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特表2024-542257直接トランス分化誘導用組成物およびこれにより処理された幹細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】直接トランス分化誘導用組成物およびこれにより処理された幹細胞
(51)【国際特許分類】
A61K 35/30 20150101AFI20241106BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20241106BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20241106BHJP
A61K 31/423 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K35/30
A61P9/10
A61P25/00
A61P25/02
A61P25/16
A61P25/14
A61P25/28
C12N5/0797
A61K31/423
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024530500
(86)(22)【出願日】2022-11-21
(85)【翻訳文提出日】2024-07-22
(86)【国際出願番号】 KR2022018430
(87)【国際公開番号】W WO2023090971
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】10-2021-0161446
(32)【優先日】2021-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522194315
【氏名又は名称】ワイジェイ セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】ユン，テ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジ ユン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD32
4B065BD34
4B065CA44
4B065CA46
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC70
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C086ZA20
4C086ZA36
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB45
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA16
4C087ZA20
4C087ZA36
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を通じた直接トランス分化を誘導する組成物と、これを処理した幹細胞の用途に関し、本発明によると、本発明の化合物は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を調節することで、これを媒介に成体幹細胞を神経前駆細胞に直接トランス分化誘導することができるので、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導または直接トランス分化誘導用途で活用することができ、直接トランス分化誘導されたｃｉＮＳＣ５は、ＡＬＳマウスモデル、ＭＳマウスモデル、ＰＤレットモデルおよび慢性脊髄損傷レットモデルの両方で顕著な治療効果を示したので、細胞治療剤として活用することができる。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、ＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化誘導用組成物：【化1】
【請求項2】
ＣｔＢＰｓは、ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２である、請求項１に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物。
【請求項3】
化学式Iの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００に結合する、請求項１に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物。
【請求項4】
化学式IIの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００およびＡｒｇ２６６に結合する、請求項１に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物。
【請求項5】
化学式３の化合物は、ＣｔＢＰ１のＰｈｅ１０２、Ａｒｇ１８４およびＨｉｓ２３６に結合する、請求項１に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物。
【請求項6】
ＣｔＢＰｓ－媒介によって成体幹細胞を神経前駆細胞に分化させる、請求項１に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物。
【請求項7】
化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の神経前駆細胞への直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）誘導用組成物。
【請求項8】
成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）である、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項9】
間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣ－ＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤ－ＭＳＣ）または骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＢＭ－ＭＳＣ）である、請求項８に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項10】
神経前駆細胞は、ｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）である、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項11】
Ｔｕｊ１、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１、ＧＡＰ－４３またはｐ７５の発現を増加させる、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項12】
Ｔｕｊ１タンパク質、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質、ｐ７５タンパク質、ＧＡＰ－４３タンパク質、ＣＤ５４タンパク質、ＣＤ３０９タンパク質、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質、ＣＤ２９タンパク質、ＭＡＳＨ１タンパク質またはＴＢＲ２タンパク質の発現を増加させる、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項13】
ＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現を減少させる、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項14】
ＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌を増加させる、請求項７に記載の直接トランス分化誘導用組成物。
【請求項15】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで試料に化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を処理するステップを含む、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法。
【請求項16】
試料は、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である、請求項１５に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法。
【請求項17】
化合物処理前に比べて処理後に試料でＴｕｊ１、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｐ７５、ＧＡＰ－４３、ＣＤ３０９、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、ＣＤ２９、ＭＡＳＨ１またはＴＢＲ２発現を増加させる、請求項１５に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法。
【請求項18】
化合物処理前に比べて処理後に試料でＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌を増加させる、請求項１５に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法。
【請求項19】
化合物処理前に比べて処理後に試料でＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現を減少させる、請求項１５に記載のＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法。
【請求項20】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を成体幹細胞に処理するステップを含む、成体幹細胞を神経前駆細胞に直接トランス分化を誘導する方法。
【請求項21】
化合物処理前に比べて処理後に細胞でＴｕｊ１、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｐ７５、ＧＡＰ－４３、ＣＤ５４、ＣＤ３０９、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、ＣＤ２９、ＭＡＳＨ１またはＴＢＲ２発現を増加させる、請求項２０に記載の直接トランス分化を誘導する方法。
【請求項22】
化合物処理前に比べて処理後に細胞でＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌を増加させる、請求項２０に記載の直接トランス分化を誘導する方法。
【請求項23】
化合物処理前に比べて処理後に細胞でＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現を減少させる、請求項２０に記載の直接トランス分化を誘導する方法。
【請求項24】
下記化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞：【化2】
【請求項25】
化合物が処理された幹細胞は成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項26】
成体幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣ－ＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤ－ＭＳＣ）または骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＢＭ－ＭＳＣ）である、請求項２５に記載の幹細胞。
【請求項27】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を３～７日間処理した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項28】
化合物処理によって成体幹細胞で神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）に直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）されたことである、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項29】
神経前駆細胞は、ｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）である、請求項２８に記載の幹細胞。
【請求項30】
化合物が処理されていない幹細胞に比べてＴｕｊ１、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１、ＧＡＰ－４３またはｐ７５の発現が増加した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項31】
化合物が処理されていない幹細胞に比べてＴｕｊ１タンパク質、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質、ｐ７５タンパク質、ＧＡＰ－４３タンパク質、ＣＤ５４タンパク質、ＣＤ３０９タンパク質、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質、ＣＤ２９タンパク質、ＭＡＳＨ１タンパク質またはＴＢＲ２タンパク質の発現が増加した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項32】
化合物が処理されていない幹細胞に比べてＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現が減少した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項33】
化合物が処理されていない幹細胞に比べてＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌が増加した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項34】
化合物が処理されていない幹細胞に比べてＨＥＳ１、Ｓｏｘ２またはＯＣＴ４の発現が増加した、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項35】
化合物の処理によってＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化が誘導された、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項36】
ＭＡＰ２、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｓａｓｈｉ １またはＧＦＡＰを発現しない、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項37】
ドーパミン性神経細胞、神経細胞または成熟した神経細胞に分化可能な、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項38】
請求項２４に記載の幹細胞、幹細胞培養物または懸濁培養物を有効成分として含む、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項39】
神経損傷疾患が中枢または末梢神経系の損傷、または神経変性疾患である、請求項３８に記載の神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項40】
中枢または末梢神経系の損傷が脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、末梢神経損傷、脳卒中または脳癌である、請求項３９に記載の神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項41】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）である、請求項３９に記載の神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項42】
ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導に使用するための、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物または化学式IIIの化合物の用途。
【請求項43】
直接トランス分化誘導に使用するための、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物または化学式IIIの化合物の用途。
【請求項44】
化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞の神経損傷疾患の予防または治療用途。
【請求項45】
化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞を神経損傷疾患を有する個体に移植するステップを含む、神経損傷疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を通じた直接トランス分化を誘導する組成物と、これを処理した幹細胞の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
神経系は、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）と末梢神経系（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）に分けられ、中枢神経系には脳と脊髄が該当し、その他のものは末梢神経系に該当する。末梢神経系は、運動神経と感覚神経を含む体性神経系と自律神経系に分けられる。中枢神経系（脳と脊髄）を構成する神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、および希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）は、多能性幹細胞に分化された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＮＳＣ）または神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ：ＮＰＣ）を分化させて作ることができ、一方、末梢神経系を構成する末梢神経（自律神経、運動神経、感覚神経）とシュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ）は、多能性幹細胞に分化された神経堤幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＮＣＳＣ）から由来する。神経組織を構成する神経細胞は、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）と軸索（ａｘｏｎ）を通じて中枢神経系からの命令信号を末梢神経系に伝達するか、末梢神経系から入力される情報を中枢神経系に伝達する役割を遂行する。軸索は、中枢神経系からより遠い側の神経細胞に電気信号を伝達し、信号伝達を速くするために絶縁体の構造である髄鞘（ｍｙｅｌｉｎ）で取り囲まれているが、これを髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）と言う。哺乳動物の脳は、神経幹細胞の分裂と分化および生存と死滅、シナプス形成などの一連の過程を経て体系的な神経回路網（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を発生することで複雑な機能を遂行することができるようになる。成体時期にも動物の脳神経細胞では神経成長に必要な多くの物質を生産して軸索と樹状突起が成長するようになり、新たな学習と記憶をする度にシナプス連結と神経回路網を絶えずに再構成（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）するので、分化が続くと言える。神経細胞は細胞分化し、シナプスを形成する過程で神経成長因子のような標的由来生存因子（ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ）を受けることができなければ細胞死滅が発生し、ストレスと細胞毒性物質（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）による細胞死滅は、変性脳疾患の主要原因となる。動物の末梢神経系は、損傷されたとき中枢神経系とは異なり軸索が長時間にわたって再生する。神経傷害部位の後側軸索は、ワーラー変性（Ｗａｌｌｅｒｉａｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）と知られている過程によって退化し、神経の細胞体は軸索の成長（ａｘｏｎａｌ ｒｅｇｒｏｗｔｈ）をさらに始め、シュワン細胞は分裂した後に生存と死滅によって標的神経を決定し、さらに分化するなど、発生過程をさらに経て再生するようになる。
【0003】
変性神経疾患は、多様な原因により神経細胞の漸進的な構造的、機能的な損失が発生して、認知、運動、感覚などの中枢神経系機能が退化する疾患である。変性神経疾患は、神経系特定部位の神経細胞退化が進行されて、認知症、錐体外路異常、小脳異常、感覚障害、運動障害などの症状を伴い、同時に様々な部位に異常が現れて症状が複合的に現れることもある。これに対して、患者が見せる臨床様相によって疾患を診断するが、症状が多様に現れ、互いに異なる疾患が共通的な臨床症状を見せる場合が多くて診断に困難があるという特徴がある。このような変性神経疾患は、疾患徴候が徐々に現れ、老化とともに発病する場合が多い。一旦発病すれば、死亡まで数年あるいは数十年にわたって持続的に病気が進行され、根本的な治療が難しくて社会的な負担が非常に大きく、発病原因として家族力による遺伝的な影響があるが、後天的な要因も重要に作用することが知られている。変性神経疾患は、その臨床症状によって大きく進行性認知症（アルツハイマー病など）、および神経学的異常（ピック病など）、姿勢および運動異常（パーキンソン病など）、進行性失調症、筋萎縮および萎弱、感覚および運動障害などに区分される。
【0004】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）は、遺伝的に感受性のある個体で起こり、ウイルスなどの環境因子による先天的な免疫反応の媒介体、抗体および補体のような免疫学的因子と関連した自己免疫、慢性炎症性および脱髄鞘中枢神経系疾患である。ＭＳは、炎症性脱髄鞘疾患に分類され、すべての年齢層で発生する可能性があるが、主に２０～４０歳に最も多く発生し、女性の発病率が男性に比べて２倍程度高いと知られている。このような神経性障害は、中枢神経系内の炎症性反応による神経細胞の軸索を取り囲んでいる髄鞘の損傷に起因する。病変は脳と脊髄の白質部位に散在性で現れ、病変部では典型的な現象である原発性炎症疾患である。初期には炎症が一時的であり、損傷した髄鞘の復旧が起こるが持続しない。しかし、時間が経過するほど集中的且つ慢性的な神経退行と関連した幅広い小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性化により、病理学的変化が進行され、臨床的に障害症状が次第に危篤になる。
【0005】
ルーゲーリッグ病としても知られている筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）は、一次運動皮質、脳幹および脊髄で運動神経細胞の著しい損失を特徴とする最も致命的な進行性神経変性疾患である。運動神経細胞の損失は、呼吸のような基本的且つ根本的な動きを破壊し、一般的に診断後２～５年以内に患者の死亡を招く。患者の運動機能の漸進的な悪化は、結局、患者の呼吸能力を深刻に阻害して、患者の生存のためのある形態の呼吸補助具を必要とする。他の症状としては、手、腕、脚または嚥下筋肉の筋肉弱化をまた含む。一部患者（例えば、前頭側頭葉認知症（ＦＴＤ）－ＡＬＳ）は、前頭側頭葉認知症を発達させる可能性もある。ＡＬＳ協会によると、米国で約５，６００人が毎年ＡＬＳと診断される。ＡＬＳの発病率は、１００，０００人当たり２人である。２種形態のＡＬＳが記述されている：一つは、散発性ＡＬＳ（ｓｐｏｒａｄｉｃ ＡＬＳ、ｓＡＬＳ）であって、これは、米国で最も一般的な形態のＡＬＳであり、診断されたすべての事例の９０～９５％を占める；また他の一つは、家族性ＡＬＳ（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ、ｆＡＬＳ）であって、主に優性遺伝を持つ家族系統で発生し、米国ですべての事例の約５～１０％のみを占める。ｓＡＬＳとｆＡＬＳは、臨床的に区別することができない。現在、臨床でグルタミン酸毒性抑制剤であるリルゾールや抗酸化剤であるエダラボンが処方されているが、薬物はＡＬＳ進行を多少遅らせる効果を見せるものの治療効果を期待することはできない。ＡＬＳ治療のためのまた他の戦略は、幹細胞に基づいた治療法である。幹細胞は、運動ニューロンに分化して、ＡＬＳ患者の中枢神経系、例えば、一次運動皮質、脳幹および脊髄で変性運動ニューロンを代替する潜在力がある。実際に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）および脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ））および神経組織起源神経幹細胞（例えば、胎児脊髄神経幹細胞（ＮＳＣ）、多能性神経前駆細胞（ＮＰＣ））を含み、様々なソースから誘導された幹細胞がＡＬＳ進行過程で変性運動ニューロンを代替する可能性が提示された（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２０１４、２３（３）、２０７－２１４参照）。
【0006】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、１８１７年Ｊａｍｅｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎによって初めて報告された疾病であって、年を取るにつれ、老化によって筋肉を調節する神経伝達物質であるドーパミン分泌が行われる黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ、ＳＮ）の神経細胞の損失と線条体のドーパミン欠乏により運動能力を喪失する代表的な変性脳疾患の一種である。パーキンソン病は、６５歳以上の人口の１％、８５歳以上の人口では５％程度が発病する（Ｔｗｅｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ １８， １９－３１）。特徴的な臨床的症状としては、安静時振戦（ｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ）、動作緩慢（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、固縮（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）および姿勢の不安定（ｐｏｓｔｕｒａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を伴い、黒質内ドーパミン神経（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の選択的消失（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｏｓｓ）によって誘発され、レビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）と知られた神経細胞間タンパク凝集体（ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｏｕｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）の存在が代表的な病理学的特性である（Ｏｌａｎｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２、１２３－４４）。パーキンソン病の発病原因は正確に明かされていない。大部分のパーキンソン病である散発型（ｓｐｏｒａｄｉｃ ｆｏｒｍ）の場合、その原因は特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）でほぼ知られていないが、環境的要因（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒ）とまだ完全に究明されていない遺伝的感受性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）との間の複雑な相互作用が重要な原因として推定されている（Ｌａｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４４（３ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４５－５２）。パーキンソン病は、病理学的に中脳の黒質に存在するメラニン色素を含むドーパミン性神経細胞と神経線維 （ｎｅｕｒｉｔｅ ｆｉｂｅｒ）の特異的損失と線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）のドーパミン欠乏によって行動学的異常症状を表すようになる。また、パーキンソン病患者の神経細胞では、タンパク質凝集体であるレビー小体が疾病の標識因子として観察される。パーキンソン病の代表的な発病機序としては、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）、ミトコンドリア機能不全（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、ユビキチン－プロテアソーム機能不全（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）および異常タンパク質蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）がある。
【0007】
外傷などによって脊髄神経が損傷を受けるようになれば、人体機能の麻痺を招く。脊髄神経組織は、脳に比べて単純な構造を有しているが、再生は容易でない。脊髄損傷後に起こる病理学的現象は、時間に応じて大きく一次的損傷と二次的損傷に分けられる。一次的損傷は、損傷直後の数分内に起こる現象であって、主に傷部位の細胞が壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）するが、この時期にはあまりにも早く細胞が破壊されるため、薬物学的な治療で扱うことがほとんど不可能である。一次的損傷に続く二次的損傷は、数時間から数日にわたってゆっくりと進行されるが、傷部位の細胞だけ退化するのではなく、周辺の損傷されていない神経細胞と希突起膠細胞までもアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によって徐々に細胞死滅が始まる。細胞死滅は、傷部位を中心として持続的に進行されて、結局、脊髄内部の損傷部位が次第に拡がるようになる。また、神経信号の移動通路である軸索と軸索の機能を助けるミエリン髄鞘の退化が起き、終局的に脊髄内の空いた空間（ｃｙｓｔｉｃ ｃａｖｉｔｙ）が形成され、これ以上の神経信号伝達が行われなくなり、永久的な機能消失が引き起こされる。長期間脊髄神経外傷後に起こる病理作用に対する原因究明と再生に関する研究を通じて、脊髄損傷による永久的な機能麻痺を抑制するか、緩和させようとする研究が進行されてきた。脊髄損傷の初期機序はあまりにも早く進行されて、薬物学的な治療と扱い難いため、二次的な機序を扱う薬物学的な戦略の治療剤開発が重要である。
【0008】
現在までステロイド、抗酸化剤、グルタミン酸水溶体抑制剤、イオンチャンネル抑制剤、抗炎症剤、神経成長因子など、多様な薬物学的治療が試みられたことがあるが、メチルプレドニゾロンだけが現在臨床で唯一に使用されている。しかし、メチルプレドニゾロンは、脊髄損傷後８時間内に投与すればこそ効果を期待することができるという限界を持ち、抗炎症、抗酸化、抗細胞自滅効果があり、二次損傷を減らして少しの回復を起こすが、感染の危険性および胃臓管合併症を誘発することができる副作用があって、事実上、現在としては効果的な脊髄損傷治療剤が全くない実情である。
【0009】
これまでは神経の再生ではなく、損傷後に発生する二次損傷程度を減らすための治療法開発にのみ主眼点を置いたが、近来、幹細胞に対する研究が多様な分野で活発に行われるとともに、脊髄損傷のような非可逆的な神経系損傷に対して神経再生治療の可能性が次第に高まっている。
【0010】
一方、細胞性治療法は、例えば、再生医療、臓器移植および、その上に癌のような任意の状態の診断または予防目的を含む任意の目的のために、生きている細胞を投与することを含む。幹細胞は、細胞治療法において非常に立派な潜在性を持つと評価されている。幹細胞は、生物組織を構成する多様な細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）できる細胞であって、胚芽、胎児および成体の各組織で得ることができる分化される前ステップの未分化細胞を総称する。幹細胞は、分化刺激（環境）によって特定細胞への分化が進行され、分化が完了して細胞分裂が止められた細胞とは異なり、細胞分裂によって自分と同一の細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）する特性があり、他の環境または他の分化刺激によって他の細胞にも分化することができるので、分化に柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を持っていることが特徴である。幹細胞は、大きく胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）から得られ、すべての細胞に分化できる潜在力（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を持つ全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ ｃｅｌｌ）と各組織から得られる多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）の成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とに区分される。成体幹細胞は、造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）、神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＮＳＣ）、腸幹細胞、筋肉幹細胞、毛包幹細胞および内皮幹細胞などがある。このうち間葉系幹細胞は、多くの成熟した組織に存在し、自己再生能力および多様な系統に分化できる可能性を持つものとよく知られており、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血、ホウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ′ｓ ｊｅｌｌｙ）などの成体組織から容易に得ることができる。
【0011】
従来の人工多能性幹細胞を利用した特定細胞への分化およびこれを通じた細胞治療の限界点を克服するために、任意の体細胞をすべての細胞に分化が可能な人工多能性幹細胞に逆分化させた後、さらに下位に分化させる過程（ｒｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を経ずに、「直接」所望の特定細胞に転換させる技術である直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に対する研究が多く行われている。しかし、既存の直接トランス分化方法は様々な問題点が存在する。例えば、逆分化幹細胞誘導過程で形成された多能性幹細胞を利用した交差分化法によっては多様な組織細胞を誘導することができるが、奇形腫発生の危険を内包し、逆分化幹細胞因子と発掘した特定組織細胞特異転写因子の遺伝子組み合わせによる分化法は、奇形腫の発生危険が少ないが、それぞれの組織細胞分化を誘導する特異因子を発掘するのに困難がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２０１４、２３（３）、２０７－２１４
【非特許文献2】Ｔｗｅｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ １８， １９－３１
【非特許文献3】Ｏｌａｎｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２、１２３－４４
【非特許文献4】Ｌａｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４４（３ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４５－５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、ＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化誘導用組成物を提供することである。
【0014】
また、本発明の目的は、直接トランス分化誘導用組成物を提供することである。
【0015】
また、本発明の目的は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法を提供することである。
【0016】
また、本発明の目的は、直接トランス分化を誘導する方法を提供することである。
【0017】
また、本発明の目的は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞を提供することである。
【0018】
また、本発明の目的は、前記幹細胞を有効成分として含む、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【0019】
また、本発明の目的は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導に使用するための、化学式１の化合物、化学式２の化合物または化学式３の化合物の用途を提供することである。
【0020】
また、本発明の目的は、直接トランス分化誘導に使用するための、化学式１の化合物、化学式２の化合物または化学式３の化合物の用途を提供することである。
【0021】
また、本発明の目的は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞の神経損傷疾患の予防または治療用途を提供することである。
【0022】
さらに、本発明の目的は、神経損傷疾患の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0023】
上記目的を達成するために、本発明は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導用組成物を提供する。
【0024】
また、本発明は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、成体幹細胞の神経前駆細胞への直接トランス分化誘導用組成物を提供する。
【0025】
また、本発明は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法を提供する。
【0026】
また、本発明は、直接トランス分化を誘導する方法を提供する。
【0027】
また、本発明は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞を提供する。
【0028】
また、本発明は、前記幹細胞、幹細胞培養物または懸濁培養物を有効成分として含む、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0029】
また、本発明は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導に使用するための、化学式１の化合物、化学式２の化合物または化学式３の化合物の用途を提供する。
【0030】
また、本発明は、直接トランス分化誘導に使用するための、化学式１の化合物、化学式２の化合物または化学式３の化合物の用途を提供する。
【0031】
また、本発明は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞の神経損傷疾患の予防または治療用途を提供する。
【0032】
さらに、本発明は、化学式１の化合物、化学式２の化合物および化学式３の化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞を神経損傷疾患を有する個体に移植するステップを含む、神経損傷疾患の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0033】
本発明によると、本発明の化合物は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を調節することで、これを媒介に成体幹細胞を神経前駆細胞に直接トランス分化誘導することができる。このように直接トランス分化誘導されたｃｉＮＳＣ５は、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）マーカーおよび成熟した神経細胞（ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎ）マーカーを発現しないとともに、中間神経前駆体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）または未成熟神経細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎ）マーカータンパク質の発現が成体幹細胞に比べて顕著に増加し、成長因子、組織分解因子、神経分化、神経生成および軸索再生に関与するリガンド、およびサイトカインを含む分泌タンパク質の分泌が増加し、神経生成、神経再生、神経保護、神経膠瘢痕分解のための酵素、神経発生関連因子の発現が増加し、ドーパミン性神経細胞または神経細胞に分化能を有するので、本発明の化合物をＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導または直接トランス分化誘導用途で活用することができ、ＡＬＳマウスモデル、ＭＳマウスモデル、ＰＤレットモデルおよび慢性脊髄損傷レットモデルの両方で顕著な治療効果を示したので、本発明の化合物を処理した幹細胞を細胞治療剤として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３のＤＡＲＴＳ（Ｄｒｕｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）分析結果を示した図である。
【図2】ＹＪ１０２のＣＴＢＰ１オリゴマー化調節様相を免疫沈澱法で確認した図である。
【図3】ＣｔＢＰ１とＹＪ１０１、ＹＪ１０２、ＹＪ１０３の分子ドッキング結果を示す。
【図4】ＣｈＩＰ方法でＣｔＢＰ１－ＹＪ１０２の標的遺伝子を確認した図である。
【図5】ＹＪ１０２によるＣｔＢＰ１－媒介ｃｉＮＳＣ５分化有無を確認した図である。
【図6】ＹＪ１０１、ＹＪ１０２またはＹＪ１０３を処理したヒトＵＣＢ－ＭＳＣの直接トランス分化有無を確認した図である。
【図7】多様な由来の間葉系幹細胞がＹＪ１０２によって直接トランス分化されるかを確認した図である。
【図8】ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３のＵＣＢ－ＭＳＣに対する細胞毒性を確認した図である。
【図9】ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３がＵＣＢ－ＭＳＣの細胞増殖に及ぼす影響を確認した図である。
【図10】ＹＪ１０２を５日間処理したｃｉＮＳＣ５で神経マーカーの発現を免疫蛍光分析で確認した図である。
【図11】ＹＪ１０２を５日間処理したｃｉＮＳＣ５で神経前駆細胞マーカータンパク質の発現をウェスタンブロット分析で確認した図である。
【図12】ＹＪ１０２を５日間処理したｃｉＮＳＣ５でＭＳＣ細胞表面抗原マーカータンパク質発現をウェスタンブロット分析で確認した図である。
【図14】ＹＪ１０２を５日間処理したｃｉＮＳＣ５で増加する成長因子、組織分解および神経分化／再生関連因子を確認した図である。
【図16】ＹＪ１０２処理によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５を継代してＹＪ１０２のない培地で２日間培養した後、培地内の成長因子、組織分解および神経分化／再生関連タンパク質をウェストンブロッで確認した図である。
【図18】ＹＪ１０２処理によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５をＹＪ１０２が含まれない培地で４日または７日間追加培養した後、培地内成長因子、組織分解および神経分化／再生関連タンパク質をウェストンブロッで確認した図である。
【図20】ｃｉＮＳＣ５をＹＪ１０２を含まない培地で２日間培養した後、該当培地内のｃｉＮＳＣ５で増加する成長因子および組織分解関連６種因子の量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図21】ＥＬＩＳＡ結果値とＭＳＣ培地で確認された量対比ｃｉＮＳＣ５培地で増加した割合を示した図である。
【図22】ｃｉＮＳＣ５で発現される遺伝子をＲＮＡ－ｓｅｑで分析した結果をｈｅａｔ ｍａｐで示した図である。
【図23】ＲＮＡ－ｓｅｑ結果を基盤に５日目に培地で発現が変化する因子のうち神経発生、シナプス、神経伝達物質、神経成長因子などに関与した遺伝子を選択して分析した図である。
【図25】５日間ＹＪ１０２を処理したＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５で神経膠瘢痕分解のための酵素の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで分析した図である。
【図26】５日間ＹＪ１０２を処理したＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５で神経発生に関連した転写因子の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで分析した図である。
【図27】５日間ＹＪ１０２を処理したＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でミエリン化、シナプシス、マトリックス／細胞付着、カルシウムシグナリングのようなニューロンマーカーの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで分析した図である。
【図28】５日間ＹＪ１０２を処理したＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でニューロンレセプターおよびチャンネルの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで分析した図である。
【図29】ｃｉＮＳＣ５の継代培養時の細胞特性変化を継代別ダブリング時間で確認した図である。
【図30】ｃｉＮＳＣ５の継代培養時の細胞特性変化を継代数によるＣＰＤＬ値で確認した図である。
【図31】継代培養時ｃｉＮＳＣ５のＴｕｊ１発現を確認した図である。
【図32】ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇを通じてｃｉＮＳＣ５の継代培養時の染色体異常を確認した図である。
【図33】ｃｉＮＳＣ５の神経細胞への分化有無を確認した図である。
【図34】ＭＤＩ処理時の脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）をそのマーカーであるＣ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの発現で確認した図である。
【図35】ｃｉＮＳＣ５移植後のＡＬＳマウスモデルの寿命を確認した図である。
【図36】ｃｉＮＳＣ５移植後のＡＬＳマウスモデルの挙動分析（ロータロッド、運動スコア、ハンギングワイヤーテストおよびバランスビームテスト）を遂行した図である。
【図37】ｃｉＮＳＣ５移植後のＡＬＳマウスモデルの腰椎脊髄神経損失を確認した図である。
【図38】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの挙動分析を遂行した図である。
【図39】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの脱髄鞘化範囲および程度を確認した図である。
【図40】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの脊髄白質周囲に浸透された単核細胞を確認した図である。
【図41】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの脊髄白質に浸透されたマクロファージを確認した図である。
【図42】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの脊髄で小膠細胞および星状細胞の活性化を確認した図である。
【図43】ｃｉＮＳＣ５移植後のＥＡＥマウスモデルの脊髄で小膠細胞および星状細胞の活性化を確認した図である。
【図44】６－ＯＨＤＡ注入を通じたＰＤレットモデルを製作過程およびＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃの位置（Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ：ＡＰ＋０．７、ＭＬ＋２．６、ＤＶ －４．５ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ；およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙ：ＡＰ －２．２、ＭＬ＋１．５、ＤＶ－８．０ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ）を示した図である。
【図45】ｃｉＮＳＣ５移植後のＰＤレットモデルで運動機能回復を挙動分析（ローテーションテストおよびステッピングテスト）で確認した図である。
【図46】ｃｉＮＳＣ５移植後のＰＤレットモデルでドーパミン神経細胞の消失を確認した図である。
【図47】ｃｉＮＳＣ５移植後のＰＤレットモデルでヒト特異的抗体（ＳＴＥＭ１２１）で移植を確認した図である。
【図48】ｃｉＮＳＣ５移植後のＰＤレットモデルに細胞を移植した部位でヒト特異的抗体（ＳＴＥＭ１２１）およびドーパミン神経細胞（ＴＨ－陽性細胞）を確認することでｃｉＮＳＣｓが移植後のヒトドーパミン神経細胞に分化されたことを確認した図である。
【図49】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで運動機能回復を挙動分析（ＢＢＢ、グリッドワークおよびフットプリント）で確認した図である。
【図50】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで運動機能回復をＦＲＩで分析した図である。
【図51】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで病変体積およびミエリン損失を確認した図である。
【図52】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで病変部位の神経膠症的傷形成程度を確認した図である。
【図53】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで軸索再生をＢＤＡ先行軸索追跡で確認した図である。
【図54】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで軸索再生をフルオロゴールド逆行軸索追跡で確認した図である。
【図55】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルで軸索再生因子であるＧＡＰ４３の発現様相をウェスタンブロットで確認した図である。
【図56】ｃｉＮＳＣ５移植後の慢性脊髄損傷レットモデルに細胞移植６週後に成熟した神経細胞に分化されたかを確認するために、ヒト特異的抗体であるＳＴＥＭ１２１抗体および神経細胞マーカーを利用して免疫組織化学染色を遂行した図である。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、添付の図面を参照して、本発明の具現例で本発明を詳しく説明することにする。ただし、下記の具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであって、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曇ることができるものと判断される場合には、その詳細な説明を省略することができ、これにより本発明が制限されることはない。本発明は、後述する特許請求の範囲の記載およびそれから解析される均等範疇内で多様な変形および応用が可能である。
【0036】
また、本明細書において使用される用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために使用された用語であって、これは、使用者、運用者の意図または本発明の属する分野の慣例などによって変わることがある。したがって、本用語に対する定義は、本明細書全般にわたった内容に基づいて下されなければならない。明細書の全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【0037】
本発明において使用されるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また本明細書には、好ましい方法や試料が記載されるが、これと類似するか、または同等なものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載されるすべての刊行物の内容は、本発明に統合される。
【0038】
本明細書の全体にわたって、特定物質の濃度を示すために使用される「％」は、別途の言及がない場合、固体／固体は（ｗ／ｗ）％、固体／液体は（ｗ／ｖ）％、そして液体／液体は（ｖ／ｖ）％である。
【0039】
一側面において、本発明は、下記の化１で表されるベンゾオキサゾール誘導体、その立体異性体、その薬剤学的に許容される塩、またはその溶媒和物あるいは水和物に関する。
【0040】
【化1】
【0041】
化１において、
Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；ニトロ基（－ＮＯ２）；またはアミノ基（－ＮＨ２）であり、
Ｌは、Ｃ１－Ｃ４アルキレン基であり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ６；または－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ７であり、
Ｒ５は、水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；またはＣ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基であり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基である。
Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；ニトロ基（－ＮＯ２）；またはアミノ基（－ＮＨ２）であり、
Ｌは、Ｃ１－Ｃ４アルキレン基であり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ６；または－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ７であり、
Ｒ５は、水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；またはＣ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基であり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基である。
【0042】
本発明において、前記立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）は、分子内の原子または原子団の配置が空間的に異なって生じる異性体であって、光学異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）と幾何異性体（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｉｓｏｍｅｒ）をすべて含む。
【0043】
本発明において、前記水和物は、ベンゾオキサゾール誘導体、その薬学的に許容可能な塩、またはその立体異性体などと水が非共有的分子間の力で結合されているものであって、化学量論的または非化学量論的の量の水を含むものであってよい。具体的には、前記水和物は、活性成分１モルを基準に水を約０．２５モル～約１０モル比で含むことができ、より具体的には、約０．５モル、約１モル、約１．５モル、約２モル、約２．５モル、約３モル、約５モルなどを含むことができる。
【0044】
本明細書において、「溶媒和物」は、ベンゾオキサゾール誘導体、その薬学的に許容可能な塩、またはその立体異性体などと水ではない溶媒が分子間の力で結合されているものであって、溶媒を化学量論的または非化学量論的量で含むことができる。具体的には、前記溶媒和物は、活性成分１モルを基準に溶媒分子を約０．２５モル～約１０モル比で含むことができ、より具体的には、約０．５モル、約１モル、約１．５モル、約２モル、約２．５モル、約３モル、約５モルなどで含むことができる。
【0045】
一具現例において、前記化１で表されるベンゾオキサゾール誘導体は、下記化学式２で表されるベンゾオキサゾール誘導体であることであるベンゾオキサゾール誘導体、その立体異性体、その薬剤学的に許容される塩、またはその溶媒和物あるいは水和物であってよい。
【0046】
【化2】
【0047】
化２において、
ＬおよびＲ１～Ｒ５の定義は、前記化１で定義したとおりである。
一具現例において、Ｒ１～Ｒ３のうち２つは水素であり、残り１つは水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；ニトロ基（－ＮＯ２）；またはアミノ基（－ＮＨ２）であってよい。
ＬおよびＲ１～Ｒ５の定義は、前記化１で定義したとおりである。
一具現例において、Ｒ１～Ｒ３のうち２つは水素であり、残り１つは水素；ハロゲン基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルキル基；Ｃ１－Ｃ４の直鎖または分枝鎖のアルコキシ基；ニトロ基（－ＮＯ２）；またはアミノ基（－ＮＨ２）であってよい。
【0048】
本発明の実施例において、前記化１で表されるベンゾオキサゾール誘導体は、下記化学式I、化学式IIまたは化学式IIIの化合物のうちいずれか１つであってよい。
【0049】
【化3】
【0050】
一側面において、本発明は、化３のうち、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、ＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化誘導用組成物に関する。
【0051】
一具現例において、ＣｔＢＰｓは、ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２であってよい。
【0052】
一具現例において、前記組成物は、ＣｔＢＰｓを酵素から保護してオリゴマー化を誘導することができる。
【0053】
一具現例において、前記オリゴマー化は、ＣｔＢＰ１－ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２－ＣｔＢＰ２のホモオリゴマー化であってよい。
【0054】
一具現例において、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物は、ＣｔＢＰ１と直接結合することができ、化学式２の化合物は、ＣｔＢＰ２とも直接結合することができる。
【0055】
一具現例において、化学式Iの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００に結合し、化学式IIの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００およびＡｒｇ２６６に結合し、化学式IIIの化合物は、ＣｔＢＰ１のＰｈｅ１０２、Ａｒｇ１８４およびＨｉｓ２３６に結合することができる。
【0056】
一具現例において、前記組成物は、ＨＥＳ１の発現を減少させることができる。
【0057】
一具現例において、前記組成物は、Ｓｏｘ２の発現を増加させることができる。
【0058】
一具現例において、前記組成物は、ＯＣＴ４の発現を誘導することができる。
【0059】
一具現例において、前記組成物は、ＣｔＢＰｓ－媒介によって成体幹細胞を神経前駆細胞に分化させることができる。
【0060】
一具現例において、成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）であってよく、間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣ－ＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤ－ＭＳＣ）または骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＢＭ－ＭＳＣ）であってよい。
【0061】
一具現例において、神経前駆細胞は、ｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）であってよい。
【0062】
一具現例において、前記組成物は、試薬組成物または培地組成物であってよい。
一側面において、本発明は、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の神経前駆細胞への直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）誘導用組成物に関する。
一側面において、本発明は、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の神経前駆細胞への直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）誘導用組成物に関する。
【0063】
一具現例において、前記組成物は、成体幹細胞からＣｔＢＰｓのオリゴマーを誘導してＣｔＢＰｓ－媒介による神経前駆細胞への直接トランス分化を誘導することができる。
【0064】
一具現例において、成体幹細胞は、間葉系幹細胞であってよく、間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であってよく、成体幹細胞なら特定組織細胞に関係なく適用することができるので、これに制限されない。多数の本発明の具体的な実施例においては、臍帯（血）に由来した間葉系幹細胞を使用したが、脂肪由来間葉系幹細胞および骨髄由来間葉系幹細胞からも神経前駆細胞に直接トランス分化が可能であることを確認した。
【0065】
一具現例において、神経前駆細胞は、ｃｉＮＳＣ５であってよい。
【0066】
一具現例において、前記組成物は神経マーカーの発現を増加させることができ、神経マーカーはＴｕｊ１、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１、ＧＡＰ－４３またはｐ７５であってよい。
【0067】
一具現例において、前記組成物は神経前駆細胞マーカータンパク質の発現を増加させることができ、神経前駆細胞マーカータンパク質はＴｕｊ１タンパク質、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質、ｐ７５タンパク質、ＧＡＰ－４３タンパク質、ＣＤ５４タンパク質、ＣＤ３０９タンパク質、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質、ＣＤ２９タンパク質、ＭＡＳＨ１タンパク質またはＴＢＲ２タンパク質であってよく、直接トランス分化誘導前に比べて誘導後にＴｕｊ１タンパク質を６倍以上、好ましくは６～８倍、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質を７倍以上、好ましくは７～１０倍、ｐ７５タンパク質を４倍以上、好ましくは４～８倍、ＧＡＰ４３タンパク質を４倍以上、好ましくは４～７倍、ＣＤ５４タンパク質を２倍以上、好ましくは２～５倍、ＣＤ３０９タンパク質を３倍以上、好ましくは３～７倍、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質を３．５倍以上、好ましくは３．５～６倍、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質を４倍以上、好ましくは４～６倍、ＣＤ２９タンパク質を４．５倍以上、好ましくは４．５～８倍、ＭＡＳＨ１タンパク質を４倍以上、好ましくは４～８倍、またはＴＢＲ２タンパク質を３倍以上、好ましくは３～７倍発現増加させることができる。
【0068】
一具現例において、前記組成物は成体幹細胞マーカータンパク質の発現を減少させることができ、成体幹細胞マーカータンパク質はＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５であってよく、直接トランス分化誘導前に比べて誘導後にＣＤ４４タンパク質を５０～９０％、ＣＤ７３タンパク質を３０～７０％またはＣＤ１０５タンパク質を５０～９０％発現減少させることができる。
【0069】
一具現例において、前記組成物は分泌タンパク質の分泌を増加させることができ、分泌タンパク質は成長因子、組織分解因子、リガンドまたはサイトカインであってよい。
【0070】
一具現例において、前記成長因子はＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＶＥＧＦＡであってよく、直接トランス分化誘導前に比べて誘導後にＰｌＧＦを１．５～４倍、ＮＧＦを１．５～６倍、ＢＤＮＦを１．５～３倍またはＶＥＧＦＡを１．５～５倍分泌増加させることができる。
【0071】
一具現例において、前記組織分解因子はＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７またはＴＩＭＰ２であってよく、直接トランス分化誘導前に比べて誘導後にＭＭＰ１を１．５～３．５倍またはＭＭＰ２を２～６倍分泌増加させることができる。
【0072】
一具現例において、前記リガンドはＳＨＨまたはＮｏｔｃｈ１であってよい。
【0073】
一具現例において、前記サイトカインはＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６であってよく、直接トランス分化誘導前に比べて誘導後にＴＮＦＳＦ１２を１．５～４倍分泌増加させることができる。
【0074】
一具現例において、前記組成物は試薬組成物または培地組成物であってよい。
【0075】
本発明において、前記マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現水準は、前記マーカーの核酸配列、前記核酸配列に相補的な核酸配列、前記核酸配列および相補的な配列の断片を特異的に認識するプライマー対、プロブ、またはプライマー対およびプロブを利用して重合酵素連鎖反応、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応、競争的重合酵素連鎖反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ保護分析（ＲＮａｓｅ、Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕ交雑法、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはＤＮＡチップ方法で測定されることができ、前記マーカーのタンパク質発現水準はマーカーのタンパク質全長またはその断片を特異的に認識する抗体、抗体断片、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｄｉｔｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒ）またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を利用してウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、質量分析またはタンパク質マイクロアレイ方法で測定されることができる。
【0076】
本発明において使用された用語「直接トランス分化（Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ、Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、高等生物で全く異なる細胞タイプを有する成熟した（分化が終わった）細胞間の転換を誘導する過程で、任意の体細胞（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ Ａ）をすべての細胞に分化が可能な人工多能性幹細胞に逆分化させた後に再分化させる過程（ｒｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を経ずに、「直接」所望の特定細胞（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ Ｂ）に転換させる技術である。現在、直接トランス分化は、疾病モデリングと新薬発掘などに利用される可能性を認められており、未来には遺伝子治療、そして再生医学などにも応用されることができるものと予想される。
【0077】
一側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試料に化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を処理するステップを含むＣｔＢＰｓのオリゴマー化を誘導する方法に関する。
【0078】
一具現例において、前記化合物は、３～７日間処理されることができ、５日間処理されることが最も好ましい。
【0079】
一具現例において、ＣｔＢＰｓは、ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２であってよい。
【0080】
一具現例において、前記オリゴマー化は、ＣｔＢＰ１－ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２－ＣｔＢＰ２のホモオリゴマー化であってよい。
【0081】
一具現例において、前記試料は、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）であってよく、一具現例において、成体幹細胞は、間葉系幹細胞であってよく、間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞、脂肪由来中肝葉幹歳または骨髄由来間葉系幹細胞であってよい。
【0082】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に試料でＴｕｊ１、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｐ７５、ＧＡＰ－４３、ＣＤ３０９、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、ＣＤ２９、ＭＡＳＨ１またはＴＢＲ２発現を増加させることができ、Ｔｕｊ１を６倍以上、好ましくは６～８倍、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）を７倍以上、好ましくは７～１０倍、ｐ７５を４倍以上、好ましくは４～８倍、ＧＡＰ４３を４倍以上、好ましくは４～７倍、ＣＤ５４を２倍以上、好ましくは２～５倍、ＣＤ３０９を３倍以上、好ましくは３～７倍、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）を３．５倍以上、好ましくは３．５～６倍、ＰＳＡ－ＮＣＡＭを４倍以上、好ましくは４～６倍、ＣＤ２９を４．５倍以上、好ましくは４．５～８倍、ＭＡＳＨ１を４倍以上、好ましくは４～８倍、またはＴＢＲ２を３倍以上、好ましくは３～７倍発現増加させることができる。
【0083】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に試料で成長因子、組織分解因子、リガンドまたはサイトカインの分泌を増加させることができ、化合物処理前に比べて処理後に試料でＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌を増加させ、ＰｌＧＦを１．５～４倍、ＮＧＦを１．５～６倍、ＢＤＮＦを１．５～３倍、ＶＥＧＦＡを１．５～５倍、ＭＭＰ１を１．５～３．５倍、ＭＭＰ２を２～６倍またはＴＮＦＳＦ１２を１．５～４倍分泌増加させることができ、化合物処理前に比べて処理後に試料でＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現を減少させることができ、ＣＤ４４の発現を５０～９０％、ＣＤ７３の発現を３０～７０％またはＣＤ１０５の発現を５０～９０％減少させることができる。
【0084】
一側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を成体幹細胞に処理するステップを含む成体幹細胞を神経前駆細胞に直接トランス分化を誘導する方法に関する。
【0085】
一具現例において、前記化合物は、３～７日間処理されることができ、５日間処理されることが最も好ましい。
【0086】
一具現例において、ＣｔＢＰｓ－媒介によって直接トランス分化が誘導されることができ、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化を通じて直接トランス分化が誘導されることがさらに好ましい。
【0087】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に細胞でＴｕｊ１、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｐ７５、ＧＡＰ－４３、ＣＤ３０９、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、ＣＤ２９、ＭＡＳＨ１またはＴＢＲ２の発現を増加させることができ、Ｔｕｊ１を２～５倍、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）を３～６倍、ｐ７５を１．５～４倍、ＧＡＰ４３を２～６倍、ＣＤ３０９を１．５～３倍、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）を１．５～４．５倍、ＰＳＡ－ＮＣＡＭを１．５～４倍、ＣＤ２９を１．５～４倍、ＭＡＳＨを２～４倍またはＴＢＲ２を５～９倍発現増加させることができる。
【0088】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に細胞で成長因子、組織分解因子、リガンドまたはサイトカインの分泌を増加させることができる。
【0089】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に細胞でＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＴＩＭＰ２、ＳＨＨ、Ｎｏｔｃｈ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６の分泌を増加させて、ＰｌＧＦを１．５～４倍、ＮＧＦを１．５～６倍、ＢＤＮＦを１．５～３倍、ＶＥＧＦＡを１．５～５倍、ＭＭＰ１を１．５～３．５倍、ＭＭＰ２を２～６倍またはＴＮＦＳＦ１２を１．５～４倍分泌増加させることができる。
【0090】
一具現例において、前記方法は、化合物処理前に比べて処理後に細胞でＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現を減少させることができ、ＣＤ４４の発現を５０～９０％、ＣＤ７３の発現を３０～７０％またはＣＤ１０５の発現を４０～８０％減少させることができる。
【0091】
本発明の直接トランス分化誘導用組成物および直接トランス分化方法で誘導される直接トランス分化によって、成体幹細胞から神経前駆細胞への直接的分化誘導が可能であり、ここで、さらに神経細胞および／またはドーパミン神経細胞に分化されることができる。この場合、前記直接トランス分化方法は、先立って説明した本発明の化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上、またはこれを含む直接トランス分化組成物を成体幹細胞に取り入れて得た神経前駆細胞を神経細胞またはドーパミン神経細胞に分化させるステップをさらに含むことができ、このとき間葉系幹細胞を神経細胞またはドーパミン神経細胞に分化させるステップは、一般的な分化技術を適用して遂行されるものであってよい。
【0092】
一側面において、本発明は、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞に関する。
【0093】
一具現例において、化合物が処理された幹細胞は、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）であってよく、成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）であってよく、間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣ－ＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤ－ＭＳＣ）または骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＢＭ－ＭＳＣ）であってよい。
【0094】
一具現例において、本発明の幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を３～７日間処理した幹細胞であってよく、幹細胞に化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理するステップ；および化合物が処理された幹細胞を３～７日間培養するステップを含む方法で製造された幹細胞であってよい。
【0095】
一具現例において、本発明の幹細胞は、前記化合物をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解して５～１００ｕＭの濃度で処理した幹細胞であってよい。
【0096】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物処理によって成体幹細胞に直接トランス分化（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）された神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）であってよく、神経前駆細胞は、ｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）であってよい。
【0097】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べて神経マーカーの発現が増加することができ、神経マーカーは、Ｔｕｊ１、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１、ＧＡＰ－４３またはｐ７５であってよい。
【0098】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べて神経前駆細胞マーカータンパク質の発現が増加することができ、神経前駆細胞マーカータンパク質は、Ｔｕｊ１タンパク質、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質、ｐ７５タンパク質、ＧＡＰ－４３タンパク質、ＣＤ５４タンパク質、ＣＤ３０９タンパク質、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質、ＣＤ２９タンパク質、ＭＡＳＨ１タンパク質またはＴＢＲ２タンパク質であってよい。
【0099】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＴｕｊ１タンパク質が６倍以上、好ましくは６～８倍、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質が７倍以上、好ましくは７～１０倍、ｐ７５タンパク質が４倍以上、好ましくは４～８倍、ＧＡＰ４３タンパク質が４倍以上、好ましくは４～７倍、ＣＤ５４タンパク質が２倍以上、好ましくは２～５倍、ＣＤ３０９タンパク質が３倍以上、好ましくは３～７倍、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質が３．５倍以上、好ましくは３．５～６倍、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質が４倍以上、好ましくは４～６倍、ＣＤ２９タンパク質が４．５倍以上、好ましくは４．５～８倍、ＭＡＳＨ１タンパク質が４倍以上、好ましくは４～８倍、またはＴＢＲ２タンパク質が３倍以上、好ましくは３～７倍発現増加することができる。
【0100】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＣＤ４４、ＣＤ７３またはＣＤ１０５の発現が減少することができ、ＣＤ４４タンパク質の発現が５０～９０％、ＣＤ７３タンパク質の発現が３０～７０％またはＣＤ１０５タンパク質の発現が５０～９０％減少することができる。
【0101】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べて分泌タンパク質の分泌が増加することができ、分泌タンパク質は、成長因子、組織分解因子、リガンドまたはサイトカインであってよい。
【0102】
一具現例において、成長因子は、ＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＶＥＧＦＡであってよく、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＰｌＧＦの分泌が１．５～４倍、ＮＧＦの分泌が１．５～６倍、ＢＤＮＦの分泌が１．５～３倍またはＶＥＧＦＡの分泌が１．５～５倍増加することができる。
【0103】
一具現例において、組織分解因子は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７またはＴＩＭＰ２であってよく、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＭＭＰ１の分泌が１．５～３．５倍またはＭＭＰ２の分泌が２～６倍増加することができる。
【0104】
一具現例において、リガンドは、ＳＨＨまたはＮｏｔｃｈ１であってよい。
【0105】
一具現例において、サイトカインは、ＴＮＦＳＦ１２またはＩＬ－１６であってよく、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＴＮＦＳＦ１２の分泌が１．５～４倍増加することができる。
【0106】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べてＨＥＳ１、Ｓｏｘ２またはＯＣＴ４の発現が増加することができる。
【0107】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物の処理によってＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化が誘導されることができ、化合物がＣｔＢＰｓを酵素から保護することでオリゴマー化が誘導されることができる。
【0108】
一具現例において、ＣｔＢＰｓは、ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２であってよい。
【0109】
一具現例において、前記オリゴマー化は、ＣｔＢＰ１－ＣｔＢＰ１またはＣｔＢＰ２－ＣｔＢＰ２のホモオリゴマー化であってよい。
【0110】
一具現例において、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物は、ＣｔＢＰ１と直接結合することができ、化学式IIの化合物は、ＣｔＢＰ２とも直接結合することができる。
【0111】
一具現例において、化学式Iの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００に結合し、化学式IIの化合物は、ＣｔＢＰ１のＳｅｒ１００およびＡｒｇ２６６に結合し、化学式IIIの化合物は、ＣｔＢＰ１のＰｈｅ１０２、Ａｒｇ１８４およびＨｉｓ２３６に結合することができる。
【0112】
一具現例において、前記化合物は、ＣｔＢＰｓ－媒介によって成体幹細胞を神経前駆細胞に分化させることができる。
【0113】
一具現例において、前記化合物は、成体幹細胞からＣｔＢＰｓのオリゴマーを誘導してＣｔＢＰｓ－媒介による神経前駆細胞への直接トランス分化を誘導することができる。
【0114】
一具現例において、成体幹細胞は、間葉系幹細胞であってよく、間葉系幹細胞は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ－ＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞であってよく、成体幹細胞なら特定組織細胞に関係なく適用することができるので、これに制限されない。多数の本発明の具体的な実施例においては、臍帯（血）に由来した間葉系幹細胞を使用したが、脂肪由来間葉系幹細胞および骨髄由来間葉系幹細胞からも神経前駆細胞に直接トランス分化が可能であることを確認した。
【0115】
一具現例において、本発明の幹細胞は、ＭＡＰ２、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｓａｓｈｉ １またはＧＦＡＰを発現しなくてよい。
【0116】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べて神経生成を誘導遺伝子、誘導性神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）分泌遺伝子、神経発生関連遺伝子、ニューロンマーカー遺伝子、ニューロンレセプター遺伝子およびチャンネル関連遺伝子の発現が増加することができる。
【0117】
一具現例において、本発明の幹細胞は、化合物が処理されていない幹細胞に比べて神経膠瘢痕分解のための酵素の発現が増加することができる。
【0118】
一具現例において、本発明の幹細胞は、ドーパミン性神経細胞、神経細胞または成熟した神経細胞に分化ができる。
【0119】
一具現例において、本発明の幹細胞は、脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）が誘導されなくてよい。
【0120】
本発明において使用された用語「発現」は、核酸がＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ転写物に）転写される過程および／または以後に転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される過程を指称する。
【0121】
本発明において、前記遺伝子のｍＲＮＡの発現水準は、前記マーカーの核酸配列、前記核酸配列に相補的な核酸配列、前記核酸配列および相補的な配列の断片を特異的に認識するプライマー対、プロブ、またはプライマー対およびプロブを利用して重合酵素連鎖反応、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応、競争的重合酵素連鎖反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ保護分析（ＲＮａｓｅ、Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕ交雑法、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはＤＮＡチップ方法で測定されることができ、前記遺伝子のタンパク質発現水準は、該当タンパク質全長またはその断片を特異的に認識する抗体、抗体断片、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｄｉｔｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒ）またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を利用してウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、質量分析またはタンパク質マイクロアレイ方法で測定されることができる。
【0122】
本発明において使用された用語「直接トランス分化（Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ、Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、高等生物で全く異なる細胞タイプを有する成熟した（分化が終わった）細胞間の転換を誘導する過程で、任意の体細胞（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ Ａ）をすべての細胞に分化が可能な人工多能性幹細胞に逆分化させた後に再分化させる過程（ｒｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を経ずに、「直接」所望の特定細胞（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ Ｂ）に転換させる技術である。
【0123】
本発明の化合物を処理した幹細胞は、神経前駆細胞に直接トランス分化され、ここで、さらに成熟した神経細胞および／またはドーパミン神経細胞に分化されることができる。この場合、前記化合物を処理した幹細胞神経細胞またはドーパミン神経細胞に分化させる構成を本発明にさらに含むことができ、このとき間葉系幹細胞を神経細胞またはドーパミン神経細胞に分化させるステップは、一般的な分化技術を適用して遂行されるものであってよい。
【0124】
一側面において、本発明は、本発明の幹細胞、幹細胞培養物または懸濁培養物を有効成分として含む、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【0125】
一具現例において、神経損傷疾患は、中枢または末梢神経系の損傷、または神経変性疾患であってよく、ＣＮＳ（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）損傷疾患であってよい。
【0126】
一具現例において、中枢または末梢神経系の損傷が脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、末梢神経損傷、脳卒中または脳癌であってよい。
【0127】
一具現例において、脊髄損傷は、外傷または炎症によって誘発されることができ、急性横断性脊髄炎、急性種まき性脊髄炎、脊髄病症、非ホジキンリンパ腫、水頭症、遺伝性失調症、神経梅毒、水俣病、ルーゲーリッグ病および多発性硬化症からなる群より選択された一つ以上によって誘発されることができる。
【0128】
一具現例において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）であってよく、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症（ＭＳ）であることがさらに好ましい。
【0129】
一具現例において、本発明の組成物は、脊髄内運動神経細胞の死滅を有意的に抑制し、運動機能の障害が同伴されるルーゲーリッグ病症状の進行を遅延し、寿命を延長することでルーゲーリッグ病の予防または治療効果を達成することができる。
【0130】
一具現例において、本発明の組成物は、ＣＮＳの脱髄鞘化を抑制し、脊髄白質への単核細胞またはマクロファージの浸透を抑制し、小膠細胞または星状細胞の活性化を抑制することで、多発性硬化症（ＭＳ）の予防または治療効果を達成することができる。
【0131】
一具現例において、本発明の組成物は、ドーパミン神経細胞の消失を抑制し、移植された本発明の幹細胞がドーパミン神経細胞に分化することで、パーキンソン病（ＰＤ）の予防または治療効果を達成することができる。
【0132】
一具現例において、本発明の組成物は、ミエリン損失を減少させ、神経膠症的傷（ｇｌｉｏｔｉｃ ｓｃａｒ）形成を減少させ、軸索（ａｘｏｎ）を増加させ、移植された本発明の幹細胞が成熟した神経細胞に分化することで、慢性脊髄損傷の予防または治療効果を達成することができる。
【0133】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による組成物の投与により神経損傷疾患の発生、発達および再発を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【0134】
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による組成物の投与で神経損傷疾患およびこれによる合併症の症状を好転させるか、有利に変更すべての行為を意味する。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などで提示された資料を参照して本願の組成物の効果がある疾患の正確な基準が分かり、改善、向上および治療された程度を判断することができるはずである。
【0135】
本明細書において使用される用語「治療」は、有利であるか、好ましい臨床的結果を得るための接近を意味する。本発明の目的のために、有利であるか、好ましい臨床的結果は、非制限的に、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾病進行の遅延または速度の減少、疾病状態の改善または一時的緩和および軽減（部分的や全体的に）、検出可能であるか、または検出されないか否かを含む。
【0136】
また、「治療」は、治療を受けなかった場合に予想される生存率と比較して生存率を伸ばすことを意味することもできる。「治療」は、治療学的治療および予防的または予防措置方法のすべてを示す。前記治療は、予防される障害だけでなく、既に発生した障害において要求される治療を含む。疾病を「緩和（Ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」することは、治療をしない場合と比較して、疾病状態の範囲および／または好ましくない臨床的徴候が減少するか、および／または進行の時間的推移（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）が遅くなるか、長くなることを意味する。
【0137】
本発明の組成物の治療的に有効な量は、様々な要素、例えば、投与方法、目的部位、個体の状態などによって変わることがある。
【0138】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において使用される用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険割合で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量水準は、個体の健康状態、神経損傷疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、配合または同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。本発明の組成物は、個別治療剤で投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。上記の要素をすべて考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されることができる。
【0139】
前記治療とは、特に言及されない限り、前記用語が適用される疾患または疾病、または前記疾患または疾病の一つ以上の症状を逆転させるか、緩和させるか、その進行を抑制するか、または予防することを意味し、本願において使用された前記治療という用語は、「治療する」が前記のように定義されるとき、治療する行為を言う。したがって、哺乳動物において自己免疫疾患の治療または治療療法は、下記の一つ以上を含むことができる：
（１）神経損傷疾患の成長を阻害する、すなわち、その発達を阻止させる、
（２）神経損傷疾患の拡散を予防する、すなわち、転移を予防する、
（３）神経損傷疾患を軽減させる。
（４）神経損傷疾患の再発を予防する、および
（５）神経損傷疾患の症状を緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）。
（１）神経損傷疾患の成長を阻害する、すなわち、その発達を阻止させる、
（２）神経損傷疾患の拡散を予防する、すなわち、転移を予防する、
（３）神経損傷疾患を軽減させる。
（４）神経損傷疾患の再発を予防する、および
（５）神経損傷疾患の症状を緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）。
【0140】
もし、受益動物が組成物の投与に耐えることができるか、組成物のその動物への投与が適した場合であれば、組成物は「薬学的にまたは生理学的に許容可能である」ことを示す。投与された量が生理学的に重要な場合には、前記製剤は「治療学的に有効量」で投与されたと言える。前記製剤の存在が移植患者の生理学的に検出可能な変化を招いた場合であれば、前記製剤は生理学的に意味がある。
【0141】
本明細書において使用される「有効量」は、有利であるか、好ましい臨床的または生化学的結果に影響を与える適切な量である。有効量は、一度またはそれ以上投与されることができる。本発明の目的のために、促進剤の有効量は、関連疾病状態の進行を一時的に緩和、改善、安定化、戻す、速度を遅らせるか、または遅延させるのに適切な量である。
【0142】
本発明の組成物の治療的に有効な量は、多くの要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わることがある。よって、人体に使用時投与量は、安全性および効率性を一緒に考慮して適正量で決定しなければならない。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮すべきこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ′ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。
【0143】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において使用される用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険割合で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量水準は、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、配合または同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られた要素によって決定されることができる。本発明の組成物は、個別治療剤で投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。上記の要素をすべて考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されることができる。
【0144】
本発明の薬学的組成物は、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または２つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。本発明において使用される用語「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。前記担体は、組成物を生体内伝達に適したものであれば特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して利用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような主利用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または精製で製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を利用して各疾患によって、または成分によって、好ましく製剤化することができる。
【0145】
一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される一つ以上の剤形であってよい。
【0146】
本発明の組成物はまた生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または２つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物を生体内伝達にてき適したものであれば特別に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して利用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような主利用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または精製で製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法でまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を利用して各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。
【0147】
本発明の組成物にさらに同一または類似する機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【0148】
本発明の薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、テンプン、ゼラチン化テンプン、非晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、前糊化テンプン、トウモロコシテンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、テンプングリコール酸ナトリウム、カルナバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが使用され得る。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部～９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0149】
本発明の組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、０．０００１～１０ｍｇ／ｍlであり、好ましくは０．０００１～５ｍｇ／ｍlであり、一日一回～数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【0150】
本発明の組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常的に使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが一緒に含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。
【0151】
一側面において、本発明は、ＣｔＢＰｓのオリゴマー化誘導に使用するための、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物または化学式IIIの化合物の用途に関する。
【0152】
一側面において、本発明は、直接トランス分化誘導に使用するための、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物または化学式IIIの化合物の用途に関する。
【0153】
一側面において、本発明は、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞の神経損傷疾患の予防または治療用途に関する。
【0154】
一側面において、本発明は、化学式Iの化合物、化学式IIの化合物および化学式IIIの化合物からなる群より選択されるいずれか一つ以上の化合物を処理した幹細胞を神経損傷疾患を有する個体に移植するステップを含む、神経損傷疾患の治療方法に関する。
【0155】
下記の実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであるだけであって、これにより本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【0156】
実施例１．本発明の化合物のＣＴＢＰ１オリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）調節
１－１．ＤＡＲＴ分析を通じたＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３結合タンパク質確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）で本発明の化合物であるＹＪ１０１（化学式I）、ＹＪ１０２（化学式II）およびＹＪ１０３（化学式III）と結合するタンパク質を確認するために、ＤＡＲＴ分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣ（Ｋａｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）を１００ｍＭ培養ディッシュに分注し、１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．１６００００４４）が含まれたＫＳＢ－３培地（Ｃａｔ．Ｋ３９０１、Ｋａｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）で培養した後、これを収集してＰＢＳで洗浄した。その次に、ＩＰ５０破砕バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮＰ４０］を入れて超音波破砕し、４℃で１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液に１／１０体積の１０Ｘ ＴＮＣ ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１００ｍＭ ＣａＣｌ２］を添加し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法でタンパク質濃度を測定した。その次に、９μlの細胞破砕物（ｌｙｓａｔｅ）と１μlのＹＪ１０１（２０または４０μＭ）、ＹＪ１０２（２０または３０μＭ）またはＹＪ１０３（２０または４０μＭ）をマイクロセントリフューズチューブに入れて混合し、室温で１時間の間インキュベーションした。対照群は１μlのＤＭＳＯを処理した。インキュベーションが終わったマイクロセントリフューズチューブに１×ＴＮＣバッファーを利用して１ｍｇ／ｍｌで希釈したプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）（Ｃａｔ．１０ １６５ ９２１ ００１、Ｒｏｃｈｅ）１μl（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、１／５体積の５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇを遂行した。また、ＵＣＢ－ＭＳＣを６０ｍＭ培養ディッシュに４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで分注し、２４時間後、４ｕｇのＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ１またはＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ２ ＤＮＡを４μlのｊｅｔＰＲＩＭＥを使用してトランスフェクションした。４８時間後に細胞を収集して前記と同じ方法でタンパク質を抽出および定量した。ＦＬＡＧで標識されたＣｔＢＰ１の細胞破砕物とＹ１０２でＤＡＲＴＳ分析を遂行し、ｆｌａｇ抗体（Ｃａｔ．Ｆ３１６５、Ｓｉｇｍａ）でウェスタンブロット分析を遂行した。
１－１．ＤＡＲＴ分析を通じたＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３結合タンパク質確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）で本発明の化合物であるＹＪ１０１（化学式I）、ＹＪ１０２（化学式II）およびＹＪ１０３（化学式III）と結合するタンパク質を確認するために、ＤＡＲＴ分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣ（Ｋａｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）を１００ｍＭ培養ディッシュに分注し、１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．１６００００４４）が含まれたＫＳＢ－３培地（Ｃａｔ．Ｋ３９０１、Ｋａｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）で培養した後、これを収集してＰＢＳで洗浄した。その次に、ＩＰ５０破砕バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＮＰ４０］を入れて超音波破砕し、４℃で１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液に１／１０体積の１０Ｘ ＴＮＣ ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１００ｍＭ ＣａＣｌ２］を添加し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法でタンパク質濃度を測定した。その次に、９μlの細胞破砕物（ｌｙｓａｔｅ）と１μlのＹＪ１０１（２０または４０μＭ）、ＹＪ１０２（２０または３０μＭ）またはＹＪ１０３（２０または４０μＭ）をマイクロセントリフューズチューブに入れて混合し、室温で１時間の間インキュベーションした。対照群は１μlのＤＭＳＯを処理した。インキュベーションが終わったマイクロセントリフューズチューブに１×ＴＮＣバッファーを利用して１ｍｇ／ｍｌで希釈したプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）（Ｃａｔ．１０ １６５ ９２１ ００１、Ｒｏｃｈｅ）１μl（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、１／５体積の５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇを遂行した。また、ＵＣＢ－ＭＳＣを６０ｍＭ培養ディッシュに４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで分注し、２４時間後、４ｕｇのＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ１またはＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ２ ＤＮＡを４μlのｊｅｔＰＲＩＭＥを使用してトランスフェクションした。４８時間後に細胞を収集して前記と同じ方法でタンパク質を抽出および定量した。ＦＬＡＧで標識されたＣｔＢＰ１の細胞破砕物とＹ１０２でＤＡＲＴＳ分析を遂行し、ｆｌａｇ抗体（Ｃａｔ．Ｆ３１６５、Ｓｉｇｍａ）でウェスタンブロット分析を遂行した。
【0157】
その結果、ＤＡＲＴＳ分析後、ＹＪ１０２によって保護されたバンド（＊）を確認し、ＣｔＢＰ１（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）で同定された（図１Ａ）。ＹＪ１０２がＣｔＢＰ１を保護してプロナーゼによって分解されず（図１Ｂ）、過発現されたＣｔＢＰ１がＹＪ１０２によって保護されてプロナーゼによって分解されておらず（図１Ｃ）、過発現されたＣｔＢＰ１（ｆｌａｇ－ＣｔＢＰ１）がＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によって保護されてプロナーゼによって分解されないことが示された（図１Ｄ）。また、ＹＪ１０２がＣｔＢＰ２も保護してプロナーゼによって分解されないことが示され（図１Ｅ）、過発現されたＣｔＢＰ２もＹＪ１０２によって保護されてプロナーゼによって分解されないことを確認した（図１Ｆ）。
【0158】
これを通じて、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２、ＹＪ１０３のいずれもＣｔＢＰ１と結合し、ＹＪ１０２がヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣｔＢＰ１およびＣｔＢＰ２に結合することを確認した。
【0159】
１－２．ＹＪ１０２のＣＴＢＰ１オリゴマー化調節確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化の調節に対するＹＪ１０２の効果を確認するために、免疫沈澱法分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを６０ｍＭ培養ディッシュに４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで分注し、翌日、ＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ１、ＨＡ－ＣｔＢＰ１、ＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ２およびＨＡ－ＣｔＢＰ１を４μl ｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して細胞にトランスフェクションした。その次に、ＹＪ１０２（ｓｔｏｃｋ ３０ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ）およびＭＴＯＢ（ｓｔｏｃｋ ３００ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ）を細胞にそれぞれ２０ｕＭおよび３００ｕＭでそれぞれ処理した（表１）。トランスフェクション４８時間後、前記実施例１－１と同じ方法でタンパク質を抽出した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアガローススラリー（ａｇａｒｏｓｅ ｓｌｕｒｒｙ）をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの１％ ＢＳＡでブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳで希釈した１μｇの抗－ＨＡ抗体を添加して４℃で２時間の間インキュベーションした。その次に、３，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液を除去し、ＩＰ１５０バッファーで２回洗浄し、前記から抽出したタンパク質１μｇを添加して４℃で終夜インキュベーションした。インキュベーション後、３，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで希釈した１ｍｇ／ｍｌのＨＡペプチド５０ｕｌを添加し、室温で１０分間インキュベーションした。３，０００×ｇで２分間遠心分離した後、上澄み液を新しいマイクロセントリフューズチューブに移して１０ｕｌの５Ｘサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）を添加した後、１００℃で５分間加熱してＦＬＡＧ抗体またはＨＡ抗体でウェスタンブロット分析を遂行した。
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣｔＢＰｓ（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のオリゴマー化の調節に対するＹＪ１０２の効果を確認するために、免疫沈澱法分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを６０ｍＭ培養ディッシュに４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで分注し、翌日、ＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ１、ＨＡ－ＣｔＢＰ１、ＦＬＡＧ－ＣｔＢＰ２およびＨＡ－ＣｔＢＰ１を４μl ｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して細胞にトランスフェクションした。その次に、ＹＪ１０２（ｓｔｏｃｋ ３０ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ）およびＭＴＯＢ（ｓｔｏｃｋ ３００ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ）を細胞にそれぞれ２０ｕＭおよび３００ｕＭでそれぞれ処理した（表１）。トランスフェクション４８時間後、前記実施例１－１と同じ方法でタンパク質を抽出した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアガローススラリー（ａｇａｒｏｓｅ ｓｌｕｒｒｙ）をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの１％ ＢＳＡでブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳで希釈した１μｇの抗－ＨＡ抗体を添加して４℃で２時間の間インキュベーションした。その次に、３，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液を除去し、ＩＰ１５０バッファーで２回洗浄し、前記から抽出したタンパク質１μｇを添加して４℃で終夜インキュベーションした。インキュベーション後、３，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで希釈した１ｍｇ／ｍｌのＨＡペプチド５０ｕｌを添加し、室温で１０分間インキュベーションした。３，０００×ｇで２分間遠心分離した後、上澄み液を新しいマイクロセントリフューズチューブに移して１０ｕｌの５Ｘサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）を添加した後、１００℃で５分間加熱してＦＬＡＧ抗体またはＨＡ抗体でウェスタンブロット分析を遂行した。
【0160】
【表1】
【0161】
その結果、ＹＪ１０２がＣｔＢＰ１のオリゴマー化を誘導することが示され、このようなオリゴマー化がＭＴＯＢによって抑制されることが示された（図２）。一方、ＣｔＢＰ１－ＣｔＢＰ２ヘテロマー化（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）にはＹＪ１０２が影響を及ぼさないことが示された。ＭＴＯＢは、ＣｔＢＰが有した脱水素化酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｅａｓｅ）の基質で高濃度でＣｔＢＰの転写活性を抑制する阻害剤として作用し、オリゴマー化を抑制すると知られている。
【0162】
１－３．ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３とＣｔＢＰ１の相互作用部位確認
本発明の化合物ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３がＣｔＢＰ１と相互作用する部位を確認するために分子ドッキングを遂行した。具体的に、タンパク質－リガンドドッキングはＧｌｉｄｅ（Ｇｒｉｄ ｂａｓｅｄ ＬＩｇａｎｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）ｄｏｃｋｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ｕｉｔｅｓ ｒｏｇｒａｍ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＣ、Ｙ、ＳＡ）を使用して実施し、ＣｔＢＰ１タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：６ＣＤＦ）およびＹＪ１０２の三次元構造はＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ｓｉｔｅｓを使用して製作した。また、ＣｔＢＰ１に対する受容体グリッドは結合（活性）部位残基を特定して生成し、ＳｉｔｅＭａｐで確認した。受容体グリッド生成後、Ｇｌｉｄｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用してリガンドをＣｔＢＰ１にドッキングさせ、ドッキングされた配座異性体をＧｌｉｄｅ（Ｇ）Ｓｃｏｒｅを使用して評価した。Ｇ Ｓｃｏｒｅは、下記数１で計算した。
本発明の化合物ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３がＣｔＢＰ１と相互作用する部位を確認するために分子ドッキングを遂行した。具体的に、タンパク質－リガンドドッキングはＧｌｉｄｅ（Ｇｒｉｄ ｂａｓｅｄ ＬＩｇａｎｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）ｄｏｃｋｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ｕｉｔｅｓ ｒｏｇｒａｍ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＣ、Ｙ、ＳＡ）を使用して実施し、ＣｔＢＰ１タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：６ＣＤＦ）およびＹＪ１０２の三次元構造はＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ｓｉｔｅｓを使用して製作した。また、ＣｔＢＰ１に対する受容体グリッドは結合（活性）部位残基を特定して生成し、ＳｉｔｅＭａｐで確認した。受容体グリッド生成後、Ｇｌｉｄｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用してリガンドをＣｔＢＰ１にドッキングさせ、ドッキングされた配座異性体をＧｌｉｄｅ（Ｇ）Ｓｃｏｒｅを使用して評価した。Ｇ Ｓｃｏｒｅは、下記数１で計算した。
【0163】
【数1】
【0164】
その結果、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３のいずれもＣｔＢＰ１のＮＡＤ（Ｈ）結合ドメインと相互作用することが示され、ΔＧ値は、ＹＪ１０１は－４．９８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、ＹＪ１０２は－５．４５８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、およびＹＪ１０３は－３．７６７ｋｃａｌ／ｍｏｌで示された（図３Ａ）。また、ＹＪ１０１とＣＴＢＰ１の相互作用にはＣＴＢＰ１のＳｅｒ１００が重要であり、ＹＪ１０２とＣｔＢＰ１の相互作用にはＣＴＢＰ１のＳｅｒ１００およびＡｒｇ２６６が重要であるものと予測され、ＹＪ１０３とＣＴＢＰ１の相互作用にはＣＴＢＰ１のＰｈｅ１０２、Ａｒｇ１８４およびＨｉｓ２３６が重要に作用するものと予測された（図３Ｂ）。
【0165】
１－４．ＣＴＢＰ－ＹＪ１０２の標的遺伝子確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣｔＢＰ１－ＹＪ１０２の標的遺伝子を確認するために、クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）分析を遂行した。具体的に、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに２×１０６個分注し、翌日、１０ｕｌのＹＪ１０２（３０ｍＭ）またはＤＭＳＯ（対照群）を処理して２日間培養した。交差－結合およびＤＮＡシェアリングのために、ＵＣＢ－ＭＳＣが培養された培養ディッシュに１％になるようにホルムアルデヒドを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして固定した。培養培地を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含有したＰＢＳで２回洗浄して細胞を収集した。３０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、プロテアーゼ阻害剤が添加されたＳＤＳ破砕バッファーを添加して氷上で１０分間インキュベーションし、超音波で細胞破砕した。４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、１／１０体積のＣｈＩＰ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。その次に、ＤＮＡを精製し、アガロースゲル電気泳動をしてＤＮＡが２００～１０００ｂｐでシェアリングされたことを確認した。また、クロマチン免疫沈降のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧアガローススラリーをＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの１％ＢＳＡでブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄し、超音波で破砕した細胞破砕物および一次抗体として抗－ＣｔＢＰ１抗体（Ｃａｔ．０７－３０６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗－ＬＳＤ１抗体（Ｃａｔ．Ａ１１５６、Ａｂｃｌｏｎａｌ）およびＮｏｒｍａｌ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｃａｔ．１２－３７０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（対照群）をそれぞれ１ｕｇ添加して４℃で終夜ローテーターを利用してインキュベーションした。
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣｔＢＰ１－ＹＪ１０２の標的遺伝子を確認するために、クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）分析を遂行した。具体的に、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに２×１０６個分注し、翌日、１０ｕｌのＹＪ１０２（３０ｍＭ）またはＤＭＳＯ（対照群）を処理して２日間培養した。交差－結合およびＤＮＡシェアリングのために、ＵＣＢ－ＭＳＣが培養された培養ディッシュに１％になるようにホルムアルデヒドを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして固定した。培養培地を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含有したＰＢＳで２回洗浄して細胞を収集した。３０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、プロテアーゼ阻害剤が添加されたＳＤＳ破砕バッファーを添加して氷上で１０分間インキュベーションし、超音波で細胞破砕した。４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、１／１０体積のＣｈＩＰ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。その次に、ＤＮＡを精製し、アガロースゲル電気泳動をしてＤＮＡが２００～１０００ｂｐでシェアリングされたことを確認した。また、クロマチン免疫沈降のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧアガローススラリーをＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの１％ＢＳＡでブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄し、超音波で破砕した細胞破砕物および一次抗体として抗－ＣｔＢＰ１抗体（Ｃａｔ．０７－３０６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗－ＬＳＤ１抗体（Ｃａｔ．Ａ１１５６、Ａｂｃｌｏｎａｌ）およびＮｏｒｍａｌ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｃａｔ．１２－３７０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（対照群）をそれぞれ１ｕｇ添加して４℃で終夜ローテーターを利用してインキュベーションした。
【0166】
翌日、遠心分離して上澄み液を除去した後、ＤＮＡ－抗体－アガロースビーズをＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ；およびＬｉＣｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒの順で１回洗浄し、１Ｘ ＴＥで２回洗浄した。前記ＤＮＡ－抗体－アガロースビーズに２５０μlの溶出バッファー（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３）を添加し、室温で１５分間ローテーターを利用してインキュベーションした後、遠心分離して上澄み液を新しいマイクロセントリフューズチューブに移した。前記の溶出過程を１回さらに繰り返して溶出物を混合した。溶出物に２０μlの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、６５℃で４時間の間加熱した後、１０μlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２０μlの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）および２μlのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加して４５℃で１時間の間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を実施し、ＤＮＡペレットをＤＷで再懸濁した後、下記表２のプライマーを利用してリアルタイム定量ＰＣＲを遂行した。
【0167】
【表2】
【0168】
その結果、ＹＪ１０２によってＨＥＳ１遺伝子プロモーターに結合するＣｔＢＰ１が増加してＨＥＳ１の発現が減少し（図４Ａ）、ＹＪ１０２によってＣｔＢＰ１－ＬＳＤ１コンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ）がＳｏｘ２遺伝子プロモーターに結合してＳｏｘ２の発現を増加させることが示された（図４Ｂ）。また、ＹＪ１０２がＯＣＴ４遺伝子プロモーターに結合するＣｔＢＰ１－ＬＳＤ１コンプレックスの量を増加させてＯＣＴ４の発現を誘導し（図４Ｃ）、ＹＪ１０２がＨＥＳ１遺伝子プロモーターに結合するＣｔＢＰ１を増加させ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４遺伝子プロモーターに結合するＣｔＢＰ１－ＬＳＤ１コンプレックスを増加させることが示された（図４Ｄ）。
【0169】
実施例２．本発明の化合物によるｃｉＮＳＣ５への直接トランス分化
２－１．ＹＪ１０２によるＵＣＢ－ＭＳＣのｃｉＮＳＣ５への分化確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＹＪ１０２によるＣｔＢＰ１－媒介ｃｉＮＳＣ５分化有無を確認するために、ＮＳＣ９５３９７またはＭＴＯＢ（４－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－２－ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ）処理によるＣＴＢＰ１機序を免疫化学分析法で分析した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラス（ｃｉｒｃｕｌａｒ）が入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。分注翌日、３０ｕＭのＹＪ１０２、１０ｕＭ ＮＳＣ９５３９７（Ｃａｔ．９３７１８－８３－３、Ｍｅｒｃｋ）または３００ｕＭのＭＴＯＢ（Ｃａｔ．Ｋ６０００、Ｍｅｒｃｋ）を単独または組み合わせて処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３（Ｃａｔ．１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
２－１．ＹＪ１０２によるＵＣＢ－ＭＳＣのｃｉＮＳＣ５への分化確認
ヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＹＪ１０２によるＣｔＢＰ１－媒介ｃｉＮＳＣ５分化有無を確認するために、ＮＳＣ９５３９７またはＭＴＯＢ（４－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－２－ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ）処理によるＣＴＢＰ１機序を免疫化学分析法で分析した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラス（ｃｉｒｃｕｌａｒ）が入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。分注翌日、３０ｕＭのＹＪ１０２、１０ｕＭ ＮＳＣ９５３９７（Ｃａｔ．９３７１８－８３－３、Ｍｅｒｃｋ）または３００ｕＭのＭＴＯＢ（Ｃａｔ．Ｋ６０００、Ｍｅｒｃｋ）を単独または組み合わせて処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３（Ｃａｔ．１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【0170】
その結果、ＹＪ１０２によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたＹＪ１０２－処理ｃｉＮＳＣ５におけるＴｕｊ１発現が、ＰｘＤＬＳモチーフを有するタンパク質とＣｔＢＰの結合を阻害するＮＳＣ９５３９７によって減少することが示され（図５Ａ）、ＣｔＢＰの転写活性を抑制するＭＴＯＢによってＴｕｊ１の発現が減少することが示された（図５Ｂ）。
【0171】
これを通じて、ＹＪ１０２がＣｔＢＰ１調節を通じてＵＣＢ－ＭＳＣを神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５に分化させることを確認した。
【0172】
２－２．ＹＪ１０１、ＹＪ１０２またはＹＪ１０３によるＵＣＢ－ＭＳＣのｃｉＮＳＣ５への直接トランス分化確認
本発明の化合物であるＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＵＣＢ－ＭＳＣがＴｕｊ１－陽性神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５に直接トランス分化されるかを確認するために、免疫化学分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラスが入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞にそれぞれ３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／５００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ＦＩＴＣを処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
本発明の化合物であるＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＵＣＢ－ＭＳＣがＴｕｊ１－陽性神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５に直接トランス分化されるかを確認するために、免疫化学分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラスが入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞にそれぞれ３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／５００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ＦＩＴＣを処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【0173】
その結果、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でＴｕｊ１の発現が増加したことが示され（図６）、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３のいずれもＵＣＢ－ＭＳＣからｃｉＮＳＣ５に直接トランス分化を誘導することを確認した。
【0174】
２－３．由来が異なる間葉系幹細胞のＹＪ１０１、ＹＪ１０２またはＹＪ１０３による直接トランス分化確認
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２またはＹＪ１０３を５日間ヒトＵＣＢ－ＭＳＣに処理したとき、神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５に直接トランス分化される現象の由来が異なるＭＳＣでも類似に発生するかを確認するために、ヒトＡＤ－ＭＳＣ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ヒトＢＭ－ＭＳＣ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＡＴＣＣ）およびヒトＵＣＢ－ＭＳＣ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ）のＭＳＣを使用して分化されたｃｉＮＳＣ５で神経マーカーの発現を免疫化学分析法で確認した。具体的に、ＡＤ－ＭＳＣ（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｈｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）はＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ 培地で、ＢＭ－ＭＳＣ（ＡＴＣＣ、Ｐａｓｓａｇｅ ＃ ６）はＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ａｄｉｐｏｓｅ、Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣ（Ｃａｔ．ＰＣＳ－５００－０３０、ＡＴＣＣ）培地で、およびＵＣＢ－ＭＳＣ（Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）はＣｅｌｌＣｏｒ ＣＤ ＭＳＣ（Ｃａｔ．ＹＳＰ００１、Ｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）培地で培養した後、１８ｍｍカバーグラス（ｃｉｒｃｕｌａｒ）が入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞にそれぞれ１０、２０または３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理ＵＣＢ－ＭＳＣ）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄してＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２またはＹＪ１０３を５日間ヒトＵＣＢ－ＭＳＣに処理したとき、神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５に直接トランス分化される現象の由来が異なるＭＳＣでも類似に発生するかを確認するために、ヒトＡＤ－ＭＳＣ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ヒトＢＭ－ＭＳＣ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＡＴＣＣ）およびヒトＵＣＢ－ＭＳＣ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ）のＭＳＣを使用して分化されたｃｉＮＳＣ５で神経マーカーの発現を免疫化学分析法で確認した。具体的に、ＡＤ－ＭＳＣ（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｈｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）はＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ 培地で、ＢＭ－ＭＳＣ（ＡＴＣＣ、Ｐａｓｓａｇｅ ＃ ６）はＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ａｄｉｐｏｓｅ、Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣ（Ｃａｔ．ＰＣＳ－５００－０３０、ＡＴＣＣ）培地で、およびＵＣＢ－ＭＳＣ（Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ、Ｐａｓｓａｇｅ＃６）はＣｅｌｌＣｏｒ ＣＤ ＭＳＣ（Ｃａｔ．ＹＳＰ００１、Ｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）培地で培養した後、１８ｍｍカバーグラス（ｃｉｒｃｕｌａｒ）が入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞にそれぞれ１０、２０または３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理ＵＣＢ－ＭＳＣ）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体（Ｃａｔ．８０１２０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄してＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【0175】
その結果、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＡＤ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でＴｕｊ１の発現が増加したことが示され（図７Ａ）、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＢＭ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でもＴｕｊ１の発現が増加することが示され（図７Ｂ）、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５でもＴｕｊ１の発現が増加したことが示された（図７Ｃ）。
【0176】
２－４．化合物の細胞毒性確認
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３の細胞毒性をヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｇ８０９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用して確認した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを９６ウェルプレートの各ウェルに１００μl（６，０００ ｃｅｌｌｓ）ずつ分注し、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、前記細胞に１０、２０または４０ｕＭの濃度でそれぞれ処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で３日または５日間培養した。化合物プレートは９６ウェルプレートで４０μＭから系列希釈して準備した。最も高い投与量は４、８および１２列にプレイティングし、ＤＭＳＯ（賦形剤対照）は１、５および９列にプレイティングした（表３）。化合物プレートをシェーカーで１分間混合し、ＵＣＢ－ＭＳＣが分注された前記９６ウェルプレートの培地を除去した後、１００μlの化合物溶液を処理した後、３７℃で３日および５日間培養した。その次に、Ｐｌａｃｅ Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ ＢｕｆｆｅｒをＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７基質と混合して製造したＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７試薬１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート蓋をした後、、３００～５００ｒｐｍで３０秒間振とうして混合した。その次に、室温で３０分間インキュベーションし、ｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｉｎｇ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光を測定した後、下記数２で計算してフローティングした。
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３の細胞毒性をヒトＵＣＢ－ＭＳＣでＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｇ８０９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用して確認した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを９６ウェルプレートの各ウェルに１００μl（６，０００ ｃｅｌｌｓ）ずつ分注し、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、前記細胞に１０、２０または４０ｕＭの濃度でそれぞれ処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で３日または５日間培養した。化合物プレートは９６ウェルプレートで４０μＭから系列希釈して準備した。最も高い投与量は４、８および１２列にプレイティングし、ＤＭＳＯ（賦形剤対照）は１、５および９列にプレイティングした（表３）。化合物プレートをシェーカーで１分間混合し、ＵＣＢ－ＭＳＣが分注された前記９６ウェルプレートの培地を除去した後、１００μlの化合物溶液を処理した後、３７℃で３日および５日間培養した。その次に、Ｐｌａｃｅ Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ ＢｕｆｆｅｒをＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７基質と混合して製造したＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７試薬１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート蓋をした後、、３００～５００ｒｐｍで３０秒間振とうして混合した。その次に、室温で３０分間インキュベーションし、ｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｉｎｇ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光を測定した後、下記数２で計算してフローティングした。
【0177】
【表3】
【0178】
【数2】
【0179】
その結果、本発明の化合物ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３はいずれもＵＣＢ－ＭＳＣの細胞アポトーシスを誘導しないことが示された（図８）。
【0180】
２－５．化合物がＭＳＣ増殖に及ぼす影響確認
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３がＭＳＣの増殖に及ぼす影響を確認するために、ＵＣＢ－ＭＳＣを９６ウェルプレートの各ウェルに１００μl（６，０００ ｃｅｌｌｓ）ずつ分注し、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、前記細胞に１０、２０または４０ｕＭの濃度でそれぞれ処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で３日または５日間培養した。化合物プレートは前記実施例２－４と同じ方法で製作し、ＵＣＢ－ＭＳＣが分注された前記９６ウェルプレートの培地を除去した後、１００μlの化合物溶液を処理した後、３７℃で３日および５日間培養した。その次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ＢｕｆｆｅｒをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質と混合して製造したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬１００μlを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート蓋をして室温で３０分間インキュベーションした。その次に、ｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｉｎｇ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光を測定した後、下記数３で計算してフローティングした。
ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３がＭＳＣの増殖に及ぼす影響を確認するために、ＵＣＢ－ＭＳＣを９６ウェルプレートの各ウェルに１００μl（６，０００ ｃｅｌｌｓ）ずつ分注し、ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、前記細胞に１０、２０または４０ｕＭの濃度でそれぞれ処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で３日または５日間培養した。化合物プレートは前記実施例２－４と同じ方法で製作し、ＵＣＢ－ＭＳＣが分注された前記９６ウェルプレートの培地を除去した後、１００μlの化合物溶液を処理した後、３７℃で３日および５日間培養した。その次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ＢｕｆｆｅｒをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質と混合して製造したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬１００μlを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート蓋をして室温で３０分間インキュベーションした。その次に、ｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｉｎｇ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光を測定した後、下記数３で計算してフローティングした。
【0181】
【数3】
【0182】
その結果、本発明の化合物ＹＪ１０１、ＹＪ１０２およびＹＪ１０３はいずれも濃度依存的に細胞増殖を減少させた（図９）。一般的に細胞分化時に細胞増殖が減少する。
【0183】
実施例３．本発明の化合物によって直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の特性
３－１．ｃｉＮＳＣ５の神経マーカー発現分析
前記実施例２の方法でＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）で神経マーカーの発現を免疫化学分析法およびウェスタンブロット分析で確認した。具体的に、免疫化学分析のために、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラスが入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で希釈した１次抗体として抗－Ｔｕｊ１抗体、抗－ＴＢＲ２抗体（Ｃａｔ．Ａｂ２３３４５、ａｂｃａｍ）、抗－ＭＡＳＨ１抗体（Ｃａｔ．Ａｂ７４０６５、ａｂｃａｍ）、抗－ＧＡＰ４３抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１６０５３、ａｂｃａｍ）、抗－ｐ７５抗体（Ｃａｔ．Ｇ３２３Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、抗－ＭＡＰ２抗体（Ｃａｔ．４５４２、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗－ＮＳＥ抗体（Ｃａｔ．ＡＢ９５１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗－ＮｅｕＮ抗体（Ｃａｔ．ＭＡＢ３７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗－Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（Ｃａｔ．１８０２１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８７２３、ａｂｃａｍ）、抗－ＮｅｕｒｏＤ１抗体（Ｃａｔ．Ａｂ２１３７２５、ａｂｃａｍ）、抗－Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８１０２、ａｂｃａｍ）、抗－Ｍｕｓａｓｈｉ １抗体（Ｃａｔ．ＡＢ５９７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および抗－ＧＦＡＰ抗体（Ｃａｔ．Ｇ３８９３、Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ処理して、４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３または抗－ラビットＩｇＧ－ｃｙ３（Ｃａｔ．１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。また、ウェスタンブロット分析のために、培養培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した後、破砕バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍl ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍl ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｖａｎａｄａｔｅおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を入れ、スクレイパーを利用して細胞を集め、４℃で２０分間ｒｏｃｋｉｎｇした後、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を他のｅ－チューブに移し、ＢＣＡ分析キットを利用してタンパク質を定量して同じ量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングして電気泳動を行った。その次に、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅメンブレインにトランスファーし、１次抗体である抗－ＣＤ３２５抗体（Ｃａｔ．１０－０２２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－ｐ７５抗体、抗－ＧＡＰ４３抗体、抗－ＣＤ５４抗体（Ｃａｔ．６７８３６、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗－ＣＤ３０９抗体（Ｃａｔ．ＭＡ５－１５１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－ＣＤ５６抗体（Ｃａｔ．Ａ７９１３、Ａｂｃｌｏｎａｌ）、抗－ＰＳＡ－ＮＣＡＭ抗体（Ｃａｔ．５３２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗－ＣＤ２９抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８３６６６、ａｂｃａｍ）、抗－ＭＡＳＨ１抗体、抗－ＴＢＲ２抗体、抗－ＣＤ４４抗体、抗－ＣＤ７３抗体および抗－ＣＤ１０５抗体それぞれのａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａ ｓｈｅｅｔに出されるプロトコルによってウェスタンブロットを施行した。
３－１．ｃｉＮＳＣ５の神経マーカー発現分析
前記実施例２の方法でＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ５）で神経マーカーの発現を免疫化学分析法およびウェスタンブロット分析で確認した。具体的に、免疫化学分析のために、ＵＣＢ－ＭＳＣを１８ｍｍカバーグラスが入っている１２ウェルプレートに２．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した（ＤＭＳＯ対照群は３．５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）。分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。培養培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で希釈した１次抗体として抗－Ｔｕｊ１抗体、抗－ＴＢＲ２抗体（Ｃａｔ．Ａｂ２３３４５、ａｂｃａｍ）、抗－ＭＡＳＨ１抗体（Ｃａｔ．Ａｂ７４０６５、ａｂｃａｍ）、抗－ＧＡＰ４３抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１６０５３、ａｂｃａｍ）、抗－ｐ７５抗体（Ｃａｔ．Ｇ３２３Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、抗－ＭＡＰ２抗体（Ｃａｔ．４５４２、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗－ＮＳＥ抗体（Ｃａｔ．ＡＢ９５１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗－ＮｅｕＮ抗体（Ｃａｔ．ＭＡＢ３７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗－Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（Ｃａｔ．１８０２１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８７２３、ａｂｃａｍ）、抗－ＮｅｕｒｏＤ１抗体（Ｃａｔ．Ａｂ２１３７２５、ａｂｃａｍ）、抗－Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８１０２、ａｂｃａｍ）、抗－Ｍｕｓａｓｈｉ １抗体（Ｃａｔ．ＡＢ５９７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および抗－ＧＦＡＰ抗体（Ｃａｔ．Ｇ３８９３、Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ処理して、４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３または抗－ラビットＩｇＧ－ｃｙ３（Ｃａｔ．１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。また、ウェスタンブロット分析のために、培養培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した後、破砕バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍl ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍl ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｖａｎａｄａｔｅおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を入れ、スクレイパーを利用して細胞を集め、４℃で２０分間ｒｏｃｋｉｎｇした後、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を他のｅ－チューブに移し、ＢＣＡ分析キットを利用してタンパク質を定量して同じ量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングして電気泳動を行った。その次に、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅメンブレインにトランスファーし、１次抗体である抗－ＣＤ３２５抗体（Ｃａｔ．１０－０２２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－ｐ７５抗体、抗－ＧＡＰ４３抗体、抗－ＣＤ５４抗体（Ｃａｔ．６７８３６、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗－ＣＤ３０９抗体（Ｃａｔ．ＭＡ５－１５１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗－ＣＤ５６抗体（Ｃａｔ．Ａ７９１３、Ａｂｃｌｏｎａｌ）、抗－ＰＳＡ－ＮＣＡＭ抗体（Ｃａｔ．５３２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗－ＣＤ２９抗体（Ｃａｔ．Ａｂ１８３６６６、ａｂｃａｍ）、抗－ＭＡＳＨ１抗体、抗－ＴＢＲ２抗体、抗－ＣＤ４４抗体、抗－ＣＤ７３抗体および抗－ＣＤ１０５抗体それぞれのａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａ ｓｈｅｅｔに出されるプロトコルによってウェスタンブロットを施行した。
【0184】
免疫分析結果、ＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５は、神経前駆（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）マーカーであるＴｕｊ１、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１、ＧＡＰ－４３およびｐ７５を発現し、成熟した神経マーカー（ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ）であるＭＡＰ２、ＮＳＥおよびＮｅｕＮは発現しないことが示され、神経細胞の初期分化過程に発現されると知られたｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎとＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）を発現せずに、初期神経幹細胞マーカー（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）であるＮｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｓａｓｈｉ １およびＧＦＡＰも発現しないことが示された（図１０）。また、神経前駆細胞マーカータンパク質のウェスタンブロット分析結果、ＭＳＣに比べてｃｉＮＳＣ５でＴｕｊ１タンパク質が６倍以上（約、６～８倍）、ＣＤ３２５（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）タンパク質が７倍以上（約、７～１０倍）、ｐ７５タンパク質が４倍以上（約、４～８倍、ＧＡＰ４３タンパク質が４倍以上（約、４～７倍）、ＣＤ５４タンパク質が２倍以上（約、２～５倍）、ＣＤ３０９タンパク質が３倍以上（約、３～７倍）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）タンパク質が３．５倍以上（約、３．５～６倍）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭタンパク質が４倍以上（約、４～６倍）、ＣＤ２９タンパク質が４．５倍以上（約、４．５～８倍）、ＭＡＳＨ１タンパク質が４倍以上（約、４～８倍）、またはＴＢＲ２タンパク質が３倍以上（約、３～７倍）増加した（図１１および図１３）。一方、ＭＳＣマーカーであるＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のタンパク質発現はＭＳＣに比べてｃｉＮＳＣ５でそれぞれ９０％、５０％および８０％以上減少することが示された（図１２および図１３）。
【0185】
３－２．ｃｉＮＳＣ５の分泌タンパク質分析
前記実施例２の方法でＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の治療効果を成長因子、組織分解および神経分化／再生関連因子の分泌を通じて確認するためにウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、（ＤＭＳＯ対照群は５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）、分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養してＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５の細胞破砕物を修得した。また、ＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５で培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に継代してＹＪ１０２のない新しい培養培地を添加して３７℃で２日、または４および７日間培養した。その次に、各細胞を破砕してウェスタンブロット分析を遂行した。以後、ｃｉＮＳＣ５の細胞破砕物と培養培地でウェスタンブロット分析を遂行した。分析時に使用した抗体情報は表４と表５に表示した。
前記実施例２の方法でＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の治療効果を成長因子、組織分解および神経分化／再生関連因子の分泌を通じて確認するためにウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析を遂行した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、（ＤＭＳＯ対照群は５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）、分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養してＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５の細胞破砕物を修得した。また、ＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５で培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に継代してＹＪ１０２のない新しい培養培地を添加して３７℃で２日、または４および７日間培養した。その次に、各細胞を破砕してウェスタンブロット分析を遂行した。以後、ｃｉＮＳＣ５の細胞破砕物と培養培地でウェスタンブロット分析を遂行した。分析時に使用した抗体情報は表４と表５に表示した。
【0186】
【表4】
【0187】
【表5】
【0188】
その結果、ＹＪ１０２処理によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５の場合、ＭＳＣに比べてｃｉＮＳＣ５で成長因子ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦＡ（ＶＥＧＦ－Ａ）が増加し、組織分解因子ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７およびＴＩＭＰ２が増加することが示され、神経分化（ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および軸索再生（ａｘｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）などに関与するリガンドのうちＳＨＨおよびＮｏｔｃｈ１が増加することが示された（図１４および図１５）。また、ＹＪ１０２処理によってＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５を継代して、ＹＪ１０２のない培地で２日間培養した場合、ＭＳＣに比べてｃｉＮＳＣ５培養培地で増加する成長因子はＰｌＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＶＥＧＦＡ（ＰｌＧＦ：２．５倍、ＮＧＦ：３．８倍、ＢＤＮＦ：２倍およびＶＥＧＦＡ：２．１倍）で示され、サイトカインはＴＮＦＳＦ１２およびＩＬ－１６が増加することが示された（図１６および図１７）。また、組織分解因子はＭＭＰ１およびＭＭＰ２が増加し、ＭＭＰ７およびＴＩＭＰ２が増加することが示され、神経分化、神経生成および軸索再生などに関与するリガンドのうちＳＨＨおよびＮｏｔｃｈ１が増加することが示された（図１６および図１７）。また、ｃｉＮＳＣ５をＹＪ１０２が含まれない培地で４日または７日間追加培養した後、培地内タンパク質をウェストンブロッで確認した結果、図１８および図１９に示されたように成長因子、組織分解および神経分化／再生関連タンパク質の分泌が変化することが示された。併せて、前記ウェスタンブロット分析結果でｃｉＮＳＣ５で増加したことが示された成長因子および組織分解関連因子のうちＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ－２、ＮＧＦ、ＭＭＰ１、ＰｌＧＦおよびＴＮＦＳＦ１２の量をｃｉＮＳＣ５をＹＪ１０２を含まない培地で２日間培養した培地で確認した結果、ｃｉＮＳＣ５培地に分泌したＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ－２、ＮＧＦ、ＭＭＰ１、ＰｌＧＦおよびＴＮＦＳＦ１２の量がＭＳＣ培地で確認された量に比べて顕著に増加したことが示された（図２０および図２１）。
【0189】
３－３．ＲＮＡ－ｓｅｑを利用したｃｉＮＳＣ５で発現される遺伝子分析
ＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の発現遺伝子プロファイルをｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＲＮＡ－ｓｅｑで分析した。具体的に、６０ｍＭ培養ディッシュにヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１×１０５個分注した後（対照群は１．６７×１０４個分注）、ＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解したＹＪ１０２を細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で２、３または５日間培養した。その次に、培養培地を除去してＰＢＳで洗浄し、スクレイパーで細胞を集めてマイクロセントリフューズチューブに移した。遠心分離してＰＢＳを除去し、５００μlのＴｒｉ－ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔを添加してパイペットティングしてよく混合した。１００μlのクロロホルムを添加してチューブを１５秒間ボルテキシングして混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その次に、上部水性相をパイペットを利用して新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、５５０μlのイソプロパノールを添加して混合した。４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した後、１ｍｌの７０％エタノールでペレットを洗浄した。２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を廃棄した。ペレットを空気乾燥した後、５０μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでＲＮＡを溶解させた。１μl ＤＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間インキュベーションした。その次に、同一体積の８Ｍ ＬｉＣｌを添加して氷上に１時間の間置き、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、７０％エタノールで洗浄した後、空気乾燥した。１００μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでペレットを再懸濁し、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを空気乾燥した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してＲＮＡ濃度を定量した。その次に、Ｔｈｅｒａｇｅｎ ＢｉｏでＲＮＡｓｅｑを遂行し、サンプル間の遺伝子の発現程度はＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）で比較した。正確性検証のために、Ｆｉｓｈｅｒ′ｓ ｍｅｔｈｏｄを利用してｐ－ｖａｌｕｅが０．０５未満である遺伝子を基準に有意な遺伝子オントロジー分類を選択し、ＤＭＳＯを処理したＵＣＢ－ＭＳＣと比較して２倍以上増加するか、０．５倍以下に減少した遺伝子を選択して機能分析を遂行した。遺伝子発現プログラムファイルは、発現値によるＲＧＢ（ｒｅｄ、ｇｒｅｅｎ、ｂｌａｃｋ）の３色を持つヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）で示し（図２２）、遺伝子機能データベースであるＲｅａｃｔｏｍｅを利用して遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ）を確認して傾向成分析を遂行した。
ＹＪ１０２を５日間処理して、ヒトＵＣＢ－ＭＳＣから直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の発現遺伝子プロファイルをｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＲＮＡ－ｓｅｑで分析した。具体的に、６０ｍＭ培養ディッシュにヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１×１０５個分注した後（対照群は１．６７×１０４個分注）、ＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解したＹＪ１０２を細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で２、３または５日間培養した。その次に、培養培地を除去してＰＢＳで洗浄し、スクレイパーで細胞を集めてマイクロセントリフューズチューブに移した。遠心分離してＰＢＳを除去し、５００μlのＴｒｉ－ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔを添加してパイペットティングしてよく混合した。１００μlのクロロホルムを添加してチューブを１５秒間ボルテキシングして混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その次に、上部水性相をパイペットを利用して新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、５５０μlのイソプロパノールを添加して混合した。４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した後、１ｍｌの７０％エタノールでペレットを洗浄した。２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を廃棄した。ペレットを空気乾燥した後、５０μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでＲＮＡを溶解させた。１μl ＤＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間インキュベーションした。その次に、同一体積の８Ｍ ＬｉＣｌを添加して氷上に１時間の間置き、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、７０％エタノールで洗浄した後、空気乾燥した。１００μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでペレットを再懸濁し、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを空気乾燥した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してＲＮＡ濃度を定量した。その次に、Ｔｈｅｒａｇｅｎ ＢｉｏでＲＮＡｓｅｑを遂行し、サンプル間の遺伝子の発現程度はＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）で比較した。正確性検証のために、Ｆｉｓｈｅｒ′ｓ ｍｅｔｈｏｄを利用してｐ－ｖａｌｕｅが０．０５未満である遺伝子を基準に有意な遺伝子オントロジー分類を選択し、ＤＭＳＯを処理したＵＣＢ－ＭＳＣと比較して２倍以上増加するか、０．５倍以下に減少した遺伝子を選択して機能分析を遂行した。遺伝子発現プログラムファイルは、発現値によるＲＧＢ（ｒｅｄ、ｇｒｅｅｎ、ｂｌａｃｋ）の３色を持つヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）で示し（図２２）、遺伝子機能データベースであるＲｅａｃｔｏｍｅを利用して遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ）を確認して傾向成分析を遂行した。
【0190】
ＲＮＡ－ｓｅｑ結果、ＹＪ１０２を３日間処理したＵＣＢ－ＭＳＣで細胞分裂関連遺伝子の発現は減少し、神経系関連遺伝子の発現は増加し、これを基盤に５日目に培地で発現が変化する因子のうち神経発生、シナプス、神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）、神経成長因子などに関与した遺伝子を選択して分析した結果、ｃｉＮＳＣ５で神経生成を誘導する遺伝子（転写因子、ｌｉｇａｎｄおよびｒｅｃｅｐｔｏｒ）と神経再生と神経保護のための脳由来神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）分泌に関与する遺伝子の発現が目立つことが示された（図２３および２４）。
【0191】
３－４．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲを利用したｃｉＮＳＣ５で発現される遺伝子分析
前記実施例３－３のＲＮＡ－ｓｅｑ分析結果を基盤に選別した遺伝子の発現をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲで確認してＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５での遺伝子の発現様相を確認した。具体的に、６０ｍＭ培養ディッシュにヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１×１０５個分注した後（対照群は１．６７×１０４個分注）、ＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解したＹＪ１０２を細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。その次に、ＲＮＡを前記実施例と同じ方法で抽出した後に定量した。
前記実施例３－３のＲＮＡ－ｓｅｑ分析結果を基盤に選別した遺伝子の発現をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲで確認してＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５での遺伝子の発現様相を確認した。具体的に、６０ｍＭ培養ディッシュにヒトＵＣＢ－ＭＳＣを１×１０５個分注した後（対照群は１．６７×１０４個分注）、ＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解したＹＪ１０２を細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理）、３７℃で５日間培養した。その次に、ＲＮＡを前記実施例と同じ方法で抽出した後に定量した。
【0192】
その結果、５日間ＹＪ１０２を処理したＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５で神経膠瘢痕分解のための酵素の発現が対照群に比べて顕著に増加したことが示され（図２５）、神経発生に関連した転写因子の発現も対照群に比べて増加したことが示された（図２６）。また、ミエリン化、シナプシス、マトリックス／細胞付着、カルシウムシグナリングのようなニューロンマーカーの発現も大部分対照群に比べて増加したことが示され（図２７）、ニューロンレセプターおよびチャンネルの発現も大部分対照群に比べて増加したことが示された（図２８）。
【0193】
これを通じて、ＹＪ１０２処理が多様な神経発生遺伝子プログラムを誘導し、神経発生およびエクソン再生に関連した分泌分子も誘導することが分かった。また、ＹＪ１０２はｃｉＮＳＣ５で神経膠瘢痕分解を可能にする酵素の発現も増加させ得ることを確認した。
【0194】
３－５．ｃｉＮＳＣ５の継代による細胞特性変化確認
ＹＪ１０２によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５の継代による細胞特性変化有無をＴｕｊ１抗体に対する免疫化学分析法で確認した。具体的に、ＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５をそれぞれ２×１０６個ずつ１００ｍｍ培養ディッシュに分注し、２日ごとに継代を進行して総ｐａｓｓａｇｅ ６回まで培養を進行した後、培養培地を除去してＰＢＳで洗浄し、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
ＹＪ１０２によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５の継代による細胞特性変化有無をＴｕｊ１抗体に対する免疫化学分析法で確認した。具体的に、ＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５をそれぞれ２×１０６個ずつ１００ｍｍ培養ディッシュに分注し、２日ごとに継代を進行して総ｐａｓｓａｇｅ ６回まで培養を進行した後、培養培地を除去してＰＢＳで洗浄し、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で１／５０００希釈した抗－Ｔｕｊ１抗体を処理して４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で１／２０００希釈した抗－マウスＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【0195】
その結果、ｃｉＮＳＣ５を継代してもダブリング時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）が維持されることが示され（図２９）、継代数によるＣＰＤＬ（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）値も維持されることが示された（図３０）。また、ｃｉＮＳＣ５を継代してもＴｕｊ１の発現が維持され（図３１）、ＹＪ１０２によって分化されたｃｉＮＳＣ５で染色体異常がないことが示された（図３２）。
【0196】
これを通じて、ｃｉＮＳＣ５を継代培養しても細胞特性が維持されることが分かった。
【0197】
３－６．ｃｉＮＳＣ５の神経細胞への分化確認
ＹＪ１０２によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５が神経細胞に分化可能であるかを確認し、ｃｉＮＳＣ５の分化安定性を調査するためにＭＤＩ（Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｉｎｓｕｌｉｎ）処理によって脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）が起こるかを確認した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し（ＤＭＳＯ対照群は５かける１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）、分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理ＵＣＢ－ＭＳＣ）、３７℃で５日間培養してＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５を修得した。その次に、ドーパミン性神経細胞または神経細胞に分化させるために、前記ｃｉＮＳＣ５と対照群であるＭＳＣｓをそれぞれ５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍ培養ディッシュに分注し、３日ごとに培地を入れ替って形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）の変化を観察した。また、ｃｉＮＳＣ５が脂肪細胞に分化可能であるかを確認するために、ＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５をそれぞれ５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍ培養ディッシュに分注し、ＭＤＩ（０．５ｍＭ ｏｆ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、１ｕＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅおよび１０ｕｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ）が添加された培地で３日間培養した後、回収した。免疫化学分析のために、培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で希釈した抗－ＴＨ抗体（Ｃａｔ．ｐ４０１０１－１５０、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ）および抗－ＭＡＰ２抗体（Ｃａｔ．４５４２、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をそれぞれ処理し、４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した抗－ラビットＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。また、ＲＮＡを抽出するために、培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、スクレイパーで細胞を集めてマイクロセントリフューズチューブに移した。遠心分離してＰＢＳを除去し、５００μlのＴｒｉ－ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔを添加してパイペットティングしてよく混合した。１００μlのクロロホルムを添加し、チューブを１５秒間ボルテキシングして混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その次に、上部水性相をパイペットを利用して新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、５５０μlのイソプロパノールを添加して混合した。４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した後、１ｍｌの７０％エタノールでペレットを洗浄した。２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を廃棄した。ペレットを空気乾燥した後、５０μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでＲＮＡを溶解させた。１μl ＤＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間インキュベーションした。その次に、同一体積の８Ｍ ＬｉＣｌを添加して氷上に１時間の間置き、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、７０％エタノールで洗浄した後、空気乾燥した。１００μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでペレットを再懸濁し、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを空気乾燥した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してＲＮＡ濃度を定量した。その次に、５００ｎｇのＲＮＡに２ｕｌのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ＤＷで全体体積を１０ｕｌで合わせた。３７℃で１５分間逆転写してｃＤＮＡを合成し、８５℃で５秒間反応させて逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を不活性化させた。合成されたｃＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲで脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）のマーカーであるＣ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの発現を確認した。
ＹＪ１０２によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５が神経細胞に分化可能であるかを確認し、ｃｉＮＳＣ５の分化安定性を調査するためにＭＤＩ（Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｉｎｓｕｌｉｎ）処理によって脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）が起こるかを確認した。具体的に、ＵＣＢ－ＭＳＣを１００ｍｍ培養ディッシュに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し（ＤＭＳＯ対照群は５かける１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注）、分注翌日、ＹＪ１０２をＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解した後、細胞に３０ｕＭの濃度で処理し（対照群はＤＭＳＯ処理ＵＣＢ－ＭＳＣ）、３７℃で５日間培養してＵＣＢ－ＭＳＣから分化されたｃｉＮＳＣ５を修得した。その次に、ドーパミン性神経細胞または神経細胞に分化させるために、前記ｃｉＮＳＣ５と対照群であるＭＳＣｓをそれぞれ５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍ培養ディッシュに分注し、３日ごとに培地を入れ替って形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）の変化を観察した。また、ｃｉＮＳＣ５が脂肪細胞に分化可能であるかを確認するために、ＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５をそれぞれ５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍ培養ディッシュに分注し、ＭＤＩ（０．５ｍＭ ｏｆ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、１ｕＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅおよび１０ｕｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ）が添加された培地で３日間培養した後、回収した。免疫化学分析のために、培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、１０分間室温で４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ－Ｔで１０分間細胞を透過させ、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ＢＳＡおよび５％ヤギ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ）で１時間の間ブロッキングした。その次に、ブロッキング溶液で希釈した抗－ＴＨ抗体（Ｃａｔ．ｐ４０１０１－１５０、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ）および抗－ＭＡＰ２抗体（Ｃａｔ．４５４２、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をそれぞれ処理し、４℃で終夜インキュベーションした。翌日、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した抗－ラビットＩｇＧ－ｃｙ３を処理して、暗条件で１時間の間インキュベーションした。その次に、ＰＢＳ－Ｔで１０分ずつ１０回洗浄し、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。また、ＲＮＡを抽出するために、培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、スクレイパーで細胞を集めてマイクロセントリフューズチューブに移した。遠心分離してＰＢＳを除去し、５００μlのＴｒｉ－ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔを添加してパイペットティングしてよく混合した。１００μlのクロロホルムを添加し、チューブを１５秒間ボルテキシングして混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その次に、上部水性相をパイペットを利用して新しいマイクロセントリフューズチューブに移し、５５０μlのイソプロパノールを添加して混合した。４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した後、１ｍｌの７０％エタノールでペレットを洗浄した。２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を廃棄した。ペレットを空気乾燥した後、５０μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでＲＮＡを溶解させた。１μl ＤＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間インキュベーションした。その次に、同一体積の８Ｍ ＬｉＣｌを添加して氷上に１時間の間置き、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、７０％エタノールで洗浄した後、空気乾燥した。１００μl ＲＮａｓｅ遊離ＤＩＷでペレットを再懸濁し、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを空気乾燥した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してＲＮＡ濃度を定量した。その次に、５００ｎｇのＲＮＡに２ｕｌのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ＤＷで全体体積を１０ｕｌで合わせた。３７℃で１５分間逆転写してｃＤＮＡを合成し、８５℃で５秒間反応させて逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を不活性化させた。合成されたｃＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲで脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）のマーカーであるＣ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの発現を確認した。
【0198】
【0199】
実施例４．本発明の化合物によって直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５のルーゲーリッグ病治療効果確認
４－１．ＡＬＳモデルマウスの寿命増加確認
ルーゲーリッグ病に対するｃｉＮＳＣ５の有効性を確認するために、ＡＬＳモデルマウスを製作し、ＡＬＳモデルマウスにｃｉＮＳＣ５を移植した後、マウスの寿命を確認した。具体的に、トランスジェニックＡＬＳマウス（Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＳＯＤ１ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｌｙ９３→Ａｌａ ｍｕｔａｔｉｏｎ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）を類似したバックグラウンドを持つ雌マウス（Ｂ６／ＳＪＬＦ１）と交配させてＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスモデルを製作した。その子孫は、ＰＣＲ検定を使用して尻尾ＤＮＡの遺伝型を分析した。生後６０日目に、マウスを無作為にグループ化した後、抱水クロラール（ｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅ）（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）で麻酔させた後、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはＹＪ１０２ ５日処理によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）に注入した。対照群には同量の食塩水を大槽に注入した。その次に、各グループの寿命を確認した。
その結果、ＭＳＣ－移植グループおよびｃｉＮＳＣ５－移植グループのいずれも寿命が食塩水処理グループに比べて増加し、特に、ｃｉＮＳＣ５を移植したグループの寿命は食塩水－移植グループに比べて１２日、ＭＳＣ－移植グループに比べて９日さらに延長された（図３５）。
４－１．ＡＬＳモデルマウスの寿命増加確認
ルーゲーリッグ病に対するｃｉＮＳＣ５の有効性を確認するために、ＡＬＳモデルマウスを製作し、ＡＬＳモデルマウスにｃｉＮＳＣ５を移植した後、マウスの寿命を確認した。具体的に、トランスジェニックＡＬＳマウス（Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＳＯＤ１ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｌｙ９３→Ａｌａ ｍｕｔａｔｉｏｎ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）を類似したバックグラウンドを持つ雌マウス（Ｂ６／ＳＪＬＦ１）と交配させてＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスモデルを製作した。その子孫は、ＰＣＲ検定を使用して尻尾ＤＮＡの遺伝型を分析した。生後６０日目に、マウスを無作為にグループ化した後、抱水クロラール（ｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅ）（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）で麻酔させた後、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはＹＪ１０２ ５日処理によってヒトＵＣＢ－ＭＳＣに分化されたｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）に注入した。対照群には同量の食塩水を大槽に注入した。その次に、各グループの寿命を確認した。
その結果、ＭＳＣ－移植グループおよびｃｉＮＳＣ５－移植グループのいずれも寿命が食塩水処理グループに比べて増加し、特に、ｃｉＮＳＣ５を移植したグループの寿命は食塩水－移植グループに比べて１２日、ＭＳＣ－移植グループに比べて９日さらに延長された（図３５）。
【0200】
４－２．ＡＬＳ発病（ｏｎ ｓｅｔ）および運動症状進行遅延確認
前記ＡＬＳモデルマウスにｃｉＮＳＣ５を移植した後、生後７５日目から５日ごとに行動テストを施行してマウスの運動機能を確認した。行動テストは、ロータロッドテスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）、運動スコア（Ｍｏｔｏｒ ｓｃｏｒｅ）、ハンギングワイヤーテスト（Ｈａｎｇｉｎｇ ｗｉｒｅ ｔｅｓｔ）：およびバランスビームテスト（Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅａｍ ｔｅｓｔ）を進行した。マウスの一般運動調整力および強度およびバランスを評価するためのロータロッドテストのために、テスト３日前からマウスをロータロッドデバイス（４－４０ｒｐｍ．１８０ｓｅｃ）で訓練させ、テストの際に各マウスは１８０秒間ロータロッド上で運動し、運動中間にロータロッドからマウスが落ちる時間を記録した。マウス当たり計３回テストを進行し、テスト間１０分以上の休息間隔を置いた。３回の記録に対する平均値を各マウスのスコアで決定した。また、運動スコアはマウスの尻尾を持ち上げたときの後肢の状態を確認して、［４点＝正常；３．５点＝後肢開き欠陥の開始；３点＝非正常的な歩き方；２点＝部分的な後肢麻痺（足を引きずる最初の徴候）；１点＝後肢麻痺および前肢弱化；０点＝後肢と類似した程度の前肢の麻痺］の基準に基づいて０－４のスコアを付けた。また、重力に反して維持される足の神経筋強度を評価するハンギングワイヤーテストを実施するために、各マウスを通常のハウジングケースのワイヤリードに載せてリードを前後に覆した。テストは、計１８０秒間進行され、ワイヤリードに吊り下げられていたマウスが床に落ちる時点までの時間を測定した。マウス当たり計３回テストを進行し、テスト間１０分以上の休息間隔を置いた。３回の記録に対する平均値を各マウスのスコアで決定した。併せて、バランスビームテストのために、マウスを丸い木材ビーム（０．５ｃｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、１００ｃｍ ｌｏｎｇ、および６０ｃｍ ｈｉｇｈ）に載せてバランスを維持する能力を［０点＝マウスがビーム上に３０秒間立っていることができない；１点＝マウスが３０秒間ビーム右上に立っていることができる、２点＝マウスが歩くことはできないがビーム上で左側または右側に回転することができる；３点＝マウスがビーム上で左側または右側に回転することができ一歩以上歩くことができる；４点＝マウスが発病した後肢の５０％以上の足スライドを見せてビームを横切ることができる；５点：マウスが発病した後肢の５０％以下の足スライドを見せてビームを横切ることができる；６点＝マウスが一足以下の足スライドでビームを横切ることができる］の基準に基づいて０～６のスコアを付けた。
前記ＡＬＳモデルマウスにｃｉＮＳＣ５を移植した後、生後７５日目から５日ごとに行動テストを施行してマウスの運動機能を確認した。行動テストは、ロータロッドテスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）、運動スコア（Ｍｏｔｏｒ ｓｃｏｒｅ）、ハンギングワイヤーテスト（Ｈａｎｇｉｎｇ ｗｉｒｅ ｔｅｓｔ）：およびバランスビームテスト（Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅａｍ ｔｅｓｔ）を進行した。マウスの一般運動調整力および強度およびバランスを評価するためのロータロッドテストのために、テスト３日前からマウスをロータロッドデバイス（４－４０ｒｐｍ．１８０ｓｅｃ）で訓練させ、テストの際に各マウスは１８０秒間ロータロッド上で運動し、運動中間にロータロッドからマウスが落ちる時間を記録した。マウス当たり計３回テストを進行し、テスト間１０分以上の休息間隔を置いた。３回の記録に対する平均値を各マウスのスコアで決定した。また、運動スコアはマウスの尻尾を持ち上げたときの後肢の状態を確認して、［４点＝正常；３．５点＝後肢開き欠陥の開始；３点＝非正常的な歩き方；２点＝部分的な後肢麻痺（足を引きずる最初の徴候）；１点＝後肢麻痺および前肢弱化；０点＝後肢と類似した程度の前肢の麻痺］の基準に基づいて０－４のスコアを付けた。また、重力に反して維持される足の神経筋強度を評価するハンギングワイヤーテストを実施するために、各マウスを通常のハウジングケースのワイヤリードに載せてリードを前後に覆した。テストは、計１８０秒間進行され、ワイヤリードに吊り下げられていたマウスが床に落ちる時点までの時間を測定した。マウス当たり計３回テストを進行し、テスト間１０分以上の休息間隔を置いた。３回の記録に対する平均値を各マウスのスコアで決定した。併せて、バランスビームテストのために、マウスを丸い木材ビーム（０．５ｃｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、１００ｃｍ ｌｏｎｇ、および６０ｃｍ ｈｉｇｈ）に載せてバランスを維持する能力を［０点＝マウスがビーム上に３０秒間立っていることができない；１点＝マウスが３０秒間ビーム右上に立っていることができる、２点＝マウスが歩くことはできないがビーム上で左側または右側に回転することができる；３点＝マウスがビーム上で左側または右側に回転することができ一歩以上歩くことができる；４点＝マウスが発病した後肢の５０％以上の足スライドを見せてビームを横切ることができる；５点：マウスが発病した後肢の５０％以下の足スライドを見せてビームを横切ることができる；６点＝マウスが一足以下の足スライドでビームを横切ることができる］の基準に基づいて０～６のスコアを付けた。
【0201】
ロータロッドテスト結果、食塩水処理グループとＭＳＣ－移植グループとの間に有意な差はなかったが、ｃｉＮＳＣ５移植グループでは、食塩水－移植グループおよびＭＳＣ－移植グループの両方に比べて運動能力減少がかなり遅延したことが示された（１２０日間食塩水グループ１２．８±５．８、ＭＳＣグループ２１．８±９．０およびｃｉＮＳＣ５グループ１０７．４±２２．７）（図３６Ａ）。また、運動スコアを確認した結果、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスで運動スコアは９０日から減少し始めて終了点まで持続して減少し、ＭＳＣ－移植マウスは食塩水－処理マウスより多少高いスコアを見せたが、有意な差はなかったのに対し、ｃｉＮＳＣ５－移植マウスグループは１２０日後に運動スコアの減少を見せ、実験期間中の運動スコアは食塩水グループおよびＭＳＣグループの両方に比べて有意に高く示された（１２０日間食塩水グループ２．１±０．４、ＭＳＣグループ２．３±０．４およびｃｉＮＳＣ５グループ３．７±０．２）（図３６Ｂ）。また、ハンギングワイヤーテスト結果、食塩水－移植グループおよびＭＳＣ－移植グループマウスは８０日目からワイヤから落ち始めたが、ｃｉＮＳＣ５を移植したマウスは９５日以後から落ちるマウスが一部観察されるほど発病時期が遅延した。また、ハンギングワイヤーテストが進行された全過程でｃｉＮＳＣ５移植グループが他の２つのグループに比べて有意に高いスコアを示した（１２０日間食塩水グループ６．４±２．８、ＭＳＣグループ２２．９±１５．１４およびｃｉＮＳＣ５グループ１１３．１±１８．２）（図３６Ｃ）。併せて、バランスビームテスト結果、ｃｉＮＳＣ５移植グループは生後８５日から実験終了時点まで他の２つのグループに比べて有意にさらに高いスコアを示した（１２０日間食塩水グループ１．５±０．３２、ＭＳＣグループ２．３±０．５およびｃｉＮＳＣ５グループ４．０±０．５）（図３６Ｄ）。
【0202】
４－３．脊髄内運動神経細胞消失抑制効果確認
ｃｉＮＳＣ５移植がＡＬＳの臨床症状を伴う腰椎脊髄神経損失を緩和させるかを確認するために、移植１１０日目にＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色を遂行し、腰椎脊髄での運動神経細胞の数を計数した。
ｃｉＮＳＣ５移植がＡＬＳの臨床症状を伴う腰椎脊髄神経損失を緩和させるかを確認するために、移植１１０日目にＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色を遂行し、腰椎脊髄での運動神経細胞の数を計数した。
【0203】
その結果、野生型マウスの平均７７１１．３±１９３．８個の運動神経細胞に比べて食塩水－処理ＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは運動神経細胞の数が顕著に減少し（３８７５．１±４６５）、ＭＳＣ－移植マウスは食塩水－処理マウスに比べて運動神経細胞の数が少し増加したが、有意な差はないことが示された。しかし、ｃｉＮＳＣ５－移植マウスグループにおける運動神経細胞の数は、食塩水－処理またはＭＳＣ－移植グループに比べて顕著に増加したことが示された（図３７）。
【0204】
これを通じて、ｃｉＮＳＣ５はＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスモデルで食塩水－およびＭＳＣ－処理グループの両方に比べて脊髄内運動神経細胞の死滅を有意に抑制し、運動機能の障害が同伴されるルーゲーリッグ病症状の進行を遅延させ、ＡＬＳマウスの寿命を延長させることができることを確認した。
【0205】
実施例５．本発明の化合物によって直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の多発性硬化症治療効果確認
５－１．ＥＡＥマウスの挙動症状改善確認
多発性硬化症（ＭＳ）の正統的なモデルである実験的自己免疫性脳脊髄塩（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）マウスモデルでｃｉＮＳＣ５有効性を確認した。具体的に、雌成体Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウス（８～９週齢；１９－２１ｇ）をＮａｒａｂｉｏｔｅｃ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で購入し、４ｍｇ／ｍｌの滅菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｄｉｆｃｏ）を含有したＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２００ｎｇ ＭＯＧ３５－５５ペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を皮下免疫化してＥＡＥを誘導した。０および２日に、免疫反応を刺激する主要役割をする２００ｎｇ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注入した（図３８Ａ）。ＭＯＧ注入後８日目に、マウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）で麻酔させ、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）に注入した。対照群には同一時点に同量の食塩水を注入した。以後、ＥＡＥマウスモデルの挙動症状を下記の０～７範囲の標準スコアによって毎日評価した：スコア０＝症状なし；スコア１＝部分的な尻尾垂下；スコア２＝中間程度の後肢弱化（ｗａｄｄｌｉｎｇ ｇａｉｔ）；スコア３＝適当にひどい後肢弱化；スコア４＝両下肢麻痺；スコア５＝中間程度の前肢弱化を有する両下肢麻痺；スコア６＝四肢麻痺、瀕死状態；スコア７＝死。挙動分析結果は、ＡＮＯＶＡ（ｔｉｍｅ ｖｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の繰り返し評価で分析した。
５－１．ＥＡＥマウスの挙動症状改善確認
多発性硬化症（ＭＳ）の正統的なモデルである実験的自己免疫性脳脊髄塩（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）マウスモデルでｃｉＮＳＣ５有効性を確認した。具体的に、雌成体Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウス（８～９週齢；１９－２１ｇ）をＮａｒａｂｉｏｔｅｃ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で購入し、４ｍｇ／ｍｌの滅菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｄｉｆｃｏ）を含有したＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２００ｎｇ ＭＯＧ３５－５５ペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を皮下免疫化してＥＡＥを誘導した。０および２日に、免疫反応を刺激する主要役割をする２００ｎｇ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注入した（図３８Ａ）。ＭＯＧ注入後８日目に、マウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）で麻酔させ、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）に注入した。対照群には同一時点に同量の食塩水を注入した。以後、ＥＡＥマウスモデルの挙動症状を下記の０～７範囲の標準スコアによって毎日評価した：スコア０＝症状なし；スコア１＝部分的な尻尾垂下；スコア２＝中間程度の後肢弱化（ｗａｄｄｌｉｎｇ ｇａｉｔ）；スコア３＝適当にひどい後肢弱化；スコア４＝両下肢麻痺；スコア５＝中間程度の前肢弱化を有する両下肢麻痺；スコア６＝四肢麻痺、瀕死状態；スコア７＝死。挙動分析結果は、ＡＮＯＶＡ（ｔｉｍｅ ｖｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の繰り返し評価で分析した。
【0206】
その結果、塩水－処理対照群のマウスは、ＥＡＥ誘導後８－９日に（開始ステップ）麻痺が進行されていることを立証する尻尾垂下および足麻痺を始めとした典型的な挙動症状を示し始め、１８－２０日に最高点を取り、実験終了時点まで持続した（図３８Ｂ）。一方、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５を移植したグループは、開始ステップでもＥＡＥの挙動症状が有意に緩和され、特に、ｃｉＮＳＣ５移植グループで臨床スコアがＭＳＣ移植グループより有意にさらに低い値を示した（移植後９日に食塩水グループ２．７±０．２、ＭＳＣグループ２．１±０．２およびｃｉＮＳＣ５グループ１．５±０．２）（図３８ＢおよびＤ）。実験期間の間に実験グループの間で体重の有意な差はなかった（図３８Ｃ）。
【0207】
５－２．ＣＮＳ脱髄鞘化抑制効果確認
ＭＯＧ注入後３０日目に、マウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および、引き継き０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。脊髄の腰椎分節を切開して同じ固定液に浸けて６時間の間後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。分節をＯＣＴに入れて凍結切片を作り、横断面切片をｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１６μｍで切断した。分子研究のために、動物をＰＢＳで灌流させ、腰椎脊髄（Ｌ４－Ｌ５）の切片を分離して使用前まで－８０℃で冷凍した。冷凍された切片をＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ１１ｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）およびＣＤ６８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する抗体を利用して免疫組織化学法で分析した。二重標識のために、ＦＩＴＣまたはｃｙ３－接合二次抗体を使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。また、核はＤＡＰＩで標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。免疫染色対照研究は、一次抗体を非－免疫、対照抗体に入れ替え、過量（１０μｇ／ｍｌ）の各抗原で予備吸着して一次抗体を脱落させて実施した。力価以上の蛍光強度をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量して平均化した。力価数値は少なくとも３回のバックグラウンドであり、バックグラウンドは一次抗体脱落対照について定量および平均化された。併せて、ウェスタンブロット分析のために、冷凍された脊髄組織に破砕バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍl ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍl ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｖａｎａｄａｔｅおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を入れて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した。これをｅ－チューブに集めた後、４℃で２０分間ｒｏｃｋｉｎｇし、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上澄み液を他のｅ－チューブに移してＢＣＡ分析キットを利用してタンパク質定量を遂行した後、同一量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングして電気泳動を行った。その次に、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅメンブレインにトランスファーして、それぞれのａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａ ｓｈｅｅｔに出されるｐｒｏｔｏｃｏｌによってウェスタンブロット分析を遂行した。確保したデータは平均±ＳＥＭで示し、グループ間の多重比較はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを実施した。Ｔｕｋｅｙ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎをＰｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓとして使用した。ｐ＜０．０５を統計学的に意味があるものと見なした。すべての統計分析はＳＰＳＳ １５．０（ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して実施した。
ＭＯＧ注入後３０日目に、マウスを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および、引き継き０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。脊髄の腰椎分節を切開して同じ固定液に浸けて６時間の間後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。分節をＯＣＴに入れて凍結切片を作り、横断面切片をｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１６μｍで切断した。分子研究のために、動物をＰＢＳで灌流させ、腰椎脊髄（Ｌ４－Ｌ５）の切片を分離して使用前まで－８０℃で冷凍した。冷凍された切片をＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ１１ｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）およびＣＤ６８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する抗体を利用して免疫組織化学法で分析した。二重標識のために、ＦＩＴＣまたはｃｙ３－接合二次抗体を使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。また、核はＤＡＰＩで標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。免疫染色対照研究は、一次抗体を非－免疫、対照抗体に入れ替え、過量（１０μｇ／ｍｌ）の各抗原で予備吸着して一次抗体を脱落させて実施した。力価以上の蛍光強度をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量して平均化した。力価数値は少なくとも３回のバックグラウンドであり、バックグラウンドは一次抗体脱落対照について定量および平均化された。併せて、ウェスタンブロット分析のために、冷凍された脊髄組織に破砕バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍl ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍl ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｖａｎａｄａｔｅおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を入れて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した。これをｅ－チューブに集めた後、４℃で２０分間ｒｏｃｋｉｎｇし、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上澄み液を他のｅ－チューブに移してＢＣＡ分析キットを利用してタンパク質定量を遂行した後、同一量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングして電気泳動を行った。その次に、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅメンブレインにトランスファーして、それぞれのａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａ ｓｈｅｅｔに出されるｐｒｏｔｏｃｏｌによってウェスタンブロット分析を遂行した。確保したデータは平均±ＳＥＭで示し、グループ間の多重比較はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを実施した。Ｔｕｋｅｙ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎをＰｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓとして使用した。ｐ＜０．０５を統計学的に意味があるものと見なした。すべての統計分析はＳＰＳＳ １５．０（ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して実施した。
【0208】
その結果、ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ染色によって評価される脱髄鞘化は、免疫化後３０日にＥＡＥマウスの脊髄の白質で顕著に増加したが（図３９Ａ、Ｓａｌｉｎｅ）、ｃｉＮＳＣ５－移植したＥＡＥマウスでは脊髄の脱髄鞘化が顕著に減少することが示された（図３８ＡおよびＢ）。また、ｃｉＮＳＣ５－移植したＥＡＥマウスはＭＳＣ－移植したＥＡＥマウスに比べても有意に脱髄鞘化減少効果を示した。ｃｉＮＳＣ５の脱髄鞘化抑制効能を再検証するために、ＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）発現を免疫染色およびウェストンブロッで確認した結果、Ｓｈａｍに比べて食塩水を投与したＥＡＥマウスでＭＢＰの発現が顕著に減少し、ｃｉＮＳＣ５を移植したマウスの脊髄ではＭＢＰの減少が食塩水またはＭＳＣ－移植したマウスに比べて顕著に抑制された（図３９ＣおよびＤ）。ウェスタンブロット結果でも同様にｃｉＮＳＣ５－移植マウスでＭＢＰ発現が他の２つのグループ（食塩水－移植グループまたはＭＳＣ－移植グループ）に比べて顕著に高く示された（図３９ＥおよびＦ）。これを通じて、ＭＳ患者の典型的な病理学的特徴と知られたＣＮＳ脱髄鞘化をｃｉＮＳＣ５が抑制することで、その範囲と程度を緩和させることを確認した。
【0209】
５－３．脊髄白質への単核細胞およびマクロファージ浸透抑制効果確認
ＭＯＧ免疫化後３０日目に、脊髄の小血管周囲の単核細胞の浸透をｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ（Ｃａｔ．Ｃ５０４２、Ｓｉｇｍａ）染色で検出した。また、ＭＯＧ免疫化後３０日目にＣＤ６８－陽性マクロファージを免疫組織化学染色で確認した。
ＭＯＧ免疫化後３０日目に、脊髄の小血管周囲の単核細胞の浸透をｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ（Ｃａｔ．Ｃ５０４２、Ｓｉｇｍａ）染色で検出した。また、ＭＯＧ免疫化後３０日目にＣＤ６８－陽性マクロファージを免疫組織化学染色で確認した。
【0210】
その結果、ＥＡＥマウスは、脊髄の白質周囲に集中的な単核細胞の浸透を示したのに対し（図４０ＡおよびＢ、食塩水）、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５処理グループでは胸椎（Ａ）および腰椎（Ｂ）切片の両方で脊髄白質への単核細胞浸透が減少したことが示され（図４０）、ｃｉＮＳＣ５移植が脊髄白質へのＥＡＥ－誘導単核細胞浸透を緩和させることを確認した。また、Ｄ６８－陽性マクロファージが食塩水処理されたＥＡＥマウスの白質で観察されたのに対し、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５移植グループでは浸透されたマクロファージの数が有意に減少することが示された（図４１）。
【0211】
５－４．小膠細胞および星状細胞の活性化抑制効果確認
脊髄で小膠細胞および星状細胞のような膠細胞の活性化に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、免疫化後３０日目にＣＤ１１ｂ（小膠細胞マーカー）またはＧＦＡＰ（星状膠細胞マーカー）抗体に対する免疫組織化学分析を遂行した。
脊髄で小膠細胞および星状細胞のような膠細胞の活性化に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、免疫化後３０日目にＣＤ１１ｂ（小膠細胞マーカー）またはＧＦＡＰ（星状膠細胞マーカー）抗体に対する免疫組織化学分析を遂行した。
【0212】
その結果、食塩水を処理したＥＡＥマウスの脊髄で非常に強いＧＦＡＰ免疫反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が示され、脊髄内星状膠細胞の活性化が起きたことを確認した（図４２）。一方、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５を移植したＥＡＥマウスでは脊髄内星状膠細胞の活性化が顕著に減少し、ＧＦＡＰ蛍光強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を定量化した結果、ＭＳＣ－移植グループおよびｃｉＮＳＣ５－移植グループのいずれも有意にＧＦＡＰ強度が減少した。特に、ｃｉＮＳＣ５はＭＳＣに比べて顕著なＧＦＡＰ発現抑制効果を示した（図４２Ｄ）。これは、ＥＡＥマウスでｃｉＮＳＣ５が星状膠細胞活性化を抑制させることを示す。また、ＣＤ１１ｂで免疫染色を施行した結果、ＥＡＥマウスの脊髄内小膠細胞は細胞質が肥大になり、枝が短くなる典型的な活性化様相を見せるのに対し（図４３Ａ）、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５を移植したＥＡＥマウスでは小膠細胞の活性化様相が顕著に減少した。特に、ｃｉＮＳＣ５－移植マウスでは細長い枝を有する小膠細胞の休息期形態（ｒｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒｍ）も多数観察された（図４３）。この結果は、ＥＡＥマウスでｃｉＮＳＣ５移植によって小膠細胞活性化が抑制されたことを示す。
【0213】
実施例６．本発明の化合物によって直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５のパーキンソン病治療効果確認
６－１．運動機能回復改善効果確認
６－ＯＨＤＡ注入を通じたＰＤ動物モデル慢性ステップで機能回復に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄レット（２３０－２５０ｇ、Ｓａｍ：ＴａｃＮ（ＳＤ）ＢＲ、Ｓａｍｔａｋｏ、Ｏｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）の体重を測定し、抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で麻酔させてＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃにレットを固定して決まった位置（Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデル：ＡＰ＋０．７、ＭＬ＋２．６、ＤＶ－４．５ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ；およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙモデル：ＡＰ－２．２、ＭＬ＋１．５、ＤＶ－８．０ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ）に８ｕｇの６－ＯＨＤＡを４μlの食塩水に溶かし、３３ゲージハミルトン注射器を利用して注入した（図４４）。６－ＯＨＤＡ注入後４週目に、レットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させた後、ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃにレットを固定させ、右側線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）（ＡＰ：＋１．０、ＭＬ：－３．０、ＤＶ：－５．０）に食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を移植した。その次に、アポモルヒネ（ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下に注射して直径４０ｃｍの透明な円筒に入れ、１０分間適応させた後、１０分間分当たり４回以上回転した場合をパーキンソン病モデルが完成されたレットと決定した。Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデルでのｃｉＮＳＣ５運動機能向上効能を評価するために、細胞移植後２週ごとにｒｏｔａｔｉｏｎテストを進行した。また、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙモデルの場合、運動機能回復を確認するために、移植後２週目から週１回ステッピングテストを進行した。トレッドミルにレットの前肢を一つずつ載せ、１分間ビデオを撮って観察し、６－ＯＨＤＡが注入された側の反対方向の歩行障害が現れたｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌと正常歩行が可能なｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌのステップを計数して、ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌステップを全体ステップで除してステップピン割合（％）を計算した。正常レットは５０％のステップピン割合を示し、パーキンソン病が誘発されたレットは１０％以下の値を示す。
６－１．運動機能回復改善効果確認
６－ＯＨＤＡ注入を通じたＰＤ動物モデル慢性ステップで機能回復に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄レット（２３０－２５０ｇ、Ｓａｍ：ＴａｃＮ（ＳＤ）ＢＲ、Ｓａｍｔａｋｏ、Ｏｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）の体重を測定し、抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で麻酔させてＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃにレットを固定して決まった位置（Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデル：ＡＰ＋０．７、ＭＬ＋２．６、ＤＶ－４．５ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ；およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙモデル：ＡＰ－２．２、ＭＬ＋１．５、ＤＶ－８．０ ｆｒｏｍ ｂｒｅｇｍａ）に８ｕｇの６－ＯＨＤＡを４μlの食塩水に溶かし、３３ゲージハミルトン注射器を利用して注入した（図４４）。６－ＯＨＤＡ注入後４週目に、レットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させた後、ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃにレットを固定させ、右側線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）（ＡＰ：＋１．０、ＭＬ：－３．０、ＤＶ：－５．０）に食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を移植した。その次に、アポモルヒネ（ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下に注射して直径４０ｃｍの透明な円筒に入れ、１０分間適応させた後、１０分間分当たり４回以上回転した場合をパーキンソン病モデルが完成されたレットと決定した。Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデルでのｃｉＮＳＣ５運動機能向上効能を評価するために、細胞移植後２週ごとにｒｏｔａｔｉｏｎテストを進行した。また、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙモデルの場合、運動機能回復を確認するために、移植後２週目から週１回ステッピングテストを進行した。トレッドミルにレットの前肢を一つずつ載せ、１分間ビデオを撮って観察し、６－ＯＨＤＡが注入された側の反対方向の歩行障害が現れたｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌと正常歩行が可能なｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌのステップを計数して、ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌステップを全体ステップで除してステップピン割合（％）を計算した。正常レットは５０％のステップピン割合を示し、パーキンソン病が誘発されたレットは１０％以下の値を示す。
【0214】
その結果、ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデルで、移植後に時間が過ぎるほどＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５を移植したレットでｒｏｔａｔｉｏｎの数が減って、ｃｉＮＳＣ５－移植レットでは移植後２週から６週まで食塩水移植グループに比べて顕著な運動機能回復効果が示された（図４５Ａ）。また、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｊｕｒｙモデルで、食塩水投与グループは移植前と比較したとき全く変化がないのに対し、ｃｉＮＳＣ５を移植したグループでは移植後２週目から食塩水グループよりステップピン頻度が顕著に増加し、移植後６週までもその効果が持続した（図４５Ｂ）。
【0215】
６－２．ドーパミン神経細胞消失抑制効果確認
６－ＯＨＤＡ注入ＰＤ動物モデルに細胞を移植し、４週または６週後にレットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および引き継き０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。脳を摘出して同じ固定液に２４時間の間含浸して後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。ＯＣＴ化合物で包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した組織をｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４０μｍで切断し、Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａが含まれた組織をドーパミン神経細胞マーカーであるＴＨに対する抗体で免疫染色して免疫組織化学染色を遂行した。
６－ＯＨＤＡ注入ＰＤ動物モデルに細胞を移植し、４週または６週後にレットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および引き継き０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。脳を摘出して同じ固定液に２４時間の間含浸して後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。ＯＣＴ化合物で包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した組織をｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４０μｍで切断し、Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａが含まれた組織をドーパミン神経細胞マーカーであるＴＨに対する抗体で免疫染色して免疫組織化学染色を遂行した。
【0216】
その結果、ｃｉＮＳＣ５を移植した組織で食塩水またはＭＳＣを移植した組織よりドーパミン神経細胞の数が顕著に多く残っていることが示された（図４６）。
【0217】
６－３．ＴＨ－陽性ドーパミン神経細胞への分化効果確認
Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデルで移植後６週のレットの線条体をヒト特異的抗体であるＳＴＥＭ１２１を利用して免疫染色を遂行した結果、ＭＳＣ移植グループではＳＴＥＭ１２１陽性細胞が観察されていないが（データ図示しない）、ｃｉＮＳＣ５移植グループではＳＴＥＭ１２１－陽性細胞が確認された（図４７）。これは、移植後６週目にも移植したｃｉＮＳＣ５が組織内で生存していることを意味する。また、ＳＴＥＭ１２１抗体とＴＨ抗体を利用した二重免疫染色を施行した結果、ｃｉＮＳＣ５を移植した組織内ＳＴＥＭ１２１陽性ヒト細胞がＴＨ－陽性ドーパミン神経細胞であることが確認され（図４８）、移植されたｃｉＮＳＣ５が線条体内でドーパミン神経細胞に分化されたことを示す。
Ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｊｕｒｙモデルで移植後６週のレットの線条体をヒト特異的抗体であるＳＴＥＭ１２１を利用して免疫染色を遂行した結果、ＭＳＣ移植グループではＳＴＥＭ１２１陽性細胞が観察されていないが（データ図示しない）、ｃｉＮＳＣ５移植グループではＳＴＥＭ１２１－陽性細胞が確認された（図４７）。これは、移植後６週目にも移植したｃｉＮＳＣ５が組織内で生存していることを意味する。また、ＳＴＥＭ１２１抗体とＴＨ抗体を利用した二重免疫染色を施行した結果、ｃｉＮＳＣ５を移植した組織内ＳＴＥＭ１２１陽性ヒト細胞がＴＨ－陽性ドーパミン神経細胞であることが確認され（図４８）、移植されたｃｉＮＳＣ５が線条体内でドーパミン神経細胞に分化されたことを示す。
【0218】
これを通じて、ｃｉＮＳＣ５は６－ＯＨＤＡによって誘導されるＰＤモデルで行動学的症状をかなり改善させるだけでなく、ドーパミン神経細胞の死滅を抑制する効果を見せ、ＭＳＣより顕著な治療効能を示し、特に、移植された神経前駆細胞であるｃｉＮＳＣ５は移植部位である線条体でドーパミン神経細胞に分化したので、ｃｉＮＳＣ５が神経組織に移植されたときＰＤによって減少したドーパミン神経細胞を振り替えることで治療効能を示すことができることが分かる。
【0219】
実施例７．本発明の化合物によって直接トランス分化されたｃｉＮＳＣ５の慢性脊髄損傷治療効果確認
７－１．運動機能回復改善効果確認
脊髄損傷後、慢性ステップで機能回復に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ｃｉＮＳＣ５移植後、ＢＢＢオープンフィールドテスト、グリッドワークテスト（Ｇｒｉｄ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）およびフットプリント分析（Ｆｏｏｔ ｐｒｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む挙動テストを遂行し、これらを統合して機能回復インデックス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ；ＦＲＩ）分析を遂行した。具体的に、慢性脊髄損傷レットモデルを製作するために、手術前に成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄および雌レット（２３０－２５０ｇ、Ｓａｍ：ＴａｃＮ（ＳＤ）ＢＲ、Ｓａｍｔａｋｏ、Ｏｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）の体重を測定し、抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で麻酔させ、背中および首部分を髭剃りをして椎弓切除（ｌａｍｉｎｅｃｔｏｍｙ）をＴ９－Ｔ１０水準で実施して軽膜の損傷なしに脊髄の下部分を露出させた。その次に、Ｔ８およびＴ１１の棘突起をクランプで固定して脊椎を安定化し、露出した脊髄の背中表面に中間程度のあざ損傷（１０ｇ×２５ｍｍ）を与え、慢性脊髄損傷レットモデルを製作した。損傷後、筋肉および皮膚を覆ってレットを温度および湿度制御チャンバに終夜置いた。手術後に、レットに補充液（５ ｍｌ、ｌａｃｔａｔｅｄ ｒｉｎｇｅｒ）を皮下注入し、抗生剤（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、５ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を手術後５日間毎日１回注入した。損傷後レットをケージ当たり一匹ずつ飼育して水と飼料接近を容易にした。体重および残った食べ物と水の重量をすべての動物に対して確認して記録した。反射排尿が確立されるまで一日３回受動的に膀胱を空にした。脊髄損傷後６週目に、レットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させ、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を病変腔に注入した。対照群は対応時点に同量の食塩水を注入した。ＢＢＢオープンフィールドテスト、グリッドワークテスト（Ｇｒｉｄ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）およびフットプリント分析の挙動分析は、移植後８週間に週１回実施した。ＢＢＢオープンフィールドテストは、ＢＢＢスコアを慢性ＳＣＩ研究で機能回復および移動テストに使用し、完全麻痺（スコア０）から正常移動（スコア２１）までのＢａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｉｅおよびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）基準によって下記のオープンフィールド移動スコア（表５）を使用して移動機能をテストしてレット脊髄でのあざ損傷後回復を評価した。また、グリッドワークテストは、床から３０ｃｍ離れた１ｍ長さの金属グリッドバーの水平ランウエーで動物を歩かせ、規定された１０個バーセクターを分析するために選択した。固定されたバー間隔に対する習慣化を防止するために、このようなセクターにおけるバーを不規則的に（１－４ｃｍ間隔）配列し、テストセクションたびに替えた。分析は、足位置のエラー数を計数して実施し、動物が後肢で歩けない場合、バー当たり２つのエラーを作り、計２０個のエラーを引き起こすようにして、ステップ当たり足の踏み外しの百分率を計算した。また、フットプリント分析は、動物の前肢および後肢を非毒性の赤色および青色染料に浸けた後、狭いボックス（１ｍ長さおよび７ｃｍ幅）を横切って歩かせて足跡をスキャンし、デジタル化された像を分析した。併せて、前記３種の挙動テストを統合して、細胞移植時点および移植後８週間の挙動を比較して、８週間の移動機能回復デルタ数値を計算することで、運動機能回復のステップを定量して機能回復インデックス（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｄｅｘ；ＦＲＩ）を導き出した。各挙動実験で与えられたポイントの標準は、下記表６に示した。
７－１．運動機能回復改善効果確認
脊髄損傷後、慢性ステップで機能回復に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ｃｉＮＳＣ５移植後、ＢＢＢオープンフィールドテスト、グリッドワークテスト（Ｇｒｉｄ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）およびフットプリント分析（Ｆｏｏｔ ｐｒｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む挙動テストを遂行し、これらを統合して機能回復インデックス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ；ＦＲＩ）分析を遂行した。具体的に、慢性脊髄損傷レットモデルを製作するために、手術前に成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄および雌レット（２３０－２５０ｇ、Ｓａｍ：ＴａｃＮ（ＳＤ）ＢＲ、Ｓａｍｔａｋｏ、Ｏｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）の体重を測定し、抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で麻酔させ、背中および首部分を髭剃りをして椎弓切除（ｌａｍｉｎｅｃｔｏｍｙ）をＴ９－Ｔ１０水準で実施して軽膜の損傷なしに脊髄の下部分を露出させた。その次に、Ｔ８およびＴ１１の棘突起をクランプで固定して脊椎を安定化し、露出した脊髄の背中表面に中間程度のあざ損傷（１０ｇ×２５ｍｍ）を与え、慢性脊髄損傷レットモデルを製作した。損傷後、筋肉および皮膚を覆ってレットを温度および湿度制御チャンバに終夜置いた。手術後に、レットに補充液（５ ｍｌ、ｌａｃｔａｔｅｄ ｒｉｎｇｅｒ）を皮下注入し、抗生剤（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、５ｍｇ／ｋｇ、ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を手術後５日間毎日１回注入した。損傷後レットをケージ当たり一匹ずつ飼育して水と飼料接近を容易にした。体重および残った食べ物と水の重量をすべての動物に対して確認して記録した。反射排尿が確立されるまで一日３回受動的に膀胱を空にした。脊髄損傷後６週目に、レットを抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させ、食塩水に懸濁された１０μlのＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）を病変腔に注入した。対照群は対応時点に同量の食塩水を注入した。ＢＢＢオープンフィールドテスト、グリッドワークテスト（Ｇｒｉｄ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）およびフットプリント分析の挙動分析は、移植後８週間に週１回実施した。ＢＢＢオープンフィールドテストは、ＢＢＢスコアを慢性ＳＣＩ研究で機能回復および移動テストに使用し、完全麻痺（スコア０）から正常移動（スコア２１）までのＢａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｉｅおよびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）基準によって下記のオープンフィールド移動スコア（表５）を使用して移動機能をテストしてレット脊髄でのあざ損傷後回復を評価した。また、グリッドワークテストは、床から３０ｃｍ離れた１ｍ長さの金属グリッドバーの水平ランウエーで動物を歩かせ、規定された１０個バーセクターを分析するために選択した。固定されたバー間隔に対する習慣化を防止するために、このようなセクターにおけるバーを不規則的に（１－４ｃｍ間隔）配列し、テストセクションたびに替えた。分析は、足位置のエラー数を計数して実施し、動物が後肢で歩けない場合、バー当たり２つのエラーを作り、計２０個のエラーを引き起こすようにして、ステップ当たり足の踏み外しの百分率を計算した。また、フットプリント分析は、動物の前肢および後肢を非毒性の赤色および青色染料に浸けた後、狭いボックス（１ｍ長さおよび７ｃｍ幅）を横切って歩かせて足跡をスキャンし、デジタル化された像を分析した。併せて、前記３種の挙動テストを統合して、細胞移植時点および移植後８週間の挙動を比較して、８週間の移動機能回復デルタ数値を計算することで、運動機能回復のステップを定量して機能回復インデックス（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｄｅｘ；ＦＲＩ）を導き出した。各挙動実験で与えられたポイントの標準は、下記表６に示した。
【0220】
【表6】
【0221】
【表7】
【0222】
その結果、ｃｉＮＳＣ５移植グループおよびＭＳＣ移植グループのいずれも脊髄損傷後ＢＢＢ移動スコアをかなり増加させることが示された（図４９ＡおよびＤ）。また、ｃｉＮＳＣ５およびＭＳＣすべてのグリッド誤差率（ステップ当たり足踏み外し）は、食塩水－処理グループでさらに低く、ｃｉＮＳＣ５移植グループで足踏み外しの割合は、雄および雌レットの両方でＭＳＣ移植グループに比べて顕著に減少した（図４９ＢおよびＥ）。損傷後１４週目（移植後８週目）に、ｃｉＮＳＣ５－移植レットおよびＭＳＣ－移植レットの両方で足跡はかなり一貫した前肢－後肢の調和および非常に少ない足指引きずりを示した。これに対し、食塩水－処理グループにおける足跡は、両後肢で続くインク跡で一貫性のない前肢－後肢の調和および多くの引きずりを示した。また、ｃｉＮＳＣ５移植グループの足指引きずりは、ＭＳＣ移植グループに比べて顕著に減少したことが示された（図４９ＣおよびＦ）。併せて、機能回復インデックス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ；ＦＲＩ）分析結果、ｃｉＮＳＣ５およびＭＳＣのＦＲＩスコアが食塩水移植グループに比べてかなり増加し、特に、ｃｉＮＳＣ５移植グループのＦＲＩスコアがＭＳＣ移植グループより顕著にさらに改善した（図５０Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）。行動実験が進行される期間の間ｃｉＮＳＣ５およびＭＳＣの移植による非正常的な体重変化は観察されなかった（図５０ＣおよびＦ）。
【0223】
７－２．病変体積およびミエリン損失減少効果確認
ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５移植後８週目に、動物を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および引き継き、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。病変部位に集中した脊髄セクション（１．５ｃｍ）を切開して同じ固定液に６時間の間含浸して後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。分節をＯＣＴに入れて凍結切片を作り、縦断または横断面切片を１０または１６μｍで切断した。脊髄の背腹軸を通じた連続縦断面切片（１０μｍ）を使用して病変体積を確認するために、５０μｍごとに切片をＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ａｃｅｔａｔｅで染色して光顕微鏡で観察した。低倍率レンズ（１．２５Ｘ）を使用して病変領域をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で決定し、各縦断水準の領域を決定して連続領域の数的統合の平均で総病変体積を推論した。また、損傷後のミエリン損失を確認するために、連続的な横断クリオセックション（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）（１６μｍ厚さ）をグラススライドに載せた。選択されたスライドを９５％エタノールで酸性化された０．１％ Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂｌｕｅ ３８；Ｓｉｇｍａ）とともに６０℃で終夜インキュベーションした。分化は０．０５％ ｌｉｔｈｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅで実施した。
ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５移植後８週目に、動物を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および引き継き、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓穿刺を通じて灌流させた。病変部位に集中した脊髄セクション（１．５ｃｍ）を切開して同じ固定液に６時間の間含浸して後－固定させ、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースに入れて置いた。分節をＯＣＴに入れて凍結切片を作り、縦断または横断面切片を１０または１６μｍで切断した。脊髄の背腹軸を通じた連続縦断面切片（１０μｍ）を使用して病変体積を確認するために、５０μｍごとに切片をＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ａｃｅｔａｔｅで染色して光顕微鏡で観察した。低倍率レンズ（１．２５Ｘ）を使用して病変領域をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で決定し、各縦断水準の領域を決定して連続領域の数的統合の平均で総病変体積を推論した。また、損傷後のミエリン損失を確認するために、連続的な横断クリオセックション（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）（１６μｍ厚さ）をグラススライドに載せた。選択されたスライドを９５％エタノールで酸性化された０．１％ Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂｌｕｅ ３８；Ｓｉｇｍａ）とともに６０℃で終夜インキュベーションした。分化は０．０５％ ｌｉｔｈｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅで実施した。
【0224】
脊髄損傷後の組織損失を確認するために、連続縦断切片をＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔで染色して病変体積を測定した結果、移植後８週目にｃｉＮＳＣ５およびＭＳＣ－処理グループの両方で食塩水－注入グループに比べて全体病変体積がかなり減少し、ｃｉＮＳＣ５移植グループでＭＳＣ移植グループに比べて病変体積が顕著にさらに減少した（図５１ＡおよびＢ）。また、損傷後のミエリン損失をＬｕｘｏｌ－ｆａｓｔ ｂｌｕｅ染色で確認した結果、ｃｉＮＳＣ５およびＭＳＣ－処理グループの両方で食塩水－注入グループに比べてかなり抑制されたミエリン損失を示し、ｃｉＮＳＣ５移植グループではＭＳＣ移植グループに比べて顕著にさらに減少したミエリン損失を示した（図５１ＣおよびＤ）。
【0225】
７－３．神経膠症的傷形成減少効果確認
神経膠症的傷形成に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ＧＦＡＰおよびＣＳＰＧに対する二重免疫染色で評価し、脊髄損傷後に病変部位内に密集されて形成された傷から分泌するＣＳＰＧは軸索再生および機能回復に対する化学的障害物とされるので、ＣＳ－５６で染色してＣＳＰＧの存在有無を確認した。具体的に、冷凍された切片をＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＣＳ－５６（ＣＳＰＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に対する抗体を利用して免疫組織化学法で分析した。二重標識のために、ＦＩＴＣまたはｃｙ３－接合二次抗体を使用し（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、核はＤＡＰＩで標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。免疫染色対照研究は、一次抗体を非－免疫、対照抗体に入れ替え、過量（１０μｇ／ｍｌ）の各抗原で予備吸着して一次抗体を脱落させて実施した。力価以上の蛍光強度をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量し、平均化した。力価数値は少なくとも３回のバックグラウンドであり、バックグラウンドは一次抗体脱落対照に対して定量および平均化された。
神経膠症的傷形成に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ＧＦＡＰおよびＣＳＰＧに対する二重免疫染色で評価し、脊髄損傷後に病変部位内に密集されて形成された傷から分泌するＣＳＰＧは軸索再生および機能回復に対する化学的障害物とされるので、ＣＳ－５６で染色してＣＳＰＧの存在有無を確認した。具体的に、冷凍された切片をＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＣＳ－５６（ＣＳＰＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に対する抗体を利用して免疫組織化学法で分析した。二重標識のために、ＦＩＴＣまたはｃｙ３－接合二次抗体を使用し（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、核はＤＡＰＩで標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。免疫染色対照研究は、一次抗体を非－免疫、対照抗体に入れ替え、過量（１０μｇ／ｍｌ）の各抗原で予備吸着して一次抗体を脱落させて実施した。力価以上の蛍光強度をＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量し、平均化した。力価数値は少なくとも３回のバックグラウンドであり、バックグラウンドは一次抗体脱落対照に対して定量および平均化された。
【0226】
ＣＳＰＧの存在有無をＣＳ－５６で染色して確認した結果、食塩水－処理グループの脊髄の病変部位はＣＳ－５６およびＧＦＡＰ－陽性染色信号で豊かに満たされているのに対し、ＣＳＰＧおよびＧＦＡＰ強度のいずれも食塩水－処理グループに比べてＭＳＣおよびｃｉＮＳＣ５－移植グループでかなり減少した（図５２Ａ～Ｃ）。ウェスタンブロットでＧＦＡＰ水準を確認した結果でも、免疫染色結果と類似してｃｉＮＳＣ５移植したグループでＧＦＡＰ水準（ｌｅｖｅｌ）が食塩水グループだけではなくＭＳＣ移植グループに比べても顕著に減少することが示された（図５２Ｄ）。これを通じて、ｃｉＮＳＣ５が神経膠症的傷（ｇｌｉｏｔｉｃ ｓｃａｒ）形成を阻害することを確認した。
【0227】
７－４．軸索再生改善効果確認
皮質脊髄路軸索の成長に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ＢＤＡを使用して先行軸索追跡を実施し、損傷部位に繋がる余分の下向き軸索（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｘｏｎ）経路の規模を確認するために、フルオロゴールド（ＦＧ）を損傷後１４週目に尻尾部分を通じて病変部位に注入し、上位脊髄核（ｓｕｐｒａｓｐｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｉ）で選択されたＦＧ－標識ニューロンを計数した。具体的に、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５移植後８週目に、１２匹レット（食塩水注入グループから３匹、ＭＳＣ移植グループから５匹およびｃｉＮＳＣ５移植グループから５匹）を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、運動皮質上にある骨を除去した。１０％蛍光－標識ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を運動皮質内に両方向に８箇所（各側面当たり４箇所）注入し、ＢＤＡ注入後２週目に、レットを０．１Ｍリン酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで灌流させた。脊髄を収集して冷凍マイクロトーム上で２０ｍｍ厚さで縦断切断した後、蛍光顕微鏡で２０ｘレンズ下で軸索再生を定量した。０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００および３０００μｍ間隔の線が描かれたグリッドで各切片を調整し、病変腔の扉側縁からの角距離で軸索の数を計数し、皮質脊髄路（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）を含む１００μｍ間隔で選択された４個組織でＢＤＡ－陽性軸索を計数した。各動物における軸索の総数をグループ当たり平均化した。動物当たり４個切片で存在する軸索の総数を計数して平均化した。また、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（ＦＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用する逆行追跡で余分の下行軸索（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｘｏｎ）が扉側腰椎拡大に至る程度を決定するために、損傷後４週目に、４％ ＦＧをＹＪ１０１脊髄分画に注入し、下記定位座標によって各面に４箇所（０．５μｌ ｐｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に注入した：（１）０．５ｍｍ ｍｅｄｉａｌ－ｌａｔｅｒａｌ（Ｍ－Ｌ）、０．５ｍｍ ｄｏｒｓａｌ－ｖｅｎｔｒａｌ（Ｄ－Ｖ）；（２）１．０ｍＭ Ｍ－Ｌ、０．５ｍｍ Ｄ－Ｖ；（３）０．５ｍｍ Ｍ－Ｌ、２．０ｍＭ Ｄ－Ｖ；および（４）１．０ｍＭ Ｍ－Ｌ、２．０ｍＭ Ｄ－Ｖ．各注入後２分以上染料を分散させ、一週間後に動物を犠牲にさせて組織学的分析を実施した。注入部位を含む５－ｍｍ脊髄切片の横断面を連続的に切断して白質を含むバルク注入の範囲を確認し、染料が注入された脊髄切片を越して拡散しないことを確認した。このような基準を満たさないケースは追加研究から排除した。感覚運動皮質を含む横断脳切片（４０μｍ厚さ）をｃｒｙｏｓｔａｔ上で切断し、毎３番目の切片をガラススライドに載せた。レット当たり１０個切片を分析し、標識されたニューロンを各レット当たり計数とし、レット全体にわたって平均化した。併せて、軸索再生因子と知られているＧＡＰ４３の発現様相をウェスタンブロットで確認した。
皮質脊髄路軸索の成長に対するｃｉＮＳＣ５の効果を確認するために、ＢＤＡを使用して先行軸索追跡を実施し、損傷部位に繋がる余分の下向き軸索（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｘｏｎ）経路の規模を確認するために、フルオロゴールド（ＦＧ）を損傷後１４週目に尻尾部分を通じて病変部位に注入し、上位脊髄核（ｓｕｐｒａｓｐｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｉ）で選択されたＦＧ－標識ニューロンを計数した。具体的に、ＭＳＣまたはｃｉＮＳＣ５移植後８週目に、１２匹レット（食塩水注入グループから３匹、ＭＳＣ移植グループから５匹およびｃｉＮＳＣ５移植グループから５匹）を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、運動皮質上にある骨を除去した。１０％蛍光－標識ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を運動皮質内に両方向に８箇所（各側面当たり４箇所）注入し、ＢＤＡ注入後２週目に、レットを０．１Ｍリン酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで灌流させた。脊髄を収集して冷凍マイクロトーム上で２０ｍｍ厚さで縦断切断した後、蛍光顕微鏡で２０ｘレンズ下で軸索再生を定量した。０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００および３０００μｍ間隔の線が描かれたグリッドで各切片を調整し、病変腔の扉側縁からの角距離で軸索の数を計数し、皮質脊髄路（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）を含む１００μｍ間隔で選択された４個組織でＢＤＡ－陽性軸索を計数した。各動物における軸索の総数をグループ当たり平均化した。動物当たり４個切片で存在する軸索の総数を計数して平均化した。また、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（ＦＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用する逆行追跡で余分の下行軸索（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｘｏｎ）が扉側腰椎拡大に至る程度を決定するために、損傷後４週目に、４％ ＦＧをＹＪ１０１脊髄分画に注入し、下記定位座標によって各面に４箇所（０．５μｌ ｐｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に注入した：（１）０．５ｍｍ ｍｅｄｉａｌ－ｌａｔｅｒａｌ（Ｍ－Ｌ）、０．５ｍｍ ｄｏｒｓａｌ－ｖｅｎｔｒａｌ（Ｄ－Ｖ）；（２）１．０ｍＭ Ｍ－Ｌ、０．５ｍｍ Ｄ－Ｖ；（３）０．５ｍｍ Ｍ－Ｌ、２．０ｍＭ Ｄ－Ｖ；および（４）１．０ｍＭ Ｍ－Ｌ、２．０ｍＭ Ｄ－Ｖ．各注入後２分以上染料を分散させ、一週間後に動物を犠牲にさせて組織学的分析を実施した。注入部位を含む５－ｍｍ脊髄切片の横断面を連続的に切断して白質を含むバルク注入の範囲を確認し、染料が注入された脊髄切片を越して拡散しないことを確認した。このような基準を満たさないケースは追加研究から排除した。感覚運動皮質を含む横断脳切片（４０μｍ厚さ）をｃｒｙｏｓｔａｔ上で切断し、毎３番目の切片をガラススライドに載せた。レット当たり１０個切片を分析し、標識されたニューロンを各レット当たり計数とし、レット全体にわたって平均化した。併せて、軸索再生因子と知られているＧＡＰ４３の発現様相をウェスタンブロットで確認した。
【0228】
ＢＤＡ先行軸索追跡（ＢＤＡ ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ ａｘｏｎ ｔｒａｃｉｎｇ）結果、食塩水－移植グループおよびＭＳＣ－移植グループでは非常に少ない再生を見せたのに対し、ｃｉＮＳＣ５移植グループでは病変腔を通じて、またこれを超えた盛んだＣＳＴ軸索再生を示した（図５３）。軸索の数を計数した結果、食塩水移植グループおよびＭＳＣ移植グループでは病変腔出発点から１０００μｍ地点で軸索が観察されていないが、ｃｉＮＳＣ５移植グループでは２０００μｍ地点でも軸索が観察された。また、フルオロゴールド逆行軸索追跡（Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ａｘｏｎ ｔｒａｃｉｎｇ）結果、ＲＮ、ＰｎＣ、ＬＶｅ、ＭｄＶおよびＭｄＤでＦＧ－標識ニューロンの数は食塩水－処理対照グループに比べてｃｉＮＳＣ５－移植グループで顕著にさらに多いことが示され、ＭＳＣ移植グループではＦＧ－標識ニューロンがＬＶｅでのみ増加し、他の部位では効果がないことが示された（図５４）。併せて、ウェスタンブロット分析結果、ｃｉＮＳＣ５を移植したグループレットの脊髄内ＧＡＰ４３発現が食塩水移植グループまたはＭＳＣ移植グループに比べて顕著に有意に増加した（図５５）。
【0229】
７－５．成熟した神経細胞への分化確認
慢性脊髄損傷モデルにｃｉＮＳＣ５を移植してから６週後、ヒト特異的ＳＴＥＭ１２１抗体を利用して免疫組織化学染色を進行した。
慢性脊髄損傷モデルにｃｉＮＳＣ５を移植してから６週後、ヒト特異的ＳＴＥＭ１２１抗体を利用して免疫組織化学染色を進行した。
【0230】
その結果、移植部位の近くでＳＴＥＭ１２１－陽性細胞が観察され、これは、移植されたｃｉＮＳＣ５が組織内に残存していることを意味する。細胞タイプを確認するために、二重免疫染色を進行したところ、移植されたｃｉＮＳＣ５は神経細胞マーカーであるＮｅｕＮ、ＭＡＰ２およびＴｕｊ１と二重染色になったことが示された（図５６）。これを通じて、移植されたｃｉＮＳＣ５が脊髄組織で成熟した神経細胞に分化したことを示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【国際調査報告】