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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-15
(54)【発明の名称】血管内ステント用の生体模倣コーティング
(51)【国際特許分類】
A61L 33/12 20060101AFI20241108BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241108BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241108BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20241108BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20241108BHJP
A61L 31/10 20060101ALI20241108BHJP
A61K 38/16 20060101ALN20241108BHJP
C07K 7/08 20060101ALN20241108BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20241108BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241108BHJP
【ＦＩ】
A61L33/12
A61P9/00
A61P9/10 101
A61P7/02
A61P9/10
A61P7/04
A61L31/10
A61K38/16
C07K7/08 ZNA
C07K7/06
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532974
(86)(22)【出願日】2022-12-02
(85)【翻訳文提出日】2024-07-31
(86)【国際出願番号】 IB2022000684
(87)【国際公開番号】W WO2023099957
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】PCT/IB2021/000860
(32)【優先日】2021-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンスティチュート、ナシオナル、ドゥ、ラ、サンテ、エ、ドゥ、ラ、ルシェルシュ、メディカル
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】505429360
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ パリ １３ パリ ノール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ １３ － ＰＡＲＩＳ ＮＯＲＤ
【住所又は居所原語表記】９９，ａｖｅｎｕｅ Ｊｅａｎ－Ｂａｐｔｉｓｔｅ Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｆ－９３４３０ Ｖｉｌｌｅｔａｎｅｕｓｅ，ＦＲＡＮＣＥ
(71)【出願人】
【識別番号】513233470
【氏名又は名称】アルシメディク
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＣＨＩＭＥＤＩＣＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ジュゼッピーナ、カリジューリ
(72)【発明者】
【氏名】アントニオ、ニコレッティ
(72)【発明者】
【氏名】シャルル、スカーベック
(72)【発明者】
【氏名】イザベル、ルフェーブル
(72)【発明者】
【氏名】クリストフ、ビュロー
【テーマコード（参考）】
4C081
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C081AC06
4C081BA01
4C081BA05
4C081CD112
4C081DA03
4C081DC03
4C081EA06
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA65
4C084MA67
4C084NA06
4C084NA10
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA451
4C084ZA452
4C084ZA531
4C084ZA532
4C084ZA541
4C084ZA542
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA14
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045BA20
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA34
4H045FA33
(57)【要約】
血管内ステント用の生体模倣コーティング
本発明者らは、移植されたデバイスと接触できるすべての健康な内皮細胞および休止血小板および白血球上での無傷のＣＤ３１分子の結合を可能にするペプチドを合成した。したがって、これらの細胞は、循環および血管新生組織の恒常性を維持するために不可欠なＣＤ３１のトランスホモフィリック結合によって伝達される「ｌｅａｖｅ－ｍｅ－ａｌｏｎｅ」シグナルを受け取ることができる。血栓性または生命を脅かす出血性または血栓塞栓性合併症の発生は、血管内デバイスの使用を妨げてきた。本発明の模倣ペプチドを有するデバイスは、血小板および白血球によって健康な内皮、すなわち「自己」成分として認識されるため、迅速に統合される。さらに、生理的な内皮細胞表現型で迅速に内皮化されるそれらの能力も、デバイス移植部位での血小板および白血球の活性化を長期的に制限する。したがって、本発明は、トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣するペプチドに関するものである。
本発明者らは、移植されたデバイスと接触できるすべての健康な内皮細胞および休止血小板および白血球上での無傷のＣＤ３１分子の結合を可能にするペプチドを合成した。したがって、これらの細胞は、循環および血管新生組織の恒常性を維持するために不可欠なＣＤ３１のトランスホモフィリック結合によって伝達される「ｌｅａｖｅ－ｍｅ－ａｌｏｎｅ」シグナルを受け取ることができる。血栓性または生命を脅かす出血性または血栓塞栓性合併症の発生は、血管内デバイスの使用を妨げてきた。本発明の模倣ペプチドを有するデバイスは、血小板および白血球によって健康な内皮、すなわち「自己」成分として認識されるため、迅速に統合される。さらに、生理的な内皮細胞表現型で迅速に内皮化されるそれらの能力も、デバイス移植部位での血小板および白血球の活性化を長期的に制限する。したがって、本発明は、トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣するペプチドに関するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣するペプチドを含むコーティングを含む医療デバイス。
【請求項2】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、以下の配列の１つを含む、請求項１に記載の医療デバイス：ａ）
【表1】
１ＱはＱ、Ｃ、Ｌ、Ｋ、またはＲのいずれか１つであってもよく、
２ＨはＨ、Ｉ、Ｖ、ＱまたはＲのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬ、Ｒ、Ｖ、ＦまたはＥのいずれか１つであってもよく、
９ＤはＤ、ＥまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１３ＦはＦ、Ｖ、ＬまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１４ＹはＹ、Ｈ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１５ＮはＮまたはＤのいずれか１つであってもよく、
１６ＩはＩ、Ｖ、ＴまたはＡのいずれか１つであってもよく、
１７ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、
１８ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい；
ｂ）
【表2】
２Ｋは、ＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
３ＳはＣまたはＳのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、ＲまたはＳのいずれか１つであってもよく、
５ＶはＶまたはＡのいずれか１つであってもよく、
６ＩはＩ、Ｋ、Ｖ、Ｌ、ＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
８ＮはＮ、ＳまたはＤのいずれか１つであってもよく、
９ＮはＮ、Ｓ、ＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１１ＥはＥ、Ｑ、Ｖ、ＫまたはＭのいずれか１つであってもよく、
１２ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１３ＴはＴ、ＡまたはＰのいずれか１つであってもよく、
１４ＴはＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
１６ＥはＥ、Ａ、ＱまたはＤのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい；
ｃ）
【表3】
３ＣはＣ、Ｖ、ＭまたはＩのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、Ｉ、ＭまたはＥのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬまたはＶのいずれか１つであってもよく、
６ＤはＤまたはＮのいずれか１つであってもよく、
７ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
８ＫはＫ、Ｔ、Ｍ、ＲまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１１ＩはＩ、Ｔ、Ｍ、ＶまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１２ＱはＱまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１４ＧはＧまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１６ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１８ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１９ＮはＮ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＧまたはＨのいずれか１つであってもよく、
２２ＶはＶ、ＭまたはＬのいずれか１つであってもよく、
２３ＰはＰ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、ＬまたはＲのいずれか１つであってもよく、
２４ＥはＥ、ＧまたはＮのいずれか１つであってもよく、
２６ＫはＫ、Ｑ、Ｅ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。または
ｄ）ａ）からｃ）の任意の組み合わせ、特にａ）とｂ）の組み合わせ、およびａ）とｃ）の組み合わせ。
【請求項3】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、以下の配列の１つを含む、請求項１に記載の医療デバイス。【表4】
【請求項4】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、前記配列のうちの２つを含む、請求項１に記載の医療デバイス。
【請求項5】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、構造（ＩＡ）に基づくペプチド、
【表5】
【表6】
構造（ＩＡ）に基づくペプチド、
【表7】
【表8】
【請求項6】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、以下の配列を含むことを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。【表9】
【請求項7】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは環状ペプチドである、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項8】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、任意の末端にリンカーおよび／またはスペーサーおよび／または尾部を含むか、あるいはアミノ酸残基に結合されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項9】
前記リンカーおよび／またはスペーサーおよび／または尾部が以下のものまたはそれらの組み合わせに代表される、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。【表10】
【請求項10】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドが、Ｃ末端および／またはＮ末端に修飾を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項11】
前記修飾が以下から選択される、請求項１０に記載の医療デバイス。【表11】
【請求項12】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、以下のいずれか１つの修飾を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス：・システイン残基が対応するホモシステインで置換されてもよい；
・Ｌ－アミノ酸残基が対応するＤ－アミノ酸残基で置換されてもよい。
【請求項13】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する前記ペプチドは、以下の構造の１つを有することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。【表12】
【請求項14】
医療用途に用いる（医療用途のための、）、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項15】
血管病変の予防または治療に用いる（血管病変の予防または治療のための）、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項16】
心臓弁病変、アテローム性動脈硬化症、血栓症、虚血、出血、再狭窄、動脈瘤を含む群から選択される血管病変の予防または治療に用いる、請求項１５に記載の医療デバイス。（心臓弁病変、アテローム性動脈硬化症、血栓症、虚血、出血、再狭窄、動脈瘤を含む群から選択される血管病変の予防または治療のための、請求項１５に記載の医療デバイス）
【請求項17】
ステント内狭窄に代表される病的状態を予防するための医療用途に用いる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医療デバイス。（ステント内狭窄に代表される病的状態を予防するための医療用途のための、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医療デバイス。）
【請求項18】
ヒトまたは動物における医療用途に用いる（ヒトまたは動物における医療用途のための）、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項19】
トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣するペプチドを含むコーティングで部分的または完全にコーティングされている、前述の請求項のいずれか一項に記載の医療デバイス。
【請求項20】
バルーン拡張型ステント、自己拡張型スキャフォールド、グラフトステントのポリマーチューブ、分流メッシュ、大動脈チューブ、心臓弁、ステントリトリーバー、経カテーテル僧帽弁デバイス、カテーテル弁尖またはそれらの任意の部分を含む群から選択される、請求項１９に記載の医療デバイス。
【請求項21】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のデバイスを使用することを含む、心臓および血管の病変を予防または治療するための方法。
【請求項22】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の医療デバイスを使用することを含む、ステント内狭窄に代表される病気を予防するための方法。
【請求項23】
ヒトまたは動物に対して実施される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のデバイスの移植を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記医療デバイスが移植された個体は移植後に、ａ）抗Ｐ２Ｙ１２療法を受けず、
ｂ）従来の抗血小板剤二剤併用療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨される用量よりも著しく少ない用量の抗Ｐ２Ｙ１２療法を受け、
ｃ）従来の抗血小板剤二剤併用療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨される期間よりも著しく短い期間にわたって抗Ｐ２Ｙ１２療法を受け、または
ｂ）とｃ）の任意の組み合わせを受ける、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記医療デバイスが移植された個体は、特に血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症）、フォン・ウィレブランド病、ならびにＩ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩを含む希少因子欠乏症から選択される出血性疾患を患っている、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医療分野に応用され、特に埋め込み型医療デバイスの統合と性能を向上させることを目的とする。
【背景技術】
【0002】
医療デバイスの生体適合性を向上させるための戦略が必要である。これは、医療デバイスの植え込みに対する生体組織の反応を防ぐためであり、患者に予期せぬリスクをもたらす可能性がある。
【0003】
「異物反応」は、植え込み部位の組織の損傷によって引き起こされ、生体適合性のない材料が血液と接触することによって開始される。
【0004】
血小板の付着と活性化に続いて炎症細胞の動員が続き、慢性炎症と肉芽腫性組織の形成を特徴とする異常な創傷治癒配列が続く。
【0005】
損傷が発生すると、内皮バリアの中断により、損傷を封じ込めるために血小板が活性化され、白血球が浸潤して破片を除去し、組織再生のための部位を準備する。
【0006】
しかし、医療機器はクリアランスされることはない。
【0007】
その結果、迅速な内皮化がない場合、移植部位で白血球と血小板の強い活性化が起こる。
【0008】
過剰な血小板の付着と凝集は血流の閉塞（虚血）を引き起こす可能性があり、活性化された血小板と白血球によって放出されるプロテアーゼは血管壁の破裂（出血）を引き起こす可能性がある。
【0009】
このような状態の一つは、心臓弁や血管デバイスの存在によって引き起こされ、これらは体にとって異物と見なされる。
【0010】
それが、重篤な心血管状態の予防と治療のための弁および血管デバイスの使用を妨げている。
【0011】
ＣＤ３１は、血小板、白血球、および内皮細胞（ＥＣ）に構成的かつ排他的に発現する膜貫通型糖タンパク質である。健康な状態では、トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１相互作用により、内皮細胞、血小板、および白血球が「自己」を認識し、不適切な活性化を防ぐ。
【0012】
血液と接触するインプラントデバイスの好ましい問題は、それらの表面を「生体適合性」にする治療によって達成され、機能的な内皮層の迅速な形成を可能にし、生体材料の適切な統合を保証する。
【0013】
健康な内皮によるＣＤ３１の豊富な発現は、循環および血管化組織の恒常性の維持に重要な役割を果たす。
【0014】
Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ（Ｓｔｒｏｋｅ、２０２１年２月）は、ＣＤ３１模倣ペプチドＰ８ＲＩ（ｋｗｐａｌｆｖｒ）の固定化が血液成分の反応を減少させ、生体内皮細胞の接着を増加させ、生体での血管内デバイスの統合を強化することを明らかにしている。
【0015】
Ｄｉａｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ （ＥＨＪ、２０２１）は、Ｐ８ＲＩと呼ばれる可溶性ペプチドがＣＤ３１アゴニストのように作用することを明らかにした。したがって、ＣＤ３１模倣金属ステントコーティングが内皮細胞および血液成分の接着に与える影響と、生体での内皮ストラットの被覆および異物反応による新内膜成長に与える影響が研究された。
【0016】
ＣＤ３１は、膜遠位のＮ末端から番号が付けられた６つの細胞外Ｉｇ様ドメイン、短い膜貫通フラグメント、および細胞質尾から構成されるＩ型膜貫通糖タンパク質である。
【0017】
ＣＤ３１の従事は、最初の細胞Ａによって発現された分子のドメイン１および２と、相互作用する細胞Ｂによって発現された同じドメインとの間のトランスホモフィリックに依存した。
【0018】
相互作用するドメイン１および２（それぞれ「ＩｇＬ１」および「ＩｇＬ２」と呼ばれる）に関して、より具体的には、これらは二層のβシートを持つ古典的なＩｇドメイン構造を採用し、逆平行βストランドがジスルフィド結合を形成する一対のシステインによって固定された。
【0019】
２つの相互作用する細胞のＣＤ３１分子間のトランスホモフィリックにより、ＣＤ３１二量体界面には疎水性および親水性相互作用が含まれた。
【0020】
トランスホモフィリックするＣＤ３１分子の２つのＩｇＬ１－２フラグメントは、１つのβシートの側面（ＩｇＬ１が反対のモノマーのＩｇＬ２と相互作用する）と面対面の逆平行パターンで互いにパックされた。
【0021】
結晶構造には２つの相互作用する表面があり、１つは鎖ＡのＩｇＬ１（ＩｇＬ１－Ａ、すなわち最初の細胞ＡのＣＤ３１分子のＩｇＬ１ドメイン）と鎖ＢのＩｇＬ２（ＩｇＬ２－Ｂ、すなわち相互作用する細胞ＢのＣＤ３１分子のＩｇＬ２ドメイン）の間、もう１つは鎖ＡのＩｇＬ２（ＩｇＬ２－Ａ、すなわち最初の細胞ＡのＣＤ３１分子のＩｇＬ２ドメイン）と鎖ＢのＩｇＬ１（ＩｇＬ１－Ｂ、すなわち相互作用する細胞ＢのＣＤ３１分子のＩｇＬ１ドメイン）の間であった。
【0022】
ＣＤ３１ドメイン１および２のトランスホモフィリックは、トランスメンブランおよび膜近傍の細胞外配列の強いシスホモフィリックと側方変位によって分子のクラスター化を促進した。
【0023】
このシスホモフィリックは細胞活性化の部位で発生し、ＣＤ３１の調節機能を許可するために不可欠である。なぜなら、このタンパク質は自己リン酸化することができないからである。
【0024】
ＣＤ３１のリン酸化は、分子が活性化されたチロシンキナーゼ受容体の近くにクラスターとして留まる能力に依存した。
【0025】
細胞が活性化されると、細胞膜プロテアーゼの活性化がＣＤ３１タンパク質の細胞外部分の大部分の切断と脱落を促進した。
【0026】
ＣＤ３１の脱落は、分子のトランスホモフィリックを無効にした。なぜなら、そのトランス同種間部分（ドメイン１と２の間に含まれる）が失われ、ＣＤ３１のクラスターが解消されるからである。
【0027】
Ｐ８ＲＩ配列に含まれるアミノ酸は、ＣＤ３１のシス同種間接膜部分から発行される。Ｐ８ＲＩはこの配列と共にクラスターを形成し、炎症や血栓症の部位で活性化された内皮細胞、血小板、白血球において切断されたＣＤ３１分子の調節シグナル特性を維持する。
【発明の概要】
【0028】
本特許出願の発明者は、トランス同種間（ドメイン１と２）ＣＤ３１－ＣＤ３１細胞間相互作用を模倣する特性を持ついくつかのペプチドを驚くべきことに発見した。
【発明の目的】
【0029】
最初の目的によると、トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する特性を持つペプチドが開示される。
【0030】
好ましい側面として、これらのペプチドは３つの異なる一般的な構造を持つことができる。
【0031】
他の側面として、これらのペプチドの誘導体が開示される。
【0032】
第二の目的によると、開示されたペプチドまたはペプチド誘導体の医療用途が開示される。
【0033】
好ましい側面として、その医療用途は心臓および血管の病理を治療するための医療デバイスの植え付けに関連する合併症の予防である。
【0034】
別の好ましい側面として、その医療用途は心臓血管の病理の治療である。
【0035】
発明の第三の目的によると、開示されたバイオミメティックペプチドを含むコーティングが開示される。
【0036】
発明の第四の目的によると、開示されたバイオミメティックペプチドを含むコーティングの調製方法が開示される。
【0037】
第五の目的によると、ペプチドまたは発明のコーティングでコーティングされた部分を含むデバイスが開示される。
【0038】
第六の目的によると、血管病理の予防、治療、または診断のための方法が開示されており、発明のバイオミメティックペプチドの使用を含む。
【0039】
そじみた使用は、発明によるペプチドでコーティングされたデバイスの植え付けを含む場合がある。
【0040】
別の目的によると、発明のバイオミメティックペプチドをデバイスの表面に接着するための使用が開示される。
【0041】
実施形態によると、発明のバイオミメティックペプチドを血管デバイスに接着するための使用が開示される。
【0042】
さらに別の目的によると、発明のバイオミメティックペプチドを動脈血管の内皮化を促進し、内膜増殖を防止し、ターゲット血管内でデバイスを統合するための使用が開示される。
【発明の詳細説明】
【0043】
定義
本発明の目的のために、「バイオミメティック」という用語は自然な効果を模倣することを意味するものとする。
本発明の目的のために、「バイオミメティック」という用語は自然な効果を模倣することを意味するものとする。
【0044】
本発明において、バイオミメティックペプチドは、内皮、すなわち血管の内壁および特に動脈の内壁を覆う内皮細胞（ＥＣ）の層の自然な効果を模倣する特性を備えている。
【0045】
特に、健康な状態での内皮の自然な効果は、トランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１細胞間相互作用によって提供されるものを模倣している。
【0046】
さらに具体的には、前述の模倣活動は、内皮細胞（ＥＣ）、血小板細胞（循環血小板細胞）、および白血球を活性化しない効果を持っている。
【0047】
前述の模倣特性は、発明のペプチドで覆われた表面にも提供することができる。
【0048】
本特許出願の目的のために、発明のペプチドはトランスホモフィリックＣＤ３１－ＣＤ３１ドメイン１および２の細胞間相互作用を模倣する。
【0049】
「ホモフィリック」とは、同一の分子間の相互作用を意味し、本発明の目的のためには、それぞれが１つの細胞と相互作用する細胞によって発現される２つのＣＤ３１分子の相互作用を意味する。
【0050】
より具体的には、各ＣＤ３１分子内で、相互作用は細胞外ドメイン１およびドメイン２を通じて発生する。
【0051】
第一の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドはグループＩと呼ばれる。
【0052】
好ましい実施形態では、グループＩペプチドはＨｉｓ７１－Ｓｅｒ８７に対応するヒトＣＤ３１ ＩｇＬ１の領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。あるいは、ペプチドはＧｌｎ７０－Ｌｙｓ８９に対応するヒトＣＤ３１ＩｇＬ１の領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。オルソログ哺乳類ＣＤ３１分子のアミノ酸配列は、ｈｔｔｐｓ、／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５１７５／ｏｒｔｈｏｌｏｇ／？ｓｃｏｐｅ＝４０６７４で利用可能なＮＣＢＩオルソログデータベースから取得できる。対応する領域は、関心のあるＣＤ３１オルソログアミノ酸配列とヒトＣＤ３１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて熟練者によって決定される。
【0053】
一つの実施形態では、グループＩペプチドは、ジスルフィド結合と環状構造を提供する変異したＧｌｎ７０ｈＣｙｓおよびＭｅｔ８８ｈＣｙｓホモシステインを含む。
【0054】
グループＩペプチドは以下の配列を含む、
【表1】
【0055】
本発明の目的のために、前記配列内で、互いに独立して、１Ｑ（すなわち、配列番号、５３でＱと呼ばれる位置１の残基）は、Ｑ、Ｃ、Ｌ、Ｋ、またはＲのいずれか１つであってもよく、
２ＨはＨ、Ｉ、Ｖ、ＱまたはＲのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬ、Ｒ、Ｖ、ＦまたはＥのいずれか１つであってもよく、
９ＤはＤ、ＥまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１３ＦはＦ、Ｖ、ＬまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１４ＹはＹ、Ｈ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１５ＮはＮまたはＤのいずれか１つであってもよく、
１６ＩはＩ、Ｖ、ＴまたはＡのいずれか１つであってもよく、
１７ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、
１８ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
２ＨはＨ、Ｉ、Ｖ、ＱまたはＲのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬ、Ｒ、Ｖ、ＦまたはＥのいずれか１つであってもよく、
９ＤはＤ、ＥまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１３ＦはＦ、Ｖ、ＬまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１４ＹはＹ、Ｈ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、
１５ＮはＮまたはＤのいずれか１つであってもよく、
１６ＩはＩ、Ｖ、ＴまたはＡのいずれか１つであってもよく、
１７ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、
１８ＳはＳまたはＴのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
【0056】
コンセンサス配列の配列番号５３は、２０２２年１２月１日にＮＣＢＩオルソログデータベースから取得された哺乳類ＣＤ３１アミノ酸配列の複数配列アラインメントにおけるヒトＣＤ３１のアミノ酸配列の位置７０から８９に対応する領域に基づいている。Ｘ以外の残基は、哺乳類オルソログＣＤ３１アミノ酸配列における保存された残基に対応する。残基Ｘは、複数アラインメントにおける非常に可変な位置に対応する。
【0057】
グループＩのペプチドは以下を含む、ＳＰ７２２、ＳＰ７４５、ＳＰ７６５、ＳＰ１３７４、ＳＰ１３７５。
【0058】
第２の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドはグループＩＩとして参照される。
【0059】
好ましい実施形態では、グループＩＩペプチドはヒトＣＤ３１ ＩｇＬ１のＴｙｒ１０７－Ｇｌｕ１２２に対応する領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。あるいは、ペプチドはヒトＣＤ３１ ＩｇＬ１の１０６－１２４ａａに対応する領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。
【0060】
一つの実施形態では、変異した１０６ｈ Ｃｙｓおよび１２４ｈ Ｃｙｓホモシステインがジスルフィド結合および環状構造を提供する。
【0061】
グループＩＩペプチドは以下の配列を含みます、
【表2】
【0062】
本発明の目的のために、前記配列内で、互いに独立して、
２Ｋ（すなわち、配列番号、５４でＫと呼ばれる位置２の残基）はＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
３ＳはＣまたはＳのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、ＲまたはＳのいずれか１つであってもよく、
５ＶはＶまたはＡのいずれか１つであってもよく、
６ＩはＩ、Ｋ、Ｖ、Ｌ、ＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
８ＮはＮ、ＳまたはＤのいずれか１つであってもよく、
９ＮはＮ、Ｓ、ＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１１ＥはＥ、Ｑ、Ｖ、ＫまたはＭのいずれか１つであってもよく、
１２ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１３ＴはＴ、ＡまたはＰのいずれか１つであってもよく、
１４ＴはＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
１６ＥはＥ、Ａ、ＱまたはＤのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
２Ｋ（すなわち、配列番号、５４でＫと呼ばれる位置２の残基）はＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
３ＳはＣまたはＳのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、ＲまたはＳのいずれか１つであってもよく、
５ＶはＶまたはＡのいずれか１つであってもよく、
６ＩはＩ、Ｋ、Ｖ、Ｌ、ＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
８ＮはＮ、ＳまたはＤのいずれか１つであってもよく、
９ＮはＮ、Ｓ、ＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１１ＥはＥ、Ｑ、Ｖ、ＫまたはＭのいずれか１つであってもよく、
１２ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
１３ＴはＴ、ＡまたはＰのいずれか１つであってもよく、
１４ＴはＴまたはＳのいずれか１つであってもよく、
１６ＥはＥ、Ａ、ＱまたはＤのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
【0063】
コンセンサス配列の配列番号５４は、２０２２年１２月１日にＮＣＢＩオルソログデータベースから取得された哺乳類ＣＤ３１アミノ酸配列の複数配列アラインメントにおけるヒトＣＤ３１のアミノ酸配列の位置１０７から１２２に対応する領域に基づいている。Ｘ以外の残基は、哺乳類オルソログＣＤ３１アミノ酸配列における保存された残基に対応する。残基Ｘは、複数アラインメントにおける非常に可変な位置に対応する。
【0064】
グループＩＩのペプチドは以下を含みます、ＳＰ１０７２、ＳＰ１３７６。
【0065】
第３の側面によると、本発明のバイオミメティックペプチドはグループＩＩＩと呼ばれる。
【0066】
好ましい実施形態では、グループＩＩＩペプチドはヒトＣＤ３１ＩｇＬ２のＰｒｏ１
３３－Ｌｙｓ１５８に対応する領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。
３３－Ｌｙｓ１５８に対応する領域またはオルソログ哺乳類ＣＤ３１分子の対応する領域をカバーする。
【0067】
一つの実施形態では、グループＩＩＩペプチドは変異したＶａｌ１３５ｈ ＣｙｓおよびＣｙｓ１５２ｈ Ｃｙｓを含み、これによりジスルフィド結合と環状構造を提供する。
【0068】
グループＩＩＩペプチドは以下の配列を含む。
【表3】
【0069】
本発明の目的のために、前記配列内で、互いに独立して、
３Ｃ（すなわち、配列番号、５５でＣと呼ばれる位置３の残基）はＣ、Ｖ、ＭまたはＩのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、Ｉ、ＭまたはＥのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬまたはＶのいずれか１つであってもよく、
６ＤはＤまたはＮのいずれか１つであってもよく、
７ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
８ＫはＫ、Ｔ、Ｍ、ＲまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１１ＩはＩ、Ｔ、Ｍ、ＶまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１２ＱはＱまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１４ＧはＧまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１６ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１８ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１９ＮはＮ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＧまたはＨのいずれか１つであってもよく、
２２ＶはＶ、ＭまたはＬのいずれか１つであってもよく、
２３ＰはＰ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、ＬまたはＲのいずれか１つであってもよく、
２４ＥはＥ、ＧまたはＮのいずれか１つであってもよく、
２６ＫはＫ、Ｑ、Ｅ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
３Ｃ（すなわち、配列番号、５５でＣと呼ばれる位置３の残基）はＣ、Ｖ、ＭまたはＩのいずれか１つであってもよく、
４ＴはＴ、Ｉ、ＭまたはＥのいずれか１つであってもよく、
５ＬはＬまたはＶのいずれか１つであってもよく、
６ＤはＤまたはＮのいずれか１つであってもよく、
７ＫはＫまたはＲのいずれか１つであってもよく、
８ＫはＫ、Ｔ、Ｍ、ＲまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１１ＩはＩ、Ｔ、Ｍ、ＶまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１２ＱはＱまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１４ＧはＧまたはＥのいずれか１つであってもよく、
１６ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１８ＶはＶまたはＩのいずれか１つであってもよく、
１９ＮはＮ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＧまたはＨのいずれか１つであってもよく、
２２ＶはＶ、ＭまたはＬのいずれか１つであってもよく、
２３ＰはＰ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、ＬまたはＲのいずれか１つであってもよく、
２４ＥはＥ、ＧまたはＮのいずれか１つであってもよく、
２６ＫはＫ、Ｑ、Ｅ、ＲまたはＮのいずれか１つであってもよく、他のアミノ酸Ｘは任意の他のアミノ酸であってもよい。
【0070】
コンセンサス配列の配列番号５３は、２０２２年１２月１日にＮＣＢＩオルソログデータベースから取得された哺乳類ＣＤ３１アミノ酸配列の複数配列アラインメントにおけるヒトＣＤ３１のアミノ酸配列の位置１３３から１５８に対応する領域に基づいている。Ｘ以外の残基は、哺乳類オルソログＣＤ３１アミノ酸配列における保存された残基に対応する。残基Ｘは、複数アラインメントにおける非常に可変な位置に対応する。
【0071】
グループＩＩＩのペプチドは以下を含みます、ＳＰ１０７１、ＳＰ１３８０。
【0072】
第四の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドはグループＩＶａと呼ばれる。
【0073】
好ましい実施形態では、グループＩＶａペプチドはヘテロ二量体であり、以下を含みます、ａ）グループＩＩのペプチドとグループＩのペプチドが共有結合している。
【0074】
グループＩＶａのペプチドは以下を含みます、ＳＰ１３７９。
【0075】
第五の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドはグループＩＶｂと呼ばれる。
【0076】
好ましい実施形態では、グループＩＶｂペプチドはヘテロ二量体であり、以下を含みます、ａ）グループＩＩＩのペプチドとグループＩが共有結合している。
【0077】
グループＩＶｂのペプチドは以下を含む、ＳＰ１３８３。
【0078】
第一の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドは以下の配列ＩＡに基づいている。
【表4】
【0079】
第二の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドは以下の配列ＩＢに基づいている。
【表5】
【0080】
第三の側面によると、発明のバイオミメティックペプチドは以下の配列ＩＣに基づいている。
【表6】
【0081】
本発明の目的のために、バイオミメティックペプチドには環状ペプチドも含まれる。特に、システインまたはホモシステインを含むバイオミメティックペプチドは、ジスルフィド結合を介して環状形態にすることができる。
【0082】
本発明の目的のために、バイオミメティックペプチドはリンカーおよび／またはスペーサーおよび／または尾を含むことができ、オプションでアミノ酸配列で表されることがある。特に、該当する配列はペプチド末端または１つのアミノ酸残基に結合されることがある。
【0083】
特に好ましい実施形態では、該当するアミノ酸配列は以下の配列で表されることがある。
【表7】
【0084】
本発明の目的のために、バイオミメティックペプチドは、上記で説明した２つのペプチド配列を含むヘテロペプチドも含む。
【0085】
特に、ヘテロペプチドは以下を含むことがある。
【0086】
構造ＩＡに基づく配列を持つペプチドと構造ＩＢに基づく配列を持つペプチド、または構造ＩＡに基づく配列を持つペプチドと構造ＩＣに基づく配列を持つペプチド。
【0087】
ヘテロペプチドは、異なる配列のアミノ酸間またはリンカーおよび／またはスペーサー間のアセチルチオエーテル結合を介して結合されたペプチド配列を含むことがある。
【0088】
好ましい側面として、本発明のペプチドは以下の配列に基づいている。
【表8】
【0089】
好ましい側面として、本発明のペプチドは以下の配列に基づいている
【表9】
【0090】
好ましい側面として、本発明のペプチドは以下の構造に基づいている。
【表10】
【0091】
好ましい側面として、本発明のペプチドは以下の構造に基づいている。
【表11】
【0092】
特に好ましい側面として、本発明のヘテロペプチドは以下のペプチドを含むことを特徴とする。
【表12】
【0093】
好ましい側面によると、本発明のバイオミメティックペプチドは以下の変更を含むことができる、システイン残基が対応するホモシステイン残基に置換されることがある、Ｌ－アミノ酸が対応するＤ－アミノ酸に置換されることがある。本発明の好ましい実施形態によると、本発明のバイオミメティックペプチドは、以下から選択されたスペーサーおよび／またはリンカーおよび／または尾を含むことができる：
およびそれらの組み合わせ、例えば、
【表13】
【表14】
【0094】
本発明の目的のために、上記開示された構造はＣ末端および／またはＮ末端での変更を含む場合がある。
【0095】
特に、これらの変更は以下を含む場合がある。
【表15】
【0096】
発明の好ましい実施形態によると、以下のバイオミメティックペプチドが開示される。
【表16】
【0097】
本発明の目的のために、本発明のバイオミメティックペプチドは、上記開示された構造のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有するペプチドを含み、好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。本発明の開示において言及されるパーセント同一性は、比較される配列の最適なグローバルアラインメント後に決定され、その最適なグローバルアラインメントには、したがって、１つ以上の挿入、削除、切断および／または置換を含む場合がある。アラインメントはグローバルであり、比較される配列全体がその全長にわたって含まれることを意味する。アラインメントは「最適」であり、挿入、削除、切断および／または置換の数が可能な限り少なくなるように行われることを意味する。最適なグローバルアラインメントは、当業者によく知られている任意の配列解析方法を使用して実行され、パーセント同一性が計算される場合がある。手動比較に加えて、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアルゴリズムを使用してグローバルアラインメントを決定することも可能である。ヌクレオチド配列の場合、配列比較は、Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアなど、当業者によく知られている任意のソフトウェアを使用して実行される場合がある。使用されるパラメータは特に以下の通りである、「ギャップオープン」１０．０、「ギャップエクステンド」０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬマトリックス（ＮＣＢＩＥＭＢＯＳＳバージョンＮＵＣ４．４）。アミノ酸配列の場合、配列比較は、Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアなど、技術分野の熟練者によく知られている任意のソフトウェアを使用して実行できる。使用されるパラメータは特に以下の通りである、「ギャップオープン」は１０．０、「ギャップエクステンド」は０．５、そしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス。
【0098】
第二の目的によると、開示されたペプチドの医療用途が開示される。
【0099】
好ましい側面によれば、医療用途は血管病理の予防のためである。
【0100】
こじみた医療用途は、発明によるペプチドでコーティングされたデバイスの植え付けを含む場合がある。
【0101】
特に、現在の発明によると、これらの病理は、心臓弁病理、動脈硬化症、血栓症、虚血、出血、再狭窄、動脈瘤を含むグループから選択される。
【0102】
上記に加えて、ステント内狭窄によって表される病的状態の予防のための医療用途が開示される。
【0103】
別の好ましい側面によれば、医療用途は血管病理の治療のためである。
【0104】
上記の医療用途は、人間だけでなく獣医学分野の動物にも開示される。
【0105】
発明の第三の目的によると、開示されたバイオミメティックペプチドを含むコーティングが開示される。
【0106】
本発明の実施形態によれば、コーティングは単層コーティングであり、本発明の別の実施形態によれば、コーティングは多層コーティングである。
【0107】
発明の第四の目的によると、開示されたバイオミメティックペプチドを含むコーティングの調製方法が開示される。
【0108】
本発明の目的のために、デバイスまたはその一部のコーティングは、コーティングされる部分をコーティング浴に浸漬することによって、ディップコーティングで得ることができる。
【0109】
表面を機能化するためのよく知られた方法は、例えばＵＳ２０１８／０２９６７３２、ＷＯ２０２０／１０９８３６、またはＷＯ２０２１／２３９９０５に開示されるように、クリックケミストリーである。
【0110】
銅を使用しないクリックケミストリーは、アジド標識反応パートナーとのジアリールシクロオクチン部分（ＤＢＣＯ、アザジベンゾシクロオクチンのＡＤＩＢＯまたはジベンゾアザシクロオクチンのＤＩＢＡＣとしても知られる）の反応に基づいており、これはひずみ促進アルキンアジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）として知られている。このクリックケミストリーは室温で非常に速く、Ｃｕ（Ｉ）触媒を必要としない。ジアリールシクロオクチンは、アジドに対して非常に狭く特異的な反応性を持ち、安定したトリアゾールのほぼ定量的な収率をもたらする。反応は水性緩衝媒体で行うことができる。
【0111】
好ましい実施形態によれば、この方法は以下を含む三段階のディップコーティング法である：
・ポリドーパミンコーティングのための第一段階、
・適切なリンカーをグラフトするための第二段階、そして
・発明ペプチドでコーティングするための第三段階。
・ポリドーパミンコーティングのための第一段階、
・適切なリンカーをグラフトするための第二段階、そして
・発明ペプチドでコーティングするための第三段階。
【0112】
第一段階は、デバイスの表面またはその一部にポリドーパミン層のコーティングを実現することを意味し、ドーパミンからポリドーパミンコーティングされた表面を得るためのものである。
【0113】
ドーパミンは、いくつかの種類の基板上に非常に付着性の高いフィルムに自己重合することが知られている。ポリドーパミン（以下ＰＤＡ）は、ドーパミンの酸化によって形成される自己組織化ポリマーである。実際、ＰＤＡにはドーパミン、インドール、およびピロールユニットが含まれている。ＰＤＡは多様な反応性基を持つため、特に生体活性分子の固定化において、基板の機能化に対していくつかの可能性を提供することが知られている。ＰＤＡコーティングは、デバイスまたはその一部をドーパミンの塩、特にドーパミン塩酸塩またはドーパミンアンモニアを含む溶液に浸すことによって行うことができる。溶液は水溶液、アルコール溶液、または水－アルコール溶液であることができる。溶液の溶媒は、デバイスが水に敏感な場合（例えば腐食の場合）、好ましくはアルコール、特に無水エタノールである。デバイスは、例えばフッ化水素酸などの強酸でエッチングすることによって、ドーパミン溶液に浸す前に前処理することができる。
【0114】
最後に、ポリドーパミンがコーティングされていない部分やＰＤＡの凝集体を除去するために、すすぎ工程および／または超音波洗浄工程を行うことができる。すすぎ工程は、脱塩水またはアルコールで行うことができる。
【0115】
第二段階は、興味のあるペプチドを後で接合するために、ポリドーパミンコーティングにリンカーを固定化することに対応する。バイオミメティックペプチドの固定化を可能にする任意のリンカーを使用できる。その目的のために、第一段階で得られたポリドーパミンコーティングを、適切な手段でリンカー溶液と接触させ、ポリドーパミンコーティング上にリンカーフィルムを形成する。
【0116】
リンカーは任意の適切な二官能性試薬である。リンカーは好ましくはバイオオーソゴナルである。
【0117】
リンカーは好ましくは上記で開示されたクリックケミストリーに適している。したがって、リンカーは自由な三重結合を含み、好ましくはシクロオクチン部分、さらに好ましくはＤＢＣＯじみたジアリルシクロオクチン部分を含む。三重結合はペプチドのアジド基と反応できる。リンカーはさらに、ポリドーパミンコーティングに対して反応性のあるアミンおよび／またはチオール官能基で機能化されている。
【0118】
水および中程度の極性を持つ一般的に使用される有機溶媒への溶解性を高めるために、リンカーは好ましくはスペーサーを含む。このスペーサーは、好ましくはポリマーまたはオリゴマーである。使用される可能性のあるポリマーまたはオリゴマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリ乳酸、糖類、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、およびそれらの組み合わせが含まれる。ＰＥＧが特に好ましいである。具体的には、ＰＥＧ４親水性スペーサーは凝集や沈殿の問題を減少または排除することが知られている。
【0119】
シクロオクチンＰＥＧの例としては、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ誘導体、例えばＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミンやＤＢＣＯ－スルホ－ＰＥＧ４－ＮＨ２．などがある。
【0120】
リンカーがＰＤＡコーティングの表面に固定されていない場合、それを除去するために洗浄ステップが好ましく行われる。洗浄ステップは、脱塩水および／またはアルコールで行うことができる。
【0121】
第三のステップは、適切なリンカーを用いて修飾されたポリドーパミンコーティングデバイスにバイオミメティックペプチドをグラフトすることを含む。その目的のために、ペプチドは、リンカーの官能基（例えば、自由な三重結合）と反応できるアジド基などの官能基を好ましく含む。
【0122】
第二のステップの後に得られたデバイスまたはその一部は、特定の官能基を含むバイオミメティックペプチドと接触させるために、適切な手段によって接触させられる。グラフトは、デバイスまたはその一部をバイオミメティックペプチドを含む水溶液に浸すことによって行うことができる。反応は室温で行うことができる。
【0123】
発明の第五の目的によると、バイオミメティックペプチドまたは発明のコーティングでコーティングされた部分を含むデバイスが開示される。
【0124】
コーティングは、デバイス全体またはデバイスの一部の表面を含むことができる。
【0125】
本発明の目的のために、発明のバイオミメティックペプチドで完全または部分的に覆うことができるデバイスは、冠動脈ステント、フローダイバーティングステント、大動脈チューブ、心臓弁、バルーン拡張ステント、自己拡張型スキャフォールド、グラフトステントのポリマーチューブ、フローダイバーティングメッシュ、大動脈チューブ、心臓弁、ステントリトリーバー、経カテーテル僧帽弁デバイス、カテーテル、リーフレットまたはその一部、特にバルーン拡張ステント、自己拡張型スキャフォールド、グラフトステントのポリマーチューブ、フローダイバーティングメッシュ、大動脈チューブ、心臓弁、ステントリトリーバー、経カテーテル僧帽弁デバイス、カテーテル、リーフレットまたはその一部、そして一般的には、限られた期間または延長された期間にわたって血液と接触することができる任意の医療デバイスを含む。
【0126】
完全または部分的にコーティングされたデバイスは、例えば以下じみた任意の適切な材料で構成される場合がある：
・金属または合金、ステンレス鋼、コバルトクロム合金、プラチナクロム合金、ニッケルチタン合金（ニチノールとしても知られる）、コバルトクロムニッケル合金、マグネシウムまたはＪＤＢＭ、Ｍｇ－Ｎｄ－Ｚｎ－Ｚｒ合金、Ｍｇ－Ｎｄ－Ｚｎ－Ｃａ合金、Ｍｇ－Ｚｎ－Ｙ－Ｎｄ合金、Ｍｇ－Ａｌ、Ｍｇ－ＡＬ－Ｚｒ、ＷＥ４３、ＡＺ３１などのマグネシウム合金；
・合成高分子材料、ＰＥＢＡＸ、ＰＶＰ、ＰＥ、ＰＰ、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）；
・臨床グレードの生物組織、例えば心臓弁生体補綴物のための心膜シート。
・金属または合金、ステンレス鋼、コバルトクロム合金、プラチナクロム合金、ニッケルチタン合金（ニチノールとしても知られる）、コバルトクロムニッケル合金、マグネシウムまたはＪＤＢＭ、Ｍｇ－Ｎｄ－Ｚｎ－Ｚｒ合金、Ｍｇ－Ｎｄ－Ｚｎ－Ｃａ合金、Ｍｇ－Ｚｎ－Ｙ－Ｎｄ合金、Ｍｇ－Ａｌ、Ｍｇ－ＡＬ－Ｚｒ、ＷＥ４３、ＡＺ３１などのマグネシウム合金；
・合成高分子材料、ＰＥＢＡＸ、ＰＶＰ、ＰＥ、ＰＰ、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）；
・臨床グレードの生物組織、例えば心臓弁生体補綴物のための心膜シート。
【0127】
第六の目的によると、発明のバイオミメティックペプチドを使用した心臓および血管の病理の予防または治療のための方法が開示される。
【0128】
特定の側面によると、心臓および血管の病理の予防または治療のための方法は、発明のコーティングで完全または部分的にコーティングされたデバイスの使用を含む。特に、デバイスはバルーンマウントステント、心臓弁生体補綴物、フローダイバータであり、これらのデバイスは冠動脈および末梢動脈の血行再建術、インターベンショナル神経学、心臓弁植え込み術などの介入的心血管手技で使用することができる。
【0129】
特に、対象となる病理は以下によって表される、心臓弁病理、狭窄性血管疾患（動脈硬化症を含む、特にアテローム性動脈硬化症）、アテローム血栓症、虚血性心疾患および末梢疾患、出血のリスクを伴う血管リモデリング、再狭窄、動脈瘤。
【0130】
上記に加えて、ステント内狭窄によって表される状態の予防方法が開示される。
【0131】
異物が血液と接触していることに関連する病理組織のリモデリングを引き起こす初期のメカニズムの一つは、異物の表面への血小板の付着であり、これが白血球の募集と活性化を引き起こし、その後一連の反応の開始を引き起こし、最終的には血栓の形成および／または活性化された血小板と白血球によって放出された可溶性因子に応答して急速に増殖する血管細胞による異物のカプセル化につながり、最終的には血管内腔の減少、例えば（再）狭窄の発生につながることがよく知られている（例えば以下を参照、Forrester et al., J Am Coll Cardiol., 17, 758-769(1991))。
【0132】
心臓および血管の病理の文脈において、ステントや弁の生体補綴物などの医療デバイスが移植された個人には、一般的に抗血小板療法（アスピリンおよび／または抗Ｐ２Ｙ１２療法、例えばクロピドグレル、チクロピジン、チカグレロル、またはプラスグレル）が少なくともステント植え付け後１ヶ月から数ヶ月間投与されるのは、そじみた理由によるものである。１つ、そしてより頻繁には２つの抗血小板治療の使用は、完全に再内皮化されるまで血流にさらされるステントとの接触で血小板の活性化のリスクを排除し、したがってステント血栓症のリスクを排除し、再狭窄率を制限することを目的としている。ほとんどの場合、アスピリンと抗Ｐ２Ｙ１２療法を含む二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）は６～１２ヶ月間投与される。こじみた治療は最終的に患者を出血のリスクにさらし、この観察結果は抗血小板治療の期間を短縮する安全性を評価するきっかけとなった。ＤＡＰＴ（二重抗血小板療法）を３０日に短縮した薬剤溶出ステントを用いた臨床試験が現在進行中である。ＤＡＰＴが必要な期間が終了すると、抗血小板治療は一般的にアスピリン単独（抗Ｐ２Ｙ１２療法なし）での継続療法となる。
【0133】
薬剤溶出ステントを使用する場合、ヒトにおけるアスピリン（アセチルサリチル酸またはその塩）の推奨用量は５０～１００ｍｇ／日であり、例えば７５ｍｇ／日である。抗Ｐ２Ｙ１２薬剤に関しては、使用される特定の抗Ｐ２Ｙ１２薬剤に応じてヒトにおける推奨用量は異なる。クロピドグレルの推奨用量は５０～１００ｍｇ／日であり、特に７５ｍｇ／日（一般的には１日１回７５ｍｇ）である。チクロピジンの推奨用量は３００～３００ｍｇ／日であり、特に２５０ｍｇ／日（一般的には１日１回２５０ｍｇ）である。チカグレロルの推奨用量は１６０～３００ｍｇ／日であり、特に１８０ｍｇ／日（一般的には９０ｍｇを１日２回）である。プラスグレルの推奨用量は５～２０ｍｇ／日であり、特に１０ｍｇ／日（一般的には１０ｍｇを１日１回）である。
【0134】
しかし、抗血小板療法は、特に出血性疾患（血友病Ａ（因子ＶＩＩＩ欠乏症）、血友病Ｂ（因子ＩＸ欠乏症）、フォン・ヴィレブランド病、Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩを含む稀な因子欠乏症など）を患っている個人において、重大な副作用のリスクや困難を伴う可能性がある。特に、抗Ｐ２Ｙ１２薬は非常に強力な分子であり、特定の理由なしに全身にあざを引き起こす傾向がある。さらに、抗Ｐ２Ｙ１２療法中の患者に対しては、どの歯科医、胃腸科医、または外科医も介入時の管理不能な出血のリスクを避けるために触れたくないろう。場合によっては、心血管以外の一部の疾患に対する介入を妨げるため、これは深刻な問題となることがある。これらの分子は、下痢、かゆみ、吐き気、皮膚発疹、胃痛などの顕著な副作用も持っている。
【0135】
発明による医療デバイスにＣＤ３１由来のペプチドで作られたコーティングの生理的、非活性化、内皮組織模倣特性に基づいて、デバイスと接触する血小板の初期付着／活性化が防止されるか、または大幅に減少する可能性があり、通常はデバイスの植え付け後に続く抗血小板治療が不要になるか、少なくとも低用量に減らされるか、または通常より短い期間で投与されることになる。
【0136】
したがって、発明による医療デバイスの植え付け後に、心臓弁病変、動脈硬化症、アテローム血栓症、虚血、出血、再狭窄、動脈瘤を含む心臓および血管病変の予防または治療のための方法、またはステント内狭窄によって表される状態の予防のための方法のいずれかの文脈において、受け取る個人は好ましくは次のようにする。
【0137】
ａ）抗Ｐ２Ｙ１２療法を受けない（個人は抗血小板療法を全く受けない場合もある）；
ｂ）伝統的な二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨されるよりも著しく低い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・）抗Ｐ２Ｙ１２療法の用量（およびオプションでアスピリンの用量も著しく低い、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・低い用量）を取る；
ｃ）伝統的な二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨されるよりも著しく短い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・短い）期間、抗Ｐ２Ｙ１２療法（およびオプションでアスピリン）を取る；または
ｄ）ｂ）とｃ）の任意の組み合わせ。
ｂ）伝統的な二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨されるよりも著しく低い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・）抗Ｐ２Ｙ１２療法の用量（およびオプションでアスピリンの用量も著しく低い、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・低い用量）を取る；
ｃ）伝統的な二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨されるよりも著しく短い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・短い）期間、抗Ｐ２Ｙ１２療法（およびオプションでアスピリン）を取る；または
ｄ）ｂ）とｃ）の任意の組み合わせ。
【0138】
上記のａ）からｄ）のすべての項目は、医療デバイス（特にステント）の植え付け後の治療にのみ関連し、医療デバイスの植え付け中に投与される可能性のある薬剤には関連しません。これらの薬剤は臨床推奨に従って医師が選択する。
【0139】
上記の項目ｂ）、ｃ）、ｄ）において、「薬剤溶出ステント」または「ＤＥＳ」は、シロリムスなどの平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を抑制する薬剤を徐々に放出するステントを指す。市販されている薬剤溶出ステントの例には、ＨＴ Ｓｕｐｒｅｍｅ（登録商標）、ＸｉｅｎｃｅＶ（登録商標）、Ｐｒｏｍｕｓ（登録商標）、Ｃｙｐｈｅｒ（登録商標）、Ｔａｘｕｓ（登録商標）、Ｅｎｄｅａｖｏｒ（登録商標）がある。
【0140】
上記の項目ｂ）において、移植後、発明による医療デバイスが移植された個人は、伝統的な二重抗血小板療法（ＤＡＰＴ）内の薬剤溶出ステントに推奨されるよりも著しく低い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・） 抗Ｐ２Ｙ１２療法の用量を取る。特に、移植後、個人は以下を取ることができる、クロピドグレルの１日あたり５０ｍｇ未満、好ましくは１日あたり４０ｍｇ未満、１日あたり３５ｍｇ未満、１日あたり３０ｍｇ未満、１日あたり２５ｍｇ未満、または１日あたり２０ｍｇ未満。
【0141】
チクロピジンの摂取量は１日あたり３００ｍｇ未満、好ましくは１日あたり１７５ｍｇ未満、１日あたり１５０ｍｇ未満、１日あたり１２５ｍｇ未満、または１日あたり１００ｍｇ未満であることが望ましい。
【0142】
チカグレロールの摂取量は１日あたり１６０ｍｇ未満、好ましくは１日あたり１５０ｍｇ未満、１日あたり１４０ｍｇ未満、１日あたり１３０ｍｇ未満、１日あたり１２０ｍｇ未満、１日あたり１１０ｍｇ未満、１日あたり１００ｍｇ未満、１日あたり９０ｍｇ未満、または１日あたり８０ｍｇ未満であることが望ましい（通常、１日の投与量の半分を１日に２回摂取する）。
【0143】
プラスグレルの摂取量は１日あたり５ｍｇ未満、好ましくは１日あたり４ｍｇ未満、１日あたり３ｍｇ未満、１日あたり２．５ｍｇ未満、または１日あたり２ｍｇ未満であることが望ましい。
【0144】
個人は、植え付け後にアスピリンの著しく低い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・）用量をさらに摂取することができる。例えば、個人は１日あたり５０ｍｇ未満、好ましくは１日あたり４０ｍｇ未満、１日あたり３５ｍｇ未満、１日あたり３０ｍｇ未満、１日あたり２５ｍｇ未満、または１日あたり２０ｍｇ未満のアスピリンを服用することができる。
【0145】
上記の項目ｃ）において、発明による医療デバイスが移植された個人は、薬剤溶出ステントに推奨される期間よりも著しく短い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・短い）期間、抗Ｐ２Ｙ１２療法を受ける。個人はさらに、薬剤溶出ステントに推奨される期間よりも著しく短い（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍・・・短い）期間、移植後にアスピリンを服用することができる。
【0146】
例えば、個人はＤＡＰＴを３か月未満、好ましくは２か月未満、１か月未満、または４週間未満、３週間未満、２週間未満、または１週間未満の期間服用することができる。より短い抗血小板治療は、治療の一定期間後に個人が抗Ｐ２Ｙ１２療法を完全に停止することを意味する場合もある。
【0147】
上記の項目ｄ）は、上記の項目ｂ）およびｃ）の任意の組み合わせである。
【0148】
抗血小板療法なし、または少ない抗血小板療法でのこの改訂されたプロトコルは、抗血小板療法に関連する副作用（出血イベント）を防止または強く抑制するため、どの個人にも有用である。しかし、これは特に、血友病Ａ（因子ＶＩＩＩ欠乏症）、血友病Ｂ（因子ＩＸ欠乏症）、フォン・ウィレブランド病、およびＩ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩを含む稀な因子欠乏症などの出血障害を持つ個人にとって有用である。
【0149】
上記で開示された予防または治療の方法は、人間だけでなく獣医分野の動物にも開示される。
【0150】
別の目的によると、発明のバイオミメティックペプチドをデバイスの表面に接着するための使用が開示される。
【0151】
一つの実施形態によれば、発明のバイオミメティックペプチドを血管デバイスへの接着に使用することが開示される。
【0152】
さらに別の目的によれば、発明のバイオミメティックペプチドを使用して、血管の内皮化を促進し、新内膜の成長を防止し、ターゲット血管内でデバイスを統合することが開示される。
【0153】
特に、対象血管は冠動脈血管、末梢動脈血管、または脳血管によって表される。
【0154】
さらに別の目的によると、本発明のバイオミメティックペプチドを使用してデバイスの生体適合性を向上させることが開示される。
【0155】
さらに別の目的によると、本発明のバイオミメティックペプチドを使用して、ステントセグメントに回復した内皮の抗炎症および抗血栓特性を付与することが開示される。
【0156】
さらに別の目的によると、本発明のバイオミメティックペプチドを使用して、ステントセグメントに適応的リモデリングを改善し、その機能特性の回復を可能にすることが開示される。
【0157】
本発明は、以下の非制限的な例でさらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【0158】
【0159】
実施例および本文中で使用される特定の略語は次のとおりである、
「ＡＡ」はアミノ酸を指す、
「Ａｌｌｏｃ」はアリルオキシカルボニルを指し、
「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルをし、
「ｔＢｕ」は第三ブチルを指し、
「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、
「ＤＩＣ」はＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドを指し、
「ＤＩＰＥＡ」はＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し、
「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、
「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルを指し、
「ＨＯＡｔ」は１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールを指し、
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し、
「ＬＣＭＳ」は液体クロマトグラフィー／質量分析を指し、
「ＵＰＬＣ」は高速クロマトグラフィーを指し、
「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は逆相高速液体クロマトグラフィーを指し、
「ＭＳ」は質量分析を指し、
「ＯｔＢｕ」はＯ－ターシャリーブチルを指し、
「Ｏｘｙｍａ」はエチルシアノヒドロキシイミノアセテートを指し、
「Ｐｂｆ」は２、２、４、６、７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルを指し、
「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシランを指し、
「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、
「Ｔｒｔ」はトリチルを指す。
「ＡＡ」はアミノ酸を指す、
「Ａｌｌｏｃ」はアリルオキシカルボニルを指し、
「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルをし、
「ｔＢｕ」は第三ブチルを指し、
「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、
「ＤＩＣ」はＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドを指し、
「ＤＩＰＥＡ」はＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し、
「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、
「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルを指し、
「ＨＯＡｔ」は１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールを指し、
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し、
「ＬＣＭＳ」は液体クロマトグラフィー／質量分析を指し、
「ＵＰＬＣ」は高速クロマトグラフィーを指し、
「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は逆相高速液体クロマトグラフィーを指し、
「ＭＳ」は質量分析を指し、
「ＯｔＢｕ」はＯ－ターシャリーブチルを指し、
「Ｏｘｙｍａ」はエチルシアノヒドロキシイミノアセテートを指し、
「Ｐｂｆ」は２、２、４、６、７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルを指し、
「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシランを指し、
「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、
「Ｔｒｔ」はトリチルを指す。
【実施例】
【0160】
材料と方法
ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ化学を使用した標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成された。溶媒としてＤＭＦが使用された。以下の出発物質と方法が、実施例に記載された合成手順で使用された。
ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔ－Ｂｕ化学を使用した標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成された。溶媒としてＤＭＦが使用された。以下の出発物質と方法が、実施例に記載された合成手順で使用された。
【0161】
Ｆｍｏｃ保護された天然アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｃｈｅｍ、またはＣｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入された。合成には以下の標準アミノ酸が使用された、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ。
【0162】
さらに、以下のアミノ酸も上記と同じ供給元から購入した、Ｆｍｏｃ－Ｋ－（Ｎ３）ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｋ（ａｌｌｏｃ）ＯＨ；Ｆｍｏｃ－ｃ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－ｈＣ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｔｔｄｓ－ＣＯＯＨ，Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨ。
【0163】
分析特性評価
粗ペプチドと精製ペプチドは、ＵＶおよび質量分析検出を備えた超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳ）によって分析された。分析用ＵＰＬＣは、次のいずれかの方法に従って実施された、
方法Ａ：
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２
．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：８５、１５（０分）から８５、１５（１分）から６５、３５（５分）から１０、９０（５．２分）から１０、９０（５．５分）から８５、１５（５．７分）から８５、１５（６分）
質量分析計：正イオン検出モードでエレクトロスプレーイオン化を使用したＷａｔｅｒｓＳＱ検出器
粗ペプチドと精製ペプチドは、ＵＶおよび質量分析検出を備えた超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳ）によって分析された。分析用ＵＰＬＣは、次のいずれかの方法に従って実施された、
方法Ａ：
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２
．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：８５、１５（０分）から８５、１５（１分）から６５、３５（５分）から１０、９０（５．２分）から１０、９０（５．５分）から８５、１５（５．７分）から８５、１５（６分）
質量分析計：正イオン検出モードでエレクトロスプレーイオン化を使用したＷａｔｅｒｓＳＱ検出器
【0164】
方法Ｂ：
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：８０、２０（０分）から８０、２０（１分）から６０、４０（５分）から１０、９０（５．２分）から１０、９０（５．５分）から８０、２０（５．７分）から８０、２０（６分）
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：８０、２０（０分）から８０、２０（１分）から６０、４０（５分）から１０、９０（５．２分）から１０、９０（５．５分）から８０、２０（５．７分）から８０、２０（６分）
【0165】
方法Ｃ：
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒、Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：７５、２５（０分）から７５、２５（１分）から５５、４５（４分）から１０、９０（４．２分）から１０、９０（４．５分）から８０、２０（４．７分）から７５、２５（５分）
質量分析計：正イオン検出モードでエレクトロスプレーイオン化を使用したＷａｔｅｒｓＳＱ検出器
２１４ｎｍでの検出
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍ（２．１ｘ１００ｍｍ）４５℃
溶媒、Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量０．４ｍｌ／分）
勾配：７５、２５（０分）から７５、２５（１分）から５５、４５（４分）から１０、９０（４．２分）から１０、９０（４．５分）から８０、２０（４．７分）から７５、２５（５分）
質量分析計：正イオン検出モードでエレクトロスプレーイオン化を使用したＷａｔｅｒｓＳＱ検出器
【0166】
質量分析は、ＷａｔｅｒｓＳＱ検出器を用いて、正イオン検出モードでエレクトロスプレーイオン化により行われ、質量対電荷比のスキャン範囲は４００－１８００だった。
【表17】
【0167】
固相支持体上でのペプチド合成の一般的な手順
すべてのペプチドの合成は、Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波合成装置（ＣＥＭ社）を用いた標準的なＦｍｏｃ逐次固相合成（ＳＰＰＳ）によって行われた。組み立ては、ＰｒｏｔｉｄｅＲｉｎｋ－ａｍｉｄｅ（４－（２’、４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃ－アミノメチル）－フェノキシアセタミド－ノルロイシルアミノメチル樹脂、ＣＥＭ、３００μｍｏｌ、１００－３００メッシュ；ローディング０．２ｍｍｏｌ／ｇ）を０．２ｍｍｏｌスケールで使用し、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ活性化で行われた。溶媒としてＤＭＦが使用された。
すべてのペプチドの合成は、Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波合成装置（ＣＥＭ社）を用いた標準的なＦｍｏｃ逐次固相合成（ＳＰＰＳ）によって行われた。組み立ては、ＰｒｏｔｉｄｅＲｉｎｋ－ａｍｉｄｅ（４－（２’、４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃ－アミノメチル）－フェノキシアセタミド－ノルロイシルアミノメチル樹脂、ＣＥＭ、３００μｍｏｌ、１００－３００メッシュ；ローディング０．２ｍｍｏｌ／ｇ）を０．２ｍｍｏｌスケールで使用し、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ活性化で行われた。溶媒としてＤＭＦが使用された。
【0168】
すべてのアミノ酸はＤＭＦ中で０．４Ｍ濃度で溶解された。アシル化反応は、樹脂の遊離アミノ基に対して活性化されたアミノ酸を５倍過剰に用い、９０℃で３分間マイクロ波照射下で行われた。アミノ酸は、ＤＭＦ中の０．５ＭのＤＩＣ溶液およびＤＭＦ中の１ＭのＯｘｙｍａ溶液の等モル量で活性化された。
【0169】
以下の条件が使用された：
標準的な脱保護：ＤＭＦ中２０％ピペリジンを２ｘ１２０秒、９０℃
洗浄：４ｘＤＭＦ
標準的な単一カップリング：５当量ＡＡ０．４Ｍ／５当量ＤＩＣ１Ｍ／５
当量オキシマ１Ｍ、１２０秒、９０℃
標準的な二重カップリング：標準的な単一カップリングを２回繰り返す
洗浄：４ｘＤＭＦ
標準的な脱保護：ＤＭＦ中２０％ピペリジンを２ｘ１２０秒、９０℃
洗浄：４ｘＤＭＦ
標準的な単一カップリング：５当量ＡＡ０．４Ｍ／５当量ＤＩＣ１Ｍ／５
当量オキシマ１Ｍ、１２０秒、９０℃
標準的な二重カップリング：標準的な単一カップリングを２回繰り返す
洗浄：４ｘＤＭＦ
【0170】
組み立ての最後に、樹脂はＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＣＭ、Ｅｔ２Ｏで洗浄された。
【0171】
樹脂からのペプチドの切断は、以下の切断カクテルを使用して行われた、
【0172】
ミックス１）８７．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、２．５％ＴＩＰＳを室温で１．５から２．５時間（３０ｍｌ）。
【0173】
ミックス２）８７．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、２．５％チオアニソールを室温で１．５から２．５時間（２０ｍｌ）。
【0174】
合成に使用された樹脂は、Ｃ末端が一次アミドとして樹脂から切断されるようなものだった。
【0175】
切断混合物はろ過によって収集され、粗ペプチドはメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルに沈殿させ、遠心分離し、上澄みを除去し、新鮮なジエチルエーテルをペプチドに加えて再遠心分離し、２回行った。その後、粗ペプチドは凍結乾燥された。
【0176】
ペプチドは分析用ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認された。粗ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ２４８９ＨＰＬＣシステム（波長２１４ｎｍでのＵＶ検出）を用いた従来の製備ＲＰ－ＨＰＬＣ精製によって精製された。溶媒として以下のものを使用した、アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ（移動相Ａ）および水＋０．１％ＴＦＡ（移動相Ｂ）。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました。特に記載がない限り、化合物はＴＦＡ塩としてテストされた。
【0177】
配列番号２９の合成手順：Ａｃ－ｃ＊ＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＣ＊－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－Ｋ（Ｎ
３
）－ＣＯＮＨ
２
【0178】
ペプチドの構造は図７に示されている。
【0179】
配列番号２９（ＰｅｐＳＰ７２２）は、アセチル化されたＮ末端Ｄ－システインとＣ末端位置のセリン８７にシステインを持つＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＨｉｓ７１－Ｓｅｒ８７領域をカバーし、２つのチオール基がジスルフィド結合に関与している。
【0180】
一般的な手順（Ｍｉｘ１）に従って合成および切断を行った後、混合物を分析ＵＰＬＣで分析し、ＥＳＩ＋質量分析で確認し、粗生成物（Ｙ＝６４％）を得るために凍結乾燥した。粗材料は１ｍｇ／ｍＬの濃度で８／２アセトニトリル／水の混合物に溶解された、水性ＮＨ３を加えてｐＨ９に達し、混合物は室温で７２時間攪拌された。ＴＦＡを混合物に加え、凍結乾燥した。粗ペプチドは、調製用ＲｅｐｒｏｓｉｌＧｏｌｄＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）カラムを使用して逆相ＨＰＬＣで精製された。次のエリュエントＢのグラジエントが使用された、２０％Ｂから２０％Ｂまで５分間、２５分間で４０％Ｂまで、流量６０ｍＬ／ｍｉｎ、波長２１４ｎｍ。配列番号１は、白色の凍結乾燥固体（Ｙ＝５％）、ＴＦＡ塩として単離された。精製されたペプチドは、アセトニトリル／水８／２の混合物中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された。ＨＣｌ５０ｍＭ（１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。凍結乾燥後、ペプチドをアセトニトリル／水８／２に溶解し、再度凍結乾燥した。ペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｃ）で分析された。［Ｍ＋３Ｈ］３＋質量シグナルは保持時間３．２７分のピーク下で見つかり、ペプチド質量１０１３．５が明らかになり、これは予想される分子量３０３６．３７と一致している。
【0181】
配列番号３０の合成手順：
ＳＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＳ－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図８に示されている。配列番号３０（ＰｅｐＳＰ７４５）は、配列番号２９と共通するＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＨｉｓ７１－Ｓｅｒ８７領域をカバーしているが、配列番号１の２つのシステイン残基をセリンに置換した線形配列である。
ＳＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＳ－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図８に示されている。配列番号３０（ＰｅｐＳＰ７４５）は、配列番号２９と共通するＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＨｉｓ７１－Ｓｅｒ８７領域をカバーしているが、配列番号１の２つのシステイン残基をセリンに置換した線形配列である。
【0182】
一般的な手順（Ｍｉｘ１）に従って合成および切断を行った後、混合物を分析ＵＰＬＣで分析し、ＥＳＩ＋質量分析で確認し、粗生成物（Ｙ＝６６％）を得るために凍結乾燥した。粗ペプチドは、調製用ＲｅｐｒｏｓｉｌＧｏｌｄＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）カラムを使用して逆相ＨＰＬＣで精製された。次のエリュエントＢのグラジエントが使用された、２０％Ｂから２０％Ｂを５分間、２０分間で４０％Ｂに、流量６０ｍＬ／ｍｉｎ、波長２１４ｎｍ。配列番号２はアモルファス凍結乾燥固体（Ｙ＝４％）、ＴＦＡ塩として単離された。ペプチドはアセトニトリル／水８／２の混合物中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された、ＨＣｌ５０ｍＭ（１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。凍結乾燥後、ペプチドをアセトニトリル／水８／２に溶解し、再度凍結乾燥した。ペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｃ）で分析された。［Ｍ＋３Ｈ］３＋保持時間２．８５分のピーク下で見つかった質量信号は、予想される分子量２９６４．２２と一致するペプチド質量９８９．４を明らかにした。
【0183】
配列番号３１の合成手順：
Ａｃ－ＫＫＫｃ＊ＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＣ＊－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図９に示されている。
Ａｃ－ＫＫＫｃ＊ＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＣ＊－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図９に示されている。
【0184】
配列番号３１（ＰｅｐＳＰ７６５）は、ＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＨｉｓ７１－Ｓｅｒ８７と同じ領域をカバーし、配列番号２９と同様のジスルフィド結合を持っているが、Ｎ末端に３つのリジン残基の可溶化尾部がある。
【0185】
合成は一般的な手順に従って行われた。組み立ての最後に、樹脂はＡｃ２Ｏ（１０ｅｑ）とＤＭＦで３０分間処理された。切断はＭｉｘ１を使用して一般的な手順に従って行われ、混合物は分析ＵＰＬＣによって分析され、ＥＳＩ＋質量分析法によって確認され、凍結乾燥された（Ｙ＝６１％）。粗材料は１ｍｇ／ｍＬの濃度で８／２アセトニトリル／水の混合物に溶解された、水性ＮＨ３を加えてｐＨ９に達し、混合物は室温で７２時間攪拌された。ＴＦＡを混合物に加え、凍結乾燥した。粗ペプチドは、調製用ＲｅｐｒｏｓｉｌＧｏｌｄＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）カラムを使用して逆相ＨＰＬＣで精製された。次のエリュエントＢのグラジエントが使用された、２５％Ｂから５分間で２５％Ｂ、２５分間で４０％Ｂ、流量６０ｍＬ／ｍｉｎ。配列番号３はアモルファス凍結乾燥固体（Ｙ＝２％）、ＴＦＡ塩として単離された。ペプチドはアセトニトリル／水８／２の混合物中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された、ＨＣｌ５０ｍＭ（１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。凍結乾燥後、ペプチドをアセトニトリル／水８／２に溶解し、再度凍結乾燥した。ペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｃ）で分析された。保持時間２．９０分のピーク下で見つかった［Ｍ＋３Ｈ］３＋質量信号は、予想される分子量３５０９．１７に一致するペプチド質量１１７１．０を明らかにした。
【0186】
【0187】
シーク番号３２（ＰｅｐＳＰ１３７５）は、ＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＧｌｎ７０－Ｌｙｓ８９とＴｔｄｓユニットの長いリンカーと同じ領域をカバーしている。
【0188】
固相でのペプチド組み立て中に、ＶａｌとＬｅｕの二重アシル化反応が行われた。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンを用いた樹脂の二重処理で１２０分間９０℃で行われ、Ａｓｐ残基が９番目の位置に達するまで行われた。この残基の後、アスパルチミド形成を最小限に抑えるために室温で脱保護が行われた。切断は、Ｍｉｘ２を使用した一般的な手順に従って行われた。混合物は分析用ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認され、粗生成物（Ｙ＝７０％）を得るために凍結乾燥された。
【0189】
粗材料の精製は、ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２５０ｘ５０ｍｍ、１２０Ａ、１０ｕｍ）カラムと溶媒Ｂの勾配を使用して次のように行われた、５分間１５％Ｂ；２０分で１５％Ｂから３５％Ｂ；流速、８０ｍＬ／分。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製生成物を得ました（Ｙ＝１０％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）で分析された。［Ｍ＋４Ｈ］４＋保持時間４．２０分のピーク下で見つかった質量信号は、予想される分子量３８７０．５８に一致するペプチド質量９６９．２を示した。
【0190】
配列番号３３の合成手順：
ｈＣＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳｈＣＫ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１１に示されている。
ｈＣＨＱＭＬＦＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳｈＣＫ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１１に示されている。
【0191】
配列番号３３（ＰｅｐＳＰ１３７４）は、配列番号３２のＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＧｌｎ７０－Ｌｙｓ８９領域をホモシステインに変異させたものである、Ｇｌｎ７０ｈＣｙｓおよびＭｅｔ８８ｈＣｙｓがシクロ構造を持つジスルフィド結合を形成する。
【0192】
ペプチド組み立て中に、ＶａｌおよびＬｅｕの二重アシル化反応が行われた。Ｆｍｏｃ脱保護は、９０℃で１２０秒間、２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンを含むＤＭＦで樹脂を二重処理することにより、位置９のＡｓｐ残基まで行われた。この残基の後、アスパルチミド形成を最小限に抑えるために室温で脱保護が行われた。切断は、Ｍｉｘ２を使用した一般的な手順に従って行われた。混合物は分析用ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認され、粗生成物（Ｙ＝７０％）を得るために凍結乾燥された。粗ペプチドは分析ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認された。粗材料はＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの９／１混合物に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された、水性ＮＨ３を加えてｐＨ９に達し、混合物を室温で４８時間撹拌した。この時間の後、ジスルフィド橋の形成がＵＰＬＣで確認され、混合物は凍結乾燥された。粗材料の精製は、以下の勾配を使用してＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２５０ｘ５０ｍｍ、１２０Ａ、１０ｕｍ）カラムで行われた、５分間１５％Ｂ；２０分間でＢの１５％から３５％；流速８０ｍＬ／ｍｉｎ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製生成物を得ました（Ｙ＝１０％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）で分析された。保持時間４．０５分のピーク下で見つかった［Ｍ＋４Ｈ］４＋質量信号は、ペプチド質量９６２．４を示し、分子量３８４３．５８の予想値と一致している。
【0193】
配列番号３４の合成手順：
ＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥ－ＰＥＧ４－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１２に示されている。配列番号３４（ＰｅｐＳＰ１０７２）はＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ１０７－Ｇｌｕ１２２領域をカバーしている。
ＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥ－ＰＥＧ４－Ｋ（Ｎ３）－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１２に示されている。配列番号３４（ＰｅｐＳＰ１０７２）はＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ１０７－Ｇｌｕ１２２領域をカバーしている。
【0194】
組み立て中、すべての天然アミノ酸とＦｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨに対して二重アシル化反応が行われた。合成および一般的な手順（Ｍｉｘ１）に従って行われた切断後、混合物は分析的ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認された；凍結乾燥して粗生成物を得ました（Ｙ＝７０％）。ＬＣＭＳ分析計算。Ｃ９６Ｈ１６６Ｎ２７Ｏ３３の場合、２２２５．２１Ｄａ；ｆｏｕｎｄ；１１１４．０（Ｍ＋２）２＋．粗ペプチドは、調製用ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２５０ｘ５０ｍｍ、１２０Ａ、１０μｍ）カラムを使用して逆相ＨＰＬＣで精製され、次の溶出液Ｂの勾配を使用した、５％Ｂから５％Ｂまで５分間、５％Ｂから２５％Ｂまで２０分間、流速８０ｍＬ／分。配列番号３４は、ＴＦＡ塩としてアモルフ凍結乾燥固体（Ｙ＝２５％）として単離された。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）で分析された。［Ｍ＋３Ｈ］３＋質量シグナルは保持時間２．９７分のピーク下で見つかり、ペプチド質量７４３．０が明らかになり、これは分子量２２２６．５４の予想値と一致している。
【0195】
配列番号２３の合成手順：
ｈＣＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹｈＣ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２ペプチドの構造は図１３に示されている。
ｈＣＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹｈＣ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２ペプチドの構造は図１３に示されている。
【0196】
配列番号２３（ＰｅｐＳＰ１３７６）は１０６－１２４の領域をカバーしており、位置１０６と１２４がホモシステインに変異しており、これにより環状構造を持つジスルフィド結合が形成される。
【0197】
合成と切断は一般的な手順（Ｍｉｘ１）に従って行われ、切断された混合物は分析ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認され、凍結乾燥されて粗生成物（Ｙ＝６５％）が得られた。粗材料はＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの９／１混合物に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された、水性ＮＨ３を加えてｐＨ９に達し、混合物を室温で４８時間撹拌した。ジスルフィド橋の形成はＵＰＬＣによって確認され、混合物は凍結乾燥された。粗ペプチドは、ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２５０ｘ５０ｍｍ、１２０Ａ、１０ｕｍ）カラムを使用した逆相ＨＰＬＣによって精製され、以下の溶媒Ｂの勾配を使用した、５％Ｂから５％Ｂを５分間、２０分間で２５％Ｂに、流速８０ｍＬ／ｍｉｎ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製生成物を得ました（Ｙ＝２８％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）で分析された。［Ｍ＋３Ｈ］３＋質量信号は保持時間３．５７分のピークの下で見つかり、ペプチド質量１１９５．４が分子量３５８３．２２の予想値と一致することが明らかになった。
【0198】
配列番号３５の合成手順：
Ｋ（Ｎ３）－ＰＥＧ４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１４に示されている。
Ｋ（Ｎ３）－ＰＥＧ４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１４に示されている。
【0199】
配列番号３５（ＰｅｐＳＰ１０７１）はＣＤ３１ＩｇＬ２－ＡのＰｒｏ１３３－Ｌｙｓ１５８領域をカバーしている。
【0200】
合成および切断は一般的な手順（Ｍｉｘ１）に従って行われ、切断された混合物は分析用ＵＰＬＣで分析され、ＥＳＩ＋質量分析法で確認され、粗生成物（収率＝５４％）を得るために凍結乾燥された。粗ペプチドは、調製用ダブルＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰａｃｋＣ１８カートリッジ（１００ｘ４０ｍｍ、３００Ａ、１５μｍ）を使用して逆相ＨＰＬＣで精製された。次のエリュエントＢのグラジエントが使用された、５％Ｂから５％Ｂを５分間、２０分間で２５％Ｂに、流量８０ｍＬ／分。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製生成物を得ました（Ｙ＝３５％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）で分析された。［Ｍ＋３Ｈ］３＋質量信号は保持時間３．５７分のピークの下で見つかり、ペプチド質量１０８５．０が分子量３２５１．７６の予想値と一致することが明らかになった。
【0201】
配列番号３６の合成手順：
Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲｈＣＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮｈＣＳＶＰＥＥＫ－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１５に示されている。
Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲｈＣＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮｈＣＳＶＰＥＥＫ－ＣＯＮＨ２ペプチドの構造は図１５に示されている。
【0202】
配列番号３６（ＰｅｐＳＰ１３８０）は、配列番号３５と同様にＣＤ３１ＩｇＬ２－ＡのＰｒｏ１３３－Ｌｙｓ１５８領域をカバーしているが、位置１３５および１５２のホモシステインの変異により、環状構造を持つジスルフィド結合が形成される。
【0203】
合成は一般的な手順に従って行われた。ペプチド組み立て中、Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｖａｌ、およびＰｒｏ－Ａｒｇ－ｈｏｍｏＣｙｓ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕフラグメントの残基に対して二重アシル化反応が行われた。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンを用いて、９０℃で１２０秒間、位置６のＡｓｐまで樹脂を二重処理することで行われた。この残基の後、アスパルチミド形成を最小限に抑えるために室温で脱保護が行われた。４つのＴｔｄｓおよび末端のＬｙｓ－アジド残基は、ＨＯＡＴ（５ｅｑ）およびＤＩＰＣ（５ｅｑ）をカップリング試薬としてＤＭＦ中で手動で導入された。最後のＴｔｄｓ残基の三重カップリングが完全な変換を達成するために行われた。組み立ての最後に、樹脂はＡｃ２Ｏ（１０ｅｑ）とＤＭＦで３０分間処理された。切断は一般的な手順に従ってＭｉｘ１を使用して行われ、混合物は分析ＵＰＬＣによって分析され、ＥＳＩ＋質量分析によって確認され、粗生成物（Ｙ＝７３％）を得るために凍結乾燥された。粗材料はＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの９／１混合物に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された、水性ＮＨ３を加えてｐＨ９に達し、混合物を室温で７２時間撹拌した。この時間の後、ジスルフィド橋の形成がＵＰＬＣによって確認され、反応混合物を停止するためにＴＦＡが添加され、その後凍結乾燥された。粗ペプチドはＲｅｐｒｏｓｉｌＣ８（２５０ｘ４０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ）カラムを使用してＲＰ－ＨＰＬＣによって精製され、次の溶媒Ｂの勾配が使用された、２０％Ｂを５分間；２０％Ｂから４０％に２５分間；流量６０ｍＬ／分。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製生成物を得ました（Ｙ＝５％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）で分析された。［Ｍ＋４Ｈ］４＋ピークの保持時間３．２３分で見つかった質量信号は、ペプチド質量１０７６．８を示し、予想値４３０１．０９分子量と一致している。
【0204】
配列番号３７の合成：
［＃ＣＨ２ＣＯＮＨ２ＧＴＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹＱ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２］－［ＱＨＱＭＬＦＹｈＣ＃ＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２］ペプチドの構造は図１６に示されている。
［＃ＣＨ２ＣＯＮＨ２ＧＴＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹＱ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２］－［ＱＨＱＭＬＦＹｈＣ＃ＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２］ペプチドの構造は図１６に示されている。
【0205】
配列番号３７－３８（ＳＰ１３７９）は、インターミディエイトＡ（ＩＮＴＡ）（ＱＨＱＭＬＦＹｈＣ＃ＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２）のｈＣｙｓ８とインターミディエイトＢ（ＩＮＴＢ）［ＢｒＣＨ２ＣＯ－Ｇ＃ＴＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹＱ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２］のブロモアセチル基との間のチオエーテル結合を介して得られたヘテロ二量体である。
【0206】
ＤＭＳＯ中のＩＮＴＢ（１ｅｑ）の５ｍＭ溶液を、ＤＩＰＥＡ（５ｅｑ）の存在下でＤＭＳＯ中のＩＮＴＡ（１ｅｑ）の２ｍＭ溶液に滴下した。反応は室温で１時間撹拌され、その間に反応の進行はＬＣＭＳでモニターされた。ＴＦＡを反応混合物に加えてｐＨ４に達し、ＲｅｐｒｏｓｉｌＣ８（２５０ｘ４０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ）カラムを使用してＲＰ－ＨＰＬＣで粗製品を精製した。以下の勾配が使用された、２５％Ｂを５分間；２５％から４５％のＢを２５分間；流速、４０ｍＬ／ｍｉｎ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました（Ｙ＝２１％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）で分析された。［Ｍ＋４Ｈ］４＋質量信号は保持時間４．３５分のピーク下で見つかり、ペプチド質量１５４５．５が明らかになり、分子量６１７３．１３の予想値と一致した。
【0207】
配列番号３８の合成：
［Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－Ｔｔｄｓ－Ｋ＃（ＣＨ２ＣＯ）－ＣＯＮＨ２］－［ＱＨＱＭＬＦＹｈＣ＃ＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２］ペプチドの構造は図１７に示されている。
［Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－Ｔｔｄｓ－Ｋ＃（ＣＨ２ＣＯ）－ＣＯＮＨ２］－［ＱＨＱＭＬＦＹｈＣ＃ＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２］ペプチドの構造は図１７に示されている。
【0208】
配列番号３８は、中間体Ａ（ＩＮＴＡ）（ＱＨＱＭＬＦＹｈＣＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２）のｈＣｙｓ８と中間体Ｃ（ＩＮＴＣ）［Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（ＢｒＣＨ２ＣＯ）－ＣＯＮＨ２］のブロモアセチル基との間のチオエーテル結合を通じて得られたヘテロ二量体である。
【0209】
ＩＮＴＣ（１ｅｑ）の５ｍＭ溶液をＤＭＳＯ中のＩＮＴＡ（１ｅｑ）の２ｍＭ溶液にＤＩＰＥＡ（５ｅｑ）の存在下で滴下した。反応は室温で１時間撹拌され、その間に反応の進行はＬＣＭＳでモニターされた。ＴＦＡを反応混合物に加えてｐＨ４に達し、ＲｅｐｒｏｓｉｌＣ８（２５０ｘ４０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ）をカラムとして使用してＲＰ－ＨＰＬＣで粗製品を精製した。次のエルエントＢのグラジエントを使用した、２５％Ｂを５分間；２５％から４５％のＢを２５分間；流速、４０ｍＬ／ｍｉｎ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました（Ｙ＝５％）。精製されたペプチドはＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）で分析された。［Ｍ＋５Ｈ］５＋４．５９分の保持時間でピークの下に見つかった質量信号は、ペプチド質量１４４５．９を示し、予想される分子量７２２１．４７と一致している。
【0210】
配列番号１の合成：
中間体Ａ：ＱＨＱＭＬＦＹｈＣＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２
中間体Ａ：ＱＨＱＭＬＦＹｈＣＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫ－ＣＯＮＨ２
【0211】
中間体Ａの構造は図１８に示されている。
【0212】
ヘテロ二量体配列番号３７（ＳＰ１３７９）および配列番号３８（ＳＰ１３８３）の共通線形前駆体中間体は、合成および切断の一般的な手順に従って調製された、すべてのＦｍｏｃ脱保護は室温で行われた。粗ペプチドは、カラムとしてＲｅｐｒｏｓｉｌＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）を使用し、次のエルエントＢの勾配で精製された、２０％Ｂを５分間；２０％Ｂから４０％Ｂに２５分間；流量、６０ｍＬ／分、波長２１４ｎｍ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました（Ｙ＝２％）。
【0213】
配列番号２の合成：
中間体Ｂ：（ＢｒＣＨ２ＣＯ－ＧＴＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹＱ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２）
中間体Ｂ：（ＢｒＣＨ２ＣＯ－ＧＴＹＫＳＴＶＩＶＮＮＫＥＫＴＴＡＥＹＱ－（Ｔｔｄｓ）４－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２）
【0214】
中間体Ｂの構造は図１９に示されている。
【0215】
ヘテロ二量体の線形前駆体配列番号３７－３８（ＳＰ１３７９）は、合成の一般的な手順に従って調製された。組み立ての最後に、樹脂上の最後の残基（グリシン）の遊離アミノ基は、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ法（樹脂負荷に対して４倍の過剰量）に従って臭化酢酸（５当量）で処理された。混合物は室温で１時間振とうされ、反応はカイザーテストによって監視された。樹脂はろ過され、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（各６回）で洗浄され、一般的な合成手順で報告されているように切断混合物（Ｍｉｘ１）で処理された。粗ペプチドは、ＲｅｐｒｏｓｉｌＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）カラムを使用してＲＰ－ＨＰＬＣで精製され、次の勾配を使用した。２０％Ｂを５分間；２０％Ｂから４０％Ｂに２５分間；流量、６０ｍＬ／分、波長２１４ｎｍ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました（Ｙ＝３０％）。
【0216】
配列番号３の合成：
【0217】
ＩＮＴＣ、Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－（Ｔｔｄｓ）４－ＰＲＶＴＬＤＫＫＥＡＩＱＧＧＩＶＲＶＮＳＳＶＰＥＥＫ－Ｔｔｄｓ－Ｋ（ＢｒＣＨ２ＣＯ）－ＣＯＮＨ２
【0218】
中間体Ｃの構造は図２０に示されている。
【0219】
ヘテロ二量体配列番号３９－４０（ＳＰ１３８３）の線形前駆体Ｃは、一般的な合成手順に従って調製された。樹脂に最初にロードされたアミノ酸は、側鎖アミノ基にａｌｌｏｃで保護されたリシンだった。次の残基に対して二重アシル化が行われた、ＳＶＰ、ＩＶＲＶ、およびＰＲＶＴＬ、ＰＲＶＴＬ残基の後、すべてのＦｍｏｃ脱保護は室温で行われた。
【0220】
組み立ての最後に、樹脂はＤＣＭに懸濁された、フェニルシラン（２４ｅｑ）とＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２５ｅｑ）を加え、樹脂を３０分間振動させた。サイクルを２回繰り返した。２回目のサイクルの終わりに、０．５％ＤＩＰＥＡと０．５％ジチオカルバマートナトリウムのＤＭＦ溶液を樹脂に通してパラジウム残留物を除去した。Ｌｙｓの保護解除されたアミノグループとブロモ酢酸（５ｅｑ）のカップリングは、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ法（樹脂負荷に対して４倍の過剰量）でＤＭＦ中で行った。混合物は室温で１時間振とうされ、反応はカイザーテストによって監視された。樹脂はろ過され、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（各６回）で洗浄され、一般的な合成手順で報告されているように切断混合物（Ｍｉｘ１）で処理された。粗ペプチドを精製した、ＲｅｐｒｏｓｉｌＣ４（２５０ｘ４０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ）カラムと以下のグラジエント、２０％Ｂを５分間；２０％Ｂから４０％Ｂに２５分間；流量、６０ｍＬ／分、波長２１４ｎｍ。生成物を含む画分を収集し、凍結乾燥してＴＦＡ塩として精製された生成物を得ました（Ｙ＝３０％）。
【0221】
配列番号４１の合成：
Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－ＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫＳＴ－ＮＨ２（ＳＰ５４７）配列番号４１（ＰｅｐＳＰ５４７）は、ＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ７６－Ｔｈｒ９１領域をカバーする線状ペプチドで、アジド－リンカーの位置はＮ末端にある。
Ａｃ－Ｋ（Ｎ３）－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－ＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫＳＴ－ＮＨ２（ＳＰ５４７）配列番号４１（ＰｅｐＳＰ５４７）は、ＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ７６－Ｔｈｒ９１領域をカバーする線状ペプチドで、アジド－リンカーの位置はＮ末端にある。
【0222】
配列番号４２の合成：
Ａｃ－ＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫＳＴ－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２（ＳＰ５４８）配列番号４２（ＰｅｐＳＰ５４８）も同じくＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ７６－Ｔｈ９１領域をカバーする線状ペプチドであるが、アジド－リンカーの位置はＣ末端にある。
Ａｃ－ＹＫＤＤＶＬＦＹＮＩＳＳＭＫＳＴ－ＧＧＳＧＧＳＧＧ－Ｋ（Ｎ３）－ＮＨ２（ＳＰ５４８）配列番号４２（ＰｅｐＳＰ５４８）も同じくＣＤ３１ＩｇＬ１－ＡのＴｙｒ７６－Ｔｈ９１領域をカバーする線状ペプチドであるが、アジド－リンカーの位置はＣ末端にある。
【0223】
プロトコル
ニチノールディスクは未処理（ベアメタル）またはドメイン１、ドメイン２、またはドメイン１と２のＣＤ３１アナログペプチドでコーティングされる。テストされたペプチドは、ポリドーパミン、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミン、およびアジドＣＤ３１誘導体ペプチドを使用したシーケンシャルディップコーティング層形成手順に従ってニチノールディスクにグラフトされる。このステップの後、すべてのディスクは４８時間ヒト大動脈内皮細胞とインキュベートされる。ディスクはその後洗浄され、細胞はホルマリン溶液で固定され、染色される。染色は、アレクサフルオール（登録商標）４８８色素（アクチンの緑色蛍光）に結合したファロイジンを使用して行われ、ＤＡＰＩはＤＮＡ染色に使用され、ドメイン１のＣＤ３１抗体はＡＰＣに結合されて外部ドメイン１の染色に使用される。細胞接着およびアクチン／ＣＤ３１の発現は、染色後の表面の画像解析によって評価された。
ニチノールディスクは未処理（ベアメタル）またはドメイン１、ドメイン２、またはドメイン１と２のＣＤ３１アナログペプチドでコーティングされる。テストされたペプチドは、ポリドーパミン、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミン、およびアジドＣＤ３１誘導体ペプチドを使用したシーケンシャルディップコーティング層形成手順に従ってニチノールディスクにグラフトされる。このステップの後、すべてのディスクは４８時間ヒト大動脈内皮細胞とインキュベートされる。ディスクはその後洗浄され、細胞はホルマリン溶液で固定され、染色される。染色は、アレクサフルオール（登録商標）４８８色素（アクチンの緑色蛍光）に結合したファロイジンを使用して行われ、ＤＡＰＩはＤＮＡ染色に使用され、ドメイン１のＣＤ３１抗体はＡＰＣに結合されて外部ドメイン１の染色に使用される。細胞接着およびアクチン／ＣＤ３１の発現は、染色後の表面の画像解析によって評価された。
【0224】
【0225】
特に、図２に示すように、裸のまたはコーティングされたニチノールディスクは培養ウェルの底に配置された。一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）は、４８時間の期間ディスク上で成長することが許可された。その後、ディスクはリン酸緩衝生理食塩水で洗浄され、ホルマリンで固定され、蛍光顕微鏡検査のために処理された。ディスクに付着した細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍｌ、核を染色するため）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８染料に結合したファロイジン（０．５μＭ、Ｆ－アクチン繊維を染色するため）およびＣＤ３１ドメイン１に対するモノクローナル抗体、アロフィコシアニンに結合したもの（細胞表面での完全なＣＤ３１の存在と局在を検出するため）を含む溶液に３７℃で１時間浸漬され、洗浄され、ガラス底のイメージングチャンバーに裏返しに取り付けられ、倒立蛍光顕微鏡でイメージングされた。代表的な画像は、裸の材料上で成長するＨＡＥＣが強いＦ－アクチン染色を示し、ストレスファイバーの形成が強化されていることを反映している一方で、完全なＣＤ３１の発現はむしろ弱いことを示している。対照的に、ＣＤ３１模倣ペプチドでコーティングされたディスクは、ストレスファイバーのシグナルがほとんど見られず、細胞境界で強く均一なＣＤ３１発現を示し、より生理的な内皮表現型を反映していた。
【0226】
図３は、個々のディスク画像のシグナルの定量分析を示しており、「統合密度」（シグナル密度に陽性染色の面積を掛けたものとして、ＩｍａｇｅＪ解析オープンソフトウェアによって報告されている）として表現されている。表面タイプはＹ軸に示され、データは平均±ＳＤ（Ｎ＝６／表面タイプ）として表現されている。各ドットは特定の表面変更に対応している。Ｆ－アクチンの発現は、外来材料の存在下での細胞の細胞ストレスに関連している。すべての表面変更は、ＳＰ１０７０ペプチドを除いて、裸金属と比較して細胞ストレスの減少をもたらする。ＳＰ１０７０ペプチドは、裸金属と比較して細胞ストレスに影響を示しません。
【0227】
図４では、表面タイプがＹ軸に示されている。各ドットは特定の表面変更に対応している。データは「統合密度」平均±ＳＤ（Ｎ＝６／表面タイプ）として表現されている。ＣＤ３１の発現は、内皮細胞が特定の基質上で成長する際に生理的な表現型を採用する能力に関連している。ニチノールディスクの表面修飾に応じて、ＨＡＥＣによるＣＤ３１発現に関して重要な変動が観察される。表示されたＣＤ３１アナログペプチドのうち４つ（ペプチドＳＰ１０７２－１３７４－１３７５および１３８０）は、他の修飾ディスクおよび裸のコントロールと比較して、ＣＤ３１発現に明らかなプラスの効果を示する。
【0228】
図５の「ミラー」バーは、ディスク表面にコーティングされた各ペプチドタイプ（Ｙ軸に示されている）および裸のディスクに対するＦ－アクチン（左）およびＣＤ３１（右）染色の平均統合密度を報告している。データは、各コーティングの細胞ストレス（アクチン発現）の増加に従って（上から下へ）並べ替えられている。図に示されているように、裸の金属ディスク上で成長したＨＡＥＣでは、細胞ストレスの度合い（高いアクチン発現によって検出される）および内皮表現型の障害（低いＣＤ３１発現によって記録される）が明らかである。逆に、ＳＰ１３７４ペプチドでコーティングされたディスクじみたＣＤ３１模倣表面は、低い細胞ストレス（低いアクチン発現）と一貫した機能的内皮表現型（高いＣＤ３１発現）をもたらする。
【0229】
図６に示されているデータは、ＣＤ３１とＦ－アクチン発現の比率として表されている。裸の金属およびＰＤＡのみでコーティングされたディスクと比較して、ペプチドＳＰ１０７２、１０７４、１０７５および１０８０でコーティングされた表面で成長する細胞は、明らかにより高いＣＤ３１／アクチン比を示し、より生理的な内皮細胞表現型を反映している。
【0230】
実施例１
機能スコアとバイオミメティック性能
機能スコア
図６と同じプロトコルに従って、異なるグループに属する異なるペプチドの効果がバッチでテストされた。各グループからの異なるペプチドがバッチでテストされ、個々のペプチドの効果が別々の実験で繰り返し評価された。すべての実験からのデータは、内皮細胞で覆われたディスク側の画像のコンピュータ支援解析によって得られ、逆位蛍光顕微鏡の青、緑および赤チャネルでキャプチャされた。異なるグループに属するペプチドの機能スコアは、細胞数（青色、Ｄａｐｉ＋核の数で検出）をＣＤ３１発現の統合密度（マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体、クローン９Ｇ１１、アロフィコシアニン結合による赤色シグナル）で掛け、その積をＦ－アクチン重合の統合密度（緑色蛍光色素に結合したファロイジン）で割ることによって計算された。
機能スコアとバイオミメティック性能
機能スコア
図６と同じプロトコルに従って、異なるグループに属する異なるペプチドの効果がバッチでテストされた。各グループからの異なるペプチドがバッチでテストされ、個々のペプチドの効果が別々の実験で繰り返し評価された。すべての実験からのデータは、内皮細胞で覆われたディスク側の画像のコンピュータ支援解析によって得られ、逆位蛍光顕微鏡の青、緑および赤チャネルでキャプチャされた。異なるグループに属するペプチドの機能スコアは、細胞数（青色、Ｄａｐｉ＋核の数で検出）をＣＤ３１発現の統合密度（マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体、クローン９Ｇ１１、アロフィコシアニン結合による赤色シグナル）で掛け、その積をＦ－アクチン重合の統合密度（緑色蛍光色素に結合したファロイジン）で割ることによって計算された。
【0231】
すべての実験からの生データを使用してスコアを計算するために使用された式は次のとおりである、核の数ｘＣＤ３１染色の統合密度Ｆ－アクチン染色の統合密度スコアは各実験で（ｘ－ｍｉｎ）／（ｍａｘ－ｍｉｎ）の式を使用して０－１にスケールされた。
【0232】
【0233】
バイオミメティック性能
異なるグループに属するペプチド（ペプチド番号は括弧内に示されている）の機能効果（バイオミメティック性能）は、図６の実施例で説明されたのと同じプロトコルを使用してスクリーニングされた。各グループからの異なるペプチドがバッチでテストされ、個々のペプチドの効果が別々の実験で繰り返し評価された。すべての実験からのデータは、内皮細胞で覆われたディスク側の画像のコンピュータ支援解析によって得られ、逆位蛍光顕微鏡の青、緑および赤チャネルでキャプチャされた。異なるグループに属するペプチドの機能スコアは、細胞数（青色、Ｄａｐｉ＋核の数で検出）をＣＤ３１発現の統合密度（マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体、クローン９Ｇ１１、アロフィコシアニン結合による赤色シグナル）で掛け、その積をＦ－アクチン重合の統合密度（緑色蛍光色素に結合したファロイジン）で割ることによって計算された。
異なるグループに属するペプチド（ペプチド番号は括弧内に示されている）の機能効果（バイオミメティック性能）は、図６の実施例で説明されたのと同じプロトコルを使用してスクリーニングされた。各グループからの異なるペプチドがバッチでテストされ、個々のペプチドの効果が別々の実験で繰り返し評価された。すべての実験からのデータは、内皮細胞で覆われたディスク側の画像のコンピュータ支援解析によって得られ、逆位蛍光顕微鏡の青、緑および赤チャネルでキャプチャされた。異なるグループに属するペプチドの機能スコアは、細胞数（青色、Ｄａｐｉ＋核の数で検出）をＣＤ３１発現の統合密度（マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体、クローン９Ｇ１１、アロフィコシアニン結合による赤色シグナル）で掛け、その積をＦ－アクチン重合の統合密度（緑色蛍光色素に結合したファロイジン）で割ることによって計算された。
【0234】
すべての実験からの生データを使用してスコアを計算するために使用された式は次のとおりである、核の数ｘＣＤ３１染色の統合密度Ｆ－アクチン染色の統合密度スコアは各実験で（ｘ－ｍｉｎ）／（ｍａｘ－ｍｉｎ）の式を使用して０－１にスケーリングされ、すべての実験からのスケーリングされたスコアは図２４に示されている。
【0235】
実施例２
発明によるペプチドのさらなるＣＤ３１／アクチンスコアと従来技術のペプチドＰ８ＲＩとの比較
材料と方法
実施例１と同じプロトコルに従い、上記で定義された発明によるペプチド（ＳＰ５４７、ＳＰ５４８、ＳＰ７４５、ＳＰ１３７４、ＳＰ１０７２、ＳＰ１０７０、ＳＰ１０７１、ＳＰ１３７９およびＳＰ１３８３）と、配列ＫＷＰＡＬＦＶＲ（配列番号、）の従来技術のペプチドＰ８ＲＩを使用した。５２）．
発明によるペプチドのさらなるＣＤ３１／アクチンスコアと従来技術のペプチドＰ８ＲＩとの比較
材料と方法
実施例１と同じプロトコルに従い、上記で定義された発明によるペプチド（ＳＰ５４７、ＳＰ５４８、ＳＰ７４５、ＳＰ１３７４、ＳＰ１０７２、ＳＰ１０７０、ＳＰ１０７１、ＳＰ１３７９およびＳＰ１３８３）と、配列ＫＷＰＡＬＦＶＲ（配列番号、）の従来技術のペプチドＰ８ＲＩを使用した。５２）．
【0236】
結果
「ＣＤ３１／アクチン」スコアは、ＣＤ３１免疫染色シグナルの統合密度をファロイジンのシグナルで割ったもので、ファロイジンは細胞骨格の重合Ｆ－アクチンに結合する。このスコアは、培養ウェルの底に置かれた実験ディスクの表面に成長する動脈内皮細胞の生理的／非ストレス状態を識別するために使用された。より高いスコアはより生理的な状態を示し、より低いスコアは内皮細胞のストレス状態を反映し、血栓形成促進／炎症促進活動と関連している（個別の培養ウェルの上清中の可溶性ＰＡＩ－１およびＩＬ－６のレベルによって確認される）。したがって、ＣＤ３１／アクチンスコアが高いほど良いである。
「ＣＤ３１／アクチン」スコアは、ＣＤ３１免疫染色シグナルの統合密度をファロイジンのシグナルで割ったもので、ファロイジンは細胞骨格の重合Ｆ－アクチンに結合する。このスコアは、培養ウェルの底に置かれた実験ディスクの表面に成長する動脈内皮細胞の生理的／非ストレス状態を識別するために使用された。より高いスコアはより生理的な状態を示し、より低いスコアは内皮細胞のストレス状態を反映し、血栓形成促進／炎症促進活動と関連している（個別の培養ウェルの上清中の可溶性ＰＡＩ－１およびＩＬ－６のレベルによって確認される）。したがって、ＣＤ３１／アクチンスコアが高いほど良いである。
【0237】
異なるペプチドを用いて繰り返し行われた実験の結果は図２５に示されている。発明による新しいペプチドＳＰ７４５、ＳＰ１３７４、ＳＰ１０７２、ＳＰ１０７０、ＳＰ１０７１、ＳＰ１３７９およびＳＰ１３８３で得られたＣＤ３１／アクチンスコアは、裸の金属ディスクやＰＤＡ単独でコーティングされたディスクで得られたものよりも著しく高いである。統計的有意性は一つの測定だけでは達成できませんが、新しいペプチドＳＰ５４７およびＳＰ５４８でコーティングされたセクションは、発明による他のペプチドでコーティングされたセクションと同等のＣＤ３１／アクチンスコアを持っているようである。さらに、発明によるすべてのペプチドの平均ＣＤ３１／アクチンスコアは、従来技術のペプチドＰ８ＲＩの平均ＣＤ３１／アクチンスコアよりも高いである。
【0238】
結論
上記の結果は、発明による新しいペプチドでコーティングされたディスクが、ＰＤＡのみでコーティングされたセクションや、従来のペプチドＰ８ＲＩでコーティングされたセクションよりも高く、したがってより良いＣＤ３１／アクチンスコアを示すことを確認している。
上記の結果は、発明による新しいペプチドでコーティングされたディスクが、ＰＤＡのみでコーティングされたセクションや、従来のペプチドＰ８ＲＩでコーティングされたセクションよりも高く、したがってより良いＣＤ３１／アクチンスコアを示すことを確認している。
【0239】
実施例３
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーターステント（ＣＦＤ）の生体内効果と、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントとの比較
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーターステント（ＣＦＤ）の生体内効果と、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントとの比較
【0240】
材料と方法
ステント
フローダイバーターステント（ＣＦＤ）は、Ｓｉｎｏｍｅｄ製のニチノール製の編み目メッシュである。彼らは次のいずれかのコーティングでコーティングされている、
１．発明によるＳＰ１０７２ペプチド、または
２．親水性ポリマーｅＧＮＴＭＡ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドのエレクトログラフティングから得られる）。
ステント
フローダイバーターステント（ＣＦＤ）は、Ｓｉｎｏｍｅｄ製のニチノール製の編み目メッシュである。彼らは次のいずれかのコーティングでコーティングされている、
１．発明によるＳＰ１０７２ペプチド、または
２．親水性ポリマーｅＧＮＴＭＡ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドのエレクトログラフティングから得られる）。
【化1】
【0241】
ＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーターステントの場合、次の材料とプロトコルを使用してコーティングが行われた、
【0242】
材料：
脱塩水
Ｔｒｉｓ１０ｍＭ（分子量、１２１．１３５すなわち１．２１ｍｇ／ｍＬ）ｐＨ８．５緩衝液
０．６ｇトリズマベース（ＣＡＳ７７－８６－１）
５００ｍｌ脱塩水
ｐＨを８．５にＨＣｌで調整
０．４５μｍフィルターで濾過室温で保存
ポリドーパミン（ＰＤＡ）２ｍｇ／ｍＬ
ドーパミン塩酸塩９９％（ＣＡＳ６２－３１－７、分子量、１８９．６４、
４℃で保存）
最終濃度２ｍｇ／ｍＬの溶液を得るために、１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５に適量のドーパミン塩酸塩を溶解する（暗所で保管）
ＤＢＣＯ（分子量、６７８．７９、ＤＢＣＯ－スルホ－ＰＥＧ（４）－ＮＨ２（参照、ＲＬ－２４２１、ＩＲＩＳｂｉｏｔｅｃｈ）
化合物を受け取ったら、１５－２０ｍｇのストック重量を準備する。粉末を溶解して、
１０ｍＭＴｒｉｓバッファーｐＨ８．５で２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作成する。最終濃度３００μＭ（２０３μｇ／ｍＬ）でコーティングプロセスのための必要な体積を準備する。
脱塩水
Ｔｒｉｓ１０ｍＭ（分子量、１２１．１３５すなわち１．２１ｍｇ／ｍＬ）ｐＨ８．５緩衝液
０．６ｇトリズマベース（ＣＡＳ７７－８６－１）
５００ｍｌ脱塩水
ｐＨを８．５にＨＣｌで調整
０．４５μｍフィルターで濾過室温で保存
ポリドーパミン（ＰＤＡ）２ｍｇ／ｍＬ
ドーパミン塩酸塩９９％（ＣＡＳ６２－３１－７、分子量、１８９．６４、
４℃で保存）
最終濃度２ｍｇ／ｍＬの溶液を得るために、１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５に適量のドーパミン塩酸塩を溶解する（暗所で保管）
ＤＢＣＯ（分子量、６７８．７９、ＤＢＣＯ－スルホ－ＰＥＧ（４）－ＮＨ２（参照、ＲＬ－２４２１、ＩＲＩＳｂｉｏｔｅｃｈ）
化合物を受け取ったら、１５－２０ｍｇのストック重量を準備する。粉末を溶解して、
１０ｍＭＴｒｉｓバッファーｐＨ８．５で２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作成する。最終濃度３００μＭ（２０３μｇ／ｍＬ）でコーティングプロセスのための必要な体積を準備する。
【0243】
ＳＰ１０７２ペプチドを５０μｇ／ｍＬで使用する。
【0244】
プロトコル、
１）各ステントを５ｍＬのポリプロピレン丸底チューブ（ＢｄＦａｌｃｏｎＲｅｆ３５２０６３）に移する。ステントがチューブの底に落ちることを確認する。
２）各チューブに２ｍｇ／ｍＬのＰＤＡ溶液を４．５ｍＬ追加する。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で一晩（１８＋／－２時間）室温で均質化し、光から保護する。ステントがチューブ内で動き、キャップに引っかからないようにする。ステントの色が銀色から茶色／黒に変わるはずである。インキュベーション期間後、溶液は小さなＰＤＡ凝集体とともに黒くなる
３）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
４）最後のすすぎを残し、チューブを少なくとも３０秒間超音波処理して、残っているＰＤＡの塊を除去する。
５）各ステントを２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、チューブごとに１．８ｍＬのＤＢＣＯ（３００μＭ）を含める。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で一晩室温で均質化し、光から保護する。
６）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
７）各ステントを２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、チューブごとに１．８ｍＬのＣＤ３１ペプチド（５０μｇ／ｍＬ）を含める。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で２時間、室温で均質化し、光から保護する。
８）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
９）各ステントを絶対エタノールに５秒間浸してから乾燥させます。
１）各ステントを５ｍＬのポリプロピレン丸底チューブ（ＢｄＦａｌｃｏｎＲｅｆ３５２０６３）に移する。ステントがチューブの底に落ちることを確認する。
２）各チューブに２ｍｇ／ｍＬのＰＤＡ溶液を４．５ｍＬ追加する。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で一晩（１８＋／－２時間）室温で均質化し、光から保護する。ステントがチューブ内で動き、キャップに引っかからないようにする。ステントの色が銀色から茶色／黒に変わるはずである。インキュベーション期間後、溶液は小さなＰＤＡ凝集体とともに黒くなる
３）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
４）最後のすすぎを残し、チューブを少なくとも３０秒間超音波処理して、残っているＰＤＡの塊を除去する。
５）各ステントを２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、チューブごとに１．８ｍＬのＤＢＣＯ（３００μＭ）を含める。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で一晩室温で均質化し、光から保護する。
６）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
７）各ステントを２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、チューブごとに１．８ｍＬのＣＤ３１ペプチド（５０μｇ／ｍＬ）を含める。各チューブを回転ホイール（約２０ｒｐｍ）で２時間、室温で均質化し、光から保護する。
８）各ステントを新しいチューブに移し、脱塩水で３回すすぎます。各すすぎで回転ホイールで５分間均質化する。
９）各ステントを絶対エタノールに５秒間浸してから乾燥させます。
【0245】
比較用の親水性ポリマーｅＧＮＴＭＡコーティングフローダイバーターステントは、以下のプロトコルに従って得られた、（１）洗浄前処理、ステントフレームはアセトン、エタノール、および注射用水でそれぞれ１０分間超音波処理された。
【0246】
（２）電気グラフト溶液の調製、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、濃度０．３０Ｍ；ＮａＮＯ３、濃度０．０５Ｍ；４－ニトロフェニルテトラフルオロボレートジアゾニウム塩、０．００５Ｍ；残りの量はＤＭＳＯ溶媒。
【0247】
（３）電気グラフトプロセス、前処理されたステントを作業電極として使用し、白金箔を対極として使用し、電気グラフト溶液に浸し、－０．１Ｖから－３．０Ｖまでの線形掃引電圧を適用し、電圧スキャン速度０．０５Ｖ／ｓで１０サイクル間、２つの電極間に適用した。
【0248】
（４）コーティングの平滑化および乾燥、電気グラフトされた足場を窒素バブリング（速度０．５－１０Ｌ／ｍｉｎ）を伴うアセトン（２Ｌ）で１０分間平滑化し、４０℃の真空乾燥オーブンに２時間静置した。
【0249】
同じ組成の編みメッシュと同じ組成のクーポンにも同じプロトコルが適用される。木の棒で電気グラフトされたクーポンに傷をつけたステップでプロフィロメトリー（ＫＬＡ－Ｔｅｎｃｏｒ）で測定したところ、１２５ｎｍのフィルムが得られた。
【0250】
動物手順
合計８匹の健康なニュージーランドホワイトウサギ（予備動物２匹を含む）、オスとメス、体重約３ｋｇがこの研究に含まれた。術後７日、３０日、６０日の３つの観察時間ポイントが設定された。実験は２つのステップに分かれた、
１）動脈瘤動物モデルの作成；
２）各動物の動脈瘤を持つ動脈および腹部大動脈に密なメッシュステントを植え込む。動脈瘤を持つ動脈へのステント植え込みは、動脈瘤治療におけるステントの安全性と有効性を調べるために使用され、腹部大動脈へのステント植え込みは、腰動脈の一対を覆うことで、テストされたステントの安全性を調べるために使用された。詳細は以下の表１を参照してください。
合計８匹の健康なニュージーランドホワイトウサギ（予備動物２匹を含む）、オスとメス、体重約３ｋｇがこの研究に含まれた。術後７日、３０日、６０日の３つの観察時間ポイントが設定された。実験は２つのステップに分かれた、
１）動脈瘤動物モデルの作成；
２）各動物の動脈瘤を持つ動脈および腹部大動脈に密なメッシュステントを植え込む。動脈瘤を持つ動脈へのステント植え込みは、動脈瘤治療におけるステントの安全性と有効性を調べるために使用され、腹部大動脈へのステント植え込みは、腰動脈の一対を覆うことで、テストされたステントの安全性を調べるために使用された。詳細は以下の表１を参照してください。
【表18】
【0251】
ステップ１）および２）のために、麻酔は以下のように行われた、すべての外科手術は無菌技術を使用して行われ、実験動物は植え付け手術中に全身麻酔下にあった。
【0252】
手術当日、実験動物は鎮静され、６ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｘ（登録商標）５０を筋肉内注射して麻酔が導入される。必要に応じて、実験動物は呼吸マスクを使用して吸入によるイソフルランで麻酔することができる。
【0253】
麻酔の導入が成功した後、実験動物は口腔内視トラキアを通じて挿管され、呼吸アクセスを確立し、麻酔と酸素の混合物を連続吸入して麻酔を維持するために人工呼吸器デバイスに接続される。手術前に実験動物が嘔吐を止めるためにアトロピンを投与する必要があるかもしれません。これは、嘔吐物による窒息を防ぐためである。
【0254】
麻酔され挿管された実験動物は、側臥位または仰臥位で手術台に置かれ、拘束バンドを使用して固定され、その位置が写真撮影および記録された（後の観察のために同じ位置と角度を容易にするため）。右後肢の手術部位が準備され、消毒され、シートが敷かれる。動物の位置が変更された場合、新しいシートと手術部位の準備が必要である。
【0255】
末梢静脈のいずれかに静脈内針を挿入し、必要に応じてカテーテルを通じて薬物や補液を投与する。
【0256】
ステップ１）（動脈瘤動物モデルの作成）は以下のように行われた、
（ａ）ウサギを仰向けに手術台に置き、首を剃ります。通常、ヨードホルムとアルコールで消毒し、タオルを敷く。
（ｂ）右総頸動脈を見つけます、正中頸部切開（上胸骨窩の上と下１．５ｃｍ）を行い、皮膚を切開し、右胸鎖乳突筋の外側に沿って分離し、右総頸動脈を見つけて解放し、迷走神経の保護に注意してウサギの心拍と呼吸が遅くなったり止まったりしないようにする。２０分ごとに、生理食塩水をウサギの頸部血管と迷走神経に注入して湿らせます。２本のＮｏ．１シルクワイヤーが右総頸動脈に巻き付けられた。
（ｃ）右総頸動脈の開始部分を完全に露出させる、組織剪刀で右胸筋の一部を開き、右総頸動脈に沿って近位に分離し、右総頸動脈と右鎖骨下動脈の一部を慎重に分離する。
（ｄ）右総頸動脈の開始部分で閉鎖ルーメンを作成する、右総頸動脈の開始部分から約２．５ｃｍの位置でＮｏ．１ワイヤーを結紮し、別のＮｏ．１ワイヤーを結び目に巻き付けますが、結紮はせず、動脈瘤クリップを右鎖骨下動脈近くの右総頸動脈の開始部分にクランプし、動脈瘤クリップの内側が右総頸動脈と右鎖骨下動脈の接合部の下にあることを確認する。
（ｅ）エラスターゼの注入、眼科用ハサミで右総頸動脈の始まりから１．５ｃｍの位置で動脈の側壁を切り、エラスターゼを含むカニューレ針（末端に注射器が付いた２２Ｇカニューレ針）を挿入し、針の先端が動脈瘤クリップにできるだけ近づくようにし、液体が漏れないように絹糸でカニューレ針の挿入部を結紮し、約７５Ｕの豚膵臓エラスターゼを管腔内に注入する。
（ｆ）血管結紮、エラスターゼアブレーションから２０分後にトロカール針を取り外し、穿刺部を結紮し、動脈瘤クリップを慎重に緩め、必要に応じて生理食塩水の点滴で湿らせます。
（ｇ）傷口を縫合する、乾燥した蓄積血液に浸したガーゼで、筋肉と皮膚層を層ごとに縫合し、ヨードホルで切開部を消毒する。
（ｈ）手術直後、ヘパリンナトリウム３００Ｕ／ｋｇおよびセフトリアキソンナトリウム溶液０．３ｇ／ｋｇを静脈内注射し、動物のバイタルサインを清掃まで注意深く観察し、別々のケージで飼育した。手術後３－５日間、抗生物質の使用を続けてください。
（ａ）ウサギを仰向けに手術台に置き、首を剃ります。通常、ヨードホルムとアルコールで消毒し、タオルを敷く。
（ｂ）右総頸動脈を見つけます、正中頸部切開（上胸骨窩の上と下１．５ｃｍ）を行い、皮膚を切開し、右胸鎖乳突筋の外側に沿って分離し、右総頸動脈を見つけて解放し、迷走神経の保護に注意してウサギの心拍と呼吸が遅くなったり止まったりしないようにする。２０分ごとに、生理食塩水をウサギの頸部血管と迷走神経に注入して湿らせます。２本のＮｏ．１シルクワイヤーが右総頸動脈に巻き付けられた。
（ｃ）右総頸動脈の開始部分を完全に露出させる、組織剪刀で右胸筋の一部を開き、右総頸動脈に沿って近位に分離し、右総頸動脈と右鎖骨下動脈の一部を慎重に分離する。
（ｄ）右総頸動脈の開始部分で閉鎖ルーメンを作成する、右総頸動脈の開始部分から約２．５ｃｍの位置でＮｏ．１ワイヤーを結紮し、別のＮｏ．１ワイヤーを結び目に巻き付けますが、結紮はせず、動脈瘤クリップを右鎖骨下動脈近くの右総頸動脈の開始部分にクランプし、動脈瘤クリップの内側が右総頸動脈と右鎖骨下動脈の接合部の下にあることを確認する。
（ｅ）エラスターゼの注入、眼科用ハサミで右総頸動脈の始まりから１．５ｃｍの位置で動脈の側壁を切り、エラスターゼを含むカニューレ針（末端に注射器が付いた２２Ｇカニューレ針）を挿入し、針の先端が動脈瘤クリップにできるだけ近づくようにし、液体が漏れないように絹糸でカニューレ針の挿入部を結紮し、約７５Ｕの豚膵臓エラスターゼを管腔内に注入する。
（ｆ）血管結紮、エラスターゼアブレーションから２０分後にトロカール針を取り外し、穿刺部を結紮し、動脈瘤クリップを慎重に緩め、必要に応じて生理食塩水の点滴で湿らせます。
（ｇ）傷口を縫合する、乾燥した蓄積血液に浸したガーゼで、筋肉と皮膚層を層ごとに縫合し、ヨードホルで切開部を消毒する。
（ｈ）手術直後、ヘパリンナトリウム３００Ｕ／ｋｇおよびセフトリアキソンナトリウム溶液０．３ｇ／ｋｇを静脈内注射し、動物のバイタルサインを清掃まで注意深く観察し、別々のケージで飼育した。手術後３－５日間、抗生物質の使用を続けてください。
【0257】
ステップ２）（各動物の動脈瘤を持つ動脈および腹部大動脈に高密度メッシュステントを植え込む）は以下のように行われた、
（ａ）麻酔、上記の通り。
（ｂ）右大腿動脈を切開し、５Ｆ保護血管穿刺シースを挿入した。
（ｃ）５Ｆイントロデューサーカテーテルを大動脈弓に配置し、ＤＳＡ血管造影を行った。
（ｄ）マイクロカテーテルの配置、静脈内ヘパリンは全身ヘパリン化で処理され、マイクロカテーテルが鎖骨下動脈から血管の遠位端までマイクロガイドワイヤーを通して押し込まれ、引き抜かれた。
（ｅ）キャリア動脈の位置におけるステント植え付け、高密度メッシュステントシステムは、イントロデューサーシースを通してマイクロカテーテルに挿入され、プッシュロッドを適切な位置まで前進させ、イントロデューサーシースを引き抜き、プッシュロッドをさらに押し続けてステントをキャリア動脈に押し込み、腫瘍の首がステントの中央付近に来るようにステントの位置を調整する。プッシュロッドを固定し、マイクロカテーテルを引き戻してステントを部分的にリリースし、回収ポイントの位置にする。ステントの位置が満足できる場合は、マイクロカテーテルを引き続き引き戻してステントを完全にリリースする。位置が満足できない場合は、マイクロカテーテルを後方に押してステントをマイクロカテーテルに回収し、位置を調整して再度リリースして動脈瘤の首を完全に覆いる。ステントの配置が完了した後、デリバリーシステムとマイクロカテーテルを引き抜く。
（ｆ）腹部大動脈におけるステント植え込み、キャリア動脈の位置にテスト記事ステントのリリースが完了した後、ガイドカテーテルを引き戻して腹部大動脈の位置に配置し、同じ方法で２番目のステントを配置する。ステントは少なくとも一対の腰動脈の始まりを通して腹部大動脈に配置する必要がある。リリースが完了した後、送達システム、マイクロカテーテル、およびガイドカテーテルを引き戻し、大腿動脈切開部を縫合する。
（ｇ）動物が目を覚まし、通常通りに餌を与えるのを待ちます。
（ａ）麻酔、上記の通り。
（ｂ）右大腿動脈を切開し、５Ｆ保護血管穿刺シースを挿入した。
（ｃ）５Ｆイントロデューサーカテーテルを大動脈弓に配置し、ＤＳＡ血管造影を行った。
（ｄ）マイクロカテーテルの配置、静脈内ヘパリンは全身ヘパリン化で処理され、マイクロカテーテルが鎖骨下動脈から血管の遠位端までマイクロガイドワイヤーを通して押し込まれ、引き抜かれた。
（ｅ）キャリア動脈の位置におけるステント植え付け、高密度メッシュステントシステムは、イントロデューサーシースを通してマイクロカテーテルに挿入され、プッシュロッドを適切な位置まで前進させ、イントロデューサーシースを引き抜き、プッシュロッドをさらに押し続けてステントをキャリア動脈に押し込み、腫瘍の首がステントの中央付近に来るようにステントの位置を調整する。プッシュロッドを固定し、マイクロカテーテルを引き戻してステントを部分的にリリースし、回収ポイントの位置にする。ステントの位置が満足できる場合は、マイクロカテーテルを引き続き引き戻してステントを完全にリリースする。位置が満足できない場合は、マイクロカテーテルを後方に押してステントをマイクロカテーテルに回収し、位置を調整して再度リリースして動脈瘤の首を完全に覆いる。ステントの配置が完了した後、デリバリーシステムとマイクロカテーテルを引き抜く。
（ｆ）腹部大動脈におけるステント植え込み、キャリア動脈の位置にテスト記事ステントのリリースが完了した後、ガイドカテーテルを引き戻して腹部大動脈の位置に配置し、同じ方法で２番目のステントを配置する。ステントは少なくとも一対の腰動脈の始まりを通して腹部大動脈に配置する必要がある。リリースが完了した後、送達システム、マイクロカテーテル、およびガイドカテーテルを引き戻し、大腿動脈切開部を縫合する。
（ｇ）動物が目を覚まし、通常通りに餌を与えるのを待ちます。
【0258】
テストグループは、動脈瘤の位置（総頸動脈）および動物モデルの腹部大動脈に密なメッシュステントシステムを移植され、対照グループは動脈瘤を持つ動脈に密なメッシュステントシステムを移植された。腹部大動脈にデバイスを移植して、ステントが貫通および分岐血管に与える影響を評価した。
【0259】
植え付け中にＩＶでヘパリンナトリウム注射１５０Ｕ／ｋｇに加えて、抗血小板療法（アスピリンとクロピドグレル）を動物に手術の３日前から１日１回５ｍｇ／ｋｇずつ経口投与し、術後もエンドポイントまで５ｍｇ／ｋｇずつ経口投与した。
【0260】
組織病理学的分析
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を受けて組織病理学的分析が行われた。
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を受けて組織病理学的分析が行われた。
【0261】
動脈瘤を持つ動脈の樹脂埋め込みステントセグメントは、動脈瘤の首を通して横断的に切断され、動脈瘤で１切片、非動脈瘤で２切片が切断され、ＨＥ染色された。非ステントセグメントはパラフィン埋め込みされ、近位端と遠位端でそれぞれ１切片が切断された。組織病理学的評価のためにＨＥ染色が行われた。
【0262】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
７Ｄ（７日）、３０Ｄ（３０日）、および６０Ｄ（６０日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植された動脈瘤を持つ動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭを行い、動脈瘤の首部および腹部大動脈の分枝血管の開口部における流れ指向ステントの内皮化を観察した。
７Ｄ（７日）、３０Ｄ（３０日）、および６０Ｄ（６０日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植された動脈瘤を持つ動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭを行い、動脈瘤の首部および腹部大動脈の分枝血管の開口部における流れ指向ステントの内皮化を観察した。
【0263】
注：７Ｄ時点では腹部大動脈のみがＳＥＭで検査され、３０Ｄ時点ではキャリア動脈のＳＥＭが決定され、６０Ｄ時点ではキャリア動脈および腹部大動脈がＳＥＭで検査された。
【0264】
結果
電気グラフトクーポン上のｅＧ（商標）ＮＴＭＡフィルムグラフトの確認ｅＧ（商標）ＮＴＭＡフィルムの赤外スペクトルは図２６に示されている。
電気グラフトクーポン上のｅＧ（商標）ＮＴＭＡフィルムグラフトの確認ｅＧ（商標）ＮＴＭＡフィルムの赤外スペクトルは図２６に示されている。
【0265】
さらに、サンプルの親水性の比較は水滴の形状によって視覚化できる（図２７）、裸の表面では水滴が表面に立っているのに対し、ｅＧ（商標）ＮＴＭＡ表面では水滴が完全に平らであり、水接触角はほとんど測定できず、表面が超親水性であることを示している。
【0266】
これらの結果は、比較ＣＦＤステント上のｅＧ（商標）ＮＴＭＡフィルムの効率的なエレクトログラフティングを確認する。
【0267】
ＳＥＭ結果
発明によるｅＧＴＭＮＴＭＡまたはＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたステントの７日目の代表的なＳＥＭ断面は、図２８に示されている。
発明によるｅＧＴＭＮＴＭＡまたはＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたステントの７日目の代表的なＳＥＭ断面は、図２８に示されている。
【0268】
ｅＧＴＭＮＴＭＡコーティングされたステント（左側を参照）の場合、ステントは血管内で完全に拡張され、良好なステント血管接合および血管内腔の開存性が見られた。少量の血栓が部分的な領域に散在していた。少量のステントでは、ステント表面に内皮被覆があり、内皮被覆がない領域では、赤血球、炎症細胞、および血小板凝集がステント表面に付着している程度が異なっていた。側副血管の口径に閉塞は見られず、側副血管内の血流の開存性を示している。
【0269】
ＳＰ１０７２コーティングされたステント（右側参照）では、ステントは血管内で完全に拡張され、良好なステント血管の適合性と血管内腔の開存性が見られた。明らかな血栓は見られませんだったが、ｅＧＴＭＮＴＭＡコーティングされたステントとは対照的だった。ステント表面には部分的に内皮被覆が見られ（特に図２６Ｂの領域ＢおよびＤでの良好な被覆を参照）、内皮被覆がない領域では、赤血球、炎症細胞、および血小板がステント表面に付着していた。側副血管の口径に閉塞は見られず、側副血管内の血流の開存性を示している。
【0270】
組織病理学的分析
７日目の代表的な病理結果は図２９に示されている。
７日目の代表的な病理結果は図２９に示されている。
【0271】
ｅＧＴＭＮＴＭＡコーティングされたステント（図２９Ａ参照）では、動脈瘤の首の前にあるステント（右側参照）は新しい壁で覆われている。しかし後者は白血球に浸潤されているように見える（筋肉部分内の黒い核、およびステントストラットの近く、右下の写真参照）、内側には新鮮なフィブリン層が層を成し、外側には赤血球と血小板が詰まっている（フィブリン層の暗灰色の領域、左下の写真の黒い円参照）。さらに、動脈瘤嚢内の血栓は組織化されていないように見える（重合された細胞外マトリックスシートの存在の証拠はあらない）し、新鮮な血液（赤血球、血小板、白血球）がまだ血栓内に入っている。これは重要である。なぜなら、新鮮な血液がまだ入って嚢内に閉じ込められるという事実は、遅発性動脈瘤破裂のリスクを高める可能性があるからである。新鮮な血液の持続的な到来により新たな血栓形成／線溶の波が発生し、最終的に二つのシステム（トロンビン、プラスミンなど）の酵素が動脈瘤壁の分解を促進するからである。総じて、これらのデータは動脈瘤の首を覆う新生組織が過剰反応している（血栓形成および炎症を起こしている）、おそらく金属（異物）に対して、そして漏れやすいことを示している。
【0272】
対照的に、ＳＰ１０７２コーティングされたステント（図２９Ａ参照）の場合、動脈瘤嚢内の血栓は「組織化された」ものであり、明確で整列した細胞外マトリックスシートが見えるため、暗灰色の長く波打った線として検出される。注目すべきは、動脈瘤嚢内の新しい壁と血栓の間の空間が、無定形の灰色物質（新鮮なフィブリンや赤血球）を含まないことであり、これは新鮮な血液がもはやそこに入って閉じ込められることがないことを示しており、したがって血液酵素による動脈瘤壁の分解のリスクが低いことを反映している。嚢の周りの動脈壁の厚く規則的な形状はこの仮定を支持しており、血栓内の無定形物質／暗い核の欠如は、新鮮な血小板や凝固因子に対して不浸透性であるという仮定を支持している。
【0273】
右上の画像の黒い円、新しい動脈壁、細胞外マトリックスが豊富でコンパクト（濃い灰色）であり、炎症がない（黒い核がない）または血栓症がステントの下で形成されている。
【0274】
外側に組織化された血栓と内側に組織化された新しい壁の存在は、血液がまだ大きな動脈瘤の袋に入る可能性があるとしても、実施例に示されているように、ステントの特定の部分を通っても、血栓に入ることも新しい壁の上で凝固することもできないという事実を支持しており、血栓の完全な治癒と短期間での閉塞を可能にする、血液が新鮮な血栓や裸のステントに接触できる状況と比較して。実際、キャビティが仮想的になると、裸のステント（新しい壁がない部分）にＣＤ３１模倣コーティングが施されることで、隣接する内皮細胞がデバイス上およびその間に移動し成長するのを促進し、組織化された血栓を完全に覆い、それによって動脈瘤の首を閉塞することができる。
【0275】
ＳＰ１０７２コーティングステントの動脈瘤に対する６０日目の代表的な病理結果は、図３０に示されている。非常に大きな動脈瘤嚢にもかかわらず、血栓は非常によく組織化されている（血栓全体にわたる長く整然とした細胞外マトリックスのシート、新鮮な血液に対して不浸透性であり、血栓への白血球／血小板／赤血球の浸潤がないことによって検出可能）。組織化された血栓の前面がステントに到達するとすぐに、首は新しい動脈壁で完全に覆われる。後者は、ステントストラットと既に接触している動脈壁の炎症／血栓症の欠如（異物に対する反応の欠如）によって示唆されるように、よく組織化されている可能性が高いである。
【0276】
結論
上記の結果は、ＳＰ１０７２コーティングが以下を示していることを示している、
・フローダイバーターステントの内面で早期内皮化を促進する、
・動脈瘤嚢の入口で組織化された血液不浸透性の新しい動脈壁の成長を促進し、嚢内に組織化され非炎症性の血栓を形成することを可能にする、そして
・動脈瘤の入口以外の部位では、デバイスの内皮化が迅速かつ完全であり、明らかな炎症や新内膜形成は見られない。
上記の結果は、ＳＰ１０７２コーティングが以下を示していることを示している、
・フローダイバーターステントの内面で早期内皮化を促進する、
・動脈瘤嚢の入口で組織化された血液不浸透性の新しい動脈壁の成長を促進し、嚢内に組織化され非炎症性の血栓を形成することを可能にする、そして
・動脈瘤の入口以外の部位では、デバイスの内皮化が迅速かつ完全であり、明らかな炎症や新内膜形成は見られない。
【0277】
発明による他のペプチドで得られた同等のｉｎｖｉｔｒｏ結果を考慮すると、熟練者によって同様のｉｎｖｉｖｏ結果も期待されるろう。
【0278】
実施例４
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーターステント（ＣＦＤ）の生体効果を、抗血小板化合物の投与がない場合において、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントと比較する
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーターステント（ＣＦＤ）の生体効果を、抗血小板化合物の投与がない場合において、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントと比較する
【0279】
実施例３で得られた良好な結果は、ＳＰ１０７２（または発明による別のペプチド）でコーティングされたステントが、移植後に抗血小板化合物、特に抗Ｐ２Ｙ１２剤の投与を防ぐために、十分に迅速な再内皮化と十分な炎症の欠如を許す可能性があることを示唆している。
【0280】
この仮説をテストするための予備実験が行われた。
【0281】
材料と方法
実施例３と同じ材料とプロトコルが使用されたが、以下の点が異なる、
・各条件に対して３匹の動物のみが使用され、
・移植後に動物にアスピリンやクロピドグレルは投与されませんだった。
実施例３と同じ材料とプロトコルが使用されたが、以下の点が異なる、
・各条件に対して３匹の動物のみが使用され、
・移植後に動物にアスピリンやクロピドグレルは投与されませんだった。
【0282】
結果
予備結果は次のことを示している、
・ＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーステントを移植された動物は、７日後も血栓なしで生存している（ｎ＝３）、
・対照的に、ｅＧＴＭＮＴＭＡでコーティングされたステントを移植された動物は、７日目にすべて血栓症で死亡した（ｎ＝３）。
予備結果は次のことを示している、
・ＳＰ１０７２でコーティングされたフローダイバーステントを移植された動物は、７日後も血栓なしで生存している（ｎ＝３）、
・対照的に、ｅＧＴＭＮＴＭＡでコーティングされたステントを移植された動物は、７日目にすべて血栓症で死亡した（ｎ＝３）。
【0283】
結論
予備的なものであるが、この実験は、発明によるペプチドでコーティングされた医療デバイスを用いた植え付け後の治療において、患者が抗Ｐ２Ｙ１２の使用を必要としない可能性があり、さらに一般的には抗血小板療法（アスピリンを含む）を必要としない可能性があることを示唆している。
予備的なものであるが、この実験は、発明によるペプチドでコーティングされた医療デバイスを用いた植え付け後の治療において、患者が抗Ｐ２Ｙ１２の使用を必要としない可能性があり、さらに一般的には抗血小板療法（アスピリンを含む）を必要としない可能性があることを示唆している。
【0284】
この結果は非常に重要であり、抗血小板化合物、特に抗Ｐ２Ｙ１２療法は出血リスクのある個人には安全に使用できない。さらに、出血リスクのない個人でも、抗血小板化合物は重大な副作用（アスピリンによる消化性潰瘍、抗Ｐ２Ｙ１２による好中球減少症など）を引き起こす可能性があり、発明によるペプチドでコーティングされた医療デバイスの使用により、抗血小板化合物が必要ない場合や、はるかに低い濃度で使用できる場合にはこれらの副作用を防ぐことができるかもしれない。
【0285】
実施例５
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされた自己拡張型ステントの生体効果と、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントの比較
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされた自己拡張型ステントの生体効果と、親水性ポリマーＮＴＭＡのみでコーティングされたステントの比較
【0286】
材料と方法
ステント
自己拡張型ステント（ＩＳＳ）は、Ｓｉｎｏｍｅｄ製のニチノールで作られた編み目メッシュである。彼らは次のいずれかのコーティングでコーティングされている、
１．発明によるＳＰ１０７２ペプチド、または
２．親水性ポリマーｅＧＴＭＮＴＭＡ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドの電着から得られる）。ＳＰ１０７２ペプチドコーティングは、上記の実施例３に記載されているように行われる。
ステント
自己拡張型ステント（ＩＳＳ）は、Ｓｉｎｏｍｅｄ製のニチノールで作られた編み目メッシュである。彼らは次のいずれかのコーティングでコーティングされている、
１．発明によるＳＰ１０７２ペプチド、または
２．親水性ポリマーｅＧＴＭＮＴＭＡ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドの電着から得られる）。ＳＰ１０７２ペプチドコーティングは、上記の実施例３に記載されているように行われる。
【0287】
親水性ポリマーｅＧＴＭＮＴＭＡコーティングされたステントは、上記の実施例３に記載されているように得られる。
【0288】
動物手順
この研究では、実験動物として５匹の健康なニュージーランドホワイトウサギが選ばれ、さらに２匹の予備動物が追加される。術後７日、１４日、２８日の３つの観察時間点があり、７日目の時間点に２匹、１４日目の時間点に１匹、２８日目の時間点に２匹の動物がいる。各実験動物に合計４本のステントが移植され（テスト記事Ａとテスト記事Ｂにそれぞれ２本ずつ）、各動物のステント移植部位として腹部大動脈と両側腸骨動脈が選択され、腹部大動脈に２本、両側腸骨動脈にそれぞれ１本のステントが移植される。術後の観察期間は画像診断でフォローアップされ、グループＡおよびＢの各動物からランダムに選択された１つのサンプルがＳＥＭに使用され、残りのサンプルは組織病理学的に分析される。実験の一般的な設計は以下の通りである。
この研究では、実験動物として５匹の健康なニュージーランドホワイトウサギが選ばれ、さらに２匹の予備動物が追加される。術後７日、１４日、２８日の３つの観察時間点があり、７日目の時間点に２匹、１４日目の時間点に１匹、２８日目の時間点に２匹の動物がいる。各実験動物に合計４本のステントが移植され（テスト記事Ａとテスト記事Ｂにそれぞれ２本ずつ）、各動物のステント移植部位として腹部大動脈と両側腸骨動脈が選択され、腹部大動脈に２本、両側腸骨動脈にそれぞれ１本のステントが移植される。術後の観察期間は画像診断でフォローアップされ、グループＡおよびＢの各動物からランダムに選択された１つのサンプルがＳＥＭに使用され、残りのサンプルは組織病理学的に分析される。実験の一般的な設計は以下の通りである。
【表19】
【0289】
外科手術手順、
（１）麻酔は以下のように行われた、
すべての外科手術は無菌技術を使用して行われ、実験動物は植え付け手順中に全身麻酔下にある。手術当日、実験動物は鎮静され、６ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｘ（登録商標）５０を筋肉内注射して麻酔が導入される。必要に応じて、実験動物は呼吸マスクを使用して吸入によるイソフルランで麻酔することができる。
（１）麻酔は以下のように行われた、
すべての外科手術は無菌技術を使用して行われ、実験動物は植え付け手順中に全身麻酔下にある。手術当日、実験動物は鎮静され、６ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｘ（登録商標）５０を筋肉内注射して麻酔が導入される。必要に応じて、実験動物は呼吸マスクを使用して吸入によるイソフルランで麻酔することができる。
【0290】
麻酔の誘導が成功した後、実験動物は口腔平面気管を通して挿管され、呼吸アクセスを確立し、麻酔と酸素の混合物を連続吸入して麻酔を維持するために人工呼吸器装置に接続される。手術前に実験動物が嘔吐を止めるためにアトロピンを投与する必要があるかもしれません。これは、嘔吐物による窒息を防ぐためである。
【0291】
麻酔された挿管された実験動物は、側臥位または仰臥位で手術台に置かれ、拘束バンドを使用して動物を固定し、位置を写真撮影および記録する（後の観察に同じ位置と角度を使用するため）。右後肢の手術部位が準備され、消毒され、シートが敷かれる。動物の位置が変更された場合、手術部位のシートと準備を再度行う必要がある。
【0292】
末梢静脈のいずれかに静脈内針を挿入し、必要に応じてカテーテルを通じて薬物や補液を投与する。
【0293】
（２）５Ｆの血管シースを左または右の総頸動脈に挿入して血管アクセスを確立する。
【0294】
（３）ガイドワイヤーの指導の下で血管アクセスを介して５Ｆカテーテルを心臓の下行大動脈に導入し、腸骨動脈の血管造影を行いる。血管造影後に定量的な動脈血管測定を行い、ステント植え込み部位の選択を指導する。
【0295】
（４）マイクロカテーテルの配置、全身ヘパリン化で静脈内ヘパリンを処理し、マイクロカテーテルを配置する。マイクロカテーテルはマイクロガイドワイヤーを通して腸骨動脈の実験動物ステントを移植する部位まで押し進められ、マイクロガイドワイヤーは引き抜かれる。
【0296】
（５）腸骨動脈ステントの植え込み、システムは導入シースを通してマイクロカテーテルに入り、プッシュロッドを適切な位置まで前進させ、導入シースを引き抜き、プッシュロッドをさらに押し進めてステントを腸骨動脈に押し込み、ステントの位置を調整してステントが血管内の所定の位置にあることを確認する。プッシュロッドを固定し、マイクロカテーテルを引き戻してステントの部分的なリリースを開始し、回収ポイント位置に配置する。ステントの位置が満足できるものであれば、マイクロカテーテルを引き続き引き戻してステントを完全にリリースする。位置が満足できない場合は、マイクロカテーテルを後方に押してステントをマイクロカテーテル内に回収し、位置を調整して再度リリースする。ステントの配置が完了した後、デリバリーシステムを引き戻し、マイクロガイドワイヤーを再度マイクロカテーテルに押し込み、マイクロガイドワイヤーとマイクロカテーテルを一緒に反対側の腸骨動脈に押し込み、同じ方法で反対側のステントの植え付けを完了する。
【0297】
（６）腹部大動脈におけるステントの植え付け、腸骨動脈の位置テストピンステントのリリースが完了した後、マイクロカテーテルを引き戻して腹部大動脈の位置に配置し、同じ方法で腹部大動脈に２セットのステントを配置する。手順の最後に、すべての器具と装置は実験動物から取り除かれる。
【0298】
（７）動物が目を覚ますのを待ち、実験が終了するまで通常通りに保ちます。
【0299】
植え付け中にヘパリンナトリウム注射１５０Ｕ／ｋｇをＩＶで投与することに加えて、アスピリンを手術の３日前から１日１回５ｍｇ／ｋｇを経口投与し、手術後もエンドポイントまで５ｍｇ／ｋｇを経口投与する。また、クロピドグレルを手術の３日前から１日１回１８．７５ｍｇを経口投与し、手術後もエンドポイントまで１８．７５ｍｇを経口投与する。
【0300】
組織病理学的分析
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を行い、組織病理学的分析のために保存される。
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を行い、組織病理学的分析のために保存される。
【0301】
腸骨動脈の樹脂包埋されたステントセグメントは横断的に切断され、ＨＥ染色される。非ステントセグメントはパラフィン包埋され、近位端と遠位端でそれぞれ１枚ずつ切片が作成される。ＨＥ染色は組織病理学的評価のために行われる。
【0302】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
７Ｄ（７日）、１４Ｄ（１４日）、および２８Ｄ（２８日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植されたステント付き腸骨動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭで観察し、ＩＳＳステントの内皮化を確認する。
７Ｄ（７日）、１４Ｄ（１４日）、および２８Ｄ（２８日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植されたステント付き腸骨動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭで観察し、ＩＳＳステントの内皮化を確認する。
【0303】
結果
実施例３でＣＦＤステントで既に得られた結果に基づいて、ＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたＩＳＳステントは、ｅＧＴＭＮＴＭＡエレクトログラフトＩＳＳステントよりも良好な内皮化と限られた新内膜形成が期待される。
実施例３でＣＦＤステントで既に得られた結果に基づいて、ＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたＩＳＳステントは、ｅＧＴＭＮＴＭＡエレクトログラフトＩＳＳステントよりも良好な内皮化と限られた新内膜形成が期待される。
【0304】
実施例６
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたバルーン拡張可能なＣｏＣｒステントの生体効果を、ベアメタルステントおよびＨＴスプリームステントと比較
本発明によるペプチドＳＰ１０７２でコーティングされたバルーン拡張可能なＣｏＣｒステントの生体効果を、ベアメタルステントおよびＨＴスプリームステントと比較
【0305】
材料と方法
ステント
３種類のバルーン拡張可能なステントが使用される、
・ＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたＣｏＣｒステント、
・ベアメタルステント、および
・Ｓｉｎｏｍｅｄによって商業化されたＦＴＳｕｐｒｅｍｅステントは、ｅＧＢｕＭＡプライマー層と１０μｍ厚のＰＬＧＡ（ポリ（乳酸－コハク酸））層を含み、シロリムスの濃度は１．２μｇ／ｍｍ２
ステント
３種類のバルーン拡張可能なステントが使用される、
・ＳＰ１０７２ペプチドでコーティングされたＣｏＣｒステント、
・ベアメタルステント、および
・Ｓｉｎｏｍｅｄによって商業化されたＦＴＳｕｐｒｅｍｅステントは、ｅＧＢｕＭＡプライマー層と１０μｍ厚のＰＬＧＡ（ポリ（乳酸－コハク酸））層を含み、シロリムスの濃度は１．２μｇ／ｍｍ２
【0306】
動物手順
この研究では、９匹の健康なニュージーランドホワイトウサギが実験動物として選ばれ、２匹の予備動物が選ばれた。動物は３つの観察時間ポイントに分けられる、手術後７日、１４日、２８日で、それぞれの時間ポイントに３匹の動物がいる。各動物には４つのステントが移植され、各動物の腹部大動脈と両側腸骨動脈がステント植え付け部位として選ばれる。腹部大動脈に２つのステントが植え付けられ、各両側腸骨動脈に１つのステントが植え付けられる。術後観察期間の終わりに、異なるコーティングを持つ各動物の２つのサンプルがランダムに選ばれてＳＥＭにかけられ、残りのサンプルは組織病理学的に分析される。実験の一般的な設計は、以下の表４に示されている。
この研究では、９匹の健康なニュージーランドホワイトウサギが実験動物として選ばれ、２匹の予備動物が選ばれた。動物は３つの観察時間ポイントに分けられる、手術後７日、１４日、２８日で、それぞれの時間ポイントに３匹の動物がいる。各動物には４つのステントが移植され、各動物の腹部大動脈と両側腸骨動脈がステント植え付け部位として選ばれる。腹部大動脈に２つのステントが植え付けられ、各両側腸骨動脈に１つのステントが植え付けられる。術後観察期間の終わりに、異なるコーティングを持つ各動物の２つのサンプルがランダムに選ばれてＳＥＭにかけられ、残りのサンプルは組織病理学的に分析される。実験の一般的な設計は、以下の表４に示されている。
【表20】
【0307】
外科手術手順
（１）麻酔、
すべての外科手術は無菌技術を使用して行われ、実験動物は植え付け手術中に全身麻酔下にあった。手術当日、実験動物は鎮静され、６ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｘ（登録商標）５０を筋肉内注射して麻酔が導入される。必要に応じて、実験動物は吸入用マスクを使用してイソフルランで麻酔することができる。
（１）麻酔、
すべての外科手術は無菌技術を使用して行われ、実験動物は植え付け手術中に全身麻酔下にあった。手術当日、実験動物は鎮静され、６ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｘ（登録商標）５０を筋肉内注射して麻酔が導入される。必要に応じて、実験動物は吸入用マスクを使用してイソフルランで麻酔することができる。
【0308】
麻酔の導入が成功した後、実験動物は口腔内視トラキアを通じて挿管され、呼吸アクセスを確立し、麻酔と酸素の混合物を連続吸入して麻酔を維持するために人工呼吸器デバイスに接続される。手術前に実験動物が嘔吐を止めるためにアトロピンを投与する必要があるかもしれません。これは、嘔吐物による窒息を防ぐためである。
【0309】
麻酔され、挿管された実験動物は、側臥位または仰臥位で手術台に置かれ、拘束バンドを使用して固定される。手術部位は準備され、消毒され、シートが敷かれる。動物の位置が変更された場合、手術部位は再度シートを敷き、準備する必要がある。
【0310】
末梢静脈のいずれかに静脈内針を挿入し、必要に応じてカテーテルを通じて薬物や補液を投与する。
【0311】
（２）６Ｆの血管シースを左または右の総頸動脈に挿入して血管アクセスを確立する。
【0312】
（３）ガイドワイヤーの指導の下、５Ｆカテーテルを血管アクセスを介して心臓の下行大動脈に導入し、腹部大動脈および腸骨動脈の血管造影を行った。血管造影後、ステント植え込み部位の選択を導くために定量的な動脈血管測定を行った。
【0313】
（４）腸骨動脈ステントの植え込み、造影カテーテルを引き抜き、ステント送達システムを準備し、負圧に達するまで送達システムのバルーン内の空気を排出し、その後、バルーンに造影剤とヘパリン化生理食塩水の混合物を吸入させる。ステント送達システムは０．０１４ガイドワイヤーによって誘導され、選択されたステント植え込み部位にステントを送達する。ステントが腸骨動脈血管植え込み部位に送達された後、バルーン拡張圧力ポンプがステントを加圧して開き、ステント植え込み情報を記録するために透視画像を保存する。バルーンは、ステント直径と移植部位の標的血管直径の比率が１．１０－１．２０、１の適切な圧力で拡張され、バラストステントがリリースされて３０秒間保持され、移植されたステントの壁への良好な接触が確保される。
【0314】
（５）一方の側にステントを移植した後、デリバリーバルーンは体内から引き抜かれ、移植されたステントを評価するために別の血管造影が行われた。他方の腸骨動脈のステント留置も同様に完了した。
【0315】
（６）腹部大動脈におけるステントの植え付け、腸骨動脈部位でのステントリリースが完了した後、同様にして腹部大動脈に２セットのステントが配置された。手術後、すべての器具と装置は実験動物から取り除かれた。
【0316】
（７）動物が目を覚ますのを待ち、実験が終了するまで通常通りに保ちます。
【0317】
植え付け中にＩＶでヘパリンナトリウム注射１５０Ｕ／ｋｇに加えて、抗血小板療法（アスピリンとクロピドグレル）を動物に手術の３日前から１日１回５ｍｇ／ｋｇずつ経口投与し、術後もエンドポイントまで５ｍｇ／ｋｇずつ経口投与した。
【0318】
組織病理学的分析
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を行い、組織病理学的分析のために保存される。
キャリア動脈のステントセグメントから収集された組織は、１０％中性ホルマリンで４８時間以上浸漬固定され、アルコールグラデーションで脱水され、キシレン透明化処理を行い、組織病理学的分析のために保存される。
【0319】
腸骨動脈の樹脂包埋されたステントセグメントは横断的に切断され、ＨＥ染色される。非ステントセグメントはパラフィン包埋され、近位端と遠位端でそれぞれ１枚ずつ切片が作成される。ＨＥ染色は組織病理学的評価のために行われる。
【0320】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
７Ｄ（７日）、１４Ｄ（１４日）、および２８Ｄ（２８日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植されたステント付き腸骨動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭで観察し、ＩＳＳステントの内皮化を確認する。
７Ｄ（７日）、１４Ｄ（１４日）、および２８Ｄ（２８日）で各１匹の動物をランダムに選択し、上記の時間点で移植されたステント付き腸骨動脈および腹部大動脈を収集してＳＥＭで観察し、ＩＳＳステントの内皮化を確認する。
【0321】
結果
実施例３でＣＦＤステントで既に得られた結果に基づいて、ＳＰ１０７２ペプチドコーティングされたバルーン拡張可能なステントは、バルーン拡張可能なベアメタルステントやＨＴスプリームステントよりも良好な内皮化と限られた新内膜形成が期待される。
実施例３でＣＦＤステントで既に得られた結果に基づいて、ＳＰ１０７２ペプチドコーティングされたバルーン拡張可能なステントは、バルーン拡張可能なベアメタルステントやＨＴスプリームステントよりも良好な内皮化と限られた新内膜形成が期待される。
【0322】
上記の説明から、本発明の利点は当業者に明らかである。
【0323】
Ｐ８ＲＩ配列が活性化細胞によって発現される切断されたＣＤ３１分子のクラスター化を維持できる一方で、本発明のペプチドの存在は、移植されたデバイスと接触できるすべての健康な内皮細胞および休息中の血小板および白血球上の完全なＣＤ３１分子の従事を可能にする。
【0324】
したがって、これらの細胞は、循環および血管新生組織の恒常性を維持するために不可欠なＣＤ３１のトランスホモフィリック結合によって伝達される「ｌｅａｖｅ－ｍｅ－ａｌｏｎｅ」シグナルを受け取ることができる。
【0325】
血栓性または生命を脅かす出血性または血栓塞栓性合併症の発生は、血管内デバイスの使用を妨げてきた。
【0326】
本発明の模倣ペプチドを有するデバイスは、血小板および白血球によって健康な内皮、すなわち「自己」成分として認識されるため、迅速に統合される。
【0327】
さらに、生理的な内皮細胞表現型で迅速に内皮化されるそれらの能力も、デバイス移植部位での血小板および白血球の活性化を長期的に制限する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【配列表】
【国際調査報告】