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特表2024-542948プロゲステロン代謝産物を測定するための方法およびシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】プロゲステロン代謝産物を測定するための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20241112BHJP
G01N 33/74 20060101ALI20241112BHJP
H01J 49/00 20060101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N33/74
H01J49/00 310
H01J49/00 360
H01J49/00 400
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523428
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-04-18
(86)【国際出願番号】 US2022048078
(87)【国際公開番号】W WO2023076509
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,517
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511172461
【氏名又は名称】ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ホルムキスト， ブレット
(72)【発明者】
【氏名】モア ケレメン， メアリー キャサリン
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA12
2G041GA03
2G041GA09
2G041HA01
2G045AA25
2G045AA26
2G045AA27
2G045CA26
2G045DA54
2G045FA36
2G045FB06
(57)【要約】
生物試料中のプロゲステロンスルファートなどのプロゲステロン代謝産物の検出および／または分析のために液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用する方法およびシステムを開示する。場合によっては、プロゲステロンスルファート量を使用して、皮膚の妊娠性掻痒症が（ＩＣＰ）の初期徴候であるのか、あるいは良性妊娠性掻痒症に起因するのかを区別し得る。上記システムは、必要に応じて、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションを含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
質量分析によって被験体由来の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する方法であって、（ａ）前記プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前記１またはそれを超えるプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成された１またはそれを超えるプリカーサーイオンまたは工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前記検出されたイオンを、前記試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量と関連付ける工程を含む、方法。
【請求項2】
前記プロゲステロン代謝産物がプロゲステロンスルファートである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記プロゲステロンスルファートが、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールスルファート（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）；５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）；または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項4】
前記質量分析が多重反応モニタリングタンデム質量分析である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ＰＭ３Ｓを、３９９．４００→９７．１００のトランジションを使用して測定する；ＰＭ５Ｓを、３９７．３→９７．０のトランジションを使用して測定する；ＰＭ４Ｓを、３９７．２→９７．０のトランジションを使用して測定する；ＰＭ２ＤｉＳを、４７９．０９８→３８１．２＋４７９．０９９→３８１．２＋４７９．１００→３８１．２＋４７９．１０１→３８１．２＋４７９．１０２→３８１．２のトランジションの合計を使用して測定する；ＰＭ３ＤｉＳを、４７９．０９８→３９９．１＋４７９．０９９→３９９．１＋４７９．１００→３９９．１＋４７９．１０１→３９９．１＋４７９．１０２→３９９．１のトランジションのトランジションの合計を使用して測定する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記試料を、質量分析前に精製工程に供する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記精製工程が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記精製工程が、前記試料の希釈および／またはタンパク質沈殿のうちの少なくとも１つを含む、請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
ＰＭ３Ｓを個別に測定し、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを同時に測定し、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを同時に測定する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
安定同位体で標識された内部標準の添加をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記安定同位体で標識された内部標準が、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート（ＰＭ３Ｓ－ｄ４）、５α－プレグナン－３β－オール－２０－オン－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート（ＰＭ５Ｓ－ｄ４）、５α－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４）、または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４）のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記試料がヒトの血清または血漿である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記プロゲステロンスルファートの定量下限（ＬＬＯＱ）が、１００μＬの試料あたり１ｎｇである、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記プロゲステロンスルファートの定量上限（ＵＬＯＱ）が、１００μＬの試料あたり５００ｎｇである、請求項２～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
プロゲステロンスルファート量を使用して、皮膚の妊娠性掻痒症が（ＩＣＰ）の初期徴候であるのか、あるいは被験体における良性妊娠性掻痒症に起因するのかを区別する、請求項２～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
被験体由来の試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのシステムであって、前記システムは、目的のプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試験試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；
１またはそれを超えるプリカーサーイオンおよび１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成するために目的のプロゲステロン代謝産物を断片化するための質量分析用のステーションおよび／または構成要素；ならびに前記試料中の目的のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのステーションおよび／または構成要素
を含む、システム。
【請求項17】
前記目的のプロゲステロン代謝産物がプロゲステロンスルファートである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記試料中の前記目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素をさらに含む、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項19】
前記試料中の前記目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項20】
コンピュータプログラム製品であって、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前記１またはそれを超えるデータプロセッサに、（ａ）プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前記１またはそれを超えるプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前記検出されたイオンを、前記試料中のプロゲステロンの代謝産物の存在または量と関連付ける工程のうちの少なくとも１つの工程を指示する操作を実施させる、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本明細書中に開示の発明の主題は、プロゲステロン代謝産物バイオマーカーを分析するための方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、臨床診断のためにバイオマーカーの測定を使用し得る。
本明細書中に開示の発明の主題は、プロゲステロン代謝産物バイオマーカーを分析するための方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、臨床診断のためにバイオマーカーの測定を使用し得る。
【背景技術】
【0002】
背景
ホルモン、ビタミン、および代謝産物などのバイオマーカーを、ある特定の障害のスクリーニングまたは診断のために使用することができる。例えば、プロゲステロンの種々の代謝産物は、閉経および乳癌などの種々の生理学的状態の重要な指標であり得る。さらに、プロゲステロン代謝産物は、排卵および健康な妊娠の維持能力で役割を果たし得る。したがって、産科における課題は、病的徴候を認識の正常の変化に関連する徴候と区別することである。プロゲステロン代謝産物（ある特定のプロゲステロンスルファートが挙げられる）は、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）などの妊娠合併症および前述の合併症から生じ得る合併症（胎児死亡、早期産、および／または医原性早期産など）を軽減するための種々の治療化合物の有効性の良好な指標であり得る。例えば、場合によっては、皮膚の妊娠性掻痒症がＩＣＰの初期徴候であるのか、あるいは良性妊娠性掻痒症に起因するのかを識別することは重要である（Ｈａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６３：１２８７－１２９８（２０１６））。ＩＣＰは、血清胆汁酸の上昇を特徴とし、自発性の早期分娩および死産を合併する。ＩＣＰのバイオマーカーは、早期診断および処置に非常に重要であり、他の母体の疾患と識別することが可能であろう。プロゲステロンスルファートの測定により、産科ケアを高リスク集団に標的集中することができる。
したがって、プロゲステロン代謝産物の測定のために使用することができる分析技術を開発することが必要である。
ホルモン、ビタミン、および代謝産物などのバイオマーカーを、ある特定の障害のスクリーニングまたは診断のために使用することができる。例えば、プロゲステロンの種々の代謝産物は、閉経および乳癌などの種々の生理学的状態の重要な指標であり得る。さらに、プロゲステロン代謝産物は、排卵および健康な妊娠の維持能力で役割を果たし得る。したがって、産科における課題は、病的徴候を認識の正常の変化に関連する徴候と区別することである。プロゲステロン代謝産物（ある特定のプロゲステロンスルファートが挙げられる）は、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）などの妊娠合併症および前述の合併症から生じ得る合併症（胎児死亡、早期産、および／または医原性早期産など）を軽減するための種々の治療化合物の有効性の良好な指標であり得る。例えば、場合によっては、皮膚の妊娠性掻痒症がＩＣＰの初期徴候であるのか、あるいは良性妊娠性掻痒症に起因するのかを識別することは重要である（Ｈａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６３：１２８７－１２９８（２０１６））。ＩＣＰは、血清胆汁酸の上昇を特徴とし、自発性の早期分娩および死産を合併する。ＩＣＰのバイオマーカーは、早期診断および処置に非常に重要であり、他の母体の疾患と識別することが可能であろう。プロゲステロンスルファートの測定により、産科ケアを高リスク集団に標的集中することができる。
したがって、プロゲステロン代謝産物の測定のために使用することができる分析技術を開発することが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｈａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６３：１２８７－１２９８（２０１６）
【発明の概要】
【0004】
要旨
いくつかの実施形態では、質量分析によって試料中のプロゲステロンの代謝産物の存在または量を決定する方法を開示する。１つの実施形態では、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用する。この方法は、（ａ）プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；および（ｃ）工程（ａ）で生成された１またはそれを超えるプリカーサーイオンまたは工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程を含み得る。１つの実施形態では、検出されたイオンを使用して、試料中のプロゲステロン代謝産物の量を決定する。ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。ある特定の実施形態では、質量分析はタンデム質量分析である。
いくつかの実施形態では、質量分析によって試料中のプロゲステロンの代謝産物の存在または量を決定する方法を開示する。１つの実施形態では、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用する。この方法は、（ａ）プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；および（ｃ）工程（ａ）で生成された１またはそれを超えるプリカーサーイオンまたは工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程を含み得る。１つの実施形態では、検出されたイオンを使用して、試料中のプロゲステロン代謝産物の量を決定する。ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。ある特定の実施形態では、質量分析はタンデム質量分析である。
【0005】
本明細書中に開示の方法または方法の工程のうちのいずれかを実施するためのシステムも開示する。ある特定の実施形態では、システムは、試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；必要に応じて、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素；必要に応じて、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素；プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンおよび１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成するための質量分析用のステーションおよび／または構成要素；ならびに試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するために質量スペクトルを分析するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ある特定のステーションまたは構成要素は、単一のステーションおよび／または構成要素として組み合わせられている。ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。ある特定の実施形態では、ステーションのうちの少なくとも１つは、コンピュータによって制御され得る。
【0006】
開示のシステムまたは開示のシステムの任意の部分（例えば、構成要素）が動作し、そして／または開示の方法のうちのいずれかの１つの工程または複数の工程を実施するように構成された命令を含む、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品も開示する。
【0007】
図面の簡単な説明
本開示は、以下の制限されない図面を参照してより理解され得る。
本開示は、以下の制限されない図面を参照してより理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
詳細な説明
開示の発明の主題は、開示の発明の主題の全てではないがいつかを示す以下の添付の説明および図面を参照した後に直ちにより完全に記載されるであろう。開示の発明の主題は、多数の異なる形態で具体化することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈されないものとする。全体を通して、同一の数字は同一の要素を指す。
開示の発明の主題は、開示の発明の主題の全てではないがいつかを示す以下の添付の説明および図面を参照した後に直ちにより完全に記載されるであろう。開示の発明の主題は、多数の異なる形態で具体化することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈されないものとする。全体を通して、同一の数字は同一の要素を指す。
【0015】
開示の発明の主題が属する分野の当業者は、説明および関連する図面に存在する技術の利点を有する本明細書中に記載の開示の発明の主題の多数の修正形態および他の実施形態を編み出すであろう。したがって、本開示の発明の主題が本明細書中に開示の特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態が添付のクレームの範囲内に含まれることが意図されると理解すべきである。具体的な用語を本明細書中で使用しているが、これらの用語は一般的および説明的な意味でのみ使用され、本発明の制限を目的としない。さらに、「本明細書中で援用される」と言及された任意の参考文献は、その全体が援用されると理解すべきである。
定義および説明
定義および説明
【0016】
以下の用語は当業者に十分に理解されていると考えられるが、ここに開示した主題の説明を容易にするために、以下に定義を記載する。他の定義は、本明細書を通して見出される。別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、ここに記載の主題が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
【0017】
本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載された数値は、可能である程度の正確さで報告されている。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定値で見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含む。さらに、本明細書中に開示の全ての範囲は、その範囲に包括されるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解されるものとする。例えば、１から１０までの範囲の記載は、最小値１と最大値１０の間（およびその両端を含む）のありとあらゆる部分範囲；すなわち、１またはそれを超える最小値（例えば、１～６．１）で始まり１０またはそれ未満の最大値（例えば、５．５～１０）で終わるすべての部分範囲を含むと見なされるべきである。
【0018】
用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、クレームを含む本出願で使用される場合、「１またはそれを超える」を指す。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」との言及には、例えば、文脈上逆の意味を明確に示さない限り（例えば、複数の細胞）、複数のかかる細胞が含まれる。
【0019】
本明細書中で使用される場合、「ＡＭＲ」または「分析測定範囲」は、いかなる希釈、濃縮、または有用なアッセイプロセスの一部ではない他の前処理を行うことなく、方法によって標本を直接測定することができる分析物の値の範囲である。
【0020】
本明細書中で使用される場合、用語「分析カラム」は、試験試料マトリックスの構成要素を分離するのに十分なクロマトグラフィー用プレートを有するクロマトグラフィーカラムを指す。好ましくは、分析カラムから溶離された構成要素を、目的の分析物（複数可）の存在または量を決定可能な様式で分離する。いくつかの実施形態では、分析カラムは、平均粒径が約５μｍまたはそれ未満の粒子を含む。いくつかの実施形態では、分析カラムは、官能化シリカもしくはポリマー－シリカハイブリッド、またはポリマー粒子もしくはモノリス型シリカ固定相（フェニル－ヘキシル官能化分析カラムなど）である。分析カラムを、さらなる精製または分析のために保持材料を非保持材料から分離または抽出して「精製された」試料を得るために典型的に使用される「抽出カラム」と区別することができる。
【0021】
本明細書中で使用される場合、「分析物」は、測定可能な量という名目で示される構成要素である。
【0022】
本明細書中で使用される場合、「分析妨害」は、検出試薬またはシグナル自体のいずれかと特異的または非特異的に反応する物質の存在に起因した分析物の見かけ上の濃度、活性、または強度の人為的な増加または減少を指す。
【0023】
本明細書中で使用される場合、用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、大気圧下でプラズマ内に生じるイオン－分子反応によってイオンを生成する質量分析法を指す。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の放電によって維持される。次いで、イオンを、典型的には、一連の差動的にポンピングされたスキマーステージを使用することによって質量分析器に引き出す。加熱および事前加熱されたＮ２ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善し得る。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性の低い種の分析にはＥＳＩよりも有効であり得る。
【0024】
本明細書中で使用される用語「大気圧光イオン化」または「ＡＰＰＩ」は、分子Ｍの光イオン化機構が分子Ｍ＋を形成するための光子吸収および電子放出である質量分析形態を指す。光子エネルギーが典型的にはイオン化電位のすぐ上にあるので、分子イオンは解離の影響を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせずに試料を分析することが可能である場合があり、したがって、時間と費用が大幅に節約される。水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを引き出してＭＨ＋を形成することができる。Ｍのプロトン親和性が高い場合にこの形成が起こる傾向がある。この形成は、Ｍ＋とＭＨ＋の合計が一定であるので、定量正確度に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の化合物は、通常はＭＨ＋として観察されるのに対して、非極性化合物は通常はＭ＋を形成する（例えば、Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１５）：３６５３－３６５９（２０００）を参照のこと）。
【0025】
本明細書中で使用される場合、用語「生物試料」は、生物学的供給源（動物、細胞培養物、および臓器培養物などが挙げられるが、これらに限定されない）から得た試料を指す。好適な試料としては、無細胞ＤＮＡ、血液、血漿、血清、尿、唾液、涙、鼻咽頭スワブ、脳脊髄液、臓器、毛髪、筋肉、または他の組織試料が挙げられる。
【0026】
本明細書中で使用される用語「化学的イオン化」は、試薬ガス（例えば、アンモニア）を電子衝撃に供し、分析物のイオンが試薬ガスイオンと分析物分子の相互作用によって形成される方法を指す。
【0027】
本明細書中で使用される場合、「クロマトグラフィー」は、液体または気体によって運搬される化学物質の混合物が、化学物質が液体または固体の固定相の周囲または上部を流れた場合の化学物質の分布の相違の結果として構成要素に分離されるプロセスを指す。
【0028】
本明細書中で使用される用語「電子イオン化」は、気相または蒸気相中の目的の分析物が電子流と相互作用する方法を指す。分析物との電子の衝撃により分析物イオンが生成され、次いで、質量分析技術に供され得る。
【0029】
本明細書中で使用される用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、溶液が短尺の細管に沿って通過し、細管の端部に正または負の高電位が印加される方法を指す。細管の末端に到達した際に、溶液は気化（噴霧化）されて、溶媒蒸気中で非常に小さな液滴のジェットまたはスプレーとなり得る。この液滴のミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発室を流れることができる。液滴が小さくなるに従って表面電荷密度が増加し、やがて同一電荷間で自然反発して、イオンおよび中性分子が放出される。
【0030】
本明細書中で使用される用語「電界脱離」は、不揮発性の試験試料をイオン化表面に配置し、強電界を使用して分析物イオンを生成する方法を指す。
【0031】
本明細書中で使用される場合、用語「ＨＰＬＣ」または「高速液体クロマトグラフィー」は、移動相を加圧下で強制的に固定相（典型的には高密度に充填されたカラム）に通過させることによって分離度を増大させる液体クロマトグラフィーを指す。クロマトグラフィー用カラムは、典型的には、化学的部分の分離（すなわち、分画）を容易にするための担体（すなわち、充填剤）を含む。担体は、微粒子を含み得る。粒子は、本明細書中に記載の実験で定量されるバイオマーカー分析物などの化学的部分の分離を容易にするために種々の化学的部分と相互作用する結合表面を含む。１つの好適な結合表面は、アルキル結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ－４、Ｃ－８、またはＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－１８結合基を含み得る。クロマトグラフィー用カラムは、試料を受け入れるための入口および分画した試料を含む流出物を排出するための出口を含む。この方法では、試料（または予め精製された試料）を、カラムの入口にアプライし、溶媒および溶媒混合物を用いて溶離し、出口から排出し得る。異なる溶媒モードを、異なる目的の分析物を溶離するために選択し得る。例えば、液体クロマトグラフィーを、勾配モード、定組成モード、または多型（すなわち、混合）モードを使用して行い得る。
【0032】
本明細書中で使用される用語「イオン化」および「イオン化すること」は、１またはそれを超える電子数と等価な正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを指す。陰イオンは、１またはそれを超える電子数の正味の電荷が負のイオンであり、一方で、陽イオンは１またはそれを超える電子数の正味の電荷が正のイオンである。
【0033】
本明細書中で使用される場合、用語「イオン合計」または「シグナル合計」は、信号対雑音比を増加させる様式での本質的に同一のトランジションの個別のクロマトグラム（例えば、タンデム質量分析）を合計する手法を指す。同一サイクル時間における複数のトランジションをプログラミングすることにより、個々のトランジションについての滞在時間が減少し、各々のトランジションについてのシグナルの強度がほぼ同一であるにもかかわらず、シグナルを合計することが可能である。ノイズが無作為であるので、シグナルの反復物を合計するとシグナルはおよそ線形に増加する一方で、ランダムノイズは減少するであろう（例えば、Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４０７：６１９１－６１９９（２０１５）を参照のこと）。
【0034】
本明細書中で使用される場合、「妨害」は、分析物を正確に測定することができるようにするための、例えば、溶血、脂肪血症、および／または黄疸に起因する試料中の非分析物の存在による負の影響を指す。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」は、流体が微粉化物質のカラムまたは細管通路を通じて均一に浸透する際に、流動物の１またはそれを超える構成要素が選択的に遅延するプロセスを意味する。バルク流体は固定相（複数可）と相対的に移動するので、遅延は、１またはそれを超える固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物の構成要素の分配に起因する。液体クロマトグラフィーとしては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
【0036】
本明細書中で使用される場合、「ＬＯＤ」または「検出限界」は、記載の確率で検出することができる試料中の分析物の最少量である。典型的には、ＬＯＤを、試料の低測定値のブランク上限（ＬＯＢ）＋１．６４５×ＳＤ（または２×ＳＤ）として表す。また、本明細書中で使用される場合、「ＬＬＯＱ」または「定量下限」は、記載の許容され得る精度および正確度を用いて定量することができる試料中の分析物の最少量である。
【0037】
本明細書中で使用される用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」または「ＭＡＬＤＩ」は、不揮発性試料をレーザー照射に供し、それにより種々のイオン化経路（光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊が挙げられる）によって試料中の分析物を脱離およびイオン化する方法を指す。ＭＡＬＤＩの場合、試料をエネルギー吸収マトリックスと混合し、分析物分子の脱離を容易にする。
【0038】
本明細書中で使用される用語「質量分析」または「ＭＳ」は、一般に、イオンの質量電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタリング、検出、および測定する方法を指す。ＭＳ技術では、１またはそれを超える目的の分子をイオン化し、その後にイオンを質量分析計に導入し、ここで、電界の組み合わせに起因して、イオンが質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存した経路の空間を進む。用語「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」は、第一段階で分子がイオン化されて親（またはプリカーサー）イオンを形成し、これらのイオンがその質量電荷（ｍ／ｚ）比によって分離される質量分析型を指す。次いで、特定のｍ／ｚの親イオンを選択および断片化して、娘（またはプロダクトまたは断片）イオンを形成し、次いで、娘イオンをそのｍ／ｚ比によって分離する。トリプル四重極質量分析計は、第１および第３の四重極をマスフィルタとして使用し、第２の四重極を、例えば、衝突誘起脱離、イオン化、または本明細書中で考察した他の技術による断片化のために使用する。
【0039】
本明細書中で使用される場合、用語「オンライン」は、システム内の種々の構成要素が動作的に連結されており、いくつかの実施形態では、流体が相互に連通している、システム中に試験試料を配置する（例えば、注入する）ような方法で実施される精製または分離工程を指す。オンラインという用語と対照的に、用語「オフライン」は、事前および／またはその後の精製もしくは分離工程および／または分析工程と分離して行われる精製、分離、または抽出を指す。
【0040】
本明細書中で使用される場合、「精度」を、標準偏差（ＳＤ）および／またはパーセント変動係数（％ＣＶ）として表す。「ラン内精度」は、同一の測定の連続的な測定結果の間の一致の近さであり、同一の測定条件（同一の分析ラン）下で行われる。「ラン間精度」は、規定された条件下（異なる分析の実施および／またはオペレータ、研究所、施設、試薬のロット、構成装置など）で得た独立した試験結果の間の一致の近さである。
【0041】
本明細書中で使用される場合、プロゲステロン代謝産物は、生化学的機序によるプロゲステロン由来の化合物である。プロゲステロンスルファートは、少なくとも１つの硫酸基を有するプロゲステロン代謝産物である。
【0042】
本明細書中で使用される場合、用語「精製する」または「分離する」またはこれらの派生語は、試料マトリックスからの目的の分析物（複数可）以外の材料の全ての除去を必ずしも指さない。その代わりに、いくつかの実施形態では、精製するまたは分離するという用語は、試料マトリックス中に存在する１またはそれを超える他の構成要素と比較して１またはそれを超える目的の分析物の量を富化させる手順を指す。いくつかの実施形態では、「精製」または「分離」手順を使用して、分析物の検出を妨害し得る試料の１またはそれを超える構成要素、例えば、質量分析による分析物の検出を妨害し得る１またはそれを超える構成要素を除去することができる。
【0043】
本明細書中で使用される場合、用語「選択性」は、試料内に見出される可能性がある他の物質が寄与することなく目的の分析物を正確に測定する測定手順の能力を指す。選択性を、目的の分析物の存在下での目的の分析物以外の物質に対する交差反応性および／または応答と表し得る。
【0044】
本明細書中で使用される場合、「選択反応モニタリング」または「ＳＲＭ」は、特定の質量のイオンをタンデム質量分析計の第１段階で選択し、プリカーサーイオンの断片化反応のイオン生成物を質量分析計の第２段階で選択する質量分析における技術である。対照的に、「多重反応モニタリング」または「ＭＲＭ」は、１またはそれを超えるプリカーサーイオン由来の複数のプロダクトイオンへのＳＲＭの適用である。例えば、１またはそれを超える異なるプリカーサーイオンが第１段階で形成されるＭＲＭでは、前述のイオンが連続的に選択され、複数のプロダクトイオンが検出され得る。ＳＲＭは、単一の固定された質量枠のみをモニタリングする一方で、ＭＲＭは、複数の断片イオン質量の軌跡を並行して取得するために複数の狭い質量枠を迅速にスキャンする。
【0045】
本明細書中で使用される場合、用語「特異性」は、目的の分析物が試料内に見出される可能性がある物質と共に存在する場合に、測定手順が目的の分析物を判別する能力を指す。特異性を、目的の分析物の非存在下での目的の分析物以外の物質に対する交差反応性および／または応答率として表し得る。
【0046】
本明細書中で使用される用語「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露し、それにより種々のイオン化経路（光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊が挙げられる）によって試料中の分析物を脱離およびイオン化する方法を指す。ＳＥＬＤＩの場合、試料を、典型的には、１またはそれを超える目的の分析物を優先的に保持する表面に結合させる。ＭＡＬＤＩと同様に、このプロセスもイオン化を容易にするためにエネルギー吸収材料を使用し得る。
【0047】
本明細書中で使用される用語、「被験体」は動物を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、試料を、哺乳動物（イヌ、ネコ、ウマ、ラット、およびサルなどが挙げられるが、これらに限定されない）から得る。いくつかの実施形態では、試料を、ヒト被験体から得る。場合によっては、ヒト被験体は、妊婦である。いくつかの実施形態では、被験体は、患者、すなわち、自ら臨床の場で疾患または症状の診断、予後、または処置を訴えている生きているヒトである。いくつかの実施形態では、試料は、生物試料ではなく、例えば、ビタミンの製造または実験室での分析中に得られ、製造および／または分析プロセスの組成および／または収量を決定するために分析することができる非生物試料を含む。
【0048】
本明細書中で使用される場合、用語「ＵＬＯＱ」または「定量上限」は、希釈することなく定量することができる試料中の分析物の最大量である。
プロゲステロンスルファートを検出する方法
プロゲステロンスルファートを検出する方法
【0049】
本開示の実施形態は、プロゲステロン代謝産物バイオマーカーの定量分析のための方法およびシステムに関する。本開示は、種々の方法で具体化され得る。
【0050】
１つの実施形態では、質量分析によって被験体由来の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する方法であって、（ａ）前述のプロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンから１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前述の検出されたイオンを、前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量と関連付ける工程を含む、方法を開示する。ある特定の実施形態では、方法は、以下を含み得る：少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試料を準備する工程；必要に応じて、前述の試料中の前述の少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離する工程；質量分析を使用して、前述のプロゲステロン代謝産物に特異的な１またはそれを超えるプリカーサーイオンおよび前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンに由来するもう１つのプロダクトイオンを生成する工程；および前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する工程。
【0051】
ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。種々の実施形態では、プロゲステロン代謝産物としては、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールスルファート（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）および／または５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；および／またはジプロゲステロンスルファート（５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）および／または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）など）のうちの少なくとも１つが挙げられ得る。プロゲステロン代謝産物について本明細書中で互換可能に使用されるさらなる名称としては、以下が挙げられ得る：ＰＭ２ＤｉＳ（アロプレグナンジオールジスルファート）：５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート；ＰＭ３Ｓ（プレグナンジオールスルファート）：５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールスルファート；ＰＭ３ＤｉＳ（プレグナンジオールジスルファート）：５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート；ＰＭ４Ｓ（アロプレグナノロンスルファート）：５α－プレグナン－３α－オール，２０－オンスルファート；またはＰＭ５Ｓ（エピアロプレグナノロンスルファート）：５α－プレグナン－３β－オール，２０－オンスルファート。
【0052】
１つの実施形態では、試料を、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって測定し得る。ある特定の実施形態では、トリプル四重極タンデム質量分析を使用し得る。ある特定の実施形態では、必要に応じてトランジションイオン合計を使用した多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用し得る。
【0053】
分析物（すなわち、目的のプロゲステロン代謝産物）を、質量分析前に部分精製し得る。したがって、１つの実施形態では、プリカーサーイオンを生成する工程（ａ）の前に試料を精製工程に供する。例えば、ある特定の実施形態では、試料をタンパク質の希釈および／または沈殿に供する。あるいは、液液抽出（ＬＬＥ）を使用し得る。あるいは、固相抽出（ＳＰＥ）を使用し得る。
【0054】
ある特定の実施形態では、試料を、精製のためのクロマトグラフィーに供し得る。１つの実施形態では、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはハイスループットクロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）である。したがって、種々の液体クロマトグラフィー分離技術を使用し得る。例えば、ＬＣ工程は、１回のＬＣ分離、または複数回のＬＣ分離を含み得る。１つの実施形態では、クロマトグラフ分離は、抽出および分析液体クロマトグラフィーを含む。本明細書中で考察されるように、ある特定の実施形態では、分析クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含み得る。ある特定の実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）（ハイスループット液体クロマトグラフィーとしても公知）を使用し得る。さらに、および／またはあるいは、他のクロマトグラフ精製タイプを使用し得る。
【0055】
また、ある特定の実施形態では、本開示の方法は、複数の液体クロマトグラフィー工程を含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、二次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）手順を使用する。例えば、１つの実施形態では、この方法は、目的のバイオマーカーをＬＣ抽出カラムから分析カラムに移動させることを含み得る。１つの実施形態では、少なくとも１つの目的のバイオマーカーの抽出カラムから分析カラムへの移動を、ハートカッティング技術によって行う。別の実施形態では、目的のバイオマーカーを、クロマトフォーカシング技術によって抽出カラムから分析カラムへ移動させる。あるいは、目的のバイオマーカーを、カラム切り替え技術によって抽出カラムから分析カラムへ移動させる。これらの移動工程は、手作業で行い得るか、オンラインシステムの一部であり得る。必要に応じて、抽出カラムを、本明細書中に記載の方法およびシステムで使用しなくてよい。
【0056】
したがって、ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）プロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試料を提供する工程；（ｂ）試料の希釈および／またはタンパク質沈殿によって試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製する工程；（ｃ）プロゲステロン代謝産物を分析カラムに移動させ、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離する工程；および（ｄ）前述のクロマトグラフィーで分離したプロゲステロン代謝産物を質量分析によって分析して、試験試料中の１またはそれを超えるバイオマーカーの存在または量を決定する、分析する工程を含み得る。１つの実施形態では、質量分析はタンデム質量分析である。
【0057】
ある特定の実施形態では、５つの別個のプロゲステロン代謝産物（例えば、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳ）を、希釈およびタンパク質沈殿後にタンデム質量分析検出（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
【0058】
ある特定の実施形態では、ある特定のプロゲステロン代謝産物を、共に（すなわち、同一のアッセイで同時に）または個別に（すなわち、異なるアッセイで）測定し得る。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＭ３Ｓを、あるアッセイ（「ＰＭ３Ｓ」アッセイ）において個別に測定する。また、ある特定の実施形態では、一流酸塩ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、あるアッセイ（「ＭＰＭＳ」アッセイ）において共に測定する。また、ある特定の実施形態では、二硫酸塩ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを、あるアッセイ（「ＰＭＤｉＳ」アッセイ）において共に測定する。かかる実施形態では、３つのアッセイは、別々の標準、品質コントロール（ＱＣ）材料、内部標準、および液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法を使用し得る。しかしながら、試料処理における工程は、３つ全てのアッセイについて同一であり得る。
【0059】
方法は、内部標準の使用を含み得る。内部標準は、安定同位体で標識した目的のプロゲステロン代謝産物の分析物を含み得る。ある特定の実施形態では、安定同位体は、重水素（ｄ）であり得る。あるいは、他の同位体を使用し得る。例えば、ある特定の実施形態では、内部標準（複数可）は、以下のうちの少なくとも１つを含み得る：ＰＭ３Ｓ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ５Ｓ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３β－オール－２０－オン－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）；および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）。かかる標準を、合成および／または購入し得る。
【0060】
したがって、ある特定の実施形態では、プロゲステロンスルファートの安定同位体で標識された内部標準（ＰＭ３Ｓ－ｄ４、ＰＭ５Ｓ－ｄ４、ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４、および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４）を標準、品質コントロール、および患者試料（例えば、血清アリコート）に添加して、各々の試料からの別個のプロゲステロンスルファートの回収率を評価および補正し得る。標準、対照試料、および患者試料を希釈し、次いで、タンパク質沈殿および／または他の精製工程に供する。次いで、試料（すなわち、試料、対照、および／または標準）の一部を、再構成前の乾燥によって濃縮し得る。
【0061】
次いで、各々の患者および検定物質由来の最終生成物を、タンデム質量分析を用いたＨＰＬＣによって分析し得る。ある特定の実施形態では、試料をＡＲＩＡ ＴＸ４システムに注入し、目的の分析物（複数可）を勾配分離による分析カラムによってクロマトグラフィー分析を行う。陰イオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モード（Ｔｕｒｂｏｉｏｎｓｐｒａｙ）で操作するＡＢ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ５０００トリプル四重極質量分析計を、検出のために使用し得る。あるいは、本明細書中に記載の他のタイプのイオン化および／または質量分析法を使用し得る。
【0062】
ある特定の実施形態では、各々の試料の逆算量を、マトリックス（例えば、６％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中に既知量のプロゲステロンスルファートをスパイクすることによって作成した二連の検量線から決定し得る。分析物および内部標準を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）および／または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）で定量し得る。ある特定の実施形態では、イオン合計を使用し得る。
【0063】
モニタリングし得るトランジションの例を表１に列挙する。１つの実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ取得は、表３～５でモニタリングされたトランジションを含み得る。あるいは、他のトランジションをモニタリングし得る。当該分野で公知のように、トランジションは機械ごとにわずかに変動する場合があり、機器の調整中に決定される。例えば、ある特定の実施形態では、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、親（プリカーサー）イオンおよびプロダクト（すなわち、娘または断片）イオンを選択し得る。親－娘（すなわち、プリカーサー－プロダクトまたはプリカーサー－断片）イオンのために選択するＰＭ３Ｓ、ＭＰＭＳ（ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓ）、およびＰＭＤｉＳ（ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳ）についてのＭＲＭスキャンの例を、図４～６にそれぞれ示す。したがって、ある特定の実施形態では、図４に示すように、ＰＭ３Ｓを、３９９．４００→９７．１００のトランジションについての分析物のピークを使用してＭＲＭによって測定する。さらに、および／またはあるいは、ある特定の実施形態では、図５に示すように、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、ＰＭ５Ｓについては３９７．３→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用し、ＰＭ４Ｓについては３９７．２→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用したＭＲＭによって測定する。さらにおよび／またはあるいは、ある特定の実施形態では、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを、イオン合計を使用したＭＲＭによって測定する。したがって、図６に示すように、４７９．０９８→３８１．２＋４７９．０９９→３８１．２＋４７９．１００→３８１．２＋４７９．１０１→３８１．２＋４７９．１０２→３８１．２のトランジションの合計をＰＭ２ＤｉＳの検出のために使用し、４７９．０９８→３９９．１＋４７９．０９９→３９９．１＋４７９．１００→３９９．１＋４７９．１０１→３９９．１＋４７９．１０２→３９９．１のトランジションの合計をＰＭ３ＤｉＳの検出のために使用し得る。
表１
表１
【表1】
【0064】
種々の試料を使用し得る。いくつかの実施形態では、生物試料は、血液、血清、血漿、尿、鼻咽頭スワブ、または唾液を含み得る。ある特定の実施形態では、試料は血清である。例えば、血清を、レッドトップチューブまたはＳＳＴ管に採取し、凍結し得る。血清を、パープルトップ（ＥＤＴＡ）チューブまたはグリーントップ（ヘパリン）チューブ中に採取し得る。ある特定の実施形態では、最少量で１ｍＬの血清、または２．５ｍＬの血清（例えば、小児被験体用）または５ｍＬの結成（成人用）を使用し得る。
【0065】
ある特定の実施形態では、血漿試料または血清試料のいずれかを使用して、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳの各々についての１００μＬの試料アリコートの検出下限（ＬＬＯＤ）は１ｎｇ／ｍＬである。より低い体積の試料を使用し得る。したがって、ある特定の実施形態では、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳについては体積２０μＬを使用し、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓについては体積１０μＬを使用し得る。
【0066】
方法は、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳについての１～５００ｎｇ／ｍＬの分析測定範囲（ＡＭＲ）（すなわち、ＬＬＯＱ－ＵＬＯＱ）にわたるプロゲステロンスルファートの検出を含み得る。ＰＭ３Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳを、２，５００ｎｇ／ｍＬの最大量の測定のために５倍まで希釈することができる一方で、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、５，０００ｎｇ／ｍＬの最大量の測定のために１０倍まで希釈することができる。ある特定の実施形態では、各々のプロゲステロンスルファートについてのＵＬＯＱは約５００ｎｇ／ｍＬであり、ＬＬＯＱは１ｎｇ／ｍＬである。
【0067】
本開示の方法の例を、図１に示す。したがって、１つの実施形態では、方法１００は、生物試料（例えば、プロゲステロンスルファート代謝産物を含むと考えられる血清試料または血漿試料）を提供する工程１０２を含み得る。
【0068】
次に、内部標準を、試料に添加し得る１０４。ある特定の実施形態では、プロゲステロンスルファートの安定同位体で標識された内部標準（ＰＭ３Ｓ－ｄ４、ＰＭ５Ｓ－ｄ４、ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４、および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４）を、標準、品質コントロール、および患者の血清または血漿アリコートに添加して、各々の試料からの別個のプロゲステロンスルファートの回収率を評価および補正する。
【0069】
次いで、試料（ならびに必要に応じた標準および対照試料）を希釈し１０６、タンパク質を沈殿させる１０８ための試薬を添加し得る。例えば、ある特定の実施形態では、試料を６％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中への内部標準（ＩＳ）の添加によって希釈し、次いで、アセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させる。次いで、試料抽出物の一部を、再構成前の試料の乾燥によって濃縮し得る。
【0070】
図１をさらに参照して、方法は、試料中のプロゲステロンスルファートを他の構成要素から分離するための手段としての液体クロマトグラフィーをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、単一工程のＨＰＬＣを使用する１１０。あるいは、いくつかの実施形態では、２つの液体クロマトグラフィー工程を使用する。例えば、方法は、第１の抽出カラムでの液体クロマトグラフィー（示さず）、その後の第２の分析カラム（例えば、ＨＰＬＣ）への移行を含み得る。あるいは、ＨＴＬＣを使用し得る。
【0071】
必要に応じて当該分野で公知の種々の分析カラムを使用して、良好に精製し得る。ある特定の実施形態では、分析カラムは、平均粒径約２～３μｍ（例えば、２．６μｍ）の粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、分析カラムは、官能化シリカもしくはポリマー－シリカハイブリッド、またはポリマー粒子もしくはモノリス型シリカ固定相（フェニル－ヘキシル官能化分析カラムなど）である。あるいは、ある特定の実施形態では、Ａｒｉａ ＴＸ４ ＨＴＬＣシステム（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）を使用する。
【0072】
次いで、分離した分析物を、質量分析によって分析する。１つの実施形態では、トリプル四重極タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用し、それにより、イオン化後に１またはそれを超えるプリカーサーイオンを選択し１１２、１またはそれを超えるプリカーサーイオンをさらなる断片化に供して１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成し１１４、それにより、１またはそれを超えるプロダクトイオンを検出のために使用する。
【0073】
次いで、目的の分析物を、タンデムＭＳ１１６によって測定した特徴的なトランジション量に基づいて定量し得る。いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、トリプル四重極質量分析計を含む。ある特定の実施形態では、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ５０００またはＡＰＩ５５００をネガティブＥＳＩモードで使用し得る。いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、陽イオン大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）モードで操作される。いくつかの実施形態では、分析物および内部標準を、選択反応モニタリングモード（ＳＲＭ）で定量する。あるいは、誘導結合プラズマ、またはＭＡＬＤＩ、またはＳＥＬＤＩ、またはＡＰＰＩなどを使用した他のイオン化法をイオン化のために使用し得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、各々の試料中の各々の分析物の逆算量を、既知量の精製された分析材料を標準的な試験試料（例えば、チャコール処理済みヒト血清またはＢＳＡ）中にスパイクすることによって作成された検量線に対する内部標準を使用した場合の未知試料の応答または応答比の比較によって決定し得る。１つの実施形態では、検定物質を既知濃度で調製し、分析して、濃度検量線に対する内部標準を使用した場合の応答または応答比を得る。
【0075】
開示の方法は、生理学的に関連するレベルでプロゲステロンスルファートを定量することができる。本明細書中で考察されるように、プロゲステロンスルファートレベルは、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）などの妊娠合併症および前述の合併症から生じ得る合併症（胎児死亡、早期産、および／または医原性早期産など）を軽減するための種々の治療化合物の有効性の重要な指標であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、プロゲステロンスルファート量を使用して、皮膚の妊娠性掻痒症が（ＩＣＰ）の初期徴候であるのか、あるいは被験体における良性妊娠性掻痒症に起因するのかを区別する。１つの実施形態では、この方法は、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、および／またはＰＭ３ＤｉＳの血清中の濃度レベルを以下の通りに報告することができる：ＰＭ３Ｓ：３６．０～２２１ｎｇ／ｍＬ；および／またはＰＭ４Ｓ：４４．７～７２５ｎｇ／ｍＬ；および／またはＰＭ５Ｓ：１１．２－２２３；ＰＭ２ＤｉＳ：３７．４～５０５ｎｇ／ｍＬ；および／またはＰＭ３ＤｉＳ：４．９１２～７８．３ｎｇ／ｍＬ。
プロゲステロンスルファートバイオマーカーを分析するためのシステム
プロゲステロンスルファートバイオマーカーを分析するためのシステム
【0076】
他の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の方法の工程のうちのいずれかを実施するためのシステムを含む。例えば、ある特定の実施形態では、試料中の１またはそれを超えるプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのシステムを開示する。ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのシステムは、目的のプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試験試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；少なくとも１つのプリカーサーイオンおよび少なくとも１つのプロダクトイオンを生成するために目的のプロゲステロン代謝産物を断片化するための質量分析計のステーションおよび／または構成要素；ならびに前述の試料中の目的のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。ある特定の実施形態では、システムは、試料中の目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。さらに、および／またはあるいは、システムは、試料中の目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素をさらに含み得る。例えば、システムは、試験試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；必要に応じて、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素；必要に応じて、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素；プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンおよび１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成するための質量分析用のステーションおよび／または構成要素；ならびに試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するために質量スペクトルを分析するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ある特定のステーションおよび／または構成要素は、単一のステーションおよび／または構成要素として組み合わせられている。
【0077】
ある特定の実施形態では、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。種々の実施形態では、プロゲステロン代謝産物としては、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールスルファート（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）および／または５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；および／またはジプロゲステロンスルファート（５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）および／または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）など）のうちの少なくとも１つが挙げられ得る。
【0078】
１つの実施形態では、試料を、タンデム質量分析によって測定し得る。ある特定の実施形態では、トリプル四重極タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用し得る。ある特定の実施形態では、必要に応じてトランジションイオン合計を使用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用し得る。
【0079】
ある特定の実施形態では、ステーションのうちの少なくとも１つを、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータおよび／またはコンピュータプログラム製品によって制御し得る。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、非一時的な機械可読記憶媒体（システムのステーションおよび／または構成要素のうちのいずれかを制御するように構成された命令を含む）中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品を含み得る。
【0080】
システムは、安定同位体で標識された内部標準（複数可）を添加するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。ある特定の実施形態では、プロゲステロンスルファートの安定同位体で標識された内部標準（例えば、ＰＭ３Ｓ－ｄ４、ＰＭ５Ｓ－ｄ４、ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４、および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４）を標準、品質コントロール、および患者の血清または血漿のアリコートに添加して、各々の試料からの別個のプロゲステロンスルファートの回収率を評価および補正する。
【0081】
ある特定の実施形態では、また、システムは、液体クロマトグラフ分離のためのステーションの前に試料中の少なくとも１つの目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。ある特定の実施形態では、部分精製のためのステーションおよび／または構成要素は、試料の希釈、液液抽出、固相抽出、および／またはタンパク質の沈殿のためのステーションまたは構成要素を含み得る。例えば、部分精製のためのステーションおよび／または構成要素は、希釈および／またはタンパク質沈殿のための試薬を含み得る。
【0082】
ある特定の実施形態では、システムは、試料中のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはハイスループットクロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）である。ＬＣ工程は、１つのＬＣ分離、または複数のＬＣ分離を含み得る。１つの実施形態では、クロマトグラフ分離は、抽出および分析液体クロマトグラフィーを含む。本明細書中で考察されるように、ある特定の実施形態では、分析クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含み得る。ある特定の実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）（ハイスループット液体クロマトグラフィーとしても公知）を使用し得る。さらに、および／またはあるいは、他のタイプの精製を使用し得る。
【0083】
本明細書中に記載のように、いくつかの実施形態では、同位体で標識された内部標準または複数の標準を、試料に添加し得る。同位体で標識された内部標準または複数の標準を部分精製工程前に添加して、前述の手順中に生じ得る分析物（例えば、プロゲステロン代謝産物）の損失を標準化し得る。したがって、部分精製のためのステーションおよび／または構成要素は、溶媒および／または同位体で標識された材料を用いた作業に必要なフードまたは他の安全機能を含み得る。
【0084】
試料の希釈、タンパク質沈殿、および内部標準の添加のためのステーションまたは構成要素は、各々が別個のステーションであり得るか、１つまたは２つのステーションまたは構成要素として組み合わせ得る。
【0085】
１つの実施形態では、クロマトグラフ分離のためのステーションおよび／または構成要素は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を行うための少なくとも１つの装置を含む。１つの実施形態では、液体クロマトグラフィーのためのステーションおよび／または構成要素は、分析クロマトグラフィーのためのカラムを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含み得る。あるいは、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、ＨＴＬＣを含み得る。いくつかの実施形態では、また、クロマトグラフ分離は、分析液体クロマトグラフィー前の抽出クロマトグラフィーを含み得る。
【0086】
当該分野で公知の種々の分析カラムを、必要に応じて良好に精製するためのクロマトグラフステーションの一部として使用し得る。ある特定の実施形態では、分析カラムは、平均粒径が約２～３μｍ（すなわち、２．６μｍ）の粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、分析カラムは、官能化シリカもしくはポリマー－シリカハイブリッド、またはポリマー粒子もしくはモノリス型シリカ固定相（フェニル－ヘキシル官能化分析カラムなど）である。あるいは、ある特定の実施形態では、ステーションは、Ａｒｉａ ＴＸ４ ＨＴＬＣシステム（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）を含み得る。
【0087】
ある特定の実施形態では、本開示のシステムは、複数の液体クロマトグラフィー工程を含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、二次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）手順を使用する。例えば、１つの実施形態では、本開示のシステムは、目的のバイオマーカーをＬＣ抽出カラムから分析カラムに移動させるためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。１つの実施形態では、少なくとも１つの目的のバイオマーカーの抽出カラムから分析カラムへの移動を、ハートカッティング技術によって行う。別の実施形態では、目的のバイオマーカーを、クロマトフォーカシング技術によって抽出カラムから分析カラムへ移動させる。あるいは、目的のバイオマーカーを、カラム切り替え技術によって抽出カラムから分析カラムへ移動させる。これらの移動工程は、手作業で行い得るか、オンラインシステムの一部であり得る。必要に応じて、抽出カラムを、本明細書中に記載の方法およびシステムで使用しなくてよい。
【0088】
ある特定の実施形態では、質量分析のためのステーションおよび／または構成要素は、タンデム質量分析計を含む。いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、トリプル四重極質量分析計を含む。ある特定の実施形態では、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ５０００、ＡＰＩ５５００、またはＡｇｉｌｅｎｔ ７０００トリプル四重極質量分析計をネガティブＥＳＩモードで使用し得る。いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、陽イオン大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）モードで操作される。いくつかの実施形態では、分析物および内部標準を、選択反応モニタリングモード（ＳＲＭ）で定量する。あるいは、誘導結合プラズマ、またはＭＡＬＤＩ、またはＳＥＬＤＩ、またはＡＰＰＩなどを使用した他のイオン化法をイオン化のために使用し得る。
【0089】
図２は、本開示のシステムの実施形態の図面を提供する。図２に示すように、システム２００は、目的のプロゲステロン代謝産物を含み得る試料をサンプリングコンテナ中に等分するためのステーションおよび／または構成要素２０２を含み得る。１つの実施形態では、試料を、液液抽出または試料の希釈を容易にするために、１つのコンテナまたは複数のコンテナに等分する。等分のためのステーションおよび／または構成要素は、分析で使用されない生物試料の一部を破棄または貯蔵するための容器を含み得る。
【0090】
システムは、内部標準を試料に添加するためのステーションおよび／または構成要素２０４をさらに含み得る。１つの実施形態では、内部標準は、非天然同位体で標識した目的のプロゲステロン代謝産物のうちの少なくとも１つを含む。したがって、内部標準を添加するためのステーションまたは構成要素は、試料への同位体で標識された内部標準溶液の添加を容易にするための安全機能を含み得る。
【0091】
また、システムは、いくつかの実施形態では、目的のプロゲステロン代謝産物の部分精製のためのステーション（複数可）および／または構成要素（複数可）２０８を含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、試料の希釈および／またはタンパク質沈殿のためのステーションまたは構成要素２０８を含み得る。あるいは、他のタイプの試料精製（液液抽出または固相抽出など）のためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。
【0092】
また、システムは、試料の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）のためのステーションおよび／または構成要素２１０を含み得る。本明細書中に記載のように、１つの実施形態では、液体クロマトグラフィーのためのステーションおよび／または構成要素は、ＨＰＬＣ（またはＨＴＬＣ）カラムを含み得る。液体クロマトグラフィーのためのステーションは、固定相を含むカラム、および移動相として使用される溶媒を含むコンテナまたは容器を含み得る。１つの実施形態では、移動相は、アセトニトリル、ギ酸アンモニウム、および水、または揮発性緩衝液との他の混和性溶媒の勾配を含む。したがって、１つの実施形態では、クロマトグラフィーのためのステーションおよび／または構成要素は、１つのカラムまたは複数のカラムに適用される別個の溶媒の量を調整するのに適切なラインおよび弁を含み得る。また、ステーションおよび／または構成要素は、目的のバイオマーカーを含まない画分を除去および破棄するための手段を含み得る。１つの実施形態では、目的のバイオマーカーを含まない画分をカラムから連続的に除去し、除染のための廃棄用容器に送り、破棄する。ある特定の実施形態では、ステーションおよび／または構成要素は、Ａｒｉａ ＴＸ４ ＨＴＬＣシステム（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）を含み得る。
【0093】
また、システムは、質量分析のためのステーションおよび／または構成要素２１２を含み得る。１つの実施形態では、質量分析のためのステーションまたは構成要素は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を含む。また、システムは、分析物の特徴付けおよび／または定量のためのステーションおよび／または構成要素を含み得る。特徴付けおよび／または定量のためのステーションおよび／または構成要素は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの結果のデータ分析のためのステーションおよび／または構成要素２１６を含み得る。１つの実施形態では、分析は、目的のプロゲステロン代謝産物（複数可）の同定および定量の両方を含む。
【0094】
図２に例証するように、システムのステーションおよび／または構成要素のうちのいずれかを、コンピュータ３００および／またはプログラミング可能なソフトウェアによって少なくとも一部を自動化、ロボット制御、および／または制御し得る。例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよび／またはデータ分析のためのステーション（複数可）および／または構成要素（複数可）を、コンピュータによって少なくとも一部を制御し得る。したがって、システムは、システムまたはシステムの任意の部分（例えば、ステーションまたは構成要素）が動作し、そして／または開示の実施形態のうちのいずれかの方法の１つの工程または複数の工程を実施するように構成された命令を含む、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品を含み得る。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるデータプロセッサ、および前述の１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサが、１またはそれを超える本明細書中に開示の方法またはプロセスのうちの一部または全部を実施し、そして／または本明細書中に開示のシステムの一部のうちのいずれかを動作させる命令を含む、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含むシステムを提供する。
【0095】
例えば、１またはそれを超えるデータプロセッサ、および前述の１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試料を準備する工程；必要に応じて、前述の試料中の前述の少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離する工程；タンデム質量分析を使用して、前述のプロゲステロン代謝産物に特異的な少なくとも１つのプリカーサーイオンおよび少なくとも１つのプロダクトイオンを生成する工程；および前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させる命令を含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含むシステムを開示する。さらにおよび／またはあるいは、ある特定の実施形態では、１またはそれを超えるデータプロセッサ、および前述の１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、（ａ）前述のプロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述のプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前述の検出されたイオンを、前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量と関連付ける工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させる命令を含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含むシステムを開示する。
【0096】
開示のシステムの構成要素またはステーションのうちのいずれかを動作させ、そして／または開示の実施形態のうちのいずれかの方法の１つの工程または複数の工程を実施するように構成された命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品も開示する。例えば、ある特定の実施形態では、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品は、１またはそれを超えるデータプロセッサに、少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試料を準備する工程；必要に応じて、前述の試料中の前述の少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離する工程；タンデム質量分析を使用して、前述のプロゲステロン代謝産物に特異的な少なくとも１つのプリカーサーイオンおよび少なくとも１つのプロダクトイオンを生成する工程；および前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させるように構成された命令を含む。ある特定の実施形態では、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、（ａ）前述のプロゲステロン代謝産物からプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述のプリカーサーイオンの１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前述の試料中の前述の検出されたイオンをプロゲステロン代謝産物の存在または量と関連付ける工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させる命令を含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を開示する。
【0097】
システムおよびコンピュータ製品は、本明細書中に開示の方法のうちのいずれかを実施し得る。本明細書中に記載の１またはそれを超える実施形態を、プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントを使用して実装することができる。プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントは、１またはそれを超える提示したタスクまたは機能を実行することができるプログラム、サブルーチン、プログラムの一部、またはソフトウェアコンポーネントまたはハードウェアコンポーネントを含むことができる。本明細書中で使用される場合、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュールまたはコンポーネントと独立してハードウェアコンポーネント上に存在することができる。あるいは、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュール、プログラム、または機械の共用の要素またはプロセスであり得る。
【0098】
図３は、プロゲステロン代謝産物の検出および／または定量のために使用される分析システム３００のブロック図を示す。図３で例証されるように、１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能なモジュール、エンジン、または構成要素（例えば、プログラム、コード、または命令）を使用して、種々の実施形態の分析システムの種々のサブシステムを実装し得る。モジュール、エンジン、またはコンポーネントは、非一時的なコンピュータ媒体に記憶され得る。必要に応じて、モジュール、エンジン、またはコンポーネントのうちの１つまたは複数は、システムメモリ（例えば、ＲＡＭ）にロードされ、分析システムの１またはそれを超えるプロセッサによって実行され得る。図３に示す例では、方法の実装または本開示のシステムのうちのいずれかの動作のためのモジュール、エンジン、または構成要素を示す。
【0099】
したがって、図３は、本開示のシステムおよび方法との使用に好適な例示的な計算装置３００を例証する。例示的な計算装置３００は、１またはそれを超える通信バス３１５を使用してメモリ３１０および計算装置３００の他の構成要素と通信しているプロセッサ３０５を含む。プロセッサ３０５は、異なる例（図１～２および４～６中の例または本明細書中の他所に開示の例など）によるプロゲステロン代謝産物レベルを検出するための１またはそれを超える方法を実施するか、１またはそれを超えるステーションを操作するためにメモリ３１０に記憶されたプロセッサ実行可能命令を実行するように構成されている。この例では、メモリ３１０は、本明細書中に考察されるように試料についての結果を分析する３２０ことができるプロセッサ実行可能命令３２５を記憶し得る。
【0100】
また、計算装置３００は、この例では、ユーザー入力を受け入れるための１またはそれを超えるユーザー入力デバイス３３０（キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロフォンなど）を含み得る。また、計算装置３００は、ユーザーインターフェースなどのユーザーに視覚的出力を提供するためのディスプレイ３３５を含み得る。また、計算装置３００は、通信インターフェース３４０を含み得る。いくつかの例では、通信インターフェース３４０は、１またはそれを超えるネットワーク（ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）；広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）（インターネットなど）；メトロポリタンエリアネットワーク（「ＭＡＮ」）；二地点間接続または同位層間接続などが挙げられる）を使用して通信できる場合がある。他のデバイスとの通信は、任意の好適なネットワークプロトコルを用いて行われ得る。例えば、１つの好適なネットワークプロトコルは、インターネットプロトコル（「ＩＰ」）、伝送制御プロトコル（「ＴＣＰ」）、ユーザーデータグラムプロトコル（「ＵＤＰ」）、またはその組み合わせ（ＴＣＰ／ＩＰまたはＵＤＰ／ＩＰなど）が挙げられ得る。
【0101】
いくつかの実施形態では、精製または分離工程のうちの１つまたは複数を、「オンライン」で実施することができる。オンラインシステムは、１つのコンテナから試料のアリコートを取り出し、かかるアリコートを別のコンテナ中に移すためのオートサンプラーを含み得る。例えば、オートサンプラーを使用して、ＬＣ抽出カラム上の抽出後に試料を移し得る。さらに、またはあるいは、オンラインシステムは、ＬＣ抽出カラムから単離された画分をＬＣ分析カラム上に注入するための１またはそれを超える注入ポートを含み得る。さらに、またはあるいは、オンラインシステムは、ＬＣ精製された試料をＭＳシステム中に注入するための１またはそれを超える注入ポートを含み得る。したがって、オンラインシステムは、１またはそれを超えるカラム（抽出カラムおよび／または分析カラムが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。さらに、またはあるいは、システムは、検出システム（例えば、質量分析計システム）を含み得る。また、オンラインシステムは、１またはそれを超えるポンプ；１またはそれを超える弁；および必要に応じた配管系統を含み得る。かかる「オンライン」システムでは、目的の試験試料および／または分析物を、システムから退出することなく（例えば、回収し、次いでシステムの別の構成要素に破棄することなく）、システムの１つの構成要素から別の構成要素まで通過することができる。
【0102】
いくつかの実施形態では、オンラインでの精製法または分離法を自動化することができる。かかる実施形態では、プロセスが設定および開始された時点で、オペレータの介入を必要とせずに工程を実施することができる。例えば、１つの実施形態では、システムまたはシステムの一部を、１つのコンピュータまたは複数のコンピュータ３００によって制御し得る。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、システムの種々の構成要素（ポンプ、弁、およびオートサンプラーなどが挙げられる）を制御するためのソフトウェアを含み得る。かかるソフトウェアを使用して、試料および溶質の正確な添加のタイミングおよび流速によって抽出プロセスを最適化することができる。
【0103】
方法における工程およびステーションを含むシステムのうちのいくつかまたは全てがオンラインであり得るが、ある特定の実施形態では、工程のうちのいくつかまたは全てを「オフライン」で実施し得る。かかるオフライン手順では、目的の分析物を、典型的には、例えば、抽出カラム上または液体／液体抽出によって、試料マトリックス中の他の構成要素から分離し、次いで、別のクロマトグラフシステムまたは検出器システムへのその後の導入のために回収する。オフライン手順は、典型的には、オペレータ側の手作業による介入が必要である。
【0104】
本明細書中に記載のように、液体クロマトグラフィーは、ある特定の実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィーまたはハイスループット液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含み得る。例えば、Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８５４：２３－３５（１９９９）を参照のこと；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；および同第５，７７２，８７４号も参照のこと。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム充填に依存し、このカラム充填は、カラムを通過する試料の層流を試料からの目的の分析物の分離の基本とする。かかるカラムでは、分離は拡散過程である。ＨＴＬＣのカラムおよび方法などによって得られる乱流は質量移動速度を増強し、分離特性を改善し得る。いくつかの実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を単独または１またはそれを超える精製方法と組み合わせて使用して、質量分析前に目的のバイオマーカーを精製し得る。かかる実施形態では、試料を、分析物を捕捉するＨＴＬＣ抽出カートリッジを使用して抽出し、次いで、イオン化の前に第２のＨＴＬＣカラムまたは分析ＨＰＬＣカラムにて溶離し、クロマトグラフィーを行い得る。これらのクロマトグラフィー手順に関与する工程を自動化様式でリンクすることができるので、分析物の精製中のオペレータ関与の必要性を最小にすることができる。また、いくつかの実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィーによる試料調製法を使用すると、液液抽出を含む他の試料調製方法が必要でなくなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、試験試料（例えば、体液）を、高乱流液体クロマトグラフィーシステムに直接配置する（例えば、注入する）ことができる。
【0105】
例えば、典型的な高乱流または乱流液体クロマトグラフィーシステムでは、試料を、巨大な（例えば、２５ミクロン超）粒子を充填した狭い（例えば、内径０．５ｍｍ～２ｍｍ×長さ２０～５０ｍｍ）カラムに直接注入し得る。ある流速（例えば、３～５００ｍＬ／分）がカラムに印加されるとき、比較的幅が狭いカラムは、移動相の速度を増加させる。カラム中に存在する巨大粒子は、加速による背圧を防止し、粒子間の間欠的な渦の形成を促進し、それにより、カラム内に乱流を得ることができる。
【0106】
高乱流液体クロマトグラフィーでは、分析物分子は、粒子に迅速に結合する場合があり、典型的には、カラムの長手方向に拡大（すなわち、拡散）しない。この長手方向の拡散の軽減により、典型的には、試料マトリックスから目的の分析物がより良好でより迅速に分離される。さらに、カラム内の乱流は、典型的には粒子を通過するにつれて生じる分子の摩擦を軽減する。例えば、伝統的なＨＰＬＣでは、粒子の最も近くを進む分子は、粒子間の経路の中心を流れる分子よりもゆっくりカラムに沿って移動する。この流速の相違により、分析物分子がカラムの長手方向に広がる。カラム内で乱流が起こるとき、粒子由来の分子上の摩擦が無視できるほどになり、長手方向の分散が軽減される。
【0107】
ある特定の実施形態では、質量分析計は、「四重極」システムを使用する。「四重極」または「四重極イオントラップ」質量分析計では、振動高周波（ＲＦ）電界にあるイオンは、電極間に印加された直流（ＤＣ）電位、ＲＦシグナルの振幅、およびｍ／ｚに比例した力を受ける。特定のｍ／ｚを有するイオンのみが四重極を長手方向に進む一方で、全ての他のイオンは四重極から外れるような電圧および振幅を選択することができる。したがって、四重極装置は、装置に注入されたイオンの「マスフィルタ」および「質量検出器」の両方としての機能を果たすことができる。
【0108】
ある特定の実施形態では、タンデム質量分析、すなわち「ＭＳ／ＭＳ」を使用する。理由の１つとしてＭＳ／ＭＳの選択性が分析前の試料の大規模なクリーンアップの必要性を最小にすることができるので、ＭＳ／ＭＳ法は、複雑な混合物、特に生物試料の分析に有用である。
【0109】
１つの実施形態では、本開示の方法およびシステムは、トリプル四重極ＭＳ／ＭＳを使用する。トリプル四重極ＭＳ／ＭＳ装置は、典型的には、断片化手段によって分離された２つの四重極マスフィルタからなる。１つの実施形態では、装置は、イオン格納デバイスまたはイオン透過デバイスとしてＲＦのみのモードで操作される四重極マスフィルタを含み得る。１つの実施形態では、四重極は、１ミリトルと１０ミリトルとの間の圧力の衝突ガスをさらに含み得る。他のタイプの「ハイブリッド」タンデム質量分析計も多く知られており、本開示の方法およびシステムで使用することができ、磁場セクター型分析器と四重極フィルタの種々の組み合わせが挙げられる。これらのハイブリッド装置は、しばしば、マスフィルタのいずれかまたは両方としての高分解能磁場セクター型分析器（すなわち、二重収束組み合わせで配置された磁場セクター型および静電気セクター型の両方を含む分析器）を含む。高分解能マスフィルタの使用は、化学的ノイズを非常に低レベルに低下させるのに非常に有効であり得る。
【0110】
本開示の方法およびシステムについて、種々の方法（電子イオン化、化学的イオン化、高速電子衝撃、電界脱離、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）、表面増強レーザー脱離イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）、光子イオン化、エレクトロスプレーイオン化、および誘導結合プラズマが挙げられるが、これらに限定されない）を使用してイオンを生成することができる。
【0111】
本開示の実施形態は、ある特定の利点を提供し得る。ある特定の実施形態では、本開示の方法およびシステムは、測定された多くの分析物について以前に達成可能な感度より高い感度を提供し得る。
【0112】
また、本開示の方法およびシステムの実施形態は、測定された多くの分析物について以前に達成されなかった迅速な処理が可能である。例えば、本開示の方法およびシステムを使用して、複数の試料を、９６ウェルプレートおよび処理能力が有意に高い４つのＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムから構成される複合システムを使用して、プロゲステロンスルファート分析物について分析し得る。
【0113】
別の利点として、本開示の方法およびシステムによって得られる特異性および感度により、種々の生物学的材料由来の分析物を分析可能である。例えば、本開示のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を、複雑な生物試料マトリックス（血液、血清、血漿、尿、唾液、および鼻咽頭スワブなどが挙げられるが、これらに限定されない）中の目的の分析物の定量に適用することができる。したがって、本開示の方法およびシステムは、臨床適用および／または臨床試験に好適である。
【0114】
さらなる潜在的な利点として、ある特定の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、標的分析物の定量下限（ＬＯＱ）（ｍｇ／ｄＬ）を達成しながら同重体妨害、試料含有量の変動（溶血試料および脂血症の試料が挙げられる）に対処するためのアプローチを提供する。したがって、本開示の方法およびシステムの実施形態は、障害の離床診断で使用される臨床バイオマーカーを定量的、高感度、かつ特異的に検出可能である。
【実施例】
【0115】
実施例
本開示は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解され得る。
実施例１－アッセイ方法
本開示は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解され得る。
実施例１－アッセイ方法
【0116】
５つの別個のプロゲステロンスルファート（ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳ）を、希釈およびタンパク質沈殿後にタンデム質量分析検出を用いた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。ＰＭ３Ｓを、１つのアッセイで別個に測定した（ＰＭ３Ｓ）。ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを１つのアッセイで共に測定し（ＭＰＭＳ）、一方で、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを１つのアッセイで共に測定した（ＰＭＤｉＳ）。３つのアッセイは、別々の標準、ＱＣ材料、内部標準、およびＬＣＭＳ法を使用する。試料処理工程は、３つ全てのアッセイで同一である。
【0117】
プロゲステロンスルファートの安定同位体で標識された内部標準（ＰＭ３Ｓ－ｄ４、ＰＭ５Ｓ－ｄ４、ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４、および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４）を、標準、品質コントロール、および患者の血清アリコートに添加して、各々の試料からの別個のプロゲステロンスルファートの回収率を評価および補正した。標準、対照試料、および患者の血清を希釈し、次いで、タンパク質沈殿を行った。試料抽出物の一部を、再構成前の試料の乾燥によって濃縮した。各々の患者および検定物質由来の最終生成物を、タンデム質量分析を用いたＨＰＬＣによって分析した。全ての試料をＡＲＩＡ ＴＸ４システムに注入し、目的の分析物（複数可）を勾配分離による分析カラムによってクロマトグラフィー分析を行った。陰イオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モード（Ｔｕｒｂｏｉｏｎｓｐｒａｙ）で操作するＡＢ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ５０００トリプル四重極質量分析計を検出のために使用した。
【0118】
各々の試料中の分析物の逆算量を、６％ＢＳＡ中に既知量のプロゲステロンスルファートをスパイクすることによって作成した二連の検量線から決定した。分析物および内部標準を、必要な場合にイオン合計を使用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで定量した。モニタリングしたトランジションを、以下の表に列挙する。トランジションは機械ごとにわずかに変動する場合があり、機器の調整中に決定されることに留意のこと。
実施例２－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによるプロゲステロンスルファートのバリデーション
実施例２－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによるプロゲステロンスルファートのバリデーション
【0119】
クロマトグラフアッセイ－バリデーションランは、最小限の３つの濃度レベル（低、中、高）の品質コントロール（ＱＣ）を含む。
【0120】
較正の合否基準－検量線は、最少でも６つの非ゼロ濃度レベルおよびブランクを有する。リードバック濃度は、前述のレベルの少なくとも７５％で名目濃度の１５％（ＬＬＯＱで２０％）以内でなければならない。
【0121】
ＱＣ合否基準－ＱＣの少なくとも２／３が目標値の±１５％である；各々の濃度レベルでのＱＣの少なくとも５０％が目標値の±１５％である。
【0122】
短期貯蔵、長期貯蔵、および凍結融解での安定性－以下の条件で貯蔵された血清は、ＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳの濃度の分析のための使用が許容される：凍結（－１０℃以下および－５５℃以下）：２７日間；冷蔵（２～８℃）：１４日間；室温（１５～３０℃）：１４日間；または凍結融解サイクル（－１０℃以下）：６サイクル（合計融解回数７）。凍結血清（－１０℃以下）についての長期貯蔵は２７日間であり、試料を、ドライアイス上での凍結状態で運搬し得る。
基準範囲
基準範囲
【0123】
基準範囲を確立するために、１２０人の妊婦の血清試料を分析し、全ての試料を、基準範囲評価のために使用した。別個の血清（ＳＳＴ）試料を、ＡＦＰ Ｔｅｔｒａ分析のために妊娠１５～２４週の範囲の女性から採取した。９７．５パーセンタイルによって決定された血清中のＰＭ３Ｓ、ＰＭ４Ｓ、ＰＭ５Ｓ、ＰＭ２ＤｉＳ、およびＰＭ３ＤｉＳ濃度の基準範囲を、以下に列挙する：
・ＰＭ３Ｓ：３６．０～２２１ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ４Ｓ：４４．７～７２５ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ５Ｓ：１１．２～２２３ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ２ＤｉＳ：３７．４～５０５ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ３ＤｉＳ：４．９１２～７８．３ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ３Ｓ：３６．０～２２１ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ４Ｓ：４４．７～７２５ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ５Ｓ：１１．２～２２３ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ２ＤｉＳ：３７．４～５０５ｎｇ／ｍＬ
・ＰＭ３ＤｉＳ：４．９１２～７８．３ｎｇ／ｍＬ
【0124】
例示的なスキャンを、図４～６に示す。これらの実験では、多重反応モニタリングを使用して、適切なトランジションを選択した。ＰＭ３Ｓを、１つのアッセイで別個にモニタリングした（ＰＭ３Ｓ）（図４）。ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、１つのアッセイで共に測定した（図５）。ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを、１つのアッセイで共に測定した（図６）。イオン合計を、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳの分析および測定のために使用した）。
【0125】
結果を表２にまとめており、表中、合否基準に合格した分析物を分析物のカラムに示す。
表２
実施例３－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ取得法
表２
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【0126】
表３～５は、ＰＭ３Ｓ（表３）、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓ（ＭＰＭＳ）（表４）、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳ（ＰＭＤｉＳ）（表５）のために使用した分析物取得方法を示す。かかるスキャンの結果を、図４（ＰＭ３Ｓ）、図５（ＭＰＭＳ）、および図６（ＰＭＤｉＳ）に示す。表３～５で使用されるように、ＩＳは、本明細書中に記載の同位体で標識した標準を示す。１、２、および３（ならびに下位指定語Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、モニタリングされた異なるトランジションを示し、アッセイ定量のために使用される場合と使用されない場合がある。
表３－ＰＭ３Ｓ取得法
表４－ＭＰＭＳ分析物取得法
表５－ＰＭＤｉＳ取得法
実施例４－好適な方法およびシステムの例示的な実施形態
表３－ＰＭ３Ｓ取得法
【表3】
【表4】
【表5-1】
【表5-2】
【0127】
以下で使用されるように、方法またはシステムに対するいかなる範囲の符号も、方法またはシステムの各々に対する１つの符号を個別に示すと理解される（例えば、「例示的な実施形態１～４は、例示的な実施形態１、２、３、または４と理解される。」）。
【0128】
例示的な実施形態１は、質量分析によって被験体由来の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する方法であり、（ａ）前述のプロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンから１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前述の検出されたイオンを、前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量と関連付ける工程を含む。
【0129】
例示的な実施形態２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。
【0130】
例示的な実施形態３は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、プロゲステロンスルファートは、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）；５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）；または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）のうちの少なくとも１つを含む。
【0131】
例示的な実施形態４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、ＰＭ３Ｓを個別に測定し、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを同時に測定し、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを同時に測定する。
【0132】
例示的な実施形態５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、質量分析はタンデム質量分析である。
【0133】
例示的な実施形態６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、タンデム質量分析はトリプル四重極タンデム質量分析である。
【0134】
例示的な実施形態７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、必要に応じてイオン合計を使用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、プリカーサーイオンおよび／またはプロダクトイオンを選択する。
【0135】
例示的な実施形態８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、ＰＭ３Ｓを、３９９．４００→９７．１００のトランジションについての分析物のピークを使用してＭＲＭによって測定する。
【0136】
例示的な実施形態９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、ＰＭ５Ｓについては３９７．３→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用し、ＰＭ４Ｓについては３９７．２→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用したＭＲＭによって別々または共に測定する。
【0137】
例示的な実施形態１０は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、ＰＭ２ＤｉＳおよび／またはＰＭ３ＤｉＳを、イオン合計を使用したＭＲＭによって測定する。
【0138】
例示的な実施形態１１は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、４７９．０９８→３８１．２＋４７９．０９９→３８１．２＋４７９．１００→３８１．２＋４７９．１０１→３８１．２＋４７９．１０２→３８１．２のトランジションの合計をＰＭ２ＤｉＳの検出のために使用する。
【0139】
例示的な実施形態１２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、４７９．０９８→３９９．１＋４７９．０９９→３９９．１＋４７９．１００→３９９．１＋４７９．１０１→３９９．１＋４７９．１０２→３９９．１のトランジションの合計をＰＭ３ＤｉＳの検出のために使用し得る。
【0140】
例示的な実施形態１３は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、試料を、最初の断片化工程（ａ）の前に精製工程に供する。
【0141】
例示的な実施形態１４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、精製工程はクロマトグラフィーを含む。
【0142】
例示的な実施形態１５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはハイスループット液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【0143】
例示的な実施形態１６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、クロマトグラフィー前に試料の希釈および／またはタンパク質沈殿のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0144】
例示的な実施形態１７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、安定同位体で標識された内部標準の添加をさらに含む。
【0145】
例示的な実施形態１８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、安定同位体で標識された内部標準は、ＰＭ３Ｓ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ５Ｓ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３β－オール－２０－オン－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）；および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）のうちの少なくとも１つを含む。
【0146】
例示的な実施形態１９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、試料は血清または血漿である。
【0147】
例示的な実施形態２０は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、プロゲステロンスルファートのＬＬＯＱは、１００μＬの試料あたり１ｎｇである。
【0148】
例示的な実施形態２１は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、プロゲステロンスルファートのＵＬＯＱは、１００μＬの試料あたり５００ｎｇである。
【0149】
例示的な実施形態２２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態の方法であり、ここで、プロゲステロンスルファート量を使用して、皮膚の妊娠性掻痒症が（ＩＣＰ）の初期徴候であるのか、あるいは被験体における良性妊娠性掻痒症に起因するのかを区別する。
【0150】
例示的な実施形態２３は、試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのシステムであり、前述のシステムは、目的のプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試験試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成し、前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンから１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成し、前述のプリカーサーイオンのうちの少なくとも１つまたは前述の少なくとも１つのプロダクトイオンの量を決定するために前述の目的のプロゲステロン代謝産物を断片化するための質量分析のステーションおよび／または構成要素；ならびに前述の試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのステーションおよび／または構成要素を含む。
【0151】
例示的な実施形態２４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、目的のプロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。
【0152】
例示的な実施形態２５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、プロゲステロンスルファートは、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）；５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）；または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）のうちの少なくとも１つを含む。
【0153】
例示的な実施形態２６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、ＰＭ３Ｓを個別に測定し（ＰＭ３Ｓ）、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを同時に測定し、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを同時に測定する。
【0154】
例示的な実施形態２７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、質量分析はタンデム質量分析である。
【0155】
例示的な実施形態２８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、タンデム質量分析はトリプル四重極タンデム質量分析である。
【0156】
例示的な実施形態２９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、必要に応じてイオン合計を使用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、プリカーサーイオンおよび／またはプロダクトイオンを選択する。
【0157】
例示的な実施形態３０は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、ＰＭ３Ｓを、３９９．４００→９７．１００のトランジションについての分析物のピークを使用してＭＲＭによって測定する。
【0158】
例示的な実施形態３１は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、ＰＭ５Ｓについては３９７．３→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用し、ＰＭ４Ｓについては３９７．２→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用したＭＲＭによって別々または共に測定する。
【0159】
例示的な実施形態３２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、ＰＭ２ＤｉＳおよび／またはＰＭ３ＤｉＳを、イオン合計を使用したＭＲＭによって測定する。
【0160】
例示的な実施形態３３は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、４７９．０９８→３８１．２＋４７９．０９９→３８１．２＋４７９．１００→３８１．２＋４７９．１０１→３８１．２＋４７９．１０２→３８１．２のトランジションの合計をＰＭ２ＤｉＳの検出のために使用する。
【0161】
例示的な実施形態３４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、４７９．０９８→３９９．１＋４７９．０９９→３９９．１＋４７９．１００→３９９．１＋４７９．１０１→３９９．１＋４７９．１０２→３９９．１のトランジションの合計をＰＭ３ＤｉＳの検出のために使用し得る。
【0162】
例示的な実施形態３５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、試料中の目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素から部分精製するためのステーションおよび／または構成要素をさらに含む。
【0163】
例示的な実施形態３６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、試料中の目的のプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離するためのステーションおよび／または構成要素をさらに含む。
【0164】
例示的な実施形態３７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、試料は血漿または血清である。
【0165】
例示的な実施形態３８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、少なくとも１つの安定同位体を内部標準として添加し、必要に応じて、安定同位体で標識された内部標準は、ＰＭ３Ｓ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ５Ｓ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３β－オール－２０－オン－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）；および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）のうちの少なくとも１つを含む。
【0166】
例示的な実施形態３９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のシステムであり、ここで、ステーションおよび／または構成要素のうちの少なくとも１つは、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータおよび／またはコンピュータプログラム製品によって制御される。
【0167】
例示的な実施形態４０は、例示的な実施形態１～２２の方法工程のうちのいずれかを実施するか、例示的な実施形態２３～３９のステーションおよび／または構成要素のうちのいずれかを制御するように構成された命令を含む、非一時的な機械可読記憶媒体中で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品である。
【0168】
例示的な実施形態４１は、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試料を準備する工程；必要に応じて、試料中の前述の少なくとも１つのプロゲステロン代謝産物を他の構成要素からクロマトグラフィーで分離する工程；タンデム質量分析を使用して、プロゲステロン代謝産物に特異的な１またはそれを超えるプリカーサーイオンおよび１またはそれを超える断片イオンを生成する工程；および前述の試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定する工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させる命令を含む任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品である。
【0169】
例示的な実施形態４２は、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、（ａ）プロゲステロン代謝産物から１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成する工程；（ｂ）前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンから１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成する工程；（ｃ）工程（ａ）で生成されたプリカーサーイオンのうちの１つまたは複数または工程（ｂ）の１またはそれを超えるプロダクトイオンまたはこれらの両方の存在または量を検出する工程；および前述の検出されたイオンを、前述の試料中のプロゲステロンの代謝産物の存在または量と関連付ける工程のうちの少なくとも１つを指示するように動作を実施させる命令を含む任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品である。
【0170】
例示的な実施形態４３は、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、前述の１またはそれを超えるデータプロセッサに、試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためにシステムまたはシステムの任意のステーションおよび／もしくは構成要素が動作するように操作を実行させる命令を含み、前述のシステムが、目的のプロゲステロン代謝産物を含むと考えられる試験試料を提供するためのステーションおよび／または構成要素；１またはそれを超えるプリカーサーイオンを生成し、前述の１またはそれを超えるプリカーサーイオンから１またはそれを超えるプロダクトイオンを生成し、１またはそれを超えるプリカーサーイオンまたは１またはそれを超えるプロダクトイオンの量を決定するために前述の目的のプロゲステロン代謝産物を断片化するための質量分析のステーションおよび／または構成要素；ならびに前述の試験試料中のプロゲステロン代謝産物の存在または量を決定するためのステーションおよび／または構成要素を含む、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品である。
【0171】
例示的な実施形態４４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、プロゲステロン代謝産物はプロゲステロンスルファートである。
【0172】
例示的な実施形態４５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、プロゲステロンスルファートは、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール（ＰＭ３Ｓ）；５α－プレグナン－３α－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ４Ｓ）；５α－プレグナン－３β－オール－２０－オンスルファート（ＰＭ５Ｓ）；５α－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ２ＤｉＳ）；または５β－プレグナン－３α，２０α－ジオールジスルファート（ＰＭ３ＤｉＳ）のうちの少なくとも１つを含む。
【0173】
例示的な実施形態４６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、ＰＭ３Ｓを個別に測定し、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを同時に測定し、ＰＭ２ＤｉＳおよびＰＭ３ＤｉＳを同時に測定する。
【0174】
例示的な実施形態４７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、質量分析はタンデム質量分析である。
【0175】
例示的な実施形態４８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、タンデム質量分析はトリプル四重極タンデム質量分析である。
【0176】
例示的な実施形態４９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、必要に応じてイオン合計を使用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、プリカーサーイオンおよび／またはプロダクトイオンを選択する。
【0177】
例示的な実施形態５０は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、ＰＭ３Ｓを、３９９．４００→９７．１００のトランジションについての分析物のピークを使用してＭＲＭによって測定する。
【0178】
例示的な実施形態５１は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、ＰＭ４ＳおよびＰＭ５Ｓを、ＰＭ５Ｓについては３９７．３→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用し、ＰＭ４Ｓについては３９７．２→９７．０のトランジションについての分析物のピークを使用したＭＲＭによって別々または共に測定する。
【0179】
例示的な実施形態５２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、ＰＭ２ＤｉＳおよび／またはＰＭ３ＤｉＳを、イオン合計を使用したＭＲＭによって測定する。
【0180】
例示的な実施形態５３は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、４７９．０９８→３８１．２＋４７９．０９９→３８１．２＋４７９．１００→３８１．２＋４７９．１０１→３８１．２＋４７９．１０２→３８１．２のトランジションの合計をＰＭ２ＤｉＳの検出のために使用する。
【0181】
例示的な実施形態５４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、４７９．０９８→３９９．１＋４７９．０９９→３９９．１＋４７９．１００→３９９．１＋４７９．１０１→３９９．１＋４７９．１０２→３９９．１のトランジションの合計をＰＭ３ＤｉＳの検出のために使用し得る。
【0182】
例示的な実施形態５５は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、試料を、最初の断片化工程（ａ）の前に精製工程に供する。
【0183】
例示的な実施形態５６は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、精製工程はクロマトグラフィーを含む。
【0184】
例示的な実施形態５７は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはハイスループット液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【0185】
例示的な実施形態５８は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、クロマトグラフィー前に試料の希釈および／またはタンパク質沈殿のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0186】
例示的な実施形態５９は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、安定同位体で標識された内部標準の添加をさらに含む。
【0187】
例示的な実施形態６０は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、安定同位体で標識された内部標準は、ＰＭ３Ｓ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ５Ｓ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３β－オール－２０－オン－［２，２，４，４－ｄ４］スルファート）；ＰＭ２ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５α－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）；および／またはＰＭ３ＤｉＳ－ｄ４（すなわち、５β－プレグナン－３α，２０α－ジオール－［２，２，４，４－ｄ４］ジスルファート）のうちの少なくとも１つを含む。
【0188】
例示的な実施形態６１は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、試料は血清または血漿である。
【0189】
例示的な実施形態６２は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、プロゲステロンスルファートのＬＬＯＱは、１００μＬの試料あたり１ｎｇである。
【0190】
例示的な実施形態６３は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、プロゲステロンスルファートのＵＬＯＱは、１００μＬの試料あたり５００ｎｇである。
【0191】
例示的な実施形態６４は、任意の前述または後述の例示的な実施形態のコンピュータプログラム製品であり、ここで、プロゲステロンスルファート量を使用して、皮膚の妊娠性掻痒症が（ＩＣＰ）の初期徴候であるのか、あるいは被験体における良性妊娠性掻痒症に起因するのかを区別する。
【0192】
本開示の種々の実施形態が本明細書中に記載されている。これらの実施形態が単に本開示の例示にすぎないと認識すべきである。前述の説明の読了後に、好ましい実施形態の変形形態が当業者に明らかとなり得る。当業者がかかる変形形態を適宜使用することができ、本開示が本明細書中の具体的記載とは異なって実施されることが意図されると予想される。したがって、本開示は、適用法に認められた本明細書に添付のクレームに記載の発明の主題の全ての修正形態および均等物を含む。さらに、その全ての可能な変形形態中の上記要素の任意の組み合わせは、別段の指示が無い限り、あるいは、文脈と明確に矛盾しない限り、本開示に包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】