(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-18
(54)【発明の名称】細胞治療において使用するＳＡＲＭ１の発現の減少
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20241111BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241111BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241111BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241111BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241111BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20241111BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241111BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20241111BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20241111BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20241111BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20241111BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
C12N5/10 ZNA
C12N15/09 100
A61P35/00
A61P31/00
A61P35/02
A61P7/00
A61P37/04
A61K35/28
A61K35/545
C12N5/078
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532886
(86)(22)【出願日】2022-12-01
(85)【翻訳文提出日】2024-07-26
(86)【国際出願番号】 US2022080749
(87)【国際公開番号】W WO2023102478
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】63/284,995
(32)【優先日】2021-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521476126
【氏名又は名称】エメンドバイオ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】エマニュエル、ラフィ
(72)【発明者】
【氏名】ゴラン・メシア、ミハル
(72)【発明者】
【氏名】ディアマント、レイチェル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB31
(57)【要約】
本発明は、がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を投与することを含む、養子免疫細胞治療又は予防のための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を投与することを含む、養子免疫細胞治療又は予防のための方法。
【請求項2】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ＳＡＲＭ１の発現が低下する又は不活性化されるように改変されているか、前記細胞は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１配列多様体又はそのドミナントネガティブ断片を発現するように改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ由来細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、前記対象において、機能性の増加、生存率の増加、パーシスタンスの増加、増殖の増加及び／又は腫瘍保持の増加を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、前記対象において、細胞毒性の増加及び／又は殺傷活性の増加を示す、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記対象は、がんに罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記がんは腫瘍を含む、及び／又は前記がんは血液悪性腫瘍である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記がんは、静止性の黒色腫、転移性前立腺がん、転移性乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、肝臓がん、頭頚部のがん、扁平上皮肺がん、非小細胞肺がん、メルケル細胞がん、肉腫、肝細胞がん、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、膵臓がん、大腸がん、子宮頸がん、胃がん、腎臓がん、転移性腎細胞がん、白血病、卵巣がん及び悪性神経膠腫からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ex vivo又はin vitroで調製される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、in vivoで調製される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、動員及び／又はアフェレーシスにより前記対象から得た細胞から調製される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞は、骨髄穿刺により前記対象から得た細胞から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞は、前記細胞のＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化の前に刺激される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、前記対象に投与する前に培養して増殖される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着可能である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、子孫細胞を生み出すことができる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着後に子孫細胞を生み出すことができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、自家生着後に子孫細胞を生み出すことができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４月か間、子孫細胞を生み出すことができる、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、細胞に、ギャップマー、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、カスタマイズしたＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は低分子阻害剤を送達することで調製される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞中のＳＡＲＭ１遺伝子のアレルが、挿入又は欠失変異を受ける、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記挿入又は欠失変異は未熟終止コドンを生じる、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を前記細胞に導入すること
を含む方法によって調製され、ここで、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子との複合体は、前記ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
前記ＲＮＡ分子の前記ガイド配列部分は、連続する１７～５０ヌクレオチドを含む、
請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ガイド配列部分は、前記ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶ、エクソンＶ、エクソンＶＩ、エクソンＶＩＩ、エクソンＶＩＩＩ又はエクソンＩＸの上流５０塩基対から下流５０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ガイド配列部分は、前記ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンの上流３０塩基対から下流３０塩基対の間に位置する標的配列に相補的であり、a) 前記エクソンはエクソンＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号１～５６、３０１～３５６、１３４８～２２２３、５７～１１４、３５７～４１４、２２２４～３０９５、１１５～１７４、４１５～４７４、３０９６～３９６３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
b) 前記エクソンはエクソンＩＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号３９６４～７６８３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
c) 前記エクソンはエクソンＩＩＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号７６８４～８９６７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
d) 前記エクソンはエクソンＩＶで、前記ガイド配列部分は、配列番号８９６８～９５２５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
e) 前記エクソンはエクソンＶで、前記ガイド配列部分は、配列番号９５２６～１０９４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
f) 前記エクソンはエクソンＶＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号１０９４８～１１５７１のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
g) 前記エクソンはエクソンＶＩＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号１１５７２～１２７１７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
h) 前記エクソンはエクソンＶＩＩＩで、前記ガイド配列部分は、配列番号１２７１８～１３４５５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；又は、
i) 前記エクソンはエクソンＩＸで、前記ガイド配列部分は、配列番号５９８～１３４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法に従い、対象における、がん、感染症、疾患又は障害の治療又は予防に使用する、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を含む医薬。
【請求項28】
対象における、がん、感染症、疾患又は障害を治療又は予防するためのキットであって、請求項２７に記載の医薬、及び、がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、前記組成物を送達するための説明書を含む、キット。
【請求項29】
細胞中のＳＡＲＭ１（sterile alpha and toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）遺伝子のアレルを不活性化する方法であって、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を前記細胞に導入すること
を含み、ここで、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子との複合体は、前記ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
前記ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含み、
前記細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ由来細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージからなる群から選択される、
方法。
【請求項30】
請求項２９に記載の方法によって改変された細胞であって、前記改変細胞が、少なくとも１つの不活性化されたＳＡＲＭ１アレルを含む、改変細胞。
【請求項31】
養子免疫細胞治療又は予防に使用する、請求項３０に記載の改変細胞。
【請求項32】
前記養子免疫細胞治療又は予防は、対象における、がん、感染症、疾患又は障害の治療又は予防である、請求項３１に記載の改変細胞。
【請求項33】
この明細書で開示した１つ以上の要素を特徴とする、組成物、方法、製造方法、キット、改変細胞又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この出願は、2021年12月1日に出願された米国仮出願第63/284,995号の恩恵を主張し、この仮出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
この出願全体で、括弧に入れて参照したものを含む、さまざまな刊行物を参照する。この出願において全体として言及された全ての刊行物の開示は、この発明が属する技術分野及びこの発明とともに使用される技術分野における追加の特徴の説明を提供するために、参照によりこの出願に組み入れられる。
【0003】
配列表への言及
この出願は、「221201_91818-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.xml」という名前のファイルに存在する塩基配列を参照により組み入れ、そのファイルは、サイズが11,660kbで、MS-Windows（登録商標）とのシステム互換性を有するＩＢＭ－ＰＣ機フォーマットで2022年12月1日に作成され、この出願の一部として、2022年12月1日に出願されたｘｍｌファイルに含まれている。
この出願は、「221201_91818-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.xml」という名前のファイルに存在する塩基配列を参照により組み入れ、そのファイルは、サイズが11,660kbで、MS-Windows（登録商標）とのシステム互換性を有するＩＢＭ－ＰＣ機フォーマットで2022年12月1日に作成され、この出願の一部として、2022年12月1日に出願されたｘｍｌファイルに含まれている。
【背景技術】
【0004】
ＣＡＲ Ｔ細胞治療のような免疫治療は、いくつかの疾患及び障害を治療するための有望なアプローチを提供する。しかし、そのような治療をより有効なものとするために、操作した細胞の患者に移入した後のパーシスタンスを増加させる同種養子免疫移入戦略を開発することが非常に望まれている。
【発明の概要】
【0005】
ＳＡＲＭ１（sterile alpha and TIR motif-containing 1）遺伝子は、プログラムされた細胞内死の傷害誘導形態であるワーラー変性を促進することによってＭＹＤ８８及びＴＲＩＦ依存性ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路の負の調節因子として作用するＮＡＤ＋ヒドロラーゼである。ＳＡＲＭ１は、ストレスに応答して細胞死を活性化させることもできる（Molday et al., 2013）。
【0006】
本発明は、操作した免疫細胞においてＳＡＲＭ１遺伝子の発現をノックアウトし、ノックダウンし、又は阻害して、細胞治療の間のそれらのパーシスタンス、増殖及び／又は保持を増加させるアプローチを開示する。したがって、明細書に記載する細胞治療に関連する細胞におけるＳＡＲＭ１遺伝子の発現の両アレルノックアウト、ノックダウン又は阻害は、がん治療のための細胞治療アプローチを含む、細胞治療アプローチを改善するために利用してもよい。
【0007】
本開示は、がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を投与することを含む、養子免疫細胞治療又は予防のための方法も提供する。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞（例．リンパ球、単球又はマクロファージ）である。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害免疫細胞は自家である。他の態様では、ＳＡＲＭ１阻害免疫細胞は同種である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A-1B】ＳＡＲＭ１を標的とするＲＮＡガイド分子の活性のＨｅＬａ細胞でのスクリーニング。細胞をＤＮＡトランスフェクションの７２時間後に採取した。ゲノムＤＮＡを抽出し、オンターゲットプライマーを使用して内因性ゲノム領域を増幅した後にキャピラリー電気泳動した。グラフは、３回の独立した実験における編集の割合（％）の平均±標準偏差（ＳＴＤＶ）を示す。図１Ａ：ＳｐＣａｓ９コーディングプラスミドを、示したＲＮＡガイド分子を発現するプラスミドと共トランスフェクトした。図１Ｂ：ＯＭＮＩ-５０又はＯＭＮＩ-７９ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、示したＲＮＡガイド分子と共トランスフェクトした。
【図2】特定のＲＮＡガイド分子と複合体を形成したＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのＲＮＰを、Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞にエレクトロポレートしてＲＮＰ活性を決定した。細胞をＤＮＡエレクトロポレーションの７２時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、次いで次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって分析した。グラフは、２回の独立したエレクトロポレーションにおける編集の割合（％）±ＳＴＤＶを示す。
【図3】編集後のＳＡＲＭ１ ＲＮＡの相対量。Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞をエレクトロポレーションの７日後に採取し、ＲＮＡを抽出し、逆転写した。AriaMxシステムを使用してＳＡＲＭ１ ＲＮＡの相対量を定量化した。ｍＲＮＡのレベルを、編集を行わなかった未処理の細胞に対して定量化する。
【図4】ＳＡＲＭ１を標的とするＲＮＡガイド分子を伴うＯＭＮＩ-１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＨｅＬａ細胞での編集活性。特定のＲＮＡガイド分子をＯＭＮＩ-１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共トランスフェクトし、それらのオンターゲット活性を決定した。細胞をＤＮＡトランスフェクションの７２時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、変異の領域を増幅し、ＮＧＳによって分析した。トランスフェクション効率をｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によって測定した。グラフは、３回の独立したトランスフェクションにおける編集の割合（％）±ＳＴＤＶを示す。
【図5】ＳＡＲＭ１経路のダイアグラム。
【図6A】ＳＡＲＭ１編集及びＮＧＳの結果。
【図6B】殺傷アッセイ。
【図6C】生存率（ATPlite）アッセイ。
【発明を実施するための形態】
【0009】
詳細な説明
別段の定義がある場合を除き、この明細書で用いる全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。この明細書に記載したものと類似した又は等価の方法及び材料は、本発明の態様の実施又は試験に使用できるが、代表的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含めて、この明細書が優先する。加えて、材料、方法及び実施例は例証となるのみであり、必ずしも限定することを意図するものではない。
別段の定義がある場合を除き、この明細書で用いる全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。この明細書に記載したものと類似した又は等価の方法及び材料は、本発明の態様の実施又は試験に使用できるが、代表的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含めて、この明細書が優先する。加えて、材料、方法及び実施例は例証となるのみであり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【0010】
この明細書では、用語「１つの（a、an）」は、列挙された成分の「１つ以上」を指すことが理解される。単数形の使用は、具体的に別段の説明がある場合を除き、複数形を含むことは当業者に明らかである。したがって、用語「１つの（a、an）」及び「少なくとも１つの」は、この出願では同じ意味である。
【0011】
この教示をより良く理解することを目的として、かつ教示の範囲を決して限定することなく、別段の指示がある場合を除き、この明細書及び特許請求の範囲で用いられる、量、パーセンテージ又は割合を表す全ての数及び他の数値は、あらゆる場合において、用語「約」により修飾されていると理解される。したがって、反する指示がある場合を除き、明細書及び特許請求の範囲に示した数的パラメータは近似値で、得ようとする所望の性質に依存して変動する可能性がある。最低でも、各数的パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を考慮しかつ通常の丸め技術を適用することによって解釈される。
【0012】
別段の説明がある場合を除き、形容詞、例えば、本発明の態様の特徴を示す状態又は関係を修飾する「実質的に」及び「約」は、その状態又は特性が、それが意図される適用についての態様の運用に受け入れられる許容範囲内までで定義されることを意味すると理解される。別段の指示がある場合を除き、この明細書及び特許請求の範囲における語「又は」は、排他的な「又は」というよりむしろ、包含的な「又は」であると見なされ、それが結合させる項目の少なくとも１つ又は任意の組合せを示す。
【0013】
本出願の説明及び特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」、「含有する（include）」及び「有する（have）」、並びにそれらの活用形は、その動詞の目的語が、必ずしも、その動詞の主語の成分、要素又は部分の完全な列挙とは限らないことを示すために用いられる。この明細書では他の用語は、当技術分野におけるそれらの周知の意味により定義されることを意図する。
【0014】
本発明のいくつかの態様では、ＤＮＡヌクレアーゼを利用して標的部位のＤＮＡを切断し、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が挙げられるがこれには限定されない、細胞修復機構を誘導する。古典的なＮＨＥＪでは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位の２つの末端が、迅速ではあるものの不正確に連結される（すなわち、切断部位におけるわずかな挿入又は欠失というＤＮＡの変異が多く生じる）。
【0015】
この明細書では、用語「改変された細胞」又は「改変細胞」は、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわち、オンターゲットハイブリダイゼーションの結果、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が二本鎖切断を行った細胞を指す。
【0016】
この明細書では、用語「標的化配列」又は「標的化分子」は、特定の標的配列とハイブリダイズできる塩基配列又は当該塩基配列を含む分子を指し、例えば、標的化配列は、標的となる配列と少なくとも部分的に相補的である塩基配列を有する。標的化配列又は標的化分子は、単独で、又は他のＲＮＡ分子と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部であってもよく、標的化配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的化部分としての役割を果たす。標的化配列を有する分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、単独で又は１つ以上の別のＲＮＡ分子（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的配列に向けることができる。限定するものではない例として、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ分子のガイド配列部分又はシングルガイドＲＮＡ分子は、標的化分子としての役割を果たしてもよい。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。標的化配列は、所望の配列を標的とするようにカスタムデザインできる。
【0017】
この明細書では、用語「標的とする」又は「向ける」は、標的化分子の標的化配列を、標的となる塩基配列を有する核酸へ優先的にハイブリダイズさせることを指す。用語「標的とする」は、変化するハイブリダイゼーション効率を包含し、したがって、標的の塩基配列を有する核酸が優先的に標的となるが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加えて、意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じる可能性があることは理解されている。ＲＮＡ分子が配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子の複合体は、ヌクレアーゼ活性のためにその配列を標的とすることは理解されている。
【0018】
ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる塩基配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、ガイド配列部分に沿って標的となるＤＮＡ配列と部分的に又は完全に相補的である塩基配列を有する。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０、又は、およそ１７～５０、１７～４９、１７～４８、１７～４７、１７～４６、１７～４５、１７～４４、１７～４３、１７～４２、１７～４１、１７～４０、１７～３９、１７～３８、１７～３７、１７～３６、１７～３５、１７～３４、１７～３３、１７～３１、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２２、１７～２１、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２２、１８～２０、２０～２１、２１～２２若しくは１７～２０である。いくつかの態様では、ガイド配列部分の全長は、ガイド配列部分に沿って標的となるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部であってもよく、ガイド配列部分がＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分としての役割を果たす。ガイド配列部分を有するＲＮＡ分子が、単独で又は１つ以上の別のＲＮＡ分子（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列に向けることができる。したがって、ガイド配列部分を有するＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを直接結合させることで、又はガイド配列部分を有するＲＮＡ分子と１つ以上のＲＮＡ分子をＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合させることで、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成できる。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。ガイド配列部分は、所望の配列を標的とするようにカスタムデザインできる。したがって、「ガイド配列部分」を含む分子は一種の標的化分子である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、この明細書に記載したガイド配列部分、例えば、配列番号１～１３４５７のいずれかに示すガイド配列と同じ配列、又は、１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド以下の異なる配列を含む。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。これらの態様の一部において、ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれかに示す配列と同じ配列を含む。この出願全体で、用語「ガイド分子」、「ＲＮＡガイド分子」、「ガイドＲＮＡ分子」及び「ｇＲＮＡ分子」は、ガイド配列部分を含む分子と同義である。
【0019】
この明細書では、用語「非区別的な」は、遺伝子の全てのアレルで共通する特定のＤＮＡ配列を標的とするＲＮＡ分子のガイド配列部分を指す。
【0020】
本発明のいくつかの態様では、ＳＡＲＭ１を標的とするＲＮＡ分子は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む。ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子のガイド配列部分は、修飾ヌクレオチドを有していてもよい。ヌクレオチド／ポリヌクレオチドへの代表的な修飾は、合成であってもよく、天然に存在するアデニン、シトシン、チミン、ウラシル又はグアニン塩基以外の塩基を含むヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを包含してもよい。ポリヌクレオチドへの修飾には、合成で、天然に存在しないヌクレオシド、例えば、ロックド核酸を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡの安定性を増加又は減少させるために、ポリヌクレオチドを修飾してもよい。修飾ポリヌクレオチドの例は、１－メチルプソイドウリジンを有するｍＲＮＡである。修飾ポリヌクレオチドとその用途の例は、参照によりこの明細書に組み入れられる米国特許第8,278,036号、国際公開第2015/006747号及びWeissman and Kariko (2015)を参照。
【0021】
この明細書では、配列番号で示す「連続する・・・ヌクレオチド」は、ヌクレオチドの介入を一切含まない、配列番号に示した順序での配列のヌクレオチドを指す。
【0022】
本発明のいくつかの態様では、ＳＡＲＭ１を標的とするＲＮＡ分子のガイド配列部分は、５０ヌクレオチド長であってもよく、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに示す配列の連続する２０～２２ヌクレオチドを含有してもよい。本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分は、２２ヌクレオチド長未満であってもよい。例えば、本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分は、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド長であってもよい。そのような態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに示す連続する１７～２２ヌクレオチドの配列における、それぞれ１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチドからなってもよい。例えば、配列番号１３４５８に示す連続する１７ヌクレオチドの配列のガイド配列部分は、以下の塩基配列のいずれか１つからなってもよい（連続する配列から排除されたヌクレオチドには、取り消し線が引かれている）：
【0023】
【化1】
【0024】
本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは、２０を超えてもよい。例えば、本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチド長は、２１、２２、２３、２４又は２５であってもよい。そのような態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに示す連続する２０、２１又は２２ヌクレオチドの配列を含有する１７～５０ヌクレオチド、及び、標的配列の３’末端、５’末端、又は両者に隣接するヌクレオチド（の配列）に完全に相補的なヌクレオチドを含む。
【0025】
本発明のいくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びガイド配列部分を含むＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列と結合して標的ＤＮＡ配列を切断する、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１は、追加のｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる塩基配列を含むガイド配列部分と、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ結合に関与する配列部分、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ配列部分は、同じＲＮＡ分子中に存在できる。あるいは、ガイド配列部分は１つのＲＮＡ分子に存在し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ結合に関与する配列部分、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、別のＲＮＡ分子に存在してもよい。ガイド配列部分（例．ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列）及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質結合ＲＮＡ配列部分（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ配列部分）を含む単一のＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化分子としての役割を果たすことができる。いくつかの態様では、ガイド配列部分を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ部分を含む第１のＲＮＡ分子と、ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子は、塩基対形成により相互作用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＤＮＡ標的部位とするＲＮＡ複合体を形成し、あるいは、融合してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＤＮＡ標的部位とするＲＮＡ分子を形成する。
【0026】
本発明のいくつかの態様において、ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を更に含んでいてもよい。そのような態様は、ＲＮＡ分子のガイド部分とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成的融合体としてデザインされてもよい。（Jinek et al., 2012参照）。そのような態様では、ＲＮＡ分子はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。本発明のいくつかの態様は、個々のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む個々のＲＮＡ分子を利用するＣＲＩＳＰＲ複合体も形成してもよい。そのような態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、塩基対形成を介してＲＮＡ分子とハイブリダイズしてもよく、この明細書に記載した発明のある特定の適用において有利な可能性がある。
【0027】
用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、塩基対形成を介してｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子に対して十分に相補的な配列を指す（米国特許第8,906,616号参照）。本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子はｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含んでいてもよい。
【0028】
本発明では、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、及び、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含み、前記制御領域の配列は、コード配列及び／又は転写配列と隣接しているか、していないかを問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、並びに遺伝子座調節領域が挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。
【0029】
「真核」細胞には、真菌細胞（例．酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【0030】
この明細書では、用語「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する能力がある酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然物から単離してもよく、又は天然物に由来するものであってもよい。天然物は、生きている生物体であってもよい。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を保持する、改変された又は合成されたタンパク質であってもよい。遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いて実現できる。
【0031】
細胞治療で使用する細胞においてＳＡＲＭ１発現を低下又は不活性化させる戦略のいずれか１つ又は組合せを、この発明で使用してもよい。
【0032】
この発明のいくつかの態様では、がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を投与することを含む、養子免疫細胞治療又は予防のための方法を提供する。
【0033】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ＳＡＲＭ１の発現が低下する又は不活性化されるように改変されているか、細胞は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１配列多様体又はそのドミナントネガティブ断片を発現するように改変されている。
【0034】
いくつかの態様では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ由来細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージからなる群から選択される。いくつかの態様では、前駆細胞が最初に改変され、次いで分化されて、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞が調製される。あるいは、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、細胞、例えば初代ＮＫ細胞を、直接編集することで調製してもよい。
【0035】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、機能性の増加を示す。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、生存率の増加及び／又は増強を示す。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、殺傷能力、細胞毒性、トラフィッキング、局在性、パーシスタンス及び／又は増殖のような、in vivoでの機能性の増強を示す。
【0036】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、対象において、機能性の増加、生存率の増加、パーシスタンスの増加、増殖の増加及び／又は腫瘍保持の増加を示す。
【0037】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、対象において、細胞毒性の増加及び／又は殺傷活性の増加を示す。例えば、いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、標的のより高い殺傷活性を示す。
【0038】
いくつかの態様では、対象は、がんに罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている。
【0039】
いくつかの態様では、がんは腫瘍を含む、及び／又はがんは血液悪性腫瘍である。
【0040】
いくつかの態様では、がんは、静止性の黒色腫、転移性前立腺がん、転移性乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、肝臓がん、頭頚部のがん、扁平上皮肺がん、非小細胞肺がん、メルケル細胞がん、肉腫、肝細胞がん、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、膵臓がん、大腸がん、子宮頸がん、胃がん、腎臓がん、転移性腎細胞がん、白血病、卵巣がん及び悪性神経膠腫からなる群から選択される。
【0041】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ex vivo又はin vitroで調製される。
【0042】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、in vivoで調製される。
【0043】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、動員及び／又はアフェレーシスにより対象から得た細胞から調製される。
【0044】
いくつかの態様では、細胞は、骨髄穿刺により対象から得た細胞から得られる。
【0045】
いくつかの態様では、細胞は、細胞のＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化の前に刺激される。
【0046】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、対象に投与する前に培養して増殖される。
【0047】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着可能である。
【0048】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、子孫細胞を生み出すことができる。
【0049】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着後に子孫細胞を生み出すことができる。
【0050】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、自家生着後に子孫細胞を生み出すことができる。
【0051】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間、子孫細胞を生み出すことができる。
【0052】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、細胞に、ギャップマー、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、カスタマイズしたＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は低分子阻害剤を送達することで調製される。
【0053】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞中のＳＡＲＭ１遺伝子のアレルは、挿入又は欠失変異を受ける。
【0054】
いくつかの態様では、挿入又は欠失変異は未熟終止コドンを生じる。
【0055】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を細胞に導入すること
を含む方法によって調製され、ここで、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子との複合体は、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を細胞に導入すること
を含む方法によって調製され、ここで、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子との複合体は、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。
【0056】
いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶ、エクソンＶ、エクソンＶＩ、エクソンＶＩＩ、エクソンＶＩＩＩ又はエクソンＩＸの上流５０塩基対から下流５０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。
【0057】
いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンの上流３０塩基対から下流３０塩基対の間に位置する標的配列に相補的であり、
ａ）エクソンはエクソンＩで、ガイド配列部分は、配列番号１～５６、３０１～３５６、１３４８～２２２３、５７～１１４、３５７～４１４、２２２４～３０９５、１１５～１７４、４１５～４７４、３０９６～３９６３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｂ）エクソンはエクソンＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号３９６４～７６８３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｃ）エクソンはエクソンＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号７６８４～８９６７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｄ）エクソンはエクソンＩＶで、ガイド配列部分は、配列番号８９６８～９５２５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｅ）エクソンはエクソンＶで、ガイド配列部分は、配列番号９５２６～１０９４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｆ）エクソンはエクソンＶＩで、ガイド配列部分は、配列番号１０９４８～１１５７１のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｇ）エクソンはエクソンＶＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１１５７２～１２７１７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｈ）エクソンはエクソンＶＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１２７１８～１３４５５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；又は、
ｉ）エクソンはエクソンＩＸで、ガイド配列部分は、配列番号５９８～１３４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。
ａ）エクソンはエクソンＩで、ガイド配列部分は、配列番号１～５６、３０１～３５６、１３４８～２２２３、５７～１１４、３５７～４１４、２２２４～３０９５、１１５～１７４、４１５～４７４、３０９６～３９６３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｂ）エクソンはエクソンＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号３９６４～７６８３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｃ）エクソンはエクソンＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号７６８４～８９６７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｄ）エクソンはエクソンＩＶで、ガイド配列部分は、配列番号８９６８～９５２５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｅ）エクソンはエクソンＶで、ガイド配列部分は、配列番号９５２６～１０９４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｆ）エクソンはエクソンＶＩで、ガイド配列部分は、配列番号１０９４８～１１５７１のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｇ）エクソンはエクソンＶＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１１５７２～１２７１７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；
ｈ）エクソンはエクソンＶＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１２７１８～１３４５５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む；又は、
ｉ）エクソンはエクソンＩＸで、ガイド配列部分は、配列番号５９８～１３４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。
【0058】
いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。
【0059】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、生存率の増加及び／又は機能性の増加を示す。
【0060】
この発明のいくつかの態様では、明細書に示す方法に従い、対象における、がん、感染症、疾患又は障害の治療又は予防に使用する、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞を含む医薬を提供する。いくつかの態様では、この発明は、対象における、がん、感染症、疾患又は障害を治療又は予防するためのキットであって、医薬、及び、がん、感染症、疾患若しくは障害に罹患している、又は罹患するリスクがあると判断されている対象に、組成物を送達するための説明書を含む、キットを提供する。
【0061】
この発明のいくつかの態様では、細胞中のＳＡＲＭ１（sterile alpha and toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）遺伝子のアレルを不活性化する方法であって、
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を細胞に導入すること
を含み、ここで、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子との複合体は、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含み、
細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ由来細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージからなる群から選択される、
方法を提供する。
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物を細胞に導入すること
を含み、ここで、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子との複合体は、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断し、
ガイド配列部分は、配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含み、
細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ由来細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージからなる群から選択される、
方法を提供する。
【0062】
この発明のいくつかの態様では、細胞中のＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを不活性化するための方法によって改変された細胞であって、改変細胞が、少なくとも１つの不活性化されたＳＡＲＭ１アレルを含む、改変細胞を提供する。
【0063】
いくつかの態様では、改変細胞は、２つの不活性化されたＳＡＲＭ１アレルを含む。いくつかの態様では、改変細胞は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、生存率の増加及び／又は機能性の増加を示す。いくつかの態様では、機能性の増加は、細胞毒性の増加及び／又は殺傷能力の増加を含む。
【0064】
いくつかの態様では、細胞は、養子免疫細胞治療又は予防に使用される。
【0065】
いくつかの態様では、養子免疫細胞治療又は予防は、対象における、がん、感染症、疾患又は障害の治療又は予防である。
【0066】
この発明のいくつかの態様では、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレル中又はその近傍に位置するＳＮＰ位置（ＲＥＦ／ＳＮＰ配列）を含む標的配列に完全に又は部分的に相補的な塩基配列を含むガイド配列部分（例．標的化配列）を含むＲＮＡ分子を送達することによって、細胞中のＳＡＲＭ１発現を不活性化する方法を提供する。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個又は２６個より多くのヌクレオチドからなる。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的配列に向けるために構成され、ＳＡＲＭ１標的部位の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５又は１０ヌクレオチド以内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される、それと複合体化したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる、切断事象を提供する。いくつかの態様では、切断事象は、ＳＡＲＭ１遺伝子のナンセンスコドン介在的分解を可能にする。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ分子又はシングルガイドＲＮＡ分子のようなガイドＲＮＡ分子である。
【0067】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルの標的配列は（例えは、ＮＨＥＪ媒介インデル（例．挿入又は欠失）の導入により）変更され、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルによってコードされる遺伝子産物の発現を低下又は排除する。いくつかの態様では、発現の低下又は排除は、未熟終止コドンに起因するような、ナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解に起因する。いくつかの態様では、発現の低下又は排除は、切断型のＳＡＲＭ１遺伝子産物の発現に起因する。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＮＰ位置を含む標的配列に相補的である。いくつかの態様では、ＳＮＰ位置はｒｓ７８２５９３６８４である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１７４のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、１、２又は３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号１、４、８、２０、２４、２６～２７、３３、３５、３７、４１、４７、４９、５１、５３、５６、１７５～２１４、５７、６０、６４、７６、８０、８２～８３、９２、９４、９８、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１４、２１５～２５６、１１５、１１８、１２２、１３２、１３９、１４１～１４２、１５１、１５７、１６１、１６４～１６５、１６７、１６９、１７１、１７４、及び２５７～３００のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、１、２又は３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。いくつかの態様では、ＳＮＰ位置１７：２８３７２３４９＿Ｃ＿ＣＴ。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号３０１～４７４のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、１、２又は３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号３０１、３０４、３１５、３２１、３２６～３２８、３３５、３３８、３４０、３４４、３４６～３４８、３５３、３５５～３５６、４７５～５１３、３５７、３６１、３６４、３６８、３７３、３８４～３８５、３９３、３９６、３９８、４０２、４０４～４０６、４１１、４１３～４１４、５１４～５５４、４１５～４１６、４１９、４２２、４２４、４２７、４３２、４４３～４４４、４５８、４６２、４６４～４６６、４７１、４７３～４７４及び５５５～５９７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、１、２又は３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。
【0068】
この発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードする配列であって、ＲＮＡ分子が、ＳＡＲＭ１遺伝子中又はその近傍に位置する標的配列に完全に又は部分的に相補的な塩基配列を含むガイド配列部分（例．標的化配列）を含む、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードする配列を提供する。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶ、エクソンＶ、エクソンＶＩ、エクソンＶＩＩ、エクソンＶＩＩＩ又はエクソンＩＸの上流３０塩基対から下流３０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶ、エクソンＶ、エクソンＶＩ、エクソンＶＩＩ、エクソンＶＩＩＩ又はエクソンＩＸの上流５０塩基対から下流５０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１遺伝子の標的配列（例えば、ＮＨＥＪ媒介インデル（例．挿入又は欠失）の導入により）は変更され、ＳＡＲＭ１遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下又は排除する。いくつかの態様では、発現の低下又は排除は、ナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解に起因する。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個又は２６個より多くのヌクレオチドからなる。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的配列に向けるために構成され、ＳＡＲＭ１標的部位の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５又は１０ヌクレオチド以内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される、それと複合体化したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる、切断事象を提供する。いくつかの態様では、切断事象は、ＳＡＲＭ１遺伝子のナンセンスコドン介在的分解を可能にする。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ分子又はシングルガイドＲＮＡ分子のようなガイドＲＮＡ分子である。
【0069】
いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンの上流３０塩基対から下流３０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンの上流５０塩基対から下流５０塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、ＳＡＲＭ１遺伝子のエクソンの上流７塩基対から下流７塩基対の間に位置する標的配列に相補的である。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＩで、ガイド配列部分は、配列番号１～５６、３０１～３５６、１３４８～２２２３、５７～１１４、３５７～４１４、２２２４～３０９５、１１５～１７４、４１５～４７４及び３０９６～３９６３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号３９６４～７６８３のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号７６８４～８９６７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＩＶで、ガイド配列部分は、配列番号８９６８～９５２５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＶで、ガイド配列部分は、配列番号９５２６～１０９４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＶＩで、ガイド配列部分は、配列番号１０９４８～１１５７１のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＶＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１１５７２～１２７１７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＶＩＩＩで、ガイド配列部分は、配列番号１２７１８～１３４５５のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。いくつかの態様では、エクソンはエクソンＩＸで、ガイド配列部分は、配列番号５９８～１３４７のいずれかに記載の配列と、同じ配列を含むか、３ヌクレオチド以下が異なる配列を含む。
【0070】
この発明の態様では、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ＲＮＡ分子を使用してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをＳＡＲＭ１アレルのエクソン又はスプライス部位に方向付け、これは、エラーが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構の誘導によるヌクレオチドの挿入又は欠失と、ＳＡＲＭ１アレル中のフレームシフト変異の形成につながる。フレームシフト変異は、例えば、ＳＡＲＭ１アレル中の未熟終止コドンが生成され、ＳＡＲＭ１アレルの不活性化又はノックアウトされ、切断型タンパク質が生成するか、アレルの転写物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解が生じる可能性がある。さらなる態様では、１つのＲＮＡ分子を使用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをＳＡＲＭ１アレルのプロモーターに方向付ける。
【0071】
明細書に記載するＳＡＲＭ１アレルの不活性化に使用するＣＲＩＳＰＲ組成物は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含んでいてもよく、対象又は細胞中で同時に効果を発揮する。少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡは、実質的に同時に送達してもよく、又は異なる時点で送達し、同時に効果を発揮してもよい。例えば、これには、ＲＮＡ分子及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡが対象又は細胞内に実質的に存在する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを対象又は細胞に送達することを含む。
【0072】
いくつかの側面によれば、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞が提供される。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞（例．単球、マクロファージ、リンパ球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、ｉＰＳ由来Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）又はｉＰＳ由来ＮＫＴ細胞）である。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害細胞は、幹細胞、ＨＳＣ又はｉＰＳｃである。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞（例．免疫細胞）は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレアーゼ、低分子又はポリヌクレオチドを含む好適なＳＡＲＭ１阻害剤を利用することで調製してもよい。
【0073】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ＳＡＲＭ１の活性が低下するように遺伝子改変される。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害又はＳＡＲＭ１不活性化細胞は、ＳＡＲＭ１の活性が低下するように遺伝子改変された前駆細胞から誘導される。限定するものではない例では、ＳＡＲＭ１阻害ｉＮＫは、ＣＲＩＳＰＲを利用してＳＡＲＭ１アレルをノックアウトすることなどによってＳＡＲＭ１の活性が低下するように遺伝子改変されて、ｉＮＫ細胞に更に分化したｉＰＳｃから誘導される。
【0074】
いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害若しくはＳＡＲＭ１不活性化細胞、又はそれから誘導された細胞は、細胞治療のために使用される。いくつかの態様では、ＳＡＲＭ１阻害細胞、又はそれから誘導された細胞は、免疫治療のために使用される。
【0075】
本開示のいくつかの側面によれば、この明細書は、細胞中のＳＡＲＭ１（sterile alpha and toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）遺伝子のアレルを不活性化することによって細胞生存率及び／又は細胞機能性を増加させるための方法であって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子、及び配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を細胞に導入することを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子との複合体が、ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを二本鎖切断する方法を提供する。この方法で改変してもよい細胞の限定するものではない例には、肝臓細胞（例．肝細胞）、肺細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、皮膚細胞、膀胱細胞、眼の細胞、眼球細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、食道細胞、頭部の細胞、頚部の細胞、卵巣の細胞、精巣の細胞、前立腺細胞、胎盤細胞、上皮細胞、内皮細胞、脂肪細胞、腎臓／腎細胞、心臓細胞、筋肉細胞、血液細胞（例．白血球）、免疫細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞及び神経節細胞などの他に、これらの組合せを含む。
【0076】
ＳＡＲＭ１編集戦略
細胞中のＳＡＲＭ１アレルをノックアウトするために提供する方法は、細胞治療又は免疫治療で使用するＳＡＲＭ１不活性化細胞の調製に使用してもよい。
細胞中のＳＡＲＭ１アレルをノックアウトするために提供する方法は、細胞治療又は免疫治療で使用するＳＡＲＭ１不活性化細胞の調製に使用してもよい。
【0077】
ＳＡＲＭ１編集戦略は、（１）スプライスドナー及びアクセプター部位に隣接するためにエクソンの上流及び下流７ヌクレオチド以内を含む、エクソン２～９のいずれか１つ、又はその組合せを標的とすることによって、これらのエクソン中のフレームシフトが、非機能的な、切断されたＳＡＲＭ１タンパク質、又は変異型ＳＡＲＭ１転写物のナンセンスコドン介在的分解をもたらす、両アレルノックアウト；並びに（２）エクソン中の第２のメチオニンコドンの上流にあるか若しくはそれとオーバーラップするエクソン１中のインデルを媒介し、それを排除して翻訳の再開を予防することによる、又はエクソン１－イントロン１ジャンクションを標的とすることによってスプライスドナーを破壊することによる、ＳＡＲＭ１タンパク質の切断を含むが、これらに限定されない。
【0078】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＰＡＭ認識
いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから選択されるか、その機能性バリアントである。いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。そのような態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（例．Ｃｐｆ１）をガイドするＲＮＡ配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼと結合し、及び／又は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを細胞中の全てのＳＡＲＭ１アレルへ誘導する。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含まない。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲタンパク質である限定するものではない例では、顕性ＳＡＲＭ１アレルと機能的アレルとの間で相違する少なくとも１つのヌクレオチドは、ＲＮＡ分子がハイブリダイズするように設計されている領域内のＰＡＭサイト内及び／又は当該サイトの近傍に存在してもよい。ＲＮＡ分子は、当技術分野において一般的に知られた方法により、ゲノム中の選択した標的と結合するように操作できることを、当業者は理解する。
いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから選択されるか、その機能性バリアントである。いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。そのような態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（例．Ｃｐｆ１）をガイドするＲＮＡ配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼと結合し、及び／又は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを細胞中の全てのＳＡＲＭ１アレルへ誘導する。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含まない。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲタンパク質である限定するものではない例では、顕性ＳＡＲＭ１アレルと機能的アレルとの間で相違する少なくとも１つのヌクレオチドは、ＲＮＡ分子がハイブリダイズするように設計されている領域内のＰＡＭサイト内及び／又は当該サイトの近傍に存在してもよい。ＲＮＡ分子は、当技術分野において一般的に知られた方法により、ゲノム中の選択した標的と結合するように操作できることを、当業者は理解する。
【0079】
この明細書では、用語「ＰＡＭ」は、標的となるＤＮＡ配列の近傍に位置し、かつＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体により認識される標的ＤＮＡの塩基配列を指す。ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼの種類によって異なっていてもよい。加えて、ほとんど全てのＰＡＭを標的にできるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがある。本発明のいくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイド配列部分と、標的を認識するための追加の要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡ部位のプロトスペーサーとの間で、ワトソン・クリック塩基対を形成することにより、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的ＤＮＡ部位へ誘導するガイド配列部分を有する１つ以上のＲＮＡ分子を利用する。その後、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ部位を切断し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。限定するものではない例において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのガイド配列部分とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間で、ワトソン・クリック塩基対を形成することにより、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）を標的ＤＮＡへ誘導する成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を利用する。本発明の操作されたＲＮＡ分子が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば利用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに関連する配列に対応するＰＡＭの隣の対象とする標的ゲノムＤＮＡ配列と会合するように更にデザインされることを、当業者は理解する。そのＰＡＭは、例えば、限定するものではない例として、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）ではＮＧＧ若しくはＮＡＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＳａＣａｓ９）ではＮＮＧＲＲＴ；Jejuni Ｃａｓ９ ＷＴではＮＮＮＶＲＹＭ；ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントではＮＧＡＮ若しくはＮＧＮＧ；ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲバリアントではＮＧＣＧ；ＳｐＣａｓ９－ＥＱＲバリアントではＮＧＡＧ；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＲＨバリアントではＮＲＲＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＴＨバリアントではＮＲＴＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＣＨバリアントではＮＲＣＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＧバリアントではＮＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＣａｓ９－ＮＧバリアントではＮＧ若しくはＮＡ（Ｎは任意の核酸塩基である）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＲＹバリアントではＮＲ若しくはＮＲＮ若しくはＮＹＮ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴである）；ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）Ｃａｓ９バリアント（ＳｃＣａｓ９）ではＮＮＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；黄色ブドウ球菌のＳａＫＫＨ－Ｃａｓ９バリアント（ＳａＣａｓ９）ではＮＮＮＲＲＴ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧである）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（ＮｍＣａｓ９）ではＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは任意の核酸塩基である）；アリサイクロバチルス・アシドフィルス（Alicyclobacillus acidiphilus）Ｃａｓ１２ｂ（ＡａｃＣａｓ１２ｂ）ではＴＴＮ（Ｎは任意の核酸塩基である）；又はＣｐｆｌではＴＴＴＶ（ＶはＡ、Ｃ、又はＧである）である。本発明のＲＮＡ分子は、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとともに複合体を形成するようにそれぞれデザインされ、かつ前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対応する１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して、対象とする塩基配列を標的とするようにデザインされる。
【0080】
いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、事実上、二本鎖又は一本鎖のいずれかで、細胞のゲノムにおける所望の位置にＤＮＡ切断を引き起こすために用いてもよい。最も一般的に用いられるＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲシステムに由来するが、他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼも、この明細書に記載したゲノム編集組成物及びゲノム編集方法における使用のために企図される。例えば、米国特許出願公開第2015/0211023号（参照によりその全内容が組み入れられる）を参照。
【0081】
本発明の実施に使用できるＣＲＩＳＰＲシステムは非常にさまざまである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のシステムであってもよい。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の限定するものではない例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ０、Ｃａｓｌ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘｌ０、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６が挙げられる。
【0082】
いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス種（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリクム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリアレス・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス種（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス種（Cyanothece sp.）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシロプトル・ベスキー（Caldicellulosiruptor bescii）、キャンディダトゥス・デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラネロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック種（Nostoc sp.）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ種（Arthrospira sp.）、リングビア種（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オシラトリア種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス・マリーナ（Acaryochloris marina）、又は既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする任意の種に由来してもよい。非培養性細菌によりコードされるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼも、本発明に関連して使用してもよい。（Burstein et al. Nature, 2017参照）。既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質のバリアント、例えば、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント、ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント又はＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアントも、本発明に関連して使用してもよい。
【0083】
したがって、Ｃａｓ９タンパク質若しくは改変されたＣａｓ９、若しくはＣａｓ９のホモログ若しくはオルソログといったＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１とそのホモログ及びオルソログといった他のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを、本発明の組成物に使用してもよい。別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、国際公開第2020/223514号及び国際公開第2020/223553号（それぞれの内容は参照により組み入れられる）に記載のヌクレアーゼも使用してもよい。
【0084】
ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと質的に共通した生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」には、天然配列の断片、並びに天然配列ポリペプチド及びその断片の誘導体（ただし、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。この明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を加水分解して断片にする能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントと、その共有結合性改変体及び融合体の両者を包含する。Ｃａｓポリペプチド又はその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質又はその断片の変異体、融合体、共有結合性改変体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。Ｃａｓタンパク質又はその断片、加えてＣａｓタンパク質又はその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から取得可能なものであってもよく、若しくは化学的に合成されるものであってもよく、又はこれらの方法の組合せにより得られるものであってもよい。細胞は、天然でＣａｓタンパク質を産生する細胞、又は、天然でＣａｓタンパク質を産生し、かつ、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、若しくは、内因性Ｃａｓと同じ若しくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように、遺伝子操作された細胞であってもよい。場合によっては、細胞は、天然ではＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。
【0085】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１である。Ｃｐｆ１は、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、ねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断によってＤＮＡを切断する。アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）及びラクノスピラ科（Lachnospiraceae）に由来する２つのＣｐｆ１酵素が、ヒト細胞において効率的にゲノム編集を行うことが示されている。（Zetsche et al., 2015参照）。
【0086】
したがって、Ｃａｓ９タンパク質若しくは改変されたＣａｓ９、若しくＣａｓ９のホモログ、オルソログ若しくはバリアントといったＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１及びそのホモログ、オルソログ若しくはバリアントといった他のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを、本発明で使用してもよい。
【0087】
いくつかの態様では、ガイド分子は、新しい性質又は向上した性質（例．分解に対する安定性、ハイブリダイゼーションエネルギー又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼとの結合性）を付与する１つ以上の化学修飾を含む。適切な化学修飾には、修飾塩基、修飾糖、又は修飾されたヌクレオシド間結合が挙げられるが、それらに限定されるものではない。適切な化学修飾の限定するものではない例には、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、β，Ｄ－ガラクトシルキューオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルプソイドウリジン、１－メチルグアノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、β，Ｄ－マンノシルキューオシン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン－５－オキシ酢酸－メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸、ワイブトキソシン、キューオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）－カルバモイル）スレオニン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、ワイブトシン、３－（３－アミノ－３－カルボキシ－プロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン又は１－メチルプソイドウリジンが挙げられる。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。
【0088】
ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによってＳＡＲＭ１アレルを標的とすることに加えて、細胞（例．造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）、γδＴ細胞、ｉＰＳｃ由来Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ｉＰＳ由来ＮＫＴ、単球又はマクロファージ）治療に使用するための、標的細胞内のＳＡＲＭ１発現を阻害する他の手段としては、ギャップマー、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、カスタマイズされたＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、低分子阻害剤、及び標的細胞において遺伝子の発現を低下させ又は排除するための当技術分野において知られている他の方法が挙げられるが、それらには限定されない。例えば、米国特許第6,506,559号；同第7,560, 438号；同第8,420,391号；同第8,552,171号；同第7,056,704号；同第7,078,196号；同第8,362,231号；同第8,372,968号；同第9,045,754号及び国際公開第2004/067736号；同第2006/097853号；同第2003/087341号；同第2000/041566号；同第2003/080809号；同第2010/079430号；同第2010/079430号；同第2011/072246号；同第2018/057989号；同第2017/164230号を参照、これらの内容全体は、参照により組み入れられる。
【0089】
有利には、この明細書で提示した少なくとも１つのガイド配列部分を含むガイドＲＮＡ分子は、細胞内でＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成した場合、他のガイドＲＮＡ分子と比べて改善されたＳＡＲＭ１ノックアウト効果をもたらす。これらの特別にデザインされた配列は、他のヌクレオチド標的化に基づいた遺伝子編集又は遺伝子サイレンシング方法、例えば、ｓｉＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼのために、ＳＡＲＭ１標的部位を特定することにも有用である可能性がある。
【0090】
細胞への送達
この明細書に記載した、ＳＡＲＭ１の発現を低下させ又は排除するのに有用な組成物は、適切な手段によって標的細胞に送達してもよい。本発明の方法でＳＡＲＭ１を標的とするために使用するＲＮＡガイド分子は、細胞治療のために対象に投与する予定の細胞又はそのような細胞とすることが予定されている細胞であって、ＳＡＲＭ１アレルを含む及び／又は発現する細胞に送達してもよい。例えば、本発明のある態様では、ＳＡＲＭ１アレルを特異的に標的とするＲＮＡ分子が標的細胞に送達され、標的細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、単球又はマクロファージである。細胞への送達は、in vivo、ex vivo又はin vitroで実施してもよい。いくつかの態様では、細胞への送達はex vivo又はin vitroで行われ、得られた改変細胞を必要とする対象に投与してもよい。いくつかの態様では、細胞への送達はin vivoで行われ、細胞の改変は、必要とする対象の内部で生じる。さらに、この明細書に記載した核酸組成物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター、又はそれらの組合せのうちの１つ以上として細胞に送達してもよい。
この明細書に記載した、ＳＡＲＭ１の発現を低下させ又は排除するのに有用な組成物は、適切な手段によって標的細胞に送達してもよい。本発明の方法でＳＡＲＭ１を標的とするために使用するＲＮＡガイド分子は、細胞治療のために対象に投与する予定の細胞又はそのような細胞とすることが予定されている細胞であって、ＳＡＲＭ１アレルを含む及び／又は発現する細胞に送達してもよい。例えば、本発明のある態様では、ＳＡＲＭ１アレルを特異的に標的とするＲＮＡ分子が標的細胞に送達され、標的細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、Ｔ細胞、自然免疫様Ｔ細胞（ｉＴ）ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）、単球又はマクロファージである。細胞への送達は、in vivo、ex vivo又はin vitroで実施してもよい。いくつかの態様では、細胞への送達はex vivo又はin vitroで行われ、得られた改変細胞を必要とする対象に投与してもよい。いくつかの態様では、細胞への送達はin vivoで行われ、細胞の改変は、必要とする対象の内部で生じる。さらに、この明細書に記載した核酸組成物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター、又はそれらの組合せのうちの１つ以上として細胞に送達してもよい。
【0091】
いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は化学修飾を含む。適切な化学修飾の限定するものではない例には、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、又は２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン及び１－メチルプソイドウリジンが挙げられる。それぞれの実現可能性は、この発明の個別の態様である。
【0092】
適切なウイルスベクター系を用いて、核酸組成物、例えば、本発明のＲＮＡ分子の組成物を送達してもよい。核酸を導入し、組織を標的とするために、通常のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子移入を行うことができる。ある特定の態様では、in vivo又はex vivo遺伝子治療のために核酸が投与される。非ウイルスベクター送達系には、裸の核酸、及び送達媒体（例．リポソーム又はポロキサマー）と複合体化した核酸が挙げられる。遺伝子治療の手順の総説は、Anderson (1992)；Nabel & Felgner (1993)；Mitani & Caskey (1993)；Dillon (1993)；Miller (1992)；Van Brunt (1988)；Vigne (1995)；Kremer & Perricaudet (1995)；Haddada et al. (1995)及びYu et al. (1994)を参照。
【0093】
核酸及び／若しくはタンパク質の非ウイルス性送達の方法には、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、パーティクルガン加速、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン若しくは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン、及び促進剤による核酸の取込みが挙げられ、又は、核酸及び／若しくはタンパク質は、細菌若しくはウイルス（例．アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、リゾビウム種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス（tobacco mosaic virus）、ジャガイモウイルスＸ（potato virus X）、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）、及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス（cassava vein mosaic virus））により植物細胞へ送達できる（例えば、Chung et al., 2006を参照）。例えばSonitron 2000系（Rich-Mar）を用いるソノポレーションも、核酸の送達に使用できる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性脂質媒介送達も、in vivo、ex vivo又はin vitro送達として企図される。（Zuris et al. (2015)を参照；Coelho et al. (2013)；Judge et al. (2006)及びBasha et al. (2011)も参照）。
【0094】
トランスポゾンに基づく系（例．組換えスリーピングビューティトランスポゾン系又は組換えPiggyBacトランスポゾン系）のような非ウイルスベクターを、標的細胞に送達してもよく、標的細胞において、組成物の分子の塩基配列又は組成物の分子をコードする塩基配列の転位に利用してもよい。
【0095】
他の代表的な核酸送達系には、Amaxa Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）及びCopernicus Therapeutics Inc.が提供するもの（例えば米国特許第6,008,336号参照）が含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号及び米国特許第4,897,355号で説明されており、リポフェクション試薬は市販されている（例．Transfectam（登録商標）、Lipofectin（登録商標）及びLipofectamine（登録商標）RNAiMAX）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質には、国際公開第91/17424号及び国際公開第91/16024号に開示されているものが含まれる。細胞（ex vivo投与）又は標的組織（in vivo投与）への送達が可能である。
【0096】
免疫脂質複合体といった標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Crystal, Science (1995)；Blaese et al., (1995)；Behr et al., (1994)；Remy et al. (1994)；Gao and Huang (1995)；Ahmad and Allen (1992)；米国特許第4,186,183号；同第4,217,344号；同第4,235,871号；同第4,261,975号；同第4,485,054号；同第4,501,728号；同第4,774,085号；同第4,837,028号及び同第4,946,787号を参照）。
【0097】
送達の別の方法には、送達する核酸をEnGeneIC送達媒体（ＥＤＶ）へパッケージングすることが含まれる。ＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を用いて、標的組織へ特異的に送達する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞内に入った後に、内容物が放出される。（MacDiarmid et al., 2009参照）。
【0098】
ウイルスによる核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルス系の使用は、ウイルスの標的を体内の特定の細胞とし、ウイルスペイロードを核へ輸送する高度に進化した方法を活用する。ウイルスベクターは、患者へ直接投与でき（in vivo）、又は、in vitroで細胞を処理するために使用でき、改変された細胞を患者へ投与する（ex vivo）。核酸を送達する従来のウイルス系には、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス及び単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【0099】
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み入れることにより変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、分裂していない細胞に形質導入又は感染できるレトロウイルスベクターであり、通常、ウイルス力価が高い。レトロウイルスの遺伝子移入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、シス作用性末端反復配列で構成され、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力がある。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、治療用遺伝子を標的細胞へ組み込み、導入遺伝子を永続的に発現させるために用いられる。広く用いられるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが挙げられる。（例えば、Buchschacher et al. (1992)；Johann et al. (1992)；Sommerfelt et al. (1990)；Wilson et al. (1989)；Miller et al. (1991)；国際公開第94/26877号を参照）。
【0100】
臨床試験における遺伝子移入のために、現在、少なくとも６つのウイルスベクターが利用でき、それらは、ヘルパー細胞株へ挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。
【0101】
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されたことがあるレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., 1995；Kohn et al., 1995；Malech et al., 1997を参照）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療の治験で使用された初めての治療用ベクターであった（Blaese et al., 1995）。ＭＦＧ－Ｓパッケージングベクターの形質導入効率は、５０％以上であった（Ellem et al., (1997)；Dranoff et al., 1997）。
【0102】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染する能力があるウイルス粒子を形成するために用いられる。そのような細胞には、アデノウイルス、ＡＡＶをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするＰｓｉ－２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子へパッケージングする産生細胞株により生成される。ベクターは、通常、パッケージング及び（該当する場合は）その後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットで置換されている。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、通常、パッケージング及び宿主ゲノムへの組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）のみを有する。ウイルスＤＮＡは細胞株においてパッケージングされ、その細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、つまり、ＩＴＲ配列を欠くが、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有する。その細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列の欠損のため、ヘルパープラスミドは大量にはパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性が高い熱処理によって軽減できる。さらに、バキュロウイルス系を用いて臨床スケールでＡＡＶを産生できる（米国特許第7,479,554号参照）。
【0103】
多くの遺伝子治療において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織に対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面のウイルス被覆タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所定の細胞に対する特異性を有するように改変できる。そのリガンドは、対象とする細胞に存在することが知られた受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Hanら(1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変でき、その組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス－標的細胞の組合せに拡張でき、その組合せでは、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、事実上、選択したいかなる細胞受容体に対しても特異的な結合親和性を有する抗体断片（例．ＦＡＢ又はＦｖ）を提示するように操作できる。この説明は、主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みを優先する特定の取込み配列を含むように操作できる。
【0104】
遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与により、例えば、全身投与（例．硝子体内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用により、in vivoで送達できる。
【0105】
ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例．リンパ球、骨髄穿刺、組織生検）又はユニバーサルドナー造血幹細胞へ、ex vivoで送達され、続いて、その細胞を患者へ、ベクターを組み入れている細胞の選択後に、再移植できる。限定するものではない代表的なex vivoアプローチは、培養のために患者から組織（例．末梢血、骨髄及び脾臓）を取り出し、培養細胞（例．造血幹細胞）に核酸を移入し、次いで、細胞を、患者の標的組織（例．骨髄及び脾臓）に生着させることを含んでいてもよい。いくつかの態様では、幹細胞又は造血幹細胞は、生存率増強剤で更に処理してもよい。
【0106】
診断、研究のための、又は（例えばトランスフェクト細胞の宿主への再注入による）遺伝子治療のためのex vivoでの細胞トランスフェクションは、当業者によく知られている。好ましい態様において、対象から細胞が単離され、核酸組成物がトランスフェクトされ、対象（例．患者）へ再注入される。ex vivoトランスフェクションに適したさまざまな細胞型は、当業者によく知られている（例えば、Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th edition, 2010)と、この文献の、患者から細胞を単離し、培養する方法の考察で引用されている文献を参照）。
【0107】
治療用核酸組成物を有するベクター（例．レトロウイルス、リポソーム）は、in vivoで細胞に形質導入するために、生物体へ直接投与することもできる。投与は、注射、注入、局所適用（例．点眼剤及びクリーム）及び電気穿孔を含むが、それらには限定されない、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触するように導入するために通常使用される経路による。そのような核酸を投与する適切な方法が利用でき、当業者によく知られており、特定の組成物を投与する複数の経路が使用できるが、特定の経路が、別の経路より迅速かつ効果的な反応を提供できる場合が多い。いくつかの態様によれば、組成物はＩＶ注射で送達される。
【0108】
導入遺伝子の免疫細胞（例．Ｔ細胞）への導入に適したベクターには、非組込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第2009/0117617号を参照。
【0109】
薬学的に許容される担体は、部分的には、投与する組成物によって、加えて、組成物の投与に用いる方法によって、決まる。したがって、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989の記載されているように、利用できる医薬組成物の幅広い種類の適切な製剤がある。
【0110】
開示した組成物及び方法は、患者のがん、疾患、障害又は感染症を治療する医薬の製造又は免疫治療にも使用してもよい。
【0111】
ＳＡＲＭ１遺伝子のアレルを特異的に標的とするＲＮＡガイド配列部分の例
ＳＡＲＭ１遺伝子を標的とするために多数のガイド配列を設計できるが、明細書に記載する方法を有効に実行するために、表１に記載され、配列番号１～１３４５７によって特定される塩基配列を具体的に選択した。ＳＡＲＭ１両アレルノックアウト細胞の例は、その全内容が参照によって組み込まれる、ＰＣＴ国際出願第PCT/US2021/034583号で提供される。この発明のいくつかの側面によれば、本明細書で開示するガイド分子は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、生存率の増加及び／又は機能性の増加を示すＳＡＲＭ１両アレルノックアウト細胞を生成するために利用してもよい。細胞の限定するものではない例は、肝臓細胞（例．肝細胞）、肺細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、皮膚細胞、膀胱細胞、眼の細胞、眼球細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、食道細胞、頭部の細胞、頚部の細胞、卵巣の細胞、精巣の細胞、前立腺細胞、胎盤細胞、上皮細胞、内皮細胞、脂肪細胞、腎臓／腎細胞、心臓細胞、筋肉細胞、血液細胞（例．白血球）、免疫細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞及び神経節細胞などの他に、これらの組合せを含む。
ＳＡＲＭ１遺伝子を標的とするために多数のガイド配列を設計できるが、明細書に記載する方法を有効に実行するために、表１に記載され、配列番号１～１３４５７によって特定される塩基配列を具体的に選択した。ＳＡＲＭ１両アレルノックアウト細胞の例は、その全内容が参照によって組み込まれる、ＰＣＴ国際出願第PCT/US2021/034583号で提供される。この発明のいくつかの側面によれば、本明細書で開示するガイド分子は、野生型のＳＡＲＭ１又は改変されていないＳＡＲＭ１を発現する対応細胞と比較して、生存率の増加及び／又は機能性の増加を示すＳＡＲＭ１両アレルノックアウト細胞を生成するために利用してもよい。細胞の限定するものではない例は、肝臓細胞（例．肝細胞）、肺細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、結腸細胞、皮膚細胞、膀胱細胞、眼の細胞、眼球細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、食道細胞、頭部の細胞、頚部の細胞、卵巣の細胞、精巣の細胞、前立腺細胞、胎盤細胞、上皮細胞、内皮細胞、脂肪細胞、腎臓／腎細胞、心臓細胞、筋肉細胞、血液細胞（例．白血球）、免疫細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞及び神経節細胞などの他に、これらの組合せを含む。
【0112】
表１は、上記態様においてＳＡＲＭ１アレルと関連付けるために説明したような使用のために設計されたガイド配列を示す。それぞれの操作したガイド分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧ又はＮＡＧにマッチするＰＡＭの隣に存在する対象とする標的ゲノムＤＮＡ配列と関連付けるように更に設計され、ここで、「Ｎ」は任意の核酸塩基である。ガイド配列は、例えばＳｐＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．１（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＮ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＣＧ）、ＳａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＧＲＲＴ）、ＳｐＲＹ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＲＮ若しくはＮＹＮ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆ１（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＴＴＴＶ）又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＮＶＲＹＭ）を含むが、これらに限定されない、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと連携して機能するように設計された。この発明のＲＮＡ分子は、それぞれ、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように設計されており、使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対応する１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して対象となる塩基配列を標的とするために設計されている。
【0113】
【表1】
【0114】
本発明の完全な理解を促すために実施例を示す。以下の実施例は、本発明の製造及び実施の代表的な様式の実例を示す。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例において開示される特定の態様に限定されず、これらの態様は実例的な目的のものに過ぎない。
【実施例】
【0115】
実験の詳細
実施例１ ＳＡＲＭ１ノックアウト分析
配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含むガイド配列部分を、ＨｅＬａ細胞においてＳｐＣａｓ９を使用して高いオンターゲット活性についてスクリーニングする。オンターゲット活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によって決定する。
実施例１ ＳＡＲＭ１ノックアウト分析
配列番号１～１３４５７のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドを含む連続する１７～５０ヌクレオチドを含むガイド配列部分を、ＨｅＬａ細胞においてＳｐＣａｓ９を使用して高いオンターゲット活性についてスクリーニングする。オンターゲット活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によって決定する。
【0116】
実施例２ ＳＡＲＭ１編集分析
ＳＡＲＭ１（Sterile alpha and toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）は、その活性が軸索変性と関連付けられるＮＡＤ＋ヒドロラーゼである。ＳＡＲＭ１の両アレルノックアウトのための最適なＲＮＡガイド分子を選択するために、ＳＡＲＭ１エクソンを標的とする２３個のＲＮＡガイド分子をＨｅＬａ細胞においてスクリーニングした（表２）。簡潔に述べれば、ＳｐＣａｓ９コーディングプラスミド（６４ｎｇ）を、ＲＮＡガイド分子を発現するＤＮＡプラスミド（２０ｎｇ）と９６ウェルプレートフォーマットにおいてjetOPTIMUS（登録商標）試薬（Polyplus）を使用して共トランスフェクトした。細胞をＤＮＡトランスフェクションの７２時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、内因性ゲノム領域を増幅するプライマーを使用してキャピラリー電気泳動のために使用した。図１Ａのグラフは、３回の独立した実験の編集の割合（％）の平均±標準偏差（ＳＴＤＶ）を示す。全てのＲＮＡガイド分子についてのキャピラリー電気泳動データの分析は１０％～９０％の活性範囲を示す。
ＳＡＲＭ１（Sterile alpha and toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）は、その活性が軸索変性と関連付けられるＮＡＤ＋ヒドロラーゼである。ＳＡＲＭ１の両アレルノックアウトのための最適なＲＮＡガイド分子を選択するために、ＳＡＲＭ１エクソンを標的とする２３個のＲＮＡガイド分子をＨｅＬａ細胞においてスクリーニングした（表２）。簡潔に述べれば、ＳｐＣａｓ９コーディングプラスミド（６４ｎｇ）を、ＲＮＡガイド分子を発現するＤＮＡプラスミド（２０ｎｇ）と９６ウェルプレートフォーマットにおいてjetOPTIMUS（登録商標）試薬（Polyplus）を使用して共トランスフェクトした。細胞をＤＮＡトランスフェクションの７２時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、内因性ゲノム領域を増幅するプライマーを使用してキャピラリー電気泳動のために使用した。図１Ａのグラフは、３回の独立した実験の編集の割合（％）の平均±標準偏差（ＳＴＤＶ）を示す。全てのＲＮＡガイド分子についてのキャピラリー電気泳動データの分析は１０％～９０％の活性範囲を示す。
【0117】
さらに、ＨｅＬａ細胞においてＯＭＮＩ-５０（配列番号１３４７１）及びＯＭＮＩ-７９（配列番号１３４７２）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いてスクリーニングを行った。トランスフェクション条件は、ＳｐＣａｓ９トランスフェクションの条件と同一であった。編集効率を次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析によって測定した。ＯＭＮＩ-５０のｇ１３による編集効率は４３％（ＳＴＤＶ＝３．９４）であった。ＯＭＮＩ-７９のｇ３３による編集効率は３５％（ＳＴＤＶ＝４．２）であった。図１Ｂを参照。ＲＮＡガイド分子のガイド配列部分を表４に示す。
【0118】
ＲＮＡガイド分子がナンセンスコドン介在的分解（ＮＭＤ）によってＳａｒｍ１ノックアウトを付与することを検証するために、ＳＡＲＭ１を発現するマウスＮｅｕｒｏ－２ａ細胞を使用した。ＨｅＬａスクリーニングからのヒトＳＡＲＭ１を標的とする１０個の最も活性のガイドＲＮＡ分子の効果を試験するために、発明者らは、ヒトガイドＲＮＡ分子に対応するマウスＳＡＲＭ１ ＤＮＡを標的とする１０個のマウスに特異的なガイドＲＮＡ分子を特定した。マウスＲＮＡガイド分子の活性をマウス細胞で試験した。簡潔に述べれば、１５０×１０３個のＮｅｕｒｏ－２ａ細胞を、１０５ピコモルのＳｐＣａｓ９タンパク質及び１２０ピコモルのｓｇＲＮＡから構成されるプレアセンブルされたＲＮＰと混合し（表３を参照）、１００ピコモルのエレクトロポレーション増強剤（ＩＤＴ－１０７５９１６）と混合し、ＤＳ－１３４プログラムを応用することによってSF cell 4D-nucleofector X Kit S（PBC2-00675, Lonza）を使用してエレクトロポレートした。細胞の画分をエレクトロポレーションの７２時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを抽出して、ＮＧＳによってオンターゲット活性を測定した。ＮＧＳ分析によれば、全てのガイドＲＮＡ分子は、高い挿入又は欠失（インデル）活性を示した（図２）。
【0119】
ＳＡＲＭ１転写物のレベルに対する編集の効果を評価するために、全ＲＮＡをＮｅｕｒｏ－２ａ細胞からエレクトロポレーションの７日後に抽出し、Ｓａｒｍ１のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果は、ナンセンスコドン介在的分解（ＮＭＤ）に起因するＳａｒｍ１ ｍＲＮＡのレベルにおける８０％より大きい低下を実証している（図３）。
【0120】
次に、独特のＰＡＭ要件を示す新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＯＭＮＩ-１０３（配列番号１３４７３）をＳＡＲＭ１の編集について試験した。このヌクレアーゼを上記のようにＨｅＬａ細胞で試験した。この目的のために、ヒトゲノム中の特定の位置を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡ分子（表５Ａに示すガイド配列部分（ｇＲＮＡ）の配列）とともに、対応するＯＭＮＩ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（ｐｍＯＭＮＩ、表７）を使用して、ＨｅＬａ細胞中にＯＭＮＩ-１０３をトランスフェクトした。７２時間後に細胞を採取し、トランスフェクション効率を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をマーカーとして利用するＦＡＣＳで定量化するために、細胞の半数を使用した。残りの細胞を溶解し、それらのゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応を行い、対応する推定ゲノム標的を増幅した。アンプリコンをＮＧＳにかけ、次いで、得られた配列を使用して、それぞれの標的部位における編集の割合を算出した。切断部位の周辺の短い挿入又は欠失（インデル）は、ヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ切断後のＤＮＡ末端の修復の代表的な結果である。したがって、編集の割合（％）の算出を、それぞれのアンプリコンの配列に含まれるインデルの比率から推定した。表５Ｂ及び図４を参照。
【0121】
実施例３ ＳＡＲＭ１編集ＮＫ細胞アッセイ
代謝アッセイ
解糖及び酸化的ミトコンドリア代謝： Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit及びSeahorse XF Cell Mito Stress Kit（Agilent Technologies）を使用して、解糖及び酸化的ミトコンドリア代謝を同時に分析するための改変した製造元の説明書に従ってSeahorseアッセイを行う。簡潔に述べれば、ＮＫ及びｉＮＫ細胞を洗浄し、グルコースを含まない培地（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁する。１．５×１０５個の細胞をウェルごとに３連でプレーティングし、Seahorse Xfe96 Analyzer（Agilent Technologies）で分析する。グルコース、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ピルビン酸ナトリウム、ロテノン及びアンチマイシンＡを段階的に注入して代謝機能を測定する。ＳＲＣ測定値は、平均最大ＯＣＲ値から平均基底ＯＣＲ値を引いたものとして算出する。ＡＴＰ関連呼吸（ATP-linked respiration）は、平均基底ＯＣＲ値から平均ポストオリゴマイシン値を引いたものとして算出する。解糖は、平均ポストグルコースＥＣＡＲ値から平均基底ＥＣＡＲ値を引いたものとして算出する。解糖予備能は、平均最大ＥＣＡＲ値からポストグルコースＥＣＡＲ値を引いたものとして算出する。
代謝アッセイ
解糖及び酸化的ミトコンドリア代謝： Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit及びSeahorse XF Cell Mito Stress Kit（Agilent Technologies）を使用して、解糖及び酸化的ミトコンドリア代謝を同時に分析するための改変した製造元の説明書に従ってSeahorseアッセイを行う。簡潔に述べれば、ＮＫ及びｉＮＫ細胞を洗浄し、グルコースを含まない培地（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁する。１．５×１０５個の細胞をウェルごとに３連でプレーティングし、Seahorse Xfe96 Analyzer（Agilent Technologies）で分析する。グルコース、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ピルビン酸ナトリウム、ロテノン及びアンチマイシンＡを段階的に注入して代謝機能を測定する。ＳＲＣ測定値は、平均最大ＯＣＲ値から平均基底ＯＣＲ値を引いたものとして算出する。ＡＴＰ関連呼吸（ATP-linked respiration）は、平均基底ＯＣＲ値から平均ポストオリゴマイシン値を引いたものとして算出する。解糖は、平均ポストグルコースＥＣＡＲ値から平均基底ＥＣＡＲ値を引いたものとして算出する。解糖予備能は、平均最大ＥＣＡＲ値からポストグルコースＥＣＡＲ値を引いたものとして算出する。
【0122】
ＡＴＰ定量化アッセイ： １ウェル当たり１×１０５個のＮＫ及びｉＮＫ細胞を、ATP Bioluminescence Assay Kit HS II（Sigma Aldrich）とInfinite M200 PRO Luminometer（Tecan）を使用して分析する。
【0123】
ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨ定量化アッセイ： ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨ濃度を、NAD/NADH Cell-Based Assay Kit（Cayman Chemical）を使用して製造元の説明のとおりに定量化し、Infinite M200 PRO Luminometerを用いて分析する。酸化ストレスの分析のために、ＮＫ及びｉＮＫ細胞を過酸化水素（Sigma Aldrich）と１時間培養する。処理後に、５ｍＭ MitoSox Indicator Dye（Thermo Fisher）を含む無血清培地中で細胞を培養する。次いで細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析のために抗ＣＤ５６抗体及び定着性生存色素（fixable viability dye）で対比染色する。代謝物の質量分析のために、ｉＮＫ細胞及び増殖させた末梢血ＮＫ細胞を液体窒素中で瞬間凍結し、メタボロミクスを行う。
【0124】
殺傷アッセイ
細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ： 腫瘍標的細胞をＣＦＳＥ染色し、５％ＦＢＳを含む培地に再懸濁する。ＮＫエフェクター細胞を標的細胞と９６ウェルプレート中５：１のＥ：Ｔ比及びヨウ化プロピジウムの存在下で共培養する。共培養された細胞をIncuCyte（Sartorius）、生細胞分析システムに最大２４時間入れ、死んだ標的細胞を示す二重染色された細胞によってＮＫ細胞の殺傷能力を定量化する。
細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ： 腫瘍標的細胞をＣＦＳＥ染色し、５％ＦＢＳを含む培地に再懸濁する。ＮＫエフェクター細胞を標的細胞と９６ウェルプレート中５：１のＥ：Ｔ比及びヨウ化プロピジウムの存在下で共培養する。共培養された細胞をIncuCyte（Sartorius）、生細胞分析システムに最大２４時間入れ、死んだ標的細胞を示す二重染色された細胞によってＮＫ細胞の殺傷能力を定量化する。
【0125】
３次元腫瘍スフェロイド細胞毒性アッセイ： 腫瘍細胞を数日間培養してスフェロイドを形成させる。次いで４×１０４個のＮＫ又はｉＮＫ細胞をそれぞれのウェルに穏やかに加え、細胞を数日間共培養した。培養の終了時に、それぞれのウェル中の細胞を破砕して単一細胞懸濁液とし、フローサイトメトリー分析のために蛍光コンジュゲートしたＣＤ５６抗体及び定着性生存色素で染色する。腫瘍細胞をNucLight Redに基づいて定量化し、ＮＫ又はｉＮＫ細胞をＣＤ５６発現に基づいて定量化する。
【0126】
ＳＡＲＭ１編集ＮＫ細胞のin vivo保持モデル：
ＮＳＧマウスにおける保持モデルを使用して、編集したＮＫ細胞のin vivo機能性を試験する。３つの実験群（対照、編集した細胞及び編集していない細胞）を使用する。マウスに１日当たり３００ｒａｄの照射を行った後に細胞を注入する。細胞を２００μｌの緩衝液に再懸濁し、マウスの静脈内に注入する。ＩＬ２及びＩＬ１５を腹腔内に注入する。注入の３～４日後にマウスを屠殺し、骨髄及び脾臓を分析してＮＫ保持能力を測定する。アッセイを要約する表を以下に示す：
ＮＳＧマウスにおける保持モデルを使用して、編集したＮＫ細胞のin vivo機能性を試験する。３つの実験群（対照、編集した細胞及び編集していない細胞）を使用する。マウスに１日当たり３００ｒａｄの照射を行った後に細胞を注入する。細胞を２００μｌの緩衝液に再懸濁し、マウスの静脈内に注入する。ＩＬ２及びＩＬ１５を腹腔内に注入する。注入の３～４日後にマウスを屠殺し、骨髄及び脾臓を分析してＮＫ保持能力を測定する。アッセイを要約する表を以下に示す：
【0127】
【表A】
【0128】
【表2】
【0129】
【表3】
【0130】
【表4】
【0131】
【表5A】
【0132】
【表5B】
【0133】
【表6】
【0134】
【表7】
【0135】
実施例４ ＮＫ細胞におけるＳＡＲＭ１のノックアウトはＮＫ細胞の殺傷活性を向上させる
序論
ＳＡＲＭ１（Sterile alpha and Toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）は、その活性が軸索変性と関連付けられるＮＡＤ＋ヒドロラーゼである。ＧＭＸ１７７８は、ＮＡＤ＋生合成酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の強力で特異的な阻害剤である。ＧＭＸ１７７８によるＮＡＭＰＴの選択的な阻害は、ＮＡＤ＋の産生を遮断し、細胞死をもたらす。そのため、ＮＡＭＰＴは、細胞内ＮＡＤ濃度の重要な制御因子であり、結果的にエネルギー代謝の重要な制御因子でもある。図５を参照。
序論
ＳＡＲＭ１（Sterile alpha and Toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1）は、その活性が軸索変性と関連付けられるＮＡＤ＋ヒドロラーゼである。ＧＭＸ１７７８は、ＮＡＤ＋生合成酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の強力で特異的な阻害剤である。ＧＭＸ１７７８によるＮＡＭＰＴの選択的な阻害は、ＮＡＤ＋の産生を遮断し、細胞死をもたらす。そのため、ＮＡＭＰＴは、細胞内ＮＡＤ濃度の重要な制御因子であり、結果的にエネルギー代謝の重要な制御因子でもある。図５を参照。
【0136】
結果
編集及びＮＧＳ： ２×１０６個の解凍した初代ＮＫ細胞を５日間増殖させ、次いで１１３ピコモルのＳｐＣａｓ９及び２２６ピコモルのＳＡＲＭ１＿ｇ９１ ｇＲＮＡ（ＧＵＡＣＵＧＧＵＧＧＣＡＡＡＣＣＣＡＧＵ（配列番号１１１０４））をエレクトロポレートした。７日後に細胞をＮＧＳ分析したところ、ＳＡＲＭ１の９０％の編集を示した。図６Ａを参照。
編集及びＮＧＳ： ２×１０６個の解凍した初代ＮＫ細胞を５日間増殖させ、次いで１１３ピコモルのＳｐＣａｓ９及び２２６ピコモルのＳＡＲＭ１＿ｇ９１ ｇＲＮＡ（ＧＵＡＣＵＧＧＵＧＧＣＡＡＡＣＣＣＡＧＵ（配列番号１１１０４））をエレクトロポレートした。７日後に細胞をＮＧＳ分析したところ、ＳＡＲＭ１の９０％の編集を示した。図６Ａを参照。
【0137】
殺傷アッセイ： エレクトロポレーションの１０日後に、６，２５０個のＮＫ細胞を、ＧＦＰで標識された２，５００個のＭＣＦ７標的細胞とともに、３連でプレーティングした。共培養物を２．５：１のＥ：Ｔ比で２４時間インキュベートした。画像を１時間ごとにIncucyte（登録商標）で撮影した。殺傷アッセイ培地は、１０％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を補充したＭＥＭ－αであった。図６Ｂを参照。
【0138】
生存率（ATPlite）アッセイ： エレクトロポレーションの１５日後に、５０，０００個のＳＡＲＭ１＿ｇ９１＿ＫＯ及び非処理（ＮＴ）細胞を、ＧＭＸ１７７８の濃度を増加させながら３連でプレーティングし、４８時間インキュベートした。細胞生存率をATPliteキットによって定量化した。図６Ｃを参照。
【0139】
結論
これらの結果は、ＳＡＲＭ１ノックアウトＮＫ細胞がＧＭＸ１７７８処理（ＳＡＲＭ１誘導剤）によって細胞生存率が向上することを示し、ＳＡＲＭ１ノックアウトＮＫ細胞の殺傷能力が向上することも示す。
これらの結果は、ＳＡＲＭ１ノックアウトＮＫ細胞がＧＭＸ１７７８処理（ＳＡＲＭ１誘導剤）によって細胞生存率が向上することを示し、ＳＡＲＭ１ノックアウトＮＫ細胞の殺傷能力が向上することも示す。
【0140】
そのため、この実施例の結果は、ＮＫ細胞におけるＳＡＲＭ１のノックアウトがＮＫ細胞の殺傷活性を向上させるという概念実証となる。他のヌクレアーゼ及びガイド分子の組合せを、ＳＡＲＭ１をノックアウトし、同じ効果を達成するために使用してもよい。これらの予想外の結果は、ＮＫ細胞におけるＳＡＲＭ１のノックアウトがＮＫ細胞の殺傷活性を向上させることを示す最初のものである。そのため、ＳＡＲＭ１－ＫＯ ＮＫ細胞は、免疫治療、例えば、がん治療で使用してもよい。
【0141】
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【配列表】
【国際調査報告】