知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-542213低グリコシル化修飾カリクレイン１及びそのポリエチレングリコール修飾体とその薬物への応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】低グリコシル化修飾カリクレイン１及びそのポリエチレングリコール修飾体とその薬物への応用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/64 20060101AFI20241106BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20241106BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20241106BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N9/64 A ZNA
A61K38/48 100
A61P9/12
A61P9/10
A61P21/00
A61P13/12
A61P25/02
A61P27/02
A61K47/60
C12N15/57
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529618
(86)(22)【出願日】2022-11-16
(85)【翻訳文提出日】2024-05-29
(86)【国際出願番号】 CN2022132102
(87)【国際公開番号】W WO2023088272
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】202111353294.2
(32)【優先日】2021-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524159077
【氏名又は名称】江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＺＯＮＨＯＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，ＩＮＣ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ 永
(72)【発明者】
【氏名】王 和
(72)【発明者】
【氏名】王 俊
(72)【発明者】
【氏名】葛 晨楠
(72)【発明者】
【氏名】江 辰▲陽▼
(72)【発明者】
【氏名】姚 翔
(72)【発明者】
【氏名】▲孫▼ 芳
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲韜▼
(72)【発明者】
【氏名】庄 宇
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 梦寒
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076CC11
4C076CC17
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF63
4C076FF67
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA21
4C084CA32
4C084CA39
4C084CA53
4C084DC04
4C084NA14
4C084ZA20
4C084ZA33
4C084ZA36
4C084ZA42
4C084ZA81
(57)【要約】
一種の低グリコシル化修飾カリクレイン１とそのＰＥＧ修飾体の提供及びその薬物への応用。
本発明はＮＦＳ配列でグリコシル化修飾がないか又はごく少量のグリコシル化修飾があるＫＬＫ１を提供し、高い活性を実現した。また本発明はＮＭＳ、ＮＨＴのみにＮ‐グリコシル化修飾がある組換えＫＬＫ１突然変異体を提供し、糖修飾が一致で、産物分子量が均一で、産量が高く、精製が簡単になったとともに、高生物学的活性と品質管理可能という利点を持つ。本発明はまた長時間作用性、品質管理可能、低免疫原性及び高生物学的活性のＰＥＧ化ＫＬＫ１を提供し、投与頻度を減らし、患者のコンプライアンスを高め、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病などの疾患の予防、治療、予後回復、再発予防など疾患全過程に薬物の応用を実現した。
本発明はＮＦＳ配列でグリコシル化修飾がないか又はごく少量のグリコシル化修飾があるＫＬＫ１を提供し、高い活性を実現した。また本発明はＮＭＳ、ＮＨＴのみにＮ‐グリコシル化修飾がある組換えＫＬＫ１突然変異体を提供し、糖修飾が一致で、産物分子量が均一で、産量が高く、精製が簡単になったとともに、高生物学的活性と品質管理可能という利点を持つ。本発明はまた長時間作用性、品質管理可能、低免疫原性及び高生物学的活性のＰＥＧ化ＫＬＫ１を提供し、投与頻度を減らし、患者のコンプライアンスを高め、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病などの疾患の予防、治療、予後回復、再発予防など疾患全過程に薬物の応用を実現した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
低グリコシル化修飾カリクレイン１またはその誘導体であって、前記カリクレイン１は霊長類動物のカリクレイン１であり、天然カリクレイン１のＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳ配列でのＮ‐グリコシル化修飾を含み、ＮＦＳのアスパラギンにグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾があることを特徴とする、低グリコシル化修飾カリクレイン１またはその誘導体であり、前記少量のグリコシル化修飾または低グリコシル化修飾は、ＮＦＳにあるアスパラギンがグリコシル化修飾された割合が≦１０％、≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％、≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％、または≦０．１％である。
【請求項2】
組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１は霊長類動物カリクレイン１であり、２つの部位のみにＮ‐グリコシル化修飾があることを特徴とする、低グリコシル化修飾カリクレイン１またはその誘導体である。
【請求項3】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、天然カリクレイン１アミノ酸配列中のＮＭＳ、ＮＨＴでのＮ‐グリコシル化修飾を保持しており、天然カリクレイン１のＮＦＳでのＮ‐グリコシル化修飾を含まないことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項4】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンがアスパラギン以外の任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＦ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項5】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのフェニルアラニンがプロリンに突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項6】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのセリンがセリン、トレオニン以外の任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｆの０個、１個、または２個のアミノ酸がほかの任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項7】
請求項４に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体はカリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンが極性中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または脂肪族アミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項8】
請求項７に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体はカリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンがグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはアラニン（Ａｌａ）に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項9】
請求項２～８のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１はヒトカリクレイン１であり、ＮＦＳのアスパラギン、フェニルアラニン、セリンはそれぞれヒトカリクレイン１の１４１位、１４２位、１４３位のアミノ酸であり、天然ヒトカリクレイン１のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１、ＮＰ００２２４８．１、ＡＡＡ３６１３６．１、ＡＡＰ３５９１７、ＡＡＵ１２５６９で登録された配列であることを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項10】
請求項２～８のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示した配列であることを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体である。
【請求項11】
請求項１に記載のカリクレイン１またはその誘導体、または請求項２～１０のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体を含む組成物。
【請求項12】
急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病の治療、予防、予後回復、再発防止に用いられる薬物の製造において、請求項１に記載のカリクレイン１またはその誘導体、または請求項２～１０のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体の応用。
【請求項13】
ポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記カリクレイン１はポリエチレングリコール修飾剤によって修飾された、請求項１に記載のカリクレイン１または請求項２～１０のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１である。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記ポリエチレングリコール修飾剤は分子量５ｋＤａ～１０ｋＤａの直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミドプロピオネートであり、一般構造式が式（１）に示される通りであり、式（１）中、ｎは１０５～２２５の整数であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１である。【化1】
（１）
【請求項15】
請求項１３に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記ポリエチレングリコール修飾剤は分子量３０ｋＤａ～４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒドであり、一般構造式は式（２）に示される通りであり、式（２）中、ｎは３３５～４５５の整数であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１である。【化2】
（２）
【請求項16】
請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１を含む組成物。
【請求項17】
急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病の治療、予防、予後回復、再発防止に用いられる薬物の製造において、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、低グリコシル化修飾カリクレイン１（ＫＬＫ１）およびそのポリエチレングリコール修飾体とその薬物への応用に関する。特に、ＮＦＳ配列でグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾があるＫＬＫ１と、組換えＫＬＫ１のＮＦＳ配列が突然変異されたＫＬＫ１変異体、それらＫＬＫ１のポリエチレングリコール修飾体とその薬物への応用に関する。
【背景技術】
【0002】
カリクレインは、キニノゲナーゼ、あるいはカリジノゲナーゼとも称され、セリンプロテアーゼの一種であり、血漿カリクレイン（ＰＫ）と組織カリクレイン（ＴＫ）の２種に分けられ、どちらも非常に重要な生理作用を発揮している。現在、ヒト組織カリクレインは少なくとも１５のメンバー（ＫＬＫ１‐ＫＬＫ１５）で構成されていると考えられており、そのなかで組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）に関する研究が比較的に多く行われている。ＫＬＫ１はキニノーゲンをキニンに変換させ、対応する受容体に作用して一連の生物学的作用を発揮する。ＫＬＫ１は神経系、循環系、呼吸器系、糖尿病、癌、腎臓病などにおいて作用することが多くの研究で示されている。
【0003】
現在、国内外で販売されているＫＬＫ１製品は２種類ある。一種はブタ膵臓より抽出された膵臓カリクレイン１であり、例えば常州千紅製薬社の怡開がこの種類に属する。この種類のＫＬＫ１製品は動物由来の原材料から制約を受けている。もう一種は、ヒト尿より抽出されたＫＬＫ１であり、例えば広東天普社のＵｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ注射剤がこの種類のＫＬＫ１である。ヒト尿は収集が困難で、収量が低く、ウイルス汚染のリスクがあり、また尿由来ＫＬＫ１のアミノ酸の１６２位でＧｌｕ／Ｌｙｓの多形性があるので、この種類のＫＬＫ１製品は薬物の品質管理において大きな課題がある。前述の天然抽出物のＫＬＫ１以外にも、組換えヒトカリクレイン１に関する研究報告が多数にある。その中で最も進んでいるのがＤｉａＭｅｄｉｃａ社のＤＭ１９９であり、現在は脳卒中治療を目的とした第２／３相臨床研究が実施されている。
【0004】
ＫＬＫ１は豊富なグリコシル化修飾を有する酵素であり、グリコシル化修飾の程度は酵素活性に重要な影響を与える。Ｎ‐グリコシル化修飾は、糖タンパク質薬物の最も注目されるグリコシル化修飾のタイプであり、糖鎖が新生ペプチド鎖中の特定のアスパラギンの遊離基‐ＮＨ２を通して結合される。Ｎ‐グリコシル化修飾部位のトライアド配列モチーフは必ずＮＸＳまたはＮＸＴでなければならない。ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、Ｘはプロリン以外のアミノ酸を表す。上記の条件を満たさない場合、アスパラギンにはＮ‐グリコシル化修飾が発生しない。異なるＮ‐グリコシル化モチーフが糖タンパク質の三次構造の異なる位置に位置しており、糖タンパク質の構造によって、そのグリコシル化修飾部位がどんなグリコシルトランスフェラーゼと結合するかが決まって、異なったグリコシル化修飾が生じる。従来技術では、異なるグリコシル化程度がＫＬＫ１の薬効および安全性に如何に影響を及ぼすかについては定説がない。中国特許ＣＮ１０７０５８２６９Ａ（特許文献１）では、ブタ膵臓カリクレイン１を精製して高グリコシル化、中グリコシル化、低グリコシル化と３つのグリコシル化程度のタンパク質産物を分離して作製した。そのなかで、低グリコシル化ブタ膵臓カリクレイン１の酵素活性安定性が低かった。精製プロセスを通してこの低グリコシル化カリクレイン１を除去することで、製品の生物活性を高め、副作用を減らすことができた。広東天普社の特許ＣＮ１０１１３４９５２Ａ（特許文献２）は、尿由来カリクレイン１の中間体から高分子量カリクレイン１と低分子量カリクレイン１を分離して２種類の成分を取得して
おり、その中から高分子量成分を薬物成分として選択した。この単一成分の高分子量ヒト尿カリクレイン１は高・低分子量のカリクレイン１を含む混合物のヒト尿カリクレイン１と比較して、副作用の発生が明らかに少なかった。広東天普社はまたＣＨＯによる組換えヒトカリクレイン１の発現を試みており、同社の特許ＣＮ１０１１３４９５３Ａ（特許文献４）は、グリコシル化修飾部位を３つ含む高分子量ＫＬＫ１を公開している。ＤｉａＭｅｄｉｃａ社の特許ＵＳ２０１３０３２３２２２Ａ（特許文献３）は、ＣＨＯにより組換えヒトカリクレイン１を発現、精製し、高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１をそれぞれ得られたことを公開している。この高グリコシル化カリクレイン１と低グリコシル化カリクレイン１はｉｎ ｖｉｖｏ活性において大きな差がないが、高グリコシル化カリクレイン１と低グリコシル化カリクレイン１を１：１の比で混合した混合物は、単一の高グリコシル化ＫＬＫ１または単一の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して活性が高かった。
おり、その中から高分子量成分を薬物成分として選択した。この単一成分の高分子量ヒト尿カリクレイン１は高・低分子量のカリクレイン１を含む混合物のヒト尿カリクレイン１と比較して、副作用の発生が明らかに少なかった。広東天普社はまたＣＨＯによる組換えヒトカリクレイン１の発現を試みており、同社の特許ＣＮ１０１１３４９５３Ａ（特許文献４）は、グリコシル化修飾部位を３つ含む高分子量ＫＬＫ１を公開している。ＤｉａＭｅｄｉｃａ社の特許ＵＳ２０１３０３２３２２２Ａ（特許文献３）は、ＣＨＯにより組換えヒトカリクレイン１を発現、精製し、高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１をそれぞれ得られたことを公開している。この高グリコシル化カリクレイン１と低グリコシル化カリクレイン１はｉｎ ｖｉｖｏ活性において大きな差がないが、高グリコシル化カリクレイン１と低グリコシル化カリクレイン１を１：１の比で混合した混合物は、単一の高グリコシル化ＫＬＫ１または単一の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して活性が高かった。
【0005】
さらに、たとえ最も創薬可能性の高いグリコシル化修飾ＫＬＫ１が決定されたとしても、いかに糖タンパク質のグリコシル化のレベルを制御するかは、現代医薬品工業生産において依然として重要な技術的課題である。通常、目的のグリコシル化産物を最大限に取得するために、組換え発現と精製条件に対して大量の最適化を行わなければならない。例えば、中国特許ＣＮ１０１１３４９５３Ａ（特許文献４）はＣＨＯにより組替えＫＬＫ１を発現しており、段落［００１０］には「培養条件を最適化することによって、発現産物のグリコシル化程度を高めた」と記載している。中国特許ＣＮ１０１０９２５９８Ａ（特許文献５）はピキア酵母を使用して組換えＫＬＫ１を発現しており、発現産物に、高グリコシル化ＫＬＫ１は３２８７１．１６Ｄの分子量で、占める割合が低く、低グリコシル化ＫＬＫ１は２８９７５．７９Ｄの分子量で、占める割合が比較的に高く、高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１の分子量が近いが、三段階の精製により両者を分離した。
【0006】
ＫＬＫ１製品には、ＫＬＫ１グリコシル化に関する課題のほかにも、生物学的安定性が低いこと、半減期が短いこと、反復投与が必要であること、組換えＫＬＫ１タンパク質はある程度の免疫原性があることなど解決すべき課題がある。例えば、ＤＭ１９９は、脳卒中発症から２４時間以内にＫＬＫ１を点滴静脈内注射し、その後２２日以内に３日ごとに皮下注射するという治療法で投与される。臨床試験の結果は、ＫＬＫ１が高リスク群の脳卒中発生率を低下させ、脳卒中の再発を防ぐことができることを示している。ＫＬＫ１は脳側副血行路の代償性を改善する薬剤として、治療効果を得るには長期かつ複数回の投与を必要とする。長期投薬がＫＬＫ１の重要な適用方法となる同時に、頻繁な投薬は患者のコンプライアンスを低下させかねないことも考えられるだろう。
【0007】
ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）化技術は、ポリエチレングリコール修飾剤を用いてタンパク質やポリペプチドなどを化学修飾する技術である。現在、１０種類以上のＰＥＧ修飾タンパク質医薬品が市販されている。ＰＥＧ修飾タンパク質は、タンパク質溶解度の増加、タンパク質安定性の向上、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長、免疫原性の低減などが可能となる。国内外においてＰＥＧ化組換えカリクレイン１に関する報告はまだ少ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】中国特許出願公開第１０７０５８２６９号明細書
【特許文献2】中国特許出願公開第１０１１３４９５２号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２０１３０３２３２２２号明細書
【特許文献4】中国特許出願公開第１０１１３４９５３号明細書
【特許文献5】中国特許出願公開第１０１０９２５９８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明が解決しようとする第一の技術的課題は、ＫＬＫ１グリコシル化修飾の選択である。本発明が解決しようとする第二の技術的課題は、既存のＫＬＫ１製品が抱えている、生物学的安定性が低いこと、半減期が短いこと、反復投与が必要であること、組換えＫＬＫ１タンパク質はある程度の免疫原性があることといった課題の解決である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明が解決しようとする第一の技術的課題は、ＫＬＫ１グリコシル化修飾の選択である。背景技術で述べたように、従来技術では異なるグリコシル化程度がＫＬＫ１の薬効および安全性に如何に影響を及ぼすかについては定説がない。また、たとえ最も創薬可能性の高いグリコシル化修飾ＫＬＫ１が決定されたとしても、目的のグリコシル化産物を最大限に得るために、糖タンパク質のグリコシル化レベルを制御するには、組換え発現と精製条件に対して大量の最適化を行わなければならない。
【0011】
本願の出願人は特性解析を通じて、ヒトカリクレイン１（ｈＫＬＫ１）には３つのグリコシル化修飾部位があり、それぞれＮ７８（ＮＭＳ配列中のＮ）、Ｎ８４（ＮＨＴ配列中のＮ）、Ｎ１４１（ＮＦＳ配列中のＮ）であることを発見した。このなかで、高グリコシル化ＫＬＫ１は３つの部位にすべてグリコシル化修飾があり、低グリコシル化ＫＬＫ１はＮ７８とＮ８４の２つの部位にグリコシル化修飾があり、Ｎ１４１にグリコシル化修飾がないか、またはごく少量のグリコシル化修飾がある。さらに、出願人は高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１の生物学的活性を比較したところ、予想外にも、低グリコシル化ＫＬＫ１の活性が高グリコシル化ＫＬＫ１の活性より遥かに高いことを発見した。さらに、出願人は低グリコシル化ＫＬＫ１を取得するために、従来法のように組換え発現条件や精製条件の最適化に取り組むのではなく、高・低グリコシル化ＫＬＫ１に対する研究に基づき、Ｎ‐グリコシル化モチーフを形成しないように、ＮＦＳ配列モチーフのアミノ酸を１個または複数個突然変異させ、突然変異体を作製することにより、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の生産量がより高いことを実現した。そして、出願人は前記の低グリコシル化ＫＬＫ１の突然変異体と突然変異されていない未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１を比較して、突然変異体のほうは酵素学的性質、活性などの面においてより優れているという驚くべき発見をした。
【0012】
ｈＫＬＫ１には、多くの天然変異体（ホモログ）が存在する。例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１、ＮＰ００２２４８．１、ＡＡＡ３６１３６．１、ＡＡＰ３５９１７、ＡＡＵ１２５６９などで登録された天然変異体がある。その組成から見ると、ｈＫＬＫ１の天然変異体はアミノ酸の数が同じで、少数のアミノ酸が異なるのみで（下の表に示すように）、相同性が非常に高く、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が基本的に同様である。本発明者はまた、それらの天然変異体のグリコシル化修飾部位が同じで、いずれもＮ７８、Ｎ８４、Ｎ１４１に位置しており、またＮ‐グリコシル化修飾部位のトライアド配列モチーフも同じで、いずれもＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳであることを発見した。
【0013】
【表1】
【0014】
本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１で登録されたｈＫＬＫ１を元に、ＮＦＳ配列モチーフのアミノ酸を１個または複数個突然変異させて、Ｎ‐グリコシル化修飾部位を２つのみ含むＫＬＫ１（低グリコシル化ＫＬＫ１）を得た。上記述べたように、ｈＫＬＫ１天然変異体のアミノ酸組成及びグリコシル化修飾部位は高度に一致しており、他のｈＫＬＫ１天然変異体の相応する位置（即ち、ＮＦＳ配列モチーフの１個または複数個のアミノ酸）を突然変異させても、同様な技術的効果が実現できる。即ち、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高くて、活性がより高い目的産物が得られる。
【0015】
さらに、本発明者は、ほかの霊長類動物、例えば、ＮＣＢＩ ＲｅＦｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００４０６１３０５．１（ゴリラ）、ＸＰ＿００３９１６０２２．１（アヌビスヒヒ）、ＸＰ＿００３８１３６８５．１（ボノボ）、ＸＰ＿００２８２９６６８．３（スマトラオランウータン）、ＸＰ＿０３２０２４９６０．１（フーロックテナガザル）などの霊長類動物のＫＬＫ１もｈＫＬＫ１と同様に３つのＮ‐グリコシル化修飾部位を含み、Ｎ‐グリコシル化修飾部位のトライアド配列モチーフも同じで、いずれもＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳであることを発見した。ほかの霊長類動物のＫＬＫ１天然アミノ酸の相応部位（即ち、ＮＦＳ配列モチーフの１個または複数個のアミノ酸）を突然変異させても、同様な技術的効果が実現できる。即ち、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高く、活性がより高い目的産物が得られる。
【0016】
本発明は上記の発見に基づいて、一種の低グリコシル化修飾ＫＬＫ１またはその誘導体を提供する。前記ＫＬＫ１は霊長類動物のＫＬＫ１であり、天然ＫＬＫ１のＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳ配列でのＮ‐グリコシル化修飾を含み、そのなかで、ＮＦＳのアスパラギンにグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾がある。前記少量のグリコシル化修飾または低グリコシル化修飾は、ＮＦＳにあるアスパラギンがグリコシル化修飾された割合が≦１０％、≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％、≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％、または≦０．１％である。具体的な実施例では、該当の低グリコシル化ＫＬＫ１は、ＮＦＳにあるアスパラギンの９６．３９％はグリコシル化修飾が発生しておらず、僅か４％未満はグリコシル化修飾が発生した。この低グリコシル化ＫＬＫ１は、ＮＦＳに高グリコシル化修飾があるＫＬＫ１と比較して、より高い活性を有している。
【0017】
さらに、本発明は一種の組換えＫＬＫ１突然変異体またはその誘導体を提供する。前記ＫＬＫ１は霊長類動物ＫＬＫ１であり、前記組換えＫＬＫ１またはその誘導体は、２つの部位のみにＮ‐グリコシル化修飾が起こり、Ｎ‐グリコシル化修飾が３つの部位に起こるＫＬＫ１を含まない。前記霊長類動物は、ヒトであってもよいし、ゴリラ、アヌビスヒヒ、ボノボ、スマトラオランウータン、フーロックテナガザルなどの非ヒト霊長類動物であ
ってもよい。
ってもよい。
【0018】
好ましくは、前記組換えＫＬＫ１突然変異体またはその誘導体は、天然ＫＬＫ１のＮＭＳ、ＮＨＴでのＮ‐グリコシル化修飾を保持しており、天然ＫＬＫ１のＮＦＳでのＮ‐グリコシル化修飾を含まない。
【0019】
好ましくは、ＫＬＫ１アミノ酸配列中のＮＦＳのＮ（アスパラギン）がアスパラギン以外の任意のアミノ酸に突然変異された。すなわち、１４１番目のアスパラギンがほかの任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＦ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異された。それにより、突然変異体は該当の位置でＮ‐グリコシル化モチーフを形成しないため、１４１位にグリコシル化修飾が起こらない。異なる突然変異体はいずれも未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して、産物がより均一で、低グリコシル化ＫＬＫ１の産量がより高いことに加えて、産物の活性がより優れている。
好ましくは、ＫＬＫ１アミノ酸配列中のＮＦＳのＦ（フェニルアラニン）がプロリンに突然変異された。すなわち、１４２番目のフェニルアラニンがプロリンに突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異された。それにより、突然変異体は該当の位置でＮ‐グリコシル化モチーフを形成しないため、１４１位にグリコシル化修飾が起こらない。同様に、突然変異体はいずれも未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１産物と比較して、産物がより均一で、低グリコシル化ＫＬＫ１の産量がより高いことに加えて、産物の活性がより優れている。
好ましくは、ＫＬＫ１アミノ酸配列中のＮＦＳのＦ（フェニルアラニン）がプロリンに突然変異された。すなわち、１４２番目のフェニルアラニンがプロリンに突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異された。それにより、突然変異体は該当の位置でＮ‐グリコシル化モチーフを形成しないため、１４１位にグリコシル化修飾が起こらない。同様に、突然変異体はいずれも未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１産物と比較して、産物がより均一で、低グリコシル化ＫＬＫ１の産量がより高いことに加えて、産物の活性がより優れている。
【0020】
好ましくは、ＫＬＫ１アミノ酸配列中のＮＦＳのＳ（セリン）がセリン、トレオニン以外の任意のアミノ酸に突然変異された。すなわち、１４３番目のセリンがセリン、トレオニン以外の任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｆの０個、１個、または２個のアミノ酸がほかの任意のアミノ酸に突然変異された。それにより、突然変異体は該当の位置でＮ‐グリコシル化モチーフを形成しないため、１４１位にグリコシル化修飾が起こらない。同様に、突然変異体はいずれも未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して、産物がより均一で、低グリコシル化ＫＬＫ１の産量がより高いことに加えて、産物の活性がより優れている。
【0021】
具体的な実施例では、例としてアスパラギンを極性中性アミノ酸（例えば、グルタミン（Ｇｌｎ））、酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ））、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン（Ａｒｇ））、脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン（Ａｌａ））といった４種類の異なるアミノ酸に突然変異させた。それにより、突然変異体はＮＦＳでＮ‐グリコシル化モチーフを形成しないため、そこにグリコシル化修飾が起こらない。異なる突然変異体はいずれも未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して、産物がより均一で、低グリコシル化ＫＬＫ１の産量がより高いことに加えて、産物の活性がより優れている。
【0022】
好ましくは、前記ＫＬＫ１はｈＫＬＫ１であり、前記天然ｈＫＬＫ１のアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１、ＮＰ００２２４８．１、ＡＡＡ３６１３６．１、ＡＡＰ３５９１７、ＡＡＵ１２５６９などで登録された配列である。
【0023】
好ましくは、ＫＬＫ１突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示される配列である。
ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示される配列である。
【0024】
本発明はまた、前記低グリコシル化ＫＬＫ１を含む組成物を提供する。
【0025】
ＫＬＫ１は、キニノーゲンをキニンに変換させ、対応する受容体に作用して一連の生物学的作用を発揮する。ＫＬＫ１は神経系、循環系、呼吸器系、糖尿病、癌、腎臓病などに
おいて作用することが多くの研究で示されている。現在市販されているＫＬＫ１は、承認を取得した適応症には微小循環障害性疾患、例えば糖尿病による腎症、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧に対する補助療法などがあり、また軽度から中等度の急性血栓性脳梗塞にも使用可能である。臨床試験中の適応症にはＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病などがある。本発明のＫＬＫ１突然変異体は天然ＫＬＫ１と比較して、少数のアミノ酸が突然変異されただけである。具体的な実施例では、それらの突然変異体はｉｎ ｖｉｔｒｏで同じ基質に作用する場合、いずれも活性を発揮することが確認されており、ｉｎ ｖｉｖｏでもＭＣＡＯ脳虚血・再灌流モデルにおいて脳梗塞症状の改善に活性を発現することが実証された。当業者は、本発明の組換えＫＬＫ１突然変異体およびその組成物は、天然ＫＬＫ１と同様に、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病の治療や予防、予後回復や再発防止において有効であると合理的に期待できる。
おいて作用することが多くの研究で示されている。現在市販されているＫＬＫ１は、承認を取得した適応症には微小循環障害性疾患、例えば糖尿病による腎症、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧に対する補助療法などがあり、また軽度から中等度の急性血栓性脳梗塞にも使用可能である。臨床試験中の適応症にはＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病などがある。本発明のＫＬＫ１突然変異体は天然ＫＬＫ１と比較して、少数のアミノ酸が突然変異されただけである。具体的な実施例では、それらの突然変異体はｉｎ ｖｉｔｒｏで同じ基質に作用する場合、いずれも活性を発揮することが確認されており、ｉｎ ｖｉｖｏでもＭＣＡＯ脳虚血・再灌流モデルにおいて脳梗塞症状の改善に活性を発現することが実証された。当業者は、本発明の組換えＫＬＫ１突然変異体およびその組成物は、天然ＫＬＫ１と同様に、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病の治療や予防、予後回復や再発防止において有効であると合理的に期待できる。
【0026】
本発明が解決しようとする第二の技術的課題は、既存のＫＬＫ１製品が抱えている、生物学的安定性が低いこと、半減期が短いこと、反復投与が必要であること、組換えＫＬＫ１タンパク質はある程度の免疫原性があることといった課題の解決である。本発明は、タンパク質の安定性を著しく高め、免疫原性を低減させ、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態特性を改善し、且つタンパク質活性を最大限に保持する、ポリエチレングリコール修飾剤によって修飾されたＫＬＫ１を提供する。
【0027】
好ましくは、前記ＰＥＧによって修飾されたＫＬＫ１は、前記低グリコシル化ＫＬＫ１である。
【0028】
好ましくは、前記ＫＬＫ１は、２つの部位にＮ‐グリコシル化修飾が起こった組換えＫＬＫ１またはその誘導体であり、Ｎ‐グリコシル化修飾が３つの部位に起こったＫＬＫ１を含まない。
【0029】
好ましくは、前記ポリエチレングリコール修飾剤は、ＫＬＫ１タンパク質のＮ末端またはリシンの遊離アミノ基に共有結合を形成しており、一般構造式が式（１‐１）または式（１‐２）に示される通りであり、式中でＲはＫＬＫ１を表している。式（１‐１）中、ｎは３３５～４５５の整数であり、式（１‐２）中、ｎは１０５～２２５の整数であり、ｍは１～８の整数である。
【0030】
【化1】
（１‐１）
【0031】
【化2】
（１‐２）
【0032】
好ましくは、前記ポリエチレングリコール修飾剤は、分子量５ｋＤａ～１０ｋＤａの直
鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミドプロピオネートであり、一般構造式が式（２）に示される通りである。式（２）中、ｎは１０５～２２５の整数である。
鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミドプロピオネートであり、一般構造式が式（２）に示される通りである。式（２）中、ｎは１０５～２２５の整数である。
【0033】
【化3】
（２）
【0034】
好ましくは、ポリエチレングリコール修飾剤は、分子量３０ｋＤａ～４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒドであり、一般構造式は式（３）に示される通りである。式（３）中、ｎは３３５～４５５の整数である。
【0035】
【化4】
（３）
【0036】
本発明は、前記ポリエチレングリコール化ＫＬＫ１の製造方法を提供する。前記方法は以下のステップを含む。
ステップ１：緩衝液置換
クロマトグラフィー・カラムによる脱塩、透析、濃縮・希釈、クロスフロー限外ろ過などの方法により、修飾するＫＬＫ１を修飾緩衝液に置換する；
ステップ２：修飾反応および修飾産物の精製
ステップ１で収集したＫＬＫ１溶液にＰＥＧ修飾剤を加えて反応させ、反応が終わった後でイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
ステップ１：緩衝液置換
クロマトグラフィー・カラムによる脱塩、透析、濃縮・希釈、クロスフロー限外ろ過などの方法により、修飾するＫＬＫ１を修飾緩衝液に置換する；
ステップ２：修飾反応および修飾産物の精製
ステップ１で収集したＫＬＫ１溶液にＰＥＧ修飾剤を加えて反応させ、反応が終わった後でイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
【0037】
本発明はまた、前記ポリエチレングリコール化ＫＬＫ１を含む組成物を提供する。
【0038】
本発明はまた、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病の治療、予防、予後回復、及び再発予防における前記ポリエチレングリコール化ＫＬＫ１の応用を提供する。
【発明の効果】
【0039】
従来技術と比較して、本発明には以下の利点がある。
第一に、本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１は明らかな利点を有している。
まず、本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１は、ＮＦＳでグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾があり、高グリコシル化ＫＬＫ１と比較してより高い活性を有している。
第一に、本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１は明らかな利点を有している。
まず、本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１は、ＮＦＳでグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾があり、高グリコシル化ＫＬＫ１と比較してより高い活性を有している。
【0040】
次に、本発明の組換えＫＬＫ１突然変異体はさらなる利点を有している。
【0041】
本発明の組換えＫＬＫ１突然変異体は天然ＫＬＫ１と比較して、Ｎ-グリコシル化修飾
が１箇所少なくなっている。製造工程の面では、本発明の組換えｈＫＬＫ１突然変異体の
精製工程は主要ピークのみの収集が必要であり、精製工程がより簡単になる。品質の面では、本発明は高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１を分離することが不要なので、得られた目的産物がより均一で、品質管理がより容易で、産量がより高いのである。活性および薬効の面で、出願人は本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１の突然変異体と未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１を比較して、突然変異体のほうは酵素学的性質、活性などの面においてより優れているという驚くべき発見をした。
が１箇所少なくなっている。製造工程の面では、本発明の組換えｈＫＬＫ１突然変異体の
精製工程は主要ピークのみの収集が必要であり、精製工程がより簡単になる。品質の面では、本発明は高グリコシル化ＫＬＫ１と低グリコシル化ＫＬＫ１を分離することが不要なので、得られた目的産物がより均一で、品質管理がより容易で、産量がより高いのである。活性および薬効の面で、出願人は本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１の突然変異体と未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１を比較して、突然変異体のほうは酵素学的性質、活性などの面においてより優れているという驚くべき発見をした。
【0042】
第二に、本発明は、ポリエチレングリコール化技術により、長時間作用性を持ち、品質管理が可能で、低免疫原性及び高生物学的活性を有するポリエチレングリコール化組換えｈＫＬＫ１を開発した。そして薬効および薬物動態研究により、ポリエチレングリコール化薬物が持つ安全性と長時間作用性の利点を十分に発掘し、投与頻度を減らし、患者のコンプライアンスを高め、急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、慢性腎臓病などの疾患に対して予防、治療、予後回復、再発予防などの段階をカバーする疾患全過程における本発明の薬物の応用を実現した。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】組換えｈＫＬＫ１と突然変異体の分子設計を示す図である。
【図2】ｐＺＨＫ２．０発現ベクターを示す図である
【図3】ＣＨＯで発現した野生型組換えｈＫＬＫ１の発酵液上清の疎水クロマトグラフィー溶出ピークのクロマトグラムを示す図である。矢印で示したのは分離された高グリコシル化産物（左）と低グリコシル化産物（右）である。
【図4】ＣＨＯで発現した野生型ｈＫＬＫ１を精製、分離して得られた高・低グリコシル化タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動図を示す図である。レーンＭはタンパク質マーカーであり、レーン１は高グリコシル化ｈＫＬＫ１であり、レーン２は低グリコシル化ｈＫＬＫ１である。
【図5】ＣＨＯで発現したｈＫＬＫ１Ｘ１（組換えｈＫＬＫ１突然変異体）の発酵液上清の疎水クロマトグラフィー溶出ピークのクロマトグラムを示す図である。矢印で示したのは分離された単一の低グリコシル化産物である。
【図6】ＣＨＯで発現したｈＫＬＫ１Ｘ１（組換えｈＫＬＫ１突然変異体）を精製、分離して得られた低グリコシル化タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動図を示す図である。レーンＭはタンパク質マーカーであり、レーン１は低グリコシル化ｈＫＬＫ１突然変異体である。
【図7】ＣＨＯで発現した野生型組換えｈＫＬＫ１の高・低グリコシル化タンパク質が分離されていない時のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動図を示す図である。レーンＭはタンパク質マーカーであり、レーン１は高・低グリコシル化タンパク質が混在する野生型組換えｈＫＬＫ１である。
【図8】高グリコシル化ｈＫＬＫ１サンプルのトリプシン酵素消化後のシーケンス・カバレッジを示す図である。
【図9】低グリコシル化ｈＫＬＫ１サンプルのトリプシン酵素消化後のシーケンス・カバレッジを示す図である。
【図10】３バッチの高グリコシル化ｈＫＬＫ１サンプルのトリプシン酵素消化後のＴＩＣクロマトグラムを示す図である。
【図11】３バッチの低グリコシル化ｈＫＬＫ１サンプルのトリプシン酵素消化後のＴＩＣクロマトグラムを示す図である。
【図12】ｈＫＬＫ１Ｘ１サンプルのトリプシン酵素消化後のシーケンス・カバレッジを示す図である。
【図13】ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）を投与された動物における抗薬物抗体の測定結果を示す図である。
【図14】ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）を投与された動物における抗薬物抗体の測定結果を示す図である。
【図15】神経欠損症状に対する実施例１０の被検物の影響を示すグラフである。
【図16】脳梗塞面積に対する実施例１０の被検物の影響を示すグラフである。
【図17】実施例１０の動物実験におけるモデル群と偽手術群の脳切片写真を示す図である。
【図18】実施例１０の動物実験におけるＵｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群と注射用膵臓カリクレイン１群の脳切片写真を示す図である。
【図19】神経欠損症状に対する実施例１１の被検物の影響を示すグラフである。
【図20】脳梗塞面積に対する実施例１１の被検物の影響を示すグラフである。
【図21】実施例１１の動物実験におけるモデル群と偽手術群の脳切片写真を示す図である。
【図22】実施例１１の動物実験における投与群の脳切片写真を示す図である。
【図23】神経欠損症状に対する実施例１２の被検物の影響を示すグラフである。
【図24】脳梗塞面積に対する実施例１２の被検物の影響を示すグラフである。
【図25】実施例１２の動物実験におけるモデル群、偽手術群及び陽性薬群の脳切片写真を示す図である。
【図26】実施例１２の動物実験における異なるＰＥＧで修飾したｈＫＬＫ１修飾体投与群の脳切片写真を示す図である。
【図27】神経欠損症状に対する実施例１３の被検物の影響を示すグラフである。
【図28】脳梗塞面積に対する実施例１３の被検物の影響を示すグラフである。
【図29】実施例１３の動物実験におけるモデル群、偽手術群の脳切片写真を示す図である。
【図30】実施例１３の動物実験における異なるＰＥＧで修飾したｈＫＬＫ１突然変異体投与群の脳切片写真を示す図である。
【図31】神経欠損症状に対する実施例１４の被検物の影響を示すグラフである。
【図32】脳梗塞面積に対する実施例１４の被検物の影響を示すグラフである。
【図33】実施例１４の動物実験におけるモデル群、偽手術群の脳切片写真を示す図である。
【図34】実施例１４の動物実験における投与群の脳切片写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0044】
特に明記しない限り、本発明における技術用語または略語は次の意味を持つ。
カリクレイン１：特に組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）を指す。
カリクレイン１：特に組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）を指す。
【0045】
ｈＫＬＫ１：配列が天然ヒト組織カリクレイン１と同一である未変異のヒト組織カリクレイン１を指し、ヒトＫＬＫ１の種々のホモログを含み、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１、ＮＰ００２２４８．１、ＡＡＡ３６１３６．１、ＡＡＰ３５９１７、ＡＡＵ１２５６９などで登録されたＫＬＫ１を含むが、これらに限定されない。
【0046】
ＫＬＫ１の３つのグリコシル化修飾部位Ｎ７８、Ｎ８４とＮ１４１：それぞれは、ＫＬＫ１アミノ酸配列の７８位、８４位、１４１位のアスパラギンを指し、該当するＮ‐グリコシル化トライアド配列モチーフはそれぞれＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳである。Ｎはアスパラギンを表し、Ｍはメチオニンを表し、Ｓはセリンを表し、Ｈはヒスチジンを表し、Ｔはトレオニンを表し、Ｆはフェニルアラニンを表す。
【0047】
高グリコシル化ｈＫＬＫ１：未変異のｈＫＬＫ１であり、高グリコシル化修飾されている。すなわち、グリコシル化修飾部位Ｎ７８、Ｎ８４、Ｎ１４１には、いずれも多くのグリコシル化修飾がある。
【0048】
低グリコシル化ｈＫＬＫ１：未変異のｈＫＬＫ１であり、低グリコシル化修飾されている。すなわち、グリコシル化修飾部位Ｎ７８、Ｎ８４には、ともに多くのグリコシル化修
飾があるが、グリコシル化修飾部位Ｎ１４１には、グリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾が起こった。
飾があるが、グリコシル化修飾部位Ｎ１４１には、グリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾が起こった。
【0049】
ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）：ポリエチレングリコールにより修飾された高グリコシル化ｈＫＬＫ１である。前記高グリコシル化ｈＫＬＫ１は前記未変異の高グリコシル化修飾を有するｈＫＬＫ１を指す。
【0050】
ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）：ポリエチレングリコールにより修飾された低グリコシル化ｈＫＬＫ１である。前記低グリコシル化ｈＫＬＫ１は前記未変異の低グリコシル化修飾を有するｈＫＬＫ１を指す。
【0051】
ｈＫＬＫ１Ｘ：ｈＫＬＫ１の突然変異体である。ｈＫＬＫ１Ｘ１、ｈＫＬＫ１Ｘ２、ｈＫＬＫ１Ｘ３、ｈＫＬＫ１Ｘ４はそれぞれ異なる突然変異体を表す。
【0052】
ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１Ｘ：ポリエチレングリコールにより修飾されたｈＫＬＫ１突然変異体である。
【0053】
ＫＬＫ１誘導体：本発明のＫＬＫ１突然変異体全長タンパク質を含めば、本発明のＫＬＫ１突然変異体タンパク質の一部、または本発明のＫＬＫ１突然変異体を元にさらに突然変異されて得られたタンパク質、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限られない）、種々の方式で修飾された修飾体（ポリエチレングリコール化修飾体を除く）をも含む。
【0054】
ポリエチレングリコール：略称がＰＥＧであり、通常、エチレンオキシドの重合により形成され、分岐型、直鎖型と多腕型がある。一般に、分子量が２０，０００以下のものをＰＥＧ、より大きい分子量のものをＰＥＯと呼ぶ。通常のポリエチレングリコールは両末端にヒドロキシ基があり、片末端をメチル基でブロックするとメトキシ・ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が得られる。
【0055】
ポリエチレングリコール修飾剤：略称がＰＥＧ修飾剤であり、官能基を持つポリエチレングリコール誘導体のことを指し、タンパク質とポリペプチドの薬物の修飾に用いられる活性化されたポリエチレングリコールである。本発明で使用するポリエチレングリコール修飾剤は、江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司または北京鍵凱科技股分有限公司から購入している。特定の分子量のＰＥＧ修飾剤の実際の分子量は、標示された値の９０％～１１０％であってよい。例えばＰＥＧ５Ｋの分子量は４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａであってよい。
【0056】
実施例で使用するＰＥＧ５Ｋは、具体的にＭ‐ＳＰＡ‐５Ｋのことを指し、それは分子量が約５ｋＤａの直鎖型メトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは１０５～１１０の整数である。
【0057】
【化5】
（１）
【0058】
実施例で使用するＰＥＧ１０Ｋは、具体的にはＭ‐ＳＰＡ‐１０Ｋのことを指し、それは分子量が約１０ｋＤａの直鎖型メトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは２２０～２２５の整数である。
【0059】
実施例で使用するＰＥＧ３０Ｋは、具体的にＹ‐ＰＡＬＤ‐３０Ｋのことを指し、それは分子量が約３０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒドであり、構造式は式（２）に示される通りである。式中、ｍは３３５～３４０の整数である。
【0060】
【化6】
（２）
【0061】
実施例で使用するＰＥＧ４０Ｋは、具体的にＹ‐ＰＡＬＤ‐４０Ｋのことを指し、それは分子量が約４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒドであり、構造式は式（２）に示される通りである。式中、ｍは４５０～４５５の整数である。
【実施例】
【0062】
実施例１ 組換えヒトカリクレイン１（ｈＫＬＫ１）の遺伝子設計、発現ベクター構築、発現、精製
（一）遺伝子設計と発現ベクター構築
ＧｅｎＢａｎｋで公開されているｈＫＬＫ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５９４５５．１）の情報に基づき、コドン最適化を行なって、成熟した産物のアミノ酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：１）およびシグナルペプチドとプロペプチドを含むｈＫＬＫ１ ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）を決定した。組替えｈＫＬＫ１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）の前にＡｖｒＩＩ制限酵素サイト配列を付加し、配列末端にＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイト配列を付加して合成を行なった。合成した遺伝子をｐＵＣ５７プラスミドに構築し、得られた長期保存プラスミドをｐＵＣ５７‐ｈＫＬＫ１プラスミドと名付けた。プライマーを用いてｐＵＣ５７‐ｈＫＬＫ１プラスミドからｈＫＬＫ１遺伝子を増幅した。１％アガロース電気泳動でＰＣＲ産物を回収し、ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉにより目的遺伝子ＰＣＲ回収産物（図１）とｐＺＨＫ２．０ベクター（図２）を二重消化し、消化された目的遺伝子をＴ４リガーゼを用いてｐＺＨＫ２．０ベクターに連結し、そしてＴｏｐ１０コンピテントセルに転換し、カナマイシン耐性を有するＬＢプレートに塗り、３７℃で一晩培養した。翌日、陽性クローンをスクリーニングし、シーケンシングして比較したところ、予想された配列と完全に一致していた。これで、ｐＺＨＫ２．０‐ｈＫＬＫ１発現ベクターを作製した。
（一）遺伝子設計と発現ベクター構築
ＧｅｎＢａｎｋで公開されているｈＫＬＫ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５９４５５．１）の情報に基づき、コドン最適化を行なって、成熟した産物のアミノ酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：１）およびシグナルペプチドとプロペプチドを含むｈＫＬＫ１ ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）を決定した。組替えｈＫＬＫ１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）の前にＡｖｒＩＩ制限酵素サイト配列を付加し、配列末端にＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイト配列を付加して合成を行なった。合成した遺伝子をｐＵＣ５７プラスミドに構築し、得られた長期保存プラスミドをｐＵＣ５７‐ｈＫＬＫ１プラスミドと名付けた。プライマーを用いてｐＵＣ５７‐ｈＫＬＫ１プラスミドからｈＫＬＫ１遺伝子を増幅した。１％アガロース電気泳動でＰＣＲ産物を回収し、ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉにより目的遺伝子ＰＣＲ回収産物（図１）とｐＺＨＫ２．０ベクター（図２）を二重消化し、消化された目的遺伝子をＴ４リガーゼを用いてｐＺＨＫ２．０ベクターに連結し、そしてＴｏｐ１０コンピテントセルに転換し、カナマイシン耐性を有するＬＢプレートに塗り、３７℃で一晩培養した。翌日、陽性クローンをスクリーニングし、シーケンシングして比較したところ、予想された配列と完全に一致していた。これで、ｐＺＨＫ２．０‐ｈＫＬＫ１発現ベクターを作製した。
【0063】
（二）安定的発現
上記で構築したプラスミドを、ＮｒｕＩ（Ｒ０１９２Ｓ、ＮＥＢ社から購入）でのオーバーナイト酵素消化により線状化させて、エレクトロポレーションによりＣＨＯ‐Ｓ細胞に導入した後、選択圧を加えてスクリーニングを行なって安定した細胞株を得た。組換えｈＫＬＫ１を高発現するＣＨＯ安定発現細胞株をＤｙｎａｍｉｓ培地（Ａ２６１７５０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入）に接種し、３７℃、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍでフェドバッチ流加培養し、２週間培養後に培養液を回収した。
上記で構築したプラスミドを、ＮｒｕＩ（Ｒ０１９２Ｓ、ＮＥＢ社から購入）でのオーバーナイト酵素消化により線状化させて、エレクトロポレーションによりＣＨＯ‐Ｓ細胞に導入した後、選択圧を加えてスクリーニングを行なって安定した細胞株を得た。組換えｈＫＬＫ１を高発現するＣＨＯ安定発現細胞株をＤｙｎａｍｉｓ培地（Ａ２６１７５０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入）に接種し、３７℃、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍでフェドバッチ流加培養し、２週間培養後に培養液を回収した。
【0064】
（三）精製
１、培養液の前処理
組換えｈＫＬＫ１を含む上記の培養液を収集し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を除去し、限外ろ過によって濃縮させ、０．２２μｍの膜でろ過して細胞破片を除去した。１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、室温で３日間撹拌して活性化させた。活性化した培養液を０．４５μｍ精密ろ過膜に通してろ過することによって清澄化させた。
１、培養液の前処理
組換えｈＫＬＫ１を含む上記の培養液を収集し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を除去し、限外ろ過によって濃縮させ、０．２２μｍの膜でろ過して細胞破片を除去した。１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、室温で３日間撹拌して活性化させた。活性化した培養液を０．４５μｍ精密ろ過膜に通してろ過することによって清澄化させた。
【0065】
２、疎水クロマトグラフィー
まず、緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ＝８．０）を用いて、ベースラインが平衡になるまでカラムを平衡化した。その後、前処理した上清をミディアムＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌ（Ａ３２５６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入）に通して、培地から組換えｈＫＬＫ１を捕捉した。その後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０でグラディエント溶離を行って、疎水性により分離された２つのピークがはっきりと出現した。各溶出ピークを収集して、異なるグリコシル化修飾度の組換えｈＫＬＫ１タンパク質がこれで分離された。溶出ピークのクロマトグラムが図３に示す通りである。
まず、緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ＝８．０）を用いて、ベースラインが平衡になるまでカラムを平衡化した。その後、前処理した上清をミディアムＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌ（Ａ３２５６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入）に通して、培地から組換えｈＫＬＫ１を捕捉した。その後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０でグラディエント溶離を行って、疎水性により分離された２つのピークがはっきりと出現した。各溶出ピークを収集して、異なるグリコシル化修飾度の組換えｈＫＬＫ１タンパク質がこれで分離された。溶出ピークのクロマトグラムが図３に示す通りである。
【0066】
３、陰イオン交換
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０緩衝液を用いて、ステップ２で収集した組換えｈＫＬＫ１タンパク質を含む溶出ピークを１０ｋＤａの限外ろ過膜で電気伝導が１０‐１５ｍｓ／ｃｍになるまで限外濾過した。緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）を使用して、ベースラインが平衡になるまでカラムを平衡化した。その後、限外濾過で前処理した上清をミディアムＱ ＦＦ（１７５１５６０１、ＧＥ社から購入）に通して、最後に、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）を用いてカラムをイソクラティック溶離して、主要な溶出ピークを収集した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０緩衝液を用いて、ステップ２で収集した組換えｈＫＬＫ１タンパク質を含む溶出ピークを１０ｋＤａの限外ろ過膜で電気伝導が１０‐１５ｍｓ／ｃｍになるまで限外濾過した。緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）を使用して、ベースラインが平衡になるまでカラムを平衡化した。その後、限外濾過で前処理した上清をミディアムＱ ＦＦ（１７５１５６０１、ＧＥ社から購入）に通して、最後に、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）を用いてカラムをイソクラティック溶離して、主要な溶出ピークを収集した。
【0067】
４、陽イオン交換
ステップ３のサンプルに対して限外濾過を行ってサンプルを１０ｍＭ ＮａＡｃ‐ＨＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝３．５‐３．７へ交換した。ミディアムＳＰ ＦＦ（１７０７２９０４、ＧＥ社から購入）を用いて、前のステップで収集した異なる分子量の組換えｈＫＬＫ１に対して高度精製を行った。平衡緩衝液は１０ｍＭ ＮａＡｃ‐ＨＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝３．７であり、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０であった。
ステップ３のサンプルに対して限外濾過を行ってサンプルを１０ｍＭ ＮａＡｃ‐ＨＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝３．５‐３．７へ交換した。ミディアムＳＰ ＦＦ（１７０７２９０４、ＧＥ社から購入）を用いて、前のステップで収集した異なる分子量の組換えｈＫＬＫ１に対して高度精製を行った。平衡緩衝液は１０ｍＭ ＮａＡｃ‐ＨＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝３．７であり、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０であった。
【0068】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動により、精製したサンプルの純度を分析した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動図で示された結果、高グリコシル化ｈＫＬＫ１タンパク質の分子量は低グリコシル化ｈＫＬＫ１タンパク質の分子量より少し高かった。結果は図４に示す通りである。
【0069】
実施例２ 組換えヒトカリクレイン１（ｈＫＬＫ１）の３バッチ連続生産及び品質特性解析
７Ｌ撹拌型リアクターで野生型組換えｈＫＬＫ１の高密度連続培養を３バッチ実施した。初期培養条件は以下の通りである：回転速度１００ｒｐｍ、溶存酸素４０％、温度３７℃、ｐＨ値７．０、基礎培地Ｄｙｎａｍｉｓ ＡＧＴ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）。種子懸濁液を採取して５×１０ｅ５ ｃｅｌｌ／ｍＬの密度でバイオリアクターに接種した。３日目に温度を３３℃に調整して、フィード培地（フィード培地はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ Ｃ＋ＡＧＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔである）とグルコースを別々で補充し、培養液の糖含量を２ｇ／Ｌ以下にならないように維持し、細胞生存率が９０％以下になったら、培養液を収集し、実施例１で述べた精製工程により精製
を行って、高グリコシル化組換えｈＫＬＫ１と低グリコシル化組換えｈＫＬＫ１をそれぞれ３バッチ得られた。
７Ｌ撹拌型リアクターで野生型組換えｈＫＬＫ１の高密度連続培養を３バッチ実施した。初期培養条件は以下の通りである：回転速度１００ｒｐｍ、溶存酸素４０％、温度３７℃、ｐＨ値７．０、基礎培地Ｄｙｎａｍｉｓ ＡＧＴ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）。種子懸濁液を採取して５×１０ｅ５ ｃｅｌｌ／ｍＬの密度でバイオリアクターに接種した。３日目に温度を３３℃に調整して、フィード培地（フィード培地はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ Ｃ＋ＡＧＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔである）とグルコースを別々で補充し、培養液の糖含量を２ｇ／Ｌ以下にならないように維持し、細胞生存率が９０％以下になったら、培養液を収集し、実施例１で述べた精製工程により精製
を行って、高グリコシル化組換えｈＫＬＫ１と低グリコシル化組換えｈＫＬＫ１をそれぞれ３バッチ得られた。
【0070】
これらのサンプルに対してタンパク質の品質特性解析を実施した。解析内容は、産量、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ純度、ＬＣ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）によるＮ／Ｃ末端アミノ酸配列・ペプチドマッピング・グリコシル化修飾部位・グリコシル化修飾の解析などを含む。結果を以下のようにまとめた。
【0071】
【表2】
【0072】
上記の表に示した分析結果は下記のことを表した。単離された高グリコシル化組換えｈＫＬＫ１と低グリコシル化組換えｈＫＬＫ１の純度はすべて９７％以上に達しており、高グリコシル化タンパク質と低グリコシル化タンパク質の分子量には差がある。Ｔｒｙｐｓｉｎ酵素消化を基にした高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１のアミノ酸配列カバー率の測定によると、低グリコシル化ｈＫＬＫ１は１００％のカバー率を達成しており、高グリコシル化ｈＫＬＫ１は一部で１００％のカバー率を達成したが、一部の産物はＮ末端に配列の欠損があった（図８、９）。低グリコシル化ｈＫＬＫ１のＮ／Ｃ末端の配列は理論的配列と一致しており（表６～８）、３バッチのペプチドマップの特性は一致している（図１１）。しかし、高グリコシル化タンパク質は３バッチ連続生産工程のバッチ２において、一部のタンパク質成分のＮ末端配列と理論的配列と一致しておらず、配列の欠損が発生した（表３～５）。そしてバッチ２のペプチドマップはバッチ１、バッチ３のペプチドマップと一致していなかった（図１０）。これは高グリコシル化組換えｈＫＬＫ１の分子に安定性上の欠陥がある可能性を示唆している。これは大きなリスクを薬物生産プロセスに引き込むことに繋がると考えられる。また、高グリコシル化と低グリコシル化の分離・精製工程も比較的に複雑であり、工程の不安定性が原因で、異なるバッチでの精製産物のグリコシル化レベルを制御することも困難になると考えられる。
【0073】
【表3】
【0074】
【表4】
【0075】
【表5】
【0076】
【表6】
【0077】
【表7】
【0078】
【表8】
【0079】
【表9】
【0080】
さらに、組換えｈＫＬＫ１のグリコシル化修飾部位の解析結果は下記のことを表した。組換え低グリコシル化ｈＫＬＫ１は、すべてＮ７８、Ｎ８４にグリコシル修飾があり、ほとんどＮ１４１にグリコシル化修飾が起こらなかった（９６．３９％）。Ｎ１４１にグリコシル化修飾があったのはごく少量のｈＫＬＫ１のみであった（４％未満）（表９）。一方、高グリコシルｈＫＬＫ１は３つのＮ‐グリコシル化修飾部位（Ｎ７８、Ｎ８４、Ｎ１４１）を含み、多種多様なグリコシル化修飾があり、グリコフォームの種類が複雑である。
【0081】
実施例１で行った疎水クロマトグラフィーによる高グリコシル化タンパク質と低グリコシル化タンパク質の溶出ピークを合併して、同様に続きの陰イオン交換精製、陽イオン交換精製を行って、高グリコシル化と低グリコシル化が混在する組換えｈＫＬＫ１タンパク質を取得した。精製したサンプルの純度をＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析し、結果を図７に示している。結果によれば、高グリコシル化タンパク質と低グリコシル化タンパク質が拡散するようなバンドを形成し、高グリコシル化タンパク質の上にさらに分子量の大きい成分が存在することがわかった。図３に示すように、疎水精製で未変異の組換えｈＫＬＫ１から高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１を分離する際の分離度がよくなく、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１を完全に分離することは困難である。要するに、未変異のｈＫＬＫ１の原タンパク質は、分子量の異なる高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１が混在しており、Ｎ１４１に不均一で複雑なグリコシル化修飾度があり、これは組換えｈＫＬＫ１の品質管理に大きな課題をもたらしている。
【0082】
さらに、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１の生物学的活性を比較したら（実施例６）、驚くべきことに、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の活性は高グリコシル化ｈＫＬＫ１の活性より、はるかに高いことが判明した。
【0083】
実施例３ 組換えヒトカリクレイン１突然変異体（ｈＫＬＫ１Ｘ）の設計、発現ベクターの構築、発現、精製
さらに、本発明の出願人は低グリコシル化ｈＫＬＫ１を取得するために、従来法のように組換えｈＫＬＫ１の発現と精製条件の最適化に多く取り組むのではなく、前記の高・低グリコシル化ｈＫＬＫ１に対する研究を基に、ＮＦＳ配列モチーフのアミノ酸を１個、または複数個突然変異させ、該当位置でグリコシル化修飾が起らないようにした。これにより、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高い突然変異体を得た。さらに驚くことに、低グリコシル化突然変異体は未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１と比較して、酵素学的性質や活性などの面においてさらなる利点があることがその後の実験で分かった。
さらに、本発明の出願人は低グリコシル化ｈＫＬＫ１を取得するために、従来法のように組換えｈＫＬＫ１の発現と精製条件の最適化に多く取り組むのではなく、前記の高・低グリコシル化ｈＫＬＫ１に対する研究を基に、ＮＦＳ配列モチーフのアミノ酸を１個、または複数個突然変異させ、該当位置でグリコシル化修飾が起らないようにした。これにより、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高い突然変異体を得た。さらに驚くことに、低グリコシル化突然変異体は未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１と比較して、酵素学的性質や活性などの面においてさらなる利点があることがその後の実験で分かった。
【0084】
本実施例で挙げた突然変異体は、ＮＦＳ配列モチーフ中のＮ（即ちＮ１４１）が突然変異され、ＮＦＳ配列モチーフ中のＦ、Ｓが突然変異されなかった。ただし、これらの例は例示を目的とするものであり、本発明の適用範囲を限定するものではない。以下の方法はいずれも元のＮＦＳ配列を変更してＮ‐グリコシル化モチーフを形成させないことにより、Ｎ１４１にグリコシル化修飾が起こらないようにすることができる。たとえば、ＮＦＳ中のアミノ酸Ｎ（即ちＮ１４１）を突然変異させ、Ｆ、Ｓ中の０個、１個、あるいは２個のアミノ酸をほかの任意のアミノ酸に突然変異させることや、ＮＦＳ中のＦ（即ちＦ１４２）をプロリンに突然変異させ、Ｎ、Ｓ中の０個、１個、あるいは２個のアミノ酸をほかの任意のアミノ酸に突然変異させること、またはＮＦＳ中のＳ（即ちＳ１４３）をトレオニン以外の任意のアミノ酸に突然変異させ、Ｎ、Ｆ中の０個、１個、あるいは２個のアミノ酸をほかの任意のアミノ酸に突然変異させることなど。前述の方法は、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高いことを実現すると同時に、得られた突然変異体は変異前と比較して酵素学的性質や活性などの面で更なる利点がある。これは元のＮＦＳ配列でグリコシル化修飾が起こらないことと関係していると考えられる。
【0085】
また、本実施例はＧｅｎｂａｎｋに登録番号ＡＡＡ５９４５５．１で登録されたｈＫＬＫ１配列に基づいた突然変異体を挙げるが、これは例示するものであり、本発明の適用範囲を限定するものではない。ほかの既知のｈＫＬＫ１天然変異体のアミノ酸組成及びグリコシル化修飾部位が高度に一致しているが、ほかのｈＫＬＫ１の天然変異体の相応する位置で（即ち、ＮＦＳ配列モチーフの１個または複数個のアミノ酸）突然変異を行なっても同様な技術的効果が実現できる。即ち、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高く、活性がより良い目的産物を得られる。ほかの霊長類動物のＫＬＫ１はすべてｈＫＬＫ１と同様に３種類のＮ‐グリコシル化修飾部位を含み、トライアド配列モチーフも同じで、いずれもＮＭＳ、ＮＨＴ、ＮＦＳである。ほかの霊長類動物ＫＬＫ１の天然アミノ酸配列の相応する位置で（即ち、ＮＦＳ配列モチーフの１個または複数個のアミノ酸）突然変異を行なっても同様な技術的効果が実現できる。即ち、産物がより均一で、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の産量がより高く、活性がより良い目的産物を得られる。
【0086】
本実施例が例示する具体的な突然変異のパターンは以下の通りである。
グリコシル化修飾部位Ｎ１４１に対して部位特異的変異を行い、アスパラギンを極性中性アミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ）、酸性アミノ酸アスパラギン酸（Ａｓｐ）、塩基性アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）、脂肪族アミノ酸アラニン（Ａｌａ）といった異なる４種類のアミノ酸にそれぞれ突然変異させて、得られたｈＫＬＫ１突然変異体をそれぞれｈＫＬＫ１Ｘ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）、ｈＫＬＫ１Ｘ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）、ｈＫＬＫ１Ｘ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）、ｈＫＬＫ１Ｘ４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）と命名する。実施例１の作製方法で各突然変異体を作製した。
グリコシル化修飾部位Ｎ１４１に対して部位特異的変異を行い、アスパラギンを極性中性アミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ）、酸性アミノ酸アスパラギン酸（Ａｓｐ）、塩基性アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）、脂肪族アミノ酸アラニン（Ａｌａ）といった異なる４種類のアミノ酸にそれぞれ突然変異させて、得られたｈＫＬＫ１突然変異体をそれぞれｈＫＬＫ１Ｘ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）、ｈＫＬＫ１Ｘ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）、ｈＫＬＫ１Ｘ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）、ｈＫＬＫ１Ｘ４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）と命名する。実施例１の作製方法で各突然変異体を作製した。
【0087】
上述の組換えｈＫＬＫ１突然変異体は実施例１の三段階精製により精製された。突然変異体の疎水精製クロマトグラムに、疎水溶出による主要な溶出ピークがいずれも一つのみ出現した。ｈＫＬＫ１Ｘ１を例に取ると、図５に示されているその疎水クロマトグラフィー溶出クロマトグラムより、突然変異後の産物がより均一であることが分かった。未変異の組換えｈＫＬＫ１は、精製工程により高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１を分離する分離度が良くないので（図３）、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１を完全に分離することが困難である。突然変異後の組換えｈＫＬｋ１は、疎水クロマトグラフィーによる精製では一つだけの主要ピークを収集してよいので、精製工程がより簡単になった。
【0088】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動により精製したサンプルの純度を分析した。各突然変異体の精製サンプルの分子量は未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１と非常に近いことが確認
され、Ｎ１４１での糖修飾を多く含む高グリコシル化ｈＫＬＫ１が完全になくなり（図６）、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の割合がより高く、産量がより高く、産物がより均一であることが分かった。
され、Ｎ１４１での糖修飾を多く含む高グリコシル化ｈＫＬＫ１が完全になくなり（図６）、低グリコシル化ｈＫＬＫ１の割合がより高く、産量がより高く、産物がより均一であることが分かった。
【0089】
ＬＣ‐ＭＳに基づいて組換えｈＫＬＫ１のアミノ酸カバー率の測定と解析を行なった。理論的アミノ酸配列とのカバー率が１００％であった（図１２）ことから、組換えｈＫＬＫ１の一次配列の正確性が確認された。また、グリコシル化修飾部位の同定を行い、組換えｈＫＬＫ１は２つのグリコシル化修飾部位（Ｎ７８とＮ８４）のみを含み、分子設計目標と一致している。ほかの突然変異体も同様な結果を示した。
【0090】
【表10】
【0091】
実施例４ 突然変異前と後のタンパク質サンプル脱グリコシル化処理後のＭＳ分子量測定
ＬＣ‐ＭＳにより、突然変異前と後の組換えタンパク質の脱グリコシル化された後の分子量を測定した。組換えタンパク質を塩酸グアニジンで変性させ、糖切断酵素ＰＮＧａｓｅＦで酵素消化した後、分子量測定を行った。高グリコシル化ｈＫＬＫ１の脱グリコシル化後の分子量が２６３８０．３３８Ｄａであり、理論的分子量２６３７７．４９３Ｄａとほぼ一致している（表１１）。低グリコシル化ｈＫＬＫ１脱グリコシル化後の分子量が２６３７９．３４６Ｄａであり、理論的分子量２６４１８．４８Ｄａとほぼ一致している（表１１）。ｈＫＬＫ１Ｘ１脱グリコシル化後の分子量が２６４１８．８２Ｄａであり、理論的分子量２６４１８．４８Ｄａとほぼ一致している（表１１）。ｈＫＬＫ１Ｘ２、ｈＫＬＫ１Ｘ３、ｈＫＬＫ１Ｘ４の脱グリコシル化後の分子量も理論的分子量とほぼ一致している。上記の結果よりこれらの組換えタンパク質の一次構造の正確性がさらに確認された。
ＬＣ‐ＭＳにより、突然変異前と後の組換えタンパク質の脱グリコシル化された後の分子量を測定した。組換えタンパク質を塩酸グアニジンで変性させ、糖切断酵素ＰＮＧａｓｅＦで酵素消化した後、分子量測定を行った。高グリコシル化ｈＫＬＫ１の脱グリコシル化後の分子量が２６３８０．３３８Ｄａであり、理論的分子量２６３７７．４９３Ｄａとほぼ一致している（表１１）。低グリコシル化ｈＫＬＫ１脱グリコシル化後の分子量が２６３７９．３４６Ｄａであり、理論的分子量２６４１８．４８Ｄａとほぼ一致している（表１１）。ｈＫＬＫ１Ｘ１脱グリコシル化後の分子量が２６４１８．８２Ｄａであり、理論的分子量２６４１８．４８Ｄａとほぼ一致している（表１１）。ｈＫＬＫ１Ｘ２、ｈＫＬＫ１Ｘ３、ｈＫＬＫ１Ｘ４の脱グリコシル化後の分子量も理論的分子量とほぼ一致している。上記の結果よりこれらの組換えタンパク質の一次構造の正確性がさらに確認された。
【0092】
【表11】
【0093】
実施例５ ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１／ｈＫＬＫ１Ｘサンプルの作製、精製及び純度分析
異なるＰＥＧで修飾するｈＫＬＫ１／ｈＫＬＫ１Ｘサンプルは通常な方法で作製・精製することができる。本実施例は以下に例示するように例を挙げる。
異なるＰＥＧで修飾するｈＫＬＫ１／ｈＫＬＫ１Ｘサンプルは通常な方法で作製・精製することができる。本実施例は以下に例示するように例を挙げる。
【0094】
一、ＰＥＧ修飾サンプルの作製
（１）前処理
未変異の低グリコシル化組換えｈＫＬＫ１の原タンパク質を取って、３ｋＤａの限外ろ過膜（または同等の効果があるほかの緩衝液置換方法）を用いて処理し、緩衝液をリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液に置換し、ｐＨ７．０、同時にタンパク質濃度を１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
（１）前処理
未変異の低グリコシル化組換えｈＫＬＫ１の原タンパク質を取って、３ｋＤａの限外ろ過膜（または同等の効果があるほかの緩衝液置換方法）を用いて処理し、緩衝液をリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液に置換し、ｐＨ７．０、同時にタンパク質濃度を１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【0095】
（２）フィード・修飾
ランダム修飾ＰＥＧ５Ｋ－ｈＫＬＫ１の作製：ｈＫＬＫ１タンパク質とＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ５Ｋの質量比が１：２５であるように、前処理したｈＫＬＫ１タンパク質溶液にＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ５Ｋを加え、ゆっくりと攪拌して均一に混合させ、その後４℃の条件下で、２４時間反応させた。
ランダム修飾ＰＥＧ５Ｋ－ｈＫＬＫ１の作製：ｈＫＬＫ１タンパク質とＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ５Ｋの質量比が１：２５であるように、前処理したｈＫＬＫ１タンパク質溶液にＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ５Ｋを加え、ゆっくりと攪拌して均一に混合させ、その後４℃の条件下で、２４時間反応させた。
【0096】
ランダム修飾ＰＥＧ１０Ｋ－ｈＫＬＫ１の作製：ｈＫＬＫ１タンパク質とＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ１０Ｋの質量比が１：２０であるように、前処理したｈＫＬＫ１タンパク質溶液にＭ‐ＳＡＰ‐ＰＥＧ１０Ｋを加え、ゆっくりと攪拌して均一に混合させ、その後４℃の条件下で、２４時間反応させた。
【0097】
部位特異的修飾ＰＥＧ３０Ｋ－ｈＫＬＫ１の作製：ｈＫＬＫ１タンパク質とＹ‐ＰＡＬＤ‐ＰＥＧ３０Ｋのモル比が１：６であるように、前処理したｈＫＬＫ１タンパク質溶液にＹ‐ＰＡＬＤ‐ＰＥＧ３０Ｋを加え、ＰＥＧと還元剤（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）のモル比が１：５０であるように、ＰＥＧ３０Ｋとタンパク質の混合溶液に還元剤を加え、ゆっくりと攪拌して均一に混合させ、その後４℃の条件下で、２４時間反応させた。
【0098】
部位特異的修飾ＰＥＧ４０Ｋ－ｈＫＬＫ１の作製：ｈＫＬＫ１タンパク質とＹ‐ＰＡＬＤ‐ＰＥＧ４０Ｋのモル比が１：６であるように、前処理したｈＫＬＫ１タンパク質溶液にＹ‐ＰＡＬＤ‐ＰＥＧ４０Ｋを加え、ＰＥＧと還元剤（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）のモル比が１：５０であるように、ＰＥＧ４０Ｋとタンパク質の混合溶液に還元剤を加え、ゆっくりと攪拌して均一に混合させ、その後４℃の条件下で、２４時間反応させた。
【0099】
二、反応混合物の精製
クロマトグラフィーの条件は次の通りである。
精製用充填剤はＧＥ社のＱ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅミディアムを使用し、精製の移動相ＢｕｆｆｅｒＡは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ９
．０であり、ＢｕｆｆｅｒＢは50ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣｌ９．０である
。
サンプルローディング：反応終了後の上述のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１修飾反応混合物を取り、再蒸留水で約１０倍に希釈し、さらに緩衝液ＢｕｆｆｅｒＡで約５倍に希釈して、サンプルをロードして精製を行った。サンプルローディングが終わったら、緩衝液ＢｕｆｆｅｒＡを使用して５カラムベッド体積以上でクロマトカラムを洗浄した。
クロマトグラフィーの条件は次の通りである。
精製用充填剤はＧＥ社のＱ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅミディアムを使用し、精製の移動相ＢｕｆｆｅｒＡは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ９
．０であり、ＢｕｆｆｅｒＢは50ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣｌ９．０である
。
サンプルローディング：反応終了後の上述のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１修飾反応混合物を取り、再蒸留水で約１０倍に希釈し、さらに緩衝液ＢｕｆｆｅｒＡで約５倍に希釈して、サンプルをロードして精製を行った。サンプルローディングが終わったら、緩衝液ＢｕｆｆｅｒＡを使用して５カラムベッド体積以上でクロマトカラムを洗浄した。
【0100】
溶出：０‐５０％のＢｕｆｆｅｒＢグラジエントを設定して１０カラムベッド体積で溶出を行い、ＵＶ２８０のトレンドに基づいて溶出サンプルを段階的に収集した。
【0101】
ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１突然変異体（ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１Ｘ）は上記の方法を参考して作製、精製した。
【0102】
三、ＰＥＧ修飾サンプルの純度分析
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考して測定を実施した。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は５％イソプロパノールを含んだ２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０緩衝液で、クロマトグラフィーカラムはＢＥＨ４５０ ＳＥＣ ３．５μｍで、収集条件は２８０ｎｍで、収集時間は２０～２５分間であった。
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考して測定を実施した。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は５％イソプロパノールを含んだ２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０緩衝液で、クロマトグラフィーカラムはＢＥＨ４５０ ＳＥＣ ３．５μｍで、収集条件は２８０ｎｍで、収集時間は２０～２５分間であった。
【0103】
液相測定の結果によると、作製した一連のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１/ｈＫＬＫ１Ｘタンパク
質の純度はすべて≧９５％であった。
質の純度はすべて≧９５％であった。
【0104】
（２）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を実施した。１２.５％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
を調製してサンプルを測定した。
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を実施した。１２.５％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
を調製してサンプルを測定した。
【0105】
電気泳動の結果によると、作製した一連のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１／ｈＫＬＫ１Ｘタンパク質の分子バンドは均一であり、不純物バンドは見られず、純度が全て良好であった。
【0106】
（３）ＰＥＧ結合数の測定
ａ）溶液の調製：１、２、４、６、８ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ標準品溶液を調製し、１ｍｇ／ｍＬの組換えｈＫＬＫ１及びそのＰＥＧ修飾溶液を調製した。
ｂ）測定方法：
クロマトグラフィーカラム： ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ ３．５μｍ ４５０Ａ
；カラム温度： ２５℃。
移動相：２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０＋１０％ＩＰＡ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ。
検出器：ＰＤＡ検出器、検出波長２８０ｎｍ；ＲＩ検出器、検出波長２８０ｎｍ。
ａ）溶液の調製：１、２、４、６、８ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ標準品溶液を調製し、１ｍｇ／ｍＬの組換えｈＫＬＫ１及びそのＰＥＧ修飾溶液を調製した。
ｂ）測定方法：
クロマトグラフィーカラム： ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ ３．５μｍ ４５０Ａ
；カラム温度： ２５℃。
移動相：２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０＋１０％ＩＰＡ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ。
検出器：ＰＤＡ検出器、検出波長２８０ｎｍ；ＲＩ検出器、検出波長２８０ｎｍ。
【0107】
ｃ）データ分析：
供試品（ＰＥＧ修飾）の濃度実測値＝供試品（ＰＥＧ修飾）のＰＤＡ検出器によるピーク面積／未修飾原タンパク質のＰＤＡ検出器によるピーク面積×１.０
サンプル中のＰＥＧピーク面積＝（供試品（ＰＥＧ修飾）のＲＩ検出器によるピーク面積／供試品（ＰＥＧ修飾）の濃度実測値）－（未修飾原タンパク質のＲＩ検出器によるピーク面積／未修飾原タンパク質の濃度）
供試品（ＰＥＧ修飾）の濃度実測値＝供試品（ＰＥＧ修飾）のＰＤＡ検出器によるピーク面積／未修飾原タンパク質のＰＤＡ検出器によるピーク面積×１.０
サンプル中のＰＥＧピーク面積＝（供試品（ＰＥＧ修飾）のＲＩ検出器によるピーク面積／供試品（ＰＥＧ修飾）の濃度実測値）－（未修飾原タンパク質のＲＩ検出器によるピーク面積／未修飾原タンパク質の濃度）
【0108】
サンプル中のＰＥＧ濃度は、サンプル中のＰＥＧピーク面積をＰＥＧ標準曲線に代入して計算される。
【0109】
サンプル中のＰＥＧ結合数 ＝（サンプル中のＰＥＧ濃度／ＰＥＧ分子量）／（サンプル
タンパク質濃度／タンパク質分子量２６ｋＤ）
タンパク質濃度／タンパク質分子量２６ｋＤ）
【0110】
【表12】
【0111】
実施例６ 組換えヒトカリクレイン１（ｈＫＬＫ１）及びその突然変異体（ｈＫＬＫ１Ｘ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定
一、人工基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
ＫＬＫ１は生体内で低分子量キニノーゲンＬＭＷＫの加水分解を触媒して、リシルブラジキニンを遊離させて生物学的機能を発揮する。その加水分解反応にはアルギニン（Ａｒｇ）のカルボキシル基末端のペプチド結合の切断が含まれる。したがって、発色性人工合成基質Ｓ‐２２６６（Ｈ‐Ｄ‐Ｖａｌ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐ＰＮＡ）内のＡｒｇとパラニトロアニリンの間のアミド結合を切断してパラニトロアニリン（ＰＮＡ）を生成することに基づいて、４０５ｎｍにおけるＰＮＡの生成を検出することを通して、組換えｈＫＬＫ１およびその突然変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性を評価することが可能である。活性単位ＩＵは、３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、一分間で１μｍｏｌのＳ‐２２６６が加水分解されてＰＮＡを生成する場合の酵素量が１ＩＵであると定義されている。反応系は、２００μｌ ２０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、１０μｌの供試品、２０μｌ ２０ｍＭのＳ‐２２６６基質溶液で構成される。反応系を３７℃の水浴中で１０分間正確に反応させ、２０μｌの５０％酢酸溶液を加えて反応を停止させる。異なる濃度のＰＮＡ標準品に基づいてフィッティングした標準曲線によって反応系中のＰＮＡ生成量を定量する。上記の方法を用いて、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１、ｈＫＬＫ１突然変異体、およびｈＫＬＫ１‐ＰＥＧ修飾体サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学活性を測定した。
一、人工基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
ＫＬＫ１は生体内で低分子量キニノーゲンＬＭＷＫの加水分解を触媒して、リシルブラジキニンを遊離させて生物学的機能を発揮する。その加水分解反応にはアルギニン（Ａｒｇ）のカルボキシル基末端のペプチド結合の切断が含まれる。したがって、発色性人工合成基質Ｓ‐２２６６（Ｈ‐Ｄ‐Ｖａｌ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐ＰＮＡ）内のＡｒｇとパラニトロアニリンの間のアミド結合を切断してパラニトロアニリン（ＰＮＡ）を生成することに基づいて、４０５ｎｍにおけるＰＮＡの生成を検出することを通して、組換えｈＫＬＫ１およびその突然変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性を評価することが可能である。活性単位ＩＵは、３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、一分間で１μｍｏｌのＳ‐２２６６が加水分解されてＰＮＡを生成する場合の酵素量が１ＩＵであると定義されている。反応系は、２００μｌ ２０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、１０μｌの供試品、２０μｌ ２０ｍＭのＳ‐２２６６基質溶液で構成される。反応系を３７℃の水浴中で１０分間正確に反応させ、２０μｌの５０％酢酸溶液を加えて反応を停止させる。異なる濃度のＰＮＡ標準品に基づいてフィッティングした標準曲線によって反応系中のＰＮＡ生成量を定量する。上記の方法を用いて、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１、ｈＫＬＫ１突然変異体、およびｈＫＬＫ１‐ＰＥＧ修飾体サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学活性を測定した。
【0112】
結果は以下の表に示される通りである。低グリコシル化ｈＫＬＫ１（未変異）サンプルの活性は高グリコシル化ｈＫＬＫ１（未変異）サンプルの活性より著しく高かった。未変異タンパク質の一連のＰＥＧ修飾産物は、ランダム修飾の産物は部位特異的修飾の産物と比較して、より高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示し、その中でも特にＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）の活性が優れている。部位突然変異された突然変異体（ｈＫＬＫ１Ｘ１、ｈＫＬＫ１Ｘ２、ｈＫＬＫ１Ｘ３、ｈＫＬＫ１Ｘ４）サンプルの活性は、全て未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１サンプルより高かった。また、ＰＥＧ修飾体サンプルの活性は修飾前のｈＫＬＫ１Ｘ１タンパク質より若干低くなり、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１の活性はＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１より高く、ＰＥＧ１０Ｋ修飾後のタンパク質は原タンパク質の活性を大体保持している。
【0113】
【表13】
【0114】
二、天然基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定
１、酵素反応と液相測定
ＫＬＫ１は生体内で低分子量キニノーゲンＬＭＷＫの加水分解を触媒して、リシルブラジキニンを遊離させて生物学的機能を発揮する。本実施例では、基質（低分子量キニノーゲンＬＭＷＫ）と酵素（ＫＬＫ１またはそのＰＥＧ修飾体）を異なる比で酵素反応させてエフェクター分子であるブラジキニンの生成状況を比較する。逆相クロマトグラフィーにより生成したエフェクター分子を分離し、産物のピーク面積を計算し、基質と酵素が異なる比で反応した場合のブラジキニンの生成状況の曲線を描き、異なる供試品が同じ反応条件下で生成したエフェクター分子の量を比較した。こうして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて体内での作用様式を模擬して、異なる供試品サンプルの体内作用効果を間接的に比較した。
１、酵素反応と液相測定
ＫＬＫ１は生体内で低分子量キニノーゲンＬＭＷＫの加水分解を触媒して、リシルブラジキニンを遊離させて生物学的機能を発揮する。本実施例では、基質（低分子量キニノーゲンＬＭＷＫ）と酵素（ＫＬＫ１またはそのＰＥＧ修飾体）を異なる比で酵素反応させてエフェクター分子であるブラジキニンの生成状況を比較する。逆相クロマトグラフィーにより生成したエフェクター分子を分離し、産物のピーク面積を計算し、基質と酵素が異なる比で反応した場合のブラジキニンの生成状況の曲線を描き、異なる供試品が同じ反応条件下で生成したエフェクター分子の量を比較した。こうして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて体内での作用様式を模擬して、異なる供試品サンプルの体内作用効果を間接的に比較した。
【0115】
供試品中のｈＫＬＫ１Ｘ１は実施例３で述べた方法により作製され、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１は実施例５で述べた方法により作製され、Ｋｂはブタ膵臓より抽出されたＫＬＫ１であり、ＰＥＧ‐ＫｂはＰＥＧ１０Ｋ修飾Ｋｂである注射用膵臓カリクレイン１であり、実施例５を参考して作製された。
【0116】
下記の表に従って、サンプルを混合反応させた（ＰＥＧ修飾体サンプルの場合、修飾される活性物質のモル質量で換算する）。混合サンプルを３７℃の恒温器内に置き、正確に計時して、１５分間インキュベートし、体積比１０：１で５０％の酢酸溶液を加えて反応を停止させた。
【0117】
【表14】
【0118】
反応停止後のサンプルを卓上遠心機に置き、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取った。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ‐Ｃｌａｓｓ測定を実施し、移動相Ａは０．１％ ＴＦＡ‐Ｈ２Ｏであり、移動相Ｂは０．１％ ＴＦＡ‐ＡＣＮであり、測定波長は２１４ｎｍで、カラム温度は３０℃で、サンプルローディング量はすべて１０μｌであり、流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎで、実行時間は３５分間で、実行グラジエントは次の通りであった。
【0119】
【表15】
【0120】
２、結果
酵素反応混合物のＵＰＬＣクロマトグラムの結果に基づいて、反応混合物のクロマトグラム上の保持時間が１３±０．５ｍｉｎ（ブラジキニンのピーク位置）のピークに対して積分して和を求め、単位質量あたり（１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬのサンプルローディング量）のブラジキニンのピーク面積と比較して酵素反応で生成したブラジキニンの濃度を計算して、表１４の総反応系に基づいてブラジキニンの生成量を計算し、最後に各モル比条件下での１ｍｇ酵素あたりのブラジキニン生成量（μｇ／ｍｇ）に換算した。結果は表１６に示す通りである。
酵素反応混合物のＵＰＬＣクロマトグラムの結果に基づいて、反応混合物のクロマトグラム上の保持時間が１３±０．５ｍｉｎ（ブラジキニンのピーク位置）のピークに対して積分して和を求め、単位質量あたり（１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬのサンプルローディング量）のブラジキニンのピーク面積と比較して酵素反応で生成したブラジキニンの濃度を計算して、表１４の総反応系に基づいてブラジキニンの生成量を計算し、最後に各モル比条件下での１ｍｇ酵素あたりのブラジキニン生成量（μｇ／ｍｇ）に換算した。結果は表１６に示す通りである。
【0121】
【表16】
【0122】
天然基質を用いた測定結果によると、全体的な傾向として、修飾後のタンパク質は酵素反応によって生成されたブラジキニンが修飾前のサンプルより低かった。これはＰＥＧ修飾タンパク質の一貫した特性に合致している。実施例９‐１３のデータと合わせて見れば、ＰＥＧ修飾後のタンパク質は、原タンパク質と比較して酵素反応をより穏やかに維持し、エフェクター分子を持続的に生成することが実現できると考えられる。また、ＫＬＫ１
類の薬物の効果発現は体内のカリクレイン‐キニン系（ＫＫＳ）の調節作用に基づいており、この調節にはエフェクター分子の生成と除去が含まれるので、穏やかで持続的な酵素反応プロセスは、ＫＫＳにおける除去メカニズムを効果的に減少し、本発明が提供する薬物がより安定して効果的に生物学的作用を発揮することを可能にした。
類の薬物の効果発現は体内のカリクレイン‐キニン系（ＫＫＳ）の調節作用に基づいており、この調節にはエフェクター分子の生成と除去が含まれるので、穏やかで持続的な酵素反応プロセスは、ＫＫＳにおける除去メカニズムを効果的に減少し、本発明が提供する薬物がより安定して効果的に生物学的作用を発揮することを可能にした。
【0123】
さらに、ＫｂとｈＫＬＫ１Ｘ１およびその修飾後産物を比較したところ、本発明が提供するサンプルはエフェクター分子の生成量がより高かった。これは実施例１０‐１３で示された動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ薬効実験の結果と一致している。動物由来ＫＬＫ１に比べて、本発明が提供するｈＫＬＫ１Ｘ１タンパク質は著しい優位性を持つことがこれらの実験により実証された。
【0124】
実施例７ ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１／ｈＫＬＫ１Ｘなどに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素動力学的測定
一、測定方法
（１）標準品の希釈：Ｓ２２６６基質緩衝液（20ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ８．５）を用いて、標準品である膵臓カリクレイン１（常州千紅生化製薬より提供）を１０ＩＵ／ｍＬまで希釈した。希釈した標準品を以下の表に従ってそれぞれ１、２、３、４、５、６ＩＵ／ｍＬに希釈し、標準曲線サンプルとして作製した。
一、測定方法
（１）標準品の希釈：Ｓ２２６６基質緩衝液（20ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ８．５）を用いて、標準品である膵臓カリクレイン１（常州千紅生化製薬より提供）を１０ＩＵ／ｍＬまで希釈した。希釈した標準品を以下の表に従ってそれぞれ１、２、３、４、５、６ＩＵ／ｍＬに希釈し、標準曲線サンプルとして作製した。
【0125】
【表17】
【0126】
（２）異なる濃度の基質の調製：Ｓ２２６６基質緩衝液を使用して、既に分注済みの基質Ｓ２２６６をそれぞれ４００、２００、１００、５０、２５、１０μＭの基質溶液として希釈した。
【0127】
（３）サンプルの希釈：Ｓ２２６６基質緩衝液を使用して、サンプルを１‐６ＩＵ／ｍＬに希釈した。
【0128】
（４）サンプルを加える：上述（１）で作製した標準曲線サンプルをマイクロプレートに、８０μＬ／ウェルで、各サンプル１ウェルずつ加えた。上述（３）で希釈後のサンプルをマイクロプレートに、８０μＬ／ウェルで、サンプル毎に並行して６ウェル加えた。
【0129】
（５）読取り：マイクロプレートリーダーを設定して３７℃、４０５ｎｍでの動力学的測定を行い、読取り間隔を１ｍｉｎに、測定時間を１５ｍｉｎに設定した。機器のサンプルプールの温度が３７℃に上昇したら基質を加え、その際、標準曲線サンプルには２００μｍの基質を８０μＬ／ウェルで加え、測定するサンプルの６つの並行ウェルには、（２）で調製した異なる濃度の基質をそれぞれ８０μＬ／ウェルで加えた。サンプルを迅速に加えてブローして均一に混ぜるように注意する必要がある。サンプルの添加が終わったら、すぐに読取りを開始し、その後１分間ごとに読取りを行った。
【0130】
（６）結果の処理：ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて結果を処理し、ミカエリス・メンテン式に基づいてデータをフィッティングし、酵素動力学的パラメータを計算した。ここで、Ｋｍはミカエリス・メンテン定数であり、酵素反応最大速度（Ｖｍａｘ）の半分の速度を与える基質濃度を表す。一般的に、１／Ｋｍをもって、酵素の基質に対する親和性の大きさを近似的に表し、１／Ｋｍが大きいほど、酵素はその基質に対
して強い親和性を持ち、酵素反応が容易に進行するのである。
して強い親和性を持ち、酵素反応が容易に進行するのである。
【0131】
二、実験の結果
各サンプルの酵素動力学的測定の結果は以下の表に示している。
各サンプルの酵素動力学的測定の結果は以下の表に示している。
【0132】
【表18】
【0133】
酵素動力学的測定の結果から、ｈＫＬＫ１Ｘ１は、未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１に比べてＫｍ値が低くなり、突然変異後に基質との親和性が向上したことが分かった。また、突然変異体の２つのＰＥＧ修飾体は、未変異のＰＥＧ修飾体に比べてＫｍ値が低くなり、突然変異体の２つの修飾体が酵素学的性質において未変異タンパク質の修飾体より優れた性能を有することが判明した。
【0134】
実施例８ ＰＥＧで修飾したｈＫＬＫ１のラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的比較
一、群分け
実験初日に測定したＳＤラットの体重に基づき、体重でラットをランダムに６つの群に分け、それぞれＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）静脈注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）皮下注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）静脈注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）皮下注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．０２ｍｇ／ｋｇ）とした。一群６匹で、半分が雌性で半分が雄性であった。動物を染色して番号を付けた。単回投与で、実験初日に１回投与した。
一、群分け
実験初日に測定したＳＤラットの体重に基づき、体重でラットをランダムに６つの群に分け、それぞれＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）静脈注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）皮下注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）静脈注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）皮下注射群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．０２ｍｇ／ｋｇ）とした。一群６匹で、半分が雌性で半分が雄性であった。動物を染色して番号を付けた。単回投与で、実験初日に１回投与した。
【0135】
二、血液サンプルの採取及び測定用サンプルの調製
測定時間：０ｍｉｎ（投与前）、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、２ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄの時点でそれぞれ一回採血し、合計で１１回の採血を行った。
測定時間：０ｍｉｎ（投与前）、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、２ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄの時点でそれぞれ一回採血し、合計で１１回の採血を行った。
【0136】
採血量：５０‐１００μＬの血清を採取して、薬物動態学パラメーターの測定に使用された。
【0137】
サンプルの調製
１）薬物動態サンプル：１０％のＳＤラット混合空白血清（ＳＤラット混合空白血清：ブロッキング液（２％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ）＝１：９）を使用して、定量限界濃度２５６０ｎｇ／ｍＬ～８０ｎｇ／ｍＬの範囲内に希釈した。
１）薬物動態サンプル：１０％のＳＤラット混合空白血清（ＳＤラット混合空白血清：ブロッキング液（２％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ）＝１：９）を使用して、定量限界濃度２５６０ｎｇ／ｍＬ～８０ｎｇ／ｍＬの範囲内に希釈した。
【0138】
２）標準品：ＳＤラット混合空白血清を使用して、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１のＰＥＧ修飾産物を希釈して、濃度勾配範囲が５１２０ｎｇ／ｍＬ～
４０ｎｇ／ｍＬである２倍希釈系列の標準品を調製した。
４０ｎｇ／ｍＬである２倍希釈系列の標準品を調製した。
【0139】
３）コントロール：ＳＤラット混合空白血清を使用して、高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１のＰＥＧ修飾産物を希釈して、高濃度（１９２０ｎｇ／ｍＬ）、中濃度（４８０ｎｇ／ｍＬ）、低濃度（２４０ｎｇ／ｍＬ）のコントロールを調製した。
【0140】
三、薬物動態学的測定
血清中の薬物濃度はＥＬＩＳＡ法で測定される。分析プロセスは以下の通りである。
１）コーティング：２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）で抗ｈＫＬＫ１抗体を４００ｎｇ／ウェルに希釈してコーティングした。前記希釈・コーティングした抗体を吸い取り、マイクロプレートのウェルに加えて（１００ｕＬ／ウェル）、プレートをシールして、４℃で一晩コーティングした。コーティングプレートはＴｈｅｒｍｏ社のマイクロプレートである。
血清中の薬物濃度はＥＬＩＳＡ法で測定される。分析プロセスは以下の通りである。
１）コーティング：２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）で抗ｈＫＬＫ１抗体を４００ｎｇ／ウェルに希釈してコーティングした。前記希釈・コーティングした抗体を吸い取り、マイクロプレートのウェルに加えて（１００ｕＬ／ウェル）、プレートをシールして、４℃で一晩コーティングした。コーティングプレートはＴｈｅｒｍｏ社のマイクロプレートである。
【0141】
２）ブロッキング：ウェル内の液体を捨て、マイクロプレートウォッシャーでプレートを１回洗浄して振って乾燥させた。ブロッキング液（２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ２０ｍＭ ＰＢＳ）を２００ｕＬ／ウェルで加え、プレートをシールして、３７℃で約２時間インキュベートした。
【0142】
３）サンプルを加える：ウェル内の液体を除去し、測定する薬物動態サンプル、標準品とコントロール溶液などをブロッキング液で１０倍に希釈した後、１００ｕＬ／ウェルでマイクロプレートに加え、プレートをシールして、３７℃で約１.５時間インキュベート
した。
した。
【0143】
４）検出用抗体を加える：ウェル内の液体を捨て、マイクロプレートウォッシャーでプレートを３回洗浄し、３００ｕＬ／ウェルで、振って乾燥させた。検出用抗体作動液（ブロッキング液で検出用酵素標識抗ｈＫＬＫ１抗体を１ｕｇ／ｍＬに希釈する）を１００ｕＬ／ウェルで加え、プレートをシールして、３７℃で約４５分間インキュベートした。
【0144】
５）発色：ウェル内の液体を捨て、マイクロプレートウォッシャーでプレートを５回洗浄し、３００ｕＬ／ウェルで、振って乾燥させた。ＴＭＢ発色液１号を加え、３７℃で１５分間インキュベートした（発色状況に応じて決める）。
【0145】
６）プレートリーディング：停止液（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を５０ｕＬ／ウェルで加え、反応を停止させ、直ちに４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。標準曲線サンプルの濃度をＸ軸に、ＯＤ値をＹ軸にして標準曲線を描き、サンプル濃度を計算した。
【0146】
７）ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ８を使用して標準曲線を描き、サンプル濃度を計算した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬを使用して平均値、標準偏差、変動係数などを計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．００を使用してＡＵＣ（曲線下面積）を計算した。
【0147】
四、測定結果
同等の投与量で、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物の暴露量（ＡＵＣ）は以下の通りである。
同等の投与量で、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物の暴露量（ＡＵＣ）は以下の通りである。
【0148】
【表19】
【0149】
上記の薬物動態学の結果から、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）は静脈注射および皮下注射の両方で、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）より著しい優れた薬物動態曲線を示し、より長い薬物半減期を示すことが分かった。ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１は筋肉注射の場合、低用量でも良好な吸収を示している。
【0150】
実施例９ 高グリコシル化ｈＫＬＫ１と低グリコシル化ｈＫＬＫ１のＰＥＧ修飾産物のラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性の比較
一、群分け
実験初日に測定したＳＤラットの体重に基づき、体重でラットをランダムに２つの群に分け、それぞれＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群とした。一群１２匹で、半分が雌性で半分が雄性であった。動物を染色して番号を付けた。
一、群分け
実験初日に測定したＳＤラットの体重に基づき、体重でラットをランダムに２つの群に分け、それぞれＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群とした。一群１２匹で、半分が雌性で半分が雄性であった。動物を染色して番号を付けた。
【0151】
二、投与
投与経路：静脈注射である。
投与頻度：週一回投与で、８回投与する。
投与量：各群はすべて０．２ｍｇ／ｍＬの投与濃度で、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。
投与経路：静脈注射である。
投与頻度：週一回投与で、８回投与する。
投与量：各群はすべて０．２ｍｇ／ｍＬの投与濃度で、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。
【0152】
三、血液サンプルの採取
測定時間：０ｍｉｎ（投与前）、投与後３日目、７日目の時点でそれぞれ一回採血する。回復期には毎週一回採血する。回復期は２週間である。毎回約５００μＬの全血を採取し、２時間静置して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。分離した血清は免疫原性の測定に使用された。
測定時間：０ｍｉｎ（投与前）、投与後３日目、７日目の時点でそれぞれ一回採血する。回復期には毎週一回採血する。回復期は２週間である。毎回約５００μＬの全血を採取し、２時間静置して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。分離した血清は免疫原性の測定に使用された。
【0153】
四、免疫原性の測定
１）コーティング：コーティング用抗原（ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１）の作動液をマイクロウェルに１００μＬ／ウェルで加え、２‐８℃で一晩インキュベートした。
２）ブロッキング：ウェル内の液体を捨て、プレートを３回洗浄し振って乾燥させた。ブロッキング液（２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ２０ｍＭ ＰＢＳ）を
２００ｕＬ／ウェルで加え、３７℃で約２時間インキュベートした。
３）サンプル処理：全ての動物血清サンプルをブロッキング液で１０倍に希釈した。
４）サンプルを加える：マイクロプレートウェル内の液体を捨て、振って乾燥させた。ウェル毎に処理後のサンプルを１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、２００ｒｐｍで約２時間振とうインキュベートした。
１）コーティング：コーティング用抗原（ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１）の作動液をマイクロウェルに１００μＬ／ウェルで加え、２‐８℃で一晩インキュベートした。
２）ブロッキング：ウェル内の液体を捨て、プレートを３回洗浄し振って乾燥させた。ブロッキング液（２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ２０ｍＭ ＰＢＳ）を
２００ｕＬ／ウェルで加え、３７℃で約２時間インキュベートした。
３）サンプル処理：全ての動物血清サンプルをブロッキング液で１０倍に希釈した。
４）サンプルを加える：マイクロプレートウェル内の液体を捨て、振って乾燥させた。ウェル毎に処理後のサンプルを１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、２００ｒｐｍで約２時間振とうインキュベートした。
【0154】
５）検出用抗原作動液を加える：マイクロプレートウェル内の液体を捨て、プレートを３回洗浄して振って乾燥させた。スクリーニング試験用のマイクロプレートの各ウェルには、１００ｕＬ／ウェルで検出用抗原作動液（ブロッキング液でバイオチン標識のＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１を２．５μｇ／ｍＬに希釈して検出用抗原作動液とする）を加え、確認試験用のマイクロプレートの各ウェルには、１００ｕＬ／ウェルで確認アッセイ検出用抗原作動液（前記検出抗原作動液を希釈液として用いて、ＰＥＧ修飾ｈＫＬＫ１を２００μｇ／ｍＬに希釈して確認アッセイ検出用抗原作動液とする）を加え、３７℃、２００ｒｐｍで約１時間振とうインキュベートした。
【0155】
６）シグナル増幅検出物作動液（ブロッキング液でストレプトアビジン‐ワサビペルオキシダーゼを０．０５μｇ／ｍＬに希釈する）を加える：マイクロプレートウェル内の液体を捨て、プレートを３回洗浄して振って乾燥させ、シグナル増幅検出物作動液を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃、２００ｒｐｍで約1時間振とうインキュベートした。
【0156】
７）発色：ウェル内の液体を捨て、プレートを３回洗浄して振って乾燥させた。ウェル毎に発色液を１００ｕＬ加え、３７℃で１５分間遮光して放置した。
【0157】
８）停止：停止液（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を１００μｌ／ウェルで加えて反応を停止させて、直ちにマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0158】
五、測定結果
図１３及び図１４の免疫原性評価の結果は、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群の１２匹の動物において、いずれも血清中抗薬物抗体（ＡＤＡ）が検出されなかったが、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群の１２匹の動物において、２匹の動物で比較的に高いＡＤＡ値が検出されたと示している。これにより、低グリコシル化タンパク質修飾体による免疫原性がより低いことが判明した。
図１３及び図１４の免疫原性評価の結果は、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群の１２匹の動物において、いずれも血清中抗薬物抗体（ＡＤＡ）が検出されなかったが、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群の１２匹の動物において、２匹の動物で比較的に高いＡＤＡ値が検出されたと示している。これにより、低グリコシル化タンパク質修飾体による免疫原性がより低いことが判明した。
【0159】
実施例１０ 注射用Urinary Kallikreinと注射用膵臓カリクレイン１のｉｎ ｖｉｖｏ活性の比較
一、モデルの作製
ＳＤ系ラット、雄性、ＳＰＤ級、体重２７０～３００ｇの動物を使用した。中大脳動脈塞栓法を用いて中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを作製した。動物はイソフルランで麻酔し，仰向けに固定し、皮膚を消毒し、頚部正中部を切開し、右側の総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を分離して、迷走神経を優しく剥離し、外頸動脈を結紮、切断した。頸動脈の近心端をクランプし、外頚動脈の結紮部の遠位に切開し、ＭＣＡＯ線栓（型番２４３８‐Ａ５、北京西濃科技有限公司より購入）を挿入し、総頚動脈分岐部を通過して内頚動脈に入り、徐々に挿入し、わずかな抵抗が感じられるところまで（分岐部から約２０ｍＭ）で止まり、中大脳動脈の血流を遮断した。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ケージに戻した。虚血９０分間後、ラットを再度麻酔し、板に固定し、頸部の皮膚を切開し、線栓を見つけて優しく抜き取り、血流を回復させ再灌流を行った。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ケージに戻して飼育した。
一、モデルの作製
ＳＤ系ラット、雄性、ＳＰＤ級、体重２７０～３００ｇの動物を使用した。中大脳動脈塞栓法を用いて中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを作製した。動物はイソフルランで麻酔し，仰向けに固定し、皮膚を消毒し、頚部正中部を切開し、右側の総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を分離して、迷走神経を優しく剥離し、外頸動脈を結紮、切断した。頸動脈の近心端をクランプし、外頚動脈の結紮部の遠位に切開し、ＭＣＡＯ線栓（型番２４３８‐Ａ５、北京西濃科技有限公司より購入）を挿入し、総頚動脈分岐部を通過して内頚動脈に入り、徐々に挿入し、わずかな抵抗が感じられるところまで（分岐部から約２０ｍＭ）で止まり、中大脳動脈の血流を遮断した。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ケージに戻した。虚血９０分間後、ラットを再度麻酔し、板に固定し、頸部の皮膚を切開し、線栓を見つけて優しく抜き取り、血流を回復させ再灌流を行った。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ケージに戻して飼育した。
【0160】
群分け：計４群、即ち偽手術群、モデル群、注射用膵臓カリクレイン１群（０．４ＩＵ
／ｋｇ、筋肉注射）、Urinary Kallikrein群（０．１ＩＵ／ｋｇ、静脈注射）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投与を行った。動物実験で使用するサンプルの比活性は、すべて実施例６に示した方法で計算される。また、上記の注射用膵臓カリクレイン１はＰＥＧ１０Ｋ修飾Ｋｂであり、実施例５で述べた製造方法により作製された。Ｋｂはブタの膵臓から抽出されたＫＬＫ１である。
／ｋｇ、筋肉注射）、Urinary Kallikrein群（０．１ＩＵ／ｋｇ、静脈注射）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投与を行った。動物実験で使用するサンプルの比活性は、すべて実施例６に示した方法で計算される。また、上記の注射用膵臓カリクレイン１はＰＥＧ１０Ｋ修飾Ｋｂであり、実施例５で述べた製造方法により作製された。Ｋｂはブタの膵臓から抽出されたＫＬＫ１である。
【0161】
二、神経欠損症状の評価
改良Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ５点法によって神経欠損症状を評価する。
改良Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ５点法によって神経欠損症状を評価する。
【0162】
【表20】
【0163】
三、脳梗塞体積の測定
動物は１０％の抱水クロラールで麻酔した後、頭部を切断し脳を摘出した。嗅球、小脳および低位脳幹を除去し、生理食塩水で大脳表面の血痕を洗い流した後、表面の残留水分を吸い取って、－８０℃で７分間放置した。その後、取り出してすぐに視線の交差平面と垂直して下向きで冠状断面を切り、さらに２ｍｍごとに後方に向かって切片を切った。脳切片を生理食塩水で新鮮に調製したＴＴＣ（２０ｇ／Ｌ）染色液に入れ、３７℃で９０分間温めて、正常な脳組織は濃い赤色に染まり、虚血が生じた脳組織は蒼白色になった。生理食塩水で洗い流した後、すぐに脳切片を前から後ろに向かって順番に並べ、表面の残留水分を吸い取り、写真を撮った。画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌ）を使って写真に基づいて統計を取り、右側の虚血面積（白色区域）と右側面積を囲んで、次の計算式により脳梗塞面積の割合を算出した。計算式：脳梗塞面積％＝虚血総面積÷右側総面積×１００。
動物は１０％の抱水クロラールで麻酔した後、頭部を切断し脳を摘出した。嗅球、小脳および低位脳幹を除去し、生理食塩水で大脳表面の血痕を洗い流した後、表面の残留水分を吸い取って、－８０℃で７分間放置した。その後、取り出してすぐに視線の交差平面と垂直して下向きで冠状断面を切り、さらに２ｍｍごとに後方に向かって切片を切った。脳切片を生理食塩水で新鮮に調製したＴＴＣ（２０ｇ／Ｌ）染色液に入れ、３７℃で９０分間温めて、正常な脳組織は濃い赤色に染まり、虚血が生じた脳組織は蒼白色になった。生理食塩水で洗い流した後、すぐに脳切片を前から後ろに向かって順番に並べ、表面の残留水分を吸い取り、写真を撮った。画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌ）を使って写真に基づいて統計を取り、右側の虚血面積（白色区域）と右側面積を囲んで、次の計算式により脳梗塞面積の割合を算出した。計算式：脳梗塞面積％＝虚血総面積÷右側総面積×１００。
【0164】
四、結果
１、被験物の神経障害症状への影響
図１５および表１９に示されるように、Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ７，８７＝２０．８０、Ｐ＝ ０．０１８）は、モデル群と比較して、神経障害症状に対
して著しい改善効果があった。また、注射用膵臓カリクレイン１群（Ｆ７，８７＝２０．８０、Ｐ＝０．０２１）はモデル群と比較して、神経障害症状に対して著しい改善効果があった。
１、被験物の神経障害症状への影響
図１５および表１９に示されるように、Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ７，８７＝２０．８０、Ｐ＝ ０．０１８）は、モデル群と比較して、神経障害症状に対
して著しい改善効果があった。また、注射用膵臓カリクレイン１群（Ｆ７，８７＝２０．８０、Ｐ＝０．０２１）はモデル群と比較して、神経障害症状に対して著しい改善効果があった。
【0165】
【表21】
【0166】
２、被験物の脳梗塞面積（％）への影響
図１６、１７、１８および表２０に示されるように、Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ７，８７＝１２．７２、Ｐ＝０．０４２）、注射用膵臓カリクレイン１群（Ｆ７，８７＝１２．７２、Ｐ＝０．０１９）は、モデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。
図１６、１７、１８および表２０に示されるように、Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ７，８７＝１２．７２、Ｐ＝０．０４２）、注射用膵臓カリクレイン１群（Ｆ７，８７＝１２．７２、Ｐ＝０．０１９）は、モデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。
【0167】
【表22】
【0168】
３、被験物の累積死亡率（％）への影響
表２１に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間に差はなかった。Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ１，２８＝０．１８、Ｐ＝０．６７４６）、注射用カリクレイン１群（Ｆ１，２８＝０．１８、Ｐ＝０．６７５３）は、モデル群と比較して、統計学的に有意差はなかった。
表２１に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間に差はなかった。Ｕｒｉｎａｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ群（Ｆ１，２８＝０．１８、Ｐ＝０．６７４６）、注射用カリクレイン１群（Ｆ１，２８＝０．１８、Ｐ＝０．６７５３）は、モデル群と比較して、統計学的に有意差はなかった。
【0169】
【表23】
【0170】
４、結論
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物Ｕｒｉｎａ
ｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎおよび注射用膵臓カリクレイン１はともに顕著な脳保護作用があった。
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物Ｕｒｉｎａ
ｒｙ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎおよび注射用膵臓カリクレイン１はともに顕著な脳保護作用があった。
【0171】
実施例１１ ＰＥＧ１０Ｋで修飾した未変異高グリコシル化ｈＫＬＫ１のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価
モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け及び投薬：計４群、即ち偽手術群、モデル群、陽性薬群（注射用膵臓カリクレイン１、０．４ＩＵ／ｋｇ、筋肉注射）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ、静脈注射）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投薬を行った。
モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け及び投薬：計４群、即ち偽手術群、モデル群、陽性薬群（注射用膵臓カリクレイン１、０．４ＩＵ／ｋｇ、筋肉注射）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ、静脈注射）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投薬を行った。
【0172】
二、結果
１、被験物の神経欠損症状への影響
図１９および表２２に示されるように、被験物ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝６３．３２、Ｐ＝０．３５２）は、モデル群と比較して神経欠損症状に対して一定の改善効果があったが、統計学的に有意差はなかった。陽性薬群（Ｆ３，４４＝５６．３４、Ｐ＝０．００６）は、モデル群と比較して神経欠損症状に顕著な改善効果があった。
１、被験物の神経欠損症状への影響
図１９および表２２に示されるように、被験物ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝６３．３２、Ｐ＝０．３５２）は、モデル群と比較して神経欠損症状に対して一定の改善効果があったが、統計学的に有意差はなかった。陽性薬群（Ｆ３，４４＝５６．３４、Ｐ＝０．００６）は、モデル群と比較して神経欠損症状に顕著な改善効果があった。
【0173】
【表24】
【0174】
２、被験物の脳梗塞面積（％）への影響
図２０、２１、２２および表２３に示されるように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝３７．７２、Ｐ＝０．１９７）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に対して一定の改善効果があったが、顕著な差はなかった。陽性薬群（Ｆ３，４４＝３４．５８、Ｐ＝０．００７）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
図２０、２１、２２および表２３に示されるように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝３７．７２、Ｐ＝０．１９７）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に対して一定の改善効果があったが、顕著な差はなかった。陽性薬群（Ｆ３，４４＝３４．５８、Ｐ＝０．００７）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
【0175】
【表25】
【0176】
３、被験物の累積死亡率（％）への影響
表２４に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。陽性薬群（Ｆ１，６＝０．００、Ｐ＝１．００００）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ１，６＝０．００、Ｐ＝１．００００）は、モデル群と比較して統計学的に有意差はなかった。
表２４に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。陽性薬群（Ｆ１，６＝０．００、Ｐ＝１．００００）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）群（Ｆ１，６＝０．００、Ｐ＝１．００００）は、モデル群と比較して統計学的に有意差はなかった。
【0177】
【表26】
【0178】
４、結論
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）は症状を改善する傾向を示したものの、統計学的に有意差はなかった。
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）は症状を改善する傾向を示したものの、統計学的に有意差はなかった。
【0179】
実施例１２ 異なるＰＥＧで修飾した未変異低グリコシル化ｈＫＬＫ１のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け及び投薬：計７群、即ち偽手術群、モデル群、陽性薬群（注射用膵臓カリクレイン１、０．４ＩＵ／ｋｇ、筋肉注射）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、 ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ ／ｋｇ）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投与を実施した。各投与群の投与量は、サンプルの比活性に基づいて算出し、１キログラム体重あたりに同じ活性単位のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１修飾体を投与する。
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け及び投薬：計７群、即ち偽手術群、モデル群、陽性薬群（注射用膵臓カリクレイン１、０．４ＩＵ／ｋｇ、筋肉注射）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、 ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ ／ｋｇ）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（０．１ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投与を実施した。各投与群の投与量は、サンプルの比活性に基づいて算出し、１キログラム体重あたりに同じ活性単位のＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１修飾体を投与する。
【0180】
二、結果
１、被験物の神経欠損症状への影響
図２３と表２５に示されるように、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝４６．２８、Ｐ＝０．２０９）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝５３．３３、Ｐ＝０．２４２）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝４６．２８、Ｐ＝０．２０９）は、モデル群と比較して神経欠損症状に対して一定の改善効果があったが、統計学的に有意差はなかった。一方、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４５＝４６．４３、Ｐ＝０．００８）、陽性薬群（Ｆ３，４５＝４６．４３、Ｐ＝０．００３）は、モデル群と比較して神経欠損症状に顕著な改善効果があった。
１、被験物の神経欠損症状への影響
図２３と表２５に示されるように、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝４６．２８、Ｐ＝０．２０９）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝５３．３３、Ｐ＝０．２４２）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝４６．２８、Ｐ＝０．２０９）は、モデル群と比較して神経欠損症状に対して一定の改善効果があったが、統計学的に有意差はなかった。一方、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４５＝４６．４３、Ｐ＝０．００８）、陽性薬群（Ｆ３，４５＝４６．４３、Ｐ＝０．００３）は、モデル群と比較して神経欠損症状に顕著な改善効果があった。
【0181】
【表27】
【0182】
２、被験物の脳梗塞面積（％）への影響
図２４、２５、２６および表２６に示されるように、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝３７．７３、Ｐ＝０．４４６）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝３６．５６、Ｐ＝０．５０２）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝３９．０５、Ｐ＝０．２１８）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に対して一定の改善効果があったが、有意な差はなかった。ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４５＝３９．３０、Ｐ＝０．００１）、陽性薬群（Ｆ３，４５＝３９．３０、Ｐ＝０．００１）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
図２４、２５、２６および表２６に示されるように、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝３７．７３、Ｐ＝０．４４６）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４３＝３６．５６、Ｐ＝０．５０２）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４４＝３９．０５、Ｐ＝０．２１８）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に対して一定の改善効果があったが、有意な差はなかった。ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ３，４５＝３９．３０、Ｐ＝０．００１）、陽性薬群（Ｆ３，４５＝３９．３０、Ｐ＝０．００１）は、モデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
【0183】
【表28】
【0184】
３、被験物の累積死亡率（％）への影響
表２７に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。陽性薬群（Ｆ１，３＝０．１５、Ｐ＝０．７２３９）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１７、Ｐ＝０．７１００）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１７、Ｐ＝０．７１０６）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１５、Ｐ＝０．７２３９）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．００、Ｐ＝０．９９９４）は、モデル群と比較して、統計学的に有意差はなかった。
表２７に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。陽性薬群（Ｆ１，３＝０．１５、Ｐ＝０．７２３９）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１７、Ｐ＝０．７１００）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１７、Ｐ＝０．７１０６）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．１５、Ｐ＝０．７２３９）、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）群（Ｆ１，３＝０．００、Ｐ＝０．９９９４）は、モデル群と比較して、統計学的に有意差はなかった。
【0185】
【表29】
【0186】
４、結論
本実施例の結果によると、未変異低グリコシル化ｈＫＬＫ１の中で、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）はｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて顕著な脳保護効果を示し、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）も症状改善の傾向を見せている。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏで行われた薬効実験の結果は一定の相関性を示しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性において、ＰＥＧ１０Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１は、ＰＥＧ５Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１より高く、ＰＥＧ３０Ｋ／４０Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１よりも高かったのである。
本実施例の結果によると、未変異低グリコシル化ｈＫＬＫ１の中で、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）はｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて顕著な脳保護効果を示し、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）、ＰＥＧ４０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）、ＰＥＧ３０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）も症状改善の傾向を見せている。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏで行われた薬効実験の結果は一定の相関性を示しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性において、ＰＥＧ１０Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１は、ＰＥＧ５Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１より高く、ＰＥＧ３０Ｋ／４０Ｋ修飾の低グリコシル化ｈＫＬＫ１よりも高かったのである。
【0187】
実施例１１及び１２の結果を総じて見ればと、同一の投与量で評価する場合、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（高グリコシル化）サンプルの薬効はＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１（低グリコシル化）サンプルに劣る。このことから、同じＰＥＧ修飾を施した場合、未変異の低グリコシル化サンプルは高グリコシル化サンプルに比べて薬効が優れると考えられる。
【0188】
実施例１３ 異なるＰＥＧで修飾したｈＫＬＫ１突然変異体のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け：計４群、即ち偽手術群、モデル群、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（０．１ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に静脈注射投与を実施した。
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け：計４群、即ち偽手術群、モデル群、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（０．１ＩＵ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（０．１ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に静脈注射投与を実施した。
【0189】
二、結果
１、被験物の神経欠損症状への影響
図２７および表２８に示されるように、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３８＝６７．１３、Ｐ＝０．０１７）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して顕著な改善効果あった。ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３７＝８６．６５、Ｐ＝０．００３）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して非常に顕著な改善効果があった。
１、被験物の神経欠損症状への影響
図２７および表２８に示されるように、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３８＝６７．１３、Ｐ＝０．０１７）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して顕著な改善効果あった。ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３７＝８６．６５、Ｐ＝０．００３）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して非常に顕著な改善効果があった。
【0190】
【表30】
【0191】
２、被験物の脳梗塞面積（％）への影響
図２８、２９、３０および表２９に示されるように、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３８＝３９．５０、Ｐ＝０．００１）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１群（Ｆ２，３７＝９０．５、Ｐ＝０．０００）はモデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
図２８、２９、３０および表２９に示されるように、ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ２，３８＝３９．５０、Ｐ＝０．００１）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１群（Ｆ２，３７＝９０．５、Ｐ＝０．０００）はモデル群と比較して脳梗塞面積に顕著な改善効果があった。
【0192】
【表31】
【0193】
３、被験物の累積死亡率（％）への影響
表３０に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ１，５＝ ０．７１、
Ｐ＝０．４３６９）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ１，５＝０．００、Ｐ＝１．００００）はモデル群と比較して統計学的に差がなかった。
表３０に示されるように、偽手術群以外のすべての群には動物の死亡があったが、死亡率において群間差はなかった。ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ１，５＝ ０．７１、
Ｐ＝０．４３６９）、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１群（Ｆ１，５＝０．００、Ｐ＝１．００００）はモデル群と比較して統計学的に差がなかった。
【0194】
【表32】
【0195】
４、結論
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１はともに顕著な脳保護作用があった。実施例１２と実施例１３を総じて、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（未変異）／ｈＫＬＫ１Ｘ（突然変異体）のｉｎ ｖｉｖｏ薬効については表３１にまとめた。
虚血再灌流後の治療で被験物を投与した場合、モデル群と比較して、被験物ＰＥＧ５Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１はともに顕著な脳保護作用があった。実施例１２と実施例１３を総じて、ＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１（未変異）／ｈＫＬＫ１Ｘ（突然変異体）のｉｎ ｖｉｖｏ薬効については表３１にまとめた。
【0196】
【表33】
【0197】
即ち、同じＰＥＧ修飾剤で修飾された場合、Ｎ１４１部位で突然変異を受けたｈＫＬＫ１タンパク質は、変異前に比べて薬物分子としての薬効が明らかに優れる。突然変異後のタンパク質は、性能の向上が確認され、より良いｉｎ ｖｉｖｏ治療効果が得られる。
【0198】
実施例１０～１３においてｉｎ ｖｉｖｏ薬効を示した薬物をまとめて表３２に示している。
【0199】
【表34】
【0200】
即ち、同一の修飾剤で修飾された場合、未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１は未変異の高グリコシル化ｈＫＬＫ１と比較して、より優れた薬効がある。また、ＮＦＳで突然変異されたｈＫＬＫ１タンパク質は、未変異の低グリコシル化ｈＫＬＫ１と比較して薬効が優れており、低投与量でも著しく優れた薬効がある。
【0201】
実施例１４ 異なる投与経路におけるＰＥＧ‐ｈＫＬＫ１の薬効研究
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け：計３群、即ち偽手術群、モデル群、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．４ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投薬を行う。
一、モデルの作製、神経欠損症状の評価、脳梗塞体積の測定方法は実施例１０と同じである。
群分け：計３群、即ち偽手術群、モデル群、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（０．４ＩＵ／ｋｇ）を設定した。投与群は再灌流２時間後に投薬を行う。
【0202】
二、結果
１、被験物の神経欠損症状への影響
図３１および表３３に示すように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（Ｆ２，３６＝１２２．８４、Ｐ＝０．０００）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して非常に顕著な改善効果があった。
１、被験物の神経欠損症状への影響
図３１および表３３に示すように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（Ｆ２，３６＝１２２．８４、Ｐ＝０．０００）はモデル群と比較して神経欠損症状に対して非常に顕著な改善効果があった。
【0203】
【表35】
【0204】
２、被験物質の脳梗塞面積（％）への影響
図３２および表３４に示すように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（Ｆ２，３６＝５５．０２、Ｐ＝０．００１）はモデル群と比較して脳梗塞面積に対して非常に顕著な改善効果があった。
図３２および表３４に示すように、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１筋肉注射群（Ｆ２，３６＝５５．０２、Ｐ＝０．００１）はモデル群と比較して脳梗塞面積に対して非常に顕著な改善効果があった。
【0205】
【表36】
【0206】
４、結論
実施例１３および実施例１４を総じて見れば、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１は静脈注射（投与量０．１ＩＵ／ｋｇ）および筋肉注射（投与量０．４ＩＵ／ｋｇ）の２つの投与経路で投与する場合、ともに非常に顕著な脳保護作用がある。また、動物の脳卒中後の神経欠損症状を効果的に治療し、脳梗塞面積を有意に改善することが確認された。
実施例１３および実施例１４を総じて見れば、ＰＥＧ１０Ｋ‐ｈＫＬＫ１Ｘ１は静脈注射（投与量０．１ＩＵ／ｋｇ）および筋肉注射（投与量０．４ＩＵ／ｋｇ）の２つの投与経路で投与する場合、ともに非常に顕著な脳保護作用がある。また、動物の脳卒中後の神経欠損症状を効果的に治療し、脳梗塞面積を有意に改善することが確認された。
【0207】
以上のことを要するに、高グリコシル化ＫＬＫ１に比べて、本発明の低グリコシル化ＫＬＫ１のほうはより高い活性を有しており、未変異のＫＬＫ１に比べて、組換えＫＬＫ１突然変異体のほうはＮ－グリコシル化修飾部位が一箇所少なく、精製工程がより簡単になり、製品の均一性が向上し、品質管理が容易になり、生産量も増加した。そして、本発明のＫＬＫ１突然変異体は未変異の低グリコシル化ＫＬＫ１と比較して酵素学的性質、活性などの面において更なる利点を有している。さらに、本発明のポリエチレングリコール化組換えｈＫＬＫ１は、さまざまな投与方法で投与されていずれも顕著な薬効を示した。そしてポリエチレングリコール薬が持つ安全性と長時間作用の利点を持っており、投与頻度の低減、患者のコンプライアンスの向上が実現でき、急性虚血性脳卒中、周辺神経病、網膜疾患、眼底疾患、高血圧、糖尿病腎疾患、ＩｇＡ腎炎、慢性腎疾患などの疾患の予防、治療及び予後の回復、再発防止等の段階をカバーする疾患全過程における本発明の薬物の応用が実現した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
低グリコシル化修飾のカリクレイン１またはその誘導体であって、前記カリクレイン１は霊長類動物のカリクレイン１であり、天然カリクレイン１のＮＭＳ、ＮＨＴでのＮ‐グリコシル化修飾を含み、ＮＦＳのアスパラギンにグリコシル化修飾がないかまたはごく少量のグリコシル化修飾があることを特徴とし、前記少量のグリコシル化修飾または低グリコシル化修飾はＮＦＳにあるアスパラギンがグリコシル化修飾された割合が≦１０％である、カリクレイン１またはその誘導体。
【請求項2】
組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１が霊長類動物カリクレイン１であり、２つの部位のみにＮ‐グリコシル化修飾があることを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項3】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、天然カリクレイン１アミノ酸配列中のＮＭＳ、ＮＨＴでのＮ‐グリコシル化修飾を保持しており、天然カリクレイン１のＮＦＳでのＮ‐グリコシル化修飾を含まないことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項4】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンがアスパラギン以外の任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＦ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項5】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのフェニルアラニンがプロリンに突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｓの０個、１個、または２個のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項6】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのセリンがセリン、トレオニン以外の任意のアミノ酸に突然変異され、ＮＦＳのＮ、Ｆの０個、１個、または２個のアミノ酸がほかの任意のアミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項7】
請求項４に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体はカリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンが極性中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または脂肪族アミノ酸に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項8】
請求項７に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体はカリクレイン１のアミノ酸配列中のＮＦＳのアスパラギンがグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはアラニン（Ａｌａ）に突然変異されたことを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項9】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記カリクレイン１はヒトカリクレイン１であり、ＮＦＳのアスパラギン、フェニルアラニン、セリンはそれぞれヒトカリクレイン１の１４１位、１４２位、１４３位のアミノ酸であり、天然ヒトカリクレイン１のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４５５．１、ＮＰ００２２４８．１、ＡＡＡ３６１３６．１、ＡＡＰ３５９１７、ＡＡＵ１２５６９で登録された配列であることを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項10】
請求項２に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体であって、前記突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：５、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６に示した配列であることを特徴とする、組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体。
【請求項11】
請求項１に記載のカリクレイン１またはその誘導体、または請求項２～１０のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体またはその誘導体を含む組成物。
【請求項12】
急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、および慢性腎臓病からなる群から選択される疾患の治療、予防、予後回復、または再発防止のための請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
ポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記カリクレイン１はポリエチレングリコール修飾剤によって修飾された、請求項１に記載のカリクレイン１または請求項２～１０のいずれか一項に記載の組換えカリクレイン１突然変異体であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記ポリエチレングリコール修飾剤は分子量５ｋＤａ～１０ｋＤａの直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミドプロピオネートであり、一般構造式が式（１）に示される通りであり、式（１）中、ｎは１０５～２２５の整数であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１。
【化1】
【請求項15】
請求項１３に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１であって、前記ポリエチレングリコール修飾剤は分子量３０ｋＤａ～４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・プロピオンアルデヒドであり、一般構造式は式（２）に示される通りであり、式（２）中、ｎは３３５～４５５の整数であることを特徴とする、ポリエチレングリコール化カリクレイン１。
【化2】
【請求項16】
請求項１３に記載のポリエチレングリコール化カリクレイン１を含む組成物。
【請求項17】
急性虚血性脳卒中、末梢神経障害、網膜症、眼底疾患、高血圧、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎炎、および慢性腎臓病からなる群から選択される疾患の治療、予防、予後回復、または再発防止のための請求項１６に記載の組成物。
【国際調査報告】