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▶ ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】抗ＨＳＰ９０α抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K31/7068
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529897
(86)(22)【出願日】2021-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-07-18
(86)【国際出願番号】 US2021060295
(87)【国際公開番号】W WO2023091148
(87)【国際公開日】2023-05-25
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505020190
【氏名又は名称】ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ツェー・シン
(72)【発明者】
【氏名】シュー， チュ・アン
(72)【発明者】
【氏名】ファン， フイ・チェン
(72)【発明者】
【氏名】クー， イー・ユー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA17
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
アミノ酸２３５～２４４及びアミノ酸２５１～２６０の領域に２個のＥＤＫ部位をそれぞれ含む、ＨＳＰ９０αエピトープに特異的に結合可能な新規の相補性決定領域を備える単離抗体が開示される。また、前記抗体に対応する核酸分子、前記抗体又は対応する核酸分子を含む薬学的組成物並びに前記抗体を用いて癌を処置及びモニタリングする方法も開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離抗体であって、アミノ酸２３５～２４４及びアミノ酸２５１～２６０の領域にアミノ酸配列ＥＤＫを含むＨＳＰ９０αエピトープに特異的に結合可能な相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える単離抗体。
【請求項2】
配列番号２又は配列番号１２の重鎖可変領域配列の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、配列番号７又は配列番号１７の軽鎖可変領域配列の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、
を備える請求項１に記載の単離抗体。
【請求項3】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２によるものであり、前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号７によるものである、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項4】
配列番号２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域及び配列番号７の配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域を含む請求項３に記載の単離抗体。
【請求項5】
前記重鎖ＣＤＲ１は配列番号３の配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２は配列番号４の配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ３は配列番号５の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号８の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０の配列を有する、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項6】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１２によるものであり、前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１７によるものである、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項7】
配列番号１２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域及び配列番号１７の配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域を含む請求項６に記載の単離抗体。
【請求項8】
前記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１３の配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２は配列番号１４の配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ３は配列番号１５の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１８の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１９の配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ３は配列番号２０の配列を有する、請求項６に記載の単離抗体。
【請求項9】
Ｆｃ領域、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、モノクローナル抗体、一価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を含む抗体である請求項１に記載の単離抗体。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項11】
請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体又は請求項１０に記載の核酸分子及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項12】
前記単離抗体は、配列番号１３の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３、配列番号１８の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２０の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ３を備える、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
被検体における癌を処置する方法であって、有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体又は請求項１０に記載の核酸分子を前記被検体に投与するステップを備える方法。
【請求項14】
前記単離抗体は、配列番号１３の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３、配列番号１８の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２０の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ３を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記癌は、線維形成の特徴を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記癌は、Ｍ２－マクロファージ増悪性の特徴を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記癌は、膵臓癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌又は肺癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記被検体に治療薬を投与するステップをさらに備える請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
前記治療薬は、ゲムシタビンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記被検体における血液ＨＳＰ９０αレベルが、前記被検体における腫瘍の縮小をモニタリングするために請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体を用いて検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項21】
被検体における線維形成を処置する方法であって、有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体又は請求項１０に記載の核酸分子を前記被検体に投与するステップを備える方法。
【請求項22】
前記単離抗体は、配列番号１３の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３、配列番号１８の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２０の配列を有する前記軽鎖ＣＤＲ３を備える、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記被検体における血液ＨＳＰ９０αレベルが、前記被検体における腫瘍の縮小をモニタリングするために請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体を用いて検出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
被検体における癌の線維形成を処置する方法であって、ｅＨＳＰ９０αを標的とする治療薬を前記被検体に投与するステップを備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、新規の抗ＨＳＰ９０α抗体及びその使用に関する。より具体的には、本開示は、新規の抗ＨＳＰ９０α単離抗体、それを含む薬学的組成物及びそれを用いて癌を処置する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌の発生及び進行は、上皮細胞の遺伝的及びエピジェネティックな変化だけでなく、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）並びに線維芽細胞及び免疫細胞のような間質細胞からなる上皮細胞の間質微小環境の重大な変化にも依存する。Ｐａｎｄｏｌ Ｓ、Ｅｄｄｅｒｋａｏｕｉ Ｍ、Ｇｕｋｏｖｓｋｙ Ｉ、Ｌｕｇｅａ Ａ、Ｇｕｋｏｖｓｋａｙａ Ａ、Ｄｅｓｍｏｐｌａｓｉａ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００９年；７（１１）：Ｓ４４－７参照。線維形成は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）及び大腸癌（ＣＲＣ）などの多くの悪性腫瘍の共通の特性であり、大量のＥＣＭ及び特徴的なマーカーとしてα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を発現する多数の筋線維芽細胞からもたらされる。活性化線維芽細胞又は癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）とも呼ばれるそのような筋線維芽細胞は、腫瘍成長、免疫抑制及び悪性進行に寄与している。Ｏｒｉｍｏ Ａ、Ｇｕｐｔａ ＰＢ、Ｓｇｒｏｉ ＤＣ、Ａｒｅｎｚａｎａ－Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ Ｆ、Ｄｅｌａｕｎａｙ Ｔ、Ｎａｅｅｍ Ｒ他、Ｓｔｒｏｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ２００５年；１２１（３）：３３５－４８、Ｌａｋｉｎｓ ＭＡ、Ｇｈｏｒａｎｉ Ｅ、Ｍｕｎｉｒ Ｈ、Ｃａｒｌａ Ｐ．Ｍａｒｔｉｎｓ ＣＰ、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＪＤ、Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１８年；９（１）：９４８、Ｔｕｒｌｅｙ ＳＪ、Ｃｒｅｍａｓｃｏ Ｖ、Ａｓｔａｒｉｔａ ＪＬ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５年；１５（１１）：６６９－８２及びＢｅａｃｈａｍ ＤＡ、Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ Ｅ、Ｓｔｒｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ ２００５年；１５（５）：３２９－４１参照。それらは、腫瘍間質細胞の大部分を構成し、組織常在性線維芽細胞、星状細胞、間葉系幹細胞／前駆細胞及び浸潤性線維細胞などの多様な供給源に由来し得る。Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｈ、Ｍｕｎｄｅｌ ＴＭ、Ｋｉｅｒａｎ ＭＷ、Ｋａｌｌｕｒｉ Ｒ、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６年；５（１２）：１６４０－６参照。さらに、ＣＡＦは、内皮細胞の内皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）からも生じ得る。Ｚｅｉｓｂｅｒｇ ＥＭ、Ｐｏｔｅｎｔａ Ｓ、Ｘｉｅ Ｌ、Ｚｅｉｓｂｅｒｇ Ｍ、Ｋａｌｌｕｒｉ Ｒ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７年；６７（２１）：１０１２３－８参照。我々の以前の研究では、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦ（すなわち、α－ＳＭＡ＋ＣＤ３１＋細胞）は、ＣＲＣ組織検体におけるオステオポンチン（ＯＰＮ）発現マクロファージの近傍に検出された。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＷＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｃｈｕａ ＫＶ他、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＨＩＦ－１α－ＴＣＦ１２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１８年；９（４）：４９９８－５０１５参照。ＯＰＮは、内皮細胞のＥｎｄｏＭＴを誘導し、得られたＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、ＨＳＰ９０αを分泌してＣＲＣ細胞の幹細胞性を助長することによって強力な腫瘍促進効果を示した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＷＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｃｈｕａ ＫＶ他、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＨＩＦ－１α－ＴＣＦ１２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１８年；９（４）：４９９８－５０１５参照。近年、我々は、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦのＰＤＡＣ細胞移植片との混合物が骨髄由来マクロファージを有意に動員し、免疫Ｔ細胞を防止し、腫瘍成長を促進することも見出した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦによって分泌されたＨＳＰ９０αは、細胞表面受容体ＣＤ９１及びＴＬＲ４並びに下流のＭｙＤ８８－ＪＡＫ２／ＴＹＫ２－ＳＴＡＴ－３経路を通じて、マクロファージのＭ２分極化及びより多くのＨＳＰ９０α分泌をさらに誘導した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。
【0003】
ＨＳＰ９０αは、癌関連Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ、Ａｋｔ、ＨＩＦ－１α、突然変異型ｐ５３及びＲａｆ－１を含む多数のクライアントタンパク質の折りたたみ、成熟及び輸送を援助する公知の細胞シャペロンである。Ｔｒｅｐｅｌ ＪＢ、Ｍｏｌｌａｐｏｕｒ Ｍ、Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ、Ｎｅｃｋｅｒｓ Ｌ、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ Ｈｓｐ９０ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１０年；１０（８）：５３７－４９参照。それはまた、傷ついた組織のケラチノサイト及び線維芽細胞から発現及び分泌され、好ましくない微小環境下にある癌細胞からも、癌細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）、遊走、浸潤及び転移を促進するように発現及び分泌される。Ｌｉ Ｗ、Ｌｉ Ｙ、Ｇｕａｎ Ｓ、Ｆａｎ Ｊ、Ｃｈｅｎｇ Ｃ－Ｆ、Ｂｒｉｇｈｔ ＡＭ他、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ－９０α：ｌｉｎｋｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ ｔｏ ｓｋｉｎ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００７年；２６（５）：１２２１－３３、Ｘｕ Ａ、Ｔｉａｎ Ｔ、Ｈａｏ Ｊ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｚｈａｎｇ Ｚ、Ｈａｏ Ｊ他、Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ＨＳＰ９０α ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｌ ２００７年；３（４）：１０７－１２及びＷａｎｇ Ｘ、Ｓｏｎｇ Ｘ、Ｚｈｕｏ Ｗ、Ｆｕ Ｙ、Ｓｈｉ Ｈ、Ｌｉａｎｇ Ｙ他、Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００９年；１０６（５０）：２１２８８－９３参照。臨床的には、血清／血漿ＨＳＰ９０αレベルの上昇は、ＣＲＣ及びＰＤＡＣを含むいくつかの悪性腫瘍から検出されている。Ｗａｎｇ Ｘ、Ｓｏｎｇ Ｘ、Ｚｈｕｏ Ｗ、Ｆｕ Ｙ、Ｓｈｉ Ｈ、Ｌｉａｎｇ Ｙ他、Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００９年；１０６（５０）：２１２８８－９、Ｗａｎｇ Ｘ、Ｓｏｎｇ Ｘ、Ｚｈｕｏ Ｗ、Ｆｕ Ｙ、Ｓｈｉ Ｈ、Ｌｉａｎｇ Ｙ他、Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００９年；１０６（５０）：２１２８８－９３、Ｃｈｅｎ ＪＳ、Ｈｓｕ ＹＭ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｅｅ ＣＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０α ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ９１／ＬＲＰ－１ ａｎｄ ＮＦ－κＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０年；２８５（３３）：２５４５８－６６及びＣｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｉ ＣＰ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｊｉａｎｇ ＳＳ、Ｆａｎ ＣＳ他、Ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＨＳＰ９０α ｉｎｄｕｃｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年；７（５）：ｅ１４２４６１２参照。そのような細胞外ＨＳＰ９０α（ｅＨＳＰ９０α）の上昇レベルは、膵炎患者及びＰＤＡＣ発症活性化Ｋ－Ｒａｓノックインマウスからも検出され得る。Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｉ ＣＰ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｊｉａｎｇ ＳＳ、Ｆａｎ ＣＳ他、Ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＨＳＰ９０α ｉｎｄｕｃｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年；７（５）：ｅ１４２４６１２参照。ｅＨＳＰ９０αは、膵臓浸潤骨髄由来マクロファージ及び刺激された膵管上皮細胞から生成されてマクロファージ関連ＰＤＡＣ発生を促進し得る。Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｉ ＣＰ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｊｉａｎｇ ＳＳ、Ｆａｎ ＣＳ他、Ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＨＳＰ９０α ｉｎｄｕｃｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年；７（５）：ｅ１４２４６１２参照。さらに、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦによって分泌されるＨＳＰ９０α又は組換えＨＳＰ９０α（ｒＨＳＰ９０α）は、Ｍ２マーカー発現及びＨＳＰ９０α分泌のフィードフォワードループをマクロファージから誘導可能であり、それは、Ｍ２分極化マクロファージが免疫抑制的及び血管新生的なだけでなく、ｅＨＳＰ９０αリッチでもある微小環境を引き起こしてＰＤＡＣ腫瘍成長及び悪性進行を増強する理由を説明し得る。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。全体として、ｅＨＳＰ９０αは、腫瘍発生及び悪性進行の双方において重要な役割を果たしており、重要な治療標的として考えられ得る。
【0004】
我々の以前の研究では、我々は、ｅＨＳＰ９０αを標的とする細胞不浸透性低分子ＨＳＰ９０α阻害剤を合成した。Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｉ ＣＰ、Ｈｓｕ ＹＴ、Ｊｉａｎｇ ＳＳ、Ｆａｎ ＣＳ他、Ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＨＳＰ９０α ｉｎｄｕｃｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年；７（５）：ｅ１４２４６１２参照。それはＰＤＡＣ細胞の腫瘍化及び転移にいくつかの阻害レベルを示したが、それはマウス体外に排泄されやすく、頻回投与はマウスの脾臓肥大を引き起こした。一方、我々は、抗ＨＳＰ９０αマウスモノクローナル抗体を用いることから希望的な手がかりを得た。我々の最近の研究は、抗ＨＳＰ９０α抗体が、ＥｎｄｏＭＴ促進性及びＭ２マクロファージ関与性のＰＤＡＣ腫瘍成長に対して強力な治療的有効性を示すことを明らかにした。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。抗ＨＳＰ９０α抗体は、ｅＨＳＰ９０αのその細胞表面受容体ＣＤ９１とのライゲーションをブロッキングすることができ、それにより、ｅＨＳＰ９０αの発現及び分泌のｅＨＳＰ９０α誘導性フィードフォワードループを防止した。この発見は、我々の最近の他の研究によって支持されている。食品添加物及び化粧品に安全に使用される一般的な酸化防止剤及び防腐剤である没食子酸オクチル（ＯＧ）も、ｅＨＳＰ９０α－ＴＬＲ４ライゲーションのブロッキングを通じて、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦ及びｅＨＳＰ９０α誘導性のマクロファージＭ２－分極化並びにより多くのＨＳＰ９０α発現に対する阻害効果を示した。Ｃｈｕａ ＫＶ、Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｈｓｉｅｈ ＳＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｏｃｔｙｌ ｇａｌｌａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ ２０２０年；９（１）：９１参照。
【0005】
すべてまとめると、ｅＨＳＰ９０αは線維形成性癌及びＭ２－マクロファージ増悪性癌に対する潜在的な治療標的であり、抗ＨＳＰ９０α抗体の開発はｅＨＳＰ９０αを標的とする有益及び希望的な戦略となり得る。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、単離抗体がここに記載される。単離抗体は、アミノ酸２３５～２４４及びアミノ酸２５１～２６０の領域にアミノ酸配列ＥＤＫを含むＨＳＰ９０αエピトープに特異的に結合可能な新規の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える。
【0007】
いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０αは、ｅＨＳＰ９０αであり得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２又は配列番号１２の重鎖可変領域配列の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、配列番号７又は配列番号１７の軽鎖可変領域配列の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、を備え得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２によるものであり、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号７によるものであり得る。
【0010】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、配列番号２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域及び配列番号７の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である軽鎖可変領域を含み得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号３の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４の配列を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号５の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号８の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０の配列を有し得る。
【0012】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１２によるものであり、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１７によるものであり得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、配列番号１２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域及び配列番号１７の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である軽鎖可変領域を含み得る。
【0014】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号１３の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１４の配列を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号１５の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１８の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１９の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号２０の配列を有し得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、Ｆｃ領域、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、モノクローナル抗体、一価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を含む抗体であり得る。
【0016】
ここに開示される抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子も、ここに記載される。
【0017】
いくつかの実施形態では、核酸分子を含む宿主細胞が、ここに提供される。
【0018】
ここに記載される抗体又はここに開示される抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む薬学的組成物も、ここに記載される。薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／又は他の治療薬（例えば、他の抗癌剤、細胞毒性薬剤又は免疫調節剤）をさらに含み得る。治療薬の例は、ゲムシタビンを含むが、これに限定されない。
【0019】
ｅＨＳＰ９０αは線維形成（特に、癌の線維形成）に対する治療戦略として使用されてもよく、したがって、被検体における癌の線維形成を処置する方法であって、ｅＨＳＰ９０αを標的とする治療薬を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える方法もここに記載される。
【0020】
いくつかの実施形態では、ここに記載される抗体は、癌細胞成長又は癌細胞転移を阻害するのにも使用され得る。したがって、被検体における癌を処置する方法であって、ここに記載される抗体又はここに開示される抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子の有効量を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える方法が、ここに記載される。
【0021】
いくつかの実施形態では、ここに記載される抗体は、線維形成を低減させ、又は線維形成の形成を防止するのにも使用され得る。したがって、被検体における線維形成を処置する方法であって、ここに記載される抗体又はここに開示される抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子の有効量を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える方法が、ここに記載される。ここで、線維形成は、癌の線維形成であり得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、本方法は、他の治療薬を被検体に投与するステップをさらに含み得る。治療薬を投与するための時間は、特に限定されない。いくつかの実施形態では、治療薬は、抗体又は核酸分子を投与する場合に投与され得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、抗体又は核酸分子を投与した後に投与され得る。
【0023】
いくつかの実施形態では、被検体における癌又は線維形成を処置する方法において、被検体における血液ＨＳＰ９０αレベルは、被検体における腫瘍の縮小をモニタリングするために、ここに記載される単離抗体を用いて検出され得る。いくつかの実施形態では、被検体における血液ＨＳＰ９０αレベルは、被検体の全血又は血清中の血液ＨＳＰ９０αレベルであり得る。
【0024】
いくつかの実施形態では、癌は、線維形成の特徴を有し得る。
【0025】
いくつかの実施形態では、癌は、Ｍ２－マクロファージ増悪性の特徴を有し得る。
【0026】
癌の例は、膵臓癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌又は肺癌を含み得るが、これらに限定されない。
【0027】
また、被検体における腫瘍の縮小を評価する方法であって、被検体の血液サンプルを得るステップと、血液サンプル中のＨＳＰ９０αレベルを決定するステップと、を備える方法も、ここに提供される。いくつかの実施形態では、血液サンプルは、全血又は血清であり得る。
【0028】
いくつかの実施形態では、被検体における腫瘍の縮小を評価する方法は、ＩｇＧを投与された被検体の血液サンプル及びここに記載される抗体又はここに開示される抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子を投与された他の被検体の他の血液サンプルを得るステップと、ここに記載されるＩｇＧ、抗体又は核酸分子を投与された被検体の血液サンプル中のＨＳＰ９０αレベルを決定するステップと、を備え得る。ここに開示される抗体又は核酸分子を投与された被検体の血液サンプル中のＨＳＰ９０αレベルがＩｇＧを投与された被検体の血液サンプル中のＨＳＰ９０αレベルより低い場合、それは、ここに記載される抗体又は核酸分子が効果的に腫瘍の成長を阻害し、又は腫瘍体積を低減させ得ることを示す。
【0029】
本開示の１以上の実施形態の詳細を、以下の説明において述べる。本開示の他の特徴、目的及び有利な効果は、説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１は、マウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体の特性評価を示すグラフのセットである。（ａ）ｒＨＳＰ９０αで免疫したマウス由来の６個のハイブリドーマクローンの培養上清のＨＳＰ９０α結合能力についてのウェスタンブロット分析である。（ｂ）６個のハイブリドーマクローンの培養上清のＨＳＰ９０α結合活性についてのＥＬＩＳＡである。（ｃ）クローン２及びクローン６の抗体の双方を、κ軽鎖を含むＩｇＧ２ｂアイソタイプの免疫グロブリンとして同定するためのサブタイプの特性評価である。（ｄ）１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又はクローン２若しくはクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αで刺激したＰＡＮＣ－１細胞における、ＣＤ９１のＨＳＰ９０α及びＩＫＫαとのそれぞれの物理的結合のレベルについての近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）である。（ｅ）ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αで１６時間の前処置をしたＳＷ６２０、ＬｏＶｏ及びＢｘＰＣ－３細胞の細胞浸潤能力についてのトランスウェル浸潤アッセイである。（ｆ）１５μ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又はクローン２若しくはクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体とを加えたもので１６時間の前刺激をしたＳＷ６２０及びＰＡＮＣ－１細胞の細胞浸潤能力についてのトランスウェル浸潤アッセイである。（ｇ）１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又はクローン２若しくはクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体とを加えたもので１６時間の前処置をしたＳＷ６２０、ＰＡＮＣ－１及びＰａｎｃ０２細胞の細胞スフェロイド形成能力についてのアッセイである。
【図2】図２は、ヒト化抗ＨＳＰ９０α抗体の特性評価を示すグラフのセットである。（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いたクローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗ＨＳＰ９０α抗体のＨＳＰ９０α結合動態についてのアッセイである。（ｂ）クローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値である。結合センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて作成し、そして単純な１：１相互作用モデルにフィッティングした。（ｃ）１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又はクローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ若しくはクローン２－ｈＣ抗ＨＳＰ９０α抗体とを加えたもので１６時間の前処置をしたＰＡＮＣ－１細胞の細胞浸潤能力についてのトランスウェル浸潤アッセイである。（ｄ）１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又はクローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ若しくはクローン２－ｈＣ抗ＨＳＰ９０α抗体とを加えたもので１６時間の前処置をしたＰＡＮＣ－１細胞の細胞スフェロイド形成能力についてのアッセイである。（ｅ）連続した濃度の１７－ＡＡＧ及びＨＨ０１（すなわち、クローン２－ｈＡ）抗体でそれぞれ７２時間処置した際のＡＲＰＥ－１９網膜色素上皮細胞の生存能力である。（ｆ）１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内（ＩＶ）注入した後の雄マウスにおけるＨＨ０１抗体の薬物動態である。
【図3】図３は、クローン２－キメラ及びＨＨ０１（すなわち、クローン２－ｈＡ）抗ＨＳＰ９０α抗体のエピトープの同定を示すグラフのセットである。（ａ）いずれのＨＳＰ９０α領域がクローン２抗体との結合に関与したのかを明確にするドメインスキャニングアッセイである。（ｂ）ＨＳＰ９０αにおけるいずれの部位がクローン２－キメラ抗体との結合に関与したのかを調べるペプチドスキャニングアッセイである。（ｃ）ＨＳＰ９０αにおけるいずれの部位がＨＨ０１抗体との結合に関与したのかを調べるペプチドスキャニングアッセイである。（ｄ）ＨＳＰ９０αのいずれのａ．ａ．残基がクローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体との結合に重要であったかを決定するアラニンスキャニングアッセイである。（ｅ）１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１５μｇ／ｍｌのコントロールペプチド（Ｐ－ｃｔｒｌ）又はエピトープ含有ペプチド（Ｐ－４６）とを加えたもので１６時間の前処置をしたＰＡＮＣ－１細胞の細胞浸潤能力についてのトランスウェル浸潤アッセイである。（ｆ）１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αと１５μｇ／ｍｌのコントロールペプチド（Ｐ－ｃｔｒｌ）又はエピトープ含有ペプチド（Ｐ－４６）とを加えたもので１６時間の前処置をしたＰＡＮＣ－１細胞の細胞スフェロイド形成能力についてのアッセイである。
【図4】図４は、線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の予防的有効性の評価を示すグラフのセットである。（ａ）Ｐａｎｃ０２細胞単独由来の腫瘍では観察されなかった、ＥｎｄｏＭＴ細胞関与性Ｐａｎｃ０２腫瘍での腫瘍線維形成を明らかにするマッソントリクローム染色アッセイである。（ｂ）我々の線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおける予防的ＨＨ０１投与スケジュールを示す概略図である。（ｃ）コントロールＩｇＧ及びＨＨ０１抗体でそれぞれ処置したマウスからのＥｎｄｏＭＴ関与性Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長曲線をプロットする表在腫瘍体積の測定である。（ｄ）接種後３０日目に屠殺したマウスから得られた腫瘍重量である。（ｅ）コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したマウスからの腫瘍組織切片のマッソントリクローム染色である。（ｆ）Ｐａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片を皮下接種し、コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したマウスの血清ＨＳＰ９０αレベルである。
【図5】図５は、線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価を示すグラフのセットである。（ａ）我々の線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおける治療的ＨＨ０１投与スケジュールを示す概略図である。（ｂ）コントロールＩｇＧ及びＨＨ０１抗体でそれぞれ処置したマウスからのＥｎｄｏＭＴ関与性Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長曲線をプロットする表在腫瘍体積の測定である。（ｃ）接種後４１日目に屠殺したマウスから得られた腫瘍重量である。（ｄ）コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したマウスからの腫瘍切片のマッソントリクローム染色である。（ｅ）Ｐａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片を皮下接種し、コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したマウスの血清ＨＳＰ９０αレベルである。
【図6】図６は、線維形成性ヒト化マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価を示すグラフのセットである。（ａ）我々の線維形成性ヒト化マウスＰＤＡＣモデルにおける治療的ＨＨ０１投与スケジュールを示す概略図である。（ｂ）コントロールＩｇＧ、コントロールＩｇＧとゲムシタビンとを加えたもの及びＨＨ０１抗体とゲムシタビンとを加えたものでそれぞれ処置したマウスからのＥｎｄｏＭＴ関与性ＰＡＮＣ－１細胞移植片の腫瘍成長曲線をプロットする表在腫瘍体積の測定である。（ｃ）接種後３９日目に屠殺したマウスから得られた腫瘍重量である。（ｄ）異なる処置によるマウスからの腫瘍切片のマッソントリクローム染色である。（ｅ）ＰＡＮＣ－１＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片を皮下接種し、コントロールＩｇＧ、コントロールＩｇＧとゲムシタビンとを加えたもの又はＨＨ０１抗体とゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスの血清ＨＳＰ９０αレベルである。
【図7】図７は、Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄ誘導性線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価を示すグラフのセットである。（ａ）Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄ誘導性線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおける治療的ＨＨ０１投与スケジュールを示す概略図である。（ｂ）コントロールＩｇＧ及びＨＨ０１抗体でそれぞれ処置したＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスのカプランマイヤー生存曲線である。（ｃ）コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスからの膵臓及び肝臓の例並びにそれらの線維形成レベルである。（ｄ）コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスの血清ＨＳＰ９０αレベルである。
【図8】図８は、有意な腫瘍促進活性を示すｅＨＳＰ９０α誘導性Ｍ２型マクロファージを示すグラフのセットである。（ａ及びｂ）ｒＨＳＰ９０α処置マクロファージによるＰａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長の促進である。Ｐａｎｃ０２細胞を、単独又は１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ若しくは１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αで２４時間の前処置をしたＢＭＤＭとともに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注入した（群あたりｎ＝６）。発生する腫瘍のサイズを、バーニアキャリパーを用いて表面的に測定し、それらの体積を１／２×長さ×幅２の式で計算した（ａ）。接種後２８日目にマウスを屠殺し、腫瘍を除去した（ｂ）。＠は、「Ｐａｎｃ０２」又は「Ｐａｎｃ０２＋ＢＭＤＭ」と比較した場合、Ｐ＜０．０１である。（ｃ）（「Ｐａｎｃ０２」群として指定された）Ｐａｎｃ０２細胞単独又は（それぞれ「Ｐａｎｃ０２＋ＢＭＤＭ」群、「Ｐａｎｃ０２＋ＬＰＳ処置ＢＭＤＭ」群及び「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」群として指定された）ＰＢＳ処置、ＬＰＳ処置若しくはｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭと混合したＰａｎｃ０２細胞によって形成された腫瘍からのＦ４／８０、ＣＤ１６３、ＣＤ４及びＣＤ８の免疫組織化学染色分析である。Ｈ／Ｅは、ヘマトキシリン・エオジン染色である。（ｄ）「Ｐａｎｃ０２」、「Ｐａｎｃ０２＋ＢＭＤＭ」、「Ｐａｎｃ０２＋ＬＰＳ処置ＢＭＤＭ」及び「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」細胞移植片由来の腫瘍のＤＡＰＩ染色組織切片である。
【図9】図９は、Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価を示すグラフのセットである。（ａ）我々のＭ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルにおける治療的ＨＨ０１投与スケジュールを示す概略図である。（ｂ）コントロールＩｇＧ及びＨＨ０１抗体でそれぞれ処置したマウスからのＭ２－マクロファージ関与性Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長曲線をプロットする表在腫瘍体積の測定である。（ｃ）接種後４２日目に屠殺したマウスから得られた腫瘍重量である。（ｄ）Ｐａｎｃ０２＋Ｍ２－マクロファージ細胞移植片を皮下接種し、コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置したマウスの血清ＨＳＰ９０αレベルである。（ｅ）コントロールＩｇＧ及びＨＨ０１抗体で処置したマウスの腫瘍からのＣＤ１６３、ＣＤ２０４、ＣＤ４及びＣＤ８の免疫組織化学染色分析である。Ｈ／Ｅは、ヘマトキシリン・エオジン染色である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
ｅＨＳＰ９０αなどのＨＳＰ９０αに結合する新規の抗体が、ここに記載される。
【0032】
単離抗体は、２３５ＡＥＥＫＥＤＫＥＥＥ２４４及び２５１ＥＳＥＤＫＰＥＩＥＤ２６０領域にアミノ酸配列ＥＤＫを含むＨＳＰ９０αエピトープに特異的に結合可能な新規のＣＤＲを含み得る。
【0033】
単離抗体は、配列番号２又は配列番号１２の重鎖可変領域配列の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに配列番号７又は配列番号１７の軽鎖可変領域配列の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を備え得る。
【0034】
一態様では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２によるものであり、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号７によるものであり得る。いくつかの実施形態では、単離抗体は、配列番号２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域及び配列番号７の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であり得る軽鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号３の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４の配列を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号５の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号８の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０の配列を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域及び配列番号７の配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域を含む抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子も提供され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、重鎖可変領域をコードするための配列番号１の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である配列及び軽鎖可変領域をコードするための配列番号６の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である配列を含み得る。
【0035】
配列番号１～配列番号１０の配列を以下の表１に列挙する。
表１：クローン２抗ＨＳＰ９０α抗体
表１：クローン２抗ＨＳＰ９０α抗体
【表1】
【0036】
一態様では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１２によるものであり、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１７によるものであり得る。いくつかの実施形態では、単離抗体は、配列番号１２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域及び配列番号１７の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であり得る軽鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号１３の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１４の配列を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号１５の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１８の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１９の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号２０の配列を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域及び配列番号１７の配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域を含む抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子も提供され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、重鎖可変領域をコードするための配列番号１１の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である配列及び軽鎖可変領域をコードするための配列番号１６の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である配列を含み得る。
【0037】
配列番号１１～配列番号２０の配列を以下の表２に列挙する。
表２：ＨＨ０１抗ＨＳＰ９０α抗体
表２：ＨＨ０１抗ＨＳＰ９０α抗体
【表2】
【0038】
本抗体は、ＨＳＰ９０αに特異的に結合し得る。より具体的には、本抗体は、他の非ＨＳＰ９０αタンパク質よりも高い親和性でＨＳＰ９０αに結合し得る。さらに、重鎖又は軽鎖の可変領域のＣＤＲは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。
【0039】
ここに記載される抗体は、ｅＨＳＰ９０αに対して高い結合親和性を示す。したがって、ここに記載される抗体は、腫瘍成長をさらに抑制し又は腫瘍サイズを低下させるように、腫瘍内の線維形成を阻害し得る。
【0040】
ここに開示される抗体の配列及びそれらのＣＤＲに基づいて、当業者は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、種々の形態における抗ＨＳＰ９０α抗体を作製してもよく、作製された抗ＨＳＰ９０α抗体は、アミノ酸２３５～２４４及びアミノ酸２５１～２６０領域に２個のＥＤＫ部位を含むＨＳＰ９０αエピトープに特異的に結合し得る。
【0041】
ＨＳＰ９０αエピトープの配列に基づいて、合成ペプチドは、ｅＨＳＰ９０αの腫瘍促進機能を競合的に抑制し得る。
【0042】
ここに用いられる用語「抗体」は、抗原結合活性を有する種々の抗体構造物を含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、モノクローナル抗体、一価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を含む抗体を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【0043】
ここに記載される抗体を含む薬学的組成物も、ここに記載される。薬学的組成物は、ここに記載される単離抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【0044】
ここに記載される抗体をコードすることが可能な核酸分子を含む薬学的組成物も、ここに記載される。薬学的組成物は、ここに記載される抗体をコードすることが可能な核酸分子及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【0045】
用語「薬学的に許容可能な担体」は、担体が有効成分と適合性がある（例えば、抗体を安定化させることが可能である）べきであり、処置される被検体に有害であってはならないことを意味する。担体は、活性剤、補助剤、分散剤、湿潤剤及び懸濁化剤からなる群から選択される少なくとも１個であり得る。担体の例は、微結晶セルロース、マンニトール、グルコース、脱脂粉乳、ポリエチレン、ポリビニルプロリドン、デンプン又はそれらの組合せであり得るが、これらに限定されない。
【0046】
抗体、核酸分子又はそれらの１以上を含む薬学的組成物は、被検体に経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻腔的に、経口腔的に又は埋込型リザーバーを介して投与され得る。ここに用いられるような用語「非経口的」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注入又は点滴技術を含む。
【0047】
癌を処置するための医薬品の製造のための抗体又は核酸分子の使用も、ここに記載される。
【0048】
被検体における癌を処置する方法であって、有効量のここに記載される抗体又は核酸分子を被検体に投与するステップを備える方法も、ここに記載される。
【0049】
癌の例は、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、腎臓癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫を含む皮膚癌、小腸癌、胃癌、胸腺癌並びに甲状腺癌を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、癌は、線維形成の特徴を有し、特に、線維形成は、腫瘍細胞内又はその周囲に見られ得る。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌又は肺癌であり得る。
【0050】
ここに記載される抗体は、癌の線維形成、免疫抑制、成長及び転移を阻害し得る。
【0051】
用語「被検体」は、ヒト又は非ヒト動物をいう。
【0052】
用語「処置している」、「処置する」又は「処置」は、疾患、症状又は素因を治癒し、軽減し、緩和し、改変し、修正し、改善し又はそれらに影響を与える目的で、抗体、核酸分子又は薬学的組成物を被検体に適用又は投与することをいう。「有効量」は、被検体に所望の効果を与えるのに必要な抗体又は核酸分子の量をいう。当業者によって認識されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用及び他の活性剤の使用などの他の治療的な処置との併用の可能性に応じて変化する。
【0053】
本開示の１以上の実施形態の詳細を、以下の説明において述べる。本開示の他の特徴、目的及び有利な効果は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【実施例】
【0054】
さらなる詳述なしに、当業者であれば、上記説明に基づいて、本開示をその最大限に利用し得ると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いずれにしても開示の残りを限定するものではない。ここに引用されるすべての刊行物は、その全体において参照によって取り込まれる。
【0055】
材料及び方法
細胞培養
ヒトＰＤＡＣ細胞株ＰＡＮＣ－１を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）並びに１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ－グルタミンの混合物（１×ＰＳＧ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。ヒトＰＤＡＣ細胞株ＢｘＰＣ－３、ヒトＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０及びマウスＰＤＡＣ細胞株Ｐａｎｃ０２を、ＲＰＭＩ－１６４０培地に１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを加えたもので、５％のＣＯ２及び９５％の空気の雰囲気中で３７℃でインキュベーションした。同じ成長条件下で、ヒトＣＲＣ細胞株ＬｏＶｏを２０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地中で維持し、ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３０２（商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、バージニア州、マナッサス）を１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを補足したＡＴＣＣ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（ｃａｔ．＃３０－２００６、ＡＴＣＣ）中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、２０％のＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び３０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補足物（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国、マサチューセッツ州、ビレリカ）を含むＭ１９９培地で、３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で成長させた。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。ＥｎｄｏＭＴ誘導のために、ＨＵＶＥＣを２％のＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で１６時間プレインキュベーションし、そして０．３μｇ／ｍｌのＯＰＮを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。マウス内皮細胞株３Ｂ－１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１６０（商標））を１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で成長させた。ＥｎｄｏＭＴ誘導のために、３Ｂ－１１細胞を、１％のＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を代わりに用いた以外はＨＵＶＥＣと同様に処置した。マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を前述のように調製し、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを加えたものにおいて培養した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。
細胞培養
ヒトＰＤＡＣ細胞株ＰＡＮＣ－１を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）並びに１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ－グルタミンの混合物（１×ＰＳＧ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。ヒトＰＤＡＣ細胞株ＢｘＰＣ－３、ヒトＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０及びマウスＰＤＡＣ細胞株Ｐａｎｃ０２を、ＲＰＭＩ－１６４０培地に１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを加えたもので、５％のＣＯ２及び９５％の空気の雰囲気中で３７℃でインキュベーションした。同じ成長条件下で、ヒトＣＲＣ細胞株ＬｏＶｏを２０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地中で維持し、ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３０２（商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、バージニア州、マナッサス）を１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを補足したＡＴＣＣ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（ｃａｔ．＃３０－２００６、ＡＴＣＣ）中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、２０％のＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び３０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補足物（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国、マサチューセッツ州、ビレリカ）を含むＭ１９９培地で、３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で成長させた。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。ＥｎｄｏＭＴ誘導のために、ＨＵＶＥＣを２％のＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で１６時間プレインキュベーションし、そして０．３μｇ／ｍｌのＯＰＮを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。マウス内皮細胞株３Ｂ－１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１６０（商標））を１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で成長させた。ＥｎｄｏＭＴ誘導のために、３Ｂ－１１細胞を、１％のＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を代わりに用いた以外はＨＵＶＥＣと同様に処置した。マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を前述のように調製し、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ及び１×ＰＳＧを加えたものにおいて培養した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。
【0056】
マウスモデル
マウス実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可により行った（ＮＨＲＩ－ＩＡＣＵＣ－１０６０３１－Ａ、１０９０２２－Ｍ２－Ｓ０２及び１０９１９６－Ａ）。線維形成性腫瘍移植モデルを確立するため、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２細胞及びＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦ（すなわち、ＯＰＮ処置３Ｂ－１１細胞）の混合物を皮下接種した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８及びＣｈｕａ ＫＶ、Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｈｓｉｅｈ ＳＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｏｃｔｙｌ ｇａｌｌａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌｓ ２０２０年；９（１）：９１参照。さらなるマウスの処置及びスケジュールは、図面及び関連テキストに示した通りであった。発生する腫瘍のサイズを、バーニアキャリパーで表面的に測定し、腫瘍体積を１／２×長さ×幅２の式で計算した。マウスを屠殺した場合、実際の腫瘍を重量測定した。ヒト化マウスにおける線維形成性腫瘍移植モデルを確立するために、ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）を移植したＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｎｕｌｌ（ＡＳＩＤ）マウスに、ＰＡＮＣ－１細胞及びＯＰＮ処置ＨＵＶＥＣの混合物を皮下接種した。採用されたｈＨＳＣ移植ＡＳＩＤマウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾、台北）で生産され、いずれも全リンパ球の３８％超のヒトＣＤ４５＋細胞レベルを含んでいた。Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルを確立するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰａｎｃ０２細胞及びｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭの混合物を皮下接種した。さらなるマウスの処置及びスケジュールは、図面及び関連テキストに示した通りであった。さらに、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅトランスジェニックマウスを、自発的ＰＤＡＣ発症マウスモデルとして採用してＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ及びＰｄｘ１－Ｃｒｅブリーダーマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（米国、メリーランド州、フレデリック）から得た。ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２ＤマウスをＰｄｘ１－Ｃｒｅマウスと交配させてＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスを作製した。さらなるマウスの処置を、図面及び関連テキストに示すように行った。
マウス実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可により行った（ＮＨＲＩ－ＩＡＣＵＣ－１０６０３１－Ａ、１０９０２２－Ｍ２－Ｓ０２及び１０９１９６－Ａ）。線維形成性腫瘍移植モデルを確立するため、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２細胞及びＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦ（すなわち、ＯＰＮ処置３Ｂ－１１細胞）の混合物を皮下接種した。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８及びＣｈｕａ ＫＶ、Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｈｓｉｅｈ ＳＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｏｃｔｙｌ ｇａｌｌａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ＨＳＰ９０α ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌｓ ２０２０年；９（１）：９１参照。さらなるマウスの処置及びスケジュールは、図面及び関連テキストに示した通りであった。発生する腫瘍のサイズを、バーニアキャリパーで表面的に測定し、腫瘍体積を１／２×長さ×幅２の式で計算した。マウスを屠殺した場合、実際の腫瘍を重量測定した。ヒト化マウスにおける線維形成性腫瘍移植モデルを確立するために、ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）を移植したＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｎｕｌｌ（ＡＳＩＤ）マウスに、ＰＡＮＣ－１細胞及びＯＰＮ処置ＨＵＶＥＣの混合物を皮下接種した。採用されたｈＨＳＣ移植ＡＳＩＤマウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾、台北）で生産され、いずれも全リンパ球の３８％超のヒトＣＤ４５＋細胞レベルを含んでいた。Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルを確立するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰａｎｃ０２細胞及びｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭの混合物を皮下接種した。さらなるマウスの処置及びスケジュールは、図面及び関連テキストに示した通りであった。さらに、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅトランスジェニックマウスを、自発的ＰＤＡＣ発症マウスモデルとして採用してＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ及びＰｄｘ１－Ｃｒｅブリーダーマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（米国、メリーランド州、フレデリック）から得た。ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２ＤマウスをＰｄｘ１－Ｃｒｅマウスと交配させてＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスを作製した。さらなるマウスの処置を、図面及び関連テキストに示すように行った。
【0057】
ウェスタンブロット分析
マウスハイブリドーマを、従来のプロトコルに従って７３２アミノ酸（ａ．ａ．）の組換え完全長ヒトＨＳＰ９０α（ｒＨＳＰ９０α；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、米国、ニュージャージー州、クランベリー）で免疫したマウスから生成した。Ｙｏｋｏｙａｍａ ＷＭ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｎｄ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００８年；８３：１１．１０．１－１１．１０．１０参照。次に、ウェスタンブロット分析の一般的な手順を採用してハイブリドーマを予備的にスクリーニングした。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。ハイブリドーマの培養培地を採取して電気泳動後のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルからブロッティングしたＨＳＰ９０α及び分子量マーカータンパク質を含む膜ストリップと反応させた。ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を加えたもので２回洗浄した後、膜ストリップをホースラディッシュペルオキシダーゼ標識２次抗体で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴでの３回の洗浄に続いて、０．０１５％のＨ２Ｏ２中の０．３ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）との反応後、免疫反応性タンパク質のバンドが目視可能となった。
マウスハイブリドーマを、従来のプロトコルに従って７３２アミノ酸（ａ．ａ．）の組換え完全長ヒトＨＳＰ９０α（ｒＨＳＰ９０α；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、米国、ニュージャージー州、クランベリー）で免疫したマウスから生成した。Ｙｏｋｏｙａｍａ ＷＭ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｎｄ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００８年；８３：１１．１０．１－１１．１０．１０参照。次に、ウェスタンブロット分析の一般的な手順を採用してハイブリドーマを予備的にスクリーニングした。Ｆａｎ ＣＳ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｈｓｕ ＴＡ他、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｈａｒｎｅｓｓｅｓ ＨＳＰ９０α－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｍ２－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１９年；１２：１３８参照。ハイブリドーマの培養培地を採取して電気泳動後のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルからブロッティングしたＨＳＰ９０α及び分子量マーカータンパク質を含む膜ストリップと反応させた。ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を加えたもので２回洗浄した後、膜ストリップをホースラディッシュペルオキシダーゼ標識２次抗体で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴでの３回の洗浄に続いて、０．０１５％のＨ２Ｏ２中の０．３ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）との反応後、免疫反応性タンパク質のバンドが目視可能となった。
【0058】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
調製した抗体のＨＳＰ９０α結合活性をアッセイするために、９６ウェルプレートを、捕捉緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）中の１２．５ｎｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αで、４℃での一晩のインキュベーションによってコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、そして、ＰＢＳＴに３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものでブロッキングした。調製した抗体を付加し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識２次抗体を添加し、３７℃でさらに１時間インキュベーションした。３回の洗浄後、０．０１５％のＨ２Ｏ２中の０．３ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを各ウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベーションした。反応を０．５ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって停止させ、ＯＤ４５０値をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社、スイス、メンネドルフ）によって測定した。さらに、抗ＨＳＰ９０α抗体の免疫グロブリン（ＩｇＧ）アイソタイプの特性評価を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ！（商標）Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いることによって行った。ＥＬＩＳＡのプロトコルを、以前に説明したように、マウス血清サンプルの分泌されたＨＳＰ９０αレベルのアッセイにも用いた。Ｃｈｅｎ ＪＳ、Ｈｓｕ ＹＭ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｅｅ ＣＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０α ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ９１／ＬＲＰ－１ ａｎｄ ＮＦ－κＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０年；２８５（３３）：２５４５８－６６参照。
調製した抗体のＨＳＰ９０α結合活性をアッセイするために、９６ウェルプレートを、捕捉緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）中の１２．５ｎｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αで、４℃での一晩のインキュベーションによってコーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、そして、ＰＢＳＴに３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものでブロッキングした。調製した抗体を付加し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識２次抗体を添加し、３７℃でさらに１時間インキュベーションした。３回の洗浄後、０．０１５％のＨ２Ｏ２中の０．３ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを各ウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベーションした。反応を０．５ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって停止させ、ＯＤ４５０値をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社、スイス、メンネドルフ）によって測定した。さらに、抗ＨＳＰ９０α抗体の免疫グロブリン（ＩｇＧ）アイソタイプの特性評価を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ！（商標）Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いることによって行った。ＥＬＩＳＡのプロトコルを、以前に説明したように、マウス血清サンプルの分泌されたＨＳＰ９０αレベルのアッセイにも用いた。Ｃｈｅｎ ＪＳ、Ｈｓｕ ＹＭ、Ｃｈｅｎ ＣＣ、Ｃｈｅｎ ＬＬ、Ｌｅｅ ＣＣ、Ｈｕａｎｇ ＴＳ、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０α ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ９１／ＬＲＰ－１ ａｎｄ ＮＦ－κＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０年；２８５（３３）：２５４５８－６６参照。
【0059】
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）
ガラスカバースリップに、２２×２２ｍｍのカバースリップあたり２×１０５個の細胞の密度で播種したＰＡＮＣ－１細胞を、０．５％の血清含有培地で３７℃でかつ５％のＣＯ２の加湿雰囲気で１６時間インキュベーションした。そして、細胞に、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。そして、処置した細胞を３％のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ ｋｉｔ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スウェーデン、ウプサラ）において提供されるブロッキング溶液でブロッキングした。さらに、細胞サンプルを、抗ＨＳＰ９０α抗体（１：８０、ｃａｔ．＃ＡＨＰ－１３３９、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社、米国、ノースカロライナ州、ローリー）又は抗ＩＫＫα抗体（１：８０、ｃａｔ．＃３２８５、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社、米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム）と混合した抗ＣＤ９１抗体（１：８０、ｃａｔ．＃５５０４９５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、カリフォルニア州、サンノゼ）とともに、４℃で一晩インキュベーションした。トリス緩衝生理食塩水に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたもので２回洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ ｋｉｔの製造業者の指示に従って、細胞サンプルを後続のライゲーション及び増幅の手順のためのＰＬＡプローブとともにインキュベーションした。最後に、核を４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で対比染色した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ＩＩ共焦点顕微鏡及びＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅ ４．０ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ社、ドイツ、ヴェッツラー）を用いて撮影及び分析した。
ガラスカバースリップに、２２×２２ｍｍのカバースリップあたり２×１０５個の細胞の密度で播種したＰＡＮＣ－１細胞を、０．５％の血清含有培地で３７℃でかつ５％のＣＯ２の加湿雰囲気で１６時間インキュベーションした。そして、細胞に、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。そして、処置した細胞を３％のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ ｋｉｔ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スウェーデン、ウプサラ）において提供されるブロッキング溶液でブロッキングした。さらに、細胞サンプルを、抗ＨＳＰ９０α抗体（１：８０、ｃａｔ．＃ＡＨＰ－１３３９、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社、米国、ノースカロライナ州、ローリー）又は抗ＩＫＫα抗体（１：８０、ｃａｔ．＃３２８５、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社、米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム）と混合した抗ＣＤ９１抗体（１：８０、ｃａｔ．＃５５０４９５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、カリフォルニア州、サンノゼ）とともに、４℃で一晩インキュベーションした。トリス緩衝生理食塩水に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたもので２回洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ ｋｉｔの製造業者の指示に従って、細胞サンプルを後続のライゲーション及び増幅の手順のためのＰＬＡプローブとともにインキュベーションした。最後に、核を４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で対比染色した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ＩＩ共焦点顕微鏡及びＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅ ４．０ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ社、ドイツ、ヴェッツラー）を用いて撮影及び分析した。
【0060】
トランスウェル浸潤アッセイ
３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で、癌細胞を０．５％のＦＢＳ含有培地中で１６時間の血清飢餓にさせ、そして、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加した。さらに２４時間後、処置した細胞を０．５％のＦＢＳ含有培養培地におけるアリコートとして収穫し（１アリコートあたり１×１０５個の細胞）、そして、各アリコートを５倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でプレコーティングしたトランスウェルのインサートの上部チャンバーに播種した。細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通じて培養培地に１０％のＦＢＳを加えたものを含む底部チャンバーへと１６時間浸潤させた。そして、トランスウェルのインサートのフィルターを固定し、ギムザで染色した。フィルター下側の浸潤細胞をＡｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ、オーバーコッヘン）を用いて撮影し、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、米国、メリーランド州、シルバースプリング）によってさらに定量化した。
３７℃かつ５％のＣＯ２の加湿インキュベーター内で、癌細胞を０．５％のＦＢＳ含有培地中で１６時間の血清飢餓にさせ、そして、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加した。さらに２４時間後、処置した細胞を０．５％のＦＢＳ含有培養培地におけるアリコートとして収穫し（１アリコートあたり１×１０５個の細胞）、そして、各アリコートを５倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でプレコーティングしたトランスウェルのインサートの上部チャンバーに播種した。細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通じて培養培地に１０％のＦＢＳを加えたものを含む底部チャンバーへと１６時間浸潤させた。そして、トランスウェルのインサートのフィルターを固定し、ギムザで染色した。フィルター下側の浸潤細胞をＡｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ、オーバーコッヘン）を用いて撮影し、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、米国、メリーランド州、シルバースプリング）によってさらに定量化した。
【0061】
細胞スフェロイド形成アッセイ（細胞自己再生活性アッセイ）
厚さ４ｍｍの０．５％のアガロース層でプレコーティングした２４ウェルプレートの各ウェルに１０００個の癌細胞を播種した。無血清培地で、３７℃でかつ５％のＣＯ２の加湿雰囲気で２４時間のインキュベーション後、細胞に、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加した。インキュベーションを、３日ごとの新鮮な無血清培地の補足により１０～１４日間にわたって維持した。最後に、密着した、付着していない、かつ１００μｍより大きい直径によって特性付けられる細胞スフェロイドをＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１倒立顕微鏡（米国、ペンシルベニア州、センターバレー）で撮影及び計数した。スフェロイド形成％を、式：（細胞スフェロイド数／１０００）×１００％によって計算した。
厚さ４ｍｍの０．５％のアガロース層でプレコーティングした２４ウェルプレートの各ウェルに１０００個の癌細胞を播種した。無血清培地で、３７℃でかつ５％のＣＯ２の加湿雰囲気で２４時間のインキュベーション後、細胞に、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ又は試験される抗ＨＳＰ９０α抗体の非存在下又は存在下で、ＰＢＳ又は１５μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０αを添加した。インキュベーションを、３日ごとの新鮮な無血清培地の補足により１０～１４日間にわたって維持した。最後に、密着した、付着していない、かつ１００μｍより大きい直径によって特性付けられる細胞スフェロイドをＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１倒立顕微鏡（米国、ペンシルベニア州、センターバレー）で撮影及び計数した。スフェロイド形成％を、式：（細胞スフェロイド数／１０００）×１００％によって計算した。
【0062】
ハイブリドーマ細胞からのマウス抗体遺伝子のクローニング及び配列決定
トータルＲＮＡを、抗ＨＳＰ９０α ＩｇＧ産生マウスハイブリドーマ細胞から単離し、逆転写酵素とランダムヘキサマーとを加えたものによってｃＤＮＡに変換した。Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＩｇＧ重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の可変ドメイン（すなわち、ＶＨ及びＶＬドメイン）のＰＣＲ増幅のために用いた。ＰＣＲ産物をＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）において供給されるｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔクローニングベクターにクローニングし、続けてクローン選択及びＤＮＡ配列分析を行った。
トータルＲＮＡを、抗ＨＳＰ９０α ＩｇＧ産生マウスハイブリドーマ細胞から単離し、逆転写酵素とランダムヘキサマーとを加えたものによってｃＤＮＡに変換した。Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＩｇＧ重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の可変ドメイン（すなわち、ＶＨ及びＶＬドメイン）のＰＣＲ増幅のために用いた。ＰＣＲ産物をＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）において供給されるｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔクローニングベクターにクローニングし、続けてクローン選択及びＤＮＡ配列分析を行った。
【0063】
組換え抗体の構築及び発現
ＩｇＧ ＶＨ及びＶＬドメインのｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ社（台湾、桃園）によって合成し、ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１及びｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋプラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）に、Ｈ及びＬ鎖の定常ドメイン（すなわち、ＣＨ及びＣＬドメイン）をコードする領域の直前の部位にそれぞれ挿入した。ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１クローニングについて、ＶＨ ｃＤＮＡをヒトＩＬ－２シグナル配列の後のＥｃｏＲＩ－ＮｈｅＩ部位に挿入し、Ｑ２５０Ｔ、Ｅ３５６Ｄ、Ｍ３５８Ｌ及びＬ４２８Ｍ残基に突然変異を有するＦｃフラグメントを含む組換えタンパク質を発現させた。一方、ＶＬドメインのｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩによる消化後、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋプラスミドに挿入した。組換えＩｇＧ Ｈ及びＬ鎖をコードする組換えＤＮＡ配列を、ｈＩｇＨＧ－Ｆ／ｈＩｇＨＧ－Ｒ及びＣＬＩｇ－Ｆ／ＣＬＩｇ－Ｒプライマーを用いてさらに増幅し、そして、それぞれｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。最後に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞に、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする組換えｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯプラスミドを２：３の比によってコトランスフェクションした。トランスフェクションされたＥｘｐｉＣＨＯ細胞の培地を、８～１０日間の培養後に収穫した。組換え抗体をＧｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロテインＡカラムによって精製した。
ＩｇＧ ＶＨ及びＶＬドメインのｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ社（台湾、桃園）によって合成し、ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１及びｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋプラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）に、Ｈ及びＬ鎖の定常ドメイン（すなわち、ＣＨ及びＣＬドメイン）をコードする領域の直前の部位にそれぞれ挿入した。ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１クローニングについて、ＶＨ ｃＤＮＡをヒトＩＬ－２シグナル配列の後のＥｃｏＲＩ－ＮｈｅＩ部位に挿入し、Ｑ２５０Ｔ、Ｅ３５６Ｄ、Ｍ３５８Ｌ及びＬ４２８Ｍ残基に突然変異を有するＦｃフラグメントを含む組換えタンパク質を発現させた。一方、ＶＬドメインのｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩによる消化後、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋプラスミドに挿入した。組換えＩｇＧ Ｈ及びＬ鎖をコードする組換えＤＮＡ配列を、ｈＩｇＨＧ－Ｆ／ｈＩｇＨＧ－Ｒ及びＣＬＩｇ－Ｆ／ＣＬＩｇ－Ｒプライマーを用いてさらに増幅し、そして、それぞれｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。最後に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞に、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする組換えｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯプラスミドを２：３の比によってコトランスフェクションした。トランスフェクションされたＥｘｐｉＣＨＯ細胞の培地を、８～１０日間の培養後に収穫した。組換え抗体をＧｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロテインＡカラムによって精製した。
【0064】
抗体のヒト化及び最適化
マウスモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２領域を、計算手法を活用してヒト化させ、すべての計算をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２０１８ソフトウェア（ＢＩＯＶＩ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）によって行った。相補性決定領域（ＣＤＲ）を、公表された方法によって同定した。Ｋａｂａｔ ＥＡ、Ｗｕ ＴＴ、Ｐｅｒｒｙ ＨＭ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ、Ｆｏｅｌｌｅｒ Ｃ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年参照。ＶＬ及びＶＨドメインの３次元（３Ｄ）構造を、それぞれＰｄｂＩＤ：４Ｘ０Ｋ及びＰｄｂＩＤ：４Ｙ５ＸのＸ線テンプレートによってモデリングした。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＬ、Ｅｎｔｚｍｉｎｇｅｒ ＫＣ、Ｈｙｕｎ Ｊ、Ｋａｌｙｏｎｃｕ Ｓ、Ｈｅａｎｅｒ ＤＰ、Ｍｏｒａｌｅｓ Ｊｒ ＩＡ、Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ａ、Ｇｕｍｂａｒｔ ＪＣ、Ｍａｙｎａｒｄ ＪＡ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＲＬ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２０１５年；７１：８９６－９０６及びＭｏｒａｇａ Ｉ、Ｗｅｒｎｉｇ Ｇ、Ｗｉｌｍｅｓ Ｓ、Ｇｒｙｓｈｋｏｖａ Ｖ、Ｒｉｃｈｔｅｒ ＣＰ、Ｈｏｎｇ ＷＪ、Ｓｉｎｈａ Ｒ、Ｇｕｏ Ｆ、Ｆａｂｉｏｎａｒ Ｈ、Ｗｅｈｒｍａｎ ＴＳ、Ｋｒｕｔｚｉｋ Ｐ、Ｄｅｍｈａｒｔｅｒ Ｓ、Ｐｌｏ Ｉ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ、Ｍｉｎａｒｙ Ｍａｊｅｔｉ ＰＲ、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ ＳＮ、Ｐｉｅｈｌｅｒ Ｊ、Ｇａｒｃｉａ ＫＣ、Ｔｕｎｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅ－ｏｒｉｅｎｔｉｎｇ ｄｉｍｅｒ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃｅｌｌ ２０１５年；１６０：１１９６－１２０８参照。さらなる３次元構造計算のために、マウス抗体のＣＤＲをインハウスのヒトテンプレート内に移植した。組換え抗体を改善する突然変異の提案に関して、計算は、凝集、翻訳後修飾、プロテアーゼ切断、薬物動態及び安定性の側面を含んだ。
マウスモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２領域を、計算手法を活用してヒト化させ、すべての計算をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２０１８ソフトウェア（ＢＩＯＶＩ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）によって行った。相補性決定領域（ＣＤＲ）を、公表された方法によって同定した。Ｋａｂａｔ ＥＡ、Ｗｕ ＴＴ、Ｐｅｒｒｙ ＨＭ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ、Ｆｏｅｌｌｅｒ Ｃ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年参照。ＶＬ及びＶＨドメインの３次元（３Ｄ）構造を、それぞれＰｄｂＩＤ：４Ｘ０Ｋ及びＰｄｂＩＤ：４Ｙ５ＸのＸ線テンプレートによってモデリングした。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＬ、Ｅｎｔｚｍｉｎｇｅｒ ＫＣ、Ｈｙｕｎ Ｊ、Ｋａｌｙｏｎｃｕ Ｓ、Ｈｅａｎｅｒ ＤＰ、Ｍｏｒａｌｅｓ Ｊｒ ＩＡ、Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ａ、Ｇｕｍｂａｒｔ ＪＣ、Ｍａｙｎａｒｄ ＪＡ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＲＬ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２０１５年；７１：８９６－９０６及びＭｏｒａｇａ Ｉ、Ｗｅｒｎｉｇ Ｇ、Ｗｉｌｍｅｓ Ｓ、Ｇｒｙｓｈｋｏｖａ Ｖ、Ｒｉｃｈｔｅｒ ＣＰ、Ｈｏｎｇ ＷＪ、Ｓｉｎｈａ Ｒ、Ｇｕｏ Ｆ、Ｆａｂｉｏｎａｒ Ｈ、Ｗｅｈｒｍａｎ ＴＳ、Ｋｒｕｔｚｉｋ Ｐ、Ｄｅｍｈａｒｔｅｒ Ｓ、Ｐｌｏ Ｉ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ、Ｍｉｎａｒｙ Ｍａｊｅｔｉ ＰＲ、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ ＳＮ、Ｐｉｅｈｌｅｒ Ｊ、Ｇａｒｃｉａ ＫＣ、Ｔｕｎｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅ－ｏｒｉｅｎｔｉｎｇ ｄｉｍｅｒ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃｅｌｌ ２０１５年；１６０：１１９６－１２０８参照。さらなる３次元構造計算のために、マウス抗体のＣＤＲをインハウスのヒトテンプレート内に移植した。組換え抗体を改善する突然変異の提案に関して、計算は、凝集、翻訳後修飾、プロテアーゼ切断、薬物動態及び安定性の側面を含んだ。
【0065】
ＨＳＰ９０α結合親和性アッセイ
抗ＨＳＰ９０α抗体のＨＳＰ９０α結合特性を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ社、米国、マサチューセッツ州、マールボロ）を用いて結合動態アッセイを行った。関心となる抗ＨＳＰ９０α抗体を、リガンドとしてプロテインＡシリーズＳセンサーチップに約３０００～５０００反応単位に達するように適用した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の一連の濃度のｒＨＳＰ９０α（１．５６２５～１００ｎＭ）をチップ表面にわたって注入した。結合を６０秒間モニタリングし、最終的な解離時間は１５００秒であった。
抗ＨＳＰ９０α抗体のＨＳＰ９０α結合特性を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ社、米国、マサチューセッツ州、マールボロ）を用いて結合動態アッセイを行った。関心となる抗ＨＳＰ９０α抗体を、リガンドとしてプロテインＡシリーズＳセンサーチップに約３０００～５０００反応単位に達するように適用した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の一連の濃度のｒＨＳＰ９０α（１．５６２５～１００ｎＭ）をチップ表面にわたって注入した。結合を６０秒間モニタリングし、最終的な解離時間は１５００秒であった。
【0066】
網膜細胞毒性アッセイ
ＡＲＰＥ－１９細胞をウェルあたり４０００個の細胞の密度で９６ウェルプレート上に播種し、そして、種々の濃度の１７－ＡＡＧ又は抗ＨＳＰ９０α抗体ＨＨ０１でトリプリケートで７２時間処置した。３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）（ＭＴＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）アッセイを採用し、ＯＤ４９０を測定して各処置における細胞生存能力を評価した。
ＡＲＰＥ－１９細胞をウェルあたり４０００個の細胞の密度で９６ウェルプレート上に播種し、そして、種々の濃度の１７－ＡＡＧ又は抗ＨＳＰ９０α抗体ＨＨ０１でトリプリケートで７２時間処置した。３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）（ＭＴＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）アッセイを採用し、ＯＤ４９０を測定して各処置における細胞生存能力を評価した。
【0067】
薬物動態アッセイ
抗ＨＳＰ９０α抗体ＨＨ０１の薬物動態プロファイルを、Ｂｌｔｗ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄マウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ社、台湾、台北）において検討した。マウスあたり２５～３０ｇの体重を有するマウス（ｎ＝５）に、１０ｍｇ／ｋｇのＨＨ０１抗体を静脈内注入した。餌及び水は、常に自由に摂取可能とした。ＨＨ０１抗体の血清曝露レベルの決定のために、血液サンプルを、投与後０．０４、０．０８、０．２５、１、２、３、７、９、１４、１６、１８、２１、２３、２５、３５、４２、４９、５６及び６３日目に採取した。これらのサンプルについて、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国、ミシガン州）によってヒトＩｇＧ１レベルをさらに測定してマウス血清中に残存するＨＨ０１レベルを表した。
抗ＨＳＰ９０α抗体ＨＨ０１の薬物動態プロファイルを、Ｂｌｔｗ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄マウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ社、台湾、台北）において検討した。マウスあたり２５～３０ｇの体重を有するマウス（ｎ＝５）に、１０ｍｇ／ｋｇのＨＨ０１抗体を静脈内注入した。餌及び水は、常に自由に摂取可能とした。ＨＨ０１抗体の血清曝露レベルの決定のために、血液サンプルを、投与後０．０４、０．０８、０．２５、１、２、３、７、９、１４、１６、１８、２１、２３、２５、３５、４２、４９、５６及び６３日目に採取した。これらのサンプルについて、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国、ミシガン州）によってヒトＩｇＧ１レベルをさらに測定してマウス血清中に残存するＨＨ０１レベルを表した。
【0068】
完全長及び切断されたＨＳＰ９０αのクローニング、発現及び精製
完全長ＨＳＰ９０α（ａ．ａ．１～７３２）並びにＮ末端とリンカードメインとを加えたもの（ａ．ａ．１～２７２）、Ｎ末端からミドルドメイン（ａ．ａ．１～６２９）及びＣ末端ドメイン（ａ．ａ．６３０～７３２）を含むその３個の切断されたフラグメントをクローニングし、発現させ、精製した。簡潔には、８×Ｈｉｓタグを有する各ｃＤＮＡ配列を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を含むプライマーで、ヒトＯＲＦクローン（ＮＭ＿００５３４８）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素で消化し、そして、ｐＥＴ－２３ａプラスミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に挿入した。そして、組換えプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）コンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ社、米国、ウィスコンシン州、ミドルトン）にトランスフォーメーションし、組換え構築物の発現をイソプロピル－Ｄ－チオガラクト－ピラノシドの添加によって刺激した。発現したヒスチジンタグ付けされた完全長及び切断されたＨＳＰ９０αを、製造業者の指示に従ってＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、米国、メリーランド州、ジャーマンタウン）を用いることによってさらに精製した。精製したタンパク質を、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ、７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴからなる保存緩衝液に対して最終的に透析し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ハーキュリーズ）によって決定した。
完全長ＨＳＰ９０α（ａ．ａ．１～７３２）並びにＮ末端とリンカードメインとを加えたもの（ａ．ａ．１～２７２）、Ｎ末端からミドルドメイン（ａ．ａ．１～６２９）及びＣ末端ドメイン（ａ．ａ．６３０～７３２）を含むその３個の切断されたフラグメントをクローニングし、発現させ、精製した。簡潔には、８×Ｈｉｓタグを有する各ｃＤＮＡ配列を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を含むプライマーで、ヒトＯＲＦクローン（ＮＭ＿００５３４８）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素で消化し、そして、ｐＥＴ－２３ａプラスミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に挿入した。そして、組換えプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）コンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ社、米国、ウィスコンシン州、ミドルトン）にトランスフォーメーションし、組換え構築物の発現をイソプロピル－Ｄ－チオガラクト－ピラノシドの添加によって刺激した。発現したヒスチジンタグ付けされた完全長及び切断されたＨＳＰ９０αを、製造業者の指示に従ってＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、米国、メリーランド州、ジャーマンタウン）を用いることによってさらに精製した。精製したタンパク質を、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ、７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴからなる保存緩衝液に対して最終的に透析し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ハーキュリーズ）によって決定した。
【0069】
エピトープの決定
最初に、ドメインスキャニング戦略を用いて、我々の調製した抗体との結合に関与するＨＳＰ９０α領域をおおよそ明確にした。上記の完全長ＨＳＰ９０α及びその３個の切断されたフラグメントを採用して、試験されるマウスモノクローナル抗体の結合活性をアッセイするために９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。結果は、試験されるマウスモノクローナル抗体がＨＳＰ９０αのａ．ａ．１～２７２領域に結合することを示唆した。したがって、ペプチドスキャニング戦略では、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２１～２７２領域の配列にまたがるように２個のａ．ａ．ずつオフセットする一連の１０－ａ．ａ．のペプチドからなる１３２個のペプチドのライブラリーをＭｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｐｔｙ社（オーストラリア、ビクトリア州、メルボルン）によって合成した。この一連のペプチドを用いて、試験される抗体の結合活性をアッセイするために９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ペプチドスキャニングの結果によって示唆される配列に基づいて、アラニンスキャニング戦略をさらに採用していずれのａ．ａ．残基が試験される抗体の結合に重要であるかを調べた。ペプチドスキャニングアッセイの結果は、試験される抗体と結合するエピトープとしてＨＳＰ９０αの２３５ＡＥＥＫＥＤＫＥＥＥ２４４及び２５１ＥＳＥＤＫＰＥＩＥＤ２６０を示唆し、したがって、１９個のペプチドを、各ａ．ａ．をアラニンによって順次置換して合成した（Ｇｅｎｏｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、台湾、台北）。これらのペプチドに、上記のようにＥＬＩＳＡを行った。
最初に、ドメインスキャニング戦略を用いて、我々の調製した抗体との結合に関与するＨＳＰ９０α領域をおおよそ明確にした。上記の完全長ＨＳＰ９０α及びその３個の切断されたフラグメントを採用して、試験されるマウスモノクローナル抗体の結合活性をアッセイするために９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。結果は、試験されるマウスモノクローナル抗体がＨＳＰ９０αのａ．ａ．１～２７２領域に結合することを示唆した。したがって、ペプチドスキャニング戦略では、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２１～２７２領域の配列にまたがるように２個のａ．ａ．ずつオフセットする一連の１０－ａ．ａ．のペプチドからなる１３２個のペプチドのライブラリーをＭｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｐｔｙ社（オーストラリア、ビクトリア州、メルボルン）によって合成した。この一連のペプチドを用いて、試験される抗体の結合活性をアッセイするために９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ペプチドスキャニングの結果によって示唆される配列に基づいて、アラニンスキャニング戦略をさらに採用していずれのａ．ａ．残基が試験される抗体の結合に重要であるかを調べた。ペプチドスキャニングアッセイの結果は、試験される抗体と結合するエピトープとしてＨＳＰ９０αの２３５ＡＥＥＫＥＤＫＥＥＥ２４４及び２５１ＥＳＥＤＫＰＥＩＥＤ２６０を示唆し、したがって、１９個のペプチドを、各ａ．ａ．をアラニンによって順次置換して合成した（Ｇｅｎｏｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、台湾、台北）。これらのペプチドに、上記のようにＥＬＩＳＡを行った。
【0070】
マッソントリクローム染色
マウスパラフィン包埋組織切片をキシレンによって脱パラフィン化し、一連のエタノール希釈物によって再水和した。マッソントリクローム染色を、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ユタ州）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。染色した切片を、段階的なエタノール溶液及びキシレン中で脱水し、最終的に封入溶液で、暗所で一晩、室温で封入した。切片を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システムを用いて観察及び撮影した。
マウスパラフィン包埋組織切片をキシレンによって脱パラフィン化し、一連のエタノール希釈物によって再水和した。マッソントリクローム染色を、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ユタ州）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。染色した切片を、段階的なエタノール溶液及びキシレン中で脱水し、最終的に封入溶液で、暗所で一晩、室温で封入した。切片を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システムを用いて観察及び撮影した。
【0071】
免疫組織化学染色
４μｍの厚さを有するマウス組織切片を、キシレンによって脱パラフィン化し、段階的なエタノール希釈物中で再水和した。抗原賦活化を、１０ｍＭのクエン酸緩衝液中でｐＨ６．０において高圧下で切片を１５分間加熱することによって行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を０．３％のＨ２Ｏ２によってブロッキングした。染色前に、切片を、ＰＢＳに３％のＢＳＡを加えたものによって加湿チャンバー内で室温で３０分間ブロッキングした。次いで、抗Ｆ４／８０抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＭＣＡ４９７Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ１６３抗体（１：８０、ｃａｔ．＃ｓｃ－３３５６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）、抗ＣＤ２０４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ５１７４９、ＧｅｎｅＴｅｘ社、台湾、新竹市）、抗ＣＤ４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ４４５３１、ＧｅｎｅＴｅｘ社）又は抗ＣＤ８抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１６６９６、ＧｅｎｅＴｅｘ社）を付加し、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄した後、２次抗体を付加し、室温で３０分間インキュベーションした。切片をＤＡＫＯ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（デンマーク、グロストルプ、Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎｓｖｅｊ ４２、ＤＫ－２６００）を用いてさらに検出し、ヘマトキシリンで対比染色した。染色した切片を脱水し、封入溶液で封入し、最終的にＡｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システムを用いて観察及び撮影した。
４μｍの厚さを有するマウス組織切片を、キシレンによって脱パラフィン化し、段階的なエタノール希釈物中で再水和した。抗原賦活化を、１０ｍＭのクエン酸緩衝液中でｐＨ６．０において高圧下で切片を１５分間加熱することによって行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を０．３％のＨ２Ｏ２によってブロッキングした。染色前に、切片を、ＰＢＳに３％のＢＳＡを加えたものによって加湿チャンバー内で室温で３０分間ブロッキングした。次いで、抗Ｆ４／８０抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＭＣＡ４９７Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗ＣＤ１６３抗体（１：８０、ｃａｔ．＃ｓｃ－３３５６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）、抗ＣＤ２０４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ５１７４９、ＧｅｎｅＴｅｘ社、台湾、新竹市）、抗ＣＤ４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ４４５３１、ＧｅｎｅＴｅｘ社）又は抗ＣＤ８抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１６６９６、ＧｅｎｅＴｅｘ社）を付加し、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄した後、２次抗体を付加し、室温で３０分間インキュベーションした。切片をＤＡＫＯ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（デンマーク、グロストルプ、Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎｓｖｅｊ ４２、ＤＫ－２６００）を用いてさらに検出し、ヘマトキシリンで対比染色した。染色した切片を脱水し、封入溶液で封入し、最終的にＡｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００／ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ顕微鏡システムを用いて観察及び撮影した。
【0072】
免疫組織蛍光染色
マウスの組織切片を、上記のように脱パラフィン化、再水和及び抗原賦活化した。切片をＰＢＳに５％のＢＳＡを加えたものによって加湿チャンバー内で室温で３０分間ブロッキングした。次いで、３個の抗体セットを付加し、それぞれ４℃で一晩インキュベーションした。抗体セット１は、抗Ｆ４／８０抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＭＣＡ４９７Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗ｉＮＯＳ抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１５３２３、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗アルギナーゼＩ抗体（１：５０、ｃａｔ．＃ｓｃ－２７１４３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）から構成された。抗体セット２は、抗ＣＤ４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ４４５３１、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗ＴＮＦ－α抗体（１：７５、ｃａｔ．＃ｓｃ－５２７４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含んでいた。抗体セット３は、抗ＣＤ８抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１６６９６、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗ＴＮＦ－α抗体（１：７５、ｃａｔ．＃ｓｃ－５２７４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）から構成されていた。洗浄した後、それぞれの蛍光標識２次抗体を付加し、室温でさらに１時間インキュベーションした。核をＤＡＰＩで染色した。最終的に、切片を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＩＩ共焦点顕微鏡及びＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅ４．０ソフトウェアを用いて観察、撮影及び分析した。
マウスの組織切片を、上記のように脱パラフィン化、再水和及び抗原賦活化した。切片をＰＢＳに５％のＢＳＡを加えたものによって加湿チャンバー内で室温で３０分間ブロッキングした。次いで、３個の抗体セットを付加し、それぞれ４℃で一晩インキュベーションした。抗体セット１は、抗Ｆ４／８０抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＭＣＡ４９７Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗ｉＮＯＳ抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１５３２３、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗アルギナーゼＩ抗体（１：５０、ｃａｔ．＃ｓｃ－２７１４３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）から構成された。抗体セット２は、抗ＣＤ４抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ４４５３１、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗ＴＮＦ－α抗体（１：７５、ｃａｔ．＃ｓｃ－５２７４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含んでいた。抗体セット３は、抗ＣＤ８抗体（１：１００、ｃａｔ．＃ＧＴＸ１６６９６、ＧｅｎｅＴｅｘ社）及び抗ＴＮＦ－α抗体（１：７５、ｃａｔ．＃ｓｃ－５２７４６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）から構成されていた。洗浄した後、それぞれの蛍光標識２次抗体を付加し、室温でさらに１時間インキュベーションした。核をＤＡＰＩで染色した。最終的に、切片を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＩＩ共焦点顕微鏡及びＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅ４．０ソフトウェアを用いて観察、撮影及び分析した。
【0073】
結果
マウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体の調製及び特性評価
６個のハイブリドーマクローンは、組換えヒトＨＳＰ９０α（ｒＨＳＰ９０α）で免疫したマウスに由来した。それらの培養上清を、標準的なウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡプロトコルを用いてＨＳＰ９０αへの結合活性をアッセイするために採取した。クローン５を除くこれらのハイブリドーマによって産生された抗体は、抗原ｒＨＳＰ９０αに結合することが示された（図１（ａ））。結合活性をＥＬＩＳＡによってさらに定量化し、クローン２及びクローン６が、上位２つのＨＳＰ９０α結合レベルを示し、したがって、次のアッセイのために選択された（図１（ｂ））。２個のクローンの抗体を精製し、双方を、κ軽鎖を含むＩｇＧ２ｂアイソタイプの免疫グロブリンとして同定した（図１（ｃ））。それらは、ｅＨＳＰ９０αの、その細胞表面受容体ＣＤ９１との結合及びＣＤ９１の下流でのＩＫＫαとの結合を効率的にブロッキングした（図１（ｄ））。所与のｅＨＳＰ９０αは、癌細胞ＥＭＴの誘導、遊走、浸潤及び幹細胞性獲得のような複数のメカニズムを通じてその癌促進効果を発揮する。以前の研究と一貫して、我々のトランスウェル浸潤アッセイはｒＨＳＰ９０αが癌細胞の浸潤性の強力な誘導物として作用し（図１（ｅ））、ｒＨＳＰ９０α誘導性の癌細胞浸潤がクローン２及びクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体によって劇的に消失され得ることを明らかにした（図１（ｆ））。さらに、スフェロイド形成活性の増加によって反映されるｒＨＳＰ９０α誘導性癌細胞の幹細胞性獲得も、クローン２及びクローン６の抗体によって有意に阻害可能であった（図１（ｇ））。まとめると、我々のデータは、抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体が潜在的にｅＨＳＰ９０α促進性の悪性腫瘍に対処するように開発され、使用され得ることを示唆した。
マウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体の調製及び特性評価
６個のハイブリドーマクローンは、組換えヒトＨＳＰ９０α（ｒＨＳＰ９０α）で免疫したマウスに由来した。それらの培養上清を、標準的なウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡプロトコルを用いてＨＳＰ９０αへの結合活性をアッセイするために採取した。クローン５を除くこれらのハイブリドーマによって産生された抗体は、抗原ｒＨＳＰ９０αに結合することが示された（図１（ａ））。結合活性をＥＬＩＳＡによってさらに定量化し、クローン２及びクローン６が、上位２つのＨＳＰ９０α結合レベルを示し、したがって、次のアッセイのために選択された（図１（ｂ））。２個のクローンの抗体を精製し、双方を、κ軽鎖を含むＩｇＧ２ｂアイソタイプの免疫グロブリンとして同定した（図１（ｃ））。それらは、ｅＨＳＰ９０αの、その細胞表面受容体ＣＤ９１との結合及びＣＤ９１の下流でのＩＫＫαとの結合を効率的にブロッキングした（図１（ｄ））。所与のｅＨＳＰ９０αは、癌細胞ＥＭＴの誘導、遊走、浸潤及び幹細胞性獲得のような複数のメカニズムを通じてその癌促進効果を発揮する。以前の研究と一貫して、我々のトランスウェル浸潤アッセイはｒＨＳＰ９０αが癌細胞の浸潤性の強力な誘導物として作用し（図１（ｅ））、ｒＨＳＰ９０α誘導性の癌細胞浸潤がクローン２及びクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体によって劇的に消失され得ることを明らかにした（図１（ｆ））。さらに、スフェロイド形成活性の増加によって反映されるｒＨＳＰ９０α誘導性癌細胞の幹細胞性獲得も、クローン２及びクローン６の抗体によって有意に阻害可能であった（図１（ｇ））。まとめると、我々のデータは、抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体が潜在的にｅＨＳＰ９０α促進性の悪性腫瘍に対処するように開発され、使用され得ることを示唆した。
【0074】
クローン２抗ＨＳＰ９０α抗体のヒト化
次に、我々は、クローン２及びクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体のＨ及びＬ鎖のＩｇＧ可変ドメイン（すなわちＶＨ及びＶＬ）のｃＤＮＡ配列をそれぞれクローニングし、分析した。ｃＤＮＡ配列及びコードするアミノ酸残基を、上記の表１及び表２に列挙した。クローン２を、ヒト化のためにさらに選択した。ＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を合成し、プラスミドベクターに、Ｈ及びＬ鎖のヒトＩｇＧ定常ドメイン（すなわち、ＣＨ及びＣＬ）を発現する領域の直前にそれぞれ挿入して「クローン２－キメラ」と呼ばれる組換えＩｇＧ１抗体を発現させた。さらに、我々は、コンピューター支援による構造モデリングの提案及び計算に従って、凝集、プロテアーゼ切断、翻訳後修飾、薬物動態及び安定性に関して抗体の特性を改善することを目的として、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣとして指定された３個のクローン２－キメラの突然変異体を構築した。突然変異部位を以下の表３に列挙した。これらの人工操作されたヒト化組換え抗体をＥｘｐｉＣＨＯ細胞によって発現させ、精製後にＨＳＰ９０α結合親和性について分析した。動態アッセイをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて行ってクローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体のｒＨＳＰ９０αに対する結合特性を決定した（図２（ａ））。クローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、それぞれ０．９４×１０－１０、１．８７×１０－１０、１．４８×１０－１０及び１．４７×１０－１０Ｍとさらに計算され（図２（ｂ））、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体における突然変異がクローン２－キメラのＨＳＰ９０α結合親和性を有意には低減させないことを示唆した。
次に、我々は、クローン２及びクローン６の抗ＨＳＰ９０α抗体のＨ及びＬ鎖のＩｇＧ可変ドメイン（すなわちＶＨ及びＶＬ）のｃＤＮＡ配列をそれぞれクローニングし、分析した。ｃＤＮＡ配列及びコードするアミノ酸残基を、上記の表１及び表２に列挙した。クローン２を、ヒト化のためにさらに選択した。ＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を合成し、プラスミドベクターに、Ｈ及びＬ鎖のヒトＩｇＧ定常ドメイン（すなわち、ＣＨ及びＣＬ）を発現する領域の直前にそれぞれ挿入して「クローン２－キメラ」と呼ばれる組換えＩｇＧ１抗体を発現させた。さらに、我々は、コンピューター支援による構造モデリングの提案及び計算に従って、凝集、プロテアーゼ切断、翻訳後修飾、薬物動態及び安定性に関して抗体の特性を改善することを目的として、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣとして指定された３個のクローン２－キメラの突然変異体を構築した。突然変異部位を以下の表３に列挙した。これらの人工操作されたヒト化組換え抗体をＥｘｐｉＣＨＯ細胞によって発現させ、精製後にＨＳＰ９０α結合親和性について分析した。動態アッセイをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて行ってクローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体のｒＨＳＰ９０αに対する結合特性を決定した（図２（ａ））。クローン２－キメラ、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、それぞれ０．９４×１０－１０、１．８７×１０－１０、１．４８×１０－１０及び１．４７×１０－１０Ｍとさらに計算され（図２（ｂ））、クローン２－ｈＡ、クローン２－ｈＢ及びクローン２－ｈＣ抗体における突然変異がクローン２－キメラのＨＳＰ９０α結合親和性を有意には低減させないことを示唆した。
【表3】
【0075】
これらのヒト化抗ＨＳＰ９０α抗体の抗癌有効性を予備的に評価するため、我々は、ｒＨＳＰ９０α誘導性のＰＤＡＣ細胞浸潤及びスフェロイド形成に対するそれらの阻害活性をアッセイした。トランスウェル浸潤アッセイの結果は、ヒトＰＤＡＣ ＰＡＮＣ－１細胞のｒＨＳＰ９０α誘導性の浸潤性の抑制において、クローン２－キメラ及びクローン２－ｈＡはクローン２－ｈＢ、クローン２－ｈＣ及びそれらの親クローン２よりも優れていることを示した（図２（ｃ））。スフェロイド形成アッセイでは、ＰＡＮＣ－１細胞のｒＨＳＰ９０α誘導性スフェロイド形成の抑制において、クローン２－ｈＡは、さらに最も優れた有効性を示した（図２（ｄ））。したがって、クローン２－ｈＡを、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイのために、最終的に選択し、ＨＨ０１抗体と名付けた。ＰＢＳ中のＨＨ０１抗体の溶解度は１０ｍｇ／ｍｌよりも高く、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇアッセイは、ＨＨ０１抗体が１０～５０ｎｍの範囲による１９．３３ｎｍの平均直径のサイズを有することを明らかにし（不図示）、ＨＨ０１抗体が凝集体を形成しにくいことを示唆した。ゲルダナマイシン及びレゾルシノール誘導体を含む低分子のＨＳＰ９０阻害剤の臨床使用が、それらがあるレベルまで網膜に蓄積した場合、網膜視細胞障害を引き起こすことを考慮して、我々は、ＨＨ０１抗体が非癌性網膜細胞において毒性を示すか否かを、ＡＲＰＥ－１９網膜色素上皮細胞の生存能力に対するＨＨ０１抗体の効果を調べることによってさらに評価した。図２（ｅ）に示すように、１７－ＡＡＧは、ＡＲＰＥ－１９細胞に対して６４．７ｎＭのＩＣ５０で細胞毒性プロファイルを示し、一方で、ＨＨ０１抗体は、その濃度が５９４．３ｎＭ（１００μｇ／ｍｌ）に達した場合でも、ＡＲＰＥ－１９細胞において明白な細胞毒性を引き起こさなかった。さらに、ＨＨ０１抗体の薬物動態を雄マウスで調べ、それは、ＨＨ０１抗体がマウス血液中では３×１０－３ｍｌ／ｍｉｎ／ｋｇでのクリアランス速度及び８０ｍｌ／ｋｇの定常状態における体積で１８．４日の半減期（Ｔ１／２）を有することを示した（図２（ｆ））。長い終末相Ｔ１／２及び高い血清曝露レベルを示す結果並びに静脈内投薬をした後の結果は、ＨＨ０１抗体がさらなる開発に適していることを明らかにした。
【0076】
ＨＨ０１抗体のエピトープの同定
上記の表３に列挙するように、ＨＨ０１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に新規アミノ酸（ａ．ａ．）配列を有して特異的にヒトＨＳＰ９０αに結合可能であり、したがって、我々は、ＨＳＰ９０αのいずれの領域がＨＨ０１抗体によって結合されるかを同定することを意図した。予備的検討では、我々は、ＨＳＰ９０αドメインスキャニングの戦略を採用してクローン２抗体との結合に関与するＨＳＰ９０α領域を明確にした。完全長ＨＳＰ９０α（ａ．ａ．１～７３２）並びにＮ末端とリンカードメインとを加えたもの（ａ．ａ．１～２７２）、Ｎ末端からミドルドメイン（ａ．ａ．１～６２９）及びＣ末端ドメイン（ａ．ａ．６３０～７３２）を含むその３個の切断されたフラグメントをクローニングし、発現させ、精製した。次いで、完全長及び切断されたＨＳＰ９０αへのクローン２抗体の結合活性を、従来のＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。結果は、クローン２抗体がａ．ａ．１～２７２領域及び完全長タンパク質に結合することを示し（図３（ａ））、クローン２抗体の結合エピトープがＨＳＰ９０αのＮ末端及びリンカードメイン（ａ．ａ．１～２７２）内となり得ることを示唆した。さらに、ペプチドスキャニングの戦略を採用してクローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体の結合エピトープを明確にした。ペプチドライブラリーを、任意の連続する２個のペプチド間に８－ａ．ａ．の重複を有する一連の１０－ａ．ａ．ペプチドからなるように確立して、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２１～２７２領域の配列をスキャニングした。クローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体の、この一連の１０－ａ．ａ．ペプチドに対する結合活性をＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果は、クローン２－キメラ抗体の有力なエピトープ部位がＨＳＰ９０αの２３５ＡＥＥＫＥＤＫＥＥＥ２４４及び２５１ＥＳＥＤＫＰＥＩＥＤ２６０であることを明らかにした（図３（ｂ））。一貫して、これら２個の部位は、ＨＨ０１抗体の結合エピトープとしても作用可能であった（図３（ｃ））。これら２個の部位の配列に基づいて、我々は、ａ．ａ．残基を順次アラニンで置換した１０－ａ．ａ．ペプチドの２つのシリーズを合成した。アラニンスキャニングの戦略を採用してクローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体のエピトープ部位への結合に重要なａ．ａ．残基を調べた。結果は、Ｅ２３７、Ｅ２３９、Ｋ２４１、Ｅ２５３及びＫ２５５をアラニンで置換すると、クローン２－キメラ抗体のエピトープ部位への結合活性が劇的に低下することを示した（図３（ｄ））。さらに、もう１つのＤ２４０も、ＨＨ０１抗体の結合に関与した（図３（ｄ））。上記のエピトープマッピングの結果により、我々は、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２２７～２７２領域の配列を有するペプチドを合成した。このペプチドは、ｒＨＳＰ９０α誘導性のＰＡＮＣ－１細胞浸潤（図３（ｅ））及びスフェロイド形成（図３（ｆ））を競合的に抑制し、エピトープ部位を含むＨＳＰ９０α領域が新規抗癌戦略の標的となり得るということを裏付けた。
上記の表３に列挙するように、ＨＨ０１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に新規アミノ酸（ａ．ａ．）配列を有して特異的にヒトＨＳＰ９０αに結合可能であり、したがって、我々は、ＨＳＰ９０αのいずれの領域がＨＨ０１抗体によって結合されるかを同定することを意図した。予備的検討では、我々は、ＨＳＰ９０αドメインスキャニングの戦略を採用してクローン２抗体との結合に関与するＨＳＰ９０α領域を明確にした。完全長ＨＳＰ９０α（ａ．ａ．１～７３２）並びにＮ末端とリンカードメインとを加えたもの（ａ．ａ．１～２７２）、Ｎ末端からミドルドメイン（ａ．ａ．１～６２９）及びＣ末端ドメイン（ａ．ａ．６３０～７３２）を含むその３個の切断されたフラグメントをクローニングし、発現させ、精製した。次いで、完全長及び切断されたＨＳＰ９０αへのクローン２抗体の結合活性を、従来のＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。結果は、クローン２抗体がａ．ａ．１～２７２領域及び完全長タンパク質に結合することを示し（図３（ａ））、クローン２抗体の結合エピトープがＨＳＰ９０αのＮ末端及びリンカードメイン（ａ．ａ．１～２７２）内となり得ることを示唆した。さらに、ペプチドスキャニングの戦略を採用してクローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体の結合エピトープを明確にした。ペプチドライブラリーを、任意の連続する２個のペプチド間に８－ａ．ａ．の重複を有する一連の１０－ａ．ａ．ペプチドからなるように確立して、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２１～２７２領域の配列をスキャニングした。クローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体の、この一連の１０－ａ．ａ．ペプチドに対する結合活性をＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果は、クローン２－キメラ抗体の有力なエピトープ部位がＨＳＰ９０αの２３５ＡＥＥＫＥＤＫＥＥＥ２４４及び２５１ＥＳＥＤＫＰＥＩＥＤ２６０であることを明らかにした（図３（ｂ））。一貫して、これら２個の部位は、ＨＨ０１抗体の結合エピトープとしても作用可能であった（図３（ｃ））。これら２個の部位の配列に基づいて、我々は、ａ．ａ．残基を順次アラニンで置換した１０－ａ．ａ．ペプチドの２つのシリーズを合成した。アラニンスキャニングの戦略を採用してクローン２－キメラ及びＨＨ０１抗体のエピトープ部位への結合に重要なａ．ａ．残基を調べた。結果は、Ｅ２３７、Ｅ２３９、Ｋ２４１、Ｅ２５３及びＫ２５５をアラニンで置換すると、クローン２－キメラ抗体のエピトープ部位への結合活性が劇的に低下することを示した（図３（ｄ））。さらに、もう１つのＤ２４０も、ＨＨ０１抗体の結合に関与した（図３（ｄ））。上記のエピトープマッピングの結果により、我々は、ＨＳＰ９０αのａ．ａ．２２７～２７２領域の配列を有するペプチドを合成した。このペプチドは、ｒＨＳＰ９０α誘導性のＰＡＮＣ－１細胞浸潤（図３（ｅ））及びスフェロイド形成（図３（ｆ））を競合的に抑制し、エピトープ部位を含むＨＳＰ９０α領域が新規抗癌戦略の標的となり得るということを裏付けた。
【0077】
線維形成性マウスＰＤＡＣ移植モデルにおけるＨＨ０１抗体の予防的及び治療的有効性の評価
ＨＨ０１抗体は、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ抗癌アッセイのものであった。我々の以前の研究では、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、膵臓腺癌Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長を有意に助長した。マッソントリクローム染色の我々の結果は、ＥｎｄｏＭＴ細胞関与性Ｐａｎｃ０２腫瘍がＰａｎｃ０２細胞単独由来の腫瘍では観察されなかった有意なレベルの線維形成を示すことをさらに明らかにした（図４（ａ））。ＨＨ０１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を調べるため、我々は、マウス抗体を用いた以前のスケジュールに従い、ＥｎｄｏＭＴ関与性マウスＰＤＡＣモデルにおけるその癌防止活性をアッセイした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２細胞とＥｎｄｏＭＴ細胞とを加えたものを皮下接種した。接種後４日目に、マウスに１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体を、３日間隔で８用量分さらに静脈内投与した（図４（ｂ））。図４（ｃ）に示すように、ＥｎｄｏＭＴ関与性Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長の動態は、ＨＨ０１抗体によって強力に抑制された。すべてのマウスを接種後３０日目に屠殺し、それらの腫瘍を重量測定するために取り出した。予想されたように、ＨＨ０１処置は、Ｐａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片の腫瘍サイズを有意に抑圧した（ｐ＜０．００１、図４（ｄ））。腫瘍の線維形成も、ＨＨ０１処置によって有意に防止された（図４（ｅ））。さらに、ｅＨＳＰ９０αレベルの上昇が、我々の線維形成性マウスＰＤＡＣモデルの血清中に検出され、マウスにおいて、血清ＨＳＰ９０αレベルが、ＨＨ０１処置に対して有意に低減した（図４（ｆ））。これらのデータは、ＨＨ０１抗体がＰＤＡＣ細胞のＥｎｄｏＭＴ促進性腫瘍成長を防止する強力な薬剤であることを示唆する。
ＨＨ０１抗体は、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ抗癌アッセイのものであった。我々の以前の研究では、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、膵臓腺癌Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長を有意に助長した。マッソントリクローム染色の我々の結果は、ＥｎｄｏＭＴ細胞関与性Ｐａｎｃ０２腫瘍がＰａｎｃ０２細胞単独由来の腫瘍では観察されなかった有意なレベルの線維形成を示すことをさらに明らかにした（図４（ａ））。ＨＨ０１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を調べるため、我々は、マウス抗体を用いた以前のスケジュールに従い、ＥｎｄｏＭＴ関与性マウスＰＤＡＣモデルにおけるその癌防止活性をアッセイした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２細胞とＥｎｄｏＭＴ細胞とを加えたものを皮下接種した。接種後４日目に、マウスに１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体を、３日間隔で８用量分さらに静脈内投与した（図４（ｂ））。図４（ｃ）に示すように、ＥｎｄｏＭＴ関与性Ｐａｎｃ０２細胞移植片の腫瘍成長の動態は、ＨＨ０１抗体によって強力に抑制された。すべてのマウスを接種後３０日目に屠殺し、それらの腫瘍を重量測定するために取り出した。予想されたように、ＨＨ０１処置は、Ｐａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片の腫瘍サイズを有意に抑圧した（ｐ＜０．００１、図４（ｄ））。腫瘍の線維形成も、ＨＨ０１処置によって有意に防止された（図４（ｅ））。さらに、ｅＨＳＰ９０αレベルの上昇が、我々の線維形成性マウスＰＤＡＣモデルの血清中に検出され、マウスにおいて、血清ＨＳＰ９０αレベルが、ＨＨ０１処置に対して有意に低減した（図４（ｆ））。これらのデータは、ＨＨ０１抗体がＰＤＡＣ細胞のＥｎｄｏＭＴ促進性腫瘍成長を防止する強力な薬剤であることを示唆する。
【0078】
線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片を皮下接種した。接種後２０日目に、マウスは、７５ｍｍ３の平均サイズの腫瘍を担持し、１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体を、７日間隔で３回分静脈内注入され始めた（図５（ａ））。結果は、ＨＨ０１処置がＰａｎｃ０２＋ＥｎｄｏＭＴ細胞移植片の腫瘍成長動態を完全に抑制することを示した（図５（ｂ））。腫瘍を重量測定するために４１日目に取り出し、データは、腫瘍成長がＨＨ０１処置マウス群において確かに抑圧されることを明らかにした（図５（ｃ））。ＨＨ０１処置はまた、腫瘍の線維形成（図５（ｄ））及び血清ＨＳＰ９０αレベル（図５（ｅ））の有意な低下をもたらした。まとめると、これらのデータは、ＨＨ０１抗体が線維形成性ＰＤＡＣを効果的に処置する治療薬として開発され得ることを示唆する。
【0079】
線維形成性ヒト化マウスＰＤＡＣ移植モデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価
我々はまた、線維形成性ヒト化マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。ｈＨＳＣ移植ＡＳＩＤマウスに、ヒト膵臓腺癌ＰＡＮＣ－１細胞のＥｎｄｏＭＴ由来細胞との混合物を皮下接種した。接種後２０日目に、マウスをさらなる処置のために３群に分けた（図６（ａ））。Ａ群マウス（ｎ＝３）に、１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧを、７日間隔で３用量分静脈内注入した。ＨＨ０１抗体の２回に加えてゲムシタビンを２回注入されたＣ群マウス（ｎ＝５）と比較して、Ｂ群マウス（ｎ＝５）には、コントロールＩｇＧの２回に加えてゲムシタビンを２回注入した。マウスに、接種後の２０日目に最初の５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ（Ｂ群）又はＨＨ０１（Ｃ群）を投与し、４日後に、それらに最初の１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンをさらに静脈内注入した。コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体のさらに２用量及びゲムシタビンのさらに１用量を、それぞれ７日間隔で投与した（図６（ａ））。発生する腫瘍を、接種後３９日目まで３日ごとに表面的に測定し、腫瘍成長曲線を図６（ｂ）のようにプロットした。ＩｇＧ単独で処置したマウスと比較して、ＩｇＧとゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスは、２回目のゲムシタビン投与後に、有意に抑圧された腫瘍を有した。一方で、ＨＨ０１とゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスでは、初回用量のＨＨ０１の注入後のわずか４日目で、腫瘍成長のより効果的な抑圧が観察された。腫瘍は、２回目の用量のゲムシタビン及び３回目の用量のＨＨ０１が投与された後、さらに縮小した（図６（ｂ））。すべてのマウスを３９日目に屠殺し、ＨＨ０１とゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスからの腫瘍は、有意に抑圧された（図６（ｃ））。ＨＨ０１抗体のゲムシタビンとの組合せも、腫瘍の線維形成（図６（ｄ））及び血清ＨＳＰ９０αレベル（図６（ｅ））の抑制において強力な有効性を示した。これらのデータは、ＨＨ０１抗体が線維形成性ＰＤＡＣを標的とする効果的な治療薬となり得ることを裏付けた。
我々はまた、線維形成性ヒト化マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。ｈＨＳＣ移植ＡＳＩＤマウスに、ヒト膵臓腺癌ＰＡＮＣ－１細胞のＥｎｄｏＭＴ由来細胞との混合物を皮下接種した。接種後２０日目に、マウスをさらなる処置のために３群に分けた（図６（ａ））。Ａ群マウス（ｎ＝３）に、１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧを、７日間隔で３用量分静脈内注入した。ＨＨ０１抗体の２回に加えてゲムシタビンを２回注入されたＣ群マウス（ｎ＝５）と比較して、Ｂ群マウス（ｎ＝５）には、コントロールＩｇＧの２回に加えてゲムシタビンを２回注入した。マウスに、接種後の２０日目に最初の５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ（Ｂ群）又はＨＨ０１（Ｃ群）を投与し、４日後に、それらに最初の１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンをさらに静脈内注入した。コントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体のさらに２用量及びゲムシタビンのさらに１用量を、それぞれ７日間隔で投与した（図６（ａ））。発生する腫瘍を、接種後３９日目まで３日ごとに表面的に測定し、腫瘍成長曲線を図６（ｂ）のようにプロットした。ＩｇＧ単独で処置したマウスと比較して、ＩｇＧとゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスは、２回目のゲムシタビン投与後に、有意に抑圧された腫瘍を有した。一方で、ＨＨ０１とゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスでは、初回用量のＨＨ０１の注入後のわずか４日目で、腫瘍成長のより効果的な抑圧が観察された。腫瘍は、２回目の用量のゲムシタビン及び３回目の用量のＨＨ０１が投与された後、さらに縮小した（図６（ｂ））。すべてのマウスを３９日目に屠殺し、ＨＨ０１とゲムシタビンとを加えたもので処置したマウスからの腫瘍は、有意に抑圧された（図６（ｃ））。ＨＨ０１抗体のゲムシタビンとの組合せも、腫瘍の線維形成（図６（ｄ））及び血清ＨＳＰ９０αレベル（図６（ｅ））の抑制において強力な有効性を示した。これらのデータは、ＨＨ０１抗体が線維形成性ＰＤＡＣを標的とする効果的な治療薬となり得ることを裏付けた。
【0080】
Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄ誘導性線維形成性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価
次に、我々は、自発的ＰＤＡＣ発症マウスモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。臨床的に、９０％を超えるＰＤＡＣ患者は、彼らの腺癌細胞において活性化Ｋ－Ｒａｓ突然変異体を保有している。トランスジェニックマウスモデルでは、膵管細胞における活性化突然変異体Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄのノックイン発現が、腺管－管状形質転換（ＡＤＭ）、膵上皮内新形成（ＰａｎＩＮ）及び結果としてのＰＤＡＣのプロセスを通じて、ＰＤＡＣ発症を引き起こす。これらの膵臓Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄ発現マウス（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）は、生後３ヵ月という早期にＡＤＭを発症し、さらに生後６ヵ月でＰＤＡＣ病変を発症する。マッソントリクローム染色の結果は、３ヶ月齢のＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスの膵臓組織からは小サイズの線維形成性領域がわずかに検出されることもあり、さらに６ヶ月齢以上のＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスの膵臓組織から線維形成が広範囲に検出されるが、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄコントロールマウスからは検出されないことを明らかにした。ＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価するために、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスは、それらが６ヵ月齢でＰＤＡＣを発症するまで処置を受けなかった。それらに、１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体を、毎週投与される４用量、続けて隔週ごとに投与される４用量及び最終的に毎月投与される２用量の、全部で１０用量のスケジュールで静脈内注入した（図７（ａ））。実験の全体は終点を４５０日目に設定し、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置マウスの生存曲線をカプランマイヤー法によりプロットした（図７（ｂ））。７匹中６匹のＩｇＧ処置マウスは４５０日未満で死亡したが、９匹中７匹のＨＨ０１処置マウスは４５０日目にまだ生存していた。ＩｇＧ及びＨＨ０１処置マウスの生存時間の中央値は、それぞれ３４４日及び４５０日超であった（ログランク分析によってｐ＝０．００４）。正常なＣ５７ＢＬ／６マウス又はＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄコントロールマウスの平滑な膵臓の形態とは異なり、すべてのＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスは、マウスがＨＨ０１治療を受けたか否かに関わらず、結節性膵臓を有していた（図７（ｃ））。一方で、マッソントリクローム染色は、ＨＨ０１で処置され、かつ４５０日目にまだ生存しているそれらのマウスでは、膵臓の線維形成が劇的に回復することを明らかにした（図７（ｃ））。１匹のＩｇＧ処置マウス及び１匹のＨＨ０１処置マウスは、肝臓の外観に腫瘍結節を有することが観察されたが、それにもかかわらず、ＨＨ０１処置マウスは、ＩｇＧ処置マウスよりも、明らかに少ない結節を有した（図７（ｃ））。マッソントリクローム染色は、ＨＨ０１処置マウスが肝臓の線維形成の有意な改善を示すことも明らかにした（図７（ｃ））。さらに、マウス血清サンプルを、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置の開始の１日前から毎月採取した。マウスの死期の近傍で採取した最終の血清サンプルのＨＳＰ９０αレベルを、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置前に採取したサンプルのものと比較した（すなわち、処置前対処置後）。我々のデータは、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスにおける血清ＨＳＰ９０αレベルの上昇がＨＨ０１治療によって効果的に消失され得ることを示した（図７（ｄ））。
次に、我々は、自発的ＰＤＡＣ発症マウスモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。臨床的に、９０％を超えるＰＤＡＣ患者は、彼らの腺癌細胞において活性化Ｋ－Ｒａｓ突然変異体を保有している。トランスジェニックマウスモデルでは、膵管細胞における活性化突然変異体Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄのノックイン発現が、腺管－管状形質転換（ＡＤＭ）、膵上皮内新形成（ＰａｎＩＮ）及び結果としてのＰＤＡＣのプロセスを通じて、ＰＤＡＣ発症を引き起こす。これらの膵臓Ｋ－ＲａｓＧ１２Ｄ発現マウス（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）は、生後３ヵ月という早期にＡＤＭを発症し、さらに生後６ヵ月でＰＤＡＣ病変を発症する。マッソントリクローム染色の結果は、３ヶ月齢のＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスの膵臓組織からは小サイズの線維形成性領域がわずかに検出されることもあり、さらに６ヶ月齢以上のＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスの膵臓組織から線維形成が広範囲に検出されるが、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄコントロールマウスからは検出されないことを明らかにした。ＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価するために、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスは、それらが６ヵ月齢でＰＤＡＣを発症するまで処置を受けなかった。それらに、１用量あたり５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体を、毎週投与される４用量、続けて隔週ごとに投与される４用量及び最終的に毎月投与される２用量の、全部で１０用量のスケジュールで静脈内注入した（図７（ａ））。実験の全体は終点を４５０日目に設定し、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置マウスの生存曲線をカプランマイヤー法によりプロットした（図７（ｂ））。７匹中６匹のＩｇＧ処置マウスは４５０日未満で死亡したが、９匹中７匹のＨＨ０１処置マウスは４５０日目にまだ生存していた。ＩｇＧ及びＨＨ０１処置マウスの生存時間の中央値は、それぞれ３４４日及び４５０日超であった（ログランク分析によってｐ＝０．００４）。正常なＣ５７ＢＬ／６マウス又はＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄコントロールマウスの平滑な膵臓の形態とは異なり、すべてのＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスは、マウスがＨＨ０１治療を受けたか否かに関わらず、結節性膵臓を有していた（図７（ｃ））。一方で、マッソントリクローム染色は、ＨＨ０１で処置され、かつ４５０日目にまだ生存しているそれらのマウスでは、膵臓の線維形成が劇的に回復することを明らかにした（図７（ｃ））。１匹のＩｇＧ処置マウス及び１匹のＨＨ０１処置マウスは、肝臓の外観に腫瘍結節を有することが観察されたが、それにもかかわらず、ＨＨ０１処置マウスは、ＩｇＧ処置マウスよりも、明らかに少ない結節を有した（図７（ｃ））。マッソントリクローム染色は、ＨＨ０１処置マウスが肝臓の線維形成の有意な改善を示すことも明らかにした（図７（ｃ））。さらに、マウス血清サンプルを、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置の開始の１日前から毎月採取した。マウスの死期の近傍で採取した最終の血清サンプルのＨＳＰ９０αレベルを、ＩｇＧ又はＨＨ０１処置前に採取したサンプルのものと比較した（すなわち、処置前対処置後）。我々のデータは、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅマウスにおける血清ＨＳＰ９０αレベルの上昇がＨＨ０１治療によって効果的に消失され得ることを示した（図７（ｄ））。
【0081】
Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性の評価
Ｍ２－マクロファージ関与性マウスＰＤＡＣモデルを確立するために、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの皮下接種のために、ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭをＰａｎｃ０２細胞と混合した。Ｍ１マクロファージとの比較のため、Ｐａｎｃ０２細胞とＬＰＳ処置ＢＭＤＭとを加えたものを他のマウスの群に接種した。「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」の移植片の成長は、接種後の６日目から始まり、腫瘍の成長は、他の移植片の群よりも高速で継続した（図８（ａ））。接種後の３０日目にすべてのマウスを屠殺し、それらの腫瘍を重量測定するために取り出した。図８（ｂ）に示すように、ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭはＰａｎｃ０２腫瘍成長を有意に促進させ、それは、ＬＰＳ処置ＢＭＤＭからもたらされる腫瘍抑制効果とは対照的であった。免疫組織化学分析の結果は、「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」の移植片由来の腫瘍組織が、他のマウスの群から取り出した腫瘍塊と比較した場合、ＣＤ１６３＋細胞をより多く含むが、有意に低減したレベルのＣＤ４－細胞及びＣＤ８＋細胞を含むことを明らかにした（図８（ｃ））。ＬＰＳ処置ＢＭＤＭでのマウス群では、抑圧された腫瘍組織は、相対的に高いレベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含んでいた。４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）での核染色も、クロマチン凝縮及び核フラグメント化の上昇したレベルを示し（図８（ｄ））、ＬＰＳ誘導性Ｍ１－マクロファージがＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫細胞を動員し、より多くの細胞アポトーシスを引き起こしてＰａｎｃ０２腫瘍成長を抑制することを示唆した。したがって、これらの結果は、ｅＨＳＰ９０α誘導性Ｍ２型マクロファージが強力な免疫抑制活性及び腫瘍促進活性を示すことを結論付けた。さらに、我々は、このＭ２マクロファージ促進性ＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ細胞移植片を皮下接種した。接種後２７日目に、各マウスは約０．１ｃｍ３の腫瘍を担持し、５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置され始めた（図９（ａ））。１８．４日超のＨＨ０１のマウス血中の半減期を考慮して、ＨＨ０１抗体の作用を、７日間隔の後の２回目の用量によって増強した。図９（ｂ）に示すように、ＨＨ０１処置における劇的な腫瘍の縮小は、すぐに３日後に観察された。すべてのマウスを４２日目に屠殺すると、結果は、コントロールマウス群において継続的に成長するそれらの腫瘍と比較した場合、ＨＨ０１処置マウスでは腫瘍が有意に縮小することを示した（ｐ＝０．００１、図９（ｃ））。一貫して、血清ＨＳＰ９０αレベルの上昇もＨＨ０１治療後に有意に抑制された（図９（ｄ））。腫瘍サンプルの免疫組織化学分析も、ＨＨ０１治療に対するＭ２－マクロファージの減少に従って、Ｍ２－マクロファージ抑制性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞レベルが効果的に回復されることを明らかにした（図９（ｅ））。これらの結果は、免疫組織蛍光染色の結果によって裏付けられた。Ｆ４／８０＋ｉＮＯＳ＋（Ｍ１）細胞の増加及びＦ４／８０＋アルギナーゼ１＋（Ｍ２）細胞の減少は、ＨＨ０１処置マウスの組織から観察された（図１０（ａ）及び１０（ｂ））。一貫して、ＣＤ４＋ＴＮＦ－α＋（効果的なＴ）細胞及びＣＤ８＋ＴＮＦ－α＋（細胞傷害性のＴ）細胞のレベルは、ＨＨ０１抗体での治療に応じて双方とも増加した（図１０（ｃ）及び１０（ｄ））。これらのデータは、ＨＨ０１抗体がＭ２－マクロファージ増悪性ＰＤＡＣを抑制し、腫瘍微小環境の免疫を改善する有効な薬剤であることを示唆する。
Ｍ２－マクロファージ関与性マウスＰＤＡＣモデルを確立するために、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの皮下接種のために、ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭをＰａｎｃ０２細胞と混合した。Ｍ１マクロファージとの比較のため、Ｐａｎｃ０２細胞とＬＰＳ処置ＢＭＤＭとを加えたものを他のマウスの群に接種した。「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」の移植片の成長は、接種後の６日目から始まり、腫瘍の成長は、他の移植片の群よりも高速で継続した（図８（ａ））。接種後の３０日目にすべてのマウスを屠殺し、それらの腫瘍を重量測定するために取り出した。図８（ｂ）に示すように、ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭはＰａｎｃ０２腫瘍成長を有意に促進させ、それは、ＬＰＳ処置ＢＭＤＭからもたらされる腫瘍抑制効果とは対照的であった。免疫組織化学分析の結果は、「Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ」の移植片由来の腫瘍組織が、他のマウスの群から取り出した腫瘍塊と比較した場合、ＣＤ１６３＋細胞をより多く含むが、有意に低減したレベルのＣＤ４－細胞及びＣＤ８＋細胞を含むことを明らかにした（図８（ｃ））。ＬＰＳ処置ＢＭＤＭでのマウス群では、抑圧された腫瘍組織は、相対的に高いレベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含んでいた。４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）での核染色も、クロマチン凝縮及び核フラグメント化の上昇したレベルを示し（図８（ｄ））、ＬＰＳ誘導性Ｍ１－マクロファージがＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫細胞を動員し、より多くの細胞アポトーシスを引き起こしてＰａｎｃ０２腫瘍成長を抑制することを示唆した。したがって、これらの結果は、ｅＨＳＰ９０α誘導性Ｍ２型マクロファージが強力な免疫抑制活性及び腫瘍促進活性を示すことを結論付けた。さらに、我々は、このＭ２マクロファージ促進性ＰＤＡＣモデルにおけるＨＨ０１抗体の治療的有効性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎｃ０２＋ｒＨＳＰ９０α処置ＢＭＤＭ細胞移植片を皮下接種した。接種後２７日目に、各マウスは約０．１ｃｍ３の腫瘍を担持し、５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又はＨＨ０１抗体で処置され始めた（図９（ａ））。１８．４日超のＨＨ０１のマウス血中の半減期を考慮して、ＨＨ０１抗体の作用を、７日間隔の後の２回目の用量によって増強した。図９（ｂ）に示すように、ＨＨ０１処置における劇的な腫瘍の縮小は、すぐに３日後に観察された。すべてのマウスを４２日目に屠殺すると、結果は、コントロールマウス群において継続的に成長するそれらの腫瘍と比較した場合、ＨＨ０１処置マウスでは腫瘍が有意に縮小することを示した（ｐ＝０．００１、図９（ｃ））。一貫して、血清ＨＳＰ９０αレベルの上昇もＨＨ０１治療後に有意に抑制された（図９（ｄ））。腫瘍サンプルの免疫組織化学分析も、ＨＨ０１治療に対するＭ２－マクロファージの減少に従って、Ｍ２－マクロファージ抑制性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞レベルが効果的に回復されることを明らかにした（図９（ｅ））。これらの結果は、免疫組織蛍光染色の結果によって裏付けられた。Ｆ４／８０＋ｉＮＯＳ＋（Ｍ１）細胞の増加及びＦ４／８０＋アルギナーゼ１＋（Ｍ２）細胞の減少は、ＨＨ０１処置マウスの組織から観察された（図１０（ａ）及び１０（ｂ））。一貫して、ＣＤ４＋ＴＮＦ－α＋（効果的なＴ）細胞及びＣＤ８＋ＴＮＦ－α＋（細胞傷害性のＴ）細胞のレベルは、ＨＨ０１抗体での治療に応じて双方とも増加した（図１０（ｃ）及び１０（ｄ））。これらのデータは、ＨＨ０１抗体がＭ２－マクロファージ増悪性ＰＤＡＣを抑制し、腫瘍微小環境の免疫を改善する有効な薬剤であることを示唆する。
【0082】
結論
線維形成は、急速な腫瘍成長、転移の発生及び難治性の治療成績と密接に関連する多数の悪性腫瘍の特質である。悪性進行を緩和し、治療的有効性を向上させる線維形成を標的とする薬剤及び戦略は、癌患者に対して未だ満たされていない医療ニーズである。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の大量産生は、線維形成の主な原因の１つであり、内皮細胞の内皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）は、ＣＡＦに対する豊富な供給源を提供する。ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、大量の骨髄由来マクロファージを腫瘍中に動員し、これらのマクロファージのＭ２型への分極化を促進する。Ｍ２型マクロファージは、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－αを分泌し、効果的なＴ細胞及び細胞傷害性のＴ細胞を抑制するだけでなく、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦを産生して腫瘍の血管新生を刺激する。さらに、これらのＭ２型マクロファージは、ｅＨＳＰ９０αを大量に発現及び分泌し、癌細胞の拡散及び幹細胞性獲得の利点を有するｅＨＳＰ９０α豊富な腫瘍微小環境を形成する。したがって、ｅＨＳＰ９０α及びｅＨＳＰ９０α豊富な腫瘍微小環境は、新規の癌治療標的として見なされ得る。マウス腫瘍モデルの我々の以前の発表結果では、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、膵臓腺癌細胞移植片の腫瘍成長を有意に促進した。一方で、このＥｎｄｏＭＴ促進性腫瘍化は、マウスが癌細胞接種後４日目以降にマウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体での静脈内注入を投与される場合、劇的に抑制された。我々は、このマウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体の遺伝子を配列決定した。コンピューター支援による分析及び提案の後、我々は、ヒト化及び改良された抗体遺伝子をさらに構築した。組換え遺伝子をＥｘｐｉＣＨＯ細胞に導入してヒト化抗ＨＳＰ９０α抗体であるＨＨ０１を発現させた。一連の分析を通じて、我々は、ＨＨ０１抗体がそのＣＤＲ中に新規のアミノ酸配列を有し、１．８７×１０－１０ＭのＫＤ値でｅＨＳＰ９０αに対する高い結合親和性を示すことがわかった。ＨＨ０１抗体は、凝集体を形成しにくい。それは、極めて水溶性であるが、１８．４日より長い血液中の半減期によりマウス体内から排泄されにくい。それは、網膜色素上皮細胞に対して細胞毒性ではなく、マウスの脾臓肥大を引き起こさない。ＨＨ０１抗体は、抗癌機能においてもその優位性を示す。それは、膵臓腺癌及び大腸癌細胞株の浸潤活性及びスフェロイド形成活性を強力に抑制する。我々の３個のマウス癌モデルの結果は、単独のＨＨ０１抗体は皮下接種した膵臓腺癌細胞移植片のＥｎｄｏＭＴ促進性の線維形成性腫瘍成長活性を消失可能であり、ゲムシタビンと併用して相乗効果も示し得ることを明らかにするものである。ＰＤＡＣ発症トランスジェニックマウスモデルでは、それはＫ－Ｒａｓ突然変異による膵臓の線維形成及び腺癌の発症並びに肝臓の転移を強力に抑制し、したがって実験マウスの生存期間を延長可能である。さらに、Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルでは、ＨＨ０１抗体は、腫瘍成長を抑制し、腫瘍免疫を改善するのにも有効である。
線維形成は、急速な腫瘍成長、転移の発生及び難治性の治療成績と密接に関連する多数の悪性腫瘍の特質である。悪性進行を緩和し、治療的有効性を向上させる線維形成を標的とする薬剤及び戦略は、癌患者に対して未だ満たされていない医療ニーズである。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の大量産生は、線維形成の主な原因の１つであり、内皮細胞の内皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）は、ＣＡＦに対する豊富な供給源を提供する。ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、大量の骨髄由来マクロファージを腫瘍中に動員し、これらのマクロファージのＭ２型への分極化を促進する。Ｍ２型マクロファージは、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－αを分泌し、効果的なＴ細胞及び細胞傷害性のＴ細胞を抑制するだけでなく、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦを産生して腫瘍の血管新生を刺激する。さらに、これらのＭ２型マクロファージは、ｅＨＳＰ９０αを大量に発現及び分泌し、癌細胞の拡散及び幹細胞性獲得の利点を有するｅＨＳＰ９０α豊富な腫瘍微小環境を形成する。したがって、ｅＨＳＰ９０α及びｅＨＳＰ９０α豊富な腫瘍微小環境は、新規の癌治療標的として見なされ得る。マウス腫瘍モデルの我々の以前の発表結果では、ＥｎｄｏＭＴ由来ＣＡＦは、膵臓腺癌細胞移植片の腫瘍成長を有意に促進した。一方で、このＥｎｄｏＭＴ促進性腫瘍化は、マウスが癌細胞接種後４日目以降にマウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体での静脈内注入を投与される場合、劇的に抑制された。我々は、このマウス抗ＨＳＰ９０αモノクローナル抗体の遺伝子を配列決定した。コンピューター支援による分析及び提案の後、我々は、ヒト化及び改良された抗体遺伝子をさらに構築した。組換え遺伝子をＥｘｐｉＣＨＯ細胞に導入してヒト化抗ＨＳＰ９０α抗体であるＨＨ０１を発現させた。一連の分析を通じて、我々は、ＨＨ０１抗体がそのＣＤＲ中に新規のアミノ酸配列を有し、１．８７×１０－１０ＭのＫＤ値でｅＨＳＰ９０αに対する高い結合親和性を示すことがわかった。ＨＨ０１抗体は、凝集体を形成しにくい。それは、極めて水溶性であるが、１８．４日より長い血液中の半減期によりマウス体内から排泄されにくい。それは、網膜色素上皮細胞に対して細胞毒性ではなく、マウスの脾臓肥大を引き起こさない。ＨＨ０１抗体は、抗癌機能においてもその優位性を示す。それは、膵臓腺癌及び大腸癌細胞株の浸潤活性及びスフェロイド形成活性を強力に抑制する。我々の３個のマウス癌モデルの結果は、単独のＨＨ０１抗体は皮下接種した膵臓腺癌細胞移植片のＥｎｄｏＭＴ促進性の線維形成性腫瘍成長活性を消失可能であり、ゲムシタビンと併用して相乗効果も示し得ることを明らかにするものである。ＰＤＡＣ発症トランスジェニックマウスモデルでは、それはＫ－Ｒａｓ突然変異による膵臓の線維形成及び腺癌の発症並びに肝臓の転移を強力に抑制し、したがって実験マウスの生存期間を延長可能である。さらに、Ｍ２－マクロファージ増悪性マウスＰＤＡＣモデルでは、ＨＨ０１抗体は、腫瘍成長を抑制し、腫瘍免疫を改善するのにも有効である。
【他の実施形態】
【0083】
本明細書に開示された特徴のすべては、任意の組合せで組み合わせられ得る。本明細書で開示された各特徴は、同一、均等又は同様の目的を果たす代替的な特徴によって置換され得る。したがって、明示の断りがない限り、開示された各特徴は、一般的な一連の均等又は同様の特徴の例に過ぎない。
【0084】
さらに、以上の説明から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を容易に解明し、その主旨及び範囲から逸脱することなく、本開示の種々の変更及び変形を行ってそれを種々の用途及び条件に適合できるはずである。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内となる。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図9-5】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【配列表】
【国際調査報告】