number: 92 (2019)）。ＰＤ－Ｌ１は、自己反応性Ｔ細胞および自己反応性Ｂ細胞の調節ならびに免疫寛容において幅広い作用を有し、末梢組織のＴ細胞応答およびＢ細胞応答における役割を果たす。腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１の高発現は、がん患者における予後不良と関連している。
【0006】
二重特異性抗体は抗体医薬開発の方向性であるが、前臨床評価モデル、低い発現レベル、低い安定性、複雑なプロセス、および品質管理における大きな差など、多くの課題に直面している。したがって、二重特異性抗体の研究開発は、常に困難を伴っている。
【0007】
したがって、良好な特異性、良好な有効性を有し、調製が容易な、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性抗体を開発する必要性が存在する。
【0008】
本発明の内容
徹底的な研究および創造的作業の後、発明者らは抗ＴＩＧＩＴ抗体を得、この抗体に基づいて抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した。発明者らは、驚くべきことに、ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＧＩＴに対する高い結合親和性を有する（二重特異性抗体は、１つまたは複数の態様の陽性対照抗体よりもさらに良好である）、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗体または本発明の抗体とも呼ぶ）および本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（二重特異性抗体または本発明の二重特異性抗体とも呼ぶ）が、そのリガンドＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合およびそのリガンドＣＤ１５５／ＣＤ１１２に対するＴＩＧＩＴの結合をそれぞれ遮断し、これにより阻害性シグナルの細胞への伝達を減少または除去することが可能であるとともに、本発明の抗体の投与により、動物モデルにおいて腫瘍の増殖を著しく阻害することが可能であることを見出した。これによって、以下の発明を提供する。
徹底的な研究および創造的作業の後、発明者らは抗ＴＩＧＩＴ抗体を得、この抗体に基づいて抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した。発明者らは、驚くべきことに、ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＧＩＴに対する高い結合親和性を有する（二重特異性抗体は、１つまたは複数の態様の陽性対照抗体よりもさらに良好である）、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗体または本発明の抗体とも呼ぶ）および本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（二重特異性抗体または本発明の二重特異性抗体とも呼ぶ）が、そのリガンドＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合およびそのリガンドＣＤ１５５／ＣＤ１１２に対するＴＩＧＩＴの結合をそれぞれ遮断し、これにより阻害性シグナルの細胞への伝達を減少または除去することが可能であるとともに、本発明の抗体の投与により、動物モデルにおいて腫瘍の増殖を著しく阻害することが可能であることを見出した。これによって、以下の発明を提供する。
【0009】
本発明の一態様では、
ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＴＩＧＩＴとは異なる標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む、二重特異性抗体であって、
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの軽鎖可変領域が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体を設計する。
ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＴＩＧＩＴとは異なる標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む、二重特異性抗体であって、
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの軽鎖可変領域が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体を設計する。
【0010】
軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原に対する結合を決定し、各鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含み、このうち重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、当技術分野において公知の種々の付番方式に従って決定することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、好ましくは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ ＨＶＲまたはＩＭＧＴ付番方式により決定する。他に述べない限り、本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、好ましくは、Ｋａｂａｔ付番方式により決定する（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)）。
【0011】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、第１のタンパク質機能性領域および第２のタンパク質機能性領域は、直接的に結合するか、またはリンカー（リンカーペプチドとも呼ぶ）を介して結合し、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーのアミノ酸配列は、配列番号２に示し、
ここで、括弧内のＧＧＧＧＳは、配列番号２２により表す。
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーのアミノ酸配列は、配列番号２に示し、
ここで、括弧内のＧＧＧＧＳは、配列番号２２により表す。
【0012】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、第１のタンパク質機能性領域および第２のタンパク質機能性領域の数は、独立的に１、２または２より大きい数である。
【0013】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、第１のタンパク質機能性領域の数は、１であり、第２のタンパク質機能性領域の数は、２である。
【0014】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、第１のタンパク質機能性領域の数は、２であり、第２のタンパク質機能性領域の数は、１である。
【0015】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、第２のタンパク質機能性領域は、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする単一ドメイン抗体または一本鎖抗体であり、
好ましくは、単一ドメイン抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、
好ましくは、一本鎖抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体である。
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、第２のタンパク質機能性領域は、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする単一ドメイン抗体または一本鎖抗体であり、
好ましくは、単一ドメイン抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、
好ましくは、一本鎖抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体である。
【0016】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体である。
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体である。
【0017】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能性領域は、標的がＴＩＧＩＴとは異なる、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、
好ましくは、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンは、抗ＰＤ－Ｌ１免疫グロブリンである。
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能性領域は、標的がＴＩＧＩＴとは異なる、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片であり、
好ましくは、ＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンは、抗ＰＤ－Ｌ１免疫グロブリンである。
【0018】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１免疫グロブリンまたはその抗原結合断片である。
第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ一本鎖抗体であり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１免疫グロブリンまたはその抗原結合断片である。
【0019】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、１つの重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号３に示す。
抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、１つの重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号３に示す。
【0020】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１９に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２０に示し、
好ましくは、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示し、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示す。
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１９に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２０に示し、
好ましくは、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示し、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示す。
【0021】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域断片からなる群から選択される。
【0022】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの、またはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンの定常領域は、ヒト抗体に由来し、
好ましくは、定常領域は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域から選択される。
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの、またはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンの定常領域は、ヒト抗体に由来し、
好ましくは、定常領域は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域から選択される。
【0023】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンでは、重鎖定常領域は、ヒトＩｇガンマ１鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）またはヒトＩｇガンマ４鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）であり、好ましくは、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ＥＵ付番方式によるＬ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異も含む。
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンまたはＴＩＧＩＴとは異なる標的を標的とする免疫グロブリンでは、重鎖定常領域は、ヒトＩｇガンマ１鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）またはヒトＩｇガンマ４鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１．１）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）であり、好ましくは、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ＥＵ付番方式によるＬ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異も含む。
【0024】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一ドメイン抗体または一本鎖抗体は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンのＣ末端またはＮ末端に結合し、例えば、単一ドメイン抗体または一本鎖抗体の数は、２であり、各単一ドメイン抗体または一本鎖抗体の一端は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの２つの重鎖のＣ末端またはＮ末端にそれぞれ結合する。
【0025】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンのＣ末端またはＮ末端に結合し、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体の数は、２であり、各抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体の一端は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの２つの重鎖のＣ末端またはＮ末端にそれぞれ結合する。
【0026】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一ドメイン抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、単一ドメイン抗体を抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンに結合させることにより得られるペプチド鎖は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
【0027】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの同一の第１のペプチド鎖および２つの同一の第２のペプチド鎖により形成される四量体であり、ここで、
第１のペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号４に示し、第２のペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示す。
第１のペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号４に示し、第２のペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示す。
【0028】
本発明の一部の実施形態では、二重特異性抗体は、
ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含み、
第１のタンパク質機能性領域の数は、１であり、第２のタンパク質機能性領域の数は、２であり、
ここで、第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示し、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示し、
抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号３に示し、
２つの抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの各重鎖のＣ末端に同一または異なるリンカーによりそれぞれ結合し、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーのアミノ酸配列は、配列番号２に示し、
ここで、括弧内のＧＧＧＧＳは、配列番号２２により表す。
ＴＩＧＩＴを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含み、
第１のタンパク質機能性領域の数は、１であり、第２のタンパク質機能性領域の数は、２であり、
ここで、第１のタンパク質機能性領域は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンであり、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体であり、
抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンでは、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示し、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示し、
抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号３に示し、
２つの抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの各重鎖のＣ末端に同一または異なるリンカーによりそれぞれ結合し、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５または６であり、
好ましくは、リンカーのアミノ酸配列は、配列番号２に示し、
ここで、括弧内のＧＧＧＧＳは、配列番号２２により表す。
【0029】
本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ＶＨＨ型である。
【0030】
本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ型、すなわち、モリソンパターンである。
【0031】
本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体では、単一ドメイン抗体または一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に結合する。免疫グロブリンは２つの重鎖からなるため、１つの免疫グロブリン分子は、２つの単一ドメイン抗体分子または２つの一本鎖抗体分子に結合する。好ましくは、２つの単一ドメイン抗体分子は、同一である。好ましくは、２つの一本鎖抗体分子は、同一である。好ましくは、単一ドメイン抗体または一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に、前述のリンカーにより形成されるアミド結合を介して結合する。
【0032】
本発明の１つまたは複数の実施形態では、二重特異性抗体について、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原、カニクイザルＰＤ－Ｌ１抗原、ヒトＴＩＧＩＴ抗原、および／またはカニクイザルＴＩＧＩＴ抗原への結合に対するその一価性親和性は、それぞれこの単一末端抗体分子の、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗原、抗カニクイザルＰＤ－Ｌ１抗原、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗原、および／または抗カニクイザルＴＩＧＩＴ抗原への結合に対する一価性親和性と等価かこれよりも良好である。
【0033】
本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離核酸分子に関する。
【0034】
本発明のさらなる態様は、本発明の単離核酸分子を含む、ベクターに関する。
【0035】
本発明のさらなる態様は、本発明の単離核酸分子または本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【0036】
本発明のさらなる態様は、本発明の宿主細胞を適する条件下で培養するステップと、細胞培養物から二重特異性抗体を回収するステップとを含む、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製するための方法に関する。
【0037】
本発明の別の態様は、二重特異性抗体およびコンジュゲーション部分を含む、コンジュゲートであって、二重特異性抗体が、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、コンジュゲーション部分が、検出可能な標識であり、好ましくは、コンジュゲーション部分が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、コンジュゲートに関する。
【0038】
本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートを含む、キットであって、
好ましくは、キットが、二重特異性抗体に特異的に結合可能な第２の抗体をさらに含み、任意選択で、第２の抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キットに関する。
好ましくは、キットが、二重特異性抗体に特異的に結合可能な第２の抗体をさらに含み、任意選択で、第２の抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キットに関する。
【0039】
本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートを含む、医薬組成物であって、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【0040】
本発明の別の態様は、悪性腫瘍を予防および／または治療するための医薬の製造における、本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートの使用であって、好ましくは、悪性腫瘍が、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、使用に関する。
【0041】
本発明のまた別の態様は、有効量の本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、悪性腫瘍を治療および／または予防するための方法であって、好ましくは、悪性腫瘍が、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、方法に関する。
【0042】
本発明の一部の実施形態では、悪性腫瘍を治療および／または予防するための方法において、有効量の本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与するステップは、外科的治療前後および／または放射線療法前後に実施する。
【0043】
本発明の一部の実施形態では、悪性腫瘍を治療および／または予防する方法において、
本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１キログラム当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは、４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇであり、あるいは、本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１キログラム当たり１０～１０００ｍｇ、好ましくは、５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇであり、
好ましくは、投与は、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１０日毎、１週間毎、２週間毎または３週間毎に実施し、
好ましくは、投与は、点滴静注または静脈内注射の方法により実施する。
本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１キログラム当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは、４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇであり、あるいは、本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１キログラム当たり１０～１０００ｍｇ、好ましくは、５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇであり、
好ましくは、投与は、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１０日毎、１週間毎、２週間毎または３週間毎に実施し、
好ましくは、投与は、点滴静注または静脈内注射の方法により実施する。
【0044】
本発明の項目のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートは、悪性腫瘍の治療および／または予防に使用し、好ましくは、悪性腫瘍は、メラノーマ、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される。
【0045】
本発明では、他に述べない限り、本明細書において使用する科学的および技術的用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。その上、本明細書において使用する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫実験の手順は、対応する分野において広く使用される常用手順である。一方、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義および説明を下記に提供する。
【0046】
「ＥＣ５０」という用語は、最大作用の５０％の濃度を指し、最大作用の５０％をもたらす濃度を指す。
【0047】
「抗体」という用語は、通常、２対のポリペプチド鎖で構成され、各対が、「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する、免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類し、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとしてそれぞれ定義することができる。軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は、およそ１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域が結合し、重鎖は、およそ３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む、宿主の組織または因子および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。ＶＨ領域およびＶＬ領域はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度に可変の領域と、それとともに散在性の、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的な領域とに細分することができる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれアミノ末端からカルボキシル末端に次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、抗体結合部位をそれぞれ形成する。領域またはドメインに対するアミノ酸の割当ては、Bethesda M.d., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, (1987および1991))、もしくはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917；Chothiaら、Nature, 1989; 342: 878-883の定義；またはＩＭＧＴ付番方式に従い、Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF [J]. Nucleic acids research, 2009; 38(suppl_1): of D301-D307の定義を参照されたい。
【0048】
「抗体」という用語は、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を含む、抗体を生成する特定のいかなる方法にも制限されない。抗体は、種々のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４亜型）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭの抗体であり得る。
【0049】
「ｍｃＡｂ」および「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同な抗体分子の群、すなわち、自然発生的に生じ得る天然変異を除いて同一の抗体分子の群由来の抗体または抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と相対的であり、通常、少なくとも２つ以上の異なる抗体を含み、このような異なる抗体は、通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、通常、Ｋｏｈｌｅｒらにより最初に報告されたハイブリドーマ技術を使用して得ることができるが（Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. nature, 1975; 256巻(5517号): 495）、組換えＤＮＡ技術を使用して得ることもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【0050】
「一本鎖抗体（一本鎖可変断片、ＳｃＦｖ）」という用語は、リンカーにより結合する抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む分子を指し、ここで、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、対形成し、リンカーを介して一価の分子を形成し、これにより単一ポリペプチド鎖が生成可能となる（例えば、Birdら、Science 1988; 242: 423 426およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 5879 5883を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を有し得る。適する従来のリンカーは、反復するＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなり得る。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２３）を有するリンカーを使用することができるが、そのバリアントも使用することができる（Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 6444-6448）。本発明に有用な他のリンカーは、Alfthanら、Protein Eng. 1995; 8: 725-731、Choiら、Eur. J. Immunol. 2001; 31: 94-106、Huら、Cancer Res. 1996; 56: 3055-3061、Kipriyanovら、J. Mol. Biol. 1999; 293: 41-56、およびRooversら、Cancer Immunology, Immunotherapy, 2001, 50(1): 51-59により記載されている。説明。
【0051】
本明細書において使用する場合、「単離した」または「単離する」という用語は、天然状態から人工的手段により得ることを指す。「単離した」物質または成分が天然に存在するものである場合、この天然環境の変化によるものであり得るか、またはこの物質がこの天然環境から分離されたものであるか、またはこの両方である。例えば、特定の非単離のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、生きている動物に天然に存在し、この天然状態から単離した高純度の同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離した」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ぶ。「単離した」または「単離する」という用語は、人工の混合物も合成物質の混合物も除外せず、物質の活性に影響しない他の不純物質の存在も除外しない。
【0052】
本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入可能な核酸送達媒体を指す。挿入したポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、ベクターが発現可能であるとき、ベクターは、発現ベクターと呼ぶ。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより宿主細胞に導入することができ、それによって保有する遺伝子材料エレメントを宿主細胞において発現させることができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルス等が挙げられるが、これらに制限されない。ベクターとして使用可能な動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに制限されない。ベクターは、制限されないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含む、多様な発現制御エレメントを含み得る。加えて、ベクターは、複製開始部位も含み得る。
【0053】
本明細書において使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入に使用可能な細胞を指し、原核細胞、例えば、大腸菌（Escherichia coli）もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）、真菌細胞、例えば、酵母細胞もしくはアスペルギルス（Aspergillus）等、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ（Drosophila）細胞もしくはＳｆ９、または動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞を含むが、これらに制限されない。
【0054】
本明細書において使用する場合、「特異的結合」という用語は、２分子間の非ランダム結合反応、例えば、抗体と標的とする抗原との間の反応を指す。特定の実施形態では、抗原に対して特異的に結合する抗体（または抗原に対して特異的な抗体）は、約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ以下未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。
【0055】
本明細書において使用する場合、「ＫＤ」という用語は、特異的な抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、抗体と抗原との間の結合親和性を記載するために使用する。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合がより堅固であり、抗体と抗原との間の親和性がより高い。典型的には、抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ以下未満の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（例えば、ＴＩＧＩＴタンパク質またはＰＤ－Ｌ１タンパク質）に結合する。ＫＤは、当業者に公知の方法を使用して、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用解析装置を使用して決定することができる。
【0056】
本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」および「ＭｃＡｂ」という用語は、同一の意味を有し、互換的に使用する。「ポリクローナル抗体」および「ＰｃＡｂ」も、同一の意味を有し、互換的に使用する。また、本発明では、アミノ酸は一般に、当技術分野において周知の１文字および３文字の略称により表す。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａにより表すことができる。
【0057】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合する、担体および／または賦形剤を指す。これは、当技術分野において周知であり（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、ｐＨ調整物質、界面活性物質、アジュバント、イオン強度増強物質を含むが、これらに制限されない。例えば、ｐＨ調整物質としては、リン酸緩衝液が挙げられるが、これに制限されない。界面活性物質としては、カチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性物質、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０が挙げられるが、これに制限されない。イオン強度増強物質としては、塩化ナトリウムが挙げられるが、これに制限されない。
【0058】
本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、所望の作用を少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、予防的に有効な量は、疾患（例えば、腫瘍）の発症を予防、抑止または遅延させるのに十分な量であり、治療的に有効な量は、既に疾患を有する患者において疾患およびこの合併症を治癒または少なくとも部分的に予防するのに十分な量である。このような有効量の決定は、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用に有効な量は、治療する疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的状態、患者の全身状態、例えば、年齢、体重、および性、薬物を投与する方法、ならびに併用する他の治療等に依存する。
【0059】
本明細書において使用する場合、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（プログラム細胞死リガンド１、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）のアミノ酸配列に言及するとき、完全長のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質、またはヒトＰＤ－Ｌ１細胞外断片ＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤ（例えば、配列番号６に示すアミノ酸配列）もしくはＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤを含む断片を含み、ＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスまたはヒトＩｇＧ Ｆｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合した断片も含む。しかし、当業者は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列では、変異または変化（置換、欠失、および／または付加を含むが、これらに制限されない）が、生物学的機能に影響せずに、天然に生じるか、または人工的に導入可能であることを理解している。したがって、本発明では、「ＰＤ－Ｌ１タンパク質」という用語は、示す配列およびその天然または人工バリアントを含む、あらゆるそのような配列を含むものとする。その上、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の配列断片を記載するとき、配列断片だけでなく、この天然または人工バリアントに対応する配列断片も含む。
【0060】
本明細書において使用する場合、ＴＩＧＩＴタンパク質（ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２）のアミノ酸配列に言及するとき、完全長のヒトＴＩＧＩＴタンパク質、またはヒトＴＩＧＩＴの細胞外断片ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ（例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列）もしくはＴＩＧＩＴ ＥＣＤを含む断片を含み、ＴＩＧＩＴタンパク質の完全長融合タンパク質またはＴＩＧＩＴ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合した断片も含む。しかし、当業者は、ＴＩＧＩＴタンパク質のアミノ酸配列では、変異または変化（置換、欠失、および／または付加を含むが、これらに制限されない）が、この生物学的機能に影響せずに、天然に生じるか、または人工的に導入可能であることを理解している。したがって、本発明では、「ＴＩＧＩＴタンパク質」という用語は、その天然または人工バリアントを含む、あらゆるそのような配列を含むものとする。その上、ＴＩＧＩＴタンパク質の配列断片を記載するとき、この天然または人工バリアントに対応する配列断片も含む。
【0061】
本明細書において使用する場合、ＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００５００９．２）のアミノ酸配列に言及するとき、完全長のヒトＰＤ－１タンパク質、またはヒトＰＤ－１の細胞外断片ＰＤ－１ ＥＣＤもしくはＰＤ－１ ＥＣＤを含む断片を含み、ＰＤ－１タンパク質の完全長の融合タンパク質またはＰＤ－１ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合した断片も含む。しかし、当業者は、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列では、変異または変化（置換、欠失、および／または付加を含むが、これらに制限されない）が、この生物学的機能に影響せずに、天然に生じるか、または人工的に導入可能であることを理解している。したがって、本発明では、「ＰＤ－１タンパク質」という用語は、その天然または人工バリアントを含む、あらゆるそのような配列を含むものとする。また、ＰＤ－１タンパク質の配列断片を記載するとき、この天然または人工バリアントに対応する配列断片も含む。
【0062】
本発明では、「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、および「ナノボディ」という用語は、同一の意味を有しており、抗体の重鎖の可変領域をクローニングして、最小の完全機能性抗原結合断片である、唯一の重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築することを指す。通常、軽鎖および重鎖定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠く抗体の入手後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、唯一の重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
【0063】
本発明では、他に述べない限り、「第１」（例えば、第１のタンパク質機能性領域、第１のペプチド鎖）および「第２」（例えば、第２のタンパク質機能性領域、第２のペプチド鎖）という用語は、参照物を区別するかまたは明確とするために使用し、典型的な連続的意味を有しない。
【0064】
本発明では、単一末端抗体分子は、他に特定しない限り、二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域分子もしくは第２のタンパク質機能性領域分子と同一であるかもしくは類似している抗体分子、例えば、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、または二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域分子もしくは第２のタンパク質機能性領域分子と同一であるかもしくは類似している抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を指す。
【0065】
本発明の有利な作用
本発明では、以下の作用の１つまたは複数を達成する。
（１）本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、優れた親和性および特異性を有する。
（２）本発明の二重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴに非常に良好に特異的に結合することができる。
（３）本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に非常に良好に特異的に結合することができる。
（４）本発明の二重特異性抗体は、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に同時に結合することができる。
（５）本発明の二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域との間に相乗作用が存在する。例えば、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ１５５／ＣＤ１１２媒介ＴＩＧＩＴ下流阻害性シグナル伝達経路およびＰＤ－Ｌ１媒介ＰＤ－１下流阻害性シグナル伝達経路をそれぞれ軽減することができ、この活性は、２つの単一末端抗体分子の併用による活性よりも良好であり、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでのこの抗腫瘍活性は、２つの単一末端抗体分子の併用による抗腫瘍活性よりも良好である。
（６）本発明の二重特異性抗体は、生成が容易である。
（７）本発明の二重特異性抗体は、安定性が良好であり、半減期が長い。
本発明では、以下の作用の１つまたは複数を達成する。
（１）本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、優れた親和性および特異性を有する。
（２）本発明の二重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴに非常に良好に特異的に結合することができる。
（３）本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に非常に良好に特異的に結合することができる。
（４）本発明の二重特異性抗体は、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に同時に結合することができる。
（５）本発明の二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域との間に相乗作用が存在する。例えば、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ１５５／ＣＤ１１２媒介ＴＩＧＩＴ下流阻害性シグナル伝達経路およびＰＤ－Ｌ１媒介ＰＤ－１下流阻害性シグナル伝達経路をそれぞれ軽減することができ、この活性は、２つの単一末端抗体分子の併用による活性よりも良好であり、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでのこの抗腫瘍活性は、２つの単一末端抗体分子の併用による抗腫瘍活性よりも良好である。
（６）本発明の二重特異性抗体は、生成が容易である。
（７）本発明の二重特異性抗体は、安定性が良好であり、半減期が長い。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】本発明の二重特異性抗体の模式的構造図を示す。
【図2A】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＰＤ－Ｌ１に対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【図2B】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したカニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【図2C】本発明の二重特異性抗体がＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合を遮断する曲線を示す。
【図3A】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【図3B】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したカニクイザルＴＩＧＩＴに対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【図3C】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対する本発明の二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【図3D】本発明の二重特異性抗体がＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対するヒトＣＤ１５５の結合を遮断する曲線を示す。
【図3E】本発明の二重特異性抗体がＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対するマウスＣＤ１５５の結合を遮断する曲線を示す。
【図4】本発明の二重特異性抗体がヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質およびヒトＴＩＧＩＴタンパク質に同時に結合する曲線を示す。
【図5】本発明の二重特異性抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路およびＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５／ＣＤ１１２シグナル伝達経路を遮断する曲線を示す。
【図7】Ａ３７５およびヒトＰＢＭＣを同時接種したＢ－ＮＤＧマウスモデルにおける本発明の二重特異性抗体の薬力学曲線を示す。
【図8】Ａ３７５およびヒトＰＢＭＣを同時接種したＢ－ＮＤＧマウスモデルにおける本発明の二重特異性抗体の用量依存性薬力学曲線を示す。
【図9】ヒトＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ遺伝子導入マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける本発明の二重特異性抗体の薬力学曲線を示す。
【図10】マウスにおける本発明の二重特異性抗体の半減期曲線を示す。
【図11】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合曲線を示す。
【図12】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したカニクイザルＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合曲線を示す。
【図13】ＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合曲線を示す。
【図14】本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体がＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対するヒトＣＤ１５５の結合を遮断する曲線を示す。
【図15】本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体がＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対するマウスＣＤ１５５の結合を遮断する曲線を示す。
【図16】活性化ヒト初代Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合曲線を示す。
【0067】
本発明に含まれる配列を下記の表Ａに示し、このＣＤＲは、それぞれＫａｂａｔの付番方式に従って決定する。
【表A-1】
【表A-2】
【表A-3】
【実施例】
【0068】
本発明を実行するための特定のモデル
本発明は、特定の実施例と組み合わせて下記にさらに記載する。このような実施例は、単に本発明を例示するために使用し、本発明の範囲を制限することは意図しないことが理解されるべきである。次の実施例において特定の条件を明示しない実験方法は、通常、従来の条件、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件、または製造者により推奨される条件に従う。他に述べない限り、パーセンテージおよび分率は、重量による。
本発明は、特定の実施例と組み合わせて下記にさらに記載する。このような実施例は、単に本発明を例示するために使用し、本発明の範囲を制限することは意図しないことが理解されるべきである。次の実施例において特定の条件を明示しない実験方法は、通常、従来の条件、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件、または製造者により推奨される条件に従う。他に述べない限り、パーセンテージおよび分率は、重量による。
【0069】
対照抗体アテゾリズマブ：抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、商標：テセントリク（Tecentriq）、Ｒｏｃｈｅ。
【0070】
対照抗体チラゴルマブ（Tiragolumab）：抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体、Ｒｏｃｈｅ。
【0071】
実施例１：抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現および精製
この実施例では、抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号１９）を、完全遺伝子合成を使用して合成し、野生型ｈＩｇＧ１抗体重鎖に組み換えて完全な「ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３」抗体重鎖（配列番号１）を形成し、抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ（配列番号３）を重鎖Ｃ末端において２つのリンカーＧ４Ｓ（配列番号２）により結合させて配列番号４に示すペプチド鎖＃１の完全長アミノ酸配列を得た。加えて、抗ＴＩＧＩＴ軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号２０）を、完全遺伝子合成を使用して合成し、カッパ軽鎖に組み換えて完全「ＶＬ－ＣＬ」抗体軽鎖構造を形成した。得られたペプチド鎖＃２の完全長アミノ酸配列は、配列番号５に示した。
この実施例では、抗ＴＩＧＩＴ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号１９）を、完全遺伝子合成を使用して合成し、野生型ｈＩｇＧ１抗体重鎖に組み換えて完全な「ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３」抗体重鎖（配列番号１）を形成し、抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ（配列番号３）を重鎖Ｃ末端において２つのリンカーＧ４Ｓ（配列番号２）により結合させて配列番号４に示すペプチド鎖＃１の完全長アミノ酸配列を得た。加えて、抗ＴＩＧＩＴ軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号２０）を、完全遺伝子合成を使用して合成し、カッパ軽鎖に組み換えて完全「ＶＬ－ＣＬ」抗体軽鎖構造を形成した。得られたペプチド鎖＃２の完全長アミノ酸配列は、配列番号５に示した。
【0072】
分子クローニング技術を使用してｐｃＤＮＡ３．１発現フレームに重鎖配列および軽鎖配列をそれぞれ構築し、従来の発現をＥｘｐｉ－２９３発現系により行った。トランスフェクション方法は、製品指示書に従って実施し、ここでは、細胞培養から５日後に上清を採取し、標的タンパク質を、プロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入）を使用して精製した。磁気ビーズは、適切な容量の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）（磁気ビーズの１～４倍量）に再懸濁し、次いで、精製する試料に加え、その期間中穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。試料を磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒから購入）上に静置し、上清を廃棄し、磁気ビーズを結合緩衝液で３回洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を磁気ビーズの３～５倍量で加え、室温で５～１０分間振盪し、磁気スタンド上に戻し、溶出緩衝液を採取し、中和緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ８．５４）を加えた採取チューブに移し、十分に混合した。
【0073】
抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（本発明では、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体とも呼ぶ）を得、この模式的構造を図１に示した。
【0074】
実施例２：抗体親和性の検出
バイオフィルム層光干渉技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、実施例１で得た二重特異性抗体およびそれに対応する単一末端抗体分子がヒトおよびカニクイザルのＰＤ－Ｌ１およびＴＩＧＩＴに結合する結合解離定数（ＫＤ）を決定した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定は、既存の方法に従って実行し（Este, Pら、High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs, 2013.5巻(2号): p.270-8）、ここで、このヒトＰＤ－Ｌ１細胞外断片アミノ酸配列、カニクイザルＰＤ－Ｌ１細胞外断片アミノ酸配列、ヒトＴＩＧＩＴ細胞外断片アミノ酸配列、およびカニクイザルＴＩＧＩＴ細胞外断片アミノ酸配列を、配列番号６～９にそれぞれ示した。
バイオフィルム層光干渉技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、実施例１で得た二重特異性抗体およびそれに対応する単一末端抗体分子がヒトおよびカニクイザルのＰＤ－Ｌ１およびＴＩＧＩＴに結合する結合解離定数（ＫＤ）を決定した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定は、既存の方法に従って実行し（Este, Pら、High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs, 2013.5巻(2号): p.270-8）、ここで、このヒトＰＤ－Ｌ１細胞外断片アミノ酸配列、カニクイザルＰＤ－Ｌ１細胞外断片アミノ酸配列、ヒトＴＩＧＩＴ細胞外断片アミノ酸配列、およびカニクイザルＴＩＧＩＴ細胞外断片アミノ酸配列を、配列番号６～９にそれぞれ示した。
【0075】
詳細な手順は、次のとおりであった。センサーをオフラインで解析緩衝液により３０分間平衡し、次いで、オンラインで６０秒間検出してベースラインを確立し、精製したインタクトな抗体をＡＨＱセンサー上に１ｎｍの厚さに添加して親和性検出を行った。抗体を添加したセンサーを１００ｎＭのヒトまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ－ｈｉｓ抗原にプラトー相まで曝露し、次いで、センサーを少なくとも２分間解析緩衝液に移して解離速度を測定した。動態解析を１：１の結合モデルを使用して実施した。
【0076】
ヒト、カニクイザルのＰＤ－Ｌ１およびＴＩＧＩＴに対する結合における二重特異性抗体およびそれに対応する単一末端抗体分子のＫＤ値は、下記の表１に示した。
【表1】
【0077】
結果は、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原、カニクイザルＰＤ－Ｌ１抗原、ヒトＴＩＧＩＴ抗原、およびカニクイザルＴＩＧＩＴ抗原に対する抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の一価性親和性値が、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原、カニクイザルＰＤ－Ｌ１抗原、ヒトＴＩＧＩＴ抗原、およびカニクイザルＴＩＧＩＴ抗原に対する単一末端抗体分子の一価性親和性値にそれぞれ匹敵するか、またはさらに良好であったことを示した。
【0078】
実施例３：ヒト／カニクイザルＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性および遮断活性
３．１ フローサイトメトリー検出方法に基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＰＤ－Ｌ１およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１をＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後の過剰発現した細胞を適切な細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、次いで、遠心分離し、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。
３．１ フローサイトメトリー検出方法に基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＰＤ－Ｌ１およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１をＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後の過剰発現した細胞を適切な細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、次いで、遠心分離し、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。
【0079】
【0080】
結果は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を有し、この結合活性が、ＰＤ－Ｌ１末端モノクローナル抗体分子（抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ）の結合活性に匹敵することを示した。
【0081】
３．２ フローサイトメトリー検出に基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合についての抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の遮断活性の検出
詳細には、ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＰＤ－１細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＰＤ－１をＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。精製した検査抗体をＰＢＳで希釈し、希釈した試料を６０μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えた。次いで、ビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度０．５μｇ／ｍＬに達するまで加え、混合し、４℃で３０分間インキュベートした。増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＰＤ－１細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに達するように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えて遠心分離し、上清を廃棄した。上記の同時インキュベートした抗体－抗原混合物を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳで１００倍希釈したストレプトマイシン アビジン－Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡＰＥ）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＩＣ５０値を得た。
詳細には、ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＰＤ－１細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＰＤ－１をＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。精製した検査抗体をＰＢＳで希釈し、希釈した試料を６０μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えた。次いで、ビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度０．５μｇ／ｍＬに達するまで加え、混合し、４℃で３０分間インキュベートした。増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＰＤ－１細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに達するように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えて遠心分離し、上清を廃棄した。上記の同時インキュベートした抗体－抗原混合物を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳで１００倍希釈したストレプトマイシン アビジン－Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡＰＥ）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＩＣ５０値を得た。
【0082】
結果を表２および図２Ｃに示した。結果は、ＣＨＯ細胞上に過剰発現したヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合についての本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の遮断活性が、このＰＤ－Ｌ１末端モノクローナル抗体分子（抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ）の遮断活性に匹敵するか、またはさらに良好であったことを示した。
【0083】
実施例４：ヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性および遮断活性
４．１ フローサイトメトリー検出方法に基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞）、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＴＩＧＩＴ細胞）、およびマウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、カニクイザルＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、およびマウスＴＩＧＩＴｃＤＮＡをＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後の過剰発現細胞を適する細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、遠心分離し、次いで、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。
４．１ フローサイトメトリー検出方法に基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞）、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＴＩＧＩＴ細胞）、およびマウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、カニクイザルＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、およびマウスＴＩＧＩＴｃＤＮＡをＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後の過剰発現細胞を適する細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、遠心分離し、次いで、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。
【0084】
【0085】
結果は、ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性は、このＴＩＧＩＴ末端モノクローナル抗体分子（抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ）の結合活性に匹敵するか、またはさらに良好であることを示した。
【0086】
４．２ ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対するヒトＣＤ１５５の結合およびＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対するマウスＣＤ１５５の結合についてのフローサイトメトリーに基づく抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の遮断活性の検出
詳細には、増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するヒトＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
詳細には、増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するヒトＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0087】
増殖培養後のＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに達するように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するマウスＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＩＣ５０値を得た。
【0088】
結果を表３、および図３Ｄ～図３Ｅに示した。結果は、ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対するヒトＣＤ１５５の結合およびＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対するマウスＣＤ１５５の結合についての本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の遮断活性が、このＴＩＧＩＴ末端モノクローナル抗体分子（抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ）の遮断活性に匹敵することを示した。
【0089】
実施例５：ヒトＴＩＧＩＴおよびヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の同時結合活性
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の同時結合活性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいて検出した。
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の同時結合活性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいて検出した。
【0090】
詳細には、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質を指示書に従って溶解し、１×ＥＬＩＳＡコーティング溶液で１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、フィルムで覆い、４℃で一晩静置した。コーティング溶液を廃棄し、１×ＰＢＳＴによる洗浄を３回実施し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェルで加えて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより段階希釈した検査抗体を１００μＬ／ウェルで加え、室温で２時間インキュベートした。抗体希釈液を廃棄し、１×ＰＢＳＴによる洗浄を３回実施し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したビオチン標識ＰＤ－Ｌ１タンパク質を１００μＬ／ウェルで最終濃度１μｇ／ｍＬに達するまで加え、室温で１時間インキュベートした。抗原希釈液を廃棄し、１×ＰＢＳＴによる洗浄を３回実施し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＳＡ－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。ＳＡ－ＨＲＰ希釈液を廃棄し、１×ＰＢＳＴによる洗浄を３回実施し、ＥＬＩＳＡ発色溶液を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１～３分間反応させ、次いで、ＥＬＩＳＡ停止溶液を５０μＬ／ウェルで加え、吸光度値を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して濃度－吸光度値結合曲線をプロットした。
【0091】
結果を図４に示した。本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に同時結合可能であった。
【0092】
実施例６：ルシフェラーゼレポーター遺伝子系におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路およびＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５／ＣＤ１１２シグナル伝達経路についての抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の遮断活性
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路およびＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５／ＣＤ１１２シグナル伝達経路の同時遮断についての抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性を細胞レベルでさらに検出するために、この実施例では、次のルシフェラーゼレポーター遺伝子系を構築した。簡潔には、レンチウイルスを使用して細胞をトランスフェクトし、ヒトＣＤ１５５、ヒトＣＤ１１２、ヒトＰＤ－Ｌ１、およびＯＫＴ－３ｓｃＦｖを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５－ＣＤ１１２－ＰＤ－Ｌ１）ならびにヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＰＤ－１、およびＮＦ－ＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を過剰発現するジャーカット細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＰＤ－１－ｌｕｃ）を構築し、その後、このレポーター遺伝子系を使用して関連する実験を行った。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路およびＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５／ＣＤ１１２シグナル伝達経路の同時遮断についての抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性を細胞レベルでさらに検出するために、この実施例では、次のルシフェラーゼレポーター遺伝子系を構築した。簡潔には、レンチウイルスを使用して細胞をトランスフェクトし、ヒトＣＤ１５５、ヒトＣＤ１１２、ヒトＰＤ－Ｌ１、およびＯＫＴ－３ｓｃＦｖを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５－ＣＤ１１２－ＰＤ－Ｌ１）ならびにヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＰＤ－１、およびＮＦ－ＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を過剰発現するジャーカット細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＰＤ－１－ｌｕｃ）を構築し、その後、このレポーター遺伝子系を使用して関連する実験を行った。
【0093】
詳細には、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５－ＣＤ１１２－ＰＤ－Ｌ１機能性細胞を分解により得、所望の細胞密度に達するように調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルの白色底プレートに加え、一晩培養して接着させた。翌日、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＰＤ－１－ｌｕｃエフェクター細胞の懸濁液を調製し、検査試料を反応培地で段階希釈した。白色底プレートを取り出し、培養上清をピペット操作により除去し、希釈した上記の試料を４０μＬ／ウェルで白色底プレートに加え、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＰＤ－１－ｌｕｃエフェクター細胞の懸濁液を４０μＬ／ウェルで加え、３７℃で、５％ＣＯ２のインキュベーター内で６時間のインキュベーションを実施した。この時間内にＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を室温に戻した。培養完了後、細胞を取り出し、室温で５分間平衡した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を８０μＬ／ウェルで加え、多機能性マイクロプレートリーダーを使用して蛍光シグナル値を読み取った。
【0094】
結果を図５に示した。結果は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ発現を上方制御可能な、ＣＤ１５５／ＣＤ１１２媒介ＴＩＧＩＴ下流阻害性シグナル伝達経路およびＰＤ－Ｌ１媒介ＰＤ－１下流阻害性シグナル伝達経路をそれぞれ解放可能であり、この活性が、２つの単一末端抗体分子の併用による活性よりも良好であることを示した。
【0095】
実施例７：混合リンパ球アッセイにおけるＴ細胞活性化についての抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性
この実施例では、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、Ｔ細胞活性化における抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性を検出した。詳細な実験方法は、以下のとおりであった。
この実施例では、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、Ｔ細胞活性化における抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性を検出した。詳細な実験方法は、以下のとおりであった。
【0096】
ＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹＢＩＯから購入、ＸＦＢ－ＨＰ１００Ｂ）を蘇生させ、遠心分離した。このＰＢＭＣ細胞をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地（ＬＯＮＺＡから購入）１０ｍＬに再懸濁し、細胞培養インキュベーター内で３７℃で２時間培養し、非接着細胞を除去した。ＤＣ培地（Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地に１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄから購入）、および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｒ＆Ｄから購入）を補充）１０ｍＬを加え、３日間培養し、次いで、ＤＣ培地５ｍＬを補充し、６日目まで培養を継続した。次いで、ＤＣ成熟培地（Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地に１０００Ｕ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄから購入）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（Ｒ＆Ｄから購入）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄから購入）、および１μＭのＰＧＥ２（Ｔｏｃｒｉｓから購入）を添加）を加え、２日間培養し、次いで、成熟ＤＣ細胞を採取し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地を使用して細胞密度を２×１０５細胞／ｍＬに調整した。
【0097】
別のドナー由来のＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯから購入、ＸＦＢ－ＨＰ１００Ｂ）を蘇生させ、遠心分離した。このＰＢＭＣ細胞をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地１０ｍＬに再懸濁した。Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌから購入）を使用してＴ細胞を濃縮し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５を使用してＴ細胞を再懸濁し、細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。Ｔ細胞懸濁液を上記で採取した成熟ＤＣ細胞と容量比１：１で混合し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのＵ底プレートに加えた。
【0098】
検査する抗体試料は、２００ｎＭから開始して１０倍希釈により計５のポイントについて、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培養培地で希釈し、１００μＬ／ウェルで上記の混合細胞ウェルに加え、５日間培養した。次いで、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入）方法を使用してＩＦＮ－γ発現レベルを検出した。
【0099】
結果を図６Ａおよび６Ｂに示した。結果は、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、ＭＬＲ実験において良好な生物学的活性を示し、Ｔ細胞活性化レベルが、２つの単一末端抗体分子の併用による活性に匹敵することを示した。
【0100】
実施例８：Ａ３７５およびヒトＰＢＭＣの混合物を接種したＢ－ＮＤＧマウスにおける抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的試験
この実験では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍作用をＡ３７５（Ａｄｄｅｘｂｉｏから購入、Ｃ００２０００４、ヒト悪性メラノーマ細胞）およびヒトＰＢＭＣ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｉｌｅｓ－ｂｉｏ、Ａ１０Ｓ０３３０１４／ＰＢ１００Ｃ）の混合物を接種したＢ－ＮＤＧマウスのモデル（Ａ３７５ ｈｕＰＢＭＣモデル）において決定した。ここでは、ヒト免疫系を局所的に再構成したヒト化腫瘍マウスモデルを、ヒト免疫細胞（ＰＢＭＣ）を免疫不全マウスに接種することにより生成した。
この実験では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍作用をＡ３７５（Ａｄｄｅｘｂｉｏから購入、Ｃ００２０００４、ヒト悪性メラノーマ細胞）およびヒトＰＢＭＣ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｉｌｅｓ－ｂｉｏ、Ａ１０Ｓ０３３０１４／ＰＢ１００Ｃ）の混合物を接種したＢ－ＮＤＧマウスのモデル（Ａ３７５ ｈｕＰＢＭＣモデル）において決定した。ここでは、ヒト免疫系を局所的に再構成したヒト化腫瘍マウスモデルを、ヒト免疫細胞（ＰＢＭＣ）を免疫不全マウスに接種することにより生成した。
【0101】
詳細には、Ａ３７５細胞およびヒトＰＢＭＣを、最初に、１：１の等しい体積比で混合して細胞懸濁液０．１ｍＬを得、マウス腹部の右鼠径部に皮下注射して、Ａ３７５ ｈｕＰＢＭＣモデルを確立した。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、群化を実施した。種々の用量および同一の投与容量のＰＢＳまたは抗体を各群のマウス６匹に腹腔内投与して処置した。各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回のモニタリング頻度でモニターし、モニタリングを２～３週間継続的に実施した。用量および投与方法を表４に示した。
【0102】
【表4】
【0103】
結果を図７に示した。結果は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、有意な抗腫瘍作用を有し、この作用が、２つの単一末端抗体分子の併用による作用よりも良好であることを示した。
【0104】
実施例９：Ａ３７５およびヒトＰＢＭＣの混合物を接種したＢ－ＮＤＧマウスにおける抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの用量依存性薬力学的試験
この実験では、Ａ３７５ ｈｕＰＢＭＣモデルを皮下混合接種により確立した（モデルを確立するためのステップは実施例８と同一であった）。平均腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達したとき、マウスを複数の群に分けた。種々の用量および同一の容量のＰＢＳまたは二重特異性抗体を各群のマウス６匹に腹腔内投与して処置した。各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回のモニタリング頻度でモニターし、モニタリングを２～３週間継続的に実施した。用量および投与方法を表５に示した。
この実験では、Ａ３７５ ｈｕＰＢＭＣモデルを皮下混合接種により確立した（モデルを確立するためのステップは実施例８と同一であった）。平均腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達したとき、マウスを複数の群に分けた。種々の用量および同一の容量のＰＢＳまたは二重特異性抗体を各群のマウス６匹に腹腔内投与して処置した。各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回のモニタリング頻度でモニターし、モニタリングを２～３週間継続的に実施した。用量および投与方法を表５に示した。
【0105】
【表5】
【0106】
結果を図８に示した。本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、マウスの腫瘍の増殖を用量依存的に有意に阻害可能であった。
【0107】
実施例１０：ｈｕＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ ＫＩマウスにおける抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的試験
この実験では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍作用を、ヒトＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ遺伝子導入マウス（ｈｕＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ ＫＩマウス）へのＣＴ－２６－ｈｕＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１をＣＴ２６マウス結腸がん細胞にノックインした、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｇｅｍｐｈａｒｍａｔｅｃｈから購入）の移植により決定した。
この実験では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍作用を、ヒトＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ遺伝子導入マウス（ｈｕＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ ＫＩマウス）へのＣＴ－２６－ｈｕＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１をＣＴ２６マウス結腸がん細胞にノックインした、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｇｅｍｐｈａｒｍａｔｅｃｈから購入）の移植により決定した。
【0108】
詳細には、ＣＴ－２６－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞懸濁液を最初に調製し、およそ５×１０５細胞を含む０．１ｍＬをマウス腹部の右鼠径部に皮下注射して、ＣＴ－２６－ｈｕＰＤ－Ｌ１腫瘍担持マウスモデルを確立した。平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ３に達したとき、マウスを複数の群に分けた。種々の用量および同一の容量のＰＢＳまたは抗体を各群のマウス６匹に腹腔内注射により投与して処置した。各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回のモニタリング頻度でモニターし、モニタリングを２～３週間継続的に実施した。用量および投与方法を表６に示した。
【0109】
【表6】
【0110】
結果を図９に示した。本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の有効性は、臨床薬物の併用（アテゾリズマブ＋チラゴルマブ）による有効性に匹敵し、抗腫瘍活性は、２つのモノクローナル抗体群の活性よりも優れていた。
【0111】
実施例１１：マウスにおける抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期試験
尾静脈単回注射方法を使用してマウスにおける本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の半減期を検出した。
尾静脈単回注射方法を使用してマウスにおける本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の半減期を検出した。
【0112】
詳細には、Ｂａｌｂ／ｃ実験マウスの雄３匹および雌３匹を、１２／１２時間の明／暗調節環境において温度２４℃±２℃および湿度４０％～７０％で飼育し、水および食物を自由に摂取可能とした。実験当日に、Ｂａｌｂ／ｃマウスに用量１０ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体分子の単回尾静脈注射を投与した。血液採取時点：投与後５分、０．５時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、および５０４時間にマウスの眼窩から血液を採取した。全血試料は、２℃～８℃で３０分間静置し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して血清を採取した。生じた血清を２℃～８℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、－８０℃で保存した。血清中の二重特異性抗体分子の量をＥＬＩＳＡにより検出した。
【0113】
結果を図１０に示した。結果は、マウスにおける単回注射後の本発明の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の半減期が１８９時間であったことを示した。
【0114】
調製実施例１：抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の調製
抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の重鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号１９に示した）をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ならびにＬ２３４Ａ修飾およびＬ２３５Ａ修飾を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に組み換えた。加えて、軽鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号２０に示した）をヒトカッパ軽鎖定常領域に組み換え、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体を５５７９６－Ｇ１および５５７９６－Ｇ１ＬＡＬＡとそれぞれ名付けた。一過性発現および精製は、ＨＥＫ２９３発現系を介して実施した。特定の操作は、次のとおりであった。化学的トランスフェクション方法を使用して抗体重鎖および抗体軽鎖を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＨＥＫ２９３細胞に移入し、３７℃および８％ＣＯ２で７日間培養した。細胞透明質を採取し、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を採り出し、プロテインＡで精製し、ＳＥＣを使用して抗体純度を検出し、エンドトキシン含量を同時に調節した。
抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の重鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号１９に示した）をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ならびにＬ２３４Ａ修飾およびＬ２３５Ａ修飾を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に組み換えた。加えて、軽鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号２０に示した）をヒトカッパ軽鎖定常領域に組み換え、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体を５５７９６－Ｇ１および５５７９６－Ｇ１ＬＡＬＡとそれぞれ名付けた。一過性発現および精製は、ＨＥＫ２９３発現系を介して実施した。特定の操作は、次のとおりであった。化学的トランスフェクション方法を使用して抗体重鎖および抗体軽鎖を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＨＥＫ２９３細胞に移入し、３７℃および８％ＣＯ２で７日間培養した。細胞透明質を採取し、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を採り出し、プロテインＡで精製し、ＳＥＣを使用して抗体純度を検出し、エンドトキシン含量を同時に調節した。
【0115】
調製した抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体５５７９６－Ｇ１および５５７９６－Ｇ１ＬＡＬＡを次の検査実施例１～３に使用した。
検査実施例１：抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の親和性検出
バイオフィルム層光干渉技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＴＩＧＩＴに対する結合における、調製実施例１で調製した抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合解離定数（ＫＤ）を決定した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定は、既存の方法に従って実施した（Este, Pら、High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs, 2013.5巻(2号): p.270-8）。このヒトＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列、カニクイザルＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列、およびマウスＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列を、配列番号８、９、および２１にそれぞれ示した。
検査実施例１：抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の親和性検出
バイオフィルム層光干渉技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＴＩＧＩＴに対する結合における、調製実施例１で調製した抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合解離定数（ＫＤ）を決定した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定は、既存の方法に従って実施した（Este, Pら、High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs, 2013.5巻(2号): p.270-8）。このヒトＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列、カニクイザルＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列、およびマウスＴＩＧＩＴの細胞外アミノ酸配列を、配列番号８、９、および２１にそれぞれ示した。
【0116】
ヒト、カニクイザル、およびマウスのＴＩＧＩＴ－ｈｉｓタンパク質に対するインタクトな抗体（すなわち、Ａｄｉｍａｂより最初に入手した完全長ＩｇＧ）の一価性親和性を測定した。センサーをオフラインでアッセイ緩衝液により２０分間平衡し、次いで、オンラインで１２０秒間検出を実施してベースラインを確立し、インタクトなＴＩＧＩＴ抗体をＡＨＱセンサー上に１ｎｍの厚さに達するように添加して親和性検出を行った。抗体を添加したセンサーを１００ｎＭのＴＩＧＩＴ－ｈｉｓ抗原にプラトー相までインキュベートし、次いで、センサーを少なくとも２分間アッセイ緩衝液に移して解離速度を測定した。動態解析を１：１の結合モデルを使用して実施した。
【0117】
上記の決定方法では、測定したＫＤ値を下記の表７に示した。
【表7】
【0118】
表７の結果から次が認められた。（１）ヒトＴＩＧＩＴ－ｈｉｓタンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の一価性親和性は、対照分子チラゴルマブの親和性よりも高かった。（２）カニクイザルＴＩＧＩＴ－ｈｉｓタンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の一価性親和性は、対照分子チラゴルマブの親和性に匹敵した。（３）抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、マウスＴＩＧＩＴとの交差結合活性を有した。
【0119】
検査実施例２：ヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合活性および遮断活性
２．１ フローサイトメトリーに基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞）、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＴＩＧＩＴ細胞）、およびマウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、カニクイザルＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、およびマウスＴＩＧＩＴｃＤＮＡをＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後、過剰発現細胞を適切な細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えた。遠心分離後、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。結果を表８および図１１～１３に示した。
２．１ フローサイトメトリーに基づくＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒト／カニクイザル／マウスＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合活性の検出
詳細には、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞）、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＴＩＧＩＴ細胞）、およびマウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞）を、圧力スクリーニングにより、ヒトＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、カニクイザルＴＩＧＩＴｃＤＮＡ、およびマウスＴＩＧＩＴｃＤＮＡをＭＣＳにクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクトすることによって生成した。増殖培養後、過剰発現細胞を適切な細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えた。遠心分離後、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＥＣ５０値を得た。結果を表８および図１１～１３に示した。
【0120】
２．２ ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴに対するヒトＣＤ１５５の結合遮断における、およびＣＨＯ細胞上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴに対するマウスＣＤ１５５の結合遮断におけるフローサイトメトリーに基づく抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の遮断活性の検出
詳細には、増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するヒトＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
詳細には、増殖培養後のＣＨＯ－ｈｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するヒトＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0121】
増殖培養後のＣＨＯ－ｍｕＴＩＧＩＴ細胞を細胞密度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加え、後の使用のために遠心分離した。精製したモノクローナル抗体は、４００ｎＭから開始して３倍希釈により計１２のポイントについてＰＢＳで希釈した。希釈した試料を６０μＬ／ウェルで上記の９６ウェルのフローサイトメトリープレートに細胞とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、マウスＩｇＧ２ａＦｃタグを有するマウスＣＤ１５５タンパク質を６０μＬ／ウェルで最終濃度２μｇ／ｍＬに達するまで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を１００μＬ／ウェルで加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してグラフ解析を行い、ＩＣ５０値を得た。結果を表８および図１４～１５に示した。
【0122】
【表8】
【0123】
本発明の抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体について、表８および図１１～１３から次が認められた。（１）ＣＨＯ細胞の表面上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対するその結合活性は、対照分子チラゴルマブの活性よりも良好であった。（２）ＣＨＯ細胞の表面上で過剰発現したカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対するその結合活性は、対照分子チラゴルマブの活性よりも良好であった。（３）ＣＨＯ細胞の表面上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴタンパク質に対して有意な結合を示した。
【0124】
本発明の抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体について、表８および図１４～１５から次が認められた。（１）ＣＨＯ細胞の表面上で過剰発現したヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対するヒトＣＤ１５５の結合を遮断するその能力は、対照分子チラゴルマブの能力よりも良好であった。（２）ＣＨＯ細胞の細胞表面上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴタンパク質に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体分子は、ＣＨＯ細胞の表面上で過剰発現したマウスＴＩＧＩＴタンパク質に対するマウスＣＤ１５５の結合を有意に遮断可能であった。
【0125】
検査実施例３：初代Ｔ細胞の表面上のＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合
活性化Ｔ細胞の表面上のＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合活性を、フローサイトメトリー検出方法に基づいて検出した。
活性化Ｔ細胞の表面上のＴＩＧＩＴに対する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合活性を、フローサイトメトリー検出方法に基づいて検出した。
【0126】
詳細には、ＳＴＥＭＣＥＬＬにより提供された実験プロトコル（ｓｔｅｍｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：＃１７９５１Ｃ）に従ってヒトＰＢＭＣを選別して、ヒト全Ｔ細胞を得た。Ｔ細胞の濃度を、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（ｌｏｎｚａから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．０４－４１８Ｑ）を使用して１．０×１０６細胞／ｍＬに調整し、次いで、ＩＬ－２保存液（１００万ＩＵ）１μＬを加え、一方、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（ｇｉｂｃｏから購入、Ｎｏ．：１１１３２Ｄ）を１：１（ビーズ対細胞）で加え、５％ＣＯ２のインキュベーター内で３７℃で４８時間培養した。活性化Ｔ細胞を適切な細胞密度に調整し、９６ウェルのフローサイトメトリープレートに加えた。遠心分離後、段階希釈した検査試料を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、適切な濃度に同様に希釈した蛍光二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに再懸濁した細胞を加え、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0127】
結果を図１６に示した。結果は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体５５７９６－Ｇ１および５５７９６－Ｇ１ＬＡＬＡが、Ｔ細胞表面上のＴＩＧＩＴ分子に結合可能であり、これらの結合活性が、対照分子チラゴルマブの活性よりも良好であることを示した。
【0128】
本発明の特定の実施形態を詳細に記載しているが、当業者は、開示するすべての教示によれば、種々の修飾および置換をこのような詳細に対して為すことができ、このような変更が、本発明の保護範囲内であることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびそのすべての等価物によって与えられる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】