特表 2024-542858 ケラチノサイトを増殖させるための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-15

(54)【発明の名称】ケラチノサイトを増殖させるための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241108BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535850

(86)(22)【出願日】2022-12-15

(85)【翻訳文提出日】2024-07-26

(86)【国際出願番号】 CA2022051834

(87)【国際公開番号】W WO2023108288

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】63/290,480

(32)【優先日】2021-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518393115

【氏名又は名称】ステムセル テクノロジーズ カナダ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ヤオヤオ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ウィング

(72)【発明者】

【氏名】スティーブンソン，ヴィクトリア

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB04

4B065BB19

4B065BB31

4B065BB32

4B065BB34

4B065BB40

4B065BC03

4B065BC11

4B065BC41

4B065BD45

4B065CA50

(57)【要約】

本開示は、培地組成物及び／または培地に添加されるサプリメントに関し、かつケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞を培養及び／または増殖させるための方法に関する。別の態様では、本開示は、培地組成物及び／または培地に添加されるサプリメントに関し、かつケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の集団の濃縮または選択を提供する方法に関する。ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、多能性幹細胞から、より具体的には、多能性幹細胞の分化集団から誘導され得る。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

表皮ケラチノサイトを増殖させる方法であって、
多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化集団を、基礎培地、ならびに形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上を含む増殖培地と接触させることと、
前記増殖培地中で前記ＰＳＣの分化集団を培養して、増殖した表皮ケラチノサイトを生成することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記増殖培地は、前記ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤、前記ガンマセクレターゼ阻害剤、及び前記細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち２つ以上を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記増殖培地は、血清及び／またはウシ下垂体抽出物を含まない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記接触工程及び前記培養工程は、フィーダー細胞を含まない条件下で行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記接触工程及び前記培養工程は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体もしくはコーティング上で、または支持体もしくはコーティング内で実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドを解離させて、前記ＰＳＣの分化集団を得ることをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドは、血清及びまたはフィーダー細胞を含まない条件下で形成される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドは、ＰＳＣ由来毛髪含有皮膚オルガノイドである、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

前記接触工程及び前記培養工程が前記増殖培地中で実施される場合に、前記ＴＧＦＢシグナル伝達の阻害剤、前記ガンマセクレターゼ阻害剤、及び前記細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充されていない基礎培地と比較して、汚染性細胞型よりも、より多くの表皮ケラチノサイトを産生することをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２のうち１つ以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

表皮ケラチノサイト増殖培地であって、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充された基礎培地を含む、前記培地。

【請求項16】

前記ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である、請求項１５に記載の培地。

【請求項17】

前記ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２のうち１つ以上である、請求項１５または１６に記載の培地。

【請求項18】

前記ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の培地。

【請求項19】

前記細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の培地。

【請求項20】

前記Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、請求項１９に記載の培地。

【請求項21】

前記培地は、フィーダー細胞と接触せず、表皮ケラチノサイトを増殖させる、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の培地。

【請求項22】

前記表皮ケラチノサイトは、ＰＳＣの分化集団から誘導される、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の培地。

【請求項23】

前記培地は、血清及び／またはＢＰＥを含まない、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の培地。

【請求項24】

前記培地は、外因的に添加されたＴＧＦシグナル伝達の阻害剤を含まない、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の培地。

【請求項25】

前記培地は、外因的に添加されたガンマセクレターゼ阻害剤を含まない、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の培地。

【請求項26】

前記培地は、前記上皮細胞の増殖を支持する、請求項１５～２５のいずれか１項に記載の培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願の米国特許仮出願第６３／２９０，４８０号の優先権の利益を主張し、その全内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

本開示は、細胞培養用途に関し、より具体的には、ケラチノサイトの培養及び／または増殖に関し、さらにより具体的には、表皮ケラチノサイトの培養及び／または増殖に関する。

【背景技術】

【0003】

研究ツールとしてのそれらの使用に加えて、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを増殖させる能力は、医療用途に重要なものとなるであろう。増殖可能であり、かつ潜在的に無制限のケラチノサイトの供給源は、火傷の犠牲者、及び他の皮膚移植片を必要とする者にとって非常に重要性が高まるであろう。

【0004】

加えて、増殖可能であり、かつ潜在的に無制限の表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの供給源は、生体外モデル系で製品及び製品成分の効果を試験するために、化粧品産業などの産業にとって有益なリソースとなるであろう。

【0005】

またさらに、増殖可能であり、かつ潜在的に無制限の表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの供給源により、皮膚の発生生物学、ならびに黒色腫及びその他の皮膚癌などの皮膚に関する疾患を研究する科学的研究が可能になるであろう。

【0006】

しかし、一次皮膚サンプルは不足しており、初代ヒトケラチノサイト培養物の寿命は限られている。したがって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からケラチノサイトを誘導するための培地及び方法の開発は、研究及び産業的研究室、ならびに潜在的に医療分野に、実験的または治療的な物質の限界のない供給源をもたらすであろう。実際、ＰＳＣ由来ケラチノサイトは、遺伝性であるか、または自然発生であるかにかかわらず、皮膚疾患のモデリングを可能にし、診療所における患者特異的細胞療法に希望をもたらすであろう。

【0007】

したがって、ＰＳＣ由来表皮ケラチノサイトなどのＰＳＣ由来ケラチノサイトの集団を生成及び増殖させるための、頑強かつ効率的な培地、キット、方法及びシステムが必要とされる。

【発明の概要】

【0008】

本開示の一態様では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを生成及び／または増殖及び／または濃縮するための方法が提供される。方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化集団を、基礎培地、ならびに形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上を含む増殖培地と接触させることと、増殖培地中でＰＳＣの分化集団を培養して、増殖したケラチノサイトを生成することと、を含み得る。

【0009】

一実施形態では、増殖培地には、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち２つ以上が補充される。

【0010】

一実施形態では、増殖培地は、血清及び／またはウシ下垂体抽出物を含まない。

【0011】

一実施形態では、接触工程及び培養工程は、フィーダー細胞を含まない条件で行われる。

【0012】

一実施形態では、接触工程及び培養工程は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体上で、または支持体内で実施される。

【0013】

一実施形態では、方法は、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドを解離させて、ＰＳＣの分化集団を得ることをさらに含み得る。一実施形態では、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドは、血清及びまたはフィーダー細胞を含まない条件下で形成される。

【0014】

一実施形態では、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドは、ＰＳＣ由来毛髪含有皮膚オルガノイドである。

【0015】

一実施形態では、方法は、接触工程及び培養工程が増殖培地中で実施される場合に、ＴＧＦＢシグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充されていない基礎培地と比較して、汚染性細胞型よりも、より多くの表皮ケラチノサイトを産生することをさらに含み得る。

【0016】

一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２のうち１つ以上である。

【0017】

一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴである。

【0018】

一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。

【0019】

本開示の別の態様では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを生成及び／または増殖及び／または濃縮するための培地が提供される。培地は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充された基礎培地（例えば、増殖培地）を含み得る。

【0020】

一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２のうち１つ以上である。

【0021】

一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴである。

【0022】

一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。

【0023】

一実施形態では、培地は、フィーダー細胞と接触せず、（表皮）ケラチノサイトを増殖させる。

【0024】

一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、ＰＳＣの分化集団から誘導される。

【0025】

一実施形態では、培地は、血清及び／またはＢＰＥを含まない。

【0026】

一実施形態では、培地は、外因的に添加されたＴＧＦシグナル伝達の阻害剤を含まない。

【0027】

一実施形態では、培地は、外因的に添加されたガンマセクレターゼ阻害剤を含まない。

【0028】

一実施形態では、培地は、上皮細胞の増殖を支持する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

本明細書に記載の種々の実施形態のより良い理解のため、またこれらの種々の実施形態を効果的に実行し得る方法をより明確に示すために、少なくとも１つの例示的実施形態を示す添付図面を参照として提示し、これより、添付図面について説明する。図面は、本明細書に記載される教示の範囲を限定することを意図したものではない。

【図1】培養中のヒト細胞の代表的写真を示す。（Ａ）ヒト初代新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ３）を、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で単層として培養し、３回目の継代の２５日目に撮像した。（Ｂ）ヒトＰＳＣを、Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、公開されているプロトコル（Ｋａｊｉｗａｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ，２０１７）を使用して単層として培養した。スケールバーは、２００μｍである。

【図2】ＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞を使用した本開示のケラチノサイト分化プロトコルの異なる段階に対応する代表的画像を示す。図１に示した結果と比較して、ＰＳＣからのケラチノサイト誘導の効率は、毛髪含有皮膚オルガノイドの細胞を開始点として使用する場合に改善される可能性がある。パネルＡ）は、７０～１２０目のＰＳＣ由来毛髪含有皮膚オルガノイドを示す。パネルＢ）～Ｄ）の画像は、本開示の培養培地中の単層にＰＳＣ由来毛髪含有皮膚オルガノイドの解離細胞をプレーティングした後の４、７、及び１０日目に対応する。スケールバーは、２００μｍである。

【図3】ケラチノサイト集団倍加の線グラフを示す。本開示の培養培地中で延長させた培養の間、Ｈ９ ＥＳ細胞、Ｈ１ ＥＳ細胞、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞の集団倍加を、初代新生児ケラチノサイト及び初代成人ケラチノサイトと比較した。

【図4】ケラチノサイトの増殖に対する細胞外マトリックスコーティングの効果を示す。分化ＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞を、プラスチック皿に直接、またはコラーゲンコーティング上のいずれかに、単層としてプレーティングし、本開示の培養培地と接触させて、細胞を少なくとも６回の継代（ｐ６）で成長させた。（Ａ）プレーティング後５日目、及び、６回目の継代の５日目に、各条件の画像を撮像した。（Ｂ）ＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ由来ケラチノサイトの増殖を、プラスチック皿に直接、またはコラーゲンコーティング上のいずれかにプレーティングした細胞間で評価した。スケールバーは、２００μｍである。

【図5】ＰＳＣから誘導／増殖させたケラチノサイト間でのケラチノサイト特異的マーカーの発現に対する免疫細胞化学染色を示す。（Ａ）ＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞を、本開示に従って、ケラチノサイト様細胞に分化させ、継代１回目のケラチン１４（Ｋ１４）、ケラチン５（Ｋ５）、及びＴＰ６３（ｐ６３）の発現について評価した。（Ｂ）ＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞を、本開示に従って、ケラチノサイト様細胞に分化させ、継代９回目のケラチン１４（Ｋ１４）、ケラチン５（Ｋ５）、及びＴＰ６３（ｐ６３）の発現について評価した。（Ｃ）Ｈ９ ＥＳ細胞を、本開示に従って、ケラチノサイト様細胞に分化させ、継代４回目のＫ１４、Ｋ５、及びｐ６３の発現について評価した。（Ｄ）ＰＳＣ由来ケラチノサイト間でのＫ１４、Ｋ５、及びｐ６３の発現レベルを、ヒト初代ケラチノサイトの対照培養に対して評価した。スケールバーは、２００μｍである。

【図6】あるクローン細胞密度で播種したケラチノサイトのコロニーの形態を示す。初代新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ３）及び解離ＰＳＣ由来皮膚オルガノイド（ＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２）の細胞の両方を、２００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、コーティングまたはフィーダー細胞支持体の不在下でＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）中で培養した。画像中、灰色はＫ１４＋細胞／コロニーを示している。

【図7】種々の市販の培地中で培養した後のＰＳＣ由来細胞の形態を示す。ＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞を、本明細書に記載のように毛髪含有皮膚オルガノイドに形成し、解離させた後、細胞を、（Ａ）ＥｐｉＬｉｆｅ（商標）ＥＤＧＳ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、（Ｂ）ＥｐｉＬｉｆｅ（商標）ＨＫＧＳ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、または（Ｃ）ＣｎＴ－５７培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）にプレーティングした。各培地条件で成長した細胞の画像を、指定の時点で撮像した。スケールバーは、２００μｍである。

【図8】種々の培養培地中で成長したＰＳＣ由来細胞の集団倍加の線グラフを示す。Ｈ９ ＥＳ細胞を、本開示のケラチノサイト分化培地中またはＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ培地中のいずれかで成長させ、集団倍加を数週間にわたって評価した。ＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞を、本開示のケラチノサイト分化培地中またはＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ培地中のいずれかで成長させ、集団倍加を数週間にわたって評価した。Ｈ１ ＥＳ細胞を、本開示のケラチノサイト分化培地中で成長させ、集団倍加を数週間にわたって評価した。

【図9】異なる培地配合物中で培養したＰＳＣ由来細胞間でのケラチン１４の発現を示す。（Ａ）本開示の培地、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、またはＣｎＴ５７培養培地のいずれかを使用した、Ｈ１及びＨ９ ＥＳ細胞、ならびにＷＬＳ－１Ｃ及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞から誘導させた細胞間でのケラチン１４染色の代表的免疫細胞化学画像である。（Ｂ）プロットは、指定のＰＳＣ株から、指定の培養培地中で分化させたケラチン１４陽性細胞のパーセンテージを示す。スケールバーは、２００μｍである。

【図10】異なる培地配合物中で培養したＰＳＣ由来細胞間でのＴＰ６３の発現を示す。（Ａ）本開示の培地、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、またはＣｎＴ５７培養培地のいずれかを使用した、Ｈ１及びＨ９ ＥＳ細胞、ならびにＷＬＳ－１Ｃ及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞から誘導させた細胞間でのＴＰ６３染色の代表的免疫細胞化学画像である。（Ｂ）プロットは、指定のＰＳＣ株から、指定の培養培地中で分化させたケラチノサイト間でのＴＰ６３陽性細胞のパーセンテージを示す。スケールバーは、２００μｍである。

【図11】種々の培地配合物中で培養した後のＰＳＣ由来細胞の形態を示す。Ｈ９ ＥＳ細胞及びＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞を、本明細書に記載のように毛髪含有皮膚オルガノイドに形成し、解離させた後、細胞を、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、または異なる小分子を補充したＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳにプレーティングした。各培地条件で成長した細胞の画像を、指定の時点で撮像した。スケールバーは、２００μｍである。

【図12】種々の培地配合物中で生成したＴＰ６３＋細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞を、本明細書に記載のように毛髪含有皮膚オルガノイドに形成し、解離させた後、細胞を、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、または指定の小分子を補充したＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳにプレーティングした。ＴＰ６３発現に対して細胞を染色し、ＦＡＣＳによって分析した。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本開示は、培地組成物及び／または培地に添加されるサプリメントに関し、かつヒトケラチノサイトを培養するための方法に関する。より具体的には、本開示は、出発細胞の集団中に存在するオフターゲットまたは汚染性細胞型の増殖（条件）ではなく、ヒトケラチノサイトの増殖またはヒトケラチノサイトの増殖条件に関する。一実施形態では、本開示は、繊維芽細胞などの皮膚で見られる他の細胞型との比較における、ケラチノサイト（例えば、表皮ケラチノサイト）の優先的または選択的増殖に関する。

【0031】

本開示で使用される場合、用語「ケラチノサイト」とは、種々の動物で、特にその皮膚内だけでなく、例えば、食道でも見られる細胞型を指す。ヒト及び他の動物において、ケラチノサイトは、皮膚の外層（すなわち、表皮）の大部分を構成する。したがって、本開示の実施形態では、用語「ケラチノサイト」とは、ヒト表皮ケラチノサイトなどの表皮ケラチノサイトを指す。そのようなものであるから、用語「ケラチノサイト」及び「表皮ケラチノサイト」は、本明細書において同じ意味で用いられる。皮膚に関連して、ケラチノサイトは、下にある基底層から分化し、表皮の表面に向かって上方へ移動する。ヒトにおいて、ケラチノサイトは、表皮の皮膚細胞の約９０％以上を構成し得る。表皮幹細胞からケラチノサイトが発達する間、ケラチノサイト発達の異なる段階は、段階特異的マーカーの発現によって特徴付けられる。ケラチノサイトは、ＴＰ６３、ケラチン５（「Ｋ５」）、及びケラチン１４（「Ｋ１４」）の発現によって特徴付けられ得る。生体内で、ケラチノサイトは、分化する、及び／または、老化する、及び／または剥がれ落ちる前に、少なくともいくらかの増殖能力を有する。

【0032】

本開示で使用される場合、用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」または複数形のその変形形態は、自己複製することができ、かつ３つの全三胚葉、及びそれ以上に分化することができる細胞の集団を指す。それらを未分化状態で維持するようにＰＳＣを培養するための条件は公知であるが、これらの条件の改善は、現行の研究の主題である。ＰＳＣは、胚性幹細胞（「ＥＳＣ」）及び誘発多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方などを表現する広義の用語である。ＥＳＣの調達に関する倫理的課題があり得るが、現在までに、いくつかのＥＳＣ株が当分野で十分に確立されている。一方、ｉＰＳＣは、成人体細胞を含む豊富な種類の直ちに利用可能な細胞から誘発され得るため、倫理的制約との関連は少ない。したがって、新しいｉＰＳＣ株が、恒常的に出現する。ＰＳＣは、分化メカニズムを研究し、疾患をモデル化し、かつ重要な医学的機会を提供するために重要なモデルである。ＰＳＣは、任意の供給源種から採取、誘導、または誘発され得るが、本開示では、ＰＳＣは、好ましくはヒト由来である。

【0033】

本開示で使用される場合、用語「ＰＳＣの分化集団」とは、ある時点で、１つ以上の未分化ＰＳＣから出現し、種々の内部的または外部的きっかけに曝された結果、未分化状態ではなくなる細胞の集団を指す。ＰＳＣの分化集団は、依然として自己複製のいくらかの能力を維持するが、そのような集団の細胞が任意の系統に分化する能力は、（それらが曝された内部的または外部的きっかけ（複数可）によって影響を受けるのと同様に）発達上の辿る軌跡によって制約される場合がある。本開示の文脈において、ＰＳＣの分化集団は、外胚葉系統に向けて促された細胞の集団である。より具体的には、ＰＳＣの分化集団は、表皮系統に向かう、または表皮系統への初期外胚葉のさらに下流の細胞の集団である。ＰＳＣから始まり、ＰＳＣの分化集団は、目的の細胞型に直接分化し得るか、または１つ以上の中間段階を通過し得る。したがって、表皮幹細胞を生じさせることができるＰＳＣの分化集団は、外胚葉始原細胞段階を含む１つ以上の初期段階を通過している場合がある。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団は、解離ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドの細胞に対応する。ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドは、Ｌｅｅらによって発表された方法（Ｎａｔｕｒｅ，２０２０）を含む当技術分野で公知の任意の方法で生成されてよい。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団は、毛髪含有ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドの細胞に対応する。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団は、解離毛髪含有ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドの細胞に対応する。ＰＳＣの分化集団は、任意の供給源種に対応し得るが、本開示では、ＰＳＣの分化集団は、好ましくはヒト由来である。

【0034】

培地及びサプリメント
本開示の一態様では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを増殖させるための培地が提供される。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、初代由来であり、すなわち、対象または患者から直接採取される。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、ＰＳＣ由来である。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、ＰＳＣの分化集団から誘導される。したがって、ＰＳＣの分化集団は、ＰＳＣと（表皮）ケラチノサイトとの中間体である場合がある。

【0035】

一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上の表皮幹細胞を含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の１つ以上の始原細胞を含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上の表皮幹細胞及びケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の１つ以上の始原細胞の両方を含み得る。

【0036】

一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、哺乳動物由来である。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、ヒト由来である。一実施形態では、ケラチノサイトは、ＰＳＣ由来である。一実施形態では、ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、増殖可能及び／または自己複製型である。したがって、一実施形態では、ケラチノサイトは、幹細胞及び／またはケラチノサイト始原細胞であり得るか、またはそれらを含み得る。

【0037】

一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のホロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のメロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のパラクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、２つ以上のホロクローン及び２つ以上のメロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、パラクローンよりもホロクローン及び／またはメロクローンを多く含み得る。

【0038】

本開示のケラチノサイト培地は、表皮ケラチノサイト及び／またはケラチノサイト様細胞などのケラチノサイトを増殖させるために使用され得、ゆえに、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地と称される場合がある。前述の用語は、本明細書において同じ意味で用いられる場合がある。

【0039】

本開示のケラチノサイト培地は、基礎培地を含む。一実施形態では、基礎培地は、表皮ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞などのケラチノサイトの増殖を支持することができる任意の培地であってよい。一実施形態では、基礎培地は、ＰＳＣ由来表皮ケラチノサイトなどのＰＳＣ由来ケラチノサイトの増殖を支持することができる任意の培地であってよい。基礎培地は当技術分野で公知であり、かつＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆ－１２、ＭＣＤＢ１５３、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ａｄｖ ＤＭＥＭ、Ａｄｖ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含み得る。基礎培地は、典型的には、炭水化物、アミノ酸、微量元素、脂質、緩衝液、塩などを含む。いくつかの実施形態では、基礎培地は、前述の成分のタイプのうち１つ以上を含まない場合があり、これらの成分はサプリメントに含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、基礎培地には、さらに、前述の成分のタイプのうち１つ以上が補充されてよい。

【0040】

本開示の（表皮）ケラチノサイト増殖培地を配合するために使用される基礎培地はまた、完全培地を作るために追加の成分が補充されてよい。したがって、本開示のケラチノサイト培地（例えば、表皮ケラチノサイト増殖培地）は、完全培地として、または完全培地を作るために使用される前に基礎培地に添加される１つ以上のサプリメントと共に（キットでまたは他の方法で、いずれにせよ）提供される基礎培地として配合されてよい。

【0041】

完全（表皮）ケラチノサイト増殖培地を配合するために、１つ以上の成長因子またはその他のタンパク質、１つ以上のホルモン、塩、ビタミン、アルブミン供給源、１つ以上の小分子などのうち１つ以上を含む（またはさらに補充する）ことが有益及び／または必要である場合がある。

【0042】

一実施形態では、アルブミン供給源は、本開示のケラチノサイト増殖培地に含まれる。一実施形態では、アルブミン供給源は、哺乳動物から採取された血清などの血清であってよい。一実施形態では、アルブミン供給源は、血清よりもさらに定義されている成分である。例えば、アルブミン供給源は、単離されたアルブミンであってよい。一実施形態では、単離されたアルブミンは、組換えアルブミンである。一実施形態では、単離されたアルブミンは、ウシ血清アルブミンである。一実施形態では、単離されたアルブミンは、ヒトアルブミンである。

【0043】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、血清を含まない。

【0044】

一実施形態では、ケラチノサイト増殖培地は、１つ以上の小分子の補充から利益を得るか、及び／またはそれを必要とする。一実施形態では、１つ以上の小分子は、１つ以上の小分子阻害剤を含む。一実施形態では、１つ以上の小分子（例えば、小分子阻害剤）は、サプリメント中に含まれる。

【0045】

一実施形態では、ケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充された基礎培地を含む。

【0046】

形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦによるシグナル伝達を阻害する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、タンパク質である。一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７のうち１つ以上である。

【0047】

ガンマセクレターゼ阻害剤は、ガンマセクレターゼによるシグナル伝達を阻害する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、タンパク質である。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）、アバガセスタット（ＢＭＳ－７０８１６３）、ジベンザゼピン（ＹＯ－０１０２７）、ＬＹ４１１５７５、Ｌ－６８５，４５８、クレニガセスタット（ＬＹ３０３９４７８）のうち１つ以上である。

【0048】

細胞骨格構造を破壊する薬剤は、細胞骨格を破壊する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、タンパク質である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｙ－２７６３２、チアゾビビン、ファスジル（ＨＡ－１０７７）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２二塩酸塩、アザインドール１（ＴＣ－Ｓ ７００１）のうち１つ以上である。

【0049】

一実施形態では、ケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち２つ以上が補充された基礎培地を含む。一実施形態では、２つ以上の小分子（例えば、小分子阻害剤）は、サプリメント中に含まれる。

【0050】

一実施形態では、ケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のそれぞれが補充された基礎培地を含む。一実施形態では、小分子（例えば、小分子阻害剤）のそれぞれは、サプリメント中に含まれる。

【0051】

一実施形態では、本開示の表皮ケラチノサイト増殖培地は、定義されているものであってよい。すなわち、一実施形態では、本開示の表皮ケラチノサイト増殖培地は、未定義の成分を含まない、及び／または未定義の成分と接触しない。細胞培養培地にしばしば含まれるか、または細胞培養培地と接触する未定義の成分の例としては、ウシ下垂体抽出物（「ＢＰＥ」）、血清、ヒト血小板溶解物、フィーダー細胞、細胞によって産生される単離された細胞外マトリックスタンパク質（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））、馴化培地などが挙げられる。

【0052】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、血清及び／またはＢＰＥを含まない。一実施形態では、本開示の培地は、フィーダー細胞またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの未定義の細胞支持体（例えば、マトリックス）と接触しない。

【0053】

一実施形態では、本開示の培地の存在下で増殖する、または増殖したケラチノサイト（例えば、表皮ケラチノサイト）は、細胞外マトリックスの存在下で、好ましくは、コラーゲンコーティング上などの定義されている細胞外マトリックスコーティングの存在下で培養されてよい。

【0054】

したがって、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、完全培地として、または本明細書に記載のように補充される基礎培地として提供されるかどうかにかかわらず、ＰＳＣ由来または初代のいずれであっても（表皮）ケラチノサイトの増殖を支持する。一実施形態では、本開示の培地は、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、または６０以上のケラチノサイト集団倍加を支持する。

【0055】

一実施形態では、本開示の培地を使用して増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトは、特徴的なマーカーを発現する。一実施形態では、増殖した細胞の４０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞の５０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞の６０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞の７０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞の８０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞の９０％超が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。一実施形態では、増殖した細胞のほぼ１００％が、（表皮）ケラチノサイトの特徴的なマーカーに対して陽性である。

【0056】

一実施形態では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの特徴的なマーカーとしては、Ｋ１４及びｐ６３のうち１つ以上が挙げられる。一実施形態では、増殖した細胞の４０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞の５０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞の６０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞の７０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞の８０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞の９０％超が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。一実施形態では、増殖した細胞のほぼ１００％が、２回目の継代、３回目の継代、４回目の継代、または５回目の継代でＫ１４及びｐ６３のうち１つまたは両方を発現する。

【0057】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、市販の培地よりも（実際にケラチノサイトである細胞を産出する割合の点で）優れている。例えば、初代ケラチノサイトを増殖する目的で作られた培地としては、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、ＫＳＦＭ、ＤＫＳＦＭ、ＫＧＭ２、ＫＧＭ ｇｏｌｄ、ＣｎＴ－０７、ＣｎＴ－５７、及びＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅが挙げられる。加えて、種々のこれらの培地製品は、定義されていないなどの他の制限を有する場合がある。

【0058】

したがって、本開示のケラチノサイト培地は、前述の培地配合物よりも多い集団倍加を支持し得る。加えて、または代替的に、本開示の表皮ケラチノサイト増殖培地は、前述の培地配合物よりも、多い割合の増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを産生し得る。

【0059】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、ＰＳＣ由来であるか、一次組織サンプルから供給されたかにかかわらず、（その他の培地と比較して）優先的または選択的に、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの成長を支持する。このような実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）の存在下で培養される場合、オフターゲット細胞は、標的細胞（例えば、ケラチノサイト）に打ち負かされる場合がある。対照的に、前述のパラグラフで列挙した市販の培地など現在利用可能な培地の存在下で培養される場合、標的細胞（例えば、ケラチノサイト）は、オフターゲット細胞（例えば、繊維芽細胞、ケラチノサイト以外の表皮細胞）に打ち負かされる場合がある。

【0060】

方法
本開示の一態様では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを増殖させるための方法が提供される。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、初代由来であり、すなわち、対象または患者から直接採取される。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、ＰＳＣ由来である。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、ＰＳＣの分化集団から誘導される。したがって、ＰＳＣの分化集団は、ＰＳＣと（表皮）ケラチノサイトとの中間体である場合がある。

【0061】

一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、哺乳動物由来である。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、ヒト由来である。一実施形態では、哺乳動物ケラチノサイトは、ＰＳＣ由来である。一実施形態では、ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞は、増殖可能及び／または自己複製型である。したがって、一実施形態では、ケラチノサイトは、幹細胞及び／またはケラチノサイト始原細胞であり得るか、またはそれらを含み得る。

【0062】

一実施形態では、ＰＳＣの分化集団は、皮膚オルガノイド（例えば、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイド）の細胞から生じるか、またはそれに対応し得る。一実施形態では、解離皮膚オルガノイドは、毛髪含有皮膚オルガノイドの細胞に対応し得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団は、毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドから誘導された細胞の解離された集団であってよい。

【0063】

上述したケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）の説明は、本明細書に記載の方法、キット及び使用に関連するような培地のいずれの言及にも適用される。

【0064】

表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを増殖させる方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化集団をケラチノサイト培地（前述のような）と接触させることと、ＰＳＣの分化集団をそのような培地中で培養して、増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを生成することと、を含み得る。

【0065】

別の態様では、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの集団を濃縮または選択する方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化集団をケラチノサイト培地と接触させることと、ＰＳＣの分化集団をそのような培地中で培養して、濃縮された及び／または増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを生成することと、を含む。濃縮された細胞の集団とは、標的細胞、このケースでは、ケラチノサイトが、単独であるか、またはオフターゲット細胞（例えば、繊維芽細胞、ケラチノサイト以外の表皮細胞など）との組み合わせであるかにかかわらず、各集団よりも優位であるシナリオを指す。

【0066】

一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上の表皮幹細胞を含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の１つ以上の始原細胞を含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上の表皮幹細胞及びケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の１つ以上の始原細胞の両方を含み得る。

【0067】

一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のホロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のメロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、１つ以上のパラクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、２つ以上のホロクローン及び２つ以上のメロクローンを含み得る。一実施形態では、ＰＳＣの分化集団（例えば、皮膚オルガノイドまたは毛髪含有皮膚オルガノイドからの）は、パラクローンよりもホロクローン及び／またはメロクローンを多く含み得る。

【0068】

接触工程及び培養工程は、濃縮された及び／または増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを所望の量で産生し得る任意の持続時間であってよい。一実施形態では、接触工程及び培養工程は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日にわたって行われる。

【0069】

一実施形態では、接触工程及び培養工程は、１回超、２回超、３回超、４回超、５回超、６回超、７回超、８回超、９回超、または１０回超の継代にわたって行われる。当然、増殖されたまたは増殖する（表皮）ケラチノサイトの集団は、培養物が継代されている期間、一時的にケラチノサイト培地との接触から除外される場合がある。

【0070】

一実施形態では、接触工程及び培養工程は、フィーダー細胞を含まない条件で行われる。一実施形態では、接触工程及び培養工程は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体もしくはコーティング上で、または支持体もしくはコーティング内で実施される。一実施形態では、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体またはコーティングは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの未定義のものである。一実施形態では、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体またはコーティングは、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニンなどの定義されているものである。一実施形態では、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質は、組換え体である。一実施形態では、接触工程及び培養工程は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む支持体またはコーティングの不在下で実施される。

【0071】

前述したように、本開示の増殖培地は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち１つ以上が補充された基礎培地を含む。

【0072】

形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦによるシグナル伝達を阻害する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤は、タンパク質である。一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、及びＳＢ４３１５４２、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７のうち１つ以上である。

【0073】

ガンマセクレターゼ阻害剤は、ガンマセクレターゼによるシグナル伝達を阻害する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、タンパク質である。一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）、アバガセスタット（ＢＭＳ－７０８１６３）、ジベンザゼピン（ＹＯ－０１０２７）、ＬＹ４１１５７５、Ｌ－６８５，４５８、クレニガセスタット（ＬＹ３０３９４７８）のうち１つ以上である。

【0074】

細胞骨格構造を破壊する薬剤は、細胞骨格を破壊する機能を行う任意の因子であってよい。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、小分子阻害剤などの小分子である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、タンパク質である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、細胞骨格構造を破壊する薬剤は、Ｙ－２７６３２、チアゾビビン、ファスジル（ＨＡ－１０７７）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２二塩酸塩、アザインドール１（ＴＣ－Ｓ ７００１）のうち１つ以上である。

【0075】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のうち２つ以上が補充された基礎培地を含む。

【0076】

一実施形態では、本開示のケラチノサイト培地（例えば、ケラチノサイト増殖培地または表皮ケラチノサイト増殖培地）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤のそれぞれが補充された基礎培地を含む。

【0077】

一実施形態では、本明細書に記載のように補充された基礎培地（例えば、表皮ケラチノサイト増殖培地）は、血清及び／またはウシ下垂体抽出物を含まない。一実施形態では、本明細書に記載のように補充された基礎培地（例えば、表皮ケラチノサイト増殖培地）は、定義されているものである。

【0078】

一実施形態では、方法は、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドを解離させて、ＰＳＣの分化集団を得ることをさらに含み得る。一実施形態では、方法は、ＰＳＣの分化集団の解離サンプルを提供することをさらに含む。一実施形態では、解離サンプルは、皮膚オルガノイドを解離させることによって採取される。一実施形態では、皮膚オルガノイドは、毛髪含有皮膚オルガノイドである。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、ＰＳＣ由来である。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、ヒトＰＳＣなどのヒト細胞から誘導される。

【0079】

一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、公開されている方法に従って誘導される。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して誘導される。

【0080】

一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、血清及びまたはフィーダー細胞を含まない条件下で形成される。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の存在下で形成される。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の不在下で形成される。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、低接着、超低接着、または非組織培養処理プレート（例えば、９６ウェル、２４ウェル、または６ウェルなど）を使用して形成される。一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドを形成するために使用されるプレートは、それに細胞を播種する前に、Ａｎｔｉ－ａｄｈｅｒｅｎｃｅ Ｒｉｎｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの界面活性剤でコーティングされてよい。

【0081】

一実施形態では、皮膚オルガノイド及び／または毛髪含有皮膚オルガノイドは、段階的に形成され、構造及び細胞型が発達する前に、最低１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０日以上かかる。

【0082】

一実施形態では、皮膚（または毛髪含有皮膚）オルガノイドは、任意の既知の解離手段を使用して解離されてよい。一実施形態では、解離手段は、プロテアーゼベースのものであってよい。一実施形態では、解離手段は、トリプシン、ディスパーゼ、ＴｒｙｐｌＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）であってよい。

【0083】

一実施形態では、皮膚（または毛髪含有皮膚）オルガノイドは、それらの発達時間軸の間の種々の時点で解離されてよく、本開示の培地及び方法に従って培養される場合に、依然として、増殖したケラチノサイトを産生する。したがって、一実施形態では、種々の時点で解離された皮膚（または毛髪含有皮膚）オルガノイド（例えば、分化ＰＳＣの集団）は、それでもなお、増殖した及び／または濃縮されたケラチノサイト（例えば、表皮ケラチノサイト）を採取するために使用され得る。理論に縛られることなく、ケラチノサイト（例えば、表皮ケラチノサイト）の適切な始原細胞は、皮膚（または毛髪含有皮膚）オルガノイドが完全に発達する前に存在する場合があり、かつそのような発達の後期段階まで生き残る場合がある。一実施形態では、７０日目、１００日目、または１４０日目のオルガノイドが、本開示の培地中で（または方法を実施して）、増殖した及び／または濃縮された（表皮）ケラチノサイトを誘導するために使用され得る。

【0084】

本開示の方法（及び培地の使用）は、増殖した表皮ケラチノサイトを産生する。増殖した表皮ケラチノサイトは、玉石様及び多角形の上皮細胞形態を示すはずである。さらに、繊維芽細胞及び／またはその他の汚染性細胞、オフターゲット細胞型に似ている場合がある細長い細胞または紡錘状の細胞は、少ないか、または存在しないはずである。一実施形態では、繊維芽細胞及び／またはその他の汚染性またはオフターゲット細胞の量は、継代の間に、または継代の後に減少するが、その一方で、（表皮）ケラチノサイトまたはケラチノサイト様細胞の量は、継代の間に、または継代の後に増加する。

【0085】

一実施形態では、増殖したケラチノサイトは、コロニーとして成長する。一実施形態では、増殖したケラチノサイトは、クローン性誘導コロニーとして成長する。一実施形態では、コロニーは、ホロクローンまたはホロクローン様細胞（ＰＳＣ由来の培養の場合）から誘導される。一実施形態では、コロニーは、メロクローンまたはメロクローン様細胞（ＰＳＣ由来の培養の場合）から誘導される。一実施形態では、コロニーは、パラクローンまたはパラクローン様細胞（ＰＳＣ由来の培養の場合）から誘導される。一実施形態では、コロニーの大部分は、ホロクローンまたはホロクローン様細胞から（ＰＳＣ由来の培養の場合）、及び／またはメロクローンまたはメロクローン様細胞（ＰＳＣ由来の培養の場合）から誘導される。

【0086】

一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、１％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、２％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、３％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、４％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、５％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、６％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、７％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、８％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、９％を超える。一実施形態では、ＰＳＣ（例えば、解離された毛髪含有皮膚オルガノイドなどの皮膚オルガノイドの細胞の中で）の分化集団（その中でも、１つ以上のホロクローン及び／またはメロクローン）のコロニー形成効率は、１０％以上である。

【0087】

一実施形態では、方法は、接触工程及び培養工程が本開示の培地を使用して実施される場合に、ＴＧＦＢシグナル伝達の阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、及び細胞骨格構造を破壊する薬剤の１つ以上、２つ以上、またはそれぞれが補充されていない基礎培地の使用と比較して、汚染性（例えば、オフターゲット）細胞型よりも、より多くの（表皮）ケラチノサイトを産生することをさらに含み得る。したがって、表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトの優先的増殖／生成／濃縮は、有利に、かつ驚くべきことに、他の市販の培地と比較して、本明細書にて開示するような培地及び方法を使用して達成され得る。

【0088】

表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを増殖／生成／濃縮する本明細書にて開示する培地及び方法の効率は、バイオマーカーを調べることによって評価され得る。表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトのマーカーとしては、ケラチン１４（Ｋ１４）、ケラチン５（Ｋ５）、ケラチン１５（Ｋ１５）、ＴＰ６３、インテグリンα６（ＩＴＧＡ６）、インテグリンβ１（ＩＴＧＢ１）、及びコラーゲンＸＶＩＩ（ＢＰ１８０）などの基底層マーカーを挙げてもよい。効率はまた、ケラチン１０（Ｋ１０）及び／またはインボルクリンなどの基底上層マーカーを含む、（表皮）ケラチノサイト間で測定可能なレベルで発現しないはずのバイオマーカーを別々にまたは並行して調べることによって評価され得る。

【0089】

方法は、本明細書にて開示される培地を使用して、または方法に従って、生成／濃縮／増殖した表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトを分化させることをさらに含み得る。表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトは、当業者に公知の任意の方法または培地を使用して分化され得る。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、１ｍＭ超ＣａＣｌ_２などの高カルシウム濃度を含む溶液の存在下で分化され得る。一実施形態では、（表皮）ケラチノサイトは、気相液相界面条件下で分化され得る。分化される場合、ＡＬＩ条件下であるかどうかにかかわらず、初代ケラチノサイトまたはＰＳＣ由来ケラチノサイトは、細胞構築及びマーカー発現が適切な重層上皮細胞を生成できるはずである。ＰＳＣ由来ケラチノサイトの場合、そのような適切な構築及びマーカー発現は、それらの生体内対照物と一致するか、類似するか、または同等であるはずである。

【0090】

一実施形態では、本開示の培地及び／または方法を使用して生成された及び／または増殖された及び／または濃縮された表皮ケラチノサイトなどのケラチノサイトは、治療目的または化粧品目的のために使用され得る。一実施形態では、そのようなケラチノサイトは、生体外誘導皮膚移植片を生成するために、適切な足場と組み合わされ得る。一実施形態では、そのようなケラチノサイトは、皮膚の発達、及びまたは種々の皮膚関連疾患の生物学を研究するために使用され得る。一実施形態では、そのようなケラチノサイトまたは生体外誘導皮膚移植片は、対象の皮膚に使用することを目的とした化合物または他の物質を試験するために使用され得る。

【0091】

以下の非限定的実施例は、本開示を例示するものである。

【実施例】

【0092】

実施例１：多能性幹細胞の維持
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＰＳＣ維持培地（ｍＴｅＳＲ１（商標）、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、またはｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持し、製造者の推奨する維持培養及び継代プロトコルに従って継代した。ケラチノサイト誘導プロトコルの開始時に、１０００～３５００個のＰＳＣをＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）８００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）マイクロウェルデバイスの各マイクロウェル中、または低接着９６ウェルプレートのウェルごとに凝集させ、ＰＳＣを維持するために使用した同じ培地（この場合、ｍＴｅＳＲ１（商標）、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、またはｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のうち１つ）中で２日間培養して、凝集体を形成した。

【0093】

実施例２：皮膚オルガノイドの形成
実施例１の凝集体を、非接着条件下でＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）または９６ウェルプレートにプレーティングし、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの皮膚オルガノイド誘発培地中で１２日間培養した。続いて、皮膚オルガノイドを、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に少なくとも８週間移し、３～４日ごとに培地を追加または交換する。皮膚オルガノイドが成熟し、好ましくは、毛髪含有皮膚オルガノイドとして現れた（例えば、毛髪のプラコードが皮膚オルガノイドを提示する）後、それらを、３７℃のインキュベータ内でＤｉｓｐａｓｅ溶液中で一晩解離させる。

【0094】

実施例３：接着条件下での皮膚オルガノイドの解離細胞のプレーティング
実施例２の解離オルガノイドを、本開示の細胞培養培地中（例えば、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標），ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ中）で、適切な密度、通常は６ウェルプレートのウェルあたり１つの解離オルガノイドからＴ２５フラスコまでの範囲で、プレーティングする。大きなコロニーが現れたら、それらを、コンフルエント状態に達した時点またはその直前に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）またはトリプシンベースの解離試薬を使用して継代した。細胞をＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）培地に移した後、製造者が推奨するプロトコルに従って培養物を継代し、この際、ｃｍ^２あたりに１．２５～５×１０^３個の細胞を播種する。

【0095】

培養中の初代ヒトケラチノサイトは、玉石様の上皮細胞形態を示す（図１Ａ）。また、初代ヒトケラチノサイトは、基底層マーカーＫ１４、Ｋ５、ｐ６３、ＩＴＧＡ６、及びＩＴＧＢ１を発現するはずであるが、顕著なレベルの基底上層マーカーＫ１０及びインボルクリンを発現しないはずである。しかし、ＰＳＣをケラチノサイト培地中の単層条件に直接播種して、公開されているプロトコル（Ｋａｊｉｗａｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ，２０１７）を使用して分化させる場合、生じる細胞の形態は、玉石様ではない。むしろ、生じた細胞は、細長く（繊維芽細胞のような）、かつ拡散し、かつ重複しているように見える（図１Ｂ）。簡単に述べると、Ｋａｊｉｗａｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ，２０１７のプロトコルは、レチノイン酸及びＢＭＰ４を補充したＤｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（「ＤＫＳＦＭ」）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で、ビトロネクチンでコーティングしたプレート上で４日間ＰＳＣを培養することを含む。４～１４日目に、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充したＤＫＳＦＭ中で細胞を培養する。１４日後、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び１０ｕＭのＹ－２７６３２を補充したＤＫＳＦＭ中で、フィブロネクチン及び１型コラーゲンでコーティングしたプレート上で細胞を培養する。

【0096】

このように、ＰＳＣ由来ケラチノサイトを生成する改善された手段が必要であり、前述の観察結果は、解離皮膚オルガノイドの細胞がＰＳＣ由来ケラチノサイトの比較的純粋な培養物を増殖させるために驚くべき有効な開始点を提供するように見えるといった予期せぬ発見を導いた実験を促すものであった。

【0097】

皮膚オルガノイドは、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＳＣから生成し得る。図２Ａは、実施例１及び２に記載されているように形成されたＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して形成された毛髪含有皮膚オルガノイドの代表的画像を示している。皮膚オルガノイドを、製造者の推奨するプロトコルに従って、前述の培地中で開始し、１２日後、誘発した皮膚オルガノイドを、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｓｋｉｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。皮膚オルガノイドを、非接着条件下で、３～４日ごとに細胞培養培地を交換しながら、約６週間以上にわたって成熟させた。皮膚オルガノイドは、毛嚢が細胞培養培地の方に向かってそれらの外側表面で観察された時点で成熟していると見なされ得る。

【0098】

（毛髪含有）皮膚オルガノイドが十分に成熟したら、それらを、Ｄｉｓｐａｓｅ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃で一晩インキュベートして、構造を細胞の懸濁液中に解離させることができる。細胞の解離懸濁液を、組織培養処理培養プレートまたはフラスコにプレーティングし、接着条件下でＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養する。培地を、約２～３日ごとに交換し、細胞がコンフルエント状態に達する前に、それらを、Ａｃｃｕｔａｓｅまたはトリプシンベースの解離試薬を使用して継代した。ＰＳＣの分化集団の最初の播種後、３または４日目にケラチノサイトのコロニーはほとんど観察されない（図２Ｂ）。しかし、培養の約７日後、ケラチノサイトの大きなコロニーが出現する（図２Ｃ及び２Ｄ）。

【0099】

本実施例３に従って３つの異なるヒトＰＳＣ株（Ｈ９ ＥＳ細胞、Ｈ１ ＥＳ細胞、及びＳＴｉＰＳ Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞）から誘導したケラチノサイトの集団倍加を数週間にわたって測定した。ヒトＰＳＣ由来ケラチノサイトの増殖を、市販の初代成人ヒトケラチノサイト及び初代新生児ヒトケラチノサイトと比較した。図３は、本実験にわたって、ＰＳＣ由来ケラチノサイトの集団倍加は、わずかに減少しただけであり、ゆえに初代ケラチノサイト対照と同等であることを示している。

【0100】

実施例４：細胞をコラーゲンでコーティングしたプレートに播種する場合ＰＳＣ由来ケラチノサイトの増殖が増加する
ＰＳＣ由来ケラチノサイトの集団倍加に対する細胞外マトリックスの効果を調査した。Ｆ０２２ ｉＰＳ細胞から誘導したケラチノサイトを形成し、基本的に実施例３に記載のようにプレーティングした。ただし、解離皮膚オルガノイドの細胞懸濁液を、プラスチック皿に直接、またはコラーゲンでコーティングした皿（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかにプレーティングした。初期継代（継代０）及び後期継代（継代６）の両方で、コラーゲンコーティング表面で成長した場合、より多くのＰＳＣ由来ケラチノサイトが現れた（図４Ａ）。この観察結果は、前述の培養条件でＰＳＣ由来ケラチノサイトの数を数週間にわたって定量した際に確認した。解離皮膚オルガノイドの細胞懸濁液をコラーゲンでコーティングしたプレート上で培養したところ、細胞をプラスチック上に直接プレーティングした条件と比較して、集団倍加の数が約１０増加した（図４Ｂ）。

【0101】

実施例５：ＰＳＣ由来ケラチノサイトは、初代ケラチノサイトの対照培養と比較して、同等のレベルの基底細胞マーカーを示す
実施例３または４に従って生成したＰＳＣ由来ケラチノサイトを、免疫細胞化学によってケラチノサイトマーカーの発現について評価した。簡単に述べると、サンプルを、４％ ＰＦＡ中で、室温で１時間、または４℃で一晩固定した。次に、サンプルを室温で１時間ブロッキング緩衝液に曝した。続いて、サンプルを、希釈ＰＢＳＴ中で、摂氏４℃で一晩、一次抗体（下記表に示されているような）と共にインキュベートした。一連の洗浄の後、サンプルを、暗所にて室温で１時間、ＰＢＳＴで希釈した二次抗体と共にインキュベートした。一連の洗浄の後、サンプルを、室温で８分間、ＤＡＰＩ染料と共に（ＰＢＳ中１：１００００）インキュベートした。ＰＢＳを使用した一連の洗浄を行い、その後、蛍光顕微鏡法を使用してサンプルを可視化した。

【表1】

【0102】

ケラチン１４（Ｋ１４）、ケラチン５（Ｋ５）、及びＴＰ６３（ｐ６３）の発現を、ＷＬＳ－１Ｃ ｉＰＳ細胞で継代１及び継代９で確認し（図５Ａ及び５Ｂ）、Ｈ９ ＥＳ細胞で継代４で確認した（図５Ｃ）。これらのマーカーの発現レベルは、ヒト初代ケラチノサイトの培養物の間でのこれらのマーカーの発現と同等に見えた（図５Ｄ）。これらの結果は、ＰＳＣ由来ケラチノサイトが初代ケラチノサイトと良好に類似していることを示している。

【0103】

ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドの解離細胞のコロニーを形成する能力を試験するために、限定した数の初代ケラチノサイト及びＰＳＣ由来細胞（合計２００）を、いかなるコーティングまたはフィーダー層の不在下で、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）中で６ウェルプレートのウェルにプレーティングした（図６）。出現したコロニーをＫ１４に対して染色したところ、出発細胞集団の両方のタイプが、Ｋ１４＋コロニーを形成する能力のある細胞を有していることが明らかとなった。５％超、かつおそらく約１０％の明らかなコロニー形成効率が達成された。形態及びコロニーサイズを考慮すると、開始細胞集団の両方が、２００個の播種細胞の間で、多数のホロクローン及びメロクローンを含んでいることが明らかとなった。これらのデータは、本開示の培地及び方法が、ケラチノサイト幹細胞または初期ケラチノサイト始原細胞の増殖及びクローン誘導を支持することを示唆している。

【0104】

実施例６：市販の培地を使用して成長させた細胞の分析
種々の市販の細胞培養培地：ＥｐｉＬｉｆｅ（商標）培地と共に使用するためのＥｐｉＬｉｆｅ（商標）Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＥｐｉＬｉｆｅ培地またはＭｅｄｉｕｍ １５４と共に使用するためのＧｉｂｃｏ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；及びＣｎｔ－５７Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍが、ヒト表皮ケラチノサイトを培養する目的で市販されている。基本的に、実施例３に記載のように採取した解離皮膚オルガノイドの細胞懸濁液から開始して、増殖したＰＳＣ由来表皮ケラチノサイトの集団を生成する実験でこれらの培地を試験した。ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ（図７Ａ）、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ（図７Ｂ）、及びＣｎＴ－５７（図６Ｃ）のいずれかの中で培養した後、異なる時点で撮像した生じた細胞の画像は、これらの培地が玉石様の形態を示すＰＳＣ由来ケラチノサイトを増殖できないことを示している。本開示の培養培地中で種々のＰＳＣ株から成長するケラチノサイトの集団倍加もまた、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ及びＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳとの比較で、数週間にわたって評価した。ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）は、試験した全ての細胞株でＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ及びＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳより優れていた（図８）。これらの結果は、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、及びＣｎＴ－５７が、増殖したＰＳＣ由来ケラチノサイトの集団を生成することができないことを示唆している。

【0105】

ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）及び前述した市販の培地を使用して、さらなる実験を行い、この際、異なるＰＳＣ株から分化したケラチノサイトの間で、ケラチン１４及びＴＰ６３の発現を評価した。

【0106】

図９Ａは、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、ＣｎＴ－５７、及びＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）のいずれかの中で、２つのＥＳ細胞株（Ｈ１及びＨ９）及び２つのｉＰＳ細胞株（ＷＬＳ－１Ｃ及びＳＴｉＰＳ Ｆ０２２）から分化した細胞の間でのケラチン１４発現の代表的画像を示している。画像は、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）配合物が市販の配合物より優れていることを示唆しており、これらの観察結果を確認するために、産出ＰＳＣ由来ケラチノサイトを定量化した（図９Ｂ）。画像Ｊを使用して細胞を定量化し、試験した市販の培地と比較して、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）中で明らかに多くのＫ１４^＋細胞が生成した。特に、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）を使用して生成したＫ１４^＋細胞のパーセンテージは、試験したＰＳＣ株のそれぞれから生成したケラチノサイトにわたって一貫していた。

【0107】

図１０Ａは、ＥｐｉＬｉｆｅ ＨＫＧＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ ＥＤＧＳ、ＣｎＴ－５７、及びＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）のいずれかの中で、２つのＥＳ細胞株（Ｈ１及びＨ９）及び２つのｉＰＳ細胞株（ＷＬＳ－１Ｃ及びＳＴｉＰＳ Ｆ０２２）から分化したケラチノサイトの間でのＴＰ６３発現の代表的画像を示している。画像は、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）配合物が市販の配合物より優れていることを示唆しており、これらの観察結果を確認するために、産出ＰＳＣ由来ケラチノサイトを定量化した（図１０Ｂ）。図９に関して前述したように細胞を定量化し、試験した市販の培地と比較して、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）中で明らかに多くのＴＰ６３^＋細胞が生成した。特に、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）を使用して生成したＴＰ６３^＋細胞のパーセンテージは、試験したＰＳＣ株のそれぞれから生成したケラチノサイトにわたって一貫していた。

【0108】

市販の培地のＰＳＣ由来ケラチノサイトを増殖する能力は、１つ以上の小分子阻害剤を補充することによりいくらか回復可能であったが、ＤｅｒｍａＣｕｌｔ（商標）のレベル程ではない（図１１）。具体的には、ＨＫＧＳ培地に、Ａ８３－０１、ＤＡＰＴ、Ｙ－２７６３２またはＡ８３－０１、ＤＡＰＴ及びＹ－２７６３２の３つの全てを補充した。図１０は、ＥＳ細胞株（Ｈ９）及びｉＰＳ細胞株（１Ｃ）をＹ－２７６３２または前述の因子の３つ全てを補充したＨＫＧＳ中で培養した場合の、コロニーの出現を示している。１Ｃ ｉＰＳ細胞を前述の培地条件で培養し、ｐ６３発現について分析して、ＰＳＣ由来皮膚オルガノイドに含まれているケラチノサイトと繊維芽細胞などの他の細胞型とを区別する異なる実験で、これらの所見を確認した（図１２）。解離（毛髪含有）皮膚オルガノイドの細胞を、Ｙ－２７６３２または前述の因子の３つ全てに曝したところ、結果として、ＨＫＧＳのみの存在下での培養後の出現ｐ６３＋細胞の不在と比較して、同等数のｐ６３＋細胞が出現した。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】