(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-15
(54)【発明の名称】周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/00 20060101AFI20241108BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241108BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20241108BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20241108BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20241108BHJP
【ＦＩ】
G01N27/00 Z
G01N33/53 Z
G01N33/543 593
C07K14/195
C12Q1/68 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024530483
(86)(22)【出願日】2022-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-07-17
(86)【国際出願番号】 EP2022082822
(87)【国際公開番号】W WO2023094385
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】21210216.4
(32)【優先日】2021-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】レンプト，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】ベルナー，クリスティアン
【テーマコード（参考）】
2G060
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G060AA15
2G060AA19
2G060AD06
2G060AF03
2G060AF20
2G060AG03
2G060HA02
2G060KA09
4B063QA11
4B063QA20
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QS39
4B063QS40
4B063QX05
4H045AA30
4H045AA40
4H045CA11
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法およびその使用、修飾されたナノポア、分析システム、キットおよびその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
周波数検出によって目的の分析物（３）を決定するための方法であって、ａ） ナノポア（１）を設けるステップであって、前記ナノポア（１）は、２次元材料（２）に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有しており、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポア（４）を設けるステップであって、前記修飾されたナノポア（４）は、前記２次元材料（２）に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有しており、前記ＡＣ周波数ｆＡＣを有する前記ＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
前記修飾されたナノポア（４）は、前記目的の分析物（３）を含む、ステップ、
ｃ） 前記第１の周波数と前記第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップであって、Δ＝｜ｆ２｜－｜ｆ１｜である、ステップ、および
ｄ） 前記周波数シフトΔを用いて、前記目的の分析物を決定するステップ、
を含む方法。
【請求項2】
ステップｃ）の前に、ｅ） ステップａ）で設けられた前記ナノポア（１）とステップｂ）で設けられた前記修飾されたナノポア（４）の電圧を時間の関数として検出するステップ、ならびに
ｆ） ステップｅ）から前記第１の周波数、前記第２の周波数、および／または前記周波数シフトを、フーリエ変換などの移行操作を用いて時間領域から周波数領域へ計算するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップｂ）で設けられた前記修飾されたナノポア（４）は、ステップａ）で設けられた前記ナノポア（１）を修飾することによって生成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記目的の分析物（３）は、前記修飾されたナノポア（４）の単一分子である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＡＣ周波数ｆＡＣ測定は、時間的および空間的に並列化されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＣ周波数ｆＡＣは、５００Ｈｚより高い、もしくは６５０Ｈｚより高い、もしくは６５０Ｈｚより高い、もしくは７００Ｈｚより高い、もしくは７５０Ｈｚより高い、例えば７７０Ｈｚであり、かつ／または前記ＡＣ周波数ｆＡＣは、２０００Ｈｚより低い、もしくは１７００Ｈｚより低い、もしくは１５００Ｈｚより低い、もしくは１３００Ｈｚより低い、もしくは１０００Ｈｚより低い、例えば９００Ｈｚである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の周波数および／または前記第２の周波数は、４００Ｈｚから５００Ｈｚの間である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記修飾されたナノポア（４）は、前記ナノポア（１）内に捕捉された構築物を含む分析物によって生成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記修飾されたナノポア（４）は、前記ナノポア（１）に付着したバインダーによって生成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記バインダーは、前記ナノポア（１）に共有結合で付着する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記バインダーは、非共有結合で、好ましくはファンデルワールス力で、前記ナノポア（１）に非特異的に付着する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記目的の分析物（３）を決定するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項13】
前記目的の分析物（３）を決定するために、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法において使用する修飾されたナノポア（４）であって、－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 前記目的の分析物、
を含む修飾されたナノポア（４）。
【請求項14】
分析システムであって、－ ナノポア（１）であって、前記ナノポア（１）は、２次元材料（２）に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有しており、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ナノポア（１）と、
－ 修飾されたナノポア（４）であって、前記修飾されたナノポア（４）は、前記２次元材料（２）に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有しており、前記ＡＣ周波数ｆＡＣを有する前記ＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポア（４）と、
を備え、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
前記修飾されたナノポア（４）は、前記目的の分析物（３）を含み、
前記分析システムは、前記第１の周波数と前記第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、前記周波数シフトΔを用いて前記目的の分析物（３）を決定するように構成されている、
分析システム。
【請求項15】
周波数検出によって目的の分析物（３）を決定するための、請求項１４に記載の分析システムの使用。
【請求項16】
請求項１から１１に記載の方法を実行するのに適したキットであって、－ 前記２次元材料（２）を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 前記ナノポア（１）を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 前記修飾されたナノポア（４）を形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、
を含むキット。
【請求項17】
周波数検出によって目的の分析物（３）を決定するための、請求項１６に記載のキットの使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法およびその使用、修飾されたナノポア、分析システム、キットおよびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
小分子、タンパク質、抗原、免疫グロブリン、核酸などの生物学的に活性な成分は、数多くの生物学的プロセスや機能に関与している。したがって、このような成分のレベルが乱れると、病気になったり、病気の進行が早まったりする可能性がある。このため、患者の診断や治療に用いるために、生物学的に活性な成分を迅速に検出し同定する信頼性の高い方法の開発に多くの努力が払われてきた。例えば、血液や尿サンプル中のタンパク質または小分子を検出することで、患者の代謝状態を評価することができる。同様に、血液や尿サンプル中の抗原を検出することで、患者が曝露した病原体を同定し、適切な治療を行うことができる。溶液中の分析物の濃度を決定できることは、さらに有益である。例えば、血液成分や尿成分の濃度を決定することで、その成分を基準値と比較することができ、患者の健康状態のさらなる評価が容易になる。
【0003】
数多くの検出および同定方法がある。例えば、ＵＳ２０２１１００８８５１１では、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用によって捕獲されたタグとナノポア内の大きなタンパク質とによって、単一のナノポア内に捕捉された荷電構築物が得られるという基本コンセプトについて説明されている。それぞれのタグは、ポア（細孔）内の閉塞度合いに応じて、ポアを通るイオン電流が異なるように設計されている。ポア内への挿入は、ポアの上にある周囲のタンパク質および／または化学物質、ならびに、そのそれぞれの挙動および／または周囲の媒体との相互作用に基づいている。
【0004】
ＡＣ電流の通常レベルは、シーケンシング実験が行われる場合１Ｈｚの範囲であり、読み出し周波数は１０００Ｈｚである。
【0005】
ナノポアを修飾することは、酵素（ポリメラーゼなど）がナノポア自体にタグ付けされたシーケンシング技術（Ｇｅｎｉａなど）にも見られる。
【0006】
このシステムでは、ポア挿入後の開いたチャネル、ビオチン－ストレプトアビジン－タグ－タンパク質の構築物の捕捉、およびさらなる修飾事象が、異なる電流レベルによって確認できる。電流レベルは、それぞれのＡＣを通じて生成される。ＡＣ（交流、正／負）の切り替えは、ポアの状態、およびそれぞれのイオン流の強さと方向（正に帯電したイオンは負電極へ、およびその逆）を反映する２つの電流レベルを与える。
【0007】
１つの分析物だけを検出する必要がある場合、実験による（ＡＣ）値の電流読み出しコンセプトは、非常に有用である。捕捉された構築物の生の信号を解釈するのは難しいことが多いので、使用する緩衝液の組成は、非常に注意深く調整され、最適化され得る。電流コンセプトには、タグの固有性、または構築物のさらなる結合および／もしくは変化事象の検出というコンセプトは組み込まれていないが、これは、多重化が望まれ、活性結合／ポア部位および結合された部位／ポアのデジタルカウントの場合には、実際、非常に興味深いであろう。さらに、ナノポアは、単一分子の性質上、曖昧で解釈が難しい信号を生成する可能性があり、そのため、機能するポアがいくつあるかを望ましい精度で調べることはできない。これは、低濃度および高濃度の分析物が存在する場合にも重要であり、自由な結合部位、バインダー、および覆われた結合部位の数をカウントおよび／または決定できる場合にのみ可能である。
【0008】
分析物の結合または一般に修飾事象は、電流レベルのシフトにのみ現れる。このシフトは誤解を招くことが多く、別の次元の情報によってより明確にされる必要がある。
【0009】
しかしながら、検出および同定方法を改善する必要はまだある。
【0010】
本発明は、周波数検出によって、例えば生体サンプル中の、ステロイド、ペプチド、タンパク質、およびその他のタイプの分析物などの目的の分析物を決定するための方法に関する。本発明はさらに、修飾されたナノポア、分析システムおよびその使用に関する。
【0011】
本発明の目的は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法、その使用、修飾されたナノポア、分析システムおよびその使用を提供することである。
【0012】
この目的は、独立請求項の主題によって解決される。さらなる実施形態は、従属請求項に従う。
【発明の概要】
【0013】
以下において、本発明は、以下の態様に関する：
第１の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法に関する。
第１の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法に関する。
【0014】
第２の態様では、本発明は、目的の分析物を決定するための本発明の第１の態様の方法の使用に関する。
【0015】
第３の態様では、本発明は、目的の分析物を決定するための本発明の第１の態様の方法において使用する修飾されたナノポアであって、
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポアに関する。
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポアに関する。
【0016】
第４の態様では、本発明は、
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備える分析システムに関し、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている。
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備える分析システムに関し、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている。
【0017】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法を実行するのに適したキットであって、
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキットに関する。
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキットに関する。
【0018】
第７の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための本発明の第５の態様のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１Ａは、修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）の実験された電流／磁気駆動読み出しの一般原理を示しており、時間依存読み出しが示されている。図１Ｂは、定められた電圧レベルをナノポア内に生成するために使用されるタグを示している。
【図2】修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）の実験された電流／磁気駆動読み出しの一般原理を示しており、時間依存読み出しが示されている。
【図3】外部場（磁場または電場）の影響を受け、それゆえ歪められ、その結果、電流が変化するナノポアのワークフローによる方法を示している。
【図4】修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）の実験された電流／磁気駆動読み出しの一般原理を示しており、時間依存読み出しが示されている。
【図5A】修飾されたナノポアのＲＡＷ（生の）信号（電流対時間）を示している。
【図7A】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図7B】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図8A】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図8B】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図8C】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図8D】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図8E】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。
【図9A】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ｆＡＣ＝１Ｈｚにおける周波数依存ＦＦＴ解析を示している。
【図9B】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ｆＡＣ＝１Ｈｚにおける周波数依存ＦＦＴ解析を示している。
【図9C】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ｆＡＣ＝１Ｈｚにおける周波数依存ＦＦＴ解析を示している。
【図10A】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ｆＡＣ＝１０００Ｈｚにおける周波数依存ＦＦＴ解析を示している。
【図10B】修飾されたナノポアのＲＡＷ信号（電流対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ｆＡＣ＝１０００Ｈｚにおける周波数依存ＦＦＴ解析を示している。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態および実施例に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【0021】
いくつかの文献が、本明細書の本文中で引用されている。本明細書に引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であろうと下記であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。このように組み込まれた参考文献の定義または教示と、本明細書に記載された定義または教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先する。
【0022】
以下、本発明の各要素について説明する。これらの要素は特定の実施形態とともに列挙されているが、これらは任意の方法および任意の数で組み合わされて追加の実施形態を作成することができることを理解されたい。種々の説明された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に説明された実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態をサポートし、かつ包含するものと理解されるべきである。さらにまた、本出願に記載されている全ての要素の任意の順列および組み合わせは、文脈が別段の意味を示さない限り、本出願の記載によって開示されているとみなされるべきである。
【0023】
定義
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの包含を意味するが、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの除外を意味しないことが理解されよう。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、交換可能に使用され得る。
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの包含を意味するが、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの除外を意味しないことが理解されよう。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、交換可能に使用され得る。
【0024】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に別のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0025】
パーセンテージ、濃度、量、およびその他の数値データは、「範囲」形式で本明細書に表現または提示される場合がある。このような範囲形式は、単に便宜上および簡潔にするために使用されているに過ぎず、したがって、その範囲の境界として明示的に記載されている数値を含むだけではなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に記載されているかのごとく、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲の全てを含むように、柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に記載されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値および部分範囲を含むように解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、４、５、６、７、８、９、１０、．．．１８、１９、２０％等の個々の値、および４～１０％、５～１５％、１０～２０％等の個々の部分範囲が含まれる。この同じ原理が、最小値または最大値を記載する範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載されている特性にかかわらず、適用されるべきである。
【0026】
「約」という用語は、数値に関連して使用される場合、表示された数値よりも５％小さい下限値を有し、且つ表示された数値よりも５％大きい上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【0027】
本開示の文脈において、「分析物」、「分析物分子」、または「目的の分析物」という用語は、交換可能に使用されて、分析される化学種を指す。化学種、すなわち分析物は、生体内に存在する任意の種類の分子であり得、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、サイトゾルタンパク質等）、代謝産物もしくはホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール等）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子（例えば、タンパク質上の糖部分もしくはホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）、または生体によって内在化された物質（例えば、治療薬、乱用薬物、毒素等）、またはそのような物質の代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、「バイオマーカー」という用語は、生物系の生物学的状態の指標として使用される当該生物系内の物質を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、目的の分析物を「決定する」という用語は、目的の分析物の定量化および／または認定を指し、例えば、目的の分析物の存在を決定すること、および／またはサンプル（試料）中の目的の分析物のレベルを測定することを指す。
【0029】
「ナノポア」という用語は、薄い膜もしくは２次元材料（例えば、脂質二重層）の上にあるナノメートルスケールの小さな細孔を意味するか、または固体の２次元平面からナノメートルスケールの小さな細孔として形成されたもの（例えば、ガラスナノポア）を意味することができる。ナノポアとポアは、交換可能に使うことができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、広義の用語であり、当業者にとって通常かつ慣習上の意味を与えられるべきであり、特殊なまたは特別な意味に限定されるべきではない。この用語は、限定されないが、特に、２次元材料に埋め込まれた修飾されたナノポアを指すことができ、修飾は、バインダーによって引き起こされることができ、これが、例えば共有結合または非共有結合により、ナノポアに付着して、修飾されたナノポアを形成する。
【0031】
本明細書で使用される場合、「両親媒性分子」という用語は、広義の用語であり、当業者にとって通常かつ慣習上の意味を与えられるべきであり、特殊なまたは特別な意味に限定されるべきではない。この用語は、限定されないが、特に、同一分子内に溶媒に対する親和性が異なる２つの別個の共有結合成分を含む任意の化合物であって、１つの部分は極性溶媒（水など）に対して高い親和性を有し、別の部分は炭化水素、エーテル、エステルなどの非極性溶媒に対して強い親和性を有する化合物を指すことができる。界面活性剤、高分子の両親媒性物質、および親水性と疎水性の両方の成分を含む一部の脂質分子は、両親媒性分子の典型的な例である。
【0032】
本明細書で使用される場合、「二重層」という用語は、広義の用語であり、当業者にとって通常かつ慣習上の意味を与えられるべきであり、特殊なまたは特別な意味に限定されるべきではない。この用語は、限定されないが、特に、脂質分子、好ましくはリン脂質分子の２つの層で作られた膜を指すことができる。
【0033】
「臨床診断システム」は、体外診断用のサンプルの分析専用の実験室自動化装置である。臨床診断システムは、必要に応じて、かつ／または所望の実験室ワークフローに従って、異なる構成を有してもよい。追加の構成が、複数の装置および／またはモジュールを互いに結合することによって得られる。「モジュール」は、専用機能を有する、臨床診断システム全体よりサイズが典型的には小さい作業セルである。この機能は分析機能であってよいが、分析前機能または分析後機能であってもよく、分析前機能、分析機能、または分析後機能のいずれかの補助機能であってもよい。特に、モジュールは、例えば１つ以上の分析前ステップおよび／または分析ステップおよび／または分析後ステップを実行することによって、サンプル処理ワークフローの専用タスクを実行するための１つ以上の他のモジュールと協働するように構成することができる。特に、臨床診断システムは、特定のタイプの分析（例えば、臨床化学、免疫化学、凝固、血液学、液体クロマトグラフィー分離、質量分析など）に最適化されたそれぞれのワークフローを実行するように設計された１つ以上の分析装置を備えることができる。したがって、臨床診断システムは、１つの分析装置から構成されてもよいし、それぞれのワークフローを備えたこのような分析装置のいずれかの組み合わせから構成されてもよく、ここで、分析前モジュールおよび／または分析後モジュールが、個々の分析装置に連結されてもよいし、複数の分析装置によって共有されてもよい。あるいは、分析前機能および／または分析後機能は、分析装置に組み込まれたユニットによって実行されてもよい。臨床診断システムは、サンプルおよび／または試薬および／またはシステム流体のピペッティングおよび／またはポンピングおよび／または混合のための液体ハンドリングユニットなどの機能ユニットを備えることができ、分類、保管、輸送、同定、分離、検出のための機能ユニットもさらに備えることができる。
【0034】
臨床診断システムは、ナノポアホルダーを備えることができる。ナノポアホルダーは当業者には既知であり、したがって詳細な説明はしないが、例えば、Ｂｈａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．，２０２１，１１，２８９９６を参照されたい。
【0035】
臨床診断システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するための検出器をさらに備えることができる。
【0036】
臨床診断システムは、時間領域から周波数領域へステップｅ）から第１の周波数、第２の周波数、および／または周波数シフトを計算するための変換器または計算器を、さらに備えることができる。変換器は、フーリエ変換などの移行操作を使用するように構成されている。
【0037】
「サンプル準備ステーション」は、サンプル内の干渉マトリックス成分を除去もしくは少なくとも低減すること、および／またはサンプル内の目的の分析物を濃縮することを目的とした一連のサンプル処理ステップを実行するように設計された、１つ以上の分析装置に結合した分析前モジュールまたは分析装置内のユニットとすることができる。このような処理ステップは、サンプルまたは複数のサンプルに対して、順次に、並行して、または交互に実行される以下の処理操作のうちの任意の１つ以上を含むことができる：流体のピペッティング（吸引および／または分配）、流体のポンピング、試薬との混合、特定の温度でのインキュベーション、加熱または冷却、遠心分離、分離、濾過、ふるい分け、乾燥、洗浄、再懸濁、分注、移送、保管など。
【0038】
「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば疾患の治療のための薬品、または本発明のバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するためのプローブを備える、任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、好ましくは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、宣伝、配布、または販売されている。通常、キットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器手段をしっかりと閉じ込めた状態で収容するように区画化されたキャリア手段を、さらに備えることができる。特に、容器手段の各々は、第１の態様の方法で使用される別個の要素のうちの１つを含む。キットは、反応触媒を含むがこれに限定されない１つ以上の他の試薬を、さらに備えてもよい。キットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、および使用説明書を含むがこれらに限定されない、さらなる材料を含む１つ以上の他の容器を、さらに備えてもよい。組成物が特定の用途に使用されることを示すために、ラベルが容器に貼付されていてもよく、また、インビボ使用またはインビトロ使用のいずれかのための指示が示されていてもよい。コンピュータプログラムコードが、光記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）等のデータ記憶媒体もしくはデバイス上に提供されてもよいし、またはコンピュータもしくはデータ処理デバイス上に直接提供されてもよい。さらに、キットは、較正目的のために、本明細書の別の箇所に記載されているようなバイオマーカーの標準量を含み得る。
【0039】
この詳細な説明において、「一実施形態」、「実施形態」、または「実施形態では」への言及は、言及されている特徴が、本開示によるその全ての態様に関する本技術の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。さらに、「一実施形態」、「実施形態」、または「複数の実施形態」への別個の言及は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。しかしながら、そのような実施形態は、特に明記しない限り、および当業者に容易に明らかになる場合を除いて、相互に排他的でもない。したがって、本開示によるその全ての態様における本技術は、本明細書に記載の実施形態の任意の様々な組み合わせおよび／または統合を包含することができる。
【0040】
実施形態
第１の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法に関する。
第１の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法に関する。
【0041】
本明細書では、２次元材料、例えば脂質二重層内のナノポア内に捕捉された荷電構築物の周波数変化を検出する原理について述べる。タグ付けされたナノポア構築物（修飾されたナノポア）の検出が可視であり、時間領域から周波数領域へ切り替えた後の非常に安定した信号が示されている。
【0042】
好ましくは、２次元材料－ナノポア－構築物の「固有周波数」または共振周波数（ｆ１および／またはｆ２）は、脂質二重層は適切に形成されるがポア構築物は確立されないことを意味する、共振による破壊という災害事象のため、駆動ＡＣ周波数ｆＡＣと一致すべきではない。
【0043】
駆動力は、電流駆動とすることができ、あるいは磁気駆動であってもよい。
【0044】
あるいはまた、ナノポア自体にタンパク質または非特異的バインダーを共有結合させることで、捕捉された構築物なしでナノポア自体を使用することも可能である。
【0045】
ステップ（ａ）により、ナノポアが設けられている。ナノポアは、２次元材料に埋め込まれている。ナノポアは、第１の共振周波数ｆ１を有する。ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が、印加される。
【0046】
第１の共振周波数に対して、ｆ１とｆ１という略語が、交換可能に使用され得る。
【0047】
本発明の第１の態様の実施形態では、周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法は、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップであって、Δ＝｜ｆ２｜－｜ｆ１｜である、ステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む。
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップであって、Δ＝｜ｆ２｜－｜ｆ１｜である、ステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む。
【0048】
本発明の第１の態様の実施形態では、第１の共振周波数ｆ１は、ナノポアの共振周波数である。
【0049】
本発明の第１の態様の実施形態では、第１の共振周波数ｆ１は、２次元材料に埋め込まれたナノポアの共振周波数である。
【0050】
好ましくは、１つより多いナノポアが設けられ、例えば、２、３、４、または数百、または数千、または数百万のナノポアが設けられている。ナノポアは、ウェルプレート上に設けられている。ウェルプレートは、半導体チップである。半導体チップは、１２８ｋ個のセルを有することができる。
【0051】
原則として、ナノポアは当業者にとって既知であるため、あまり詳しく説明しない。ナノポアは、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入できる。ナノポアを通る電流を測定するために、例えば２６４個の個別にアドレス指定可能な電極を含む相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップを使用することができる。このチップは、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が開発した。
【0052】
本発明の第１の態様の実施形態では、ナノポアは、１０００ｎｍ未満のポア径を有するポアを含み、好ましくは２ｎｍ～２０ｎｍのポア径を有する。
【0053】
本発明の第１の態様の実施形態では、ナノポアは、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポアである。
【0054】
本発明の第１の態様の実施形態では、タンパク質ナノポアは、α－ヘモリシンまたはマイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐｏｒｉｎ Ａ）である。
【0055】
本発明の第１の態様の実施形態では、タンパク質ナノポアは、ＭｏＳ２、グラフェン、Ｓｉ、ＳｉＮｘおよび／またはＳｉＯ２を含む合成膜である。
【0056】
ステップ（ｂ）により、修飾されたナノポアが設けられている。修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれている。修飾されたナノポアは、第２の共振周波数ｆ２を有する。ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２である。修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む。詳細には、ＡＣ周波数ｆＡＣを有する同じＡＣ電流が、ナノポアにも修飾されたナノポアにも印加される。
【0057】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＣ周波数ｆＡＣ測定は、時間的および空間的に並列化され、ならびに／または時間的および空間的に多重化される。
【0058】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＣ周波数ｆＡＣ測定は、電気的および／または磁気的測定を使用して実行される。
【0059】
ＡＣ周波数に対して、ｆＡＣとｆＡＣという略語が、交換可能に使用され得る。第２の共振周波数に対して、ｆ２とｆ２という略語が、交換可能に使用され得る。共振周波数（ｆ１および／またはｆ２）は、固有周波数とも呼ばれる。
【0060】
本発明の第１の態様の実施形態では、第２の共振周波数ｆ２は、修飾されたナノポアの共振周波数である。
【0061】
本発明の第１の態様の実施形態では、第２の共振周波数ｆ２は、２次元材料に埋め込まれた修飾されたナノポアの共振周波数である。
【0062】
修飾されたナノポアまたは２次元材料に埋め込まれた修飾されたナノポアは、ここおよび本開示全体において、構築物と呼ぶことができる。
【0063】
好ましくは、１つより多い修飾されたナノポアが設けられ、例えば、２、３、４、または数百、または数千の修飾されたナノポアが設けられている。修飾されたナノポアは、ウェルプレート上に設けられている。
【0064】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアとナノポアは、修飾によって互いと区別される。修飾は、複合体または構築物であってもよく、これらが、ナノポア内に捕捉され、修飾されたナノポアを形成する。加えて、または代替として、修飾は、バインダーであってもよく、これが、ナノポアに付着して、修飾されたナノポアを形成する。
【0065】
本発明の第１の態様の実施形態では、ステップｂ）で設けられる修飾されたナノポアは、ステップａ）で設けられるナノポアを修飾することによって生成される。
【0066】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアは、ナノポア内に捕捉された構築物を含む分析物によって生成される。
【0067】
本発明の第１の態様の実施形態では、構築物は、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、例えばＦＡＢ、非特異的バインダー、例えばＣ１８および／または芳香族構造と分析物との間のファンデルワールス相互作用、ＤＮＡ、酵素、例えばポリメラーゼ、イオン相互作用、例えば正電荷と負電荷の対、を含む。
【0068】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアは、ナノポアに付着したバインダーによって生成される。
【0069】
本発明の第１の態様の実施形態では、バインダーは、ナノポアに共有結合で付着する。
【0070】
本発明の第１の態様の実施形態では、バインダーは、非共有結合で、好ましくはファンデルワールス力で、ナノポアに非特異的に付着する。
【0071】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアは、１０００ｎｍ未満のポア径を有するポアを含み、好ましくは２ｎｍ～２０ｎｍのポア径を有する。
【0072】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアは、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポアである。
【0073】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたタンパク質ナノポアは、α－ヘモリシンまたはマイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡである。
【0074】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたタンパク質ナノポアは、ＭｏＳ２、グラフェン、Ｓｉ、ＳｉＮｘおよび／またはＳｉＯ２を含む合成膜である。
【0075】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＣ周波数は、第１の共振周波数よりも高く、かつ第２の共振周波数よりも高い。第１の共振周波数は、第２の共振周波数よりも高く、ＡＣ周波数よりも低い。第２の共振周波数は、第１の共振周波数よりも低く、第１の共振周波数よりも低い。
【0076】
本発明の第１の態様の実施形態では、ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２は、｜ｆＡＣ｜＞｜ｆ１｜＞｜ｆ２｜である。原則として、絶対値は省略できる。何故なら、その一般的な意味は、質量（例えば、ナノポアまたは修飾されたナノポア）が増加すると、その部分全体が重くなるため、共振周波数の低下に直接つながるということだからである。
【0077】
本発明の第１の態様の実施形態では、目的の分析物は、修飾されたナノポアの単一分子である。好ましくは、分析物の正確に１つの単一分子が、修飾されたナノポアの一部である。したがって、この方法は、単一分子の検出を可能にする。
【0078】
本発明の第１の態様の実施形態では、周波数シフトは、Δ＝ｆ２－ｆ１、好ましくはΔ＝｜ｆ２｜－｜ｆ１｜である。特に、両方の用語は、交換可能に使用され得る。
【0079】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＣ周波数ｆＡＣは、５００Ｈｚより高い、または６５０Ｈｚより高い、または６５０Ｈｚより高い、または７００Ｈｚより高い、または７５０Ｈｚより高い、例えば７７０Ｈｚである。
【0080】
本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＣ周波数ｆＡＣは、２０００Ｈｚより低い、または１７００Ｈｚより低い、または１５００Ｈｚより低い、または１３００Ｈｚより低い、または１０００Ｈｚより低い、例えば９００Ｈｚである。
【0081】
本発明の第１の態様の実施形態では、第１および／または第２の周波数は、４００Ｈｚ～５００Ｈｚである。原理的には、目的の分析物、ナノポアおよび／または２次元材料の種類に応じて、他の第１および／または第２の周波数が可能である。
【0082】
本発明の第１の態様の実施形態では、２次元材料は、両親媒性分子を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、２次元材料は、二重層、好ましくは脂質二重層である。
【0083】
本発明の第１の態様の実施形態では、２次元材料は、単分子膜であり、好ましくは、２つの親水基または２つの疎水基を有する両親媒性分子を含み、より好ましくは、２つの親水基が疎水基によって互いに分離されているか、または２つの疎水基が親水基によって互いに分離されている。
【0084】
本発明の第１の態様の実施形態では、目的の分析物は、小分子である。
【0085】
本発明の第１の態様の実施形態では、目的の分析物は、タンパク質である。
【0086】
本発明の第１の態様の実施形態では、目的の分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生体によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0087】
本発明の第１の態様の実施形態では、この方法は、ステップｃ）の前に、さらなるステップ：
ｅ） ステップａ）で設けられたナノポアとステップｂ）で設けられた修飾されたナノポアの時間の関数としての電圧を検出するステップ、および／または
ｆ） ステップｅ）から第１の周波数、第２の周波数、および／または周波数シフトを、フーリエ変換などの移行操作を用いて、時間領域から周波数領域へ計算するステップ、を含む。
ｅ） ステップａ）で設けられたナノポアとステップｂ）で設けられた修飾されたナノポアの時間の関数としての電圧を検出するステップ、および／または
ｆ） ステップｅ）から第１の周波数、第２の周波数、および／または周波数シフトを、フーリエ変換などの移行操作を用いて、時間領域から周波数領域へ計算するステップ、を含む。
【0088】
本発明の第１の態様の実施形態では、ステップｃ）およびステップｄ）は、ステップａ）およびステップｂ）の後に実行される。好ましくは、ステップａ）は、ステップｂ）の前に実行される。より好ましくは、ステップａ）のナノポアが設けられた後、ステップａ）で設けられたこのナノポアが修飾されて、ステップｂ）で設けられる修飾されたナノポアが形成される。
【0089】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、生物学的組織、生物学的材料、食料品、ポリマー、絵画、考古学的遺物、人工骨、皮膚、尿、または血液を含む。
【0090】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、タンパク質、例えばＴＮＴである。
【0091】
本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のケト基を含む分析物分子は、ケトステロイドである。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ケトステロイドは、テストステロン、エピテストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、デソキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６－ケトエストラジオール、１６－アルファ－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、１７－ヒドロキシプレグネノロン、１７－ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Δ４－アンドロステンジオン、１１－デオキシコルチゾール、コルチコステロン、２１－デオキシコルチゾール、１１－デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロン、およびアルドステロンからなる群から選択される。
【0092】
本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸、ベンゾイルエクゴニン、サリチル酸、２－ヒドロキシ安息香酸、ガバペンチン、プレガバリン、バルプロ酸、バンコマイシン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、モンテルカスト、レパグリニド、フロセミド、テルミサルタン、ゲムフィブロジル、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ゾメピラク、イソキセパック、およびペニシリンからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、およびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0093】
本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアルデヒド基を含む分析物分子は、ピリドキサール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、アルカフタジン、ストレプトマイシン、およびジョサマイシンからなる群から選択される。
【0094】
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、カルボニルエステル基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエステル基を含む分析物分子は、コカイン、ヘロイン、リタリン、アセクロフェナク、アセチルコリン、アムシノニド、アミロキサート、アミロカイン、アニレリジン、アラニジピン、アルテスネート、およびペチジンからなる群から選択される。
【0095】
本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上の無水物基を含む分析物分子は、カンタリジン、無水コハク酸、無水トリメリット酸、および無水マレイン酸からなる群から選択される。
【0096】
本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、セコステロイドである。実施形態では、セコステロイドは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、カルシフェジオール、カルシトリオール、タキステロール、ルミステロール、およびタカルシトールからなる群から選択される。特に、セコステロイドは、ビタミンＤ、特にビタミンＤ２もしくはＤ３またはそれらの誘導体である。特定の実施形態では、セコステロイドは、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシフェジオール）、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、ビタミンＡ、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、ナタマイシン、シロリムス、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、エベロリムス、テムシロリムス、およびフィダキソマイシンからなる群から選択される。
【0097】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、単一のヒドロキシル基または２つのヒドロキシル基を含む。１つより多いヒドロキシル基が分析物分子中に存在する実施形態では、２つのヒドロキシル基は、互いに隣接して配置されてもよく（１，２－ジオール）、または１、２、もしくは３個のＣ原子によって分離されてもよい（それぞれ、１，３－ジオール、１，４－ジオール、１，５－ジオール）。第１の態様の特定の実施形態では、分析物分子は、１，２－ジオール基を含む。１つのヒドロキシル基のみが存在する実施形態では、前記分析物は、第一級アルコール、第二級アルコール、および第三級アルコールからなる群から選択される。１つ以上のヒドロキシル基を分析物分子が含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ベンジルアルコール、メントール、Ｌ－カルニチン、ピリドキシン、メトロニダゾール、一硝酸イソソルビド、グアイフェネシン、クラブラン酸、ミグリトール、ザルシタビン、イソプレナリン、アシクロビル、メトカルバモール、トラマドール、ベンラファキシン、アトロピン、クロフェダノール、アルファ－ヒドロキシアルプラゾラム、アルファ－ヒドロキシトリアゾラム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、エチルグルクロニド、エチルモルヒネ、モルヒネ、モルヒネ－３－グルクロニド、ブプレノルフィン、コデイン、ジヒドロコデイン、ｐ－ヒドロキシプロポキシフェン、Ｏ－デスメチルトラマドール、デスメトラマドール、ジヒドロキニジン、およびキニジンからなる群から選択される。１つより多いヒドロキシル基を分析物分子が含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ビタミンＣ、グルコサミン、マンニトール、テトラヒドロビオプテリン、シタラビン、アザシチジン、リバビリン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ストレプトゾトシン、アデノシン、ビダラビン、クラドリビン、エストリオール、トリフルリジン、クロファラビン、ナドロール、ザナミビル、ラクツロース、アデノシンモノホスフェート、イドクスウリジン、レガデノソン、リンコマイシン、クリンダマイシン、カナグリフロジン、トブラマイシン、ネチルマイシン、カナマイシン、チカグレロル、エピルビシン、ドキソルビシン、アルベカシン、ストレプトマイシン、ウアバイン、アミカシン、ネオマイシン、フラミセチン、パロモマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ビンデシン、ジギトキシン、ジゴキシン、メトリザミド、アセチルジギトキシン、デスラノシド、フルダラビン、クロファラビン、ゲムシタビン、シタラビン、カペシタビン、ビダラビン、およびプリカマイシンからなる群から選択される。
【0098】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のチオール基（アルキルチオール基およびアリールチオール基を含むがこれらに限定されない）を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のチオール基を含む分析物分子は、チオマンデル酸、ＤＬ－カプトプリル、ＤＬ－チオルファン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｄ－ペニシラミン、グルタチオン、Ｌ－システイン、ゾフェノプリラート、チオプロニン、ジメルカプロール、サクシマーからなる群から選択される。
【0099】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のジスルフィド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジスルフィド基を含む分析物分子は、グルタチオンジスルフィド、ジピリチオン、硫化セレン、ジスルフィラム、リポ酸、Ｌ－シスチン、フルスルチアミン、オクトレオチド、デスモプレシン、バプレオチド、テルリプレシン、リナクロチド、およびペギネサチドからなる群から選択される。硫化セレンは、二硫化セレン、ＳｅＳ２、または六硫化セレン、Ｓｅ２Ｓ６であり得る。
【0100】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のエポキシド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエポキシド基を含む分析物分子は、カルバマゼピン－１０，１１－エポキシド、カルフィルゾミブ、フロセミドエポキシド、ホスホマイシン、セベラマー塩酸塩、セルレニン、スコポラミン、チオトロピウム、チオトロピウムブロミド、メチルスコポラミンブロミド、エプレレノン、ムピロシン、ナタマイシン、およびトロレアンドマイシンからなる群から選択される。
【0101】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のフェノール基を含む。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ステロイドまたはステロイド様化合物である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ｓｐ２混成のＡ環と、Ａ環の３位にＯＨ基とを有するステロイドまたはステロイド様化合物である。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイド様分析物分子は、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｂ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、および１６，１７－エピエストリオールおよび／またはそれらの代謝産物からなる群から選択される。実施形態では、代謝産物は、エストリオール、１６－エピエストリオール（１６－ｅｐｉＥ３）、１７－エピエストリオール（１７－ｅｐｉＥ３）、１６，１７－エピエストリオール（１６，１７－ｅｐｉＥ３）、１６－ケトエストラジオール（１６－ｋｅｔｏＥ２）、１６ａ－ヒドロキシエストロン（１６ａ－ＯＨＥｌ）、２－メトキシエストロン（２－ＭｅＯＥｌ）、４－メトキシエストロン（４－ＭｅＯＥｌ）、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル（３－ＭｅＯＥｌ）、２－メトキシエストラジオール（２－ＭｅＯＥ２）、４－メトキシエストラジオール（４－ＭｅＯＥ２）、２－ヒドロキシエストロン（２－ＯＨＥ１）、４－ヒドロキシエストロン（４－ＯＨＥ１）、２－ヒドロキシエストラジオール（２－ＯＨＥ２）、エストロン（Ｅｌ）、エストロンサルフェート（Ｅｌｓ）、１７ａ－エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７ｂ－エストラジオール（Ｅ２Ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２Ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７ａ－ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７ｂ－ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７－ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７α－ジヒドロエキレニン、１７β－ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９－ジヒドロエストロン（ｄＥｌ）、Δ８，９－ジヒドロエストロンサルフェート（ｄＥｌｓ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール、ミコフェノール酸からなる群から選択される。βまたはｂは、交換可能に使用することができる。αおよびａは、交換可能に使用することができる。
【0102】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基としてアミン基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基は、アルキルアミン基またはアリールアミン基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアミン基を含む分析物は、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基を含む分析物分子は、３，４－メチレンジオキシアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシ－Ｎ－エチルアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシメタンフェタミン、アンフェタミン、メタンフェタミン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、７－アミノクロナゼパム、７－アミノフルニトラゼパム、３，４－ジメチルメトカチノン、３－フルオロメトカチノン、４－メトキシメトカチノン、４－メチルエトカチノン、４－メチルメトカチノン、アンフェプラモン、ブチロン、エトカチノン、エレフェドロン、メトカチノン、メチロン、メチレンジオキシピロバレロン、ベンゾイルエクゴニン、デヒドロノルケタミン、ケタミン、ノルケタミン、メタドン、ノルメタドン、６－アセチルモルヒネ、ジアセチルモルヒネ、モルヒネ、ノルヒドロコドン、オキシコドン、オキシモルホン、フェンシクリジン、ノルプロポキシフェン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、トリミプラミン、フェンタニル、グリシルキシリジド、リドカイン、モノエチルグリシルキシリジド、Ｎ－アセチルプロカインアミド、プロカインアミド、プレガバリン、２－メチルアミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、２－アミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、ノルメペリジン、Ｏ－デストラマドール、デスメトラマドール、トラマドール、ラモトリギン、テオフィリン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン、メトトレキサート、ガバペンチンシソマイシン、および５－メチルシトシンからなる群から選択される。
【0103】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、炭水化物または炭水化物部分を有する物質、例えば糖タンパク質またはヌクレオシドである。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、単糖であり、特に、リボース、デソキシリボース、アラビノース、リブロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルニューロミン酸などからなる群から選択される。実施形態では、分析物分子は、オリゴ糖であり、特に、二糖、三糖、四糖、多糖からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、二糖は、スクロース、マルトース、およびラクトースからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、上述の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖部分を含む物質である。
【0104】
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、アルキルまたはアリールアジドからなる群から選択されるアジド基を官能基として含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアジド基を含む分析物分子は、ジドブジンおよびアジドシリンからなる群から選択される。
【0105】
このような分析物分子は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織または細胞抽出物などの生体サンプルまたは臨床サンプル中に存在し得る。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、および乾燥血液スポットからなる群から選択される生体サンプルまたは臨床サンプル中に存在する。本発明の第１の態様のいくつかの実施形態では、分析物分子は、精製されたまたは部分的に精製されたサンプル、例えば、精製されたまたは部分的に精製されたタンパク質混合物または抽出物であるサンプル中に存在し得る。
【0106】
驚くべきことに、本発明により、脂質二重層内のナノポア内に捕捉された荷電構築物の周波数変化を検出できることが判明した。ＡＣ周波数を変調させることで、脂質二重層／ナノポア構築物の「固有周波数」は、さらに高い周波数になる。タグ付けされたナノポア構築物の検出が可視であり、時間領域から周波数領域に切り替えた後に非常に安定した信号が観測されることが示されている。
【0107】
本発明の第１の態様の実施形態では、修飾されたナノポアは、
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む。
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む。
【0108】
第２の態様では、本発明は、目的の分析物を決定するための本発明の第１の態様の方法の使用に関する。
【0109】
本発明の第１の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第２の態様に適用され、その逆もまた同様である。
【0110】
第３の態様では、本発明は、目的の分析物を決定するための本発明の第１の態様の方法において使用する修飾されたナノポアであって、
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポアに関する。
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポアに関する。
【0111】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第３の態様に適用され、その逆もまた同様である。
【0112】
第４の態様では、本発明は、分析システムであって、
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備える分析システムに関し、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている。
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備える分析システムに関し、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている。
【0113】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、その逆もまた同様である。
【0114】
本発明の第４の態様の実施形態では、分析システムは、臨床診断システムである。
【0115】
第５の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための分析システムの使用に関する。
【0116】
本発明の第４の態様の実施形態では、ＡＣ電流は、実験条件、例えば緩衝液条件、ポアのタイプ、分析物のタイプに合わせて適合または調整される。
【0117】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様および／または本発明の第４の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第５の態様に適用され、その逆もまた同様である。
【0118】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法を実行するのに適したキットであって、
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキットに関する。
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキットに関する。
【0119】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様、本発明の第４の態様および／または本発明の第５の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第６の態様に適用され、その逆もまた同様である。
【0120】
第７の態様では、本発明は、周波数検出によって目的の分析物を決定するための本発明の第５の態様のキットの使用に関する。
【0121】
本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様、本発明の第４の態様、本発明の第５の態様および／または本発明の第６の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第７の態様に適用され、その逆もまた同様である。さらなる実施形態において、本発明は、以下の態様に関する：
１． 周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法。
１． 周波数検出によって目的の分析物を決定するための方法であって、
ａ） ナノポアを設けるステップであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、ステップ、
ｂ） 修飾されたナノポアを設けるステップであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加され、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含む、ステップ、
ｃ） 第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出するステップ、および
ｄ） 周波数シフトΔを用いて、目的の分析物を決定するステップ、を含む方法。
【0122】
２． ステップｃ）の前に、さらなるステップ：
ｅ） ステップａ）で設けられたナノポアとステップｂ）で設けられた修飾されたナノポアの電圧を時間の関数として検出するステップ、および
ｆ） ステップｅ）から第１の周波数、第２の周波数、および／または周波数シフトを、フーリエ変換などの移行操作を用いて、時間領域から周波数領域へ計算するステップ、を含む態様１の方法。
ｅ） ステップａ）で設けられたナノポアとステップｂ）で設けられた修飾されたナノポアの電圧を時間の関数として検出するステップ、および
ｆ） ステップｅ）から第１の周波数、第２の周波数、および／または周波数シフトを、フーリエ変換などの移行操作を用いて、時間領域から周波数領域へ計算するステップ、を含む態様１の方法。
【0123】
３． ステップｂ）で設けられる修飾されたナノポアは、ステップａ）で設けられるナノポアを修飾することによって生成される、先行するいずれかの態様の方法。
【0124】
４． 目的の分析物は、修飾されたナノポアの単一分子である、先行するいずれかの態様の方法。
【0125】
５． 周波数シフトはΔ＝ｆ２－ｆ１であり、かつ／または、ＡＣ周波数ｆＡＣ測定は時間的および空間的に並列化されている、先行するいずれかの態様の方法。
【0126】
６． ＡＣ周波数ｆＡＣは、５００Ｈｚより高い、または６５０Ｈｚより高い、または６５０Ｈｚより高い、または７００Ｈｚより高い、または７５０Ｈｚより高い、例えば７７０Ｈｚである、先行するいずれかの態様の方法。
【0127】
７． ＡＣ周波数ｆＡＣは、２０００Ｈｚより低い、または１７００Ｈｚより低い、または１５００Ｈｚより低い、または１３００Ｈｚより低い、または１０００Ｈｚより低い、例えば９００Ｈｚである、先行するいずれかの態様の方法。
【0128】
８． 第１および／または第２の周波数は、４００Ｈｚ～５００Ｈｚである、先行するいずれかの態様の方法。
【0129】
９． 修飾されたナノポアは、ナノポア内に捕捉された構築物を含む分析物によって生成される、先行するいずれかの態様の方法。
【0130】
１０． 構築物は、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、例えばＦＡＢ、非特異的バインダー、例えばＣ１８および／または芳香族構造と分析物との間のファンデルワールス相互作用、ＤＮＡ、酵素、例えばポリメラーゼ、を含む、先行するいずれかの態様の方法。
【0131】
１１． 修飾されたナノポアは、ナノポアに付着したバインダーによって生成される、先行するいずれかの態様の方法。
【0132】
１２． バインダーは、ナノポアに共有結合で付着する、先行するいずれかの態様の方法。
【0133】
１３． バインダーは、非共有結合で、好ましくはファンデルワールス力で、ナノポアに非特異的に付着する、先行するいずれかの態様の方法。
【0134】
１４． ナノポアは、１０００ｎｍ未満のポア径を有する（好ましくは、２ｎｍ～２０ｎｍのポア径を有する）ポアを含む、先行するいずれかの態様の方法。
【0135】
１５． ナノポアは、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポアである、先行するいずれかの態様の方法。
【0136】
１６． タンパク質ナノポアは、α－ヘモリシンまたはマイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡである、先行するいずれかの態様の方法。
【0137】
１７． タンパク質ナノポアは、ＭｏＳ２、グラフェン、Ｓｉ、ＳｉＮｘおよび／またはＳｉＯ２を含む合成膜である、先行するいずれかの態様の方法。
【0138】
１８． ２次元材料は、両親媒性分子を含む、先行するいずれかの態様の方法。
【0139】
１９． ２次元材料は、二重層、好ましくは脂質二重層である、先行するいずれかの態様の方法。
【0140】
２０． ２次元材料は、単分子膜であり、好ましくは、２つの親水基または２つの疎水基を有する両親媒性分子を含み、より好ましくは、２つの親水基が疎水基によって互いに分離されているか、または２つの疎水基が親水基によって互いに分離されている、単分子膜である、先行するいずれかの態様の方法。
【0141】
２１． 目的の分析物は、小分子である、先行するいずれかの態様の方法。
【0142】
２２． 目的の分析物は、タンパク質である、先行するいずれかの態様の方法。
【0143】
２３． 目的の分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生体によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行するいずれかの態様の方法。
【0144】
２４． 修飾されたナノポアは、
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む、先行するいずれかの態様の方法。
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む、先行するいずれかの態様の方法。
【0145】
２５． 目的の分析物を決定するための、先行するいずれかの態様の方法の使用。
【0146】
２６． 目的の分析物を決定するために、先行するいずれかの態様の方法において使用する修飾されたナノポアであって、
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポア。
－ タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア、
－ 任意選択でバインダー、および
－ 目的の分析物、を含む修飾されたナノポア。
【0147】
２７． 分析システムであって、
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを 有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備え、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている、分析システム。
－ ナノポアであって、ナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを 有するＡＣ電流が印加される、ナノポアと、
－ 修飾されたナノポアであって、修飾されたナノポアは、２次元材料に埋め込まれ、第２の共振周波数ｆ２を有し、ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流が印加される、修飾されたナノポアと、を備え、
ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２であり、
修飾されたナノポアは、目的の分析物を含み、
分析システムは、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔを検出し、周波数シフトΔを用いて目的の分析物を決定するように構成されている、分析システム。
【0148】
２８． 周波数検出によって目的の分析物を決定するための、態様２７の分析システムの使用。
【0149】
２９． 先行するいずれかの態様の方法を実行するのに適したキットであって、
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポア（例えば、タグ）を形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品（例えば、チップ、ピペット）、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキット。
－ ２次元材料を形成するための１つまたは複数の試薬、
－ ナノポアを形成するための１つまたは複数の試薬、
－ 修飾されたナノポア（例えば、タグ）を形成するための１つまたは複数の試薬、ならびに
－ 任意選択で、キャリブレータ、緩衝液、添加剤、消耗品（例えば、チップ、ピペット）、評価用アルゴリズム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構成要素、を含むキット。
【0150】
３０． 周波数検出によって目的の分析物を決定するための、態様２９のキットの使用。
【0151】
実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるのであって、限定するものではない。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるのであって、限定するものではない。
【0152】
図１Ａは、本発明の第１の態様による方法を示す。一実施形態による方法を示す。これは、修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）の実験された電流駆動読み出しの一般原理であり、時間依存読み出しが示されている。
【0153】
ナノポア１が設けられ、ナノポア１は２次元材料２（例えば脂質二重層）に埋め込まれ、第１の共振周波数ｆ１を有する。ＡＣ周波数ｆＡＣを有するＡＣ電流。修飾されたナノポア４が設けられ、これは、この場合、修飾によって適合されたナノポア１である。修飾されたナノポア４は、第２の共振周波数ｆ２を有する。修飾されたナノポアまたは修飾されたナノポア－２次元材料の固有周波数付近の周波数を持つ低ＡＣパルスが、印加される。振動のＦＩＤ（自由誘導減衰）は、慣性に基づいている。
【0154】
一例として、開いたナノポア１が、脂質二重層２に電気的に挿入される。ナノポアのトランス側では、緩衝液が、ストレプトアビジンを含む。一定時間後、ビオチン７標識を備えた修飾オリゴヌクレオチド５に共有結合で付着したｆａｂフラグメント３などの目的の分析物が、ナノポアのシス側に適用される。Ｆａｂ－オリゴストレプトアビジン分子がナノポアに入り、ストレプトアビジンに付着し、ナノポアから出ることができなくなる。実験中はずっとＡＣ周波数が印加される。
【0155】
修飾されたナノポア４は、ナノポア１と目的の分析物３を含む。目的の分析物３は、例えばタンパク質または小分子とすることができ、ビオチン５がタグ付けされ得る。ｆＡＣ＞ｆ１＞ｆ２である。
【0156】
次に、第１の周波数と第２の周波数の周波数シフトΔが検出され、周波数シフトΔを用いて目的の分析物が決定される。詳細には、ステップａ）で設けられたナノポアとステップｂ）で設けられた修飾されたナノポアの、時間の関数としての電圧が検出され、ステップｅ）からの第１の周波数、第２の周波数および／または周波数シフトが、例えばフーリエ変換などの移行操作を用いて、時間領域から周波数領域へ計算される。
【0157】
修飾されたナノポアは、以下のように用意され得る：
図１Ｂは、定められた電圧レベルをナノポア内に生成するために使用されるタグを示している。これは、Ｃ３スペーサーとチミジンを含む、またはそれらからなる。原理的には、他のタグ、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドなども可能である。ナノポアは、αヘモリシンまたはその変異体であり得る。原理的には、構築物の「ホスト」となるのに適した他のナノポアも可能である。ポア形成タンパク質の例としては、αヘモリシン、エロリジン、ＭｓｐＡポリンがある。
図１Ｂは、定められた電圧レベルをナノポア内に生成するために使用されるタグを示している。これは、Ｃ３スペーサーとチミジンを含む、またはそれらからなる。原理的には、他のタグ、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドなども可能である。ナノポアは、αヘモリシンまたはその変異体であり得る。原理的には、構築物の「ホスト」となるのに適した他のナノポアも可能である。ポア形成タンパク質の例としては、αヘモリシン、エロリジン、ＭｓｐＡポリンがある。
【0158】
図２は、本発明の第１の態様による方法を示す。図１Ａとは異なり、図２は、２次元材料（例えば、脂質二重層）２に電気的に挿入されたナノポア１に磁気標識（例えば、磁性ナノ粒子）１０が共有結合で付着している手順を説明する。ヘルムホルツコイル９によって印加される交流磁場からの支援により、磁気標識は、二重層内のナノポアに外部切り替え磁場を印加することができる。
【0159】
図３は、外部場（磁場または電場）の影響を受け、それゆえ歪められ、その結果、電流が変化するナノポアのワークフローによる方法を示している。各外部場切り替え事象後の自由誘導減衰１１が、取得される。実験が実行される時間領域（好ましくは秒）は、ＦＦＴなどのデータ処理方法を用いて、周波数領域に変えられる。
【0160】
図４は、本発明の第１の態様による方法を示す。これは、修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）の可能な電流駆動読み出しの一般原理であり、時間依存読み出しが示されている。開いたナノポア１が、脂質二重層２に電気的に挿入される。ＦＡＢ結合部分は、例えばＬ－ＬＮＡ支持体１３によって、ナノポアに共有結合している。実験中はずっとＡＣ周波数が印加される。「ｆａｂ」および「ＦＡＢ」という用語は、交換可能に使用され得る。「ポア」および「ナノポア」という用語は、交換可能に使用され得る。
【0161】
図５Ａは、７７０ＨｚのＡＣ周波数における修飾されたナノポア（脂質二重層内のビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）のＲＡＷ信号（電圧対時間）を示している。ｘ軸は、時間信号として表されている（０は実験の開始に対応し、１０００は実験の終了を表す）。領域Ａは、脂質二重層内の開いたナノポアであり、領域Ｂは、ビオチン－オリゴヌクレオチド－ＦＡＢフラグメント分子の添加であり、領域Ｃは、ストレプトアビジンと結合した領域Ｂで添加された化学物質の定常状態である。図５Ｂは、図５Ａで説明した生の信号をフーリエ変換した後の、図５Ａで説明した領域のそれぞれの信号（振幅対周波数）を示している（ＦＦＴ信号）。４７５Ｈｚ付近に明確なピークが見られ、領域Ａ（４８１．８Ｈｚ）から領域Ｂ（４７７．１Ｈｚ）を経て定常状態の領域Ｃ（４７４．１Ｈｚ）へとシフトしている。領域Ａと領域Ｃの区別が見られる。
【0162】
図６は、図５と同様の実験のＲＡＷ信号（電圧対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。ＦＦＴ解析は、ＦＦＴ解析に使用されるタイムポイントを増やしながら（１００秒から８９０秒まで）行われた。ＦＦＴ信号は変化していないので、ＦＦＴに複数のポイントを使用するか、または得られたＦＦＴスペクトルを乗算することで、スペクトルの品質を向上させることができる。
【0163】
図７Ａは、７７０ＨｚのＡＣ周波数における脂質二重層内の修飾されたナノポア（ビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）のＲＡＷ信号（電圧対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。特定の生データポイントからのＦＦＴスペクトルは、４７２Ｈｚにピークを持つ。
【0164】
図７Ｂは、７７０ＨｚのＡＣ周波数における脂質二重層内の修飾されたナノポア（ビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）のＲＡＷ信号（電圧対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。同じ実験内の図７Ａとは異なるタイムポイントからのＦＦＴスペクトルが、図７Ａと全く同じ４７２Ｈｚのピークを持つ。したがって、ナノポアの定常状態では信号が一定であると仮定できる。
【0165】
【0166】
図８Ａでは、開いたナノポアの領域がＦＦＴ解析で処理されて、開いたポアの信号が４８１Ｈｚで得られる。
【0167】
図８Ｂでは、ビオチンタグがポア内のストレプトアビジンに捕捉されていない開いた／塞がれたナノポア中間体の領域がＦＦＴ解析で処理され、開いたナノポアの信号が４７５Ｈｚで得られる。
【0168】
図８Ｃでは、ビオチンタグＦＡＢ分子が結合せずにポアを離れた開いたナノポアの領域がＦＦＴ解析で処理され、開いたポアの信号が４８１Ｈｚで得られる。
【0169】
【0170】
図９Ａ～図９Ｃは、１ＨｚのＡＣ周波数における脂質二重層内の修飾されたナノポア（ビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）のＲＡＷ信号（電圧対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。図９Ａ～図９ＣのＦＦＴスペクトルは、異なるタイムポイントで示されており、実験の状態を区別するものではなく、脂質二重層内のナノポアのそれぞれの固有周波数も示していない。したがって、駆動周波数＞脂質二重層内のナノポアの固有周波数、であることが必要である。
【0171】
図１０Ａ～図１０Ｂは、１０００ＨｚのＡＣ周波数で駆動される脂質二重層内の修飾されたナノポア（ビオチン－ストレプトアビジン－タンパク質）のＲＡＷ信号（電圧対時間）とＦＦＴ信号（振幅対周波数）を示している。異なるタイムポイント（ＦＡＢ－オリゴ－ビオチン分子がポアの上を流れる前と流れた後）における図１０Ａ～図１０ＢのＦＦＴスペクトルは、実験の状態（ＦＡＢ－オリゴ－ビオチン分子を流す前と流した後）を区別することができない。これは、それぞれのＦＡＢ－オリゴ－ビオチン分子が流れる前と流れた後で、約５２４Ｈｚの同じ周波数が観測されていることで表現されている。それゆえ、この場合、ＦＡＢ－オリゴ－ビオチン分子はナノポア内に格納されていないにもかかわらず、脂質二重層内のナノポアは、約５２４Ｈｚでそれぞれの固有周波数を表している。
【0172】
本特許出願は、欧州特許出願２１２１０２１６．４号の優先権を主張し、この欧州特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【符号の説明】
【0173】
１ ナノポア
２ ２次元材料
３ 目的の分析物または分析物バインダー（例えば、ＦＡＢフラグメント）
４ 修飾されたナノポア
５ ポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）
６ ストレプトアビジン
７ アンカータグ（例えば、ビオチン）
８ 電気接点
９ ヘルムホルツコイル
１０ 磁気タグ（例えば、磁性ナノ粒子）
１１ 自由誘導減衰
１２ ポリマー（例えば、ＤＮＡおよび／またはタンパク質）間の共有結合
１３ リジッドポリマー（例えば、ＤＮＡ）
２ ２次元材料
３ 目的の分析物または分析物バインダー（例えば、ＦＡＢフラグメント）
４ 修飾されたナノポア
５ ポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）
６ ストレプトアビジン
７ アンカータグ（例えば、ビオチン）
８ 電気接点
９ ヘルムホルツコイル
１０ 磁気タグ（例えば、磁性ナノ粒子）
１１ 自由誘導減衰
１２ ポリマー（例えば、ＤＮＡおよび／またはタンパク質）間の共有結合
１３ リジッドポリマー（例えば、ＤＮＡ）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6-1】
【図6-2】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【国際調査報告】