特表 2024-542939 抗体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】抗体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241112BHJP

   C07K 17/04 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 17/08 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 17/10 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241112BHJP

   A01K 67/0275 20240101ALI20241112BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241112BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K17/04

C07K17/08

C07K17/10

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/08

C07K1/22

C12N15/864 100Z

A01K67/0275

C12N7/01

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P21/04

A61K35/76

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522269

(86)(22)【出願日】2022-10-15

(85)【翻訳文提出日】2024-05-24

(86)【国際出願番号】 US2022078180

(87)【国際公開番号】W WO2023064947

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/256,511

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518278029

【氏名又は名称】リジェネクスバイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】フィチェラ ミケーレ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン リン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ジュチュン

(72)【発明者】

【氏名】パテル ヒレン

(72)【発明者】

【氏名】ワン フワ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA12

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA94

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA94

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、ペプチド抗原に特異的に結合する抗体である。ペプチド抗原を検出、単離または定量する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は、プロテアーゼ消化によってジストロフィンまたはマイクロジストロフィンから放出される。抗体を使用して試料にてマイクロジストロフィンまたはジストロフィンを検出または定量するための方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、核酸ベースの治療を施されている対象にてマイクロジストロフィンの発現をモニターするのに使用される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１から成る、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

配列番号２のアミノ酸から成るペプチドに結合しない、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｃ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｃ）それぞれ、７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１及び７５Ａ２－１の前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がＫａｂａｔに従う、請求項６または請求項７に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）１３０Ｄ２－１抗体の前記ＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１３３Ｅ１０－１抗体の前記ＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）７５Ａ２－１抗体の前記ＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）それぞれ１３０Ｄ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｂ）それぞれ１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
（ｃ）それぞれ７５Ａ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項13】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは、配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項15】

配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、請求項６～１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項16】

前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１から成る、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

配列番号２のアミノ酸から成るペプチドに結合しない、請求項６～１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項18】

配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項19】

前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号３から成る、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項20】

前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１８または請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項21】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１８または請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項22】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｃ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｄ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｅ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項23】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｃ）それぞれ、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｄ）それぞれ、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｅ）それぞれ、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項24】

１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１及び１３３Ｄ７－１の前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がＫａｂａｔに従う、請求項２２または請求項２３に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項25】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｅ）１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項26】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）それぞれ１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｂ）それぞれ１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｃ）それぞれ１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｄ）それぞれ１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
（ｅ）それぞれ１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項27】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項28】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項29】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは、配列番号１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項30】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは配列番号１４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは配列番号１５のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項31】

配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、請求項２２～３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項32】

前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号３から成る、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項33】

前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単離されたＶＨドメインを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。

【請求項35】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物である、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と固体支持体とを含む、アフィニティー樹脂。

【請求項37】

前記固体支持体がビーズ、ゼラチン、またはアガロースを含む、請求項３６に記載のアフィニティー樹脂。

【請求項38】

前記抗体またはその抗原結合断片が共有結合によって前記固体支持体に結合されている、請求項３６または請求項３７に記載のアフィニティー樹脂。

【請求項39】

前記抗体またはその抗原結合断片が非共有会合によって前記固体支持体に結合されている、請求項３６または請求項３７に記載のアフィニティー樹脂。

【請求項40】

請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項41】

請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項42】

請求項４０に記載のポリヌクレオチド、または請求項４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項43】

ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。

【請求項44】

請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を産生するのに好適な条件下で請求項４２または請求項４３に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記方法。

【請求項45】

試料からペプチドを単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記ペプチドを含む前記試料を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項１８～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記抗体またはその抗原結合断片への前記ペプチドの結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合していない前記試料の部分を除去することと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片から前記ペプチドを解離することと
を含み、前記ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１または３を含む、前記方法。

【請求項46】

前記ペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１または３から成る、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記抗体またはその抗原結合断片を含む前記組成物が、ビーズ、ゼラチン、またはアガロースから成る群から選択される固体支持体を含むアフィニティー樹脂である、請求項４５または請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記抗体またはその抗原結合断片が共有結合によって前記固体支持体に結合されている、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記抗体またはその抗原結合断片が非共有会合によって前記固体支持体に結合されている、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記試料が、対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記プロテアーゼがトリプシンを含む、請求項５０または請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

（ｄ）前記ペプチドを回収することと；
（ｅ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
をさらに含む、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記試料が、配列番号１または３のアミノ酸配列を含む安定同位体標識ペプチド標準をさらに含む、請求項４５～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記組換えポリペプチドがマイクロジストロフィンである、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

対象にて組換えポリペプチドのレベルを定量する方法であって、
（ａ）前記対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；
（ｂ）前記試料を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項１８～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記抗体またはその抗原結合断片の前記ペプチドへの結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合した前記ペプチドを回収することと；
（ｄ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
を含み、前記組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む、前記方法。

【請求項64】

前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、請求項６３または請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記組換えポリペプチドがマイクロジストロフィンである、請求項６３～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記試料が、前記抗体またはその抗原結合断片に結合することができる標識された１つまたは複数のペプチドをさらに含む、請求項６３～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記標識された１つまたは複数のペプチドが安定同位体標識された１つまたは複数のペプチドである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルを定量する方法であって、
（ａ）前記対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；
（ｂ）前記試料を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項１８～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記抗体またはその抗原結合断片の前記ペプチドへの結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合した前記ペプチドを回収することと；
（ｄ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
を含み、前記マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む、前記方法。

【請求項76】

前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの絶対定量を提供する、請求項７５または請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの相対定量を提供する、請求項７５または請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記試料が、前記抗体またはその抗原結合断片に結合することができる標識された１つまたは複数のペプチドをさらに含む、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記標識された１つまたは複数のペプチドが安定同位体標識された１つまたは複数のペプチドである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記標識された１つまたは複数のペプチドが配列番号１または３のアミノ酸配列を含む、請求項８１または請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記対象がヒトである、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記対象が霊長類である、請求項８４に記載の方法。

【請求項87】

前記対象がマウスである、請求項８４に記載の方法。

【請求項88】

前記対象がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている、請求項７５～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記対象が、ジストロフィン遺伝子に１以上の変異を含むように遺伝子操作されている非ヒト哺乳類である、請求項７５～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記対象が、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、請求項７５～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記組換えポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項９０または請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記組換えポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項９０または請求項９１に記載の方法。

【請求項94】

前記ＲＮＡが修飾リボヌクレオチドを含むｍＲＮＡである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記対象が、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、請求項７５～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項97】

前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項９５または請求項９６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ペプチド抗原に特異的に結合し、ペプチド抗原を検出、単離または定量するのに使用することができる抗体に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１５日に出願された米国特許出願第６３／２５６，５１１号の利益を主張し、当該出願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0003】

電子的に提出された配列表への参照
本出願とともに電子的に提出された配列表（名称：６７２８＿１４０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ、サイズ：２９，４０１バイト、作成日：２０２２年１０月１３日）の内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

背景
ジストロフィノパチーと呼ばれる神経筋疾患の一群は、ＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる。それぞれのジストロフィノパチーは異なる表現型を有し、すべての患者が筋力低下を患い、最終的にはさまざまな重症度の心筋症を患う。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子におけるフレームシフト変異によりジストロフィンタンパク質の発現が消失することによって引き起こされる。ジストロフィンタンパク質の欠如により、骨格筋、そして最終的には心筋及び呼吸筋（例えば、肋間筋や横隔膜）が変性し、早期死亡を引き起こす。進行性の筋力低下と筋萎縮は小児期に始まる。冒された人々は呼吸困難、呼吸器感染症、嚥下障害を経験する。ほぼすべてのＤＭＤ患者が心筋症を発症する。心臓病変を合併した肺炎が最も頻度の高い死因であり、２０代までに発症することが多い。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）はＤＭＤほど症状は重くないが、依然として早期死亡につながる。

【0005】

ジストロフィンは、既知の最大のヒト遺伝子であるＤＭＤ遺伝子によってコードされる細胞質タンパク質である。完全長ジストロフィンは、その機能に寄与する多数のサブドメインを含む大きな（４２７ｋＤａ）タンパク質である。ＤＭＤでは、突然変異によりフレームシフトが引き起こされることが多く、その結果、途中で終止コドンが生じ、タンパク質が切り詰められ、機能しなくなり、または不安定になる。ＢＭＤでは、患者は、切り詰められ、部分的に機能するジストロフィンを発現する。

【0006】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が介在する遺伝子治療は、ＤＭＤ、ＢＭＤ、及びそれほど重度ではないジストロフィノパチーの治療のために開発されている。ＡＡＶベクターのペイロードサイズには制限があるため、完全長タンパク質の少なくとも一部の機能を維持しながら、非必須のサブドメインを排除する、ジストロフィンのさらに小さい型であるマイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンを作り出すことに注目が集まっている。国際特許出願公開第ＷＯ２０２１１０８７５５号（特許文献１）。

【0007】

遺伝子治療を受けている対象にて導入遺伝子が介在するマイクロジストロフィン及びミニジストロフィンの発現を検出及び定量する方法に対するニーズがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際特許出願公開第ＷＯ２０２１１０８７５５号

【発明の概要】

【0009】

簡単な概要
一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、単離された抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１または７５Ａ２－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１、または７５Ａ２－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１、または７５Ａ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔに従う。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0010】

一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる単離された抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１または１３３Ｄ７－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１、または１３３Ｄ７－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１または１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔに従う。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0011】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体を含む組成物である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0012】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体及び固体支持体を含むアフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0013】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0014】

一態様では、本明細書で提供されるのは、抗体を産生するのに好適な条件下で抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をインキュベートすることを含む、本明細書に開示されている抗体を産生する方法である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0015】

一態様では、本明細書で提供されるのは、ペプチドの抗体への結合を可能にする条件下でペプチドを含む試料を本明細書に記載されている抗体と接触させることを含む、試料にて配列番号１または３の配列を有するペプチドを検出、単離または定量する方法である。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、ペプチドを回収することを含む。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、回収されたペプチドの量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドの量はＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１を含み、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号３を含み、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0016】

一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１または３の配列を有するペプチドの抗体への結合を可能にする条件下で試料を本明細書に記載されている抗体と接触させることを含む、試料にて組換えポリペプチドのレベルを検出または定量する方法であり、その際、試料はプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含み、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１を含み、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３を含み、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0017】

一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１または３の配列を有するペプチドの抗体への結合を可能にする条件下で試料を本明細書に記載されている抗体と接触させることを含む、試料にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンのレベルを検出または定量する方法であり、その際、試料はプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含み、マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは、ヒト、霊長類、またはマウスのジストロフィンである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、試料は、マイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与された対象からのプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、検出または定量されるタンパク質はマイクロジストロフィンであり、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、検出または定量されるタンパク質はマイクロジストロフィン及びジストロフィンであり、抗体は１３３Ｄ７－１である。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する。
［１．］配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２．］前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１から成る、［１］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［３．］配列番号２のアミノ酸から成るペプチドに結合しない、［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［４．］前記抗体がポリクローナル抗体である、［１］～［３］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［５．］前記抗体がモノクローナル抗体である、［１］～［３］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［６．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｃ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［７．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｃ）それぞれ、７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［８．］１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１及び７５Ａ２－１の前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がＫａｂａｔに従う、［６］または［７］に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片；
［９．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及び前記ＶＬが
（ａ）１３０Ｄ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）７５Ａ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１０．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）それぞれ１３０Ｄ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｂ）それぞれ１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
（ｃ）それぞれ７５Ａ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１１．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１２．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１３．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは、配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１４．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１５．］配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、［６］～［１４］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［１６．］前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１から成る、［１５］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［１７．］配列番号２のアミノ酸から成るペプチドに結合しない、［６］～［１６］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［１８．］配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる単離された抗体またはその抗原結合断片；
［１９．］前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号３から成る、［１８］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［２０．］前記抗体がポリクローナル抗体である、［１８］または［１９］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［２１．］前記抗体がモノクローナル抗体である、［１８］または［１９］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［２２．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｃ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｄ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｅ）それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２３．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｃ）それぞれ、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
（ｄ）それぞれ、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
（ｅ）それぞれ、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２４．］１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１及び１３３Ｄ７－１の前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がＫａｂａｔに従う、［２２］または［２３］に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２５．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｅ）１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２６．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ及びＶＬが
（ａ）それぞれ１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｂ）それぞれ１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｃ）それぞれ１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
（ｄ）それぞれ１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
（ｅ）それぞれ１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２７．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２８．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨがＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、且つ前記ＶＬがＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含み、
（ａ）前記ＶＨのＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＶＨのＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＶＨのＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＶＬのＣＤＲ１は配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＶＬのＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）前記ＶＬのＣＤＲ３は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［２９．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは、配列番号１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［３０．］可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨは配列番号１４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｂ）前記ＶＬは配列番号１５のアミノ酸配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片；
［３１．］配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、［２２］～［３０］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［３２．］前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号３から成る、［３１］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［３３．］前記抗体断片が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単離されたＶＨドメインを含む、［１］～［３２］に記載の抗体またはその抗原結合断片；
［３４．］［１］～［３３］に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
［３５．］薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物である、［３４］に記載の組成物；
［３６．］［１］～［３３］に記載の抗体またはその抗原結合断片と固体支持体とを含むアフィニティー樹脂；
［３７．］前記固体支持体がビーズ、ゼラチン、またはアガロースを含む、［３６］に記載のアフィニティー樹脂；
［３８．］前記抗体またはその抗原結合断片が共有結合によって前記固体支持体に結合されている、［３６］または［３７］に記載のアフィニティー樹脂；
［３９．］前記抗体またはその抗原結合断片が非共有会合によって前記固体支持体に結合されている、［３６］または［３７］に記載のアフィニティー樹脂；
［４０．］［１］～［３３］に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド；
［４１．］［４０］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター；
［４２．］［４０］に記載のポリヌクレオチドまたは［４１］に記載のベクターを含む宿主細胞；
［４３．］ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、［４２］に記載の宿主細胞；
［４４．］［１］～［３３］に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を産生するのに好適な条件下で［４２］または［４３］に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記方法；
［４５．］試料からペプチドを単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記ペプチドを含む前記試料を、［１］～［１７］に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項［１８］～［３３］のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記抗体またはその抗原結合断片への前記ペプチドの結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合していない前記試料の部分を除去することと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片から前記ペプチドを解離することと
を含み、前記ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１または３を含む、前記方法；
［４６．］前記ペプチドの前記アミノ酸配列が配列番号１または３から成る、［４５］に記載の方法；
［４７．］前記抗体またはその抗原結合断片を含む前記組成物が、ビーズ、ゼラチン、またはアガロースから成る群から選択される固体支持体を含むアフィニティー樹脂である、［４５］または［４６］に記載の方法；
［４８．］前記抗体またはその抗原結合断片が共有結合によって前記固体支持体に結合されている、［４７］に記載の方法；
［４９．］前記抗体またはその抗原結合断片が非共有会合によって前記固体支持体に結合されている、［４７］に記載の方法；
［５０．］前記試料が、対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、［４５］～［４９］に記載の方法；
［５１．］前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、［５０］に記載の方法；
［５２．］前記プロテアーゼがトリプシンを含む、［５０］または［５１］に記載の方法；
［５３．］前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、［５０］～［５２］に記載の方法；
［５４．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている、［５０］～［５３］に記載の方法；
［５５．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、［５０］～［５３］に記載の方法；
［５６．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、［５０］～［５３］に記載の方法；
［５７．］前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、［５６］に記載の方法；
［５８．］
（ｄ）前記ペプチドを回収することと；
（ｅ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
をさらに含む、［４５］～［５７］に記載の方法；
［５９．］前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、［５８］に記載の方法；
［６０．］前記試料が、配列番号１または３のアミノ酸配列を含む安定同位体標識ペプチド標準をさらに含む、［４５］～［５９］に記載の方法；
［６１．］前記組換えポリペプチドがマイクロジストロフィンである、［５４］～［６０］に記載の方法；
［６２．］前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、［６１］に記載の方法；
［６３．］対象にて組換えポリペプチドのレベルを定量する方法であって、
（ａ）前記対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；
（ｂ）前記試料を、［１］～［１７］に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項［１８］～［３３］のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記ペプチドへの抗体またはその抗原結合断片の結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合した前記ペプチドを回収することと；
（ｄ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
を含み、前記組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む、前記方法；
［６４．］前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、［６３］に記載の方法；
［６５．］前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、［６３］または［６４］に記載の方法；
［６６．］前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、［６３］～［６５］に記載の方法；
［６７．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている、［６３］～［６６］に記載の方法；
［６８．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、［６３］～［６６］に記載の方法；
［６９．］前記対象が、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、［６３］～［６６］に記載の方法；
［７０．］前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、［６９］に記載の方法；
［７１．］前記組換えポリペプチドがマイクロジストロフィンである、［６３］～［７０］に記載の方法。
［７２．］前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、［７１］に記載の方法。
［７３．］前記試料が、前記抗体またはその抗原結合断片に結合することができる標識された１つまたは複数のペプチドをさらに含む、［６３］～［７２］のいずれか１項に記載の方法；
［７４．］前記標識された１つまたは複数のペプチドが安定同位体標識された１つまたは複数のペプチドである、［７３］に記載の方法；
［７５．］対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルを定量する方法であって、
（ａ）前記対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；
（ｂ）前記試料を、［１］～［１７］に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、及び任意で請求項［１８］～［３３］のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、前記ペプチドへの前記抗体またはその抗原結合断片の結合を可能にする条件下で、接触させることと；
（ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合した前記ペプチドを回収することと；
（ｄ）工程（ｄ）で回収されたペプチドの量を決定することと
を含み、前記マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む、前記方法；
［７６．］前記ペプチドの量がＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される、［７３］に記載の方法；
［７７．］ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの絶対定量を提供する、［７３］または［７４］に記載の方法；
［７８．］ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの相対定量を提供する、［７３］または［７４］に記載の方法；
［７９．］前記試料が、前記対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む、［７３］～［７６］に記載の方法；
［８０．］前記プロテアーゼがトリプシンである、［７３］～［７７］に記載の方法；
［８１．］前記試料が、前記抗体またはその抗原結合断片に結合することができる標識された１つまたは複数のペプチドをさらに含む、［７５］～［８０］のいずれか１項に記載の方法；
［８２．］前記標識された１つまたは複数のペプチドが安定同位体標識された１つまたは複数のペプチドである、［８１］に記載の方法；
［８３．］前記標識された１つまたは複数のペプチドが配列番号１または３のアミノ酸配列を含む、［８１］または［８２］に記載の方法；
［８４．］前記対象がヒト対象、霊長類対象、イヌ対象、またはマウス対象である、［７５］～［８３］に記載の方法；
［８５．］前記対象がヒトである、［８４］に記載の方法；
［８６．］前記対象が霊長類である、［８４］に記載の方法；
［８７．］前記対象がマウスである、［８４］に記載の方法；
［８８．］前記対象がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている、［７５］～［８４］に記載の方法；
［８９．］前記対象が、ジストロフィン遺伝子に１以上の変異を含むように遺伝子操作されている非ヒト哺乳類である、［７５］～［８４］に記載の方法；
［９０．］前記対象が、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている、［７５］～［８９］に記載の方法；
［９１．］前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、［９０］に記載の方法；
［９２．］前記組換えポリヌクレオチドがＤＮＡである、［９０］または［９１］に記載の方法；
［９３．］前記組換えポリヌクレオチドがＲＮＡである、［９０］または［９１］に記載の方法；
［９４．］前記ＲＮＡが修飾リボヌクレオチドを含むｍＲＮＡである、［９３］に記載の方法；
［９５．］前記対象が、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている、［７５］～［８９］に記載の方法；
［９６．］前記マイクロジストロフィンが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、［６９］に記載の方法；
［９７．］前記組換えウイルスが組換えアデノ随伴ウイルスである、［９５］または［９６］に記載の方法。

【0019】

本明細書で説明される組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】マイクロジストロフィンＡのＬＣ－ＭＳ定量用の候補トリプシンペプチドを示す図である。

【図2】ウサギモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体のＬＥＭペプチドへの結合を示す図である。

【図3】ウサギモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体のＬＬＱペプチドへの結合を示す図である。

【図4】ＬＣＭＳによるウサギ抗ＬＥＭペプチドモノクローナル抗体のスクリーニングを示す図である。

【図5】ＬＣＭＳによるウサギ抗ＬＬＱペプチドモノクローナル抗体のスクリーニングを示す図である。

【図6】マイクロジストロフィンＡとジストロフィンを同時に定量するためのＬＣＭＳアッセイを示す図である。

【図7】ＬＢＡ／ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイのワークフローを示す図である。

【図8-1】ＬＥＭペプチド検出アッセイの選択性を示す図である。

【図8-2】ＬＥＭペプチド検出アッセイの選択性を示す図である。

【図9-1】ＬＬＱペプチド検出アッセイの選択性を示す図である。

【図9-2】ＬＬＱペプチド検出アッセイの選択性を示す図である。

【図10】ＬＥＭペプチド検出アッセイによるマイクロジストロフィン導入遺伝子産物の絶対定量を示す図である。

【図11-1】ＬＬＱペプチド検出アッセイによる種々の種における完全長ジストロフィンの相対定量を示す図である。

【図11-2】ＬＬＱペプチド検出アッセイによる種々の種における完全長ジストロフィンの相対定量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
本明細書で提供されるのは、配列番号１または３の配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体である。抗体は、配列番号１または３の配列を有するペプチドの検出、単離及び定量に有用である。抗体はまた、プロテアーゼ、例えば、トリプシンによる消化により配列番号１または３の配列を有するペプチドを放出するタンパク質、例えば、ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンを検出または定量するのに使用することもできる。

【0022】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、マイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている筋ジストロフィーを患う対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現を検出及び定量するための方法である。いくつかの実施形態では、対象は、マイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与されている。いくつかの実施形態では、この方法は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して、配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを検出及び定量する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＬＣ－ＭＳ検出アッセイは、マイクロジストロフィン導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ粒子を投与された非ヒト霊長類対象の筋肉試料にてマイクロジストロフィンレベルの高精度の絶対定量を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＬＣ－ＭＳ検出アッセイは、種々の種、例えばヒト及び霊長類からの筋肉試料にて総ジストロフィンレベルの高精度の相対定量も提供する。

【0023】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。

【0024】

「抗体」という用語は、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせを、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識し、これに特異的に結合する当該免疫グロブリン分子（または免疫グロブリン分子の群）を指す。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、技術用語であり、本明細書では相互交換可能に使用することができ、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を持つ分子を指す。

【0025】

抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換えにより産生される抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、再表面化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖分子及び２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖ペア、イントラボディ、ヘテロ複合体抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、二重特異性抗体、及び多重特異性抗体を挙げることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体はポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの独自性に基づいて、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）、またはその任意のサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のものであることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元構成を有する。抗体は、裸であることができ、または他の分子、例えば毒素、放射性同位体、他のポリペプチドなどに結合または融合され得る。

【0026】

「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」という用語、及び類似の用語は、抗原（例えば、配列番号１または３の配列を有するペプチド）に対するその特異性を抗体分子に付与するアミノ酸残基を含む、抗体分子の部分を指す。抗原結合領域は、マウスやヒトのような任意の動物種に由来することができる。

【0027】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は相互交換可能に使用され、当該技術分野では一般的である。配列の可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるこれらの領域に集中している一方で、可変ドメイン内のさらに高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定の機構や理論にも束縛されることを望まずに、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは主に、抗原（例えば、配列番号１または３の配列を有するペプチド）との抗体の相互作用及び特異性に関与していると考えられる。特定の実施形態では、可変領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を、Ｎ末端からＣ末端にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で含む。特定の実施形態では、可変領域はヒト可変領域である。特定の実施形態では、可変領域はヒトＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域はＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、１以上のＣＤＲが親抗体のＣＤＲと比べて置換、欠失、または挿入によって修飾された。特定の実施形態では、可変領域はＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、１以上のＦＲが親抗体のＦＲと比べて置換、欠失、または挿入によって修飾された。特定の実施形態では、可変領域はＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、１以上のＣＤＲ及び１以上のＦＲが親抗体のＣＤＲ及びＦＲと比べて置換、欠失、または挿入によって修飾された。特定の実施形態では、親抗体はＰＧＺＬ１である。特定の実施形態では、可変領域はヒトＣＤＲ及び霊長類（例えば、非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0028】

当業者はＣＤＲを決定するためのいくつかの方法があることを理解している。１つのアプローチは、異種間の配列変動に基づくものである（すなわち、Ｋａｂａｔ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）（「Ｋａｂａｔ」）。別のアプローチは、抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づいている（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７））（「Ｃｈｏｔｈｉａ」）。加えて、当該技術分野ではこれら２つの方法の組み合わせを用いてＣＤＲを決定することもある。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列はＫａｂａｔに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列はＣｈｏｔｈｉａに従って同定される。可変領域におけるＣＤＲの同定はＣＤＲに隣接する配列としてのＦＲも同定することが理解される。

【0029】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメイン内の残基（大体、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（５ｔｈ Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（「Ｋａｂａｔ」）。

【0030】

Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置の番号付けは、Ｋａｂａｔ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（５ｔｈ Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），「Ｋａｂａｔ」）における抗体の編成の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列との抗体の配列の相同性領域での配列比較によって、所与の抗体について決定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ番号付け規則を用いて番号付けした場合、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームがＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、このループは３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、このループは３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの双方が存在する場合、このループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの折衷物であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用され、例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅにて利用可能である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列はＫａｂａｔに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列はＣｈｏｔｈｉａに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列はＡｂＭに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＶＨのＣＤＲ３配列はＫａｂａｔに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＶＨのＣＤＲ３配列はＣｈｏｔｈｉａに従って同定される。いくつかの実施形態では、ＶＨのＣＤＲ３配列はＡｂＭに従って同定される。

【0031】

【0032】

「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。

【0033】

「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。

【0034】

「抗体断片」という用語はインタクト抗体の一部を指す。「抗原結合断片」とは、抗原に結合するインタクト抗体の一部を指す。抗原結合断片は、インタクト抗体の抗原決定可変領域を含有することができる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、及び単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片とは、単一の抗原決定基、またはエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体または抗原結合断片の集団を指す。これは、通常、さまざまな抗原決定基に向けられたさまざまな抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片という用語は、インタクトのモノクローナル抗体及び完全長のモノクローナル抗体の双方と同様に、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異型、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、及びトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、あらゆる方法で作製されるそのような抗体及びその抗原結合断片を指す。

【0036】

「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界には見られない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、もはやそれらが自然界に見られる形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの実施形態では、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。

【0037】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すのに相互交換可能に使用される。このポリマーは、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に修飾されている、あるいは、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合のような任意の他の操作もしくは修飾のような介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。この定義内に同様に含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１以上の類似体を含有するポリペプチドと同様に、当該技術分野で既知の他の修飾である。本明細書に記載されているポリペプチドは抗体に基づいているので、特定の実施形態では、当該ポリペプチドは、単鎖または結合鎖として存在できることが理解される。

【0038】

２以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の一致を得るために比較し、整列させた（必要に応じてギャップを導入）場合、同じである、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する、２以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列比較を得るのに使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。配列の配列比較アルゴリズムのそのような非限定的な一例は、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４－２２６８（１９９０）（Ｋａｒｌｉｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３－５８７７（１９９３）にて改変）に記載され、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９１））に組み込まれたアルゴリズムである。特定の実施形態では、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されたように使用することができる。ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は配列を整列させるのに使用することができる追加の公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアにおけるＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ ｍａｔｒｉｘ及び４０、５０、６０、７０、または９０のギャップ加重及び１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して）決定される。特定の代替の実施形態では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を組み込んでいるＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップ加重を１６、１４、１２、１０、８、６、または４、長さ加重を１、２、３、４、５とする）。あるいは、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、ＰＡＭ１２０で残差テーブル、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。当業者は、特定の配列比較ソフトウェアによる最大配列比較に適したパラメーターを決定することができる。特定の実施形態では、配列比較ソフトウェアの初期設定パラメーターが使用される。特定の実施形態では、第１のアミノ酸配列の第２の配列のアミノ酸に対する同一性割合「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、その際、Ｙは、第１及び第２の配列の配列比較（目視検査または特定の配列の配列比較プログラムによって整列させたもの）にて同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｚは第２の配列内の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高くなるであろう。

【0039】

非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチドが参照配列に対して特定の割合の配列同一性（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、及びいくつかの実施形態では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）を有するかどうかは、特定の実施形態では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２ ４８９（１９８１））を使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見つける。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列の配列比較プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本明細書に記載されている参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメーターは、同一性の割合が参照ヌクレオチドの完全長にわたって計算され、同一性におけるギャップは参照配列内のヌクレオチドの総数の最大５％まで許容されるように設定される。

【0040】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている２つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であるということは、配列比較アルゴリズムまたは目視検査を使用して測定したとき、最大の一致を求めて比較及び整列させた場合、それらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及びいくつかの実施形態では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。同一性は、長さが少なくとも約１０、約２０、約４０～６０残基である、またはそれらの間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在することができ、６０～８０残基より長い領域、例えば、少なくとも約９０～１００残基にわたって存在することができ、いくつかの実施形態では、配列は、例えばヌクレオチド配列のコード領域のような、比較される配列の完全長にわたって実質的に同一である。

【0041】

「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルスの省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくは偽型を指すのに使用されてもよい。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態の双方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」という用語には、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ－４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ－５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ－６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ－７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ－８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ－９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、または偽型が含まれる。

【0042】

ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、自然界におけるＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子構築物をもたらす１以上の手順の産物であることを意味する。

【0043】

組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子、例えば、配列番号２７のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子）を含むカプシドに包まれたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターゲノムとで構成されるウイルス粒子を指す。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、または偽型を含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、もしくはＡＡＶ－１０、またはこれらの派生体／修飾物／偽型）のものであってもよい。そのようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／偽型、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／偽型を生成する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照のこと）。マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ粒子は、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０２１１０８７５５号に開示されている。

【0044】

本開示及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形態を含む。

【0045】

諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～から成る」及び／または「本質的に～から成る」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～から成る」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～から成る」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。

【0046】

「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用される場合、Ａ及びＢの双方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0047】

本開示の実施形態がマーカッシュ群またはその他の代替の群に関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられた群全体を包含するだけでなく、群の各メンバーも個別に包含し、主要群の全ての可能な亜群も包含し、さらに群メンバーの１以上が不在の主要群も包含する。また、開示されている方法は、開示されている方法における群メンバーのいずれかの１以上が明示的に除外されることも想定している。

【0048】

抗体
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる単離された抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１から成る。いくつかの実施形態では、抗体は配列番号２のアミノ酸から成るペプチドに結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、抗原結合を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単離されたＶＨドメインを含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0050】

いくつかの実施形態では、抗体は、ｐＡｂ＃７６８４－Ａ、ｐＡｂ＃７６８４－Ｂ、またはｐＡｂ＃７６８５ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はｐＡｂ＃７６８４－Ａポリクローナル抗体である。

【0051】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
－それぞれ、１３０Ｄ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
－それぞれ７５Ａ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１、及び７５Ａ２－１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はＫａｂａｔに従う。

【0054】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、
－１３０Ｄ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
－１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
－７５Ａ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、
－それぞれ１３０Ｄ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
－それぞれ１３３Ｅ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
－それぞれ７５Ａ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
－ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号８のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号９のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
－ＶＨのＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ１は配列番号１１のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬのＣＤＲ３は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、
－ＶＨは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬは、配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、
－ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１から成る。いくつかの実施形態では、抗体は配列番号２のアミノ酸から成るペプチドには結合しない。

【0061】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる単離された抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３から成る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗原結合を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単離されたＶＨドメインを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0063】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
－それぞれ、独立して０、１、２、３、４または５個の置換を含む、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、
－それぞれ、１１２Ｅ４－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、１１５Ｇ６－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、１１９Ｈ２－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
－それぞれ、１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
－それぞれ、１３３Ｄ７－１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１、及び１３３Ｄ７－１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＫａｂａｔに従う。

【0066】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、
－１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
－１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
－１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；
－１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；または
－１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、
－それぞれ１１２Ｅ４－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
－それぞれ１１５Ｇ６－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
－それぞれ１１９Ｈ２－１抗体のＶＨ及びＶＬ；
－それぞれ１２１Ｆ１０－１抗体のＶＨ及びＶＬ；または
－それぞれ１３３Ｄ７－１抗体のＶＨ及びＶＬ
を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
－ＶＨのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ１は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ２は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬのＣＤＲ３は、０、１、２、３、４または５個の置換を含む配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨはＶＨの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、且つＶＬはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
－ＶＨのＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
－ＶＨのＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ１は配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
－ＶＬのＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬのＣＤＲ３は配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含み、
－ＶＨは、配列番号１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬは、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0071】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
－ＶＨは配列番号１４のアミノ酸配列を含み；且つ
－ＶＬは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、単離された抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３から成る。

【0073】

いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単離されたＶＨドメインを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている単離されたモノクローナル抗体はさらに、重鎖及び／または軽鎖の定常領域を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている単離されたモノクローナル抗体はさらに、ヒトの重鎖及び／または軽鎖の定常領域を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２から成る群から選択される。

【0077】

いくつかの実施形態では、重鎖定常領域はネイティブのアミノ酸配列を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は非ネイティブの変異型アミノ酸配列を含む。

【0079】

一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、組換え抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または多重特異性抗体である。一実施形態では、抗体断片は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、または単離されたＶＨドメインを含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗体は多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、結合特異性の一方は配列番号１の配列を有するペプチドに対するものであり、他方は配列番号３の配列を有するペプチドに対するものである。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体断片として調製することができる。

【0081】

多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免役グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）），ＷＯ９３／０８８２９，及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照のこと）、及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電的ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照のこと）；「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）；及び例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されたような三重特異性抗体を調製することによって作製されてもよい。「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」または二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンを含む、３以上の機能的抗原結合部位を持つ操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１及び米国特許第１０，０９３，７３３号を参照のこと）。本明細書に開示されている抗体または断片には、異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる。

【0082】

一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は重鎖及び／または軽鎖の定常領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている抗体はヒトの重鎖及び／または軽鎖の定常領域を含む。一実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２の定常領域である。一実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１の定常領域である。一実施形態では、重鎖定常領域はネイティブのアミノ酸配列を含む。

【0083】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体（例えば、１３３Ｄ７－１、または１３３Ｄ７－１）と同じまたは重複する、配列番号１または３の配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体のエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線結晶構造解析、ネガティブ染色及びクライオＥＭ（例えば、Ｌｉｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９６１－９７１（２０１８）；Ｒａｎｔａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２３（１１）；３２４９－３２６１（２０１８）；Ｔｏｒｒｅｎｔｓ ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇ．１５；１５（７）：ｅ１００７９２０（２０１９））、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、及び／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。Ｘ線結晶構造解析については、結晶化は、当該技術分野で知られている方法のいずれかを使用して達成されてもよい（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４），Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体：抗原の結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して検討されてもよく、Ｐｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ６６，２１３－２２１（２０１０））、及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）のようなコンピューターソフトウェアを使用して精査してもよい。変異誘発マッピング試験は、当業者に知られている任意の方法を使用して達成されてもよい。例えば、アラニンスキャニング変異誘発技術を含む変異誘発技術の説明については、上記Ｃｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）及び上記Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ ＆ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）を参照のこと。具体的な実施形態では、抗体のエピトープはアラニンスキャニング変異誘発試験を使用して決定される。通常、エピトープ内の残基がアラニンに置換されると、抗原への結合は減少または破壊される。一実施形態では、エピトープ内の残基がアラニンに置換されると、抗原への結合のＫ_Ｄは約５倍、１０倍、２０倍、１０倍以上増加する。一実施形態では、結合親和性はＥＬＩＳＡによって決定される。加えて、同じまたは重複するエピトープを認識して結合する抗体は、免疫アッセイのような日常的な技術を使用して、例えば、ある抗体が標的抗原への別の抗体の結合を阻止する能力、すなわち、競合結合アッセイを示すことによって同定することができる。

【0084】

一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、１３３Ｄ７－１または１３３Ｄ７－１が結合するエピトープと重複するエピトープに免疫特異的に結合する。

【0085】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、それぞれ配列番号１または３の配列を有するペプチドへの結合に関して１３３Ｄ７－１または１３３Ｄ７－１と競合することができる。

【0086】

特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体のエピトープは抗体を産生させるための免疫原として使用される。

【0087】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体の操作された変異型を生成するための方法である。いくつかの実施形態では、操作された変異型を生成するための方法は指向進化及び酵母ディスプレイを含む。操作された抗体を生成するための方法は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／４３５７８に記載されているように、当業者に知られている。いくつかの実施形態では、操作された抗体は、１以上の改善された特性、例えば、親抗体と比べて標的抗原に対するさらに高い結合親和性を保有する。

【0088】

いくつかの実施形態では、親抗体の操作された変異型を生成する方法は、ＶＨの１以上のアミノ酸残基を置換して、及び／またはＶＬの１以上のアミノ酸残基を置換して、操作された変異型抗体を作り出し、操作された変異型抗体を産生することを含む。いくつかの実施形態では、親抗体は本明細書に記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、親抗体は１３０Ｄ２－１または１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、例えば、親抗体と比べて標的抗原に対する操作された変異型抗体の結合親和性を決定することによって、操作された変異型抗体が改善された特性を有することを決定することを含む。

【0089】

抗原に対する抗体の親和性または結合活性は、当技術分野で周知の任意の好適な方法、例えばフローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、生物層干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または動態解析（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を使用して実験的に決定することができる。直接結合アッセイと同様に競合結合アッセイ形式を容易に採用することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載されている方法を参照のこと。特定の抗体－抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）下で測定すると変動する可能性がある。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、Ｋ_ＤまたはＫｄ、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ）の測定は、当該技術分野で知られているように、抗体及び抗原の標準化溶液、及び標準化緩衝液、例えば、本明細書に記載されている緩衝液を使用して行われる。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているペプチド特異的抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されたもののようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、宿主（例えば、マウス）を免疫し、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はインビトロでも免疫することができる。免疫の後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して、好適な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成し、次いでこれを、融合していないリンパ球及び骨髄腫細胞から選別することができる。免疫沈降、免疫ブロッティングによって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって判定したとき、選択された抗原に対して特異的に向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、次いで、標準的方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を使用したインビトロ培養で、またはインビボで動物にて腹水腫瘍として、増殖させることができる。次いで、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、このモノクローナル抗体を培養培地または腹水から精製することができる。

【0091】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように組み換えＤＮＡ法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源から増幅することができ、または化学的に合成することができる。重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは次いで、好適な発現ベクターにクローニングされ、これが、免疫グロブリンタンパク質を別途産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質移入されると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。

【0092】

モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、組換えＤＮＡ技術を使用する多くの異なる方法で修飾されて別の抗体を生成することができる。いくつかの実施形態では、軽鎖及び重鎖の定常ドメインを非免疫グロブリンポリペプチドと置換して、融合抗体を生成することができる。いくつかの実施形態では、定常領域を切り詰め、または除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成する。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

【0093】

抗体を操作するための方法も使用することができ、当該技術分野で周知である。操作された抗体は置換された、欠失した、または挿入された１以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの配列修飾を使用して、当該技術分野で知られているように、結合、親和性、オンレート、オフレート、結合活性、特異性、または任意の他の好適な特性を減らす、増強する、または改変することができる。グリコシル化部位、酸化部位、または脱アミノ化部位のような翻訳後修飾の標的となる配列要素を変更または除去することによって、開発上の不都合を排除するように抗体を操作することもできる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的に、且つ最も実質的に関与している。したがって、ＣＤＲ配列の一部またはすべては維持される一方で、可変フレームワーク及び定常領域は、置換、挿入、または欠失を導入することによって操作することができる。

【0094】

本明細書に開示されている抗体は、任意で、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持するように操作することもできる。この目標を達成するために、親配列と操作された配列の三次元モデルを使用して、親配列と種々のコンセプトの操作産物を解析するプロセスによって、操作された抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を可能にする。このように、標的抗原（複数可）に対する高い親和性のような所望の抗体の特性が達成されるように、フレームワーク（ＦＲ）残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。

【0095】

特定の実施形態では、抗体断片が提供される。抗体断片を生成するための種々の技法が知られている。従来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化を介して得られる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。特定の実施形態では、抗体断片は組換えで生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖの抗体断片はすべて、大腸菌または他の宿主細胞で発現されて分泌され得るので、これらの断片の大量生成が可能になる。そのような抗体断片は抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような線状抗体であることができ、単一特異性または二重特異性であることができる。抗体断片を生成するための他の技術は当業者には明らかであろう。

【0096】

特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の双方における可変ドメインが、１以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、及び、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域置換及び配列変化によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体に由来してもよく、特定の実施形態では、異なる種の抗体に由来してもよいことが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移行させるために、ＣＤＲのすべてをドナーの可変領域由来の完全なＣＤＲで置き換える必要はなくてもよい。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要である残基を移行させることのみが必要であってもよい。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号及び同第５，６９３，７６２号に示されている説明を考慮すると、免疫原性が低下した機能的抗体を得ることは、日常的な実験を実施することによって、または試行錯誤試験を行うことによって、十分に当業者の能力の範囲内であろう。

【0097】

本発明はさらに、本明細書に記載されている抗体またはその抗体断片と実質的に相同である変異型及び等価物を包含する。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による１以上のアミノ酸の置換を含有することができる。例えば、保存的置換とは、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、ある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で、といったように、あるアミノ酸を、同じ一般的なクラス内の別のアミノ酸で置換することを指す。保存的アミノ酸置換が何を意図するかは当該技術分野にて周知である。

【0098】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されている抗体を含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0099】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されている抗体と固体支持体とを含むアフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズ、ゼラチンまたはアガロースを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は磁気ビーズを含む。いくつかの実施形態では、抗体は共有結合によって固体支持体に結合されている。いくつかの実施形態では、抗体は非共有会合によって固体支持体に結合されている。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0100】

ポリヌクレオチド
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体（例えば、可変軽鎖及び／または可変重鎖の領域）またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列または複数のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びベクター、例えば、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターである。一実施形態では、ベクターは、宿主細胞（例えば、大腸菌及び哺乳類細胞）における本明細書に記載されている抗体の組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔに従う。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0101】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体の重鎖可変領域または重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

【0102】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体の軽鎖可変領域または軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

【0103】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体の重鎖可変領域または重鎖、及び本明細書に記載されている抗体の軽鎖可変領域または軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、配列番号６及び７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、配列番号１６及び１７のヌクレオチド配列を含む。

【0105】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、軽鎖及び重鎖、例えば、別個の軽鎖及び重鎖を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。軽鎖に関して、具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドはカッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドはラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖を含む本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ヒト定常領域配列は、米国特許第５，６９３，７８０号に記載されているものであることができる。

【0106】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体は重鎖を含み、重鎖の定常領域はヒトのアルファまたはガンマ重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0107】

さらに別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体は、本明細書に記載されている任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、定常領域は、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＧ１（例えば、アロタイプ１、１７、または３）、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0108】

さらに別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、例えば、コドン／ＲＮＡの最適化、異種シグナル配列による置換、及びｍＲＮＡ不安定性要素の除去によって最適化されている、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。組換え発現のために、ｍＲＮＡにてコドン変更を導入する及び／または阻害領域を除去することによって、配列番号１または３の配列を有するペプチドに結合する抗体またはその断片（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号；同第６，１７４，６６６号；同第６，２９１，６６４号；同第６，４１４，１３２号；及び同第６，７９４，４９８号に記載された最適化法を適応させることによって実施することができる。例えば、核酸配列によってコードされたアミノ酸を変更することなく、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位及び不安定要素（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチ要素）を変異させて、組換え発現のためにＲＮＡの安定性を高めることができる。この変更は、遺伝暗号の縮重、例えば、同一のアミノ酸に別のコドンを使用することを利用する。いくつかの実施形態では、保存的変異、例えば、元のアミノ酸と同様の化学構造及び特性及び／または機能を持つ同様のアミノ酸をコードするように１以上のコドンを変更することが望ましい場合がある。

【0109】

ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている任意の方法によって取得することができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列、及びこれらの抗体の修飾型は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンは、抗体をコードする核酸を生成するような方法で構築される。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドを、化学合成オリゴヌクレオチドから構築することかでき（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２－２４６に記載されているように）、これは要するに、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いでＰＣＲによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を含む。

【0110】

特定の抗体またはその断片をコードする核酸を含有するクローンを入手できないが、抗体分子またはその断片の配列が分かっている場合、免疫グロブリンまたはその断片をコードする核酸は、配列の３’末端及び５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、化学的に合成することができ、または好適な供給源（例えば、本明細書に記載されている抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞のような、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成される抗体ｃＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から入手することができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

【0111】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体を（例えば、組換えにより）発現する細胞（例えば、宿主細胞）、及び関連するポリヌクレオチド及び発現ベクターである。本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）である。一実施形態では、ベクターは、宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）における本明細書に記載されている抗体の組換え発現に使用することができる。本明細書で提供されるのはまた、本明細書に記載されている抗体を組換え発現するためのそのようなベクターを含む宿主細胞である。特定の態様では、本明細書で提供されるのは、宿主細胞にて本明細書に記載されている抗体を発現させることを含む、そのような抗体を生成するための方法である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔに従う。いくつかの実施形態では、抗体は抗原結合抗体断片を含む。

【0112】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む単離されたベクターである。

【0113】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたは本明細書に記載されているベクターを含む宿主細胞である。一実施形態では、ベクターは本明細書に記載されている抗体をコードする。一実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、本明細書に記載されているＶＨをコードする第１のベクターと、本明細書に記載されているＶＬをコードする第２のベクターとを含む。一実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、本明細書に記載されているＶＨをコードする第１のヌクレオチド配列と、本明細書に記載されているＶＬをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは配列番号４及び５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは配列番号１４及び１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号６及び７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１６及び１７のヌクレオチド配列を含む。

【0114】

一実施形態では、宿主細胞は、組織培養における大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＮＩＨ－３Ｔ３、Ｈｅｌｇａ、ＢＨＫ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０の細胞、植物細胞、昆虫細胞、及びヒト細胞から成る群から選択される。一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯである。

【0115】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、本明細書に記載されている宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載されている抗体（例えば、１３０Ｄ２－１及び１３３Ｄ７－１）を産生する方法である。一実施形態では、当該方法はさらに、抗体を回収することを含む。

【0116】

単離されたポリペプチド、すなわち本明細書に記載されている抗体は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法によって産生することができる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、好適な形質転換宿主にてそれらの配列を発現させることまで、さまざまである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、組換え技術を使用して、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することによって構築される。任意で、配列を部位特異的変異誘発によって変異させて、その機能的類似体を提供することができる。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２－５０６６（１９８４）及び米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと。

【0117】

いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成によって構築されるであろう。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞にて好まれるコドンを選択して設計することができる。標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補的構築のための５’または３’オーバーハングを含有する。

【0118】

（合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって）いったん構築されると、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適切な発現制御配列に操作可能に連結される。適切な構築は、ヌクレオチドの配列決定、制限マッピング、及び好適な宿主における生物学的に活性があるポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野で周知のように、宿主にて形質移入された遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主にて機能性である転写及び翻訳の発現制御配列に操作可能に連結される必要がある。

【0119】

特定の実施形態では、抗体またはその断片をコードするＤＮＡを増幅し発現させるために組換え発現ベクターが使用される。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する好適な転写または翻訳の調節要素に操作可能に連結された抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成ＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する、複製可能なＤＮＡ構築物である。転写ユニットは一般に、（１）遺伝子発現を調節する役割を有する遺伝要素または複数の遺伝要素、例えば、転写プロモーターまたは転写エンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳の開始配列及び終結配列との集合体を含む。そのような調節要素には、転写を制御するためのオペレーター配列を挙げることができる。通常、複製起点によって付与される宿主で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子とが、さらに組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連しているとき、操作可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されている；プロモーターは、それがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に操作可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置付けられている場合、コード配列に操作可能に連結されている。酵母発現系での使用を目的とする構造要素には、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、タンパク質はＮ末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は任意でその後、発現された組換えタンパク質から切断されて最終的な生成物をもたらすことができる。

【0120】

発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択に依存するであろう。種々の宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載されている抗体分子を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を生成し、続いて精製することができる媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入された場合に、本明細書に記載されている抗体分子を原位置で発現することができる細胞も表す。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス・ピチア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のような緑藻）；あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を内部に持つ哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、Ｈｅｌｇａ、及びＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０の細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体を発現するための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えばヒト細胞株である。具体的な実施形態では、哺乳類発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に組換え抗体分子全体の発現のための大腸菌のような細菌細胞、または真核細胞（例えば、哺乳類細胞）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせて、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ＭＫ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：１０１－１０５；及びＣｏｃｋｅｔｔ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６６２－６６７）。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞によって産生される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって調節される。

【0121】

本明細書に記載されている抗体のような目的のポリペプチドの発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫、または高等真核生物の細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば、大腸菌または桿菌が挙げられる。高等真核細胞には、哺乳類起源の確立された細胞株が挙げられる。無細胞翻訳系も採用され得る。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類の細胞宿主で使用するための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）によって記載されており、その関連する開示は参照によって本明細書に組み込まれる。抗体産生を含むタンパク質産生の方法に関する追加情報は、例えば、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号及び同第６，６６０，５０１号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０４００９８２３号に見いだすことができ、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0122】

種々の哺乳類または昆虫の細胞培養系も、本明細書に記載されている抗体のような組換えタンパク質を発現させるために有利に採用される。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般に正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能するので実行することができる。好適な哺乳類宿主細胞株の例には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因的に生成しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモーター及びエンハンサー、及び他の５’または３’隣接非転写配列のような非転写エレメント、ならびに、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終結配列のような５’または３’非翻訳配列を含むことができる。昆虫細胞にて異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。

【0123】

形質転換された宿主によって産生されるタンパク質は、任意の好適な方法に従って精製することができる。そのような標準的方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的技法が挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザＨＡペプチド配列、及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼのようなアフィニティータグをタンパク質に結合させて、適切なアフィニティーカラムに通すことによる容易な精製を可能にすることができる。タンパク質分解、核磁気共鳴、及びＸ線結晶構造解析のような技法を使用して、単離タンパク質を物理的に特徴付けることもできる。

【0124】

例えば、組換えタンパク質、例えば、抗体を培養培地中に分泌する系からの上清は先ず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮工程の後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂は、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）のペンダント基を有するマトリックスまたは基質を採用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般に採用される他の種類であることができる。あるいは、カチオン交換工程を採用することができる。好適なカチオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。最後に、疎水性ＲＰ－ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを採用する、１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）工程を採用して、作用物質をさらに精製することができる。前述の精製工程の一部またはすべてを、種々の組み合わせで採用して、均質な組換えタンパク質をもたらすこともできる。

【0125】

細菌培養で産生された組換えタンパク質は、例えば、最初に細胞ペレットから抽出し、その後、１以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除のクロマトグラフィー工程を行うことによって単離することができる。最終的な精製工程には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用することができる。組換えタンパク質の発現に採用される微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の好都合な方法によって破壊することができる。

【0126】

抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野で知られている方法には、例えば、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号、第２００８／０１７７０４８号、及び第２００９／０１８７００５号に記載されているものも含まれ、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0127】

具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は単離される、または精製される。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を持つ他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体の調製物は、細胞性物質及び／または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という言語には、抗体が単離されるまたは組換えにより産生される細胞の細胞性構成成分から抗体が分離される抗体の調製物が含まれる。したがって、細胞性物質を実質的に含まない抗体には、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満の異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）及び／または抗体の変異型（例えば、抗体のさまざまな翻訳後修飾型）を有する抗体の調製物が含まれる。ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている抗体）が組換えにより産生される場合、それはまた一般に、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満となる。ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている抗体）が化学合成によって生成される場合、それは一般に、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からそれは分離されている。したがって、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている抗体）のそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物を約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量で）有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は単離されている、または精製されている。

【0128】

ペプチドまたはタンパク質を検出、単離、または定量するための方法
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されている抗体とペプチドを接触させることを含む、試料にてペプチドを検出、単離または定量するための方法であり、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１または配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、試料はプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物は対象から、例えば、対象の骨格筋組織から得られた。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態では、試料は配列番号１を含むペプチド及び配列番号３を含むペプチドを含む。

【0129】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、プロテアーゼで、例えば、トリプシンで消化したタンパク質単離物を含む試料にて組換えポリペプチドを検出または定量するための方法であり、方法は、ペプチドを本明細書に開示されている抗体と接触させることを含み、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。

【0130】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、対象におけるジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現を検出または定量するための方法である。いくつかの実施形態では、方法は、試料を本明細書に開示されている抗体と接触させることを含み、試料はプロテアーゼ、例えばトリプシンで消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは完全長ジストロフィンである。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは内在性ジストロフィンである。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは組換えジストロフィンである。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは、変異させた、または操作されたジストロフィンである。いくつかの実施形態では、ジストロフィンは、抗ＬＬＱ ｍＡｂには結合するが、抗ＬＥＭ ｍＡｂには結合しない、変異させた、または操作されたジストロフィンである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは抗ＬＬＱ ｍＡｂには結合するが、抗ＬＥＭ ｍＡｂには結合しない。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、マイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチド、例えば、マイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与された対象に由来するプロテアーゼ、例えば、トリプシンで消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化したマイクロジストロフィン及びプロテアーゼ消化したジストロフィンを含み、マイクロジストロフィンのプロテアーゼ消化により、配列番号１のＬＥＭペプチドが放出される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して試料にてマイクロジストロフィン及びジストロフィンを同時に検出または定量する。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫親和性精製、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）、または同等のアッセイを介して試料から配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを単離する方法である。いくつかの実施形態では、試料からペプチドを単離する方法は、（ａ）抗体へのペプチドの結合を可能にする条件下で、ペプチドを含む試料を本明細書に記載されている抗体を含む組成物と接触させることと、（ｂ）抗体に結合していない試料の部分を取り除くことと、（ｃ）抗体からペプチドを解離させることとを含む。いくつかの実施形態では、抗体を含む組成物は、固体支持体と本明細書に記載されている抗体とを含むアフィニティー樹脂を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、ゼラチン、またはアガロースから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、固体支持体は磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、抗体は共有結合によって固体支持体に結合されている。いくつかの実施形態では、抗体は非共有会合によって固体支持体に結合されている。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドの精製を容易にするために、タグ、例えば、ビオチン、ヘキサヒスチジンタグ、またはＦＬＡＧタグを含む。いくつかの実施形態では、試料は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドとを同時に単離する。

【0132】

本明細書に記載されている配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを単離する方法のいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８～１２及び１３のアミノ酸配列を含む６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体はそれぞれ配列番号４及び５のＶＨ及びＶＬを含む。

【0133】

本明細書に記載されている配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを単離する方法のいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８～２２及び２３のアミノ酸配列を含む６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１４及び１５のＶＨ及びＶＬを含む。

【0134】

本明細書に記載されている配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを単離する方法のいくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されているポリクローナル抗体、例えばｐＡｂ＃７６８４－Ａである。

【0135】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ペプチドを本明細書に記載されている抗体と接触させることを含む、試料にて配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを定量する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、放射性免疫アッセイ、免疫親和性（ＩＡ）アッセイ、またはリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を含む。いくつかの実施形態では、方法は、試料からペプチドを単離すること、及び回収したペプチドの量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ペプチドの抗体への結合を可能にする条件下で、ペプチドを含む試料を本明細書に記載されている抗体を含む組成物と接触させることと、（ｂ）抗体に結合していない試料の部分を取り除くことと、（ｃ）ペプチドを回収することと、（ｄ）工程（ｃ）にて回収したペプチドの量を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドの量はＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態では、試料はさらに、配列番号１または３のアミノ酸配列を含む安定同位体標識ペプチド標準を含む。いくつかの実施形態では、方法はペプチドの絶対定量を提供する。いくつかの実施形態では、方法はペプチドの相対定量を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に開示されているモノクローナル抗体（例えば、１３０Ｄ２－１または１３３Ｄ７－１）である。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に開示されているポリクローナル抗体、例えば、ｐＡｂ＃７６８４－Ａである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、試料にて配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを同時に定量する。

【0136】

いくつかの実施形態では、試料は、対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、骨格筋は腓腹筋、大腿四頭筋、または横隔膜である。いくつかの実施形態では、試料は、対象の心筋から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンを含む。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象、霊長類対象またはマウス対象である。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはマイクロジストロフィンである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、試料にて組換えポリペプチドを検出または定量するための方法であり、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。当業者は、配列番号２８及び２９を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドのプロテアーゼ消化、例えばトリプシン消化により、それぞれ配列番号１及び３のペプチドが放出されることを理解する。当業者はさらに、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するペプチドを検出または定量する、本明細書に記載されている方法が、組換えポリペプチドのプロテアーゼ消化によってそれぞれ配列番号１及び／または３のペプチドが放出されるという事実に基づいて配列番号２８及び／または２９を含むアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドの検出または定量にも使用できることを理解する。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは配列番号２７のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンである。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；（ｂ）抗体のペプチドへの結合を可能にする条件下で、本明細書に記載されている抗体を含む組成物と試料を接触させることと；（ｃ）抗体に結合したペプチドを回収することと；（ｄ）工程（ｃ）で回収したペプチドの量を決定することとを含む、対象にて組換えポリペプチドのレベルを定量する方法である。いくつかの実施形態では、ペプチドの量はＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態では、試料は対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象、霊長類対象またはマウス対象である。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び／または２９のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはマイクロジストロフィンである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に開示されているモノクローナル抗体（例えば、１３０Ｄ２－１または１３３Ｄ７－１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示されているポリクローナル抗体、例えば、ｐＡｂ＃７６８４－Ａである。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現を検出または定量するための方法である。ジストロフィンのプロテアーゼ、例えば、トリプシン消化により配列番号３の配列を有するペプチドが放出される。配列番号２７のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンのプロテアーゼ、例えば、トリプシン消化により、配列番号１または３の配列を有するペプチドが放出される。当業者は、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを検出または定量する本明細書に記載されている方法を使用して、試料のプロテアーゼ、例えば、トリプシン消化の後、試料にてジストロフィン及びマイクロジストロフィンのレベルを検出または定量できることを理解する。当業者はさらに、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを検出または定量する本明細書に記載されている方法を使用して、試料のプロテアーゼ、例えば、トリプシン消化の後、試料にてマイクロジストロフィンのレベルを検出または定量できることを理解する。したがって、本明細書に記載されている方法を使用して、当業者は、マイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを送達するための遺伝子治療、例えばＡＡＶが介在する遺伝子治療を施されている対象にてマイクロジストロフィンの発現をモニターすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、試料にてジストロフィン及びマイクロジストロフィンを同時に検出または定量するのに使用される。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；（ｂ）抗体のペプチドへの結合を可能にする条件下で、本明細書に記載されている抗体を含む組成物と試料を接触させることと；（ｃ）抗体に結合したペプチドを回収することと；（ｄ）工程（ｃ）で回収したペプチドの量を決定することとを含む、対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルを定量する方法であり、その際、マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドの量はＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの絶対定量を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの相対定量を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に開示されているモノクローナル抗体（例えば、１３０Ｄ２－１または１３３Ｄ７－１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示されているポリクローナル抗体、例えば、ｐＡｂ＃７６８４－Ａである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、対象にてジストロフィン及びマイクロジストロフィンの発現レベルを同時に定量するのに使用される。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；（ｂ）抗体のそのペプチド標的への結合を可能にする条件下で、ＬＥＭペプチド（配列番号１）に結合することができる、本明細書に記載されている第１の抗体を含む組成物と試料を接触させることと；（ｃ）抗体に結合したペプチドを回収することと；（ｄ）工程（ｃ）で回収したペプチドの量を決定することとを含む、対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルを定量する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）対象から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む試料を用意することであって、前記試料は配列番号１または３のアミノ酸配列を有する１以上のペプチドを含む、前記用意することと；（ｂ）第１と第２の抗体のそのそれぞれのペプチド標的への結合を可能にする条件下で、（ｉ）ＬＥＭペプチド（配列番号１）に結合することができる、本明細書に記載されている第１の抗体を含む組成物、及び（ｉｉ）プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合することができる第２の抗体を含む組成物と、試料を接触させることと；（ｃ）抗体に結合したペプチドを回収することと；（ｄ）工程（ｃ）で回収したそれぞれのペプチドの量を決定することとを含む、対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルを定量する方法である。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、ＬＥＭペプチド（配列番号１）に結合できる抗体は１３０Ｄ２－１を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合できる抗体は、ＬＬＱペプチド（配列番号３）に結合することができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合できる抗体は、ＬＬＱペプチド（配列番号３）に結合することができる、本明細書に開示されている抗体である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合することができる抗体は、１３３Ｄ７－１、１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、もしくは１２１Ｆ１０－１抗体、または、１３３Ｄ７－１、１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１もしくは１２１Ｆ１０－１抗体と同じもしくは重複する、配列番号３の配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合できる抗体は１３３Ｄ７－１を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ消化したジストロフィンペプチドに結合できる抗体は、プロテアーゼ消化したマイクロジストロフィンまたは操作されたジストロフィンペプチドにも結合する。ジストロフィンに結合する他の抗体またはその抗原結合断片は当該技術分野で知られている。例には、ａｂ２７５３９１（Ａｂｃａｍ）、ａｂ２１８１９８（Ａｂｃａｍ）、ａｂ１５２７７（Ａｂｃａｍ）、ＮＣＬ－ＤＹＳＢ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。ジストロフィンに結合する追加の抗体は、ａｂｃａｍ．ｃｏｍ及びｌａｂｏｍｅ．ｃｏｍで開示されている。いくつかの実施形態では、ペプチドの量はＬＣ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの絶対定量を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現レベルの相対定量を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、対象にてジストロフィン及びマイクロジストロフィンの発現レベルを同時に定量するのに使用される。

【0142】

いくつかの実施形態では、試料は、対象の骨格筋組織から得られたプロテアーゼ消化したタンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。

【0143】

いくつかの実施形態では、対象はヒト対象、霊長類対象またはマウス対象である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は霊長類である。いくつかの実施形態では、対象はマウスである。いくつかの実施形態では、対象はデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている。

【0144】

いくつかの実施形態では、対象は、ジストロフィン遺伝子に１以上の変異を含むように遺伝子操作された非ヒト哺乳類である。

【0145】

いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードする組換えポリヌクレオチドを投与されている。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは修飾されたリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡである。

【0146】

いくつかの実施形態では、対象は、配列番号２８及び２９のアミノ酸配列を含むマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを投与されている。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルスである。

【0147】

本明細書に記載されている抗体を使用して、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、またはウェスタンブロッティングのような免疫アッセイを含む当業者に既知の古典的な免疫学的方法を使用して、試料、例えば生体試料にて、配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを検出することができる。一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は検出可能な標識と結合される。好適なアッセイ標識は当該技術分野で知られており、これにはグルコースオキシダーゼのような酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）のような放射性同位体；ルミノールのような発光標識；ならびにフルオレセイン、ローダミン、及びビオチンのような蛍光標識が挙げられる。そのような標識を使用して、本明細書に記載されている抗体を標識することができる。あるいは、本明細書に記載されている抗体を認識する第２の抗体を標識し、本明細書に記載されている抗体と組み合わせて使用して、配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを検出することができる。

【0148】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、試料を本明細書に記載されている抗体と接触させることを含む、前記試料にて配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドを検出するための方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、検出可能な標識または機能的な標識を保有することができる。本明細書に記載されている抗体は蛍光標識を保有することができる。例示的な蛍光標識には、例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ色素、及びＤｙＬｉｇｈｔ色素が挙げられる。本明細書に記載されている抗体は放射性標識を保有することができる。放射性標識が使用される場合、当該技術分野で知られている現在利用可能な計数手順を利用して、本明細書に記載されている抗体の特異的結合を同定及び定量してもよい。標識が酵素である場合、検出は、当該技術分野で知られている現在利用されている比色分析、分光光度分析、蛍光分光光度分析、電流分析またはガス分析技術のいずれかによって達成されてもよい。これは、抗体と配列番号１または３のアミノ酸配列を含むペプチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、試料または対照試料を本明細書に記載されている抗体と接触させることによって達成することができる。抗体とペプチド間で形成される任意の複合体が試料及び対照で検出及び比較される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、試料にて配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを同時に検出する。

【0149】

キット
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、試料にてペプチドを検出、単離または定量するためのキットであり、キットは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合することができる、本明細書に開示されている１以上の抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、配列番号１の配列を有する単離されたペプチド及び／または配列番号３の配列を有する単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された１つまたは複数のペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。

【0150】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、試料にて組換えポリペプチドを検出または定量するためのキットであり、キットは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合することができる本明細書に開示されている１以上の抗体を含み、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、配列番号１の配列を有する単離されたペプチド及び／または配列番号３の配列を有する単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、組換えポリペプチド、任意で、安定同位体標識された組換えポリペプチドを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはマイクロジストロフィンである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された１つまたは複数のペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。

【0151】

特定の態様では、本明細書で提供されるのは、対象にてジストロフィン及び／またはマイクロジストロフィンの発現を検出または定量するためのキットであり、キットは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる、本明細書に開示されている１以上の抗体を含み、マイクロジストロフィンのアミノ酸配列は配列番号２８及び／または２９を含む。いくつかの実施形態では、キットは、対象にてマイクロジストロフィンの発現を検出または定量するためのものである。いくつかの実施形態では、キットはさらに、配列番号１の配列を有する単離されたペプチド及び／または配列番号３の配列を有する単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、対象にてマイクロジストロフィンの発現を検出または定量するためのものである。いくつかの実施形態では、キットはさらに、マイクロジストロフィン、任意で、安定同位体標識されたマイクロジストロフィンを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された１つまたは複数のペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。

【0152】

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる本明細書に開示されている抗体及び配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１の６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８～１２及び１３のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３０Ｄ２－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号４及び５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。

【0153】

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる本明細書に開示されている抗体及び配列番号３のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１の６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は配列番号１８～２２及び２３のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１３３Ｄ７－１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１４及び１５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。

【0154】

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる本明細書に開示されている抗体と、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる本明細書に開示されている抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドと、配列番号３のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３０Ｄ２－１であり、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３３Ｄ７－１である。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３０Ｄ２－１の６つのＣＤＲを含み、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３３Ｄ７－１の６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３０Ｄ２－１のＶＨ及びＶＬを含み、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを結合することができる抗体は１３３Ｄ７－１のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するペプチドは安定同位体標識されたペプチドである。いくつかの実施形態では、キットはさらに、マイクロジストロフィン、任意で、安定同位体標識されたマイクロジストロフィンを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

【実施例】

【0155】

実施例１－マイクロジストロフィンＡの定量のための候補トリプシンペプチド
マイクロジストロフィンＡ（配列番号２７）を含む種々のマイクロジストロフィン構築物は、野生型ジストロフィンタンパク質の減少または喪失をもたらすジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる先天性疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための遺伝子治療に使用するために開発されている。例えば、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる国際出願公開第２０２１１０８７５５号を参照のこと。マイクロジストロフィン発現のモニタリングのために２つのトリプシンペプチドを選択した。図１。ＬＥＭペプチド（配列番号１）は、マイクロジストロフィンＡに特異的な人工接合部を包含するのに対して、ＬＬＱペプチド（配列番号３）は完全長ジストロフィンとマイクロジストロフィンＡの双方に存在する。したがって、ＬＥＭペプチドの検出と定量により、マイクロジストロフィンＡ発現のモニタリングが可能になる。一方、ＬＬＱペプチドの検出と定量により、総ジストロフィン発現、すなわち、完全長ジストロフィンとマイクロジストロフィンＡの発現の合計のモニタリングが可能になる。さらに、ＬＬＱペプチド配列はヒト、霊長類及びマウスのジストロフィンポリペプチドに存在するので、ＬＬＱペプチドの検出及び定量により、これらの生物すべてにおける総ジストロフィン発現のモニタリングが可能になる。

【0156】

当業者はさらに、本明細書に開示されているＬＥＭペプチド及びＬＬＱペプチドを検出及び定量するための試薬及び方法を使用して、トリプシンによるその消化がＬＥＭペプチド及び／またはＬＬＱペプチドを放出する任意のポリペプチドまたはタンパク質の発現をモニターすることができることを理解する。

【0157】

実施例２－ＬＥＭペプチド特異的抗体
標準的な実験室技術を使用して、ＬＥＭペプチドに特異的なウサギのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成した。製造業者のプロトコールに従って実行したＭＳＤ実験を使用して、抗体の結合親和性を評価した。ＭＳＤプレートをＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのペプチドでコーティングし、ＰＢＳ中のカゼインでブロックした。抗ウサギスルホタグ付き抗体を検出剤として使用した。結合を阻害する標的ペプチドを含む対照反応を使用して、抗体結合特異性を評価した。結果を図２に示す。結合の親和性及び特異性を以下の表１に示す。データは、抗体１３０Ｄ２－１、１３３Ｅ１０－１、及び７５Ａ２－１のＬＥＭペプチドに対する良好な親和性及び特異性の結合を示している。調べた抗体はどれも、ＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するＬＥＭペプチドの断片に結合することができない。

【0158】

【表1】

【0159】

実施例３－ＬＬＱペプチド特異的抗体
標準的な実験室技術を使用して、ＬＬＱペプチドに特異的なウサギのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成した。製造業者のプロトコールに従って実行したＭＳＤ実験を使用して、抗体の結合親和性を評価した。ＭＳＤプレートをＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのペプチドでコーティングし、ＰＢＳ中のカゼインでブロックした。抗ウサギスルホタグ付き抗体を検出剤として使用した。結合を阻害する標的ペプチドを含む対照反応を使用して、抗体の結合特異性を評価した。結果を図３に示す。結合の親和性及び特異性を以下の表２に示す。データは、モノクローナル抗体１１２Ｅ４－１、１１５Ｇ６－１、１１９Ｈ２－１、１２１Ｆ１０－１及び１３３Ｄ７－１がポリクローナル抗体（ｐＡｂ）よりもＬＬＱペプチドに対して良好な結合親和性を有することを示している。ほとんどの抗ＬＬＱモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びポリクローナル抗体（ｐＡｂ）はカゼインブロッカーに結合するが、その結合はＬＬＱペプチドによって阻害することができる（データは示さず）。

【0160】

【表2】

【0161】

実施例４－ＬＣＭＳで使用するための抗ＬＥＭ及びＬＬＱペプチド抗体のスクリーニング
ＬＣＭＳで使用するために抗ＬＥＭペプチド抗体及び抗ＬＬＱペプチド抗体をスクリーニングした。手短には、希釈した組織溶解物をトリプシンで一晩消化した。１％プロテアーゼ阻害剤を加えることによって残りのトリプシン活性をクエンチした。希釈した組織溶解物に、合成のＬＥＭペプチドまたはＬＬＱペプチドを低濃度及び高濃度のレベルで添加した。ＬＥＭペプチド添加物を、トリプシンで消化した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）腓腹筋（ＧＡＳ）組織溶解物に直接加えた。ＬＬＱペプチド添加物を、消化したジストロフィン欠損ｍｄｘ ＧＡＳ組織溶解物に加えた；ＮＨＰ ＧＡＳ溶解物をマトリックス対照として使用した。ＰｉｅｒｃｅプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ上に不動化したポリクローナル抗体または抗ペプチドＩｇＧモノクローナル抗体を使用して、各試料を免疫捕捉した。結合したペプチドを酸でビーズから溶離した。定量のために、標準量の安定同位体標識ＬＥＭまたはＬＬＱペプチドを溶出試料に加えた。種々の抗ＬＥＭ抗体及び抗ＬＬＱ抗体を使用して得られたＬＣＭＳの結果をそれぞれ図４及び５に示す。溶出試料にて検出された未標識ペプチドの安定同位体標識ペプチドに対する比率を示す。１３０Ｄ２－１モノクローナル抗ＬＥＭ抗体は、高添加条件と低添加条件の双方で抗ＬＥＭポリクローナル抗体と同等の結果をもたらした。５つの抗ＬＬＱｍＡｂはすべてｐＡｂと同様の性能を有し、１３３Ｄ７－１抗ＬＬＱ抗体はわずかに優れた結果を示した。

【0162】

実施例５－組織試料におけるジストロフィン及びマイクロジストロフィンの定量のためのＬＣＭＳアプローチ
抗ＬＥＭ抗体及び抗ＬＬＱ抗体をＬＣＭＳアッセイで使用して、種々の組織試料にてジストロフィン及びマイクロジストロフィンの発現レベルを定量した。アッセイの一般的な概要とワークフローをそれぞれ図６と図７に示す。このアッセイでは、マイクロジストロフィンＡとジストロフィンの双方の同時定量が可能である。１３０Ｄ２－１抗ＬＥＭモノクローナル抗体及び１３３Ｄ７－１抗ＬＬＱモノクローナル抗体を使用して、アッセイを実行した。組換えマイクロジストロフィン（配列番号２７）を標準として使用して、ＡＡＶ導入遺伝子によってコードされたマイクロジストロフィンの定量法を開発した。ビーグル骨格筋を代替マトリックスとして使用し、マイクロジストロフィン標準を添加した正常なヒト骨格筋をマトリックス対照として使用した。ストレプトアビジン磁気ビーズ上に不動化したビオチン化モノクローナル抗ＬＥＭ及び抗ＬＬＱ抗体を免疫捕捉試薬として使用した。逆相ＵＨＰＬＣクロマトグラフィー分離及びＳｃｉｅｘ ７５００ Ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄ ＭＳまたはＴｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ ＭＳを使用してアッセイを実行した。このアッセイでは、標的の定量を円滑にするために安定同位体標識内部標準（ＳＩＬ－ＩＳ）ペプチドを採用した。ＬＥＭペプチド検出はマイクロジストロフィンの絶対定量に使用された；ＬＥＭペプチドはマイクロジストロフィンに特有のものである。ＬＬＱペプチド検出は、総ジストロフィン（マイクロジストロフィン及びジストロフィン）の定量に使用された。ＬＬＱペプチドは、マイクロジストロフィン及び完全長ジストロフィンに存在する；また、マウス、ヒト、ＮＨＰのジストロフィンでも保存されている。総ジストロフィンの相対定量は、正常な対照対象の骨格筋に存在する完全長ジストロフィンに対して行われた。ＬＥＭペプチドとＬＬＱペプチドの双方の較正範囲は、溶解物タンパク質１ｍｇにつき１２．５～２５００ｆｍｏｌだった。代替マトリックス及び正常ヒトマトリックスにおいて組換えマイクロジストロフィンを添加したＱＣ試料の精度と正確度は、２０％以内だった。双方のペプチドの再現性のある回収がマイクロジストロフィン添加の低レベル及び高レベルで観察されたということは、ペプチドの効率的なトリプシン消化と免疫捕捉を示している。ＬＥＭペプチドの回収率は低添加レベルで２６２％、高添加レベルで１２６％であった（ＣＶ＜９．２％、ｎ＝３；観察された回収率が１００％を超えたのは添加後の溶液中におけるＬＥＭペプチドの非特異的結合損失によるものだった）が、ＬＬＱペプチドの回収率は低添加レベルで９２％、高添加レベルで７５％であった（ＣＶ＜７．６％、ｎ＝３）。図８及び９に示すように、ＬＥＭ及びＬＬＱペプチド検出アッセイは、マイクロジストロフィン及び総ジストロフィンに対して高度に選択性であった。ＬＢＡ／ＬＣ－ＭＳアッセイは、種々の種及びさまざまな筋肉タイプにて導入遺伝子がコードするマイクロジストロフィンタンパク質及び完全長ジストロフィンタンパク質の双方を定量する機能を有する。このアッセイは、筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のための遺伝子治療を支えるのに好適である感度、精度、及び正確度を有する。

【0163】

ＬＢＡ／ＬＣ－ＭＳ ＬＥＭ検出アッセイは、マイクロジストロフィン導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ８粒子を投与された非ヒト霊長類対象の筋肉試料にてマイクロジストロフィンレベルの高精度の絶対定量に使用された（図１０）。ＬＢＡ／ＬＣ－ＭＳ ＬＬＱ検出アッセイは、種々の種の筋肉試料にて総ジストロフィンレベルを高精度に相対定量するのに使用された（図１１）。

【0164】

本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等の調整を網羅するように意図されていることを理解されたい。

【0165】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の双方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれるように指示されたのと同程度に、あらゆる目的にて参照によってこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0166】

配列
配列番号１－ＬＥＭペプチド
ＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＴＬＥＲ
配列番号２
ＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰ
配列番号３－ＬＬＱペプチド
ＬＬＱＶＡＶＥＤＲ
配列番号４－１３０Ｄ２－１ ＶＨ
ＱＳＬＡＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＶＤＬＳＹＹＰＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＩＧＩＩＬＨＮＧＴＳＣＹＡＲＷＡＲＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＥＬＲＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＳＶＡＳＩＶＧＳＳＤＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５－１３０Ｄ２－１ ＶＬ
ＬＶＬＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＹＫＮＳＡＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＮＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＡＤＡＡＴＹＹＣＴＧＡＩＮＤＥＩＨＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＲ
配列番号６－１３０Ｄ２－１ ＶＨ
ＣＡＧＴＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＣＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号７－１３０Ｄ２－１ ＶＬ
ＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＧＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡ
配列番号８－１３０Ｄ２－１ ＶＨのＣＤＲ１
ＹＹＰＭＴ
配列番号９－１３０Ｄ２－１ ＶＨのＣＤＲ２
ＩＩＬＨＮＧＴＳＣＹＡＲＷＡＲＧ
配列番号１０－１３０Ｄ２－１ ＶＨのＣＤＲ３
ＡＳＶＡＳＩＶＧＳＳＤＩ
配列番号１１－１３０Ｄ２－１ ＶＬのＣＤＲ１
ＱＳＳＱＳＶＹＫＮＳＡＬＳ
配列番号１２－１３０Ｄ２－１ ＶＬのＣＤＲ２
ＧＡＳＴＬＡＳ
配列番号１３－１３０Ｄ２－１ ＶＬのＣＤＲ３
ＴＧＡＩＮＤＥＩＨＡ
配列番号１４－１３３Ｄ７－１ ＶＨ
ＱＳＶＫＥＳＥＧＧＬＦＫＰＴＤＴＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＴＩＳＮＮＡＩＤＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＹＩＧＴＩＧＫＳＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳＲＳＴＩＴＲＮＴＮＬＮＴＶＴＬＫＭＴＳＬＴＰＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＬＰＩＳＫＰＤＴＬＮＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１５－１３３Ｄ７－１ ＶＬ
ＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＹＫＮＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＤＴＳＩＤＩＦＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ
配列番号１６－１３３Ｄ７－１ ＶＨ
ＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣ ＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１７－１３３Ｄ７－１ ＶＬ
ＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＡＧＧＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＡＣＴＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＡ
配列番号１８－１３３Ｄ７－１ ＶＨのＣＤＲ１
ＮＮＡＩＤ
配列番号１９－１３３Ｄ７－１ ＶＨのＣＤＲ２
ＴＩＧＫＳＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳ
配列番号２０－１３３Ｄ７－１ ＶＨのＣＤＲ３
ＬＰＩＳＫＰＤＴＬＮＬ
配列番号２１－１３３Ｄ７－１ ＶＬのＣＤＲ１
ＱＳＳＱＳＶＹＫＮＹＬＳ
配列番号２２－１３３Ｄ７－１ ＶＬのＣＤＲ２
ＧＡＳＴＬＡＳ
配列番号２３－１３３Ｄ７－１ ＶＬのＣＤＲ３
ＬＧＧＹＤＴＳＩＤＩＦＴ
配列番号２４
ＰＶＶＴＫＥＴＡＩＳＫＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＡＬＡＤＦＮＲＡＷＴＥＬＴＤＷＬＳＬ
配列番号２５
ＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＡＬＡＤＦＮＲ
配列番号２６
ＰＶＶＴＫＥＴＡＩＳＫＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＴＬＥＲＬＱＥＬＱ
配列番号２７
ＭＬＷＷＥＥＶＥＤＣＹＥＲＥＤＶＱＫＫＴＦＴＫＷＶＮＡＱＦＳＫＦＧＫＱＨＩＥＮＬＦＳＤＬＱＤＧＲＲＬＬＤＬＬＥＧＬＴＧＱＫＬＰＫＥＫＧＳＴＲＶＨＡＬＮＮＶＮＫＡＬＲＶＬＱＮＮＮＶＤＬＶＮＩＧＳＴＤＩＶＤＧＮＨＫＬＴＬＧＬＩＷＮＩＩＬＨＷＱＶＫＮＶＭＫＮＩＭＡＧＬＱＱＴＮＳＥＫＩＬＬＳＷＶＲＱＳＴＲＮＹＰＱＶＮＶＩＮＦＴＴＳＷＳＤＧＬＡＬＮＡＬＩＨＳＨＲＰＤＬＦＤＷＮＳＶＶＣＱＱＳＡＴＱＲＬＥＨＡＦＮＩＡＲＹＱＬＧＩＥＫＬＬＤＰＥＤＶＤＴＴＹＰＤＫＫＳＩＬＭＹＩＴＳＬＦＱＶＬＰＱＱＶＳＩＥＡＩＱＥＶＥＭＬＰＲＰＰＫＶＴＫＥＥＨＦＱＬＨＨＱＭＨＹＳＱＱＩＴＶＳＬＡＱＧＹＥＲＴＳＳＰＫＰＲＦＫＳＹＡＹＴＱＡＡＹＶＴＴＳＤＰＴＲＳＰＦＰＳＱＨＬＥＡＰＥＤＫＳＦＧＳＳＬＭＥＳＥＶＮＬＤＲＹＱＴＡＬＥＥＶＬＳＷＬＬＳＡＥＤＴＬＱＡＱＧＥＩＳＮＤＶＥＶＶＫＤＱＦＨＴＨＥＧＹＭＭＤＬＴＡＨＱＧＲＶＧＮＩＬＱＬＧＳＫＬＩＧＴＧＫＬＳＥＤＥＥＴＥＶＱＥＱＭＮＬＬＮＳＲＷＥＣＬＲＶＡＳＭＥＫＱＳＮＬＨＲＶＬＭＤＬＱＮＱＫＬＫＥＬＮＤＷＬＴＫＴＥＥＲＴＲＫＭＥＥＥＰＬＧＰＤＬＥＤＬＫＲＱＶＱＱＨＫＶＬＱＥＤＬＥＱＥＱＶＲＶＮＳＬＴＨＭＶＶＶＶＤＥＳＳＧＤＨＡＴＡＡＬＥＥＱＬＫＶＬＧＤＲＷＡＮＩＣＲＷＴＥＤＲＷＶＬＬＱＤＩＬＬＫＷＱＲＬＴＥＥＱＣＬＦＳＡＷＬＳＥＫＥＤＡＶＮＫＩＨＴＴＧＦＫＤＱＮＥＭＬＳＳＬＱＫＬＡＶＬＫＡＤＬＥＫＫＫＱＳＭＧＫＬＹＳＬＫＱＤＬＬＳＴＬＫＮＫＳＶＴＱＫＴＥＡＷＬＤＮＦＡＲＣＷＤＮＬＶＱＫＬＥＫＳＴＡＱＩＳＱＱＰＤＬＡＰＧＬＴＴＩＧＡＳＰＴＱＴＶＴＬＶＴＱＰＶＶＴＫＥＴＡＩＳＫＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＴＬＥＲＬＱＥＬＱＥＡＴＤＥＬＤＬＫＬＲＱＡＥＶＩＫＧＳＷＱＰＶＧＤＬＬＩＤＳＬＱＤＨＬＥＫＶＫＡＬＲＧＥＩＡＰＬＫＥＮＶＳＨＶＮＤＬＡＲＱＬＴＴＬＧＩＱＬＳＰＹＮＬＳＴＬＥＤＬＮＴＲＷＫＬＬＱＶＡＶＥＤＲＶＲＱＬＨＥＡＨＲＤＦＧＰＡＳＱＨＦＬＳＴＳＶＱＧＰＷＥＲＡＩＳＰＮＫＶＰＹＹＩＮＨＥＴＱＴＴＣＷＤＨＰＫＭＴＥＬＹＱＳＬＡＤＬＮＮＶＲＦＳＡＹＲＴＡＭＫＬＲＲＬＱＫＡＬＣＬＤＬＬＳＬＳＡＡＣＤＡＬＤＱＨＮＬＫＱＮＤＱＰＭＤＩＬＱＩＩＮＣＬＴＴＩＹＤＲＬＥＱＥＨＮＮＬＶＮＶＰＬＣＶＤＭＣＬＮＷＬＬＮＶＹＤＴＧＲＴＧＲＩＲＶＬＳＦＫＴＧＩＩＳＬＣＫＡＨＬＥＤＫＹＲＹＬＦＫＱＶＡＳＳＴＧＦＣＤＱＲＲＬＧＬＬＬＨＤＳＩＱＩＰＲＱＬＧＥＶＡＳＦＧＧＳＮＩＥＰＳＶＲＳＣＦＱＦＡＮＮＫＰＥＩＥＡＡＬＦＬＤＷＭＲＬＥＰＱＳＭＶＷＬＰＶＬＨＲＶＡＡＡＥＴＡＫＨＱＡＫＣＮＩＣＫＥＣＰＩＩＧＦＲＹＲＳＬＫＨＦＮＹＤＩＣＱＳＣＦＦＳＧＲＶＡＫＧＨＫＭＨＹＰＭＶＥＹＣＴＰＴＴＳＧＥＤＶＲＤＦＡＫＶＬＫＮＫＦＲＴＫＲＹＦＡＫＨＰＲＭＧＹＬＰＶＱＴＶＬＥＧＤＮＭＥＴＰＶＴＬＩＮＦＷＰＶＤＳＡＰＡＳＳＰＱＬＳＨＤＤＴＨＳＲＩＥＨＹＡＳＲＬＡＥＭＥＮＳＮＧＳＹＬＮＤＳＩＳＰＮＥＳＩＤＤＥＨＬＬＩＱＨＹＣＱＳＬＮＱＤＳＰＬＳＱＰＲＳＰＡＱＩＬＩＳＬＥＳＥＥＲＧＥＬＥＲＩＬＡＤＬＥＥＥＮＲＮＬＱＡＥＹＤＲＬＫＱＱＨＥＨＫＧＬＳＰＬＰＳＰＰＥＭＭＰＴＳＰＱＳＰＲ
配列番号２８
ＸＬＥＭＰＳＳＬＭＬＥＶＰＴＬＥＲ、ここで、ＸはＲまたはＬである
配列番号２９
ＸＬＬＱＶＡＶＥＤＲ、ここで、ＸはＲまたはＬである

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-18

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2024542939000001.xml

【国際調査報告】