特表 2024-542353 キュウリモザイクウイルス基盤改良型組換えベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-15

(54)【発明の名称】キュウリモザイクウイルス基盤改良型組換えベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/83 20060101AFI20241108BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241108BHJP

   C07K 14/415 20060101ALI20241108BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241108BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20241108BHJP

【ＦＩ】

C12N15/83 Z ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

C07K14/415

C07K19/00

C12P21/00 C

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518263

(86)(22)【出願日】2023-11-10

(85)【翻訳文提出日】2024-04-30

(86)【国際出願番号】 KR2023018034

(87)【国際公開番号】W WO2024101936

(87)【国際公開日】2024-05-16

(31)【優先権主張番号】10-2022-0150990

(32)【優先日】2022-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2023-0038110

(32)【優先日】2023-03-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519217032

【氏名又は名称】ケーティー アンド ジー コーポレイション

(71)【出願人】

【識別番号】509329800

【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】セオ、ヒョ セオク

(72)【発明者】

【氏名】セオ、ジャン キュン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ヨウン ギ

(72)【発明者】

【氏名】クウォン、スン ジュン

(72)【発明者】

【氏名】キム、デュク ス

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジェオン ヘオン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミュン フウィ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CC24

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA30

4H045EA60

(57)【要約】

一態様は、キュウリモザイクウイルス基盤改良型組換えベクターに係り、一実施例による組換えベクターは、植物における外来タンパク質発現効率を著しく増進させることができ、既存組換えベクターより、外来タンパク質発現効率が顕著であるので、さまざまな植物種において、有用タンパク質の生産及びその研究に幅広く活用可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１によってなるヌクレオチドを含む、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）組換えベクター。

【請求項2】

配列番号２によってなるヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のキュウリモザイクウイルス組換えベクター。

【請求項3】

配列番号３によってなるヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のキュウリモザイクウイルス組換えベクター。

【請求項4】

前記キュウリモザイクウイルスは、Ｐ１タイプキュウリモザイクウイルスである、請求項１に記載のキュウリモザイクウイルス組換えベクター。

【請求項5】

前記Ｐ１タイプキュウリモザイクウイルスは、ＣＭＶ－ＧＴＮストレインである、請求項４に記載のキュウリモザイクウイルス組換えベクター。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載のキュウリモザイクウイルス組換えベクターによって形質転換された、形質転換微生物。

【請求項7】

配列番号１によってなるヌクレオチドを含むキュウリモザイクウイルス組換えベクターを作製する段階と、
前記キュウリモザイクウイルス組換えベクターを菌に形質転換する段階と、
前記形質転換された菌を植物に接種する段階と、を含む、タンパク質生産方法。

【請求項8】

前記タンパク質生産方法によって製造されたタンパク質は、Ｃ末端に２ｘＦＬＡＧタグ及び６ｘＨＩＳタグを含む、請求項７に記載のタンパク質生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２２年１１月１１日出願された大韓民国特許出願第１０－２０２２－０１５０９９０号、及び２０２３年３月２３日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２３－００３８１１０号を優先権として主張し、前述の明細書全体は、本出願の参考文献である。

【0002】

本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：cucumber mosaic virus）基盤遺伝子組換えベクターに関する。

【背景技術】

【0003】

植物ウイルスは、寄主植物体に感染したとき、数日内に全身感染を起こし、寄主の要素を利用し、自体の遺伝体を増殖する。そのような増殖過程においてウイルスは、自体のタンパク質を植物細胞内で大量に発現することになる。また、ウイルスは、遺伝体の大きさが小さく、分子生物学的な操作を介し、遺伝体構造や遺伝子発現メカニズムの調節が可能である。

【0004】

そのような植物ウイルスの特徴を活用し、外来遺伝子の挿入及び発現が可能になるように、ウイルスの遺伝体構造を操作することにより、遺伝子伝達ベクターに開発する研究が活発に進められているが、さらに効率的なベクターの開発が持続的に要求されている実情である。

【0005】

そのような背景下、本発明者らは、目的タンパク質の発現レベルを顕著に上昇させるのに適するベクターを開発するために研究努力した結果、キュウリモザイクウイルスに基づく組換えベクターが、目的タンパク質の発現を顕著に増進させうるということを確認し、発明完成に至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

一態様は、配列番号１によってなるヌクレオチドを含むキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：cucumber mosaic virus）組換えベクターを提供するものである。

【0007】

他の態様は、前記組換えベクターによって形質転換された、形質転換微生物を提供するものである。

【0008】

さらに他の態様は、配列番号１によってなるヌクレオチドを含むキュウリモザイクウイルス組換えベクターを作製する段階と、前記組換えベクターを菌に形質転換する段階と、前記形質転換された菌を植物に接種する段階と、を含むタンパク質生産方法を提供するものである。

【0009】

しかしながら、本発明が解決しようとする課題は、以上で言及された課題に制限されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から、当該技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されうるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様は、配列番号１によってなるヌクレオチドを含むキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：cucumber mosaic virus）組換えベクターを提供する。

【0011】

前記キュウリモザイクウイルス組換えベクターは、配列番号２によってなるヌクレオチドをさらに含むものでもあり、配列番号３によってなるヌクレオチドをさらに含むものでもある。以下のところに制限されるものではないが、前記キュウリモザイクウイルス組換えベクターは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によってなるヌクレオチドを含むものでもある。

【0012】

前記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）は、国内唐辛子栽培において、発生頻度が最も高く、深刻な被害を与えるウイルスであり、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）は、６５属８８５種の植物に感染される寄主範囲が広く、３個の分節ゲノムで構成されている一本鎖陽方向鎖ＲＮＡウイルス（positive-sense single stranded RNA virus）である。キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の分離株は、塩基配列により、サブグループ（subgroup）ＩＡ，ＩＢ及びIIに区分されうるが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）分離株において、Ｐ０タイプのＣＭＶ－Ｆｎｙ（CMV-Fny strain）は、サブグループＩＡに属し、Ｐ１タイプのＣＭＶ－ＧＴＮ（CMV-GTN strain）の場合、サブグループＩＢに属する。本明細書で、前記ＣＭＶ－ＧＴＮの場合、高病原性Ｐ１タイプであり、２０１３年、忠北槐山郡の唐辛子栽培農家で生育している唐辛子品種「青陽」から純粋分離されたものを意味する（Res. Plant Dis. 21(2): 99-102 (2015)）。

【0013】

一実施例によれば、前記配列番号１のヌクレオチドは、外来遺伝子挿入が可能になるように作動自在になるように連結されたＭＣＳ（multiple cloning site）を含むものでもあり、発現される外来タンパク質の検出及び抽出のために、該ＭＣＳの後ろに、２ｘＦＬＡＧタグと６ｘＨＩＳタグとをさらに含むものでもある。それにより、前記組換えベクターによって製造されたタンパク質は、該２ｘＦＬＡＧタグと該６ｘＨＩＳタグとをＣ末端に含むものでもある。

【0014】

本明細書において用語「組換えベクター」は、宿主細胞において目的とする外来遺伝子を発現することができるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように、作動自在に連結された必須な調節要素を含むベクターを意味する。適するベクターは、プローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンヘンサーのような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列、またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造されうる。

【0015】

本明細書において用語「作動自在に連結された」は、発現が必要な遺伝子と、その調節配列とが互いに結合され、遺伝子発現を可能にする方式で連結されることを意味する。

【0016】

他の態様は、前記組換えベクターによって形質転換された形質転換微生物を提供する。

【0017】

前記形質転換微生物において、前記組換えベクターと重複される部分は、その説明を省略する。

【0018】

一実施例によれば、前記微生物は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）でもある。

【0019】

さらに他の態様は、配列番号１によってなるヌクレオチドを含むキュウリモザイクウイルス組換えベクターを作製する段階と、前記組換えベクターを菌に形質転換する段階と、前記形質転換された菌を植物に接種する段階と、を含むタンパク質生産方法を提供する。

【0020】

前記タンパク質生産方法によって製造されたタンパク質は、Ｃ末端に、２ｘＦＬＡＧタグ及び６ｘＨＩＳタグを含むものでもある。

【0021】

前記タンパク質生産方法において、前記組換えベクター及び形質転換微生物と重複される部分は、その説明を省略する。

【発明の効果】

【0022】

一態様によるキュウリモザイクウイルス基盤組換えベクターを介し、植物における外来タンパク質発現効率を著しく増進させることができる。本実施例による組換えベクターは、既存組換えベクターより外来タンパク質発現効率が顕著であるので、さまざまな植物種において、有用タンパク質生産及びその研究に幅広く活用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２及びｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ３の構造を示した図である。

【図1B】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖの構造を示した図である。

【図1C】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２の構造を示した図である。

【図1D】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖの効果を確認するために、蛍光と結合したｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰの構造を示した図である。

【図1E】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１及びｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２の構造を示した図である。

【図1F】キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの構造において、一実施例によるＰＺＰ－ＧＦＰの構造を示した図である。

【図2A】ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、ＰＺＰ－ＧＦＰとの比較実験を行った図である。

【図2B】ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ組合わせベクターとの比較実験を行った図である。

【図3A】ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、ＧＦＰ発現レベルを蛍光測定装備で確認した図である。

【図3B】ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、接種後２日目、接種部位タンパク質を抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析した結果を示した図である。

【図3C】ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、ＩｍａｇｅＪを利用し、ＧＦＰバンド定量分析を行った図である。

【図3D】ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせベクター（ｐＣＭＶ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の発現効率を評価するために、生重量当たりのＧＦＰ発現レベルを示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明につき、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

【0025】

本明細書で使用されているように、単数形態は、文脈上、他のところではないとする場合を確かに指摘するものでないならば、複数の形態を含むものでもある。また、本明細書で使用される場合、「含む（comprise，include）」及び／または「含むところの（comprising，including）」は、言及された形状、数、段階、動作、部材、要素、及び／またはそれらグループの存在を特定するものであるが、１以上の他の形状、数、動作、部材、要素、及び／またはグループの存在または付加を排除するものではない。

【0026】

実施例
１．キュウリモザイクウイルス基盤改良型ベクターの製造
以下、実施例による改良型ベクターの製造方法につき、図１Ａから図１Ｆを参照して説明する。図１Ａから図１Ｆは、一実施例によるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：cucumber mosaic virus）基盤改良型ベクターの製造方法を概略的に図示したものである。具体的には、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）感染性ｃＤＮＡクローン、組換えベクター、及び緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）過発現のために作製された組換えクローンの模式図を示したものである。

【0027】

キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）を基にする遺伝子過発現ベクターを作製するためのナイナリー（binary）ベクターとして、ｐＣａｓｓ－Ｒｚベクターを利用した。ｐＣａｓｓ－Ｒｚベクターは、Ｔ－ＤＮＡのleft border、ＣａＭＶのdouble ３５Ｓプロモーター、ＭＣＳ（multiple cloning site）（ＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）、cis-cleaving ribozyme sequence（Ｒｚ）、３５Ｓ terminator（Ｔ）、Ｔ－ＤＮＡのright borderを順に含んでおり、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）に形質転換し、アグロインフィルトレーション（agroinfiltration）を介し、植物に対象遺伝子を伝達しうる。また、ｐＣａｓｓ－Ｒｚベクターは、カナマイシン（kanamycin）抵抗性遺伝子を含んでおり、大腸菌とアグロバクテリウム属（Agrobacterium）とに形質転換するとき、形質転換体を選択培養しうる。

【0028】

キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）基盤組換えタンパク質過発現ベクターを作製するために、既分離のＣＭＶ－ＧＴＮ（唐辛子から分離されたキュウリモザイクウイルス）（Res. Plant Dis. 21(2): 99-102 (2015)）系統の感染性ｃＤＮＡクローン（Virus Evolution, Volume 6, Issue 2, July 2020, veaa070参照）を利用した。キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のゲノムは、ＲＮＡ切片である、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３によってなる。ＲＮＡ１は、ＲＮＡ複製に関与する１ａ遺伝子をコーディングしており、ＲＮＡ２は、複製酵素である２ａ遺伝子と、遺伝子沈黙抑制因子である２ｂ遺伝子とをコーディングしている。ＲＮＡ３は、ウイルスの移動タンパク質（ＭＰ）遺伝子と、外被タンパク質（ＣＰ）遺伝子とをコーディングしている。

【0029】

韓国内圃場の唐辛子から分離された高病原性のＣＭＶ－ＧＴＮ系統のＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３に係わるゲノムＤＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲを介してそれぞれ増幅した。各ゲノムＲＮＡに係わるＰＣＲ産物を、ｐＣａｓｓ－ＲＺベクターのＭＣＳに存在する制限酵素サイトを利用し、それぞれクローニングした。その結果として得られたＣＭＶ－ＧＴＮ ＲＮＡ１，ＲＮＡ２，ＲＮＡ３に係わる感染性ｃＤＮＡクローンを、それぞれｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１（配列番号３）、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２（配列番号４）、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ３（配列番号５）と命名した。それに加え、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖは、配列番号６の配列を意味し、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰは、配列番号７の配列を意味し、ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１は、配列番号８の配列を意味し、ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２は、配列番号９の配列を意味し、ＰＺＰ－ＧＦＰは、配列番号１０の配列を意味する。

【0030】

ＣＭＶ－ＧＴＮ系統の感染性クローンを利用し、外来遺伝子の高い発現効率が予想されるＲＮＡ３のＣＰ ＯＲＦ（open reading frame）のゲノム配列を操作し、外来タンパク質を過発現するためのキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）基盤ベクターとして開発した。

【0031】

具体的には、ＲＮＡ３ ＣＰ ＯＲＦからＣＰ遺伝子を除外し、外来遺伝子挿入が可能になるように、ＭＣＳとして、ＳｐｅＩとＭｌｕＩとのサイトを導入し、発現された外来タンパク質の検出及び抽出のために、ＭＣＳの後ろに、２ｘＦＬＡＧタグと６ｘＨＩＳタグとを導入した。従って、ＭＣＳを利用してクローニングする場合、発現されるタンパク質は、２ｘＦＬＡＧタグと６ｘＨＩＳタグとをＣ末端に含むことになる。そのように作製されたＣＭＶ－ＧＴＮ ＲＮＡ３基盤ベクタークローンを、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ（配列番号１）と命名した。

【0032】

ＣＭＶ ＲＮＡ２は、遺伝子沈黙抑制因子である２ｂ遺伝子をコーディングしている最中、一実施例においては、２ｂ遺伝子を、さらに強力な遺伝子沈黙抑制因子として知られているＦＨＶ（flock house virus）のＢ２遺伝子で代替した組換えＣＭＶ ＲＮＡ２感染性クローンを作製し、ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２（配列番号２）と命名した。

【0033】

具体的には、ＣＭＶ ＲＮＡ２の２ｂ ＯＲＦのＣ末端を除外し、当該位置に、ＦＭＤＶ（foot and mouth disease virus）の自己切断ペプチド（self－cleaving peptide）（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧ／Ｐ）、ＭｌｕＩサイト、及びＦＨＶ Ｂ２配列を導入した。該Ｂ２遺伝子は、２ｂ ＯＲＦの翻訳（translation）を介して発現されて、ＦＭＤＶ自己切断ペプチド（self－cleaving peptide）によって切断されながら、Ｎ末端にさらなるプロリン（Ｐ）アミノ酸１個を含むことになる。

【0034】

２．改良型ベクターの発現効率評価
（１）発現効率評価のためのクローン製造
前述の１．で製造されたＣＭＶ－ＧＴＮ基盤ベクターを利用した植物における外来遺伝子発現効率を評価するために、ｐＣＭＶ－Ｒ３ＶのＳｐｅＩとＭｌｕＩとの制限酵素サイトを利用し、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入したクローンを作製するものとする。そのために、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、プライマー（5'-GGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'及び5'-AACGACGCGTGAGGATCCCCTTGTACAGCTC-3'）を利用し、ＰＣＲを介して増幅した後、ＳｐｅＩとＭｌｕＩとの制限酵素で処理し、ｐＣＭＶ－Ｒ３ＶベクターのＳｐｅＩとＭｌｕＩとの制限酵素サイトに挿入した。そのように、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を挿入したクローンを、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰと命名した（図１Ａから図１Ｆ参照）。また、高病原性のキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）系統ではなく、ＣＭＶ－Ｆｎｙ系統に係わる感染性クローンを作製するために、ｐＣａｓｓ－Ｒｚベクターを利用し、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１及びｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２のようなクローニング方法でもって、ＣＭＶ－Ｆｎｙ ＲＮＡ１とＣＭＶ－Ｆｎｙ ＲＮＡ２とにつき、それぞれｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１及びｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２を製造した。対照群で使用するために、ＰＺＰベクターに、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を挿入したＰＺＰ－ＧＦＰを作製して準備した。該ＰＺＰベクターは、Ｔ－ＤＮＡのleft border、ＣａＭＶのdouble ３５Ｓプロモーター、ＴＥ（translation enhance element）、ＭＣＳ（ＳｔｕＩ、ＳｐｅＩ）、３５Ｓ terminator（Ｔ）、Ｔ－ＤＮＡのright borderを順に含んでおり、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）に形質転換し、アグロインフィルトレーション（agroinfiltration）を介し、植物に対象遺伝子を伝達しうる。また、ＰＺＰベクターは、スペクチノマイシン（Spectinomycin）抵抗性遺伝子を含んでおり、大腸菌とアグロバクテリウム属（Agrobacterium）とに形質転換するとき、形質転換体を選択培養しうる。該ＰＺＰベクターのＳｔｕＩとＳｐｅＩとの制限酵素サイトを利用し、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入し、ＰＺＰ－ＧＦＰクローンを作製した

【0035】

図１Ａから図１Ｆの構造を有する、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１，ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２，ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ，ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２，ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１，ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２及びＰＺＰ－ＧＦＰクローンのプラスミドＤＮＡを、それぞれアグロバクテリウム属（Agrobacterium）ストレイン（strain）ＥＨＡ１０５に形質転換した。形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）を、５ｍｌのＹＥＰ液体培地（１００μｇ／ｍｌのカナマイシンと、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン（rifampicin）とを含む）において、３０℃の条件で１６時間振盪培養した後、一次培養液１ｍｌを、５０ｍｌの新たなＹＥＰ培地（１００μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン、及び２０μＭのアセトシリンゴンを含む）に接種し、３０℃の条件で６時間振盪培養した。培養液を４，８００Ｇで１０分間遠心分離し、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を沈澱させ、ＭＭＡインフィルトレーションバッファ（ＭＳ塩，１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、２００μＭアセトシリンゴン）に、６００ｎｍの波長でもってＯ．Ｄ．０．７の濃度にさらに懸濁させた。その後、該懸濁液を３０℃の条件で、４時間振盪培養した。

【0036】

それぞれのクローンに形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液を、以下に提示されているように、同じ比率で混ぜるか、あるいは単独でタバコ植物（N. benthamiana）葉の胚軸面に、１ｍｌ注射器を利用し、圧力でインフィルトレーションした。

【0037】

１）ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ：ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１、ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰにそれぞれ形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液（Ｏ．Ｄ．０．７）を同じ比率で混ぜ、インフィルトレーションする。

【0038】

２）ＰＺＰ－ＧＦＰ：ＰＺＰ－ＧＦＰに形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液（Ｏ．Ｄ．０．７）を単独でインフィルトレーションする。

【0039】

３）ＣＭＶ－Ｆｎｙ－ＧＦＰ：ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１、ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰにそれぞれ形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液（Ｏ．Ｄ．０．７）を同じ比率で混ぜ、インフィルトレーションする。

【0040】

４）ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ：ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１、ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２、ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰにそれぞれ形質転換されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液（Ｏ．Ｄ．０．７）を同じ比率で混ぜ、インフィルトレーションする。

【0041】

（２）ＧＦＰ発現効率評価
１）ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせベクターの発現効率
各組み合わせのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液を接種した後、接種部位における経時的な緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を、蛍光測定装備（FOBI system）を利用して観察した。

【0042】

図２Ａは、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３ＶＧＦＰ）とＰＺＰ－ＧＦＰとの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を比較分析した図である。

【0043】

植物形質転換に広く使用される３５Ｓプローモーターを含むバイナリーベクターを利用して作製されたＰＺＰ－ＧＦＰと比較し、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）の場合、非常に多量の緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が発現されることを確認した（図２Ａ参照）。ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせによって発現される緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の量は、接種後２日目（２ｄｐｉ）に最も多く、経時的に徐々に減少することを確認した（図２Ａ参照）。

【0044】

前述のような結果を介し、配列番号１で表示されるｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖを含むベクターは、植物における外来タンパク質発現を顕著に増進させうることを確認した。

【0045】

また、実施例で新たに作製された高病原性のＣＭＶ－ＧＴＮ系統が、他のキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）系統に比べ、ベクターとしての高い外来タンパク質発現効率を有するか否かということを確認するために、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせとＣＭＶ－Ｆｎｙ－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）とを比較した。

【0046】

図２Ｂは、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせとＣＭＶ－Ｆｎｙ－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｆｎｙ－Ｒ２＋ｐＣＭＶＲ３Ｖ－ＧＦＰ）との緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を比較分析したものである。各組み合わせのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液を接種した後、接種部位における経時的な緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を、蛍光測定装備（FOBI system）を利用して観察したものである。

【0047】

その結果、ＣＭＶ－Ｆｎｙ－ＧＦＰ組合わせに比べ、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせが、はるかにすぐれる緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を有していることを確認することができた（図２Ｂ参照）。そのような結果は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）系統により、ベクターとして、外来遺伝子過発現効率に差がありうることを示しており、実施例で利用されたＣＭＶ－ＧＴＮ系統が、外来遺伝子過発現ベクターとしてすぐれた効果を有するということを示す。

【0048】

２）ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせベクターの発現効率
次に、さらに強力な遺伝子沈黙抑制因子を発現するために、ＣＭＶ２ｂ遺伝子を、ＦＨＶ Ｂ２遺伝子で代替したｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２を利用する場合、発現効率を上昇させるか否かということを確認するために、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせとＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）とを比較した。

【0049】

図３Ａは、各組み合わせのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）懸濁液を接種した後、接種部位における経時的な緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を、蛍光測定装備（FOBI system）を利用して観察したものである。図３Ｂは、接種後２日目、接種部位から全体タンパク質を抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析したものである。図３Ｃは、ＩｍａｇｅＪを利用し、Ｂの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）バンドに係わる定量的比較分析結果である。図３Ｄは、組換えＣＭＶＧＴＮ基盤ベクターの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現量に係わる、植物生重量（fresh weight）対比の定量分析結果である。

【0050】

接種したタバコ植物における発現効率を、蛍光測定装備（ＦＯＢＩ）で確認した結果、ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせに比べ、ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせが若干高い発現効率を有していることを確認することができた（図３Ａ参照）。２つの組み合わせ間の緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率をさらに正確に比較するために、接種後２日目、接種部位から全体タンパク質を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施した。その結果、ＣＭＶ－ＧＴＮ基盤ベクターを利用して発現された緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タンパク質の量が、全体抽出タンパク質において、非常に高いパーセントを占めていることを確認することができ、またＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせに比べ、ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせが若干多くの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を誘導することを確認した（図３Ｂ）。それにつき、イメージ定量分析プログラムであるＩｍａｇｅＪを利用して分析した結果、ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせが、約３０％ほど上昇した緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を有していることを確認した（図３Ｃ参照）。

【0051】

ＣＭＶ－ＧＴＮ基盤ベクターによる緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現量を、植物生重量と対比させて分析するために、接種後２日目、接種部位から細胞質タンパク質を抽出し、GFP Quantification Kit（製品番号ａｂ２３５６７２（Abcam（英国）））を利用し、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）定量分析を実施した。ＣＭＶ－ＧＴＮ－ＧＦＰ組合わせの場合、生重量１ｍｇ当たり２，８４６ｎｇの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を示し、ＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせの場合、約２０％上昇した、生重量１ｍｇ当たり３，４４４ｎｇの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現効率を示した（図３Ｄ参照）。

【0052】

従って、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を各ベクターにクローニングし、タバコ（Nicotiana benthamiana）植物で発現させた後、発現量を比較分析した結果、高病原性であるＣＭＶ－ＧＴＮ基盤ベクターの場合、一般的に研究に広く使用されるＣＭＶ－Ｆｎｙ系統と比較し、はるかに高いレベルの緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現量を示すことを知ることができた。また、野生型ＣＭＶ ＲＮＡ２感染性クローン（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ２）に比べ、ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２を利用する場合、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現量が約１２％ほど上昇されることを確認した。

【0053】

前述のような結果を介し、本実施例によるＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｂ２－ＧＦＰ組合わせ（ｐＣＭＶ－ＧＴＮ－Ｒ１＋ｐＣＭＶ－Ｒ２Ｖ－Ｂ２＋ｐＣＭＶ－Ｒ３Ｖ－ＧＦＰ）のベクターは、植物における外来タンパク質発現において、非常に向上された発現効率を示すということを知ることができる。

【0054】

前述の実施例に係わる説明は、例示的なものに過ぎず、当該技術分野において通常の知識を有する者であるならば、それらから、多様な変形、及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解するであろう。従って、発明の真の保護範囲は、添付された特許請求の範囲によって定められるものであり、特許請求の範囲に記載された内容と同等な範囲にある全ての差異は、特許請求の範囲によって定められる保護範囲に含まれると解釈されなければならないのである。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図2a】

【図2b】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【配列表】

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【国際調査報告】