特表 2024-543025 皮膚炎症治療のためのキメラタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】皮膚炎症治療のためのキメラタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241112BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241112BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241112BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20241112BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20241112BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20241112BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/705 ZNA

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/88 Z

A61K38/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

A61K9/51

A61K9/127

A61K47/42

A61K47/44

A61K47/18

A61K47/24

A61K47/28

A61P29/00

A61P17/00

A61P17/06

A61P37/08

A61P19/02

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K31/573

A61K39/395 N

C07K14/715

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525999

(86)(22)【出願日】2022-11-01

(85)【翻訳文提出日】2024-06-28

(86)【国際出願番号】 US2022079046

(87)【国際公開番号】W WO2023077152

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/369,836

(32)【優先日】2022-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/325,568

(32)【優先日】2022-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/320,628

(32)【優先日】2022-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/274,232

(32)【優先日】2021-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519302132

【氏名又は名称】シャタック ラボ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュライバー、テイラー

(72)【発明者】

【氏名】フロム、ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】シュプトライン、ケイシー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87

4B065AA93Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA65

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB31

4C076CC04

4C076CC18

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE41

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA19

4C084CA53

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA55

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA55

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA96

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087MA24

4C087MA38

4C087MA55

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、とりわけ、外皮系の炎症性疾患の治療における使用を見出す、とりわけ、異種キメラタンパク質を含む、組成物及び方法に関する。
【選択図】図１０Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質であって、
（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインであり、
（ｂ）は、前記第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、任意選択で、（optionally）ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、
（ｃ）は、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである、前記キメラタンパク質。

【請求項2】

前記ＴＮＦＲ２の一部は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。

【請求項3】

前記ＴＮＦＲ２の一部は、配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のキメラタンパク質。

【請求項4】

前記ＣＬＲは、Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）、ランゲリン、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン２）から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項5】

前記第２のドメインはＣｌｅｃ７ａの一部を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項6】

前記Ｃｌｅｃ７ａの一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン、またはβ－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なその断片を含む、請求項５に記載のキメラタンパク質。

【請求項7】

前記Ｃｌｅｃ７ａの一部は、配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５または請求項６に記載のキメラタンパク質。

【請求項8】

前記キメラタンパク質は、
配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインと、
配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｃｌｅｃ７ａの一部と、
前記細胞外ドメインに隣接するリンカーと、を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項9】

前記第２のドメインはランゲリンの一部を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項10】

前記ランゲリンの一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン、または硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なその断片を含む、請求項９に記載のキメラタンパク質。

【請求項11】

前記ランゲリンの一部は、配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９または請求項１０に記載のキメラタンパク質。

【請求項12】

前記キメラタンパク質は、
配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインと、
配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ランゲリンの一部と、
前記細胞外ドメインに隣接するリンカーと、を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項13】

前記第２のドメインはＤＣ－ＳＩＧＮの一部を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項14】

前記ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン、または細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なその断片を含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質。

【請求項15】

前記ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のキメラタンパク質。

【請求項16】

前記キメラタンパク質は、
配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインと、
配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部と、
前記細胞外ドメインに隣接するリンカーと、を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項17】

前記第２のドメインはデクチン２の一部を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項18】

前記デクチン２の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン、またはαマンナンに結合できるその断片を含む、請求項１７に記載のキメラタンパク質。

【請求項19】

前記デクチン２の一部は、配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７または請求項１８に記載のキメラタンパク質。

【請求項20】

前記キメラタンパク質は、
配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインと、
配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、デクチン２の一部と、
前記細胞外ドメインに隣接するリンカーと、を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項21】

前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４に由来する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項22】

前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のキメラタンパク質。

【請求項23】

前記リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される、請求項２１または請求項２２に記載のキメラタンパク質。

【請求項24】

前記リンカーは、２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは、配列番号４～配列番号５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項26】

前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であるか、またはｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡを含む、請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記ポリヌクレオチドは、ｍｍＲＮＡであるか、またはｍｍＲＮＡを含む、請求項２５または請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチ。

【請求項28】

前記ｍｍＲＮＡは、１つ以上のヌクレオシド修飾を含む、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記ヌクレオシド修飾は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにこれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記ｍｍＲＮＡは、５’キャップ及び／またはポリＡテールを更に含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項31】

前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項32】

前記ポリヌクレオチドは、皮膚特異的調節エレメントを含む、請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項33】

前記皮膚特異的調節エレメントは、ケラチン５（Ｋ５）プロモーター、ケラチン６（Ｋ６）プロモーター、ケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター、ケラチン１６（Ｋ１６）プロモーター、α－１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、フィラグリンプロモーター、ロリクリンプロモーター、インボルクリンプロモーター、チロシナーゼプロモーター、及びαＶインテグリンプロモーターから選択される皮膚特異的プロモーターである、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項34】

前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡを含む、請求項２５または請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチ。

【請求項35】

請求項３１～３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項36】

請求項２５～３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項37】

請求項３５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項38】

薬学的に許容される賦形剤もしくは担体、及び請求項１～２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項３５に記載のベクター、または請求項３７に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。

【請求項39】

前記医薬組成物は、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡを含む、請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記担体は、脂質様物質、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、または複合体である、請求項３８または請求項３９に記載の医薬組成物。

【請求項41】

前記医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、またはリポソームとして製剤化される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項42】

前記医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される、請求項４１に記載の医薬組成物。

【請求項43】

前記脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（例えば、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、及びＣ１２－２００から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質）；構造脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））；コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質（例えば、ＰＥＧジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧセラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物、またはＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８））；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される脂質を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。

【請求項44】

前記脂質ナノ粒子は、（ａ）粒子中に存在する総脂質の５０モル％～８５モル％を含むカチオン性脂質、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の１３モル％～４９．５モル％を含む非カチオン性脂質、及び（ｃ）粒子中に存在する総脂質の０．５モル％～２モル％を含む粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む、請求項４２または請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

前記脂質ナノ粒子は、ＳＭ－１０２、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５及びＣ１２－２００；コレステロール；ならびにＰＥＧ脂質から選択される脂質を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項46】

前記医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項47】

前記医薬組成物は、局所、皮膚、皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内または経皮投与用に製剤化される、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項48】

前記医薬組成物は、局所投与用に製剤化される、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項49】

外皮系の炎症を治療または予防する方法であって、前記方法は、対象に請求項１～２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項３５に記載のベクター、または請求項３７に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。

【請求項50】

外皮系の炎症を治療または予防する方法であって、対象に請求項３８～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項51】

前記炎症は、前記外皮系の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している、請求項４９または請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記炎症は、皮膚の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記皮膚の疾患または障害は、乾癬、尋常性天疱瘡、強皮症、アトピー性皮膚炎、サルコイドーシス、結節性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、スウィート症候群、白斑、慢性爪囲炎、湿疹、脂漏性皮膚炎、及び／またはじん麻疹である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記皮膚の疾患または障害は乾癬である、請求項５２または請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記乾癬は尋常性乾癬である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記乾癬は乾癬性関節炎である、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記炎症は、マクロファージ及び／または樹状細胞によって媒介される、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記治療により、
前記治療前のＴ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ及び／またはＮＫ細胞の浸潤レベルと比較して、炎症組織におけるＴ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ及び／またはＮＫ細胞の浸潤レベル、及び／または、
前記治療前のＴＮＦα、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－２３のレベルと比較して、炎症組織におけるＴＮＦα、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－２３のレベルが減少する、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記治療により、前記治療前の皮膚の赤み、肥厚及び剥離の軽減と比較して、皮膚の赤み、肥厚及び剥離が軽減される、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記対象に抗炎症薬を投与することを更に含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記抗炎症薬は、非ステロイド性抗炎症薬またはコルチコステロイドである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記医薬組成物及び前記抗炎症薬は、同時に提供される、請求項６０または請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記医薬組成物及び前記抗炎症薬は、２つの異なる医薬組成物として提供される、請求書６２に記載の方法。

【請求項64】

前記医薬組成物及び前記抗炎症薬は、単一の医薬組成物として提供される、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

前記医薬組成物は、前記抗炎症薬が提供された後に提供される、請求項６０または請求項６１に記載の方法。

【請求項66】

前記医薬組成物は、前記抗炎症薬が提供される前に提供される、請求項６０または請求項６１に記載の方法。

【請求項67】

前記抗炎症薬は、アセチルサリチル酸（アスピリン）、ベンジル－２，５－ジアセトキシ安息香酸、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、エトフェナメート、フルインダク、サリチル酸グリコール、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、サリチル酸メチル、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サリチル酸、サリチルミド、エソメプラゾール、または、これらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される、非ステロイド性抗炎症薬である、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記抗炎症薬は、αメチルデキサメタゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン及びそのエステルの残り、安息香酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、βメチルベタメタゾン、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、クレシノロン、吉草酸クロベタゾール、クロコルテロン、コルチゾン、コルトドキソン、デソニド、デオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、二酢酸ジフルオロゾン、ジフルプレドナート、フルアドレノロン、フルセトニド、フルクロロロンアセトニド、フルクロロニド、フルコルチンブチルエステル、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメタロン、フルオシノロンアセトニド、フルペロロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルプレドニゾロン、フルラドレノロンアセトニド、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、及びトリアムシノロンアセトニドから選択されるコルチコステロイドである、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記対象に免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、同時に提供される、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、２つの異なる医薬組成物として提供される、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、単一の医薬組成物として提供される、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

前記医薬組成物は、前記免疫抑制剤が提供された後に提供される、請求項６９に記載の方法。

【請求項74】

前記医薬組成物は、前記免疫抑制剤が提供される前に提供される、請求項６９に記載の方法。

【請求項75】

前記免疫抑制剤は、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、及びシロリムス）、代謝拮抗剤（例えば、アザチオプリン、及びメトトレキサート）、細胞分裂阻害薬（例えば、アルキル化剤）、細胞傷害性抗生物質、インターフェロン、マイコフェノラート、オピオイド、低分子生物剤（例えば、フィンゴリモド、及びミリオシン）、及びＴＮＦ結合タンパク質から選択される、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記対象に抗炎症薬及び免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

ＩＬ－１２／ＩＬ－２３阻害剤及び／またはＩＬ－１７阻害剤を含む、第２の医薬組成物を前記対象に投与することを更に含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、同時に提供される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、２つの異なる医薬組成物として提供される、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記医薬組成物及び前記免疫抑制剤は、単一の医薬組成物として提供される、請求項７７に記載の方法。

【請求項81】

前記医薬組成物は、前記免疫抑制剤が提供された後に提供される、請求項７７に記載の方法。

【請求項82】

前記医薬組成物は、前記免疫抑制剤が提供される前に提供される、請求項７７に記載の方法。

【請求項83】

前記ＩＬ－１７阻害剤は、セクキヌマブ、イキセキズマブ、ビメキズマブ、及びブロダルマブから選択される、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記ＩＬ１２／ＩＬ－２３阻害剤は、ウセキヌマブ、リサンキズマブ、グセルクマブ、及びチルドラキズマブから選択される、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

炎症の治療または予防に使用するための請求項３８～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項86】

炎症の治療または予防に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項３５に記載のベクター、または請求項３７に記載の宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、とりわけ、外皮系の炎症性疾患の治療における使用を見出す、とりわけ、異種キメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を含む、組成物及び方法に関する。

【0002】

優先権
本出願は、２０２１年１１月１日に出願された米国仮出願第６３／２７４，２３２号、２０２２年３月１６日に出願された米国仮出願第６３／３２０，６２８号、２０２２年３月３０日に出願された米国仮出願第６３／３２５，５６８号、及び２０２２年７月２９日に出願された米国仮出願第６３／３６９，８３６号の利益ならびに優先権を主張し、各出願の内容は、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。

【0003】

配列表
本出願には、Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介してＸＭＬ形式で提出された配列リストが含まれている。２０２２年１０月３１日に作成され、サイズが１１７，８１０バイトである「ＳＨＫ－０５４ＰＣ＿１１６９８１－５０５４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」という名称のＸＭＬコピーの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

乾癬は、皮膚上の赤み、かゆみ及び鱗状の斑点によって特徴付けられる炎症性皮膚疾患である。乾癬は世界中で２～３％のヒトに影響を及ぼしており、免疫経路によって引き起こされると考えられている。従来、乾癬の治療には、局所コルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド及びプロピオン酸クロベタゾール）、局所角質溶解薬（例えば、サリチル酸）、局所ビタミンＤ３類似体（例えば、カルシトリオール）、経口または局所レチノイド（例えば、タザロテン及びアシトレチン）、全身性細胞傷害性薬剤（例えば、メトトレキサート）、及び免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）が使用されている。最近、標的薬剤が開発された。これらの薬剤には、抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ及びアダリムマブ）及びエタネルセプト（ＴＮＦ受容体ＴＮＦＲ２とＦｃドメインの融合タンパク質）などのＴＮＦα拮抗薬；抗ＩＬ－１２Ｂ（抗ＩＬ－１２及び抗ＩＬ－２３）抗体（例えば、ウステキヌマブ）；抗ＩＬ－２３抗体（例えば、グセルクマブ）；及び抗ＩＬ－１７抗体（例えば、セクキヌマブ）が含まれる。

【0005】

乾癬には治療法がない。なぜなら、前述の治療法はすべて、根本的な病気の治療ではなく、症状を一時的に緩和するものだからである。その結果、これらの治療法はせいぜい症状の寛解をもたらすだけで、通常は再発を引き起こす。これらの治療法は、一時的な症状の緩和と引き換えに、皮膚の炎症から結核を含む重篤な感染症への罹患など、軽度から重度の副作用を引き起こす可能性がある。また、前述の治療法は、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、尋常性乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病などの基礎疾患の治療ではなく、症状の一時的な緩和を提供する。したがって、乾癬、ならびに炎症性皮膚疾患及び炎症性ＧＩ管疾患を含む他の炎症性疾患を治療するための新しい治療法や治療アプローチが必要である。

【発明の概要】

【0006】

したがって、様々な態様では、本開示は、とりわけ、外皮系の炎症状態、例えば、乾癬を含む外皮系の皮膚炎症の治療に有用な組成物及び方法を提供する。

【0007】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。

【0008】

諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0009】

諸実施形態では、ＣＬＲは、Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）、ランゲリン、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン２）から選択される。

【0010】

諸実施形態では、第２のドメインは、Ｃｌｅｃ７ａの一部を含む。諸実施形態では、Ｃｌｅｃ７ａの一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン、またはβ－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合できるその断片を含む。諸実施形態では、Ｃｌｅｃ７ａの一部は、配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣｌｅｃ７ａの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。

【0011】

諸実施形態では、第２のドメインは、ランゲリンの一部を含む。諸実施形態では、ランゲリンの一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン、または硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なその断片を含む。諸実施形態では、ラングリンの一部は、配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むラングリンの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。

【0012】

諸実施形態では、第２のドメインは、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部を含む。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン、または細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なその断片を含む。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＤＣ－ＳＩＧＮの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。

【0013】

諸実施形態では、第２のドメインは、デクチン２の一部を含む。諸実施形態では、デクチン２の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン、またはαマンナンに結合できるその断片を含む。諸実施形態では、デクチン２の一部は、配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むデクチン２の一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。

【0014】

諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0015】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）などのｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１つ以上のヌクレオシド修飾を含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’キャップ及び／またはポリＡテールを更に含む。

【0016】

一態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤または担体、及び本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を含む、医薬組成物を提供する。諸実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡを含む。

【0017】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、例えば、ｍｍＲＮＡを対象に投与することを含む。

【0018】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0019】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを対象に投与することを含む。

【0020】

一態様では、本開示は、炎症によって引き起こされる病気を治療または予防する方法を提供する。諸実施形態では、病気は、乾癬、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、尋常性乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及びクローン病から選択される。

【0021】

諸実施形態では、炎症は、外皮系の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している。諸実施形態では、炎症は、皮膚の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している。諸実施形態では、皮膚の疾患または障害は、乾癬、尋常性天疱瘡、強皮症、アトピー性皮膚炎、サルコイドーシス、結節性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、スウィート症候群、白斑、慢性爪囲炎、湿疹、脂漏性皮膚炎、及び／またはじん麻疹である。諸実施形態では、皮膚の疾患または障害は、乾癬である。諸実施形態では、乾癬は、尋常性乾癬及び／または乾癬性関節炎である。

【0022】

本明細書に記載されるいずれの態様または実施形態も、本明細書に開示されるいずれの他の態様または実施形態とも組み合わされ得る。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）（左のタンパク質）、及び細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有する、本明細書に開示するＩＩ型膜貫通タンパク質Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（右のタンパク質）の概略図を示す。

【図1B】ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）及びＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部（例えば、細胞外ドメイン）を含み、リンカーが２つを連結している、本明細書に開示されるいくつかの態様のキメラタンパク質の図を示す。

【図1C】ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）及びＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部（例えば、細胞外ドメイン）を含み、リンカーが２つを連結している、本明細書に開示されるいくつかの態様のキメラタンパク質の図を示す。

【図1D】２つのＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部（例えば、細胞外ドメイン）を含み、リンカーが２つを連結している、本明細書に開示されるいくつかの態様のキメラタンパク質の図を示す。

【図1E】２つのＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部（例えば、細胞外ドメイン）を含み、リンカーが２つを連結している、本明細書に開示されるいくつかの態様のキメラタンパク質の図を示す。

【図2】Ａ～Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の構築を示す。Ａは、分子量ラダーを示す。Ｂは、抗ＴＮＦＲ２、抗Ｆｃ及び抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体を用いてプローブしたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のウエスタンブロットであり、キメラタンパク質に３つの部分がすべて存在することを示している。Ｃは、抗ＴＮＦＲ２、抗Ｆｃ及び抗デクチン２抗体を用いてプローブしたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のウエスタンブロットであり、キメラタンパク質に３つの部分がすべて存在することを示している。Ｄは、抗ＴＮＦＲ２、抗Ｆｃ及び抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体を用いてプローブしたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のウエスタンブロットであり、キメラタンパク質に３つの部分がすべて存在することを示している。Ｅは、抗ＴＮＦＲ２、抗Ｆｃ及び抗ランゲリン抗体を用いてプローブしたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のウエスタンブロットであり、キメラタンパク質に３つの部分がすべて存在することを示している。

【図3A】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3B】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3C】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3D】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3E】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3F】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図3G】Ａ～Ｇは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ヒトデクチン２抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトデクチン２を欠く無関係なタンパク質を、陰性対照をして使用した。Ｆは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ヒトランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。Ｇは、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図4A】Ａ～Ｄは、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の構築を示す。Ａは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗Ｃｌｅｃ７抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗デクチン２抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｃは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｄは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ランゲリン抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロットは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるネイティブな状態と多量体を形成する傾向を示している。キメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を使用せず、煮沸したもの）をすべてのブロットのレーン１にロードした。レーン２の試料は、還元剤であるβ－メルカプトエタノールで処理され、煮沸された。レーン３の試料は、脱グリコシル化剤、還元剤で処理され、煮沸された。各ブロットには、タンパク質サイズラダーが含まれた。各ブロットのレーン１と比較したレーン２の移動の変化はオリゴマー化を示し、各ブロットのレーン２と比較したレーン３の移動の変化はグリコシル化を示す。

【図4B】Ａ～Ｄは、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の構築を示す。Ａは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗Ｃｌｅｃ７抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗デクチン２抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｃは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｄは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ランゲリン抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロットは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるネイティブな状態と多量体を形成する傾向を示している。キメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を使用せず、煮沸したもの）をすべてのブロットのレーン１にロードした。レーン２の試料は、還元剤であるβ－メルカプトエタノールで処理され、煮沸された。レーン３の試料は、脱グリコシル化剤、還元剤で処理され、煮沸された。各ブロットには、タンパク質サイズラダーが含まれた。各ブロットのレーン１と比較したレーン２の移動の変化はオリゴマー化を示し、各ブロットのレーン２と比較したレーン３の移動の変化はグリコシル化を示す。

【図4C】Ａ～Ｄは、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の構築を示す。Ａは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗Ｃｌｅｃ７抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗デクチン２抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｃは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｄは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ランゲリン抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロットは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるネイティブな状態と多量体を形成する傾向を示している。キメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を使用せず、煮沸したもの）をすべてのブロットのレーン１にロードした。レーン２の試料は、還元剤であるβ－メルカプトエタノールで処理され、煮沸された。レーン３の試料は、脱グリコシル化剤、還元剤で処理され、煮沸された。各ブロットには、タンパク質サイズラダーが含まれた。各ブロットのレーン１と比較したレーン２の移動の変化はオリゴマー化を示し、各ブロットのレーン２と比較したレーン３の移動の変化はグリコシル化を示す。

【図4D】Ａ～Ｄは、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の構築を示す。Ａは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗Ｃｌｅｃ７抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗デクチン２抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｃは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。Ｄは、抗ＴＮＦＲ２抗体（左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（中央のブロット）、及び抗ランゲリン抗体（右のブロット）を用いてプローブしたマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の特性を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロットは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるネイティブな状態と多量体を形成する傾向を示している。キメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を使用せず、煮沸したもの）をすべてのブロットのレーン１にロードした。レーン２の試料は、還元剤であるβ－メルカプトエタノールで処理され、煮沸された。レーン３の試料は、脱グリコシル化剤、還元剤で処理され、煮沸された。各ブロットには、タンパク質サイズラダーが含まれた。各ブロットのレーン１と比較したレーン２の移動の変化はオリゴマー化を示し、各ブロットのレーン２と比較したレーン３の移動の変化はグリコシル化を示す。

【図5A】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5B】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5C】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5D】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5E】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5F】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5G】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5H】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5I】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5J】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5K】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5L】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5M】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図5N】Ａ～Ｎは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質とそれぞれのリガンドとの結合を示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ＴＮＦＲ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるＴＮＦα及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｃは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質による抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｄは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｅは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質による抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｆは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質による抗ランゲリン抗体及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｇは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるラミナリン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｈは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるガレクチン９及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｉは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｊは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質によるザイモサン及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｋは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｌは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｍは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＣＡＥＣＡＭ１及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。Ｎは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質によるＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及び抗Ｆｃ抗体への同時結合を示している。

【図6】ＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトしてから２４時間後にｑＰＣＲを使用した、細胞内のＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍＲＮＡの検出を示す。

【図7A】Ａ～Ｃは、Ｌ９２９（Ａ）、ＨＥＫ２９３（Ｂ）、またはＣＨＯＫ１細胞（Ｃ）にキメラタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入してから２４時間後に、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の発現を示す。

【図7B】Ａ～Ｃは、Ｌ９２９（Ａ）、ＨＥＫ２９３（Ｂ）、またはＣＨＯＫ１細胞（Ｃ）にキメラタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入してから２４時間後に、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の発現を示す。

【図7C】Ａ～Ｃは、Ｌ９２９（Ａ）、ＨＥＫ２９３（Ｂ）、またはＣＨＯＫ１細胞（Ｃ）にキメラタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入してから２４時間後に、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の発現を示す。

【図8A】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質がリガンドを隔離し、活性化レポーター細胞をブロックすることを示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または陰性対照として使用された無関係なタンパク質の存在下で、ＴＮＦαと共にインキュベートされたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン２細胞における分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターの活性化を示す。Ｂは、緩衝液のみ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質、または陰性対照キメラタンパク質の存在下で、グリカン／炭水化物ザイモサンと共にインキュベートしたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン１ｂ細胞における分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターの活性化を示す。

【図8B】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質がリガンドを隔離し、活性化レポーター細胞をブロックすることを示している。Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または陰性対照として使用された無関係なタンパク質の存在下で、ＴＮＦαと共にインキュベートされたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン２細胞における分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターの活性化を示す。Ｂは、緩衝液のみ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質、または陰性対照キメラタンパク質の存在下で、グリカン／炭水化物ザイモサンと共にインキュベートしたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン１ｂ細胞における分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターの活性化を示す。

【図9A】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質が、Ｌ９２９線維芽細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害することを示している。Ａは、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡによるアポトーシスの阻害を示す。Ｌ９２９線維芽細胞に、空のＬＮＰ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、もしくは無関係なキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを含むＬＮＰをトランスフェクトし、その後、漸増量のＴＮＦαで処理した。切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度は、ＴＮＦαの量に応じてプロットされた。Ｂは、本明細書に開示されたキメラタンパク質によるアポトーシスの阻害を示す。Ｌ９２９線維芽細胞を、漸増量のＴＮＦαの存在下で、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または無関係なキメラタンパク質と共にインキュベートした。切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度を、キメラタンパク質：ＴＮＦαのモル比に応じてプロットした。無関係なキメラタンパク質を陰性対照として使用した。

【図9B】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質が、Ｌ９２９線維芽細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害することを示している。Ａは、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡによるアポトーシスの阻害を示す。Ｌ９２９線維芽細胞に、空のＬＮＰ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、もしくは無関係なキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを含むＬＮＰをトランスフェクトし、その後、漸増量のＴＮＦαで処理した。切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度は、ＴＮＦαの量に応じてプロットされた。Ｂは、本明細書に開示されたキメラタンパク質によるアポトーシスの阻害を示す。Ｌ９２９線維芽細胞を、漸増量のＴＮＦαの存在下で、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または無関係なキメラタンパク質と共にインキュベートした。切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度を、キメラタンパク質：ＴＮＦαのモル比に応じてプロットした。無関係なキメラタンパク質を陰性対照として使用した。

【図10A】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質のマウス大腸炎モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療活性を示す。Ａは、８日目の体重の変化を示す棒グラフである。Ｂは、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちのＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋とＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞の割合を示す棒グラフである。

【図10B】Ａ及びＢは、本明細書に開示されたキメラタンパク質のマウス大腸炎モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療活性を示す。Ａは、８日目の体重の変化を示す棒グラフである。Ｂは、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちのＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋とＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞の割合を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書では、例えば、（１）組織の炎症を引き起こすサイトカインであるＴＮＦαの活性を、これらに限定されないが、ＴＮＦαを隔離すること及び／または細胞のＴＮＦ受容体種の機能を阻害することなどによって、（２）病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ、アラーミン）細胞の過活動／異常な感知の伝達（例えば、ＰＡＭＰＳ／ＤＡＭＰ受容体を活性化するリガンドの隔離による）を妨害、阻止、減少及び／または阻害し、それによって、マクロファージ、単球及び／または樹状細胞の過剰活性化／異常活性化を防ぐ、二重作用キメラタンパク質ならびにキメラタンパク質をコードする核酸を開示する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示されたキメラタンパク質またはそれをコードする核酸は、２つの異なる経路によって抗炎症効果及び／または抗自己免疫効果を提供する。この二重作用は、患者に治療効果を提供する可能性が高く、及び／または患者に強化された治療効果を提供する可能性が高い。更に、理論に束縛されるものではないが、このようなキメラタンパク質は２つの異なる経路を介して作用することができるため、少なくとも、２つの経路のうちの１つを標的とする治療にあまり反応しない患者には効果がある可能性がある。したがって、２つの経路のうちの１つを介して作用する治療に対して不十分な応答者である患者は、他の経路を標的とすることによって治療効果を達成することができる。

【0025】

本明細書では、キメラタンパク質、及びそれをコードする核酸を開示する。キメラタンパク質は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインを含み、これは、リンカーを介して、リガンド（これらに限定されないが、例えば、Ｃｌｅｃ７Ａ、ランゲリン、ＤＣ－ＳＩＧＮ及びデクチン－２）と結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインと結合している。

【0026】

第１のドメインと第２のドメインは同じポリペプチド上に存在し、したがって、（１）本明細書に開示されるキメラタンパク質は単一の転写産物によって生成され、（２）抗体とは異なり、２つのポリペプチドのヘテロ二量体化は必要とされない。したがって、本明細書に開示されるキメラタンパク質は、精製されたタンパク質として、または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸として送達され得る。したがって、本開示はまた、部分的に、キメラタンパク質をコードする核酸の、例えば、皮膚への送達に基づいている。本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド及び／または本明細書に開示されるキメラタンパク質は、外皮系の炎症によって引き起こされる、もしくは外皮系の炎症に関連する疾患または障害を治療するために使用され得る。本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド及び／またはキメラタンパク質は、外皮系の治療に適した任意の投与方法によって、例えば、局所投与によって、送達されることができる。

【0027】

本開示のキメラタンパク質
膜貫通タンパク質は、通常、細胞外ドメイン、１つまたは一連の膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる。理論に束縛されるものではないが、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性受容体もしくはリガンド、または膜結合受容体もしくはリガンド（すなわち、隣接する細胞の膜）との相互作用に関与する。理論に束縛されるものではないが、膜貫通ドメイン（複数可）は、膜貫通タンパク質を原形質膜に局在化させる原因となる。理論に束縛されるものではないが、膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達分子との相互作用を調整し、細胞内応答を細胞外環境と調整する（またはその逆の）原因となる。したがって、膜貫通タンパク質は、状況に応じて、受容体（すなわち、同族リガンドによる刺激に応答してシグナル伝達を開始する）、リガンド（すなわち、同族受容体を有する細胞内でシグナル伝達を刺激する）、または受容体とリガンドの両方（すなわち、同族リガンドのシグナル伝達応答結合を刺激し、同族受容体を有する細胞内でシグナル伝達を開始する）として機能する可能性がある。

【0028】

シングルパス膜貫通タンパク質には、一般的に２つの種類があり、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質、ならびに細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有するＩＩ型膜貫通タンパク質（図１Ａ、右タンパク質を参照されたい）である。ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）は、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有し、Ｉ型膜貫通タンパク質である（図１Ａ、左タンパク質を参照されたい）。本明細書に開示されるＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）は、細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有し、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。Ｉ型膜貫通タンパク質（例えば、ＴＮＦＲ２）について、タンパク質のアミノ末端は、細胞の外側を向いており、したがって、細胞外環境において他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか、例えば、ＴＮＦα）との相互作用に関与する機能ドメインを含む。ＩＩ型膜貫通タンパク質（例えば、本明細書に開示されるＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ））について、タンパク質のカルボキシ末端は、細胞の外側を向いており、したがって、細胞外環境において他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む。したがって、これら２種類の膜貫通タンパク質は細胞膜に対して互いに反対の向きを有し、Ｉ型膜貫通タンパク質のアミノ末端は細胞膜から離れた方向に向いているのに対し、ＩＩ型膜貫通タンパク質のアミノ末端は細胞膜に近づく方向に向いている。

【0029】

諸実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用することができる膜貫通タンパク質の一部を指す。諸実施形態では、細胞外ドメインは、リガンドまたは受容体と結合するのに十分であり、細胞にシグナルを伝達するのに有効である膜貫通タンパク質の一部を指す。諸実施形態では、細胞外ドメインは通常、細胞または細胞膜の外部に存在する膜貫通タンパク質のアミノ酸配列全体である。諸実施形態では、細胞外ドメインは、細胞または細胞膜の外部にあり、当技術分野で既知である方法を使用してアッセイされ得るような（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリガンド結合及び／または細胞活性化アッセイ）、シグナル伝達及び／またはリガンド結合に必要とされる膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の一部である。

【0030】

いくつかの態様では、本開示のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質（例えば、ＴＮＦＲ２）及びＩＩ型膜貫通タンパク質（本明細書に開示されるＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ））を含み、それらは、それらの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが取り除かれ、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインがリンカー配列を使用して隣接し、単一のキメラタンパク質を生成するように操作され得る。諸実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるように、ＴＮＦＲ２（Ｉ型膜貫通タンパク質）の細胞外ドメイン、及び本明細書に開示されるＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（ＩＩ型膜貫通タンパク質）の細胞外ドメインは、単一のキメラタンパク質に組み合わせる。図１Ｂは、遊離したＴＮＦＲ２（膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから遊離したＩ型膜貫通タンパク質）または遊離したカルボキシ末端アンカー型細胞外タンパク質（アンカードメインから）と、本明細書に開示された遊離したＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから遊離したＩＩ型膜貫通タンパク質）との結合が、リンカー配列によって隣接されているいくつかの実施形態を示す。この図における細胞外ドメインには、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列全体、またはその一部が含まれ、その一部は、ＴＮＦαに結合する能力を保持する。同様に、この図の細胞外ドメインには、本明細書に開示されたＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアミノ酸配列全体、またはその一部が含まれ、その一部は、その意図されたリガンド／受容体に結合する能力を保持する。更に、これらの態様のキメラタンパク質は、第１の細胞外ドメイン（図１Ｂ及び図１Ｃのキメラタンパク質の左端に示される）がその受容体／リガンドと立体的に結合することができ、及び／または第２の細胞外ドメイン（図１Ｂ及び図１Ｃのキメラタンパク質の右端に示される）がその受容体／リガンドと立体的に結合することができるように、ドメイン間の十分な全体的柔軟性及び／または物理的距離を含む。図１Ｃは、キメラタンパク質の各細胞外ドメインが「外向き」に面する、線形キメラタンパク質における隣接する細胞外ドメインを示す。

【0031】

いくつかの態様では、本開示のキメラタンパク質は、本明細書に開示される２つのＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（ＩＩ型膜貫通タンパク質）の細胞外ドメイン、例えば、２つの異なるＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）からの細胞外ドメイン、または１つのＣ型レクチン受容体からの２つの細胞外ドメインを含む。したがって、これらの実施形態のキメラタンパク質は、少なくとも、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の細胞外ドメインを含む第１のドメインを含み、これは、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の細胞外ドメインを含む第２のドメインと－直接的にまたはリンカーを介して－接続される。図１Ｄ及び図１Ｅに示されるように、ドメインがアミノ末端からカルボキシ末端の配向に連結される場合、第１のドメインは、キメラタンパク質の「左」に位置し、かつ「内向き」となり、第２ドメインは、キメラタンパク質の「右」に位置し、かつ「外向き」となる。

【0032】

第１及び第２のドメインの他の構成、例えば、第１のドメインが外向きであり、かつ第２のドメインが内向きであること、第１及び第２のドメインが両方とも内向きであること、第１及び第２のドメインが両方とも外向きであることが想定される。

【0033】

本発明のキメラタンパク質及び本発明のキメラタンパク質をコードする核酸は、これらに限定されないが、使用の容易さ及び生成の容易さを含む利点を提供する。この理由は、２つの異なる免疫療法剤が１つの製品に組み合わされ、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスが可能になり得るためである。更に、２つの個別の薬剤の代わりに１つの薬剤を投与することで、投与が容易になり、患者のコンプライアンスが向上する。更に、例えば、多数のジスルフィド結合及びグリコシル化などの翻訳後修飾を含む大きな多量体タンパク質であるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のキメラタンパク質及び本発明のキメラタンパク質をコードする核酸は、製造が容易であり、かつ製造の費用対効果が高い。更に、例えば、少なくとも２つのオープンリーディングフレームを使用して、場合によっては核酸から生合成される必要がある２つのポリペプチド鎖から作成されるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸は、本発明のキメラタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを保有する単一の核酸分子から生合成される、単一のポリペプチドを含む。したがって、本発明のキメラタンパク質は、精製されたキメラタンパク質として、またはキメラタンパク質をコードする核酸として適切に投与され得る。

【0034】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。

【0035】

一態様では、本開示は、キメラタンパク質、またはそれをコードする核酸を提供し、キメラタンパク質は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインを含み、これは、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーを介して、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインに隣接している。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。

【0036】

ＴＮＦＲ２は、その細胞外ドメインに４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を有することにより特徴付けられる、シングルスパニングＩ型膜貫通タンパク質である。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたはその断片は、隔離によってＴＮＦ結合に関して細胞性受容体種と競合することにより、ＴＮＦαを阻害する。諸実施形態では、第１のドメインは、細胞性ＴＮＦ受容体種とオリゴマー化して不活性複合体を形成し、それによって細胞性ＴＮＦ受容体種の機能を阻害することによって、ＴＮＦαを阻害する。

【0037】

諸実施形態では、第１のドメインは、以下の配列を有するＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含む。
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号５７）。

【0038】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５７と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0039】

諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0040】

当業者であれば、文献及び構造情報、例えば、Ｋｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃａｎ ｓｈｅｄ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（２１），８３３１－８３３５（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｆｉｎｅｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８（４９５８），１０１９－１０２３（１９９０）；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ＨＬ６０ ｃｅｌｌｓ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３３），２０１３１－２０１３８（１９９０）；Ｄｅｍｂｉｃ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｗｏ ｈｕｍａｎ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ， ｂｕｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ， ｄｏｍａｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２（４），２３１－２３７（１９９０）；Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ７５－ｋＤａ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ， ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２９），２１１７２－２１１７８（１９９２）；及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＴＲＡＦ２．” Ｎａｔｕｒｅ３９８（６７２７），５３３－５３８（１９９９）；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．３（１４８）：ｒａ８３（２０１０）；ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＰＤＢ ＩＤ：３ＡＬＱ（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＴＮＦＲ２の既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0041】

一態様では、本開示は、キメラタンパク質、またはそれをコードする核酸を提供し、キメラタンパク質は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインを含み、これは、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーを介して、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインに隣接している。諸実施形態では、リガンドは、ＣＬＲの天然リガンドである。諸実施形態では、ＣＬＲは、Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）、ランゲリン、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン２）から選択される。

【0042】

諸実施形態では、第２のドメインは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ、アラーミン）の異常な感知をブロックすることによって、マクロファージの異常及び／または過剰活性化を阻害する。諸実施形態では、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のリガンドは、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰである。諸実施形態では、第２のドメインは、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの初期認識ならびに取り込みを阻害、低減またはブロックする。諸実施形態では、第２のドメインは、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの初期認識ならびに取り込みによって開始される、マクロファージ媒介炎症カスケードを阻害、低減またはブロックする。

【0043】

諸実施形態では、第２のドメインは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ、アラーミン）の異常な感知時にマクロファージ、単球及び／または樹状細胞が開始する炎症反応の開始を阻害、ブロックまたは低減し、それによって、マクロファージ、単球及び／または樹状細胞によるＴＮＦα、ＩＬ－１７ならびにＩＬ－２３などの炎症誘発性サイトカインの産生をブロック、低減及び／または阻害する。

【0044】

諸実施形態では、第２のドメインは、Ｃｌｅｃ７ａ（樹状細胞関連Ｃ型レクチン－１（デクチン－１）またはＣＤ３６９としても知られる）の一部を含む。諸実施形態では、Ｃｌｅｃ７ａの一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン、またはβ－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なその断片を含む。

【0045】

Ｃｌｅｃ７ａは、細胞外領域にＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ、炭水化物認識ドメイン、ＣＲＤとも呼ばれる）（Ｔ細胞上のβ－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンならびに内因性リガンドを認識する）を含有する膜貫通タンパク質である。諸実施形態では、第２のドメインは、ＣＬＤを含む。

【0046】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
ＴＭＡＩＷＲＳＮＳＧＳＮＴＬＥＮＧＹＦＬＳＲＮＫＥＮＨＳＱＰＴＱＳＳＬＥＤＳＶＴＰＴＫＡＶＫＴＴＧＶＬＳＳＰＣＰＰＮＷＩＩＹＥＫＳＣＹＬＦＳＭＳＬＮＳＷＤＧＳＫＲＱＣＷＱＬＧＳＮＬＬＫＩＤＳＳＮＥＬＧＦＩＶＫＱＶＳＳＱＰＤＮＳＦＷＩＧＬＳＲＰＱＴＥＶＰＷＬＷＥＤＧＳＴＦＳＳＮＬＦＱＩＲＴＴＡＴＱＥＮＰＳＰＮＣＶＷＩＨＶＳＶＩＹＤＱＬＣＳＶＰＳＹＳＩＣＥＫＫＦＳＭ（配列番号５８）。

【0047】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５８と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0048】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するＣｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含む。
ＳＳＰＣＰＰＮＷＩＩＹＥＫＳＣＹＬＦＳＭＳＬＮＳＷＤＧＳＫＲＱＣＷＱＬＧＳＮＬＬＫＩＤＳＳＮＥＬＧＦＩＶＫＱＶＳＳＱＰＤＮＳＦＷＩＧＬＳＲＰＱＴＥＶＰＷＬＷＥＤＧＳＴＦＳＳＮＬＦＱＩＲＴＴＡＴＱＥＮＰＳＰＮＣＶＷＩＨＶＳＶＩＹＤＱＬＣＳＶＰＳＹＳＩＣＥＫＫＦＳＭ（配列番号５９）

【0049】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、Ｃｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５９と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0050】

諸実施形態では、Ｃｌｅｃ７ａの一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、Ｃｌｅｃ７ａの一部は、配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号５８または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0051】

当業者であれば、文献及び構造情報、例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｅｔａ－Ｇｌｕｃａｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｅｃｔｉｎ－１：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ１６：１０４２－１０５２（２００７）；ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＰＤＢ ＩＤ：２ＢＰＥ；Ａｌｐｈａｆｏｌｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ５９６：５８３－５８９（２０２１））；Ｌｅｇｅｎｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ β－（１→３）－Ｇｌｕｃａｎｓ ｗｉｔｈ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０（６）：９７４５－６６（２０１５）（これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）を参照することにより、Ｃｌｅｃ７ａの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0052】

諸実施形態では、第２のドメインは、ランゲリン（Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＫまたはＣＤ２０７としても知られる）の一部を含む。諸実施形態では、ランゲリンの一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン、または硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なその断片を含む。

【0053】

ランゲリンは、マンノース結合特異性を示すカルシウム依存性レクチンである。それは、抗原の取り込みを促進し、Ｔ細胞への提示のための抗原のルーティング及び／またはプロセッシングに関与する。ランゲリンは、カンジダ種、サッカロミセス種、及びマラセチア種の初代ランゲルハンス細胞の主要な受容体である。これは、ＨＩＶウイルスのエンベロープ糖タンパク質に存在する高マンノース構造に結合し、その後、ウイルスはバーベック顆粒に標的化され、速やかに分解される。

【0054】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するランゲリンの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
ＰＲＦＭＧＴＩＳＤＶＫＴＮＶＱＬＬＫＧＲＶＤＮＩＳＴＬＤＳＥＩＫＫＮＳＤＧＭＥＡＡＧＶＱＩＱＭＶＮＥＳＬＧＹＶＲＳＱＦＬＫＬＫＴＳＶＥＫＡＮＡＱＩＱＩＬＴＲＳＷＥＥＶＳＴＬＮＡＱＩＰＥＬＫＳＤＬＥＫＡＳＡＬＮＴＫＩＲＡＬＱＧＳＬＥＮＭＳＫＬＬＫＲＱＮＤＩＬＱＶＶＳＱＧＷＫＹＦＫＧＮＦＹＹＦＳＬＩＰＫＴＷＹＳＡＥＱＦＣＶＳＲＮＳＨＬＴＳＶＴＳＥＳＥＱＥＦＬＹＫＴＡＧＧＬＩＹＷＩＧＬＴＫＡＧＭＥＧＤＷＳＷＶＤＤＴＰＦＮＫＶＱＳＶＲＦＷＩＰＧＥＰＮＮＡＧＮＮＥＨＣＧＮＩＫＡＰＳＬＱＡＷＮＤＡＰＣＤＫＴＦＬＦＩＣＫＲＰＹＶＰＳＥＰ（配列番号６０）。

【0055】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリンの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0056】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含む。
ＱＶＶＳＱＧＷＫＹＦＫＧＮＦＹＹＦＳＬＩＰＫＴＷＹＳＡＥＱＦＣＶＳＲＮＳＨＬＴＳＶＴＳＥＳＥＱＥＦＬＹＫＴＡＧＧＬＩＹＷＩＧＬＴＫＡＧＭＥＧＤＷＳＷＶＤＤＴＰＦＮＫＶＱＳＶＲＦＷＩＰＧＥＰＮＮＡＧＮＮＥＨＣＧＮＩＫＡＰＳＬＱＡＷＮＤＡＰＣＤＫＴＦＬＦＩＣＫＲＰＹＶＰＳＥＰ（配列番号６１）

【0057】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６１と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0058】

諸実施形態では、ランゲリンの一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、ラングリンの一部は、配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0059】

当業者であれば、文献及び構造情報、例えば、Ｎｕｒｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｌａｎｇｅｒｉｎ ａｎｄ Ｂｉｒｂｅｃｋ ｇｒａｎｕｌｅ：ａ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４８：２６８４－９８（２００９）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｌａｎｇｅｒｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１３２８５－９３（２０１０）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｌａｎｇｅｒｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｌｙｃａｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０５：１０２７－３９（２０１１）；Ｃｈａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｌａｎｇｅｒｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｉｇｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｎｅ ｏｆ ＤＣ－ＳＩＧＮ ｂｕｔ ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ，ｃａｌｃｉｕｍ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１９８１－９４（２００８）；Ｃｈａｂｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｎｇｅｒｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｂｉｒｂｅｃｋ ｇｒａｎｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．１０８：６６６－７７（２０１５）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌａｎｇｅｒｉｎ ｃｈａｎｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（５２）：３６７６２－３６７７１（２０１３）；Ｐｏｒｋｏｌａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ－Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｌｉｇａｎｄｓ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＣ－ＳＩＧＮ ａｎｄ Ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ Ｌａｎｇｅｒｉｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（３）：６００－６０８（２０１８）；Ａｌｐｈａｆｏｌｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ５９６：５８３－５８９（２０２１））（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照することにより、ランゲリンの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0060】

諸実施形態では、第２のドメインは、ＤＣ－ＳＩＧＮ（Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＬまたはＣＤ２０９としても知られる）の一部を含む。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン、または細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なその断片を含む。

【0061】

ＤＣ－ＳＩＧＮは、未熟な樹状細胞（ＤＣ）の表面に発現し、一次免疫応答の開始に関与する病原体認識受容体である。これは、病原体のエンドサイトーシスを媒介し、その後リソソーム区画で分解されると考えられている。

【0062】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインを含む。
ＱＶＳＫＶＰＳＳＩＳＱＥＱＳＲＱＤＡＩＹＱＮＬＴＱＬＫＡＡＶＧＥＬＳＥＫＳＫＬＱＥＩＹＱＥＬＴＱＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＬＱＥＩＹＱＥＬＴＲＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＬＱＥＩＹＱＥＬＴＷＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＭＱＥＩＹＱＥＬＴＲＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＱＱＥＩＹＱＥＬＴＲＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＱＱＥＩＹＱＥＬＴＲＬＫＡＡＶＧＥＬＰＥＫＳＫＱＱＥＩＹＱＥＬＴＱＬＫＡＡＶＥＲＬＣＨＰＣＰＷＥＷＴＦＦＱＧＮＣＹＦＭＳＮＳＱＲＮＷＨＤＳＩＴＡＣＫＥＶＧＡＱＬＶＶＩＫＳＡＥＥＱＮＦＬＱＬＱＳＳＲＳＮＲＦＴＷＭＧＬＳＤＬＮＱＥＧＴＷＱＷＶＤＧＳＰＬＬＰＳＦＫＱＹＷＮＲＧＥＰＮＮＶＧＥＥＤＣＡＥＦＳＧＮＧＷＮＤＤＫＣＮＬＡＫＦＷＩＣＫＫＳＡＡＳＣＳＲＤＥＥＱＦＬＳＰＡＰＡＴＰＮＰＰＰＡ（配列番号６２）。

【0063】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0064】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含む。
ＨＰＣＰＷＥＷＴＦＦＱＧＮＣＹＦＭＳＮＳＱＲＮＷＨＤＳＩＴＡＣＫＥＶＧＡＱＬＶＶＩＫＳＡＥＥＱＮＦＬＱＬＱＳＳＲＳＮＲＦＴＷＭＧＬＳＤＬＮＱＥＧＴＷＱＷＶＤＧＳＰＬＬＰＳＦＫＱＹＷＮＲＧＥＰＮＮＶＧＥＥＤＣＡＥＦＳＧＮＧＷＮＤＤＫＣＮＬＡＫＦＷＩＣＫ（配列番号６３）

【0065】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６３と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0066】

諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部は、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0067】

当業者であれば、文献及び構造情報、例えば、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ＤＣ－ＳＩＧＮ ａｎｄ ＤＣ－ＳＩＧＮＲ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４：２１６３－６（２００１）；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＤＣ－ＳＩＧＮ ａｎｄ ＤＣ－ＳＩＧＮＲ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５９１－８（２００４）；Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＤＣ－ＳＩＧＮ，Ｃｅｌｌ１２４：４８５－９３（２００６）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ＤＣ－ＳＩＧＮ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃａｎｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２ ４２０２－９（２００７）；Ｔｈｅｐａｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ＤＣ－ＳＩＧＮ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５ ２５１８－２９（２０１３）；Ｍｅｄｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ＤＣ－ＳＩＧＮ ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５（６４）：１４６５９－１４６６８（２０１９）；Ｓｕｔｋｅｖｉｃｉｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅ ＤＣ－ＳＩＧＮ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｓｍａｌｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ： Ａ Ｌｅｓｓｏｎ ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（６）：１３７７－１３８５（２０１４）；Ｐｏｒｋｏｌａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ－Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｌｉｇａｎｄｓ： Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＣ－ＳＩＧＮ ａｎｄ Ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ Ｌａｎｇｅｒｉｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（３）：６００－６０８（２０１８）；Ａｌｐｈａｆｏｌｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ５９６：５８３－５８９（２０２１））（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照することにより、ＤＣ－ＳＩＧＮの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0068】

諸実施形態では、第２のドメインは、デクチン２（Ｃ型レクチンドメインファミリー６メンバーＡまたはＣ型レクチンスーパーファミリーメンバー１０としても知られる）の一部を含む。諸実施形態では、デクチン２の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン、またはαマンナンに結合できるその断片を含む。

【0069】

デクチン２は、自然免疫系のパターン認識受容体（ＰＲＲ）として機能するカルシウム依存性レクチンであり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌糸上のαマンナンを特異的に認識して結合する。諸実施形態では、デクチン２の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン、またはマンノース依存的にハウスダストダニ及び真菌からのアレルゲン、及び／または適応免疫応答を変化させるマンソン住血吸虫の卵からの可溶性要素を認識できるその断片を含む。

【0070】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するデクチン２の細胞外ドメインを含む。
ＴＹＨＦＴＹＧＥＴＧＫＲＬＳＥＬＨＳＹＨＳＳＬＴＣＦＳＥＧＴＫＶＰＡＷＧＣＣＰＡＳＷＫＳＦＧＳＳＣＹＦＩＳＳＥＥＫＶＷＳＫＳＥＱＮＣＶＥＭＧＡＨＬＶＶＦＮＴＥＡＥＱＮＦＩＶＱＱＬＮＥＳＦＳＹＦＬＧＬＳＤＰＱＧＮＮＮＷＱＷＩＤＫＴＰＹＥＫＮＶＲＦＷＨＬＧＥＰＮＨＳＡＥＱＣＡＳＩＶＦＷＫＰＴＧＷＧＷＮＤＶＩＣＥＴＲＲＮＳＩＣＥＭＮＫＩＹＬ（配列番号６４）。

【0071】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、デクチン２の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６４と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0072】

諸実施形態では、第２のドメインは、以下の配列を有するデクチン２のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含む。
ＦＧＳＳＣＹＦＩＳＳＥＥＫＶＷＳＫＳＥＱＮＣＶＥＭＧＡＨＬＶＶＦＮＴＥＡＥＱＮＦＩＶＱＱＬＮＥＳＦＳＹＦＬＧＬＳＤＰＱＧＮＮＮＷＱＷＩＤＫＴＰＹＥＫＮＶＲＦＷＨＬＧＥＰＮＨＳＡＥＱＣＡＳＩＶＦＷＫＰＴＧＷＧＷＮＤＶＩＣＥＴＲＲＮＳＩＣＥ（配列番号６５）

【0073】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、デクチン２のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６５と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0074】

諸実施形態では、デクチン２の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン、またはその断片を含む。諸実施形態では、デクチン２の一部は、配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号６４または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0075】

当業者であれば、文献及び構造情報、例えば、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｄｅｃｔｉｎ－２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９２（３２）：１３４０２－１３４１４（２０１７）；Ｄｅｃｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｌｉｐｏｇｌｙｃａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ Ｄｅｃｔｉｎ－２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ８：１６８４０（２０１８）；ＭｃＧｒｅａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｄｅｃｔｉｎ－２ ｉｓ ａ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６（５）：４２２－４３０（２００６）；Ａｌｐｈａｆｏｌｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ５９６：５８３－５８９（２０２１））（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照することにより、デクチン２の既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0076】

一態様では、本開示は、キメラタンパク質、またはそれをコードする核酸を提供し、キメラタンパク質は、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第１のドメインを含み、これは、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーを介して、リガンドに結合可能な第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインに隣接している。諸実施形態では、リガンドは、ＣＬＲの天然リガンドである。諸実施形態では、第１のＣＬＲ及び第２のＣＬＲは、独立して、Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）、ランゲリン、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン２）から選択される。諸実施形態では、第１のＣＬＲ及び第２のＣＬＲは、独立して、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含む。

【0077】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、そのリガンドに結合可能な第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、そのリガンドに結合可能な第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。

【0078】

諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、Ｃｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0079】

諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、Ｃｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0080】

諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0081】

諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ランゲリンの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0082】

諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0083】

諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、ＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0084】

諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、デクチン２のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0085】

諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、デクチン２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、これは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部は、デクチン２のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）を含み、これは、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性であるアミノ酸配列を有する。

【0086】

諸実施形態では、本開示の異種キメラタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ６９の細胞外ドメインを含むか、または異種キメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、以下のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ６９の細胞外ドメインをコードする。
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号８０）。

【0087】

諸実施形態では、本開示の方法で使用される異種キメラタンパク質は、ＣＤ６９の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号８０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0088】

諸実施形態では、異種キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0089】

諸実施形態では、異種キメラタンパク質は、実質的に、ＣＤ６９の細胞外ドメイン全体を含む。

【0090】

当業者であれば、文献、例えば、Ｌｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ－Ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ６９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７６（１０）：７３１２－７３１９（２００１）；Ｎａｔａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ６９：ａ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９：１４７７９－１４７８６（２０００）；Ｖａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ａｎ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍａｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｉｃｅ，ＦＥＢＳ Ｊ２７５：５５８９－５６０６（２００８）；Ｋｏｌｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ６９ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔ Ｃｏｍｍｕｎ６５：１２５８－１２６０（２００９）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＣＤ６９の既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。

【0091】

リンカー
一態様では、本開示は、リンカーによって隣接するＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部とＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部とを含むキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供する。諸実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を形成可能な少なくとも１つのシステイン残基を含む。少なくとも１つのシステイン残基は、キメラタンパク質の１対（またはそれ以上）の間にジスルフィド結合を形成することが可能である。理論に束縛されるものではないが、かかるジスルフィド結合形成は、キメラタンパク質の有用な多量体状態を維持する原因となる。これは、キメラタンパク質の効率的な生産を可能とし、それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで所望される活性を可能とする。

【0092】

諸実施形態では、リンカーは単一のアミノ酸リンカーではなく、例えば、限定されないが、リンカーは１アミノ酸長より長い。諸実施形態では、リンカーの長さは１～６アミノ酸以上であり、例えば、限定されないが、リンカーの長さは７アミノ酸長以上である。諸実施形態では、リンカーは、１つより多くのグリシン残基を含む。

【0093】

諸実施形態では、本開示のキメラタンパク質では、リンカーは、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、または抗体配列から選択されるポリペプチドである。諸実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ４、任意選択で、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ１、任意選択で、ヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。

【0094】

諸実施形態では、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来し得るか、または、例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２（２）：１５３－１６７，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような経験的なリンカーである。諸実施形態では、リンカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９、及びＣｒａｓｔｏ ｅｔ．ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３０９－３１２（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを使用して設計してもよい。

【0095】

諸実施形態では、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。

【0096】

諸実施形態では、リンカーは、ポリペプチドを含む。諸実施形態では、ポリペプチドは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２アミノ酸長未満であり得る。

【0097】

諸実施形態では、リンカーは、柔軟性である。

【0098】

諸実施形態では、リンカーは、剛性である。

【0099】

諸実施形態では、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基からなる（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。

【0100】

諸実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラス抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動することを可能とする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列及び長さの両方が異なる。例えば、ヒンジ領域の長さ及び可塑性は、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６～２３１を包括し、自由に可塑性であるため、Ｆａｂフラグメントはその対称軸を中心に回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の中心にある球内を移動し得る。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２個のアミノ酸残基及び４個のジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠いており、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性のポリプロリン二重らせんを含む。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の可塑性を制限する。ＩｇＧ３は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含み、可塑性がないポリプロリン二重らせんを形成する、その固有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）が他のサブクラスと異なる。ＩｇＧ３では、Ｆａｂフラグメントは、Ｆｃフラグメントから比較的離れており、分子の可塑性が高まる。ＩｇＧ３における細長いヒンジは、他のサブクラスと比較してその高分子量の原因でもある。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その可塑性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に減少すると報告されている。諸実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体形成（Ｓ２２８Ｐを含む）またはＦｃＲｎ結合を増強するための１つ以上の変異を含み得る。

【0101】

結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、機能的に、上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の３つの領域に更に細分することができる。Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域には、Ｃ_Ｈ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジにおける第１の残基、通常は２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基までのアミノ酸が含まれる。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの可塑性と相関する。コアヒンジ領域には、重鎖間ジスルフィド架橋が含まれ、下部ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ２ドメインのアミノ末端と結合し、Ｃ_Ｈ２の残基が含まれる。（同上。）野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣ（配列番号２４）を含み、これは、ジスルフィド結合形成によって二量体化されると、回転軸として作用すると考えられる環状オクタペプチドをもたらし、したがって柔軟性が与えられる。実施形態では、本発明のリンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域のうちの１つ、２つ、または３つを含む。ヒンジ領域はまた、１つ以上のグリコシル化部位を含み得、これは、炭水化物付着のためのいくつかの構造的に異なる種類の部位を含む。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、分泌型免疫グロブリンにとって有利な特性と考えられる、腸のプロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの抵抗性を付与する。諸実施形態では、本開示のリンカーは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。

【0102】

諸実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。

【0103】

本開示のキメラタンパク質では、リンカーは、ＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、リンカーは、配列番号１～配列番号３または配列番号７３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、例えば、配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを含み、そのような結合リンカーは、独立して、配列番号４～５０（またはそのバリアント）から選択される。諸実施形態では、リンカーは、２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは、独立して、配列番号４～５０（またはそのバリアント）から選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0104】

諸実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、Ｆｃドメインは、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して増加した親和性及び増強した結合を示す。諸実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、ＦｃＲｎとの結合を増強する１つ以上の変異を含む。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎに対する親和性の増大及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させると考えられる。

【0105】

諸実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３、もしくは４３４（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）、またはそれらの同等物での１つ以上のアミノ酸置換を含む。諸実施形態では、アミノ酸残基２５０でのアミノ酸置換は、グルタミンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基２５２でのアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはスレオニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基２５４でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基２５６でのアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはスレオニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３０９でのアミノ酸置換は、プロリンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３１１でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３８５でのアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはグリシンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３８６でのアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、またはメチオニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３８７でのアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、またはアラニンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基３８９でのアミノ酸置換は、プロリン、セリン、またはアスパラギンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基４１６でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基４２８でのアミノ酸置換は、ロイシンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基４３３でのアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、またはグルタミンによる置換である。諸実施形態では、アミノ酸残基４３４でのアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、またはチロシンによる置換である。

【0106】

諸実施形態では、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、または４３６（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での置換などの１つ以上の変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異またはＹＴＥ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異またはＫＦＨ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＹＴＥ及びＫＦＨ変異の組み合わせを含む。

【0107】

諸実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での１つ以上の変異を含むＩｇＧ定常領域を含む。例示的な変異には、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａが含まれる。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異またはＬＳ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異またはＱＬ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異またはＡＡＡ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異またはＩＨＨ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ及びＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異の組み合わせを含む。

【0108】

ＩｇＧ定常領域における追加の例示的な変異は、例えば、Ｒｏｂｂｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７－６１５３、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４－２４、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１－８０、Ｋｏ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１４：６４２－６４５、Ｇｒｅｖｙｓ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７－５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0109】

諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列（以下の表を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号１のアミノ酸配列（以下の表を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、変異は、安定性及び／または半減期を増加させるために、配列番号１に対して作製される。例えば、諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号２のアミノ酸配列（以下の表を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的なＦｃ安定化変異体は、Ｓ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本発明のリンカーは、これらの変異体の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含み得る。

【0110】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎと結合する。諸実施形態では、キメラタンパク質は、約１ｎＭ～約８０ｎＭのＫ_ＤでＦｃＲｎと結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、または約８０ｎＭのＫ_ＤでＦｃＲｎと結合し得る。諸実施形態では、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫ_ＤでＦｃＲｎと結合し得る。諸実施形態では、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）と実質的に結合しない。

【0111】

諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号１のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有する。諸実施形態では、変異は、安定性及び／または半減期を増加させるために、配列番号１に対して作製される。例えば、諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号２のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号３のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0112】

諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１に由来する。例えば、諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、ＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ１である。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ＩｇＧ４は、ヒトＩｇＧ４である。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0113】

諸実施形態では、Ｆｃドメインは、哺乳動物Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン、マウスＦｃドメイン、ラットＦｃドメイン、ヒツジＦｃドメイン、ヤギＦｃドメイン、ロバＦｃドメイン、ネコＦｃドメイン、ハムスターＦｃドメイン、モルモットＦｃドメイン、ウマＦｃドメイン、ウサギＦｃドメイン、ブタＦｃドメイン、イヌＦｃドメイン、及びウシＦｃドメインから選択されるＦｃドメインを含む。諸実施形態では、Ｆｃドメインは、血清半減期を延長する（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、二量体化を促進する（例えば、Ｓ２２８Ｐまたはノブインホール変異）、Ｆｃエフェクター機能を低下させる（例えば、Ｐ３２９Ｇ変異の有無にかかわらず、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異（ＬＡＬＡ））、及び／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の強化する、１つ以上の変異を任意選択で含む、ヒトＦｃドメインを含む。諸実施形態では、リンカーのＦｃドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列（以下の表１を参照されたい）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、ＩｇＡ Ｆｃドメイン、ＩｇＭ Ｆｃドメイン、ＩｇＥ Ｆｃドメイン及びＩｇＤ Ｆｃドメインから選択される、Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ３ Ｆｃドメイン、及びＩｇＧ４ Ｆｃドメインから選択される。諸実施形態では、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２から選択される。

【0114】

更に、１つ以上の結合リンカーは、リンカーのＦｃドメイン（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７３、またはそれに対して少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一であるもののうちの１つ）及び細胞外ドメインを接続するために使用され得る。例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそのバリアントのうちのいずれか１つが、本明細書に開示される細胞外ドメイン、及び本明細書に開示されるリンカーにおけるＦｃドメインを接続し得る。任意選択で、配列番号４～５０、またはそのバリアントのうちのいずれか１つは、本明細書に開示される細胞外ドメインと本明細書に開示されるＦｃドメインとの間に位置する。
諸実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、以下の表１に開示される結合リンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号４～５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0115】

諸実施形態では、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてもよく、またはそれらは同じであってもよい。

【0116】

理論に束縛されるものではないが、キメラタンパク質においてＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーを含めることは、不溶性であり、非機能性の可能性のあるタンパク質コンカテマー及び／または凝集体の形成を回避する助けとなる。これは、キメラタンパク質間にジスルフィド結合を形成することが可能であるＦｃドメイン内にシステインが存在するためである。

【0117】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に開示されるように、１つ以上の結合リンカーを含み得、本明細書に開示されるように、Ｆｃドメインリンカーを欠き得る。

【0118】

諸実施形態では、第１及び／または第２の結合リンカーは独立して、配列番号４～５０のアミノ酸配列から選択され、以下の表１に提供される：

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0119】

諸実施形態では、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基を含む（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。例えば、諸実施形態では、結合リンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎであり、ここで、ｎは、約１～約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８（配列番号２５～配列番号３２のそれぞれ）である。諸実施形態では、結合リンカー配列は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）である。追加の例示的な結合リンカーには、これらに限定されないが、配列ＬＥ、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１～３）（配列番号３６～配列番号３８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号３９～配列番号４２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ（配列番号４３）、ＰＡＰＡＰ（配列番号４４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４５）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４６）、及びＸが、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕなどの任意のアミノ酸を示す、（ＸＰ）_ｎを有するリンカーが含まれる。諸実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＳである。諸実施形態では、結合リンカーは、配列（Ｇｌｙ）_ｎを有し、ここで、ｎは、１～１００の任意の数、例えば、（Ｇｌｙ）_８（配列番号３４）及び（Ｇｌｙ）_６（配列番号３５）である。

【0120】

諸実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号４７）、ＧＳＥＳＧ（配列番号４８）、ＧＳＥＧＳ（配列番号４９）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号５０）、ならびに４アミノ酸間隔ごとにランダムに配置されるＧ、Ｓ、及びＥの結合リンカーのうちの１つ以上である。

【0121】

第１の結合リンカー、Ｆｃドメインリンカー、及び第２の結合リンカーの組み合わせは、本明細書において「モジュラーリンカー」と称される。諸実施形態では、異種キメラタンパク質は、表２に示されるようなモジュラーリンカーを含む。

【表2-1】

【表2-2】

【0122】

諸実施形態では、本発明の異種キメラタンパク質は、上記の表２に開示されるモジュラーリンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号５１～５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0123】

諸実施形態では、リンカーは、これに限定されないが、高い柔軟性を含む柔軟性であり得る。諸実施形態では、リンカーは、これに限定されないが、剛性αヘリックスを含む剛性であり得る。例示的な結合リンカーの特徴を以下の表３に示す。

【表3】

【0124】

諸実施形態では、リンカーは、機能性であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明の異種キメラタンパク質の折り畳み及び／または安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、及び／または生物活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、異種キメラタンパク質を特定の細胞型または位置に標的化するように機能し得る。

【0125】

諸実施形態では、異種キメラタンパク質は、１つの結合リンカーのみを含む。

【0126】

諸実施形態では、異種キメラタンパク質は、結合リンカーを欠いている。

【0127】

諸実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成リンカーである。

【0128】

諸実施形態では、異種キメラタンパク質は、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第１のドメイン、及び／またはそのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第２のドメインを有する。したがって、細胞外ドメインのリガンド／受容体結合ドメインがそのリガンド／受容体の結合を立体的に妨げられないように、キメラタンパク質及び／または細胞外ドメイン（またはその一部）と残りのキメラタンパク質との間の物理的距離に十分な全体的な柔軟性がある。この柔軟性及び／または物理的距離（「緩み」と称される）は通常、細胞外ドメイン（複数可）に存在し、通常はリンカーに存在し、及び／または通常はキメラタンパク質に（全体として）存在し得る。代替的にまたは追加的に、アミノ酸配列（例えば）は、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、１つ以上の細胞外ドメイン及び／またはリンカーに追加され得る。緩みを提供する任意のアミノ酸配列が追加され得る。諸実施形態では、追加されるアミノ酸配列は、配列（Ｇｌｙ）_ｎを含み、ここで、ｎは、１～１００の任意の数である。追加可能なアミノ酸配列の追加の例には、表１及び表３に記載される結合リンカーが含まれる。諸実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、細胞外ドメインとリンカーとの間に追加され得る。かかるＰＥＧリンカーは、当技術分野において周知である。

【0129】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。

【0130】

諸実施形態では、第１のドメインは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたはその断片を含むＴＮＦＲ２の一部を含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２の一部は、配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能である、アミノ酸配列を含む。諸実施形態では、ＣＬＲの一部は、ＣＬＲの細胞外ドメイン、またはＣＬＲの天然リガンドに結合可能であるその断片を含む。諸実施形態では、ＣＬＲの一部は、配列番号５８～６５から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0131】

諸実施形態では、キメラタンパク質がＴＮＦＲ２の一部、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びＣｌｅｃ７ａの一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ＴＮＦＲ２のＥＣＤ－Ｆｃドメイン－結合リンカー－Ｃｌｅｃ７ａの一部

【0132】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能であり、配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣｌｅｃ７ａの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0133】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なＣ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0134】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンを含むリガンドに結合可能なＣ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）の一部を含み、及び配列番号５８または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0135】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外ドメインは斜体フォントで示される）：

【化1】

【0136】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６６と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0137】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、Ｃｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化2】

【0138】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６７と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0139】

例示的なマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、以下の配列を有する（マウスＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、マウスＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外は斜体フォントで示される）：

【化3】

【0140】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号８１と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0141】

諸実施形態では、キメラタンパク質がＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びランゲリンの一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ＴＮＦＲ２のＥＣＤ－Ｆｃドメイン－結合リンカー－ランゲリンの一部

【0142】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンを含むリガンドに結合可能であり、及び配列番号６０もしくは配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むラングリンの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0143】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なランゲリンの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0144】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンを含むリガンドに結合可能なランゲリンの細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0145】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ランゲリンの細胞外ドメインは斜体フォントで示される）：

【化4】

【0146】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６８と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0147】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化5】

【0148】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６９と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0149】

例示的なマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、以下の配列を有する（マウスＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、マウスＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ランゲリンの細胞外は斜体フォントで示される）：

【化6】

【0150】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号８４と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0151】

諸実施形態では、キメラタンパク質がＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びＤＣ－ＳＩＧＮの一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ＴＮＦＲ２のＥＣＤ－Ｆｃドメイン－結合リンカー－ＤＣ－ＳＩＧＮの一部

【0152】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＤＣ－ＳＩＧＮの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0153】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0154】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0155】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインは斜体フォントで示される）：

【化7】

【0156】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0157】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化8】

【0158】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７１と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0159】

例示的なマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、以下の配列を有する（マウスＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、マウスＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外は斜体フォントで示される）：

【化9】

【0160】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号８２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0161】

諸実施形態では、キメラタンパク質がＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びデクチン２の一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ＴＮＦＲ２のＥＣＤ－Ｆｃドメイン－結合リンカー－デクチン２の一部

【0162】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン；配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むデクチン２の一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0163】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0164】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンを含むリガンドに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号６４または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0165】

例示的なＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、以下の配列を有する（ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、デクチン２のＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化10】

【0166】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0167】

例示的なマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、以下の配列を有する（マウスＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは下線で示され、マウスＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、デクチン２の細胞外は斜体フォントで示される）：

【化11】

【0168】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号８３と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0169】

諸実施形態では、キメラタンパク質がランゲリンの一部、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びＣｌｅｃ７ａの一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ランゲリンの一部－Ｆｃドメイン－結合リンカー－Ｃｌｅｃ７ａの一部

【0170】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンを含むリガンドに結合可能であり、及び配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むランゲリンの一部；β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能であり、及び配列番号５８もしくは配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｃｌｅｃ７ａの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0171】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0172】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なランゲリンの一部を含み、及び配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号５８または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0173】

例示的なランゲリン－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンの細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、Ｃｌｅｃ７ａの細胞外は斜体フォントで示される）：

【化12】

【0174】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７４と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0175】

例示的なランゲリン（ＣＬＤ）－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ（ＣＬＤ）キメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、Ｃｌｅｃ７ａのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化13】

【0176】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７５と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0177】

諸実施形態では、キメラタンパク質がランゲリンの一部、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びＤＣ－ＳＩＧＮの一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ランゲリンの一部－Ｆｃドメイン－結合リンカー－ＤＣ－ＳＩＧＮの一部

【0178】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンを含むリガンドに結合可能であり、及び配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むランゲリンの一部；細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能であり、及び配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＤＣ－ＳＩＧＮの一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。
一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0179】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なランゲリンの一部を含み、及び配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0180】

例示的なランゲリン－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンの細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外は斜体フォントで示される）：

【化14】

【0181】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７６と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0182】

例示的なランゲリン（ＣＬＤ）－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＬＤ）キメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、ＤＣ－ＳＩＧＮのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は斜体フォントで示される）：

【化15】

【0183】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７７と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0184】

諸実施形態では、キメラタンパク質がランゲリンの一部、Ｆｃドメインの前の結合リンカー、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの後の結合リンカー、及びデクチン２の一部を含む場合、キメラタンパク質は以下の構造を含むことができる。
ランゲリンの一部－Ｆｃドメイン－結合リンカー－デクチン２の一部

【0185】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンを含むリガンドに結合可能であり、及び配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むランゲリンの一部；αマンナンに結合可能であり、及び配列番号６４もしくは配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、デクチン２の一部；及び細胞外ドメインに隣接するリンカーを含む。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来する。諸実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。諸実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを更に含み、そのような結合リンカーは、配列番号４～５０から独立して選択される。諸実施形態では、リンカーは２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは配列番号４～５０から独立して選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。

【0186】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0187】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なランゲリンの一部を含み、及び配列番号６４または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含み、及び配列番号６４または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２のドメインである。

【0188】

例示的なランゲリン－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンの細胞外ドメインは下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、デクチン２の細胞外は斜体フォントで示される）：

【化16】

【0189】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７８と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0190】

例示的なランゲリン（ＣＬＤ）－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、以下の配列を有する（ランゲリンのＣ型レクチン結合ドメイン（ＣＬＤ）は下線で示され、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃドメインを含むリンカーは太字フォントで示され、変異は下線で示され、結合リンカーは下線付き太字斜体フォントで示され、デクチン２の細胞外ドメインは斜体フォントで示される）：

【化17】

【0191】

諸実施形態では、キメラタンパク質は、ランゲリン－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号７９と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。

【0192】

本開示のキメラタンパク質をコードする核酸
様々な態様では、本開示は、本明細書に開示されるキメラタンパク質のいずれか、またはそのいずれかの成分をコードする単離された核酸を提供する。

【0193】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、（ａ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメイン、またはＴＮＦＲ２リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片を含む第１のドメインであり、（ｃ）は、ＣＬＥＣ７ａまたはＣＬＥＣ７ａリガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）またはＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）またはデクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）またはランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＣＤ６９から選択される細胞外ドメインを含む、第２のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、リンカーは、ジスルフィド結合を形成可能な少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２リガンドは、ＴＮＦαである。諸実施形態では、ＣＬＥＣ７ａリガンドは、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンである。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドは、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）である。諸実施形態では、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドは、αマンナンである。諸実施形態では、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドは、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンである。諸実施形態では、ＣＤ６９リガンドは、ガレクチン１（Ｇａｌ－１）またはＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９複合体である。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示された実施形態のいずれかに従って修飾されたｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。

【0194】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコートする単離されたポリヌクレオチド、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、任意選択で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、リガンドに結合可能なＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。諸実施形態では、ＣＬＲは、Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）、ランゲリン、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び樹状細胞関連Ｃ型レクチン２（デクチン２）から選択される。

【0195】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なＣ型レクチンドメイン含有７Ａ（Ｃｌｅｃ７Ａ）の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0196】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能なランゲリンの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0197】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0198】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、ＴＮＦαに結合可能及び／または細胞性ＴＮＦ受容体とオリゴマー形成可能なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0199】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、そのリガンドに結合可能な第１のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、（ｃ）は、そのリガンドに結合可能な第２のＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）の一部を含む第２のドメインである。

【0200】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンに結合可能なＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0201】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）に結合可能なＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0202】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質、またはキメラタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、（ａ）は、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンに結合可能であるランゲリンの一部を含む第１のドメインであり、（ｂ）は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、（ｃ）は、αマンナンに結合可能なデクチン２の細胞外ドメインの一部を含む第２のドメインである。

【0203】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0204】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードするＲＮＡ（限定されないが、例えばｍｍＲＮＡ）を含む宿主細胞を提供する。本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、例えば、ｍｍＲＮＡを含む宿主細胞。
諸実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、任意選択で、ｍＲＮＡである。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。

【0205】

諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡもしくは修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）あるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、これに限定されないが、ヌクレオシド修飾を含むポリヌクレオチド修飾を含み得る。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１つ以上のヌクレオシド修飾を含む。諸実施形態では、ヌクレオシド修飾は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにこれらの組み合わせから選択される。

【0206】

諸実施形態では、ポリペプチド、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン（Ｉ）、１－メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、ならびにこれらの２つ以上の組み合わせから選択される。
諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｍＲＮＡが導入された細胞の自然免疫応答の実質的な誘導を引き起こさない。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡの修飾により、キメラタンパク質の生成効率、ｍｍＲＮＡの細胞内保持、及び接触細胞の生存率のうちの１つ以上が向上し、免疫原性が低下する。

【0207】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、本開示のキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むのに十分な長さを有する。

【0208】

修飾ｍＲＮＡは、分子の全長にわたって均一に修飾される必要はない。異なるヌクレオチド修飾及び／または骨格構造は、核酸内の様々な位置に存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）は、核酸の機能が実質的に低下しないように、核酸の任意の位置（複数可）に配置できることを理解するであろう。修飾は、５’末端修飾または３’末端修飾であり得る。核酸には、最低１個及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の介在割合、例えば、少なくとも約５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも約８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも約９０％の修飾ヌクレオチドが含有され得る。

【0209】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡには、ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンが含有され得る。諸実施形態では、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、諸実施形態では、修飾ウラシルは、単一の固有構造を有する化合物で置換されてもよいか、または上で開示された異なる構造を有する複数の化合物で置換されることができる（例えば、同じｍｍＲＮＡは、２、３、４種またはそれ以上の固有に修飾されたウラシルを含有してもよい）。諸実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％は、修飾シトシンで置換されてもよい。修飾シトシンは、単一の固有構造を有する化合物で置換されることができるか、または上で開示された異なる構造を有する複数の化合物で置換されることができる（例えば、同じｍｍＲＮＡは、２、３、４種またはそれ以上の固有に修飾されたシトシンを含有してもよい）。

【0210】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン（Ｉ）、１－メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、ならびにこれらの２つ以上の組み合わせから選択される。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含み、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びこれらの組み合わせから選択される。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、化学的に修飾されたウリジンで完全に修飾される。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、完全に修飾されたＮ１－メチルプソイドウリジンｍＲＮＡである。追加の化学修飾は、米国特許出願公開第２０１９０１１１００３号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0211】

諸実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンを含む。諸実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンを含む。

【0212】

諸実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンを含む。

【0213】

諸実施形態では、修飾ヌクレオシドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンを含む。

【0214】

諸実施形態では、ヌクレオチドは主溝面において修飾され得、ウラシルのＣ－５上の水素をメチル基またはハロ基で置換することを含むことができる。

【0215】

諸実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－ウリジン、または５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジンである。

【0216】

修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの組み合わせの更なる例は、米国特許第８，７１０，２００号、同第８，８２２，６６３号、同第８，９９９，３８０号、同第９，１８１，３１９号、同第９，２５４，３１１号、同第９，３３４，３２８号、同第９，４６４，１２４号、同第９，９５０，０６８号、同第１０，６２６，４００号、同第１０，８０８，２４２号、同第１１，０２０，４７７号、米国特許出願公開第２０２２０００１０２６号、同第２０２１０３１８８１７号、同第２０２１０２８３２６２号、同第２０２００３６０４８１号、同第２０２００１１３８４４号、同第２０２０００８５７５８号、同第２０１７０２０４１５２号、同第２０１９０１１４０８９号、同第２０１９０１１４０９０号、同第２０１８０３６９３７４号、同第２０１８０３１８３８５号、同第２０１９０１１１００３号、及びＰＣＴ国際出願第ＷＯ／２０１７１１２９４３号、同第ＷＯ２０１４／０２８４２９号、同第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。修飾ｍＲＮＡを合成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１７０２０４１５２号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0217】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡのシトシン残基の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％は、修飾シトシン残基によって置換される。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡのウラシル残基の少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％は、修飾ウラシル残基によって置換される。

【0218】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’－ＵＴＲを更に含み、そのいずれかまたは両方は、独立して、１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。このような実施形態では、ヌクレオシド修飾も翻訳可能領域に存在し得る。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、コザック配列を更に含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を更に含む。

【0219】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’キャップ及び／またはポリＡテールを更に含む。

【0220】

諸実施形態では、５’キャップは、５’末端のヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間に５’－５’－三リン酸結合を含む。諸実施形態では、５’キャップは、２’ヒドロキシル基上の最後及び最後から２番目の５’ヌクレオチドのメチル化を含む。諸実施形態では、５’キャップは、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）の結合を促進し、細胞内でのｍＲＮＡの安定性を付与し、及び／または翻訳能力を付与する。

【0221】

諸実施形態では、ポリＡテールの長さは、約３０ヌクレオチド超、または約４０ヌクレオチド超である。諸実施形態では、ポリＡテールの長さは、少なくとも約４０ヌクレオチド、または少なくとも約４５ヌクレオチド、または少なくとも約５５ヌクレオチド、または少なくとも約６０ヌクレオチド、または少なくとも約８０ヌクレオチド、または少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド、または少なくとも約１２０ヌクレオチド、または少なくとも約１４０ヌクレオチド、または少なくとも約１６０ヌクレオチド、または少なくとも約１８０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約２５０ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約３５０ヌクレオチド、または少なくとも約４００ヌクレオチド、または少なくとも約４５０ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチド、または少なくとも約７００ヌクレオチド、または少なくとも約８００ヌクレオチド、または少なくとも約９００ヌクレオチド、または少なくとも約１０００ヌクレオチドである。

【0222】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。諸実施形態では、３’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１９０１１４０８９号（これは、その全体が本明細書に組み込まれる）の表４に記載された配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の核酸配列を含む。諸実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２（ｍｉＲ－１２２）結合部位を含み、ｍｉＲ－１２２結合部位は、ｍｉＲ－１２２－３ｐ結合部位またはｍｉＲ－１２２－５結合部位である。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２に結合する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐに結合する。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。

【0223】

諸実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内に挿入される。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。諸実施形態では、オープンリーディングフレームとｍｉＲＮＡ結合部位との間にスペーサー配列が更に含まれる。一態様では、スペーサー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。

【0224】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを更に含む。諸実施形態では、５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１９０１１４０８９号の表３に記載されている配列、またはＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１７／２０１３２５号及び同第ＷＯ２０１４／１６４２５３号（これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。諸実施形態では、５’ＵＴＲは、翻訳開始に役割を果たす特徴を有する。諸実施形態では、５’ＵＴＲは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られている、コザック配列などのシグネチャーを保有する。諸実施形態では、５’ＵＴＲは、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成する。諸実施形態では、ｃ－ｍｙｃなどの上方制御されることが知られているｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドなどの核酸分子の発現を増強するために使用され得る。諸実施形態では、肝臓及び／または脾臓で上方制御されることが知られているｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、肝臓及び／または脾臓におけるポリヌクレオチドなどの核酸分子の発現を増強するために使用され得る。

【0225】

諸実施形態では、Ａの結合ヌクレオシドの領域の少なくとも１つは、５’ＵＴＲとして機能する結合ヌクレオシドの配列を含み、Ｃの結合ヌクレオシドの領域の少なくとも１つは、３’ＵＴＲとして機能する結合ヌクレオシドの配列を含む。諸実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、同じ種または異なる種に由来する。諸実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、同じ種または異なる種に由来する異なるタンパク質からのネイティブの非翻訳領域であり得る。諸実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、合成配列を有し得る。

【0226】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、３’ポリアデニル化（ポリＡテール）を更に含む。

【0227】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’末端キャップを更に含む。諸実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはこれらの類似体である。

【0228】

諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）される。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラである。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。

【0229】

諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ミニサークルもしくはプラスミドＤＮＡであるか、またはそれらを含む。諸実施形態では、プラスミドＤＮＡには、原核生物成分が全く含まれない。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、組織特異的調節エレメントを含む。諸実施形態では、組織特異的調節エレメントは、プロモーターまたはエンハンサーである。諸実施形態では、プラスミドＤＮＡは、発現ベクターである。諸実施形態では、ＤＮＡはミニサークルであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、ミニサークルは環状分子であり、それは、任意選択で小さい。諸実施形態では、ミニサークルは細胞転写及び翻訳機構を利用し、コード化遺伝子産物を生成する。諸実施形態では、ミニサークルには、原核生物成分が全く含まれない。諸実施形態では、ミニサークルは、実質的に、哺乳動物起源の配列（または哺乳動物細胞用に最適化されたもの）のみを含む。諸実施形態では、ミニサークルには、自然免疫系及び／またはＴｏｌｌ様受容体によって認識されるＤＮＡ配列エレメントが欠如しているか、またはそれらの量が減少している。諸実施形態では、ミニサークルは、親プラスミドから細菌成分を切除し、それによって親ＤＮＡ配列よりも小さくなることによって生成される。諸実施形態では、ミニサークルは、非ウイルス起源である。諸実施形態では、ミニサークルは、エピソームのままである。諸実施形態では、ミニサークルは、宿主細胞で複製されない。諸実施形態では、ミニサークルを有する非分裂細胞におけるキメラタンパク質の発現は、分裂細胞において少なくとも２日間、または少なくとも４日間、または少なくとも６日間、または少なくとも８日間、または少なくとも１０日間、または少なくとも１２日間、または少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間、または少なくとも１８日間、または少なくとも２０日間、または少なくとも２２日間、または少なくとも２４日間、またはそれ以上持続する。諸実施形態では、ミニサークルを有する非分裂細胞におけるキメラタンパク質の発現は、分裂細胞において少なくとも４日間、または少なくとも６日間、または少なくとも８日間、または少なくとも１０日間、または少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも４週間、または少なくとも５週間、または少なくとも６週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月、または少なくとも８ヶ月、またはそれ以上持続する。

【0230】

諸実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、これらに限定されないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）及び合成方法を含む当技術分野で利用可能な手段によって生成される。酵素ＩＶＴ、固相、液相、複合合成法、小領域合成、及びライゲーション法を利用し得る。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ＩＶＴ酵素合成法を使用して作製される。ＩＶＴによるポリヌクレオチドの作製方法は当技術分野で公知であり、国際出願ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載されており、その内容は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。したがって、本開示はまた、本明細書に記載のｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写するために使用できるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、コンストラクト及びベクターを含む。

【0231】

諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。諸実施形態では、ポリヌクレオチドは、皮膚特異的調節エレメントを含む。諸実施形態では、皮膚特異的調節エレメントは、ケラチン５（Ｋ５）プロモーター、ケラチン６（Ｋ６）プロモーター、ケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター、ケラチン１６（Ｋ１６）プロモーター、α１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、フィラグリンプロモーター、ロリクリンプロモーター、インボルクリンプロモーター、チロシナーゼプロモーター、及びαＶインテグリンプロモーターから選択される皮膚特異的プロモーターであり、これらは、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１０００６８号、同第２００３／０１５８１３７号、同第２００５／００４３２３５号、同第２００７／０１４２２８２号、同第２００８／０１４７０４５号、同第２０１０／０１５４０６８号、同第２０２０／００８５０２１号に記載のとおり構築することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0232】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。諸実施形態では、キメラタンパク質は、発現ベクターとして提供することができる。諸実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクターである。諸実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。諸実施形態では、発現ベクターは、非ウイルス発現ベクター（限定されないが、例えば、プラスミド）である。

【0233】

諸実施形態では、本非ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、制御配列に作動可能に連結されている線状または環状ＤＮＡ分子であり、制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。諸実施形態では、非ウイルスベクターは、プロモーター配列、ならびに転写及び翻訳停止シグナル配列を含む。諸実施形態では、発現ベクターは、とりわけ、染色体及びエピソームベクター、例えば、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクターを含むことができる。本コンストラクトは、発現を調節及び発生させる制御領域を含有し得る。

【0234】

ベクターは一般に単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる。当技術分野では、これらに限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが公知である。諸実施形態では、発現ベクターは、自律複製プラスミドまたはウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）である。諸実施形態では、発現ベクターは、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、核酸の細胞への移送を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物である。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限らない。

【0235】

諸実施形態では、ポリヌクレオチドまたは細胞療法は、宿主細胞内で機能する発現制御領域に作動可能に結合されたキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを使用することができる。発現制御領域は、発現ベクターを用いて形質転換されたヒト細胞においてキメラタンパク質が生成されるように、作動可能に結合されたコード化核酸の発現を駆動し得る。発現制御領域は、作動可能に結合された核酸の発現に影響を及ぼす、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書ではエレメントと称されることもある）である。発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞において作動可能に結合されたコード化核酸を発現し得る。一実施形態では、発現制御領域は、作動可能に結合された核酸に制御可能な発現を付与する。シグナル（刺激と称されることもある）は、このような発現制御領域に作動可能に結合された核酸の発現を増大または低減し得る。シグナルに応答して発現を増大させる、このような発現制御領域は、誘導可能と称される場合が多い。シグナルに応答して発現を低減させる、このような発現制御領域は、抑制可能と称される場合が多い。様々な実施形態では、キメラタンパク質の発現は、誘導可能または抑制可能である。通常、このようなエレメントによって付与される増大または低減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増大または低減が大きくなる。

【0236】

ヒト細胞で機能する発現系は当技術分野で周知であり、ウイルス系が含まれる。一般に、ヒト細胞で機能するプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼと結合し、コード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置される転写開始領域と、通常、転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスとを有する。ＴＡＴＡボックスは、正確な部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、通常、ＴＡＴＡボックスの上流の１００～２００塩基対内に典型的に位置する上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）も含むであろう。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、どちらの配向にも作用し得る。プロモーターとして特に使用されるのは、ウイルス遺伝子が高度に発現される場合が多く、広い宿主範囲を有するので、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。

【0237】

必要に応じて、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達剤を利用することもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ－Ｄｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１－４０６，１９９８、Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１－３５７，１９８６、Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２－３２５，２００５、Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ１５：３２６－３３２，１９９９、Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３を参照されたい）。これらとしては、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼが挙げられる。例としては、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７－４８６，１９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３－５４５，１９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７－２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０－６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７－６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティ（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポザーゼ、ならびにレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列など、ウイルス組み込みを提供する構成要素を有するＡＡＶ、レトロウイルス、及びアンチウイルスなどのウイルスを組み込むための構成要素（Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３）が挙げられる。更に、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含む、核酸配列を挿入してもよい。

【0238】

医薬組成物
一態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤または担体、及び本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を含む、医薬組成物を提供する。諸実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡを含む。

【0239】

適切な医薬組成物は、米国特許第８，７１０，２００号、同第８，８２２，６６３号、同第８，９９９，３８０号、同第９，１８１，３１９号、同第９，２５４，３１１号、同第９，３３４，３２８号、同第９，４６４，１２４号、同第９，９５０，０６８号、同第１０，６２６，４００号、同第１０，８０８，２４２号、同第１１，０２０，４７７号、米国特許出願公開第２０２２０００１０２６号、同第２０２１０３１８８１７号、同第２０２１０２８３２６２号、同第２０２００３６０４８１号、同第２０２００１１３８４４号、同第２０２０００８５７５８号、同第２０１７０２０４１５２号、同第２０１９０１１４０８９号、同第２０１９０１１４０９０号、同第２０１８０３６９３７４号、同第２０１８０３１８３８５号、同第２０１９０１１１００３号、及びＰＣＴ国際出願第ＷＯ／２０１７１１２９４３号、同第ＷＯ２０１４／０２８４２９号、同第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0240】

一態様では、本開示は、配列番号８０～９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する異種キメラタンパク質をコードする、単離された修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含む医薬組成物に関する。

【0241】

諸実施形態では、担体は、修飾（例えば、ＲＮＡエレメント）を含むｍｍＲＮＡであり、この修飾は、所望の翻訳調節活性を提供する。このような修飾は、ＰＣＴ出願番号、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１８２１３７８９に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0242】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を更に含む。諸実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２（ｍｉＲ－１２２）結合部位を含む。諸実施形態では、ｍｉＲ－１２２結合部位は、ｍｉＲ－１２２－３ｐ結合部位またはｍｉＲ－１２２－５結合部位である。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、オープンリーディングフレームとｍｉＲＮＡ結合部位との間にスペーサー配列を更に含む。諸実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。

【0243】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを更に含む。諸実施形態では、５’ＵＴＲはコザック配列を保有し、及び／または伸長因子の結合を促進する二次構造を形成する。

【0244】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’末端キャップを更に含む。諸実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはこれらの類似体である。

【0245】

本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得る。本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含み得る。諸実施形態では、修飾は、ヌクレオシド修飾である。諸実施形態では、修飾は、塩基修飾である。諸実施形態では、修飾は、糖－リン酸骨格修飾である。

【0246】

諸実施形態では、修飾は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。諸実施形態では、修飾は、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン（Ｉ）、１－メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。諸実施形態では、修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びこれらの組み合わせから選択される。

【0247】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのＮ１－メチルプソイドウリジンを含む。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、化学的に修飾されたウリジンで完全に修飾される。諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンで完全に修飾される。

【0248】

諸実施形態では、修飾は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。

【0249】

諸実施形態では、修飾は、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンから選択される。

【0250】

諸実施形態では、修飾は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンから選択される。

【0251】

諸実施形態では、修飾は、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンから選択される。

【0252】

諸実施形態では、修飾は、主溝面上に存在する。諸実施形態では、ウラシルのＣ－５上の水素は、メチル基またはハロ基で置換される。

【0253】

諸実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－ウリジン、及び５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジンから選択される１つ以上の修飾を更に含む。

【0254】

諸実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、またはリポソームとして製剤化される。諸実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。諸実施形態では、本明細書に記載のｍｍＲＮＡは、カチオン性水中油型エマルジョンに配合することができ、エマルジョン粒子は、油コアと、ｍＲＮＡと相互作用して分子をエマルジョン粒子に固定することができるカチオン性脂質と、を含む。諸実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡは、親水相が分散された連続疎水相を含む、油中水型エマルジョンに配合されてもよい。例示的なエマルジョンは、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１２００６３８０号及び同第ＷＯ２０１０８７７９１号（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって作製することができる。

【0255】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に配合される。脂質ナノ粒子は、通常、目的の核酸カーゴと共に、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、例えば、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０２１２３１８５４号、同第ＷＯ２０２１０５０９８６号、同第ＷＯ２０２１０５５８３３号、同第ＷＯ２０２１２１３９２４号、同第ＷＯ２０２１０５５８４９号、同第ＷＯ２０２１２１４２０４号、同第ＷＯ２０２１１８８９６９号、同第ＷＯ２０２１０５５８３５号、同第ＷＯ２０２００６１２８４号、同第ＷＯ２０２００６１２９５号、同第ＷＯ２０１７０４９２４５号、同第ＷＯ２０１７０３１２３２号、同第ＷＯ２０１７１１２８６５号、同第ＷＯ２０１７２１８７０４号、同第ＷＯ２０１７２１８７０４号、同第ＷＯ２０１７０９９８２３号、同第ＷＯ２０１７０４９０７４号、同第ＷＯ２０１７１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７１８０９１７号、同第ＷＯ２０１７０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７２２３１３５、同第ＷＯ２０１６１１８７２４号、同第ＷＯ２０１５１６４６７４号、同第ＷＯ２０１５０３８８９２号、同第ＷＯ２０１４１５２２１１号、及び同第ＷＯ２０１３０９０６４８号（それぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている成分、組成物、及び方法を使用して作成することができる。ＰＥＧ脂質は、イオン化可能な脂質（例えば、米国特許第８，１５８，６０１号、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号、及び同第ＷＯ２０１５／１３０５８４号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、当技術分野で公知のもの）から選択される。イオン化可能な脂質は、これらに限定されないが、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号及び同第ＷＯ２０１３１１６１２６号（これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のイオン化可能な脂質から選択することができる。諸実施形態では、脂質は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されるもののような切断可能な脂質であり得る。諸実施形態では、脂質は、当技術分野で公知の方法及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号（そのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって合成することができる。諸実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性増強分子を更に含むことができる。非限定的な透過性増強分子は、米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

【0256】

諸実施形態では、担体は、脂質様物質、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、または複合体である。諸実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、またはリポソームとして製剤化される。諸実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（例えば、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、及びＣ１２－２００から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質）；構造脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））；コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質（例えば、ＰＥＧジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧセラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物、またはＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８））；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される脂質を含む。

【0257】

諸実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。諸実施形態では、ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、約５～２５％のリン脂質、約２５～５５％の構造脂質、及び約０．５～１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。諸実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン化可能なアミノ脂質、約８～１２％のリン脂質、約３７～４０％の構造脂質、及び約１～２％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（例えば、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、及びＣ１２－２００から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質）；構造脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））；コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質（例えば、ＰＥＧジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧセラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物、またはＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８））；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される脂質を含む。

【0258】

諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、（ａ）粒子中に存在する総脂質の５０モル％～８５モル％を含むカチオン性脂質、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の１３モル％～４９．５モル％を含む非カチオン性脂質、及び（ｃ）粒子中に存在する総脂質の０．５モル％～２モル％を含む粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＳＭ－１０２、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５及びＣ１２－２００；コレステロール；ならびにＰＥＧ脂質から選択される脂質を含む。

【0259】

本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。

【0260】

一態様では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかの実施形態のｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示されるいずれかの実施形態のｍｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む、医薬組成物を提供する。諸実施形態では、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。

【0261】

諸実施形態では、医薬組成物は、配列番号８０～９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する異種キメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含む。諸実施形態では、医薬組成物は、イオン化可能なアミノ脂質、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ脂質を含む、ＬＮＰとして製剤化される。

【0262】

諸実施形態では、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。諸実施形態では、医薬組成物は、局所、皮膚、皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内または経皮投与用に製剤化される。諸実施形態では、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。

【0263】

一態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤または担体、及び本明細書に開示される実施形態のいずれか１つのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を含む、医薬組成物を提供する。諸実施形態では、医薬組成物は、核酸、例えば、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つのｍｍＲＮＡを含む。

【0264】

諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質（例えば、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、及びＣ１２－２００から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質）；構造脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））；コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質（例えば、ＰＥＧジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧセラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物、またはＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８））；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；及び核酸、例えば、ｍｍＲＮＡから選択される脂質を含む。

【0265】

諸実施形態では、ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、約５～２５％のリン脂質、約２５～５５％の構造脂質、及び約０．５～１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。諸実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は以下の式を含む：

【化18】

【0266】

諸実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質；構造脂質；コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；ならびに核酸（例えば、ｍｍＲＮＡ）から選択される脂質を含む。諸実施形態では、イオン化可能な脂質は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、及びＣ１２－２００から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質である。諸実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質は、ＰＥＧジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧセラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物、またはＰＥＧジラウリルオキシプロピル（例えば、（Ｃ１２）、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８））から選択される。

【0267】

諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、例えば、脂質粒子を用いる方法などの様々なトランスフェクション方法によって細胞に導入される、共役ポリヌクレオチド配列であるか、またはそれを含む。諸実施形態では、遺伝子導入コンストラクトを含む組成物は、送達粒子を含む。諸実施形態では、送達粒子は、脂質に基づく粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））、カチオン性脂質、または生分解性ポリマー）を含む。遺伝子導入コンストラクトの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、潜在的なオフターゲット事象及び免疫応答を制限するための一過性の非組み込み発現、ならびに大きなカーゴを輸送する能力を有する効率的な送達を含む、特定の利点を提供する。ＬＮＰは、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びｍＲＮＡの送達、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を肝細胞及び肝臓にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで送達するために使用されてきた。例えば、米国特許第１０，１９５，２９１号は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療剤の送達のためのＬＮＰの使用について記載している。

【0268】

諸実施形態では、本開示の実施形態による組成物は、ＬＮＰの形態にある。諸実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリル）、ならびに１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｌ）－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含む。

【0269】

諸実施形態では、組成物は、様々な比で脂質及びポリマーを有し得、脂質は、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＰＣ、トリオレイン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧから選択され得、ポリマーは、例えば、ＰＥＩまたはポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）であり得る。更にまたはあるいは、任意の他の脂質及びポリマーを使用し得る。諸実施形態では、脂質及びポリマーの比は、約０．５：１、または約１：１、または約１：１．５、または約１：２、または約１：２．５、または約１：３、または約３：１、または約２．５：１、または約２：１、または約１．５：１、または約１：１、または約１：０．５である。

【0270】

諸実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含み、その非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）もしくはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－’）アミノ）エチル）（２ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、またはこれらの混合物が挙げられる。

【0271】

諸実施形態では、ＬＮＰは、肝送達に好適である、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびにＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む。諸実施形態では、ＬＮＰは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９８５，８２６号に記載の肝指向性化合物を含む。ＧａｌＮＡｃは、哺乳動物肝細胞で発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的とすることが知られている。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２０１４；２１（１０）：１０２５－３０を参照されたい。

【0272】

いくつかの例では、単離されたポリヌクレオチドは、ＰＥＩ、またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等のそれらの誘導体と製剤化または複合化され得る。

【0273】

諸実施形態では、ＬＮＰは、共役脂質であり、その非限定的な例としては、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質が挙げられる。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。

【0274】

諸実施形態では、ＬＮＰ製剤は、リン酸複合体を更に含んでもよく、それは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を延長させることができ、及び／またはナノ粒子の標的送達を増加させることができる。リン酸複合体は、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載の方法によって作製することができる。ＬＮＰ製剤はまた、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、同第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、及び同第ＵＳ２０１３００７２７０９号（参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなポリマー複合体（例えば、水溶性複合体）も含有する。

【0275】

諸実施形態では、ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体には、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンコハク酸オクテニル、フィトグリコーゲンβデキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβデキストリン（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１２１０９１２１、本明細書にその全体が参照により組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。諸実施形態では、ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を改善するために界面活性剤またはポリマーでコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、親水性コーティング、例えば、限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／または米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の中性表面電荷を有するコーティングでコーティングすることができる。諸実施形態では、ＬＮＰ製剤は、粒子の表面特性を変更するように操作することができ、その結果、脂質ナノ粒子は粘膜バリアを透過することができる。これは、米国特許第８，２４１，６７０号またはＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。諸実施形態では、粘液透過性ＬＮＰは、粘膜透過増強コーティングを含む低張性製剤であり得る。製剤は、送達される上皮に対して低張性であり得る。低張性製剤の非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0276】

諸実施形態では、本明細書に記載のｍｍＲＮＡは、平均直径が１０～１０００ｎｍの球形であり得る固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化される。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化できる固体脂質コアマトリックスを保有する。例示的なＳＬＮは、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されているものであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0277】

諸実施形態では、ナノ粒子は、約１０００ｎｍ未満の直径を有する粒子である。諸実施形態では、本開示のナノ粒子は、約５００ｎｍ以下、または約４００ｎｍ以下、または約３００ｎｍ以下、または約２００ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。諸実施形態では、本開示のナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約１３０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１１０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。諸実施形態では、本開示のナノ粒子は、約１００ｎｍの最大寸法（例えば、直径）を有する。

【0278】

諸実施形態では、キメラタンパク質またはｍＲＮＡを含む治療用ナノ粒子は、持続放出用に製剤化することができ、本明細書で使用する場合、持続放出とは、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。諸実施形態では、期間には、時間、日、週、月及び年が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載のｍＲＮＡの持続放出ナノ粒子は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号及び同第ＵＳ２０１３０１５０２９５号（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように製剤化することができる。

【0279】

諸実施形態では、キメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）は、様々な製剤に含まれる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）は、液剤、懸濁剤、乳剤、点滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤、坐剤、乳濁液、エアロゾル、噴霧、懸濁剤、または使用に適した他の形態をとってもよい。タンパク質配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトも使用してもよい。諸実施形態では、組成物は、カプセルの形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照されたい）。適切な薬学的賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されている。

【0280】

諸実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるキメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクターを提供する。諸実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。諸実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。

【0281】

原核生物及び真核生物の両方のベクターは、キメラタンパク質の発現に使用することができる。原核生物ベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ配列に基づくコンストラクトが含まれる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ１９９６，６０：５１２－５３８を参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために使用され得る調節領域の非限定的な例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、及びλＰ_Ｌが挙げられる。原核生物発現ベクターの非限定的な例には、λｇｔ１１などのλｇｔベクター系列（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ． Ｉ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．４９－７８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクター系列（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ１９９０，１８５：６０－８９）が含まれ得る。しかしながら、原核生物宿主－ベクター系は哺乳動物細胞の翻訳後プロセシングの多くを実行できない。したがって、真核生物宿主－ベクター系は、特に有用であり得る。様々な調節領域は、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用することができる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＲＳＶ－ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞において有用であり得る誘導性プロモーターには、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルス糖質コルチコイド応答性末端反復配列（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）、β－インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターが含まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１９８９，４９：２７３５－４２、及びＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９９０，１０：１６５－７５を参照されたい）。熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現を駆動するために有利であり得る。

【0282】

諸実施形態では、本開示の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域またはその補体に作動可能に結合された、キメラタンパク質またはその補体をコードする核酸（及び／または追加の薬剤）を含む。発現制御領域は、発現ベクターを用いて形質転換されたヒト細胞において遮断及び／または刺激因子が生成されるように、作動可能に結合された遮断及び／または刺激因子をコードする核酸の発現を駆動し得る。

【0283】

発現制御領域は、作動可能に結合された核酸の発現に影響を及ぼす、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書ではエレメントと称されることもある）である。本開示の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞において作動可能に結合されたコード化核酸を発現し得る。諸実施形態では、細胞は、上皮細胞である。諸実施形態では、細胞は、外皮系の炎症によって引き起こされる、もしくはそれに関連する病変障害内またはその近くに位置する。諸実施形態では、細胞は、非腫瘍細胞である。諸実施形態では、発現制御領域は、作動可能に結合された核酸に調節可能な発現を付与する。シグナル（刺激と称されることもある）は、かかる発現制御領域に作動可能に結合された核酸の発現を増加または低減させることができる。シグナルに応答して発現を増大させる、このような発現制御領域は、誘導可能と称される場合が多い。シグナルに応答して発現を低減させる、このような発現制御領域は、抑制可能と称される場合が多い。通常、このようなエレメントによって付与される増大または低減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増大または低減が大きくなる。

【0284】

諸実施形態では、本開示は、合図に応答して一過性で高レベルの発現をもたらし得る誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、外皮系の炎症によって引き起こされる、またはそれに関連する病変障害の近くにある場合、かかる発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換された細胞を適切な合図に曝露することによって、高レベルの薬剤を一過性に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域には、低分子化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含む領域が含まれる。特定の例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、同第５，９３５，９３４号、同第６，０１５，７０９号、及び同第６，００４，９４１号に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0285】

発現制御領域及び遺伝子座制御領域には、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの完全長プロモーター配列、ならびに完全長もしくは非バリアント機能の全部または一部を保持する、部分配列またはポリヌクレオチドバリアントが含まれる。本明細書で使用する場合、「機能的」という用語及びその文法上の変形は、核酸配列、部分配列、または断片に関して使用される場合、その配列が天然核酸配列（例えば、非バリアントまたは非修飾配列）の１つ以上の機能を有することを意味する。

【0286】

本明細書で使用する場合、「作動可能に結合する」とは、それらが意図した様式で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的並置を指す。核酸と作動可能に結合する発現制御エレメントの例では、この関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するような関係である。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端近く（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（例えば、イントロン内）に位置し得る。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離に位置し得る（例えば、核酸から１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００、またはそれ以上のヌクレオチド）。発現制御エレメントの特定の例はプロモーターであり、これは通常、転写される配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例は、転写される配列の５’もしくは３’、または転写される配列内に位置し得るエンハンサーである。

【0287】

ヒト細胞で機能する発現系は当技術分野で周知であり、ウイルス系が含まれる。一般に、ヒト細胞で機能するプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼと結合し、コード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置される転写開始領域と、典型的に、転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスとを有する。ＴＡＴＡボックスは、正確な部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、典型的に、ＴＡＴＡボックスの上流の１００～２００塩基対内に典型的に位置する上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）も含むであろう。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、どちらの配向にも作用し得る。プロモーターとして特に使用されるのは、ウイルス遺伝子が高度に発現される場合が多く、広い宿主範囲を有するので、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。外皮系で発現するプロモーターの例としては、ケラチン５（Ｋ５）プロモーター、ケラチン６（Ｋ６）プロモーター、ケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター、ケラチン１６（Ｋ１６）プロモーター、α１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、フィラグリンプロモーター、ロリクリンプロモーター、インボルクリンプロモーター、チロシナーゼプロモーター、及びαＶインテグリンプロモーターが挙げられる。

【0288】

典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’に位置する調節領域であり、したがって、プロモーターエレメントと一緒に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。イントロンもまた、発現コンストラクトに含まれてもよい。

【0289】

核酸を生きた細胞に導入するために使用可能な種々の技法が存在する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞への核酸の移入に好適な技術としては、リポソームの使用、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマー系システム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈降法などが挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入のために、リポソーム、キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含む多数の技術及び試薬も使用されてもよい。ウイルスベクターもｉｎ ｖｉｖｏでの形質導入に好適である。いくつかの状況では、外皮系の炎症によって引き起こされる、もしくはそれに関連する病変障害内もしくはその近くに位置する、細胞からの細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連付けられた細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環中の内部化を受けるタンパク質の抗体、細胞内限局化を標的とし、細胞内半減期を強化するタンパク質を標的とするため、及び／またはそれらの取り込みを促進するために使用し得る。受容体を媒介したエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９－４４３２（１９８７）、及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０－３４１４（１９９０）に記載される。

【0290】

必要に応じて、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達剤を利用することもできる。多数の組み込み配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ－Ｄｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１－４０６，１９９８、Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１－３５７，１９８６、Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２－３２５，２００５、Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ １５：３２６－３３２，１９９９、Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３を参照されたい）。これらとしては、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼが挙げられる。例としては、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７－４８６，１９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３－５４５，１９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７－２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０－６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７－６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティ（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポザーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，前述）、ならびにレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列など、ウイルス組み込みを提供する構成要素を有するＡＡＶ、レトロウイルス、及びアンチウイルスなどのウイルスを組み込むための構成要素（Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３）が挙げられる。更に、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含む、キメラタンパク質をコードする核酸配列を挿入してもよい。

【0291】

一態様では、本開示は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の発現のための発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが公知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１ １７，１２２，２００３を参照されたい。例示的なウイルスベクターとしては、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるウイルスベクターが含まれるが、他のウイルスベクターも使用されてよい。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用について、αウイルス及びアデノウイルスなど、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターが使用に好適である。αウイルスの例示的な種類としては、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用について、レトロウイルス、ＡＡＶ、及びアンチウイルスなど、宿主ゲノムに組み込まれるウイルスベクターが好適である。諸実施形態では、本開示は、外皮系の炎症によって引き起こされる、もしくはそれに関連する病変障害内またはその近くに位置する細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで本開示のウイルスベクターと接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト細胞を形質導入する方法を提供する。
諸実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。諸実施形態では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードするＲＮＡ（限定されないが、例えばｍｍＲＮＡ）を含む宿主細胞を提供する。

【0292】

本発明のキメラタンパク質を生成するために、発現ベクターを宿主細胞に導入してもよい。細胞は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されてもよいし、または遺伝子操作されてもよい。有用な哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， ｉｎ “Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．を参照されたい）。これらとしては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（例えば、２９３、２９３－ＥＢＮＡ、または浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ１９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞－ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１９８０，７７：４２１６）、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ１９８０，２３：２４３－２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ－３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；及びマウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。本明細書に記載されるキメラタンパク質を発現するための例示的な細胞型には、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びその卵白アルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウスメラノーマ細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、ならびにヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７が含まれる。
宿主細胞は、健康なヒト、外皮系の炎症に罹患している患者、及び感染性疾患を有する患者を含む正常または罹患した対象から、民間研究所の寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公的な培養物収集、または商業的供給業者から得ることができる。

【0293】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のキメラタンパク質の生成に使用され得る細胞としては、限定するものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；血球、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などが挙げられる。細胞型の選択は、治療もしくは予防されている外皮系の炎症によって引き起こされるか、もしくはそれと関連している疾患または障害の種類に依存し、当業者によって決定され得る。

【0294】

必要に応じて、キメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）を含む製剤はまた、可溶化剤も含んでもよい。また、薬剤は、当技術分野で公知の好適なビヒクルまたは送達デバイスを用いて送達され得る。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクルまたは送達デバイスで共送達され得る。投与用の組成物は、任意選択で、注入の部位における疼痛を緩和するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。

【0295】

本開示のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）を含む製剤は、好都合に単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野において周知である任意の方法によって調製してもよい。このような方法は一般に、治療薬を１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。典型的には、製剤は、治療剤を液体担体、細かく分割した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させることによって調製され、次に必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形に成形する（例えば、湿式または乾式造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知である従来の方法を使用して錠剤化する）。

【0296】

諸実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）は、慣用的な手順に従って、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として製剤化される。

【0297】

本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）は、経口投与してもよい。このようなキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）はまた、他の簡便な経路、例えば、静脈内注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層を介した吸収（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など）によって投与されてもよく、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身性であっても、または局所性であってもよい。種々の送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が公知であり、投与に使用することができる。

【0298】

本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）の投与量ならびに投与スケジュールは、これらに限定されないが、治療される疾患、対象の一般的な健康状態、及び投与する医師の裁量を含む種々のパラメータに依存し得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、追加の薬剤の投与前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、同時に、または投与後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に、薬剤を必要とする対象に投与され得る。諸実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加の薬剤は、１分あけて、１０分あけて、３０分あけて、１時間未満あけて、１時間あけて、１時間～２時間あけて、２時間～３時間あけて、３時間～４時間あけて、４時間～５時間あけて、５時間～６時間あけて、６時間～７時間あけて、７時間～８時間あけて、８時間～９時間あけて、９時間～１０時間あけて、１０時間～１１時間あけて、１１時間～１２時間あけて、１日あけて、２日あけて、３日あけて、４日あけて、５日あけて、６日あけて、１週間あけて、２週間あけて、３週間あけて、または４週間あけて投与される。

【0299】

本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）の投与量は、状態の重症度、状態を治療するか予防するか、ならびに治療される対象の年齢、体重、及び健康状態を含むいくつかの要因に依存し得る。更に、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療上の薬物動態、薬力学、または有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報が使用される投与量に影響し得る。更に、正確な個々の投与量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与の期間、投与の経路、製剤の性質、排泄率、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む、種々の要因に応じて若干調整され得る。投与量のある程度の変動が予想され得る。

【0300】

諸実施形態では、送達は、小胞、特にリポソーム内であることができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎＬｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）を参照されたい。

【0301】

本明細書に記載される任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）は、制御放出もしくは持続放出手段によって、または当業者に周知である送達デバイスによって投与され得る。例としては、限定するものではないが、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、及び同第５，７３３，５５６号に記載されているものが含まれ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような剤形は、種々の割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはこれらの組み合わせを使用して、１つ以上の活性成分の制御放出または持続放出を提供するために有用であり得る。活性成分の制御放出または持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度もしくは利用能、水の濃度もしくは利用能、または他の生理学的条件もしくは化合物を含むがこれらに限定されない種々の条件によって刺激され得る。

【0302】

諸実施形態では、高分子材料を使用してもよい（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたく；また更にＬｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。

【0303】

諸実施形態では、制御放出系は、治療される標的領域の近くに配置され得、したがって全身用量のほんの一画分しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前述，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３）による総説で論じられている他の制御放出系を使用してもよい。

【0304】

本明細書に記載の任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）の投与は、独立して、毎日１～４回、または月に１～４回、または年に１～６回、または２、３、４、または５年に１回であり得る。投与は、１日または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、対象の生涯にわたる場合もある。

【0305】

本明細書に記載される任意のキメラタンパク質、または単離されたポリヌクレオチドもしくはｍｍＲＮＡ（及び／または追加の薬剤）を利用する投与レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別、及び医学的状態；治療される状態の重症度；投与の経路；対象の腎機能または肝機能；個々の薬理ゲノミクス構成；及び使用される本開示の特定の化合物を含む、種々の要因に応じて選択され得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）も、１日１回投与されてもよいし、または１日合計投与量を１日２、３、または４回の分割投与で投与されてもよい。更に、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）も、投与計画全体を通じて断続的にではなく連続的に投与されてもよい。

【0306】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのポリヌクレオチドを含む、宿主を提供する。

【0307】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードするＲＮＡ（限定されないが、例えばｍｍＲＮＡ）を含む宿主細胞を提供する。

【0308】

本開示のキメラタンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸で治療できる疾患／障害
諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ））は、自己免疫疾患及び／またはアレルギー疾患を治療または予防するのに適している。諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、ベーチェット病、サルコイドーシス、創傷潰瘍、血管炎、及び壊疽性膿皮症から選択される疾患もしくは障害を治療または予防するのに適している。

【0309】

諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、マクロファージ、単球、樹状細胞及び／またはＴ細胞によって媒介される炎症を治療または予防するのに適している。諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－２３によって媒介される炎症を治療または予防するのに適している。諸実施形態では、炎症は、外皮系の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している。諸実施形態では、炎症は、皮膚の疾患または障害によって引き起こされるか、またはそれと関連している。

【0310】

諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、これらに限定されないが、関節リウマチ、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎、ウェゲナー病（肉芽腫症）、クローン病（または炎症性腸疾患）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、喘息、悪液質、乾癬、もしくはアトピー性皮膚炎、または他の炎症性もしくは自己免疫関連の病気、障害もしくは状態を含む、対象においてＴＮＦα活性が有害である疾患を治療または予防するのに適している。本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）で治療することができる追加の疾患は、国際特許出願公開第ＷＯ２０００／０６２７９０号、同第ＷＯ２００１／０６２２７２号、及び米国特許第８，７７２，４５８号、同第７，７００，３１８号、及び米国特許公開第２０１９／０１３５９２９号、同第２０２１／０１７７９８３号に記載されており、これらの全内容は、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。

【0311】

諸実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、乾癬、尋常性天疱瘡、強皮症、アトピー性皮膚炎、サルコイドーシス、結節性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、スウィート症候群、白斑、慢性爪囲炎、湿疹、脂漏性皮膚炎、及び／またはじん麻疹から選択される皮膚の疾患もしくは障害を治療または予防するのに適している。

【0312】

本明細書に開示されるキメラタンパク質または本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）は、乾癬（限定されないが、例えば、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎）を治療または予防するのに適している。

【0313】

乾癬は、ヒトに特有の慢性炎症性皮膚疾患である。これは、乾癬の皮膚病変におけるＴ細胞、ならびに好中球、樹状細胞、マクロファージ及びＮＫ細胞を含む自然免疫系の細胞の密な浸潤によって特徴付けられる。乾癬はまた、皮膚の上皮細胞（例えば、ケラチノサイト）の過剰増殖及び異常な分化によって特徴付けられ、表皮の顕著な肥厚を引き起こす。表皮のすぐ下にある血管の数及び大きさが、劇的に増加していることが観察される。好中球からなる膿瘍が表皮内に形成され、皮膚が赤くなり、厚くなり、剥がれ落ちる。皮膚におけるケラチノサイトの過剰増殖及びマクロファージの活性化を促進するメカニズムは、まだ完全に解明されていない。乾癬は、症状（例えば、皮膚病変）は短期的には治療できるものの、治療を中止すると症状が再発するため、多くの患者にとって慢性の生涯にわたる疾患である。

【0314】

治療方法
一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、自己免疫状態または炎症性障害の対象を治療するための方法に関し、ここで、（ａ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメイン、またはＴＮＦＲ２リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片を含む第１のドメインであり、（ｃ）は、ＣＬＥＣ７ａまたはＣＬＥＣ７ａリガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）またはＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）またはデクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）またはランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＣＤ６９またはＣＤ６９リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片から選択される細胞外ドメインを含む、第２のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、リンカーは、ジスルフィド結合を形成可能な少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２リガンドは、ＴＮＦαである。諸実施形態では、ＣＬＥＣ７ａリガンドは、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンである。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドは、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）である。諸実施形態では、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドは、αマンナンである。諸実施形態では、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドは、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンである。諸実施形態では、ＣＤ６９リガンドは、ガレクチン１（Ｇａｌ－１）またはＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９複合体である。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示された実施形態のいずれかに従って修飾されたｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。

【0315】

一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、迅速かつ持続的な免疫抑制を対象に誘導する方法に関し、ここで、（ａ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメイン、またはＴＮＦＲ２リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片を含む第１のドメインであり、（ｃ）は、ＣＬＥＣ７ａまたはＣＬＥＣ７ａリガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）またはＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）またはデクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）またはランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片、ＣＤ６９またはＣＤ６９リガンドと結合可能なそのバリアントもしくは断片から選択される細胞外ドメインを含む、第２のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメインと第２のドメインに隣接するリンカーであり、リンカーは、ジスルフィド結合を形成可能な少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。諸実施形態では、ＴＮＦＲ２リガンドは、ＴＮＦαである。諸実施形態では、ＣＬＥＣ７ａリガンドは、β－１，３結合及び／またはβ－１，６結合グルカンである。諸実施形態では、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）リガンドは、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）及び／または細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）である。諸実施形態では、デクチン２（ＣＬＥＣ６Ａ）リガンドは、αマンナンである。諸実施形態では、ランゲリン（ＣＤ２０７、ＣＬＣ４Ｋ）リガンドは、硫酸化グリカン、マンノシル化グリカン、ケラタン硫酸（ＫＳ）及び／またはβグルカンである。諸実施形態では、ＣＤ６９リガンドは、ガレクチン１（Ｇａｌ－１）またはＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９複合体である。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。諸実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示された実施形態のいずれかに従って修飾されたｍＲＮＡであるか、またはそれを含む。

【0316】

本発明の一態様は、自己免疫疾患を治療する方法であり、治療を必要とする対象に、薬学的に許容される賦形剤または担体を含む有効量の医薬組成物、及び本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）の治療有効量を投与することを含む。

【0317】

一態様では、本開示は、炎症によって引き起こされる病気を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を対象に投与することを含む。諸実施形態では、病気は、乾癬、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、尋常性乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及びクローン病から選択される。

【0318】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を対象に投与することを含む。

【0319】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0320】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、例えば、ｍｍＲＮＡを対象に投与することを含む。

【0321】

一態様では、本開示は、外皮系の炎症を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを対象に投与することを含む。

【0322】

諸実施形態では、治療により、治療前のＴ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ及び／またはＮＫ細胞の浸潤レベルと比較して、炎症組織におけるＴ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ及び／またはＮＫ細胞の浸潤レベルが減少する。諸実施形態では、治療により、治療前のＴＮＦα、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－２３のレベルと比較して、炎症組織におけるＴＮＦα、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－２３のレベルが減少する。諸実施形態では、治療により、治療前の皮膚の赤み、肥厚及び剥離の軽減と比較して、皮膚の赤み、肥厚及び剥離が軽減される。

【0323】

一態様では、本開示は、炎症の治療または予防に使用するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を提供する。

【0324】

一態様では、本開示は、炎症の治療または予防に使用するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を提供する。

【0325】

一態様では、本開示は、尋常性乾癬を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0326】

一態様では、本開示は、尋常性乾癬を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0327】

一態様では、本開示は、尋常性乾癬を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0328】

一態様では、本開示は、尋常性乾癬を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0329】

一態様では、本開示は、乾癬性関節炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0330】

一態様では、本開示は、乾癬性関節炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0331】

一態様では、本開示は、関節リウマチを治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0332】

一態様では、本開示は、関節リウマチを治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0333】

一態様では、本開示は、若年性特発性関節炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0334】

一態様では、本開示は、若年性特発性関節炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0335】

一態様では、本開示は、強直性脊椎炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0336】

一態様では、本開示は、強直性脊椎炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0337】

一態様では、本開示は、若年性関節炎を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0338】

一態様では、本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0339】

一態様では、本開示は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0340】

一態様では、本開示は、炎症性クローン病を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、及び／または本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（限定されないが、例えば、ｍｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む。

【0341】

一態様では、本開示は、炎症によって引き起こされる病気を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質、本明細書に開示される実施形態のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｍｍＲＮＡ、または本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、または本明細書に開示される実施形態のいずれかの宿主細胞を対象に投与することを含む。諸実施形態では、病気は、乾癬、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、尋常性乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病から選択される。

【0342】

諸実施形態では、本方法は、対象に抗炎症薬を投与することを更に含む。諸実施形態では、抗炎症薬は、非ステロイド性抗炎症薬またはコルチコステロイドである。

【0343】

諸実施形態では、医薬組成物及び抗炎症薬は、同時に提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び抗炎症薬は、２つの異なる医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び抗炎症薬は、単一の医薬組成物として提供される。実施形態では、抗炎症薬が提供された後に医薬組成物が提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、抗炎症薬が提供される前に、提供される。

【0344】

諸実施形態では、抗炎症薬は、アセチルサリチル酸（アスピリン）、ベンジル－２，５－ジアセトキシ安息香酸、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、エトフェナメート、フルインダク、サリチル酸グリコール、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、サリチル酸メチル、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サリチル酸、サリチルミド、及びｖｉｍｏｖｏ（登録商標）（ナプロキセンとエソメプラゾールマグネシウムの組み合わせ）から選択される、非ステロイド性抗炎症薬である。諸実施形態では、抗炎症薬は、αメチルデキサメタゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン及びそのエステルの残り、安息香酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、βメチルベタメタゾン、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、クレシノロン、吉草酸クロベタゾール、クロコルテロン、コルチゾン、コルトドキソン、デソニド、デオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、二酢酸ジフルオロゾン、ジフルプレドナート、フルアドレノロン、フルセトニド、フルクロロロンアセトニド、フルクロロニド、フルコルチンブチルエステル、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメタロン、フルオシノロンアセトニド、フルペロロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルプレドニゾロン、フルラドレノロンアセトニド、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、及びトリアムシノロンアセトニドから選択されるコルチコステロイドである。

【0345】

諸実施形態では、本方法は、対象に免疫抑制剤を投与することを更に含む。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、同時に提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、２つの異なる医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、単一の医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制剤が提供された後に提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制剤が提供される前に提供される。

【0346】

諸実施形態では、免疫抑制剤は、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、及びシロリムス）、代謝拮抗剤（例えば、アザチオプリン、及びメトトレキサート）、細胞分裂阻害薬（例えば、アルキル化剤）、細胞傷害性抗生物質、インターフェロン、マイコフェノラート、オピオイド、低分子生物剤（例えば、フィンゴリモド、及びミリオシン）、及びＴＮＦ結合タンパク質から選択される。

【0347】

諸実施形態では、本方法は、抗炎症薬及び免疫抑制剤を対象に投与することを更に含む。諸実施形態では、医薬組成物、ならびに抗炎症薬及び免疫抑制剤は、同時に提供される。諸実施形態では、医薬組成物、ならびに抗炎症薬及び免疫抑制剤は、２つの異なる医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物、ならびに抗炎症薬及び免疫抑制剤は、単一の医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、抗炎症薬及び免疫抑制剤が提供された後に提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、抗炎症薬及び免疫抑制剤が提供される前に提供される。

【0348】

諸実施形態では、本方法は、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３阻害剤及び／またはＩＬ－１７阻害剤を含む、第２の医薬組成物を対象に投与することを更に含む。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、同時に提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、２つの異なる医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物及び免疫抑制剤は、単一の医薬組成物として提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制剤が提供された後に提供される。諸実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制剤が提供される前に提供される。諸実施形態では、ＩＬ－１７阻害剤は、セクキヌマブ、イキセキズマブ、ビメキズマブ、及びブロダルマブから選択される。諸実施形態では、ＩＬ１２／ＩＬ－２３阻害剤は、ウセキヌマブ、リサンキズマブ、グセルクマブ、及びチルドラキズマブから選択される。

【実施例】

【0349】

本明細書の実施例は、本技術の利点及び利益を説明するため、ならびに本開示のキメラタンパク質及びそれをコードする核酸の調製または使用に関して当業者を更に支援するために示される。本明細書の実施例は、本技術の好ましい態様をより完全に説明するためにも提示される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって例示される本開示の範囲を限定するものとしては決して解釈されるべきではない。これらの実施例は、上述した本技術の変形例、態様、または実施形態のいずれかを含んでも、または組み込んでもよい。上述の変形例、態様または実施形態は、それぞれ、本技術のいずれかまたはすべての他の変形例、態様または実施形態の変形例を更に含んでもよいし、または組み込んでもよい。

【0350】

実施例１．例示的なヒトＴＮＦＲ２及びＣｌｅｃ７ａ系キメラタンパク質の構築ならびに特性評価
ヒトＴＮＦＲ２及びヒトＣｌｅｃ７ａ系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。「ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ」コンストラクトには、ＩｇＧ４由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してヒトＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインヒトＴＮＦＲ２が含まれていた。

【0351】

このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0352】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ウエスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、精製されたヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａタンパク質を変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を３回繰り返して使用して分離した。タンパク質を膜上に転写し、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体を使用してプローブし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認した。ブロットを分子量ラダーと比較した（図２Ａ）。図２Ｂに示すように、ウエスタンブロットでは、多量体であることと一致するＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質のバンドが示された。抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体のそれぞれによるバンドの検出は、キメラタンパク質に３つの部分すべてが存在することを示した。

【0353】

実施例２．例示的なヒトＴＮＦＲ２及びデクチン２系キメラタンパク質の構築ならびに特性評価
ヒトＴＮＦＲ２及びヒトデクチン２系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。「ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２」コンストラクトには、ＩｇＧ４由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してヒトデクチン２の細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインヒトＴＮＦＲ２が含まれていた。

【0354】

このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0355】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２コンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ウエスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、精製されたヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２タンパク質を変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を３回繰り返して使用して分離した。タンパク質を膜上に転写し、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトデクチン２抗体を使用してプローブし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の各ドメインの存在を確認した。ブロットを分子量ラダーと比較した（図２Ａ）。図２Ｃに示すように、ウエスタンブロットでは、多量体であることと一致するＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のバンドが示された。抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトデクチン２抗体のそれぞれによるバンドの検出は、キメラタンパク質に３つの部分すべてが存在することを示した。

【0356】

実施例３．例示的なヒトＴＮＦＲ２及びＤＣ－ＳＩＧＮ系キメラタンパク質の構築ならびに特性評価
ヒトＴＮＦＲ２及びヒトＤＣ－ＳＩＧＮ系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。「ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ」コンストラクトには、ＩｇＧ４由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してヒトＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインヒトＴＮＦＲ２が含まれていた。

【0357】

このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0358】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ウエスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、精製されたヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮタンパク質を変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を３回繰り返して使用して分離した。タンパク質を膜上に転写し、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体を使用してプローブし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認した。ブロットを分子量ラダーと比較した（図２Ａ）。図２Ｄに示すように、ウエスタンブロットでは、多量体であることと一致するＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質のバンドが示された。抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体のそれぞれによるバンドの検出は、キメラタンパク質に３つの部分すべてが存在することを示した。

【0359】

実施例４．例示的なヒトＴＮＦＲ２及びランゲリン系キメラタンパク質の構築ならびに特性評価
ヒトＴＮＦＲ２及びヒトランゲリン系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。「ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン」コンストラクトには、ＩｇＧ４由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してヒトランゲリンの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインヒトＴＮＦＲ２が含まれていた。

【0360】

このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0361】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ウエスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、精製されたヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンタンパク質を変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を３回繰り返して使用して分離した。タンパク質を膜上に転写し、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトランゲリン抗体を使用してプローブし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認した。ブロットを分子量ラダーと比較した（図２Ａ）。図２Ｅに示すように、ウエスタンブロットでは、多量体であることと一致するＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のバンドが示された。抗ヒトＴＮＦＲ２抗体、抗ヒトＦｃ抗体、または抗ヒトランゲリン抗体のそれぞれによるバンドの検出は、キメラタンパク質に３つの部分すべてが存在することを示した。

【0362】

実施例５．本明細書に開示されるＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質は、それぞれのリガンドに結合する
上で開示したキメラタンパク質と抗ヒトＴＮＦＲ２抗体との結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体をプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質、またはＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ヒトＴＮＦＲ２抗体で捕捉した。プレートに結合した抗ヒトＴＮＦＲ２抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ａに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、ならびに組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的に抗ヒトＴＮＦＲ２抗体に結合した。対照的に、ＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質は、結合の証拠を示さなかった。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質がＴＮＦＲ２リガンド及びＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0363】

上で開示したキメラタンパク質とＴＮＦαとの結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ＴＮＦαをプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質、またはＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＴＮＦαで捕捉した。プレートに結合したＴＮＦαによって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｂに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、ならびに組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にＴＮＦαに結合した。対照的に、ＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質は、結合の証拠を示さなかった。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質がＴＮＦＲ２リガンドＴＮＦα及びＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0364】

ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質と抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体をプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体で捕捉した。プレートに結合した抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｃに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ヒトＣｌｅｃ７ａ抗体に結合した。これらの結果は、とりわけ、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質がＣｌｅｃ７ａリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0365】

ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質と抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体をプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質、組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、及びヒトＤＣ－ＳＩＧＮタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体で捕捉した。ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃタンパク質及びヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。プレートに結合した抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｄに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体に結合した。予想どおり、組換えＤＣ－ＳＩＧＮ－Ｆｃも用量依存的かつ飽和的に抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体に結合したが、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質は抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体に結合しなかった。これらの結果は、とりわけ、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質がＤＣ－ＳＩＧＮリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0366】

ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質と抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体をプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質及びＤＣ－ＳＩＧＮを欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体で捕捉した。無関係なキメラタンパク質を陰性対照として使用した。プレートに結合した抗ヒトＤＣ－ＳＩＧＮ抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｅに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ヒトデクチン２抗体に結合した。予想どおり、デクチン２を欠く無関係なキメラタンパク質は抗ヒトデクチン２抗体に結合しなかった。これらの結果は、とりわけ、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質がデクチン２リガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0367】

ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質と抗ヒトランゲリン抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ヒトランゲリン抗体をプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、組換えヒトランゲリン－Ｆｃ融合タンパク質、及びランゲリンを欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ヒトランゲリン抗体で捕捉した。ヒトランゲリン－Ｆｃタンパク質及びヒトに無関係なキメラタンパク質を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。プレートに結合した抗ヒトランゲリン抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｆに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ヒトランゲリン抗体に結合した。予想どおり、組換えランゲリン－Ｆｃも用量依存的かつ飽和的に抗ヒトランゲリン抗体に結合したが、無関係なキメラタンパク質は抗ヒトランゲリン抗体に結合しなかった。これらの結果は、とりわけ、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質がランゲリンリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0368】

ラミナリンは、β－（１－６）結合を有するβ－（１－３）グルカンからなる水溶性多糖類であり、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ、またはＥｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓなどの褐藻類の乾燥葉状体から抽出され、単離される。多くのＣ型レクチンは、ラミナリンに結合する。上で開示したキメラタンパク質とラミナリンとの結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ラミナリンをプレートにコーティングした。ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したラミナリンで捕捉した。プレートに結合したラミナリンによって捕捉されたタンパク質は、抗ヒトＦｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図３Ｇに示すように、ヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質、ならびに組換えヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にラミナリンに結合したが、動態は異なっていた。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質がラミナリンに結合することを示しているが、親和性は異なっていた。

【0369】

実施例６．本明細書に開示されるＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質のマウス代替物の構築ならびに特性評価
ヒトＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質のマウス代替物であるＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は、疾患のマウスモデルで使用するために構築された。

【0370】

ＴＮＦＲ２及びＣｌｅｃ７ａ系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。コンストラクトには、ＩｇＧ由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＣｌｅｃ７ａの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインＴＮＦＲ２が含まれていた。このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0371】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａコンストラクトは２９３細胞で一時的に発現し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質の天然構造を理解するために、未処理の変性試料（すなわち、還元剤または脱糖化剤による処理を行わず、ＳＤＳ存在下で煮沸）を、（ｉ）脱糖化されていない還元試料（すなわち、β－メルカプトエタノールのみで処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）、及び（ｉｉ）還元及び脱糖化サンプル（すなわち、β－メルカプトエタノールと脱糖化剤の両方で処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）と比較した。更に、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認するために、ゲルを３回実行し、抗ＴＮＦＲ２抗体（図４Ａ、左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（図４Ａ、中央のブロット）、または抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体（図４Ａ、右のブロット）を使用してプローブした。ウエスタンブロットでは、非還元レーン（図４Ａ、各ブロットのレーン１）に優勢な二量体バンドが存在し、還元剤であるβ－メルカプトエタノールの存在下では、グリコシル化された単量体バンドに還元されたことが示された（図４Ａ、各ブロットのレーン２）。図４Ａの各ブロットのレーン３に示されているように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）と脱グリコシル化剤の両方の存在下で、予測された分子量でモノマーとして移動した。

【0372】

ＴＮＦＲ２及びデクチン２系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。コンストラクトには、ＩｇＧ由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してデクチン２の細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインＴＮＦＲ２が含まれていた。このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0373】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２コンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２コンストラクトは２９３細胞で一時的に発現し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の天然構造を理解するために、未処理の変性試料（すなわち、還元剤または脱糖化剤による処理を行わず、ＳＤＳ存在下で煮沸）を、（ｉ）脱糖化されていない還元試料（すなわち、β－メルカプトエタノールのみで処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）、及び（ｉｉ）還元及び脱糖化サンプル（すなわち、β－メルカプトエタノールと脱糖化剤の両方で処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）と比較した。更に、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の各ドメインの存在を確認するために、ゲルを３回実行し、抗ＴＮＦＲ２抗体（図４Ｂ、左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（図４Ｂ、中央のブロット）、または抗デクチン２抗体（図４Ｂ、右のブロット）を使用してプローブした。ウエスタンブロットでは、非還元レーン（図４Ｂ、各ブロットのレーン１）に優勢な二量体バンドが存在し、還元剤であるβ－メルカプトエタノールの存在下では、グリコシル化された単量体バンドに還元されたことが示された（図４Ｂ、各ブロットのレーン２）。図４Ｂの各ブロットのレーン３に示されているように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）と脱グリコシル化剤の両方の存在下で、予測された分子量でモノマーとして移動した。

【0374】

ＴＮＦＲ２及びＤＣ－ＳＩＧＮ系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。コンストラクトには、ＩｇＧ由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインＴＮＦＲ２が含まれていた。このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0375】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮコンストラクトは２９３細胞で一時的に発現し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の天然構造を理解するために、未処理の変性試料（すなわち、還元剤または脱糖化剤による処理を行わず、ＳＤＳ存在下で煮沸）を、（ｉ）脱糖化されていない還元試料（すなわち、β－メルカプトエタノールのみで処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）、及び（ｉｉ）還元及び脱糖化サンプル（すなわち、β－メルカプトエタノールと脱糖化剤の両方で処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）と比較した。更に、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認するために、ゲルを３回実行し、抗ＴＮＦＲ２抗体（図４Ｃ、左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（図４Ｃ、中央のブロット）、または抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（図４Ｃ、右のブロット）を使用してプローブした。ウエスタンブロットでは、非還元レーン（図４Ｃ、各ブロットのレーン１）に優勢な二量体バンドが存在し、還元剤であるβ－メルカプトエタノールの存在下では、グリコシル化された単量体バンドに還元されたことが示された（図４Ｃ、各ブロットのレーン２）。図４Ｃの各ブロットのレーン３に示されているように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）と脱グリコシル化剤の両方の存在下で、予測された分子量でモノマーとして移動した。

【0376】

ＴＮＦＲ２及びランゲリン系キメラタンパク質をコードするコンストラクトが作成された。コンストラクトには、ＩｇＧ由来のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してランゲリンの細胞外ドメインに融合された細胞外ドメインＴＮＦＲ２が含まれていた。このコンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化され、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、個々のクローンが高発現のために選択された。その後、高発現クローンを使用して、無血清培地中の撹拌バイオリアクターで小規模製造を行い、関連するキメラ融合タンパク質をタンパク質Ａ結合樹脂カラムで精製する。

【0377】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンコンストラクトは、２９３細胞で一時的に発現した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンコンストラクトは２９３細胞で一時的に発現し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の天然構造を理解するために、未処理の変性試料（すなわち、還元剤または脱糖化剤による処理を行わず、ＳＤＳ存在下で煮沸）を、（ｉ）脱糖化されていない還元試料（すなわち、β－メルカプトエタノールのみで処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）、及び（ｉｉ）還元及び脱糖化サンプル（すなわち、β－メルカプトエタノールと脱糖化剤の両方で処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）と比較した。更に、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の各ドメインの存在を確認するために、ゲルを３回実行し、抗ＴＮＦＲ２抗体（図４Ｄ、左のブロット）、抗Ｆｃ抗体（図４Ｄ、中央のブロット）、または抗ランゲリン抗体（図４Ｄ、右のブロット）を使用してプローブした。ウエスタンブロットでは、非還元レーン（図４Ｄ、各ブロットのレーン１）に優勢な二量体バンドが存在し、還元剤であるβ－メルカプトエタノールの存在下では、グリコシル化された単量体バンドに還元されたことが示された（図４Ｄ、各ブロットのレーン２）。図４Ｄの各ブロットのレーン３に示されているように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）と脱グリコシル化剤の両方の存在下で、予測された分子量でモノマーとして移動した。

【0378】

実施例７．本明細書に開示されるＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質は、それぞれのリガンドに結合する
上で開示したキメラタンパク質と抗マウスＴＮＦＲ２抗体との結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ＴＮＦＲ２抗体をプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、またはマウスＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体で捕捉した。プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ａに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的に抗ＴＮＦＲ２抗体に結合した。対照的に、ＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質は、結合の証拠を示さなかった。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウスＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質がＴＮＦＲ２リガンド及びＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0379】

上で開示したキメラタンパク質と組換えＴＮＦαとの結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、組換えＴＮＦαをプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、またはマウスＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した組換えＴＮＦαで捕捉した。プレートに結合した組換えＴＮＦαによって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｂに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的に組換えＴＮＦαに結合した。対照的に、ＴＮＦＲ２の一部を欠く無関係なキメラタンパク質は、結合の証拠を示さなかった。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウスＴＮＦＲ２及びＣ型－Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）系キメラタンパク質がＴＮＦα及びＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0380】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質と抗マウスＣｌｅｃ７ａ抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体をプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体で捕捉した。プレートに結合した抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗Ｆｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図５Ｃに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質は抗Ｃｌｅｃ７ａ抗体に結合した。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質がＣｌｅｃ７ａリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0381】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質と抗マウスＤＣ－ＳＩＧＮ抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体をプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体で捕捉した。プレートに結合した抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗Ｆｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図５Ｄに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体に結合した。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質がＤＣ－ＳＩＧＮリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0382】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質と抗マウスデクチン２抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗デクチン２抗体をプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗デクチン２抗体で捕捉した。プレートに結合した抗デクチン２抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗Ｆｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図５Ｅに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗デクチン２抗体に結合した。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質がデクチン２リガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0383】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質と抗マウスランゲリン抗体の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、抗ランゲリン抗体をプレートにコーティングした。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合した抗ランゲリン抗体で捕捉した。プレートに結合した抗ランゲリン抗体によって捕捉されたタンパク質は、抗Ｆｃ抗体とＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合二次抗体を使用して検出された。図５Ｆに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に抗ランゲリン抗体に結合した。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質がランゲリンリガンドとＦｃリガンドに同時に結合することを示している。

【0384】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の、β－（１－６）結合を有するβ－（１－３）グルカンからなる水溶性多糖類であるラミナリンへの結合を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ラミナリンをプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したラミナリンで捕捉した。プレートに結合したラミナリンによって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｇに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にラミナリンに結合したが、動態は異なっていた。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウス代替キメラタンパク質がラミナリンに結合することを示しているが、親和性は異なっていた。

【0385】

感染症の進行を促進または抑制可能なβ－ガラクトシド結合レクチンであるガレクチン９は、ヒト及びマウス両方の樹状細胞の細胞基質内のＣ型レクチン受容体と相互作用することが公知である。Ｃａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｉｇｉｄｉｔｙ，ｉＳｃｉｅｎｃｅ．２０１９；２２：２４０－２５５。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のガレクチン９への結合を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ガレクチン９をプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したガレクチン９で捕捉した。プレートに結合したガレクチン９によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｈに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にガレクチン９に結合したが、動態は異なっていた。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウス代替キメラタンパク質がガレクチン９に結合することを示しているが、親和性は異なっていた。

【0386】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）への結合を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ＤＳＳをプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＤＳＳで捕捉した。プレートに結合したＤＳＳによって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｉに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にＤＳＳに結合したが、動態は異なっていた。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウス代替キメラタンパク質がＤＳＳに結合することを示しているが、親和性は異なっていた。

【0387】

酵母細胞壁（ザイモサン）はＣ型レクチン受容体デクチン１に結合し、タンパク質チロシンキナーゼＳｙｋのリクルートメントを誘導し、その結果、サイトカインの産生を誘導する。Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｋ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｅｃｔｉｎ－１ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｃ Ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５；２２ ５０７－５１７。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のザイモサンへの結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ザイモサンをプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したザイモサンで捕捉した。プレートに結合したザイモサンによって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｊに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質のそれぞれは、用量依存的かつ飽和的にザイモサンに結合したが、動態は異なっていた。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたマウス代替キメラタンパク質がザイモサンに結合することを示しているが、親和性は異なっていた。

【0388】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質とインターαインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）との結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ＩＴＩＨ４をプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＩＴＩＨ４で捕捉した。プレートに結合したＩＴＩＨ４によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｋに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的にＩＴＩＨ４に結合した。

【0389】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質とヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）の結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に説明すると、ＨＡＢＰ１をプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＨＡＢＰ１で捕捉した。プレートに結合したＨＡＢＰ１によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｌに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的にＨＡＢＰ１に結合した。

【0390】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質と癌胎児抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）との結合を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ＣＡＥＣＡＭ１をプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＣＡＥＣＡＭ１で捕捉した。プレートに結合したＣＡＥＣＡＭ１によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｍに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的にＣＡＥＣＡＭ１に結合した。

【0391】

マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質とブチロフィリンサブファミリー２メンバーＡ１（ＢＴＮ２Ａ１）との結合は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。簡単に言うと、ＢＴＮ２Ａ１をプレートにコーティングした。マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質を漸増量でプレートに加え、プレートに結合したＢＴＮ２Ａ１で捕捉した。プレートに結合したＢＴＮ２Ａ１によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。図５Ｎに示すように、マウスＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和的にＢＴＮ２Ａ１に結合した。

【0392】

実施例８．本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡの合成
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質とそれらのマウス代替物をコードする修飾ｍＲＮＡを合成した。簡単に言えば、キメラタンパク質をコードする遺伝子が設計され、ヒト細胞での発現のためにコドンが最適化された。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質のオープンリーディングフレームを含む遺伝子には、５’キャップ及び３’ポリＡテールも含まれた。次に、ｍＲＮＡの修飾が設計された。合成は、当技術分野で既知の方法のいずれかを使用して行われた。例えば、修飾ｍＲＮＡは、化学合成によって、または修飾ヌクレオチドをｍＲＮＡに組み込む変異ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成することができる。

【0393】

修飾ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞にトランスフェクトされ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の発現はウエスタンブロットを使用して評価された。ウエスタンブロットのために使用する試料は、未処理の変性試料（すなわち、還元剤または脱糖化剤による処理を行わず、ＳＤＳ存在下で煮沸）であり、それを、（ｉ）脱糖化されていない還元試料（すなわち、β－メルカプトエタノールのみで処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）、及び（ｉｉ）還元及び脱糖化サンプル（すなわち、β－メルカプトエタノールと脱糖化剤の両方で処理し、ＳＤＳ存在下で煮沸）と比較する。更に、キメラタンパク質の各ドメインの存在を確認するために、ゲルを３回実行し、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体、または抗Ｃｌｅｃ７ａ／ランゲリン／ＤＣ－ＳＩＧＮ／デクチン２抗体を使用してプローブする。ウエスタンブロットでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリン、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質の効率的な発現が示されることが期待される。

【0394】

実施例９．キメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、または細胞へのｍｍＲＮＡの導入後のキメラタンパク質自体の検出
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）をＰｏｌｙｐｌｕｓ ＪｅｔＭｅｓｓｅｎｇｅｒ ｍＲＮＡ試薬と複合させ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成した。ｍｍＲＮＡを欠くＬＮＰ（ＬＮＰのみ）も、陰性対照として使用するために調製した。ｍｍＲＮＡを欠くＬＮＰ（ＬＮＰのみ）も、陰性対照として使用するために調製した。ＬＮＰのみ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質をコードする１００μｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを、２５０，０００個のＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞ペレットからＲＮＡを採取し、逆転写し、ｑＰＣＲを使用して増幅した。ｍＴＮＦＲ２を増幅するプライマーとハウスキーピング対照ＧＡＰＤＨの間のサイクル閾値（Ｃｔ）の差を使用し、ΔΔＣｔ法を使用してｍＲＮＡコンストラクトの相対的発現を評価した。図６に示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質をコードするｍＲＮＡは、２４時間後に検出できた。対照的に、ＬＮＰのみの対照は、増幅のバックグラウンドレベルのみを示した。

【0395】

ＬＮＰのみ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２もしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードする１００μｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを、２５０，０００個のＬ９２９細胞にトランスフェクトした。２４時間後、培養上清を収集し、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出された。簡単に説明すると、抗ＴＮＦＲ２抗体をプレートにコーティングした。培養上清をプレートに加え、プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって、Ｌ９２９細胞から分泌されたキメラタンパク質を捕捉した。プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。ＭＳＤシグナルは、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清を使用して得られたシグナルで正規化された。図７Ａに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清は、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞と比較して、約４０～約３００倍のＭＳＤシグナルを生成した。対照的に、非トランスフェクト細胞またはＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを生成した（図７Ａ）。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡがＬ９２９細胞で効率的に翻訳され、キメラタンパク質を生成したことを示す。

【0396】

ＬＮＰのみ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２もしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードする１００μｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを、２５０，０００個のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。４８時間後、培養上清を収集し、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出された。簡単に説明すると、抗ＴＮＦＲ２抗体をプレートにコーティングした。培養上清をプレートに加え、プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって、ＨＥＫ２９３細胞から分泌されたキメラタンパク質を捕捉した。プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。ＭＳＤシグナルは、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清を使用して得られたシグナルで正規化された。図７Ｂに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清は、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞と比較して、約２０～約１００倍のＭＳＤシグナルを生成した。対照的に、非トランスフェクト細胞またはＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを生成した（図７Ｂ）。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡがＨＥＫ２９３細胞で効率的に翻訳され、キメラタンパク質を生成したことを示す。

【0397】

ＬＮＰのみ、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２もしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードする１００μｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを、２５０，０００個のＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。４８時間後、培養上清を収集し、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出された。簡単に説明すると、抗ＴＮＦＲ２抗体をプレートにコーティングした。培養上清をプレートに加え、プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって、ＣＨＯＫ１細胞から分泌されたキメラタンパク質を捕捉した。プレートに結合した抗ＴＮＦＲ２抗体によって捕捉されたタンパク質は、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体を使用して検出された。ＭＳＤシグナルは、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清を使用して得られたシグナルで正規化された。図７Ｃに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清は、ＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞と比較して、約１００～約１５００倍のＭＳＤシグナルを生成した。対照的に、非トランスフェクト細胞またはＬＮＰのみをトランスフェクトした細胞の培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを生成した（図７Ｃ）。これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡがＣＨＯＫ１細胞で効率的に翻訳され、キメラタンパク質を生成したことを示す。

【0398】

まとめると、これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡが安定しており、ｍｍＲＮＡを保持する細胞内でＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２、及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ランゲリンキメラタンパク質の持続的な発現を示したことを実証している。

【0399】

実施例１０．本明細書に開示されたキメラタンパク質は、レポーター細胞におけるＴＮＦαまたはザイモサン媒介ＮＦκＢ誘導を阻害する。
本明細書に開示されたキメラタンパク質のＴＮＦα誘導シグナル伝達に対する効果は、５つのＮＦκＢ及びＡＰ－１結合部位に融合された最小プロモーターの制御下にて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン２細胞を使用して行われた。簡単に説明すると、ＳＥＡＰレポーター遺伝子を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン２細胞を、ＴＮＦαの存在下もしくは非存在下で、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または陰性対照として使用された無関係なタンパク質と共にインキュベートした。インキュベート後にＳＥＡＰシグナルを測定した。図８Ａに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａもしくはＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または無関係なタンパク質は、バックグラウンドレベルのＳＥＡＰ活性を示した（いずれの場合も約０．１の読み取り値）。無関係なタンパク質の存在下でＴＮＦαを添加すると、ＳＥＡＰ活性が２０倍超増加した（図８Ａ）。興味深いことに、ＴＮＦαと無関係なタンパク質の組み合わせと比較して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質は、ＳＥＡＰ活性を約４倍及び２０倍超低下させた（図８Ａ）。

【0400】

これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２系キメラタンパク質がＴＮＦαを隔離し、それによって、ＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ誘導及び下流シグナル伝達を低下させることを示している。

【0401】

本明細書に開示されたキメラタンパク質のザイモサン誘導シグナル伝達に対する効果は、５つのＮＦκＢ及びＡＰ－１結合部位に融合された最小プロモーターの制御下にて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン１ｂ細胞を使用して行われた。簡単に説明すると、ＳＥＡＰレポーター遺伝子を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン１ｂ細胞を、ザイモサンの存在下もしくは非存在下で、緩衝液のみ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質、または陰性対照として使用された無関係なタンパク質と共にインキュベートした。インキュベート後にＳＥＡＰシグナルを測定した。図８Ｂに示すように、ＳＥＡＰレポーター遺伝子を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）デクチン１ｂ細胞を、緩衝液のみ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質、または無関係なタンパク質と共にインキュベートすると、バックグラウンドレベルのＳＥＡＰ活性を示した（いずれの場合も約０．１の読み取り値）。緩衝液の存在下でザイモサンを添加した場合、ＳＥＡＰ活性は約２～３倍しか増加しなかった（図８Ｂ）。興味深いことに、ザイモサン単独処理（緩衝液のみ）と比較して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質との共処理では、ＳＥＡＰ活性は約２～３倍減少し（図８Ｂ）、活性はバックグラウンドレベルに戻った。無関係なタンパク質との共インキュベーションでは、ＳＥＡＰ活性のそのような低下は見られなかった（図８Ｂ）。

【0402】

これらの結果は、とりわけ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質がザイモサンを隔離し、それによって、ザイモサン誘導性ＮＦκＢ誘導及び下流シグナル伝達を低下させることを示している。まとめると、これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２系キメラタンパク質がＴＮＦα及びＣ型レクチンリガンドを隔離し、それによって、ＮＦκＢ誘導及び下流シグナル伝達を低下させることを示している。

【0403】

実施例１１．本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）または精製されたキメラタンパク質は、感受性細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する
精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質がＬ９２９線維芽細胞におけるＴＮＦαによって誘導されるアポトーシスに及ぼす影響を、分析した。簡単に説明すると、Ｌ９２９線維芽細胞を、漸増量のＴＮＦαのモル比の存在下で、精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質、または無関係なタンパク質（陰性対照として使用）と共に共インキュベートした。インキュベート後、切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度を、キメラタンパク質／無関係なタンパク質とＴＮＦαのモル比に応じてプロットした。図９Ｂに示すように、無関係なタンパク質とＴＮＦαで処理したＬ９２９線維芽細胞は、ＴＮＦαの濃度が増加するにつれて用量依存的なアポトーシスを示した。対照的に、図９Ｂに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質で処理したＬ９２９線維芽細胞は、ＴＮＦα媒介アポトーシスからの保護を示した。

【0404】

これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２系キメラタンパク質がＴＮＦαを隔離し、それによって、ＴＮＦα媒介アポトーシスから細胞を保護することを実証している。

【0405】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）がＬ９２９線維芽細胞におけるＴＮＦαによって誘導されるアポトーシスに及ぼす影響を、分析した。簡単に説明すると、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）をＰｏｌｙｐｌｕｓ ＪｅｔＭｅｓｓｅｎｇｅｒ ｍＲＮＡ試薬と複合させ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成した。ｍｍＲＮＡを欠く空のＬＮＰ（ｍＲＮＡなし）または無関係なタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを有するＬＮＰ（陰性対照として使用）も、陰性対照として使用するために調製された。Ｌ９２９線維芽細胞は、ＬＮＰを使用してトランスフェクトされ、その後、漸増量のＴＮＦαでインキュベートされた。インキュベートの後、切断されたカスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスの程度は、ＴＮＦαの量に応じてプロットされた。図９Ａに示すように、空のＬＮＰ（ｍＲＮＡなし）をトランスフェクトしたＬ９２９線維芽細胞は、ＴＮＦαの濃度が増加するにつれて用量依存的なアポトーシスを示した。無関係なタンパク質をコードするｍＲＮＡを含有するＬＮＰをトランスフェクトしたＬ９２９線維芽細胞（陰性対照）も、ＴＮＦαの濃度が増加するにつれて用量依存的なアポトーシスを示した（図９Ａ）。対照的に、図９Ａに示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａ及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ－デクチン２キメラタンパク質をコードするｍＲＮＡを含有するＬＮＰをトランスフェクトしたＬ９２９線維芽細胞は、ＴＮＦα媒介アポトーシスからの保護を示した。

【0406】

これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたＴＮＦＲ２系キメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞が、ＴＮＦαを効果的に隔離し、細胞自体をＴＮＦα媒介アポトーシスから保護するのに十分なレベルの機能的なＴＮＦＲ２系キメラタンパク質を生成することを実証している。

【0407】

実施例１２．本明細書に開示されたキメラタンパク質の大腸炎マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
このデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデルは、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するために使用された。ＤＳＳは多糖類であり、マウスの飲料水に投与されると、体重減少、ＴＮＦα産生の増加、ならびに自然及び適応炎症反応の刺激を伴う大腸炎を引き起こす。

【0408】

簡単に説明すると、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）または陰性対照として使用された無関係なタンパク質を、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ＪｅｔＭｅｓｓｅｎｇｅｒ ｍＲＮＡ試薬と複合させ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成した。マウスの体重を測定し、以下の治療群に分類した：（１）ＤＳＳなし、（２）ＤＳＳ＋ＬＮＰなし（処理なし）、（３）無関係なタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを含有するＤＳＳ＋ＬＮＰ、及び（４）ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを含有するＤＳＳ＋ＬＮＰ。０日目に、実験治療群の動物に、飲料水に３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を８日間適宜投与した。対照動物（群１、ＤＳＳなしの対照）には、改変されていない飲料水が投与された。１日目に、群３の動物に、無関係なタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰの単回ＩＶ注入を投与し、群３の動物には、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰの単回ＩＶ注入を投与した。動物たちは苦痛の兆候がないか毎日監視され、体重が測定された。図１０Ａは、８日目の体重の変化を示す棒グラフである。図１０Ａに示すように、ＤＳＳなしの対照と比較して、それ以上の処理を受けなかったＤＳＳ処理マウスは、体重が約１５％減少した（図１０Ａの最初の棒ブラフと２番目の棒グラフを比較）。無関係なタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを投与されたマウスも、ＤＳＳに曝露された未処理マウスと同様に、約１５％の体重減少を示した（図１０Ａの２番目の棒グラフと３番目の棒グラフを比較）。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを投与されたマウスは、ＤＳＳに曝露された未処理マウスと比較して、最小限の体重減少を示した（図１０Ａの２番目の棒グラフと４番目の棒グラフを比較）。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡの単回注射がＤＳＳによって誘発された大腸炎を逆転させることを示している。

【0409】

６日目に、動物から末梢血を採取し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４５抗体を含む抗体パネルで染色し、フローサイトメトリーで分析した。図１０Ｂに示すように、ＤＳＳを受けなかったマウスと比較して、ＤＳＳを受けたがそれ以上の処理を受けなかったマウスでは、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞が増加しており、炎症が増加していることを示している（図１０Ｂ）。無関係なタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを投与されたマウスでも、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞が増加しており、これは、ＤＳＳに曝露された未処理マウスの場合と同様である（図１０Ｂの２番目の棒グラフと３番目の棒グラフを比較）。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－Ｃｌｅｃ７ａキメラタンパク質をコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡを含有するＬＮＰを投与されたマウスでは、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞の増加が完全に逆転し（図１０Ｂの２番目の棒グラフと４番目の棒グラフを比較）、ＤＳＳを投与されなかったマウスと同様に、総ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞のレベルが回復した（図１０Ａの１番目の棒グラフと４番目の棒グラフを比較）。これらの結果は、とりわけ、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡの単回注射により、投与後に持続的な生物学的効果が得られ、大腸炎によって引き起こされる細胞の変化が逆転することを示している。したがって、とりわけ、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードするｍｍＲＮＡは、炎症を抑制することが有益な治療法に使用することができる。

【0410】

参照による組み込み
本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0411】

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本技術が、先行開示のためにかかる刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0412】

本明細書で使用される場合、すべての見出しは単に構成上の理由によるものであり、いかなる様式においても本開示を限定することを意図するものではない。あらゆる個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能であり得る。

【0413】

等価物
本開示は、その特定の実施形態に関連して開示したが、更なる修正が可能であり、本開示は、一般に、本開示の原理に従って、本開示の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本開示が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。

【0414】

当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に詳細に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが企図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図5L】

【図5M】

【図5N】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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【国際調査報告】