特表 2024-542879 ＰＤ－１およびＴＧＦ－ＢＲＩＩ結合ドメインを含む多重特異性結合部位

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-18

(54)【発明の名称】ＰＤ－１およびＴＧＦ－ＢＲＩＩ結合ドメインを含む多重特異性結合部位

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241111BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241111BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241111BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241111BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241111BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241111BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241111BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241111BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241111BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241111BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20241111BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P37/02

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024524389

(86)(22)【出願日】2022-11-18

(85)【翻訳文提出日】2024-05-31

(86)【国際出願番号】 EP2022082377

(87)【国際公開番号】W WO2023089083

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】2029844

(32)【優先日】2021-11-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510340757

【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ

(71)【出願人】

【識別番号】506130045

【氏名又は名称】インサイト コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】ジェウイジェン セシリア アンナ ヴィルヘルミナ

(72)【発明者】

【氏名】メイズ パトリック

(72)【発明者】

【氏名】スチュワート ショーン エム．

(72)【発明者】

【氏名】ワン リアンーチュワン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、多重特異性結合部位に関連する。本開示は、そのような多重特異性結合部位を含む医薬組成物、そのような多重特異性結合部位を使用する治療方法、およびそのような多重特異性結合部位を産生する細胞に、さらに関連する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、
および
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、
多重特異性結合部位。

【請求項2】

請求項１に記載された多重特異性結合部位であって、
活性化Ｔ細胞において、具体的には活性化腫瘍特異的Ｔ細胞において、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、
および
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、
多重特異性結合部位。

【請求項3】

請求項１または２に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を有する、
多重特異性結合部位。

【請求項5】

請求項４に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、または実質的に発現しない前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞である、
多重特異性結合部位。

【請求項6】

請求項４に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、活性化ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しない前記細胞は、非活性化ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋細胞である、
多重特異性結合部位。

【請求項7】

請求項４に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しない前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β細胞である、
多重特異性結合部位。

【請求項8】

請求項４～６のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【請求項9】

請求項４または７に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、アイソジェニックＰＤ－１－ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【請求項10】

請求項４～９のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、少なくとも約２００倍、好ましくは約２００～３００００倍高い、
多重特異性結合部位。

【請求項11】

請求項４～１０のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を全く発現しない細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも低く、
および
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも高く、
前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である、
多重特異性結合部位。

【請求項12】

請求項１１に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも、少なくとも約１００倍、好ましくは約１００～２００００倍高い、
多重特異性結合部位。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、腫瘍体積を減少させる際に参照抗体の組合せよりも高い活性を有し、
参照抗体の前記組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、
ＰＤ－１を標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、
多重特異性結合部位。

【請求項14】

請求項１３に記載された多重特異性結合部位であって、
腫瘍体積を減少させる際の前記活性は、インビボマウス試験において、具体的にはＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片ｈｕＣＤ３４ ＮＳＧマウスを使用するインビボマウス試験において、腫瘍体積の減少を測定することにより決定される、
多重特異性結合部位。

【請求項15】

請求項１３または１４に記載された多重特異性結合部位であって、
ここで、腫瘍体積を減少させる際のより高い活性とは、参照抗体の前記組合せの腫瘍体積の減少の、少なくとも約１．５倍の、好ましくは約１．５～１００倍の、腫瘍体積の減少である、
多重特異性結合部位。

【請求項16】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項17】

請求項１６に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項18】

請求項１６または１７に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項19】

請求項１６～１８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項20】

請求項１６～１７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項21】

請求項１６～２０のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項22】

請求項１６～２１のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項23】

請求項１６～２２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項24】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項25】

請求項２４に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項26】

請求項２４または２５に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項27】

請求項２４～２６のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項28】

請求項２４～２７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項29】

請求項２４～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項30】

請求項２４～２９のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項31】

請求項２４～３０のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項32】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１および／またはＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について、請求項１～３１のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位と競合する、
多重特異性結合部位。

【請求項33】

有効量の請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物。

【請求項34】

治療に使用するための、請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項３３に記載された医薬組成物。

【請求項35】

抑制された免疫系に関連する疾患、具体的には癌の治療に使用するための、請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項３３に記載された医薬組成物。

【請求項36】

疾患を治療するための方法であって、
有効量の請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項３３に記載された医薬組成物を、それを必要とする対象へ投与するステップを含む
方法。

【請求項37】

抑制された免疫系に関連する疾患、具体的には癌を治療するための方法であって、
有効量の請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項３３に記載された医薬組成物を、それを必要とする対象へ投与するステップを含む
方法。

【請求項38】

請求項１６または１７において規定されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、請求項２０または２１において規定されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
細胞。

【請求項39】

請求項３８に記載された細胞であって、
前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
細胞。

【請求項40】

請求項３８または３９に記載された細胞であって、
前記細胞は、軽鎖可変領域、具体的には請求項１８または１９において規定される軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
細胞。

【請求項41】

請求項１～３２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位を産生する、細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗体の分野に関連する。具体的には、異常細胞（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｅｌｌｓ）が関わる疾患の治療のための、治療用抗体の分野に関連する。さらに具体的には、ＰＤ－１に結合する結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩに結合する結合ドメインとを含む、多重特異性結合部位に関連する。

【背景技術】

【0002】

Ｔリンパ球が腫瘍の免疫監視に果たす役割はよく知られているが、癌細胞は、阻害性免疫経路の誘導によって、免疫制御から逃れることができる。その結果、阻害性免疫経路を阻害するために抗体が使用される免疫チェックポイント阻害療法（ＩＣＢ）が、有望な治療選択肢として出現し、前臨床および臨床試験において、ある癌に対する内因性免疫を増強および維持することが実証されている。

【0003】

プログラム死１（ＰＤ－１）およびプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、正常な生理機能においてはＴ細胞活性を弱めるがＴ細胞媒介抗腫瘍免疫応答を抑制するために腫瘍によって悪用されうる、免疫抑制ネットワークの構成要素である。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対して向けられる抗体は、いくつかの異なる癌を患う一部の患者の応答および生存に、改善をもたらしている。しかしながら、有望な臨床活性にもかかわらず、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に応答する患者は少数のみであり、持続性も限られる。従って、癌を治療するための新しく安全かつ効果的な治療法の開発が急務である。

【0004】

プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーに属する細胞表面受容体であり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現する。ＰＤ－１は現在、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合することが知られている。ＰＤ－１は、免疫チェックポイントとして機能し、Ｔ細胞の活性化を阻害することによって免疫系をダウンレギュレーションさせる際に重要な役割を果たし、その結果、体細胞上に存在する場合、自己免疫を減少させ、自己寛容を促進する。ＰＤ－１の阻害効果は、リンパ節の抗原特異性Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを減少させるという、二重のメカニズムを通じて達成されると考えられている。ＰＤ－１はまた、ＰＤＣＤ１；プログラム細胞死１；全身性エリテマトーデス感受性２；タンパク質ＰＤ－１；ＨＰＤ－１；ＰＤ１；プログラム細胞死１タンパク質；ＣＤ２７９抗原；ＣＤ２７９；ＨＰＤ－Ｌ；ＨＳＬＥ１；ＳＬＥＢ２；およびＰＤ－１などの、多くの異なる別名でも知られている。ＰＤ－１の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：８７６０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５１３３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９；ＯＭＩＭ：６００２４４；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６である。ＰＤ－１の活性を阻害する新しいクラスの薬剤、ＰＤ－１阻害剤は、腫瘍を攻撃する免疫系を活性化し、それゆえある種の癌を治療するために使用される。

【0005】

ＰＤ－１を標的とするモノクローナル抗体は、様々な悪性腫瘍の治療のために承認されている。抗ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ）を用いて治療されたメラノーマ患者における奏効率は、例えば、７０～８０％の患者が当初応答したにもかかわらず、３年で３３％である（Ribas A. et al. Association of Pembrolizumab With Tumor Response and Survival Among Patients With Advanced Melanoma. JAMA. 2016 Apr 19; 315(15):1600-9）。

【0006】

ＴＧＦ－βシグナル伝達は、上皮および造血細胞における細胞周期停止、間葉系細胞の増殖および分化の制御、創傷治癒、細胞外マトリックス産生、免疫抑制、および発癌を含む、多くの生理的および病理的過程を制御する（Massague J. TGFβ signalling in context. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012 Oct; 13(10):616-30）。加えて、ＴＧＦ－βシグナル伝達は、細胞周期進行、アポトーシス、接着、および分化を含む、多くの癌細胞機能を制御する（Liu S et al, Signal Transduction and targeted Therapy, 2021）。ＴＧＦ－βは、正常および前癌細胞においては、主に腫瘍抑制因子として作用することが報告されている一方、腫瘍細胞においては、増殖促進機能および上皮間葉転換を可能にし、その結果、腫瘍細胞の遊走、浸潤、血管内侵入、および血管外遊出を可能にするという、二相性の機能を示す。

【0007】

ＴＧＦ－βＲＩＩは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーおよびＴＧＦＢ受容体サブファミリーの一員である。これは、ＴＧＦＢＲ２、ＡＡＴ３、ＦＡＡ３、ＬＤＳ１Ｂ、ＬＤＳ２、ＬＤＳ２Ｂ、ＭＦＳ２、ＲＩＩＣ、ＴＡＡＤ２、ＴＧＦＲ－２、ＴＧＦベータ－ＲＩＩ、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２、ＴＢＲ－ｉｉ、およびＴＢＲＩＩを含む、様々な同義語で知られている。ＴＧＦ－βＲＩＩは、別の受容体タンパク質とヘテロ二量体複合体を形成し、ＴＧＦ－βと結合する。この受容体／リガンド複合体は、タンパク質をリン酸化し、その後核に入り、細胞増殖に関連する遺伝子のサブセットの転写を制御する。

【0008】

ＴＧＦ－β経路を標的とするいくつかの阻害剤が、前臨床および臨床開発段階にあり、ＴＧＦ－βを様々なレベルで；すなわち、リガンド、リガンド－受容体レベル、または細胞内レベルで、阻害する。阻害剤には、例えばＴＧＦ－β中和モノクローナル抗体、抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体、可溶性受容体、抗体リガンドトラップ（例えば抗ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－βＲＩＩＥＣＤ）、ＴＧＦ－β合成を妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＧＦ－β２アンチセンス遺伝子修飾同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）癌細胞ワクチン、およびＴＧＦ－βＲＩのキナーゼドメインを標的とする低分子を含む。

【0009】

単一特異性抗体を用いたＴＧＦ－β経路の標的化は、インビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を示すことが報告されている；しかしながら、有効性が低く、重大なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を含む許容できない毒性により、悪い臨床結果が続いている。ＴＧＦ－β経路と免疫チェックポイント阻害との複合標的化は、抗ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦＢＲＩＩ二機能性融合タンパク質であるＢｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｐｈａを用いて試みられたが、強い臨床効果は示されなかった。

【0010】

腫瘍微小環境において局所的に活性化された腫瘍特異的ＰＤ－１発現Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βシグナル伝達を、選択的に阻害する新規の治療介入が、Ｔ細胞腫瘍浸入を促進し、Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター活性を回復および持続させるために、依然として必要とされている。そのような標的化は、全身的なＴＧＦ－β阻害に伴う毒性を最小限にしながら、効果的で耐久性のある癌除去のために、免疫抑制経路を緩和し、ＣＴＬ機能およびＴ細胞記憶を強力に促進する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本開示の目的の１つは、ヒト疾患の治療のための、具体的には癌の治療のための、新たな医薬品を提供することである。この目的は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩとに結合する多重特異性結合部位、例えば二重特異性抗体の提供により満たされる。多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、腫瘍および腫瘍排出リンパ節において、多重特異性結合部位の活性化／疲弊エフェクターＴ細胞に対する特異性を駆動することを目的とし、そこでＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βがＴＧＦ－βＲＩＩに結合するのを局所的に阻害することができ、非Ｔ細胞に対するＴＧＦ－β阻害の全身毒性を減少させる。さらに、多重特異性結合部位は、腫瘍微小環境において、ＰＤ１およびＴＧＦ－β媒介免疫抑制経路の両方を緩和し、細胞傷害性Ｔリンパ球活性を促進する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本開示は、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、多重特異性結合部位を提供する。

【0013】

本開示はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記ＰＤ－１結合ドメインは、本明細書においてさらに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、多重特異性結合部位を提供する。

【0014】

本開示はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、本明細書においてさらに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、多重特異性結合部位を提供する。

【0015】

本開示は、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位を含む医薬組成物を、さらに提供する。

【0016】

本開示は、治療に使用するための、本明細書において記載される多重特異性結合部位、および本明細書において記載される医薬組成物を、さらに提供する。

【0017】

本開示は、癌の治療に使用するための、本明細書において記載される多重特異性結合部位、および本明細書において記載される医薬組成物を、さらに提供する。

【0018】

本開示は、疾患を治療するための方法であって、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位、または本明細書において記載される医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む方法を、さらに提供する。

【0019】

本開示は、癌を治療するための方法であって、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位、または本明細書において記載される医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む方法を、さらに提供する。

【0020】

本開示は、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域とをコードする核酸配列とを含む細胞を、さらに提供する。

【0021】

本開示は、本明細書において記載される多重特異性結合部位を産生する細胞を、さらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＰＤ－１－ＳＨＰリクルートメントアッセイで測定された、二重特異性抗体および対照抗体によるＰＤ－１媒介ＳＨＰリクルートメントの阻害百分率。Ａ）二重特異性抗体は：配列番号３９×配列番号９および配列番号３５×配列番号５である。対照抗体は：ペムブロリズマブアナログ－配列番号７８／配列番号７９；ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ－配列番号８０／配列番号８１、およびＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７である。Ｂ）二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１８；配列番号４７×配列番号１３；配列番号８８×配列番号１３；配列番号８９×配列番号１３；配列番号２３×配列番号１４；および配列番号４３×配列番号９である。対照抗体は：ペムブロリズマブアナログ－配列番号７８／配列番号７９；およびＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７である。

【図2】ＰＤ－１－ＮＦＡＴレポーターアッセイで測定された、二重特異性抗体および対照抗体によるＴ細胞活性化の誘導倍率（Ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）。Ａ）二重特異性抗体は：配列番号３９×配列番号９および配列番号３５×配列番号５である。対照抗体は：ペムブロリズマブアナログ－配列番号７８／配列番号７９；ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ－配列番号８０／配列番号８１、およびＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７である。Ｂ）二重特異性抗体は：配列番号４７×配列番号１３；配列番号８８×配列番号１３；および配列番号８９×配列番号１３である。対照抗体は：ペムブロリズマブアナログ－配列番号７８／配列番号７９；およびＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７である。Ｃ）二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１８；配列番号２３×配列番号１４；および配列番号４３×配列番号９である。対照抗体は：ペムブロリズマブアナログ－配列番号７８／配列番号７９；およびＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７である。

【図3】Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ（Ａ～Ｇ）細胞およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞（Ｈ～Ｎ）における、二重特異性抗体および対照抗体によるリン酸化ＳＭＡＤ２／３の阻害。これらのグラフは、二重特異性抗体または対照抗体と共にインキュベートされたＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞のライセート中の、リン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルを示す。「ＴＧＦ－β１なし」は、二重特異性抗体の非存在下で測定された、ＴＧＦ－βリガンドが加えられない場合の、バックグラウンドリン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルを示す；「１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β１」は、二重特異性抗体の非存在下で１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－βリガンドが加えられる場合の、最大リン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルを示す。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；および配列番号２３、３１、３９、２７、３５、または４３に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含む、ＴＧＦ－βＲＩＩ×ＲＳＶ抗体；配列番号８６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、ＲＳＶ結合ドメイン；および配列番号４８に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列と配列番号７５に示される軽鎖定常領域アミノ酸配列とを含む、共通の軽鎖である。各データ点は、対応する複製物の平均吸光度を表す。ＡおよびＨ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＢおよびＩ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＣおよびＪ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＤおよびＫ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＥおよびＬ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＦおよびＭ：配列番号１、５、９、１４、または１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインと、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む、二重特異性抗体；ＧおよびＮ：二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号９；配列番号２３×配列番号１４；配列番号４３×配列番号９；配列番号２３×配列番号１３；配列番号２３×配列番号１８；配列番号４７×配列番号１３；配列番号８８×配列番号１３；および配列番号８９×配列番号１３である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；およびペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９である。

【図4】フローサイトメトリーによる細胞内リン酸化ＳＭＡＤ２の測定。これらのグラフは、二重特異性抗体または対照抗体と共にインキュベートされた刺激および非刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の、細胞内リン酸化ＳＭＡＤ２レベルを示す。二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１８および配列番号４７×配列番号１３である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；およびペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９である。Ａ：ドナーＡの刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞；Ｂ：ドナーＡの刺激ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｃ：ドナーＡの非刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞；Ｄ：ドナーＡの非刺激ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｅ：ドナーＢの刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞；Ｆ：ドナーＢの刺激ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｇ：ドナーＢの非刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞；Ｈ：ドナーＢの非刺激ＣＤ８^＋Ｔ細胞。

【図5】二重特異性抗体または対照抗体によって誘導されるサイトカイン産生の、疲弊ＭＬＲアッセイでの測定。試験された二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号９；配列番号２３×配列番号１４；配列番号２３×配列番号１９；配列番号３１×配列番号１４；配列番号３９×配列番号９；配列番号３５×配列番号９；配列番号３５×配列番号１４；配列番号３５×配列番号１９；配列番号２７×配列番号９；配列番号４３×配列番号９；配列番号４３×配列番号１９；配列番号２３×配列番号１３；配列番号２３×配列番号１８；配列番号４７×配列番号１３；配列番号８８×配列番号１３；および配列番号８９×配列番号１３である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；ペムブロリズマブとＴＧＦ１アナログとの組合せ－配列番号７８／配列番号７９＋配列番号７６／配列番号７７；ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ－配列番号８０／配列番号８１；およびペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９である。Ａ：このグラフは、１人の代表的なドナーの疲弊Ｔ細胞による、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌の誘導を示す。Ｂ：このグラフは、１人の代表的なドナーの疲弊Ｔ細胞による、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌の誘導を示す。Ｃ：このグラフは、１人の代表的なドナー内の疲弊Ｔ細胞による、ＩＬ－２サイトカイン分泌の誘導を示す。Ｄ：このグラフは、１人の代表的なドナー内の疲弊Ｔ細胞による、ＴＮＦ－αサイトカイン分泌の誘導を示す。Ｅ：このグラフは、１人の代表的なドナー内の疲弊Ｔ細胞による、ＴＮＦ－αサイトカイン分泌の誘導を示す。

【図6】二重特異性抗体または対照抗体によって誘導されるＴＧＦ－β誘導シグナル伝達の、阻害百分率の測定。二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１４；配列番号２３×配列番号１９；配列番号３９×配列番号９；配列番号３５×配列番号９；配列番号３５×配列番号１４；配列番号３５×配列番号１９；配列番号２７×配列番号９；配列番号４３×配列番号９；および配列番号４３×配列番号１９である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；およびペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９である。ＡおよびＢ：これらのグラフは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞における、二重特異性抗体または対照抗体によるＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。ＣおよびＤ：これらのグラフは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞における、二重特異性抗体または対照抗体によるＴＧＦ－βＲシグナル伝達の阻害を示す。

【図7】二重特異性抗体または対照抗体によって誘導されるサイトカイン産生の、Ｔｒｅｇ抑制アッセイでの測定。二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１４；配列番号２３×配列番号１９；配列番号３１×配列番号１４；配列番号３９×配列番号９；配列番号３５×配列番号９；配列番号３５×配列番号１４；配列番号３５×配列番号１９；配列番号２７×配列番号９；配列番号４３×配列番号９；および配列番号４３×配列番号１９である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；ペムブロリズマブとＴＧＦ１アナログとの組合せ－配列番号７８／配列番号７９＋配列番号７６／配列番号７７；およびペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９である。Ａ：このグラフは、１人の代表的なドナーのＴｒｅｇのＰＢＭＣとの共培養における、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌の誘導を示す。Ｂ：このグラフは、１人の代表的なドナーのＴｒｅｇのＰＢＭＣとの共培養における、ＴＮＦ－αサイトカイン分泌の誘導を示す。

【図8】二重特異性抗体または対照抗体によって誘導されるサイトカイン産生の、マクロファージ抑制アッセイでの測定。二重特異性抗体は：配列番号３５×配列番号９；配列番号２３×配列番号１４；配列番号２３×配列番号１９；配列番号４３×配列番号９；配列番号３９×配列番号９；配列番号４３×配列番号１９；配列番号３５×配列番号１４；配列番号３５×配列番号１９；配列番号３１×配列番号１４；および配列番号２７×配列番号９である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；オプジーボ；ＬＩＬＲＢ２；ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ－配列番号８０／配列番号８１；ペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９；およびニボルマブアナログ－配列番号９６／配列番号９７である。Ａ：これらのグラフは、３人の異なるドナーからのＰＢＭＣから得られたＭ２マクロファージ上の、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＣＤ２０６、およびＣＤ８６の発現を示す。Ｂ：これらのグラフは、３人の異なるドナーからのＰＢＭＣから得られたＭ２マクロファージの存在下での、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γサイトカイン分泌の誘導を示す。

【図9】二重特異性抗体のインビボでの有効性。Ａ：このグラフは、対照抗体および参照抗体によって誘導される腫瘍体積の減少（ｍｍ^３）を示す。Ｂ～Ｅ：これらのグラフは、二重特異性抗体によって誘導される腫瘍体積の減少（ｍｍ^３）を、対照抗体および参照抗体と比較して示す。二重特異性抗体は：配列番号４３×配列番号９；配列番号４３×配列番号１９；配列番号２３×配列番号１４；配列番号２３×配列番号１９；配列番号３９×配列番号９；配列番号２７×配列番号９；配列番号２３×配列番号１８；および配列番号４７×配列番号１３である。対照抗体は：ＲＳＶ ＩｇＧ１－配列番号８６／配列番号８７；ＴＧＦ１アナログ－配列番号７６／配列番号７７；ペムブロリズマブ－配列番号７８／配列番号７９；ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ－配列番号８０／配列番号８１；およびペムブロリズマブとＴＧＦ１アナログとの組合せ－配列番号７８／配列番号７９＋配列番号７６／配列番号７７である。二重特異性抗体は、１ｍｇ／ｋｇ（１）および／または１０ｍｇ／ｋｇ（１０）で（Ａ～Ｃ）、および１０ｍｇ／ｋｇのみで（Ｄ～Ｆ）、投与された。Ｆ：二重特異性抗体または対照抗体を用いて治療後の、左のグラフはＴＧＦ－βＲＩＩ受容体の占有率を、右のグラフはＰＤ－１受容体の占有率を示す。

【図10】ベクターマップ

【図11】二重特異性抗体のインビボでの有効性。このグラフは、例示的な二重特異性抗体によって誘導される腫瘍体積の減少（ｍｍ^３）を、２つの異なる用量レベル：１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、１０ｍｇ／ｋｇでの対照抗体と比較して示す。二重特異性抗体は：配列番号２３×配列番号１８であり、および対照抗体は：配列番号８６／配列番号８７である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

ある実施形態において、本開示は、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、多重特異性結合部位を提供する。

【0024】

本明細書において使用される、「阻害する（ｂｌｏｃｋｓ）」または「阻害する（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」とは、リガンドと受容体との間の相互作用を妨げるまたは修飾すること、または、シグナル伝達カスケードの全体的または部分的な減少を引き起こすことを意味する。本開示の目的のために、ある実施形態において、リガンド誘導ＰＤ－１シグナル伝達を阻害する際の効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）は、実施例２に記載されるＳＨＰリクルートメントアッセイ、または実施例３に記載されるＮＦＡＴレポーターアッセイを使用することによって、決定される。ある実施形態において、リガンド誘導ＰＤ－１シグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例２に記載されるＳＨＰリクルートメントアッセイを使用することによって、決定される。ある実施形態において、リガンド誘導ＰＤ－１シグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例３に記載されるＮＦＡＴレポーターアッセイを使用することによって、決定される。本開示の目的のために、ある実施形態において、リガンド誘導ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例４または５に記載されるＳＭＡＤアッセイを使用することによって、決定される。ある実施形態において、リガンド誘導ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例４に記載されるＳＭＡＤアッセイを使用することによって、決定される。ある実施形態において、リガンド誘導ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例５に記載されるＳＭＡＤアッセイを使用することによって、決定される。

【0025】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ヒトＰＤ－１に結合する。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、例えば、実施例２または３に記載されるアッセイにおいて測定されるように、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する。

【0026】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合する。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩは、様々なアイソフォームが存在する膜貫通タンパク質である。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡのアミノ酸配列は、配列番号８２として提供され；ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号８３として提供される。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＢは、細胞外ドメインにおける挿入により、より長いアイソフォームをコードする、スプライスバリアントである。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＢのアミノ酸配列は、配列番号８４として提供され；ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号８５に示される。

【0027】

「結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、タンパク質性分子を指し、例えば以下のような、当該技術分野において利用可能な全ての抗体フォーマットを含む：完全長ＩｇＧ抗体、免疫複合体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢｉＴＥ、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ＶＨＨおよびＶＨなど）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ＤＡＲＴ分子、ＴａｎｄＡｂ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）′２、Ｆ（ａｂ）′２－ｓｃＦｖ２、およびイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）。

【0028】

ある実施形態において、多重特異性結合部位は、多重特異性抗体である。本開示に記載された多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる標的またはエピトープに対して特異性を有する、少なくとも２つの結合ドメインを含む抗体である。ある実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、Ｆｃ領域またはその一部をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＩｇＧ１抗体である。本開示の結合部位の定常領域は、標的抗原への結合特性以外の結合部位の特性を調節する、１または複数のバリエーションを含みうる。例えば、定常領域は、２つのＰＤ－１重鎖および／または２つのＴＧＦ－βＲＩＩ重鎖のホモ二量体化以上に、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩ重鎖のヘテロ二量体化を促進する、１または複数のバリエーションを含んでもよく、および／または、定常領域は、エフェクター機能を減少させまたは改善する１または複数のバリエーションを、具体的にはエフェクター機能を減少させる１または複数のバリエーションを、含んでもよい。

【0029】

「Ｆａｂ」とは、典型的には重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＨ１およびＣＬ領域を含む、結合ドメインを意味する。

【0030】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域を含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域からなる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域から本質的になる。

【0031】

「Ｆｃ領域」は、典型的にはヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む。適切なヒンジには、アミノ酸配列が配列番号６８に示されるヒンジを含むが、これに限定されない。適切なＣＨ２およびＣＨ３領域には、アミノ酸配列が配列番号７０または７１に示されるＣＨ２領域、およびアミノ酸配列が配列番号７２、または７３および７４に示されるＣＨ３領域を含むが、これらに限定されない。

【0032】

ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３領域は、例えば、異なる重鎖のヘテロ二量体化を促進するため、重鎖－軽鎖の対合を改善するため、および免疫細胞エフェクター機能を増加または減少させるためを含む、好ましい抗体特性を得るために、当該技術分野において既知の方法に従って修飾されうる。

【0033】

ある実施形態において、活性化Ｔ細胞、具体的には活性化腫瘍特異的Ｔ細胞において、多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する。

【0034】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力を有する。

【0035】

従って本開示はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力を有する、多重特異性結合部位をも提供する。

【0036】

ある実施形態において、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞、例えばヒトＰＤ－１とＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞などであり、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を発現しない細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞などである。ヒトＰＤ－１とＮＦＡＴ－ＲＥによって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、例えばＰｒｏｍｅｇａから市販され（カタログ番号ＣＳ１８７１０５－キットＣＳ１８７１０６およびＣＳ１８７１０７の一部）；Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞は、例えばＡＴＣＣから公的に入手可能である（カタログ番号ＴＩＢ－１５２）。

【0037】

ある実施形態において、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞は、刺激ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞であり、ＴＧＦ－βＲＩＩと低レベルのＰＤ－１とを発現する細胞は、非刺激ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞である。ある実施形態において、刺激ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞は、組換えヒトＴＧＦ－β１を用いて刺激される。

【0038】

ある実施形態において、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞は、例えば実施例７に記載されるような、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞であり、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を発現しない細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞、例えばＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞などである。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞は、例えばＩｎｖｉｖｏｇｅｎから市販され（カタログ番号ｈｋｂ－ｔｇｆｂ）、ヒトＴＧＦＢＲＩ、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４遺伝子を含む、安定してトランスフェクトされたヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞である。これらはさらに、Ｓｍａｄ３／４結合エレメント（ＳＢＥ）誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を発現する。

【0039】

ある実施形態において、ＰＤ－１が全くないか、実質的にないか、または低レベルであるとは、本明細書で提示されるような適切なアッセイにおいて検出不可能である細胞表面上のＰＤ－１のレベルを指す。ある実施形態において、低レベルのＰＤ－１とは、細胞表面上に存在する１００未満のＰＤ－１分子を指す。ある実施形態において、ＰＤ－１のレベルは、ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ法（ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ｂｅａｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して測定される。

【0040】

本開示の目的のために、多重特異性結合部位が、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力を有するかどうかを決定することは、本明細書において記載されるアッセイのうちの１つを使用することによって行われる。

【0041】

本明細書において提供される多重特異性結合部位の効力データは、実施例４および５に記載されるリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイ、および実施例７に記載されるアイソジェニックＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイを用いて得られる。従って、ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例４または実施例５に記載されるリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおいて測定される。

【0042】

簡単に言うと、実施例４に記載されるリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイは、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で培養された、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞とを使用して行われる。細胞は、６段階連続希釈（１００μｇ／ｍｌ～０．００１μｇ／ｍｌ）の試験または対照抗体と共に、３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートされる。１時間後、ヒト組換えＴＧＦ－β１が最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで加えられ、細胞は３７℃／５％ＣＯ_２でさらに２時間インキュベートされる。インキュベート後、細胞はＰＢＳを用いて穏やかに洗浄される。細胞ライセートは、ホスファターゼ阻害剤とプロテアーゼ阻害剤とを含む溶解バッファーを使用して調製される。リン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルは、ＥＬＩＳＡを使用して決定される。

【0043】

簡単に言うと、実施例５に記載されるリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイは、健康なドナーからのＰＢＭＣを使用して行われ、これは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を用いて４８時間刺激され、その後０．１％ＦＢＳ中で１６時間血清除去される。刺激および非刺激ＰＢＭＣは、試験および対照抗体と共に室温で３０分間インキュベートされる。組換えヒトＴＧＦ－β１が最終濃度１ｎｇ／ｍｌで加えられ、細胞はさらに３０分間インキュベートされる。最後に、細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄され、細胞表面マーカーを染色され、続いて細胞内リン酸化ＳＭＡＤ２染色される。フローサイトメトリーは、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞をゲートするために行われる。リン酸化ＳＭＡＤ２シグナルは、これらの細胞上の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）で測定される。

【0044】

ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、実施例７に記載されるアイソジェニックＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおいて測定される。

【0045】

簡単に言うと、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイは、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ（商標）ＴＧＦ－β細胞とＨＥＫ－ＢＬＵＥ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞とを使用して、１ウェルあたり２５０００細胞で行われる。試験および対照抗体の連続希釈液が加えられ、細胞は室温で１時間インキュベートされ、続いてヒト組換えＴＧＦ－β１が最終濃度１ｎｇ／ｍｌで加えられる。細胞は３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートされる。インキュベート後、４０ｕｌの上澄みと１６０ｕｌの再懸濁ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液が、３７℃／５％ＣＯ_２で４０分間インキュベートされる。上澄み中に分泌されたＳＥＡＰの量は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を使用して評価される。ＳＥＡＰレベルは、分光光度計を使用して６５０ｎｍで決定される。

【0046】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を発現しない細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際に、少なくとも約１０倍、好ましくは約１０～１０００００倍高い効力を有する。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を発現しない細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際に、少なくとも１０倍、好ましくは１０～１０００００倍高い効力を有する。ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイまたはＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおけるＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）で決定される。ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおけるＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）で決定される。ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおけるＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）で決定される。

【0047】

ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の、本開示の多重特異性結合部位の効力は、同じ細胞を標的とする参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも低く、およびＴＧＦ－βＲＩＩとＰＤ－１の両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の、多重特異性結合部位の効力は、同じ細胞を標的とする参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも高く、ここで参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である。

【0048】

ある実施形態において、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞、刺激ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞、またはＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞であり；ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、または実質的に発現しない細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞であるか、またはＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞であり；および、ＴＧＦ－βＲＩＩと低レベルのＰＤ－１とを発現する細胞は、非刺激ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞であり、本明細書においてさらに説明される。

【0049】

ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩとＰＤ－１の両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の、本開示の多重特異性結合部位の効力は、参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも、少なくとも１０倍、好ましくは１０～１０００００倍高い。ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩとＰＤ－１の両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の、本開示の多重特異性結合部位の効力は、参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも、少なくとも約１０倍、好ましくは約１０～１０００００倍高い。ある実施形態において、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である。ある実施形態において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおけるＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）で決定される。

【0050】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、腫瘍体積を減少させる際に参照抗体の組合せよりも高い活性を有する。ある実施形態において、参照抗体の組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、ここでＰＤ－１を標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、および抗ＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

【0051】

従って本開示はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記多重特異性結合部位は、腫瘍体積を減少させる際に参照抗体の組合せよりも高い活性を有する、多重特異性結合部位をも提供する。ある実施形態において、多重特異性結合部位は、参照抗体の組合せの２価の単一特異性抗体の各々よりも、２倍低い～最大２０倍低い数のＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを投与される。例えば、ＰＤ－１への結合について１価でありかつＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について１価である多重特異性結合部位は、１ｍｇ／ｋｇで投与される場合、各々がＰＤ－１またはＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について２価でありかつ各々が１０ｍｇ／ｋｇで投与される参照抗体の組合せよりも、腫瘍体積を減少させる際に高い活性を有する。また、ＰＤ－１への結合について１価でありかつＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について１価である多重特異性結合部位は、１０ｍｇ／ｋｇで投与される場合、各々がＰＤ－１またはＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について２価でありかつ各々が１０ｍｇ／ｋｇで投与される参照抗体の組合せよりも、腫瘍体積を減少させる際に高い活性を有する。

【0052】

ある実施形態において、参照抗体の組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、ここでＰＤ－１を標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

【0053】

ある実施形態において、腫瘍体積を減少させる際の活性は、インビボマウス試験において、具体的にはＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片ｈｕＣＤ３４ ＮＳＧマウスを使用するインビボマウス試験において、腫瘍体積の減少を測定することにより決定される。

【0054】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、参照抗体の組合せの腫瘍体積の減少の、少なくとも１．５倍である、好ましくは１．５～１００倍、または２～８０倍、または５～８０倍、または１０～８０倍、または１５～８０倍、または２０～８０倍、または３０～８０倍、または４０～８０倍、または５０～８０倍、または２～６０倍、または５～６０倍、または１０～６０倍、または１５～６０倍、または２０～６０倍、または３０～６０倍、または４０～６０倍の間である、腫瘍体積の減少をもたらす。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、参照抗体の組合せの腫瘍体積の減少の、少なくとも約１．５倍である、好ましくはおおよそ１．５～１００倍、または２～８０倍、または５～８０倍、または１０～８０倍、または１５～８０倍、または２０～８０倍、または３０～８０倍、または４０～８０倍、または５０～８０倍、または２～６０倍、または５～６０倍、または１０～６０倍、または１５～６０倍、または２０～６０倍、または３０～６０倍、または４０～６０倍の間である、腫瘍体積の減少をもたらす。言い換えれば、本開示の多重特異性結合部位は、参照抗体の組合せよりも大きな腫瘍体積の減少をもたらす。ある実施形態において、参照抗体の組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、ここでＰＤ－１を標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

【0055】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、単剤として投与される場合に腫瘍体積を減少させる。

【0056】

従って本開示はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、前記多重特異性結合部位は、単剤として腫瘍体積の減少を誘導する、多重特異性結合部位を提供する。

【0057】

ある実施形態において、本開示は、例示的な多重特異性結合部位としていくつかのＰＤ－１×ＴＧＦ－βＲＩＩ二重特異性抗体を提供し、そのＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８および１９から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、そのＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；および８９から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、および、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの両方が、同じ軽鎖を含む。

【0058】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含む：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。

【0059】

本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域は、限られた数の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個などの、非保存的アミノ酸置換、または無制限の数の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

【0060】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインはまた、そのＰＤ－１結合ドメインバリアントをも含み、ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、１つまたは２つのＨＣＤＲのみが、多くとも３つ、２つ、または１つの非保存的アミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、そのようなバリアントは、ＨＣＤＲ３においてアミノ酸バリエーションを含まない。ある実施形態において、アミノ酸バリエーションは、保存的アミノ酸置換である。

【0061】

典型的には、保存的アミノ酸置換は、相同アミノ酸残基（類似の特徴または特性を共有する残基である）を有する、アミノ酸のバリエーションを含む。相同アミノ酸は、当該技術分野において既知であり、抗体の結合または機能に大きな影響を与えることなく抗体結合ドメインにおいてアミノ酸置換を行うための定型的な方法も同様である。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Nelson, David L., and Michael M. Cox. 2017. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th ed. New York, NY: W.H. Freeman）またはＳｔｒｙｅｒ（Berg, J., Tymoczko, J., Stryer, L. and Stryer, L., 2007. Biochemistry. New York: W.H. Freeman）のようなハンドブックを参照。アミノ酸が保存アミノ酸で置換されうるかどうかを決定する際に、評価は典型的には、以下のような要因について行われうるが、これらに限定されない：（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート状またはらせん状配座、（ｂ）標的サイトでの分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖（複数可）の大きさ。残基が類似の側鎖または類似の電荷または疎水性などの共通の特徴を有する残基で置換されうる場合、そのような残基が置換基として好ましい。例えば、以下のグループが決定されうる：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；および（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、アミノ酸は以下のようにグループ分けされうる：（１）芳香族：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）；（２）無極性：Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（３）脂肪族：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；（４）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（５）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）；および（６）極性：Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｙｒ（Ｙ）。あるいは、アミノ酸残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられうる：（１）疎水性：Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；（２）中性親水性：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）；（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）；および（６）芳香族：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）。

【0062】

あるアミノ酸残基を、同じグループに存在する別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。従って保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのあるメンバーを、その同じクラスの別のメンバーと交換することを含みうる。典型的には、バリエーションによって、意図した標的への結合ドメインの結合特異性が損なわれることは、ないかまたは実質的にない。

【0063】

アミノ酸バリエーションのさらなるタイプには、体細胞超変異または親和性成熟に起因するバリエーションを含む。本開示に包含されるＰＤ－１結合バリアントには、体細胞超変異または親和性成熟した重鎖可変領域を含み、これは本明細書において配列により記載される重鎖可変領域と同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖可変領域であり、バリアントは、１つ、２つ、または３つ全てのＨＣＤＲにおいて非保存的および／または保存的アミノ酸置換を含む、アミノ酸バリエーションを有する。抗体結合ドメインを親和性成熟するための定型的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＴａｂａｓｉｎｅｚｈａｄ Ｍら（Trends in therapeutic antibody affinity maturation: From in-vitro towards next-generation sequencing approaches. Immunol Lett. 2019 Aug;212:106-113）を参照。

【0064】

アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置の例には、ＨＣＤＲ１の第１、第２、および／または第４アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１３、第１４、および／または第１６アミノ酸；および／またはＨＣＤＲ３の第６および／または第１３アミノ酸を含むが、これらに限定されない。

【0065】

ある実施形態において、本開示は従ってまた、多重特異性結合部位を提供し、そのＰＤ－１結合ドメインは以下を含む：
－ アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＦＸ_３Ｓを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ_１は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、またはＨであってもよく；
Ｘ_２は、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＤであってもよく；
Ｘ_３は、Ｗ、またはＹであってもよい；
および／または
－ アミノ酸配列ＹＩＸ_１ＹＳＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＰＸ_７Ｘ_８ＫＸ_９を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ_１は、Ｙ、Ｖ、またはＩであってもよく；
Ｘ_２は、Ｓ、またはＧであってもよく；
Ｘ_３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｌ、またはＱであってもよく；
Ｘ_４は、Ｓ、またはＮであってもよく；
Ｘ_５は、Ｆ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ_６は、Ｎ、またはＳであってもよく；
Ｘ_７は、ＳまたはＡであってもよく；
Ｘ_８は、ＦまたはＬであってもよく；
Ｘ_９は、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＮであってもよい；
および／または
－ アミノ酸配列ＧＧＹＴＧＸ_１ＧＧＤＷＦＤＸ_２を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ_１は、Ｙ、Ｈ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ_２は、Ｐ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、またはＳであってもよい。

【0066】

アミノ酸バリエーションを導入するための他の適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第２、第３、第４、および／または第５アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第４、第５、第６、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、および／または第１７アミノ酸；および／またはＨＣＤＲ３の第１、第２、第６、第７、第９、第１０、第１４、第１５、第１６、および／または第１８アミノ酸を含むが、これらに限定されない。

【0067】

ある実施形態において、本開示は従ってまた、多重特異性結合部位を提供し、そのＰＤ－１結合ドメインは以下を含む：
－ アミノ酸配列ＲＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４を有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ_１は、Ｆ、またはＹであってもよく；
Ｘ_２は、Ｔ、Ａ、またはＶであってもよく；
Ｘ_３は、Ｍ、Ｌ、またはＶであってもよく；
Ｘ_４は、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＴであってもよい；
および／または
－ アミノ酸配列ＷＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ_１は、Ｎ、またはＤであってもよく；
Ｘ_２は、Ｐ、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ_３は、Ｎ、またはＱであってもよく；
Ｘ_４は、Ｔ、またはＤであってもよく；
Ｘ_５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｌ、またはＥであってもよく；
Ｘ_６は、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｈ、またはＦであってもよく；
Ｘ_７は、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ_８は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ_９は、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＦであってもよく；
Ｘ_１０は、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ_１１は、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＳであってもよく；
Ｘ_１２は、Ｆ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ_１３は、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｇであってもよく；
Ｘ_１４は、Ｇ、Ｎ、Ｅ、またはＤであってもよい；
および／または
－ アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＧＹＣＸ_３Ｘ_４ＤＸ_５ＣＹＰＮＸ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＸ_９を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ_１は、Ｉ、Ｓ、またはＶであってもよく；
Ｘ_２は、Ｌ、Ｑ、またはＮであってもよく；
Ｘ_３は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、またはＤであってもよく；
Ｘ_４は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、またはＥであってもよく；
Ｘ_５は、Ｎ、またはＩであってもよく；
Ｘ_６は、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｗ、Ａ、またはＬであってもよく；
Ｘ_７は、Ｉ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ_８は、Ｆ、Ｌ、またはＩであってもよく；
Ｘ_９は、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＬであってもよい。

【0068】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれらのバリアントを含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントを含む。

【0069】

本明細書において核酸またはアミノ酸配列に関する「パーセント（％）の同一性（Ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、最適な比較の目的のために配列をアライメントさせ（ａｌｉｇｎｉｎｇ）た後、選択された配列における残基と同一である候補配列における残基の百分率として規定される。２つの配列間のアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入されうる。そのようなアライメントは、比較される配列の全長にわたって行われうる。あるいはアライメントは、より短い長さにわたって、例えば約２０、約５０、約１００またはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって行われうる。配列同一性は、報告されたアライメント領域にわたる２つの配列間の同一一致の百分率である。

【0070】

配列の比較および２つの配列間の配列同一性の百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。当業者は、２つの配列をアライメントさせ、２つの配列間の同一性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を知っているであろう（Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1 -44 Addison Wesley）。２つのアミノ酸配列または核酸配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定されうる（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のために、アミノ酸および核酸配列の同一性パーセントを決定するために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用される（version 2.8.0, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. LongdenJ. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスとして使用される。ＤＮＡ配列については、ＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用されたパラメータは、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ－ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が１０、ギャップ延長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が０．５である。

【0071】

上述のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメント後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の百分率は、以下のように計算される：両配列において同一のアミノ酸または同一のヌクレオチドを示すアライメント中の対応する位置の数を、アライメント中のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で割ったもの。

【0072】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントを含み、これは、上述のＨＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。バリエーションは、例えば体細胞超変異または親和性成熟に起因する保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換などの、本明細書において記載される任意のタイプのアミノ酸バリエーションでありうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインバリアントは、ＣＤＲ領域においてバリエーションを含まないが、フレームワーク領域において１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＰＤ－１結合特異性を保持することが期待される。従って、ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む：
－ 配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0073】

本開示の多重特異性結合部位の結合ドメインは、共通の軽鎖を用いて、具体的にはＶＫ１－３９／ＪＫ１と呼ばれる共通の軽鎖を用いて、作製されている。本開示の多重特異性結合部位の結合ドメインは、当該技術分野において既知の共通の軽鎖を含むがこれらに限定されない、任意の適切な軽鎖を含みうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位の結合ドメインは、共通の軽鎖ＶＫ１－３９／ＪＫ１、または、限られた数の、例えば１つ、２つ、または３つなどの、非保存的アミノ酸置換、または無制限の数の保存的アミノ酸置換を抱える（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）、そのバリアントを含む。

【0074】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントを含む。

【0075】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインの軽鎖可変領域はまた、そのバリアントをも含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、アミノ酸バリエーションは、保存的アミノ酸置換である。

【0076】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントを含み、これは、上述のＬＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。バリエーションは、好ましくは保存的アミノ酸置換である。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインバリアントは、ＬＣＤＲ領域においてバリエーションを含まないが、フレームワーク領域において１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する。従って、ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む：
－ 配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；
この軽鎖可変領域は、配列番号４９に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５０に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５１に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0077】

これらのＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む、軽鎖または軽鎖可変領域は、例えば当該技術分野においてＶＫ１－３９／ＪＫ１と呼ばれる軽鎖でありうる。これは共通の軽鎖である。本開示に記載された「共通の軽鎖（ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」という用語は、複数の異なる重鎖、例えば異なる抗原またはエピトープ結合特異性を有する重鎖などと、対合可能である軽鎖を指す。共通の軽鎖は、例えば二重特異性または多重特異性抗体の作製において特に有用であり、全ての結合ドメインが同じ軽鎖を含む場合、抗体産生はより効率的になる。「共通の軽鎖」という用語は、同一であるか、またはアミノ酸配列にいくつかの差異を有するが、全長抗体の結合特異性に影響を与えない軽鎖を包含する。例えば、保存的アミノ酸変化、すなわち重鎖と対合したときに結合特異性に寄与しないか部分的にしか寄与しないことが知られているか示されている領域のアミノ酸の変化などを導入する、よく確立されたバリエーションを使用することにより、同一ではないが機能的にはなお同等である軽鎖を調製または見出すことは、本明細書で使用される共通の軽鎖の定義の範囲内で、例えば可能である。

【0078】

上述のＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む共通の軽鎖とは別に、当該技術分野において既知の他の共通の軽鎖が使用されうる。そのような共通の軽鎖の例には、以下を含むが、これらに限定されない：
ＶＫ１－３９／ＪＫ５は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む；
ＶＫ３－１５／ＪＫ１は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む；
ＶＫ３－２０／ＪＫ１は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６１、配列番号６２、および配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む；および
ＶＬ３－２１／ＪＬ３は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６５、配列番号６６、および配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。

【0079】

ＶＫ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９；ＩＧＫＶ１３９；ＩＧＫＶ１－３９；ＩｇＶκ１－３９としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５７４０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＶＫ１－３９のアミノ酸配列は、配列番号９３として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。適切なＶＪ領域配列は、ＶＫ１－３９／ＪＫ１（配列番号９４）およびＶＫ１－３９／ＪＫ５（配列番号９５）として示され；別名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。これらの名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。

【0080】

ＶＫ３－１５は、免疫グロブリン可変カッパ３－１５遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－１５；ＩＧＫＶ３１５；ＩＧＫＶ３－１５；ＩｇＶκ３－１５としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４４４３７である。ＶＫ３－１５のアミノ酸配列は、配列番号９８として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。適切なＶＪ領域配列は、ＶＫ３－１５／ＪＫ１（配列番号９９）として示され；別名は、Ｖκ３－１５＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。

【0081】

ＶＫ３－２０は、免疫グロブリン可変カッパ３－２０遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－２０；ＩＧＫＶ３２０；ＩＧＫＶ３－２０；ＩｇＶκ３－２０としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１７；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２３９９５１である。ＶＫ３－２０のアミノ酸配列は、配列番号１００として示される。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。適切なＶＪ領域配列は、ＶＫ３－２０／ＪＫ１（配列番号１０１）として示され；別名は、ＩｇＶκ３－２０＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。

【0082】

ＶＬ３－２１は、免疫グロブリン可変ラムダ３－２１遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンラムダ可変３－２１；ＩＧＬＶ３２１；ＩＧＬＶ３－２１；ＩｇＶλ３－２１としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５９０５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８７９６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１６６２．２である。ＶＬ３－２１のアミノ酸配列は、配列番号１０２として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。適切なＶＪ領域配列は、ＶＬ３－２１／ＪＬ３（配列番号１０３）として示され；別名は、ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。

【0083】

さらに、当該技術分野において利用可能なＰＤ－１抗体の任意の軽鎖可変領域が、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインと対合したとき抗原結合活性を示すことにより、例えば抗体ディスプレイライブラリなどから容易に入手されうる任意の他の軽鎖可変領域と同様に、使用されうる。

【0084】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含みうる。任意のＣＨ１ドメイン、具体的にはヒトＣＨ１ドメインが、使用されうる。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号６９として提供されるアミノ酸配列によって提供される。任意のＣＬドメイン、具体的にはヒトＣＬが、使用されうる。適切なＣＬドメインの例は、配列番号７５として提供されるアミノ酸配列によって提供される。

【0085】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含む：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。

【0086】

本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域は、限られた数の、例えば１つ、２つ、または３つなどの、非保存的アミノ酸置換、または無制限の数の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

【0087】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインはまた、そのＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインバリアントをも含み、ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、１つまたは２つのＨＣＤＲのみが、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、そのようなバリアントは、ＨＣＤＲ３においてアミノ酸バリエーションを含まない。ある実施形態において、アミノ酸バリエーションは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、本明細書においてさらに説明される。

【0088】

本開示に包含されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合バリアントには、体細胞超変異または親和性成熟した重鎖可変領域を含み、これは本明細書において配列により記載される重鎖可変領域と同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖可変領域であり、バリアントは、１つ、２つ、または３つ全てのＨＣＤＲにおいて非保存的および／または保存的アミノ酸置換を含む、アミノ酸バリエーションを有する。

【0089】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれらのバリアントを含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む。

【0090】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインはまた、ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインバリアントを含み、これは、上述のＨＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。バリエーションは、例えば体細胞超変異または親和性成熟に起因する保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換などの、本明細書において記載される任意のタイプのアミノ酸バリエーションでありうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインバリアントは、ＣＤＲ領域においてバリエーションを含まないが、フレームワーク領域において１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＴＧＦ－βＲＩＩ結合特異性を保持することが期待される。従って、ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む：
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号３９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号９０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－ 配列番号８８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－ 配列番号８９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号９０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0091】

当該技術分野において利用可能なＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の任意の軽鎖可変領域が、例えば本明細書において記載されているように、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと対合したとき抗原結合活性を示すことにより、例えば抗体ディスプレイライブラリなどから容易に入手されうる任意の他の軽鎖可変領域と同様に、使用されうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＰＤ－１結合ドメインと同一または実質的に同一の軽鎖を含む。

【0092】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントを含む。

【0093】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの軽鎖可変領域はまた、そのバリアントをも含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つの保存的または非保存的アミノ酸バリエーションを含んでもよい。ある実施形態において、アミノ酸バリエーションは、保存的アミノ酸置換である。

【0094】

ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含みうる。任意のＣＨ１ドメイン、具体的にはヒトＣＨ１ドメインが、使用されうる。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号６９として提供されるアミノ酸配列によって提供される。任意のＣＬドメイン、具体的にはヒトＣＬが、使用されうる。適切なＣＬドメインの例は、配列番号７５として提供されるアミノ酸配列によって提供される。

【0095】

従って本発明はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位を提供し、ＰＤ－１結合ドメインは、本明細書において記載されるように、重鎖可変領域を含み、および、軽鎖可変領域およびＣＨ１およびＣＬ領域を含んでもよい。ある実施形態において、多重特異性結合部位は、本明細書において記載されるように、重鎖可変領域を含み、および、軽鎖可変領域およびＣＨ１およびＣＬ領域を含んでもよい、ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインをさらに含む。

【0096】

従って本発明はまた、ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位を提供し、ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、本明細書において記載されるように、重鎖可変領域を含み、および、軽鎖可変領域およびＣＨ１およびＣＬ領域を含んでもよい。ある実施形態において、多重特異性結合部位は、本明細書において記載されるように、重鎖可変領域を含み、および、軽鎖可変領域およびＣＨ１およびＣＬ領域を含んでもよい、ＰＤ－１結合ドメインをさらに含む。

【0097】

ある実施形態において、本明細書で開示される任意のＰＤ－１結合ドメインは、本明細書で開示される任意のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、本開示の多重特異性結合部位を産生するために、組み合わされうる。従って本開示は、表１に示されるような例示的な多重特異性結合部位ＰＢ１～ＰＢ１８を提供する。

【0098】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0099】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0100】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0101】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0102】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0103】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0104】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0105】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0106】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0107】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0108】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲはアミノ酸バリエーションを含まない。

【0109】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0110】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0111】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0112】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0113】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0114】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0115】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0116】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0117】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0118】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0119】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ それぞれ配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ それぞれ配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、
および
ここでＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーション、例えば置換を含んでもよい。ある実施形態において、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲは、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0120】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0121】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0122】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0123】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0124】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0125】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0126】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0127】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0128】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0129】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0130】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲを含む。ある実施形態において、重鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0131】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0132】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0133】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0134】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0135】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0136】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0137】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0138】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0139】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0140】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0141】

一実施形態において、本開示は、以下を含む多重特異性結合部位を提供する：
－ 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメイン；
および
－ 配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはこれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まないＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを、それぞれ含む。ある実施形態において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各々は、アミノ酸バリエーションを含まない。

【0142】

本明細書においてさらに提供されるのは、本開示の多重特異性結合部位を産生するために有用な、核酸である。ある実施形態において、そのような核酸は、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む。ある実施形態において、本開示の核酸は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の核酸は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書において記載される共通の軽鎖可変領域でありうる。

【0143】

本明細書においてさらに提供されるのは、本開示の多重特異性結合部位を産生するために有用な本開示の核酸を含む、ベクターである。ある実施形態において、そのようなベクターは、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む。ある実施形態において、本開示のベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示のベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書において記載される共通の軽鎖可変領域でありうる。

【0144】

本開示はまた、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列、例えばベクターと、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、細胞をも提供する。ある実施形態において、本開示の細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列、例えばベクターをさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１つの核酸配列、例えばベクターをさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書において記載される共通の軽鎖可変領域でありうる。

【0145】

本開示はまた、本明細書において記載される多重特異性結合部位を産生する、細胞をも提供する。ある実施形態において、そのような細胞は、本開示の核酸、例えばベクターを用いて形質転換された、組換え細胞でありうる。ある実施形態において、本開示の細胞は、本明細書において記載されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列、例えばベクターと、本明細書において記載されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む。ある実施形態において、本開示の細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列、例えばベクターをさらに含む。ある実施形態において、本開示の細胞は、軽鎖可変領域、具体的には本明細書において記載される軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１つの核酸配列、例えばベクターをさらに含む。

【0146】

本開示は、本明細書において記載される多重特異性結合部位を産生する細胞を、さらに提供する。

【0147】

ある実施形態において、本開示は、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位を含み、および薬学的に許容される担体を含んでもよい、医薬組成物を提供する。

【0148】

ある実施形態において、本開示は、治療に使用するための、本明細書において記載される多重特異性結合部位、および本明細書において記載される医薬組成物を、提供する。

【0149】

ある実施形態において、本開示は、癌の治療に使用するための、本明細書において記載される多重特異性結合部位、または本明細書において記載される医薬組成物を、提供する。

【0150】

ある実施形態において、本開示は、疾患を治療するための方法であって、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位、または本明細書において記載される医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む、方法を提供する。

【0151】

ある実施形態において、本開示は、癌を治療するための方法であって、有効量の本明細書において記載される多重特異性結合部位、または本明細書において記載される医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む、方法を提供する。

【0152】

本明細書で使用される「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、互換的に使用され、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物を、具体的には癌を有するヒト対象を指す。

【0153】

本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患またはその症状を治癒または改善する目的で、または肯定的な治療反応を生む目的で、対象に対して行われる任意のタイプの介入または過程、または、活性薬剤または活性薬剤の組合せを対象へ投与することを指す。本明細書で使用される「肯定的な治療反応（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、有益な効果を、例えば、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候を逆転させ、緩和し、改善し、阻害し、または減速させる効果、および、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の、発症、進行、進展、重症化または再発を予防する効果、例えば癌などの疾患または障害の少なくとも１の症状の改善などの効果を生む、治療を指す。有益な効果は、ベースラインに対する改善の形をとることができ、本方法に従った治療の開始前に行われた測定または観察に対する改善を含む。例えば、有益な効果は、疾患の臨床的または診断的症状の、または癌のマーカーの、減少または消失によって証明されるように、任意の臨床段階において、対象における癌の進行を遅らせ、安定化し、停止し、または逆転させる形をとることができる。有効な治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、循環腫瘍細胞の存在の減少、腫瘍の転移の減少または予防、腫瘍増殖の遅延または阻止、および／または、腫瘍の再発または再燃の予防または遅延でありうる。

【0154】

「治療量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、癌などの疾患を治療する薬剤または薬剤の組合せの量を指す。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の進展を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の再発を予防または遅延させるのに十分な量である。

【0155】

本明細書で使用される、有効量の薬剤または組成物は、例えば以下のことをしうるものである：（ｉ）癌細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍の大きさを減少させる；（ｉｉｉ）癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し、妨害し、ある程度遅らせ、および停止する；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させる；および／または（ｖｉｉ）癌に関連する１または複数の症状をある程度除去する。

【0156】

有効量は、治療される個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、および、個体における所望の反応を誘発する薬剤または薬剤の組合せの能力などの因子に従って、変化してもよく、これは通常の技術を有する医師または他の医療従事者により容易に評価されうる。

【0157】

有効量は、１または複数回投与で、対象へ投与されうる。

【0158】

有効量はまた、薬剤または薬剤の組合せによる任意の毒性または有害な効果と、有益な効果とのバランスをとる量をも含みうる。

【0159】

「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、治療上の活性物質を指し、本件の場合、本開示の多重特異性結合部位、または本開示の医薬組成物を指す。

【0160】

本明細書で使用される「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その単語の後に続く項目が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）が、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。

【0161】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１または複数を指すために、本明細書で使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１または複数の要素を意味する。

【0162】

本明細書における特許文書または他の事項への言及は、その文書または事項が公知であったこと、またはそれが含む情報が請求項のいずれかの優先日における技術常識の一部であったことを、認めるものとして受け取られるべきではない。

【0163】

本明細書中で引用される全ての特許および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0164】

なお本明細書において、特に断りのない限り、抗体または抗体フラグメントの可変領域においてＣＤＲおよびフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングに従って特定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991）参照）。定常領域におけるアミノ酸は、ＥＵナンバリングシステムに従って示される。

【0165】

アクセッション番号は主に、標的を同定するさらなる方法を提供するために与えられ、結合するタンパク質の実際の配列は、例えばいくつかの癌などで起こるようなコード遺伝子における変異のために、変化しうる。本開示の多重特異性結合部位の抗原結合サイトは、いくつかの抗原陽性の免疫細胞または腫瘍細胞により発現されるものなど、抗原およびその様々なバリアントと結合しうる。ＨＧＮＣとは、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の略である。略語に続く番号は、アクセッション番号であり、その番号で遺伝子および遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＨＧＮＣデータベースから検索できる。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは、アクセッション番号または遺伝子ＩＤを提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースから検索できる。Ｅｎｓｅｍｂｌは、アクセッション番号を提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベースから入手できる。Ｅｎｓｅｍｂｌは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩとＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの共同プロジェクトであり、選択された真核生物ゲノムについて、自動アノテーションを作成および維持するソフトウェアシステムを開発している。

【0166】

本明細書において遺伝子またはタンパク質に言及する場合、好ましくはその遺伝子またはタンパク質のヒト型に言及する。本明細書において遺伝子またはタンパク質に言及する場合、天然の遺伝子またはタンパク質、および、腫瘍、癌などにおいて検出されうる、好ましくはヒト腫瘍、癌などにおいて検出されうる、遺伝子またはタンパク質のバリアント型の、両方に言及する。

【0167】

［条項］
１． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、
および
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、
多重特異性結合部位。

【0168】

２． 条項１に記載された多重特異性結合部位であって、
活性化Ｔ細胞において、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、
および
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、
多重特異性結合部位。

【0169】

３． 条項１または２に記載された多重特異性結合部位であって、
活性化腫瘍特異的Ｔ細胞において、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、
および
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する、
多重特異性結合部位。

【0170】

４． ＰＤ－１に特異的に結合するＦａｂドメインと、ＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合するＦａｂドメインとを含む、
多重特異性結合部位。

【0171】

５． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に特異的に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域からなる、
多重特異性結合部位。

【0172】

６． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力を有する、
多重特異性結合部位。

【0173】

７． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力を有する、
多重特異性結合部位。

【0174】

８． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、腫瘍体積を減少させる際に参照抗体の組合せよりも高い活性を有し、
参照抗体の前記組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、
ＰＤ－１を標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、
多重特異性結合部位。

【0175】

９． 条項８に記載された多重特異性結合部位であって、
腫瘍体積を減少させる際の前記活性は、インビボマウス試験において、具体的にはＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片ｈｕＣＤ３４ ＮＳＧマウスを使用するインビボマウス試験において、腫瘍体積の減少を測定することにより決定される、
多重特異性結合部位。

【0176】

１０． 条項８または９に記載された多重特異性抗体またはそのバリアントであって、
ここで、腫瘍体積を減少させる際のより高い活性とは、参照抗体の前記組合せの腫瘍体積の減少の、少なくとも約１．５倍の、好ましくは約１．５～１００倍の、腫瘍体積の減少である、
多重特異性結合部位。

【0177】

１１． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、活性化Ｔ細胞である、
多重特異性結合部位。

【0178】

１２． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、活性化腫瘍特異的Ｔ細胞である、
多重特異性結合部位。

【0179】

１３． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、または実質的に発現しない前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞である、
多重特異性結合部位。

【0180】

１４． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、活性化ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する前記細胞は、非活性化ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋細胞である、
多重特異性結合部位。

【0181】

１５． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞であり、
および
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β細胞である、
多重特異性結合部位。

【0182】

１６． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【0183】

１７． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、アイソジェニックＰＤ－１－ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【0184】

１８． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的にか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、少なくとも約２００倍、または５００倍、または１０００倍、または５０００倍、または１００００倍、または１５０００倍、または２００００倍、または３００００倍、または約２００～３００００倍、または５００～３００００倍、または１０００～３００００倍、または５０００～３００００倍、または１００００～３００００倍、または２００～２００００倍、または２００～１５０００倍高い、
多重特異性結合部位。

【0185】

１９． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を全く発現しない細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも低く、
および
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも高く、
前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である、
多重特異性結合部位。

【0186】

２０． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも、少なくとも約１００倍または２００倍、好ましくは約１００～２００００倍、または１００～１５０００倍、または１００～１２０００倍、または２００～２００００倍、または２００～１５０００倍、または２００～１２０００倍高い、
多重特異性結合部位。

【0187】

２１． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、Ｆａｂドメインである
多重特異性結合部位。

【0188】

２２． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、二重特異性抗体である
多重特異性結合部位。

【0189】

２３． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＩｇＧ１二重特異性抗体である
多重特異性結合部位。

【0190】

２４． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは各々、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、
多重特異性結合部位。

【0191】

２５． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、同じ軽鎖を含む
多重特異性結合部位。

【0192】

２６． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0193】

２７． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0194】

２８． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0195】

２９． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0196】

３０． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【0197】

３１． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み；
ここで前記ＬＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0198】

３２． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【0199】

３３． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0200】

３４． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【0201】

３５． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み；
ここで前記ＬＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【0202】

３６． 前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【0203】

３７． ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１および／またはＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について、前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位と競合する、
多重特異性結合部位。

【0204】

３８． 有効量の前記条項のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物。

【0205】

３９． 治療に使用するための、条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物。

【0206】

４０． 抑制された免疫系に関連する疾患の治療に使用するための、条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物。

【0207】

４１． 癌の治療に使用するための、条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物。

【0208】

４２． 抑制された免疫系に関連する疾患の治療に使用する薬物の製造のための、条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物の使用。

【0209】

４３． 癌の治療に使用する薬物の製造のための、条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物の使用。

【0210】

４４． 疾患を治療するための方法であって、
有効量の条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物を、それを必要とするヒト対象へ投与するステップを含む
方法。

【0211】

４５． 抑制された免疫系に関連する疾患を治療するための方法であって、
有効量の条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物を、それを必要とするヒト対象へ投与するステップを含む
方法。

【0212】

４６． 癌を治療するための方法であって、
有効量の条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または条項３８に記載された医薬組成物を、それを必要とするヒト対象へ投与するステップを含む
方法。

【0213】

４７． 条項２８または３０において規定されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、条項２９または３４において規定されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
細胞。

【0214】

４８． 条項４７に記載された細胞であって、
前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
細胞。

【0215】

４９． 条項４７または４８に記載された細胞であって、
前記細胞は、軽鎖可変領域、具体的には条項３４または３５において規定される軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
細胞。

【0216】

５０． 条項１～３７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位を産生する、細胞。

【0217】

［図面の簡単な説明］
以下のように、本明細書では以下の命名規則が使用される。図において、２価の単一特異性抗体は、配列番号Ａ／配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号Ａは両結合ドメインの重鎖を指し、配列番号Ｂは両結合ドメインの軽鎖を指す。

【0218】

２価の二重特異性抗体は、配列番号Ａ×配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号ＡおよびＢの両方は、重鎖可変配列を指す。二重特異性抗体の各結合ドメインは、同じ軽鎖を含む。

【0219】

２価の単一特異性参照抗体ペムブロリズマブ、ニボルマブ、およびＴＧＦ１アナログは、配列番号Ａ／配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号Ａはそれぞれの重鎖配列を指し、配列番号Ｂはそれぞれの軽鎖配列を指す。ペムブロリズマブおよびＴＧＦ１アナログの組合せは、配列番号Ａ／配列番号Ｂ＋配列番号Ｃ／配列番号Ｄのフォーマットで示され、配列番号ＡはペムブロリズマブまたはＴＧＦ１アナログのいずれかの重鎖配列を指し、配列番号ＢはペムブロリズマブまたはＴＧＦ１アナログのいずれかの軽鎖配列を指し、配列番号Ｃは他方の重鎖配列を指し、配列番号Ｄは他方の軽鎖配列を指す。

【0220】

参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログは、Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａのアナログであり、配列番号Ａ／配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号Ａは、ＴＧＦ－βＲＩＩの（Ｇ_４Ｓ）_４Ｇリンカーと細胞外ドメインとを含む重鎖配列を指し、配列番号Ｂは、軽鎖配列を指す。参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログは、２つのＰＤ－Ｌ１結合ドメインと２つのＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインとを含む。

【実施例】

【0221】

本開示を説明するために使用されるが、いかなる意味においても本開示を限定することを意図しない実施例において、二重特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域可変領域と、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む。二重特異性抗体は好ましくは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、いかなる意味においても本開示を限定することを意図しない実施例において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含み；および、ＴＧＦ－ＲＩＩ結合重鎖は、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。

【0222】

実施例において使用された参照抗体および分子、および対照抗体は、以下を含む：
－ 参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブアナログは、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である。
－ 参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ製、Ｍｙｏｎｅｘ配給）。
－ 参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１は、ＴＧＦ１の２価の単一特異性アナログであり、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖とを含む。
－ 参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子は、ＰＤ－Ｌ１への結合について２価の単一特異性のＢｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａのアナログであり、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖と、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖とを含み、配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインが、（Ｇ_４Ｓ）_４Ｇリンカーを通じて各重鎖のＣ末端に連結されている。
－ 陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ－Ｇ）は、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖と、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体である。
－ 対照ＴＧＦ－βＲＩＩ×ＲＳＶ抗体は、以下を含む２価の二重特異性抗体である：配列番号２３、３１、３９、２７、３５、または４３に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメイン；配列番号８６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、ＲＳＶ結合ドメイン；および、配列番号４８に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号７５に示される軽鎖定常領域アミノ酸配列とを含む、共通の軽鎖。
－ 陽性対照ＬＩＬＲＢ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号３３８７１４）。
－ 市販の参照ＰＤ－１抗体オプジーボ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）製）。

【0223】

［実施例１ － ＰＤ－１×ＴＧＦ－βＲＩＩ二重特異性抗体の作製］
ヒトＰＤ－１への結合特異性を有する結合ドメイン、抗体、および重鎖可変領域、および、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合特異性を有する重鎖可変領域は、共通のＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）を、ヒトＰＤ－１またはＴＧＦ－βＲＩＩ抗原部位で免疫化する（ＤＮＡ、タンパク質、および細胞ベースの抗原送達の様々な形の使用を含む）ことにより、得られた。

【0224】

配列番号１；５；９；１３；１４；１８；および１９に示されるアミノ酸配列を有するヒトＰＤ－１への結合特異性を有する重鎖可変領域、および、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；および８９に示されるアミノ酸配列を有するヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合特異性を有する重鎖可変領域が、二重特異性抗体の産生のために選択された。本明細書における結合ドメイン配列は、本明細書で提供される技術を通じて特性評価され配列が決定されると、その後、当該技術分野において既知の任意の方法によって得られうる。

【0225】

【0226】

二重特異性ＩｇＧ抗体は、一方はＰＤ－１結合ＶＨ領域を有するＩｇＧ重鎖をコードし、もう一方はＴＧＦ－βＲＩＩ結合ＶＨ領域を有するＩｇＧ重鎖をコードする、２つのプラスミドベクターを、一時的に同時トランスフェクトすることにより、作製された。ＷＯ２０１３／１５７９５４およびＷＯ２０１３／１５７９５３に記載されるＣＨ３工学技術が採用され、効率的なヘテロ二量体化および二重特異性抗体の形成が保証された。両ベクターは、ＩＧＫＶ１－３９／Ｊｋ１軽鎖可変領域を含む共通の軽鎖を、さらにコードする。細胞トランスフェクション、細胞培養、および抗体の採取と精製は、当該技術分野において既知の方法により行われた。

【0227】

［実施例２ － ＰＤ－１－ＳＨＰリクルートメントアッセイ］
二重特異性抗体は、ＰＤ－１－ＳＨＰリクルートメントアッセイで特性評価され、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害し、それによりＴ細胞におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する能力を決定した。ＰＤ－１－ＳＨＰリクルートメントアッセイは、酵素供与体（ＥＤ）タグ付きＰＤ－１受容体（例えばＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）を発現するように操作されたＵ２０Ｓ細胞と、ＰＤ－１を発現しかつ酵素受容体（ＥＡ）融合ＳＨＰ１を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とを含む、２つの細胞系を含む。リガンドまたはアゴニスト抗体誘導ＰＤ－１によるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化により、ＳＨＰ１がリクルートされ、ＥＤとＥＡが相互作用し、活性β－ｇａｌ酵素が再構成される。再構成されたβ－ｇａｌは、基質存在下で化学発光シグナルを生成する。

【0228】

抗体試料には、いくつかの二重特異性抗体、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブアナログ、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、および参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログを含んだ。

【0229】

Ｕ２ＯＳ／ＰＤ－Ｌ１細胞（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１０％ＦＢＳ＋０．２５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、維持された。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＳＨＰ細胞（Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ；ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１０％ＦＢＳ、２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、培養された。Ｕ２ＯＳ／ＰＤ－Ｌ１細胞およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＳＨＰ細胞の両方は、まずコニカルチューブ中で遠心分離されて培養培地を除去し、その後洗浄され、細胞プレーティングの前にアッセイ培地（１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて再懸濁された。Ｕ２ＯＳ／ＰＤ－Ｌ１細胞は、３８４ウェルの黒色透明底アッセイプレート（ＣＥＬＬＣＯＡＴ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅｓ、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に、１ウェルあたり５０００細胞ずつ、２０μＬのアッセイ培地中に加えられた。抗体試料は、１％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に連続希釈により調製され、５μＬ／ウェルが細胞プレートへ移され、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートされた。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＳＨＰ細胞は、細胞プレートに、１ウェルあたり５０００細胞ずつ、２０μＬのアッセイ培地中に加えられ、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートされた後、各ウェルに２．５μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ試薬１（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が加えられた。アッセイプレートはその後、３５０ｒｐｍで１分間振とうされ、室温で１５分間暗所に保たれた後、１０μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ試薬２（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が加えられた。化学発光シグナルは、室温で１時間インキュベートした後、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて記録された。ＰＢＳのみを含むウェルは陽性対照として用いられ、細胞を含まないウェルは陰性対照として使用された。ＩＣ_５０の決定は、対照活性パーセント対化合物濃度の対数の曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを使用してフィッティングすることにより、行われた。

【0230】

結果は表２および図１に示される。全ての二重特異性抗体は、ＰＤ－１媒介ＳＨＰリクルートメントを阻害した。ＰＤ－１結合について１価である多くの二重特異性抗体は、ＰＤ－１－ＳＨＰリクルートメントアッセイにおいて、２価の単一特異性参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブアナログ、およびＰＤ－Ｌ１結合について２価である参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子と、等効力である。

【0231】

【0232】

［実施例３ － ＰＤ－１－ＮＦＡＴレポーターアッセイ］
二重特異性抗体は、ＰＤ－１－ＮＦＡＴレポーターアッセイで特性評価され、活性化Ｔ細胞におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する能力を決定した。ＰＤ－１－ＮＦＡＴレポーターアッセイは、ＴＣＲ同族タンパク質を共発現するＰＤ－Ｌ１^＋ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞と、ＮＦＡＴ－ＲＥシスエレメントの制御下でルシフェラーゼレポーターを駆動するＰＤ－１^＋エフェクターＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とを有する、２つのトランスジェニック細胞株系を含む。エフェクターＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、抗原非依存的にＴＣＲシグナル伝達を活性化する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、ＴＣＲ媒介発光を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害は、ＴＣＲシグナル伝達を可能にし、それにより基質を加えることにより検出可能な発光を誘導する。

【0233】

抗体試料には、いくつかの二重特異性抗体、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブアナログ、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、および参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログを含んだ。

【0234】

ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（人工抗原提示細胞）／ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）－Ｋ１細胞；Ｐｒｏｍｅｇａ）は、１０％ＦＢＳ、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた、Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、維持された。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴエフェクター細胞（活性化Ｔ細胞核内因子；Ｐｒｏｍｅｇａ）は、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、培養された。ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴエフェクター細胞の両方は、まず遠心分離されて培養培地を除去し、その後洗浄され、細胞プレーティングの前にアッセイ培地（１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて再懸濁された。ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、３８４ウェルの白色透明底アッセイプレート（ＣＥＬＬＣＯＡＴ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅｓ、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に、１ウェルあたり８０００細胞ずつ、１０μＬのアッセイ培地中に加えられた。抗体試料は、１％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に連続希釈により調製され、５μＬ／ウェルが細胞プレートへ移された。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴエフェクター細胞は、各ウェルに、１ウェルあたり１００００細胞ずつ、５μＬのアッセイ培地中に分注された。アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートされた。アッセイプレートは室温に１５分間平衡化された後、２０μＬ／ウェルのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）が加えられた。室温で８分間インキュベートした後、発光はＰｈｅｒａｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて読み取られた。ＰＢＳを含むウェルは陰性対照（０％誘導）として用いられ、１２．５ｕｇ／ｍＬのペムブロリズマブアナログを含むウェルは陽性対照（１００％誘導）として使用された。ＥＣ_５０の決定は、対照活性パーセント対化合物濃度の対数の曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを使用してフィッティングすることにより、行われた。

【0235】

結果は表３および図２に示される。全ての二重特異性抗体は、ＰＤ－１媒介Ｔ細胞阻害を阻害した。ＰＤ－１結合について１価である多くの二重特異性抗体は、ＰＤ－１－ＮＦＡＴレポーターアッセイにおいて、２価の単一特異性参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブアナログと、等効力である。

【0236】

【0237】

［実施例４ － Ｊｕｒｋａｔリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイ］
二重特異性抗体は、Ｊｕｒｋａｔリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイで特性評価され、Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する能力を決定した。Ｊｕｒｋａｔリン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞における二重特異性抗体の活性を比較し、二重特異性抗体が、ＴＧＦ－β誘導ＳＭＡＤ２／３リン酸化を、ＰＤ－１に相関する形で阻害するかどうかを決定した。参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、ＴＧＦ－βＲＩＩ×ＲＳＶ二重特異性抗体、および配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む陰性対照２価単一特異性ＩｇＧ１抗体が、対照抗体として含まれた。

【0238】

ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中のＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞（ＡＴＣＣ カタログ番号ＴＩＢ－１５２）およびＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号ＣＳ１８７１０５）が、９６ウェルの平底プレートに播種された。ＰＤ－１の発現は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞では検出されなかった；Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞におけるＰＤ－１分子の数は、ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ法を使用して約４０００と決定された。二重特異性抗体および対照抗体は、６段階連続希釈（１００μｇ／ｍｌ～０．００１μｇ／ｍｌ）で加えられ、細胞は３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートされた。１時間後、ヒト組換えＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号７７５４－ＢＨ）が最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで加えられ、細胞は３７℃／５％ＣＯ_２でさらに２時間インキュベートされた。インキュベート後、細胞はＰＢＳを用いて穏やかに洗浄された。細胞ライセートは、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ＃ Ｐ００４４およびＰ－５７２６）とプロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃ ８７７８５）とを含む溶解バッファー（ＭＳＤ＃ Ｒ６０ＴＸ－２）を使用して、調製された。試料は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ＃ ２３２２７）を使用して、総タンパク質で正規化された。リン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルは、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃１２００１）を使用して、決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．２．０）が、グラフをプロットするために使用された。

【0239】

結果は、表４、５、および６、および図３に示される。表６は、１０の二重特異性抗体のＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞対Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際の、効力の倍数差を示す。このアッセイにおいて、二重特異性抗体の倍数差は、参照抗体ＴＧＦ１のアナログの倍数差よりも２００倍～１１０００倍高い。

【0240】

全ての二重特異性抗体は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞の両方において、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害した。二重特異性抗体は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞においてＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際に、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞においてよりも高い効力があり、それらがＴＧＦ－β誘導ＳＭＡＤ２／３リン酸化を、ＰＤ－１発現に相関する形で阻害することを示している。全ての二重特異性抗体は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^ｎｕｌｌ細胞においてＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害するために、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログよりも高い濃度を必要とする。ＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について１価である多くの二重特異性抗体は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１^＋細胞においてＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際に、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１の２価の単一特異性アナログよりも優れている。

【0241】

【0242】

【0243】

【0244】

［実施例５ － 刺激および非刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いた、リン酸化ＳＭＡＤ２アッセイ］
二重特異性抗体は、リン酸化ＳＭＡＤ２アッセイで特性評価され、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞においてＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する際の特異性を決定した。リン酸化ＳＭＡＤ２アッセイでは、低レベルのＰＤ－１を発現している非刺激Ｔ細胞と、高レベルのＰＤ－１を発現している刺激Ｔ細胞とにおける、二重特異性抗体の活性を比較し、二重特異性抗体が、ＴＧＦ－β誘導ＳＭＡＤ２リン酸化を、ＰＤ－１発現に相関する形で阻害するかどうかを決定した。参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、および配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む陰性対照２価単一特異性ＩｇＧ１抗体が、それぞれ陽性対照および陰性対照として含まれた。

【0245】

健康なドナーからのＰＢＭＣは、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ ５５５３３６）を用いて４８時間刺激され、続いて１６時間血清除去（０．１％ＦＢＳ）された。活性化ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１分子の数は、ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ法を使用して、約１０００～２０００と決定された。その後、刺激および非刺激ＰＢＭＣは、二重特異性抗体および対照抗体と共に、室温で３０分間インキュベートされた。組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７７５４－ＢＨ）が最終濃度１ｎｇ／ｍｌで加えられ、細胞はさらに３０分間インキュベートされた。最後に、細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄され、細胞表面マーカーを染色され、続いて細胞内リン酸化ＳＭＡＤ２染色された。

【0246】

フローサイトメトリーのための染色には、以下の抗体が使用された：ヒトＣＤ４５（クローン：ＨＩ３０；カタログ５５７７４８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトＣＤ１１ｂ（クローン：Ｍ１／７０；カタログ＃ ５６３０１５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトＣＤ３（クローン：ＵＣＨＴ１；カタログ＃ ５６５４９１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトＣＤ４（クローン：ＳＫ３；カタログ＃ ５６３５５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトＣＤ８（クローン＃ＳＫ１、カタログ＃ ３４４７１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびヒトリン酸化ＳＭＡＤ２（カタログ＃５６５３２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体。分析中に死細胞を除外するために、死細胞染色色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃ ４２３１１４）が使用された。細胞取得は、ＤＩＶＡソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３の下で行われた。

【0247】

ＰＢＭＣは、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａを使用して、大きさおよび粒度に基づいてゲートされ、破片を除外した。その後、固定可能な死細胞染色色素を使用して、死細胞が除外された。ＣＤ４５陽性細胞が選択され、続いてＣＤ１１ｂ陰性およびＣＤ３陽性Ｔ細胞が選択された。最後に、ＣＤ４およびＣＤ８陽性サブセットがゲートされ、リン酸化ＳＭＡＤ２シグナルが、これらのサブセット上の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）で測定された。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行われ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．２．０）が、グラフをプロットするために使用された。

【0248】

結果は図４に示される。全ての二重特異性抗体は、刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害した。一方のドナー（ドナーＢ）では、二重特異性抗体は、非刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害しなかった。他方のドナーでは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＰＤ－１重鎖可変領域と配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ－βＲＩＩ重鎖可変領域とを含む二重特異性抗体は、非刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害せず、および、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＰＤ－１重鎖可変領域と配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ－βＲＩＩ重鎖可変領域とを含む二重特異性抗体は、非刺激ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞において、刺激ＣＤ４^＋ＴおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞においてよりも有意に低い効力で、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害した。これらのデータは、二重特異性抗体が、ＴＧＦ－β誘導ＳＭＡＤリン酸化を、ＰＤ－１発現に相関する形で阻害するという、実施例４の所見を確認する。

【0249】

［実施例６ － 疲弊混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ］
二重特異性抗体は、疲弊混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで特性評価され、疲弊Ｔ細胞によってサイトカイン産生を誘導する際のその効力を決定した。

【0250】

抗体試料には、いくつかの二重特異性抗体、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、および参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログとの組合せを含んだ。

【0251】

ヒトＰＢＭＣは、健康なドナーから単離された。インビトロでのＴ細胞疲弊は、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によるＰＢＭＣの活性化を６日間繰り返すことによって行われた。全Ｔ細胞は、Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃ １７９５１）を使用して、製造者の指示に従って単離された。Ｔ細胞は、異なるドナーからの樹状細胞（ＤＣ）と、１０：１のＴ細胞ＤＣ比で、９６ウェルのＵ底プレート中で、混合された。抗体試料の連続希釈液が加えられ、プレートは３７℃／５％ＣＯ_２で、さらに６日間インキュベートされた。６日後、上澄み中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはＴＮＦ－αサイトカインレベルが、カスタムＭＳＤキットを使用して測定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．２．０）が、グラフをプロットするために使用された。

【0252】

各５人のドナーを用いた２つの実験からの代表的な結果が、図５Ａ、Ｃ、およびＤに示される。３人のドナーを用いたさらなる実験からの結果が、図５ＢおよびＥに示される。ほとんどの二重特異性抗体は、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログ、または参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１との組合せと、同様のレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはＴＮＦ－αを誘導した。初期研究からの多くの二重特異性抗体のＩＣ_５０値が、表７に示される。

【0253】

【0254】

［実施例７ － ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイ］
二重特異性抗体は、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＰＤ－１ ＴＧＦ－βレポーターアッセイで特性評価され、Ｔ細胞においてＴＧＦ－β誘導シグナル伝達を阻害する際のその効力を決定した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞またはＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞をＴＧＦ－βを用いて刺激すると、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達経路の活性化が誘導され、ＳＥＡＰの産生を誘導するＳｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体の形成に至る。

【0255】

使用された試薬：組換えヒトＴＧＦ－ベータ１（ヒト細胞発現）タンパク質、Ｒ＆Ｄ、カタログ＃ ７７５４－ＢＨ。増殖培地：ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；５６℃で３０分）、１００μｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍｌ－１００μｇ／ｍｌ）。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞のためのピューロマイシン０．４ｕｇ／ｍＬを含む増殖培地。試験培地：ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１％熱不活性化ＦＢＳ、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍｌ－１００μｇ／ｍｌ）。Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、ブラストサイジン、ハイグロマイシンＢ、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）は含まない。

【0256】

安定なＰＤ－１発現ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞株は、以下のように作製された：ＰＤ－１の全長ｃｄｓが、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターｐＤ２５２９－ＥＦＭ（ＡＴＵＭ）内に挿入された。プロモーターは、修飾ＥＦ１ａである。ベクター構築は、ＡＴＵＭによって行われ、配列が確認された。ベクターマップは図１０を参照。ＰＤ－１発現が検出されないＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、製造者のプロトコルに従ってトランスフェクトされた。安定的にトランスフェクトされた細胞は、０．４ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β培地中で選択された。クローンは限界希釈によって単離され、ＰＤ－１発現についてウェスタンブロットによって特性評価された。１つのクローンが、以下に基づいて選択された：１）その安定かつ均一な表面ＰＤ－１発現（ヒストグラムプロットにおいて１つのピーク）；２）親ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞株と比較して、同様の表面ＴＧＦ－βＲＩＩ発現を有する；および３）レポーターアッセイにおいて、参照抗体ＴＧＦ１と同様のＥＣ５０を有する。選択されたクローンにおけるＰＤ－１のＧＭＦＩは、３２７２であったのに対し、親細胞株では５、アイソタイプ対照では８であった。これらの細胞上のＰＤ－１分子の数は、ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ法を使用して約２００００と決定された。

【0257】

抗体試料には、いくつかの二重特異性抗体、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、および参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログを含んだ。

【0258】

ＴＧＦ－βＲＩＩを発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｈｋｂ－ｔｇｆｂ）、またはＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－β－ＰＤ－１^＋細胞は、９６ウェルの平底プレートに、１ウェルあたり２５０００細胞ずつ、試験培地中に播種された。抗体試料の連続希釈液が加えられ、細胞は室温で１時間インキュベートされた；続いてヒト組換えＴＧＦ－β１が、最終濃度１ｎｇ／ｍｌで加えられた。細胞は３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートされた。インキュベート後、４０ｕｌの上澄みが、各ウェルから新しい平底９６ウェルプレート内に移され；１６０ｕｌの再懸濁ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液が、上澄みに加えられた。プレートは３７℃／５％ＣＯ_２で４０分間インキュベートされた。上澄み中に分泌されたＳＥＡＰの量は、ＳＥＡＰ検出試薬であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を使用して、評価された。ＳＥＡＰレベルは、分光光度計を使用して６５０ｎｍで決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．２．０）が、グラフをプロットするために使用された。

【0259】

結果は図６および表８に示される。多くの二重特異性抗体は、ＰＤ－１発現に相関する形で、ＴＧＦ－β誘導シグナル伝達を強力に阻害する効力を示す。

【0260】

【0261】

［実施例８ － Ｔｒｅｇ抑制アッセイ］
二重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ抑制アッセイで特性評価され、制御性Ｔ細胞の抑制効果を除去または減少させ、それによりＴ細胞によるサイトカイン産生を誘導する能力を決定した。

【0262】

抗体試料には、いくつかの二重特異性抗体、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、および参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログとの組合せを含んだ。

【0263】

ヒトＰＢＭＣは、健康なドナーからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって単離された。Ｔｒｅｇは、ＥａｓｙＳｅｐ ｔｒｅｇ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１８０６３）を使用して、製造者の指示に従って単離された。Ｔｒｅｇは、同じドナーからのＰＢＭＣと混合された。抗ＣＤ３ ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５５３３６）および抗ＣＤ２８ ａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５７２５）が、共培養に加えられた。最後に、二重特異性抗体の連続希釈液が加えられ、プレートは３７℃／５％ＣＯ_２で３日間インキュベートされた。３日間のインキュベート後、上澄み中のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αサイトカインレベルが、ＭＳＤキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）を使用して測定された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．２．０）が、グラフをプロットするために使用された。

【0264】

結果は図７および表９に示される。ほとんどの二重特異性抗体は、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、または参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログとの組合せと、同様のレベルのＩＦＮ－γまたはＴＮＦ－αを誘導した。

【0265】

【0266】

［実施例９ － マクロファージ抑制アッセイ］
Ｍ２表現型の腫瘍関連マクロファージは、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害する。二重特異性抗体は、Ｍ２マクロファージ抑制アッセイで特性評価され、それらがＴ細胞増殖およびＩＦＮ－γ産生に対するＭ２マクロファージの阻害効果を逆転できるかどうかを試験した。

【0267】

二重特異性抗体は、陰性対照ＩｇＧ１抗体（ＲＳＶ）、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログ、参照ＰＤ－１抗体ニボルマブのアナログ、市販の参照ＰＤ－１抗体オプジーボ（ＢＭＳ）、陽性対照抗体抗ＬＩＬＲＢ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびｈｕＩｇＧ４アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に、試験された。加えて、試験抗体または対照抗体を加えない刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞とＭ２マクロファージとの共培養、または、ＣＤ４^＋Ｔ細胞単独（非刺激対刺激）が、アッセイにおける対照条件として含まれた。

【0268】

３人の異なる健康なドナーからのＰＢＭＣ単離単球は、Ｍ－ＣＳＦを用いて６日間マクロファージに分化され、サイトカインＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍｌ）（＋Ｍ－ＣＳＦ）の特異性カクテルを使用して極性化され、Ｍ２マクロファージを得た。表現型を確認するために、ＣＤ１６３（Ｍｉｌｔｅｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ２０９（Ｍｉｌｔｅｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ２０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＣＤ８６（Ｍｉｌｔｅｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃ）の発現が、フローサイトメトリーによって測定された（図８）。ＣＤ１６３は、全てのドナーにおいてＭｓ様マクロファージによって発現される。ＣＤ２０９およびＣＤ２０６は、全てのドナーにおいてＭ２マクロファージによって高発現される。ＣＤ８６は、Ｍ２様マクロファージによって低レベルで発現される。Ｍ２様マクロファージは、３人全てのドナーにおいて予期された表現型を示す。

【0269】

次に、Ｍ２マクロファージは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて４時間活性化された。マクロファージは、採取され、洗浄され、９６ウェルプレートに、自己ＣＤ４^＋活性化Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＤ３／ＣＤ２８ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）により活性化された）と共に、１：５の比率で、試験抗体または対照抗体の存在下、１０μｇ／ｍｌの濃度で、５回反復で播種された。共培養５日目に、分泌されたＩＦＮ－γの濃度が、ＥＬＩＳＡにより測定された（ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸＴＭ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。データは多元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０で分析された。

【0270】

結果は図８に示される。多くの二重特異性抗体は、参照ＰＤ－１抗体ニボルマブのアナログ、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ、または参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログと比較して、同様またはそれ以上のレベルのＩＦＮ－γを誘導した。

【0271】

［実施例１０ － インビボヒト化ＮＳＧ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウスモデル］
二重特異性抗体は、ヒト化ＮＳＧ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウスモデルにおいてインビボで特性評価され、腫瘍体積を減少させる際のその効力を決定した。このマウスモデルは、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む陰性対照２価単一特異性ＩｇＧ１抗体１０ｍｇ／ｋｇ；参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）；参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）；参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）と参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）との組合せ；および参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子のアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）、を使用して検証された。結果は図９Ａに示される。

【0272】

ヒト化ＣＤ３４ ＮＳＧマウスは、１００μｌの無血清培養培地およびマトリゲルマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に等体積で懸濁された合計３×１０^６のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を、皮下接種された。腫瘍が確立した後（８０～１００ｍｍ^３）、マウスは以下の治療群に無作為に割り当てられた：
１）配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、陰性対照２価単一特異性ＩｇＧ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
２）参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）；
３）参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）；
４）参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）；
５）配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）；
６）配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
７）配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）；
８）配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
９）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）；
１０）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
１１）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）；
１２）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
１３）配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
１４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
１５）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；
１６）配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む、二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）。

【0273】

各群は８～９匹のマウスを有した。動物は２７または３０日の期間、５日ごとに腹腔内投与された。腫瘍はキャリパーを使用して測定され、式：ｌ（長さ）×ｗ^２（幅）×１／２を使用して楕円体に同化させることで、腫瘍体積が計算された。体重もまた、試験を通じてモニターされた。試験終了後、腫瘍免疫プロファイリングおよび受容体占有率のために、腫瘍が採取された（最終投与から２４時間後）。

【0274】

結果は図９Ｂ～Ｅに示される。全ての二重特異性抗体は、参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログとの組合せよりも、優れた抗腫瘍応答を誘導した。二重特異性抗体は、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの両方の投与量レベルで優れた抗腫瘍応答を誘導した一方、参照抗体の組合せは、各参照抗体１０ｍｇ／ｋｇの投与量を含んだ。

【0275】

有効性とともに、二重特異性抗体治療によるＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩの両受容体の受容体カバー率が、最終投与から２４時間後に分析されたＴ細胞において、参照ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１のアナログと参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブとの組合せ治療と同様に、観察された（図９Ｆ）。

【0276】

［実施例１１ － インビボヒト化ＮＳＧ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウスモデルにおける異なる用量の試験］
配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインと配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、実施例１０に記載されるように、ヒト化ＮＳＧ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウスモデルにおいてインビボで、２つの異なる用量レベル、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、特性評価された。配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号８７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む陰性対照２価単一特異性ＩｇＧ１抗体が、１０ｍｇ／ｋｇで含まれた。

【0277】

結果は図１１に示される。二重特異性抗体は、両方の用量レベルで有意な抗腫瘍応答を誘導した。

【0278】

［配列表］
配列番号１－重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＭＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＩＰＶＦＤＴＳＳＹＥＫＫＦＱＧＲＩＴＩＩＡＤＫＳＴＳＴＶＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＡＡＶＹＹＣＡＲＧＴＶＥＡＴＬＬＦＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0279】

配列番号２－重鎖ＣＤＲ１
ＳＹＶＩＳ

【0280】

配列番号３－重鎖ＣＤＲ２
ＭＩＩＰＶＦＤＴＳＳＹＥＫＫＦＱＧ

【0281】

配列番号４－重鎖ＣＤＲ３
ＧＴＶＥＡＴＬＬＦＤＦ

【0282】

配列番号５－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＤＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0283】

配列番号６－重鎖ＣＤＲ１
ＦＤＦＷＳ

【0284】

配列番号７－重鎖ＣＤＲ２
ＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧ

【0285】

配列番号８－重鎖ＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ

【0286】

配列番号９－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＧＳＩＧＹＨＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0287】

配列番号１０－重鎖ＣＤＲ１
ＹＨＦＷＳ

【0288】

配列番号１１－重鎖ＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ

【0289】

配列番号１２－重鎖ＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ

【0290】

配列番号１３－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＥＧＳＩＧＹＨＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0291】

配列番号１４－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0292】

配列番号１５－重鎖ＣＤＲ１
ＲＦＡＬＨ

【0293】

配列番号１６－重鎖ＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ

【0294】

配列番号１７－重鎖ＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ

【0295】

配列番号１８－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0296】

配列番号１９－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0297】

配列番号２０－重鎖ＣＤＲ１
ＲＦＡＬＳ

【0298】

配列番号２１－重鎖ＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧ

【0299】

配列番号２２－重鎖ＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮ

【0300】

配列番号２３－重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0301】

配列番号２４－重鎖ＣＤＲ１
ＩＹＡＭＴ

【0302】

配列番号２５－重鎖ＣＤＲ２
ＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ

【0303】

配列番号２６－重鎖ＣＤＲ３
ＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹ

【0304】

配列番号２７－重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＮＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0305】

配列番号２８－重鎖ＣＤＲ１
ＩＮＡＭＴ

【0306】

配列番号２９－重鎖ＣＤＲ２
ＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ

【0307】

配列番号３０－重鎖ＣＤＲ３
ＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹ

【0308】

配列番号３１－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0309】

配列番号３２－重鎖ＣＤＲ１
ＮＡＷＭＳ

【0310】

配列番号３３－重鎖ＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧ

【0311】

配列番号３４－重鎖ＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ

【0312】

配列番号３５－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＱＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0313】

配列番号３６－重鎖ＣＤＲ１
ＮＡＷＭＳ

【0314】

配列番号３７－重鎖ＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＱＦＡＡＰＶＫＧ

【0315】

配列番号３８－重鎖ＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ

【0316】

配列番号３９－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0317】

配列番号４０－重鎖ＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ

【0318】

配列番号４１－重鎖ＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧ

【0319】

配列番号４２－重鎖ＣＤＲ３
ＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰ

【0320】

配列番号４３－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0321】

配列番号４４－重鎖ＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ

【0322】

配列番号４５－重鎖ＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧ

【0323】

配列番号４６－重鎖ＣＤＲ３
ＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰ

【0324】

配列番号４７－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＹＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0325】

配列番号４８－軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0326】

配列番号４９－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ１
ＱＳＩＳＳＹ

【0327】

配列番号５０－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ２
ＡＡＳ

【0328】

配列番号５１－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ

【0329】

配列番号５２－軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ

【0330】

配列番号５３－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ１
ＱＳＩＳＳＹ

【0331】

配列番号５４－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ２
ＡＡＳ

【0332】

配列番号５５－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴ

【0333】

配列番号５６－軽鎖可変領域
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0334】

配列番号５７－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ１
ＱＳＶＳＳＮ

【0335】

配列番号５８－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ２
ＧＡＳ

【0336】

配列番号５９－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ３
ＱＱＹＮＮＷＰＷＴ

【0337】

配列番号６０－軽鎖可変領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0338】

配列番号６１－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ１
ＱＳＶＳＳＳＹ

【0339】

配列番号６２－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ２
ＧＡＳ

【0340】

配列番号６３－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ３
ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ

【0341】

配列番号６４－軽鎖可変領域
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ

【0342】

配列番号６５－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ１
ＮＩＧＲＫＳ

【0343】

配列番号６６－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ２
ＹＤＳ

【0344】

配列番号６７－ＩＭＧＴに従った軽鎖ＣＤＲ３
ＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶ

【0345】

配列番号６８－ヒンジ領域
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ

【0346】

配列番号６９－ＣＨ１領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ

【0347】

配列番号７０－ＣＨ２領域
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ

【0348】

配列番号７１－ＣＨ２－ＤＭ領域
ＡＰＥＬＧＲＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ

【0349】

配列番号７２－ＣＨ３領域
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

【0350】

配列番号７３－ＣＨ３－ＤＥ領域
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＤＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＥＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

【0351】

配列番号７４－ＣＨ３－ＫＫ領域
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＫＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＫＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

【0352】

配列番号７５－ＣＬ領域
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0353】

配列番号７６－重鎖参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１アナログ
ＱＬＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＮＳＹＦＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＩＤＴＳＫＳＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＰＲＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0354】

配列番号７７－軽鎖参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体ＴＧＦ１アナログ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0355】

配列番号７８－重鎖参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0356】

配列番号７９－軽鎖参照ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0357】

配列番号８０－重鎖参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＩＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ

【0358】

配列番号８１－軽鎖参照ＰＤ－Ｌ１－ＴＧＦ－β ＴＲＡＰ分子アナログ
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

【0359】

配列番号８２－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡ
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ

【0360】

配列番号８３－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡの細胞外ドメイン
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ

【0361】

配列番号８４－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＢ
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ

【0362】

配列番号８５－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの細胞外ドメイン
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ

【0363】

配列番号８６－重鎖陰性対照ＲＳＶ ＩｇＧ１抗体
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＴＫＹＳＡＤＳＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＧＷＳＦＤＳＳＧＹＲＳＷＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

【0364】

配列番号８７－軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0365】

配列番号８８－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0366】

配列番号８９－重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＹＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0367】

配列番号９０－重鎖ＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ

【0368】

配列番号９１－重鎖ＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＹＴＤＳＶＫＧ

【0369】

配列番号９２－重鎖ＣＤＲ３
ＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰ

【0370】

配列番号９３－Ｖ領域ＶＫ１－３９
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ

【0371】

配列番号９４－ＶＫ１－３９／ＪＫ１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0372】

配列番号９５－ＶＫ１－３９／ＪＫ５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ

【0373】

配列番号９６－重鎖参照ニボルマブアナログ抗体
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0374】

配列番号９７－軽鎖参照ニボルマブアナログ抗体
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0375】

配列番号９８－Ｖ領域ＶＫ３－１５
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰ

【0376】

配列番号９９－ＶＫ３－１５／ＪＫ１
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0377】

配列番号１００－Ｖ領域ＶＫ３－２０
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ

【0378】

配列番号１０１－ＶＫ３－２０／ＪＫ１
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0379】

配列番号１０２－Ｖ領域ＶＬ３－２１
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨ

【0380】

配列番号１０３－ＶＬ３－２１／ＪＬ３
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ

【0381】

配列番号１０４－細胞外ドメインＴＧＦ－βＲＩＩ
ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図3N】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B-1】

【図8B-2】

【図9A】

【図9B-1】

【図9B-2】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F-1】

【図9F-2】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-06-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項2】

請求項１に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項3】

請求項１に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項4】

請求項３に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項6】

請求項５に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項7】

請求項５に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項8】

請求項７に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項9】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）それぞれ、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項10】

請求項９に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号２３；２７；３１；３５；３９；４３；４７；８８；８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項11】

請求項９に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項12】

請求項１１に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項13】

請求項９～１２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｅ）それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＤＣＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸バリエーションを含んでもよい；
多重特異性結合部位。

【請求項14】

請求項１３に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１；５；９；１３；１４；１８；１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、またはこれらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項15】

請求項１３に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、またはこれらのバリアントを含む、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項16】

請求項１５に記載された多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項17】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および、前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害し、
具体的には活性化Ｔ細胞において、具体的には活性化腫瘍特異的Ｔ細胞において、前記ＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１媒介シグナル伝達を阻害し、および、前記ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害してよい、
多重特異性結合部位。

【請求項18】

請求項１７に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１に結合する単一のＦａｂドメイン、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合する単一のＦａｂドメイン、およびＦｃ領域を含む、
多重特異性結合部位。

【請求項19】

請求項１７または１８に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際により高い効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、
具体的には、（ｉ）ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１ ^＋ 細胞であり、および、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、または実質的に発現しない前記細胞は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１ ^ｎｕｌｌ 細胞であってよく、（ｉｉ）ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、活性化ＣＤ４ ^＋ および／またはＣＤ８ ^＋ 細胞であり、および、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しない前記細胞は、非活性化ＣＤ４ ^＋ および／またはＣＤ８ ^＋ 細胞であってよく、または、（ｉｉｉ）ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β－ＰＤ－１ ^＋ 細胞であり、および、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しない前記細胞は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＧＦ－β細胞であってよい、
多重特異性結合部位。

【請求項20】

請求項１９に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、リン酸化ＳＭＡＤ２／３アッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【請求項21】

請求項１９に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、アイソジェニックＰＤ－１－ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおいて測定される、
多重特異性結合部位。

【請求項22】

請求項１９に記載された多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記効力は、ＴＧＦ－βＲＩＩを発現し、かつＰＤ－１を全く発現しないか、実質的に発現しないか、または低レベルのＰＤ－１を発現する細胞においてよりも、少なくとも約２００倍、好ましくは約２００～３００００倍高い、
多重特異性結合部位。

【請求項23】

請求項１９に記載された多重特異性結合部位であって、
ＴＧＦ－βＲＩＩを発現しかつＰＤ－１を全く発現しない細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の効力よりも低く、
および
ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも高く、
前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、２価の単一特異性抗体であり、
具体的には、ＰＤ－１とＴＧＦ－βＲＩＩの両方を発現する細胞において、ＴＧＦ－βＲＩＩ媒介シグナル伝達を阻害する際の前記多重特異性結合部位の前記効力は、前記参照抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の前記効力よりも、少なくとも約１００倍、好ましくは約１００～２００００倍高くてもよい、
多重特異性結合部位。

【請求項24】

請求項１７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、腫瘍体積を減少させる際に参照抗体の組合せよりも高い活性を有し、
参照抗体の前記組合せは、ＰＤ－１およびＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする２つの２価の単一特異性抗体であり、
ＰＤ－１を標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、および、ＴＧＦ－βＲＩＩを標的とする前記２価の単一特異性抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
具体的には、腫瘍体積を減少させる際の前記活性は、インビボマウス試験において、具体的にはＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片ｈｕＣＤ３４ ＮＳＧマウスを使用するインビボマウス試験において、腫瘍体積の減少を測定することにより決定されてよい、
多重特異性結合部位。

【請求項25】

請求項２４に記載された多重特異性結合部位であって、
ここで、腫瘍体積を減少させる際のより高い活性とは、参照抗体の前記組合せの腫瘍体積の減少の、少なくとも約１．５倍の、好ましくは約１．５～１００倍の、腫瘍体積の減少である、
多重特異性結合部位。

【請求項26】

ＰＤ－１結合ドメインとＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインとを含む多重特異性結合部位であって、
ＰＤ－１および／またはＴＧＦ－βＲＩＩへの結合について、請求項１、９、または１７に記載された多重特異性結合部位と競合する、
多重特異性結合部位。

【請求項27】

有効量の請求項１、９、または１７に記載された多重特異性結合部位と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物。

【請求項28】

治療に使用するための、請求項１、９、または１７に記載された多重特異性結合部位、または請求項２７に記載された医薬組成物。

【請求項29】

抑制された免疫系に関連する疾患、具体的には癌の治療に使用するための、請求項１、９、または１７に記載された多重特異性結合部位、または請求項２７に記載された医薬組成物。

【請求項30】

請求項１または２において規定されるＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、請求項５または６において規定されるＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、細胞であって、
具体的には、前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含んでよい、
細胞。

【請求項31】

請求項３０に記載された細胞であって、
前記細胞は、軽鎖可変領域、具体的には請求項３または４において規定される軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
細胞。

【請求項32】

請求項１、９、または１７に記載された多重特異性結合部位を産生する、細胞。

【国際調査報告】