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特表2024-542623真菌細胞におけるタンパク質生産を増強するための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-15
(54)【発明の名称】真菌細胞におけるタンパク質生産を増強するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/15 20060101AFI20241108BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241108BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20241108BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241108BHJP
C12N 9/42 20060101ALN20241108BHJP
【ＦＩ】
C12N1/15 ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/56
C12N15/31
C12N9/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531680
(86)(22)【出願日】2022-11-11
(85)【翻訳文提出日】2024-05-28
(86)【国際出願番号】 US2022079686
(87)【国際公開番号】W WO2023102315
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】63/284,875
(32)【優先日】2021-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509240479
【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク
(74)【代理人】
【識別番号】110003579
【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(72)【発明者】
【氏名】コザック、バーバラ ウルシュラ
(72)【発明者】
【氏名】ニコラエフ、イゴール
(72)【発明者】
【氏名】パルマー、ジョナサン エム
(72)【発明者】
【氏名】バーエンド、シャリーフ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA57X
4B065AA70X
4B065AB01
4B065BA02
4B065BD50
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA47
4B065CA60
(57)【要約】
本開示は、一般に、目的タンパク質（ポリペプチド）の商業規模生産に使用するための組換え真菌株に関する。特定の実施形態は、本開示の１つ以上の天然の（内因性）調節タンパク質の生産及び／又は１つ以上の調節タンパク質を過剰発現が欠損した組換え真菌株に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
表１に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【請求項2】
表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞。
【請求項3】
表１に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含み、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【請求項4】
前記細胞が、表１に記載のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している、請求項１又は請求項３に記載の組換え真菌細胞。
【請求項5】
目的タンパク質を発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
【請求項6】
表１０に示されるタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む調節タンパク質をコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）プロモーターを含むポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含む組換え真菌細胞。
【請求項8】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、内因性目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する組換え真菌細胞。
【請求項9】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、異種目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする少なくとも１つの導入カセットを発現する組換え真菌細胞。
【請求項10】
前記導入カセットが、前記異種ＰＯＩをコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーターを含む、請求項９に記載の組換え真菌細胞。
【請求項11】
表１に示される調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産において前記組換え細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
【請求項12】
前記内因性ＰＯＩがセルラーゼである、請求項８に記載の組換え真菌細胞。
【請求項13】
前記異種ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質及び免疫原性タンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の組換え真菌細胞。
【請求項14】
セルラーゼの生産を増強するための方法であって、（ａ）セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
工程の前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、方法。
【請求項15】
前記組換え細胞が、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質をコードする１つ以上の導入ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
セルラーゼの生産を増強するための方法であって、（ａ）セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現するその組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
工程の前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、方法。
【請求項17】
前記組換え細胞が、表１の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産において前記細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記セルラーゼが、セロビオヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
目的タンパク質（ＰＯＩ）の生産を増強するための方法であって、（ａ）ＰＯＩをコードする発現カセットを親真菌細胞に導入し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量の前記ＰＯＩを生産する、方法。
【請求項20】
前記ＰＯＩをコードする前記カセットが、前記ＰＯＩをコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質及び免疫原性タンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２８４，８７５号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２８４，８７５号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に、分子生物学、生化学、調節タンパク質、工業発酵、タンパク質生産、糸状真菌などの分野に関する。本開示の特定の実施形態は、目的タンパク質の生産増強に使用するための変異真菌細胞及びその方法に関する。
【0003】
配列表
ここで提出する配列表のテキストファイルには、２０２２年１１月１１日に作成されたファイル「ＮＢ４１５７５－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」が含まれており、サイズは２２８キロバイト（ＫＢ）である。この配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に適合しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ここで提出する配列表のテキストファイルには、２０２２年１１月１１日に作成されたファイル「ＮＢ４１５７５－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」が含まれており、サイズは２２８キロバイト（ＫＢ）である。この配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に適合しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、ペクチナーゼなどの加水分解酵素を分解するバイオポリマーの多くは、食品、飼料、繊維、パルプ及び紙産業などにおけるその潜在的な用途のために注目されている。例えば、工業用糸状真菌生産株、特にアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株は、これらの細胞外酵素を大量に生産することができる。同様に、過剰分泌株及びセルラーゼ（遺伝子）プロモーターなどの強力なプロモーターの存在は、糸状真菌細胞を異種タンパク質生産に特に適したものにする。
【0005】
したがって、糸状真菌は、天然の及び異種タンパク質を高レベルで発現することができ、工業、医薬品、動物の健康、及び食品及び飲料用途などのための酵素及び他のタンパク質の大規模生産によく適している。糸状真菌株に関する当技術分野における現在の知識にもかかわらず、目的タンパク質の生産に使用するための改良された菌株が当技術分野において連続的且つ継続的に必要とされている。本明細書に記載されるように、本開示の組換え糸状真菌株は、目的の内因性及び／又は異種タンパク質の生産を増強するための工業規模の発酵プロセスにおける使用によく適している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書に記載されるように、本開示は、とりわけ、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え（遺伝子改変）糸状真菌株、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損し、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、目的タンパク質を生産する組換え真菌株などを構築、取得、スクリーニング、同定するための組成物及び方法を提供する。したがって、特定の実施形態は、とりわけ、表１に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞（株）、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞、表１に記載の１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損し、表１０に記載の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞などに関する。
【0007】
他の態様では、組換え真菌細胞が目的タンパク質を発現する。特定の実施形態では、目的タンパク質は、酵素、ペプチド、抗体及び／又はその機能的抗体断片、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質、免疫原性タンパク質などを含むが、これらに限定されない。したがって、本開示の特定の他の態様は、とりわけ、増強されたタンパク質生産特性／表現型、例えば総タンパク質生産、酵素活性、セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解、タンパク質生産速度などを含む組換え真菌株を構築、取得、スクリーニング、同定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A-1H】図１は、特定のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、以下の実施例のセクションに記載の糸状真菌調節タンパク質欠失ライブラリーで同定された調節タンパク質のアミノ酸配列を示す。より具体的には、図１Ａに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿４９３３」は、配列番号３に示されるように、配列番号２の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＮＡ結合ドメイン（以下、「ＤＢＤ」という）部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿５６７５」は、配列番号６に示されるように、配列番号５の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿４８４３８」は、配列番号９に示されるように、配列番号８の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿４９２３２」は、配列番号１２に示されるように、配列番号１１の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｂに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿５５１０５」は、配列番号１５に示されるように、配列番号１４の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６０５６５」は、配列番号１８に示されるように、配列番号１７の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６０９３１」は、配列番号２１に示されるように、配列番号２０の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｃに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６７２０９」は、配列番号２４に示されるように、配列番号２３の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６８０９７」は、配列番号２７に示されるように、配列番号２６の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６８４２５」は、配列番号３０に示されるように、配列番号２９の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｄに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿６９６９５」は、配列番号３３に示されるように、配列番号３２の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７１８２３」は、配列番号３６に示されるように、配列番号３５の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７２９９３」は、配列番号３９に示されるように、配列番号３８の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｅに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７６７０５」は、配列番号４２に示されるように、配列番号４１の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２」は、配列番号４５に示されるように、配列番号４４の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７７２９１」は、配列番号４８に示されるように、配列番号４７の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿７８１６２」は、配列番号５１に示されるように、配列番号５０の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｆに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１０３１２２」は、配列番号５４に示されるように、配列番号５３の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５２３９」は、配列番号５７に示されるように、配列番号５６の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５８４９」は、配列番号６０に示されるように、配列番号５９の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１０８０１３」は、配列番号６３に示されるように、配列番号６２の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｇに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１０８７７５」は、配列番号６６に示されるように、配列番号６５の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１１９９８６」は、配列番号６９に示されるように、配列番号６８の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１２０４２８」は、配列番号７２に示されるように、配列番号７１の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。図１Ｈに示されるように、調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１２０５９７」は、配列番号７５に示されるように、配列番号７４の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１２１７５７」は、配列番号７８に示されるように、配列番号７７の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む；及び調節タンパク質「Ｔｒｉｒｅ２＿１２２７８３」は、配列番号８０に示されるように、配列番号８１の予測される全長アミノ酸配列及びその中の予測されるＤＢＤ部分配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【0009】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４９３３（ＰＩＤ ４９３３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）核酸（ＤＮＡ）配列である。
配列番号１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４９３３（ＰＩＤ ４９３３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）核酸（ＤＮＡ）配列である。
【0010】
配列番号２は、配列番号１の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿４９３３（ＰＩＤ ４９３３）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0011】
配列番号３は、配列番号２のＴｒｉｒｅ２＿４９３３（ＰＩＤ ４９３３）調節タンパク質に存在する推定ＤＮＡ結合ドメイン（以下、「ＤＢＤ」という。）のアミノ酸配列である。
【0012】
配列番号４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５６７５（ＰＩＤ ５６７５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0013】
配列番号５は、配列番号４の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿５６７５（ＰＩＤ ５６７５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0014】
配列番号６は、配列番号５のＴｒｉｒｅ２＿５６７５（ＰＩＤ ５６７５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0015】
配列番号７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４８４３８（ＰＩＤ ４８４３８）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0016】
配列番号８は、配列番号７の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿４８４３８（ＰＩＤ ４８４３８）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0017】
配列番号９は、配列番号８のＴｒｉｒｅ２＿４８４３８（ＰＩＤ ４８４３８）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0018】
配列番号１０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４９２３２（ＰＩＤ ４９２３２）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0019】
配列番号１１は、配列番号１０の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿４９２３２（ＰＩＤ ４９２３２）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0020】
配列番号１２は、配列番号１１のＴｒｉｒｅ２＿４９２３２（ＰＩＤ ４９２３２）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0021】
配列番号１３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５５１０５（ＰＩＤ ５５１０５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0022】
配列番号１４は、配列番号１３の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿５５１０５（ＰＩＤ ５５１０５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0023】
配列番号１５は、配列番号１４のＴｒｉｒｅ２＿５５１０５（ＰＩＤ ５５１０５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0024】
配列番号１６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６０５６５（ＰＩＤ ６０５６５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0025】
配列番号１７は、配列番号１６の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６０５６５（ＰＩＤ ６０５６５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0026】
配列番号１８は、配列番号１７のＴｒｉｒｅ２＿６０５６５（ＰＩＤ ６０５６５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0027】
配列番号１９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６０９３１（ＰＩＤ ６０９３１）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0028】
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６０９３１（ＰＩＤ ６０９３１）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0029】
配列番号２１は、配列番号２０のＴｒｉｒｅ２＿６０９３１（ＰＩＤ ６０９３１）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0030】
配列番号２２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６７２０９（ＰＩＤ ６７２０９）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0031】
配列番号２３は、配列番号２２の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６７２０９（ＰＩＤ ６７２０９）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0032】
配列番号２４は、配列番号２３のＴｒｉｒｅ２＿６７２０９（ＰＩＤ ６７２０９）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0033】
配列番号２５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６８０９７（ＰＩＤ ６８０９７）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0034】
配列番号２６は、配列番号２５の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６８０９７（ＰＩＤ ６８０９７）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0035】
配列番号２７は、配列番号２６のＴｒｉｒｅ２＿６８０９７（ＰＩＤ ６８０９７）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0036】
配列番号２８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６８４２５（ＰＩＤ ６８４２５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0037】
配列番号２９は、配列番号２８の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６８４２５（ＰＩＤ ６８４２５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0038】
配列番号３０は、配列番号２９のＴｒｉｒｅ２＿６８４２５（ＰＩＤ ６８４２５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0039】
配列番号３１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６９６９５（ＰＩＤ ６９６９５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0040】
配列番号３２は、配列番号３１の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿６９６９５（ＰＩＤ ６９６９５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0041】
配列番号３３は、配列番号３２のＴｒｉｒｅ２＿６９６９５（ＰＩＤ ６９６９５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0042】
配列番号３４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７１８２３（ＰＩＤ ７１８２３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0043】
配列番号３５は、配列番号３４の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７１８２３（ＰＩＤ ７１８２３）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0044】
配列番号３６は、配列番号３５のＴｒｉｒｅ２＿７１８２３（ＰＩＤ ７１８２３）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0045】
配列番号３７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７２９９３（ＰＩＤ ７２９９３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0046】
配列番号３８は、配列番号３７の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７２９９３（ＰＩＤ ７２９９３）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0047】
配列番号３９は、配列番号３８のＴｒｉｒｅ２＿７２９９３（ＰＩＤ ７２９９３）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0048】
配列番号４０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７６７０５（ＰＩＤ ７６７０５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0049】
配列番号４１は、配列番号４０の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７６７０５（ＰＩＤ ７６７０５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0050】
配列番号４２は、配列番号４１のＴｒｉｒｅ２＿７６７０５（ＰＩＤ ７６７０５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0051】
配列番号４３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（ＰＩＤ ７６８７２）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0052】
配列番号４４は、配列番号４３の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７６８７２（ＰＩＤ ７６８７２）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0053】
配列番号４５は、配列番号４４のＴｒｉｒｅ２＿７６８７２（ＰＩＤ ７６８７２）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0054】
配列番号４６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７７２９１（ＰＩＤ ７７２９１）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0055】
配列番号４７は、配列番号４６の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７７２９１（ＰＩＤ ７７２９１）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0056】
配列番号４８は、配列番号４７のＴｒｉｒｅ２＿７７２９１（ＰＩＤ ７７２９１）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0057】
配列番号４９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７８１６２（ＰＩＤ ７８１６２）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0058】
配列番号５０は、配列番号４９の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿７８１６２（ＰＩＤ ７８１６２）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0059】
配列番号５１は、配列番号５０のＴｒｉｒｅ２＿７８１６２（ＰＩＤ ７８１６２）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0060】
配列番号５２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０３１２２（ＰＩＤ １０３１２２）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0061】
配列番号５３は、配列番号５２の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１０３１２２（ＰＩＤ １０３１２２）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0062】
配列番号５４は、配列番号５３のＴｒｉｒｅ２＿１０３１２２（ＰＩＤ １０３１２２）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0063】
配列番号５５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５２３９（ＰＩＤ １０５２３９）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0064】
配列番号５６は、配列番号５５の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１０５２３９（ＰＩＤ １０５２３９）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0065】
配列番号５７は、配列番号５６のＴｒｉｒｅ２＿１０５２３９（ＰＩＤ １０５２３９）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0066】
配列番号５８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５８４９（ＰＩＤ １０５８４９）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0067】
配列番号５９は、配列番号５８の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１０５８４９（ＰＩＤ １０５８４９）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0068】
配列番号６０は、配列番号５９のＴｒｉｒｅ２＿１０５８４９（ＰＩＤ １０５８４９）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0069】
配列番号６１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０８０１３（ＰＩＤ １０８０１３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0070】
配列番号６２は、配列番号６１の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１０８０１３（ＰＩＤ １０８０１３）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0071】
配列番号６３は、配列番号６２のＴｒｉｒｅ２＿１０８０１３（ＰＩＤ １０８０１３）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0072】
配列番号６４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０８７７５（ＰＩＤ １０８７７５）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0073】
配列番号６５は、配列番号６４の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１０８７７５（ＰＩＤ １０８７７５）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0074】
配列番号６６は、配列番号６５のＴｒｉｒｅ２＿１０８７７５（ＰＩＤ １０８７７５）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0075】
配列番号６７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１１９９８６（ＰＩＤ １１９９８６）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0076】
配列番号６８は、配列番号６７の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１１９９８６（ＰＩＤ １１９９８６）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0077】
配列番号６９は、配列番号６８のＴｒｉｒｅ２＿１１９９８６（ＰＩＤ １１９９８６）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0078】
配列番号７０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２０４２８（ＰＩＤ １２０４２８）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0079】
配列番号７１は、配列番号７０の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１２０４２８（ＰＩＤ １２０４２８）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0080】
配列番号７２は、配列番号７１のＴｒｉｒｅ２＿１２０４２８（ＰＩＤ １２０４２８）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0081】
配列番号７３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２０５９７（ＰＩＤ １２０５９７）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0082】
配列番号７４は、配列番号７３の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１２０５９７（ＰＩＤ １２０５９７）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0083】
配列番号７５は、配列番号７４のＴｒｉｒｅ２＿１２０５９７（ＰＩＤ １２０５９７）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0084】
配列番号７６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２１７５７（ＰＩＤ １２１７５７）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0085】
配列番号７７は、配列番号７９の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１２１７５７（ＰＩＤ １２１７５７）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0086】
配列番号７８は、配列番号８０のＴｒｉｒｅ２＿１２１７５７（ＰＩＤ １２１７５７）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0087】
配列番号７９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２２７８３（ＰＩＤ １２２７８３）」と名付けられた調節タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【0088】
配列番号８０は、配列番号７９の核酸配列によってコードされるＴｒｉｒｅ２＿１２２７８３（ＰＩＤ １２２７８３）調節タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。
【0089】
配列番号８１は、配列番号８０のＴｒｉｒｅ２＿１２２７８３（ＰＩＤ １２２７８３）調節タンパク質を提示する推定ＤＢＤのアミノ酸配列である。
【0090】
配列番号８２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１９４１（ＰＩＤ １９４１）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0091】
配列番号８３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿２１４８（ＰＩＤ ２１４８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0092】
配列番号８４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿３６０５（ＰＩＤ ３６０５）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0093】
配列番号８５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４７４８（ＰＩＤ ４７４８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0094】
配列番号８６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５６６４（ＰＩＤ ５６６４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0095】
配列番号８７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５９２７（ＰＩＤ ５９２７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0096】
配列番号８８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿２１９９７（ＰＩＤ ２１９９７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0097】
配列番号８９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿２２７７４（ＰＩＤ ２２７７４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0098】
配列番号９０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿２２７８５（ＰＩＤ ２２７８５）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0099】
配列番号９１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿３６７０３（ＰＩＤ ３６７０３）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0100】
配列番号９２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４４２９０（ＰＩＤ ４４２９０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0101】
配列番号９３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４４７８１（ＰＩＤ ４４７８１）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0102】
配列番号９４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４５８６６（ＰＩＤ ４５８６６）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0103】
配列番号９５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４８７７３（ＰＩＤ ４８７７３）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0104】
配列番号９６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿４９９１８（ＰＩＤ ４９９１８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0105】
配列番号９７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５２４３８（ＰＩＤ ５２４３８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0106】
配列番号９８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５２９２４（ＰＩＤ ５２９２４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0107】
配列番号９９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５３１０６（ＰＩＤ ５３１０６）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0108】
配列番号１００は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５３４８４（ＰＩＤ ５３４８４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0109】
配列番号１０１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５５２７４（ＰＩＤ ５５２７４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0110】
配列番号１０２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５６２１４（ＰＩＤ ５６２１４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0111】
配列番号１０３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５８１３０（ＰＩＤ ５８１３０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0112】
配列番号１０４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５９３５３（ＰＩＤ ５９３５３）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0113】
配列番号１０５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿５９６０９（ＰＩＤ ５９６０９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0114】
配列番号１０６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６０５５８（ＰＩＤ ６０５５８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0115】
配列番号１０７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６１４７６（ＰＩＤ ６１４７６）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0116】
配列番号１０８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６５０７０（ＰＩＤ ６５０７０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0117】
配列番号１０９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６５８９５（ＰＩＤ ６５８９５）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0118】
配列番号１１０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿６８０２８（ＰＩＤ ６８０２８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0119】
配列番号１１１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７０４１４（ＰＩＤ ７０４１４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0120】
配列番号１１２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７０９９１（ＰＩＤ ７０９９１）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0121】
配列番号１１３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７１０８０（ＰＩＤ ７１０８０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0122】
配列番号１１４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７１６８９（ＰＩＤ ７１６８９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0123】
配列番号１１５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７２０７６（ＰＩＤ ７２０７６）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0124】
配列番号１１６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７３４１７（ＰＩＤ ７３４１７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0125】
配列番号１１７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７３５５９（ＰＩＤ ７３５５９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0126】
配列番号１１８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７３６８９（ＰＩＤ ７３６８９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0127】
配列番号１１９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７６０３９（ＰＩＤ ７６０３９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0128】
配列番号１２０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７６５９０（ＰＩＤ ７６５９０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0129】
配列番号１２１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿７７８７８（ＰＩＤ ７７８７８）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0130】
配列番号１２２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５７８４４（ＰＩＤ １０５７８４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0131】
配列番号１２３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５８８０（ＰＩＤ １０５８８０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0132】
配列番号１２４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９１７（ＰＩＤ １０５９１７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0133】
配列番号１２５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９８０（ＰＩＤ １０５９８０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0134】
配列番号１２６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９８９（ＰＩＤ １０５９８９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0135】
配列番号１２７は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０６００９（ＰＩＤ １０６００９）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0136】
配列番号１２８は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０６７２０（ＰＩＤ １０６７２０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0137】
配列番号１２９は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１０９２７７（ＰＩＤ １０９２７７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0138】
配列番号１３０は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１１０９０１（ＰＩＤ １１０９０１）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0139】
配列番号１３１は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１１９８２６（ＰＩＤ １１９８２６）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0140】
配列番号１３２は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２１１６４（ＰＩＤ １２１１６４）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0141】
配列番号１３３は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２１３１０（ＰＩＤ １２１３１０）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0142】
配列番号１３４は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２１６０２（ＰＩＤ １２１６０２）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0143】
配列番号１３５は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２２４５７（ＰＩＤ １２２４５７）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0144】
配列番号１３６は、「Ｔｒｉｒｅ２＿１２３７１３（ＰＩＤ １２３７１３）」という名称の調節タンパク質の予測アミノ酸配列である。
【0145】
Ｉ．概要
本明細書に記載されるように、本開示の特定の実施形態は、目的タンパク質の商業規模生産に使用するための変異（組換え）真菌細胞（株）に関する。したがって、特定の態様は、目的タンパク質を発現する組換え真菌株を構築及び取得するための組成物及び方法に関する。特定の態様では、本明細書に記載されるように、本開示は、とりわけ、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え（遺伝子改変）糸状真菌株、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損し、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、目的タンパク質を生産する組換え真菌株などを構築、取得、スクリーニング、同定するための組成物及び方法を提供する。
本明細書に記載されるように、本開示の特定の実施形態は、目的タンパク質の商業規模生産に使用するための変異（組換え）真菌細胞（株）に関する。したがって、特定の態様は、目的タンパク質を発現する組換え真菌株を構築及び取得するための組成物及び方法に関する。特定の態様では、本明細書に記載されるように、本開示は、とりわけ、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え（遺伝子改変）糸状真菌株、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、特定の天然調節タンパク質の生産が欠損し、天然調節タンパク質をコードする特定の遺伝子を過剰発現する組換え真菌株、目的タンパク質を生産する組換え真菌株などを構築、取得、スクリーニング、同定するための組成物及び方法を提供する。
【0146】
ＩＩ．定義
本株、組成物及び方法をさらに詳細に説明する前に、以下の用語及び語句を定義する。定義されない用語は、使用され、且つ当業者に知られている通常の意味と一致すべきである。
本株、組成物及び方法をさらに詳細に説明する前に、以下の用語及び語句を定義する。定義されない用語は、使用され、且つ当業者に知られている通常の意味と一致すべきである。
【0147】
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0148】
ある範囲の値が示されている場合、文脈上別段の明確な指示がなければ、その範囲の上限と下限の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値、及びその範囲内の任意の他の記載された値又は介在値は、本組成物及び方法の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ、また、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、本発明の組成物及び方法に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限界の一方又は両方を除く範囲もまた、本発明の組成物及び方法に含まれる。
【0149】
本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書においては、「約」という用語は、これが先行する正確な数、及び、この用語が先行する数に近い数又は近似する数に対するリテラルサポートを提供するために使用される。数字が具体的に挙げられた数に近い又は近似するかを決定する際に、挙げられていない近い又は近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に挙げられた数の実質的に等価な数を提供する数であり得る。例えば、数値に関連して「約」という用語は、その用語が文脈において特に明確に定義されていない限り、その数値の－１０％～＋１０％の範囲を指す。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４～６．６のｐＨ値を意味する。
【0150】
この発明を実施するための形態によると、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量（ｔｈｅ ｄｏｓａｇｅ）」という言及は、１つ以上の用量及び当業者には既知のその同等物を含むなどである。
【0151】
特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。例えば、特定の実施形態では、「培地が誘導基質を含まない」という条件は、セルロース、ラクトース、ゲンチビオース、ソホロースなどの誘導基質を除外するために使用され得る。
【0152】
さらに、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分を「含むが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することに留意されたい。用語「含む」の後の成分は必要とされ、又は必須であるが、この成分を含む組成物は、その他の非必須又は任意選択の成分をさらに含み得る。
【0153】
「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語は、本明細書で使用されるとき、「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語の後の成分を「含み、且つそれに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することに留意されたい。したがって、用語「からなる」の後の成分は必要とされ、又は必須であり、その他の成分はその組成物中に存在しない。
【0154】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他の一部の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【0155】
本明細書で使用されるとき、「子嚢菌真菌細胞」という用語は、菌界における子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の任意の生物を指す。子嚢菌真菌細胞の例には、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種などのチャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門内の糸状真菌が含まれるが、それらに限定されない。
【0156】
本明細書で使用されるとき、「糸状真菌」は、真菌植物（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門及び卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の全ての糸状真菌形を指す。例えば、糸状真菌には、限定されないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種が含まれる。
【0157】
特定の実施形態では、糸状真菌には、限定されないが、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅを含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種細胞（株）が含まれる。当業者に知られているように、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）は、以前に「Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ」として分類された。
【0158】
他の実施形態では、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ等のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞（株）である。
【0159】
本明細書で使用されるとき、「野生型」及び「天然の」という用語は、互換的に使用され、そして天然に見出されるような遺伝子、タンパク質、真菌細胞又は菌株を指す。
【0160】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え」又は「非天然」は、少なくとも１つの遺伝子改変を有する、又は異種核酸分子の導入によって改変された生物、微生物、細胞、核酸分子、若しくはベクターを指すか、又は異種若しくは内因性核酸分子若しくは遺伝子の発現を制御できるように改変された細胞（例えば、微生物細胞）を指す。組換えはまた、非天然細胞に由来するか、又は１つ以上のそのような改変を有する非天然細胞の子孫である細胞を指す。遺伝子改変には、例えば、タンパク質をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、又は細胞の遺伝物質の他の核酸分子の付加、欠失、置換若しくは他の機能的変化が含まれる。例えば、組換え細胞は、天然の（野生型）細胞内で同一又は相同な形態では見られない遺伝子又は他の核酸分子を発現し得るか、又は内因性遺伝子の変化した発現パターン、例えば過剰発現される、過少発現される、最小限発現される、又は全く発現されないなどを提供し得る。
【0161】
「組み換え」、「組み換える（こと）」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であり、この集合体は、キメラ遺伝子又はポリヌクレオチドを発生させる。
【0162】
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡの発現をコード且つ指示する核酸を指す用語「対立遺伝子」と同義である。糸状真菌の栄養型は一般に一倍体であり、このため特定の表現型を付与するには、特定の遺伝子の単一コピー（即ち、単一の対立遺伝子）で十分である。
【0163】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド（タンパク質）鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コーディング領域の前後の領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列、３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、プロモーター配列、ターミネーター配列など）並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。例えば、目的の遺伝子（ＤＮＡ）配列（ＧＯＩ）は、調節タンパク質、構造タンパク質、商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチド、例えば酵素（例えば、プロテアーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ、リパーゼ）などをコードし得る。目的遺伝子は、天然に存在する遺伝子、変異（改変）遺伝子又は合成遺伝子であり得る。
【0164】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、下流の遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ；又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは一般に、標的遺伝子が発現している宿主細胞（例えば、真菌細胞）に適切である。プロモーターは他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、所与の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、コアプロモーター及びエンハンサー又は活性化因子又はリプレッサー配列を含むプロモーター及びターミネーター配列、転写及び翻訳開始及び停止配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、調整可能なプロモーター、合成プロモーター、タンデムプロモーター及びそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、誘導性プロモーターは、誘導性セルラーゼ遺伝子プロモーターである。
【0165】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター活性」という用語は、核酸が宿主細胞中の下流（３’）ポリヌクレオチドの転写を指示する能力である。プロモーター活性を試験するために、（プロモーター）核酸を下流ポリヌクレオチドに作動可能に連結して組換え核酸を産生することができる。組換え核酸を細胞に導入し、ポリヌクレオチドの転写を評価してもよい。ある特定の場合において、ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしてよく、ポリヌクレオチドの転写は、細胞におけるタンパク質の生産を査定することによって評価され得る。
【0166】
本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の核酸配列間の機能的連結を指す。したがって、核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係に置かれたときに作動可能に連結される。例えば、プロモーター配列又はターミネーター配列は、それがＣＤＳの転写に影響を及ぼす場合、遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）に作動可能に連結される。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結されている。分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードする核酸配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ（核酸）配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、且つリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。２つ以上の核酸配列（すなわち、作動可能に連結する）を連結することは、当業者に対する方法のいずれかを使用して達成される。
【0167】
本明細書で使用されるとき、例示的な親トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株には、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａ（ＡＴＣＣ（登録商標）１３６３１）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ－Ｐ３７（ＮＲＲＬ寄託番号１５７０９）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ－Ｃ３０（ＡＴＣＣ（登録商標）５６７６５）が含まれるが、これらに限定されない。例示的な親アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株としては、限定されないが、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株ＡＴＣＣ（登録商標）１０１５が挙げられる。例示的な親アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）株としては、限定されないが、Ａ．オリゼー株ＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ（登録商標）４２１４９）が挙げられる。及び例示的な親マイセリオフィソラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）株としては、限定されないが、Ｍ．サーモフィル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）株ＡＴＣＣ（登録商標）４２４６４が挙げられる。
【0168】
例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株Ｒｕｔ－Ｃ３０及びＲＬ－Ｐ３７は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）自然分離株ＱＭ６ａ（Ｌｅ Ｃｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ及びＭｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、１９８４年）の変異誘発誘導体であり、ＮＧ１４株は最後の共通祖先である。本開示の特定の態様では、例示的な糸状真菌株は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ－Ｐ３７から誘導／得られ、Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ及びＭｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ（１９８４）並びに国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレットによって一般的に記載されているように、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子（以下、「Δｐｙｒ２」と略す）の欠失を含む。
【0169】
本明細書で使用されるとき、「リグノセルロース分解酵素」、「セルラーゼ酵素」、及び「セルラーゼ」という語句は、互換的に使用され、セルロース（ヘミセルロース）のグリコシド結合を加水分解して糖（例えば、グルコース．、キシロース、アラビノース等）を生成する、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ－グルコシダーゼなどのグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）酵素を含む。
【0170】
本明細書で使用されるとき、「エンドグルカナーゼ」タンパク質は「ＥＧ」と省略されてもよく、「セロビオヒドロラーゼ」タンパク質は「ＣＢＨ」と省略されてもよく、「β－グルコシダーゼ」タンパク質は「ＢＧ」と省略されてもよく、「キシラナーゼ」タンパク質は「ＸＹＬ」と省略されてもよい。したがって、本明細書で使用されるとき、ＥＧタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は「ｅｇ」と省略されてもよく、ＣＢＨタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は「ｃｂｈ」と省略されてもよく、ＢＧタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は「ｂｇ」と省略されてもよく、ＸＹＬタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は「ｘｙｌ」と省略されてもよい。ある特定の実施形態において、セロビオヒドロラーゼには、酵素委員会番号（ＥＣ３．２．１．９１）に分類される酵素が含まれ、エンドグルカナーゼには、ＥＣ３．２．１．４に分類される酵素が含まれ、エンド－β－１，４－キシラナーゼには、ＥＣ３．２．１．８に分類される酵素が含まれ、β－キシロシダーゼには、ＥＣ３．２．１．３７に分類される酵素が含まれ、β－グルコシダーゼには、ＥＣ３．２．１．２１に分類される酵素が含まれる。
【0171】
本明細書で使用されるとき、「セルラーゼ遺伝子プロモーター」には、セロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）遺伝子プロモーター配列、エンドグルカナーゼ（例えば）遺伝子プロモーター配列、β－グルコシダーゼ（ｂｇ）遺伝子プロモーター配列、キシラナーゼ（ｘｙｌ）遺伝子プロモーター配列などが含まれるが、これらに限定されない。
【0172】
本明細書で使用されるとき、用語「改変」及び「遺伝子改変」は互換的に使用され、以下を含む：（ａ）遺伝子における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子の転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御及び／若しくは上方制御、（ｆ）本明細書に開示される任意の１つ以上の遺伝子／ＤＮＡ配列の特異的突然変異誘発及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発。
【0173】
本明細書で使用されるとき、「改変糸状真菌細胞」、「変異糸状真菌細胞」、「組換え真菌細胞」、「改変糸状真菌株」などの語句は、互換的に使用され得、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ ｓｕｂｐｈｙｌｕｍに属する親糸状真菌細胞に由来する（すなわち、得られる）糸状真菌細胞を指す。例えば、「改変された」糸状真菌細胞は、親糸状真菌細胞から誘導（得）されてよく、改変された細胞は、親細胞には見られない少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
【0174】
本明細書で使用されるとき、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物、すなわち、一般的にはタンパク質を生産するために、細胞成分が使用し得る遺伝子である。対照的に、「非機能性遺伝子」は、活性遺伝子産物（すなわち、機能性タンパク質）を生産するために細胞成分によって使用することができないか、又は活性遺伝子産物（すなわち、機能性タンパク質）を生産するために細胞成分によって使用される能力が低下している。
【0175】
本明細書で使用されるとき、「機能性タンパク質」は、酵素機能／活性、結合機能／活性（例えば、ＤＮＡ結合）、表面活性特性などの機能又は活性を有し、その機能／活性を消失又は減少させるように変異誘発、切断又は他の方法で改変されていないタンパク質である。
【0176】
本明細書で使用されるとき、「調節遺伝子」は、その機能が真菌宿主によるタンパク質の生産に影響を及ぼす遺伝子である。本開示の特定の態様では、調節遺伝子（調節タンパク質をコードする）の過剰発現は、糸状真菌（宿主）細胞によるタンパク質生産に影響を及ぼす。「調節遺伝子」は、「調節タンパク質」をコードする。
【0177】
本明細書で使用されるとき、「調節タンパク質」には、転写因子タンパク質、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、ヒストン改変又はクロマチンリモデリングに関与するタンパク質、及び遺伝子又はタンパク質活性の調節に関連する同様の機能が含まれるが、これらに限定されない。
【0178】
より具体的には、本明細書で使用されるとき、用語「調節遺伝子」、「調節タンパク質」及び／又は他の「遺伝子転写調節タンパク質」は、限定することを意味するものではなく、むしろ本開示の例示的な遺伝子及び／又はタンパク質を分類、特徴付け及び／又は同定するのを助けるために本明細書で使用される。したがって、以下のセクションＩＩＩ及び以下の実施例でさらに特定されるように、本開示のＤＮＡ及び／又はタンパク質（ＰＲＴ）配列は、全体的なタンパク質機能にかかわらず、本明細書では特に調節遺伝子及び／又は調節タンパク質と呼ばれる。例えば、表１、表１０及び／又は表１６に記載の調節タンパク質は、１つ以上の代謝経路活性などに関与するタンパク質（例えば、酵素）を（例えば、経路のボトルネックを緩和するなどのために）含んでよく、そのようなタンパク質（酵素）は、全体的なタンパク質機能にかかわらず、本明細書では調節タンパク質と呼ばれ得る。
【0179】
さらに詳述し、以下に記載するように、本開示の特定の態様は、変異真菌細胞を本開示の１つ以上の調節タンパク質の生産において欠損させる遺伝子改変に関する。より具体的には、以下の実施例２～４（表１を参照されたい）に記載されるように、表１の１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損した変異真菌細胞は、タンパク質生産特性／表現型の増強を含む（例えば、総タンパク質生産、酵素活性、セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解、タンパク質生産速度など）。
【0180】
さらに詳述し、以下に記載するように、本開示の特定の態様は、調節タンパク質をコードする特定の調節遺伝子の過剰発現（過剰発現）に関する。本明細書で使用されるとき、調節タンパク質をコードする遺伝子の「過剰発現」（略して「ＯＥ」）は、例えば、調節タンパク質をコードする特定の遺伝子の追加のコピー（又は複数のコピー）を真菌宿主に導入することによって、又は調節タンパク質をコードする遺伝子を異種プロモーターの制御下で発現させて遺伝子の発現を増加させることによって、又はそうでなければ遺伝子がより豊富に発現される及び／又は遺伝子産物の活性が増加するように真菌宿主を遺伝子改変することによって、行うことができる。調節タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現（ＯＥ）の影響は、タンパク質生産に適した条件下で改変宿主を培養することによって研究することができる。内因性タンパク質又は異種タンパク質の生産に対する効果は、例えば、特異的酵素活性を決定すること、総タンパク質の量を決定すること、又は生産された特異的内因性又は異種タンパク質の量を決定することによって研究することができる。
【0181】
より具体的には、実施例５及び６（表１０を参照されたい）に記載されるように、（表１０に提示される）１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損した変異真菌細胞は、タンパク質生産特性／表現型の減少を含む（例えば、総タンパク質生産、酵素活性、セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解、タンパク質生産速度など）。したがって、本明細書に記載及び熟慮されるように、特定の態様では、本開示は、とりわけ、表１０の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する変異真菌細胞を提供する。
【0182】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、宿主細胞が機能性遺伝子産物（例えば、機能性タンパク質）を生産することを実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。遺伝子破壊の例示的な方法には、ポリペプチドコーディング配列、プロモーター、エンハンサー、又は別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全又は部分的欠失、或いはそれらの変異誘発（ここで、変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活性化し、機能性遺伝子産物（すなわち、機能性タンパク質）の生産を実質的に減少又は阻害する置換、挿入、欠失、逆位、並びにそれらの任意の組み合わせ及びバリエーションを包含する）が含まれる。
【0183】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムからの遺伝子の除去を指す。遺伝子が遺伝子のコーディング配列に直接隣接して位置していない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コーディング配列の欠失を指し、及び任意選択的に、例えば、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列を含むがこれらに限定されない隣接エンハンサーエレメントの欠失を指す。
【0184】
本明細書で使用されるとき、「異種遺伝子」は、配列の少なくとも一部が、それが導入及び／又は発現される細胞にとって天然ではないか又は天然の形態で存在するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を指す。
【0185】
本明細書で使用されるとき、「異種核酸コンストラクト」又は「異種ＤＮＡ配列」は、それが発現される細胞にとって天然ではないか又は天然の形態で存在しない配列の一部を有する。
【0186】
本明細書で使用されるとき、「異種タンパク質」は、異種遺伝子、異種核酸（ポリヌクレオチド）配列、異種ＤＮＡ配列などによってコードされる。
【0187】
したがって、一定の実施形態では、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする異種遺伝子、異種核酸コンストラクト、異種ＤＮＡ配列などを糸状真菌細胞（株）に導入する（例えば、変換される）。例えば、ＰＯＩをコードする異種遺伝子コンストラクトは、本明細書に記載の他の遺伝子改変の実施前、実施中、又は実施後に糸状真菌細胞（株）に導入され得る。
【0188】
異種とは、制御配列に関して、その発現が現在調節しているのと同じ遺伝子を調節するように自然界で機能しない制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）を指す。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられたものである。「異種」核酸コンストラクトは、天然の細胞に見出される制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一であるか、又は異なる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせを含み得る。
【0189】
本明細書で使用されるとき、「コーディング配列」（略して「ＣＤＳ」）という用語は、その（コードされた）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチド配列を指す。ＣＤＳの境界は、一般に、通常は開始コドン（ＡＴＧ）で始まるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって決定される。コーディング配列には、一般的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えヌクレオチド配列が含まれる。例えば、ＯＲＦは、一般に、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）コードされたタンパク質産物のアミノ酸を表す一連のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含み、５’から３’方向に読み取られる（又は翻訳される）ポリヌクレオチド配列（天然に存在するか、天然に存在しないか、又は合成であるかにかかわらず）を指す。
【0190】
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡコンストラクト」又は「発現コンストラクト」という用語は、少なくとも２つのＤＮＡポリヌクレオチド断片を含む核酸配列を指す。ＤＮＡ又は発現コンストラクトを用いて、核酸配列を真菌宿主細胞に導入することができる。このＤＮＡはインビトロで（例えば、ＰＣＲで）又は任意の他の好適な手法によって生成し得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、目的の配列（例えば、目的タンパク質をコードする）を含む。ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、プロモーター及び／又はターミネーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体とは非相同な配列を含む。
【0191】
本明細書で使用されるとき、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。特定の実施形態では、入来配列は、両側で相同ボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及び相同ボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、糸状真菌染色体中の配列と相同である。これらの配列は、糸状真菌染色体のどこに新しいコンストラクトが組み込まれる、もしあれば、染色体のどの部分が入ってくる配列によって置き換えられるかを指示する。
【0192】
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現の用語「下方制御」語は、機能性遺伝子産物のより低い（下方制御された）発現をもたらす任意の方法を含む。
【0193】
「ベクター」という用語は、本明細書では、１つ以上の細胞型に導入する核酸配列を保有するように設計されたポリヌクレオチドとして定義される。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ又はウイルス粒子、ＤＮＡコンストラクト、カセットなどが含まれる。発現ベクターには、プロモーター、シグナル配列、コーディング配列及び転写ターミネーターなどの調節配列が含まれ得る。
【0194】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、好適な宿主中でタンパク質を発現させることができる好適な制御配列に、作動可能に連結されたコーディング配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。
【0195】
本明細書で使用されるとき、「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、そのより大きなポリペプチドに、それが合成された細胞の分泌経路を通過させるポリペプチド（すなわち、「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を意味する。より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を通る過程で切断され、分泌ペプチドが除去される。
【0196】
本明細書で使用されるとき、「単離（された）」又は「精製（された）」という用語は、天然に結合している少なくとも１つの成分から除去された糸状真菌細胞、核酸又はポリペプチドを指す。
【0197】
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」又は「ＰＯＩ」という用語は、糸状真菌細胞において発現することが所望されるポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質などであり得、高レベルで発現させることができ、商業化を目的とすることができる。例えば、下記に一般的に記載されるように、ＰＯＩとしては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ポリエステラーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、α－グルカナーゼ、β－グルカナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ等が含まれるが、これらに限定されない。
【0198】
目的タンパク質（ＰＯＩ）は、「内因性」遺伝子によってコードされ得る。例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、天然のセルラーゼ群（例えば、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼ）をコードする上述の野生型遺伝子など、糸状真菌細胞（株）に内因性の遺伝子によってコードされる。
【0199】
本明細書で使用されるとき、「増加した生産」という用語及びその変形は、培地組成、温度、ｐＨ、細胞密度、溶存酸素、及び調節タンパク質を過剰発現しない親（対照）糸状真菌細胞と同じ条件下で培養した場合の、本開示の調節タンパク質をコードする調節遺伝子を過剰発現する改変（変異）糸状真菌細胞による目的タンパク質の生産における少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、又は少なくとも２０％（例えば、２０％超）の増加を意味する。
【0200】
本明細書で使用されるとき、組換え細胞が「『増加した量』の目的タンパク質を産生する」などの語句で使用される場合、「増加した量」という用語及びその変形は、培地組成、温度、ｐＨ、細胞密度、溶存酸素、及び調節タンパク質を過剰発現しない親（対照）糸状真菌細胞と同じ条件下で培養した場合の、本開示の調節タンパク質をコードする調節遺伝子を過剰発現する改変（変異）糸状真菌細胞によって産生された目的タンパク質の量における少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、又は少なくとも２０％（例えば、２０％超）の増加を意味する。
【0201】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（及び／又はそれらのそれぞれの複数形）は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってよく、改変アミノ酸を含むことができ、さらに非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、又は介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合などの他の任意の操作若しくは修飾）によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
【0202】
本明細書で使用されるとき、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのようなタンパク質は、属及び／又は種が異なる生物、或いは異なる分類の生物（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連タンパク質はまた、一次配列分析によって決定されるか、二次又は三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される相同体を包含する。
【0203】
本明細書で使用されるとき、「実質的に活性を有しない」という語句、又は類似の語句は、特定の活性が混合物中で検出できないか、又は混合物の意図する目的を妨害しない量で存在することを意味する。
【0204】
本明細書で使用されるとき、「誘導ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか又は両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つ又は多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の一方若しくは両方の末端での、又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、並びに／或いはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、タンパク質から得られるか、又は得ることができるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導タンパク質を形成することによって達成することができる。
【0205】
関連（及び誘導）タンパク質には、「変異タンパク質」が含まれる変異タンパク質は、少ない数のアミノ酸残基における置換、欠失及び／又は挿入によって、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）とは異なる。変異タンパク質と親タンパク質との間の異なるアミノ酸残基の数は、１個以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質はまた、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等において、参照タンパク質と異なっていてもよい。
【0206】
本明細書で使用されるとき、「相同」タンパク質という用語は、参照タンパク質と同様の活性、機能及び／又は構造を有するタンパク質を指す。相同体が必ずしも進化的に関連しているということではない。したがって、この用語は異なる生物から得られる（即ち、構造及び機能に関して）同一の、類似の、又は対応するタンパク質を包含することが意図されている。いくつかの実施形態では、参照タンパク質に類似の四次、三次及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及び／又はＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（すなわち、本開示の全長Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対する実質的なアミノ酸配列同一性を含む）由来の調節タンパク質ホモログは、実施例１０（表６を参照されたい）に記載されている。
【0207】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用して決定し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０年）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスを含み得る。「最長同一性」とラベル付けされた（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得された）針の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントの総ギャップ数）
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントの総ギャップ数）
【0208】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（上記のＲｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされた（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得された）針の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントの総ギャップ数）
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントの総ギャップ数）
【0209】
本明細書で使用されるとき、語句「実質的に類似」及び「実質的に同一」は、少なくとも２つの核酸若しくはポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが参照（即ち、野生型）配列と比較して少なくとも約４０％の同一性、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％以上さえの同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の公知のプログラムを使用して決定することができる。
【0210】
本明細書で使用されるとき、用語「インデューサー」、「インデューサー（複数）」又は「誘導基質」は互換的に使用され、糸状真菌細胞に総タンパク質の「増加した量」を産生させる任意の化合物を指す。誘導基質の例には、ソホロース、ラクトース、ゲンチビオース及びセルロースが含まれるが、これらに限定されない。
【0211】
本明細書で使用されるとき、用語「誘導」は、「インデューサー」（すなわち、誘導基質）の存在に応じて、極めて大きい速度で糸状真菌細胞中での目的タンパク質の合成をもたらす遺伝子の転写の増加を指す。
【0212】
目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）の「誘導」を測定するために、改変された糸状真菌細胞に候補誘導基質（インデューサー）を補充し、同じ誘導基質（インデューサー）を補充した親糸状真菌（対照）細胞と比較する。したがって、親（対照）細胞には１００％の相対タンパク質活性値が割り当てられ、改変宿主細胞におけるＰＯＩをコードするＧＯＩの誘導は、活性値（すなわち、対照細胞に対して）が、１００％超（例えば、１００．１％～１００．９％）、１０１％超、１０５％超、１１０％超、１５０％超、２００～５００％（すなわち、対照に対して）超、又はそれを超える場合に達成される。
【0213】
本明細書で使用されるとき、「好気性発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。
【0214】
本明細書で使用されるとき、「細胞ブロス」という用語は、液体培養／液内培養における培地及び細胞を集合的に指す。
【0215】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞集団」は、液体／液内培養中に存在する（インタクト細胞及び溶解細胞を含む）細胞成分を指す。細胞量は、乾燥重量又は湿潤重量で表すことができる。
【0216】
本明細書で使用されるとき、語句「高温発酵（培養）温度」は、実施例に記載される標準発酵条件よりも高い発酵温度である。
【0217】
本開示の方法は、改変（変異）糸状真菌細胞（株）を得るための特定の順序に限定されないことが理解されよう。遺伝子の改変は、内因性目的タンパク質（ＰＯＩ）の生産及び／又は異種ＰＯＩの生産のための株のコンストラクトにおける任意の工程で親株に導入することができる。
【0218】
ＩＩＩ．調節タンパク質
当業者によって一般に理解されるように、調節タンパク質は、ＤＮＡをＲＮＡに転写するプロセスを含むがこれに限定されない様々なレベルで細胞恒常性の調節に関与する。例えば、転写因子と呼ばれる多くの調節タンパク質は、典型的には、（調節された）遺伝子のプロモーター領域中の特定の（標的）部位に結合することによって遺伝子転写の速度を制御、調節、媒介などする配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である（Ｌａｔｃｈｍａｎ、１９９３年）。より具体的には、転写因子の１つの異なる特徴は、エンハンサー又はプロモーター配列と呼ばれるＤＮＡの特定の配列に結合する能力をそれらに与えるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有することである。したがって、いくつかの調節タンパク質は、転写開始部位の近くのＤＮＡプロモーター配列に結合し、転写開始複合体の形成を助ける。他の調節タンパク質は、エンハンサー配列などの調節配列に結合し、関連遺伝子の転写を刺激又は抑制することができ、これらの調節配列は、転写される遺伝子の上流（５’）又は下流（３’）の数千塩基対（ｂｐ）であり得る。
当業者によって一般に理解されるように、調節タンパク質は、ＤＮＡをＲＮＡに転写するプロセスを含むがこれに限定されない様々なレベルで細胞恒常性の調節に関与する。例えば、転写因子と呼ばれる多くの調節タンパク質は、典型的には、（調節された）遺伝子のプロモーター領域中の特定の（標的）部位に結合することによって遺伝子転写の速度を制御、調節、媒介などする配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である（Ｌａｔｃｈｍａｎ、１９９３年）。より具体的には、転写因子の１つの異なる特徴は、エンハンサー又はプロモーター配列と呼ばれるＤＮＡの特定の配列に結合する能力をそれらに与えるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有することである。したがって、いくつかの調節タンパク質は、転写開始部位の近くのＤＮＡプロモーター配列に結合し、転写開始複合体の形成を助ける。他の調節タンパク質は、エンハンサー配列などの調節配列に結合し、関連遺伝子の転写を刺激又は抑制することができ、これらの調節配列は、転写される遺伝子の上流（５’）又は下流（３’）の数千塩基対（ｂｐ）であり得る。
【0219】
プロテインキナーゼは、リン酸をそれらに（共有結合的に）付加することによって他のタンパク質を選択的に改変すること（すなわち、リン酸化）ができる調節タンパク質である。ヒストンアセチラーゼ／脱アセチル化酵素は、それぞれアセチル基（ＣＯＣＨ３）の共有結合的付加／除去を介してヒストンタンパク質を改変することができる調節タンパク質である。例えば、転写の調節は、遺伝子制御の最も一般的な形態であり、調節タンパク質の作用は、遺伝子発現パターンの独特の時空間的調節を可能にする。
【0220】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、ペクチナーゼなどの生産は、主に糸状真菌の転写レベルで調節されると考えられている（Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２００５）。例えば、Ｓｔｒｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００８）は、ＸｌｎＲ及びＸｙｒ１の作用を含む、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるセルラーゼ及びヘミセルラーゼの発現の転写調節の類似性及び差異を記載した。Ｋｕｂｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）によって記載されているように、いくつかの調節成分が、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるセルラーゼ調節に陽性（Ｘｙｒ１、Ａｃｅ２、Ｈａｐ２／３／５）又は陰性（Ａｃｅ１、Ｃｒｅ１）のいずれかで関与している。タンパク質の生産に対するいくつかの調節遺伝子の作用が記載されているが、内因性及び異種の目的タンパク質の生産を増強することができる改良された糸状真菌株が依然として必要とされている。
【0221】
当技術分野で一般的に知られているように、糸状真菌株は、典型的には、とりわけ、培養培地（すなわち、発酵ブロス）に酸素及び栄養素を導入及び分配し、最適なｐＨ及び温度を維持するように適合されたバイオリアクター内で菌糸体液内培養として増殖される。特に、発酵ブロスを混合、曝気、冷却などするのに必要な電力は、生産コストを大幅に増加させ、モーター、電源、冷却装置などの点でより高い資本支出を招く可能性がある。例えば、発酵プロセス中の熱の発生は、炭素及びエネルギー源の利用に密接に関連している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９７９）。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）によって一般的に記載されているように、熱量は成長及び生成物形成の化学量論に関連するが、熱発生率はプロセスの速度論に比例し、熱発生への関心は発酵プロセス中にそれを除去する必要性から生じる（例えば、最適な生成物形成を維持するため）。したがって、プロセスをより高い温度で実行することは、発酵時間を短縮し、発酵能力を放出することができるので有益であり得る。
【0222】
一般に、ほとんどの糸状真菌は、約２０℃～４０℃の温度範囲内でのみ成長し、タンパク質又は他の代謝産物を効率的に生産する。例えば、発酵温度は多少変動し得るが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状真菌の場合、温度は一般に約２０℃～４０℃の範囲内、一般に好ましくは約２５℃～３４℃の範囲内である。したがって、タンパク質の生産のために高温で糸状真菌株を発酵させる能力は、タンパク質生産の時間及びコストを低減する上で特に興味深い。以下に記載されるように、本開示の変異真菌細胞（株）は、目的タンパク質の生産を増強するための工業規模の発酵プロセスでの使用によく適している。
【0223】
より具体的には、本明細書に記載され、実施例のセクションで以下に記載されるように、出願人は、ＪＧＩデータベース（Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０１４）から野生型トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ株（ＡＴＣＣ第１３６３１号）を使用してバイオインフォマティクスツールを介して予測された４００個を超える調節タンパク質を最初に同定した。実施例１に記載されるように、本出願人は、調節タンパク質欠失コンストラクトのライブラリーを（融合ＰＣＲによって）作製し、このライブラリーでは、合計３４３個の調節タンパク質欠失（欠損）株が得られ、改善された特性についてスクリーニングされた。出願人は、タンパク質生産特性／表現型の変化について３４３個の調節タンパク質欠損株をさらにスクリーニングした（例えば、総タンパク質生産、酵素活性、セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解、タンパク質生産速度など）。より具体的には、実施例のセクション（実施例２～４を参照されたい）に記載されているように、特定の条件下でタンパク質生産表現型が改善されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質消去株を以下の表２～９に示す。
【0224】
実施例のセクションにさらに記載されるように、表１０の１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損した変異真菌株は、実施例５及び６に指定された条件下でのタンパク質生産特性／表現型の減少を含む（表１１～１５）。したがって、特定の態様では、本開示は、表１０の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する変異真菌株に関し、ＯＥ変異株は、指定条件下で改善されたタンパク質生産表現型を含む。
【0225】
ある特定の態様において、親真菌株は、表１、表１０及び／若しくは表１６に記載される調節タンパク質、又はそのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）部分配列と少なくとも約５０％以上の配列同一性、少なくとも約５５％以上の配列同一性、少なくとも約６０％以上の配列同一性、少なくとも約６５％以上の配列同一性、又は少なくとも約７０％以上の配列同一性を含む調節タンパク質をコードする天然の遺伝子を含む。一定の実施形態では、親真菌細胞が、表１、表１０及び／又は表１６に記載の調節タンパク質、又はそのＤＢＤ部分配列と約７０％～９９％のアミノ酸配列同一性を含む機能性調節タンパク質を含む。
【0226】
実施例７に一般的に記載されるように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びマイセリオフィソラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来の真菌調節タンパク質ホモログを表１６に示す。ある特定の態様において、本開示の調節タンパク質は、表１６に示される調節タンパク質ホモログに対する少なくとも約５０％又はそれを超える配列同一性（例えば、約５１～９９％の同一性又は１００％の同一性）を含む。
【0227】
したがって、特定の態様では、親真菌株は、表１～１６のいずれか１つに記載の調節タンパク質、又はそのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）部分配列と少なくとも約５０％以上の配列同一性、少なくとも約５５％以上の配列同一性、少なくとも約６０％以上の配列同一性、少なくとも約６５％以上の配列同一性、又は少なくとも約７０％以上の配列同一性を含む調節タンパク質をコードする天然の遺伝子を含む。
【0228】
一定の実施形態では、親真菌細胞が、表１～１６のいずれか１つに記載の調節タンパク質又はそのＤＢＤ部分配列と約７０％～９９％のアミノ酸配列同一性を含む機能性調節タンパク質を含む。
【0229】
一定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド配列（又はその部分配列）、及び／又は本開示のタンパク質配列（又はその部分配列）及び／又はそのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）部分配列、又はその断片を使用して、当技術分野で周知の方法に従って異なる属又は種の株由来の調節タンパク質をコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）を同定及びクローニングするための核酸プローブを設計することができる。特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準サザンブロッティング手順に従って、目的の真菌細胞のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用することができる。
【0230】
そのようなプローブは、配列全体よりもかなり短くてもよいが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチド長でなければならない。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの両方を使用することができる。これらのプローブは、通常、対応する遺伝子を検出するために（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン又はアビジンを用いて）標識される。したがって、そのような他の株から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを、上記のプローブとハイブリダイズし、且つ調節タンパク質をコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。そのような他の株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は他の分離手法によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離したＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移して固定化され得る。配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、若しくは７９とハイブリダイズするクローン又はＤＮＡ、又はその部分配列を同定するために、担体材料はサザンブロットで使用される。
【0231】
したがって、一定の実施形態は、本明細書に開示の１つ以上の真菌調節タンパク質に対して少なくとも約５０％の同一性を含むアミノ酸配列を含む１つ以上の機能性調節タンパク質をコードする天然の遺伝子を含む親真菌株に由来する変異真菌株に関し、調節タンパク質をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるように遺伝子改変されており、それにより変異真菌細胞を１つ以上の機能性調節タンパク質の生産において（すなわち、親細胞に対して）欠損させる。関連する態様では、本開示の変異真菌株（１つ以上の機能性調節タンパク質の生産が欠損している）は、同じ条件下で培養した場合、親真菌株に対して増加した量の目的タンパク質を生産する。
【0232】
下記の表１及び表１０に一般に示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、全長調節タンパク質の一次（１°）アミノ酸配列に存在するアミノ酸（サブ配列）である。しかしながら、本明細書中に提示される特定のＤＢＤアミノ酸部分配列は、限定的であることを意味するのではなく、むしろ、本明細書中に記載される遺伝子改変に適した例示的なアミノ酸部分配列（すなわち、ＤＢＤドメイン／モチーフ）を提供することを意味する。例えば、本明細書で熟慮及び記載されるように、調節タンパク質は、典型的には、（調節された）遺伝子のプロモーター領域中の特定の（標的）部位（すなわち、ＤＢＤ）に結合することによって遺伝子転写の速度を制御、調節、媒介などする配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。したがって、特定の実施形態では、変異株は、親真菌株から誘導／取得され、変異株は、１つ以上の調節タンパク質（表１を参照されたい）のＤＢＤを破壊、欠失、又は他の方法で変異させる遺伝子改変を含み、それによって変異株を（親株に対して）１つ以上の調節タンパク質の生産において欠損させる。特定の他の実施形態では、変異細胞は、親真菌株から誘導／得られ、変異株は、表１０に記載される１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する導入された核酸（例えば、発現カセット）を含む。例えば、ある特定の実施形態において、変異細胞は、１つ以上の機能的調節タンパク質（すなわち、親株に対して）の１つ以上のコピーをコードする導入された発現カセットを含む。関連する態様では、本開示の変異真菌細胞は、とりわけ、表１の少なくとも１つの調節タンパク質の生産が欠損しており、表１０の少なくとも１つの調節タンパク質を過剰発現する。
【0233】
ＩＶ．組換え核酸及び分子生物学
上記のセクションＩＩＩに記載されるように、特定の態様は、本開示の１つ以上の調節タンパク質をコードする天然の遺伝子を含む親株に由来する変異真菌株に関し、変異株は、天然の遺伝子によってコードされる１つ以上の調節タンパク質の生産において変異株に欠損させる遺伝子改変を含む。特定の他の態様は、本開示の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の導入された核酸（例えば、発現カセット）を含む変異真菌株に関する。関連する態様では、変異真菌株は、変異株が１つ以上の調節タンパク質の生産において欠損させるようにする遺伝子改変を含み、本開示の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の導入された核酸を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、変異株及び／又は親株は、本明細書に記載のさらなる遺伝子改変を含み得る。
上記のセクションＩＩＩに記載されるように、特定の態様は、本開示の１つ以上の調節タンパク質をコードする天然の遺伝子を含む親株に由来する変異真菌株に関し、変異株は、天然の遺伝子によってコードされる１つ以上の調節タンパク質の生産において変異株に欠損させる遺伝子改変を含む。特定の他の態様は、本開示の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の導入された核酸（例えば、発現カセット）を含む変異真菌株に関する。関連する態様では、変異真菌株は、変異株が１つ以上の調節タンパク質の生産において欠損させるようにする遺伝子改変を含み、本開示の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の導入された核酸を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、変異株及び／又は親株は、本明細書に記載のさらなる遺伝子改変を含み得る。
【0234】
特定の態様では、出願人は、タンパク質生産特性／表現型の増強について３００個を超える調節タンパク質欠損（変異）株をスクリーニングした（実施例１～４を参照されたい。表２～９）。特定の他の態様では、出願人は、指定された条件下で低下したタンパク質生産特性／表現型を含む、１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損した変異真菌株を同定した（表１０）（実施例５～６、表１１～１５を参照されたい）。特定の実施形態では、本開示は、表１０の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する変異真菌株を提供し、ＯＥ変異株は、（特定の条件下で）タンパク質生産特性／表現型の増強を含む。したがって、特定の実施形態は、組換え微生物株、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、発現カセットなどに関する。特定の態様では、本明細書に記載の変異（組換え）糸状真菌株は、１つ以上の（異種又は内因性の）目的タンパク質を発現する。
【0235】
本明細書に簡単に記載されるように、実施例に以下に記載されるように、本開示は、一般に、組換え遺伝学の分野における日常的な技術に依存し、記載される組換えポリヌクレオチド、糸状真菌株などは、当技術分野で公知の日常的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９；２０１１；２０１２；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ １９９０及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９４）を使用して構築することができる。
【0236】
したがって、ある特定の態様において、１つ以上の遺伝的エレメント、例えば、プロモーター配列、遺伝子ＣＤＳ、５’－ＵＴＲ配列、ベクター、ポリヌクレオチドなどは、当業者によって一般に理解されるように、遺伝子改変され得る。特定の実施形態では、遺伝子改変には、（ａ）遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子の転写若しくは翻訳に必要な調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御、（ｆ）遺伝子の過剰発現（ＯＥ）、（ｇ）特異的突然変異誘発及び／又は（ｈ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子のランダム突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。
【0237】
特定の実施形態では、改変（変異）糸状真菌細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集を介して構築され得る。例えば、目的遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１）又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって、改変、破壊、欠失、又は下方制御されてもよく、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失又は改変させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（この目的のために、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９）又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、真菌細胞において活性なプロモーター及び真菌細胞において活性なターミネーターに作動可能に連結され、それにより、真菌Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、目的遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、関心対象の遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＣＥＲ）に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＮＧＧ）の５’側である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組合せは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのための真菌細胞発現カセットは、真菌細胞において活性なプロモーター及び真菌細胞において活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結することによって、作製される。
【0238】
特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的遺伝子の約５００ｂｐの５’は、標的遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合して編集鋳型を生成することができ、その鋳型は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）によって生成されたＤＮＡ切断を修復するために真菌宿主の機構によって使用される。二本鎖又は一本鎖ＤＮＡの形態のヌクレオチドのさらに短いストレッチを編集鋳型として使用することができる。
【0239】
Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多くの異なる方法（例えば、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック）を用いて糸状真菌細胞に同時送達され得る。形質転換細胞を、フォワード及びリバースプライマーを用いて標的遺伝子をＰＣＲ増幅することによってスクリーニングする。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。
【0240】
当業者は、本開示の真菌宿主細胞を形質転換するために、糸状真菌の形質転換及び真菌の培養のための標準的な技術（当業者に周知である）が使用される、ポリヌクレオチドを糸状真菌細胞（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種等）に導入するための適切な方法を十分に承知している。したがって、真菌宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入法には、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ－デキストリン媒介トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆微粒子を用いる高速銃、遺伝子銃又はバイオリスティック形質転換、プロトプラスト融合などの手法が含まれる。一般的な形質転換技術は当該技術分野で知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及び２０１２、並びにＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）内での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１及びＨａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）も参照されたい。
【0241】
他の特定の実施形態では、組換え核酸（又はそのポリヌクレオチド発現カセット若しくはその発現ベクター）は、１つ以上の選択マーカーをさらに含む。糸状真菌に使用するための選択マーカーとしては、ａｌｓｌ、ａｍｄＳ、ｈｐｈＢ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ ｔｒｐＣ、ａｒｇＢ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラストサイジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、チミジンキナーゼマーカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、選択マーカーはｐｙｒ２であり、その成分及び使用方法は、国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレットに一般的に記載されている。
【0242】
一般に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種細胞の形質転換は、通常、１０５～１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬの密度で透過性処理を施したプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール及び５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの容量のこれらのプロトプラスト又は細胞を、所望のＤＮＡと混合する。一般に、高濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が取り込み溶液に添加される。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加剤もまた、形質転換を促進するために取り込み溶液に添加し得る。同様の手順は、他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書及び同第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい（これらは両者とも参照により組み込まれる）。
【0243】
特定の態様では、変異株は、本開示の天然調節タンパク質をコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター配列を異種プロモーター配列で置換（置換）する遺伝子改変を含む。例えば、特定の実施形態では、変異株は、天然調節タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現を駆動するノックイン異種プロモーター配列を含む。他の態様では、変異株は、機能性調節タンパク質をコードする内因性遺伝子のノックアウト（又は変異）天然のプロモーター配列を含み、それによって変異株を天然調節タンパク質の生産において欠損させる状態にする。
【0244】
他の態様では、変異（又は改変）株は、本開示の１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の導入核酸を含む。例えば、特定の態様では、変異株は、本開示の調節タンパク質をコードする下流（３’）核酸に上流（５’）及び作動可能に連結された異種プロモーター（ｐｒｏ）配列を含む導入ポリヌクレオチド（発現カセット）を含む。調節タンパク質の発現又は過剰発現を駆動するのに適した異種プロモーター（プロ）配列には、当業者に公知の任意のプロモーター配列が含まれ、特に好ましいプロモーターには、所望の真菌細胞における調節タンパク質の発現を増加させることができる任意のプロモーター配列が含まれる。関連する実施形態では、カセットは、遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結された下流（３’）転写ターミネーター配列をさらに含み得る。
【0245】
例えば、調節遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結された上流プロモーターを含む調節遺伝子発現カセットが以下に概略的に示され（スキームＡ）、プロモーター［ｐｒｏ］及び調節遺伝子ＣＤＳ［ｒｅｇ＿ｇｅｎｅ］配列は、５’から３’方向に作動可能な「－」の組み合わせで示される。
【0246】
スキームＡ：５’－［ｐｒｏ］－［ｒｅｇ＿ｇｅｎｅ］－３’
同様に、下流ターミネーター配列に作動可能に連結された調節遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結された上流プロモーターを含む調節遺伝子発現カセットを以下のスキームＢに概略的に示し、プロモーター［ｐｒｏ］、調節遺伝子ＣＳ［ｒｅｇ＿ｇｅｎｅ］及びターミネーター［ｔｅｒｍ］配列は、５’から３’方向に作動可能な「－」の組み合わせで示されている。
同様に、下流ターミネーター配列に作動可能に連結された調節遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結された上流プロモーターを含む調節遺伝子発現カセットを以下のスキームＢに概略的に示し、プロモーター［ｐｒｏ］、調節遺伝子ＣＳ［ｒｅｇ＿ｇｅｎｅ］及びターミネーター［ｔｅｒｍ］配列は、５’から３’方向に作動可能な「－」の組み合わせで示されている。
【0247】
スキームＢ：５’－［ｐｒｏ］－［ｒｅｇ＿ｇｅｎｅ］－［ｔｅｒｍ］－３’
スキームＡ又はＢに示されるように、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列は、限定することを意図するものではなく、むしろ所望の真菌細胞／株において機能的であるように選択される。例えば、プロモーター配列は、変異体／変異体プロモーター、切断型プロモーター、タンデムプロモーター、ハイブリッドプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーター、調整プロモーター、条件発現系及びそれらの組み合わせを含む、糸状真菌細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり得る。多くの場合、適切なプロモーターは、糸状真菌細胞にとって天然の又は異種（外来）の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。本開示の１つ以上の調節遺伝子の発現を駆動するのに適したプロモーターの例としては、限定されないが、Ｆｉｔｚ ｅｔ ａｌ．に記載されているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） ｃＤＮＡ１プロモーター、ｅｎｏ１プロモーター、ｐｄｃ１プロモーター、ｐｋｉ１プロモーター、ｔｅｆ１プロモーター、ｒｐ２プロモーター、及び他のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターが挙げられる。２０１８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ｔｈｉＡプロモーター、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｇｐｄＡプロモーターなど。
スキームＡ又はＢに示されるように、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列は、限定することを意図するものではなく、むしろ所望の真菌細胞／株において機能的であるように選択される。例えば、プロモーター配列は、変異体／変異体プロモーター、切断型プロモーター、タンデムプロモーター、ハイブリッドプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーター、調整プロモーター、条件発現系及びそれらの組み合わせを含む、糸状真菌細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり得る。多くの場合、適切なプロモーターは、糸状真菌細胞にとって天然の又は異種（外来）の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。本開示の１つ以上の調節遺伝子の発現を駆動するのに適したプロモーターの例としては、限定されないが、Ｆｉｔｚ ｅｔ ａｌ．に記載されているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） ｃＤＮＡ１プロモーター、ｅｎｏ１プロモーター、ｐｄｃ１プロモーター、ｐｋｉ１プロモーター、ｔｅｆ１プロモーター、ｒｐ２プロモーター、及び他のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターが挙げられる。２０１８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ｔｈｉＡプロモーター、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｇｐｄＡプロモーターなど。
【0248】
特定の実施形態では、本開示は、糸状真菌宿主細胞に対して内因性である１つ以上の目的タンパク質の発現／生産に関する。他の実施形態では、本開示は、糸状真菌宿主細胞に対して異種である１つ以上の目的タンパク質を発現／生産することに関する。
【0249】
ある特定の実施形態において、異種遺伝子は、発現のために糸状真菌（宿主）細胞に形質転換される前に、中間ベクターにクローニングされる。これらの中間ベクターは、例えば、プラスミド又はシャトルベクターなどの原核生物ベクターであり得る。発現ベクター／コンストラクトは、通常、異種配列の発現に必要な全ての追加のエレメントを含む転写ユニット又は発現カセットを含有する。例えば、典型的な発現カセットは、ＰＯＩをコードする異種核酸配列に作動可能に連結した５’プロモーターを含有し、転写物、リボソーム結合部位、及び翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な配列シグナルをさらに含み得る。カセットの追加のエレメントには、エンハンサーと、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能性スプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンが含まれ得る。
【0250】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、又は異なる遺伝子から得てもよい。本発明では、任意の真菌ターミネーターが機能的である可能性が高いが、好ましいターミネーターとしては以下が挙げられる。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈＩ遺伝子由来のターミネーター、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）若しくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、及び／又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子（欧州特許第０２１５５９４号明細書）。
【0251】
遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現に使用される、従来のベクターのいずれも使用し得る。標準的な細菌発現ベクターとしては、バクテリオファージλ及びＭ１３、並びにプラスミド、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、及び融合発現系、例えばＭＢＰ、ＧＳＴ及びＬａｃＺ、並びに酵母２μプラスミド及びセントロメア酵母プラスミドが挙げられる。便宜的な単離方法を提供するために、組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃを添加することもできる。
【0252】
発現ベクター中に含むことができるエレメントには、また、レプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、又は異種配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位があり得る。当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれもが好適であり得るため、選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は確定的ではない。原核生物配列は、好ましくは、真菌宿主におけるＤＮＡの複製又は組み込みを妨げないように選択される。
【0253】
本開示の形質転換方法は、形質転換ベクターの全部又は一部を糸状真菌のゲノムに安定に組み込むことをもたらし得る。しかしながら、自己複製する染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も考えられる。外来（異種）ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための公知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、バイオリスティックス法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、及び宿主細胞にクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝子物質を導入する方法として知られる他の任意の方法の使用が含まれる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。米国特許第６，２５５，１１５号明細書に記載されているような、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介トランスフェクション法も有用である。
【0254】
発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で遺伝子の発現を促進する条件下で培養される。形質転換細胞の大きなバッチは、本明細書に記載されるように培養することができる。最後に、標準的な手法を用いて培養物から生成物を回収する。
【0255】
Ｖ．目的タンパク質
上記のように、一定の実施形態は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子を発現する遺伝子改変を含む、遺伝子変異及び／又は改変（組換え）真菌細胞に関する。より具体的には、特定の実施形態は、本開示の改変（変異）真菌細胞におけるそのような目的タンパク質の発現／生産のための組成物及び方法に関する。したがって、特定の実施形態では、組換え真菌細胞は、酵素、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質生物製剤などを含むがこれらに限定されない目的タンパク質の量を増加させた。
上記のように、一定の実施形態は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子を発現する遺伝子改変を含む、遺伝子変異及び／又は改変（組換え）真菌細胞に関する。より具体的には、特定の実施形態は、本開示の改変（変異）真菌細胞におけるそのような目的タンパク質の発現／生産のための組成物及び方法に関する。したがって、特定の実施形態では、組換え真菌細胞は、酵素、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質生物製剤などを含むがこれらに限定されない目的タンパク質の量を増加させた。
【0256】
特定の態様では、目的タンパク質には酵素が含まれる。特定の実施形態では、目的タンパク質は、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ポリエステラーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、α－グルカナーゼ、β－グルカナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、インベルターゼ、及びイソメラーゼからなる群から選択される酵素である。
【0257】
目的タンパク質（ＰＯＩ）は、内因性ＰＯＩ又は異種ＰＯＩであり得る。
【0258】
特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６からなる群から選択される酵素委員会（ＥＣ）番号から選択される。
【0259】
例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸ｌ３Ｓ－リポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｚｙｇｅｎａｓｅ））、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．ｌ．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．ｌ．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
【0260】
特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．ｌ．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテマスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４アルファ－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－ベータ－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－アルファ－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、アルファグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
【0261】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロールエステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸モノエステル加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセセンスヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ－１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－アルファ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、アルファ－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランアルファ－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、アルファ－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ－ベータ－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－ベータ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナン加水分解酵素）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、ベータアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、アルファ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、アルファ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、ベータ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、ベータ－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－ベータ－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－ベータ－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、アルファ－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、ベータ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、アルファ－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－ベータ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－アルファ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－アルファ－ガラクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－ベータ－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－ベータ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－アルファ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンベータ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソポリアルファガラクツロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、カッパカラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－ベータ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－ベータ－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル糖タンパク質エンド－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－アルファ－Ｌ－アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミルペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、サーモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、茎ブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコルペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、デューテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル脂肪族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、プロテイン－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－ベータ－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸脱アシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含む加水分解酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
【0262】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
【0263】
特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１ ４）－ａ－Ｄ－グルカン１－ａ－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがこれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
【0264】
さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸アルファ－リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
【0265】
タンパク質の生産の最適条件は、宿主細胞の選択及び発現されるタンパク質の選択によって変化する。そのような条件は、ルーチンの実験及び／又は最適化によって、当業者には容易に確かめ得る。
【0266】
目的タンパク質は、発現後に精製又は単離することができる。目的タンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかによって、当業者に知られた様々な方法で単離又は精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動手法、分子的手法、免疫学的手法、クロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換、疎水性、親和性、及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、並びにクロマトフォーカシングが含まれるが、これらに限定されない。例えば、目的タンパク質は、標準的な抗目的タンパク質抗体カラムを用いて精製し得る。タンパク質濃度と関連して、限外ろ過及びダイアフィルトレーション手法もまた有用である。必要な精製の程度は、目的タンパク質の使用目的により異なる。ある場合には、タンパク質の精製は不要である。
【0267】
特定の他の実施形態では、本開示の遺伝子改変真菌細胞が高レベルの目的タンパク質を産生することを確認するために、様々なスクリーニング方法を実施することができる。発現ベクターは、検出可能な標識として機能する標的タンパク質へのポリペプチド融合物をコードし得る、又は標的タンパク質自体が選択可能な若しくはスクリーニング可能なマーカーとして機能し得る。標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓウェブサイトで入手可能な方法）、ＥＬＩＳＡ、又は標識がＧＦＰである場合、全細胞蛍光法及び／若しくはＦＡＣＳによって検出し得る。例えば、６－ヒスチジンタグは標的タンパク質への融合体として含まれ、そしてこのタグはウェスタンブロッティングによって検出される。標的タンパク質が十分に高いレベルで発現する場合、クマシー／銀染色と組み合わされたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、変異宿主細胞において親（対照）細胞を越える発現の増加を検出するために実施することができ、この場合は標識を必要としない。さらに、目的タンパク質の改善されたレベルを確認するために他の方法、例えば、クーマシーブルー又はＢＣＡ試薬に基づくタンパク質分離又は標準的な総タンパク質測定のＨＰＬＣ方法を使用した、細胞当たりのタンパク質量又は発酵培地１ミリリットル当たりのタンパク質量の増加の検出を使用してもよい。比生産性の検出は、タンパク質の生産性を評価する別の方法である。比生産性（Ｑｐ）は、次式により求めることができる：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、生成時間並びに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）によって決定できる。最終的に、目的タンパク質が酵素活性を有する場合、その発現レベルは酵素アッセイから計算することができる。
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、生成時間並びに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）によって決定できる。最終的に、目的タンパク質が酵素活性を有する場合、その発現レベルは酵素アッセイから計算することができる。
【0268】
ＶＩ．発酵
特定の実施形態は、本開示の改変（変異）糸状真菌細胞を増殖、培養又は発酵させることを含む、目的タンパク質を産生するための組成物及び方法に関する。一般に、当技術分野で周知の発酵方法は、真菌細胞を発酵させるために使用される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、バッチ、フェドバッチ又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、発酵の開始時点で培地の組成を設定して、発酵の間それを改変しない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく発酵が行われる。典型的には、バッチ発酵は栄養素の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子は制御される。バッチ系のブロス及び培養組成物は、発酵が停止するまで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が低下若しくは停止する静止期に進む。未処置の場合、細胞はアポトーシスに進行し、最終的に死滅する。一般に、バッチ段階では、生成物の生産の大部分は、対数期の間に起こる。
特定の実施形態は、本開示の改変（変異）糸状真菌細胞を増殖、培養又は発酵させることを含む、目的タンパク質を産生するための組成物及び方法に関する。一般に、当技術分野で周知の発酵方法は、真菌細胞を発酵させるために使用される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、バッチ、フェドバッチ又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、発酵の開始時点で培地の組成を設定して、発酵の間それを改変しない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく発酵が行われる。典型的には、バッチ発酵は栄養素の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子は制御される。バッチ系のブロス及び培養組成物は、発酵が停止するまで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が低下若しくは停止する静止期に進む。未処置の場合、細胞はアポトーシスに進行し、最終的に死滅する。一般に、バッチ段階では、生成物の生産の大部分は、対数期の間に起こる。
【0269】
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形例では、対数期が終了した後、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される。異化物質抑制を回避するために、フェドバッチ系がしばしば使用される。基質の連続供給は、プロセスがその濃度を細胞代謝及びタンパク質生産の阻害をもたらし得る臨界レベル未満に保つことを可能にする。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、よく知られている。
【0270】
連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の（高い）密度に維持し、細胞は主に対数期増殖に保たれる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに生産物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。
【0271】
本開示の特定の実施形態は、真菌を培養するための発酵手順に関する。セルラーゼ酵素の生産のための発酵手順は、当該技術分野で知られている。例えば、セルラーゼ酵素は、バッチ、フェドバッチ及び連続フロープロセスなどの、固体又は液内培養によって産生することができる。培養は一般に、水性無機塩培地、有機増殖因子、炭素及びエネルギー源物質、分子状酸素、及び、当然に、使用される糸状真菌宿主の出発接種材料を含む増殖培地中で行われる。
【0272】
適切な微生物増殖を確実にし、微生物変換プロセスで細胞による炭素及びエネルギー源の吸収を最大にし、発酵培地において最大細胞密度で最大細胞収率を達成するには、炭素及びエネルギー源、酸素、吸収可能な窒素、並びに微生物接種材料に加えて、好適な量の無機栄養素を適切な割合で供給する必要がある。
【0273】
水性無機培地の組成は、当該技術分野で知られているように、使用する微生物及び基質に部分的に依存して、広範囲にわたって変えることができる。無機培地は、窒素に加えて、好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及びナトリウムを、好適な可溶性の吸収可能なイオン性の複合形態で含み、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及びヨウ素などのいくつかの微量元素を、やはり適切な可溶性の吸収可能な形態で含み、これらはすべて当技術分野で知られている。
【0274】
発酵プロセスは、微生物種が盛んに増殖するのを助けるのに有効な好適な酸素分圧で、発酵槽の内容物を維持するために提供される、空気、酸素富化空気、又は実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素含有ガスによって必要な分子状酸素が供給される好気的プロセスであり得る。
【0275】
発酵温度はいくらか変えることができるが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状真菌の場合、温度は一般に約２０℃～４０℃の範囲内、一般に好ましくは約２５℃～３４℃の範囲内である。
【0276】
微生物はまた、吸収可能な窒素源を必要とする。吸収可能な窒素源は、任意の窒素含有化合物、又は微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出することができる任意の化合物であり得る。タンパク質加水分解物などの、様々な有機窒素源化合物を使用することができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素などの安価な窒素含有化合物、及びリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は他の様々なアンモニウム化合物などの各種アンモニウム塩を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模な操作に便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）をバブリングして使用することができる。同時に、そのようなアンモニアは、ｐＨ制御を助けるために用いることもできる。
【0277】
水性微生物発酵物中のｐＨ範囲は、約２．０～１０．０の例示的な範囲であるべきである。糸状真菌では、ｐＨは、通常、約２．５～８．０の範囲であり、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）では、ｐＨは、通常、約３．０～７．０の範囲である。微生物の好ましいｐＨ範囲は、使用される培地及び特定の微生物にある程度依存し、したがって、当業者によって容易に決定され得るようにいくらか調整することができる。
【0278】
制限因子として炭素含有基質を制御することができるようなやり方で発酵を行うことが好ましく、それによって炭素含有基質の生成物への良好な転換が提供され、相当量の未変換基質による細胞の汚染が回避される。後者は、水溶性基質では、微量の残存物は容易に洗い流せるので、問題にならない。しかしながら、非水溶性基質の場合には問題となる可能性があり、好適な洗浄工程などの追加の生成物処理工程が必要になる。
【0279】
上記のように、このレベルに到達する時間は重要ではなく、特定の微生物及び実施する発酵プロセスによって変化し得る。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度の決定方法、及び所望の炭素源レベルが達成されているか否かの決定方法は、当該技術分野ではよく知られている。
【0280】
発酵はバッチ又は連続操作として行うことができ、流加操作は、制御の容易さ、均一な量の生成物の生産、及び全ての装置の最も経済的な使用という点で非常に好ましい。
【0281】
必要ならば、水性無機培地を発酵槽に供給する前に、炭素及びエネルギー源物質の一部又は全部及び／又はアンモニアなどの吸収可能な窒素源の一部を水性無機培地に加えることができる。
【0282】
反応器に導入される流れの各々は、所定の速度に制御するか、炭素及びエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽排ガス中の酸素又は二酸化炭素、乾燥細胞重量により測定可能な細胞密度、透光度などの、モニタリングによって決定可能な必要性に応じて制御することが好ましい。様々な材料の供給速度は、最大生産速度及び／又は最大収率を得るように変化させることができる。
【0283】
バッチ又は好ましい流加操作においては、全ての装置、反応器、又は発酵手段、槽又は容器、配管、付随する循環又は冷却装置などは、最初に、通常、蒸気を使用して、例えば、約１２１℃で少なくとも約１５分間、滅菌する。次いで、酸素を含む必要な栄養素の全て、及び炭素含有基質を存在下で、滅菌した反応器に選択された微生物の培養物を接種する。使用する発酵槽の種類は重要ではない。
【0284】
発酵ブロスからの酵素（例えば、セルラーゼ）の回収及び精製も、当業者に公知の手順によって行うことができる。発酵ブロスは、一般に、細胞残屑、例えば、細胞、種々の懸濁固体及び他のバイオマス混入物質、並びに所望のセルラーゼ酵素産物を含み、これらは、当該技術分野で知られた手段によって発酵ブロスから除去することが好ましい。
【0285】
そのような除去に好適なプロセスには、無細胞ろ液を生成するための、例えば、遠心分離、ろ過、透析、精密ろ過、回転真空ろ過、又は他の知られたプロセスなどの従来の固液分離手法が含まれる。結晶化の前に、限外ろ過、蒸発又は沈殿などの手法を使用して、発酵ブロス、又は細胞を含まないろ液をさらに濃縮することが好ましい。
【0286】
上清又はろ液のタンパク質成分の沈殿が、塩、例えば硫酸アンモニウム又はアセトンなどの有機溶媒によって行われ、続いて、各種のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は類似の分野で認められている方法によって精製が行われ得る。
【0287】
ＶＩＩ．例示的な実施形態
本明細書に開示される組成物及び方法の非限定的な実施形態は以下の通りである。
本明細書に開示される組成物及び方法の非限定的な実施形態は以下の通りである。
【0288】
１．表１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【0289】
２．表１６に記載の調節タンパク質ホモログと少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【0290】
３．表１０に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞。
【0291】
４．表１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含み、表１０に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【0292】
５．表１６に記載の調節タンパク質ホモログに対して少なくとも８０％の同一性を含み、表１０に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する、１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【0293】
６．細胞が、表１に示されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している、実施形態１、２、４又は５のいずれか１つに記載の組換え真菌細胞。
【0294】
７．目的タンパク質を発現する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組換え真菌細胞。
【0295】
８．表１０に記載のタンパク質（例えば、５’－［ｐｒｏ］－［ｒｅｇ＿ｐｒｏｔｅｉｎ］－３’）に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む調節タンパク質をコードする下流（３’）核酸（ｒｅｇ＿ｐｒｏｔｅｉｎ）に作動可能に連結された上流（５’）プロモーター（ｐｒｏ）を含むポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）。
【0296】
９．上流プロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、実施形態８に記載のポリヌクレオチド。
【0297】
１０．調節タンパク質をコードする核酸（ｒｅｇ＿ｐｒｏｔｅｉｎ）に作動可能に連結された下流（３’）のターミネーター（用語）配列をさらに含む、実施形態８に記載のポリヌクレオチド。
【0298】
１１．実施形態８の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含む組換え真菌細胞。
【0299】
１２．実施形態８の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、内因性目的タンパク質を発現する組換え真菌細胞。
【0300】
１３．実施形態８の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、異種目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする少なくとも１つの導入カセットを発現する組換え真菌細胞。
【0301】
１４．導入カセットが、異種ＰＯＩ（例えば、５’－［ｐｒｏＣｅｌ］－［ＰＯＩ］－３’）をコードする下流（３’）核酸（ＰＯＩ）に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーター（ｐｒｏＣｅｌ）配列を含む、実施形態１３に記載の組換え真菌。
【0302】
１５．表１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産において組換え細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の組換え真菌細胞。
【0303】
１６．表１６に記載の調節タンパク質ホモログに対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産において組換え細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の組換え真菌細胞。
【0304】
１７．内因性ＰＯＩがセルラーゼである、実施形態１２に記載の組換え真菌細胞。
【0305】
１８．セルラーゼが、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態１７に記載の組換え真菌細胞。
【0306】
１９．異種ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体（及びその機能性抗体断片）、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質、免疫原性タンパク質などからなる群から選択される、実施形態１３に記載の組換え真菌細胞。
【0307】
２０．セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、親細胞を遺伝子改変して、表１に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、組換え細胞を培養することと、を含み、組換え細胞が、同じ条件下で培養された親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産を増強するための方法。
【0308】
２１．組換え細胞が、表１０に示される調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質をコードする１つ以上の導入ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２０に記載の方法。
【0309】
２２．セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、親細胞を遺伝子改変して、表１０に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞を取得することと、組換え細胞を培養することと、を含み、組換え細胞が、同じ条件下で培養された親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産を増強するための方法。
【0310】
２３．組換え細胞が、表１の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産において細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、実施形態２２に記載の方法。
【0311】
２４．セルラーゼが、セロビオヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態２０～２３のいずれか１つに記載の方法。
【0312】
２５．ＰＯＩをコードする少なくとも１つの発現カセットを親真菌細胞に導入し、親細胞を遺伝子改変して、表１に記載される調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、組換え細胞を培養することと、を含み、組換え細胞が、同じ条件下で培養された親細胞に対して増加した量のＰＯＩを生産する、目的タンパク質（ＰＯＩ）の生産を増強するための方法。
【0313】
２６．ＰＯＩをコードするカセットが、ＰＯＩをコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーターを含む、実施形態２５に記載の方法。
【0314】
２７．ＰＯＩをコードするカセットが、真菌細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態２５に記載の方法。
【0315】
２８．ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体（及びその機能性抗体断片）、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質、免疫原性タンパク質などからなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法。
【実施例】
【0316】
以下の実施例は本開示の実施形態を示しているが、それらは例示としてのみ与えられていることを理解されたい。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は種々の使用及び条件に適合させるために、本開示の種々の変更及び修正を行うことができる。このような修正もまた、特許請求の範囲に記載された発明の範囲に含まれるものとする。本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は当分野で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【0317】
実施例１
真菌細胞における調節タンパク質欠失ＬＩＢＲＡＲＹの構築及びスクリーニング
概説
真菌細胞における調節タンパク質欠失ＬＩＢＲＡＲＹの構築及びスクリーニング
概説
【0318】
詳細な説明において上記で一般に記載されるように、調節タンパク質は、細胞遺伝子発現の重要な調節因子であり、そのような調節タンパク質は、典型的には、（調節された）遺伝子のプロモーター領域中の特定の（標的）部位に結合することによって遺伝子発現を調節する。例えば、その標的プロモーター部位への調節タンパク質の結合は、様々な細胞機能、プロセスなどに関与する遺伝子の転写を上方制御又は下方制御することができる。
【0319】
本実施例では、出願人は、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）データベース（Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０１４）からトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） ＱＭ６ａ株を使用してバイオインフォマティクスツールを介して予測された４００を超える調節タンパク質を同定した。より具体的には、実施例及び以下に提示されるデータ（表１～１５を参照されたい）において、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株（ＱＭ６ａ；ＡＴＣＣ（登録商標）１３６３１）を分子生物学的操作のための研究全体を通して使用した。さらに、遺伝子欠失の効率を改善するために、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構が損なわれたｋｕ８０破壊（Δｋｕ８０）変異体を、ｋｕ８０遺伝子をｐｙｒ４マーカーで置き換えることによって構築した（例えば、ＮＨＥＪにおいて損なわれたそのようなΔｋｕ８０真菌変異体の構築を記載する国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレットを参照されたい）。したがって、ある特定の局面において、調節タンパク質欠失コンストラクトのライブラリーが、真菌の形質転換及び遺伝子ノックアウトの選択のために使用されたハイグロマイシン選択マーカー（ｈｐｈＢ）によって隔てられるおよそ２ｋｂの長さの遺伝子特異的な上流側（５’）及び下流側（３’）のフランキング領域の間での融合ＰＣＲアプローチによって作製された。形質転換コロニーを、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを補充した２％麦芽抽出物、０．２％ペプトン、２％グルコース、１Ｍソルビトール、５ｍＭトリス（ｐＨ５．０）を含有する寒天プレート上で選択し、続いて特定の遺伝子座における破壊カセットの正しい組み込みのためのコロニーＰＣＲ分析を行った。合計で３４３個の調節タンパク質欠失（変異）株を得て、以下の実施例に記載される改善された特性についてスクリーニングした。
【0320】
Ｂ．接種材料の調製
【0321】
１０μＬの胞子懸濁液を、２％麦芽抽出物寒天培地（Ｏｘｏｉｄ）を含む２４ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に蒔き、光の存在下、３０℃でインキュベートした。胞子形成が観察されたとき、胞子を回収し、同じＯＤ６００ｎｍ値に正規化した。５０μＬの正規化胞子溶液を生産プレートの接種に使用した。
【0322】
Ｃ．タンパク質生産及び試料の調製
【0323】
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）液体培養物を、グルコース／ソホロース混合物を含有する培地、又はラクトース若しくはグルコースを固体多孔質マトリックスから放出するように構成されたプレートを含む２４ウェルポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒｔ（登録商標）ＣＬＳ３５２７）中で増殖させた。より詳細には、各ウェルは１．２ｍＬの生産培地（９ｇ／Ｌのカスアミノ酸、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）及び０．２５％のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素［１７５ｇ／Ｌ Ｃ６Ｈ８Ｏ７、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．８ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３］）を含有していた。ポリスチレンプレートの場合、２％（ｗ／ｗ）の最終濃度のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として使用した。グルコース及びラクトース放出プレートの場合、１．６％（ｗ／ｗ）グルコースを生産培地に添加した。プレートを２８℃又は３４℃、湿度８０％で２００ｒｐｍ（５０ｍＭスロー）でインキュベートした。
【0324】
インキュベーションの７２時間後及び１２０時間後にサンプリングを行った。２００μＬの培養物を収集し、０．２μＭ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＦＩＬＴＲＥＸ（商標）ＣＬＳ３５０５でろ過した。得られた上清を総タンパク質測定及び酵素活性測定に使用した。
【0325】
Ｄ．ブラッドフォード及びＨＰＬＣによるタンパク質決定
【0326】
培養上清中の総タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用するバイオラッド・ブラッドフォード・アッセイによって決定した。セロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）レベルを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ１．７μｍ（４．６×１５０ｍＭ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ＃１８６００５２２５）を備えたアジレント１２００ ＨＰＬＣを使用してＨＰＬＣによって測定した。２５μＬの試料を７５μＬの脱ミネラル化水と混合した。４倍希釈した試料１０μＬをカラムに注入した。試料を溶出するために、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．７）及び１００ｍＭ ＮａＣｌを５分間均一濃度で流した。性能指数（ＰＩ）を算出するために、同一条件における、ＱＭ６ａ（Δｋｕ８０）株の欠失変異体が産生する（平均）総タンパク質と、野生型ＱＭ６Ａ（Δｋｕ８０）株が産生する（平均）総タンパク質との比率を比較した。
【0327】
Ｅ．リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解アッセイ
【0328】
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）は、Ｗｏｏｄ（１９７１）の公開された方法に従ってＡｖｉｃｅｌから調製され、国際公開第２０１４／０９３２７５号パンフレットに記載されている。この物質を緩衝液及び水で希釈して０．５％（ｗ／ｖ）混合物を得て、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ（ｐＨ５．０）になるようにした。ＣＢＨ１活性は、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ＰＳ ３６４１）中の１４０μＬの反応混合物（０．３６％ ＰＡＳＯ；２９．４ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）；１４３ｍＭ ＮａＣｌ）に５μＬ、１０μＬ、２０μＬ及び４０μＬの上清（Ｃ参照）を添加することによって決定した。マイクロタイタープレートを密封し、９００ｒｐｍで連続的に振とうしながら５０℃で２時間インキュベートした後、氷上で５分間冷却した。１００μＬのクエンチ緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液；ｐＨ１０）を加えることによって、加水分解反応を停止させた。加水分解反応生成物を、以下の修正を加えて、Ｌｅｖｅｒ（１９７２）によるｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）アッセイで分析した。
【0329】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：ＰＡＨＢＡＨ還元糖試薬１５０μＬのアリコート（試薬１００ｍＬの場合：１．５ｇのｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ番号Ｈ９８８２）、２％ ＮａＯＨに溶解した５ｇの酒石酸ナトリウムカリウム四水和物）を、空のマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加した。１０μＬの加水分解反応上清をＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加した。すべてのプレートを密封し、９００ｒｐｍの連続振とう下、６９℃でインキュベートした。１時間後、プレートを氷上に５分間置き、室温で７２０×ｇで５分間遠心分離した。プレートの吸光度（終点）を分光光度計において４１０ｎｍで測定した。セロビオース標準を対照及び適切なブランク試料として含めた。性能指数（ＰＩ）を計算するために、野生型ＱＭ６ａ（Δｋｕ８０）株によって産生された（平均）全糖を、ＱＭ６ａ（Δｋｕ８０）株の調節タンパク質欠失変異体によって産生された（平均）全糖で割った。
【0330】
実施例２
２８℃でのタンパク質生産の改善
１６６個の調節タンパク質欠失変異体のサブセットを、様々な条件下でのタンパク質生産の改善についてスクリーニングした。例えば、以下の表１に、本明細書に記載の特定のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質欠失変異体のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子（ＤＮＡ）配列（配列番号）、予測タンパク質配列（配列番号）、予測ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）配列（配列番号）を示す。
２８℃でのタンパク質生産の改善
１６６個の調節タンパク質欠失変異体のサブセットを、様々な条件下でのタンパク質生産の改善についてスクリーニングした。例えば、以下の表１に、本明細書に記載の特定のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質欠失変異体のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子（ＤＮＡ）配列（配列番号）、予測タンパク質配列（配列番号）、予測ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）配列（配列番号）を示す。
【表1】
【0331】
より具体的には、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイ（実施例１）によってタンパク質生産性を測定し、その欠失が２８℃での総タンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を以下の表２～４に記載する。
【0332】
例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける２８℃でのタンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を表２に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、及びブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表2】
【0333】
表２に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース放出（誘導）条件下、２８℃で発酵させた場合、増強されたタンパク質生産性表現型（すなわち、親細胞に対して）を含み、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）の生産が欠損した変異細胞は、増加した量の総タンパク質及び増加した量のＣＢＨ１を生産し、これにより、（親株に対してＰＡＳＣアッセイによって例示されるように）より高い糖化活性がもたらされる。
【0334】
同様に、欠失が１２０時間のインキュベーション後にグルコース放出プレートにおける２８℃でのタンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を表３に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表3】
【0335】
例えば、表３に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）、Ｔｒｉｒｅ２＿１２０４２８（配列番号７１）、Ｔｒｉｒｅ２＿７６７０５（配列番号４１）、Ｔｒｉｒｅ２＿７８１６２（配列番号５０）又はＴｒｉｒｅ２＿１０５２３９（配列番号５６）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出条件下２８℃で発酵させた場合に、（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の増強を含む。より具体的には、上述の調節タンパク質の生産が欠損したそのような変異細胞（表３）は、そのようなグルコース放出条件下で（親細胞に対して）増加した量の総タンパク質及び／又は増加した量のＣＢＨ１を生産した。
【0336】
さらに、以下の表４に記載されるのは、調節タンパク質であり、その欠失が１２０時間のインキュベーション後に炭素源として２％（ｗ／ｗ）グルコース／ソホロースを含むポリスチレンプレートにおいて２８℃でのタンパク質生産の増加をもたらし、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表4】
【0337】
上記の表４に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿６９６９５（配列番号３２）、Ｔｒｉｒｅ２＿７６７０５（配列番号４１）、Ｔｒｉｒｅ２＿７８１６２（配列番号５０）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５８４９（配列番号５９）、Ｔｒｉｒｅ２＿７１８２３（配列番号３５）、Ｔｒｉｒｅ２＿６０９３１（配列番号２０）、Ｔｒｉｒｅ２＿４８４３８（配列番号８）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０８０１３（配列番号６２）、Ｔｒｉｒｅ２＿６８０９７（配列番号２６）、Ｔｒｉｒｅ２＿４９３３（配列番号２）、Ｔｒｉｒｅ２＿７２９９３（配列番号３８）、Ｔｒｉｒｅ２＿１１９９８６（配列番号６８）、Ｔｒｉｒｅ２＿５５１０５（配列番号１４）、Ｔｒｉｒｅ２＿６８４２５（配列番号２９）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０３１２２（配列番号５３）、Ｔｒｉｒｅ２＿５６７５（配列番号５）、Ｔｒｉｒｅ２＿１２１７５７（配列番号７７）又はＴｒｉｒｅ２＿７７２９１（配列番号４７）の欠失を含む変異細胞は、炭素源として２％（ｗ／ｗ）グルコース／ソホロースを用いて２８℃で発酵させた場合に（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の増強を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表４）は、そのようなグルコース／ソホロース（誘導）条件下で（親細胞に対して）増加した量の総タンパク質及び／又は増加した量のＣＢＨ１を生産する。
【0338】
実施例３
３４℃でのタンパク質生産の改善
本実施例では、出願人は、１６６個の調節タンパク質欠失ライブラリー変異体（実施例２）をスクリーニングして、調節タンパク質欠失のいずれかが、３４℃のより高い培養温度（例えば、表５及び表６を参照されたい）でタンパク質生産の改善をさらにもたらすかどうかを決定した。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を表５に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
３４℃でのタンパク質生産の改善
本実施例では、出願人は、１６６個の調節タンパク質欠失ライブラリー変異体（実施例２）をスクリーニングして、調節タンパク質欠失のいずれかが、３４℃のより高い培養温度（例えば、表５及び表６を参照されたい）でタンパク質生産の改善をさらにもたらすかどうかを決定した。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を表５に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表5】
【0339】
上記の表５に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）、Ｔｒｉｒｅ２＿６７２０９（配列番号２３）又はＴｒｉｒｅ２＿１２２７８３（配列番号８０）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース放出条件下、３４℃で発酵させた場合、（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の増強を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表５）は、そのようなラクトース（誘導）条件下で（親細胞に対して）増加した量の総タンパク質及び／又は増加した量のＣＢＨ１を生産する。
【0340】
同様に、欠失が１２０時間のインキュベーション後にグルコース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の増加をもたらした調節タンパク質を表６に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表6】
【0341】
したがって、上記の表６に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６７０５（配列番号４１）、Ｔｒｉｒｅ２＿１２０５９７（配列番号７４）、Ｔｒｉｒｅ２＿４９２３２（配列番号１１）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０８７７５（配列番号６５）又はＴｒｉｒｅ２＿６０５６５（配列番号１７）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出条件下３４℃で発酵させた場合に（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の増強を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表６）は、（親細胞に対して）誘導基質の非存在下、３４℃で増加した量の総タンパク質及び／又は増加した量のＣＢＨ１を生産する。
【0342】
実施例４
タンパク質生産速度の改善
本実施例では、欠失がより高いタンパク質生産速度をもたらす調節タンパク質を、７２時間の早い時点でのタンパク質生産の比較、続いて１２０時間での最終タンパク質生産測定によって決定した。より具体的には、以下の表７～９に示すように、欠失が７２時間でより高い生産をもたらし、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０と比較して１２０時間で同等又は改善されたタンパク質生産をもたらす調節タンパク質のみを選択した。
タンパク質生産速度の改善
本実施例では、欠失がより高いタンパク質生産速度をもたらす調節タンパク質を、７２時間の早い時点でのタンパク質生産の比較、続いて１２０時間での最終タンパク質生産測定によって決定した。より具体的には、以下の表７～９に示すように、欠失が７２時間でより高い生産をもたらし、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０と比較して１２０時間で同等又は改善されたタンパク質生産をもたらす調節タンパク質のみを選択した。
【0343】
例えば、欠失が２８℃又は３４℃で７２時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおけるタンパク質生産速度の増加をもたらした調節タンパク質を以下の表７に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表7】
【0344】
上記の表７に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース放出プレートにおいて２８℃で７２時間培養した後、（親細胞に対して）タンパク質生産速度の増強を含む。さらに、表７に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース放出プレートにおいて３４℃で７２時間培養した後、（親細胞に対して）タンパク質生産速度の増強を含む。したがって、上に例示したように、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表７）は、（親細胞に対して）タンパク質生産速度の増加を示す。
【0345】
同様に、欠失が２８℃又は３４℃で７２時間のインキュベーション後にグルコース放出プレートにおいてタンパク質生産速度の増加をもたらした調節タンパク質を以下の表８に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表8】
【0346】
上記の表８に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出プレートにおいて２８℃で７２時間培養した後に、増強されたタンパク質生産速度（すなわち、親細胞に対して）を含む。同様に、表８において上記で示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７６８７２（配列番号４４）又はＴｒｉｒｅ２＿７８１６２（配列番号５０）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出プレートにおける３４℃での７２時間の培養後に、増強されたタンパク質生産速度を含む。したがって、上に例示したように、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表８）は、（親細胞に対して）タンパク質生産速度の増加を示す。
【0347】
さらに、欠失が、２８℃で７２時間のインキュベーション後に炭素源として２％グルコース／ソホロースを含むポリスチレンプレートにおけるタンパク質生産速度の増加をもたらした調節タンパク質を以下の表９に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表9】
【0348】
上記の表９に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿７８１６２（配列番号５０）又はＴｒｉｒｅ２＿１０５８４９（配列番号５９）の欠失を含む変異細胞は、炭素源として２％（ｗ／ｗ）グルコース／ソホロースを含む培地中、２８℃で７２時間培養した後のタンパク質生産速度の増強を含む。したがって、上に例示したように、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表９）は、（親細胞に対して）タンパク質生産速度の増加を示す。
【0349】
実施例５
２８℃でのタンパク質生産の減少
１６６個の調節タンパク質欠失変異体のサブセットを、様々な条件下でのタンパク質生産の改善についてスクリーニングした。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、以下の表１０に、その調節タンパク質欠失が総タンパク質生産の減少をもたらしたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質欠失変異体の予測タンパク質配列（配列番号）を示す。
２８℃でのタンパク質生産の減少
１６６個の調節タンパク質欠失変異体のサブセットを、様々な条件下でのタンパク質生産の改善についてスクリーニングした。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、以下の表１０に、その調節タンパク質欠失が総タンパク質生産の減少をもたらしたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）調節タンパク質欠失変異体の予測タンパク質配列（配列番号）を示す。
【表10-1】
【表10-2】
【0350】
例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける２８℃でのタンパク質生産の減少をもたらした調節タンパク質を以下の表１１に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、及びブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表11】
【0351】
表１１に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿３６０５（配列番号８４）、Ｔｒｉｒｅ２＿４７４８（配列番号８５）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４７８１（配列番号９３）、Ｔｒｉｒｅ２＿４８７７３（配列番号９５）、Ｔｒｉｒｅ２＿５３４８４（配列番号１００）、Ｔｒｉｒｅ２＿５８１３０（配列番号１０３）、Ｔｒｉｒｅ２＿５９６０９（配列番号１０５）、Ｔｒｉｒｅ２＿６５０７０（配列番号１０８）、Ｔｒｉｒｅ２＿６５８９５（配列番号１０９）、Ｔｒｉｒｅ２＿７１０８０（配列番号１１３）、Ｔｒｉｒｅ２＿７１６８９（配列番号１１４）、Ｔｒｉｒｅ２＿７２０７６（配列番号１１５）、Ｔｒｉｒｅ２＿７３５５９（配列番号１１７）、Ｔｒｉｒｅ２＿７３６８９（配列番号１１８）、Ｔｒｉｒｅ２＿７６０３９（配列番号１１９）、Ｔｒｉｒｅ２＿１１９８２６（配列番号１３１）、Ｔｒｉｒｅ２＿１２１１６４（配列番号１３２）、Ｔｒｉｒｅ２＿１２１６０２（配列番号１３４）又はＴｒｉｒｅ２＿１２２４５７（配列番号１３５）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース（誘導）条件下で２８℃において発酵させた場合、低下した（減少した）タンパク質生産性表現型（すなわち、親細胞に対して）を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表１１）は、総タンパク質の量を減少させ、ＣＢＨ１の量を減少させ、（親株と比較してＰＡＳＣアッセイによって例示されるように）より低い糖化活性をもたらす。
【0352】
同様に、欠失が１２０時間のインキュベーション後にグルコース放出プレートにおける２８℃でのタンパク質生産の減少をもたらした調節タンパク質を表１２に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表12】
【0353】
例えば、表１２に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿１９４１（配列番号８２）、Ｔｒｉｒｅ２＿２１４８（配列番号８３）、Ｔｒｉｒｅ２＿５６６４（配列番号８６）、Ｔｒｉｒｅ２＿５９２７（配列番号８７）、Ｔｒｉｒｅ２＿２１９９７（配列番号８８）、Ｔｒｉｒｅ２＿２２７８５（配列番号９０）、Ｔｒｉｒｅ２＿３６７０３（配列番号９１）、Ｔｒｉｒｅ２＿４８７７３（配列番号９５）、Ｔｒｉｒｅ２＿４９９１８（配列番号９６）、Ｔｒｉｒｅ２＿５２４３８（配列番号９７）、Ｔｒｉｒｅ２＿５２９２４（配列番号９８）、Ｔｒｉｒｅ２＿５３１０６（配列番号９９）、Ｔｒｉｒｅ２＿５５２７４（配列番号１０１）、Ｔｒｉｒｅ２＿５６２１４（配列番号１０２）、Ｔｒｉｒｅ２＿５９３５３（配列番号１０４）、Ｔｒｉｒｅ２＿５９６０９（配列番号１０５）、Ｔｒｉｒｅ２＿６０５５８（配列番号１０６）、Ｔｒｉｒｅ２＿６１４７６（配列番号１０７）、Ｔｒｉｒｅ２＿６５８９５（配列番号１０９）、Ｔｒｉｒｅ２＿７０４１４（配列番号１１１）、Ｔｒｉｒｅ２＿７０９９１（配列番号１１２）、Ｔｒｉｒｅ２＿７１６８９（配列番号１１４）、Ｔｒｉｒｅ２＿７３４１７（配列番号１１６）、Ｔｒｉｒｅ２＿７６５９０（配列番号１２０）、Ｔｒｉｒｅ２＿７７８７８（配列番号１２１）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５７８４（配列番号１２２）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５８８０（配列番号１２３）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９１７（配列番号１２４）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９８０（配列番号１２５）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０５９８９（配列番号１２６）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０６００９（配列番号１２７）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０６７２０（配列番号１２８）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０９２７７（配列番号１２９）、Ｔｒｉｒｅ２＿１１０９０１（配列番号１３０）又はＴｒｉｒｅ２＿１２１３１０（配列番号１３３）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出条件下で２８℃で発酵した場合、（親細胞に対して）低下した（減少した）タンパク質生産性表現型を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表１２）は、そのようなグルコース放出条件下で（親細胞に対して）減少した量の総タンパク質又は減少した量のＣＢＨ１を生産する。
【0354】
さらに、以下の表１３に記載されるのは、１２０時間のインキュベーション後に炭素源として２％（ｗ／ｗ）グルコース／ソホロースを含むポリスチレンプレートにおいて２８℃でのタンパク質生産の減少をもたらした欠失調節タンパク質であり、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定、又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表13】
【0355】
表１３に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿１９４１（配列番号８２）、Ｔｒｉｒｅ２＿２２７８５（配列番号９０）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４２９０（配列番号９２）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４７８１（配列番号９３）、Ｔｒｉｒｅ２＿４５８６６（配列番号９４）、Ｔｒｉｒｅ２＿４８７７３（配列番号９５）、Ｔｒｉｒｅ２＿７２０７６（配列番号１１５）又はＴｒｉｒｅ２＿７６５９０（配列番号１２０）の欠失を含む変異細胞は、炭素源として２％（ｗ／ｗ）グルコース／ソホロースを用いて２８℃で発酵させた場合、（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の減少を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表１３）は、そのようなグルコース／ソホロース条件下で（親細胞に対して）減少した量の総タンパク質又は減少した量のＣＢＨ１を生産する。
【0356】
実施例６
３４℃でのタンパク質生産の減少
本実施例では、出願人は、１６６個の調節タンパク質欠失ライブラリー変異体（実施例２）をスクリーニングして、調節タンパク質欠失のいずれかが３４℃のより高い温度でタンパク質生産の減少をさらにもたらすかどうかを決定した（例えば、表１４及び表１５を参照されたい）。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の減少をもたらした調節タンパク質を表１４に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
３４℃でのタンパク質生産の減少
本実施例では、出願人は、１６６個の調節タンパク質欠失ライブラリー変異体（実施例２）をスクリーニングして、調節タンパク質欠失のいずれかが３４℃のより高い温度でタンパク質生産の減少をさらにもたらすかどうかを決定した（例えば、表１４及び表１５を参照されたい）。タンパク質生産性は、総タンパク質決定及び酵素活性アッセイによって測定した（実施例１）。例えば、欠失が１２０時間のインキュベーション後にラクトース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の減少をもたらした調節タンパク質を表１４に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表14】
【0357】
したがって、上記の表１４に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿４７４８（配列番号８５）、Ｔｒｉｒｅ２＿２１９９７（配列番号８８）、Ｔｒｉｒｅ２＿２２７７４（配列番号８９）、Ｔｒｉｒｅ２＿２２７８５（配列番号９０）、Ｔｒｉｒｅ２＿３６７０３（配列番号９１）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４２９０（配列番号９２）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４７８１（配列番号９３）、Ｔｒｉｒｅ２＿５９６０９（配列番号１０５）、Ｔｒｉｒｅ２＿６８０２８（配列番号１１０）、Ｔｒｉｒｅ２＿７１６８９（配列番号１１４）、Ｔｒｉｒｅ２＿７２０７６（配列番号１１５）又はＴｒｉｒｅ２＿７７８７８（配列番号１２１）の欠失を含む変異細胞は、ラクトース放出条件下で３４℃で発酵した場合に（親細胞に対して）低下した（減少した）タンパク質生産性表現型を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表１４）は、そのようなラクトース誘導条件下で（親細胞に対して）総タンパク質の量が減少し、ＣＢＨ１の量が減少する。
【0358】
同様に、欠失が１２０時間のインキュベーション後にグルコース放出プレートにおける３４℃でのタンパク質生産の減少をもたらした調節タンパク質を表１５に記載し、数値は、対照（野生型）株ＱＭ６ａΔｋｕ８０に対して、ＰＡＳＣ酵素アッセイ、ＣＢＨ１のＨＰＬＣ測定又はブラッドフォードによって測定された総タンパク質について計算された性能指数（ＰＩ）を表す。
【表15】
【0359】
したがって、上記の表１５に示されるように、調節タンパク質Ｔｒｉｒｅ２＿２２７７４（配列番号８９）、Ｔｒｉｒｅ２＿２２７８５（配列番号９０）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４２９０（配列番号９２）、Ｔｒｉｒｅ２＿４４７８１（配列番号９３）、Ｔｒｉｒｅ２＿４８７７３（配列番号９５）、Ｔｒｉｒｅ２＿７２０７６（配列番号１１５）、Ｔｒｉｒｅ２＿１０６００９（配列番号１２７）又はＴｒｉｒｅ２＿１２３７１３（配列番号１３６）の欠失を含む変異細胞は、グルコース放出条件下３４℃で発酵した場合に（親細胞に対して）タンパク質生産性表現型の減少を含む。例えば、上述の調節タンパク質の生産が欠損した変異細胞（表１５）は、（親細胞に対して）そのようなグルコース放出条件下で、減少した量の総タンパク質及び減少した量のＣＢＨ１を生産する。
【0360】
実施例７
真菌調節タンパク質オルソログ
本実施例では、出願人は、真菌種アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＡＴＣＣ １０１５ ｖ４．０、マイセリオフィソラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（スポロトリカム・サーモフィル（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））ｖ２．０、及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０に対する３６個の調節因子の相同性に基づく検索を行った。以下に示すように、表１６は、これらの選択された真菌種群について同定されたオルソログを列挙している。
真菌調節タンパク質オルソログ
本実施例では、出願人は、真菌種アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＡＴＣＣ １０１５ ｖ４．０、マイセリオフィソラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（スポロトリカム・サーモフィル（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））ｖ２．０、及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０に対する３６個の調節因子の相同性に基づく検索を行った。以下に示すように、表１６は、これらの選択された真菌種群について同定されたオルソログを列挙している。
【表16-1】
【表16-2】
【表16-3】
【0361】
参考文献
欧州特許第０２１５５９４号明細書
国際公開第２０２１／１０２２３８号パンフレット
国際公開第２００８／０９７６１９号パンフレット
国際公開第２００５／０５６７７２号パンフレット
国際公開第２００８／０８００１７号パンフレット
国際公開第２０１１／１５１５１２号パンフレット
国際公開第２０１１／１５１５１３号パンフレット
国際公開第２０１１／１５１５１５号パンフレット
国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレット
国際公開第２０１３／１０２６７４号パンフレット
国際公開第２０１４／０９３２７５号パンフレット
国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット
米国特許第６，０２２，７２５号明細書
米国特許第６，２５５，１１５号明細書
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国際公開第２００５／０５６７７２号パンフレット
国際公開第２００８／０８００１７号パンフレット
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国際公開第２０１４／０９３２７５号パンフレット
国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
表１に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【請求項2】
表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する組換え真菌細胞。
【請求項3】
表１に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含み、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現する１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している組換え真菌細胞。
【請求項4】
前記細胞が、表１に記載のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産が欠損している、請求項１又は請求項３に記載の組換え真菌細胞。
【請求項5】
目的タンパク質を発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
【請求項6】
表１０に示されるタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む調節タンパク質をコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）プロモーターを含むポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含む組換え真菌細胞。
【請求項8】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、内因性目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する組換え真菌細胞。
【請求項9】
請求項６に記載の少なくとも１つの導入ポリヌクレオチドを含み、異種目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする少なくとも１つの導入カセットを発現する組換え真菌細胞。
【請求項10】
前記導入カセットが、前記異種ＰＯＩをコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーターを含む、請求項９に記載の組換え真菌細胞。
【請求項11】
表１に示される調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質の生産において前記組換え細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
【請求項12】
前記内因性ＰＯＩがセルラーゼである、請求項８に記載の組換え真菌細胞。
【請求項13】
前記異種ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質及び免疫原性タンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の組換え真菌細胞。
【請求項14】
セルラーゼの生産を増強するための方法であって、（ａ）セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
工程の前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、方法。
【請求項15】
前記組換え細胞が、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質をコードする１つ以上の導入ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
セルラーゼの生産を増強するための方法であって、（ａ）セルラーゼを発現する親真菌細胞を取得し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１０に記載の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の調節タンパク質を過剰発現するその組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
工程の前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量のセルラーゼを生産する、方法。
【請求項17】
前記組換え細胞が、表１の調節タンパク質に対して少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産において前記細胞に欠損させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記セルラーゼが、セロビオヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
目的タンパク質（ＰＯＩ）の生産を増強するための方法であって、（ａ）ＰＯＩをコードする発現カセットを親真菌細胞に導入し、前記親細胞を遺伝子改変して、表１に記載の調節タンパク質と少なくとも８０％の同一性を含む１つ以上の天然調節タンパク質の生産が欠損した組換え真菌細胞を取得することと、
（ｂ）前記組換え細胞を培養することと、を含み、
前記組換え細胞が、同じ条件下で培養された前記親細胞に対して増加した量の前記ＰＯＩを生産する、方法。
【請求項20】
前記ＰＯＩをコードする前記カセットが、前記ＰＯＩをコードする下流（３’）核酸に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＰＯＩが、酵素、ペプチド、抗体、受容体タンパク質、動物飼料タンパク質、ヒト食品タンパク質、タンパク質生物製剤、治療用タンパク質及び免疫原性タンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】