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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】細胞の分析のための検電撮像のための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20241112BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20241112BHJP
G01N 27/414 20060101ALI20241112BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241112BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
G01N33/483 F
G01N27/414 301Y
C12M1/34 D
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521274
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-04-09
(86)【国際出願番号】 US2022078760
(87)【国際公開番号】W WO2023076984
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,361
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
(71)【出願人】
【識別番号】502221282
【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100130937
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100144451
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 博子
(74)【代理人】
【識別番号】100123630
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 誠
(72)【発明者】
【氏名】パーカー スコット
(72)【発明者】
【氏名】デヴィルデレ ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】ドノヒュー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】チリン デイジー
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045CB01
2G045FA11
4B029AA07
4B029BB01
4B029FA10
4B029FA15
4B063QA20
4B063QQ05
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの表面上に配設された細胞を分析することは、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことを含み得、センサアレイのＣｈｅｍＦＥＴセンサが、ｐＨのステップ変化に応答して信号を生成して、検電画像データを生成する。取得時間間隔中に、検電画像データの複数のフレームが取得される。各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたセンサアレイによって生成された信号サンプルに対応する。各フレームが、画素を含み、フレーム内の所与の画素が、センサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する。検電画像データが、信号サンプルの特性に基づいて、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する背景領域と、にセグメント化される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法であって、前記センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことであって、前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された前記溶液の前記ｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成する、流すことと、
取得時間間隔中に前記検電画像データの複数のフレームを取得することであって、各フレームが、前記取得時間間隔中のサンプリング時間において測定された前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された前記複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、前記フレーム内の所与の画素が、前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、
流された前記溶液の前記ｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される前記信号サンプルの特性に基づいて、前記検電画像データを、前記センサアレイ表面上の前記細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しない前記センサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む、方法。
【請求項2】
各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、前記フレームの画素のサブセットを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記セグメント化するステップが、前記取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記セグメント化するステップが、前記ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することと、
前記ピークツーピーク画像内の各画素値から前記平均値を減算して、差分画像を形成することと、
前記差分画像内の各画素の絶対値を計算することと、を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記セグメント化するステップが、前記タイルの各画素に対応する前記信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記セグメント化するステップが、前記ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含み、前記ぼかし関数が、前記ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記セグメント化するステップが、前記ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、前記閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、前記閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記セグメント化するステップが、前記粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する前記粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記セグメント化するステップが、前記フィルタリングされた細胞マスクの選択された前記特徴に分水界アルゴリズムを適用して、前記フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記セグメント化するステップが、前記細胞マスク内の最も近いサブ領域について、細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて、前記細胞マスクを検証することと、
前記ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための前記細胞領域及び前記背景領域を判定することと、を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するためのシステムであって、プロセッサと、前記プロセッサと通信可能に接続されたデータストアと、を備え、前記プロセッサが、命令を実行するように構成され、前記命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記システムに、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、前記検電画像データが、前記センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことに応答して生成され、前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された前記溶液の前記ｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、前記検電画像データを生成し、各フレームが、前記取得時間間隔中のサンプリング時間において測定された前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された前記複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、前記フレーム内の所与の画素が、前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、
流された前記溶液の前記ｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される前記信号サンプルの特性に基づいて、前記検電画像データを、前記センサアレイ表面上の前記細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しない前記センサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む方法を行わせる、システム。
【請求項12】
各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、前記フレームの画素のサブセットを備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記セグメント化するステップが、前記取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項14】
前記セグメント化するステップが、前記ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することと、
前記ピークツーピーク画像内の各画素値から前記平均値を減算して、差分画像を形成することと、
前記差分画像内の各画素の絶対値を計算することと、を更に含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項15】
前記セグメント化するステップが、前記タイルの各画素に対応する前記信号サンプルの前記特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項16】
前記セグメント化するステップが、前記ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含み、前記ぼかし関数が、前記ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項17】
前記セグメント化するステップが、前記ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、前記閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、前記閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記セグメント化するステップが、前記粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する前記粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
前記セグメント化するステップが、前記フィルタリングされた細胞マスクの選択された前記特徴に分水界アルゴリズムを適用して、前記フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
前記セグメント化するステップが、前記細胞マスク内の最も近いサブ領域について、細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて、前記細胞マスクを検証することと、
前記ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための前記細胞領域及び前記背景領域を判定することと、を更に含む、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年１０月２７日出願の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく米国仮出願第６３／２７２，３６１号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月２７日出願の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく米国仮出願第６３／２７２，３６１号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【0002】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法は、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことであって、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成する、流すことと、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含み得る。
新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に明らかにされている。本教示の特徴及び利点のより良好な理解は、例解的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより得られるであろう。
新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に明らかにされている。本教示の特徴及び利点のより良好な理解は、例解的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0003】
【図1A】本教示のシステム及び方法の様々な実施形態による、検電画像を生成する、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）ベースの細胞分析システムを描写するブロック図である。
【図1B】本教示の細胞分析システム上に配置された細胞の概略描写図である。
【図1C】本教示のセンサデバイス上に配置された細胞の概略断面図である。
【図2A】一連の２Ｄ画像として表される取得時間間隔中のセンサアレイからの出力信号の一例を例解する。
【図2B】例示的なＣｈｅｍＦＥＴセンサの属性をまとめた表である。
【図2C】様々な細胞サイズにわたる細胞分析のためのＣｈｅｍＦＥＴシステム属性を表示する表である。
【図3】一実施形態による、検電画像データを処理する全般的な概要を示すブロック図である。
【図4A】一実施形態による、検電画像セグメント化３０４のブロック図である。
【図4B】一実施形態による、コンセンサス細胞マスクを形成するためのブロック図である。
【図4C】最終的なコンセンサス細胞マスクを形成するための例示的なブロック図である。
【図5】画素値の局所空間平均を計算するために使用され得る畳み込みカーネルの例（縮尺通りではない）を示す。
【図6A】ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答するタイルのグレースケール画像の例を示す。
【図6B】タイルに対する粗い細胞マスクの例を示す。
【図6C】局所背景補正細胞マスクのタイルの例を示す。
【図6D】ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答する単一画素に対応するセンサ信号の例である。
【図6E】細胞領域及び背景領域を有するタイルの例を示す。
【図7】単一細胞領域及び局所背景領域の一例の例解図である。
【図8】２つの細胞領域及び２つの局所背景領域の一例の例解図である。
【図9】関心対象の細胞領域から信号データを抽出するための例示的なブロック図である。
【図10】タイル画像、セグメント化結果、及び抽出された信号データの例を示す。
【図11A】経時的な平均ＲＯＩ信号値の平均及び標準偏差のプロットの例を示す。
【図11B】４２～６４μｍのサイズ範囲内の複数の細胞についての平均ＲＯＩ信号値の最大値の棒グラフの例を示す。
【図12A】取得期間にわたる細胞領域内の画素の最大振幅の空間プロットの一例を示す。
【図12B】取得期間にわたる細胞領域内の画素の最小振幅の空間プロットの一例を示す。
【図12C】取得期間にわたる細胞領域内の画素のピーク値に対する時間の空間プロットの一例を示す。
【図12D】取得期間にわたる細胞領域内の画素のトラフ値に対する時間の空間プロットの一例を示す。
【図13】１０１個の細胞の細胞サイズのヒストグラム及び統計値の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【0004】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイベースのシステムを使用する細胞の検電撮像は、フローセルに装着されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に細胞のサンプルをプレーティングすることを含み得る。細胞のサンプル内の各細胞は、センサアレイ表面上にフットプリントを有する。ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイベースのシステムは、細胞のサンプルに対する実験中にＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の各センサの信号を出力するように構成されている。各センサの出力信号は、アナログ－デジタル変換器によって瞬間的にサンプリングされる。時間的な特定の瞬間におけるＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイについてのサンプリングされた信号は、二次元検電画像として表され得る。
【0005】
図１Ａは、概して、本教示による、細胞分析システム１００の例示的なコンポーネントのブロック図を例解している。図１Ａにおいて描写されるように、細胞分析システム１００は、様々な流体システム、並びにアレイコントローラ５０、ユーザインターフェース６０、及びセンサアレイデバイスアセンブリ１１５を含むことができる。本明細書でより詳細に説明されるように、様々な細胞分析は、センサアレイデバイスアセンブリ１１５のセンサアレイデバイス１１０を使用して実行することができる。本教示とともに使用するための細胞分析システムの構造及び／又は設計は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年３月１９日に出願された米国特許出願公開第２０２０／００８８６７６号に説明される１つ以上の特徴を含み得る。
【0006】
図１Ｂは、概して、細胞分析システム１００Ａの写実描写を例解している。図１Ｂに描写されるように、核２及び細胞膜４のある細胞５は、マイクロウェルの複数のサブセット上に配置され、それにより、細胞５が対応するセンサのサブセット上に占める、接触面積又はフットプリントを定義する。本明細書に列記されているように、「接触面積」及び「フットプリント」は、同義的に使用することができる。細胞分析システム１００Ａは、図１Ａの細胞分析システム１００の概略描写について説明されるものと同じ特徴のうちの多くを共有している。図１Ｂの細胞分析システム１００Ａは、試薬流体システム１０及び洗浄溶液流体システム２０を含むことができる。試薬流体システム１０は、図１Ｂの試薬容器１１Ａ～１１Ｄなどの、複数の試薬容器を含むことができる。各試薬容器は、図１Ｂの、試薬流体ライン１３Ａ～１３Ｄなどの、試薬流体ラインと流体連通することができる。本教示の細胞分析システムの各試薬流体ラインからの流動は、図１Ｂの試薬流体ラインバルブ１５Ａ～１５Ｄなどの、バルブによって制御することができる。洗浄溶液流体システム２０は、既知の電解質組成の洗浄溶液を収容することができる洗浄溶液容器２１、並びに洗浄溶液流体ライン２３、洗浄溶液流体ラインバルブ２５、及び洗浄溶液流体ライン２３内の基準電極２７を含むことができる。本明細書でより詳細に説明されるように、基準電極２７は、センサアレイデバイス内のセンサに安定した基準電圧１２７を提供することができる。そのため、図１Ｂのセンサアレイデバイス１１０は、試薬流体システム１０及び洗浄溶液流体システム２０と流体連通することができる。図１Ｂには示されていないが、センサアレイデバイスと連通することができる、追加の電極は、図１Ｂの細胞５などの、センサアレイ上の細胞に電気的刺激を提供するように、利用することができる。
【0007】
センサアレイデバイス１１０は、センサアレイ又は画素アレイ１２０を含むことができる。本明細書に列記されているように、「センサ」及び「画素」という用語、並びに「デバイス」及び「チップ」という用語、並びにこれらの用語の派生物は、同義的に使用することができる。追加的に、「センサアレイ」及び「ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ」、並びにそれらの派生物は、同義的に使用することができる。図１Ｂには通常のアレイとして二次元アレイが描写されているが、本教示のセンサアレイの様々な実施形態は、様々なアレイ形状、例えば、六方最密充填形状に配置することができる。センサアレイデバイス１１０は、マイクロウェルアレイ１２２を含むことができ、これは、図１Ｂに例解されるように、センサアレイ１２０内の各センサ又は画素と協調的に係合する各マイクロウェルを描写し、その結果、マイクロウェル１２２Ａ１からマイクロウェル１２２Ａ６の各々は、対応するセンサ１２０Ａ１からセンサ１２０Ａ６と協調的に係合する。しかしながら、本教示のセンサアレイデバイスの様々な実施形態では、ウェルごとに２つ以上の画素が存在することができる。本明細書でより詳細に説明されるように、本教示の様々なタイプのセンサアレイデバイスは、定義されているが異なるマイクロウェルの深さで製造することができる。本教示の更に他のタイプのセンサアレイデバイスは、センサアレイ上に形成されたマイクロウェル構造を有しないことがあり得る。センサアレイ１２０の各センサは、マイクロウェルアレイ１２２内の流体と流体連通する感知表面を有することができる。本教示の細胞分析システム１００の様々な実施形態では、センサアレイ１２０の各センサは、化学電界効果トランジスタ（chemical field-effect transistor、ＣｈｅｍＦＥＴ）であり得、センサアレイ１２０内の各センサが、少なくとも１つの化学感応性電界効果トランジスタを含む。本教示によれば、センサアレイ１２０は、例えば、グルコース、スクロース、乳酸塩及び尿素などの、細胞生物学の関心対象の標的化学種の分析のために選択的に改変された感知表面で製造することができる、ＣｈｅｍＦＥＴを含むことができる。別の非限定的な例として、イオン感応性電界効果トランジスタ（ion sensitive field-effect transistor、ＩＳＦＥＴ）は、関心対象の様々なイオン、特に、水素、カリウム、カルシウム及び塩化物のような様々な細胞代謝研究について選択的であるように変更された感知表面を有することができる。
【0008】
その点に関して、本発明者らは、本教示の細胞分析システムの様々な実施形態が、例えば、様々な条件又は刺激のいずれかに供された細胞の細胞電気生理学及び代謝の変化を監視するように使用することができることを認識した。そのうえ、本発明者らは、ＣｈｅｍＦＥＴセンサの感知表面の電位の変化を引き起こすことができる細胞の状態における変化が、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの様々な実施形態のセンサによって監視することができることを認識した。例えば、本発明者らは、細胞膜を横切る電位が、化学的又は電気的刺激に応答して変化すると、細胞膜を横切る電位の変化が、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの様々な実施形態のセンサによって検出することができるように、細胞が、センサの感知表面に容量的に結合されていることを認識している。追加的に、任意の変化、例えば、ＣｈｅｍＦＥＴセンサの感知表面の電位の変化を引き起こし得る細胞代謝における変化は、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの様々な実施形態のセンサによって検出することができる。本明細書でより詳細に説明されるように、そのような変化は、例えば、状態又は刺激に応答して細胞から流れる可能性のある細胞流出の場合など、センサアレイ表面上に固定された細胞の接触面積又はフットプリントに関連して局所的に検出することができるか、又は細胞フットプリントに関連しないエリアで検出することができる。
【0009】
本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスの様々な実施形態での、様々な刺激への細胞応答を監視する実験において収集されたデータは、多数の形式でエンドユーザに提示することができる。１つの形式において、時間応答は、時間の関数としての感知表面電位におけるミリボルト（ｍＶ）変化と容易に相関させることができる、検出器カウントとして提示される。別の形式において、選択されたアプリケーションの過程にわたる選択された時間のいずれかについて、細胞の空間的視覚化は、検電画像として提示することができる。本発明者らは、検電撮像が、生細胞に対して誘発することができる、様々な応答に基づいているので、例えば、センサアレイ上の細胞を視覚化するための一般的なツールとして有用であり得ることを認識した。例えば、センサアレイに固定された細胞の検電画像を確認することによって、エンドユーザは、実験を実行する前にアプリケーション構成の一部として関心対象のエリアを選択することができる。本明細書でより詳細に説明されるように、センサアレイデバイスの選択されたエリアをウィンドウダウンすることにより、実験のデータ速度が増加する。本教示によれば、高いデータ速度と結合された細胞のフットプリントにわたる実質的な画素被覆は、例えば、サブミリ秒範囲のデータ速度が必要とされ得る、様々な興奮性細胞の活動電位の細胞内監視を提供することができる。
【0010】
図１Ｃにおいて、センサアレイ１２０の部分断面図は、第１のセンサ１２０－１及び第２のセンサ１２０－２とともに描写されている。本教示のセンサアレイデバイスの様々な実施形態において、センサアレイ１２０は、センサフローティングゲート構造１４０に結合されたフローティングゲート上部１３０を含むことができる。代替的に、本教示のセンサアレイデバイスの様々な実施形態では、センサアレイ１２０は、センサフローティングゲート構造１４０を含むことができる。本明細書でより詳細に説明されるように、フローティングゲート上部１３０は、誘電体１３５において形成された、上部金属層、センサプレート１３２、並びに金属ビア１３４を含むことができる。
【0011】
センサフローティングゲート構造１４０は、金属ビア１３４を通ってセンサプレート１３２に結合された金属層１３６を有することができる。金属層１３６は、センサフローティングゲート構造１４０における最上部のフローティングゲート導体である。例解される例において、センサフローティングゲート構造１４０は、誘電体材料１５０の層内に導電性材料の複数の層を含む。センサ１２０－１及び１２０－２は、半導体基板１６０内にソース／ドレイン領域１４２及びソース／ドレイン領域１４４を含む導通端子を含むことができる。ソース／ドレイン領域１４２及びソース／ドレイン領域１４４は、基板１６０の導電率タイプとは異なるタイプの導電率を有するドープされた半導体材料を含む。例えば、ソース／ドレイン領域１４２及びソース／ドレイン領域１４４は、ドープされたＰ型半導体材料を含むことができ、基板１６０は、ドープされたＮ型半導体材料を含むことができる。チャネル領域１５２は、ソース／ドレイン領域１４２及びソース／ドレイン領域１４４を分離する。フローティングゲート構造１４０は、チャネル領域１４６を覆い、ゲート誘電体１５２によって基板１６０から分離されている。ゲート誘電体１５２は、例えば、二酸化ケイ素であることができる。代替的に、他の好適な誘電体、例えば、より高い誘電率を有する材料、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、窒化ケイ素（Ｓｉ3Ｎ4）、酸窒化ケイ素（Ｓｉ2Ｎ2Ｏ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、二酸化ハフニウム（ＨｆＯ2）、酸化スズ（ＳｎＯ2）、酸化セシウム（ＣｅＯ2）、酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化タングステン（ＷＯ3）、酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）、酸化ランタン（Ｌａ2Ｏ3）、酸化ガドリニウム（Ｇｄ2Ｏ3）、及びそれらの任意の組み合わせなどが、ゲート誘電体１５２のために使用することができる。
【0012】
本明細書でより詳細に説明されるように、センサプレート１３２の感知表面１２６Ｓは、例えば、様々な条件又は刺激のいずれかに供された細胞の細胞電気生理学及び代謝の変化を監視するためのセンサ表面として機能することができる。その点に関して、細胞の部分断面として図１Ｃにおいて示される細胞５は、センサ１２０－１及び１２０－２のセンサプレート１３２上に配置されるように描写されている。細胞５は、表面コーティング１２４を介してセンサアレイ１２０に固定されているように描写されている。表面コーティング１２４は、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、及びそれらの組み合わせを含む様々な生体高分子材料、並びに細胞外マトリックス（extracellular matrix、ＥＣＭ）の様々な調製物などの、任意の細胞適合性材料であることができる。エンドユーザは、図１Ｃの上部で矢印によって示されるように、様々な試薬及び溶液がセンサアレイ１２０の表面上に制御可能に流動することができる、本教示の細胞分析システムを使用してアプリケーションを実行することができる。
【0013】
センサ１２０－１及び１２０－２は、フローティングゲート１４０の電圧における変化を引き起こすことができる、感知表面１２６Ｓに近接するイオン層１２８の表面電位における変化に応答する。そのため、印加基準電圧は、図１Ｂについて本明細書に先で説明されるように、フローティングゲート電圧における小さい変化がチャネル領域１４６を通って流動する電流を引き起こすことができるという条件で、フローティングゲートの電圧が閾値電圧を超えることを確実にし、センサ１２０－１及び１２０－２の出力信号における結果をもたらす。その点に関して、イオン層１２８の表面電位への変化は、例えば、ソース領域１４２とドレイン領域１４４との間のチャネル領域１４６における電流を測定することによって測定することができる。そのため、センサ１２０－１及び１２０－２は、ソース領域１４２又はドレイン領域１４４に接続されたアレイライン上に電流ベースの出力信号を直接的に提供するように、又は電圧ベースの出力信号を追加的回路で間接的に提供するように、使用することができる。
【0014】
本明細書で説明されるように、イオン層１２８における表面電位を変えることができる、細胞５の状態における変化は、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスの様々な実施形態によって監視することができる。出力信号に関して、表面電位を増加させることができる、細胞活動は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサの正の振幅の出力信号をもたらし、一方、表面電位を減少させることができる、細胞活動は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサの負の振幅の出力信号をもたらすであろう。その点に関して、ＣｈｅｍＦＥＴセンサの表面電位を変化させることができる、細胞の状態における変化は、測定可能な出力信号をもたらすことができる。例えば、ＩＳＦＥＴセンサが選択的である、カチオン種のイオン濃度を増加させることができる、代謝活動は、表面電位における増加を引き起こす。その結果は、そのＩＳＦＥＴセンサの正の振幅の出力信号になる。逆に、ＩＳＦＥＴセンサが選択的である、カチオン種のイオン濃度を減少させることができる、代謝活性は、表面電位における減少を引き起こす。その結果は、そのＩＳＦＥＴセンサの負の振幅の出力信号になる。別の例において、表面電位は、センサアレイ１２０への細胞５の容量結合によって変えることができ、その結果、細胞膜４を横切る電位が、化学的又は電気的刺激に応答して変化すると、細胞膜を横切る電位の変化を、ＣｈｅｍＦＥＴセンサ１２０－１及び１２０－２によって検出することができる。
【0015】
取得時間間隔にわたるセンサアレイからの出力信号は、一連の二次元（two dimensional、２Ｄ）画像として表され得、各画像は、動画と同様に、所与の時間にセンサアレイから受信された信号サンプルのアレイに対応する。図２Ａは、一連の２Ｄ画像２０２としての、取得時間間隔中のセンサアレイからの出力信号の一例を例解する。特定のサンプリング時間における２Ｄ画像２０４は、本明細書では、動画又はビデオのフレームに類似して、フレームと称され得る。各２Ｄ画像は、本明細書では検電画像と称される。各２Ｄ画像２０４は、複数のタイル２０６及び複数の画素２０８を含み得る。フレームは各サンプリング時間において生成されるので、「サンプリング時間」及び「フレーム時間」という用語は、本明細書では同義的に使用される。例えば、１５フレーム／秒（ｆｐｓ）は、取得時間間隔中に取得され得る。７秒の取得間隔の場合、各取得時間間隔において１０５個のフレームが取得される。例示的な寸法は、タイルに対して６４０×６６４画素であり、８タイル×１２タイルは、フレームに対する画像全体を含み得る。いくつかの実施形態において、タイルは、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの物理的タイルに対応し得、ここで、物理的タイルは、約２ｍｍ×２ｍｍの寸法を有する。
【0016】
図２Ｂは、例示的なＣｈｅｍＦＥＴセンサの属性をまとめた表１を示す。本教示のセンサアレイデバイスの様々な実施形態は、約８５０ｎｍ～約３．３６μｍの間である、各センサ間の中心間間隔、すなわちピッチで、約２０Ｍ～約６６０Ｍ画素の間を有することができる。データ収集に関して、アレイにおける全てのセンサからのセンサ出力信号の収集は、データのフレームを構成する。約２０００万画素～約６億６０００万画素での本教示の様々なセンサアレイデバイスでは、のフレームは、秒当たりのフレームとしてヘルツ（hertz、Ｈｚ）の単位で収集される、かなりのサイズのデータファイルである。更に、画素数を表す選択された関心対象のエリアと、データが収集することができる速度との間には反比例の関係があるため、監視する画素のより小さいサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサアレイデバイスのエリアをウィンドウダウンすることによって、フレーム速度を増加させることができる。ウィンドウダウンの影響は、デバイス全体からデータを収集するための最大フレーム速度である、最後から２番目の列に入力された値と、デバイスの単一の行からデータを収集するため最大フレーム速度である、最後の列に入力された値との比較によって、表１において明示される。そのため、単一の行からデータを収集するようにウィンドウダウンすることによって、フレーム速度は、実質的に増加される。
【0017】
追加的に、表１において提供されているように、デバイスＡとデバイスＢの唯一の相違は、デバイス当たりのセンサの総数であり、デバイスＡと対比したデバイスＢ当たりのセンサの数は、２倍である。表１において示されるように、デバイスＢに対するフレーム速度は、デバイスＡの半分であり、画素数と収集することができるデータでの速度との間で、反比例関係と一致する。そのため、アプリケーションに適合した望ましいフレーム速度を有するデバイスを選択することができる。
【0018】
図２Ｃは、細胞分析のための例示的なセンサアレイデバイスの属性をまとめた表を示す。本教示の様々なセンサアレイデバイスを提供するように変更することができる、センサアレイデバイス属性は、画素寸法、並びにデータがセンサアレイデバイスから収集することができる速度を含む。図２Ｃは、デバイスＢからデバイスＥについて表１において与えられているように、様々なセンサ（画素）寸法の４つの例示的なセンサアレイデバイスに関係するサイズによる細胞の５つのカテゴリの概要を提供する。細胞の５つのカテゴリは、平均直径及び平均フットプリントだけでなく、記述的に識別される。
【0019】
図２Ｃの精査によって、平均直径が５μｍ及び平均面積が２０μｍ2のセンサアレイ表面上に固定された極小細胞では、最小接触面積又はフットプリントは、チップ１デバイスでは約１行及び約２画素に対応し、チップ４デバイスでは６行及び３２画素に増加する。同様に、平均直径が１０μｍ及び平均面積が７８μｍ2のセンサアレイ表面上に固定された小形細胞では、最小接触面積又はフットプリントは、チップ１デバイスでは約３行及び約８画素に対応し、チップ４デバイスでは１２行及び１２６画素に増加する。平均直径が２５μｍ及び平均面積が４９１μｍ2のセンサアレイ表面上に固定された中形細胞では、最小接触面積又はフットプリントは、チップ１デバイスでは約７行及び約５０画素に対応し、チップ４デバイスでは２９行及び７９２画素に増加する。平均直径が５０μｍ及び平均面積が１，９６４μｍ2のセンサアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１では約１５行及び約２０１画素に対応する最小接触面積又はフットプリントを有することができ、チップ４デバイスでは５９行及び３，１６８画素に増加する。最後に、平均直径が１００μｍ及び平均面積が７，８５４μｍ2のセンサアレイ表面上に固定された特大細胞では、最小接触面積又はフットプリントは、チップ１デバイスでは約３０行及び約８０３画素に対応し、チップ４デバイスでは１１８行及び１２，６６８画素に増加する。図２Ｃの精査から、動向は、細胞サイズの増加及び画素サイズの減少とともに、画素被覆が増加する傾向にある。
【0020】
画素の観点から、パーセント画素被覆の列は、単一の画素が被覆する、細胞の面積のパーセンテージである。センサアレイ表面上に固定された極小細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは５０％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、３％の被覆に対応する。同様に、センサアレイ表面上に固定された小形細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは１２％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．８％の被覆に対応する。センサアレイ表面上に固定された中形細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは２％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．１％の被覆に対応する。センサアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１デバイスでは０．５％の被覆に対応する単一の画素を有することができるが、チップ４デバイスでは単一の画素は、０．０３％の被覆に対応する。最後に、センサアレイ表面上に固定された特大細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは０．１％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．００８％の被覆に対応する。図２Ｃの精査から、動向は、細胞サイズの増加及び画素サイズの減少とともに、画素当たりの細胞被覆のパーセンテージが減少する傾向にある。
【0021】
図２Ｃの表に提示されるものを考慮すると、本教示の例示的なセンサアレイデバイスの画素被覆の選択は、様々な平均細胞直径に対して行うことができる。例えば、約５μｍ～約１００μｍの細胞では、センサアレイデバイスの選択は、センサアレイ表面上に固定された細胞の対応するフットプリントに対して、３行の画素を超える約８画素から１１８行の画素を超える１２，６６８画までの被覆を提供するように行うことができる。細胞サイズのその範囲にわたって、画素サイズが変化することができるので、選択されたセンサアレイデバイスの各画素は、細胞の約１２％から細胞の約０．００８％までを被覆することができる。図２Ｃに提示されたデータに基づいて、任意の細胞サイズでは、細胞がセンサアレイデバイス上で占めることができる、接触面積に関連するかなりの数のセンサを提供することができる、例示的なセンサアレイデバイスを選択することができることは、明らかである。本教示の様々なセンサアレイデバイスによって提供することができる、空間分解能は、信号の細胞内識別を可能にすることができ、それゆえ、細胞内分析を提供している。
【0022】
データ収集に関して、本教示の様々な細胞分析システムでは、アレイにおける全てのセンサからのセンサ出力信号の収集は、データのフレームを構成する。本教示の様々なセンサアレイデバイスが約２０００万画素～約６億６０００万画素を有することができることを考えると、本教示の様々なセンサアレイデバイスからのデータのフレームは、かなりのサイズのデータファイルである。追加的に、本教示の様々な細胞分析システムは、毎秒センサアレイデバイスから、かなりの数のデータフレームを生成するように構成されている、センサアレイデバイスに結合された制御回路を含む。そのうえ、選択された関心対象のエリアと、データを収集することができる速度との間には反比例の関係があるため、監視する画素のより小さいサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサアレイデバイスのエリアをウィンドウダウンすることによって、フレーム速度を増加させることができる。
【0023】
例えば、表１を参照すると、４，０００万画素のあるセンサアレイデバイスは、約１２０フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でデータを収集することができる。その後、２，０００万画素の関心対象のエリアが選択されると、約２４０フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でのデータは、収集することができ、単一のセンサアレイ行の関心対象のエリアが選択されると、約７５，０００フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でのデータは、収集することができる。具体的には、図２Ｃに提示された本教示の例示的なセンサアレイデバイスに関して、センサの行当たりの最大フレーム速度は、最後から２番目の列において提供される。最後の列において、行ごとの最大フレーム速度を細胞直径当たりの行で割ることによって導出される、細胞によって被覆される行の小数部分について、データを収集することができる、最大フレーム速度は、提示される。
【0024】
図２Ｃの最後の列の精査によってわかるように、秒当たりのかなりの数のフレームは、様々な細胞サイズにわたって関心対象の標的エリアについて、収集することができ、ｋＨｚ範囲内で快適にデータ収集を提供する。センサアレイ表面上に固定された極小細胞では、データは、チップ１デバイスでは７５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができるが、チップ４ではデータは、２７，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができる。同様に、センサアレイ表面上に固定された小形細胞では、データは、チップ１デバイスでは２５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができるが、チップ４ではデータは、１３，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができる。センサアレイ表面上に固定された中形細胞では、データは、チップ１デバイスでは１０，７１４ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができるが、チップ４ではデータは、５，５８７ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができる。センサアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１デバイスでは５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度を有することができるが、チップ４ではデータは、２，７４６ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができる。最後に、センサアレイ表面上に固定された特大細胞では、データは、チップ１デバイスでは２，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができるが、チップ４ではデータは、１，３７３ｆｐｓの最大フレーム速度で収集することができる。
【0025】
図２Ｃの精査から、動向は、細胞サイズの増加及び画素サイズの減少とともに、フレーム速度が減少する傾向にあり、これは、選択された関心対象のエリアと収集することができるデータでの速度との間で、反比例関係と一致する。そのため、監視する画素のより小さいサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサアレイデバイスのエリアをウィンドウダウンすることによって、フレーム速度を増加させることができる。追加的に、表１を参照して、アプリケーションに一致する望ましいフレーム速度を有するデバイスを選択することができる。
【0026】
図３は、一実施形態による、検電画像データを処理する全般的な概要を示すブロック図である。検電画像データは、取得時間間隔にわたってセンサアレイから取得された一連の二次元画像２０２を含む。一例では、時間間隔は、７秒の長さであり得る。取得時間間隔は、休止間隔によって分離され得る。休止間隔は、センサアレイからシステムプロセッサへの検電画像データのデータ転送を可能にし得る。いくつかの実施形態では、休止間隔は、実験計画の一部であり得る。例えば、この実験は、休止間隔によって分離された周期的な間隔で高速データを取得し得る。例えば、実験は、より長い期間にわたって高速過渡活動をサンプリングするために、７秒の１２０ｆｐｓデータを取得し、５分の休止間隔を有し得る。データ取得ステップ３０２は、取得時間間隔の各サンプリング時間に並行して、センサアレイの個々のセンサからの信号サンプルを含む検電画像データを取得し得る。データ取得ステップ３０２は、１つ以上の取得時間間隔にわたって検電画像データを取得して、検電画像の１つ以上のシーケンスを生成し得る。検電画像の１つ以上のシーケンスは、プロセッサによる分析のためにメモリに記憶され得る。
【0027】
データ取得ステップ３０２は、「ＣｅｌｌＦｉｎｄ」フローに応答してセンサアレイから検電画像データを受信することを含み得る。ＣｅｌｌＦｉｎｄフローは、細胞のサンプルが堆積されるセンサアレイ表面をコーティングするために使用される緩衝媒体からの特定のｐＨステップ差を有する溶液を含み得る。例えば、緩衝媒体は、４～８単位の範囲のｐＨを有し得る。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４２９１ＤＪ）が、緩衝媒体のために使用され得る。ＣｅｌｌＦｉｎｄフローについて特定のｐＨ差を達成するために、少量のＮａＯＨ又はＨＣｌを添加して、溶液のｐＨを調整する。ｐＨステップ差を有する溶液は、センサアレイを横切って流される。例えば、溶液は、０．０１～０．５単位のｐＨ差を有し得る。Ｃｅｌｌｆｉｎｄ溶液は、媒体に対して調整され、緩衝媒体に対して酸性又は塩基性のいずれかであり得る。例えば、ｐＨ変化は、緩衝媒体中の７．４からＣｅｌｌＦｉｎｄフロー溶液中の７．３までであり得る。ｐＨ変化は、正又は負であり得る。ＣｈｅｍＦＥＴセンサは、ｐＨの変化に応答して信号を生成する。いくつかの実施形態では、測定された信号の極性は、ｐＨステップ変化が負の方向であっても、応答が正の方向であるように変更され得る。細胞で被覆されていないセンサアレイの領域は、ｐＨステップ差に対してより迅速に応答する。１つ以上の細胞で被覆されたセンサアレイ表面の領域は、細胞によるセンサの閉塞に起因して、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローにおけるｐＨステップ差に対してより遅い応答を有する。ＣｅｌｌＦｉｎｄフローの後に生じる１つ以上の取得時間間隔中のデータ取得は、細胞の場所に関連する動的変化を示す経時的な検電画像データを提供する。
【0028】
図６Ａは、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答するタイルの応答の単一フレームのグレースケール画像の例を示す。図６Ｄは、経時的なＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答する単一画素に対応するセンサ信号のプロットの例を示す。図６Ｅは、細胞領域及び背景領域を有するタイルの例を示す。図６Ｅの矢印は、ＣｅｌｌＦｉｎｄフロー用などの試薬が左から右に流れることを示す。図６Ｆは、経時的なＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答した、図６Ｅのタイル内の２つの画素に対応するセンサ信号のプロットの例を示す。図６Ｅの細胞領域６１０内の画素に対応するセンサ信号は、図６Ｆのプロット６１４を生成した。図６Ｅの背景領域６０８内の画素に対応するセンサ信号は、図６Ｆのプロット６１２を生成した。図６Ｆの時間軸は、フレーム単位（１５ｆｐｓ）である。この例では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ試薬は、２秒間（フレーム１５からフレーム４５まで）流れ、これは、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローのｐＨの変化に応答して上昇するセンサ信号と下降するセンサ信号の両方に及ぶ。図６Ｅ及び図６Ｆの例は、細胞によって被覆されたセンサアレイの領域が、細胞によって被覆されていない背景領域よりも、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに対して遅い応答を有することを示す。
【0029】
プロセッサは、２Ｄ画像を、センサアレイ上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する背景領域と、にセグメント化するために、検電画像セグメント化ステップ３０４を検電画像データに適用し得る。細胞信号及び背景信号の選択ステップ３０６は、２Ｄ画像内の細胞領域及び背景領域の場所に対応する信号を選択し得る。以下では、「画像」及び「タイル」という用語は、どちらも画像であるので、同義的に使用され得る。信号パラメータ化ステップ３０８は、細胞領域内の画素に対応する信号サンプルを組み合わせて、パラメータ化し得る。ユーザ表示及び対話ステップ３１０は、選択された信号及びパラメータ化をユーザに提示し得る。
【0030】
図４Ａは、一実施形態による、検電画像セグメント化３０４のブロック図である。ステップ４０２において、利得は、フレーム内の各画素について補正され得る。各実験の開始時に、各画素の電気利得は、外部摂動を流体電位に適用し、測定された画素当たりのステップサイズを予想ステップサイズと比較することによって判定される。各画素の利得は、フレーム内の画素値を画素の電気利得で除算することによって補正され得る。ステップ４０４において、各画素についての背景値がフレームの各画素から減算される。例えば、フレームごとの大域背景値は、フレーム内の全ての画素値の統計上の最頻値を計算することによって判定され得る。大域背景値が計算され、取得間隔中に取得された全てのフレームについてフレームごとに各画素から減算される。ステップ４０６において、２Ｄ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像（ＣＩ）の画素値が、取得時間間隔にわたって計算され得る。ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素は、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答して測定された信号サンプルの特性に基づいて計算された特徴の値を含む。ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素は、二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために閾値処理され得、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる。ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像における１の画素値は、細胞の存在の可能性を示す。ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、取得時間間隔内の各フレームについてタイルごとに判定され得る。いくつかの実施形態では、同じタイルに対応する複数のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像が計算され得、各ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、以下で説明されるように、特定の特性を測定する。
【0031】
ステップ４０８において、ぼかし関数は、計算されたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像に適用され得る。いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、以下のように周波数領域においてローパスフィルタを適用することによってぼかされ得る。
Ａ．ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各タイルについて、２Ｄフーリエ変換、例えば、２Ｄ高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を計算して、周波数領域画像を形成する。
Ｂ．周波数領域においてローパスフィルタを適用して、周波数領域フィルタリング済み画像を形成する。例えば、バターワースフィルタが適用され得る。例示的なバターワースフィルタ方程式は、以下によって与えられる。
ｅｘｐ（－ｒ2.5／１．５Ｎ3） （１）
ここで、ｒ＝Ｘ2＋Ｙ2であり、Ｘ及びＹは、周波数領域における座標であり、Ｎは、Ｘ又はＹのいずれかにおける成分の最小数である。
Ｃ．周波数領域フィルタリング済み画像の逆２Ｄフーリエ変換、例えば、逆２Ｄ ＦＦＴを計算する。
Ｄ．ぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値を形成するために、逆２Ｄ ＦＦＴの実部を保持する。
Ａ．ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各タイルについて、２Ｄフーリエ変換、例えば、２Ｄ高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を計算して、周波数領域画像を形成する。
Ｂ．周波数領域においてローパスフィルタを適用して、周波数領域フィルタリング済み画像を形成する。例えば、バターワースフィルタが適用され得る。例示的なバターワースフィルタ方程式は、以下によって与えられる。
ｅｘｐ（－ｒ2.5／１．５Ｎ3） （１）
ここで、ｒ＝Ｘ2＋Ｙ2であり、Ｘ及びＹは、周波数領域における座標であり、Ｎは、Ｘ又はＹのいずれかにおける成分の最小数である。
Ｃ．周波数領域フィルタリング済み画像の逆２Ｄフーリエ変換、例えば、逆２Ｄ ＦＦＴを計算する。
Ｄ．ぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値を形成するために、逆２Ｄ ＦＦＴの実部を保持する。
【0032】
ステップ４１０において、閾値Ｔが、ぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値に適用されて、ぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値がＴ以上である画素場所に１を有し、ぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値がＴ未満である画素場所に０を有する二値画像を生成し得る。
Ｔ＝（ｍｅａｎ＋［ｍａｘ－ａｌｇｏ＿ｍｉｎ］*ｆｒａｃ） （２）
Ｔ＝（ｍｅａｎ＋［ｍａｘ－ａｌｇｏ＿ｍｉｎ］*ｆｒａｃ） （２）
【0033】
式（２）では、タイルのぼかしたＣｅｌｌＦｉｎｄ値の画素値について、平均値（mean）及び最大値（max）が判定され得る。分数「ｆｒａｃ」は、ユーザによって定義され得る。例えば、ｆｒａｃ値は、０．１に設定され得る。結果として得られる二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、粗い細胞マスク４１２を提供し、ここで、細胞の近似場所は１によって示され、背景領域は０によって示される。
【0034】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、取得時間間隔内のフレームについて判定された「ピークツーピーク（peak-to-peak、ＰＴＰ）」画像を含み得る。ＰＴＰ画像内の画素のＰＴＰ値は、以下のステップによって判定することができる。
ａ．取得時間間隔中のタイル内の各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算する。
ｂ．ＰＴＰ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｃ．式（２）に従って、ぼかしたＰＴＰ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、典型的な最大ＰＴＰ値の２５％である１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＰＴＰ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｄ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．取得時間間隔中のタイル内の各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算する。
ｂ．ＰＴＰ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｃ．式（２）に従って、ぼかしたＰＴＰ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、典型的な最大ＰＴＰ値の２５％である１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＰＴＰ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｄ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、取得時間間隔内のフレームについて判定された「ピークツーピーク絶対値（ＰＴＰ－Ａｂ）」の画像を含む。ＰＴＰ－Ａｂ画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．取得時間間隔についてＰＴＰ画像を計算する。
ｂ．ＰＴＰ画像内の画素の平均ＰＴＰ値を計算する。
ｃ．ＰＴＰ画像内の各画素のＰＴＰ値から平均ＰＴＰ値を減算して、差分画像を形成する。
ｄ．差分画像内の各画素の差分の絶対値を計算して、絶対差分画像を形成する。
ｅ．平均ＰＴＰ値を各画素に加算してＰＴＰ－Ａｂ画像を形成する。
ｆ．ＰＴＰ－Ａｂ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｇ．式（２）に従って、ぼかしたＰＴＰーＡｂ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＰＴＰ－Ａｂ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。１００のａｌｇｏ＿ｍｉｎ値は、典型的な最大ＰＴＰ－Ａｂ値の２５％である。二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．取得時間間隔についてＰＴＰ画像を計算する。
ｂ．ＰＴＰ画像内の画素の平均ＰＴＰ値を計算する。
ｃ．ＰＴＰ画像内の各画素のＰＴＰ値から平均ＰＴＰ値を減算して、差分画像を形成する。
ｄ．差分画像内の各画素の差分の絶対値を計算して、絶対差分画像を形成する。
ｅ．平均ＰＴＰ値を各画素に加算してＰＴＰ－Ａｂ画像を形成する。
ｆ．ＰＴＰ－Ａｂ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｇ．式（２）に従って、ぼかしたＰＴＰーＡｂ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＰＴＰ－Ａｂ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。１００のａｌｇｏ＿ｍｉｎ値は、典型的な最大ＰＴＰ－Ａｂ値の２５％である。二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、取得時間間隔内のフレームについて判定された「最大変動（ＭａｘＶａｒ）」画像を含み得る。ＭａｘＶａｒ画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．各フレーム時間又はサンプリング時間におけるタイルの画素の平均値を計算して、平均値のアレイを与える。例えば、取得時間間隔内の１０５個のフレームについて、１０５個の平均値が計算されて、タイルに対応する平均値の１×１０５アレイを与える。
ｂ．平均値のアレイ内の隣接する平均値間の差を計算して、差分値のアレイを形成する。例えば、平均値の１×１０５アレイに対して、差分値の１×１０４アレイが計算される。
ｃ．差分値のアレイにおいて最大の差分を有するフレームをフレームｆmaxとして識別する。
ｄ．タイル（ｆmax）と取得時間間隔タイル（ｆ1）内の第１のフレームのタイル（ｆ1）との間の差分を計算する。ＭａｘＶａｒ ｉｍａｇｅ＝ｔｉｌｅ（ｆmax）－ｔｉｌｅ（ｆ1）。
ｅ．ＭａｘＶａｒ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｆ．式（２）に従って、ぼかしたＭａｘＶａｒ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＭａｘＶａｒ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．各フレーム時間又はサンプリング時間におけるタイルの画素の平均値を計算して、平均値のアレイを与える。例えば、取得時間間隔内の１０５個のフレームについて、１０５個の平均値が計算されて、タイルに対応する平均値の１×１０５アレイを与える。
ｂ．平均値のアレイ内の隣接する平均値間の差を計算して、差分値のアレイを形成する。例えば、平均値の１×１０５アレイに対して、差分値の１×１０４アレイが計算される。
ｃ．差分値のアレイにおいて最大の差分を有するフレームをフレームｆmaxとして識別する。
ｄ．タイル（ｆmax）と取得時間間隔タイル（ｆ1）内の第１のフレームのタイル（ｆ1）との間の差分を計算する。ＭａｘＶａｒ ｉｍａｇｅ＝ｔｉｌｅ（ｆmax）－ｔｉｌｅ（ｆ1）。
ｅ．ＭａｘＶａｒ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｆ．式（２）に従って、ぼかしたＭａｘＶａｒ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、ＭａｘＶａｒ画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、本明細書で「ＭａｘＶａｒ局所」画像と称される、取得時間間隔内のフレームのサブタイルについて判定されたＭａｘＶａｒサブ画像の合成を含み得る。ＭａｘＶａｒ局所画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．タイルを複数のサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｂ．他のサブタイルから独立して、各サブタイルについてＭａｘＶａｒ局所画像を計算する。平均値のアレイ及び差分値のアレイが、各サブタイルについて計算される。フレームｆmax及びサブタイル（ｆmax）が、各サブタイルについて識別される。各ＭａｘＶａｒ局所画像は、ＭａｘＶａｒ局所画像＝サブタイル（ｆmax）－サブタイル（ｆ1）に対応する。
ｃ．サブタイルについて判定されたＭａｘＶａｒ局所画像から合成ＭａｘＶａｒ局所画像を生成する。
ｄ．合成ＭａｘＶａｒ局所画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｅ．式（２）に従って、ぼかした合成ＭａｘＶａｒ局所画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、合成ＭａｘＶａｒ局所画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｆ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．タイルを複数のサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｂ．他のサブタイルから独立して、各サブタイルについてＭａｘＶａｒ局所画像を計算する。平均値のアレイ及び差分値のアレイが、各サブタイルについて計算される。フレームｆmax及びサブタイル（ｆmax）が、各サブタイルについて識別される。各ＭａｘＶａｒ局所画像は、ＭａｘＶａｒ局所画像＝サブタイル（ｆmax）－サブタイル（ｆ1）に対応する。
ｃ．サブタイルについて判定されたＭａｘＶａｒ局所画像から合成ＭａｘＶａｒ局所画像を生成する。
ｄ．合成ＭａｘＶａｒ局所画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｅ．式（２）に従って、ぼかした合成ＭａｘＶａｒ局所画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、合成ＭａｘＶａｒ局所画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｆ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、時間平均画像を形成するために、取得時間間隔にわたるタイルの画素の時間平均の関数を含み得る。時間平均画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．タイル内の各画素値の取得時間間隔にわたる平均を計算して、第１の平均画像を形成する。
ｂ．タイル内の各画素値の取得時間間隔内の複数の初期フレームにわたる平均を計算して、第２の平均画像を形成する。複数の初期フレーム内のフレーム数は、取得時間間隔内のフレーム総数の５％～５０％の範囲であり得る。例えば、初期フレームの数は、最初の１０フレームであり得、フレームの総数は、取得時間間隔内の１０５フレームであり得る。
ｃ．第１の平均画像から第２の平均画像を減算して、時間平均画像を形成する。
ｄ．時間平均画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｅ．式（２）に従って、ぼかした時間平均画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、時間平均画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｆ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．タイル内の各画素値の取得時間間隔にわたる平均を計算して、第１の平均画像を形成する。
ｂ．タイル内の各画素値の取得時間間隔内の複数の初期フレームにわたる平均を計算して、第２の平均画像を形成する。複数の初期フレーム内のフレーム数は、取得時間間隔内のフレーム総数の５％～５０％の範囲であり得る。例えば、初期フレームの数は、最初の１０フレームであり得、フレームの総数は、取得時間間隔内の１０５フレームであり得る。
ｃ．第１の平均画像から第２の平均画像を減算して、時間平均画像を形成する。
ｄ．時間平均画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｅ．式（２）に従って、ぼかした時間平均画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１００に設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、時間平均画像の最大値の１０％～１００％の範囲であり得る。
ｆ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0039】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、「ピークまでの時間（ｔＰｅａｋ）」画像を含み得る。ｔＰｅａｋ画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各最大画素値について、最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定する。
ｃ．各画素場所が最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を有するｔＰｅａｋ画像を形成する。
ｄ．ｔＰｅａｋ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｄ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、４フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｅ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各最大画素値について、最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定する。
ｃ．各画素場所が最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を有するｔＰｅａｋ画像を形成する。
ｄ．ｔＰｅａｋ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｄ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、４フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｅ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、「ピークまでの時間８０％（ｔＰｅａｋ８０）」画像を含み得る。ｔＰｅａｋ８０画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各画素場所について、最大画素値の８０％を計算する。
ｃ．８０％の最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定する。
ｄ．各画素場所が最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を有するｔＰｅａｋ８０画像を形成する。
ｅ．ｔＰｅａｋ８０画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｆ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ８０画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、３フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｇ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各画素場所について、最大画素値の８０％を計算する。
ｃ．８０％の最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定する。
ｄ．各画素場所が最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を有するｔＰｅａｋ８０画像を形成する。
ｅ．ｔＰｅａｋ８０画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｆ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ８０画像の画素値に閾値Ｔを適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、３フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｇ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、「ピークまでの時間局所（ｔＰｅａｋ局所）」画像を含み得る。ｔＰｅａｋ局所画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各最大値について、最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定して、ｔＰｅａｋ画像を生成する。
ｃ．ｔＰｅａｋ画像をサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｄ．各サブタイルについて、サブタイル内の平均画素値を減算する。
ｅ．サブタイルを含む合成ｔＰｅａｋ局所画像を生成する。
ｈ．合成ｔＰｅａｋ局所画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｉ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ局所画像の画素値に閾値を適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、７フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｊ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．各画素場所について、取得時間間隔中の最大画素値を判定する。
ｂ．各最大値について、最大画素値に対応するフレームインデックス又はフレーム数を判定して、ｔＰｅａｋ画像を生成する。
ｃ．ｔＰｅａｋ画像をサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｄ．各サブタイルについて、サブタイル内の平均画素値を減算する。
ｅ．サブタイルを含む合成ｔＰｅａｋ局所画像を生成する。
ｈ．合成ｔＰｅａｋ局所画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｉ．式（２）に従って、ぼかしたｔＰｅａｋ局所画像の画素値に閾値を適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、７フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｊ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、「下降までの時間（ｔＦａｌｌ局所）」画像を含み得る。これは、信号の下降側における元のｐＨへの戻りの指標である。ｔＦａｌｌ局所画像は、以下のステップによって判定され得る。
ａ．タイルをサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｂ．各フレーム時間又はサンプリング時間におけるサブタイルの画素の平均値を計算して、平均値のアレイを与える。例えば、取得時間間隔内の１０５個のフレームについて、１０５個の平均値が計算されて、サブタイルに対応する平均値の１×１０５アレイを与える。
ｃ．サブタイルに対応する平均値のアレイ内の最大平均値に対応するフレームインデックスｆmax又は時間インデックスを見つける。
ｄ．フレームインデックスに対応するサブタイル、サブタイル（ｆmax）を識別する。
ｅ．最後のフレームｆlast内の対応するサブタイル、サブタイル（ｆlast）について、差分画像＝サブタイル（ｆmax）－サブタイル（ｆlast）を計算する。
ｆ．差分画像の各画素値の分数を計算して、分数値を与える。例えば、分数値は、２５％であり得る。分数値の値の範囲は５％～９０％である。
ｇ．分数値をサブタイル（ｆlast）内の画素値に加算して、サブタイルの閾値画像を形成する。
ｈ．サブタイル内の各画素場所について、画素値が閾値画像内の画素場所に対応する閾値を下回るとき、フレームインデックスｆT又はフレームの数を判定する。
ｉ．サブタイル内の各画素場所について、ｆTからｆmaxを減算して、サブタイルに対応するｔＦａｌｌ局所画像を形成する。
ｊ．サブタイルに対応するｔＦａｌｌ局所画像を合成して、タイルに対応する合成ｔＦａｌｌ画像を形成する。
ｋ．合成ｔＦａｌｌ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｌ．式（２）に従って、ぼかした合成ｔＦａｌｌ画像の画素値に閾値を適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、６フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｍ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
ａ．タイルをサブタイルに分割する。サブタイル寸法は、全タイル寸法の５％～５０％であり得る。例えば、６６４×６４０のタイル寸法の場合、サブタイル寸法は、約８０×８０であり得る。
ｂ．各フレーム時間又はサンプリング時間におけるサブタイルの画素の平均値を計算して、平均値のアレイを与える。例えば、取得時間間隔内の１０５個のフレームについて、１０５個の平均値が計算されて、サブタイルに対応する平均値の１×１０５アレイを与える。
ｃ．サブタイルに対応する平均値のアレイ内の最大平均値に対応するフレームインデックスｆmax又は時間インデックスを見つける。
ｄ．フレームインデックスに対応するサブタイル、サブタイル（ｆmax）を識別する。
ｅ．最後のフレームｆlast内の対応するサブタイル、サブタイル（ｆlast）について、差分画像＝サブタイル（ｆmax）－サブタイル（ｆlast）を計算する。
ｆ．差分画像の各画素値の分数を計算して、分数値を与える。例えば、分数値は、２５％であり得る。分数値の値の範囲は５％～９０％である。
ｇ．分数値をサブタイル（ｆlast）内の画素値に加算して、サブタイルの閾値画像を形成する。
ｈ．サブタイル内の各画素場所について、画素値が閾値画像内の画素場所に対応する閾値を下回るとき、フレームインデックスｆT又はフレームの数を判定する。
ｉ．サブタイル内の各画素場所について、ｆTからｆmaxを減算して、サブタイルに対応するｔＦａｌｌ局所画像を形成する。
ｊ．サブタイルに対応するｔＦａｌｌ局所画像を合成して、タイルに対応する合成ｔＦａｌｌ画像を形成する。
ｋ．合成ｔＦａｌｌ画像をぼかす（ステップ４０８）。
ｌ．式（２）に従って、ぼかした合成ｔＦａｌｌ画像の画素値に閾値を適用する（ステップ４１０）。例えば、ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、６フレームに設定され得る。ａｌｇｏ＿ｍｉｎは、１から取得時間間隔内のフレームの総数までの範囲であり得る。
ｍ．二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成するために、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる（ステップ４１２）。
【0043】
いくつかの実施形態では、ピアソン差（Pearson Difference、ＰＤ）は、上で説明されるＣｅｌｌＦｉｎｄ法のいずれかから導出される二値ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像から計算され得る。推定二値マスクは、画素を「細胞」領域及び「背景」領域の初期推定値に分割する。ピアソン差は、推定されたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各画素について以下のように計算され得る。
ＰＤ＝Ｐo,c－Ｐo,b （３）
ここで、Ｐo,cは、オブジェクトの時系列と二値マスク内の細胞として識別された全ての画素の平均時系列との間のピアソン相関でありＰo,bは、オブジェクトの時系列と、背景として識別された全ての画素の平均時系列との間のピアソン相関である。この場合、オブジェクトは、個々の画素である。ピアソン相関は、以下のように計算され得る。
Ｐx,y＝ｃｏｖ（ｘ，ｙ）／［ｓｔｄ（ｘ）*ｓｔｄ（ｙ）］ （４）
ここで、Ｐx,yは、時系列ｘ及び時系列ｙのピアソン相関係数であり、ｃｏｖ（ｘ，ｙ）は、時系列ｘ及び時系列ｙの共分散であり、ｓｔｄ（ｘ）は、時系列ｘの標準偏差であり、ｓｔｄ（ｙ）は、時系列ｙの標準偏差である。細胞として定義された領域内の全ての画素の平均についての時系列が計算される（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。背景として定義された領域内の全ての画素の平均についての時系列が計算される（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。オブジェクトの時系列が計算される。この場合、オブジェクトは、単一の画素又は１つ以上の画素の平均であり得る（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。式（３）によって計算されたピアソン差（ＰＤ）ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、Ｏｔｓｕの方法（ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｔｓｕ％２７ｓ＿ｍｅｔｈｏｄ）を使用して細胞領域と背景領域とに分割され得る。ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のヒストグラムが計算され得る。このヒストグラムは、２つのクラスに対応する２つのピークを有し得、１つは、細胞領域に対するものであり、１つは、背景領域に対するものである。Ｏｔｓｕの方法は、クラス内分散を最小化することによって、ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のヒストグラムにおける２つのピークに対応する２つのクラスに画素を最適に分離する単一の閾値を判定する。閾値は、二値ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を生成するために、ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像に適用され得る。
ＰＤ＝Ｐo,c－Ｐo,b （３）
ここで、Ｐo,cは、オブジェクトの時系列と二値マスク内の細胞として識別された全ての画素の平均時系列との間のピアソン相関でありＰo,bは、オブジェクトの時系列と、背景として識別された全ての画素の平均時系列との間のピアソン相関である。この場合、オブジェクトは、個々の画素である。ピアソン相関は、以下のように計算され得る。
Ｐx,y＝ｃｏｖ（ｘ，ｙ）／［ｓｔｄ（ｘ）*ｓｔｄ（ｙ）］ （４）
ここで、Ｐx,yは、時系列ｘ及び時系列ｙのピアソン相関係数であり、ｃｏｖ（ｘ，ｙ）は、時系列ｘ及び時系列ｙの共分散であり、ｓｔｄ（ｘ）は、時系列ｘの標準偏差であり、ｓｔｄ（ｙ）は、時系列ｙの標準偏差である。細胞として定義された領域内の全ての画素の平均についての時系列が計算される（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。背景として定義された領域内の全ての画素の平均についての時系列が計算される（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。オブジェクトの時系列が計算される。この場合、オブジェクトは、単一の画素又は１つ以上の画素の平均であり得る（典型的には、取得時間間隔内の１０５フレームに対して１×１０５）。式（３）によって計算されたピアソン差（ＰＤ）ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、Ｏｔｓｕの方法（ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｔｓｕ％２７ｓ＿ｍｅｔｈｏｄ）を使用して細胞領域と背景領域とに分割され得る。ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のヒストグラムが計算され得る。このヒストグラムは、２つのクラスに対応する２つのピークを有し得、１つは、細胞領域に対するものであり、１つは、背景領域に対するものである。Ｏｔｓｕの方法は、クラス内分散を最小化することによって、ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のヒストグラムにおける２つのピークに対応する２つのクラスに画素を最適に分離する単一の閾値を判定する。閾値は、二値ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を生成するために、ＰＤ ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像に適用され得る。
【0044】
ステップ４１２からのｉ番目の粗い細胞マスクは、ステップ４０４における局所背景値の計算のために、（ｉ＋１）回目の反復４１４において提供され得る。局所背景値は、タイルの画素値に畳み込みカーネルを適用することによって判定され得る。いくつかの実施形態では、畳み込みカーネルは、係数の矩形アレイであり得る。例えば、畳み込みカーネルは、０の中心係数と、１に等しい全ての他の係数とを有し得る。カーネルをタイルの画素値で畳み込み、カーネル内の１の数で除算することにより、中心係数に対応する画素場所における背景値の局所空間平均が生成される。図５は、画素値の局所空間平均を計算するために使用され得る畳み込みカーネルの例（縮尺通りではない）を示す。畳み込みカーネルの寸法は、ユーザによって構成可能であり得る。例えば、６４０×６６４画素のタイル寸法の場合、畳み込みカーネルは、水平寸法が４１画素×垂直寸法が１０１画素の寸法を有し得る。水平寸法は、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローの方向に平行である。垂直寸法は、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローの方向に垂直である。ＣｅｌｌＦｉｎｄフローは、センサアレイの一方の側から他方の側に進む。図６Ｅは、タイルを左から右へ横切るＣｅｌｌＦｉｎｄフローの方向の例を示す。いくつかの実施形態では、畳み込みカーネル内の画素の数は、タイル内の画素の数の６％であり得る。いくつかの実施形態では、畳み込みカーネル内の画素の数は、タイル内の画素の数の３％～２０％の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、粗い細胞マスク値１に対応する画素場所は、畳み込み入力から除外され、局所背景は、粗い細胞マスク内で識別された細胞の不在下で推定され得る。局所背景値のアレイは、局所背景補正タイルを形成するために、対応する画素場所におけるタイルの画素値から減算され得る。局所背景値のアレイは、各フレーム内の全てのタイルについて判定され、同じ粗い細胞マスクを使用して取得時間間隔の各フレームから減算されて、対応する局所背景補正フレームを生成し得る。
【0045】
ステップ４０６の（ｉ＋１）回目の反復では、上で説明されるように、局所背景補正フレーム内の各画素のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像値を計算して局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成する。
【0046】
ステップ４０８の（ｉ＋１）回目の反復では、ぼかし関数は、局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像に適用され得る。ステップ４１０の（ｉ＋１）回目の反復では、閾値を、ぼかした局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素値に適用して、ぼかした局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ値がＴi+1以上である画素場所に１を有し、ぼかした局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ値がＴi+1未満である画素場所に０を有する二値画像を生成し得る。いくつかの実施形態において、閾値Ｔi+1は、式（５）によって計算され得る。
Ｔi+1＝（ｍｅａｎi+1＋［ｍａｘi+1－ａｌｇｏ＿ｍｉｎ］*ｆｒａｃi+1） （５）
Ｔi+1＝（ｍｅａｎi+1＋［ｍａｘi+1－ａｌｇｏ＿ｍｉｎ］*ｆｒａｃi+1） （５）
【0047】
式（５）では、タイルのぼかした局所背景補正ＣｅｌｌＦｉｎｄ値の画素値について、平均値（ｍｅａｎi+1）及び最大値（ｍａｘi+1）が判定され得る。分数「ｆｒａｃi+1」は、ユーザによって定義され得る。例えば、ｆｒａｃi+1値は、０．１に設定され得る。ｆｒａｃi+1値の範囲は、０＜ｆｒａｃi+1＜ｆｒａｃである。得られた二値画像は、局所背景補正細胞マスクを提供し、ここで、細胞のおおよその場所は１で示され、背景領域は０で示される。いくつかの実施形態では、局所背景補正細胞マスクは、取得時間間隔について判定され得る。
【0048】
図６Ａは、ＣｅｌｌＦｉｎｄフローに応答するタイルのグレースケール画像の例を示す。図６Ｂは、粗い細胞マスクのタイルの例を示す。図６Ｂは、局所背景補正前の第１回目（ｉ＝１）の粗い細胞マスク４１２を表す。図６Ｃは、２回の反復（ｉ＋１＝２）後の局所背景補正細胞マスクのタイルの例を示す。図６Ｃは、ステップ４０４の局所背景減算、上で説明されるピークツーピーク（ＰＴＰ）計算を使用したステップ４０６のＣｅｌｌＦｉｎｄ計算、ステップ４０８のぼかし動作、及びステップ４１０の閾値処理の後の局所背景補正細胞マスクを表す。特徴は、おおよその可能な細胞場所を表す。図６Ｃの局所背景補正細胞マスクにおける特徴は、図６Ｂの粗い細胞マスクにおける特徴よりも数が多く、強調されている。例えば、図６Ｂにおける特徴のクラスタ６０２及び図６Ｃにおけるより大きい特徴のクラスタ６０４は、タイルの応答のグレースケール画像における特徴のクラスタ６０１に対応する。
【0049】
いくつかの実施形態では、複数の細胞マスクは、上で説明されるＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のタイプのうちの２つ以上を計算することによって生成され得る。図４Ｂは、一実施形態による、コンセンサス細胞マスクを形成するためのブロック図である。ステップ４１６では、図４Ａのステップ４０４～４１２に関して上で説明されるように、複数の異なるタイプのＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を計算して、複数の細胞マスクを生成し得る。ステップ４１８では、細胞マスクは、以下のように重み付けされ、合計され得る。
加重和画像＝Σjｗj×細胞マスクj （６）
加重和画像＝Σjｗj×細胞マスクj （６）
【0050】
細胞マスクj内の二値データタイプから浮動小数点データタイプへの変換は、重みｗjによる乗算の前に適用され得る。ステップ４２０において、加重和画像に第１の閾値を適用し得る。二値コンセンサス細胞マスクを形成するために、第１の閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる。例えば、加重和画像に適用される第１の閾値は、細胞である可能性が高い領域を識別するために、相対的に大きい値１．８に設定され得る。いくつかの実施形態では、第２のコンセンサス細胞マスクは、ステップ４２０において、加重和画像に第２の閾値を適用することによって生成され得る。例えば、第２の閾値は、０．７など、第１の閾値よりも低い値を有し得る。第２の閾値がより低いので、第２のコンセンサス細胞マスクは、ある程度の誤差を許容しながら、より多くの可能な細胞領域を許容する。第１の閾値及び第２の閾値の値の範囲は、ｍｉｎ（ｗj）～Σjｗjである。例えば、第１の閾値は、細胞を識別するための低い偽陽性率を有するように選択される。第２の閾値は、細胞を識別するための低い偽陰性率を有するように選択される。
【0051】
表Ａは、重みｗjの例示的な値を与える。特定のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像タイプが使用されないとき、対応する重みｗjは、０に設定され得る。重みｗjの値は、ユーザによって選択され得る。
【0052】
【表1】
【0053】
図４Ｃは、最終的なコンセンサス細胞マスクを形成するための例示的なブロック図である。図４Ａに関して上で説明されるように、１つのタイプのＣｅｌｌＦｉｎｄ画像のみが計算される実施形態では、粗い細胞マスクは、サイズ選択ステップ４２２への入力細胞マスクである。図４Ｂに関して上で説明されるように、複数のタイプのＣｅｌｌＦｉｎｄ画像が計算される実施形態では、コンセンサス細胞マスクは、サイズ選択ステップ４２２への入力細胞マスクである。サイズ選択ステップ４２２では、関心対象のサイズに対応する入力細胞マスク内の特徴のサイズが検出される。例えば、細胞の分析のための関心対象のサイズは、２０～７５ミクロンの範囲であり得る。関心対象のサイズは、有効径ｄeffに対応し得る。
【0054】
【数1】
【0055】
ステップ４２４では、フィルタリングされた細胞マスクは、分水界アルゴリズムを使用してセグメント化される。分水界アルゴリズムは、選択された特徴を、１つ以上の細胞領域にセグメント化する。フィルタリングされた細胞マスクにおいて、各選択された特徴は画素値１を有し、背景領域は画素値０を有する。フィルタリングされた細胞マスクは、以下のようにセグメント化される。
ａ．フィルタリングされた細胞マスク内のフィルタリングされた特徴領域の画素（すなわち、画素値１を有する画素）について、最も近い背景画素（すなわち、画素値０を有する画素）までの距離を計算する。
ｂ．所与のフィルタリングされた特徴領域内の計算された距離の１つ以上の極大値を識別する。各極大値は、重心に対応する。
ｃ．フィルタリングされた特徴領域の１つ以上の重心までの距離に基づいて、フィルタリングされた特徴領域内の各画素を分類する。フィルタリングされた特徴領域内の各画素を最も近い重心に割り当てる。同じ重心に割り当てられた画素群は、細胞領域として分類される。
ｄ．ステップｃで判定された各細胞領域内の画素場所にインデックスを割り当てることによって、ラベル付けされたマスク画像を作成する。例えば、第１の細胞領域は、その画素場所に割り当てられた１を有し得、第２の細胞領域は、その画素場所に割り当てられた２を有し得る、などである。
ａ．フィルタリングされた細胞マスク内のフィルタリングされた特徴領域の画素（すなわち、画素値１を有する画素）について、最も近い背景画素（すなわち、画素値０を有する画素）までの距離を計算する。
ｂ．所与のフィルタリングされた特徴領域内の計算された距離の１つ以上の極大値を識別する。各極大値は、重心に対応する。
ｃ．フィルタリングされた特徴領域の１つ以上の重心までの距離に基づいて、フィルタリングされた特徴領域内の各画素を分類する。フィルタリングされた特徴領域内の各画素を最も近い重心に割り当てる。同じ重心に割り当てられた画素群は、細胞領域として分類される。
ｄ．ステップｃで判定された各細胞領域内の画素場所にインデックスを割り当てることによって、ラベル付けされたマスク画像を作成する。例えば、第１の細胞領域は、その画素場所に割り当てられた１を有し得、第２の細胞領域は、その画素場所に割り当てられた２を有し得る、などである。
【0056】
ステップ４２６では、細胞マスクを検証して、最終的な細胞マスクを生成し得る。セグメント化ステップ４２４から得られる細胞マスクは、過剰な細胞領域を示す場合がある。識別された細胞領域のいくつかは、誤差であり得、実際に背景領域に対応する。ステップ４２６では、ステップ４２４によって生成された細胞マスクは、複数のサブ領域に空間的に分割され得る。取得時間間隔中に取得されたＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、対応する複数のサブ領域に空間的に分割することができる。例えば、細胞マスク及びＣｅｌｌＦｉｎｄ画像は、４つの象限に各々分割され得る。サブ領域の範囲は、１～１００個のサブ領域であり得る。各細胞領域について、ピアソン差（式３）を、細胞平均時系列と、最も近いサブ領域についての細胞及び背景時系列との間で計算することができる。この場合、「オブジェクト」は特定の細胞に対応し、Ｐo,c又はＰo,b内の変数「ｏ」は、単一の特定の細胞に属するものとして定義された画素の平均時系列である。Ｐo,c内の変数「ｃ」は、ステップ４２０で加重和画像に適用された第１の閾値に従って、任意の細胞に属すると定義された全ての画素の平均時系列である。Ｐo,b内の変数「ｂ」は、ステップ４２０で加重和画像に適用された第２の閾値に従って、背景に属すると定義された全ての画素の平均時系列である。細胞ごとの結果として生じるＰＤ値は、１×Ｎアレイに記憶され、ここで、Ｎは、細胞マスク内で識別される細胞の総数である。いくつかの実施形態では、数値安定性を加えるために、背景領域から画素を無作為に選択することによって、１つ以上の「偽細胞」が生成され得る。偽細胞のサイズは、１０画素から背景領域の１００％までの範囲であり得る。典型的なサイズは、背景領域の２０％である。偽細胞の数は、細胞マスク内の識別された細胞領域の５％から識別された細胞領域の１００％までの範囲であり得る。典型的な数は、識別された細胞領域の１０％である。偽細胞ごとに、ピアソン差を計算し、実際の細胞からの値に追加して、１×（Ｎ＋Ｆ）アレイを生成することができ、ここで、Ｆは、追加された偽細胞の総数である。ピアソン差のアレイは、例えば、ｋ平均クラスタリング（ｗｗｗ．ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ．ｏｒｇ／ｓｔａｂｌｅ／ｍｏｄｕｌｅｓ／ｇｅｎｅｒａｔｅｄ／ｓｋｌｅａｒｎ．ｃｌｕｓｔｅｒ．ＫＭｅａｎｓ．ｈｔｍｌ）に従って、２つのクラスタに分割され得る。より大きい平均ピアソン差を有するクラスタは、「実際の」細胞領域を含むと判定され、より小さい平均値を有するクラスタは、セグメント化アーチファクトを含むと判定される。「偽細胞」の３０％超が「実細胞」クラスタ内に見出される場合、実細胞クラスタはセグメント化アーチファクトを含むと判定され、検証された細胞は、そのクラスタに関連付けられない。
【0057】
最終的な二値細胞マスクを使用して、取得期間中に取得された信号データの分析のために、細胞領域の各々の重心付近の画素のセットを選択することができる。重心付近の画素の選択されたサブセットは、本明細書では細胞関心対象領域（region of interest、ＲＯＩ）と称される。細胞ＲＯＩは、重心を取り囲み、かつその細胞のセグメント化された領域内に含まれる複数の画素を選択することによって選択することができる。選択される画素の数は、ユーザによって定義され得る。例えば、画素数は、２５であり得る。選択される画素数の範囲は、１画素から、ラベル付けされたマスク画像に対応するラベルを有する細胞の全エリアにおける画素数までであり得る。
【0058】
各細胞領域の局所背景領域を識別することができる。各細胞領域の局所背景領域は、上記ステップｄで生成されたラベル付けされたマスク画像において背景ラベルを割り当てられた。取得期間中に背景領域について取得された信号データは、細胞ＲＯＩの信号データからオフセットを除去するために使用され得る。二値細胞マスク内の各細胞領域に対する局所背景領域は、以下のように判定され得る。
【0059】
所与の細胞領域に対する局所背景領域の外側境界を判定することができる。所与の細胞の細胞領域について、細胞領域の二値拡張の第１の複数の反復を実行する。第１の反復回数は、ユーザによって選択され得る。例えば、反復回数は、２５回であり得る。第１の反復回数の範囲は、１５～１５０回の反復であり得る。得られた領域は、細胞領域を取り囲む局所背景の外側境界を画定する。二値拡張の第１の複数の反復は、外側境界の内側に１を有し、外側境界の外側に０を有する第１の二値マスクを生成する。
【0060】
所与の細胞領域に対する局所背景領域の内側境界を判定することができる。所与の細胞の細胞領域について、二値拡張の第２の複数の反復を実行する。第２の反復回数は、外側境界を画定するために使用される反復回数よりも少なく、ユーザによって選択され得る。例えば、反復回数は、１０回であり得る。反復回数の範囲は、５～５０回の反復であり得る。得られた領域は、細胞領域を取り囲む局所背景の内側境界を画定する。二値拡張の第２の複数の反復は、内側境界の内側に１を有し、内側境界の外側に０を有する第２の二値マスクを生成する。
【0061】
第２の二値マスクと第１の二値マスクとの間の二値差を計算することは、所与の細胞領域を部分的に又は全体的に取り囲む局所背景二値マスクを与え得る。局所背景二値マスクは、内側境界と外側境界との間の領域に１を含む。局所背景二値マスクの画素は、ラベル付けされたマスク画像において注釈を付けられ得る。
【0062】
所与の細胞領域に対する局所背景として定義される任意の画素は、細胞マスク内の任意の細胞領域から最小距離に位置する。最小距離は、ユーザによって設定され得る。例えば、最小距離は、２５画素であり得る。所与の細胞領域は、任意の他の細胞領域の背景として定義されない場合がある。所与の細胞領域に対する局所背景の内側境界は、細胞領域と局所背景とが互いに隣接しないように、細胞領域の境界から空間的に分離されている。
【0063】
図７は、単一細胞領域及び局所背景領域の一例の例解図である。細胞領域７０２は、細胞マスク内の画素値１によって表され得る。外側境界７０６は、第１の二値拡張によって判定され得る。内側境界７０４は、第２の二値拡張によって判定され得る。この例では、局所背景領域７０８は、細胞領域７０２を取り囲み、細胞領域７０２の境界から空間的に分離されている。図７は、例解目的に過ぎず、縮尺通りではない。
【0064】
図８は、２つの細胞領域及び２つの局所背景領域の一例の例解図である。細胞領域８０１及び８０２は、細胞マスク内の画素値１によって表され得る。外側境界８０６は、第１の二値拡張によって判定され得る。内側境界８０４は、第２の二値拡張によって判定され得る。この例では、局所背景領域８１０は、細胞領域８０１を部分的に囲み、局所背景領域８０８は、細胞領域８０２を部分的に取り囲んでいる。局所背景領域８０８及び８１０は、細胞領域８０１及び８０２の境界から空間的に分離されている。図８は、例解目的に過ぎず、縮尺通りではない。
【0065】
いくつかの実施形態において、第２のコンセンサス細胞マスクは、図４Ｂに関して上で説明されるように、ステップ４２０でより低い閾値を使用することによって生成され得る。第２のコンセンサス細胞マスクの逆数が計算され得る。二値拡張は、第２のコンセンサス細胞マスクの逆数に適用され得る。得られた逆マスクは、第２の局所背景二値マスクを形成するために、局所背景二値マスクとＡＮＤ演算され得る。
【0066】
図９は、細胞関心対象領域から信号データを抽出するための例示的なブロック図である。図１０は、タイル画像、セグメント化結果、及び抽出された信号データの例を示す。画像１０１０は、特定のタイルに対する最終的な二値マスクを示す。いくつかの細胞領域が、エリア１０１１などに示されている。この例では、エリア１０１２が、信号データの分析のために選択される。画像１０２０は、最終的な細胞マスク１０１０のエリア１０１２の拡大図である。２つの細胞領域、すなわち、細胞領域１０２１の画素のセット及び細胞領域１０２２の画素のセットが示されている。この例は、細胞領域１０２１に焦点を当てている。ステップ９０２において、細胞領域１０２１の画素のセットの重心が計算され得る。重心の計算は、細胞領域１０２１の境界の画素を除外し得る。重心は、画像１０２０、１０３０及び１０４０において「Ｘ」でマークされている。ステップ９０４において、細胞領域１０２１内の画素のサブセットは、関心対象領域（ＲＯＩ）１０３１の画素を定義するために選択され得る。例えば、そのＲＯＩのために選択された画素のサブセットは、重心を取り囲み得る。ＲＯＩ１０３１のために選択される画素の数は、ユーザによって選択され得る。例えば、選択された数は、２５画素であり得る。別の例では、細胞領域１０２１内の画素のサブセットが、ＲＯＩのためにユーザによって選択され得る。
【0067】
ステップ９０６において、そのＲＯＩ画素に対応する信号が得られ得る。ＲＯＩ画素に対応する信号は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの対応する場所におけるセンサについてのセンサ信号を含む。信号は、試薬がセンサアレイ上に流された後にセンサによって測定され得る。細胞の場所に対応するセンサによって測定された信号は、試薬に対する細胞の応答を示し得る。各画素に対して、取得時間間隔中にフレーム当たり１つの信号サンプルが存在する。ステップ９０８において、信号サンプルの値は、フレームごとの平均信号値を与えるために、各フレーム時間又はサンプリング時間においてＲＯＩ内の画素について空間的に平均化され得る。ＲＯＩ内の画素の数は、各フレーム時間ｔFRAMEにおいて空間的に平均化される信号サンプルの数を決定する。空間平均は、以下のように計算され得る。
Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝ΣROIｓｉｇ（ｔFRAME，ｘROI，ｙROI）／ＮROI （８）
ここで、Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）は、時間ｔFRAMEにおけるフレームごとの平均ＲＯＩ信号値、ΣROIは、ＲＯＩ（例えば、ＲＯＩ１０３１）内の画素にわたる和、ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘROI，ｙROI）は、ＲＯＩ内に位置する画素座標（ｘROI，ｙROI）における時間ｔFRAMEにおける信号サンプルの値、ＮROIは、ＲＯＩ内の画素数である。
Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝ΣROIｓｉｇ（ｔFRAME，ｘROI，ｙROI）／ＮROI （８）
ここで、Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）は、時間ｔFRAMEにおけるフレームごとの平均ＲＯＩ信号値、ΣROIは、ＲＯＩ（例えば、ＲＯＩ１０３１）内の画素にわたる和、ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘROI，ｙROI）は、ＲＯＩ内に位置する画素座標（ｘROI，ｙROI）における時間ｔFRAMEにおける信号サンプルの値、ＮROIは、ＲＯＩ内の画素数である。
【0068】
ステップ９１０において、特定の細胞領域に対する局所背景領域内の画素のセットが、局所背景マスク内で識別され得る。例えば、画像１０４０は、細胞領域１０２１の局所背景領域１０４１を示す。ステップ９１２において、背景画素に対応する信号が得られ得る。背景画素に対応する信号は、細胞が存在しないＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの対応する場所におけるセンサについてのセンサ信号を含む。試薬がセンサアレイ上に流された後にセンサによって測定された信号は、センサ上の流された試薬の影響を表し得る。ステップ９１４において、信号サンプルの値は、フレームごとの平均信号値を与えるために、各フレーム時間又はサンプリング時間において背景領域内の画素について空間的に平均化され得る。背景領域における画素の数は、各フレーム時間ｔFRAMEにおいて空間的に平均化される信号サンプルの数を決定する。空間平均は、以下のように計算され得る。
Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝ΣBKGｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘBKG，ｙBKG）／ＮBKG （９）
ここで、Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）は、時間ｔFRAMEにおけるフレームごとの平均背景信号値、ΣBKGは、局所背景領域（例えば、局所背景領域１０４１）内の画素にわたる和、ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘBKG，ｙBKG）は、局所背景領域内に位置する画素座標（ｘBKG，ｙBKG）における時間ｔFRAMEにおける背景信号サンプルの値、ＮBKGは、局所背景領域内の画素数である。
Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝ΣBKGｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘBKG，ｙBKG）／ＮBKG （９）
ここで、Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）は、時間ｔFRAMEにおけるフレームごとの平均背景信号値、ΣBKGは、局所背景領域（例えば、局所背景領域１０４１）内の画素にわたる和、ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME，ｘBKG，ｙBKG）は、局所背景領域内に位置する画素座標（ｘBKG，ｙBKG）における時間ｔFRAMEにおける背景信号サンプルの値、ＮBKGは、局所背景領域内の画素数である。
【0069】
ステップ９１６において、フレーム当たりの平均背景信号値がフレーム当たりの平均ＲＯＩ信号値から減算されて、フレーム当たりの細胞平均ＲＯＩ信号Ｃｅｌｌ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）が以下のように与えられる。
Ｃｅｌｌ＿ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）－Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME） （１０）
Ｃｅｌｌ＿ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）＝Ａｖｇ＿ＲＯＩ＿ｓｉｇ（ｔFRAME）－Ａｖｇ＿ｂｋｇ＿ｓｉｇ（ｔFRAME） （１０）
【0070】
図１０を参照すると、グラフ１０５０は、平均ＲＯＩ信号及び平均背景信号のプロットの例を示す。プロット１０５１、１０５２、１０５３及び１０５４は、それぞれのデータ取得時間間隔に対する平均ＲＯＩ信号値を示す。プロット１０６１、１０６２、１０６３及び１０６４は、それぞれのデータ取得時間間隔に対する平均背景信号値を示す。プロット１０５１、１０６１、１０５２、１０６２、１０５３及び１０６３は、センサアレイ上の洗浄溶液の３つの流れに応答した平均ＲＯＩ信号値及び平均背景信号値を示す。プロット１０５４及び１０６４は、それぞれ、センサアレイ上の増加する濃度のＦＣＣＰを有する試薬溶液の流れに応答してＨｅｐＧ２細胞について判定された平均ＲＯＩ信号値及び平均背景信号値を示す。ＦＣＣＰ（カルボニルシアニドｐ－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の有効な反応解除剤である。ＦＣＣＰの濃度は、試薬溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４２９１ＤＪ）において、１、１０、１００ｍＭであった。
【0071】
図３に戻ると、ステップ３０８において、細胞の平均ＲＯＩ信号値は、振幅及び時間応答を分析するためにパラメータ化され得る。例えば、経時的な細胞の平均ＲＯＩ信号値の平均値、中央値、標準偏差などの統計パラメータが計算され得る。図１１Ａは、経時的な平均及び標準偏差のプロットの例を示す。横軸は、時間軸を秒単位で表している。各々が７秒の持続時間を有する取得期間に対応するトレースがプロットされている。取得期間の間の時間間隔は、除去されている。トレース１１０２は＋／－標準偏差をプロットし、トレース１０４は、平均をプロットしている。平均及び標準偏差は、対照「ＣＯＮ」溶液の４つの流れ及びグルコース「Ｇｌｕ」溶液の１つの流れに対する応答についてプロットされている。平均トレースにおける降下は、溶液が細胞を通過して流れる際の過渡現象である。グルコース溶液に応答した平均トレースは、対照溶液流に対する応答と比較して、上昇した定常状態１１０６を維持する。図１１Ｂは、４２～６４μｍのサイズ範囲内の複数の細胞についての平均ＲＯＩ信号値の最大値の棒グラフの例を示す。図１１Ａに示される結果は、図１１Ｂに示される結果のサブセットである。
【0072】
図１２Ａ～図１２Ｄは、２つの細胞についての信号パラメータの画素ごとの空間プロットの例を示す。これらのプロットにおいて、平均局所背景は、最終的な細胞マスクにおいて示されるような細胞領域における画素から減算される。各細胞の重心は、「Ｘ」でマークされている。図１２Ａは、取得期間にわたる細胞領域内の画素の最大振幅の空間プロットの一例を示す。図１２Ｂは、取得期間にわたる細胞領域内の画素の最小振幅の空間プロットの一例を示す。図１２Ｃは、取得期間にわたる細胞領域内の画素のピーク値に対する時間の空間プロットの一例を示す。図１２Ｄは、取得期間にわたる細胞領域内の画素のトラフ値に対する時間の空間プロットの一例を示す。
【0073】
最終的な細胞マスクは、細胞サイズ統計のために分析され得る。図１３は、１０１個の細胞の細胞サイズのヒストグラム及び統計値の例を示す。略語ｑ１、ｑ２及びｑ３は、それぞれ第１、第２及び第３の四分位数を示す。略語「ｉｑｒ」は、四分位数間範囲、ｑ３－ｑ１、又は分布の中央半分を示す。有効径は、式（７）に関して上で説明されている。
【0074】
様々な例示的な実施形態によれば、上で考察される教示及び／又は例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、適切に構成及び／又はプログラムされたハードウェア及び／又はソフトウェア要素を使用して行われ、又は実装され得る。実施形態がハードウェア及び／又はソフトウェア要素を使用して実装されるかどうかの判定は、任意の要因、例えば、所望の計算速度、出力レベル、耐熱性、処理サイクル予算、入力データ速度、出力データ速度、メモリリソース、データバススピードなど、及び他の設計又は性能の制約に基づき得る。
【0075】
ハードウェア要素の例は、プロセッサ、マイクロプロセッサ、ローカルインターフェース回路を介して通信可能に連結した入力及び／又は出力（Ｉ／Ｏ）デバイス（又は周辺機器）、回路要素（例えば、トランジスタ、抵抗器、コンデンサ、インダクタなど）、集積回路、特定用途向け集積回路（application specific integrated circuit、ＡＳＩＣ）、プログラム可能論理デバイス（programmable logic device、ＰＬＤ）、デジタル信号プロセッサ（digital signal processor、ＤＳＰ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（field programmable gate array、ＦＰＧＡ）、論理ゲート、レジスタ、半導体デバイス、チップ、マイクロチップ、チップセットなどを含み得る。ローカルインターフェースは、例えば、ハードウェアコンポーネント間の適切な通信を可能にするために、１つ以上のバス又は他の有線若しくは無線接続、制御器、バッファ（キャッシュ）、ドライバ、リピータ、及び受信機などを含み得る。プロセッサは、ソフトウェア、特にメモリに記憶されているソフトウェアを実行するためのハードウェアデバイスである。プロセッサは、任意のカスタムメイド又は市販のプロセッサ、中央処理ユニット（central processing unit、ＣＰＵ）、コンピュータに関連付けられたいくつかのプロセッサのうちの補助プロセッサ、半導体ベースのマイクロプロセッサ（例えば、マイクロチップ又はチップセットの形態において）、マクロプロセッサ、又はソフトウェア命令を実行するための、概して任意のデバイスであることができる。プロセッサはまた、分散型処理アーキテクチャを表すことができる。Ｉ／Ｏデバイスには、入力デバイス、例えば、キーボード、マウス、スキャナ、マイクロフォン、タッチスクリーン、様々な医療デバイス及び／又は実験機器のためのインターフェース、バーコード読み取り機、スタイラス、レーザ読み取り機、無線周波デバイス読み取り機等が含まれ得る。更に、Ｉ／Ｏデバイスには、出力デバイス、例えば、プリンタ、バーコードプリンタ、ディスプレイ等も含まれ得る。最後に、Ｉ／Ｏデバイスには、入力及び出力の両方として通信するデバイス、例えば、変調器／復調器（モデム；別のデバイス、システム、又はネットワークにアクセスするため）、無線周波（radio frequency、ＲＦ）トランシーバ又は他のトランシーバ、電話インターフェース、ブリッジ、ルータ等が更に含まれ得る。
【0076】
ソフトウェアの例は、ソフトウェアコンポーネント、プログラム、アプリケーション、コンピュータプログラム、アプリケーションプログラム、システムプログラム、マシンプログラム、オペレーティングシステムソフトウェア、ミドルウェア、ファームウェア、ソフトウェアモジュール、ルーチン、サブルーチン、関数、方法、手続き、ソフトウェアインターフェース、アプリケーションプログラムインターフェース（application program interface、ＡＰＩ）、命令セット、演算コード、コンピュータコード、コードセグメント、コンピュータコードセグメント、ワード、値、記号、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。メモリにおけるソフトウェアは、論理関数を実装するための実行可能な命令が順序付けられたリストを含み得る１つ以上の別個のプログラムを含み得る。メモリにおけるソフトウェアは、本教示に従ってデータ流を識別するためのシステム、並びにシステムなどの他のコンピュータプログラムの実行を制御し得、スケジューリング、入出力制御、ファイル及びデータ管理、メモリ管理、通信制御などを提供する任意の好適なカスタムメイド又は市販のオペレーティングシステム（operating system、Ｏ／Ｓ）を含み得る。
【0077】
様々な例示的な実施形態によれば、上で考察される教示及び／又は例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、機械によって実行された場合、例示的な実施形態による方法及び／又は動作を機械が行わせ得る命令又は命令のセットを記憶し得る、適切に構成及び／又はプログラムされた非一時的機械可読媒体又は物品を使用して行われ、又は実装され得る。そのような機械は、例えば、任意の好適な処理プラットフォーム、コンピューティングプラットフォーム、コンピューティングデバイス、処理デバイス、コンピューティングシステム、処理システム、コンピュータ、プロセッサ、科学機器又は実験機器などを含み得、ハードウェア及び／又はソフトウェアの任意の好適な組み合わせを使用して実装され得る。機械可読媒体又は物品は、例えば、任意の好適なタイプのメモリユニット、メモリデバイス、メモリ物品、メモリ媒体、記憶デバイス、記憶物品、記憶媒体、及び／又は記憶ユニット、例えば、メモリ、取り外し可能又は取り外し不可能な媒体、消去可能又は消去不可能な媒体、書き込み可能又は書き換え可能な媒体、デジタル又はアナログ媒体、ハードディスク、フロッピーディスク、読み出し専用コンパクトディスク（read-only memory compact disc、ＣＤ－ＲＯＭ）、記録可能コンパクトディスク（recordable compact disc、ＣＤ－Ｒ）、書き換え可能コンパクト（rewriteable compact disc、ＣＤ－ＲＷ）、光ディスク、磁気媒体、光磁気媒体、リムーバブルメモリカード又はディスク、様々なタイプのデジタル多用途ディスク（Digital Versatile Disc、ＤＶＤ）、テープ、カセットなどを含み得、コンピュータにおける使用に好適な任意の媒体を含む。メモリは、揮発性メモリ要素（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ、例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭなど））及び不揮発性メモリ要素（例えば、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＲＯＭ、フラッシュメモリ、ハードドライブ、テープ、ＣＤＲＯＭなど）のうちの任意の１つ又は組み合わせを含むことができる。更に、メモリは、電気、磁気、光、及び／又は他のタイプの記憶媒体を組み込むことができる。メモリは、様々なコンポーネントが互いから離れて位置しているが、依然としてプロセッサによってアクセスされる分散型アーキテクチャを有することができる。命令は、任意の好適なタイプのコード、例えば、任意の好適な高レベル、低レベル、オブジェクト指向、ビジュアル、コンパイル済み、及び／又は解釈されたプログラミング言語を使用して実装された、ソースコード、コンパイル済みコード、解釈されたコード、実行可能コード、静的コード、動的コード、暗号化されたコードなどを含み得る。
【0078】
様々な例示的な実施形態によると、上で考察される教示及び／又は例示的な実施形態のうちのいずれか１つ以上の１つ以上の特徴は、分散型、クラスタ、リモート、又はクラウド計算リソースを少なくとも部分的に使用して実施又は実装され得る。
【0079】
様々な例示的な実施形態によれば、上で考察される教示及び／又は例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、ソースプログラム、実行可能プログラム（オブジェクトコード）、スクリプト、又は行われる命令のセットを含む任意の他のエンティティを使用して行われるか、又は実装され得る。ソースプログラムである場合、プログラムは、Ｏ／Ｓと通信して正常に動作するように、メモリ内に含まれるか又は含まれない場合があるコンパイラ、アセンブラ、インタープリタ等を介して翻訳され得る。命令は、（ａ）データ及び方法のクラスを有するオブジェクト指向プログラミング言語、又は（ｂ）例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｒ、Ｐａｓｃａｌ、Ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｃｏｂｏｌ、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ、及びＡｄａを含み得る、ルーチン、サブルーチン、及び／又は機能を有する手続き型プログラミング言語を使用して書き込まれ得る。
【0080】
様々な例示的な実施形態によれば、上で考察される例示的な実施形態のうちの１つ以上は、ユーザインターフェースデバイス、コンピュータ可読記憶媒体、ローカルコンピュータシステム、又はリモートコンピュータシステムに、そのような例示的な実施形態によって生成、アクセス、又は使用された任意の情報、信号、データ、及び／又は中間若しくは最終結果を伝送、表示、保存、印刷、又は出力することを含み得る。そのような伝送、表示、記憶、印刷、又は出力された情報は、例えば、実行及び報告、画像、表、チャート、グラフ、スプレッドシート、相関、配列、並びにそれらの組み合わせの検索可能及び／又はフィルタリング可能なリストの形態を採ることができる。
【実施例】
【0081】
実施例１は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法であって、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことであって、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成する、流すことと、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む、方法である。
【0082】
実施例２は、実施例１の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0083】
実施例３は、実施例１の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0084】
実施例４は、実施例３の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0085】
実施例５は、実施例４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0086】
実施例６は、実施例５の主題を含み、セグメント化するステップが、差分画像内の各画素の絶対値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0087】
実施例７は、実施例２の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてタイル内の画素の平均値を計算して、各タイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0088】
実施例８は、実施例２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルを複数のサブタイルに分割することを更に含む、ことを更に規定する。
【0089】
実施例９は、実施例８の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてサブタイル内の画素の平均値を計算して、各サブタイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0090】
実施例１０は、実施例９の主題を含み、セグメント化するステップが、平均値のアレイにおける最大平均値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0091】
実施例１１は、実施例２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔にわたる平均を計算して、第１の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0092】
実施例１２は、実施例１１の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔中の複数の初期フレームにわたる平均を計算して、第２の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0093】
実施例１３は、実施例１２の主題を含み、セグメント化するステップが、第１の平均画像から第２の平均画像を減算して、時間平均画像を形成するステップを更に含む、ことを更に規定する。
【0094】
実施例１４は、実施例１の主題を含み、セグメント化するステップが、各画素場所について取得時間間隔中の最大画素値を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0095】
実施例１５は、実施例１４の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0096】
実施例１６は、実施例１４の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値の８０％に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0097】
実施例１７は、実施例２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0098】
実施例１８は、実施例１７の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0099】
実施例１９は、実施例１８の主題を含み、ぼかし関数が、周波数領域においてＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを含む、ことを更に規定する。
【0100】
実施例２０は、実施例１８の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0101】
実施例２１は、実施例２０の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0102】
実施例２２は、実施例２１の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0103】
実施例２３は、実施例２１の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0104】
実施例２４は、実施例２３の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0105】
実施例２５は、実施例２４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0106】
実施例２６は、実施例２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの複数の異なる特性に基づいて複数の特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0107】
実施例２７は、実施例２６の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかし関数を複数のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々に適用して、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0108】
実施例２８は、実施例２７の主題を含み、セグメント化するステップが、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々にそれぞれの閾値を適用して、複数の粗い細胞マスクを生成することを更に含み、それぞれの閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、それぞれの閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0109】
実施例２９は、実施例２８の主題を含み、セグメント化するステップが、複数の粗い細胞マスクの加重和を計算して、加重和画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0110】
実施例３０は、実施例２９の主題を含み、更に、セグメント化するステップが、加重和画像に第２の閾値を適用してコンセンサス細胞マスクを形成することを更に含み、第２の閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、第２の閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0111】
実施例３１は、実施例３０の主題を含み、セグメント化するステップが、コンセンサス細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有するコンセンサス細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0112】
実施例３２は、実施例３１の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0113】
実施例３３は、実施例３１の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0114】
実施例３４は、実施例３３の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0115】
実施例３５は、実施例３４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0116】
実施例３６は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するためのシステムであって、プロセッサと、プロセッサと通信可能に接続されたデータストアとを備え、プロセッサは、命令を実行するように構成され、命令は、プロセッサによって実行されるときに、システムに、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、検電画像データは、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことに応答して生成され、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成し、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む方法を行わせる、システムである。
【0117】
実施例３７は、実施例３６の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0118】
実施例３８は、実施例３６の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0119】
実施例３９は、実施例３８の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0120】
実施例４０は、実施例３９の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0121】
実施例４１は、実施例４０の主題を含み、セグメント化するステップが、差分画像内の各画素の絶対値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0122】
実施例４２は、実施例３７の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてタイル内の画素の平均値を計算して、各タイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0123】
実施例４３は、実施例３７の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルを複数のサブタイルに分割することを更に含む、ことを更に規定する。
【0124】
実施例４４は、実施例４３の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてサブタイル内の画素の平均値を計算して、各サブタイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0125】
実施例４５は、実施例４４の主題を含み、セグメント化するステップが、平均値のアレイにおける最大平均値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0126】
実施例４６は、実施例３７の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔にわたる平均を計算して、第１の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0127】
実施例４７は、実施例４６の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔中の複数の初期フレームにわたる平均を計算して、第２の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0128】
実施例４８は、実施例４７の主題を含み、セグメント化するステップが、第１の平均画像から第２の平均画像を減算して時間平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0129】
実施例４９は、実施例３６の主題を含み、セグメント化するステップが、各画素場所について取得時間間隔中の最大画素値を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0130】
実施例５０は、実施例４９の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0131】
実施例５１は、実施例４９の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値の８０％に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0132】
実施例５２は、実施例３７の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0133】
実施例５３は、実施例５２の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0134】
実施例５４は、実施例５３の主題を含み、ぼかし関数が、周波数領域においてＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを含む、ことを更に規定する。
【0135】
実施例５５は、実施例５３の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0136】
実施例５６は、実施例５５の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0137】
実施例５７は、実施例５６の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0138】
実施例５８は、実施例５６の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0139】
実施例５９は、実施例５８の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0140】
実施例６０は、実施例５９の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0141】
実施例６１は、実施例３７の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの複数の異なる特性に基づいて複数の特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0142】
実施例６２は、実施例６１の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかし関数を複数のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々に適用して、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0143】
実施例６３は、実施例６２の主題を含み、セグメント化するステップが、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々にそれぞれの閾値を適用して、複数の粗い細胞マスクを生成することを更に含み、それぞれの閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、それぞれの閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0144】
実施例６４は、実施例６３の主題を含み、セグメント化するステップが、複数の粗い細胞マスクの加重和を計算して、加重和画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0145】
実施例６５は、実施例６４の主題を含み、セグメント化するステップが、加重和画像に第２の閾値を適用して、コンセンサス細胞マスクを形成することを更に含み、第２の閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、第２の閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0146】
実施例６６は、実施例６５の主題を含み、セグメント化するステップが、コンセンサス細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有するコンセンサス細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0147】
実施例６７は、実施例６６の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0148】
実施例６８は、実施例６６の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0149】
実施例６９は、実施例６８の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0150】
実施例７０は、実施例６９の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0151】
実施例７１は、コンピュータによって実行されるときに、コンピュータに、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法を実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であり、方法は、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、検電画像データは、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことに応答して生成され、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成し、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む方法を行わせる、非一時的コンピュータ可読媒体である。
【0152】
実施例７２は、実施例７１の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0153】
実施例７３は、実施例７１の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0154】
実施例７４は、実施例７３の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0155】
実施例７５は、実施例７４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0156】
実施例７６は、実施例７５の主題を含み、セグメント化するステップが、差分画像内の各画素の絶対値を計算することを更に含む、ことを更に規定する。
【0157】
実施例７７は、実施例７２の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてタイル内の画素の平均値を計算して、各タイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0158】
実施例７８は、実施例７２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルを複数のサブタイルに分割することを更に含む、ことを更に規定する。
【0159】
実施例７９は、実施例７８の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔内の各サンプリング時間においてサブタイル内の画素の平均値を計算して、各サブタイルに対応する平均値のアレイを生成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0160】
実施例８０は、実施例７９の主題を含み、セグメント化するステップが、平均値のアレイにおける最大平均値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0161】
実施例８１は、実施例７２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔にわたる平均を計算して、第１の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0162】
実施例８２は、実施例８１の主題を含み、セグメント化するステップが、タイル内の各画素値の取得時間間隔中の複数の初期フレームにわたる平均を計算して、第２の平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0163】
実施例８３は、実施例８２の主題を含み、セグメント化するステップが、第１の平均画像から第２の平均画像を減算して、時間平均画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0164】
実施例８４は、実施例７１の主題を含み、セグメント化するステップが、各画素場所について取得時間間隔中の最大画素値を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0165】
実施例８５は、実施例８４の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0166】
実施例８６は、実施例８４の主題を含み、セグメント化するステップが、最大画素値の８０％に対応するフレームインデックスを判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0167】
実施例８７は、実施例７２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0168】
実施例８８は、実施例８７の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0169】
実施例８９は、実施例８８の主題を含み、ぼかし関数が、周波数領域においてＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを含む、ことを更に規定する。
【0170】
実施例９０は、実施例８８の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0171】
実施例９１は、実施例９０の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0172】
実施例９２は、実施例９１の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0173】
実施例９３は、実施例９１の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0174】
実施例９４は、実施例９３の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0175】
実施例９５は、実施例９４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0176】
実施例９６は、実施例７２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの複数の異なる特性に基づいて複数の特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0177】
実施例９７は、実施例９６の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかし関数を複数のＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々に適用して、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0178】
実施例９８は、実施例９７の主題を含み、セグメント化するステップが、複数のぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の各々にそれぞれの閾値を適用して、複数の粗い細胞マスクを生成することを更に含み、それぞれの閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、それぞれの閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0179】
実施例９９は、実施例９８の主題を含み、セグメント化するステップが、複数の粗い細胞マスクの加重和を計算して、加重和画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0180】
実施例１００は、実施例９９の主題を含み、セグメント化するステップが、加重和画像に第２の閾値を適用して、コンセンサス細胞マスクを形成することを更に含み、第２の閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、第２の閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0181】
実施例１０１は、実施例１００の主題を含み、セグメント化するステップが、コンセンサス細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有するコンセンサス細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0182】
実施例１０２は、実施例１０１の主題を含み、関心対象のサイズが細胞のサイズに対応すること、を更に規定する。
【0183】
実施例１０３は、実施例１０１の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0184】
実施例１０４は、実施例１０３の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することを更に含む、ことを更に規定する。
【0185】
実施例１０５は、実施例１０４の主題を含み、セグメント化するステップが、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することを更に含む、ことを更に規定する。
【0186】
実施例Ａ１は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法であって、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことであって、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成する、流すことと、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む、方法である。
【0187】
実施例Ａ２は、実施例Ａ１の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0188】
実施例Ａ３は、実施例Ａ１の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0189】
実施例Ａ４は、実施例Ａ３の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することと、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することと、差分画像内の各画素の絶対値を計算することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【0190】
実施例Ａ５は、実施例Ａ２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0191】
実施例Ａ６は、実施例Ａ５の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含み、ぼかし関数は、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを更に含む、ことを更に規定する。
【0192】
実施例Ａ７は、実施例Ａ６の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0193】
実施例Ａ８は、実施例Ａ７の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0194】
実施例Ａ９は、実施例Ａ８の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0195】
実施例Ａ１０は、実施例Ａ９の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することと、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【0196】
実施例Ａ１１は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するためのシステムであって、プロセッサと、プロセッサと通信可能に接続されたデータストアとを備え、プロセッサは、命令を実行するように構成され、命令は、プロセッサによって実行されるときに、システムに、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、検電画像データは、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことに応答して生成され、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成し、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む方法を行わせる、システムである。
【0197】
実施例Ａ１２は、実施例Ａ１１の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0198】
実施例Ａ１３は、実施例Ａ１１の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0199】
実施例Ａ１４は、実施例Ａ１３の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することと、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することと、差分画像内の各画素の絶対値を計算することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【0200】
実施例Ａ１５は、実施例Ａ１２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0201】
実施例Ａ１６は、実施例Ａ１５の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含み、ぼかし関数は、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを更に含む、ことを更に規定する。
【0202】
実施例Ａ１７は、実施例Ａ１６の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0203】
実施例Ａ１８は、実施例Ａ１７の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0204】
実施例Ａ１９は、実施例Ａ１８の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0205】
実施例Ａ２０は、実施例Ａ１９の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することと、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクのための細胞領域及び背景領域を判定することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【0206】
実施例Ａ２１は、コンピュータによって実行されるときに、コンピュータに、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイデバイスのセンサアレイ表面上に配設された細胞を分析するための方法を行わせる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であり、方法は、取得時間間隔中に検電画像データの複数のフレームを取得することであって、検電画像データは、センサアレイ表面にわたってｐＨのステップ変化を有する溶液を流すことに応答して生成され、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイの複数のＣｈｅｍＦＥＴセンサが、流された溶液のｐＨのステップ変化に応答して、複数の信号を生成して、検電画像データを生成し、各フレームが、取得時間間隔中のサンプリング時間において測定されたＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイによって生成された複数の信号の信号サンプルに対応し、各フレームが、複数の画素を含み、フレーム内の所与の画素が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサアレイ内の所与のセンサからの信号サンプルに対応する、取得することと、流された溶液のｐＨにおけるステップ変化に応答して生成される信号サンプルの特性に基づいて、検電画像データを、センサアレイ表面上の細胞の場所に対応する１つ以上の細胞領域と、細胞を有しないセンサアレイ上のエリアに対応する１つ以上の背景領域と、にセグメント化することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体である。
【0207】
実施例Ａ２２は、実施例Ａ２１の主題を含み、各フレームが、複数のタイルを備え、各タイルが、フレームの画素のサブセットを備える、ことを更に規定する。
【0208】
実施例Ａ２３は、実施例Ａ２１の主題を含み、セグメント化するステップが、取得時間間隔中に、各画素場所について、最大画素値から最小画素値を減算して、ピークツーピーク画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0209】
実施例Ａ２４は、実施例Ａ２３の主題を含み、セグメント化するステップが、ピークツーピーク画像内の画素の平均値を計算することと、ピークツーピーク画像内の各画素値から平均値を減算して、差分画像を形成することと、差分画像内の各画素の絶対値を計算することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【0210】
実施例Ａ２５は、実施例Ａ２２の主題を含み、セグメント化するステップが、タイルの各画素に対応する信号サンプルの特性に基づいて、特徴値を判定して、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0211】
実施例Ａ２６は、実施例Ａ２５の主題を含み、セグメント化するステップが、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にぼかし関数を適用して、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像を形成することを更に含み、ぼかし関数は、ＣｅｌｌＦｉｎｄ画像にローパスフィルタを適用することを更に含む、ことを更に規定する。
【0212】
実施例Ａ２７は、実施例Ａ２６の主題を含み、セグメント化するステップが、ぼかしＣｅｌｌＦｉｎｄ画像の画素に閾値を適用して、粗い細胞マスクを生成することを更に含み、閾値以上の画素値には、１の値が割り当てられ、閾値未満の画素値には、０の値が割り当てられる、ことを更に規定する。
【0213】
実施例Ａ２８は、実施例Ａ２７の主題を含み、セグメント化するステップが、粗い細胞マスクをフィルタリングして、関心対象のサイズを有する粗い細胞マスクの特徴を選択して、フィルタリングされた細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0214】
実施例Ａ２９は、実施例Ａ２８の主題を含み、セグメント化するステップが、フィルタリングされた細胞マスクの選択された特徴に分水界アルゴリズムを適用して、フィルタリングされた細胞マスクの画素を１つ以上の初期細胞領域及び１つ以上の初期背景領域に分類して、細胞マスクを形成することを更に含む、ことを更に規定する。
【0215】
実施例Ａ３０は、実施例Ａ２９の主題を含み、セグメント化するステップが、細胞マスク内の最も近いサブ領域について細胞平均時系列と細胞及び背景時系列との間で計算されたピアソン差に基づいて細胞マスクを検証することと、ピアソン差をクラスタ化して、最終的な細胞マスクについて細胞領域及び背景領域を判定することと、を更に含む、ことを更に規定する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【国際調査報告】