▶ ユナイテッド セラピューティクス コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-15
(54)【発明の名称】内皮細胞バリアを改善するための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241108BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N1/00 G
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534276
(86)(22)【出願日】2022-12-07
(85)【翻訳文提出日】2024-07-31
(86)【国際出願番号】 US2022052120
(87)【国際公開番号】W WO2023107553
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/287,254
(32)【優先日】2021-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/399,494
(32)【優先日】2022-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511266520
【氏名又は名称】ユナイテッド セラピューティクス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100153693
【弁理士】
【氏名又は名称】岩田 耕一
(72)【発明者】
【氏名】フィオレット，ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ピーターセン，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ボンヴィライン，ライアン
(72)【発明者】
【氏名】グラハム，デヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】ヴュ，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ゴア，ロッテ ヴァン デン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB11
4B065BB26
4B065BB28
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
本明細書では、内皮細胞の血管バリアの改善で使用するための方法および組成物が記載される。本方法は、バリアアゴニスト化合物および内皮細胞を培養するための改善された技術の使用を含み得る。内皮細胞を培養するための改善された方法および組成物は、以下のうちの少なくとも１つのまたは複数を含み得る：アデニリルシクラーゼ活性化剤、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体の内在化の活性化剤、密着結合タンパク質発現の直接的または間接的誘導因子、および接着結合タンパク質発現の直接的または間接的誘導因子。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む、内皮細胞を作製する方法。
【請求項2】
内皮細胞を細胞培養培地中で培養するステップをさらに含み、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップが、培養するステップの間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップが、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
血管バリアの強化が、血管漏出の低減によって判定される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記内皮細胞が肺（lung）内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
内皮細胞を用いて移植可能な肺を作製するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記内皮細胞が、ヒト肺動脈内皮細胞およびヒト肺微小血管内皮細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物が、内皮細胞間結合の発現の増大を促進する、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の生成の増大を促進する、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体の内在化を促進する、接着結合タンパク質の生成の増大を促進する、または密着結合タンパク質の生成の増大を促進する１つまたは複数の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物が、フォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
接触させるステップが、内皮細胞を約３０μＭから約５０μＭの濃度のフォルスコリンと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
接触させるステップが、内皮細胞を約４０μＭの濃度のフォルスコリンと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
接触させるステップが、内皮細胞を約５０ｎＭの濃度のフィンゴリモド－リン酸と接触させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
接触させるステップが、内皮細胞を約４０μＭの濃度のフォルスコリンおよび約５０ｎＭの濃度のフィンゴリモド－リン酸と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法であって、改善が、（ｉ）培養内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップ、および
（ｉｉ）内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を細胞培養培地中で維持するステップ
を含み、
前記血管バリアの強化が血管漏出の低減によって特徴付けされる、方法。
【請求項15】
前記少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物が、フォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
接触させるステップの後、フォルスコリンが約３０μＭから約５０μＭの濃度で細胞培養培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
接触させるステップの後、フォルスコリンが約４０μＭの濃度で細胞培養培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
接触させるステップの後、フォルスコリンが約４０μＭの濃度で細胞培養培地中に存在し、フィンゴリモド－リン酸が約５ｎＭから約５０ｎＭの範囲の濃度で細胞培養培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
接触させるステップの後、フォルスコリンが約４０μＭの濃度で細胞培養培地中に存在し、フィンゴリモド－リン酸が約５０ｎＭの濃度で細胞培養培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項20】
少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物を含む細胞培養培地であって、前記少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物がフォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸を含む、細胞培養培地。
【請求項21】
前記バリアアゴニスト化合物がメチルプレドニゾロンをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項22】
メチルプレドニゾロンをさらに含む、請求項２０に記載の細胞培養培地。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６３／２８７，２５４号および２０２２年８月１９日に出願された米国特許仮出願第６３／３９９，４９４号に対する優先権を主張し、これら出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６３／２８７，２５４号および２０２２年８月１９日に出願された米国特許仮出願第６３／３９９，４９４号に対する優先権を主張し、これら出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本願は全体として、細胞培養物に、さらに特には、限定はしないが、内皮細胞の血管バリアを改善するための方法および組成物、ならびにこのような方法から作製される細胞に関する。
【背景技術】
【0003】
本願は、培養中の内皮細胞の血管バリアを増強させるためのバリアアゴニスト化合物の使用に関する。
【0004】
肺組織の操作は、毎年肺疾患で死亡している４０万人を超えるアメリカ人への健康で移植可能な肺の供給の可能性を有する、有望ではあるが困難な分野である。組織を操作された移植可能な肺を生成するための１つの戦略は、開始スキャフォールドとしてブタの肺を使用する脱細胞化－再細胞化方法を介する。このような肺スキャフォールドの移植を成功させるための最大の困難の１つは、成熟した機能的な血管バリアを復元することである。成熟した血管バリアの重要な構成要素は、血流から下層の肺組織への体液および分子の移動の調節を助ける密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の内皮発現である。
【0005】
ブタ肺スキャフォールドの再細胞化された血管系からの漏出の予防は、依然として非常に困難である。再細胞化された肺スキャフォールドが機能試験（例えば、エクスビボでの肺の灌流）でうまくいかない１つの理由は、血管漏出に起因して気道に体液が流れることである。したがって、培養内皮細胞で細胞の血管漏出を低減させる方法および組成物に対する要求は、未だ解決されていない。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、血管バリアが増強した内皮細胞を作製するための方法および組成物を提供することによって、これまでに公知のアプローチの欠点に対処する。本開示の方法および組成物は、低減した血管漏出を特徴とする、血管バリアが増強した培養内皮細胞を作製するために使用することができる。また、本明細書では、血管バリアが増強した内皮細胞から肺組織を作製するための、改善された方法および組成物が提供される。
【0007】
内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含み得る。一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、培養の際に内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップをさらに含み得る。多くの実施形態では、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップは、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり行ってよい。一部の態様では、血管バリアの強化は、血管漏出の低減によって判定される。
【0008】
本開示の内皮細胞は、任意のヒトまたは非ヒト内皮細胞であり得る。本開示の内皮細胞は、肺内皮細胞であり得る。一部の実施形態では、内皮細胞は、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）からなる群から選択され得る。一部の態様では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を用いて移植可能な肺を作製するステップをさらに含む。
【0009】
本開示のバリアアゴニスト化合物には、内皮細胞間結合の発現の増大を促進する、環状アデノシン一リン酸の生成の増大を促進する、接着結合タンパク質（例えばＶＥ－カドヘリン）の生成の増大を促進する、または密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、オクルジン）の生成の増大を促進する、１つまたは複数の化合物が含まれ得る。一部の好ましい実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップであって、少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物がフォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸を含むステップを含み得る。一部の実施形態では、バリアアゴニスト化合物は、メチルプレドニゾロンをさらに含んでいてよい。内皮細胞を作製する方法の一部のこのような実施形態では、フォルスコリンは、約３０μＭから約５０μＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フォルスコリンは、約４０μＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、フィンゴリモド－リン酸は、約５ｎＭから約５０ｎＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は約５０ｎＭの濃度で存在し得る。
【0010】
本明細書では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製するための改善された方法が開示されている。一部の実施形態では、改善は、（ｉ）培養内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップ、および（ｉｉ）内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を細胞培養培地中で維持するステップであって、血管バリアの強化が血管漏出の低減によって特徴付けされるステップを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物には、フォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸が含まれ得る。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する改善された方法の一部のこのような実施形態では、フォルスコリンは、約３０μＭから約５０μＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フォルスコリンは、約４０μＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、フィンゴリモド－リン酸は、約５ｎＭから約５０ｎＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。このような改善された方法の一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は約５０ｎＭの濃度で存在し得る。
【0011】
本開示は、内皮細胞の作製に有用な細胞培養培地組成物を提供する。細胞培養培地組成物は、少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物を含み得る。一部の実施形態では、本開示の細胞培養培地組成物に含まれる少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物には、フォルスコリンおよびフィンゴリモド－リン酸が含まれ得る。一部の実施形態では、本開示の細胞培養培地組成物に含まれるバリアアゴニスト化合物には、フォルスコリン、フィンゴリモド－リン酸、およびメチルプレドニゾロンが含まれ得る。
【0012】
前述の概要、ならびに以下の図面の説明および詳細な説明は、共に、例示的かつ説明的なものである。これらは、本開示のさらなる詳細を提供するためのものであるが、限定するものとしては解釈されない。他の目的、利点、および新規な特徴は、本開示の以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａ～図１Ｂ： ＭＣＤＢ１３１培養培地（図１Ａ）およびＨＰＬＭ培養培地（図１Ｂ）での処理の１５時間、４８時間、および１２０時間後の培養ＨＰＡＥＣのインピーダンスの増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示す図である。
【図2】図２Ａ～図２Ｂ： ０μＭ、１０μＭ、または４０μＭのフォルスコリンを有するＭＣＤＢ１３１培養培地での処理の１５時間、４８時間、および１００時間後のＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（ＰＣ）から入手した培養ＨＭＶＥＣのインピーダンスの増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンの有効性を示す図である。（図２Ａ）様々な処理条件での、ＥＣＩＳによって測定された、正規化されたインピーダンス。（図２Ｂ）様々な処理条件で得られた生ＥＣＩＳトレース。
【図3】図３Ａ～図３Ｂ： ０μＭ、１０μＭ、または４０μＭのフォルスコリンを有するＭＣＤＢ１３１培養培地での処理の１５時間、４８時間、および１００時間後のＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＡ）から入手した培養ＨＭＶＥＣのインピーダンスの増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンの有効性を示す図である。（図３Ａ）様々な処理条件での、ＥＣＩＳによって測定された、正規化されたインピーダンス。（図３Ｂ）様々な処理条件で得られた生のＥＣＩＳトレース。
【図4】図４Ａ～図４Ｂ： ０μＭ、４０μＭ、または６０μＭのフォルスコリンを有するＭＣＤＢ１３１培養培地での処理後１５時間、４８時間、および１００時間の、ＡＴＣＣから入手した培養ＨＰＡＥＣのインピーダンスの増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンの有効性を示す図である。（図４Ａ）様々な処理条件での、ＥＣＩＳによって測定された、正規化されたインピーダンス。（図４Ｂ）様々な処理条件で得られた生のＥＣＩＳトレース。
【図5】０μＭまたは４０μＭのフォルスコリンおよび０ｎＭ、５ｎＭ、または５０ｎＭのＦＴＹ７２０Ｐを有するＭＣＤＢ１３１培養培地での処理の１５時間、４８時間、および１２０時間後の、培養ＨＰＡＥＣのインピーダンスの増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示す図である。
【図6】図６Ａ～図６Ｃ： フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストラン経内皮透過性アッセイを介して測定された、フォルスコリン（４０μＭ）およびＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）を有するＭＣＤＢ１３１培養培地での処理の１８時間後の、培養ＨＰＡＥＣの血管バリアの増強における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示す図である。
【図7】図７Ａ～図７Ｂ： フローサイトメトリーによって測定された、両化合物での処理後１８時間後の、培養ＨＰＡＥＣでの密着結合（ＴＪ）タンパク質および接着結合（ＡＪ）タンパク質の発現の増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示す図である。（図７Ａ）各々のアッセイされた結合タンパク質について陽性である細胞のパーセンテージ。（図７Ｂ）生トレース。
【図8】図８Ａ～図８Ｂ： 免疫蛍光によって測定された、両化合物での処理後２時間（図８Ａ）および１８時間（図８Ｂ）の、培養ＨＰＡＥＣの原形質膜での密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の増大における、バリアアゴニスト化合物であるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示す図である。
【図9】培養ＨＰＡＥＣの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大に対する、バリアアゴニスト化合物であるメチルプレドニゾロン（ＭＰ）とフォルスコリンおよびフィンゴリモドリン酸との組み合わせの相乗効果を示す図である。多重比較を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを行った。Ｎ＝３の個別の生物学的反復から＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本開示に従った実施形態を、以下でさらに完全に記載する。本開示の態様はしかし、異なる形態で実施されてもよく、本明細書で示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものとなるように、および本開示によって本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために、提供される。本明細書の記載で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定するためのものではない。
【0015】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語、例えば、一般に使用される辞書で定義されている用語は、本願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と合致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書でそのように明記されていない限り、理想化されたまたは過剰に形式的な意味では解釈されるべきではないことがさらに理解される。以下では明確に定義しないが、このような用語は、それらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。
【0016】
本明細書の記載で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、本発明を限定するためのものではない。本明細書で記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾する場合では、定義を含め、本明細書が優先される。他の態様は、以下に続く特許請求の範囲の中で示されている。
【0017】
本技術の実施は、別段の指示がない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、化学的操作、および細胞生物学の従来の技術を利用し、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。
【0018】
文脈により別段の指示がない限り、本明細書で記載される様々な特徴が任意の組み合わせで使用され得ることが、具体的に意図される。さらに、本開示ではまた、一部の実施形態で、本明細書で示されるあらゆる特徴または特徴の組み合わせが排除または省略され得ることも検討される。説明のために、複合体が構成成分Ａ、Ｂ、およびＣ（または、Ａ、Ｂ、および／もしくはＣ）を含むことが本明細書で記載されていれば、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはこれらの組み合わせが単独でまたは任意の組み合わせで省略および排除され得ることが、具体的に意図される。
【0019】
別段のことが明示されていない限り、全ての特定された実施形態、特徴、および用語は、記載された実施形態、特徴、または用語と、これらの生物学的同等物との両方を含むものである。
【0020】
範囲を含む、全ての数値による指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０もしくは０．１の増加量で、または代替的には＋／－１５％、または代替的には１０％、または代替的には５％、または代替的には２％の変動量で（＋）または（－）に変動し得る近似値である。常に明記はされていないが、全ての数値による指定は、「約」という用語が前にあることが理解される。
【0021】
定義
本発明および添付の特許請求の範囲の記載で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されていない限り、複数形も含むものである。
本発明および添付の特許請求の範囲の記載で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されていない限り、複数形も含むものである。
【0022】
「実質的に」および「約」という用語は、小さな変動を記載および説明するために本明細書で使用される。事象または状況と組み合わせて使用される場合、当該用語は、前記事象または状況が正確に生じる場合、および前記事象または状況が近似で生じる場合を指し得る。数値と組み合わせて使用される場合、当該用語は、前記数値の±１０％以下、例えば±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、または±０．０５％以下の変動範囲を指し得る。第１の数値を、第２の数値と「実質的に」または「約」等しいと記載する場合、当該用語は、第１の数値が第２の数値の±１０％以下、例えば±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、または±０．０５％以下の変動範囲内にあることを指し得る。「許容可能な」、「効果的な」、または「十分な」という用語は、本明細書で開示されている任意の構成成分、範囲、投与形態などの選択を記載するために使用される場合、前記構成成分、範囲、投与形態などが、開示されている目的のために適切であることを意味している。
【0023】
さらに、量、比率、および他の数値は、本明細書において範囲形式で表されることがある。このような範囲形式は利便性および簡便性のために使用されることが理解され、また、明示的に特定された数値を範囲の限界として含むだけではなく、その範囲に含まれる全ての個々の数値または部分範囲も各数値および部分範囲が明示的に特定されているかのように含むと、柔軟に理解されるべきである。例えば、約１から約２００の範囲の比率は、約１および約２００という明示的に記載された限界だけではなく、個々の比率、例えば約２、約３、および約４、ならびに部分範囲、例えば約１０から約５０、約２０から約１００なども含むと理解されるべきである。
【0024】
同様に本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された事項の１つまたは複数の、任意のおよび全ての考えられる組み合わせ、ならびに選択的に（「または」）解釈される場合には組み合わせの欠如を指し、包含する。
【0025】
本明細書で使用される場合、「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、および、記載が、事象または状況が生じる場合および生じない場合を含むことを意味する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「バリアアゴニスト化合物」という用語は、例えば血管漏出の低減によって決定される内皮細胞の血管バリアの増強が可能な任意の化合物を指す。バリアアゴニスト化合物は、１つまたは複数の重複しているまたは異なるメカニズムを介して、内皮細胞の血管バリアを増強させることができる。非限定的な例として、一般に、バリアアゴニストは、血流から下層の肺組織への体液および分子の移動の調節を助ける密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の内皮発現を増強させることができる。
【0027】
本明細書で使用される場合、「完全培地」という用語は、内皮細胞（例えば、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ））の血管バリアの増強に最適化された細胞培養培地を指す。一部の場合では、完全培地は、無機塩、微量元素、ビタミン、アミノ酸、脂質、炭水化物、サイトカイン、増殖因子、低分子、および／または追加のタンパク質を含み、ここで、構成成分の、互いに対する比率は、血管バリアの増強に最適化されている。一部の実施形態では、完全培地は、１×大血管内皮添加物（ＬＶＥＳ）を含む。一部の実施形態では、完全培地は、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパラン硫酸、塩基性ＦＧＦ、約２％のＦＢＳ、約２ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および約３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウムを含む。典型的な追加のタンパク質には、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、およびインスリンが含まれる。典型的な炭水化物には、グルコースが含まれる。典型的な無機塩には、ナトリウムイオン、カリウムイオン、およびカルシウムイオンが含まれる。典型的な微量元素には、亜鉛、銅、セレン、およびトリカルボン酸が含まれる。典型的なアミノ酸には、必須アミノ酸、例えばＬ－グルタミン（例えば、アラニル－ｌ－グルタミンもしくはグリシル－ｌ－グルタミン）、または非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、例えばグリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、および／もしくはＬ－セリンが含まれる。典型的な低分子には、フォルスコリン、フィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ）、およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）が含まれる。一部の実施形態では、完全培地はまた、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、フェノールレッド、抗生物質、および／またはβ－メルカプトエタノールのうちの１つまたは複数を含む。一部の場合では、完全培地は無血清培地である。一部の場合では、完全培地はゼノフリー培地である。
【0028】
本明細書で使用される場合、「内皮細胞」という用語は、内皮の任意の細胞を指す。通常、内皮細胞は細胞単層を形成しており、当該層は全ての血管の表面を覆い、血流と周辺組織との間の交換を調節する（Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al., Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. Garland Science; 2002）。内皮細胞は、あらゆる器官系の内皮細胞であり得る。例えば、内皮細胞は、肺（lung）内皮細胞または肺（pulmonary）内皮細胞であり得る。内皮細胞は、ヒト内皮細胞または非ヒト内皮細胞であり得る。内皮細胞は培養内皮細胞であり得る。内皮細胞は、当技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、器官組織から単離することができる。内皮細胞は、当技術分野で公知のあらゆる方法を使用して培養することができる。
【0029】
本明細書で使用される場合、「血管漏出」という用語は、血管バリアまたは血管膜を通過する体液の移動を指す。一部の実施形態では、血管漏出は、血管内部から下層組織への体液および分子の血管外漏出を指す。一部の実施形態では、血管漏出の増大は内皮細胞バリアの透過性の増大を反映し、血管漏出の減少は内皮細胞バリアの透過性の低下を反映する。
【0030】
内皮細胞バリアを改善するための組成物
内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、培養内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物が提供される。
内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、培養内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物が提供される。
【0031】
一部の態様では、内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物は、少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物を含む。一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアを増強させるための細胞培養培地組成物は、少なくとも２つの（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える）バリアアゴニスト化合物を含む。バリアアゴニスト化合物の非限定的な例としては、アデニリルシクラーゼ活性化剤、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体の内在化の活性化剤、シグナル伝達酵素Ｒａｃ１の直接的または間接的活性化剤、密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、およびオクルジン）発現の直接的または間接的誘導因子、ならびに接着結合タンパク質（例えばＶＥ－カドヘリン）発現の直接的または間接的誘導因子が含まれる。一部の場合では、細胞培養培地は、少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物を任意選択で添加した、ＦＢＳベースの培地である。一部の場合では、細胞培養培地は、１つまたは複数のバリアアゴニスト化合物を任意選択で添加した無血清培地である。一部の場合では、細胞培養培地は、１つまたは複数のバリアアゴニスト化合物を任意選択で添加した最小培地である。一部の場合では、細胞培養培地は、１つまたは複数のアミノ酸添加物（例えばＬ－グルタミン）および／または抗生物質をさらに含む。一部の場合では、細胞培養培地組成物は、内皮細胞、例えば、肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、またはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）などの血管バリアの増強のための以下で記載する方法と共に使用される。
【0032】
一部の実施形態では、内皮細胞は肺（lung）内皮細胞である。一部の実施形態では、内皮細胞は肺（pulmonary）内皮細胞である。一部の実施形態では、内皮細胞はヒト内皮細胞である。一部の実施形態では、内皮細胞は培養内皮細胞である。一部の実施形態では、内皮細胞は、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）またはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）である。
【0033】
細胞培養培地組成物の一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１μＭから約１００μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１０μＭから約６０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約３０μＭから約５０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。生成物の濃度について、アデニリルシクラーゼ活性化剤はさらに、約３０μＭ、３１μＭ、３２μＭ、３３μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３７μＭ、３８μＭ、３９μＭ、４０μＭ、４１μＭ、４２μＭ、４３μＭ、４４μＭ、４５μＭ、４６μＭ、４７μＭ、４８μＭ、４９μＭ、または５０μＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、約４０μＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、アデニリルシクラーゼの活性を増強させるかまたは環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の生成を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、タンパク質ＥｐａｃおよびＲａｐ１、ならびに／またはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化を誘導し、これによって、原形質膜に隣接するアクチン細胞骨格の再配置を誘導する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、接着結合タンパク質（例えばＶＥ－カドヘリン）の発現を増大させる。一部の場合では、１つまたは複数のアデニリルシクラーゼ活性化剤が、細胞培養培地組成物に含まれる。アデニリルシクラーゼの直接的および間接的活性化剤の非限定的な例としては、フォルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ１、ノルエピネフリン（ＮＥ）、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＩ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１－２７（ＰＡＣＡＰ１－２７）、ＰＡＣＡＰ１－３８、およびＮＫＨ４７７が含まれる。
【0034】
細胞培養培地組成物の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１ｎＭから約１００ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１０ｎＭから約７０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約４０ｎＭから約６０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。生成物の濃度について、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤はさらに、約４０ｎＭ、４１ｎＭ、４２ｎＭ、４３ｎＭ、４４ｎＭ、４５ｎＭ、４６ｎＭ、４７ｎＭ、４８ｎＭ、４９ｎＭ、５０ｎＭ、５１ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、５４ｎＭ、５５ｎＭ、５６ｎＭ、５７ｎＭ、５８ｎＭ、５９ｎＭ、または６０ｎＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、約５０ｎＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、Ｓ１Ｐ受容体の内在化を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、オクルジン）の発現を増大させる。一部の場合では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の１つまたは複数の活性化剤が、細胞培養培地組成物に含まれる。一部の態様では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、フィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ）またはＳ１Ｐであり得る。
【0035】
一部の実施形態では、細胞培養培地組成物は、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む細胞培養培地組成物は、約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、および約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む。一部の好ましい実施形態では、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む細胞培養培地組成物は、約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、および約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む。一部の好ましい実施形態では、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む細胞培養培地組成物は、約４０μＭの濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、および約５０ｎＭの濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤を含む。
【0036】
一部の実施形態では、細胞培養培地組成物は、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤、および少なくとも１つの追加のバリアアゴニスト化合物を含む。追加のバリアアゴニスト化合物は、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤のメカニズムと実質的に同一のまたは異なるメカニズムを介して作用し得る。例えば、追加のバリアアゴニスト化合物は、限定はしないが、内皮接着分子の発現を誘導する、および／または結合タンパク質の転写調節に影響を与える化合物であり得る。一部の実施形態では、細胞培養培地組成物は、約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤、および約０．５μＭから約５０μＭの範囲の濃度の少なくとも１つの追加のバリアアゴニスト化合物を含む。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地組成物は、約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤、および約０．５μＭから約２μＭの範囲の濃度の少なくとも１つの追加のバリアアゴニスト化合物を含む。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地組成物は、約４０μＭの濃度のアデニリルシクラーゼ活性化剤、および約５０ｎＭの濃度のＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤、および約１μＭの濃度の少なくとも１つの追加のバリアアゴニスト化合物を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地組成物は、フォルスコリンおよびＦＴＹ－７２０Ｐを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のバリアアゴニスト化合物は、メチルプレドニゾロンである。一部の実施形態では、細胞培養培地組成物は、フォルスコリン、ＦＴＹ－７２０Ｐ、およびメチルプレドニゾロンを含む。
【0037】
培養培地組成物の一部の実施形態では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、約１％から約１０％容積濃度（ｖ／ｖ）またはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲であり得る。ある特定の生成物濃度では、ウシ胎児血清は、約１．２５％、１．５％、１．７５％、２．０％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０．０％の容積濃度（ｖ／ｖ）で含まれていてよい。一部の場合では、ＦＢＳは、約２％の濃度で含まれる。
【0038】
培養培地組成物の一部の実施形態では、組成物は、アデニリルシクラーゼ活性化剤およびＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤などの１つまたは複数の追加の構成成分をさらに添加された基礎培地を含む。一部の場合では、基礎培地は、ＭＣＤＢ１３１（Ｇｉｂｃｏ（１０３７２０１９））培地である。一部の場合では、基礎培地は、ＨＰＬＭ（Ｇｉｂｃｏ（Ａ４８９９１０１））培地である。一部の実施形態では、基礎培地は、内皮細胞増殖培地２（ＥＧＭ２、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）である。一部の場合では、培養培地組成物は、Ｌ－グルタミン（例えばＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））を含む。一部の場合では、培地組成物は、約０．１μｇ／ｍＬから約１０，０００μｇ／ｍＬを含む。一部の場合では、培地組成物は、約０．１μｇ／ｍＬから約１０，０００μｇ／ｍＬを含む。一部の場合では、培地組成物は、約０．１μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、培地組成物は、約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの抗生物質を含む。抗生物質の非限定的な例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン、ゲンタマイシン、およびアムホテリシンＢが含まれる。
【0039】
一部の実施形態では、培地組成物は、ＭＣＤＢ１３１培地およびＨＰＬＭ培地から選択される基礎培地を含む。一部の場合では、培地組成物は、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパラン硫酸、塩基性ＦＧＦ、約２％のＦＢＳ、約２ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、フォルスコリン、およびＦＴＹ７２０Ｐをさらに含む。一部の場合では、培地組成物は、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパラン硫酸、塩基性ＦＧＦ、約２％のＦＢＳ、約２ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、フォルスコリン、ＦＴＹ７２０Ｐ、およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）をさらに含む。
【0040】
内皮細胞バリアを改善するための方法
本明細書では、ある特定の実施形態において、例えばＨＰＡＥＣおよびＨＭＶＥＣを含む内皮細胞の血管バリアを増強させるための方法が開示されている。
本明細書では、ある特定の実施形態において、例えばＨＰＡＥＣおよびＨＭＶＥＣを含む内皮細胞の血管バリアを増強させるための方法が開示されている。
【0041】
血管漏出を最小にするための１つの方法は、内皮細胞間結合タンパク質の発現の増大を介する。内皮細胞間結合タンパク質としては、限定はしないが、密着結合（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、オクルジン）タンパク質および接着結合（例えばＶＥ－カドヘリン）タンパク質が含まれる。従来の内皮培養方法、特に、再細胞化されたスキャフォールド内でのまたは再細胞化されたスキャフォールド上での内皮細胞培養方法は、内皮バリアを強化するように特異的には設計されていない微小血管内皮細胞培養培地ＭＣＤＢ１３１中での増殖を伴うものであった。これらの方法では、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を大血管内皮添加物（ＬＶＥＳ）と組み合わせることで、安定な血管バリアの形成よりも細胞増殖を優先させるように設計されたＭＣＤＢ完全培地が作製される（表１を参照されたい）。
【0042】
【表1】
【0043】
本明細書では、血管バリアの強化が細胞増殖よりも優先される、内皮細胞を作製するための方法が提供される。血管バリアの強化の優先は、細胞培養培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１またはＨＰＬＭ）にバリアアゴニスト化合物（例えば、フォルスコリン、フィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ）、および／またはメチルプレドニゾロン（ＭＰ））を添加することによって行うことができる。
【0044】
シグナル伝達酵素Ｒａｃ１は、血管バリア強化のプロセスにおける重要な媒介物として機能する。フォルスコリンによって誘導されるｃＡＭＰの増大は、Ｒａｃ１によって媒介される内皮バリアの密着化を引き起こす。フォルスコリンは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激して、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を生成させる。ｃＡＭＰは、２つの主要な下流のシグナル伝達経路を利用して、血管バリアを強化する。ｃＡＭＰはＥｐａｃ１に直接結合し、Ｅｐａｃ１は、Ｒａｐ１を介して作用して、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を刺激し、Ｒａｃ１を活性化させる。あるいは、ｃＡＭＰはＰＫＡを活性化させ得、ＰＫＡもまた、ＧＥＦを介するＲａｃ１の活性化をもたらす。Ｅｐａｃ１／Ｒａｐ１またはＰＫＡを介するＲａｃ１の活性化は、密着結合タンパク質および接着結合タンパク質（例えば、クローディン、オクルジン、ＶＥ－カドヘリンなど）の発現の増大を介して皮質のアクチン細胞骨格を強化することによって、血管バリアを増強させる（Schegel and Washke, Cell Tissue Res, 2014）。
【0045】
リン酸化され活性なＦＴＹ７２０代謝産物であるＦＴＹ７２０Ｐは、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体の内在化を誘導するが、当該受容体は、原形質膜から細胞質に移動し、一部にはクローディン－５の発現の増大によって、さらなる細胞骨格の再配置およびバリアの強化を引き起こす。さらに、Ｓ１Ｐ（およびＦＴＹ７２０Ｐ）もまた、Ｒａｃ１の活性化およびそれに続く血管バリアの密着化をもたらす。
【0046】
メチルプレドニゾロン（ＭＰ）は、合成の抗炎症性グルココルチコイドである。このグルココルチコイドの直接的な遺伝子標的としては、密着結合（オクルジン、クローディン－５）および接着結合（ＶＥ－カドヘリン）が含まれる。ＭＰはまた、体液の再吸収において役割を有する抗浮腫薬でもあり、細胞膜の水透過性を増大させるアクアポリン水チャネルの上方調節を誘導する。ＭＰは、細胞質内のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合することによって作用する。ＧＣ－ＧＲ複合体は核に移動し、ＧＣ－ＧＲ複合体は核内で、ＧＣ応答性エレメント（ＧＲＥ）を介して結合タンパク質の転写を刺激する。
【0047】
一部の実施形態では、本開示は、血管バリアが強化された内皮細胞を培養するための方法を提供する。一部の実施形態では、培養内皮細胞は肺（lung）内皮細胞である。一部の実施形態では、培養内皮細胞は肺（pulmonary）内皮細胞である。一部の実施形態では、培養内皮細胞はヒト内皮細胞である。一部の実施形態では、培養内皮細胞は、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）またはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）である。内皮細胞は、当技術分野で公知の方法によって培養することができる。内皮細胞は、二次元基質または三次元基質で培養することができる。
【0048】
ＨＰＡＥＣは、ヒト肺動脈内皮に由来する細胞である。これらは接着性であり、玉石のような外見をしている。ＨＰＡＥＣは、表面タンパク質マーカーである血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ／ＣＤ３１）および血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン／ＣＤ１４４）の発現を特徴とし得る。これら細胞はまた、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２／Ｆｌｋ－１／ＫＤＲ）、血管内皮増殖因子１（ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ－１）、および内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）も発現する。インビトロでのＨＰＡＥＣの機能的特性としては、アセチル化された低密度リポタンパク質（Ａｃ－ＬＤＬ）の取り込みおよび管腔の形成が含まれる。
【0049】
一部の実施形態では、本開示は、内皮細胞を作製するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、血管バリアが増強した内皮細胞を作製するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む、内皮細胞を作製するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、内皮細胞を少なくとも３つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む、内皮細胞を作製するための方法を提供する。一部の態様では、このような方法は、内皮細胞を細胞培養培地中で培養するステップを含み、ここで、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップが、培養するステップの間に行われる。一般に、内皮細胞が培養物中でコンフルエントになると、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させてよい。一部の実施形態では、内皮細胞が培養物中で約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％コンフルエントになると、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させてよい。
【0050】
一部の実施形態では、本開示は、内皮細胞を少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む、内皮細胞を作製するための方法を提供する。一部の態様では、このような方法は、内皮細胞を細胞培養培地中で培養するステップを含み、ここで、内皮細胞を少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップが、培養するステップの間に行われる。一般に、内皮細胞が培養物中でコンフルエントになると、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させてよい。一部の実施形態では、内皮細胞が培養物中で約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％コンフルエントになると、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させてよい。
【0051】
一部の実施形態では、バリアアゴニスト化合物は、内皮細胞を含む細胞培養培地に直接添加してよい。一部の態様では、内皮細胞を培養する細胞培養培地にバリアアゴニスト化合物を直接添加することによって、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させることができる。一部の場合では、内皮細胞を、バリアアゴニスト化合物を含む細胞培養培地と接触させることによって、内皮細胞をバリアアゴニスト化合物と接触させることができる。
【0052】
一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物と接触させてよい。一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間は、約１時間から約１０日間の範囲であり得る。一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１００時間、少なくとも１２０時間、または少なくとも１５０、またはそれを超える時間であり得る。一部の実施形態では、内皮細胞に、１サイクルまたは複数サイクルの培地交換を行ってよい。一部の実施形態では、内皮細胞に培地交換サイクルを全く行わなくてもよい。例えば、また例示のみを目的として、バリアアゴニスト化合物と１２０時間にわたり接触させた内皮細胞は、培地交換を行わずに、バリアアゴニスト化合物を含む同一の培養培地で１２０時間維持してもよい。例示のみを目的とした別の例として、バリアアゴニスト化合物と１２０時間にわたり接触させた内皮細胞に、１２０時間の接触期間の過程にわたり、１サイクル、２サイクル、３サイクル、またはそれを超えるサイクル数の培地交換を行ってもよく、ここで、各培地交換サイクルは、細胞から培養培地を取り出すステップ、および、バリアアゴニスト化合物を含む新たな培地を細胞に添加するステップを含む。
【0053】
一部の態様では、血管バリアの強化は、血管漏出の低減によって判定および／または特徴付けされる。一般に、血管漏出は、血管バリアを通過する、例えば血流から下層組織への、体液および分子の移動である。血管漏出は、本開示に従った任意の適用可能な技術によってアッセイすることができる。血管漏出を測定するためのまたは血管バリアの密着化を定量するための技術の非限定的な例としては、電気的細胞－基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストラン経内皮透過性アッセイが含まれる。
【0054】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で記載される方法に従って作製された内皮細胞を用いて移植可能な器官を作製するための方法を提供する。移植可能な器官の非限定的な例としては、肺、心臓、腎臓、および肝臓が含まれる。一部の実施形態では、移植可能な器官は、移植可能な肺である。
【0055】
本開示に従ったあらゆるタイプの内皮細胞を使用することができる。内皮細胞の非限定的な例としては、ヒト肺静脈内皮細胞（ＨＰＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肝臓類洞内皮細胞（ＨＬＳＥＣ）、ヒト糸球体内皮細胞（ＨＧＥＣ）、およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が含まれる。一部の実施形態では、内皮細胞は、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）からなる群から選択される。
【0056】
内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１μＭから約１００μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の態様では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１０μＭから約６０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約３０μＭから約５０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤はさらに、約３０μＭ、３１μＭ、３２μＭ、３３μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３７μＭ、３８μＭ、３９μＭ、４０μＭ、４１μＭ、４２μＭ、４３μＭ、４４μＭ、４５μＭ、４６μＭ、４７μＭ、４８μＭ、４９μＭ、または５０μＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、約４０μＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、アデニリルシクラーゼの活性を増強させるかまたは環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の生成を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、タンパク質ＥｐａｃおよびＲａｐ１の活性化を誘導し、これによって、皮質のアクチン細胞骨格の再配置を誘導する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、ＶＥ－カドヘリンなどの接着結合タンパク質の発現を増大させる。一部の場合では、１つまたは複数のアデニリルシクラーゼ活性化剤が、内皮細胞を作製する方法で使用される細胞培養培地組成物に含まれる。アデニリルシクラーゼの直接的および間接的活性化剤の非限定的な例としては、フォルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ１、ノルエピネフリン（ＮＥ）、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＩ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１－２７（ＰＡＣＡＰ１－２７）、ＰＡＣＡＰ１－３８、およびＮＫＨ４７７が含まれる。
【0057】
内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１ｎＭから約１００ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の態様では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１０ｎＭから約７０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約４０ｎＭから約６０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、約４０ｎＭ、４１ｎＭ、４２ｎＭ、４３ｎＭ、４４ｎＭ、４５ｎＭ、４６ｎＭ、４７ｎＭ、４８ｎＭ、４９ｎＭ、５０ｎＭ、５１ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、５４ｎＭ、５５ｎＭ、５６ｎＭ、５７ｎＭ、５８ｎＭ、５９ｎＭ、または６０ｎＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、約５０ｎＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、Ｓ１Ｐ受容体の内在化を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、および／またはオクルジン）の発現を増大させる。一部の場合では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の１つまたは複数の活性化剤が、内皮細胞を作製する方法で使用される細胞培養培地組成物に含まれる。一部の態様では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、フィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ）またはＳ１Ｐであり得る。
【0058】
内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）は、モル濃度で約０．１μＭから約５０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で培養培地中に存在し得る。一部の態様では、メチルプレドニゾロンは、モル濃度で約０．５μＭから約１０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の態様では、メチルプレドニゾロンは、モル濃度で約０．５μＭから約２μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、または約２μＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約１μＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、例えば接着分子の発現を誘導することによって、血管バリアの完全性を増大させる。
【0059】
一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。一部のこのような実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約４０μＭの濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約５０ｎＭの濃度で存在する。
【0060】
一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも３つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。一部のこのような実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約４０μＭの濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約５０ｎＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、内皮細胞を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも３つの（すなわち、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える）バリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含み得、ここで、少なくとも３つのバリアアゴニスト化合物には、フォルスコリン、フィンゴリモド－リン酸、およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）が含まれる。内皮細胞を作製する方法の一部のこのような実施形態では、フォルスコリンは、約３０μＭから約５０μＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フォルスコリンは、約４０μＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、フィンゴリモド－リン酸は、約５ｎＭから約５０ｎＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約０．５μＭから約２μＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約１μＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は約５０ｎＭの濃度で存在し得、そしてメチルプレドニゾロンは約１μＭの濃度で存在し得る。
【0061】
本開示は、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法に対する改善を提供する。一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法に対する改善は、（ｉ）培養内皮細胞を少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップ、および（ｉｉ）内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を細胞培養培地中で維持するステップであって、血管バリアの強化が血管漏出の低減によって特徴付けされるステップを含む。一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法に対する改善は、（ｉ）培養内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップ、および（ｉｉ）内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を細胞培養培地中で維持するステップであって、血管バリアの強化が血管漏出の低減によって特徴付けされるステップを含む。
【0062】
細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１μＭから約１００μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の態様では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約１０μＭから約６０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部のこのような実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、モル濃度で約３０μＭから約５０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤はさらに、約３０μＭ、３１μＭ、３２μＭ、３３μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３７μＭ、３８μＭ、３９μＭ、４０μＭ、４１μＭ、４２μＭ、４３μＭ、４４μＭ、４５μＭ、４６μＭ、４７μＭ、４８μＭ、４９μＭ、または５０μＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、約４０μＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、アデニリルシクラーゼの活性を増強させるかまたは環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の生成を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、タンパク質ＥｐａｃおよびＲａｐ１、ならびに／またはＰＫＡの活性化を誘導し、これによって、原形質膜に隣接するアクチン細胞骨格の再配置を誘導する。一部の実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、接着結合タンパク質（例えばＶＥ－カドヘリン）の発現を増大させる。一部の場合では、１つまたは複数のアデニリルシクラーゼ活性化剤が、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法で使用される細胞培養培地組成物に含まれる。アデニリルシクラーゼの直接的および間接的活性化剤の非限定的な例としては、フォルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ１、ノルエピネフリン（ＮＥ）、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＩ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１－２７（ＰＡＣＡＰ１－２７）、ＰＡＣＡＰ１－３８、およびＮＫＨ４７７が含まれる。
【0063】
細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１ｎＭから約１００ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部のこのような実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約１０ｎＭから約７０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、モル濃度で約４０ｎＭから約６０ｎＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、約４０ｎＭ、４１ｎＭ、４２ｎＭ、４３ｎＭ、４４ｎＭ、４５ｎＭ、４６ｎＭ、４７ｎＭ、４８ｎＭ、４９ｎＭ、５０ｎＭ、５１ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、５４ｎＭ、５５ｎＭ、５６ｎＭ、５７ｎＭ、５８ｎＭ、５９ｎＭ、または６０ｎＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、約５０ｎＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、Ｓ１Ｐ受容体の内在化を増大させる任意の活性化剤を包含する。一部の実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ－１、ＪＡＭ－Ａ、クローディン－５、および／またはオクルジン）の発現を増大させる。一部の場合では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の１つまたは複数の活性化剤は、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法で使用される細胞培養培地組成物に含まれる。一部の態様では、Ｓ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は、フィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ）またはＳ１Ｐであり得る。
【0064】
細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）は、モル濃度で約０．１μＭから約５０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で培養培地中に存在し得る。一部の態様では、メチルプレドニゾロンは、モル濃度で約０．５μＭから約１０μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。一部の態様では、メチルプレドニゾロンは、モル濃度で約０．５μＭから約２μＭまたはこれらの間にある任意の値もしくは部分範囲の濃度で存在し得る。内皮細胞を作製する方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、または約２μＭのモル濃度で含まれていてもよい。一部の好ましい実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約１μＭのモル濃度で含まれる。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、例えば接着分子の発現を誘導することによって、血管バリアの完全性を増大させる。
【0065】
一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも２つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。一部のこのような実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約４０μＭの濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約５０ｎＭの濃度で存在する。
【0066】
一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも３つのバリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。一部のこのような実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約１μＭから約１００μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約１ｎＭから約１００ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約３０μＭから約５０μＭの範囲の濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約４０ｎＭから約６０ｎＭの範囲の濃度で存在する。一部の好ましい実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤および少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤と接触させるステップを含み、ここで、少なくとも１つのアデニリルシクラーゼ活性化剤は約４０μＭの濃度で存在し、少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の内在化の活性化剤は約５０ｎＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法は、内皮細胞を少なくとも３つの（すなわち、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える）バリアアゴニスト化合物と接触させるステップを含み得、ここで、少なくとも３つのバリアアゴニスト化合物としては、フォルスコリン、フィンゴリモド－リン酸、およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）が含まれる。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部のこのような実施形態では、フォルスコリンは、約３０μＭから約５０μＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フォルスコリンは、約４０μＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、フィンゴリモド－リン酸は、約５ｎＭから約５０ｎＭの濃度で存在し得る。好ましくは、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は、約５０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約０．５μＭから約２μＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、メチルプレドニゾロンは、約１μＭの濃度で存在し得る。一部の好ましい実施形態では、フォルスコリンは約４０μＭの濃度で存在し得、フィンゴリモド－リン酸は約５０ｎＭの濃度で存在し得、そしてメチルプレドニゾロンは約１μＭの濃度で存在し得る。
【0067】
細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間にわたり、内皮細胞を少なくとも１つのバリアアゴニスト化合物とさせてよい。細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法の一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間は、約１時間から約１０日間の範囲であり得る。一部の実施形態では、内皮細胞の血管バリアの強化を可能にするために十分な期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１００時間、少なくとも１２０時間、または少なくとも１５０時間、またはそれを超える時間であり得る。一部のこのような実施形態では、内皮細胞に、１サイクルまたは複数サイクルの培地交換を行ってよい。一部の実施形態では、内皮細胞に培地交換サイクルを全く行わなくてもよい。例えば、また例示のみを目的として、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法では、バリアアゴニスト化合物と１２０時間にわたり接触させた内皮細胞は、培地交換を行わずに、バリアアゴニスト化合物を含む同一の培養培地で１２０時間維持してもよい。例示のみを目的とした別の例として、細胞培養培地中の培養内皮細胞から肺組織を作製する方法では、バリアアゴニスト化合物と１２０時間にわたり接触させた内皮細胞に、１２０時間の接触期間の過程にわたり、１サイクル、２サイクル、３サイクル、またはそれを超えるサイクル数の培地交換を行ってよく、ここで、各培地交換サイクルは、細胞から培養培地を取り出すステップ、および、バリアアゴニスト化合物を含む新たな培地を細胞に添加するステップを含む。
【実施例】
【0068】
これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するためではない。
【0069】
[実施例１]
内皮細胞バリア強化化合物は、複数の異なる培養培地で機能的である
培養培地
バリアアゴニスト化合物が複数のタイプの細胞培養培地で血管バリア強化効果を発揮し得るかどうかを判定するために、異なる細胞培養培地を試験した。一アッセイでは、以下の２つの個別の細胞培養培地を試験した：１）ＭＣＤＢ１３１完全培地：１×大血管内皮添加物（ＬＶＥＳ）を添加したＭＣＤＢ１３１基礎培地、および２）ＨＰＬＭ完全培地：１×ＬＶＥＳを添加したヒト血漿様培地（ＨＰＬＭ）。各完全培地の構成成分を表１に示す。
内皮細胞バリア強化化合物は、複数の異なる培養培地で機能的である
培養培地
バリアアゴニスト化合物が複数のタイプの細胞培養培地で血管バリア強化効果を発揮し得るかどうかを判定するために、異なる細胞培養培地を試験した。一アッセイでは、以下の２つの個別の細胞培養培地を試験した：１）ＭＣＤＢ１３１完全培地：１×大血管内皮添加物（ＬＶＥＳ）を添加したＭＣＤＢ１３１基礎培地、および２）ＨＰＬＭ完全培地：１×ＬＶＥＳを添加したヒト血漿様培地（ＨＰＬＭ）。各完全培地の構成成分を表１に示す。
【0070】
プロトコル
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地またはＨＰＬＭ完全培地のいずれか（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）で培養した。細胞の凍結バイアルを、３７℃の水浴を使用して解凍した。細胞を２，０００～５，０００細胞／ｃｍ２の間の細胞密度でＴ７５フラスコに播種し、完全培地（すなわち、ＭＣＤＢ１３１完全培地またはＨＰＬＭ完全培地）で培養した。細胞を、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２のインキュベーターで維持した。細胞の増殖をモニタリングし、培地を４８時間ごと（すなわち、培養の３日目、５日目、７日目など）に交換した。
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地またはＨＰＬＭ完全培地のいずれか（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）で培養した。細胞の凍結バイアルを、３７℃の水浴を使用して解凍した。細胞を２，０００～５，０００細胞／ｃｍ２の間の細胞密度でＴ７５フラスコに播種し、完全培地（すなわち、ＭＣＤＢ１３１完全培地またはＨＰＬＭ完全培地）で培養した。細胞を、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２のインキュベーターで維持した。細胞の増殖をモニタリングし、培地を４８時間ごと（すなわち、培養の３日目、５日目、７日目など）に交換した。
【0071】
コンフルエントになったら、細胞をバリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに処理し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォーム（電気的細胞－基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ））システムを使用して、バリア機能の変化についてアッセイした。簡潔に述べると、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅのサポートのある９６ウェルプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ－Ｐｌａｔｅ９６ＰＥＴ、カタログ番号００３００６００９１０）を製造者のプロトコルに従って準備し、その後、プレートに約６，６００細胞／ウェル（約２０，０００細胞／ｍＬに対応する）を播種した。ＥＣＩＳの測定値を所望の時点で得た。実験期間にわたり、培地を毎日交換した。
【0072】
バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日後の、電気的細胞－基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）の結果。インピーダンス値が高いほど、内皮バリアが密着していることを示している。全ての結果を、処理前のインピーダンスレベルに対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー多重比較ポストホック検定を使用して、統計分析を行った。
【0073】
結果
図１Ａおよび図１Ｂにおいてグラフで示されているように、試験したバリアアゴニスト化合物は、試験した全ての時点で、ＭＣＤＢ１３１完全培地（図１Ａ）およびＨＰＬＭ完全培地（図１Ａ）で培養されたＨＰＡＥＣのインピーダンスの増強において有効であった。これらのデータは、バリアアゴニスト化合物が複数の異なるタイプの細胞培養培地と適合し、これら培地で有効であることを示唆している。
図１Ａおよび図１Ｂにおいてグラフで示されているように、試験したバリアアゴニスト化合物は、試験した全ての時点で、ＭＣＤＢ１３１完全培地（図１Ａ）およびＨＰＬＭ完全培地（図１Ａ）で培養されたＨＰＡＥＣのインピーダンスの増強において有効であった。これらのデータは、バリアアゴニスト化合物が複数の異なるタイプの細胞培養培地と適合し、これら培地で有効であることを示唆している。
【0074】
[実施例２]
培養内皮細胞の血管バリアの強化のためのフォルスコリン濃度の最適化
観察される内皮細胞バリア密着化効果を最大にするフォルスコリン濃度を決定するために、複数の濃度のフォルスコリンを３つの個別の実験で試験した。
培養内皮細胞の血管バリアの強化のためのフォルスコリン濃度の最適化
観察される内皮細胞バリア密着化効果を最大にするフォルスコリン濃度を決定するために、複数の濃度のフォルスコリンを３つの個別の実験で試験した。
【0075】
実験１
ヒト微小血管内皮細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ＰＣから入手したＨＭＶＥＣ）を、実施例１で記載されているように、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（１０μＭもしくは４０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間、４８時間、および５日（１００時間）に得た。
ヒト微小血管内皮細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ＰＣから入手したＨＭＶＥＣ）を、実施例１で記載されているように、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（１０μＭもしくは４０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間、４８時間、および５日（１００時間）に得た。
【0076】
【0077】
実験２
ヒト微小血管内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＡから入手したＨＭＶＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（１０μＭもしくは４０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１００時間）後に得た。
ヒト微小血管内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＡから入手したＨＭＶＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（１０μＭもしくは４０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１００時間）後に得た。
【0078】
結果
図３Ａおよび図３Ｂにおいてグラフで示されているように、４０μＭのフォルスコリンは、１０μＭのフォルスコリンまたは未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、本実施例の実験１および実施例１の結果に照らして、フォルスコリンが複数の異なるタイプの内皮細胞において血管バリア強化効果を発揮することを示している。
図３Ａおよび図３Ｂにおいてグラフで示されているように、４０μＭのフォルスコリンは、１０μＭのフォルスコリンまたは未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、本実施例の実験１および実施例１の結果に照らして、フォルスコリンが複数の異なるタイプの内皮細胞において血管バリア強化効果を発揮することを示している。
【0079】
実験３
ヒト肺動脈内皮細胞（ＡＴＣＣから入手したＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（４０μＭもしくは６０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１００時間）後に得た。
ヒト肺動脈内皮細胞（ＡＴＣＣから入手したＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（４０μＭもしくは６０μＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１００時間）後に得た。
【0080】
結果
図４Ａおよび図４Ｂにおいてグラフで示されているように、４０μＭのフォルスコリンは、６０μＭのフォルスコリンまたは未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、フォルスコリンが複数の異なるタイプの内皮細胞において血管バリア強化効果を発揮すること、およびフォルスコリンが有限範囲内の濃度で存在している場合にその血管バリア強化効果が最適に生じることを示している。
図４Ａおよび図４Ｂにおいてグラフで示されているように、４０μＭのフォルスコリンは、６０μＭのフォルスコリンまたは未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、フォルスコリンが複数の異なるタイプの内皮細胞において血管バリア強化効果を発揮すること、およびフォルスコリンが有限範囲内の濃度で存在している場合にその血管バリア強化効果が最適に生じることを示している。
【0081】
[実施例３]
培養内皮細胞の血管バリアの強化のためのＦＴＹ７２０Ｐ濃度の最適化
観察される内皮細胞バリア密着化効果を最大にするＦＴＹ７２０Ｐ濃度を決定するために、複数のＦＴＹ７２０Ｐ濃度を試験した。
培養内皮細胞の血管バリアの強化のためのＦＴＹ７２０Ｐ濃度の最適化
観察される内皮細胞バリア密着化効果を最大にするＦＴＹ７２０Ｐ濃度を決定するために、複数のＦＴＹ７２０Ｐ濃度を試験した。
【0082】
実験１
ヒト肺動脈内皮細胞（ＡＴＣＣから入手したＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（４０μＭ）、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５ｎＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１２０時間）後に得た。
ヒト肺動脈内皮細胞（ＡＴＣＣから入手したＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をフォルスコリン（４０μＭ）、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５ｎＭ）で処理したか、または処理しなかった（コントロール）。ＥＣＩＳの結果を、バリアアゴニスト処理の１５時間後、４８時間後、および５日（１２０時間）後に得た。
【0083】
結果
図５においてグラフで示されているように、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）は、フォルスコリン（４０μＭ）単独、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５ｎＭ）、および未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）がフォルスコリンと組み合わされると内皮細胞の血管バリア強化を増強させ得ること、およびこの効果が濃度依存性であることを示している。
図５においてグラフで示されているように、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）は、フォルスコリン（４０μＭ）単独、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５ｎＭ）、および未処理コントロールよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した。これらのデータは、ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）がフォルスコリンと組み合わされると内皮細胞の血管バリア強化を増強させ得ること、およびこの効果が濃度依存性であることを示している。
【0084】
実験２
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまで、半透性のコラーゲン処理膜上のＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をバリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに１８時間処理し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストラン経内皮透過性アッセイを使用して、バリア機能の変化についてアッセイした。バリアアゴニスト化合物（上記のような）を伴うまたは伴わないＭＣＤＢ１３１での培養ＨＰＡＥＣの一晩（１８時間）のインキュベーションの後、細胞を、ＦＩＴＣ－デキストラン中で２０、４０、または１２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、下層の培地中のＦＩＴＣ－デキストランのレベル（すなわち、内皮細胞単層および下層の半透膜を通過したＦＩＴＣ－デキストランのレベル）を、４８５ｎｍの励起フィルターおよび５３５ｎｍの発光フィルターを有する蛍光プレートリーダーを使用して定量した。
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまで、半透性のコラーゲン処理膜上のＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した。コンフルエントになったら、細胞をバリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに１８時間処理し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストラン経内皮透過性アッセイを使用して、バリア機能の変化についてアッセイした。バリアアゴニスト化合物（上記のような）を伴うまたは伴わないＭＣＤＢ１３１での培養ＨＰＡＥＣの一晩（１８時間）のインキュベーションの後、細胞を、ＦＩＴＣ－デキストラン中で２０、４０、または１２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、下層の培地中のＦＩＴＣ－デキストランのレベル（すなわち、内皮細胞単層および下層の半透膜を通過したＦＩＴＣ－デキストランのレベル）を、４８５ｎｍの励起フィルターおよび５３５ｎｍの発光フィルターを有する蛍光プレートリーダーを使用して定量した。
【0085】
結果
図６Ａ～図６Ｃにおいてグラフで示されているように、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）は、ＦＩＴＣ－デキストランとのインキュベーションの２０分後（図６Ａ）、４０分後（図６Ｂ）、および１２０分後（図６Ｃ）に測定すると、未処理コントロールで見られたものよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した（内皮細胞単層を下層の培地まで通過するＦＩＴＣ－デキストランの量の減少によって測定される）。各プロットの小さなドットは、試験した個々のウェルを示す。統計分析は、対応のないｔ検定を使用して行った。これらのデータは、上記の実施例３の実験１でのＥＣＩＳベースの所見に対する直交的裏付けを提供している。
図６Ａ～図６Ｃにおいてグラフで示されているように、フォルスコリン（４０μＭ）＋ＦＴＹ７２０Ｐ（５０ｎＭ）は、ＦＩＴＣ－デキストランとのインキュベーションの２０分後（図６Ａ）、４０分後（図６Ｂ）、および１２０分後（図６Ｃ）に測定すると、未処理コントロールで見られたものよりも血管バリア強度の増強を大きく誘導した（内皮細胞単層を下層の培地まで通過するＦＩＴＣ－デキストランの量の減少によって測定される）。各プロットの小さなドットは、試験した個々のウェルを示す。統計分析は、対応のないｔ検定を使用して行った。これらのデータは、上記の実施例３の実験１でのＥＣＩＳベースの所見に対する直交的裏付けを提供している。
【0086】
[実施例４]
フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐは、ＨＰＡＥＣの細胞間結合での密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現を増大させる
本実施例は、培養内皮細胞内での密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の増強におけるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示している。
フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐは、ＨＰＡＥＣの細胞間結合での密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現を増大させる
本実施例は、培養内皮細胞内での密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の増強におけるフォルスコリンおよびＦＴＹ７２０Ｐの有効性を示している。
【0087】
プロトコル
フローサイトメトリーによる評価
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）。コンフルエントになったら、細胞を、バリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに１８時間処理した。処理後、結合タンパク質を保護するために、ＨＰＡＥＣを透過処理せずに固定し、示されている通りに染色した。フローサイトメトリー分析を行って、密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の差を定量した。
フローサイトメトリーによる評価
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）。コンフルエントになったら、細胞を、バリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに１８時間処理した。処理後、結合タンパク質を保護するために、ＨＰＡＥＣを透過処理せずに固定し、示されている通りに染色した。フローサイトメトリー分析を行って、密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の差を定量した。
【0088】
免疫蛍光染色による評価
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）。コンフルエントになったら、細胞を、バリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに２時間または１８時間処理し、バリア機能の変化についてアッセイした。密着結合マーカーおよび接着結合マーカー（ＨＰＡＥＣ上で発現される）の免疫蛍光染色を、免疫蛍光に適した抗体を使用して行った。
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を、コンフルエントになるまでＭＣＤＢ１３１完全培地で培養した（ここで、完全培地は、表１で定義されているように１×ＬＶＥＳを含有している）。コンフルエントになったら、細胞を、バリアアゴニスト（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））を伴ってまたは伴わずに２時間または１８時間処理し、バリア機能の変化についてアッセイした。密着結合マーカーおよび接着結合マーカー（ＨＰＡＥＣ上で発現される）の免疫蛍光染色を、免疫蛍光に適した抗体を使用して行った。
【0089】
結果
図７Ａおよび図７Ｂにおいてグラフで示されているように、試験したバリアアゴニスト化合物は、フローサイトメトリーによって測定すると、培養ＨＰＡＥＣでの密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の増大において有効であった。処理とコントロールとの間で同じゲーティングを使用する、個々の結合マーカーについて陽性の細胞の定量を、図７Ａにまとめる。生データを図７Ｂにまとめる。曲線の右側または上側へのシフトは、より多くの結合タンパク質の存在を示す。
図７Ａおよび図７Ｂにおいてグラフで示されているように、試験したバリアアゴニスト化合物は、フローサイトメトリーによって測定すると、培養ＨＰＡＥＣでの密着結合タンパク質および接着結合タンパク質の発現の増大において有効であった。処理とコントロールとの間で同じゲーティングを使用する、個々の結合マーカーについて陽性の細胞の定量を、図７Ａにまとめる。生データを図７Ｂにまとめる。曲線の右側または上側へのシフトは、より多くの結合タンパク質の存在を示す。
【0090】
図８Ａおよび図８Ｂで示されているように、試験したバリアアゴニスト化合物（４０μＭのフォルスコリンおよび５０ｎＭのフィンゴリモド－リン酸（ＦＴＹ７２０Ｐ））は、バリアアゴニスト化合物での処理の２時間後（図８Ａ）および１８時間後（図８Ｂ）の免疫蛍光によって測定すると、培養ＨＰＡＥＣの原形質膜での密着結合（ＺＯ－１、クローディン－５、およびＪＡＭ－Ａ）タンパク質ならびに接着結合（ＶＥ－カドヘリン）タンパク質の発現の増大において有効であった。
【0091】
[実施例５]
フォルスコリン、ＦＴＹ７２０Ｐ、およびメチルプレドニゾロンは、培養ＨＰＡＥＣの経上皮電気抵抗を相乗的に増大させる
本実施例は、ＡＴＣＣから入手した培養ＨＰＡＥＣの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を増大させるための、バリアアゴニスト化合物であるメチルプレドニゾロン（ＭＰ）をフォルスコリンおよびフィンゴリモドリン酸と組み合わせることの相乗効果を示している。
フォルスコリン、ＦＴＹ７２０Ｐ、およびメチルプレドニゾロンは、培養ＨＰＡＥＣの経上皮電気抵抗を相乗的に増大させる
本実施例は、ＡＴＣＣから入手した培養ＨＰＡＥＣの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を増大させるための、バリアアゴニスト化合物であるメチルプレドニゾロン（ＭＰ）をフォルスコリンおよびフィンゴリモドリン酸と組み合わせることの相乗効果を示している。
【0092】
ＴＥＥＲの評価
バリアアゴニスト処理を２日目（４８時間）に開始し、残りの培養を通して維持した。ＥＶＯＭ（商標）Ｍａｎｕａｌ ＴＥＥＲ測定器（ＥＶＯＭ ３ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、上皮のボルト／オームメーター）を製造者のプロトコルに従って（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＥＶＯＭ（商標）Ｍａｎｕａｌ ＴＥＥＲ測定器：クイックスタートガイド、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）使用して、細胞をＴＥＥＲの分析にかけた。ＴＥＥＲの測定値は、ＭＣＤＢ１３１培養培地でのバリアアゴニスト処理の２４時間後、４８時間後、および１２０時間後に得た。バリアアゴニスト化合物は、培養物に投与される際、以下の濃度で提供された：フォルスコリン（４０μＭ）、ＦＴＹ７２０－Ｐ（５０ｎＭ）、メチルプレドニゾロン（１μＭ）。
バリアアゴニスト処理を２日目（４８時間）に開始し、残りの培養を通して維持した。ＥＶＯＭ（商標）Ｍａｎｕａｌ ＴＥＥＲ測定器（ＥＶＯＭ ３ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、上皮のボルト／オームメーター）を製造者のプロトコルに従って（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＥＶＯＭ（商標）Ｍａｎｕａｌ ＴＥＥＲ測定器：クイックスタートガイド、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）使用して、細胞をＴＥＥＲの分析にかけた。ＴＥＥＲの測定値は、ＭＣＤＢ１３１培養培地でのバリアアゴニスト処理の２４時間後、４８時間後、および１２０時間後に得た。バリアアゴニスト化合物は、培養物に投与される際、以下の濃度で提供された：フォルスコリン（４０μＭ）、ＦＴＹ７２０－Ｐ（５０ｎＭ）、メチルプレドニゾロン（１μＭ）。
【0093】
結果
図９で示されているように、メチルプレドニゾロン処理は、いかなるバリアアゴニスト化合物も伴わずに培養された細胞と比較して、培養細胞のＴＥＥＲを有意に増大させた。メチルプレドニゾロン単独は、フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０－Ｐでの処理の後に見られた程度よりも大きくＴＥＥＲを増大させることはなかったが、メチルプレドニゾロン、フォルスコリン、およびＦＴＹ７２０－Ｐの組み合わせは、フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０－Ｐでの処理の後の程度よりも大きく、ＴＥＥＲの相乗的な増大をもたらした。
図９で示されているように、メチルプレドニゾロン処理は、いかなるバリアアゴニスト化合物も伴わずに培養された細胞と比較して、培養細胞のＴＥＥＲを有意に増大させた。メチルプレドニゾロン単独は、フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０－Ｐでの処理の後に見られた程度よりも大きくＴＥＥＲを増大させることはなかったが、メチルプレドニゾロン、フォルスコリン、およびＦＴＹ７２０－Ｐの組み合わせは、フォルスコリンおよびＦＴＹ７２０－Ｐでの処理の後の程度よりも大きく、ＴＥＥＲの相乗的な増大をもたらした。
【0094】
[実施例６]
バリアアゴニスト化合物はＨＰＡＥＣの増殖を調節する
本実施例は、細胞がフォルスコリン（４０μＭ）の存在下で培養されると内皮細胞の増殖が低減すること、およびＦＴＹ７２０－ＰまたはＭＰと培養されると内皮細胞の増殖が低減しないことを示している。
バリアアゴニスト化合物はＨＰＡＥＣの増殖を調節する
本実施例は、細胞がフォルスコリン（４０μＭ）の存在下で培養されると内皮細胞の増殖が低減すること、およびＦＴＹ７２０－ＰまたはＭＰと培養されると内皮細胞の増殖が低減しないことを示している。
【0095】
プロトコル
ＨＰＡＥＣを低い初期コンフエルエンシー（３０００～５０００細胞／ｃｍ２）で播種して、Ｉ型コラーゲンでコーティングした培養ディッシュ上でのそれらの増殖を研究した。バリアアゴニストを０時間目（図１０Ａ）または４８時間目（図１０Ｂ）に添加し、残りの培養を通して維持した。バリアアゴニスト化合物は、培養培地（ＭＣＤＢ１３１）に添加される際、以下の濃度で添加された：フォルスコリン（４０μＭ）、ＦＴＹ７２０－Ｐ（５０ｎＭ）、メチルプレドニゾロン（１μＭ）。ヘキスト色素で染色し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でイメージングされた核の個々の定量を介して、細胞数を測定した。
ＨＰＡＥＣを低い初期コンフエルエンシー（３０００～５０００細胞／ｃｍ２）で播種して、Ｉ型コラーゲンでコーティングした培養ディッシュ上でのそれらの増殖を研究した。バリアアゴニストを０時間目（図１０Ａ）または４８時間目（図１０Ｂ）に添加し、残りの培養を通して維持した。バリアアゴニスト化合物は、培養培地（ＭＣＤＢ１３１）に添加される際、以下の濃度で添加された：フォルスコリン（４０μＭ）、ＦＴＹ７２０－Ｐ（５０ｎＭ）、メチルプレドニゾロン（１μＭ）。ヘキスト色素で染色し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でイメージングされた核の個々の定量を介して、細胞数を測定した。
【0096】
結果
図１０Ａで示されているように、フォルスコリンで処理した細胞は、ＦＴＹ７２０－Ｐで処理した細胞または処理を受けなかった細胞よりも有意に低い内皮細胞増殖を示した。図１０Ｂで示されているように、フォルスコリンを含む１つまたは複数のバリアアゴニスト化合物で処理した細胞は、当該化合物を含まない群（未処理またはメチルプレドニゾロンのみ）よりも有意に低い内皮細胞増殖を示した。
図１０Ａで示されているように、フォルスコリンで処理した細胞は、ＦＴＹ７２０－Ｐで処理した細胞または処理を受けなかった細胞よりも有意に低い内皮細胞増殖を示した。図１０Ｂで示されているように、フォルスコリンを含む１つまたは複数のバリアアゴニスト化合物で処理した細胞は、当該化合物を含まない群（未処理またはメチルプレドニゾロンのみ）よりも有意に低い内皮細胞増殖を示した。
【0097】
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【0098】
ある特定の実施形態を説明および記載してきたが、これら実施形態において、以下の特許請求の範囲で定義されているその広い方の態様における技術から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って変更および修正を行うことができることが理解される。
【0099】
本明細書で例示的に記載される実施形態は、本明細書で具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定のない状況下で、適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは広く解釈され、限定を伴わない。さらに、本明細書で使用されている用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用では、示されているおよび記載されている特徴またはその一部分の何らかの同等物を排除することは意図されていないが、特許請求の範囲に記載の技術の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。さらに、「から基本的になる」という表現は、具体的に列挙されている要素、ならびに特許請求の範囲に記載の技術の基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響しない追加の要素を含むと理解される。「からなる」という表現は、特定されていないいかなる要素も排除する。
【0100】
本開示は、本願で記載されている特定の実施形態に関して限定されるものではない。当業者には明らかとなろうが、多くの修正および変型を、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書で列挙されたものに加えて、本開示の範囲内の機能的に同等な方法および組成物が、先の記載から当業者に明らかとなろう。このような修正および変型は、添付の特許請求の範囲に含まれるものである。本開示は、それに対してこのような特許請求の範囲の内容である同等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。本開示は、当然のことながら変化し得る特定の方法、試薬、化合物、または組成物に限定されないことが理解される。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図したものではないことも理解される。
【0101】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの用語で記載されている場合、当業者には、本開示がまた、それによって、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることが認識されよう。
【0102】
当業者には理解されるように、任意のおよび全ての目的で、特に、記載要件の提供に関して、本明細書で開示されている全ての範囲は、終点を含む、任意のおよび全ての考えられる部分範囲およびこれらの部分範囲の組み合わせも包含する。あらゆる列挙された範囲は、十分に説明的であり、当該範囲を少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などすることが可能であることが、容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、真ん中３分の１、および上３分の１などに容易に分けることができる。同様に当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「を超える」、「未満」などの全ての語は、列挙された数値を含み、上述したようにその後に部分範囲に分けられ得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。
【0103】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、登録された特許、および他の文献は、それぞれの個々の刊行物、特許出願、登録された特許、または他の文献が参照によってその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれる文書に含まれる定義は、これらが本開示における定義と矛盾する限りにおいて排除される。
【0104】
他の実施形態を、以下の特許請求の範囲で示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】