特表 2024-543000 操作されたＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】操作されたＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20241112BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241112BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 130Z

C12N15/113 140Z

C12N15/88 Z

C12N15/85 Z

C12N15/86 Z

C12N15/11 Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

A61K31/7105

A61K35/76

A61P25/00

A61P21/00

A61P27/02

A61P3/00

A61P1/16

A61P35/00

A61P25/28

A61P25/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525333

(86)(22)【出願日】2022-10-27

(85)【翻訳文提出日】2024-06-25

(86)【国際出願番号】 US2022078801

(87)【国際公開番号】W WO2023077013

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/272,418

(32)【優先日】2021-10-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/277,662

(32)【優先日】2021-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/333,256

(32)【優先日】2022-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522217854

【氏名又は名称】シェイプ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バーン， スーザン

(72)【発明者】

【氏名】ブース， ブライアン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】サリバン， リチャード トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ブリッグス， エイドリアン ランガム

(72)【発明者】

【氏名】サバ， イアニス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA23

4B065CA44

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA56

4C086MA57

4C086MA58

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA16

4C086ZA33

4C086ZA75

4C086ZA94

4C086ZB26

4C086ZC21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA56

4C087MA57

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA16

4C087ZA33

4C087ZA75

4C087ZA94

4C087ZB26

4C087ZC21

(57)【要約】

対象における疾患または状態の治療のための操作されたＲＮＡ及びそれを含む組成物が本明細書に開示される。操作されたＲＮＡ、記載される操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に記載される医薬組成物を投与することによって、対象における疾患または状態を治療する方法もまた、本明細書に開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）標的ＲＮＡに対して相補性を有する標的化配列と、
（ｂ）
（ｉ）ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１）またはＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２）に対して最大９０．９％の配列同一性を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び
（ｉｉ）ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）に対して最大９６．８％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）に対して最大９６．９％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む、ＲＮＡエレメントと、を含む、操作されたＲＮＡ。

【請求項2】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、ＲＮＡ配列決定によって決定してる、前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を欠く以外は同等のＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集の量の増加を容易にする、請求項１に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項3】

前記標的ＲＮＡが、疾患または状態と関連しており、前記疾患または状態が、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項4】

前記標的ＲＮＡが、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、テイ・サックス病、ヒト免疫不全ウイルス、家族性高コレステロール血症、糖尿病、及びがんからなる群から選択される疾患または状態と関連している、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項5】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号２に対して最大９０．９％の配列同一性を有する前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項6】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列の５’末端が、配列番号２に対して添加されたＵまたはＣを含む、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項7】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号３９を含む、請求項６に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項8】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列の３’末端が、配列番号２に対して添加されたＵまたはＡを含む、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項9】

配列番号２のヌクレオチド３、４、５、６、及び７が、各々、Ｕを含み、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項10】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号２のヌクレオチド８においてＧからＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項11】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号２のヌクレオチド９においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項12】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号２のヌクレオチド１０においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項13】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号２のヌクレオチド１１においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである、請求項５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項14】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２を含む、請求項１３に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項15】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号１に対して最大９０．９％の配列同一性を有する前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項16】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号１のヌクレオチド６においてＧからＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号１の第１のヌクレオチドである、請求項１５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項17】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号１のヌクレオチド１においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、５’末端における配列番号１の第１のヌクレオチドである、請求項１５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項18】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号１または配列番号２と比較して、２つ、３つまたは４つのポリヌクレオチド置換を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項19】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号３に対して最大９６．８％の配列同一性を有する前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項20】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド３においてＧ挿入を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項21】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４４を含む、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項22】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド２においてＡからＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項23】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４３を含む、請求項２２に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項24】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド５においてＵからＧ、Ｃ、またはＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項25】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４５を含む、請求項２４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項26】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド６においてＵからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項27】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４６を含む、請求項２６に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項28】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド８においてＵからＧ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項29】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド１０においてＵからＣまたはＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項30】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４７を含む、請求項２９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項31】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド１１においてＧからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項32】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３のヌクレオチド１２においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１が、前記５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項33】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４８を含む、請求項３２に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項34】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３と比較して２～１５個のポリヌクレオチド置換を有する、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項35】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３と比較して２、３、５、または１０個のポリヌクレオチド置換を有する、請求項１９に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項36】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４に対して最大９６．９％の配列同一性を有する前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項37】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号４と比較して２～１５個のポリヌクレオチド置換を有する、請求項３６に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項38】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号４と比較して２、３、５、または１０個のポリヌクレオチド置換を有する、請求項３６に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項39】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、ＡＡＵＵＵＮ_１ＵＮ_２Ｎ_３ＡＧ（配列番号７）と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含み、
Ｎ_１、Ｎ_２、及びＮ_３の各々が、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、
配列番号７のＮ_１がＧである場合、Ｎ_２が、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３が、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２及びＮ_３のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号７のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１が、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_１が、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_２がＧである場合、Ｎ_１が、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_１が、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号７のＮ_３がＵである場合、Ｎ_１が、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_２が、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、または配列番号７のＮ_３がＧである場合、Ｎ_１が、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２が、Ａ、Ｕ、もしくはＣである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項40】

前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、Ｎ_１ＡＧＧＮ_２ＵＵＵＣＵＧＮ_３ＣＵＵＮ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７ＣＮ_８ＧＮ_９ＡＡＡＮ_１０ＣＣＣＮ_１１Ｎ_１２（配列番号８）と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含み、
Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、Ｎ_７、Ｎ_８、Ｎ_９、Ｎ_１０、Ｎ_１１、及びＮ_１２の各々が、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、
配列番号８のＮ_１がＣである場合、Ｎ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_４及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_８及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、あるいは
配列番号８のＮ_３がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_９は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_３がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_９及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_４がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_４がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_５がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_６及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_５がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_６がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_６がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_７がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_７がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つであり、あるいは
配列番号８のＮ_８がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_６のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_８がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_９がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_９がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_１０がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_４のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２が、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１０がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_１１がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_７のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１１がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは
配列番号８のＮ_１２が存在しない場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つが、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号８のＮ_１２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_６のうちの少なくとも１つ、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣである、請求項１～４１のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項41】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号４９または配列番号６０を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項42】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号５０または配列番号６１を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項43】

前記ＲＮＡエレメントが、配列番号５１または配列番号６２を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項44】

前記標的化配列が、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、ミスマッチ、バルジ、内部ループ、ヘアピン、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される構造的特徴を含むガイド－標的ＲＮＡ足場を形成し、前記構造的特徴が、前記標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に実質的に形成され、前記構造的特徴が、操作されたガイドＲＮＡの前記標的ＲＮＡへの前記ハイブリダイゼーション前に前記操作されたガイドＲＮＡ内に存在しない、請求項１～４３のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項45】

前記構造的特徴が、ミスマッチを含む、請求項４４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項46】

前記ミスマッチが、少なくとも１つのアデノシン－グアノシン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデノシン－アデノシン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、または少なくとも１つのアデノシン－シチジン（Ａ－Ｃ）を含み、アデノシンが、前記標的ＲＮＡ中に存在する、請求項４５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項47】

前記ミスマッチが、Ａ－Ｃミスマッチを含み、前記アデノシンが、前記標的ＲＮＡ中に存在する、請求項４５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項48】

前記構造的特徴が、前記バルジを含む、請求項４４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項49】

前記バルジが、非対称バルジを含む、請求項４８に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項50】

前記バルジが、対称バルジを含む、請求項４８に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項51】

前記構造的特徴が、前記内部ループを含む、請求項４４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項52】

前記内部ループが、非対称内部ループを含む、請求項５１に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項53】

前記内部ループが、対称内部ループを含む、請求項５１に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項54】

前記構造的特徴が、前記ヘアピンを含む、請求項４４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項55】

前記ヘアピンが、約３塩基～約１５塩基長の長さを含む、請求項５４に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項56】

前記操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び前記操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、前記ミスマッチの３’である、請求項４５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項57】

前記操作されたＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチドによってコードされている、請求項１～５６のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項58】

前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターが、Ｕ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５７に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項59】

前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターが、Ｕ７プロモーターである、請求項５８に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項60】

前記ミスマッチの３’であるターミネータを更に含む、請求項４５に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項61】

前記ターミネータが、Ｕ７ボックスターミネータである、請求項６０に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項62】

前記ターミネータが、切断型ターミネータである、請求項６０に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項63】

前記ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質を含む、請求項２～６２のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項64】

前記ＡＤＡＲタンパク質が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６３に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項65】

前記標的ＲＮＡが、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、またはＳＯＤ１、これらのいずれか１つの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項66】

前記標的ＲＮＡが、ＡＢＣＡ４であり、前記ＡＢＣＡ４が、Ｇ６３２０Ａ、Ｇ５７１４Ａ、Ｇ５８８２Ａ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される変異を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項67】

前記操作されたＲＮＡが、ＲＮＡ編集エンティティによる前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され、その結果、前記編集された標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質が、前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集から生成される修飾されたＡＰＰポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸残基の差異が、前記ＡＰＰポリペプチドのＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、Ｋ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、Ｔ７１４Ｘ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項68】

前記標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１が、Ｇ９９８９Ａの変異を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項69】

標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１が、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質中のＥ３４２Ｋの変異をコードする、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項70】

前記標的ＲＮＡが、ＬＲＲＫ２であり、前記ＬＲＲＫ２が、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質中の変異をコードし、前記変異が、Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｎ１４３７Ｈ、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、Ｑ２４９０Ｎ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項71】

前記標的ＲＮＡが、ＳＮＣＡであり、前記ＳＮＣＡが、コドン１における翻訳開始部位（ＴＩＳ）ＡＵＧ～ＧＴＧ、コドン５におけるＴＩＳ ＡＵＧ、エクソン２における２６５位におけるＡＵＧ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡ編集のための変異を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項72】

前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して標的相補性を有する、請求項１～７１のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項73】

前記標的化配列が、
（ａ）前記標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して標的相補性を有するか、または
（ｂ）前記標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して標的相補性を有する、請求項１～７２のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項74】

前記ミスマッチが、前記標的化配列のいずれかの末端から１塩基～約２００塩基に位置する、請求項４４～７３のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項75】

前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対して標的相補性を有する、請求項１～７４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項76】

前記標的化配列が、翻訳開始部位に対して標的相補性を有する、請求項１～７５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項77】

前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡのイントロン領域に対して標的相補性を有する、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項78】

前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡのエクソン領域に対して標的相補性を有する、請求項１～７７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項79】

前記操作されたＲＮＡが、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド長である、請求項１～７８のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項80】

前記操作されたＲＮＡが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項１～７８のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項81】

前記ＡＳＯが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項８０に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項82】

前記少なくとも１つの化学修飾が、５’アデニレート、５’グアノシン－トリホスフェートキャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－トリホスフェートキャップ、５’トリホスフェートキャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ_１２スペーサー、Ｃ_３スペーサー、Ｃ_６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’修飾、５’－５’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、２－Ｏ－メチル ３ホスホロチオエート、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む、請求項８１に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項83】

前記ＡＳＯが、約１０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド長である、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項84】

前記ＡＳＯが、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド長である、請求項８３に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項85】

前記ＡＳＯが、前記標的ＲＮＡに完全に相補的である、請求項８０～８４のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項86】

前記ＡＳＯが、前記標的ＲＮＡの標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように構成されている、請求項８０～８５のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項87】

前記操作されたＲＮＡが、環化操作されたＲＮＡである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ。

【請求項88】

請求項１～７９または８７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項89】

請求項１～８７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ、または請求項８８に記載のポリヌクレオチドを含む、送達ビヒクル。

【請求項90】

前記送達ビヒクルが、ベクター、リポソーム、粒子、デンドリマー、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８９に記載の送達ビヒクル。

【請求項91】

前記送達ビヒクルが、ウイルスベクターである、請求項８９または９０に記載の送達ビヒクル。

【請求項92】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはその誘導体である、請求項９１に記載の送達ビヒクル。

【請求項93】

前記ＡＡＶベクター、その誘導体、またはこれらのいずれかのハイブリッドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶｈｕ６８、これらのいずれかの誘導体、及びこれらのいずれかのハイブリッドからなる群から選択される、請求項９２に記載の送達ビヒクル。

【請求項94】

前記ＡＡＶベクターまたはその誘導体が、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、キメラＡＡＶベクター、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９３に記載の送達ビヒクル。

【請求項95】

医薬組成物であって、
（ａ）請求項１～８７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ、請求項８８に記載のポリヌクレオチド、または請求項８９～９４のいずれか１項に記載の送達ビヒクル、及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、前記医薬組成物。

【請求項96】

単位用量形態である、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項97】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記対象に、前記対象における前記疾患または状態を治療するために、有効量の請求項１～８７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ、請求項８８に記載のポリヌクレオチド、請求項８９～９４のいずれか１項に記載の送達ビヒクル、または請求項９５もしくは９６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項98】

前記疾患または状態が、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記疾患または状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症様疾患、ウィルソン病、及びシュタルガルト病からなる群から選択される、請求項９７または９８に記載の方法。

【請求項100】

前記疾患または状態が、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子における変異、または前記遺伝子によってコードされるＲＮＡと関連している、請求項９７～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記投与することが、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、注射（例えば、脳実質注射、鞘内注射、心室内注射、槽内注射、静脈内注射）、間質内、眼窩内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心臓内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、脳実質内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、定位式、もしくはこれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらによるものである、請求項９７～１００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項102】

前記対象が、ヒトである、請求項９７～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

前記対象が、前記方法を必要とする対象である、請求項９７～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

前記対象が、前記疾患または状態を有すると診断されている、請求項９７～１０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

対象において疾患または状態の治療において使用するための、請求項１～８７のいずれか１項に記載の操作されたＲＮＡ、請求項８８に記載のポリヌクレオチド、請求項８９～９４のいずれか１項に記載の送達ビヒクル、または請求項９５もしくは９６に記載の医薬組成物。

【請求項106】

前記疾患または状態が、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１０５に記載の使用のための、前記操作されたＲＮＡ、前記送達ビヒクル、または前記医薬組成物。

【請求項107】

前記疾患または状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症様疾患、ウィルソン病、及びシュタルガルト病からなる群から選択される、請求項１０５または１０６に記載の使用のための、前記操作されたＲＮＡ、前記送達ビヒクル、または前記医薬組成物。

【請求項108】

前記疾患または状態が、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子における変異、または前記遺伝子によってコードされるＲＮＡと関連している、請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の使用のための、前記操作されたＲＮＡ、前記送達ビヒクル、または前記医薬組成物。

【請求項109】

前記投与することが、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、注射（例えば、脳実質注射、鞘内注射、心室内注射、槽内注射、静脈内注射）、間質内、眼窩内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心臓内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、脳実質内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、定位式、もしくはこれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらによるものである、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の使用のための、前記操作されたＲＮＡ、前記送達ビヒクル、または前記医薬組成物。

【請求項110】

前記対象が、ヒトである、請求項１０５～１０９のいずれか１項に記載の使用のための、前記操作されたＲＮＡ、前記送達ビヒクル、または前記医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条の下で２０２１年１０月２７日に出願された仮出願第６３／２７２，４１８号、２０２１年１１月１０日に出願された仮出願第６３／２７７，６６２号、及び２０２２年４月２１日に出願された仮出願第６３／３３３，２５６号に基づく優先権を主張し、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0002】

（ａ）標的ＲＮＡに対して相補性を有する標的化配列と、（ｂ）（ｉ）ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１）またはＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２）に対して最大９０．９％の配列同一性を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び（ｉｉ）ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）に対して最大９６．８％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）に対して最大９６．９％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む、ＲＮＡエレメントと、を含む操作されたＲＮＡが本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＲＮＡ配列決定によって決定して、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を欠く以外は同等のＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集の量の増加を容易にする。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、疾患または状態と関連しており、疾患または状態は、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、テイ・サックス病、ヒト免疫不全ウイルス、家族性高コレステロール血症、糖尿病、及びがんからなる群から選択される疾患または状態と関連している。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号２に対して最大９０．９％の配列同一性を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列の５’末端は、配列番号２に対して添加されたＵまたはＣを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号３９を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列の３’末端は、配列番号２に対して添加されたＵまたはＡを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２のヌクレオチド３、４、５、６、及び７は、各々、Ｕを含み、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２のヌクレオチド８においてＧからＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２のヌクレオチド９においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２のヌクレオチド１０においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２のヌクレオチド１１においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号２の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号１に対して最大９０．９％の配列同一性を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１のヌクレオチド６においてＧからＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号１の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１のヌクレオチド１においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号１の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１または配列番号２と比較して、２つ、３つまたは４つのポリヌクレオチド置換を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号３に対して最大９６．８％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド３においてＧ挿入を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４４を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド２においてＡからＵ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４３を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド５においてＵからＧ、Ｃ、またはＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４５を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド６においてＵからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４６を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド８においてＵからＧ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１０においてＵからＣまたはＡ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４７を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１１においてＧからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１２においてＡからＣ置換を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有し、ヌクレオチド１は、５’末端における配列番号３の第１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４８を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３と比較して２～１５個のポリヌクレオチド置換を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３と比較して、２、３、５、または１０個のポリヌクレオチド置換を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４に対して最大９６．９％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号４と比較して、２～１５個のポリヌクレオチド置換を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号４と比較して２、３、５、または１０個のポリヌクレオチド置換を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＮ_１ＵＮ_２Ｎ_３ＡＧ（配列番号７）と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含み、Ｎ_１、Ｎ_２、及びＮ_３の各々は、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、配列番号７のＮ_１がＧである場合、Ｎ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２及びＮ_３のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_１は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_２がＧである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_３がＵである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、または配列番号７のＮ_３がＧである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＣである。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、Ｎ_１ＡＧＧＮ_２ＵＵＵＣＵＧＮ_３ＣＵＵＮ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７ＣＮ_８ＧＮ_９ＡＡＡＮ_１０ＣＣＣＮ_１１Ｎ_１２（配列番号８）と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含み、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、Ｎ_７、Ｎ_８、Ｎ_９、Ｎ_１０、Ｎ_１１、及びＮ_１２の各々は、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、配列番号８のＮ_１がＣである場合、Ｎ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_４及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９


のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_８及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、あるいは配列番号８のＮ_３がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_９は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_３がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_９及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_４がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_４がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_５がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_６及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_５がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_６がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_６がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_７がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_７がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つであり、あるいは配列番号８のＮ_８がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_６のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_８がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_９がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_９がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１０がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_４のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２が、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１０がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１１がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_７のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１１がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１２が存在しない場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号８のＮ_１２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_６のうちの少なくとも１つ、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、


Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４９または配列番号６０を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５０または配列番号６１を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５１または配列番号６２を含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、ミスマッチ、バルジ、内部ループ、ヘアピン、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される構造的特徴を含むガイド－標的ＲＮＡ足場を形成し、構造的特徴は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に実質的に形成され、構造的特徴は、操作されたガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション前に操作されたガイドＲＮＡ内に存在しない。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、ミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、少なくとも１つのアデノシン－グアノシン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデノシン－アデノシン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、または少なくとも１つのアデノシン－シチジン（Ａ－Ｃ）を含み、アデノシンは、標的ＲＮＡ中に存在する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ－Ｃミスマッチを含み、アデノシンは、標的ＲＮＡ中に存在する。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、バルジを含む。いくつかの実施形態において、バルジは、非対称バルジを含む。いくつかの実施形態において、バルジは、対称バルジを含む。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、内部ループを含む。いくつかの実施形態において、内部ループは、非対称内部ループを含む。いくつかの実施形態において、内部ループは、対称内部ループを含む。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、ヘアピンを含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、約３塩基～約１５塩基長の長さを含む。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ミスマッチの３’である。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターは、Ｕ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターは、Ｕ７プロモーターである。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、ミスマッチの３’であるターミネータを更に含む。いくつかの実施形態において、ターミネータは、Ｕ７ボックスターミネータである。いくつかの実施形態において、ターミネータは切断型ターミネータである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲタンパク質は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、またはＳＯＤ１、これらのいずれか１つの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４であり、ＡＢＣＡ４は、Ｇ６３２０Ａ、Ｇ５７１４Ａ、Ｇ５８８２Ａ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される変異を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され、その結果、編集された標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質は、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集から生成される修飾されたＡＰＰポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含み、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異は、ＡＰＰポリペプチドのＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、Ｋ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、Ｔ７１４Ｘ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、ＳＥＲＰＩＮＡ１は、Ｇ９９８９Ａの変異を含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、ＳＥＲＰＩＮＡ１は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質中のＥ３４２Ｋの変異をコードする。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＬＲＲＫ２であり、ＬＲＲＫ２は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質中の変異をコードし、変異は、Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｎ１４３７Ｈ、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、Ｑ２４９０Ｎ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＮＣＡであり、ＳＮＣＡは、コドン１における翻訳開始部位（ＴＩＳ）ＡＵＧ～ＧＴＧ、コドン５におけるＴＩＳ ＡＵＧ、エクソン２における２６５位におけるＡＵＧ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡ編集のための変異を含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、標的化配列は、（ａ）標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して標的相補性を有するか、または（ｂ）標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から１塩基～約２００塩基に位置する。いくつかの実施形態において、標的化配列は、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、標的化配列は、翻訳開始部位に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、標的化配列は、標的ＲＮＡのイントロン領域に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、標的化配列は、標的ＲＮＡのエクソン領域に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾は、５’アデニレート、５’グアノシン－トリホスフェートキャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－トリホスフェートキャップ、５’トリホスフェートキャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ_１２スペーサー、Ｃ_３スペーサー、Ｃ_６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’修飾、５’－５’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、２－Ｏ－メチル ３ホスホロチオエート、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、約１０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、標的ＲＮＡに対して完全に相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、標的ＲＮＡの標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように構成されている。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、環化操作されたＲＮＡである。

【0003】

本明細書に記載の操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドもまた、本明細書に開示される。

【0004】

本明細書に記載の操作されたＲＮＡ、または本明細書に記載の操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、送達ビヒクルもまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、ベクター、リポソーム、粒子、デンドリマー、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクター、その誘導体、またはこれらのいずれかのハイブリッドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶｈｕ６８、これらのいずれかの誘導体、及びこれらのいずれかのハイブリッドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターまたはその誘導体は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、キメラＡＡＶベクター、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0005】

（ａ）本明細書に記載の操作されたＲＮＡ、本明細書に記載のポリヌクレオチド、または本明細書に記載の送達ビヒクル、及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、医薬組成物もまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、単位用量形態である。

【0006】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、対象に、対象における疾患または状態を治療するために、有効量の本明細書に記載の操作されたＲＮＡ、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の送達ビヒクル、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法もまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症様疾患、ウィルソン病、及びシュタルガルト病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子における変異、または該遺伝子によってコードされるＲＮＡと関連している。いくつかの実施形態において、投与することは、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、注射（例えば、脳実質注射、鞘内注射、心室内注射、槽内注射、静脈内注射）、間質内、眼窩内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心臓内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、脳実質内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、定位式、もしくはこれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらによるものである。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、それを必要とする対象である。いくつかの実施形態において、対象は、疾患または状態を有すると診断されている。

【0007】

対象の疾患または状態の治療において使用するための、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の送達ビヒクル、または本明細書に記載の医薬組成物もまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症様疾患、ウィルソン病、及びシュタルガルト病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子における変異、または該遺伝子によってコードされるＲＮＡと関連している。いくつかの実施形態において、投与することは、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、注射（例えば、脳実質注射、鞘内注射、心室内注射、槽内注射、静脈内注射）、間質内、眼窩内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心臓内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、脳実質内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、定位式、もしくはこれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらによるものである。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。

【0008】

本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。本開示の例示的な原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添加の図面を参照することにより、本開示の特徴及び利点のより良好な理解が得られる：

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】Ａは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｃは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｄは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。

【図1B】Ａは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｃは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｄは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。

【図1C】Ａは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｃは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｄは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。

【図1D】Ａは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｃは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。Ｄは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンのための例示的な変異誘発ライブラリスクリーンを示し、単一塩基置換（実線の枠）、対形成されたヘアピン置換（点線の枠）、及び余分な重複塩基（破線の枠）を強調する。

【図2A】マウスＵ７（ｍＵ７）ヘアピンまたはヒトＵ７（ｈＵ７）ヘアピン配列を有するＳｍＯＰＴ配列のガイドＲＮＡ変異、及び修飾されていないＳｍＯＰＴ ｍＵ７ガイドＲＮＡに正規化したときの倍数変化編集効率に対する変異効果を示す。

【図2B】ｍＵ７ヘアピンを有するＵ１Ｓｍ配列またはｍＵ７ヘアピンを有するＵ７Ｓｍ配列のガイドＲＮＡ変異、及び修飾されていないＳｍＯＰＴ ｍＵ７ガイドＲＮＡに対して正規化された倍数変化編集効率に対する変異効果を示す。

【図2C】ＳｍＯＰＴによるｍＵ７ヘアピン配列の変異、またはＳｍＯＰＴによるｈＵ７ヘアピン配列の変異、及び修飾されていないＳｍＯＰＴ ｍＵ７ガイドＲＮＡに対して正規化された倍数変化編集効率の変異効果を示す。

【図2D】標的ＲＮＡの編集の増加に関連するＳｍＯＰＴ及びｍＵ７における変異を示す。左側のグラフは、ライブラリスクリーンからの編集データの割合を示し、右側のグラフは、個々の単一コピーのトランスフェクションからの編集データの割合を示す。

【図3】互いに組み合わせて試験した標的ＲＮＡの編集の増加に関連するＳｍＯＰＴ及びｍＵ７ヘアピンにおける代表的な個々の変異を示す。

【図4】ＲＮＡ編集のためのより広範囲の遺伝子標的に対して試験された例示的なＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン組み合わせバリアントを示す。ガイドＲＮＡ発現コンストラクトは、プラスミド一過性トランスフェクションについては２日目に、単一コピーゲノム統合については１３日目に評価された。

【図5】ＲＮＡ編集に関係なく、エクソンスキッピング遺伝子標的に対して試験された例示的なＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン組み合わせバリアントを示す。ガイドＲＮＡ発現コンストラクトは、プラスミド一過性トランスフェクションについては２日目に、単一コピーゲノム統合については１３日目に評価された。

【図6】分化した筋肉細胞における臨床的に関連するＤＭＤエクソンスキッピングのためにアンチセンスオリゴヌクレオチド上で試験した、例示的なＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン組み合わせバリアントを示す。ガイドＲＮＡ発現構築物をゲノムに無作為に組み込んで、１０日間の筋細胞分化後に評価した。

【発明を実施するための形態】

【0010】

標的ＲＮＡ中の変異に関連する疾患の治療のために、本明細書に記載のＲＮＡエレメントを含有する操作されたＲＮＡが本明細書に開示される。そのような疾患の治療に有用なＲＮＡエレメントを含有する操作されたＲＮＡの例としては、操作されたガイドＲＮＡ及び化学的に合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられる。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））を使用して、標的ＲＮＡのアデノシンの部位特異的編集のために利用され得る。いくつかの場合において、ＡＳＯは、ＲＮＡ相互作用、プロセシング、発現、またはこれらの組み合わせを変化させるために、標的ＲＮＡに結合するために利用され得る（標的ＲＮＡをブロックするか、またはカバーする）。本明細書に記載されるように、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））は、Ｓｍ－またはＳｍ－様結合ドメインコンセンサス配列（ＳｍＯＰＴバリアント配列）のバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはこれらの組み合わせなどの異種操作されたＲＮＡエレメントに作動可能に連結される。

【0011】

ＲＮＡエレメント
本開示のＲＮＡエレメントは、本明細書に記載される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはこれらの組み合わせを含み、ＲＮＡエレメントは、本明細書の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）に作動可能に連結され得る。本開示のいくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡエレメントは、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、例えば、配列番号１のＳｍタンパク質結合ドメイン配列（ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ）または配列番号２のＳｍＯＰＴ配列（ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ）を除外し、代わりに、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を形成する、配列番号２のＳｍＯＰＴ配列のバリアント（ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ）を含む、最適化ＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインの改変またはバリアントであり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡエレメントは、本明細書に記載の配列番号３（マウス：ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ）または配列番号４（ヒト：ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ）のＵ７ヘアピン配列の改変またはバリアントを含む、操作されたＵ７ヘアピンバリアントであり得る。

【0012】

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＲＮＡエレメント、例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または配列番号２のＳｍＯＰＴ配列のバリアントを含み得る。本明細書で使用される場合、「操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列」とは、天然に存在する配列または修飾されていないＳｍＯＰＴ配列（配列番号２）と比較して天然に存在しないＳｍＯＰＴ配列、修飾された配列、またはバリアント配列を意味し、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、野生型、天然に存在する、または修飾されていない配列と比較して、ポリヌクレオチド置換または少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）、１１個以下（例えば１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～１０個（例えば２～９、３～８、４～７、５～６）を含み得る。本明細書で使用される「操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列」は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、配列番号２に対して最大９０．９％の配列同一性を有するか、またはそれを含む、ＳｍＯＰＴ配列（ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ、配列番号２）の改変を含む操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧを指すことができる。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２に対して少なくとも約９％の配列同一性を有する。他の実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号２に対して約９％～９０．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、修飾されていない配列番号２と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、１０個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～１０個のポリヌクレオチド置換を含み得る。

【0013】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列Ｎ_０ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８２）を含み得、Ｎ_０は、存在しないか、またはＵであり、Ｎ_９またはＮ_１１は、Ｇ、Ａ、ＣまたはＵである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、Ｎ_０ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８２）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_０は、存在しないか、またはＵもしくはＡであり、Ｎ_９またはＮ_１１は、Ｇ、Ａ、ＣまたはＵである。

【0014】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列Ｎ_０ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８２）を含み得、Ｎ_０は、存在しないか、またはＵであり、Ｎ_９またはＮ_１１は、Ｇ、Ａ、ＣまたはＵであり、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２ではない。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、Ｎ_０ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８２）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_０は、存在しないか、またはＵであり、Ｎ_９またはＮ_１１は、Ｇ、Ａ、ＣまたはＵであり、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２ではない。

【0015】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８３）を含み得、Ｎ_１１は、Ａ、ＣまたはＵである。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＮ_９ＡＮ_１１（配列番号８３）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_９またはＮ_１１は、Ａ、ＣまたはＵである。

【0016】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列ＵＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号８４）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＵＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号８４）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0017】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＣ（配列番号８５）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＣ（配列番号８５）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0018】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＵ（配列番号８６）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＵ（配列番号８６）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。（配列番号８６）。

【0019】

好ましい実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ポリヌクレオチド配列ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＡ（配列番号８７）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＡ（配列番号８７）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0020】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＮ_２ＧＧＮ_５Ｎ_６Ｎ_７ＵＵＣＮ_１１ＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＮ_２２ＧＡＡＮ_２６Ｎ_２７ＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８８）を含み得、Ｎ_２は、ＡまたはＵであり、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_６は、ＵまたはＡであり、Ｎ_７は、ＵまたはＣであり、Ｎ_１１は、ＡまたはＵであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２２は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２６は、ＡまたはＧであり、Ｎ_２７は、ＡまたはＵであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないかのいずれかである。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＮ_２ＧＧＮ_５Ｎ_６Ｎ_７ＵＵＣＮ_１１ＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＮ_２２ＧＡＡＮ_２６Ｎ_２７ＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８８）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_２は、ＡまたはＵであり、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_６は、ＵまたはＡであり、Ｎ_７は、ＵまたはＣであり、Ｎ_１１は、ＡまたはＵであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２２は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２６は、ＡまたはＧであり、Ｎ_２７は、ＡまたはＵであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないかのいずれかである。

【0021】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＮ_２ＧＧＮ_５Ｎ_６Ｎ_７ＵＵＣＮ_１１ＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＮ_２２ＧＡＡＮ_２６Ｎ_２７ＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８８）を含み得、Ｎ_２は、ＡまたはＵであり、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_６は、ＵまたはＡであり、Ｎ_７は、ＵまたはＣであり、Ｎ_１１は、ＡまたはＵであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２２は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２６は、ＡまたはＧであり、Ｎ_２７は、ＡまたはＵであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないかのいずれかであり、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３ではない。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＮ_２ＧＧＮ_５Ｎ_６Ｎ_７ＵＵＣＮ_１１ＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＮ_２２ＧＡＡＮ_２６Ｎ_２７ＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８８）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_２は、ＡまたはＵであり、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_６は、ＵまたはＡであり、Ｎ_７は、ＵまたはＣであり、Ｎ_１１は、ＡまたはＵであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２２は、ＵまたはＧであり、Ｎ_２６は、ＡまたはＧであり、Ｎ_２７は、ＡまたはＵであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないかのいずれかであり、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３ではない。

【0022】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＮ_５ＵＵＵＵＣＵＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８９）を含み得、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣのいずれかであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧのいずれかであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないか、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３ではない。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＮ_５ＵＵＵＵＣＵＧＮ_１３ＣＵＵＣＧＧＮ_２０ＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＮ_３２Ｕ（配列番号８９）に対する少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得、Ｎ_５は、存在しないかまたはＧのいずれかであり、Ｎ_１３は、ＡまたはＣのいずれかであり、Ｎ_２０は、ＵまたはＧのいずれかであり、Ｎ_３２は、Ｕであるかまたは存在しないか、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３ではない。

【0023】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＵＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９０）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＵＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９０）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0024】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９１）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９１）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0025】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＡＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＵＣＣＣＣＵ（配列番号９２）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＡＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＵＣＣＣＣＵ（配列番号９２）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0026】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＵＣＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＵ（配列番号９３）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＵＣＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＵ（配列番号９３）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0027】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９４）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９４）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0028】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９５）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９５）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0029】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＵＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９６）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＵＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９６）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0030】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９７）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９７）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0031】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＡＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９８）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＡＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号９８）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0032】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ポリヌクレオチド配列ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＡＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９９）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、ＣＡＧＧＧＵＵＵＵＣＡＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＵＧＡＡＡＡＣＣＣＣＣＵ（配列番号９９）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0033】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８２のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0034】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８３のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0035】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８４のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0036】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８５のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0037】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８６のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0038】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号８７のポリヌクレオチド配列を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント、及び配列番号８８～９９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0039】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、または配列番号５９のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0040】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４９のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号４９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0041】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５０のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0042】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５１のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号５１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＤＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0043】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６０のポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0044】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６１のポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0045】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエレメントは、配列番号６２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（ＲＮＡとして発現される）を有する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。

【0046】

本開示のいくつかの例は、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または配列番号３もしくは配列番号４のＵ７ヘアピン配列のバリアントもしくは改変等のＲＮＡエレメントを含む、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。本明細書で使用される「操作されたＵ７ヘアピンバリアント」という語句は、天然に存在するヘアピン配列もしくは修飾されていないヘアピン配列と比較して、天然に存在しないヘアピン、修飾されたヘアピン、またはバリアントヘアピン配列を意味し、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、野生型、天然に存在する、または修飾されていない配列、例えば、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）のマウスＵ７ヘアピン配列と比較して、ポリヌクレオチド置換、または少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）、３０個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～３０個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～２９、３～２８、４～２７、５～２６、６～２５、７～２４、８～２３、９～２２、１０～２１、１１～２０、１２～１９、１３～１８、１４～１７、１５～１６）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、野生型、天然に存在する、または修飾されていない配列、例えば、ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）のヒトＵ７ヘアピン配列と比較して、ポリヌクレオチド置換または少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１）、３１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～３１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～３０、３～２９、４～２８、５～２７、６～２６、７～２５、８～２４、９～２３、１０～２２、１１～２１、１２～２０、１３～１９、１４～１８、１５～１７）を含む。いくつかの態様において、本明細書で使用される「操作されたＵ７ヘアピンバリアント」は、マウスＵ７ヘアピン配列のバリアント（ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３））、またはヒトＵ７ヘアピン配列のバリアント（ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４））を含み、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列が、配列番号３に対して最大９６．８％（９６．８％を含む）の配列同一性を有するか、または配列番号４に対して最大９６．９％（９６．９％を含む）の配列同一性を有する、操作されたＵ７ヘアピンを指すことができる。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）が操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３に対して最大９６．８％（９６．８％を含む）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）が操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号４に対して最大９６．９％（９６．９％を含む）の配列同一性を有する。

【0047】

いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を編集するように構成された操作されたガイドＲＮＡ（例えば、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡエレメントを有する操作されたガイドＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡ編集は、少なくとも部分的にハイブリダイゼーションを可能にするように、標的ＲＮＡにハイブリダイズするように構成される標的化配列、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化配列、または標的ＲＮＡに十分な相補性を有する標的化配列を有する操作されたガイドＲＮＡを使用して達成することができる。本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列のＲＮＡエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアントのＲＮＡエレメントを含む操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ配列決定等であるがこれに限定されないインビトロアッセイによって決定される、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはこれらの組み合わせを欠く以外は同等のガイドＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集の量の増加を容易にする。

【0048】

本明細書に記載されるいくつかの例は、以下を提供する：本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が、標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有し、標的ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせにハイブリダイズすることができる標的化配列、ならびに操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡエレメントを含む）を含むＲＮＡエレメントを含み、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含むか、またはそれに作動可能に連結される場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１）またはＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２）に対して最大９０．９％（９０．９％を含む）（例えば、約９％、１８％、２７％、３６％、４５％、５５％、６４％、７３％、８２％）の配列同一性を有し、操作されたＲＮＡが操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含むか、またはそれに作動可能に連結される場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）に対して最大９６．８％（９６．８％を含む）（例えば、約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６．７％）の配列同一性を有するか、または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）に対して最大９６．９％（９６．９％を含む）（例えば、約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６．８％）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ａ）標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有し、標的ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせにハイブリダイズすることができる標的化配列、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１）またはＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２）に対して少なくとも約９％（例えば、約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．９％）の配列同一性を有し、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）に対して少なくとも約３％（例えば、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６．７％、９６．８％）の配列同一性を有するか、または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）に対して少なくとも約３％（例えば、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％）の配列同一性を有する。更に更なる実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ａ）標的ＲＮＡに十分な相補性を有し、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化配列、またはこれらの組み合わせ、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み、操作されたＲＮＡが（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１）またはＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２）に対して約９％～９０．９％（例えば、１０％～９０．８％、１１％～９０％、１２％～８９％、１３％～８８％、１４％～８７％、１５％～８６％、１６％～８５％、１７％～８４％、１８％～８３％、１９％～８２％、２０％～８１％、２１％～８０％、２２％～７９％、２３％～７８％、２４％～７７％、２５％～７６％、２６％～７５％、２７％～７４％、２８％～７３％、２９％～７２％、３０％～７１％、３１％～７０％、３２％～６９％、３３％～６８％、３４％～６７％、３５％～６６％、３６％～６５％、３７％～６４％、３８％～６３％、３９％～６２％、４０％～６１％、４１％～６０％、４２％～５９％、４３％～５８％、４４％～５７％、４５％～５６％、４６％～５５％、４７％～５４％、４８％～５３％、４９％～５２％、５０％～５１％）の配列同一性を有し、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が、（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）に対して約３％～９６．８％（例えば、４％～９６．７％、５％～９６％、６％～９５％、７％～９４％、８％～９３％、９％～９２％、１０％～９１％、１１％～９０％、１２％～８９％、１３％～８８％、１４％～８７％、１５％～８６％、１６％～８５％、１７％～８４％、１８％～８３％、１９％～８２％、２０％～８１％、２１％～８０％、２２％～７９％、２３％～７８％、２４％～７７％、２５％～７６％、２６％～７５％、２７％～７４％、２８％～７３％、２９％～７２％、３０％～７１％、３１％～７０％、３２％～６９％、３３％～６８％、３４％～６７％、３５％～６６％、３６％～６５％、３７％～６４％、３８％～６３％、３９％～６２％、４０％～６１％、４１％～６０％、４２％～５９％、４３％～５８％、４４％～５７％、４５％～５６％、４６％～５５％、４７％～５４％、４８％～５３％、４９％～５２％、５０％～５１％）の配列同一性を有するか、または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）に対して約３％～９６．９％（例えば、４％～９６．８％、５％～９６．７％、６％～９６％、７％～９５％、８％～９４％、９％～９３％、１０％～９２％、１１％～９１％、１２％～９０％、１３％～８９％、１４％～８８％、１５％～８７％、１６％～８６％、１７％～８５％、１８％～８４％、１９％～８３％、２０％～８２％、２１％～８１％、２２％～８０％、２３％～７９％、２４％～７８％、２５％～７７％、２６％～７６％、２７％～７５％、２８％～７４％、２９％～７３％、３０％～７２％、３１％～７１％、３２％～７０％、３３％～６９％、３４％～６８％、３５％～６７％、３６％～６６％、３７％～６５％、３８％～６４％、３９％～６３％、４０％～６２％、４１％～６１％、４２％～６０％、４３％～５９％、４４％～５８％、４５％～５７％、４６％～５６％、４７％～５５％、４８％～５４％、４９％～５３％、５０％～５２％）の配列同一性を有する。

【0049】

いくつかの態様において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ａ）標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有し、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる標的化配列、またはこれらの組み合わせ、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み、操作されたＲＮＡが操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１または配列番号２と比較して、Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７Ｎ_８Ｎ_９Ｎ_１０Ｎ_１１（配列番号５）の少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）、１１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～１１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～１０、３～９、４～８、５～７）を含み、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３または配列番号４と比較して、Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７Ｎ_８Ｎ_９Ｎ_１０Ｎ_１１Ｎ_１２Ｎ_１３Ｎ_１４Ｎ_１５Ｎ_１６Ｎ_１７Ｎ_１８Ｎ_１９Ｎ_２０Ｎ_２１Ｎ_２２Ｎ_２３Ｎ_２４Ｎ_２５Ｎ_２６Ｎ_２７Ｎ_２８Ｎ_２９Ｎ_３０Ｎ_３１Ｎ_３２（配列番号６）の少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２）、３２個または３１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）または１～３２個のポリヌクレオチド置換もしくは１～３１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～３１、３～３０、４～２９、５～２８、６～２７、７～２６、８～２５、９～２４、１０～２３、１１～２２、１２～２１、１３～２０、１４～１９、１５～１８、１６～１７）を含み、Ｎ_１～Ｎ_３１は、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ｎ_３２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、または存在しない。本開示のいくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１もしくは配列番号２ではないか、または操作されたＲＮＡが、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３でないか、または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号４でない。

【0050】

いくつかの実施形態は、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供し、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、ＡＡＵＵＵＮ_１ＵＮ_２Ｎ_３ＡＧ（配列番号７）の少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）、１１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～１１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～１０、３～９、４～８、５～７）を含み、Ｎ_１、Ｎ_２、及びＮ_３の各々は、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、配列番号７のＮ_１がＧである場合、Ｎ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２及びＮ_３のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_１は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_２がＧである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号７のＮ_３がＵである場合、Ｎ_１は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、または配列番号３ＡのＮ_３がＧである場合、Ｎ_１は、Ａ、ＧもしくはＣであり、またはＮ_２は、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは操作されたＲＮＡが操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１または配列番号２ではない。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号１のヌクレオチド６においてＧからＵ置換を含み得る。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号１のヌクレオチド６においてＧからＵ置換を含み得る。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号１のヌクレオチド１においてＡからＣ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号２のヌクレオチド８においてＧからＡ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号２のヌクレオチド９においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号２のヌクレオチド１０においてＡからＣ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＳｍＯＰＴバリアントは、配列番号２のヌクレオチド１１においてＧからＡ、Ｃ、またはＵ置換を含む。いくつかの場合において、配列番号２の５’末端は、ＵまたはＣ挿入を含む。いくつかの場合において、配列番号２の３’末端は、ＵまたはＡ挿入を含む。いくつかの場合において、配列番号２のヌクレオチド３、４、５、６、及び７は、各々、Ｕを含む。

【0051】

いくつかの例において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、Ｎ_１ＡＧＧＮ_２ＵＵＵＣＵＧＮ_３ＣＵＵＮ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７ＣＮ_８ＧＮ_９ＡＡＡＮ_１０ＣＣＣＮ_１１Ｎ_１２（配列番号８）の少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２）、３２個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）または１～３２個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～３１、３～３０、４～２９、５～２８、６～２７、７～２６、８～２５、９～２４、１０～２３、１１～２２、１２～２１、１３～２０、１４～１９、１５～１８、１６～１７）を含み、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、Ｎ_７、Ｎ_８、Ｎ_９、Ｎ_１０、Ｎ_１１、及びＮ_１２の各々は、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、ただし、配列番号８のＮ_１がＣである場合、Ｎ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_４及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１がＵである場合、Ｎ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_２がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_８及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであり、あるいは配列番号８のＮ_３がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_９は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_３がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_９及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_４がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_４がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_５がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_６及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_５がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_６がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_６がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_７がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_７がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つであり、あるいは配列番号８のＮ_８がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５及びＮ_６のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_８がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_９がＡである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_９がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１０がＣである場合、Ｎ_１及びＮ_４のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ


_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２が、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１０がＧである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１１がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２及びＮ_７のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、Ｎ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるか、もしくは存在しないか、または配列番号８のＮ_１１がＣである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、及びＮ_１２のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_２及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであり、あるいは配列番号８のＮ_１２が存在しない場合、Ｎ_１、Ｎ_４、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_２、Ｎ_７、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_３及びＮ_９のうちの少なくとも１つは、Ｕ、Ｇ、もしくはＣであるか、またはＮ_５、Ｎ_６、及びＮ_８のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであり、または配列番号８のＮ_１２がＵである場合、Ｎ_１、Ｎ_４、Ｎ_５、及びＮ_６のうちの少なくとも１つ、またはＮ_２、Ｎ_８、及びＮ_１１のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＧであるか、またはＮ_３、Ｎ_９、及びＮ_１０のうちの少なくとも１つは、Ａ、Ｕ、もしくはＣであるか、またはＮ_７は、Ｕ、Ｇ、もしくはＣである。

【0052】

いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含む場合、操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメイン配列を含む操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、配列番号１の野生型もしくは修飾されていないＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメインポリヌクレオチド配列または配列番号２のＳｍＯＰＴ配列と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含む。１つのタイプのスプライセオソームタンパク質は、小さな核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）に一般的に見られ、真核細胞の核に見られるＳｍタンパク質を含む。ｓｎＲＮＰは、プレｍＲＮＡスプライシング、ｒＲＮＡプロセシング、ヒストンｍＲＮＡ３’末端プロセシング、テロメア複製、ｔＲＮＡ成熟などを含むいくつかの異なる機能に関連している。Ｓｍ及びＳｍ様タンパク質は、小タンパク質（約８～２８ｋＤａ）であるだけでなく、Ｓｍドメインとして知られる共通のドメインを共有する真核生物におけるポリペプチドのファミリーのメンバーである。本明細書に開示される操作されたＲＮＡの配列またはスプライセオソーム配列は、いくつかの例において、スプライセオソーム低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）または非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインと、スプライセオソームｓｎＲＮＡまたは非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピンと、を含み得る。いくつかの実施形態において、配列番号１は、Ｕ１Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＧＧＡＧ配列番号２０）またはＵ７Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ配列番号２１）を含み得る。

【0053】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列のＲＮＡエレメント（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡエレメントなど）を含む場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）、１１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～１１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～１０、３～９、４～８、５～７）を含み、本明細書で使用される（ｂ）の配列のポリヌクレオチド置換は、ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ（配列番号１、Ｓｍ結合ドメイン配列）、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ（配列番号２、ＳｍＯＰＴ配列）、または野生型もしくは修飾されていないＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン配列の１つ以上のヌクレオシドまたは塩基の変化を意味し、記載された操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含み、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列が、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有する、操作されたガイドＲＮＡが、限定されないが、ＲＮＡ配列決定などのインビトロアッセイによって決定される、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン配列を欠く以外は同等の他のＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基のＲＮＡレベルの増加または編集量の増加を容易にするのに十分な機能及び活性を維持する。

【0054】

本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供し、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列のＲＮＡエレメント（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡエレメント等）を含む場合、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）、３２個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～３０個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～２９、３～２８、４～２７、５～２６、６～２５、７～２４、８～２３、９～２２、１０～２１、１１～２０、１２～１９、１３～１８、１４～１７、１５～１６）を含み、本明細書で使用される（ｃ）のヘアピンのポリヌクレオチド置換は、例えば、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ（配列番号３）または野生型もしくは修飾されていないマウスＵ７ヘアピンの１つ以上のヌクレオシドまたは塩基の変化を意味し、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）が操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列のＲＮＡエレメントを含む場合操作されたＵ７ヘアピン変異体配列は、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１）、３１個以下のポリヌクレオチド置換（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）、または１～３１個のポリヌクレオチド置換（例えば、２～２９、３～２８、４～２７、５～２６、６～２５、７～２４、８～２３、９～２２、１０～２１、１１～２０、１２～１９、１３～１８、１４～１７、１５～１６）を含み、本明細書で使用される（ｃ）のヘアピンのポリヌクレオチド置換は、例えば、ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ（配列番号４）または野生型もしくは修飾されていないヒトＵ７ヘアピン配列の１つ以上のヌクレオシドまたは塩基の変化を意味する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有する記載の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列のＲＮＡエレメントを含む操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ配列決定等であるがこれに限定されないインビトロアッセイによって決定される、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を欠く以外は同等のガイドＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによるＲＮＡレベルの増加または標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集の量の増加を容易にするのに十分な機能及び活性を維持する。

【0055】

いくつかの実施形態において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド３にＧ挿入を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド２において、ＡからＵ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド５において、ＵからＧ、Ｃ、またはＡ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド６においてＵからＣ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド８においてＵからＧ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１０において、ＵからＣまたはＡ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１１において、ＧからＣ置換を含む。いくつかの場合において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３のヌクレオチド１２において、ＡからＣ置換を含む。

【0056】

いくつかの例において、本明細書の操作されたガイドＲＮＡは、（ａ）標的化配列、（ｂ）操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメイン配列、例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、及び（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、ならびに操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を提供し、操作されたＵ７ヘアピンバリアントは、限定されないが、ＲＮＡ配列決定等であるがこれに限定されないインビトロアッセイによって決定される、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を欠く他の同等のガイドＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基のＲＮＡレベルの増加または編集量の増加を容易にする。

【0057】

いくつかの例において、操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインを含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）。いくつかの実施形態において、（ｂ）操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインを含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、配列番号１または配列番号２の修飾されていないＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を有することができる。いくつかの実施形態は、配列番号１または配列番号２の修飾されていないＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインポリヌクレオチド配列と比較して、２、３、または４つのポリヌクレオチド置換を有する操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインを含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供することができる。

【0058】

いくつかの実施形態は、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供することができる。いくつかの例において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３または配列番号４の修飾されていないヘアピンポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換を含み得る。いくつかの実施形態は、配列番号３または配列番号４の修飾されていないヘアピンポリヌクレオチド配列と比較して、２～１５個のポリヌクレオチド置換を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を提供することができる。更にいくつかの例において、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、配列番号３または配列番号４の修飾されていないヘアピンポリヌクレオチド配列と比較して、２、３、５、または１０個のポリヌクレオチド置換を有することができる。

【0059】

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、５’から３’まで、（ａ）標的化配列（ｂ）本開示の操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインバリアント、及び（ｃ）本開示の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、野生型ＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、及び本開示の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、本開示の操作されたＳｍまたはＳｍ様タンパク質結合ドメインバリアント、及び野生型Ｕ７ヘアピン配列を含み得る。

【0060】

本開示のいくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列（例えば、修飾もしくはバリアントＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン）、及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列（例えば、修飾もしくはバリアントＵ７ヘアピン、修飾もしくはバリアントマウスＵ７ ｓｎＲＮＡヘアピン、修飾もしくはバリアントヒトＵ７ ｓｎＲＮＡヘアピン）の標的化配列及びＲＮＡエレメントを含む操作されたＲＮＡは、少なくとも１つのミスマッチの３’に位置することができ、これは、標的化配列と標的ＲＮＡとがハイブリダイズされたときに生じる。

【0061】

操作されたＲＮＡ
本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））は、ＲＮＡエレメント（例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、及びこれらの組み合わせ、例えば、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するエレメント）に作動可能に連結され得る標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡは、操作されたＲＮＡが標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ分子のある領域にハイブリダイズすることを可能にする標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、操作されたＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションのための標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列を含む。様々な実施形態は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列等のＲＮＡエレメントに作動可能に連結された標的化配列を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む。他の実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列等のＲＮＡエレメントに作動可能に連結された標的化配列を含む。本開示のいくつかの実施形態は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列に作動可能に連結された標的化配列を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。

【0062】

標的化配列
本明細書に開示される操作されたＲＮＡは、ＲＮＡ編集またはＲＮＡ相互作用、処理、または発現の変更に好適な任意の方式で操作または設計され得る。いくつかの例において、操作されたＲＮＡは、概して、本明細書で互換的に使用される標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ分子の領域にハイブリダイズすることが可能である標的化配列、または、いくつかの実施形態においては、本明細書で互換的に使用される標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ分子の領域に対して標的相補性を有する標的化配列を少なくとも含む。標的化配列は、「標的化ドメイン」または「標的化領域」とも呼ばれ、本明細書で互換的に使用され得る。

【0063】

いくつかの場合において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡの標的化配列は、操作されたガイドＲＮＡが、ワトソン－クリック塩基対形成等の塩基対形成によってＲＮＡ配列を標的とすることを可能にする。いくつかの例において、標的化配列は、操作されたＲＮＡのＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。いくつかの場合において、標的化配列は、両方の末端に位置し得る。標的化配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または最大約２００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、または２００ヌクレオチド長以下であり得る。いくつかの例において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、約６０～約５００、約６０～約２００、約７５～約１００、約８０～約２００、約９０～約１２０、または約９５～約１１５ヌクレオチド長であり得る標的化配列を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡは、約１００ヌクレオチド長であり得る標的化配列を含む。

【0064】

いくつかの場合において、標的化ドメインは、標的ＲＮＡに対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相補性を含み、これは標的ＲＮＡとハイブリダイズするのに十分な相補性である。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％未満の相補性を含み、標的ＲＮＡに部分的にハイブリダイズすることがある。例えば、標的化配列、及び標的化配列によって結合され得る標的ＲＮＡの領域は、単一塩基ミスマッチを有し得る。

【0065】

本開示のいくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して相補性または十分な相補性を有する標的化配列を含む、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供し、それにより、ガイド－標的ＲＮＡ足場を形成する標的化配列及び標的ＲＮＡの部分ハイブリダイゼーションまたは完全ハイブリダイゼーションを提供する。本明細書に開示される「ガイド－標的ＲＮＡ足場」とは、潜在的構造を有するガイドＲＮＡと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション時に形成される結果として得られる二本鎖ＲＮＡである。ガイド－標的ＲＮＡ足場には、ハイブリダイゼーション時に二本鎖ＲＮＡ二重鎖内に形成される１つ以上の構造的特徴がある。例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、バルジ、ミスマッチ、内部ループ、ヘアピン、またはゆらぎ塩基対から選択される１つ以上の構造的特徴を有し得る。本開示の様々な態様は、標的ＲＮＡに対して完全な相補性を有する標的化配列を提供する。いくつかの例において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、標的ＲＮＡに実質的に相補的である標的化配列を含む。本開示の有用な標的化配列は、標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有することができる。

【0066】

本明細書で使用される「十分な相補性」、少なくとも５個のヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００）を意味することができ、または操作されたＲＮＡの６００個以下のヌクレオチド（例えば、５５０、４５０、３５０、２５０、１５０、１０５、９５、８５、７５、６５、５５、４５、３５、２５、１５、５）は、標的ＲＮＡに相補的であるか、または標的ＲＮＡに塩基対を有することを意味することができ、操作されたＲＮＡの５～６００個のヌクレオチド（例えば、１０～５５０、１５～４５０、２０～３５０、２５～２５０、３０～１５０、３５～１０５、４０～９５、４５～８５、５０～７５、５５～６５）は、標的ＲＮＡに相補的であるか、または標的ＲＮＡに塩基対を有することを意味することができ、操作されたＲＮＡヌクレオチドの少なくとも７０％（例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）は、標的ＲＮＡに相補的であることを意味することができ、１００％以下（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％）を意味することができ、あるいは操作されたＲＮＡヌクレオチドの少なくとも７０％～１００％（例えば、７１％～９９％、７２％～９８％、７３％～９７％、７４％～９６％、７５％～９５％、７６％～９４％、７７％～９３％、７８％～９２％、７９％～９１％、８０％～９０％、８１％～８９％、８２％～８８％、８３％～８７％、８４％～８６）は、標的ＲＮＡに相補的であることを意味することができる。

【0067】

いくつかの例では、本開示の記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して標的相補性を有する標的化配列を含み得る。

【0068】

いくつかの実施形態は、本開示の記載の操作されたＲＮＡを提供することができ、標的化配列は、（ａ）標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して標的相補性、または（ｂ）標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して標的相補性を有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ａ）標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、（ｂ）翻訳開始部位、（ｃ）標的ＲＮＡのイントロン領域、または（ｄ）標的ＲＮＡのエクソン領域に対して標的相補性を有する標的化配列を含み得る。

【0069】

いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。得られたｄｓＲＮＡ基質は、本明細書において、「ガイド－標的ＲＮＡ足場」とも呼ばれる。本明細書では、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場に存在し得る「構造的特徴」について説明する。構造的特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（動員ヘアピンもしくは非動員ヘアピン）が挙げられる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５０個の特徴を有することができる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０の特徴を有することができる。いくつかの実施形態において、操作された潜在ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に、操作された潜在ガイドＲＮＡの潜在的構造から構造的特徴（例えば、ミスマッチ、バルジ、内部ループ）が形成され、それによってガイド－標的ＲＮＡ足場が形成され得る。「操作された潜在的ガイドＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、またはハイブリダイゼーション時にのみ、編集される標的アデノシンでの単一のＡ／Ｃミスマッチ特徴以外の、構造的特徴の少なくとも一部分を実質的に形成する、配列の一部分を含む操作されたガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、潜在的構造から形成されず、代わりに、予め形成された構造（例えば、ＧｌｕＲ２動員ヘアピンまたはＵ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピン）である。

【0070】

いくつかの実施形態において、記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）と、記載の標的ＲＮＡ、または本明細書に記載の標的化配列等の少なくともその一部とのハイブリダイゼーション時に、１つ以上の構造的特徴（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）、５０個以下の構造的特徴（例えば、４９、４８、４７、４６、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、１）、または１～５０個の構造的特徴（例えば、２～４９、３～４８、４～４７、５～４６、６～４５、７～４４、８～４３、９～４２、１０～４１、１１～４０、１２～３９、１３～３８、１４～３７、１５～３６、１６～３５、１７～３４、１８～３３、１９～３２、２０～３１、２１～３０、２２～２９、２３～２８、２４～２７、２５～２６、１～５、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、８～１０）を有することができ、１つ以上の構造的特徴は、バルジ、ミスマッチ、内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0071】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の標的化配列は、標的ＲＮＡにハイブリダイゼーションしたときに少なくとも１つのミスマッチしたヌクレオチド（例えば、２、３、４、５）を有するように形成され得るか、または構成され得る。いくつかの例において、本開示の操作されたＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場の構造的特徴であって、構造的特徴は、ゆらぎ塩基対を含み得、ゆらぎ塩基対は、弱く対形成する２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指してもよい。

【0072】

本開示のいくつかの例は、記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供し、操作されたＲＮＡは、標的化配列の標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、少なくとも１つのミスマッチが形成され、少なくとも１つのミスマッチが、少なくとも１つのアデノシン－グアノシン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデノシン－アデノシン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、または少なくとも１つのアデノシン－シチジン（Ａ－Ｃ）を含み、ミスマッチ中のアデノシン（Ａ）が、標的ＲＮＡ中に存在し得る、標的化配列を含む。本開示の例において、記載の操作されたＲＮＡは、Ａ－Ｃミスマッチを含む少なくとも１つのミスマッチを有し得、ミスマッチ中のアデノシンは、標的ＲＮＡ中に存在し得る。いくつかの実施形態は、標的化配列のいずれかの末端から約１塩基～約２００塩基に位置し得る少なくとも１つのミスマッチを提供する。

【0073】

本開示のいくつかの態様は、標的ＲＮＡに対して、例えば、ストリンジェント、中程度、または弱いハイブリダイゼーション条件下で、完全にまたは部分的にハイブリダイズして、それによってガイド－標的ＲＮＡ足場を形成することができる標的化配列を含む操作されたＲＮＡを提供する。いくつかの例において、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、少なくとも１つの構造的特徴を含む。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸塩、及び２０μｇ／ｍＬの変性した剪断された鮭の精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄することを指す。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件において、本開示の標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの変化は、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの低いパーセンテージはストリンジェンシーの低下をもたらす）、塩条件、または温度の操作によって達成することができる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、例えば、３７℃で、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ、０．２ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬの鮭の精子遮断ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、続いて１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで５０℃での洗浄を含む。加えて、更に低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントハイブリダイゼーションの後に行う洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。

【0074】

アンチセンスオリゴヌクレオチド操作されたＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、短い、化学修飾された、または合成された一本鎖ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯとも呼ばれる）であり得る。いくつかの例は、標的ＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る操作されたＲＮＡを対象とする。ＡＳＯは、標的配列に対して実質的にまたは完全に相補的であり得、標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得る、化学修飾された、または合成されたＤＮＡもしくはＲＮＡである。ＡＳＯは、それらの短い長さを考慮して、分解を回避するために化学修飾され得る。ＡＳＯは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、ＤＮＡは、ＲＮＡをコードしない。本開示のいくつかの実施形態において、送達されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ自体またはＲＮＡをコードするＤＮＡであり得る。ＲＮＡの相互作用、プロセシング、発現、またはこれらの組み合わせを調節または変更することができる、天然に見出されるＲＮＡから修飾または改変された操作されたＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書に記載される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡの標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成されたＡＳＯは、標的配列中のエクソンのエクソンスキッピングを促進する。タンパク質コード転写産物のエクソンスキッピングを誘導するための方法が使用されている。多くの場合において、アルファ－シヌクレイン及びＤＭＤ等のいくつかのタンパク質は、異なるスプライスバリアントとして発現することができ、そのいくつかは、疾患に関与する可能性がある。エクソンスキッピング事象を促進することによって、ある疾患に関与する変異を含有するエクソンを迂回し、またはコドンリーディングフレームを回復させ、それによって、ある疾患もしくは障害を修正するか、またはある疾患もしくは障害の症状を緩和するのに十分なバリアントの翻訳を容易にすることができるものと考えられる。

【0075】

本明細書に記載されるいくつかの例は、５個以上のヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０）、５０個以下のヌクレオチド（例えば、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２５、２０、１５、１０、５）、または５～５０個のヌクレオチド（例えば、６～４９、７～４８、８～４７、９～４６、１０～４５、１１～４４、１２～４３、１３～４２、１４～４１、１５～４０、１６～３９、１７～３８、１８～３７、１９～３６、２０～３５、２１～３４、２２～３３、２３～３２、２４～３１、２５～３０）の一本鎖を含む本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、これらは標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって、遺伝子発現を阻害またはブロックする。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、約１０～約２００ヌクレオチド長（例えば、約１０～約１８０ヌクレオチド、約１５～約１００ヌクレオチド、約１５～約６０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、または約２０～約４０ヌクレオチド長）である。

【0076】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾を含み得る。修飾は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合において、修飾は、化学修飾であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、それらの短い長さを考慮して分解を避けるための化学修飾を含み得る。好適な化学修飾は、５’アデニレート、５’グアノシン－トリホスフェートキャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－トリホスフェートキャップ、５’トリホスフェートキャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ_１２スペーサー、Ｃ_３スペーサー、Ｃ_６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’修飾、５’－５’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、２－Ｏ－メチル ３ホスホロチオエート、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学修飾を含まない。

【0077】

化学修飾は、ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロードの任意の位置で行われ得る。いくつかの場合において、修飾は、５’末端または３’末端に位置し得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０から選択される塩基での修飾を含む。ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロードに対して、１つより多い修飾を行うことができる。いくつかの場合において、修飾は、永続的であり得る。他の場合において、修飾は、一過性であり得る。いくつかの場合において、複数の修飾は、操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）に対して行われ得る。操作されたＲＮＡに対する修飾は、ヌクレオチドの立体配座、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、またはこれらの任意の組み合わせ等のヌクレオチドの物理化学的特性を変更することができる。

【0078】

化学修飾は、ホスホロチオエート置換でもあり得る。いくつかの場合において、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる迅速な分解を受けやすい場合があり、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換体を使用したヌクレオチド間連結の修飾は、細胞分解による加水分解に対して、より安定であり得る。修飾は、ポリ核酸における安定性を増加させることができる。修飾はまた、生物学的活性を増強することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエートによって増強されたＲＮＡポリ核酸は、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、子ウシ血清ヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、ヌクレアーゼへの曝露がインビボまたはインビトロでの高い可能性である用途において、使用されるべきＰＳ－ＲＮＡポリ核酸の使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、エクソヌクレアーゼ分解を阻害することができるポリ核酸の５’末端または３’末端の最後の３～５ヌクレオチド間に導入することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエート結合を、ポリ核酸全体にわたって付加し、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することができる。

【0079】

いくつかの実施形態において、化学修飾は、３’ＯＨ基、５’ＯＨ基で、骨格で、糖構成要素で、またはヌクレオチド塩基で生じ得る。化学修飾には、鎖間架橋または鎖内架橋の天然に存在しないリンカー分子が含まれ得る。一態様において、化学修飾された核酸は、３’ＯＨもしくは５’ＯＨ基、骨格、糖構成要素、またはヌクレオチド塩基のうちの１つ以上の修飾、または天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾された骨格は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖は、デオキシリボース以外の糖（修飾ＤＮＡにおいて）、またはリボース以外の糖（修飾ＲＮＡにおいて）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル以外の塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１個の化学修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上の多くの修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分に対する化学修飾としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル、及びプリンまたはピリミジン塩基の天然及び合成の修飾が挙げられる。

【0080】

いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡの少なくとも１つの化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の１つもしくは両方の修飾、ホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素の１つ以上の修飾、リボース糖の構成成分の修飾、「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置き換え、天然に存在する核酸塩基の修飾もしくは置き換え、リボース－ホスフェート骨格の修飾、ポリヌクレオチドの５’末端の修飾、ポリヌクレオチドの３’末端の修飾、デオキシリボースホスフェート骨格の修飾、ホスフェート基の置換、リボホスフェート骨格の修飾、ヌクレオチドの糖に対する修飾、ヌクレオチドの塩基に対する修飾、またはヌクレオチドの立体化学的に純粋なもののうちのいずれか１つの修飾またはそのいずれかの組み合わせを含む。操作されたＲＮＡに対する化学修飾には、本明細書に含まれる任意の修飾が含まれるが、いくつかの例示的な修飾が表１に列挙されている。

【表1-1】

【表1-2】

【0081】

ホスフェート骨格の修飾
いくつかの実施形態において、化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の１つもしくは両方の修飾、またはホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖であり得る飽和炭化水素基を指すことを意味する。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ－プロピルもしくはイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、もしくはｔ－ブチル）、またはペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、もしくはネオペンチル）が挙げられる。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１～約８、１～約６、１～約４、または１～約３個の炭素原子を含有し得る。本明細書で使用される場合、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、またはインデニル等の単環式または多環式（例えば、２、３、もしくは４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素を指し得る。いくつかの実施形態において、アリール基は、６～約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指し得る。本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、２～１２個の炭素原子を含有し、１つ以上の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指し得る。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、または３－ヘキシニルを挙げることができる。「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置き換えられたアルキル部分を指し得る。アラルキルは、１個より多い水素原子がアリール基によって置き換えられた基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、９－フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。「シクロアルキル」は、３～１２個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、または多環式の非芳香族炭化水素基を指し得る。シクロアルキル部分の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。「ヘテロシクリル」は、複素環式環系の一価のラジカルを指し得る。代表的なヘテロシクリルとしては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。「ヘテロアリール」は、複素芳香族環系の一価のラジカルを指し得る。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられ得る。

【0082】

いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドのホスフェート基は、酸素のうちの１つ以上を別の置換基で置き換えることによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、または非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る：硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであることができる）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであることができる、あるいはここで、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであることができる）。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。このように修飾されたホスフェート基中のリン原子は、不斉中心であり得る。立体中心のリン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。いくつかの場合において、ＡＳＯは、ホスホロチオエートのＳ立体配座またはホスホロチオエートのＲ立体配座を含む立体化学的に純粋なヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、９５％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、９６％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、９７％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、９８％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート産物は、９９％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、ホスホロジチオエートの非架橋酸素を両方とも硫黄によって置き換えることができる。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、１つまたは両方の非架橋酸素に対する修飾には、非架橋酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基で置き換えることも含まれ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェートリンカーは、架橋酸素（すなわち、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素）、窒素（架橋したホスホロアミデート）、硫黄（架橋したホスホロチオエート）、及び炭素（架橋したメチレンホスホネート）の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、連結酸素のいずれかまたは両方で生じ得る。

【0083】

ある特定の実施形態において、核酸は、連結された核酸を含む。核酸は、任意の核酸間連結を使用して一緒に連結され得る。核酸間連結基の２つの主要なクラスは、リン原子の存在または非存在によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結としては、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びホスホロチオエートが挙げられる（Ｐ＝Ｓ）。代表的な非リン含有核酸間連結基としては、限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）、シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）、及びＮ，Ｎ＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３））が挙げられる。ある特定の実施形態において、キラル原子を有する核酸間連結は、ラセミ混合物として、別個のエナンチオマー、例えば、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートとして調製することができる。非天然核酸は、単一の修飾を含有し得る。非天然核酸は、部分のうちの１つ内または異なる部分間に複数の修飾を含有し得る。

【0084】

核酸に対する骨格リン酸修飾としては、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、及びボラノホスフェートが挙げられ、任意の組み合わせで使用することができる。他の非リン酸連結も使用してもよい。

【0085】

いくつかの実施形態において、骨格修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びホスホロジチオエートヌクレオチド間連結）は、修飾された核酸に免疫調節活性を付与し、及び／またはそれらのインビボでの安定性を増強することができる。

【0086】

いくつかの場合において、リン誘導体（または修飾されたホスフェート基）は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド酸塩などの中の糖または糖類似体部分に結合され得、かつそれらであり得る。

【0087】

いくつかの場合において、骨格修飾は、ホスホジエステル連結を、アニオン性、中性、またはカチオン性基等の代替部分で置き換えることを含む。このような修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結、Ｎ３’～Ｐ５’ホスホラミデート修飾、ボラノホスフェートＤＮＡ、プロオリゴヌクレオチド、メチルホスホネート等の中性ヌクレオシド間連結、アミド連結ＤＮＡ、メチレン（メチルイミノ）連結、ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結、スルホニル基を含有する骨格、モルホリノオリゴ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び正荷電デオキシリボ核グアニジン（ＤＮＧ）オリゴが挙げられる。修飾された核酸は、１つ以上の修飾、例えば、ホスホジエステル及びホスホロチオエート連結の組み合わせ等のホスフェート連結の組み合わせを含むキメラ骨格または混合骨格を含み得る。

【0088】

ホスフェートの代替物としては、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合されたヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結が挙げられる。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２構成要素部品が混合しているその他のものを有するものを含む。ヌクレオチドの糖及びホスフェート部分の両方を、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも、ヌクレオチド置換において理解され得る。例えば、細胞取り込みを増強するために、他のタイプの分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結することも可能であり得る。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合させることができる。このようなコンジュゲートとしては、限定されないが、コレステロール部分、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ラック－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウムｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ラック－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、もしくはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分等の脂質部分が挙げられる。

【0089】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ホスフェート骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたホスフェート骨格を含む。ホスフェート基または骨格の例示的な化学修飾は、酸素のうちの１つ以上を別の置換基で置き換えることを含み得る。更に、操作されたＲＮＡに存在する修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、または非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る：硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ_３（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであることができる）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ_２（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであることができる、あるいはＯＲ（ここで、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであることができる）。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。つまり、このように修飾されたホスフェート基中のホスフェート原子は、不斉中心であり得、このように修飾されたホスフェート基中のリン原子は、不斉中心であり得る。立体中心のリン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。そのような場合において、化学修飾されたＡＳＯは、立体的であり得る（例えば、ＳまたはＲ立体配座）。いくつかの場合において、化学修飾された操作されたＲＮＡは、立体化学的に純粋なホスフェート修飾を含む。例えば、化学修飾された操作されたＲＮＡは、ホスホロチオエートのＳ立体配座またはホスホロチオエートのＲ立体配座を含み得る。

【0090】

ホスホロジチオエートは、硫黄によって置き換えられた非架橋酸素を両方有する。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、１つまたは両方の非架橋酸素に対する修飾には、非架橋酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基で置き換えることも含まれ得る。

【0091】

ホスフェートリンカーは、架橋酸素（すなわち、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素）、窒素（架橋したホスホロアミデート）、硫黄（架橋したホスホロチオエート）、及び炭素（架橋したメチレンホスホネート）の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。

【0092】

ホスフェート部分の置き換え
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）の少なくとも１つのホスフェート基は、化学修飾され得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート基は、非リン含有コネクタによって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、ホスフェート部分は、デホスホリンカーによって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、電荷ホスフェート基は、中性基によって置き換えることができる。いくつかの場合において、ホスフェート基は、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノによって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヌクレオチド類似体は、ホスフェート基でも修飾され得る。修飾ホスフェート基は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデート（例えば、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデート）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートとの２つのヌクレオチド間の連結での修飾を含み得る。２つのヌクレオチド間のホスフェートまたは修飾されたホスフェート連結は、３’－５’連結または２’－５’連結を介してもよく、連結は、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’などの逆極性を含有する。

【0093】

ホスフェート基の置換
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ホスフェート基の置き換えによる修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、ホスフェート基置換または置換を含む少なくとも１つの化学修飾を含む。例示的なホスフェート基置換は、非リン含有コネクタを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート基の置換または置換は、荷電ホスフェート基を中性部分で置き換えることを含み得る。ホスフェート基を置換し得る例示的な部分としては、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、またはメチレンオキシメチルイミノが挙げられ得る。

【0094】

リボホスフェート骨格の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、操作されたＲＮＡのリボホスフェート骨格を修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたリボホスフェート骨格を含む。例示的な化学修飾されたリボホスフェート骨格は、核酸を模倣することができる足場も構築することができ、ここで、ホスフェートリンカー及びリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を挙げることができる。

【0095】

糖の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、糖の修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾された糖を含む。例示的な化学修飾された糖は、修飾された、またはいくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で置換された２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’アルコキシドイオンを形成するためにヒドロキシルがもはや脱プロトン化され得ないため、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、核酸の安定性を増強し得る。２’－アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃によって分解を触媒することができる。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ２ＣＨ_２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であり得る）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾は、（ＬＮＡ（ここで、２’ヒドロキシルは、例えば、Ｃｉ－_６アルキレンまたはＣｊ－６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に接続することができ、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる）、Ｏ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。いくつかの場合において、デオキシ修飾は、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分におけるデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ２ＣＨ_２－アミノ（ここで、アミノは、例えば本明細書に記載される通りであり得る）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキルチオアルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルであり得る）を含み得、これらは、本明細書に記載されているように、例えばアミノで任意選択的に置換され得る。いくつかの場合において、糖基はまた、リボース中の対応する炭素のそれとは反対の立体化学的構成を有する１つ以上の炭素を含有することができる。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド「モノマー」は、糖上のΓ位にアルファ連結、例えば、アルファ－ヌクレオシドを有することができる。修飾核酸はまた、Ｃ－で核酸塩基を欠く「非塩基性」糖を含み得る。非塩基性糖はまた、構成糖原子のうちの１つ以上で更に修飾することができる。修飾核酸はまた、Ｌ形態であり得る１つ以上の糖、例えば、Ｌ－ヌクレオシドを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、酸素を有する５員環であってもよい糖基リボースを含む。例示的な修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドは、リボース中の酸素の置換（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、もしくはアルキレン、例えば、メチレンもしくはエチレンとの）、二重結合の付加（例えば、シクロペンテニルもしくはシクロヘキセニルでリボースを置き換える）、リボースの環収縮（例えば、シクロブタンもしくはオキセタンの４員環を形成する）、リボースの環膨張（例えば、無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホラミデート骨格も有するモルホリノ等の追加の炭素もしくはヘテロ原子を有する６もしくは７員環を形成する）を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、多環式形態（例えば、トリシクロ、及び「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、ここで、リボースは、ホスホジエステル結合に結合するグリコール単位によって置き換えられ得る）、スレオース核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡの糖に対する修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、または架橋核酸（ＢＮＡ）を含むように操作されたＲＮＡを修飾することを含む。

【0096】

リボース糖の構成成分の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、リボース糖の構成成分の少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、リボース糖の構成成分の化学修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－アミノエチル、２’－デオキシ－２’－フロアラビノ－クレイン酸、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、または３’－ホスホノチオアセテート（チオＰＡＣＥ）を含み得る。いくつかの実施形態において、リボース糖の構成成分の化学修飾は、非天然核酸を含む。いくつかの場合において、非天然核酸は、糖環の５’位及び２’位における修飾、例えば、５’－ＣＨ_２－置換２’－Ｏ－保護ヌクレオシドを含む。いくつかの場合において、非天然核酸は、アミド連結ヌクレオシド二量体を含み、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために調製されており、二量体（５’から３’）中の３’連結ヌクレオシドは、２’－ＯＣＨ_３及び５’－（Ｓ）－ＣＨ_３を含む。非天然核酸は、２’－置換５’－ＣＨ_２（またはＯ）修飾されたヌクレオシドを含み得る。非天然核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡ及びＲＮＡモノマー、ならびに二量体を含み得る。非天然核酸は、２’置換を有する５’ホスホネートモノマー及び他の修飾された５’ホスホネートモノマーを含み得る。非天然核酸は、５’－修飾メチレンホスホネートモノマーを含み得る。非天然核酸は、５’及び／または６’位にヒドロキシル基を含む５’または６’ホスホネートリボヌクレオシドの類似体を含み得る。非天然核酸は、５’ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマー及び５’ホスフェート基を有する二量体を含み得る。非天然核酸は、６’ホスホネート基を有するヌクレオシドを含み得、５’または／及び６’位は、非置換であり得るか、またはチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ_３）_３）（及びその類似体）、メチレンアミノ基（ＣＨ_２ＮＨ_２）（及びその類似体）、またはシアノ基（ＣＮ）（及びその類似体）で置換され得る。

【0097】

いくつかの実施形態において、非天然核酸はまた、糖部分の修飾を含む。いくつかの場合において、核酸は、糖基が修飾されている１つ以上のヌクレオシドを含有する。そのような糖修飾されたヌクレオシドは、強化されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的特性を付与し得る。ある特定の実施形態において、核酸は、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例としては、限定されないが、置換基（５’及び／または２’置換基を含む）の付加、２つの環原子の架橋による二環式核酸の形成、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたは保護基）による置換、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0098】

いくつかの場合において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡは、ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、修飾された糖または糖類似体を含む。したがって、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「類似」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシルまたはフラノシル形態であり得る。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであり得、糖は、［アルファ］または［ベータ］アノマー構成のいずれかでそれぞれの複素環式塩基に接続され得る。糖修飾としては、限定されないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ類似体、２’－アミノ－ＲＮＡ類似体、２’－フルオロ－ＤＮＡ、及び２’－アルコキシまたはアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル－ウリジンまたは２’－Ｏ－メチル－シチジンを含み得る。糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル置換デオキシリボヌクレオシド及び２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドが挙げられる。

【0099】

糖部分に対する修飾には、リボース及びデオキシリボースの天然修飾、ならびに非天然修飾が含まれる。糖修飾としては、限定されないが、２’位における、ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの修飾が挙げられ、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。２’糖修飾としては、限定されないが、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３）］_２も挙げられ、式中、ｎ及びｍは、１～約１０であり得る。２’位における他の化学修飾としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾は、糖上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、または２’－５’連結オリゴヌクレオチド上の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。化学修飾糖はまた、架橋環酸素で修飾を含有する糖、例えば、ＣＨ_２及びＳを含む。ヌクレオチド糖類似体はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣物を有することができる。修飾された糖部分を有する核酸の例としては、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含む核酸が挙げられる。２’位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、及びＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択することができ、式中、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルキルである。

【0100】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸は、１つ以上の二環式核酸を含む。ある特定のそのような実施形態において、二環式核酸は、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含む。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、１つ以上の二環式核酸を含み、架橋は、４’～２’二環式核酸を含む。そのような４’～２’二環式核酸の例としては、限定されないが、以下の式のうちの１つが挙げられる：４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及び４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’、及びこれらの類似体、４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及びこれらの類似体。

【0101】

ヌクレオチドの塩基上の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ヌクレオチドの塩基（例えば、核酸塩基）の修飾を含む。例示的な核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられ得る。これらの核酸塩基は、本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）に修飾または置き換えることができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、塩基の天然または合成誘導体であり得る。

【0102】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ウラシルを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたウラシルを含む。例示的な化学修飾されたウラシルとしては、シュードウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン、５－メトキシ－ウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－メチルアミノメチル－ウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルバモイルメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、ｌ－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン、１メチル－シュードウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、ｌ－メチル－４－チオ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウンジン、ジヒドロプソイドウンジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピルシュードウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル］）－２－チオ－ウリジン、ａ－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、ｌ－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－ａｒａ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（ｌ－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、キサンチン、及びヒポキサンチンが挙げられ得る。

【0103】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、シトシンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたシトシンを含む。例示的な化学修飾シトシンとしては、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－メチルシチジン、５－ハロシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロシチジン、ピロロシュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチルシチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－ｌ－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン、ａ－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、２’－ＯＨ－アラ－シチジンが挙げられ得る。

【0104】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、アデニンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたアデニンを含む。例示的な化学修飾アデニンとしては、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロイ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジドアデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン、２－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６、Ｎ６－ジメチル－アデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－アセチル－アデノシン、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン、Ｎ６、２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、Ｎ６－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６、Ｎ６、２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン、ｌ，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジドアデノシン、２’－Ｆ－ａｒａ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－ａｒａ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられ得る。

【0105】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、グアニンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（ＡＳＯ、操作されたガイドＲＮＡ、または他のＲＮＡペイロード）は、少なくとも１つの化学修飾されたグアニンを含む。例示的な化学修飾されたグアニンとしては、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、メチルワイオシン、４－デメチル－ワイオシン、イソワイオシン、ウィブトシン、ペルオキシウィブトシン、ヒドロキシウィブトシン、非デミオ化ヒドロキシウィブトシン、７－デアザ－グアノシン、キューオシン、エポキシキューオシン、ガラクトシルキューオシン、マンノシルキューオシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン、アルカレオシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン、Ｎ２－メチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチチオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、ｌ－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２、７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、ｌ，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、６－Ｏ－フェニル－２’－デオキシイノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン、１－チオ－グアノシン、６－Ｏ－メチグアノシン、Ｏ^６－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－Ｆ－ａｒａ－グアノシン、及び２’－Ｆ－グアノシンが挙げられ得る。

【0106】

いくつかの場合において、操作されたＲＮＡの化学修飾は、操作されたＲＮＡへの核酸類似体または非天然核酸の導入または置換を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、本明細書に記載の化学修飾された核酸のうちのいずれか１つであり得る。例示的な核酸類似体は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３４２７２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２５１７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５０４２３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７３５３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４１５０３、ＰＣＴ／ＵＳ１８／０４１５０９、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６、またはＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８３３中に見出すことができ、これらは全て、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。本明細書に記載される化学修飾されたヌクレオチドは、例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化によって化学的に変化された任意の天然または非天然のグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジンまたはシチジンを含む、グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、及びシトシンのバリアントを含み得る。例示的な化学修飾されたヌクレオチドとしては、１－メチル－アデノシン、１－メチル－グアノシン、１－メチル－イノシン、２，２－ジメチル－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド、２－アミノプリン－リボシド、２’－アラアデノシン、２’－アラシチジン、２’－アラウリジン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、２－クロロアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、２’－フルオロチミジン、２－メチル－アデノシン、２－メチル－グアノシン、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペネニル－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－２－アミノアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシシチジン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシグアノシン、２，－Ｏ－メチル－２’－デオキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２－チオシチジン、２－チオ－シチジン、３－メチル－シチジン、４－アセチル－シチジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－アミノアリルシチジン、５－アミノアリル－デオキシウリジン、５－ブロムリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアモノメチル－ウラシル、５－クロロ－ａｒａ－シトシン、５－フルオロ－ウリジン、５－ヨードウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン、５－メトキシ－ウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、６－アザシチジン、６－アザウリジン、６－クロロ－７－デアザ－グアノシン、６－クロロプリンリボシド、６－メルカプト－グアノシン、６－メチル－メルカプトプリン－リボシド、７－デアザ－２’－デオキシ－グアノシン、７－デアザアデノシン、７－メチル－グアノシン、８－アザアデノシン、８－ブロモアデノシン、８－ブロモ－グアノシン、８－メルカプト－グアノシン、８－オキソグアノシン、ベンズイミダゾールリボシド、ベータ－Ｄ－マンノシル－ケオシン、ジヒドロウリジン、イノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、Ｎ６－（［６－アミノヘキシル］カルバモイルメチル）－アデノシン、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、Ｎ６－メチル－アデノシン、Ｎ７－メチル－キサントシン、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、キオシン、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキソシン、キサントシン、及びキシロアデノシンが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノプリン－リボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノアデノシン－５’－トリホスフェート、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－トリホスフェート、２－チオシチジン－５’－トリホスフェート、２－チオウリジン－５’－トリホスフェート、２’－フルオロチミジン－５’－トリホスフェート、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－トリホスフェート、４－チオウリジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルシチジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、５－メチルウリジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、６－アザシチジン－５’－トリホスフェート、６－アザウリジン－５’－トリホスフェート、６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、７－デアザアデノシン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、８－アザアデノシン－５’－トリホスフェート、８－アジドアデノシン－５’－トリホスフェート、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、６－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、ピューロマイシン－５’－トリホスフェート、またはキサントシン－５’－トリホスフェートから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニルウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－チオゼブラリン、２－チオゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２、６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ウィブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－チオ－６－グアノシンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、アルファ－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、アルファ－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、アルファ－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、アルファ－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。

【0107】

非天然核酸の修飾塩基としては、限定されないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン及びグアニンならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルアデニン及びグアニンならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルクアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられ得る。特定の非天然核酸、例えば５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二重鎖形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、混合核酸、サイズ拡張核酸、フッ素化核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む）。５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル、アデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置換され得るもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、及び５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、または２－アミノ－２’－デオキシアデノシン。

【0108】

いくつかの場合において、少なくとも１つの化学修飾は、操作されたＲＮＡの５’末端または３’末端等の５’末端または３’末端を化学修飾することを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、例えば、本明細書に記載される修飾されたヌクレオチドのうちの１つ以上を組み込むことによって、分解に対して安定化され得る３’ヌクレオチドを含む化学修飾を含み得る。この実施形態において、ウリジンは、修飾ウリジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、及び５－ブロモウリジン、または本明細書に記載の修飾ウリジンのいずれかで置き換えることができ、アデノシン及びグアノシンは、修飾アデノシン及びグアノシン、例えば、８位の修飾、例えば、８－ブロモグアノシン、または本明細書に記載の修飾アデノシンもしくはグアノシンのいずれかで置き換えることができる。いくつかの実施形態において、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシンをｇＲＮＡに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、Ｏ及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンをｇＲＮＡに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、糖修飾されたリボヌクレオチドが組み込まれ得、例えば、２’ＯＨ－基は、例えば、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、またはシアノ（－ＣＮ）から選択される基によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格は、本明細書に記載されるように、例えば、ホスホチオエート基で修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのオーバーハング領域内のヌクレオチドは、各々独立して、２－Ｆ２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）等の２’－糖修飾ヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドであり得る。

【0109】

操作されたガイドＲＮＡ
本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるＲＮＡエレメント（ＳｍＯＰＴバリアント配列、Ｕ７ヘアピンバリアント配列、または配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するエレメント等の両方）を有する本開示の操作されたガイドＲＮＡを、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集に利用することができる。記載の操作されたガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるＲＮＡエレメントに作動可能に連結された標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有する標的化配列を含み、ＲＮＡエレメントは、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡ編集のために、プロモーター、ターミネータ、及び本明細書に開示される追加の要素を含み得る。

【0110】

本開示のいくつかの例において、本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡは、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド（例えば、９０～５００、１００～４００、２００～３００）の長さを有し得、少なくとも約８０以上のヌクレオチド（例えば、８５、９５、１５０、２５０、３５０、４５０、５５０、６００、６５０）の長さを有し得、または約６００ヌクレオチド以下（例えば、５７５、５２５、４７５、４２５、３７５、３２５、２７５、２２５、１７５、１２５、１１５、１１０、１０５、９５、９０、８５、８０、７５、７０）の長さを有し得る。

【0111】

環化ガイドＲＮＡ
いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、環化され得る。環化操作されたガイドＲＮＡは、前駆体の操作されたポリヌクレオチドから産生され得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作された線形ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、線形であり得る。例えば、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、プラスミドから転写された線形ｍＲＮＡであり得る。別の例において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、細胞における環化を可能にするリボザイムドメイン及びライゲーションドメイン等のドメインを有する線形ポリヌクレオチドであるように構築することができる。ライゲーションドメイン及びリボザイムドメインを有する線形ポリヌクレオチドを、細胞へトランスフェクトすることができ、内因性細胞酵素を介して環化することができる。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、環状であり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作されたガイドＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたガイドＲＮＡを使用して、操作されたガイドＲＮＡを産生することができる。

【0112】

操作されたガイドＲＮＡ等の環状または環状の操作されたガイドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端等のＲＮＡ配列の２つ以上の末端の間に連結（共有連結など）を形成することによって、直接的または間接的に形成され得る。ＲＮＡ配列は、操作されたガイドＲＮＡ（動員ドメイン、標的化ドメイン、または両方など）を含み得る。連結は、リガーゼ等の酵素を用いることによって形成することができる。好適なリガーゼ（または合成酵素）は、共有結合を形成するリガーゼを含み得る。共有結合は、炭素－酸素結合、炭素－硫黄結合、炭素－窒素結合、炭素－炭素結合、リン酸エステル結合、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。連結は、リコンビナーゼを用いることによっても形成することができる。酵素をＲＮＡ配列に動員して、連結を形成することができる。環状またはループＲＮＡは、連結エレメントを使用してＲＮＡ配列の２つ以上の末端をライゲーションすることによって形成することができる。いくつかの実施形態において、連結は、ライゲーション反応によって形成することができる。いくつかの場合において、連結は、相同組換え反応によって形成することができる。連結要素は、クリック化学を用いて、環状またはループＲＮＡを形成することができる。連結要素は、アジ化物ベースの連結であり得る。環状またはループＲＮＡは、環状またはループＲＮＡを遺伝子的にコードするか、または化学的に合成することによって形成することができる。

【0113】

環状ＲＮＡまたはループＲＮＡは、自己切断エンティティ、例えば、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのうちのいずれかの触媒活性断片、またはこれらの任意の組み合わせを用いることによって形成することができる。例えば、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒活性断片、またはこれらの任意の組み合わせを、３’末端、５’末端、または前駆体操作ＲＮＡの両方に付加することができる。別の例において、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒活性断片、またはこれらの任意の組み合わせを、３’末端、５’末端、または前駆体操作ＲＮＡの両方に付加することができる。自己切断リボザイムは、例えば、ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ、ハンマーヘッドリボザイム（例えばＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉリボザイム）、ｇｌｍＳリボザイム、ＨＤＶ様リボザイム、Ｒ２エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ＩＩ群イントロン、ヘアピンリボザイム、ＶＳリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、またはＩ群イントロンを含むことができる。いくつかの場合において、自己切断リボザイムは、それが存在する１つのＲＮＡ末端を別個のＲＮＡ末端に結合するトランス作用型リボザイムであり得る。いくつかの実施形態において、アプタマーは、操作されたガイドＲＮＡの各末端に付加され得る。リガーゼは、操作されたガイドＲＮＡの各末端において、アプタマーと接触させて、アプタマー間の共有連結を形成し、それによって、環状の操作されたガイドＲＮＡを形成することができる。いくつかの場合において、自己切断エレメントまたはアプタマーは、細胞における転写後の操作されたポリヌクレオチドまたは（例えば、前駆体の操作されたポリペプチドからの）プロポリヌクレオチドの自己環化を容易にするように構成され得る。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡの環化は、ＰＣＲによって示され得る。例えば、ガイドＲＮＡの末端に結合し、産物がガイドが環化されたときにのみ形成されるように外向きであるプライマーを開発することができる。

【0114】

いくつかの場合において、環化は、エクソンのバックスライス及びライゲーションによって生じ得る。例えば、ＲＮＡは、５’から３’まで操作されて、前方相補的配列イントロン、エクソン（ガイド配列を含み得る）、続いて逆相補的配列イントロンを含み得る。転写されると、相補的配列イントロンはハイブリダイゼーションし、ｄｓＲＮＡを形成することができる。ガイド配列を含有する内部エクソンは、スプライシングによって除去され、内因性リガーゼによってライゲーションされて、円形ガイドを形成することができる。一例において、操作されたガイドＲＮＡは、コードされたリボザイムの自己触媒反応によって細胞内の環化を開始することができる。１つ以上のリボザイムによる切断後、直鎖ポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡを環化するために、内因性リガーゼによるライゲーション配列の５’末端及び３’末端の細胞内ＲＮＡライゲーションを受ける。

【0115】

好適な自己切断分子は、リボザイムを含み得る。例えば、リボザイムドメインは、自己触媒ＲＮＡを作製することができる。リボザイムは、ＲＮａｓｅＰ、ｒＲＮＡ（ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ等）、リードザイム、Ｉ群イントロンリボザイム、ＩＩ群イントロンリボザイム、ＧＩＲ１分岐リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ツイスターリボザイム、ツイスター姉妹リボザイム、ＶＳリボザイム、ピストルリボザイム、Ｈａｔｃｈｅｔリボザイム、ウイロイド、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。リボザイムは、Ｐ３ツイスターＵ２Ａリボザイムを含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴ３’（配列番号１０５）を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＵＣＡＧＵＣＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＵＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＵ３’（配列番号１０６）を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴ３’（配列番号１０５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＵＣＡＧＵＣＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＵＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＵ３’（配列番号１０６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、Ｐ１ツイスターリボザイムを含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣ３（配列番号１０７）を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＵＧＣＣＡＡＵＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＡＣＡＧＵＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１０８）を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１０７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＵＧＣＣＡＡＵＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＡＣＡＧＵＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１０８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。

【0116】

ライゲーションドメインは、第１のヌクレオチドの第２のヌクレオチドへの連結、共有結合または非共有結合を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、ライゲーション反応を容易にするためにライゲーションエンティティを動員することができる。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、相同組換えを容易にするために組換えエンティティを動員することができる。いくつかの場合において、第１のライゲーションドメインは、第２のライゲーションドメインへの連結、共有結合または非共有結合を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、第１のライゲーションドメインは、第２のライゲーションドメインの相補的な対合を容易にすることができる。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧ３’（配列番号１０９）を含み得る。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣ３’（配列番号１１０）を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＵＧＣＣＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＡＧ３’（配列番号１１１）を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＧＣＧＧＣＵＧＡＣＵＡＣＣＧＵＣ３’（配列番号１１２）を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧ３’（配列番号１０９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣ３’（配列番号１１０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＵＧＣＣＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＡＧ３’（配列番号１１１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＧＣＧＧＣＵＧＡＣＵＡＣＣＧＵＣ３’（配列番号１１２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を含み得る。

【0117】

動員ドメインを有する操作されたガイドＲＮＡ
いくつかの例において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの不在下で形成され、存在する動員ドメインを含み得、動員ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ、ＡＰＯＢＥＣ、またはその両方）を動員する。「動員ドメイン」は、本明細書において、互換的に、「動員配列」または「動員領域」と呼ばれ得る。いくつかの例において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの調節発現、または両方を容易にするように構成され得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティによるＲＮＡの領域のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティを動員するように構成され得る。いくつかの実施形態は、ＡＤＡＲタンパク質を含むＲＮＡ編集エンティティを提供し、ここで、ＡＤＡＲタンパク質は、ＡＤＡＲ１（例えば、ヒトまたはマウス）、ＡＤＡＲ２（例えば、ヒトまたはマウス）、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。様々なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを利用することができる。いくつかの例において、動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）、ＡＰＯＢＥＣ、またはＡｌｕを含む。本開示のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、または両方を有し得る。ＲＮＡ編集エンティティがＡＤＡＲタンパク質である場合、ＡＤＡＲタンパク質は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ならびにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の組み合わせからなる群から選択され得る。他の実施形態は、ヒトＡＤＡＲ１、マウスＡＤＡＲ１、ヒトＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ２、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡ編集エンティティを対象とすることができる。

【0118】

いくつかの例において、２つ以上の動員ドメインは、本開示の操作されたガイドＲＮＡ中に含まれ得る。動員ドメインが存在する例において、動員ドメインを利用して、標的化配列、例えば、アンチセンス配列の後の標的ＲＮＡと効果的に反応させるようにＲＮＡ編集エンティティを配置し、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの場合において、動員ドメインは、操作されたガイドＲＮＡに対するＲＮＡ編集エンティティの一過性の結合を可能にし得る。いくつかの例において、動員ドメインは、操作されたガイドＲＮＡに対するＲＮＡ編集エンティティの永続的結合を可能にする。動員ドメインは、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５から、最大約８０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、または８０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、約４５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合において、動員ドメインの少なくとも一部分は、少なくとも１～約７５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、動員ドメインの少なくとも一部分は、約４５ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドを含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列またはその機能的断片を含む。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、ＡＤＡＲまたはその生物学的に活性な断片によって認識することができる。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、例えば、増強された動員のために修飾され得る。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２配列及び合成配列の一部分を含み得る。

【0120】

いくつかの例において、動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列、またはＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号９）に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性、またはＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号９）に対する長さを有する配列、またはその両方を含む。いくつかの場合において、動員ドメインは、配列番号９の少なくとも約１０、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、動員ドメインは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列相同性、配列番号９に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の長さ、またはその組み合わせを含み得る。

【0121】

追加のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインも企図される。ある実施形態において、動員ドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ドメインを含む。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインは、天然に存在しない配列または天然に存在する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、天然に存在するＡＰＯＢＥＣドメインコード配列の一部分を含み得る。別の実施形態において、動員ドメインは、Ａｌｕドメインに由来し得る。

【0122】

任意の数の動員ドメインは、本開示の操作されたＲＮＡ中に見出され得る。いくつかの例において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大約１０の動員ドメインは、操作されたＲＮＡ中に含まれ得る。動員ドメインは、操作されたガイドＲＮＡの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、ポリヌクレオチドのＮ末端、中央、またはＣ末端上にあり得る。動員ドメインは、標的化配列の上流または下流であり得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、ガイドの標的化配列に隣接する。動員配列は、全てのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含み得るが、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を含む動員ドメインは、いくつかの場合において、除外されなくてもよい。

【0123】

潜在的構造を有する操作されたガイドＲＮＡ
いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーションの不在下で形成され、存在する動員ドメインを欠いていてもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティの動員は、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場によって実現され得る。いくつかの例において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ、ＡＰＯＢＥＣ、またはその両方）を動員する構造的特徴を含まない。いくつかの実施形態は、ＡＤＡＲタンパク質を含むＲＮＡ編集エンティティを提供し、ここで、ＡＤＡＲタンパク質は、ＡＤＡＲ１（例えば、ヒトまたはマウス）、ＡＤＡＲ２（例えば、ヒトまたはマウス）、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、標的ＲＮＡとともに、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）を動員する１つ以上の構造的特徴を形成する。

【0124】

動員配列が存在し得ない場合、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡの編集を容易にし、標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節するか、またはこれらの組み合わせを行うために、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）と依然として会合することが可能である。これは、本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場において構築される特徴によって達成され得る。「潜在的構造」という用語は、標的ＲＮＡへの操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時にのみ実質的に形成される構造的特徴を指す。例えば、操作されたガイドＲＮＡの配列は、１つ以上の構造的特徴を提供するが、これらの構造的特徴は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時にのみ実質的に形成され、したがって、１つ以上の潜在的構造的特徴は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に構造的特徴として現れる。標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に、構造的特徴が形成され、したがって、操作されたガイドＲＮＡに提供される潜在的構造がマスクされない。本明細書に記載される潜在的ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、編集される標的アデノシンでの単一のＡ／Ｃミスマッチ特徴以外の、構造的特徴の少なくとも一部分を形成する、配列の一部分を含む操作されたガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、標的化配列構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、化学修飾、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含み得る。

【0125】

操作されたガイドＲＮＡ、及び当該操作されたガイドＲＮＡを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの例において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）をコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、ＤＮＡを含む。いくつかの例において、操作されたＲＮＡは、修飾ＲＮＡ塩基または修飾されていないＲＮＡ塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、修飾ＤＮＡ塩基または修飾されていないＤＮＡ塩基を含む。いくつかの例において、操作されたＲＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基の両方を含む。

【0126】

いくつかの例において、本明細書に提供される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡの少なくとも一部分へのハイブリダイゼーション時に、少なくとも部分的に、ガイド－標的ＲＮＡ足場を形成するように構成され得る操作されたＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーション時に形成される。ガイド－標的ＲＮＡ足場は、二本鎖ＲＮＡ二本鎖内に形成される構造的特徴を有することができる。例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、ミスマッチ、バルジ（例えば、対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（例えば、対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、ヘアピン（例えば、動員ヘアピンもしくは非標的化ドメインを含むヘアピン）、ゆらぎ塩基対、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの構造的特徴、または２つ以上の構造的特徴を有することができ、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、ＲＮＡ編集エンティティを動員し、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする。

【0127】

本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場中に存在し得る構造的特徴が本明細書に記載され得る。ガイド－標的ＲＮＡ足場は、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成され得、足場は、少なくとも１つまたは２つ以上の構造的特徴を有し得る。構造的特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（非標的化ドメインを含むヘアピン）、またはゆらぎ塩基対が挙げられる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５０個の特徴を有することができる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０の特徴を有することができる。本明細書に開示されるように、「構造化モチーフ」は、ガイド－標的ＲＮＡ足場中に２つ以上の特徴の組み合わせ、またはそれらを含むものを指す。

【0128】

いくつかの例において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、「ミスマッチ」は、本明細書で使用される場合、本開示の操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場内の標的ＲＮＡ中の対向する単一ヌクレオチドに対して対形成していない、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）中の単一ヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対を形成しない任意の２つの単一ヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側の関与するヌクレオチドの数が１を超える場合、結果として生じる構造はもはやミスマッチとはみなされず、構造的特徴のサイズに応じてバルジまたは内部ループとみなされる。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチ、Ａ／Ｇミスマッチ、またはＡ／Ａミスマッチであり得る。例えば、Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡと対向する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）中にＣを含み得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣと対向する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）中にＡを含み得る。例えば、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧと対向する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）中にＧを含み得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるミスマッチは、編集される標的ＲＮＡのＡ（または標的Ａ）の塩基フリッピングを容易にすることができる。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。したがって、ミスマッチは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは、標的ＲＮＡ中にあり得、Ｃは、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的化配列中にあり得る。別の実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって編集される標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基であり得る。

【0129】

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。いくつかの態様において、「バルジ」は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の形成時にのみ実質的に形成される構造を指し、本開示の操作されたガイドＲＮＡまたは標的ＲＮＡのいずれかにおける連続したヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではない。バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の二次または三次構造を変化させる可能性がある。バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において０～４個の連続したヌクレオチドを有し得、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において１～４個の連続したヌクレオチドを有し得るか、またはバルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において０～４個のヌクレオチドを有し得、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において１～４個の連続したヌクレオチドを有し得る。しかしながら、バルジは、本明細書で使用される場合、操作されたガイドＲＮＡの単一の関与するヌクレオチド、及び標的ＲＮＡの単一の関与するヌクレオチドが塩基対を形成しない構造を指すものではなく、塩基対を形成しない操作されたガイドＲＮＡの単一の関与するヌクレオチド、及び標的ＲＮＡの単一の関与するヌクレオチドは、本明細書においてミスマッチと呼ばれる。更に、操作されたガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれかにおける関与するヌクレオチドの数が４を超える場合、得られた構造は、もはやバルジとはみなされず、むしろ内部ループとみなされる。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は２個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は、３個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は、４個のバルジを有する。したがって、バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0130】

いくつかの実施形態において、ガイド－標的ＲＮＡ足場内のバルジの存在により、標的ＲＮＡ内の標的Ａを選択的に編集し、標的ＲＮＡ内の非標的Ａ（複数可）のオフターゲット編集を減らすようにＡＤＡＲを配置したり、配置を助けたりすることができる。いくつかの実施例において、ガイド－標的ＲＮＡ足場におけるバルジの存在は、追加の量のＡＤＡＲタンパク質（例えば、マウスもしくはヒトＡＤＡＲ１、マウスもしくはヒトＡＤＡＲ２、またはこれらの任意の組み合わせ）を動員することができるか、または動員に役立つことができる。本明細書に開示されるガイド－標的ＲＮＡ足場におけるバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティ（例えば、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）、またはＡＤＡＲ及びＡＰＯＢＥＣの両方）等の他のタンパク質を動員することができる。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるバルジは、編集される標的ＲＮＡの標的「Ａ」の塩基フリッピングを容易にすることができる。バルジは、標的ＲＮＡ中に存在する他のＡ（複数可）と比較して、編集される標的ＲＮＡのＡに対する配列特異性を付与するのにも役立ち得る。例えば、バルジは、標的ＲＮＡの標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ＡＤＡＲ編集を指示するのに役立ち得る。

【0131】

いくつかの態様において、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本開示のバルジは、対称バルジまたは非対称バルジであり得る。対称バルジは、バルジの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場内の対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側で同じ数のヌクレオチドを有することができる。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、対称バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0132】

いくつかの例において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称または非対称バルジであり得る。非対称バルジは、バルジの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において異なる数のヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、非対称バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0133】

いくつかの例において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、「内部ループ」は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の形成時に実質的に形成される構造を指し、操作されたガイドＲＮＡまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではなく、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側または操作されたガイドＲＮＡ側におけるいずれかの、内部ループの一方の側は、５以上のヌクレオチドを有する。操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側の両方における関与するヌクレオチドの数が５を下回る場合、得られた構造は、もはや内部ループとはみなされず、むしろ、構造的特徴のサイズに応じて、バルジまたはミスマッチとみなされる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。

【0134】

いくつかの態様において、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーション時に形成され得る。ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側または操作されたガイドＲＮＡ側のいずれかにある、内部ループの片側は、５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個のヌクレオチド、またはその間の任意の数のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１，０００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0135】

いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。「対称内部ループ」は、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成され得る。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において同数のヌクレオチドを有し得る。本明細書に記載されるいくつかの例において、本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５～１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１５０個のヌクレオチドから形成され得、ヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたガイドＲＮＡ側における５～１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１０００個のヌクレオチドから形成され得、ヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において同じである。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１１０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１２０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１３０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１４０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１，０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１，０００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、対称内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0136】

本開示のいくつかの例は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成され得るガイド－標的ＲＮＡ足場を提供する。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。「非対称内部ループ」は、内部ループの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において異なる数のヌクレオチドを有し得る。いくつかの態様において、本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５～１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得、ヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側におけるヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５～１，０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１，０００個のヌクレオチドによって形成され得、ヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側において、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側におけるヌクレオチドの数とは異なる。いくつかの例において、本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の７個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開


示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的


ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、非対称内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0137】

いくつかの実施形態は、本開示の操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場を提供し、構造的特徴は、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場に存在し得、構造的特徴は、ヘアピンであり得る。いくつかの場合において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ヘアピンドメインを欠いていてもよい。他の場合において、本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡは、１個のヘアピンドメイン、または２個以上のヘアピンドメインを含有し得る。本明細書に記載されるように「ヘアピン」は、一本鎖ＲＮＡ鎖の一部分がそれ自体で折り畳まれてＲＮＡ二本鎖を形成する、ＲＮＡ二本鎖を含む。一本鎖ＲＮＡ鎖の一部分は、互いに塩基対を形成するヌクレオチド配列を有することに起因してそれ自体で折り畳まれ、ヌクレオチド配列は、それ自体で塩基対を形成しない介在配列によって分離され、したがって、塩基対形成した一部分及び非塩基対形成した、介在するループ部分を形成する。ヘアピンは、二本鎖構造全体が１０～５００ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのループ部分は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１～１０個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１個のヘアピンを有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、２個のヘアピンを有することができる。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピンまたはヘアピンまたは非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたガイドＲＮＡ内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたＲＮＡの３’末端の近位にあるか、もしくは３’末端に存在するか、本開示の操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位にあるか、もしくは５’末端に存在するか、またはこれらの任意の組み合わせに存在する。

【0138】

いくつかの例において、「動員ヘアピン」は、本明細書に開示されるように、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、ＡＤＡＲを少なくとも部分的に動員することができる。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、標的ＲＮＡへの結合の不在下で形成され、存在してもよい。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインまたはその一部である。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインまたはその一部である。動員ヘアピンは、本明細書に定義されるように、天然に存在するＡＤＡＲ基質またはその切断を含み得る。したがって、ＧｌｕＲ２等の動員ヘアピンは、操作された潜在的ガイドＲＮＡに提供される潜在的構造によって形成される構造的特徴ではなく、操作されたガイドＲＮＡを含む構築物に存在し得る予め形成された構造的特徴である。

【0139】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるような「非動員ヘアピン」は、ＲＮＡ編集エンティティを動員する主な機能を有しない。非動員ヘアピンは、いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティを動員しない。非動員ヘアピンは、操作されたガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへの局在を改善する機能を発揮することができる。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは核保持を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡからのヘアピンを含む。したがって、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピン等の非動員ヘアピンは、操作された潜在的ガイドＲＮＡに提供される潜在的構造によって形成される構造的特徴ではなく、操作されたガイドＲＮＡ構築物を含む構築物中に存在し得る予め形成された構造的特徴である。

【0140】

本開示のヘアピンは、任意の長さのものであり得る。いくつかの態様において、ヘアピンは、約１０～５００個、またはそれより多くのヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、ヘアピンは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００個以上のヌクレオチドを含み得る。他の場合において、ヘアピンはまた、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、１０～１２０、１０～１３０、１０～１４０、１０～１５０、１０～１６０、１０～１７０、１０～１８０、１０～１９０、１０～２００、１０～２１０、１０～２２０、１０～２３０、１０～２４０、１０～２５０、１０～２６０、１０～２７０、１０～２８０、１０～２９０、１０～３００、１０～３１０、１０～３２０、１０～３３０、１０～３４０、１０～３５０、１０～３６０、１０～３７０、１０～３８０、１０～３９０、１０～４００、１０～４１０、１０～４２０、１０～４３０、１０～４４０、１０～４５０、１０～４６０、１０～４７０、１０～４８０、１０～４９０、または１０～５００個のヌクレオチドを含み得る。

【0141】

他の態様において、本明細書に記載の構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。「ゆらぎ塩基対」は、弱く塩基対形成する２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指し得る。したがって、ゆらぎ塩基対は、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0142】

ＲＮＡ編集
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡが特定のヌクレオシド上での合成後に酵素的に修飾され得るプロセスを指す。ＲＮＡ編集は、ヌクレオチド（複数可）の挿入、欠失、または置換のうちのいずれか１つを含み得る。ＲＮＡ編集の例としては、シュードウリジル化（ウリジン残基の異性化）及び脱アミノ化（シチジンからアミン基を除去してウリジンを生成すること、すなわちＣからＵへの編集、またはアデノシンからイノシンを生成すること、すなわちＡからＩへの編集）等の化学修飾が挙げられる。ＲＮＡ編集を使用して、変異を導入し、ミスセンス変異を修正し、またはＲＮＡのコード領域もしくは非コード領域を編集して、ＲＮＡ翻訳を阻害し、タンパク質ノックダウンをもたらすことができる。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡを使用して、標的ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックすることは、標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現をノックダウンするために使用され得る。

【0143】

標的化配列を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、異種操作されたＲＮＡエレメント（例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント、操作されたＵ７ヘアピンバリアント、または、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、もしくは配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するエレメント等の両方）に連結され得る。本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも長くなる。したがって、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡによるものと同じ構造を生成することができない、より短い化学修飾されたガイドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、はるかに高次の構造を有することができる。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化配列を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、本明細書に記載される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列に作動可能に連結され得る。他の例において、標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化配列を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、本明細書に記載される操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列に作動可能に連結され得る。更に、本開示の更なる実施形態において、標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化配列を含む記載の操作されたＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、本明細書に記載の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列に作動可能に連結され得る。

【0144】

いくつかの場合において、ＡＤＡＲ等のＲＮＡ編集エンティティは、ＲＮＡにおけるアデノシンからイノシンへの化学的変換を触媒する酵素であり得るが、これらに限定されない。イノシンの特性は、グアノシンの特性を模倣するため（イノシンは、例えば、シトシンとの２つの水素結合を形成する）、イノシンは、翻訳細胞機構によってグアノシンとして認識され得る。したがって、「アデノシンからイノシン（ＡからＩ）へのＲＮＡ編集」は、ＲＮＡ標的の一次配列を効果的に変化させる。一般に、ＡＤＡＲ酵素は、可変数のアミノ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）及び単一のカルボキシ末端触媒デアミナーゼドメインを含む共通のドメインアーキテクチャを共有する。ヒトＡＤＡＲは、２つまたは３つのｄｓＲＢＤを保有する。証拠は、ＡＤＡＲが、ホモ二量体を形成することができ、二本鎖ＲＮＡに結合する場合には、他のＡＤＡＲとヘテロ二量体を形成することができることを示唆しているが、編集を行うために二量体化が必要であるかどうかは、現在のところ不確定であり得る。本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、ヒトＡＤＡＲ遺伝子（例えば、ＡＤＡＲ１～３）のいずれか、または任意の組み合わせによるＲＮＡ編集を容易にすることができる。ＡＤＡＲは、そのＮ末端領域にｄｓＲＮＡ結合ドメインのうちの少なくとも２つのコピー（ｄｓＲＢＤ、３つのｄｓＲＢＤを有するＡＤＡＲ１、各々２つのｄｓＲＢＤを有するＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３）、その後にＣ末端デアミナーゼドメインを含む典型的なモジュールドメイン組織を有する。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、内因性ＡＤＡＲ酵素によるＲＮＡ編集を容易にする。いくつかの実施形態において、外因性ＡＤＡＲは、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡとともに送達され得る。

【0145】

本明細書に提供されるように、操作されたガイドＲＮＡは、目的の標的ＲＮＡに対して標的相補性を有する標的化配列を含み得る。操作されたガイドＲＮＡの標的化配列に対する標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、ＡＤＡＲ編集のための基質である構造的特徴を提供することができる。したがって、本明細書に提供される操作されたガイドＲＮＡは、標的に部位特異的に結合し、標的ＲＮＡの標的化された編集を容易にすることができる。更に、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、存在する場合、編集の量または効率を増加させる２つの追加の配列を含み得る。第１に、操作されたガイドＲＮＡは、ＳｍまたはＳｍ様結合ドメイン配列を含み得る。第２に、操作されたガイドＲＮＡは、ｓｎＲＮＡからのヘアピンを含み得る。理論によって束縛されることを望まないが、これらの特徴の両方のうちの１つの存在は、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの局在化を改善することができる。更に、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドが天然に存在するＳｍまたはＳｍ様結合ドメインに対して置換されている操作されたＳｍまたはＳｍ様結合ドメインを含み得る。更に、本開示の操作されたＲＮＡは、天然に存在するｓｎＲＮＡヘアピンに対して少なくとも１つのヌクレオチドが置換されているｓｎＲＮＡヘアピンを含み得る。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションを可能にする標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有する標的化配列を含み得、操作されたガイドＲＮＡは、本明細書に記載の配列番号１（ＡＡＵＵＵＧＵＳＫＡＧ）のＳｍ結合ドメイン配列または配列番号２（ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ）のＳｍＯＰＴ配列の改変またはバリアントを含む操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、配列番号３（マウス：ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＵ）または配列番号４（ヒト：ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＣＵＵＵＵＵＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＵ）のＵ７ヘアピン配列の改変またはバリアントを含む操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはこれらの組み合わせ等のＲＮＡエレメントに作動可能に連結される。

【0146】

本開示の記載の操作されたガイドＲＮＡは、いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に更に連結され得る。本開示の有用なＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターの非限定的な例としては、Ｕ１プロモーター（例えば、配列番号１０、ヒト）、Ｕ７プロモーター（例えば、配列番号１１－マウス、配列番号１２－ヒト）、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、記載の操作されたガイドＲＮＡは、Ｕ７プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの例は、（ａ）の標的化配列、（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列であって、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列は、操作されたＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメインであり、操作されたＳｍもしくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン配列は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列であり得る、（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列であって、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列は、操作されたマウスＵ７ ｓｎＲＮＡヘアピンバリアント配列もしくは操作されたヒトＵ７ ｓｎＲＮＡヘアピンバリアント配列である、（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む記載の操作されたガイドＲＮＡを提供することができる。

【0147】

いくつかの実施形態において、記載の操作されたガイドＲＮＡは、ターミネータを更に含む。例示的なターミネータとしては、限定されないが、マウスＵ７ターミネータ（配列番号１３）、ヒトＵ７ターミネータ（配列番号１４）、またはＵ７ボックスターミネータが挙げられ、ここで、ターミネータは、操作されたガイドＲＮＡに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、ターミネータは、３’ボックスを含む。いくつかの実施形態において、ターミネータは、３’ボックスである。３’ボックスは、限定されないが、マウスＵ７ ３’ボックス（ｍＵ７ ３’ボックス、配列番号１５）またはヒトＵ７ ３’ボックス（ｈＵ７ ３’ボックス、配列番号１６）であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、標的化配列及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される少なくとも１つのミスマッチの３’であるターミネータを更に含む。いくつかの実施形態において、ターミネータは、本明細書に開示されるヘアピンに対して３’である。いくつかの実施形態において、ターミネータは、３’ボックス、３’ボックスとヘアピンとの間に配置された１つ以上のヌクレオチド、及び３’ボックスに対して３’である１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ターミネータは、３’ボックスと、３’ボックスとヘアピンとの間に位置付けられる１つ以上のヌクレオチドとを含む。

【0148】

いくつかの実施形態において、ターミネータは切断型ターミネータである。切断型ターミネータは、参照ターミネータよりも少なくとも１つのヌクレオチドを有するターミネータであり得る。切断型ターミネータのための参照ターミネータは、例えば、マウスＵ７ターミネータ（配列番号１３）、ヒトＵ７ターミネータ（配列番号１４）、またはＵ７ボックスターミネータである。いくつかの実施形態において、切断型ターミネータの切断は、参照ターミネータより１～１５０ヌクレオチド少ない。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータよりも５０ヌクレオチド少ない。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータよりも７９ヌクレオチド少ない。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータよりも９２ヌクレオチド少ない。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータと比較して、ヘアピンと３’ボックスとの間に配置された１つ以上のヌクレオチドのものである。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータと比較して、３’ボックスの３’に位置する１つ以上のヌクレオチドのものである。いくつかの実施形態において、切断は、参照ターミネータと比較して、ヘアピンと３’ボックスとの間に配置された１つ以上のヌクレオチド、及び参照ターミネータと比較して、３’ボックスの３’に配置された１つ以上のヌクレオチドのものである。例えば、切断型ターミネータは、参照ターミネータ（例えば、配列番号１４）と比較して、３’ボックスに対して３’である５０ヌクレオチドの欠失を有する。別の例として、切断型ターミネータは、参照ターミネータと比較して、３’ボックスに対して３’である５０個のヌクレオチドの欠失（例えば、配列番号１４）、及び参照ターミネータと比較して、ヘアピンと３’ボックスとの間に位置する２８個のヌクレオチドの欠失（例えば、配列番号１４）を有する。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、本明細書に開示されるヘアピンの配列等の参照ヘアピンと比較して切断される。いくつかの実施形態において、切断されたヘアピンは、参照ヘアピンと比較して、１～１５個のヌクレオチドの欠失を有する。いくつかの実施形態において、切断されたヘアピンは、参照ヘアピンと比較して、７個のヌクレオチドの欠失を有する。操作されたガイドＲＮＡの様々なエレメントを表２に示す。

【0149】

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、（ａ）（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を用いて、Ｕ７またはＵ１プロモーター、例えば、限定されないが、マウスＵ７（ｍＵ７）プロモーター、ヒトＵ７（ｈＵ７）プロモーター、またはヒトＵ１（ｈＵ１）プロモーターを用いて発現され得るＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲを標的とし、マウスＵ７（ｍＵ７）ターミネータ配列またはヒトＵ７（ｈＵ７）ターミネータ配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータは切断型ターミネータである。

【0150】

本明細書に記載の他の態様は、（ａ）（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を用いて、ｍＵ７プロモーターまたはＲＡＢ７Ａエクソン３ヒトＵ７プロモーターを使用して発現することができ、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータ配列に作動可能に連結される、ＲＡＢ７Ａエクソン１を標的とする本開示の操作されたガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータは切断型ターミネータである。

【0151】

他の例は、本開示の操作されたＲＮＡを提供することができ、操作されたＲＮＡは、（ａ）任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７）を使用して、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方で発現することができ、マウスＵ７ターミネータ配列またはヒトＵ７ターミネータ配列に作動可能に連結されるＬＲＲＫ２遺伝子を標的とする、操作されたガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、マウスＵ７ターミネータ配列またはヒトＵ７ターミネータ配列は、切断型ターミネータである。

【0152】

いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡは、（ａ）（ｂ）配列もしくは操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）ヘアピンもしくは操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を有する、任意のプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターもしくはＵ１プロモーターを使用して発現することができ、（ｂ）及び（ｃ）のうちの少なくとも１つは、操作され、ターミネータ配列（例えば、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータ配列）に作動可能に連結されるＡＢＣＡ４遺伝子を標的とする、操作されたガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータは切断型ターミネータである。

【0153】

いくつかの例において、本開示の操作されたＲＮＡは、（ａ）（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を有する、例えば、５’二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメインを有するヒトＵ１プロモーターを使用して発現することができ、ターミネータ配列、例えば、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータ配列に作動可能に連結される、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲを標的とする、操作されたガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータは切断型ターミネータである。

【0154】

いくつかの実施形態は、編集効率を決定することができるインビトロアッセイを提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡによるＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドのＲＮＡレベルまたはヌクレオチドの塩基の編集の量を決定するためのインビトロアッセイは、ＲＮＡ配列決定を含む。例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を含む操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ配列決定によって決定して、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を欠く以外は同等のＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集の量の増加を容易にすることができる。いくつかの例は、編集効率が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株へトランスフェクトすることと、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチド及びそれ以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクションすることと、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを塩基配列することとによって決定することができるインビトロアッセイを提供する。いくつかの実施形態において、編集効率は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株へトランスフェクトすることと、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチド及びそれ以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクションすることと、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを質量分析することとによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的もしくは間接的に導入すること（例えば、トランスフェクトすること）と、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的もしくは間接的に導入すること（例えば、トランスフェクトすること）と、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを配列決定することとを含むインビトロアッセイにおいて決定することができる。いくつかの場合において、標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすることは、標的ＲＮＡをコードするプラスミドを初代細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクトすることは、前駆体の操作されたポリヌクレオチド、または前駆体の操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株内にコードするポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）をトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、配列決定することは、標的ＲＮＡが逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換された後に、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒ配列決定することを含み得る。

【0155】

いくつかの実施形態において、目的の標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたガイドＲＮＡは、標的アデノシンの１～１００％のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にした。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、標的アデノシンの４０～９０％の編集を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、標的アデノシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％、５～２０％、２０～４０％、４０～６０％、６０～８０％、８０～１００％、６０～８０％、７０～９０％、または最大９０％以上のＲＮＡ編集を容易にすることができる。任意選択で、追加的に、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、オフターゲットアデノシンの１０％未満の編集を維持しながら、これらのレベルのオンターゲットＲＮＡ編集を容易にすることができる。任意選択で、追加的に、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、オフターゲットアデノシンの３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０％の編集を維持しながら、これらのレベルのオンターゲットＲＮＡ編集を容易にすることができる。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【0156】

標的ＲＮＡ及び変異
本明細書に記載される様々な実施形態において、本明細書に提供される操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡに対して実質的に相補性を有する標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み得、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、疾患または状態に罹患している対象を治療するための治療薬として有用であり、対象は、変異を含む標的ＲＮＡまたは変異を必要とする標的ＲＮＡを有することができる。本開示のいくつかの例において、疾患もしくは状態または疾患もしくは状態の症状に罹患している対象を治療する（予防、軽減または緩和することを含む）方法は、対象に、標的ＲＮＡの編集を容易にする治療薬を投与することを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを編集することは、変異の修正を容易にすることができる。例えば、本開示の操作されたＲＮＡは、イノシン（グアノシンとして読み取られる）への変異に存在するアデノシンの編集を容易にすることができる。Ｇ～Ａ点変異を有するＲＮＡを標的とすることによって、本開示の操作されたＲＮＡは、変異のＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２媒介性編集を直接利用することによって、変異を修正することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載されるように、変異は、エクソンスキッピングによって修正され得る。本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、特定の変異を有するエクソンのスキッピングを容易にし、それによって機能的タンパク質を復元する、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を介したアデノシンの編集を容易にすることができる。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡ中に変異を有する標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによって、ＡＤＡＲ媒介性編集の不在下での標的ＲＮＡ中の変異のエクソンスキッピングを促進する。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡは、標的アデノシンの編集を容易にすることができ、また標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックすることができ、そのどちらも、標的ＲＮＡにおける変異のエクソンスキッピングを誘導する。

【0157】

変異は、ミスセンス変異またはナンセンス変異であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡの複数のＲＮＡ編集を容易にすることができる。本明細書で使用される「変異」という用語は、当該タンパク質のコンセンサス配列と比較して、タンパク質をコードする核酸配列に対する変化を指す。「ミスセンス」変異は、１つのコドンを別のコドンに置換する。「ナンセンス」変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするものから停止コドンに変化させる。ナンセンス変異は、タンパク質の切断翻訳をもたらすことが多い。「サイレント」変異は、結果として生じるタンパク質に影響を及ぼさないものである。本明細書で使用される場合、「点変異」という用語は、遺伝子配列中の１つのヌクレオチドのみに影響を与える変異を指す。「スプライス部位変異」は、（イントロンを除去するための処理の前に）プレｍＲＮＡに存在する変異であって、スプライス部位の誤った描写からのタンパク質の誤訳を引き起こし、多くは切断を引き起こす、変異である。変異は、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を含み得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、または対立遺伝子バリアントを含み得る。参照ＤＮＡ配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を及ぼすことがある。変異は、機能に影響を及ぼさないことがある。変異は、１つ以上のヌクレオチド中のＤＮＡレベル、１つ以上のヌクレオチド中のリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、１つ以上のアミノ酸中のタンパク質レベル、またはこれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、１つ以上のヌクレオチドまたは１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、または変換が挙げられ得る。変異は、点変異であり得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対または融合遺伝子は、変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体反転、またはこれらの任意の組み合わせから生じ得る。変異は、三重化、四重化等の反復配列の数の変動を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列と関連するコピー数の増加または減少（コピー数変動、またはＣＮＶ）であり得る。変異は、異なる対立遺伝子における２つ以上の配列変化、または１つの対立遺伝子における２つ以上の配列変化を含み得る。変異は、モザイク等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、キメラ等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、悪性組織中に存在し得る。変異の存在または不在は、ある疾患または状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在または不在は、ある疾患または状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異が存在しないことは、組織またはサンプルが良性であることを示している可能性がある。代替として、変異の不在は、組織または試料が良性であることを示さない場合がある。本明細書に記載される方法は、サンプル中の変異の存在を識別することを含み得る。

【0158】

いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによって標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現をノックダウンする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡまたはＡＳＯ）は、タンパク質のノックダウンを生成するために、変異を導入することができる。タンパク質ノックダウンは、野生型タンパク質の低下した発現とも呼ばれ得る。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、翻訳開始部位（ＴＩＳ）、５’ＵＴＲ等の非翻訳領域、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル部位、またはスプライス部位のうちの１つまたは任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0159】

ＴＩＳ．いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、翻訳開始部位（ＴＩＳ）におけるアデノシンを標的とする。操作されたガイドＲＮＡは、ＴＩＳ（ＡＵＧ）のＧＵＧへのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする。これは、ＲＮＡ翻訳の阻害をもたらし、それによって、タンパク質ノックダウンをもたらす。

【0160】

５’ＵＴＲ．いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内の１つ以上のアデノシンを標的とする。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、５’ＵＴＲのＫｏｚａｋ配列を標的とし得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、５’ＵＴＲの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を標的とし得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、５’ＵＴＲの鉄応答要素（ＩＲＥ）を標的とし得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１つ以上のアデノシン、５’ＵＴＲ（５’ＵＴＲの１つ以上の構造に存在する１つ以上のアデノシンを含む）のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする。いくつかの場合において、複数のアデノシンの大規模または過剰編集は、本開示の操作されたガイドＲＮＡを介して容易にされ得、これは、ｍＲＮＡ転写物のリボソーム停滞をもたらし得、それによってタンパク質ノックダウンをもたらす。

【0161】

スプライス部位．いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、スプライス部位におけるアデノシンを標的とする。操作されたガイドＲＮＡは、スプライス部位におけるＡのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする。これは、プレｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の誤訳及び／または切断をもたらし、それによってタンパク質ノックダウンをもたらし得る。

【0162】

ポリＡシグナル配列．いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡは、ポリＡシグナル配列中の１つ以上のアデノシンを標的とする。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ポリＡシグナル配列中の１つ以上のアデノシンのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にし、それによって、ＲＮＡのプロセシングの破壊、及び標的ｍＲＮＡの分解、ならびに、それによって、タンパク質のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態において、標的は、１つ以上のポリＡシグナル配列を有し得る。これらの場合において、本開示のそれぞれの配列が異なる１つ以上の操作されたＲＮＡを、１つ以上のポリＡシグナル配列中の標的アデノシンに多重化することができる。両方の場合において、本開示の操作されたＲＮＡは、ポリＡシグナル配列におけるアデノシンのイノシンへのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集（細胞機構によってグアノシンとして読み取られる）を容易にし、タンパク質ノックダウンをもたらした。

【0163】

ＡＢＣＡ４．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＡＢＣＡ４ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＡＢＣＡ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＡＢＣＡ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＡＢＣＡ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの例は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）である標的ＲＮＡに対して標的相補性を有する標的化配列を含み得る、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。本開示のいくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡまたは治療法は、Ｇ６３２０Ａ、Ｇ５７１４Ａ、Ｇ５８８２Ａ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される変異を有し得る、ＡＢＣＡ４標的ＲＮＡのＲＮＡ編集を容易にすることができる。操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡエレメントの中でもとりわけ、ＡＢＣＡ４遺伝子のＧからＡへの変異を修正することができる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１または配列番号２に対して最大９０．９％の配列同一性を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、配列番号３に対して最大９６．８％の配列同一性を有する、もしくは配列番号４に対して最大９６．９％の配列同一性を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み得る。他の実施形態において、本明細書に記載される操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１または配列番号２と比較して少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）を有する操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを提供し、操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３または配列番号４と比較して、少なくとも１つのポリヌクレオチド置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２）を有する操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含む。更なる実施形態は、本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７）と組み込まれる、ＡＢＣＡ４標的に対して実質的に相補性を有する標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたガイドＲＮＡを提供することができ、これは、操作されたガイドＲＮＡの発現を駆動することができる。いくつかの例において、ＡＢＣＡ４変異は、それを必要とする対象において、記載の操作されたガイドＲＮＡを治療のために投与することができる対象において、黄斑変性を引き起こすか、またはそれに寄与する。いくつかの例において、黄斑変性は、シュタルガルト黄斑変性であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、シュタルガルト黄斑変性（またはシュタルガルト病）を発症するリスクにあり得るか、または発症していており、これは、少なくとも部分的に、ＡＢＣＡ４の示される変異のうちの１つによって引き起こされ得る。本開示のいくつかの実施形態は、対象において、ＡＢＣＡ４標的ＲＮＡと実質的に相補性を有する標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、編集を容易にし、それによってＡＢＣＡ４における変異を修正し、シュタルガルト病の発生を低減するための操作されたガイドＲＮＡを提供する。いくつかの例において、標的ＲＮＡ分子は、５’Ｇを有するアデノシンを含む。いくつかの例において、５’Ｇを有するアデノシンは、ＲＮＡ編集エンティティによる化学修飾を意図した塩基であり得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲであり得、ＡＤＡＲは、ガイド－標的ＲＮＡ足場による動員後に、５’Ｇを有するアデノシンを化学修飾する。したがって、そのような操作されたガイドＲＮＡは、シュタルガルト黄斑変性に罹患している対象を治療する方法において使用することができる。

【0164】

ＡＰＰ．本開示の他の例は、操作されたガイドＲＮＡに向けられ得、標的ＲＮＡは、編集のために標的とされ得るアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である。操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＡＰＰ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＡＳＯまたはガイドＲＮＡ標的化ＡＰＰ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＡＳＯまたはガイドＲＮＡ標的化ＡＰＰ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＡＳＯまたはガイドＲＮＡ標的化ＡＰＰ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、特定の残基は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、及び本明細書に記載の方法を利用して標的化され得る。いくつかの例において、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、編集された標的ＲＮＡを形成するＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され、その結果、編集された標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質が、Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、Ｋ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、Ｔ７１４Ｘ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの改変または変異を含む。本開示のいくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＰＰ標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集から生成される修飾ＡＰＰポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含む修飾されていないＡＰＰポリペプチドをコードし、少なくとも１つのアミノ酸残基の差は、ＡＰＰポリペプチドのＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、Ｋ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、Ｔ７１４Ｘ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの例において、標的ＲＮＡ分子は、少なくとも部分的に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＰ開始部位、ＡＰＰ切断部位、またはＡＰＰタンパク質のベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）もしくはガンマセクレターゼ切断部位をコードする。いくつかの例において、切断部位におけるＡＰＰタンパク質の切断は、脳または血管におけるアミロイドベータ（ＡβまたはＡベータ）ペプチド沈着を引き起こすか、またはそれに寄与する。いくつかの例において、Ａベータ沈着は、神経変性疾患を引き起こすか、またはそれに寄与する。いくつかの例において、疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、レビー小体認知症、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、認知症を伴うパーキンソン病、ピック病、進行性核上性麻痺、認知症、染色体１７上のタウ変異に関連するパーキンソン症を伴う前頭側頭型認知症、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＡＰＰ標的ＲＮＡと実質的に相補性を有する標的化配列を含み、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、編集されたＡＰＰ標的ＲＮＡを形成するＲＮＡ編集エンティティによる、ＡＰＰ標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするために使用され得、その結果、編集されたＡＰＰ標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質が、本明細書に記載の少なくとも１つの変化または変異を含む。したがって、そのような操作されたＲＮＡは、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症等の神経変性疾患に罹患している対象を治療する方法において使用することができる。

【0165】

ＤＭＰＫ．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＤＭＰＫ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＤＭＰＫを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＤＭＰＫを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＤＭＰＫを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＰＫ標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供し、それは、ＤＭＰＫのＲＮＡ編集を容易にして、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼの発現をノックダウンさせる。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＤＭＰＫ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによって筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼの発現をノックダウンする。筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）は、進行性筋力低下及び筋肉（筋緊張）、主に遠位骨格筋を弛緩させることができないことを特徴とするまれな神経筋疾患である。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＤＭＰＫを標的とし、そのような操作されたガイドＲＮＡを含む組成物は、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼの発現をノックダウンさせるためのＤＭＰＫのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする。

【0166】

ＤＵＸ４．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＤＵＸ４ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＤＵＸ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＤＵＸ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＤＵＸ４を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。本開示は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方、ならびにＤＵＸ４タンパク質の発現をノックダウンするためにＲＮＡがＤＵＸ４を編集するのを容易にするＤＵＸ４標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列を含む、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＤＵＸ４ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによってＤＵＸ４タンパク質の発現をノックダウンする。常染色体優性神経筋疾患である顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、進行性骨格筋無力を特徴とし、表現型重症度及び発症年齢に著しい不均一性を有するまれな神経筋疾患である。ＦＳＨＤの遺伝的原因は、ＤＵＸ４遺伝子（生殖細胞系転写因子）の低メチル化及び調節不全発現をもたらす染色体４上のＤ４Ｚ４反復領域内の変異を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＵＸ４を標的にし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み、ＤＵＸ４、具体的には、ＤＵＸ４－ＦＬのノックダウンを媒介する、ＤＵＸ４－ＦＬのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）の組成物を提供する。

【0167】

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的遺伝子（例えば、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４－ＦＬ）のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にし、これは、タンパク質レベルのノックダウンをもたらす。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによって標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現をノックダウンする。タンパク質レベルのノックダウンは、タンパク質（例えば、ＤＭＰＫタンパク質：筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ、ＤＵＸ４－ＦＬタンパク質）の発現の低下として定量化される。例えば、目的のＤＭＰＫもしくはＤＵＸ４標的に十分に相補的な標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、１％～１００％のＤＭＰＫタンパク質ノックダウンまたはＤＵＸ４－ＦＬタンパク質ノックダウンを容易にすることができる。本開示の操作されたＲＮＡは、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、２０％～４０％、３０％～５０％、４０％～６０％、５０％～７０％、６０％～８０％、２０％～５０％、３０％～６０％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％のＤＭＰＫタンパク質ノックダウンまたはＤＵＸ４－ＦＬタンパク質ノックダウンを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、３０％～６０％のＤＭＰＫタンパク質ノックダウンまたはＤＵＸ４－ＦＬタンパク質ノックダウンを容易にする。ＤＭＰＫタンパク質ノックダウンまたはＤＵＸ４－ＦＬタンパク質ノックダウンは、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）で治療された試料または対象を、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたガイドＲＮＡで治療されていない対照試料または対象と比較するアッセイによって測定され得る。

【0168】

ＤＭＤ。操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＤＭＤ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＤＭＤを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＤＭＤを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＤＭＤを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤ標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列、及び機能的ジストロフィンタンパク質を産生するためにＤＭＤ前ＲＮＡのエクソンスキッピングを容易にする、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、典型的には、ジストロフィンタンパク質の１つ以上のエクソンの喪失を特徴とするまれな神経筋疾患である。ＤＭＤの進行は、不可逆的な方法で時間の経過とともに筋肉の弱体化をもたらす。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＤＭＰＫを標的とし、そのような操作されたガイドＲＮＡを含む組成物は、変異を有するエクソンのスキッピングを促進することによって、ＤＭＤの進行をもたらす変異を有するＤＭＤ転写産物から機能的なジストロフィンタンパク質を復元することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン２のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるエクソン５１ＤＭＤ前ＲＮＡのスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン４５のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン５３のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン４４のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン５２のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン５０のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン７１のスキッピングを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、対象におけるＤＭＤ前ＲＮＡにおけるエクソン７４のスキッピングを誘導することができる。

【0169】

ＬＲＲＫ２．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＬＲＲＫ２ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＬＲＲＫ２を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＬＲＲＫ２を標的化するＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＬＲＲＫ２を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。本開示の記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）標的ＲＮＡに対して標的相補性を有する標的化配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのような操作されたＲＮＡは、疾患または状態に関連するＬＲＲＫ２コードされた変異のＲＮＡ編集を容易にすることができ、ＬＲＲＫ２コードされた変異は、Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｎ１４３７Ｈ、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、Ｑ２４９０Ｎ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ＬＲＲＫ２を標的とするそのような操作されたＲＮＡは、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントの編集、ノックダウン、またはその両方をもたらすことによって、神経変性疾患（パーキンソン病）等の疾患または状態を治療するために使用することができる。いくつかの態様において、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントは、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。ＬＲＲＫ２を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を使用して、限定されないが、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳癌、卵巣癌、アルツハイマー病、疼痛、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、またはこれらの任意の組み合わせ等のＬＲＲＫ２関連疾患または状態を治療することができる。

【0170】

ＭＡＰＴ．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＭＡＰＴ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＡＳＯまたはＭＡＰＴを標的とするガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＡＳＯまたはＭＡＰＴを標的とするガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＡＳＯまたはＭＡＰＴを標的とするガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＲＮＡ（例えば、ＭＡＰＴのｃ．１ ＴＩＳ、ｃ．３１ ＴＩＳ、ｃ．９１ ＴＩＳ、またはｃ．３７９ ＴＩＳ等のＴＩＳ）のコード配列を標的とする。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＲＮＡの非コード配列（例えば、ポリＡ配列）を標的とする。本開示は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方、ならびにＴａｕタンパク質の発現をノックダウンするためにＲＮＡがＭＡＰＴを編集するのを容易にするＭＡＰＴ標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列を含む、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＭＡＰＴ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによってＴａｕタンパク質の発現をノックダウンする。Ｔａｕ病態は、タウオパチーとしてまとめて知られる、広範囲の神経変性疾患の主要な駆動因子であり得る。例えば、Ｔａｕが主要な役割を果たすことができる疾患としては、限定されないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、及び慢性外傷性脳症が挙げられる。タウオパチーは、凝集した、誤って折り畳まれたＴａｕ（ＭＡＰＴ遺伝子）からなる神経原線維タングル（ＮＦＴ）の細胞内蓄積を特徴とする。したがって、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはその両方を含み、Ｔａｕタンパク質をノックダウンするためのＡＤＡＲ媒介編集のためのＭＡＰＴ ＲＮＡを標的とする、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、限定されないが、ＡＤ、ＦＴＤ、自閉症、外傷性脳損傷、パーキンソン病、及びＤｒａｖｅｔ症候群を含む、いくつかの疾患における疾患進行を予防または改善することができる。

【0171】

ＰＭＰ２２．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＰＭＰ２２ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＰＭＰ２２を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＰＭＰ２２を標的化するＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＰＭＰ２２を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。本開示は、ＰＭＰ２２を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み、末梢ミエリンタンパク質－２２（ＰＭＰ２２）のＲＮＡ編集を容易にしてＰＭＰ２２の発現をノックダウンする、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＰＭＰ２２ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによってＰＭＰ２２タンパク質の発現をノックダウンする。シャルコー・マリー・トゥース症候群（ＣＭＴ１Ａ）は、進行性の遠位筋萎縮、感覚喪失、及び足／手の変形を特徴とする、最も一般的な遺伝的に駆動される末梢神経障害である。いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＭＰ２２を標的にし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み、ＰＭＰ２２のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）の組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＰＭＰ２２におけるコード配列を標的とする。例えば、コード配列は、ＰＭＰ２２の翻訳開始部位（ＴＩＳ）（ＡＵＧ）であることができ、操作されたＲＮＡは、ＡＵＧからＧＵＧへのＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にすることができる。ＰＭＰ２２を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＰＭＰ２２のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にすることができ、それによって、そのタンパク質ノックダウンをもたらす。

【0172】

ＳＥＲＰＩＮＡ１．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、本開示は、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を対象とし、操作されたＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＲＮＡ編集を容易にすることができる。例えば、そのような操作されたＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子（Ｇ９９８９Ａ）のヌクレオチド位置９９８９でＧからＡへの変異を修正し得るか、またはＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡは、Ｅ３４２Ｋの変異をコードする。いくつかの例において、変異は、本開示の操作されたガイドＲＮＡを投与することができる対象において、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）等のアンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症を引き起こすか、またはそれに寄与する。いくつかの実施形態は、ヒトであってもよく、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を発症するリスクがある、またはそれを発症している対象を治療する方法を対象とする。このようなアルファ－１アンチトリプシン欠乏症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、例えば、ヒト対象における変異の編集を容易にし、したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１における変異を修正し、対象におけるアルファ－１アンチトリプシン欠乏症の発生を低減することができる。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を有する本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に罹患している対象を治療する方法において使用することができる。

【0173】

いくつかの態様は、操作されたガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込むことができる、本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、Ｕ７）に連結されたＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とすることができる例示的な標的化配列を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。アルファ－１アンチトリプシン欠乏症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＳＥＲＰＩＮＡ１における編集を容易にし、したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１における変異を修正し、対象におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の発生を低減することができる。

【0174】

ＳＮＣＡ．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＮＣＡのＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、組成物、及び操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を有する本明細書に記載のそのような操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＳＮＣＡの発現を、例えばＳＮＣＡ ＲＮＡの３’ＵＴＲでの編集を容易にすることによって、ノックダウンすることができる。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＳＮＣＡ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによってＳＮＣＡタンパク質の発現をノックダウンする。ＳＮＣＡ中の部位を標的化する、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含むそのような操作されたＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。本開示のいくつかの実施形態において、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）標的ＲＮＡに対して標的相補性を有する標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、アルツハイマー病またはＴａｕ－ｐの蓄積に関連する他の疾患を含むが、これらに限定されない、神経変性疾患の治療に使用され得る。いくつかの例において、操作されたＲＮＡは、（ａ）マウスＵ７プロモーターを使用して発現され得るＳＮＣＡ開始コドンを標的とするか、またはマウスＵ７プロモーターを使用して発現されるＳＮＣＡ３’ＵＴＲを、（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を用いて標的とし、マウスＵ７ターミネータ配列またはヒトＵ７ターミネータ配列に作動可能に連結される、操作されたガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、マウスＵ７ターミネータまたはヒトＵ７ターミネータは、切断型ターミネータである。

【0175】

いくつかの例において、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）またはＳＮＣＡのいずれかにおける多型は、特発性パーキンソン病のリスクの増加と関連し得、疾患または状態は、特発性パーキンソン病を含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたＲＮＡの投与は、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ（６０５５^目番目のヌクレオチドにおけるＧ＞Ａ変換）を編集することができ、ＳＮＣＡの発現を低下させるようにＡＴＧのヌクレオチドのいずれかを編集することによって、開始コドンＳＮＣＡを編集することができる。本開示のいくつかの例は、ＳＮＣＡ標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有する標的化配列を含み、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供し、ＳＮＣＡは、コドン１における翻訳開始部位（ＴＩＳ）ＡＵＧ～ＧＴＧ、コドン５におけるＴＩＳ ＡＵＧ、エクソン２における２６５位におけるＡＵＧ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡ編集のための変異を含む。

【0176】

ＳＯＤ１．操作されたガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の操作されたＲＮＡペイロードが本明細書で提供され、本明細書に開示される操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７バリアント配列のうちのいずれか、または任意の組み合わせに作動可能に連結され、操作されたＲＮＡペイロードがＳＯＤ１ ＲＮＡを標的とする。特定の場合において、ＳＯＤ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号４９のうちのいずれか１つ（配列番号６０のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。いくつかの場合において、ＳＯＤ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５０のうちのいずれか１つ（配列番号６１のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。特定の場合において、ＳＯＤ１を標的とするＡＳＯまたはガイドＲＮＡ等の操作されたＲＮＡペイロードは、配列番号５１のうちのいずれか１つ（配列番号６２のＲＮＡ配列）に作動可能に連結される。本開示は、スーパーオキシドジスムターゼ酵素の発現をノックダウンするためのＳＯＤ１のＲＮＡ編集を容易にする操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を提供する。いくつかの場合において、本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＳＯＤ１ ＲＮＡ中の標的配列を阻害、カバー、マスク、またはブロックするように設計または構成され得、それによってＳＯＤ１タンパク質の発現をノックダウンする。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの死及び任意の筋肉運動の喪失を特徴とする、急速に進行する神経変性疾患である。ＡＬＳの正確な原因は不明であるが、ＳＯＤ１における機能獲得変異は、慣れたＡＬＳの約２０％及び自発的ＡＬＳの２％を占める。いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＯＤ１を標的にし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含み、ＳＯＤ１のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）の組成物を提供する。ＳＯＤ１を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＳＯＤ１のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にし、それによって、タンパク質ノックダウンをもたらす。

【0177】

いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、（ａ）（ｂ）操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、（ｃ）操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または（ｂ）の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び（ｃ）の操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を有する、例えば、Ｕ６プロモーター（ヒト）、Ｕ７プロモーター（マウス）、または５’二重ｈｎＲＮＰ Ａ１（不均一リボ核酸タンパク質Ａ１）結合部位を有するマウスＵ７プロモーターを使用して発現することができ、ターミネータ配列、例えば、マウスＵ７ターミネータ配列またはヒトＵ７ターミネータ配列に作動可能に連結される、ＳＯＤ１開始コドンを標的とする、操作されたガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、マウスＵ７またはヒトＵ７ターミネータは切断型ターミネータである。

【0178】

送達ビヒクル
本開示の他の実施形態は、標的ＲＮＡに対して実質的な相補性を有する標的化配列、及び操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、もしくは操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方、または本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のいずれかを含む送達ビヒクルを提供することができる。有用な送達ビヒクルの非限定的な例としては、ベクター、リポソーム、粒子、デンドリマー、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）またはそのような操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、送達ビヒクルを介して対象または対象の少なくとも１つの細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、ベクターである。ベクターは、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む、操作されたガイドＲＮＡの、細胞への送達を容易にして、細胞を遺伝的に修飾することができる。いくつかの例において、ベクターは、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ等のＤＮＡを含む。いくつかの例において、送達ベクターは、真核性ベクター、原核性ベクター（例えば、細菌ベクターまたはプラスミド）、ウイルスベクター、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現カセットである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルスカプシド、逆位末端反復配列を含み、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）または本開示の操作されたガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを使用して、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を細胞に送達することができる。

【0179】

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アルファウイルスベクター、レンチウイルスベクター（例えば、ヒトまたはブタ）、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、組換えベクター、ハイブリッドベクター、キメラベクター、自己相補的ベクター、一本鎖ベクター、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

【0180】

いくつかの実施形態は、ウイルスベクター送達ビヒクルを提供することができ、ここで、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはその誘導体であり得、ここで、ＡＡＶベクター、その誘導体、またはそのＡＡＶベクターもしくはその誘導体のハイブリッドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶｈｕ６８、これらのいずれかの誘導体、及びこれらのいずれかのハイブリッドからなるウイルスベクター血清型の群から選択することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターまたはその誘導体は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、キメラＡＡＶベクター、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。

【0181】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、組換えベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、キメラＡＡＶベクター、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター、一本鎖ＡＡＶ、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

【0182】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。組換えＡＡＶベクターを産生する方法は、概して、いくつかの場合において、プロデューサー細胞株に、（１）ＡＡＶカプシドのＡＡＶ複製及び合成に必要なＤＮＡ、（ｂ）ＡＡＶベクターから欠如しているウイルス機能を含む１つ以上のヘルパー構築物、（ｃ）ヘルパーウイルス、ならびに（ｄ）ＡＡＶベクターのゲノム、例えば、ＩＴＲ、プロモーター及び操作されたＲＮＡ配列等を含有するプラスミド構築物を導入することを伴う。いくつかの例において、本明細書に記載されるウイルスベクターは、文献で利用可能であり得るような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。例えば、ＡＡＶの様々な血清型のゲノム及びタンパク質配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、文献または公的データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）において見出され得る。

【0183】

いくつかの例において、ＡＡＶベクターにおける本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）のパッケージングを含む、本明細書における送達ベクターを産生する方法。いくつかの例において、本明細書に記載の送達ベクターを産生する方法は、（ａ）細胞に、（ｉ）本明細書に開示されるプロモーター及び操作されたＲＮＡペイロードを含むポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）野生型ＡＡＶカプシドタンパク質またはその修飾されたバージョンをコードする複製（Ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（Ｃａｐ）遺伝子を含むウイルスゲノムを導入することと、（ｂ）細胞中で野生型ＡＡＶカプシドタンパク質またはその修飾されたバージョンを発現することと、（ｃ）ＡＡＶ粒子を組み立てることと、（ｄ）本明細書に開示されるペイロードをＡＡＶ粒子にパッケージングし、それによってＡＡＶ送達ベクターを生成することと、を含む。いくつかの例において、組換えベクターは、１つ以上の逆位末端反復を含み、逆位末端反復は、５’逆位末端反復、３’逆位末端反復、及び変異した逆位末端反復を含む。いくつかの例において、変異した末端反復は、末端分解部位を欠いており、それによって自己相補的ＡＡＶを形成することができる。

【0184】

いくつかの例において、ハイブリッドＡＡＶベクターは、カプシド転換、例えば、第１の血清型からの逆位末端反復（ＩＴＲ）を第２の血清型のカプシドにパッケージングすることによって産生され得、第１及び第２の血清型は、同じではない可能性がある。いくつかの例において、第１のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）からのＲｅｐ遺伝子及びＩＴＲは、第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５またはＡＡＶ９）からのカプシドにおいて使用することができ、第１及び第２のＡＡＶ血清型は、同じでなくてもよい。非限定的な例として、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むハイブリッドＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２／９を示すことができる。いくつかの例において、ハイブリッドＡＡＶ送達ベクターは、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９ベクターを含む。

【0185】

いくつかの例において、ＡＡＶベクターは、キメラＡＡＶベクターであり得る。いくつかの例において、キメラＡＡＶベクターは、外因性アミノ酸もしくはアミノ酸置換、または２つ以上の血清型由来のカプシドタンパク質を含む。いくつかの例において、キメラＡＡＶベクターは、形質導入効率、選択性、またはこれらの組み合わせを増加させるように遺伝子操作され得る。

【0186】

いくつかの例において、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶゲノムを含む。自己相補的ＡＡＶゲノムは、一緒にアニーリングして、二本鎖ＤＮＡを形成することができる両方のＤＮＡ鎖を含有することができる。

【0187】

いくつかの例において、送達ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。いくつかの例において、レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、脾臓壊死ウイルスベクター、もしくはラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、もしくは乳癌ウイルスに由来するベクター、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの例において、レトロウイルスベクターは、ウイルスの構造遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）をコードする配列の大部分が欠失し、目的の遺伝子（複数可）によって置き換えることができるようにトランスフェクトされ得る。

【0188】

いくつかの例において、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターであり得る。いくつかの例において、送達ビヒクルは、プラスミドであり得る。いくつかの実施形態において、プラスミドは、ＤＮＡを含む。いくつかの例において、プラスミドは、環状二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの例において、プラスミドは、線形であり得る。いくつかの例において、プラスミドは、１つ以上の目的の遺伝子及び１つ以上の調節要素を含む。いくつかの例において、プラスミドは、複製起点を含有する細菌骨格、及び細菌におけるプラスミド増幅のための抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーを含む。いくつかの例において、プラスミドは、ミニサークルプラスミドであり得る。いくつかの例において、プラスミドは、標的細胞を誘導してプラスミドを保持するための選択的マーカーを提供する１つ以上の遺伝子を含有する。いくつかの例において、プラスミドは、針を保有するシリンジによる注射を通して送達するために製剤化され得る。いくつかの例において、プラスミドは、エレクトロポレーションを介して送達するために製剤化され得る。いくつかの例において、プラスミドは、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。例えば、いくつかの場合において、遺伝子要素は、ドナープラスミドまたは生物からの所望の遺伝子配列の制限消化によって組み立てられ得、ＤＮＡの末端を産生し、次いで、それは別の遺伝子配列に容易に連結され得る。

【0189】

いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡを含有するベクター、または操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター系である。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクター系は、カチオン性脂質、またはポリマーを含む。例えば、非ウイルスベクター系は、リポソームまたはポリマーナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡをコードする操作されたＲＮＡまたはポリヌクレオチド、または操作されたＲＮＡまたはポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターを、流体力学的注射または超音波によって細胞に送達する。

【0190】

医薬組成物
本明細書に記載の医薬組成物（例えば、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を含む組成物、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）をコードするポリヌクレオチド、または操作されたＲＮＡを含む送達ビヒクル、または操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む送達ビヒクル、これらの全ては本明細書に記載される）は、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、ポリヌクレオチド、または送達ビヒクルを必要とするか、または本明細書に記載の疾患もしくは状態の治療を必要とする対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に投与するための薬学的に許容される担体とともに製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、単位用量形態または単位剤形であり得る。本開示のいくつかの実施形態は、（ａ）本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のいずれか、本明細書に記載の操作されたＲＮＡのいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれか、または本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）もしくは操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む送達ビヒクルのいずれか、及び（ｂ）薬学的に許容される、賦形剤、希釈剤、または担体を含む、医薬組成物を提供することができる。

【0191】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という語句は、使用されるレベルでの生物学的組織の摂取または生物学的組織との接触に対して概して安全であることを意味する。薬学的に許容されるものは、生理学的に適合するものと互換的に使用される。

【0192】

薬学的に許容される担体としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション（例えば、油／水エマルションまたは水／油エマルション）、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、またはこれらの混合物）、ならびに種々の種類の湿潤剤、可溶化剤、抗酸化剤、増量剤、アルブミン等のタンパク質担体、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、ラウリル硫酸ナトリウム、等張及び吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）等を挙げることができる。また、組成物は、安定剤及び防腐剤を含むことができる。組成物は、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、浸透圧を調整するための塩、及び緩衝剤等の従来の薬学的添加剤に供することができる。本開示の組成物と一致する担体、安定剤及びアジュバントの追加の例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（２００５）に見出すことができ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のそのような組成物は、いかなる場合においても、レシピエント対象に投与するための適切な剤形、単位用量形態、またはその両方を調製するために、好適な担体とともに有効量の操作されたポリヌクレオチドを含有するであろう。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、哺乳動物における疾患の治療のための治療レジメンの一部として、政府の規制当局の承認を得て製造または販売される。医薬組成物は、例えば、単位剤形もしくは単位用量形態（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ゲルキャップ等）での経口投与、局所投与（例えば、クリーム、ゲル、ローション、もしくは軟膏）、静脈内投与（例えば、粒子塞栓を含まない無菌溶液として、及び静脈内使用に好適な溶媒系において）、または本明細書に記載される任意の他の製剤において、製剤化され得る。

【0193】

投与
投与は、生物学的作用を有する所望の部位への本明細書に記載の組成物（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）の送達を可能にするために使用され得る方法を指すことができる。例えば、目的の標的ＲＮＡに十分に相補的な標的化配列、ならびに操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、もしくは操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、またはそのような操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ構築物、ウイルスベクター、またはその両方に含まれ、静脈内投与によって投与され得る。治療または療法を必要とする領域への本明細書に開示される投与は、例えば、限定するものではなく、経口投与、局所投与、静脈内投与、吸入投与、またはこれらの任意の組み合わせによって達成することができる。いくつかの実施形態において、送達は、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心腔内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩内、脳実質内、髄腔内、脳室内、定位式、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与、またはこれらの組み合わせを含み得る。送達は、体の組織または領域に影響を及ぼすような直接的な適用を含み得る。いくつかの場合において、局所投与は、ローション、溶液、エマルション、クリーム、バーム、油、ペースト、スティック、エアロゾル、発泡体、ゼリー、発泡体、マスク、パッド、粉末、固体、チンキ剤、バター、パッチ、ゲル、スプレー、点滴、液体製剤、軟膏を、皮膚等の表面の外表面に投与することを含み得る。送達は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、または大槽内注射を含み得る。本明細書で提供される組成物は、任意の方法によって投与され得る。

【0194】

投与方法は、動脈内注射、大槽内注射、筋肉内注射、実質内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、鞘内注射、静脈内注射、心室内注射、定位注射、皮下注射、硬膜外、またはこれらの任意の組み合わせによることができる。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入投与を含む）を含み得る。いくつかの実施形態において、送達は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、細胞外小胞、インプラント、またはこれらの組み合わせ等の粒子を含み得る。いくつかの場合において、送達は、デバイスからのものであり得る。いくつかの場合において、送達は、ポンプ、注入ポンプ、またはこれらの組み合わせによって投与され得る。いくつかの実施形態において、送達は、浣腸、点眼剤、鼻スプレー、またはこれらの任意の組み合わせによるものであり得る。いくつかの場合において、対象は、監督のない状態で組成物を投与され得る。いくつかの場合において、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護師、医療助手、雑役係、ホスピスワーカー等）の監督下で組成物を投与され得る。いくつかの実施形態において、医療専門家は、組成物を投与し得る。

【0195】

いくつかの場合において、投与は、経口摂取であり得る。いくつかの場合において、送達は、カプセルまたは錠剤であり得る。経口摂取送達は、茶、エリキシル、食品、飲み物、飲料、シロップ、液体、ゲル、カプセル、錠剤、油、チンキ剤、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、食品は、医療食品であり得る。いくつかの場合において、カプセルは、ヒドロキシメチルセルロースを含み得る。いくつかの実施形態において、カプセルは、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、カプセルは、コーティング、例えば、腸溶性コーティングを含み得る。いくつかの実施形態において、カプセルは、ベジタリアン製品またはヒプロメロースカプセル等のビーガン製品を含み得る。

【0196】

いくつかの実施形態において、送達は、吸入器、拡散器、噴霧器、気化器、またはこれらの組み合わせによる吸入を含み得る。

【0197】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、方法であり得る。いくつかの場合において、本開示の使用または方法は、対象における疾患または状態を治療または予防することができる。

【0198】

処置の方法
標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有し、ＲＮＡエレメント（例えば、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方、例えば配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６０、配列番号６１、もしくは配列番号６２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を有するエレメント）に作動可能に連結される標的化配列を含む、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、疾患または状態に関連または関与する標的ＲＮＡを対象とすることができ、疾患に関連する標的ＲＮＡは、関連する疾患または状態の１つ以上の症状を引き起こすか、もしくは部分的に引き起こし、もしくは寄与し得るか、または疾患もしくは状態に現れる経路に関連するか、もしくは関与し得る。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を含む本開示の操作されたガイドＲＮＡは、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせから選択される疾患または状態を治療するために使用され得る。いくつかの態様において、疾患または状態は、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、及びテイ・サックス病から選択され得る。

【0199】

いくつかの実施形態において、記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方に作動可能に連結され得る、目的の標的ＲＮＡに対して標的相補性を有する標的化配列を含み得、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＧＲＮ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、またはＳＯＤ１、これらのいずれか１つの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、編集を必要とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方に作動可能に連結された、任意の目的の遺伝子を標的とする操作されたガイドＲＮＡ、ならびに本開示のそのような操作されたガイドＲＮＡを含む組成物は、目的の標的ＲＮＡのいずれかに関連する疾患または状態の治療に有用であり得る。

【0200】

本開示の他の実施形態は、対象における疾患または状態を治療する方法を提供することができ、本方法は、疾患または状態の治療を必要とする対象において疾患または状態を治療するために、対象に、本明細書に記載の操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方に作動可能に連結され得る標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有する標的化配列を含む操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のいずれかをコードする任意のポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載の任意の送達ビヒクル、または本開示の医薬組成物のいずれかのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される、記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、操作されたＲＮＡのうちのいずれかをコードする記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか、
操作されたＲＮＡのうちのいずれかもしくは操作されたＲＮＡのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む記載の送達ビヒクルのうちのいずれか、または記載の操作されたＲＮＡのうちのいずれか、操作されたＲＮＡのいずれかをコードする記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか、もしくは操作されたＲＮＡのうちのいずれか、もしくは操作されたＲＮＡのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む記載の送達ビヒクルのうちのいずれか、を含む医薬組成物の使用は、薬剤としてであり得、または対象における疾患もしくは状態を治療するために使用され得る。そのような操作されたＲＮＡ薬剤を使用して、それを必要とする対象における疾患または状態を治療することができる。本開示の他の例は、本明細書に記載される対象における疾患または状態の治療において使用するための、記載の操作されたＲＮＡのうちのいずれかを提供する。本明細書に開示される使用及び方法は、疾患または状態を治療することを対象とすることができ、疾患または状態を治療することは、疾患もしくは状態を予防すること、疾患もしくは状態の１つ以上の症状を予防もしくは治療すること、または疾患もしくは状態に現れる経路もしくは経路の構成要素を予防もしくは治療することを含むこともできる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される使用及び方法は、神経変性疾患または障害、筋肉疾患または障害、代謝疾患または障害、眼疾患または障害、肝臓疾患または障害、がん、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患または状態の治療を対象とすることができる。治療のための本開示の他の疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症様疾患、ウィルソン病、及びシュタルガルト病からなる群から選択され得る。本明細書の開示される操作されたガイドＲＮＡによる疾患または状態の治療のための本開示のいくつかの方法において、疾患または状態は、遺伝子における変異、または遺伝子によってコードされるＲＮＡと関連し得るか、あるいは変異が遺伝子に導入され得、遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＡＬＡＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＤＵＸ４、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＡ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＰＩＮＫ１、ＰＭＰ２２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0201】

本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療の使用または方法は、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、注射（例えば、脳実質注射、鞘内注射、心室内注射、槽内注射、静脈内注射）、間質内、眼窩内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液包内、心臓腔内、軟骨内、尾内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、脳実質内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、定位式、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な投与経路を提供し得る。

【0202】

対象における疾患または状態を治療する方法のうちのいずれかに向けられた本開示のいくつかの例において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。本開示の対象は、疾患または状態のための治療を必要とする対象であってもよく、または対象は、治療のための疾患または状態を有すると診断されてもよい。

【0203】

操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）、本開示の操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、本開示の操作されたＲＮＡ、もしくは操作されたＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む送達ビヒクル、またはこれらのうちのいずれかを含む医薬組成物は、疾患もしくは状態を治療する方法において、または薬剤を調製するため、またはそれを必要とする対象において疾患もしくは状態を治療するために使用するために使用することができる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、疾患、障害、または状態を治療するための、それを必要とする対象における、本開示の操作されたポリヌクレオチドまたは操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）の使用を対象とする。本明細書に記載される他の実施形態は、疾患または状態を治療することを必要とする対象において、それを行う方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の（ａ）本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれか、本明細書に記載される操作されたＲＮＡのうちのいずれか、または本明細書に記載される操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む送達ビヒクルのうちのいずれか、または本明細書に記載の操作されたＲＮＡのうちのいずれか、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかを含むポリヌクレオチドのうちのいずれか、または本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、または本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む送達ビヒクルのうちのいずれかを含む医薬組成物のうちのいずれか、及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を投与することを含み、本方法は、対象における疾患または状態を治療する。障害は、疾患、状態、遺伝子型、表現型、または副作用に関連する任意の状態であり得る。いくつかの実施形態において、疾患、状態、または障害を治療することは、疾患、状態、または障害の症状を予防すること、進行を遅らせること、逆転させること、または緩和することを含み得る。疾患、障害、または状態を治療する方法は、いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードする操作されたポリヌクレオチドのうちのいずれか、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、もしくは操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）をコードするポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む送達ビヒクルのうちのいずれか、または本開示の操作されたＲＮＡのうちのいずれか、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードする操作されたポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む医薬組成物のうちのいずれか、本明細書に記載の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれか、または操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）をコードするポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む送達ビヒクルのうちのいずれか及び、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を投与するか、または送達することを含み得、本方法は、対象において疾患、障害、または状態を治療するために、上記のうちのいずれかを、対象またはそれを必要とする対象の細胞に、投与または送達することを含む。いくつかの例において、疾患または状態を治療する方法

【0204】

いくつかの実施形態において、疾患、障害、または状態を治療する方法は、対象において疾患、障害、または状態を治療するために、それを必要とする対象または対象の細胞に、それを必要とする対象または対象の細胞中で操作されたＲＮＡを発現する、操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）のうちのいずれかをコードする操作されたポリヌクレオチドのいずれかを投与するか、または送達することを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたＲＮＡ（例えば、操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）を使用して、遺伝的障害（例えば、ＦＳＨＤ、ＤＭ１、ＣＭＴ１Ａ、またはＡＬＳ）を治療することができる。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用して、１つ以上の変異に関連する状態を治療し得る。例えば、ＤＵＸ４を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む、操作されたガイドＲＮＡでＦＳＨＤを治療する方法が本明細書に開示される。ＤＭＰＫを標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む、操作されたガイドＲＮＡでＤＭ１を治療する方法もまた、本明細書に開示される。ＰＭＰ２２を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む、操作されたガイドＲＮＡでＣＭＴ１Ａを治療する方法もまた、本明細書に開示される。ＳＯＤ１を標的とし、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列及び操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列の両方を更に含む、操作されたガイドＲＮＡでＡＬＳを治療する方法もまた、本明細書に開示される。

【0205】

いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはその両方を有する本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、エクソンスキッピングを引き起こすＲＮＡ編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を容易にする。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、または両方を有する本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡの配列に結合し、マスクすることができ、それによってエクソンスキッピングを促進する。いくつかの実施形態において、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列、操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列、またはその両方を有する本開示の操作されたＲＮＡ（操作されたガイドＲＮＡ、ＡＳＯ）は、ＲＮＡ編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を容易にすることができ、標的ＲＮＡの配列に結合し、標的ＲＮＡの配列をマスクすることができ、したがって、エクソンスキッピングの相加的な増加を示す。本開示の操作されたＲＮＡは、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンは、その機能を変更する変異を含有し得る。本開示の操作されたＲＮＡは、インビトロで測定される場合、操作されたＳｍＯＰＴバリアント配列または操作されたＵ７ヘアピンバリアント配列を含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンスキッピングの効率は、定量的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、またはＲＮＡ配列決定によって測定することができる。

【0206】

操作されたＲＮＡのエクソンスキッピング効率は、インビトロアッセイ、例えば、定量的ＰＣＲアッセイまたは液滴デジタルＰＣＲアッセイによって測定し、スキッピングされていない転写産物の割合に対して、エクソンスキッピングされた転写産物の割合を検出することができる。このアッセイにおいて、少なくとも２つのフルオロフォアコンジュゲート化プローブを使用し、１つは、エクソンスキッピングされた転写産物に特異的にアニーリングし、別のものは、スキッピングされていない転写産物に特異的にアニーリングする。ｄｄＰＣＲ増幅を行った。

【0207】

本開示の操作されたＲＮＡは、ｄｄＰＣＲによって測定される場合、エクソンスキッピングの効率を少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約１％～約５０％増加させることができる。本開示の操作されたＲＮＡは、エクソンスキッピングの効率を少なくとも約１％増加させることができる。本開示の操作されたＲＮＡは、エクソンスキッピングの効率を最大で約５０％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約１％～約５％、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約３０％、約５％～約４０％、約５％～約５０％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、または約４０％～約５０％増加させることができる。

【0208】

本明細書で使用される場合、数に関して「約」及び「およそ」という用語は、本明細書で使用され、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、数のいずれかの方向（多いまたは少ない）で１０％、５％、または１％の範囲内に入る数を含む。

【0209】

本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一性」という用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定される、最大の対応関係を得るために比較及びアラインメントされた場合に、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列または子配列を指し得る。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域、例えば機能ドメイン全体にわたって存在する場合もあれば、比較される２つの配列の全長にわたって存在する場合もある。

【0210】

配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて子配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

【0211】

本明細書の目的のために、パーセント同一性及び配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。

【0212】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、５’から３’末端まで読み取られるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーを指し得る。「ＲＮＡ」という用語は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、操作されたＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されるガイド－標的ＲＮＡ足場（ガイド－標的ＲＮＡ足場は、限定されないが、バルジ、ミスマッチ、内部ループ、ヘアピン、またはゆらぎ塩基対等の少なくとも１つ、２つ、またはそれ以上の構造的特徴を有することができる）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長い非コードＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）ＲＮＡｉ（阻害ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転送ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（小核小体ＲＮＡ）、及びｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）を含む。ＤＮＡという用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。

【0213】

本明細書に開示されるように、「塩基対（ｂｐ）領域」とは、ガイドＲＮＡ内の塩基が標的ＲＮＡ内の反対の塩基と対になっているガイド－標的ＲＮＡ足場の領域を指す。塩基対形成領域は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の一方の末端または一方の末端の近位から、ガイド－標的ＲＮＡ足場の他方の末端または他方の末端の近位まで延在し得る。塩基対形成領域は、２つの構造的特徴の間に延在し得る。塩基対形成領域は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の一方の末端または一方の末端の近位から、構造的特徴またはその近位まで延在し得る。塩基対形成領域は、構造的特徴からガイド－標的ＲＮＡ足場の他方の末端まで延在し得る。いくつかの実施形態において、塩基対形成領域は、１ｂｐ～１００ｂｐ、１ｂｐ～９０ｂｐ、１ｂｐ～８０ｂｐ、１ｂｐ～７０ｂｐ、１ｂｐ～６０ｂｐ、１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４５ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３５ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、１ｂｐ～２５ｂｐ、１ｂｐ～２０ｂｐ、１ｂｐ～１５ｂｐ、１ｂｐ～１０ｂｐ、１ｂｐ～５ｂｐ、５ｂｐ～１０ｂｐ、５ｂｐ～２０ｂｐ、１０ｂｐ～２０ｂｐ、１０ｂｐ～５０ｂｐ、５ｂｐ～５０ｂｐ、少なくとも１ｂｐ、少なくとも２ｂｐ、少なくとも３ｂｐ、少なくとも４ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも６ｂｐ、少なくとも７ｂｐ、少なくとも８ｂｐ、少なくとも９ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１４ｂｐ、少なくとも１６ｂｐ、少なくとも１８ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐを有する。

【0214】

本明細書で使用される場合、操作されたガイドＲＮＡによって「ＲＮＡ編集を容易にする」という用語は、ＲＮＡ編集エンティティ及び標的ＲＮＡと会合して、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡの標的化された編集を提供するときの、操作されたガイドＲＮＡの能力を指す。いくつかの場合において、操作されたＲＮＡは、標的ＲＮＡの編集のための適切な位置にＲＮＡ編集エンティティの直接動員、配置、配向、またはこれらの任意の組み合わせを行うことができる。他の場合において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズされたときに、本明細書に記載の１つ以上の特徴を有するガイド－標的ＲＮＡ足場を形成し、特徴を有するガイド－標的ＲＮＡ足場は、標的ＲＮＡの編集のための適切な位置にＲＮＡ編集エンティティを動員するか、配置するか、配向するか、またはこれらの任意の組み合わせを行う。

【0215】

詳細な実施形態が本明細書で開示されるが、開示される実施形態は単なる例示であることを理解されたい。加えて、様々な実施形態に関連して示される実施例の各々は、例証的であることを意図しており、制限的ではない。

【0216】

本明細書で使用される全ての用語は、別段の定めがない限り、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有することが意図される。別途定義されない限り、全ての濃度は、局所組成物の全重量に対する指定された構成要素の重量パーセンテージの観点からである。

【0217】

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味するものとする。本明細書で使用される場合、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味する。

【0218】

本明細書で使用される場合、数値の全ての範囲は、エンドポイント及び開示された値の間に開示された全ての可能な値を含む。全ての半分の積分数値の正確な値も、具体的に開示され、開示された範囲の全てのサブセットの制限として企図される。例えば、０．１％～０．３％の範囲は、０．１％、１％、１．５％、２．０％、２．５％、及び３％のパーセンテージを具体的に開示する。加えて、０．１～３％の範囲は、０．５％～２．５％、１％～３％、０．１％～２．５％などを含む元の範囲のサブセットを含む。個々の成分の全ての重量％の合計が１００％を超えないことが理解されるであろう。

【0219】

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、「バルジ」は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の形成時にのみ実質的に形成される構造を指し、操作されたガイドＲＮＡまたは標的ＲＮＡのいずれかにおける連続したヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではない。バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の二次または三次構造を変化させる可能性がある。バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場のガイドＲＮＡ側において０～４個の連続したヌクレオチドを有し得、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において１～４個の連続したヌクレオチドを有し得るか、またはバルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側において０～４個のヌクレオチドを有し得、ガイド－標的ＲＮＡ足場のガイドＲＮＡ側において１～４個の連続したヌクレオチドを有し得る。しかしながら、バルジは、本明細書で使用される場合、操作されたガイドＲＮＡの単一の関与するヌクレオチド、及び標的ＲＮＡの単一の関与するヌクレオチドが塩基対を形成しない構造を指すものではなく、塩基対を形成しない操作されたガイドＲＮＡの単一の関与するヌクレオチド、及び標的ＲＮＡの単一の関与するヌクレオチドは、本明細書においてミスマッチと呼ばれる。更に、ガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれかにおける関与するヌクレオチドの数が４を超える場合、得られた構造は、もはやバルジとはみなされず、むしろ内部ループとみなされる。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は２個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は、３個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場は、４個のバルジを有する。したがって、バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0220】

いくつかの実施形態において、ガイド－標的ＲＮＡ足場内のバルジの存在により、標的ＲＮＡ内の標的Ａを選択的に編集し、標的ＲＮＡ内の非標的Ａ（複数可）のオフターゲット編集を減らすようにＡＤＡＲを配置したり、配置を助けたりすることができる。いくつかの実施形態において、ガイド－標的ＲＮＡ足場におけるバルジの存在は、追加の量のＡＤＡＲを動員することができるか、または動員に役立つことができる。本明細書に開示されるガイド－標的ＲＮＡ足場におけるバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティ等の他のタンパク質を動員することができる。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるバルジは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、標的ＲＮＡ中に存在する他のＡ（複数可）と比較して、編集される標的ＲＮＡのＡに対する配列特異性を付与するのにも役立つことができる。例えば、バルジは、標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ＡＤＡＲ編集を指示するのに役立ち得る。

【0221】

本明細書に記載されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジまたは非対称バルジであり得る。対称バルジは、バルジの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場内の対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側で同じ数のヌクレオチドを有することができる。本開示の対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、対称バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0222】

本明細書に開示されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジまたは非対称バルジであり得る。非対称バルジは、バルジの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における４個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、非対称バルジは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0223】

本明細書に記載される「バーベル」は、標的ＲＮＡへのガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に現れる一対の内部ループ潜在的構造を指す。いくつかの実施形態において、各内部ループは、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成されたガイド－標的ＲＮＡ足場の５’末端または３’末端に向かって配置されている。いくつかの実施形態において、各内部ループは、マイクロフットプリント配列の反対側に隣接する。標的ＲＮＡへのガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に、マイクロフットプリント配列の反対側に隣接するバーベルマクロフットプリント配列の挿入は、マイクロフットプリントの反対側にバーベル内部ループの形成をもたらし、これは、次に、特異的標的ＲＮＡの編集を容易にする少なくとも１つの構造的特徴を含む。

【0224】

本明細書に開示されるように、「塩基対（ｂｐ）領域」とは、ガイドＲＮＡ内の塩基が標的ＲＮＡ内の反対の塩基と対になっているガイド－標的ＲＮＡ足場の領域を指す。塩基対形成領域は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の一方の末端または一方の末端の近位から、ガイド－標的ＲＮＡ足場の他方の末端または他方の末端の近位まで延在し得る。塩基対形成領域は、２つの構造的特徴の間に延在し得る。塩基対形成領域は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の一方の末端または一方の末端の近位から、構造的特徴またはその近位まで延在し得る。塩基対形成領域は、構造的特徴からガイド－標的ＲＮＡ足場の他方の末端まで延在し得る。いくつかの実施形態において、塩基対形成領域は、１ｂｐ～１００ｂｐ、１ｂｐ～９０ｂｐ、１ｂｐ～８０ｂｐ、１ｂｐ～７０ｂｐ、１ｂｐ～６０ｂｐ、１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４５ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３５ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、１ｂｐ～２５ｂｐ、１ｂｐ～２０ｂｐ、１ｂｐ～１５ｂｐ、１ｂｐ～１０ｂｐ、１ｂｐ～５ｂｐ、５ｂｐ～１０ｂｐ、５ｂｐ～２０ｂｐ、１０ｂｐ～２０ｂｐ、１０ｂｐ～５０ｂｐ、５ｂｐ～５０ｂｐ、少なくとも１ｂｐ、少なくとも２ｂｐ、少なくとも３ｂｐ、少なくとも４ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも６ｂｐ、少なくとも７ｂｐ、少なくとも８ｂｐ、少なくとも９ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１４ｂｐ、少なくとも１６ｂｐ、少なくとも１８ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ有する。

【0225】

「相補的」または「相補性」という用語は、例えば、水素結合（例えば、伝統的なワトソン－クリック）、共有結合、または他の類似の方法によって核酸が対応する核酸配列と１つ以上の結合を形成する能力を指す。ワトソン－クリック塩基対形成において、二重水素結合は、核酸塩基ＴとＡとの間に形成され、一方、三重水素結合は、核酸塩基ＣとＧとの間に形成される。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａに相補的であり得る。相補性率は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列のうちの全ての連続した残基が、第２の核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合することを意味し得る。本明細書で使用される「実質的に相補的」は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、であり得る相補性の程度を指し得、またはストリンジェントな条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする２つの核酸を指し得る。核酸は、非特異的配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、「非特異的な配列」または「特異的ではない」という用語は、任意の他の核酸配列に対して相補的であるように設計され得ないか、または任意の他の核酸配列に対して部分的にのみ相補的であり得る一連の残基を含有する核酸配列を指し得る。

【0226】

「本質的に構成される」とは、構成要素が、市販材料に存在する通常の不純物とともに、及び本開示で提供される実施形態の動作に影響を及ぼさないレベルで、例えば、５重量％未満、または１重量％未満、または更には０．５重量％未満のレベルで存在する任意の他の添加剤とともに、リストされた構成要素のみを含むことを意味する。

【0227】

「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、及び「分析する」という用語は、測定の形態を指すために本明細書で互換的に使用され得る。これらの用語は、要素が存在し得るか否かを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的、定性的、または定量的及び定性的決定を含み得る。評価することは、相対的であっても絶対的であってもよい。「の存在を検出する」は、文脈に応じて、存在し得るか否かを決定することに加えて、存在する何かの量を決定することを含み得る。

【0228】

用語「有効量」または「治療有効量」の薬剤または組成物（例えば、操作されたポリヌクレオチドを有する組成物等）は、本明細書で使用する場合、臨床結果等の有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、疾患の障害または状態の治療または防止のために有効な量で投与される。別の実施形態において、有効量の組成物を投与することは、例えば、１つ以上の症状もしくは状態を緩和もしくは改善、もしくは予防もしくは防止すること、疾患、障害、もしくは状態の程度を減少させること、疾患、障害、もしくは状態の状態を安定化させる（維持するかまたは悪化させない）こと、疾患、障害、もしくは状態の拡大を予防すること、疾患、障害、もしくは状態の進行を遅延または減速させること、疾患、障害、もしくは状態を改善もしくは緩和すること、及び寛解（部分寛解または完全寛解かにかかわらず）を、薬剤の投与なしで得られた応答と比較して検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、達成するのに十分な量である。疾患、障害、もしくは状態を「緩和する」とは、疾患、障害、もしくは状態の程度、疾患、障害、もしくは状態の望ましくない臨床的症状、または両方が減少し、進行の時間経過が、遅延もしくは延長されるかまたはその両方であること（治療の不在下での程度または時間経過と比較して）を意味する。

【0229】

本明細書で使用される「をコードする」という用語は、対応する遺伝子発現産物を産生するのに十分な情報または命令配列を提供するためのポリヌクレオチドの能力を指す。非限定的な例において、ｍＲＮＡは、翻訳中にポリペプチドをコードすることができ、一方、ＤＮＡは、転写中にｍＲＮＡ分子をコードすることができる。

【0230】

本明細書に開示されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。得られたｄｓＲＮＡ基質は、本明細書において、「ガイド－標的ＲＮＡ足場」とも呼ばれる。本明細書では、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場に存在し得る「構造的特徴」について説明する。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（動員ヘアピンもしくは非動員ヘアピン）が挙げられる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５０個の特徴を有することができる。本開示の操作されたガイドＲＮＡは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０の特徴を有することができる。いくつかの実施形態において、操作された潜在ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション時に、操作された潜在ガイドＲＮＡの潜在的構造から構造的特徴（例えば、ミスマッチ、バルジ、内部ループ）が形成され、それによってガイド－標的ＲＮＡ足場が形成され得る。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、潜在的構造から形成されず、代わりに、予め形成された構造（例えば、ＧｌｕＲ２動員ヘアピンまたはＵ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピン）である。

【0231】

本明細書に開示される「ガイド－標的ＲＮＡ足場」とは、潜在的構造を有するガイドＲＮＡと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション時に形成される結果として得られる二本鎖ＲＮＡである。ガイド－標的ＲＮＡ足場は、ハイブリダイゼーション時に二本鎖ＲＮＡ二本鎖内に形成される１つ以上の構造的特徴を有する。例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場は、バルジ、ミスマッチ、内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の特徴を有し得る。

【0232】

本明細書に開示されるように、「ヘアピン」は、一本鎖ＲＮＡ鎖の一部分がそれ自体で折り畳まれてＲＮＡ二本鎖を形成する、ＲＮＡ二本鎖である。一本鎖ＲＮＡ鎖の一部分は、互いに塩基対を形成するヌクレオチド配列を有することに起因してそれ自体で折り畳まれ、ヌクレオチド配列は、それ自体で塩基対を形成しない介在配列によって分離され、したがって、塩基対形成した一部分及び非塩基対形成した、介在するループ部分を形成する。ヘアピンは、二本鎖構造全体が１０～５００ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのループ部分は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１～１０個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、２個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピンまたは非動員ヘアピンを含み得る。ヘアピンは、本開示の操作されたガイドＲＮＡ内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位にあるか、もしくは３’末端に存在するか、本開示の操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位にあるか、もしくは５’末端に存在するか、本開示の操作されたガイドＲＮＡの標的化ドメインの近位にあるか、もしくは標的化ドメイン内に存在するか、またはこれらの任意の組み合わせである。

【0233】

本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン、非動員ヘアピン、またはこれらの任意の組み合わせを指し得る。「動員ヘアピン」は、本明細書に開示されるように、ＡＤＡＲ等のＲＮＡ編集エンティティを少なくとも部分的に動員し得る。いくつかの場合において、動員ヘアピンは、標的ＲＮＡへの結合の不在下で形成され、存在し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインまたはその一部である。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインまたはその一部である。動員ヘアピンは、本明細書に定義されるように、天然に存在するＡＤＡＲ基質またはその切断を含み得る。したがって、ＧｌｕＲ２等の動員ヘアピンは、操作された潜在的ガイドＲＮＡに提供される潜在的構造によって形成される構造的特徴ではなく、操作されたガイドＲＮＡを含む構築物に存在し得る予め形成された構造的特徴である。動員ヘアピンは、本明細書に記載されるように、天然に存在するＡＤＡＲ基質またはその切断であり得る。

【0234】

「非動員ヘアピン」は、本明細書に開示されるように、ＲＮＡ編集エンティティを動員する主要な機能を有しない。非動員ヘアピンは、いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティを動員しない。非動員ヘアピンは、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは核保持を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡからのヘアピンを含む。したがって、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピン等の非動員ヘアピンは、操作された潜在的ガイドＲＮＡに提供される潜在的構造によって形成される構造的特徴ではなく、操作されたガイドＲＮＡ構築物を含む構築物中に存在し得る予め形成された構造的特徴である。

【0235】

本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一性」という用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定される、最大の対応関係を得るために比較及びアラインメントされた場合に、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列または子配列を指し得る。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、または代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。

【0236】

配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて子配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

【0237】

本明細書の目的のために、パーセント同一性及び配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行うことができ、その教示のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。

【0238】

いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、「内部ループ」は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の形成時にのみ実質的に形成される構造を指し、操作されたガイドＲＮＡまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではなく、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側または操作されたガイドＲＮＡ側におけるいずれかの、内部ループの一方の側は、５以上のヌクレオチドを有する。ガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側の両方における関与するヌクレオチドの数が５を下回る場合、得られた構造は、もはや内部ループとはみなされず、むしろ、構造的特徴のサイズに応じて、バルジまたはミスマッチとみなされる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。

【0239】

ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側または操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの片側は、５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチド、またはその間の任意の数のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、５００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、６００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、７００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、８００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、９００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの片側は、１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0240】

本明細書に記載されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。「対称内部ループ」は、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における２０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における３０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における４０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における６０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における７０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における８０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における９０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１１０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１２０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１３０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１４０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における２５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における３５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における４５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における６００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における７００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における８００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における９００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、対称内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0241】

本明細書に開示されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。「非対称内部ループ」は、内部ループの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のガイド－標的ＲＮＡ足場における非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側において異なる数のヌクレオチドを有し得る。

【0242】

本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５～１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作された側におけるヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側におけるヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５～１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５～１０００個のヌクレオチドによって形成され得、ガイド－標的ＲＮＡ足場標的の操作された側におけるヌクレオチドの数は、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側におけるヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の７個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における６個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の８個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における７個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の９個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における８個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の１０個のヌクレオチドの内部ループの標的ＲＮＡ側によって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における９個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたガイドＲＮＡ側における１０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５


０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１５０個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における２００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における２００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における３００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における３００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における４００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足


場の操作されたポリヌクレオチド側における４００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における５００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ガイド－標的ＲＮＡ足場の標的ＲＮＡ側における１０００個のヌクレオチド、及びガイド－標的ＲＮＡ足場の操作されたポリヌクレオチド側における５００個のヌクレオチドによって形成され得る。したがって、非対称内部ループは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0243】

「潜在的構造」は、標的ＲＮＡへのガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時にのみ実質的に形成される構造的特徴を指す。例えば、ガイドＲＮＡの配列は、１つ以上の構造的特徴を提供するが、これらの構造的特徴は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時にのみ実質的に形成され、したがって、１つ以上の潜在的構造的特徴は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に構造的特徴として現れる。標的ＲＮＡに対するガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に、構造的特徴が形成され、したがって、ガイドＲＮＡに提供される潜在的構造がマスクされない。

【0244】

「操作された潜在的ガイドＲＮＡ」は、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、またはハイブリダイゼーション時にのみ、編集される標的アデノシンでの単一のＡ／Ｃミスマッチ特徴以外の、構造的特徴の少なくとも一部分を実質的に形成する、配列の一部分を含む操作されたガイドＲＮＡを指す。

【0245】

本明細書に開示されるように、「マクロフットプリント」配列は、それがマイクロフットプリント配列に隣接するように配置することができる。更に、マクロフットプリント配列は、マイクロフットプリント配列に隣接することができるが、マクロフットプリントのいずれかの末端に隣接する追加の潜在的構造も組み込むことができる。いくつかの実施形態において、そのような追加の潜在的構造は、マクロフットプリントの一部として含まれる。いくつかの実施形態において、そのような追加の潜在的構造は、別個の、異なる、またはマクロフットプリントとは別個の両方である。

【0246】

「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ分子である。一般に、ＲＮＡはＤＮＡから転写され得る。いくつかの場合において、配列中の非タンパク質コード領域を含有する前駆体ｍＲＮＡは、ＤＮＡから転写され、次いで、非コード領域（イントロン）のうちの全部または一部分を除去して、成熟ｍＲＮＡを産生するように処理され得る。本明細書で使用される場合、「プレｍＲＮＡ」という用語は、非タンパク質コード領域を除去する処理を受ける前の、ＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子を指し得る。

【0247】

本明細書に記載されるように、「マイクロフットプリント」配列は、発現されると、アデノシンデアミナーゼ酵素を介した標的ＲＮＡのアデノシンの編集を容易にする潜在的な構造を有する配列を指す。

【0248】

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質（例えば、ガイド－標的ＲＮＡ足場）は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、「ミスマッチ」という用語は、ガイド－標的ＲＮＡ足場内の標的ＲＮＡ中の対向する単一ヌクレオチドに対して、対形成していないガイドＲＮＡ中の単一ヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対を形成しない任意の２つの単一ヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側の関与するヌクレオチドの数が１を超える場合、結果として生じる構造はもはやミスマッチとはみなされず、構造的特徴のサイズに応じてバルジまたは内部ループとみなされる。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチである。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＣを含み得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＡを含み得る。Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＧを含み得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるミスマッチは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。したがって、ミスマッチは、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0249】

本明細書で使用される「変異」という用語は、参照配列と比較し得る、核酸配列またはポリペプチド配列に対する変化を指し得る。変異は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）において、またはポリペプチドもしくはタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせにおいて生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、１つ以上のヌクレオチドまたは１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、または変換が挙げられ得る。変異がなく、ポリペプチド配列をコードする核酸配列における変異の非限定的な例としては、１つのコドンの別のコドンへの置換をもたらし得る「ミスセンス」変異、特定のアミノ酸をコードするコドンを終止コドンに変化させ得る「ナンセンス」変異（タンパク質の切断された翻訳をもたらし得る）、または得られたタンパク質に影響を及ぼさないものであり得る「サイレント」変異が挙げられる。変異は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列中の１つのヌクレオチドのみに影響を及ぼす変異を指し得る「点変異」であり得る。変異は、（イントロンを除去するための処理の前の）プレｍＲＮＡに存在し、スプライス部位の誤った描写からのタンパク質の誤訳、及びしばしば切断をもたらし得る、「スプライス部位変異」であり得る。変異は、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を含み得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、または対立遺伝子バリアントを含み得る。変異は、機能に影響を及ぼすことがある。変異は、機能に影響を及ぼさないことがある。変異は、１つ以上のヌクレオチド中のＤＮＡレベル、１つ以上のヌクレオチド中のリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、１つ以上のアミノ酸中のタンパク質レベル、またはこれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、１つ以上のヌクレオチドまたは１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、または変換が挙げられ得る。変異は、点変異であり得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、または対立遺伝子バリアントを含み得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対または融合遺伝子は、変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体反転、またはこれらの任意の組み合わせから生じ得る。変異は、三重化、四重化等の反復配列の数の変動を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列と関連するコピー数の増加または減少（例えば、コピー数変動、またはＣＮＶ）であり得る。変異は、異なる対立遺伝子における２つ以上の配列変化、または１つの対立遺伝子における２つ以上の配列変化を含み得る。変異は、モザイク等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、キメラ等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、悪性組織中に存在し得る。変異の存在または不在は、ある疾患または状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在または不在は、ある疾患または状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異が存在しないことは、組織またはサンプルが良性であることを示している可能性がある。代替として、変異の不在は、組織または試料が良性であることを示さない場合がある。本明細書に記載される方法は、サンプル中の変異の存在を識別することを含み得る。

【0250】

変異の存在または不在は、ある疾患または状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在または不在は、ある疾患または状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異の不在は、組織または試料が良性であり得ることを示す場合がある。代替として、変異の不在は、組織または試料が良性であり得ることを示さない場合がある。本明細書に記載される方法は、サンプル中の変異の存在を識別することを含み得る。

【0251】

「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指し得る。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例であり得る：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーション等により、重合後に更に修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指し得る。別途の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドであり得る本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、または予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。

【0252】

ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの特定の配列で構成され得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖（例えば、リボースまたは２’デオキシリボース）及び核酸塩基、例えば、窒素系塩基を含む。核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、及びイノシン（Ｉ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒポキサンチンがＰ－Ｎ９－グリコシド結合を介してリボフラノースに接続され得るときに、Ｉは形成され得、以下の化学構造をもたらす。

【化1】

【0253】

いくつかのポリヌクレオチドの実施形態は、ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、類似のＲＮＡ配列と互換性であり得る。いくつかの実施形態は、ＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、類似のＤＮＡ配列と互換性であり得る。いくつかの実施形態において、Ｕ及びＴは、本明細書に提供される配列において互換的であり得る。

【0254】

「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、互換的かつそれらの最も広い意味で使用され得、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を指し得る。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有し得、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されなくてもよい。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤ及びＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体ならびにペプチド模倣物を含む、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または合成アミノ酸のいずれかを指し得る。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、１つより多い天然に存在するか、または組換えで産生されたタンパク質由来のドメインで構成されるタンパク質を指し得、概して、各ドメインは、異なる機能を果たす。この点に関して、「リンカー」という用語は、これらのドメインを一緒に連結し、任意選択的に、融合タンパク質ドメインの立体配座を保存するため、融合タンパク質ドメイン間のそれらのそれぞれの機能を損なう可能性のある好ましくない相互作用を予防するため、またはその両方のために使用され得るタンパク質断片を指し得る。

【0255】

「終止コドン」という用語は、翻訳の終止をシグナル伝達するメッセンジャーＲＮＡ内の３つのヌクレオチド連続配列を指し得る。非限定的な例は、ＲＮＡ、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（アンバー、オパールとしても知られる）、及びＤＮＡ ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡに含まれる。別段で注記しない限り、この用語はまた、未成熟終止コドンを導入し、任意の得られるタンパク質を異常に短縮させる、ＤＮＡまたはＲＮＡ内のナンセンス変異を含み得る。

【0256】

本明細書に開示されるように、「構造化モチーフ」という用語は、ガイド－標的ＲＮＡ足場中に２つ以上の特徴を含む。

【0257】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示による組成物（例えば、本開示の操作されたＲＮＡを含む組成物）、薬剤、またはその両方が、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、治療目的、またはこれらの組み合わせのために投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、任意の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳動物）が挙げられる。それを必要とする対象は、典型的には、本明細書に記載の疾患、障害、または状態を治療することが望ましいか、または本明細書に記載される組成物で治療することが望ましい対象である。例えば、それを必要とする対象は、治療を求めたり、治療を必要としたり、治療を受けたり、将来的に治療を受けたりすることができるか、または特定の疾患、障害、もしくは状態について訓練を受けた専門家によってケアされているヒトもしくは動物である。

【0258】

「インビボ」という用語は、対象の体内で生じる事象を指す。

【0259】

「エクスビボ」という用語は、対象の体外で生じる事象を指す。エクスビボアッセイは、対象に対して行われなくてもよい。むしろ、それは、対象から分離した試料上で行われ得る。試料に対して行われるエクスビボアッセイの例は、「インビトロ」アッセイであり得る。

【0260】

「インビトロ」という用語は、材料を得ることができる生物学的供給源から分離することができるように、実験室試薬を保持するための容器に含有されている場所で生じるイベントを指す。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞を用いることができる細胞ベースのアッセイを包含することができる。インビトロアッセイはまた、無傷の細胞を用いることができない無細胞アッセイを包含することができる。

【0261】

「ゆらぎ塩基対」という用語は、弱く塩基対形成する２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指し得る。したがって、ゆらぎ塩基対は、操作された潜在的ガイドＲＮＡによって提供される潜在的構造から形成される構造的特徴であり得る。

【0262】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、レシピエントにおいて有益な結果または所望の結果を得るための医薬または他の介入レジメンに関して使用され得る。有益な結果または所望の結果としては、限定されないが、治療的利益、予防的利益、またはその両方が挙げられる。治療的利益は、治療されている症状または基礎障害の根絶または改善を指し得る。また、治療的利益は、対象が依然として基礎障害を患っている可能性があるにもかかわらず対象において改善を観察することができるようになる、基礎障害と関連する生理学的症状のうちの１つ以上の根絶または改善によって達成することができる。予防的効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させる、予防する、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発症を遅延させる、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅延させる、停止させる、もしくは逆転させること、またはこれらの任意の組み合わせを含む。予防的利益のために、特定の疾患を発症させるリスクにおける対象、または疾患の生理学的症状のうちの１つ以上を報告する対象に対しては、この疾患の診断がなされていない可能性があるにもかかわらず、治療を受けることができる。

【実施例】

【0263】

以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の刺激、システム、及び方法の実施形態を代表するものであり、いかなる方法においても限定的であることを意図していない。

【0264】

実施例１
ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンの変異誘発スクリーニング
この実施例は、ＳｍＯＰＴ配列、天然Ｕ７ Ｓｍ結合配列、天然Ｕ１ Ｓｍ結合配列、マウスＵ７ヘアピン、またはヒトＵ７ヘアピンの変異を含有する、例示的な操作されたポリヌクレオチドガイドＲＮＡの変異誘発スクリーニングを説明する。この２５４個のＳｍＯＰＴ Ｕ７配列バリアントのセットは、３つのアンチセンスガイドＲＮＡ：ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを標的とする１００ヌクレオチド（ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ１００＠５０、配列番号１７）、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ ｈｎＲＮＰＡ１（ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ ｈｎＲＮＰＡ１ １００＠５０、配列番号１８）、またはＧＡＰＤＨを標的とする１１５ヌクレオチド（ＧＡＰＤＨ１１５＠８０４ループ（－５、＋３０）、配列番号１９）に付加される。

【0265】

図１Ａ～図１Ｄは、Ｓｍ結合ドメイン配列及びＵ７ヘアピン配列を含有する例示的な操作されたポリヌクレオチドを示す。図１Ａ及び図１Ｂの黒い枠は、１４個の単一塩基置換が行われる領域を識別する。図１Ａ及び図１Ｂの黒い点線の枠は、それぞれ、１０または１４個のヘアピン対置換が行われる領域を表す。図１Ａ及び図１Ｂの黒い破線の枠は、余分な複製ベースが挿入される領域を表す。図１Ｃ及び図１Ｄの黒い枠は、１２個の単一塩基置換が行われる領域を示す。各置換について３つの代替塩基を有する潜在的な置換（例えば、７６個）の数は、合計２２８個の変異体をもたらす。重複塩基変異体及び対照配列を加えると、２５３個のＳｍＯＰＴ Ｕ７変異体が得られる。例えば、変異体の総セットに付加された３つのガイドＲＮＡを使用して、７５９－ｐｌｅｘライブラリスクリーンを生成する。

【0266】

ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン変動を有するガイドＲＮＡライブラリ内の各ガイドＲＮＡから得られるＲＮＡ編集を測定する。操作されたガイドＲＮＡ構築物のプールを含むプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ライブラリから正確に１つの構築物を各トランスフェクトされた細胞のゲノムに安定的に組み込み、各ガイドＲＮＡの編集効率を１２日後に測定する。

【0267】

実施例２
ＳｍＯＰＴ、Ｕ１Ｓｍ、Ｕ７Ｓｍ及びＵ７ヘアピンの変異誘発スクリーニング
ＳｍＯＰＴ配列、Ｕ１Ｓｍ配列、Ｕ７Ｓｍ配列、マウスＵ７（ｍＵ７）ヘアピン配列、またはヒトＵ７（ｈＵ７）ヘアピン配列における個々に変異した塩基を有するガイドＲＮＡを試験して、野生型構築物と比較した編集効率を決定した。修飾されていないＳｍＯＰＴ配列（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ配列番号２２）（ＲＮＡ配列ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ配列番号２）、修飾されていないＵ１Ｓｍ配列（ＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧ配列番号２３）（ＲＮＡ配列ＡＡＵＵＵＧＵＧＧＡＧ配列番号２０）、及び修飾されていないＵ７Ｓｍ配列（ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ配列番号２４）（ＲＮＡ配列ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ配列番号２１）を、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの各塩基において個別に変異させた。修飾されていないｍＵ７ヘアピン配列（配列番号３）（部分的ｍＵ７ ＤＮＡ配列、ＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣ配列番号２５）（部分的ＲＮＡ配列、ＣＡＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣ配列番号２６）及び修飾されていないｈＵ７ヘアピン配列（配列番号４）（部分的ｈＵ７ ＤＮＡ配列、ＴＡＧＧＣＴＴＴＣＴＧＧ配列番号２７）（部分的ＲＮＡ配列ＵＡＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧ配列番号２８）を、最初の２つの塩基の各々において、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ中のヘアピンステムループ領域に沿った相補対として個別に変異させた。この一連のバリエーションを、３つの標的ＲＮＡのアンチセンス領域：ＲＡＢ７Ａ、ＳＮＣＡ、及びＧＡＰＤＨに付加し、編集有効性に対する変異の影響を決定する。

【0268】

ガイドを、単一細胞単一コピープールドライブラリトランスフェクションスクリーンによって試験した。簡潔に説明すると、上に記載され、図１に示されるように、Ｓｍ結合ドメインまたはＵ７ヘアピンドメインに変異を有するガイドＲＮＡのプラスミドライブラリプールを組み立てた。これらのプラスミドライブラリプールのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定は、各変異したガイドＲＮＡを識別部分と一致させた。２９３Ｔ細胞を、プラスミドライブラリプールでトランスフェクトした。成功した単一コピーの組み込みは蛍光発現によって識別され、選択された。各ガイドＲＮＡについての編集有効性をトランスフェクションの１３日後に測定した。

【0269】

各変異について、各変異したまたは修飾されていないガイドからの標的ＲＮＡのＲＮＡ編集を、修飾されていないＳｍＯＰＴ－ｍＵ７ヘアピンガイドのＲＮＡ編集に正規化し、倍率変化としてプロットした。図２Ａ～図２Ｄは、それぞれのガイドＲＮＡによる標的転写物の編集を示す：ＲＡＢ７Ａ ｈｎＲＮＰ、ＳＮＣＡ、及びＧＡＰＤＨ。グラフ上のＸ軸は、ＳｍＯＰＴ、Ｕ１Ｓｍ、Ｕ７Ｓｍ、ｍＵ７及びｈＵ７の修飾されていない配列を列挙し、Ｓｍ結合ドメインの前または後に挿入された塩基のための追加の空白を有する。図２Ａ～図２Ｃに関して、グラフ上のＹ軸は、親（修飾されていない）ガイドＲＮＡに対する編集における正規化された倍率変化を示す。各ヌクレオチドの変異は、代表的なパターンを有する個々の円記号として示される。修飾されていないガイドＲＮＡの編集レベルは、各位置にわたって破線記号として示される。図２Ａ～２Ｄの変異ＲＮＡガイド配列は、ＲＮＡガイド配列をコードするＤＮＡ配列として提示される。ガイドＲＮＡ配列は、提示されるヌクレオチド配列におけるＴの代わりにＵを置換することによって決定することができる。図２Ａは、マウスＵ７（ｍＵ７）ヘアピンまたはヒトＵ７（ｈＵ７）ヘアピン配列によるＳｍＯＰＴ配列（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ配列番号２２）のガイドＲＮＡ変異を示す。倍数変化編集効率に対する変異の効果を、修飾されていないＳｍＯＰＴガイドＲＮＡと比較した。ＴＴＴＴＴ領域の任意のＴの変異（３～７のヌクレオチドに対応する）は、編集の減少をもたらした。ヌクレオチドＧに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基８でのＡ変異は、ｍＵ７及びｈＵ７構築物の両方において、ＲＡＢ７Ａ ｈｎＲＮＰ標的に対する編集効率の増加をもたらした。別の実施例において、それぞれヌクレオチドＧ、Ｇ及びＧに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基８、９、及び１１におけるＴ変異は、ｍＵ７構築物におけるＳＮＣＡ標的の編集効率の増加をもたらした。ＳｍＯＰＴガイドの＋１配列中のいくつかの挿入（例えば、両方のＳＮＣＡガイドに対するＡＴもしくはＣ挿入、またはＳｍＯＰＴ／ｍＵ７構築物によるＧＡＰＤＨガイドに対するＡ挿入）は、編集の増加をもたらした。これらの結果は、ＳｍＯＰＴ配列を修飾して、特定の標的に対する編集を増加させることができることを示す。

【0270】

図２Ｂは、ｍＵ７ヘアピンによるＵ１Ｓｍ配列（ＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧ配列番号２３）、またはｍＵ７ヘアピンによるＵ７Ｓｍ配列（ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ配列番号２４）のガイドＲＮＡ変異を示す。倍数変化編集効率に対する変異効果を、修飾されていないガイドＲＮＡと比較した。

【0271】

図２Ｃは、ＳｍＯＰＴによるｍＵ７ヘアピン配列（配列番号３）、またはＳｍＯＰＴによるｈＵ７ヘアピン配列（配列番号４）のガイドＲＮＡ変異を示す。簡潔にするために、部分的なｍＵ７ヘアピン配列（ＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣ配列番号２５）または部分的なｈＵ７ヘアピン配列（ＴＡＧＧＣＴＴＴＣＴＧＧ配列番号２７）のみがＸ軸上に列挙される。倍数変化編集効率の変異の効果を、修飾されていないガイドＲＮＡと比較した。ｍＵ７ヘアピン配列におけるいくつかの変異は、編集の増加をもたらした。例えば、それぞれヌクレオチドＣ及びＡに対応するｍＵ７配列の１番目、または１２番目の残基におけるＴ変異は、ＳＮＣＡ標的ＲＮＡに対する編集の増加をもたらした。更に、ヌクレオチドＴ、Ｔ及びＧに対応するｍＵ７配列の６番目、１０番目、または１１番目の残基のＣ変異は、ＳＮＣＡ標的ＲＮＡの編集の増加をもたらした。ＧＡＰＤＨに関して、ヌクレオチドＧ及びＡに対応するｍＵ７配列の１１番目または１２番目の残基におけるＣ変異は、ＧＡＰＤＨ標的ＲＮＡの編集の増加をもたらした。

【0272】

同様に、ｈＵ７ヘアピン配列におけるいくつかの変異は、編集の増加をもたらした。例えば、それぞれヌクレオチドＧ、Ｔ、またはＧに対応するｈＵ７配列の４番目、１０番目、または１１番目の残基中のＣ変異は、ＳＮＣＡ標的ＲＮＡに対する編集の増加をもたらした。更に、ヌクレオチドＴに対応する７番目の残基におけるＧ変異は、ＳＮＣＡ標的ＲＮＡの編集の増加をもたらした。これらの結果は、ｍＵ７及びｈＵ７配列を修飾して、特定の標的に対する編集を増加させることができることを示す。

【0273】

図２Ｄは、３つの標的ＲＮＡ（ＲＡＢ７Ａ ｈｎＲＮＰ、ＳＮＣＡ、及びＧＡＰＤＨ）における編集の増加に関連する、ＳｍＯＰＴ（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ配列番号２２）及び部分的ｍＵ７（ＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣ配列番号２５）配列における変異の概要を示す。左側のグラフは、ライブラリスクリーンからの編集データの割合を示し、右側のグラフは、個々の単一コピーのトランスフェクションからの編集データの割合を示す。ライブラリスクリーニング（より大きな円として示される）によって同定された変異を確認するために、これらを個々のプラスミドとしてクローニングし、各々を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。成功した単一コピーの組み込みは蛍光発現によって識別され、試験のために選択された。各ガイドＲＮＡについての編集有効性をトランスフェクションの１３日後に測定した。

【0274】

個々のトランスフェクションによって試験するために、編集効率の増加を示した代表的な変異を選択した。ＳｍＯＰＴ配列について、ＴまたはＣのＳｍＯＰＴの前の挿入変異は、編集効率の増加をもたらした。更に、ヌクレオチドＧに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基８でのＡ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＧに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基９でのＴ、ＣまたはＡ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＡに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基１０でのＣ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＧに対応するＳｍＯＰＴ配列の残基１１でのＴ、ＣまたはＡ変異は、編集効率の増加をもたらし、ＳｍＯＰＴ後のＡまたはＴの挿入変異は、概して、編集効率の増加をもたらした。ｍＵ７配列について、ヌクレオチドＡに対応するｍＵ７配列の残基２におけるＴ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＧに対応するｍＵ７配列の残基３におけるＧＧ挿入変異は、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＴに対応するｍＵ７配列の残基５におけるＧ、Ｃ、またはＡ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＴに対応するｍＵ７配列の残基６におけるＣ変異は、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＴに対応するｍＵ７配列の残基８におけるＧ変異は、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＴに対応するｍＵ７配列の残基１０におけるＣ、またはＡ変異は、概して、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＧに対応するｍＵ７配列の残基１１におけるＣ変異は、編集効率の増加をもたらし、ヌクレオチドＡに対応するｍＵ７配列の残基１２におけるＣ変異は、編集効率の増加をもたらした。これらの結果は、ＳｍＯＰＴ及びｍＵ７のいくつかの配列変異が、異なる標的配列にわたって有益であり得ることを示す。

【0275】

代表的な変異を、個々の単一コピートランスフェクションによって確認して、少なくとも１つの遺伝子標的、１０（ＤＮＡ配列配列番号２９～配列番号３８またはＲＮＡ配列番号３９～配列番号４８）上の編集を増加させ、３つ全ての遺伝子標的上の編集を増加させた。

【0276】

実施例３
組み合わせでのＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンバリアントの試験
編集効率の増加のための代表的な変異を組み合わせ（ＤＮＡ配列番号４９～配列番号５９、またはＲＮＡ配列番号６０～配列番号７０）、個々のトランスフェクションによって試験した。図３は、それぞれのガイドＲＮＡによる、標的化された転写物のＲＮＡ編集を示す：ＲＡＢ７Ａ ｈｎＲＮＰ、ＳＮＣＡ、及びＧＡＰＤＨ。２９３Ｔ細胞を、それぞれのプラスミド構築物でトランスフェクトした。成功した単一コピーの組み込みは蛍光発現によって識別され、選択された。各ガイドＲＮＡについての編集有効性をトランスフェクションの１３日後に測定した。グラフ上のＸ軸は、ＳｍＯＰＴまたはｍＵ７及びｈＵ７ヘアピン配列内の各個々のバリアントの存在を示す。各バーの上に列挙される数字は、ＲＮＡ編集のパーセントを示す。陰性対照は、異なる遺伝子標的からのアンチセンス配列を有するガイドＲＮＡからの標的転写産物編集のパーセントを示す。

【0277】

代表的な個々の変異の組み合わせを、個々の単一コピートランスフェクションによって確認して、少なくとも１つの遺伝子標的の編集を更に増加させ、３つ（ＤＮＡ配列番号４９～配列番号５１またはＲＮＡ配列番号６０～配列番号６２）が、３つ全ての遺伝子標的にわたって最高の全体的なゲインを示した。

【0278】

実施例４
追加の標的でのＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンの組み合わせバリアントの試験
次いで、更なる遺伝子標的に対する個々のトランスフェクションによって、編集効率の増加のための代表的なバリアントの組み合わせ（ＤＮＡ配列番号４９～配列番号５１、またはＲＮＡ配列番号６０～配列番号６２）を試験した。図４は、示されたガイドＲＮＡによる標的化された転写物のＲＮＡ編集を示す。２９３Ｔ細胞を、それぞれのプラスミド構築物でトランスフェクトした。成功した単一コピーの組み込みは蛍光発現によって識別され、選択された。各ガイドＲＮＡについての編集有効性を、トランスフェクションの２または１３日後に測定した。

【0279】

編集効率の増加のより広範な確認のために、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントを、５’ｈｎＲＮＰＡ１ドメイン（配列番号７１）、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ８０＠４０（配列番号７２）、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ８０＠４０（配列番号７３）、ＧＡＰＤＨ８０＠４０（配列番号７４）の有無にかかわらず、８０＠４０フォーマットの３つのアンチセンスガイドＲＮＡに付加した。加えて、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントを、５’ｈｎＲＮＰＡ１ドメイン（配列番号７１）の有無にかかわらず、１００＠５０フォーマットの３つのアンチセンスガイドＲＮＡに付加した：ＳＯＤ１ １００＠５０（配列番号７５）、ＦＡＮＣ１００＠５０（配列番号７６）、ＳＭＡＤ４ １００＠５０（配列番号７７）。陰性対照は、異なる遺伝子標的からのアンチセンス配列を有するガイドＲＮＡからの標的転写産物編集のパーセントを示す。各アンチセンス配列について、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントは、元のＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン配列と比較して、同じ、またはＲＮＡ編集の増加を示した。

【0280】

実施例５
エクソンスキッピングのためのＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピン組み合わせバリアントの試験
次に、代表的なＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントの組み合わせ（ＤＮＡ配列番号４９～配列番号５１、またはＲＮＡ配列番号６０～配列番号６２）を、エクソンスキッピングのための遺伝子標的に対する個々のトランスフェクションによって試験した。図５は、示されたガイドＲＮＡによる標的化された転写物のエクソンスキッピングのパーセントを示す。２９３Ｔ細胞を、それぞれのプラスミド構築物でトランスフェクトした。成功した単一コピーの組み込みは蛍光発現によって識別され、選択された。各ガイドＲＮＡについてのエクソンスキッピング有効性を、トランスフェクションの２または１３日後に測定した。

【0281】

ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントを、５’ｈｎＲＮＰＡ１ドメイン（配列番号７１）の有無にかかわらず、ＤＭＤエクソン７１（配列番号７８）またはＤＭＤエクソン７４（配列番号７９）のスプライスアクセプター部位を標的とする２つのアンチセンスガイドＲＮＡに付加した。加えて、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントを、ＡＤＡＲ編集（配列番号８０、配列番号８１）にかかわらず、ＤＭＤエクソン７１または７４エクソンスキッピングについてのより短いＡＳＯ配列に付加した。各アンチセンス配列について、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントは、元のＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン配列と比較して、同じ、またはエクソンスキッピングの増加を示した。

【0282】

ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントは、ヒトＲＤ横紋筋肉腫細胞（ＣＣＬ－１３６）においても試験された。図６は、示されるガイドＲＮＡによるＲＡＢ７Ａ編集またはＤＭＤエクソンスキッピングのパーセントを示す。ＲＤ細胞を、ゲノムへのランダムな組み込みのためのｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼを発現するプラスミドとともに、ヒトＵ１プロモーターまたは修飾Ｕ７プロモーターからのアンチセンスガイドＲＮＡを発現するプラスミド構築物でトランスフェクトした。成功した組み込みは蛍光発現によって識別され、選択された。その後、細胞を１０日間、筋細胞に分化させて、完全長ＤＭＤ Ｄｐ４２７ｍ筋アイソフォームを発現させた。次に、液滴デジタルＰＣＲを使用して、ＲＡＢ７Ａ編集またはＤＭＤエクソンスキッピングを測定した。１０日間の筋細胞分化後の非トランスフェクトＲＤ細胞を陰性対照として使用した。

【0283】

元のＳｍＯＰＴ及びｍＵ７ヘアピン（配列番号２及び３）、またはｍＵ７－３ＧＧ－１２Ｃヘアピンバリアントを有するＳｍＯＰＴ－１１Ａ（配列番号５１）を、どちらも５’ｈｎＲＮＰＡ１ドメイン（配列番号７１）を有するＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ（配列番号１８）、またはＤＭＤエクソン７１（配列番号７８）またはＤＭＤエクソン７４（配列番号７９）を標的とするアンチセンスガイドＲＮＡに付加した。２９３Ｔ細胞と同様に、各アンチセンス配列について、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントは、元のＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン配列と比較して、同じまたは増加したＲＡＢ７Ａ編集またはＤＭＤエクソンスキッピングを示した。

【0284】

元のＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン配列を有する既存のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、現在、エクソンスキッピング療法に使用されており、ＡＤＡＲ編集とは無関係に、イントロン及びエクソンスプライスエンハンサー配列を物理的にマスキングすることによって作用する。ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントがまた、この能力における活性を改善することができることを実証するために、臨床的に関連するＤＭＤエクソンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を試験した。ＤＭＤエクソン２スキッピングに関して、アンチセンス配列「Ａ」（配列番号１００）及び「Ｃ」（配列番号１０１）は、現在、臨床試験ＮＣＴ０４２４０３１４のためにｓｃＡＡＶ９．Ｕ７．ＡＣＣＡにおいて使用されている。「Ａ」及び「Ｃ」の両方（配列番号１０２）を包含し、ＤＭＤエクソン２の全体をカバーする、より長いアンチセンス配列も試験した。ＤＭＤエクソン５１スキッピングに関して、アンチセンス配列「ｌｏｎｇ１」（配列番号１０３）及び「ｄｔ」（配列番号１０４）を試験した。「ｄｔ」は、ＤＭＤエクソン５１の２つの非連続部分にアニールするため、注目に値する。これらのアンチセンス配列を、５’ｈｎＲＮＰＡ１ドメイン（配列番号７１）、及び元のＳｍＯＰＴ及びｍＵ７ヘアピン（配列番号２及び３）のいずれか、またはｍＵ７－３ＧＧ－１２Ｃヘアピンバリアントを有するＳｍＯＰＴ－１１Ａ（配列番号５１）のいずれかとともに、またはそれなしで試験した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンは、元のＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン配列を上回った。更に、５’ｈｎＲＮＰＡ１配列、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン、及び修飾Ｕ７プロモーターの相加的な組み合わせは、ＤＭＤエクソン２及び５１の両方について、公開されているアンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッピング効率を１０倍増加させた。これは、新しいＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンバリアントが、カバーを介したエクソンスキッピングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の活性、ならびにＡＤＡＲ編集のためのガイドＲＮＡの活性を増加させることができることを実証する。

【0285】

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態は、例としてのみ提供される。多数の変形、変更、及び置換が、本開示から逸脱することなく包含される。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替物が、本開示の実施において用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれにより包含されることが意図され得る。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】