特表 2024-543032 プライミングされた子宮由来再生細胞組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】プライミングされた子宮由来再生細胞組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20241112BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20241112BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241112BHJP

   A61K 35/48 20150101ALI20241112BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20241112BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20241112BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20241112BHJP

   C12N 9/66 20060101ALN20241112BHJP

   C12N 9/76 20060101ALN20241112BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20241112BHJP

   C12N 9/26 20060101ALN20241112BHJP

   C07K 14/76 20060101ALN20241112BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61K35/36

A61P43/00 121

A61P13/12

A61P17/00

A61P37/08

A61P19/02

A61P37/02

A61P1/16

A61P1/04

A61P19/08

A61P27/02

A61P1/18

A61P19/04

A61P25/00

A61P17/02

A61K35/12

A61K35/48

A61P1/02

A61K47/26

A61K47/20

A61K47/42

A61K47/46

A61K47/02

A61K47/36

C12N5/0775

C07K14/50

C12N9/66

C12N9/76

C12N9/50

C12N9/26

C07K14/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024526559

(86)(22)【出願日】2022-10-27

(85)【翻訳文提出日】2024-06-20

(86)【国際出願番号】 US2022048067

(87)【国際公開番号】W WO2023081057

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】63/263,548

(32)【優先日】2021-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/263,550

(32)【優先日】2021-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523271170

【氏名又は名称】ギャラント・ペット，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】リンダ・ブラック

(72)【発明者】

【氏名】シェリー・ザカリアス

(72)【発明者】

【氏名】セオドア・ティー・サンド

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル・バリジャス

(72)【発明者】

【氏名】レイチェル・バティスタ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC14

4B065BB23

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA16

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB24

4C076BB36

4C076CC01

4C076CC09

4C076CC10

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076DD55

4C076DD67

4C076EE30

4C076EE41

4C076FF61

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB48

4C087BB61

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA02

4C087MA05

4C087MA16

4C087MA56

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA33

4C087ZA66

4C087ZA67

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB13

4C087ZC61

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA61

4H045CA40

4H045DA70

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA72

(57)【要約】

本開示は、イヌまたはネコの子宮組織に由来する不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物、ならびにその製造方法及びその使用に関する。いくつかの態様において、不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる。いくつかの態様において、不均一性細胞組成物は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の混合物を含む。いくつかの態様において、不均一性細胞組成物は、イヌ及びネコにおける慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷等の疾患を処置するための自家または同種治療薬として使用される。
【選択図】図９Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プライミングされた不均一性細胞組成物であって、
間葉系前駆細胞集団、及び
上皮系前駆細胞集団を含み、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は共培養され、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記プライミングされた不均一性細胞組成物。

【請求項2】

線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２または３に記載の組成物。

【請求項5】

前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項6】

前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項7】

前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の間葉系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の間葉系前駆細胞を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の上皮系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の上皮系前駆細胞を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項10】

限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項11】

細胞集団をさらに含み、各細胞は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の両方のマーカーを示す、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項12】

前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項13】

凍結保存培地をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項14】

前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

プライミングされた不均一性細胞組成物の調製方法であって、
間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含み、
前記単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記調製方法。

【請求項16】

前記単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記イヌまたは前記ネコの子宮組織を酵素的に解離して、前記単一細胞懸濁液を形成する、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、
間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することであって、前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、前記提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【請求項22】

前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

プライミングされた不均一性細胞組成物であって、
ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団、及び
Ｖ＋／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団を含み、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、共培養され、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記プライミングされた不均一性細胞組成物。

【請求項25】

線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２５または２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項29】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項30】

前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項31】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項32】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項33】

限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項34】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項35】

凍結保存培地をさらに含む、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項36】

前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

プライミングされた不均一性細胞組成物の調製方法であって、
Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含み、
前記単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記調製方法。

【請求項38】

前記単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記イヌまたは前記ネコの子宮組織を酵素的に解離して、前記単一細胞懸濁液を形成する、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、
Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及びＶ＋／Ｃ＋細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することであって、前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、前記提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【請求項44】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、
請求項１～１４または２４～３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【請求項46】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の前記処置に使用するための請求項１～１４または２４～３６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項49】

医薬として使用するための請求項１～１４または２４～３６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項50】

不均一性細胞組成物であって、
（ａ）ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団、
（ｂ）ビメンチン陰性（Ｖ－）／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団、及び
（ｃ）Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団を含み、
前記集団（ａ）～（ｃ）は、共培養され、
前記集団（ａ）～（ｃ）は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され、
前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記不均一性細胞組成物。

【請求項51】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、請求項５０に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項52】

前記Ｖ－／Ｃ＋細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、請求項５０または５１に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項53】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及び前記Ｖ－／Ｃ＋細胞集団の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項54】

ＦＧＦ－２をさらに含む、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項55】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項５０～５４のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項56】

前記ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項５０～５５のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項57】

前記集団（ａ）～（ｃ）は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、請求項５０～５６のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項58】

前記集団（ａ）～（ｃ）は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、請求項５０～５７のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項59】

前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、請求項５０～５８のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項60】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む、請求項５０～５９のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項61】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ－／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ－／Ｃ＋細胞を含む、請求項５０～６０のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項62】

５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む、請求項５０～６１のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項63】

前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、請求項５０～６２のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項64】

前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、請求項６３に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項65】

限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項５０～６４のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項66】

前記集団（ａ）～（ｃ）は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、請求項５０～６５のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項67】

凍結保存培地をさらに含む、請求項５０～６６のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項68】

前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、請求項６７に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項69】

不均一性細胞組成物の調製方法であって、
イヌまたはネコの子宮組織を単一細胞懸濁液に解離することと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で培養することによって、
前記培養された単一細胞懸濁液から前記不均一性細胞組成物を調製することと、を含み、
前記３、４、５または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりには、前記不均一性細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含む、前記調整方法。

【請求項70】

前記ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記解離ステップは、酵素による解離を含む、請求項６９または７０に記載の方法。

【請求項72】

前記酵素による解離は、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織を、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記単一細胞懸濁液は、ＦＧＦ－２と共に培養される、請求項６９～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項７３または７４に記載の方法。

【請求項76】

前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、請求項６９～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、請求項６９～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記不均一性細胞組成物は、請求項５０～６８のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物である、請求項６９～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、以下：
前記イヌまたは前記ネコ対象に少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することを含み、
前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【請求項81】

前記ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、請求項８０または８１に記載の方法。

【請求項83】

前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記不均一性細胞組成物は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、請求項５０～６８のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物であるか、または請求項６９～７９のいずれか１項に記載の方法によって製造される、請求項８０～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項８０～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、請求項８０～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

前記凍結保存状態から前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を解凍することは、前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置に使用するための請求項５０～６８のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項90】

イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置または抑制等に対する医薬として使用するための請求項５０～６８のいずれか１項に記載の不均一性細胞組成物。

【請求項91】

ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞、好ましくは子宮細胞を含む、プライミングされた細胞組成物。

【請求項92】

前記細胞組成物は、間葉系前駆細胞及び／または上皮系前駆細胞をさらに含む、請求項９１に記載の細胞組成物。

【請求項93】

線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、請求項９１または９２に記載の細胞組成物。

【請求項94】

前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、請求項９３に記載の細胞組成物。

【請求項95】

前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項９３または９４に記載の細胞組成物。

【請求項96】

前記細胞組成物は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において培養される、請求項９１～９５のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項97】

前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、請求項９１～９６のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項98】

限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項９１～９７のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項99】

凍結保存培地をさらに含む、請求項９１～９８のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項100】

前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、請求項９９に記載の細胞組成物。

【請求項101】

慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、
前記イヌまたは前記ネコ対象に、請求項９１～１００のいずれか１項に記載の細胞組成物を投与すること、を含む、前記処置、抑制、または寛解方法。

【請求項102】

前記細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、請求項１０１または１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記凍結保存状態から前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を解凍することは、前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置または抑制に使用するための請求項９１～１００のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項106】

医薬として使用するための請求項９１～１００のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月４日に出願された米国仮出願第６３／２６３５５０号及び２０２１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／２６３５４８号の優先権の利益を主張するものである。

【0002】

本開示は、プライミングされた細胞組成物を含む、イヌまたはネコの子宮組織由来の細胞組成物、ならびにその製造方法及びその臨床使用に関する。いくつかの態様において、イヌまたはネコの子宮組織由来の細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる。いくつかの態様において、不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物には、間葉系前駆細胞と上皮系前駆細胞との混合物が含まれる。さらなる態様において、前述の不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物等の細胞組成物は、イヌ及びネコにおける、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、創傷、または慢性歯肉口内炎を含む疾患の処置、抑制、または寛解のための自家療法または同種療法において使用される。

【背景技術】

【0003】

炎症及び加齢に関連した退行性疾患は、老齢動物に大きな痛みまたは不快感を生じさせることがある。ペットの飼い主が治療的介入または緩和的介入の追求を選択するのであれば、それは飼い主への感情的負担及び潜在的な金銭的負担につながる。しかしながら、多くの退行性疾患に対しては、対症療法または過度に侵襲的な処置しか行うことができない。例えば、慢性腎疾患（ＣＫＤ）はイエネコの主要な死亡原因であるが、高コストの腎移植を除いて、これらの動物における機能不全に陥った腎臓の機能を回復させる有効な処置は今のところない。別の例として、アトピー性皮膚炎は、イヌが罹患する最も一般的な皮膚疾患の１つであり、持続的なかゆみをもたらすものである。したがって、イヌ及びネコ等のペット及び他の動物のＣＫＤ、アトピー性皮膚炎、ならびに他の炎症性疾患及び／または退行性疾患に対する、効果的、安価、かつ非侵襲的な治療法が永続的に必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本明細書では、いくつかの実施形態において、細胞組成物及びプライミングされた細胞組成物が開示される。いくつかの実施形態において、これらの細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物は、間葉系前駆細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、これらの細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物は、不均一性であり、上皮系前駆細胞集団をさらに含む。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、子宮組織から得られるか、または子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、子宮組織は、イヌまたはネコの子宮組織である。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、それぞれ、１％対９９％、２％対９８％、３％対９７％、４％対９６％、５％対９５％、１０％対９０％、２０％対８０％、３０％対７０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、７０％対３０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９５％対５％、９６％対４％、９７％対３％、９８％対２％、もしくは９９％対１％または約１％対約９９％、約２％対約９８％、約３％対約９７％、約４％対約９６％、約５％対約９５％、約１０％対約９０％、約２０％対約８０％、約３０％対約７０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約７０％対約３０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９５％対約５％、約９６％対約４％、約９７％対約３％、約９８％対約２％、もしくは約９９％対約１％の比で、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比で組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、組成物中の間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％の比で、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比で存在する。

【0005】

いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、もしくはヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する少なくとも１つの生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、もしくはヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせ等の、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する少なくとも１つの生物学的または合成コーティング剤で前処理されている、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。

【0006】

いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の継代数、日数、または培養間隔数で、あるいは前述の継代数、日数、または培養間隔数のいずれか２つによって定義される範囲内の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。

【0007】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、１００百万、２０～３０百万、３０～４０百万、４０～５０百万、５０～６０百万、６０～７０百万、７０～８０百万、８０～９０百万、もしくは９０～１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万細胞、約３２百万細胞、約３３百万細胞、約３４百万細胞、約３５百万細胞、約３６百万細胞、約３７百万細胞、約３８百万細胞、約３９百万細胞、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、約１００百万、約２０～３０百万、約３０～４０百万、約４０～５０百万、約５０～６０百万、約６０～７０百万、約７０～８０百万、約８０～９０百万、もしくは約９０～１００百万個の間葉系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の間葉系前駆細胞を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、１００百万、２０～３０百万、３０～４０百万、４０～５０百万、５０～６０百万、６０～７０百万、７０～８０百万、８０～９０百万、もしくは９０～１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、約１００百万、約２０～３０百万、約３０～４０百万、約４０～５０百万、約５０～６０百万、約６０～７０百万、約７０～８０百万、約８０～９０百万、もしくは約９０～１００百万個の上皮系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の上皮系前駆細胞を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の両方のマーカーまたは特性を示す細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物、好ましくは不均一性細胞組成物は細胞集団を含み、各細胞は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の両方のマーカーまたは特性を示す。

【0010】

いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、同一の子宮組織から得られるか、または同一の子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、異なる子宮組織（例えば、別々のネコ科動物もしくはイヌ科動物に由来する）から得られるか、または異なる子宮組織に由来する。

【0011】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、これらの細胞組成物、及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、Ｖ＋／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、子宮組織から得られるか、または子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、子宮組織は、イヌまたはネコの子宮組織である。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、１％対９９％、２％対９８％、３％対９７％、４％対９６％、５％対９５％、１０％対９０％、２０％対８０％、３０％対７０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、７０％対３０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９５％対５％、９６％対４％、９７％対３％、９８％対２％、もしくは９９％対１％または約１％対約９９％、約２％対約９８％、約３％対約９７％、約４％対約９６％、約５％対約９５％、約１０％対約９０％、約２０％対約８０％、約３０％対約７０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約７０％対約３０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９５％対約５％、約９６％対約４％、約９７％対約３％、約９８％対約２％、もしくは約９９％対約１％の比で、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比で組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％の比で、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比で組成物中に存在する。

【0012】

いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、もしくはヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する少なくとも１つの生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、もしくはヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせ等の、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する少なくとも１つの生物学的または合成コーティング剤で前処理されている、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。

【0013】

いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の継代数、日数、または培養間隔数で、あるいは前述の継代数、日数、または培養間隔数のいずれか２つによって定義される範囲内の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。

【0014】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、１００百万、２０～３０百万、３０～４０百万、４０～５０百万、５０～６０百万、６０～７０百万、７０～８０百万、８０～９０百万、もしくは９０～１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、約１００百万、約２０～３０百万、約３０～４０百万、約４０～５０百万、約５０～６０百万、約６０～７０百万、約７０～８０百万、約８０～９０百万、もしくは約９０～１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、１００百万、２０～３０百万、３０～４０百万、４０～５０百万、５０～６０百万、６０～７０百万、７０～８０百万、８０～９０百万、もしくは９０～１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、約１００百万、約２０～３０百万、約３０～４０百万、約４０～５０百万、約５０～６０百万、約６０～７０百万、約７０～８０百万、約８０～９０百万、もしくは約９０～１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の両方のマーカーまたは特性を示す細胞集団を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、同一の子宮組織から得られるか、または同一の子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、異なる子宮組織（例えば、別々のネコ科動物もしくはイヌ科動物に由来する）から得られるか、または異なる子宮組織に由来する。

【0018】

いくつかの実施形態において、細胞組成物、及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量をさらに含む。いくつかの実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、組換えで産生される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ヒトＦＧＦである。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ、好ましくはヒトＦＧＦ－２は、０．０１、０．０５、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。

【0019】

いくつかの実施形態において、子宮組織は、卵巣摘出術により得られる。

【0020】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、少なくとも１種の添加物、抗生物質、サプリメント、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、凍結保存培地をさらに含む。いくつかの実施形態において、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、増殖培地中の２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または増殖培地中の約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳを含む。

【0022】

本明細書では、いくつかの実施形態において、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物、好ましくは不均一性細胞組成物を調製する方法が開示される。例示的方法は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞を含む単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含む。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液を生成させるために使用される細胞は、子宮組織から得られるか、または子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液を生成させるために使用される細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液または不均一性細胞懸濁液を生成させるために使用される細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。

【0023】

いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、１％対９９％、２％対９８％、３％対９７％、４％対９６％、５％対９５％、１０％対９０％、２０％対８０％、３０％対７０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、７０％対３０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９５％対５％、９６％対４％、９７％対３％、９８％対２％、９９％対１％、または約１％対約９９％、約２％対約９８％、約３％対約９７％、約４％対約９６％、約５％対約９５％、約１０％対約９０％、約２０％対約８０％、約３０％対約７０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約７０％対約３０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９５％対約５％、約９６％対約４％、約９７％対約３％、約９８％対約２％、もしくは約９９％対約１％の比で、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比で組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、または約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％の比で、あるいは前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比で存在する。

【0024】

さらなる実施形態は、細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物、好ましくはプライミングされた不均一性細胞組成物を調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含む。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液の細胞は、子宮組織から得られるか、または子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液の細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液の細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液の細胞は、異なるイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または異なるイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。

【0025】

いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、１％対９９％、２％対９８％、３％対９７％、４％対９６％、５％対９５％、１０％対９０％、２０％対８０％、３０％対７０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、７０％対３０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９５％対５％、９６％対４％、９７％対３％、９８％対２％、もしくは９９％対１％または約１％対約９９％、約２％対約９８％、約３％対約９７％、約４％対約９６％、もしくは約５％対約９５％、約１０％対約９０％、約２０％対約８０％、約３０％対約７０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約７０％対約３０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９５％対約５％、約９６％対約４％、約９７％対約３％、約９８％対約２％、もしくは約９９％対約１％の比で、あるいは前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比で存在する。いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、もしくは９９％対１％、または約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比である。

【0026】

いくつかの実施形態においては、子宮組織を酵素的に解離して、単一細胞懸濁液を形成する。いくつかの実施形態においては、イヌまたはネコの子宮組織を酵素的に解離して、単一細胞懸濁液を形成する。

【0027】

いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えで産生される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、ヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、０．０１、０．０５、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。

【0028】

ある特定の実施形態において、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）は、本発明の子宮由来再生細胞の免疫調節作用を刺激または増強するために使用される。本発明の子宮由来再生細胞は、ＩＦＮ－γに応答して、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯまたはＩＤＯ１）の活性を上方制御する。

【0029】

本明細書では、いくつかの実施形態において、イヌまたはネコ対象における疾患もしくは病状の処置、抑制、または寛解方法が記載される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの細胞組成物、好ましくは間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団を含む不均一性細胞組成物を提供することと、少なくとも１つの細胞組成物、好ましくは不均一性細胞組成物をイヌまたはネコ対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して自家または同種である。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して自家である。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して同種である。いくつかの実施形態において、疾患は、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫関連性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷である。こうした方法のいくつかにおいて、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、組成物において、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％の比で、あるいは前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比で提供される。

【0030】

追加の実施形態は、イヌまたはネコ対象における疾患もしくは病状の処置、抑制、または寛解方法に関する。こうした方法のいくつかは、少なくとも１つの細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物、好ましくはＶ＋／Ｃ－細胞集団及びＶ＋／Ｃ＋細胞集団を含む不均一性細胞組成物を提供することと、少なくとも１つの不均一性細胞組成物をイヌまたはネコ対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して自家または同種である。いくつかの実施形態において、疾患は、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、または創傷である。こうした方法のいくつかにおいて、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、組成物において、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％の比で、あるいは前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比で提供される。

【0031】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷に対する前駆細胞療法を受けるように好ましく同定もしくは選択されたネコまたはイヌ対象に投与される。このような選択または同定は、臨床評価及び／または診断を介して、臨床医または獣医によってなされ得る。好ましく同定もしくは選択された当該ネコまたはイヌ対象は、次いで、本明細書で提供される細胞組成物の１つ以上を、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで与えられるかまたは投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍された後に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、送達デバイスまたは容器に移された後に投与される。いくつかの実施形態において、送達デバイスまたは容器は、シリンジ、ＩＶバッグ、カニューレ、ポンプ、またはチューブである。いくつかの実施形態において、送達デバイスまたは容器は、適切な緩衝液、希釈液または流体を含む。いくつかの実施形態において、適切な緩衝液、希釈液または流体には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、またはデキストロース溶液が含まれる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を凍結保存状態から解凍することは、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む。さらなる実施形態は、好ましくは、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、もしくは創傷の処置、抑制、または寛解のために、本明細書に記載される細胞組成物のいずれか１つ以上を医薬として使用することに関する。

【0032】

本明細書で提供される実施形態には、好ましくは、以下の番号の代替形態が含まれる：

【0033】

１．プライミングされた不均一性細胞組成物であって、
間葉系前駆細胞集団、及び
上皮系前駆細胞集団を含み、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は共培養され、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、
前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記プライミングされた不均一性細胞組成物。

【0034】

２．線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、代替形態１に記載の組成物。

【0035】

３．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態２に記載の組成物。

【0036】

４．前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、代替形態２または３に記載の組成物。

【0037】

５．前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0038】

６．前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0039】

７．前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0040】

８．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の間葉系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の間葉系前駆細胞を含む、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0041】

９．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の上皮系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の上皮系前駆細胞を含む、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0042】

１０．限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0043】

１１．細胞集団をさらに含み、各細胞は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の両方のマーカーを示す、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0044】

１２．前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0045】

１３．凍結保存培地をさらに含む、先行代替形態のいずれかに記載の組成物。

【0046】

１４．前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、代替形態１３に記載の組成物。

【0047】

１５．不均一性細胞組成物の調製方法であって、
間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含み、
前記単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、前記調製方法。

【0048】

１６．前記単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、代替形態１５に記載の方法。

【0049】

１７．前記イヌまたはネコの子宮組織を酵素的に解離して、前記単一細胞懸濁液を形成する、代替形態１５または１６に記載の方法。

【0050】

１８．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法。

【0051】

１９．前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、代替形態１５～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0052】

２０．前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、代替形態１５～１９のいずれか１つに記載の方法。

【0053】

２１．慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、以下：
間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物を提供することであって、前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、前記提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含む、前記処置、抑制、または寛解方法。

【0054】

２２．前記間葉系前駆細胞及び前記上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、代替形態２１に記載の方法。

【0055】

２３．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、代替形態１５～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0056】

２４．プライミングされた不均一性細胞組成物であって、
ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団、及び
Ｖ＋／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団を含み、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、共培養され、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比であり、

【0057】

前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞はＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記プライミングされた不均一性細胞組成物。
２５．線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、代替形態２４に記載の組成物。

【0058】

２６．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態２５に記載の組成物。

【0059】

２７．前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、代替形態２５または２６に記載の組成物。

【0060】

２８．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、代替形態２４～２６のいずれか１つに記載の組成物。

【0061】

２９．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、代替形態２４～２８のいずれか１つに記載の組成物。

【0062】

３０．前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、代替形態２４～２９のいずれか１つに記載の組成物。

【0063】

３１．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む、代替形態２４～３０のいずれか１つに記載の組成物。

【0064】

３２．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む、代替形態２４～３１のいずれか１つに記載の組成物。

【0065】

３３．限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、代替形態２４～３２のいずれか１つに記載の組成物。

【0066】

３４．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、代替形態２４～３３のいずれか１つに記載の組成物。

【0067】

３５．凍結保存培地をさらに含む、代替形態２４～３４のいずれか１つに記載の組成物。

【0068】

３６．前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、代替形態３５に記載の組成物。

【0069】

３７．不均一性細胞組成物の調製方法であって、
Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含み、
前記単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、前記調製方法。

【0070】

３８．前記単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、代替形態３７に記載の方法。

【0071】

３９．前記イヌまたは前記ネコの子宮組織を酵素的に解離して、前記単一細胞懸濁液を形成する、代替形態３７または３８に記載の方法。

【0072】

４０．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態３７～３９のいずれか１つに記載の方法。

【0073】

４１．前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度である、代替形態３７～４０のいずれか１つに記載の方法。

【0074】

４２．前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、代替形態３７～４１のいずれか１つに記載の方法。

【0075】

４３．慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、以下：
Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及びＶ＋／Ｃ＋細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することであって、前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、前記提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【0076】

４４．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞及び前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、または約８０％対約２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、代替形態４３に記載の方法。

【0077】

４５．慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、以下：
代替形態１～１４または２４～３６のいずれか１つに記載の少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することと、
前記イヌまたは前記ネコ対象に前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【0078】

４６．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、代替形態３７～４５のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

４７．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、代替形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。

【0080】

４８．イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置に使用するための代替形態１～１４または２４～３６のいずれか１つに記載の組成物。

【0081】

４９．医薬として使用するための代替形態１～１４または２４～３６のいずれか１つに記載の組成物。

【0082】

５０．不均一性細胞組成物であって、
（ａ）ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団、
（ｂ）ビメンチン陰性（Ｖ－）／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団、及び
（ｃ）Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団を含み、
前記集団（ａ）～（ｃ）は、共培養され、
前記集団（ａ）～（ｃ）は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、
前記Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され、
ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記不均一性細胞組成物。

【0083】

５１．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、代替形態５０に記載の不均一性細胞組成物。

【0084】

５２．前記Ｖ－／Ｃ＋細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、代替形態５０または５１に記載の不均一性細胞組成物。

【0085】

５３．前記Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及び前記Ｖ－／Ｃ＋細胞集団の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である、代替形態５０～５２のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0086】

５４．ＦＧＦ－２をさらに含む、代替形態５０～５３のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0087】

５５．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態５０～５４のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0088】

５６．前記ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である、代替形態５０～５５のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0089】

５７．前記集団（ａ）～（ｃ）は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、代替形態５０～５６のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0090】

５８．前記集団（ａ）～（ｃ）は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される、代替形態５０～５７のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0091】

５９．前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、代替形態５０～５８のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0092】

６０．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む、代替形態５０～５９のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0093】

６１．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ－／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ－／Ｃ＋細胞を含む、代替形態５０～６０のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0094】

６２．５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む、代替形態５０～６１のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0095】

６３．前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、代替形態５０～６２のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0096】

６４．前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、代替形態６３に記載の不均一性細胞組成物。

【0097】

６５．限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、代替形態５０～６４のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0098】

６６．前記集団（ａ）～（ｃ）は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する、代替形態５０～６５のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0099】

６７．凍結保存培地をさらに含む、代替形態５０～６６のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0100】

６８．前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、代替形態６７に記載の不均一性細胞組成物。

【0101】

６９．不均一性細胞組成物の調製方法であって、
イヌまたはネコの子宮組織を単一細胞懸濁液に解離することと、
前記単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で培養することによって、
前記培養された単一細胞懸濁液から前記不均一性細胞組成物を調製することと、を含み、
前記３、４、５または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりには、前記不均一性細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含む、前記調整方法。

【0102】

７０．前記ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する、代替形態６９に記載の方法。

【0103】

７１．前記解離ステップは、酵素による解離を含む、代替形態６９または７０に記載の方法。

【0104】

７２．前記酵素による解離は、前記イヌまたは前記ネコの子宮組織を、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む、代替形態７１に記載の方法。

【0105】

７３．前記単一細胞懸濁液は、ＦＧＦ－２と共に培養される、代替形態６９～７２のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

７４．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態７３に記載の方法。

【0107】

７５．前記ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である、代替形態７３または７４に記載の方法。

【0108】

７６．前記単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される、代替形態６９～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0109】

７７．前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、代替形態６９～７６のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

７８．前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、代替形態７７に記載の方法。

【0111】

７９．前記不均一性細胞組成物は、代替形態５０～６８のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物である、代替形態６９～７８のいずれか１つに記載の方法。

【0112】

８０．慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、以下：
前記イヌまたは前記ネコ対象に少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することを含み、
前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含み、
前記不均一性細胞組成物は、ＩＦＮ－ガンマでプライミングされる、前記処置、抑制、または寛解方法。

【0113】

８１．前記ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する、代替形態８０に記載の方法。

【0114】

８２．前記不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される、代替形態８０または８１に記載の方法。

【0115】

８３．前記ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、前記不均一性細胞組成物の前記細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される、代替形態８２に記載の方法。

【0116】

８４．前記不均一性細胞組成物は、前記イヌまたは前記ネコ対象に対して自家または同種である、代替形態８０～８３のいずれか１つに記載の方法。

【0117】

８５．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、代替形態５０～６８のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物であるか、または代替形態６９～７９のいずれか１つに記載の方法によって製造される、代替形態８０～８４のいずれか１つに記載の方法。

【0118】

８６．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、代替形態８０～８５のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

８７．前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、代替形態８０～８６のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

８８．前記凍結保存状態から前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を解凍することは、前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む、代替形態８７に記載の方法。

【0121】

８９．イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置に使用するための代替形態５０～６８のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0122】

９０．イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置または抑制に対する医薬等の医薬として使用するための代替形態５０～６８のいずれか１つに記載の不均一性細胞組成物。

【0123】

９１．ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞、好ましくは子宮細胞を含む、プライミングされた細胞組成物。

【0124】

９２．前記細胞組成物は、間葉系前駆細胞及び／または上皮系前駆細胞をさらに含む、代替形態９１に記載の細胞組成物。

【0125】

９３．線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む、代替形態９１または９２に記載の細胞組成物。

【0126】

９４．前記ＦＧＦ－２は組換えヒトＦＧＦ－２である、代替形態９３に記載の細胞組成物。

【0127】

９５．前記ＦＧＦ－２は８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、代替形態９３または９４に記載の細胞組成物。

【0128】

９６．前記細胞組成物は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において培養される、代替形態９１～９５のいずれか１つに記載の細胞組成物。

【0129】

９７．前記子宮組織は卵巣摘出術により得られる、代替形態９１～９６のいずれか１つに記載の細胞組成物。

【0130】

９８．限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、代替形態９１～９７のいずれか１つに記載の細胞組成物。

【0131】

９９．凍結保存培地をさらに含む、代替形態９１～９８のいずれか１つに記載の細胞組成物。

【0132】

１００．前記凍結保存培地には、以下：
（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、
（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、
（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、
（ｄ）増殖培地中２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または
（ｅ）増殖培地中約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳ、が含まれる、代替形態９９に記載の細胞組成物。

【0133】

１０１．慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法であって、
前記イヌまたは前記ネコ対象に、代替形態９１～１００のいずれか１つに記載のプライミングされた細胞組成物を投与すること、を含む、前記処置、抑制、または寛解方法。

【0134】

１０２．前記細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、代替形態１０１に記載の方法。

【0135】

１０３．前記プライミングされた細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等の送達デバイスまたは容器に移された後に投与される、代替形態１０１または１０２に記載の方法。

【0136】

１０４．前記凍結保存状態から前記少なくとも１つのプライミングされた不均一性細胞組成物を解凍することは、前記少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む、代替形態１０３に記載の方法。

【0137】

１０５．イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置または抑制に使用するための代替形態９１～１００のいずれか１つに記載のプライミングされた細胞組成物。

【0138】

１０６．医薬として使用するための代替形態９１～１００のいずれか１つに記載のプライミングされた細胞組成物。

【0139】

上記の特徴に加えて、さらなる特徴及びバリエーションが、以下の図面の説明及び例示的実施形態から容易に明らかになるであろう。これらの図面は、典型的な実施形態を表すものであり、範囲の限定を意図するものではないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0140】

【図1】実施例３のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ及び４日目試料の総細胞集団に対する前方散乱（ＦＳＣ－Ａ）及び側方散乱（ＳＳＣ－Ａ）フローサイトメトリーのドットプロット及び等高線プロットを表している。

【図2】実施例３のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ及び４日目試料のインタクトな細胞に対するＦＳＣ－Ａ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイフローサイトメトリーのドットプロット及び等高線プロットを表している。

【図3】実施例３のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ及び４日目試料の生細胞に対するＣＤ４４及びＣＤ９０染色フローサイトメトリーの等高線プロットを表している。

【図4】実施例４のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ及び３日目試料の総細胞集団に対するＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａフローサイトメトリーの等高線プロットを表している。

【図5】実施例４のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ及び３日目試料のインタクトな細胞に対するＦＳＣ－Ａ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイフローサイトメトリーの等高線プロットを表している。

【図6】実施例４のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ、１日目、２日目、３日目、及び４日目試料の生細胞に対するＣＤ４４及びＣＤ９０染色フローサイトメトリーの等高線プロットを表している。

【図7】実施例４のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたイヌ子宮由来細胞のＰＣＦ、１日目、２日目、３日目、及び４日目試料の生細胞に対するビメンチン及びサイトケラチン染色フローサイトメトリーの等高線プロットを表している。

【図8】実施例５のプロトコルＡ及びＢに従ってプロセシングしたネコ子宮由来細胞の４日目試料の細胞に対するビメンチン及びサイトケラチン染色フローサイトメトリーのドットプロットを表している。

【図9A】位相差でのネコ子宮由来細胞の顕微鏡像を表している。

【図9B】抗ビメンチン／ＤＡＰＩでのネコ子宮由来細胞の顕微鏡像を表している。

【図9C】抗サイトケラチン－１８／ＤＡＰＩでのネコ子宮由来細胞の顕微鏡像を表している。

【図9D】抗サイトケラチン－１８／抗ビメンチンでのネコ子宮由来細胞の顕微鏡像を表している。

【図10-1】実施例６に関する、個々の動物についてのイオヘキソールクリアランスの結果、平均値、及び統計量を表している。

【図10-2】図１０－１の続き。

【図11-1】実施例６に関する、個々の動物についての体重の結果、平均値、及び統計量を表している。

【図11-2】図１１－１の続き。

【図11-3】図１１－２の続き。

【図12-1】実施例６に関する、個々の動物についての尿検査の結果、平均値、及び統計量を表している。

【図12-2】図１２－１の続き。

【図12-3】図１２－２の続き。

【図12-4】図１２－３の続き。

【図12-5】図１２－４の続き。

【図12-6】図１２－５の続き。

【図13A】第４継代細胞培養物における例示的なネコ子宮由来再生細胞の組成を表している。細胞集団には紡錘形状細胞及び立方体様細胞の両方が認められる。

【図13B】第４継代細胞培養物における例示的なイヌ子宮由来再生細胞の組成を表している。細胞集団には紡錘形状細胞が認められる。

【図14A】コントロール培地または脂肪生成誘導培地のいずれかでインキュベーションした後のネコ及びイヌＵＲＣ集団の脂肪生成染色を表している。

【図14B】コントロール培地または軟骨形成誘導培地のいずれかでインキュベーションした後のネコ及びイヌＵＲＣ集団の軟骨形成染色を表している。

【図14C】コントロール培地または骨形成誘導培地のいずれかでインキュベーションした後のネコ及びイヌＵＲＣ集団の骨形成染色を表している。

【図15】１つの例示的なネコＵＲＣ調製物の単一細胞におけるビメンチン染色及びサイトケラチン－１８染色の二重染色を表している。Ａは、ビメンチン染色を表している。Ｂは、サイトケラチン－１８染色を表している。Ｃは、ビメンチン染色及びサイトケラチン－１８染色をマージしたものを表している。

【図16】第２の例示的なネコＵＲＣ調製物の単一細胞におけるビメンチン染色及びサイトケラチン－１８染色の二重染色を表している。Ａは、ビメンチン染色を表している。Ｂは、サイトケラチン－１８染色を表している。Ｃは、ビメンチン染色及びサイトケラチン－１８染色をマージしたものを表している。

【発明を実施するための形態】

【0141】

本明細書では、子宮組織（卵巣摘出術によるもの等）から得られる細胞組成物及び／またはプライミングされた細胞組成物、好ましくは不均一性細胞組成物及び／またはプライミングされた不均一性細胞組成物が提供され、これらは子宮由来再生細胞（ＵＲＣ）と称される。本明細書で示されるように、ＵＲＣは、幹細胞／前駆細胞のいくつかの確立された特徴に基づいて、幹細胞／前駆細胞として分類され得る。本明細書に開示されるイヌ及びネコＵＲＣは、ヒトＭＳＣのプロファイルと定性的に一致するＣＤマーカープロファイルを有する。イヌ及びネコＵＲＣはまた、幹細胞／前駆細胞の公知のマーカーであるＣＤ４４が強度に陽性である。また、イヌ及びネコＵＲＣは、脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成細胞系列に分化するように誘導され得る。このことは、多能性ヒトＭＳＣに関連する別の要件である。最後に、イヌＵＲＣ及びネコＵＲＣは、培養中、接着して増殖する。したがって、本明細書に開示されるイヌ及びネコＵＲＣは、多能性幹細胞／前駆細胞である要件を満たしている。

【0142】

しかしながら、イヌ及びネコＵＲＣは、幹細胞／前駆細胞にしてはいくつかの予想外の特徴を示す。イヌ及びネコＵＲＣのどちらも、同一細胞で、前駆細胞様の特徴と上皮細胞様の特徴とを二重に発現するという、予想外の特性を示す。このことは、幹細胞性細胞及び上皮細胞に関するマーカーが、単一細胞で二重に発現しているという初めての報告であると思われる。二重発現はいくつかの方法で観察された。ネコＵＲＣにおける二重発現細胞の物理的存在は、免疫蛍光法によって証明され、いくつかの細胞はビメンチン（幹細胞性バイオマーカー）を明確に発現し、いくつかの細胞はサイトケラチン－１８（上皮性バイオマーカー）を発現し、一方で小集団は、両方のバイオマーカーを同時に発現した。フローサイトメトリー解析により、イヌ及びネコＵＲＣの両方で、ビメンチン及びサイトケラチン－１８が発現することが観察された。加えて、イヌ及びネコＵＲＣのどちらもがＣＤ４４及びＣＤ３２６を発現しており、ＣＤ４４は幹細胞性バイオマーカーであり、ＣＤ３２６は上皮細胞のバイオマーカーである。さらに、イヌＵＲＣはまた、フローサイトメトリー解析により、ＣＤ４４及びサイトケラチン－１８を発現していることが観察された。したがって、本明細書に開示されるＵＲＣ調製物は、同一細胞において、前駆細胞様特性及び上皮細胞様特性の両方を発現する細胞が存在することを実証するものである。二重発現細胞集団は、継代数がより多いイヌ及びネコＵＲＣ両方の培養物において観察され、このことは、治療薬としてのそれらの特有の潜在性を支持するものである。したがって、いくつかの実施形態には、細胞組成物及びその使用方法が含まれ、当該細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方を発現する細胞を含み、当該ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方を発現する細胞は、精製もしくは単離された形態であり得るか、またはビメンチンを発現する間葉細胞及び／またはサイトケラチン－１８を発現する上皮細胞と混合されている等、不均一性細胞集団中に存在し得る。

【0143】

イヌＵＲＣ調製物は、イヌのアトピー性皮膚炎を処置する臨床試験で評価されてきた。処置してから３０日後に、ＰＶＡＳ、ＣＡＤＥＳＩ－４及びＣＡＤＬＩ（イヌのアトピー性皮膚炎を評価するための臨床測定基準）の評価スコアが、処置前のスコアと比較して減少したことから、使用されたイヌＵＲＣ調製物が治療効果を示していることが示唆される。

【0144】

ネコＵＲＣ調製物は、慢性腎疾患を有するネコの状態改善に関する臨床試験で評価されてきた。当該試験では、食餌及び水の摂取量が改善されると共に、６ヶ月間の試験で処置されたネコの５０％超においてＧＦＲ値が２０％増加するという、主要試験転帰の１つが満たされた。この試験は、公開された７つの試験のうち、ＧＦＲ改善等の主要エンドポイントを達成した最初の試験である。

【0145】

治療効果の単一の機序に限定されるものではないが、アトピー性皮膚炎及び慢性腎疾患に共通する疾患状態の１つは、炎症促進性組織反応の存在である。本明細書に記載されるイヌ及びネコＵＲＣのどちらもが、ＭＬＲアッセイで測定されるように、炎症促進性環境を下方制御する能力を実証している。したがって、本明細書に開示されるＵＲＣは、部分的には、炎症促進性組織応答を低下させるその能力に起因して、治療効果を与えるものである。

【0146】

以下の発明を実施するための形態において、本明細書の一部を構成する添付図面を参照する。図面において、文脈上別段の指示がない限り、通常、同様の符号により同様の構成要素が識別される。発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲に記載された例示的実施形態は、限定を意味するものではない。本明細書に提示される内容の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用され得、他の変更がなされ得る。本開示の態様は、本明細書に一般的に記載され、図に例示されるように、多種多様な異なる構成で、配置され、代用され、組み合わされ、分離され、及び設計されることがあり、それらの全てが本明細書では明確に企図されていることが容易に理解されるであろう。

【0147】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本内容が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の内容の説明に使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのものであり、本内容の限定を意図するものではない。

【0148】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、当該冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すように本明細書で使用される。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

【0149】

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほど変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。

【0150】

本明細書を通じて、文脈上別段必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を意味するものではないと理解されよう。「からなる」に関しては、「からなる」という表現の前にあるものを全て含み、かつ、それらに限定することを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを指し示すものである。「から本質的になる」に関しては、その表現の前に列挙された任意の要素の包含を意味し、他の要素は、本開示で明示される列挙された要素の活性もしくは作用に干渉しないかまたは寄与しないものに限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という表現は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼすか否かによって、他の要素が存在し得ることまたは存在し得ないことを指し示すものである。

【0151】

本明細書に開示されるように、処置される「個体」、「患者」または「対象」は、いくつかの実施形態において、哺乳動物である。本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語には、限定されないが、ヒト、非ヒト動物（霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）、サル等を含む）が含まれる。いくつかの実施形態において、個体、患者、または対象は、ネコ（ネコ科）またはイヌ（イヌ科）である。対象は、本明細書に開示される方法を「必要とする」対象であり得るか、または疾患状態を経験している、及び／または疾患状態を経験すると予測される対象であり得、本発明の方法及び組成物は、治療的処置及び／または予防的処置のために使用される。対象は患者であり得、患者とは、疾患の診断または処置のために医療提供者と対面する対象を指す。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、または罹患しやすいが、疾患または障害の症状を示すこともあれば示さないこともある。

【0152】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、必要性がある対象または患者の選択に関する。いくつかの実施形態において、疾患を有している、疾患に対する処置もしくは治療を必要としている、疾患に罹患するリスクがある、以前に疾患を有していた、または現在は疾患を有していない対象が選択される。いくつかの実施形態において、以前に別の治療には反応しなかった対象が選択される。いくつかの実施形態において、疾患は、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷である。いくつかの実施形態において、前述の選択基準の任意の組み合わせを有し得る対象が選択される。このような対象または患者の選択は、臨床医もしくは獣医または両者により、臨床評価もしくは診断評価またはそれら両方によってなされ得る。

【0153】

本明細書で使用される場合、「プライミング」または「プライミングされた」という用語は、プライミングされた細胞が治療薬の形態で提供される場合にｉｎ ｖｉｖｏ環境で特定の成果を得るために、ｅｘ ｖｉｖｏ環境で細胞の薬物動態特性及び治療活性を調節するための方法及び組成物を指す。

【0154】

本明細書で使用される場合、「創傷」という用語は、対象の皮膚、表皮、及び／または真皮の損傷を指す。創傷は、開放創または閉鎖創であり得る。開放創には、限定されないが、切り傷、裂創、擦過創、裂離創、刺し傷、貫通創、または銃創が含まれる。閉鎖創には、限定されないが、血腫または挫滅創が含まれる。創傷には、細菌、ウイルス、真菌、または原生動物等の病原体による感染のリスクがあり得る。

【0155】

本明細書で使用される場合、「慢性歯肉炎」という用語は、対象の口腔内の創傷または損傷を指す。例えば、ネコ慢性歯肉口内炎（ＦＣＧＳ）と診断されたネコは、口腔に重度の炎症が生じ、これにより、ネコの食欲及び水の摂取に影響が及び、その結果クオリティオブライフが低下する。処置は、罹患したネコの歯を、ほとんど、または全て抜くことに限られる。しかしながら、このような抜本的な医療行為の後であっても、かなりの数のネコ（およそ３０％）が重度の口部炎症を患い続け、それらのネコのクオリティオブライフは、経時的に低下し続ける。

【0156】

本明細書で使用される場合、「アトピー性皮膚炎」及び「湿疹」という用語は、そう痒性皮膚に帰着する一般的な炎症関連疾患に関する。この疾患は、食物中のアレルゲン、花粉及び粉塵等の風媒性のアレルゲン、または遺伝的素因等、広範囲にわたる要因によって引き起こされ得る。アトピー性皮膚炎は、ヒトだけでなく、イヌ及びネコ等のペットを含む動物も発症する。アトピー性皮膚炎の一部の症例は、ある種の食品の使用停止等、比較的容易に処置され得る。しかしながら、多くの場合、アトピー性皮膚炎に対する治療法はなく、利用できる治療薬は抗ヒスタミン薬または抗炎症ステロイド薬しかない。ただし、こうした治療薬は、易感染性の上昇等、他の副作用を引き起こす可能性がある。

【0157】

本明細書で使用される場合、「骨関節炎」及び「ＯＡ」という用語は、１つ以上の関節に不自由がある臨床症状に関する。骨関節炎（ＯＡ）は、イヌにおける関節炎の最も一般的な形態であり、全頭数の約４分の１が発症する。骨関節炎は、関節軟骨の損失、関節包の肥厚及び関節周囲での骨新形成（骨増殖症）によって特徴付けられる慢性関節疾患であり、最終的に疼痛及び四肢の機能障害をきたす。イヌにおけるＯＡの大半は、前十字靭帯疾患、股関節形成不全、肘関節形成不全、ＯＣＤ、膝蓋骨脱臼等の進行性肢体異常疾患に続発する。ごく一部のイヌにおいて、ＯＡは、明白な主要原因なしに発症し、遺伝及び年齢に関連し得る。ＯＡの原因となる他の要因としては、体重、肥満、性別、運動、及び食餌が挙げられる。

【0158】

症状としては、硬直、跛行、引きずり足歩行、もしくは起き上がりの困難さ、無気力、走る、跳ぶ、もしくは遊ぶことを嫌がる、体重増加、易刺激性もしくは行動の変化、撫でられるかもしくは触れられると痛む、排尿もしくは排便の姿勢をとる困難さ、あるいは家の中でおもらしをする、四肢及び脊柱を覆う筋肉の量の減少が挙げられる。例えば、０日目に、Ｃａｎｉｎｅ Ｂｒｉｅｆ Ｐａｉｎ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＣＢＰＩ）でのＰａｉｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＰＳＳ）が２以上、及びＰａｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｃｏｒｅ （ＰＩＳ）が２以上と飼い主に評価されたイヌは、本発明の細胞を用いた処置の対象となり得る。イヌは、新たに診断された骨関節炎、または慢性／再発性骨関節炎のいずれかの診断を受けている可能性がある。診断は通常、既往症、身体検査における徴候、及び骨関節炎のＸ線写真によるエビデンス（放射線科医のレビューによる）から構成されることになる。例えば、イヌの跛行スコアは２以上であり得る。イヌのＣＢＰＩスコアは１０以上であり得る。イヌは、少なくとも１ヶ月間、ＯＡに関連する症状を示し得る。本明細書で使用される場合、「有効量」または「有効投与量」という用語は、観察可能な効果をもたらす、詳述された組成物または化合物の量を指す。目下開示している内容の活性組成物における活性成分の実際の投薬レベルは、特定の対象及び／または用途に対して所望の応答を達成するのに有効な活性組成物量または化合物量が投与されるように、変更され得る。選択される投薬レベルは、限定されないが、組成物の活性、配合、投与経路、他の薬物または治療薬との併用、処置される病状の重症度、ならびに処置される対象の体調及び既往歴を含む様々な要因に依存することになる。いくつかの実施形態においては、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、最小有効量まで用量が漸増される。有効投与量の決定及び調整、ならびに、いつ、どのようにこのような調整を行うかという評価が、本明細書において企図される。

【0159】

本明細書で使用される場合、「機能」及び「機能的」という用語は、生物学的機能、酵素機能、または治療学的機能を指す。

【0160】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（自然界及び／または実験環境のいずれであっても）初めに生成した際に付随していた成分の少なくとも一部から分離されている、及び／または（２）人の手によって生成、調製、及び／または製造された、物質及び／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、初めにそれらに付随していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、もしくは１００％に相当する値か、または少なくともその値（あるいは前述の値を含む範囲及び／または前述の値にまたがる範囲）で、当該他の成分から分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、実質的に１００％、または１００％（あるいは前述の値を含む範囲及び／または前述の値にまたがる範囲で）純粋である。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」（例えば、他の成分を実質的に含まない）であり得る。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物または組織中に含まれていない細胞を指す場合がある。

【0161】

「初代細胞画分」または「ＰＣＦ」という用語は、培養ステップの前に、標的組織から生存単一細胞懸濁液を調製するために行われる単離、解離、及び／または精製ステップから得られる細胞集団を指す。不均一性集団における特定の細胞型の相対的比率及び当該細胞型の特性は、１つ以上の培養ステップにわたって変化するため、ＰＣＦ集団は、１つ以上の培養ステップの後に得られる細胞集団とは異なる。

【0162】

「間葉系前駆細胞」または「ＭＰＣ」という用語は、骨形成系列、軟骨形成系列、及び脂肪生成系列に分化する可能性を示す、紡錘形の接着細胞集団を指す。ＭＰＣはまた、「間葉系間質細胞」、「間葉系幹細胞」、「ＭＳＣ」、または「間質細胞」とも呼ばれることがある。ＭＰＣは主に骨髄から単離されてきたが、他の組織にも存在し、特に臍帯組織、臍帯血、白色脂肪組織、及び胎盤組織に存在する。ＭＰＣは培養されると、一般的にＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０を発現するが、一般的にＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ－ＤＲ（クラスＩＩ）は発現しない。さらに、細胞骨格中間径フィラメントのビメンチン（Ｖ）は、公知のＭＰＣマーカーである。ＭＰＣにおける複数の細胞型に分化する能力、ならびにＭＨＣクラスＩＩの欠如により、自家または同種再生細胞療法での使用に対する研究が促されている。

【0163】

「上皮系前駆細胞」という用語は、身体組織の表面を構成する、上皮及び細胞外マトリックス成分の産生及び再生を担う立方体形状の接着細胞集団を指す。こうした細胞は、一般的にＣＤ４４、及び細胞接着タンパク質（特にＥ－カドヘリン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）等）を発現するが、一般的にＣＤ４５は発現しない。さらに、ケラチン中間フィラメントタンパク質（サイトケラチン（Ｃ）等、例えば、サイトケラチン－１４、サイトケラチン－１８）は、公知の上皮細胞及びＥＰＣマーカーである。

【0164】

「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」という用語は、細胞表面上の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）タンパク質に結合することにより、細胞の増殖、分化、及び再構成に多面的な作用を及ぼすポリペプチド増殖因子のファミリーを指す。ヒトでは、２２種のＦＧＦが公知である。これらのうちの１つは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２、塩基性線維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ－β）であり、これは、他の機能の中でも特に、幹細胞の未分化状態を維持することが明らかにされている。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、細胞培養用の増殖培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、０．０１、０．０５、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、ヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、イヌまたはネコＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えで産生される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えで産生される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、研究グレード基準または現行の医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）に従って産生される。

【0165】

「インターフェロン－ガンマ」または「ＩＦＮ－ガンマ」もしくは「ＩＦＮ－γ」という用語は、ウイルス感染、一部の細菌感染及び原生動物感染に対する自然免疫及び適応免疫にとって重大な意味を持つサイトカインである。ＩＦＮγは、マクロファージの重要な活性化因子であり、主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子の発現を誘導するものである。ＩＦＮ－γの異常発現は、いくつかの自己炎症性疾患及び自己免疫疾患に関連している。免疫系におけるＩＦＮ－γの重要性は、部分的には、ウイルスの複製を直接阻害するその能力から生じるが、最も重要な部分は、その免疫賦活作用及び免疫調節作用から生じる。ＩＦＮ－γは、自然免疫応答の一部として、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）によって主に産生され、また、適応免疫応答の一部として、抗原特異的免疫が生じ次第、ＣＤ４ Ｔｈ１及びＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞によって主に産生される。ＩＦＮ－γはまた、２０１０年代初頭に初めて発見された免疫細胞ファミリーである、非細胞傷害性自然リンパ球（ＩＬＣ）によっても産生される。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマは、本明細書に記載される濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマは、ヒトＩＦＮ－ガンマである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマは、イヌまたはネコＩＦＮ－ガンマである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマは、組換えで産生される。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマは、研究グレード基準または現行の医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）に従って産生される。

【0166】

本明細書で使用される場合、「酵素による解離」という用語は、１種以上の酵素の触媒活性を用いた細胞組織の断片化または解離を指す。当該技術分野で一般によく知られたプロセスである、酵素による解離は、通常、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシンもしくはコラゲナーゼ）、または表面接着もしくは細胞間結合に関与する他の分子に特異的な酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）の使用を必要とする。

【0167】

本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、その通常の意味を有し、組織抽出物または死滅した生物とは対照的に、生体（通例、動物、ヒトを含む哺乳動物、及び植物）内で、ある方法を実行することを指す。

【0168】

本明細書で使用される場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」は、その通常の意味を有し、天然の条件をほとんど変更せずに、生体外で、ある方法を実行することを指す。

【0169】

本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、その通常の意味を有し、生物学的条件外で（例えば、ペトリ皿または試験管において）、ある方法を実行することを指す。

【0170】

本明細書で使用される場合、任意の所与の物質、化合物、または材料の「純度」という用語は、予想される存在量に対する、物質、化合物、または材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、または材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（これらの間にある全ての小数を含む）純粋であり得る。純度は、限定されないが、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞片、低分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、もしくは夾雑物、またはそれらの任意の組み合わせを含む、望ましくない不純物によって影響を受けることがある。いくつかの実施形態において、物質、化合物、または材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、混入ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養成分、処理関連成分、マイコプラズマ、パイロジェン、細菌内毒素、及び外因性物質を実質的に含まない。純度は、限定されないが、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、分光法、紫外可視分光法、赤外分光法、質量分析、核磁気共鳴、重量測定、もしくは滴定、またはそれらの任意の組み合わせを含む技法を用いて測定することができる。

【0171】

本明細書で使用される場合、任意の所与の物質、化合物、または材料の「収率」という用語は、予想される全体量に対する、物質、化合物、または材料の実際の全体量を指す。例えば、物質、化合物、または材料の収率は、予測される全体量の少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（これらの間にある全ての小数を含む）であり得る。収率は、反応またはプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入する物質、化合物、もしくは材料の質、または製造ステップのいずれかにおける所望の物質、化合物、もしくは材料の減少によって影響を受けることがある。

【0172】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、採用される投薬量及び濃度で曝される細胞または哺乳動物に対して非毒性であるか、または許容されるレベルの毒性を有する担体、賦形剤、及び／または安定剤を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」「希釈剤」、「賦形剤」及び／または「担体」には、ヒト、ネコ、イヌ、または他の脊椎動物宿主への投与に適合性がある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに同様のものが含まれると意図される。典型的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、連邦政府、州政府、もしくは他の規制当局によって承認されているか、またはヒト及び非ヒト哺乳動物（ネコ及びイヌ等）を含む動物における使用のために米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されている、希釈剤、賦形剤、及び／または担体である。希釈剤、賦形剤、及び／または「担体」という用語は、医薬組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。このような医薬希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、水及び油（石油、動物、植物または合成由来のものを含む）等の滅菌液であり得る。水、生理食塩水、ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液は、特に、注射可能溶液用の液体希釈剤、賦形剤、及び／または担体として採用され得る。注射可能溶液用に使用される液体希釈剤のいくつかの例としては、限定されないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。適切な医薬希釈剤及び／または賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、またはエタノール及び同様のものが挙げられる。生理学的に許容される担体の非限定的な例は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体はまた、以下の１つ以上を含み得る：抗酸化剤（アスコルビン酸等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン）、アミノ酸、炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）、塩形成性対イオン（ナトリウム等）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。組成物は、所望により、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。こうした組成物は、溶剤、懸濁液剤、乳剤、徐放性製剤及び同様のものの形態を取り得る。製剤は、投与様式に適したものでなければならない。

【0173】

凍結保護物質は、大きな氷晶の形成を防ぐことにより、低温凍結保存の効率及び収率を改善するための細胞組成物添加剤である。凍結保護物質としては、限定されないが、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、トレハロース、ホルムアミド、メチル－ホルムアミド、ジメチル－ホルムアミド、グリセロール３－リン酸、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、スクロース、トリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、またはヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。凍結保護物質は凍結保存培地の一部として使用され得、この培地には、細胞の解凍後の生存性を高めるための栄養素（例えば、アルブミン、血清、ウシ血清、またはウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）等の他の成分が含まれる。凍結保存培地のいくつかの例は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、Ｈｅｓｐａｎ（登録商標）（０．９％塩化ナトリウム中６％ヘタスターチ［ヒドロキシエチルデンプン］）、ならびにＤＭＳＯ、ＦＣＳ、及び標準増殖培地を含む当該技術分野で公知の他の組成物である。こうした組成物において、ＤＭＳＯは、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の濃度で、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。こうした組成物において、ＦＣＳは、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％の濃度で、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。こうした組成物は、本明細書に記載される他の凍結保護物質（トレハロース等）も含み得る。

【0174】

望ましい特性を有する追加の賦形剤としては、限定されないが、防腐剤、アジュバント、安定剤、溶剤、緩衝剤、希釈剤、キレート剤、抗酸化剤、アルコール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、塩類、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、糖類、デキストロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、ソルビトール、セルロース、血清、アミノ酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ゼラチン、エステル、エーテル、２－フェノキシエタノール、もしくはビタミン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの賦形剤は、限定されないが、血清、アルブミン、オバルブミン、抗生物質、不活化剤、ゼラチン、細胞片、核酸、ペプチド、アミノ酸、もしくは増殖培地成分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、製造工程に由来する残留分中のものまたは夾雑物であり得る。賦形剤の量は、組成物中、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ ｗ／ｗのパーセンテージで、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲における任意の重量パーセンテージで見出され得る。

【0175】

「薬学的に許容される塩」という用語には、限定されないが、鎮痛剤、治療剤、他の原料、及び同様のものを含む組成物もしくは賦形剤の、相対的に非毒性である、無機及び有機酸付加塩、または無機及び有機塩基付加塩が含まれる。薬学的に許容される塩の例としては、鉱酸（塩酸及び硫酸等）に由来するもの、ならびに有機酸（エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、及び同様のもの等）に由来するものが挙げられる。塩の形成に適切な無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、及び同様のものの水酸化物、炭酸塩、及び重炭酸塩が挙げられる。塩はまた、適切な有機塩基で形成されてもよく、当該有機塩基には、非毒性であり、このような塩を形成するのに十分強力なものが含まれる。例えば、このような有機塩基の種類としては、限定されないが、モノ－、ジ－、及びトリアルキルアミン（メチルアミン、ジメチルアミン、及びトリエチルアミンを含む）、モノ－、ジ－、またはトリヒドロキシアルキルアミン（モノ－、ジ－、及びトリエタノールアミンを含む）、アミノ酸（グリシン、アルギニン及びリジンを含む）、グアニジン、Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルタミン、Ｎ－メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、またはトリヒドロキシメチルアミノエタンを挙げることができる。

【0176】

選択された投与経路に依存して、製剤化は適切になされる。本明細書に記載される化合物の製剤化及び投与のための技法は、当業者に公知である。当該技術分野においては、限定されないが、経腸、経口、経直腸、局所、舌下、バッカル、点耳、硬膜外、皮膚上、エアロゾル、非経口送達（筋肉内、皮下、動脈内、静脈内、門脈内、関節内、皮内、腹膜内、髄内注射、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射を含む）を含む、化合物を投与する技法が複数存在する。医薬組成物は一般に、意図された特定の投与経路に合わせて調製されることになる。

【0177】

本明細書で使用される場合、「担体」とは、細胞、組織及び／または身体器官への、化合物の通過、送達及び／または取り込みを容易にする化合物、粒子、固体、半固体、液体、または希釈液を指す。

【0178】

本明細書で使用される場合、「希釈剤」は、薬理学的活性を欠くが、薬学的に必要であり得るかまたは望ましくあり得る、医薬組成物中の成分を指す。例えば、希釈剤は、製造及び／または投与するには質量が小さすぎる、効力がある薬物の体積を増加させるために使用され得る。希釈剤はまた、注射、経口摂取または吸入により投与される薬物を溶解させるための液体であってもよい。当該技術分野における希釈剤の一般的な形態は、限定されないが、ヒト血液の組成に類似するリン酸緩衝生理食塩水等の緩衝水溶液である。

【0179】

本明細書で使用される場合、「％ ｗ／ｗ」または「％ ｗｔ／ｗｔ」という用語は、本明細書に照らして理解される、その通常の意味を有し、組成物の総重量に対する成分または薬剤の重量に１００を乗じて換算したパーセンテージを指す。本明細書で使用される場合、「％ ｖ／ｖ」または「％ ｖｏｌ／ｖｏｌ」という用語は、本明細書に照らして理解される、その通常の意味を有し、組成物の総液体体積に対する化合物、物質、成分、または薬剤の液体体積に１００を乗じて換算したパーセンテージを指す。

【0180】

子宮由来再生細胞（ＵＲＣ）
子宮では、周期的に子宮内膜の外側構造（ヒトにおいては機能層としても知られる）が再生される。ヒトにおけるサイクルは、およそ３０日ごとであるが、ネコ及びイヌといった動物におけるサイクルは、頻度が低い。子宮内膜外層の脱落（ヒト）または吸着（マウス）に続いて、子宮内膜外層は急速に再生する。例えば、ヒトでは機能層が脱落した後、２４時間以内に、新たに露出した表面において再上皮化が生じる。したがって、機能層の再生を支持する子宮内膜の基底層には、重要な幹細胞及び前駆細胞のプールが認められる。基底層に存在する幹細胞及び前駆細胞は、間質系（間葉系、周皮細胞等）及び上皮系（上皮系幹細胞を含む）の両方である。上皮系幹細胞は、妊娠及び出産の「天然の」子宮内膜傷害に起因する大規模な増殖と関連していることから、「創始」細胞として同定されている。

【0181】

上皮組織で見られる別の重要な細胞型は、「一過的増殖」（ＴＡ）細胞である。ＴＡ細胞は、上皮系幹細胞に由来し、「自己複製」（真の幹細胞の特色である）をすることができず、子宮内膜のような層状上皮組織の恒常性及び修復に必要な成体細胞となる運命にある。ＣＤ４４＋上皮細胞は、子宮前駆細胞（上皮系前駆細胞）の候補とみなされている。子宮内膜には、間質線維芽細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞及び白血球を含む、他の様々な細胞が存在する。

【0182】

上皮組織は、子宮、皮膚、腸、気道、腎臓、肝臓、乳腺及び前立腺を含む、外部環境と内部構造との界面で頻繁に見られる。上皮系幹細胞の重要な側面は、その可塑性であり、上皮系幹細胞が上皮層内の「ニッチ」から取り除かれた際に可塑性が示される。上皮系幹細胞がそのニッチから取り除かれ、移植（直接または培養後のいずれかで）されると、上皮系幹細胞は一層多能性を帯び、その際、単能性上皮細胞またはある方向への分化が決定された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）上皮細胞は、脱分化機序を介して、より「幹細胞様」の状態をとる。

【0183】

子宮組織は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従ってプロセシングされ、培養において増殖された後、主に２種の細胞型をもたらす：１）ビメンチンが単独で陽性の細胞（Ｖ＋、ＭＳＣマーカー）、ならびに２）サイトケラチン－１８とビメンチンとが二重で陽性の細胞（Ｃ＋／Ｖ＋）及び／またはＣＤ４４とＣＤ３２６とが二重で陽性の細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ３２６＋）。サイトケラチンは、上皮細胞と関連している。本明細書に記載されるものと同じプロトコルでプロセシングされた、イヌ子宮から得られた細胞は、培養４日目、またはそれ以降の継代、日、または培養間隔において調べた場合、大まかに１：１の頻度でＶ＋細胞及びＣ＋／Ｖ＋細胞をもたらす。さらに、イヌ子宮組織に由来する細胞はまた、ＣＤ９０／ＣＤ４４が二重で陽性であり、ＣＤ４４が単独で陽性であった。上述したように、ＣＤ４４マーカーは上皮系前駆細胞に関連すると考えられ、他のマーカーは前駆細胞及び線維芽細胞に関連する。

【0184】

本明細書では、「上皮様」細胞が「間葉様」細胞と共存している安定した培養環境の第４継代以降から全てが記載される。ヒト子宮内膜組織を酵素消化した後に得られた単一細胞懸濁液を培養すると、間葉系／線維芽細胞及び上皮系／小円形細胞の２種類のプラスチック接着性の細胞が生じることが、これまでに報告されてきた。しかしながら、外観上、第３継代培養物に存在する接着細胞の大部分は線維芽細胞であった。したがって、本明細書に記載されるプロトコルにおいて、第４継代に至るまでに２種の前駆細胞が存在することはめったにない。さらに、ネコ慢性腎疾患（ＣＫＤ）を処置するために、２種細胞型調製物を用いた臨床試験が実施された。当該パイロット試験では、試験対象のおよそ７０％に治療上有益な結果が得られた。この非常に肯定的な結果は、ＭＳＣのみを含有する細胞調製物に基づく、培養細胞調製物を用いた他の臨床試験とは対照的であった。

【0185】

慢性腎疾患は、腎臓のネフロンにおける上皮層の傷害によって特徴付けられる。上皮層が傷害されると生じる炎症促進性環境に長期間曝されることにより、慢性腎疾患に関連する進行性の病態が助長される。したがって、本明細書に記載されるＣＫＤの臨床試験において、２種細胞型調製物は、おそらくＣＫＤの主要な一因と考えられている炎症を抑えることによって、ＣＫＤの進行を逆転させることができたと思われる。

【0186】

ＭＳＣのような前駆細胞の重要な特性の１つは、炎症性反応の促進に関連する様々な免疫細胞に対して直接作用する、様々な生化学物質（ＩＬ－１０等のサイトカインを含む）の分泌を通じて、炎症促進性環境を和らげることである。この能力は、マクロファージの炎症促進型（Ｍ１）から抗炎症型（Ｍ２）への移行を促進する等、広範な免疫調節特性にも関連している。本明細書に記載される調製物中にＭＳＣ様細胞が存在することにより、ＣＫＤ及び／またはアトピー性皮膚炎に関連する炎症促進性環境の緩和が支持されるはずである。

【0187】

アポトーシスは、細胞（成体組織細胞、好中球、軟骨細胞等）が、そのゲノムを変化させ、プログラム細胞死をとる「シグナル」を受けると生じる。例えば、肺胞上皮細胞は、最適レベル以下の酸素に曝されると、低酸素誘導性因子を産生し、肺胞上皮細胞のアポトーシス及び細胞死を引き起こす。ＭＳＣは直接的な抗アポトーシス因子を産生する。本明細書に記載される調製物中にＭＳＣ様細胞が存在することにより、炎症促進性ネフロン等の病態部位に存在したシグナルに起因してアポトーシスに陥っていた組織細胞のレスキューが支持されるはずである。

【0188】

アポトーシス細胞のレスキューに加えて、ＭＳＣは、ＭＳＣが気管内に送達された後に、ヒト肺損傷モデルにおいて肺胞ＩＩ型上皮細胞が障害された場合、当該細胞の活性の回復を助けることが実証されている。ネコＣＫＤ臨床治験及びイヌアトピー性皮膚炎処置の場合には、間葉系様幹細胞と共に上皮系幹細胞様細胞が注入された。この組み合わせによって、ＭＳＣ型細胞と罹患したネフロンに存在する上皮細胞との有益な相互作用が強化された可能性がある。加えて、上皮系幹細胞様細胞もまた、ＴＡ細胞の生成を含め、上皮組織に見られる正常な環境を回復させることによって、上皮ニッチに応答し、これにより、ネフロンにおける機能的上皮バリアの修復及び再確立が補助された可能性がある。

【0189】

幹細胞がレジデント細胞を支持することの別の現われとして、多種多様なレジデント組織細胞の増殖を促進することが知られている生化学的因子（線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等）の分泌がある。例えば、骨関節炎で生じるように、軟骨細胞が傷害を受けた場合、軟骨細胞の増殖は、部分的にＦＧＦによって制御される。ＦＧＦ－２は、間質由来の「幹細胞」が培養中にコロニーを形成し、増殖するのを促進するが、この因子は、上皮系幹細胞のクローン形成活性は促進しない。一方、ＴＧＦ－ベータ、ＥＧＦ及びＰＤＧＦ－ＢＢは全て、上皮細胞及び間質細胞の両方のクローン形成能を増強した。上皮細胞は、子宮内膜の「機能」層（月経期に放出される子宮内膜の外層）の再生に重大な意味を持つ。機能層の再上皮化は２４時間以内に起こり、その上皮細胞は、上皮系前駆細胞に由来するものである。

【0190】

本明細書に記載のネコＣＫＤ及びイヌアトピー性皮膚炎の臨床治験で使用される治療調製物において、第４継代で２種の細胞型が存在するという事実は、２種の細胞型が長期間共培養されたことを意味し、その結果、「クロストーク」に起因して、２種の細胞型に変化が生じ得る。例えば、脂肪由来ＭＳＣは、ヒト乳房上皮細胞株の増殖によって馴化された培地で培養すると、腺房様構造を形成した。結果として生じる変性ＭＳＣが上皮遺伝子を上方制御したことから、ＭＳＣが、ヒト乳房上皮細胞から放出される因子の影響を受けていることが示された。ＩＩ型肺胞細胞はプラスチック上で増殖された場合、通常、Ｉ型細胞に分化するところ、骨髄由来ＭＳＣ及び肺胞上皮細胞を伴う混合共培養実験における肺胞細胞は、ＩＩ型の形態を維持した。したがって、ＭＳＣ及び上皮細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において互いに影響し合うことが実証された。

【0191】

細胞をまとめて共培養すると、細胞は、多数の生化学的因子の分泌を介して互いに影響を与え合うことができる。例えば、マウス腎臓の細管から細胞株を樹立した場合、上皮細胞をＦＧＦ－２（ＭＳＣによって分泌されるサイトカイン）の存在下で培養すると、上皮細胞マーカーであるサイトケラチンに対する上皮細胞の反応性が失われ始め、間葉系幹細胞マーカーであるビメンチンに対する反応性が増した。著者らは、このことが「上皮間葉転換」と呼ばれる公知のｉｎ ｖｉｖｏ現象を表している可能性があると指摘している。さらに、最初に複数の細胞型（ＭＳＣが含まれる）を培養する場合の典型的なパターンは、数回の継代中に他の細胞型が消失し、培養物がＭＳＣに支配されるというものである。

【0192】

したがって、本明細書に記載される治療調製物における、ＣＤ４４＋でもあるサイトケラチン陽性の上皮系幹細胞様細胞の存在は、培養開始時に存在する上皮系前駆細胞が、ある種の分子クロストークを通じて、それらが第４継代まで生存可能になる様式で、ＭＳＣ様前駆細胞に影響を与えることができたことを示唆している。本明細書に記載のネコＣＫＤ臨床治験で使用される治療薬における上皮系前駆細胞の存在により、上皮系幹細胞が上皮組織の再生（脱落後の子宮内膜における機能層の再生を含む）に重大な役割を果たすことに起因して、治療効果がもたらされた可能性がある。治療調製物中に存在する上皮系幹細胞様細胞はまた、ＣＫＤにおけるネフロンの機能障害性上皮組織において、健常な上皮組織を維持するための基礎となるＴＡ細胞依存性修復機序の回復を補助し得る。

【0193】

最後に、共培養における細胞間の潜在的なクロストークについては、ＩＬ－１０、ＦＧＦ及び他のサイトカイン等の生化学物質の役割に焦点が置かれてきたが、上皮系前駆細胞とＭＳＣ様細胞との間で生じるコミュニケーションの重大な要因は、エクソソームである。エクソソームは体内の全ての細胞によって産生され、非常に特異的な条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて放出される。エクソソームは、その供給源に応じて、タンパク質、脂質、プロテオグリカン、ＲＮＡ種及びＤＮＡからなる「カーゴ」を含有するように設計されている。エクソソーム内のカーゴとして運ばれるタンパク質には、ＦＧＦまたはＩＬ－１０が含まれ得る。エクソソームが、その「標的」受容体と考えられ得る細胞に結合するとすぐに、エクソソームはそのカーゴを放出する。成熟タンパク質は、直ちに標的細胞の代謝に影響を与えることができる。しかし、ＲＮＡ成分は、標的細胞のゲノム、またはタンパク質合成機構に組み込まれることになり、エクソソームのカーゴに基づいたタンパク質の産生が始まる。他のタイプのＲＮＡ成分（ｍｉＲＮＡ）は、標的細胞遺伝子の活性化を阻害し、それによって細胞のタンパク質産生に変化が生じ得る。それゆえに、本明細書に記載される治療調製物中に存在する２種の細胞型が互いに及ぼす影響には、培養物中に放出されるエクソソームの取り入れが含まれ得、このエクソソームは、共培養期間中及びそれに続いて試験対象に注入される際に、細胞の機能的挙動を改変する可能性がある。

【0194】

細胞組成物
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、特定の特性を示す細胞を含む細胞組成物に関する。いくつかの実施形態において、特定の特性としては、形態（紡錘形状及び立方体形状）、または間葉細胞型もしくは上皮細胞型に関連する細胞マーカー（例えば、ビメンチン、サイトケラチン－１８、ＣＤ４４、またはＣＤ３２６）の発現を挙げることができる。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、特定の特性を示す１種以上の細胞集団を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、２種以上の細胞集団を含む不均一性細胞組成物であり得る。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物中のいくつかの細胞集団は、２種以上の細胞型の特性を示し得る。

【0195】

本明細書では、不均一性細胞組成物が開示される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、上皮系前駆細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、子宮組織は、卵巣摘出術により得られる。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の間葉系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の間葉系前駆細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の上皮系前駆細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の上皮系前駆細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の細胞、あるいは合計が前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で３０～３６百万または約３０～３６百万個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、細胞集団をさらに含み、各細胞は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の両方のマーカーを示す。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、Ｄ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、凍結保存培地をさらに含む。いくつかの実施形態において、凍結保存培地は、（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、（ｄ）増殖培地中の２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または（ｅ）増殖培地中の約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳを含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。

【0196】

また、本明細書では、ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団及びＶ＋／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団を含む、不均一性細胞組成物が開示される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、Ｖ－／Ｃ＋細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＦＧＦ－２をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、子宮組織は、卵巣摘出術により得られる。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の細胞、あるいは合計が前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で３０～３６百万または約３０～３６百万個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤまたは類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、凍結保存培地をさらに含む。いくつかの実施形態において、凍結保存培地は、（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、（ｄ）増殖培地中の２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または（ｅ）増殖培地中の約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳを含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。

【0197】

また、本明細書では、不均一性細胞組成物も開示される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、（ａ）ビメンチン陽性（Ｖ＋）／サイトケラチン陰性（Ｃ－）細胞集団、（ｂ）ビメンチン陰性（Ｖ－）／サイトケラチン陽性（Ｃ＋）細胞集団、及び（ｃ）Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、集団（ａ）～（ｃ）は、共培養される。いくつかの実施形態において、集団（ａ）～（ｃ）は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ＋細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞集団は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、Ｖ－／Ｃ＋細胞集団は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及びＶ－／Ｃ＋細胞集団の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＦＧＦ－２をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、集団（ａ）～（ｃ）は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、集団（ａ）～（ｃ）は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、子宮組織は、卵巣摘出術により得られる。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ－細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ－細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ－／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ－／Ｃ＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個のＶ＋／Ｃ＋細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数のＶ＋／Ｃ＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の細胞、あるいは合計が前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の数の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、合計で３０～３６百万または約３０～３６百万個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、集団（ａ）～（ｃ）は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、凍結保存培地をさらに含む。いくつかの実施形態において、凍結保存培地は、（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、（ｄ）増殖培地中の２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または（ｅ）増殖培地中の約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳを含む。

【0198】

また、本明細書では、細胞組成物も開示される。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコ細胞は、子宮細胞である。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、間葉系前駆細胞及び／または上皮系前駆細胞をさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、Ｖ＋／Ｃ－細胞及び／またはＶ－／Ｃ＋細胞をさらに含む。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコ細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、イヌまたはネコ細胞は、卵巣摘出術から得られるか、または卵巣摘出術に由来する。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、ＦＧＦ－２をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、限定されないが、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、多糖類、炭水化物、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ナイドジェン、オステオポンチン、細胞外マトリックス、基底膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ハイドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、細胞接着及び／または細胞増殖を増強する生物学的または合成コーティング剤で前処理されていない、少なくとも１つの組織培養容器において共培養される。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、少なくとも１つの組織培養容器において培養される。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、３０百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約３０百万、約４０百万、約５０百万、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞、あるいは前述の細胞数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の当該細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、限定されないが、トレハロース、ＤＭＳＯ、もしくはアルブミンを含む、添加物、サプリメント、抗生物質、ビタミン、増殖因子、凍結保護物質、緩衝液、塩類、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖類、多糖類、または炭水化物、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、合計で３０～３６百万または約３０～３６百万個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、凍結保存培地をさらに含む。いくつかの実施形態において、凍結保存培地は、（ａ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５及び／またはＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＣＳ１０、（ｂ）９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び２％ ＤＭＳＯ、（ｃ）約９８％ Ｈｅｓｐａｎ及び約２％ ＤＭＳＯ、（ｄ）増殖培地中の２～１０％ ＤＭＳＯ及び２～２０％ ＦＣＳ、または（ｅ）増殖培地中の約２～１０％ ＤＭＳＯ及び約２～２０％ ＦＣＳを含む。

【0199】

本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、有効量の本明細書に記載される細胞組成物、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくはそれらの組み合わせ、を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる医薬組成物に関する。本明細書に記載される医薬組成物は、ヒト及び／または獣医学上の用途に適したものである。また、医薬化合物は、全身性ではなく局所性に（例えば、臓器、組織、がん、腫瘍、感染範囲、または他の疾患領域に化合物を直接的に注射することによって）投与され得る。

【0200】

製造方法
本明細書では、細胞組成物を調製する方法が開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、本明細書に開示される細胞組成物または不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの組織に由来する。いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、上皮系前駆細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、細胞培養物が７０～８０％コンフルエンスに達した際に継代される。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態においては、イヌまたはネコの子宮組織を酵素的に解離して、単一細胞懸濁液を形成する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。

【0201】

また、本明細書では、細胞組成物を調製する方法も開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞を含む単一細胞懸濁液を、ＦＧＦ－２と接触させることと、単一細胞懸濁液を、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数で、ＦＧＦ－２と共に培養することと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、本明細書に開示される細胞組成物または不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、イヌもしくはネコの組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの組織に由来する。いくつかの実施形態において、３、４、５、または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりに、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、Ｖ－／Ｃ＋細胞は、不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、細胞培養物が７０～８０％コンフルエンスに達した際に継代される。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、同一のイヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、または同一のイヌもしくはネコの子宮組織に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態においては、イヌまたはネコの子宮組織を酵素的に解離して、単一細胞懸濁液を形成する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。

【0202】

また、本明細書では、不均一性細胞組成物等の細胞組成物を調製する方法も開示される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。いくつかの実施形態において、本方法は、イヌまたはネコの子宮組織を単一細胞懸濁液に解離し、当該単一細胞懸濁液を、３、４、５または６の継代数、日数、または培養間隔数で培養することによって、培養された単一細胞懸濁液から不均一性細胞組成物を調製することを含む。いくつかの実施形態において、３、４、５または６の継代数、日数、または培養間隔数の終わりには、不均一性細胞組成物は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、細胞培養物が７０～８０％コンフルエンスに達した際に継代される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、解離ステップは、酵素による解離を含む。いくつかの実施形態において、酵素による解離は、イヌまたはネコの子宮組織を、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、サーモリシン、中性プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、ＦＧＦ－２と共に培養される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、組換えヒトＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ－２は、８ｎｇ／ｍＬまたは約８ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、単一細胞懸濁液は、少なくとも４の継代数、日数、または培養間隔数で培養される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。

【0203】

使用方法
本明細書で使用される場合、「処置すること」、「処置」、「治療的」、または「療法」という用語は、本明細書に照らして理解される、その通常の意味を有し、必ずしも疾患または病状の完全な治癒または消滅を意味するものではない。本明細書で使用される場合（及び当該技術分野で十分に理解されているように）、「処置すること」または「処置」という用語はまた、臨床結果を含む、対象の状態において有益な結果または所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、部分的であるかまたは全体的であるか、検出可能であるかまたは検出不可能であるかに関わらず、限定されないが、１つ以上の症状または病状の緩和または寛解、疾患範囲の縮小、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の伝播または拡散の予防、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の寛解または軽減、疾患再発の減少、及び寛解傾向を挙げることができる。本明細書で使用される「処置すること」及び「処置」には、予防処置も含まれる。処置方法は、治療有効量の活性薬剤を対象に投与することを含む。投与ステップは、単回投与からなり得るか、または一連の投与で構成され得る。組成物は、患者を処置するのに十分な量及び期間で対象に投与される。処置期間の長さは、病状の重症度、患者の年齢及び遺伝子プロファイル、活性薬剤の濃度、処置に使用される組成物の活性、またはそれらの組み合わせ等の種々の要因に依存する。また、処置または予防に使用される薬剤の有効投薬量は、特定の治療または予防体制の経過と共に増加または減少する可能性があることも認識されよう。投薬量の変更は、当該技術分野で公知の標準診断アッセイにより、結果としてなされ、明らかになり得る。場合によっては、慢性投与が必要とされる可能性がある。

【0204】

本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、２種以上の医薬組成物／薬剤または療法の組み合わせの使用を含む療法を定義することを意図する。したがって、本出願における「併用療法」、「併用」、及び組成物／薬剤の「併用」使用に対する言及は、同一の全体的な治療計画の一部として投与される組成物／薬剤を指し得る。よって、２種以上の組成物／薬剤の各々における投薬量またはタイミングは異なっていてもよい。つまり、それぞれが同時に投与され得るか、または異なる時間で投与され得る。したがって、併用する組成物／薬剤は、同一の医薬製剤中（すなわち、一緒に）、または異なる医薬製剤中（すなわち、別々に）のいずれかで、順次（例えば、前もしくは後に）または同時に投与され得る。併用療法における２種以上の組成物／薬剤の各々は、投与経路に関しても異なることがある。

【0205】

対象（イヌまたはネコ対象等）は、特定の疾患または病状を有し得る。あるいは、対象は、疾患もしくは病状を発症している可能性がある、疾患もしくは病状を有するリスクがあり得る、以前に疾患もしくは病状を有していた、または疾患もしくは病状を有していない。疾患または病状は、特発性であり得るか、または自己免疫疾患もしくは加齢に関連し得る。疾患または病状としては、限定されないが、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷を挙げることができる。本明細書に記載される少なくとも１つの不均一性細胞組成物が対象に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、経腸的または非経口的に投与され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１０百万、１１百万、１２百万、１３百万、１４百万、１５百万、１６百万、１７百万、１８百万、１９百万、２０百万、２１百万、２２百万、２３百万、２４百万、２５百万、２６百万、２７百万、２８百万、２９百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、４５百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、もしくは１００百万、または約５百万、約６百万、約７百万、約８百万、約９百万、約１０百万、約１１百万、約１２百万、約１３百万、約１４百万、約１５百万、約１６百万、約１７百万、約１８百万、約１９百万、約２０百万、約２１百万、約２３百万、約２４百万、約２５百万、約２６百万、約２７百万、約２８百万、約２９百万、約３０百万、約３１百万、約３２百万、約３３百万、約３４百万、約３５百万、約３６百万、約３７百万、約３８百万、約３９百万、約４０百万、約４５百万、約５０百万細胞、約６０百万、約７０百万、約８０百万、約９０百万、もしくは約１００百万個の細胞、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万細胞、約３０百万細胞、約３１百万細胞、約３２百万細胞、約３３百万細胞、約３４百万細胞、約３５百万細胞、または約３６百万細胞、あるいは前述の細胞数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、各用量は、前回の投与から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０日後、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月後、または１、２、３、４、５年後に投与され得る。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つの不均一性細胞組成物の投与後に、症状の緩和または疾患の完全もしくは部分的な軽減を経験する。

【0206】

また、本明細書では、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法が開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することであって、当該間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、当該イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して自家または同種である、提供することと、イヌまたはネコ対象に少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞及び上皮系前駆細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、間葉系前駆細胞は、少なくとも１つの不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、上皮系前駆細胞は、少なくとも１つの不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、送達デバイスまたは容器（生理食塩水、酢酸リンゲル液、デキストロース溶液、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等）に移された後に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を凍結保存状態から解凍することは、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該細胞が、好ましくは子宮細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物であって、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される細胞組成物。

【0207】

また、本明細書では、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、もしくは創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法が開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｖ＋／Ｃ－細胞集団及びＶ＋／Ｃ＋細胞集団を含む少なくとも１つの不均一性細胞組成物を提供することであって、当該Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞は、イヌもしくはネコの子宮組織から得られるか、またはイヌもしくはネコの子宮組織に由来し、当該イヌまたはネコの子宮組織は、イヌまたはネコ対象に対して自家または同種である、提供することと、イヌまたはネコ対象に少なくとも１つの不均一性細胞組成物を投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞及びＶ＋／Ｃ＋細胞の比は、２０％対８０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、８０％対２０％、９０％対１０％、９９％対１％、約２０％対約８０％、約４０％対約６０％、約５０％対約５０％、約６０％対約４０％、約８０％対約２０％、約９０％対約１０％、または約９９％対約１％であるか、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、Ｖ＋／Ｃ－細胞集団は、少なくとも１つの不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、Ｖ－／Ｃ＋細胞集団は、少なくとも１つの不均一性細胞組成物の総細胞数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、送達デバイスまたは容器（生理食塩水、酢酸リンゲル液、デキストロース溶液、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等）に移された後に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を凍結保存状態から解凍することは、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。

【0208】

また、本明細書では、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎または創傷の処置、抑制、または寛解を必要とするイヌまたはネコ対象における、その処置、抑制、または寛解方法が開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの細胞組成物、好ましくは不均一性細胞組成物をイヌまたはネコ対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞組成物（好ましくは不均一性細胞組成物）は、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団によってさらに定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方が陽性である細胞集団は、不均一性細胞組成物の細胞の総数のうち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のパーセンテージで、あるいは前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出される。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、イヌまたはネコ対象に対して自家または同種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、皮内、髄腔内、腹腔内、門脈内、関節内、眼内もしくは腎臓内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物は、凍結保存状態から解凍され、送達デバイスまたは容器（生理食塩水、酢酸リンゲル液、デキストロース溶液、リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液等の適切な緩衝液、希釈液または流体を含むシリンジ等）に移された後に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を凍結保存状態から解凍することは、少なくとも１つの不均一性細胞組成物を、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製される。

【0209】

また、本明細書では、イヌまたはネコの慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、慢性歯肉口内炎もしくは創傷の処置に使用するための、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれかが開示される。

【0210】

また、本明細書では、医薬の製造に使用するための、本明細書に開示される不均一性細胞組成物のいずれかが開示される。

【0211】

慢性腎疾患
いくつかの実施形態において、動物患者が罹患する疾患は慢性腎疾患（ＣＫＤ）である。イヌよりもネコでより一般的であるが、ＣＫＤは、潜在的にあらゆる動物が罹患する可能性があり、したがって、本明細書に提供されるＣＫＤに関するあらゆる開示は、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び他の動物に適用され得る。

【0212】

ネコＣＫＤは一般的な炎症性の退行性病態であり、通常は高齢のネコで生じる。全体的な有病率はおよそ４％であり、有病率は年齢と共に急速に増加し、１０歳以上のネコでは３０～４０％に達し、１５歳以降では８０％ほどに達する場合がある。ＣＫＤは、５歳以上のネコにおける最も一般的な死因であり、年齢中位数１５歳での死亡率は、少なくとも１３％である。腎臓は、内分泌物の産生から老廃物の排泄まで、広範囲にわたる生理的プロセスを担っているため、可能性がある臨床症状も同様に多岐にわたるが、多くの場合、体重減少及び食欲不振を伴う。ＣＫＤの根源的な原因は、個体によって異なり、通常は不明である。低酸素症、中毒性傷害、ワクチン接種、慢性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、上部尿路閉塞、またはレトロウイルスもしくはモルビリウイルス等のウイルス感染を含む、複数のプロセスが提唱されている。ときには、多発性嚢胞腎疾患、アミロイドーシス、腎リンパ腫、先天性疾患、高カルシウム血症性腎症、鈍的腹部外傷、急性腎臓損傷（例えば、特異的毒素の摂取）、または尿道閉塞の既往等、原因が同定されることがある。年齢以外にも、脱水、歯科疾患、変性関節疾患、または体調不良を含む、いくつかの他のリスク因子がＣＫＤと関連している。

【0213】

ＣＫＤは、慢性的な腎臓の炎症及び変性によって特徴付けられる。組織学的には、腎標本は一般的に、炎症性浸潤、細胞外マトリックスの増加、尿細管の損失、石灰化、及び線維化を示し、これらは全て、尿細管間質性腎炎及び腎線維症としてより簡潔に説明され得る。肉眼的には、腎臓のサイズは経時的に縮小する。

【0214】

疾患進行の機序は多くの要素からなり、十分に理解されていない。ある専門家は、腎機能の最良の尺度である糸球体濾過値（ＧＦＲ）は、構造変化、機能しているネフロンの減少、及び尿細管機能障害に起因して、腎臓の老化過程の「正常な」一部として減少すると推測する。細胞レベルでは、こうした現象は、テロメア短縮、ミトコンドリア傷害、酸化ストレス、炎症促進及び線維化促進メディエーター、ならびに細胞増殖及び細胞再生と細胞死及びアポトーシスとの間の全般的な不均衡と関連している。これらの分子過程は、単に自然老化の１つの態様であるという主張もいくらかあるが、慢性的な傷害からも生じる可能性があるという指摘もある。正確な病因に関わらず、ＣＫＤ患者の腎臓は、損傷に対する感受性が経時的により高くなり、傷害後の回復が低下する。その結果、慢性炎症及び変性の方へ不均衡が生じる。

【0215】

細胞レベルでは、傷害の直接的原因として、低酸素、タンパク尿、アンジオテンシンＩＩ、高血糖、または酸化ストレスを挙げることができる。傷害により、遺伝子発現の変化ならびにＴ細胞及びマクロファージ等の炎症細胞の動員が刺激され、線維化促進及び炎症促進メディエーターのレベルが上昇する。また、筋線維芽細胞は、線維細胞、内皮細胞、及び尿細管上皮細胞の分化、または周皮細胞を介した分化により生じる。この後者の経路が、間質毛細血管網の喪失の一因となり、酸化ストレス、低酸素、線維化、及びさらなる傷害が増進する。これにより、疾患進行の悪循環に陥る。

【0216】

ネコＣＫＤに関連している分子異常を挙げると長くなるが、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、単球走化性促進因子（ＭＣＰ－１）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、または活性酸素種を含むがこれらに限定されない、増殖因子、サイトカイン、及びケモカインの異常レベルが挙げられる。

【0217】

第一線の専門家パネルが率いるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによれば、ＣＫＤに対する治療の有効性は、クオリティオブライフ（ＱＯＬ）を決定する臨床徴候を改善する能力に基づいて検討されるべきである。治療によって基礎疾患の進行を遅らせることにより、延命を図ることもできるが、このことは一般に、有効性の二次的尺度と考えられている。このパラダイムのために、ＣＫＤの臨床徴候を根本的に理解することが、研究の解釈に役立つことになる。

【0218】

腎機能が低下するにつれて、血液中の毒素の蓄積、赤血球の産生低下、電解質の不均衡、脱水、代謝性アシドーシス、胃腸管の吸収不良、全身性の炎症、エネルギー必要量の増加、免疫機能の障害、高血圧、及びタンパク質の損失を含む、多くの生理的障害が生じる。こうした異常による影響は、動物によって異なり、時間と共に変化し得る。

【0219】

こうした変化に関連する臨床徴候としては、慢性的な体重減少、食欲不振、悪心、嘔吐、下痢、便秘、飲水量の増加及び排尿量の増加、無気力、呼気悪臭（口臭）、口腔潰瘍、及び被毛の減少が挙げられる。疾患が貧血を誘発するほど重篤な場合は、歯肉が淡いピンク色であるか、または白色にもなることがある。

【0220】

高血圧は、永続的な視力喪失を引き起こし得る網膜出血、心臓異常（左心室肥大（心臓の肥厚）、不整脈、心雑音、及び鼻出血（鼻血）等）、ならびに神経学的欠乏（精神変調、痙攣、行動変化、及び前庭性徴候（平衡感覚の喪失）等）を含む、様々な後遺症をもたらす可能性がある。

【0221】

ＣＫＤは尿路感染症（ＵＴＩ）のリスクを増加させるが、これはおそらく、尿濃度の低下が理由であると考えられる。下部尿路のみに影響を及ぼすＵＴＩは、無症候性であり得るか、または、血尿症（血尿）、頻尿症（頻尿）、排尿困難（排尿痛）、周囲での排尿（不適切な場所での排尿）、及び／または有痛性排尿困難（排尿負担）を含む種々の臨床徴候を引き起こし得る。さらに深刻なことに、ＵＴＩは、腎臓そのものに影響を与えることがあり（腎盂腎炎）、加えて、側腹部痛、発熱、及び極度の無気力を引き起こす。

【0222】

ＣＫＤは、少なくとも３ヶ月間の腎機能低下によって定義される。腎機能測定のゴールドスタンダードは糸球体濾過値（ＧＦＲ）であり、これは、１分ごとに糸球体で濾過される血漿量によって定義され、腎容積の直接的基準となる。ＧＦＲを最も正確に測定する方法には、腎性に排泄された物質を逐次的に測定することが必要となる。理想的には、このような物質は、非毒性であり、最小限に代謝され、血漿タンパク質との結合が最小であり、腎臓によってのみ排泄されるものである。一例は、ヨード系造影剤のイオヘキソールである。ＧＦＲを測定するには、イオヘキソールを単回注射し、続いて、注射後の血清試料を少なくとも１時間間隔で少なくとも２回採取するが、より多くの試料をより長い期間にわたって採取することで、より正確な結果が得られる。こうした一連の試料中のイオヘキソール量を測定することにより、ＧＦＲに直接関連するイオヘキソールクリアランス率を決定することができる。次いで、イオヘキソールのクリアランス率、したがって、ＧＦＲを正常範囲と比較することにより、腎機能の正常と異常とを読み取ることができる。ＧＦＲは、造影剤の注射及び核シンチグラフィを用いて測定することもできるが、この技術は一般に研究専用である。

【0223】

逐次測定による注入は、ＧＦＲを決定するための臨床的ゴールドスタンダードであるが、臨床診療ではまれである。その代わりに、ほとんどの臨床医は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＳＦＭ）及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＩＲＩＳ）が推奨するように、血清クレアチニンと尿濃度との組み合わせに依存している。クレアチニンはイオヘキソールと同様の理由で使用されるが、注目すべき例外として、クレアチニンは、身体により天然に産生され（筋肉代謝の副産物）、糸球体濾過を介して排泄され、尿細管分泌または再吸収が最小限である。理論的には、ＧＦＲが低下すると血清クレアチニンは正常範囲を超えて上昇することになる。尿比重（尿濃度の尺度）は、老廃物を濃縮する腎臓の能力の大まかな指標を与えるものであるため使用される。機能喪失によりその能力が減弱すると、尿が一層希釈される。

【0224】

事態を複雑にすることに、血清クレアチニン及び尿比重の両方が、腎臓に関連しない他の様々な理由で正常範囲を超える可能性がある。例えば、クレアチニンは、平均以上の筋肉量によって増加することがあり、尿比重は、（他の理由の中でも特に）単に動物が直近で飲んだ大量の水によって低くなる（すなわち、尿が希釈される）ことがある。したがって、血清クレアチニン及び尿比重の両方は、臨床徴候、Ｘ線所見、腎生検、ならびに他の検査結果（血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度及び尿タンパク質レベル（いずれもＣＫＤで上昇する可能性がある）等）を含み得る、他の利用可能なデータに照らして解釈されなければならない。ＣＫＤはまた、タンパク尿レベル及び収縮期血圧レベルによってサブステージに段階付けられ得る。

【0225】

ＩＲＩＳガイドラインでは、血清クレアチニン及び臨床徴候に基づいて、表１に示すように、ＣＫＤを４つのステージに分類している。（高窒素血症は、クレアチニン及びＢＵＮ等、血中老廃物のレベルが異常に高いことを指す）

【表1】

【0226】

血清クレアチニンがＧＦＲの実用的な尺度ではあるが不完全であることは再強調しておくに値する。なぜなら、血清クレアチニンは非腎性プロセスに影響される可能性があるだけでなく、少なくとも７５％のネフロンが失われるまで血清クレアチニンは上昇せず、クレアチニンが腎臓病理の非感受性バイオマーカーとなるからである。換言すれば、ＩＲＩＳステージ２のＣＫＤは、「軽度高窒素血症」と定義されるが、既に腎機能の４分の３が失われているため、ステージ２の疾患の病理学的実態は、決して軽度ではない。

【0227】

クレアチニンの非感受性、及びイオヘキソール等の物質による逐次的ＧＦＲ測定の非実用性から、ＧＦＲの代替尺度が検討されている。クレアチニンの代替（または補足）として有力なのは、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）であり、これはクレアチニンよりも感受性が高い可能性があるが、同様に非腎性プロセスの影響を受ける可能性もある。ＳＤＭＡは現在市販されており、特に疾患の早期検出を改善する手段として、一部の開業医により使用されている。

【0228】

クオリティオブライフ（ＱＯＬ）及び寿命を同時に改善することが示されている食事療法は別として、ほとんどの治療法は、ＱＯＬを阻害する臨床徴候の管理（胃腸管系の問題に対する制吐性薬物療法または脱水に対する液体投与等）を目的としている。

【0229】

ＣＫＤを処置するために、疾患のステージ及び個々の臨床症状に応じて、広範囲の治療法が用いられる。

【0230】

処置の柱は食生活の改善であり、一般的には、リン、タンパク質、及びナトリウムを減らし、カロリー密度、カリウム、ビタミンＢ群、オメガ－３脂肪酸、及び抗酸化物を増やした処方食が用いられる。注目すべきことに、食事療法は、クオリティオブライフ及び寿命の両方を改善することが判明している、唯一の既存の治療法である。

【0231】

食欲不振、悪心、及び嘔吐のために、多くのネコは、嘔吐抑制剤及び制吐剤、ならびに食欲増進剤によっても処置される。一般的に使用される薬物は、マロピタント（制吐剤）及びミルタザピン（嘔吐抑制剤、制吐剤、及び食欲増進剤）の２つである。

【0232】

脱水は、一般的に生理食塩水をベースとした皮下輸液で管理され、これは飼い主が自宅で行うことが多く、頻度と量は、動物のサイズ及び疾患の重症度に依存する。急性発症の際は、静脈内輸液がより頻繁に用いられる。

【0233】

残りの治療法は、特定の疾患症状に依存する。例えば、貧血のネコは、骨髄での赤血球産生を刺激するエリスロポエチンというホルモンの合成型である、ダルベポエチンで処置され得る。高血圧のネコには、アムロジピン等の抗高血圧薬が与えられ、ＵＴＩを発症しているネコには、理想的には尿培養に基づいて抗生物質が与えられる。腎移植及び血液透析は、専門施設ではネコに実施可能であるが、経済的及び倫理的懸念から実施されることはまれである。

【0234】

慢性炎症性病態として、ネコＣＫＤは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の治療標的となり得る。ＭＳＣは、イヌにおける骨関節炎及び乾性角結膜炎等、他の退行性疾患に対する獣医学的療法において有望視されている。しかしながら、自然に発症したＣＫＤを有するネコにおける、ＭＳＣの有効性の結果は限られており、また、一部の調製物では急性輸液反応が生じている。

【0235】

いくつかの実施形態において、ＣＫＤは、本明細書に開示される子宮由来再生組成物または細胞組成物のいずれか１つ以上を用いて処置され得る。いくつかの実施形態において、子宮由来再生組成物または細胞組成物、例えば、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の両方が陽性であるイヌまたはネコ細胞を含む細胞組成物であって、当該イヌまたはネコ細胞が、好ましくは子宮由来細胞である、細胞組成物、及び／または本明細書に記載される不均一性細胞集団（例えば、ビメンチンもしくはサイトケラチン－１８及び／または両方のマーカーが陽性であるイヌまたはネコ細胞であって、好ましくは子宮由来細胞である、イヌまたはネコ細胞）のいずれか１つ以上を含む細胞組成物は、プロトコルＢ、Ｃ、もしくはＤ、または類似のプロトコルに従って調製され得る。

【実施例】

【0236】

上述した実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されるが、これらはいかなる形であれ、本開示の範囲の限定を意図するものではない。本明細書において上で記載したように、また、特許請求の範囲に記載されるように、他の多くの実施形態も本発明の範囲内にあることが当業者に認識されよう。

【0237】

実施例１．子宮組織プロセシングプロトコルＡ（「プロトコルＡ」）
子宮試料は、ドナープログラムにより、ネコまたはイヌ等の哺乳動物から得た。子宮組織試料から脂肪組織を除去した。

【0238】

１．子宮体部及び子宮角組織を長軸に沿って開き、長軸に沿って細片に切断し、その細片を細かく切り刻み、およそ２ｍｍ×２ｍｍの組織小片にする。

【0239】

２．細かく切り刻んだ組織を遠心分離ができる容器に移し、ＤＥ １０コラゲナーゼ解離試薬を添加し、当該容器をプラットフォームロッカー上のドライインキュベーター内に３７℃で４０分間置いて、組織を消化する。

【0240】

３．インキュベーションステップの終了時点で、１０％ ＦＢＳを含有する組織培養液を添加することにより消化を停止する。

【0241】

４．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で容器を満たし、当該容器を遠心分離にかける。

【0242】

５．上清を除去し、細胞ペレットを残す。

【0243】

６．少量のＰＢＳを添加し、ペレットを再懸濁する。

【0244】

７．懸濁液を一連のセルストレーナー：１００μｍ、７０μｍ、及び４０μｍストレーナーに通過させる。

【0245】

８．最後のセルストレーナーステップに続いて細胞懸濁液を回収し、ＰＢＳを添加して体積を３５～４０ｍＬにし、遠心分離にかける。

【0246】

９．上清を除去し、細胞ペレットを残す。

【0247】

１０．少量のＰＢＳを添加し、ペレットを再懸濁する。

【0248】

１１．再度遠心分離にかけ、上清を除去し、ペレットを３～４ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁する。

【0249】

１２．細胞懸濁液の細胞数をカウントする。

【0250】

１３．十分な量の組織培養液を添加し、細胞懸濁液を、総細胞数及び播種密度に応じて、適切な数の組織培養フラスコに移す。

【0251】

１４．フラスコを標準条件下でインキュベーター内に置き、１、２、３、及び４の継代数または日数を通して、培養物を増殖させる。

【0252】

培養ステップ１４の前に細胞調製物試料を採取し、凍結保存して（Ａ－ＰＣＦ）、プロセシングプロトコルＡの終了時点で組成を評価した。接着細胞を標準プロトコルに従って培養し、各培養間隔の試料を、１、２、３、及び４日目に採取し、凍結保存した（それぞれ、Ａ－Ｄ１、Ａ－Ｄ２、Ａ－Ｄ３、及びＡ－Ｄ４）。培養を継続する場合もあり、試料採取をさらに繰り返して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日目、及びそれ以降の細胞組成物及び試料をさらに得ることができる。

【0253】

実施例２．子宮組織プロセシングプロトコルＢ（「プロトコルＢ」）
子宮組織試料は、ドナープログラムにより、ネコまたはイヌ等の哺乳動物から得た。子宮組織試料から脂肪組織を除去した。

【0254】

１．子宮体部及び子宮角組織を長軸に沿って開き、長軸に沿って細片に切断し、その細片を細かく切り刻み、およそ３ｍｍ×３ｍｍの組織片にする。

【0255】

２．細かく切り刻んだ組織を容器に移し、規定濃縮（ＤＥ１０）コラゲナーゼ（Ｖｉｔａｃｙｔｅ、＃０１１－１１１０、コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせ）解離試薬を添加し、３７℃で６０分間インキュベートして、組織を消化する。１０分ごとに容器をインキュベーターから取り出し、容器を４０回振って溶液を分散させ、容器をインキュベーターに戻す。

【0256】

３．インキュベーションステップの終了時点で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＧＩＢＣＯ ＤＭＥＭ組織培養液を添加することにより消化を停止する。

【0257】

４．追加の組織培養液を添加して、細胞懸濁液を希釈する。

【0258】

５．消化に使用した容器の内容物を、プロセシングした組織のグラム数に基づいて、適切な数のＴ－２２５培養フラスコに移す（例えば、Ｔ－２２５培養フラスコあたり０．１ｇの組織）。

【0259】

６．各フラスコに十分な量の組織培養液を添加し、ヒトＦＧＦ－２を最終濃度８ｎｇ／ｍＬに至るまで添加し（例えば、Ｔ－２２５フラスコ中の培養液４５ｍＬにおいて合計３６０ｎｇのＦＧＦ－２）、フラスコを３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内に置く。

【0260】

７．標準条件下でインキュベートして、１、２、３及び４の継代数または日数を通して、細胞を増殖させる。

【0261】

培養ステップ７の前に細胞調製物試料を採取し、凍結保存して（Ｂ－ＰＣＦ）、プロセシングプロトコルＢの終了時点で組成を評価した。

【0262】

本プロトコルを用いてプロセシングした組織から調製した試料は、未解離の組織小片を含有しているので、細胞を以下の様式で培養した：

【0263】

１．上記ステップ１のプロセシングからインキュベーション１日後（１日目、Ｄ１）、接着細胞を残しながら培養液を除去することにより、非接着細胞及び組織片を回収した。

【0264】

２．接着細胞を、当該技術分野で公知の標準プロトコルによってプラスチックから剥がし、凍結保存した（Ｂ－Ｄ１と呼ばれる試料）。

【0265】

３．回収した上清及び組織片を新しいフラスコに入れ、一晩インキュベートした。

【0266】

４．ステップ１～３を繰り返して、２、３、及び４日目に試料を生成した（それぞれ、Ｂ－Ｄ２、Ｂ－Ｄ３、及びＢ－Ｄ４）。

【0267】

別のフラスコを０日目に樹立し（ステップ７）、４日目に採取したが、それ以前の日に回収ステップを実施しなかった（Ｂ－Ｄ４－１）。ステップ１～３をさらに繰り返して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日目、及びそれ以降の細胞組成物及び試料をさらに得ることができる。

【0268】

実施例３．イヌ子宮組織を用いたプロトコルＡ及びプロトコルＢの評価
ドナーからイヌ子宮組織を得て、計量した。ドナー組織の半分をプロトコルＡに従ってプロセシングし、残りの半分はプロトコルＢに従ってプロセシングした。本実施例では、０日目のＰＣＦ（Ａ－ＰＣＦ及びＢ－ＰＣＦ）試料及び４日目の試料（Ａ－Ｄ４及びＢ－Ｄ４－１）のみを分析した。

【0269】

フローサイトメトリープロトコル（実施例３）
全ての細胞調製物を凍結保存バイアルから回収し、標準プロトコルを用いて、ＣＤ４４試薬及びＣＤ９０試薬で染色した。全ての調製物に生／死染色剤を添加した。

【0270】

細胞集団のインプットから始めて、膨潤細胞及びデブリを除いた細胞集団を、側方散乱に基づいて確定した。ここから「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｖｓ前方散乱」プロットを作成し、生細胞集団を確定した。ＣＤ４４及びＣＤ９０染色で生細胞集団を調べた。

【0271】

結果（実施例３）
試料のゲートを図１に示す。ゲートは、側方散乱に基づき、デブリ及び損傷細胞を除外するように設定した。Ｂ－Ｄ４－１パネルでは、２つの細胞集団が明示されたのに対し、Ａ－Ｄ４パネルでは、３つの細胞集団が明示され、３つ目の細胞集団は原点近くに存在した。

【0272】

生細胞／死細胞の分布を図２に示す。培養細胞の生存率はＰＣＦの生存率より低下した。これは、組織培養フラスコのプラスチックに接着しない細胞、または使用した培養液によって支持されなかった可能性がある細胞の集団死を反映している可能性がある。図２の等高線図でより容易に可視化される通り、両方法において、２つの異なる生細胞集団が存在した（すなわち、生細胞ゲートボックス内に２つの異なる等高線領域が存在する）。また、Ｄ４培養で得られた細胞のサイズ及び／または形状では、ＰＣＦ試料で明らかになったサイズ／形状分布と比較してシフトが生じた。これは、原点近くでよりタイトにクラスター化していたＰＣＴプロットにおける細胞分布に対する、Ｄ４プロットにおけるＸ軸に沿った右側へのシフトによって認められる。

【0273】

ＰＣＦ及びＤ４試料のＣＤ９０／ＣＤ４４染色の等高線プロットを図３に示す。右上の象現及び右下の象現の細胞パーセンテージは、両プロトコルとも、ＰＣＦでのレベルからＤ４でのレベルまで顕著に変化している。

【0274】

表２に示すように、上で概説したプロトコルで得られたＰＣＦ試料における生存細胞数は、プロトコルＡで５．１×１０^６、プロトコルＢで４．３×１０^６であった。培養４日後（Ｄ４試料）の細胞数は、プロトコルＡで０．４５×１０^６、プロトコルＢで５．３×１０^６であった。表２に示したパーセンテージは、Ａ－ＰＣＦ、Ｂ－ＰＣＦ、Ａ－Ｄ４、及びＢ－Ｄ４－１におけるＣＤ４４＋／ＣＤ９０＋及びＣＤ４４＋／ＣＤ９０－染色集団についての、未染色シグナル（自家蛍光による）を差し引いた後の値を反映している。しかしながら、Ａ－Ｄ４試料の自家蛍光シグナルは、これのコントロール細胞が不足していたため、推定した。

【表2】

【0275】

表３は、各プロトコルのＤ４時点とＰＣＦ時点とにおける、表示したＣＤマーカーが陽性である細胞パーセンテージの倍率変化量を示している。例えば、Ａ－ＰＣＦ試料に対してＡ－Ｄ４試料では、ＣＤ４４＋／ＣＤ９０＋細胞のパーセンテージが３．９倍高かった。１を超える倍率変化量は、培養の結果として、ＣＤマーカー陽性細胞が濃縮されたことを指し示す。

【0276】

表４は、ＰＣＦ及びＤ４試料の各プロセスにおいて、表示したＣＤマーカーセットに細胞が反応する頻度のパーセンテージを示している。例えば、Ａ－ＰＣＦ試料におけるＣＤ４４＋細胞のパーセンテージは、Ａ－ＰＣＦ試料におけるＣＤ４４＋／ＣＤ９０＋細胞のパーセンテージと比較して、５．５倍高い。

【表3】

【表4】

【0277】

結論（実施例３）
図１に示した細胞分布は、両プロトコル（プロトコルＡ及びプロトコルＢ）で得られたＰＣＦ試料で類似しているように見える。しかしながら、Ｂ－Ｄ４－１の等高線プロットでは、２つの細胞集団が支配的であるが、Ａ－Ｄ４の等高線プロットでは、それら２つの細胞集団に加えて、異なる細胞集団領域が原点近くにさらにあることが示されている。

【0278】

図２に見られるように、プロトコルＡ及びプロトコルＢの両方で作製されたＰＣＦ試料で認められる細胞では、散布図においてタイトなクラスタリングが示されている。しかしながら、両プロトコルでＤ４まで培養された細胞は、ｘ軸（前方散乱－Ａ）に沿って細胞がシフトしていることから明らかなように、形状及びサイズが変化している。こうした変化はおそらく、細胞が培養される際に受ける影響に起因するものであり、このことから、子宮組織を消化することで得たＰＣＦ試料に存在する細胞の形態からシフトが生じていることが指し示される。

【0279】

両プロトコルで得られた細胞は、図３に示すように、ＰＣＦ及びＤ４の両方に関して表面上類似したパターンでＣＤ９０及びＣＤ４４マーカーに反応した。

【0280】

表２に示したように、ＰＣＦ試料では、表示したＣＤマーカーのパーセンテージがプロトコルＢによって一層高くなった。

【0281】

表２に示したように、ＰＣＦ試料をＤ４まで培養することにより、表示したＣＤマーカーのパーセンテージがプロトコルＢによって一貫して高くならなかったことが明らかになった。実際、ＣＤ４４＋／ＣＤ９０－マーカー陽性細胞のパーセンテージは、プロトコルＡの方が高かった。

【0282】

概して、Ｄ４試料では、ＰＣＦ試料と比較して、表示したＣＤマーカーが陽性である細胞のパーセンテージが高かった。この結果は、プロトコルＡ及びプロトコルＢの両方に関し、Ｄ４において表示したＣＤマーカーが陽性である細胞のパーセンテージの、ＰＣＦに対する倍率増加として、表３に示している。

【0283】

本実施例で使用したＣＤマーカーセットは１つであった：ＣＤ４４／ＣＤ９０。両マーカーを共に発現する細胞（二重陽性－図３の右上象限）、または一方のマーカーのみを発現する細胞（単独陽性－図３の右下象限）のパーセンテージを表２に示した。各試料タイプについて、二重陽性細胞に対する単独陽性細胞のパーセンテージ変化量を表４に示す。例えば、Ａ－ＰＣＦにおける単独陽性細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ９０－）のパーセンテージは、二重陽性細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ９０＋）のパーセンテージと比較して５．５倍高い。

【0284】

Ａ－ＰＣＦ及びＢ－ＰＣＦでは、ＣＤ４４単独陽性細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ９０－）のパーセンテージが、二重陽性細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ９０＋）のパーセンテージと比較して高く、Ａ－Ｄ４及びＢ－Ｄ４－１における試料パーセンテージと比較して高かった（Ａ－ＰＣＦ ５．５倍対Ａ－Ｄ４ ４．２倍、Ｂ－ＰＣＦ ６．２倍対Ｂ－Ｄ４－１ ２．１倍）。さらに、Ａ－ＰＣＦ（５．５倍）とＡ－Ｄ４（４．２倍）とでは、ＣＤ４４単独陽性細胞レベルに１．３倍の差があり、Ｂ－ＰＣＦ（６．２倍）とＢ－Ｄ４－１（２．１倍）とでは、ＣＤ４４単独陽性細胞レベルに４．１倍の差があった。

【0285】

実施例４．イヌ子宮組織を用いたプロトコルＡ及びプロトコルＢのさらなる評価
ドナー（実施例３のドナーとは異なる）からイヌ子宮組織を得て、計量した。ドナー組織の半分をプロトコルＡに従ってプロセシングし、残りの半分はプロトコルＢに従ってプロセシングした。本実施例では、両プロトコルの０、１、２、３及び４日目の細胞（Ａ－ＰＣＦ、Ａ－Ｄ１、Ａ－Ｄ２、Ａ－Ｄ３、Ａ－Ｄ４及びＢ－ＰＣＦ、Ｂ－Ｄ１、Ｂ－Ｄ２、Ｂ－Ｄ３、Ｂ－Ｄ４）を分析した。

【0286】

フローサイトメトリープロトコル（実施例４）
全ての細胞調製物を凍結保存バイアルから回収し、標準プロトコルを用いて、ＣＤ４４及びＣＤ９０試薬で染色した。全ての調製物に生／死染色剤を添加した。

【0287】

細胞集団のインプットから始めて、膨潤細胞及びデブリを除いた細胞集団を、側方散乱に基づいて確定した。ここから「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｖｓ前方散乱」プロットを作成し、生細胞集団を確定した。ＣＤ４４及びＣＤ９０染色で生細胞集団を調べた。

【0288】

加えて、サイトケラチン及びビメンチンを検出するために細胞調製物の染色を実施した。これには別の細胞アリコートを必要とした。プロトコルには、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２４４０１）で細胞を固定し、続いて透過バッファーで細胞を処理し、その後、透過性細胞をサイトケラチンまたはビメンチンに特異的な適切な抗体とインキュベートすることを含めた。固定した細胞でＣＤ９０／ＣＤ４４も評価した。

【0289】

結果（実施例４）
細胞の収量が不十分であったため、一部の調製物は評価に使用できなかった。それらについては表中に「ＮＡ」と表示するか、または図中に直接記した。この概要では、使用可能な場合に、プロトコルＢのＰＣＦ及びＤ１～４試料、ならびにプロトコルＡのＡ－ＰＣＦまたはＡ－Ｄ４試料（固定／透過処理した調製物のみ）の結果に焦点を当てる。

【0290】

試料のゲートを図４に示す。ゲートは、Ａ－ＰＣＦ及びＢ－ＰＣＦプロットに示されているように、側方散乱に基づき、デブリ及び損傷細胞を除外するように設定した。Ａ－Ｄ３、Ａ－Ｄ４またはＢ－Ｄ４を評価するための試料は不十分であった。Ｂ－Ｄ３プロットには２つの主要な細胞集団のエビデンスがあるが、側方散乱レベルのより高い部分に非常に小さな集団がある。ドナー間のばらつきが、本実施例のドナー試料のプロセシングに由来するＢ－ＰＣＦ試料において、「第３の」非常に小さな集団を伴う２つの集団が存在することの原因であり得る。一方、実施例３のドナー試料では、Ｂ－Ｄ４－１について２つの集団のみが顕著に示された。

【0291】

生細胞／死細胞の分布を図５に示す。両プロトコルにおいて、２つの異なる生細胞集団が存在した（すなわち、生細胞ゲートボックス内に２つの異なる等高線領域が存在する）。また、Ｂ－Ｄ３試料で得られた細胞のサイズ及び／または形状では、Ｂ－ＰＣＦ試料で明らかになったサイズ／形状分布と比較してシフトが生じている。これは、左軸近くでよりタイトにクラスター化していたＢ－ＰＣＦにおける細胞分布に対する、Ｂ－Ｄ３プロットにおける前方散乱軸（ｘ軸）に沿った右側へのシフトによって認められる。Ａ－ＰＣＦ及びＢ－ＰＣＦ／Ｂ－Ｄ３で観察されたパターンは、先に実施例３で示したＬｉｖｅ／Ｄｅａｄの結果と同様である。

【0292】

Ａ－Ｄ４、Ｂ－ＰＣＦ、Ｂ－Ｄ１、Ｂ－Ｄ２、Ｂ－Ｄ３、及びＢ－Ｄ４試料のＣＤ９０／ＣＤ４４染色の等高線プロットを図６に示す。右上の象現及び右下の象現の細胞パーセンテージは、Ｂ－ＰＣＦでのレベルからＢ－Ｄ３及びＢ－Ｄ４でのレベルまで顕著に変化している。このパターンは、実施例３のプロトコルＢ試料で先に観察されたものである。

【0293】

図７に示したように、サイトケラチン／ビメンチン（Ｃ／Ｖ）染色は、Ａ－Ｄ４、Ｂ－ＰＣＦ、Ｂ－Ｄ１、Ｂ－Ｄ２、Ｂ－Ｄ３、及びＢ－Ｄ４試料で得られた。Ｃ／Ｖ染色を評価するために使用可能なＡ－ＰＣＦ細胞は十分ではなかった。

【0294】

表５に示すように、上で概説したプロトコルで得られた生存細胞数は、Ａ－ＰＣＦ及びＢ－ＰＣＦの両方で非常に少なかった。細胞数の少なさはＢ－Ｄ３でも示された。ＣＤ４４／ＣＤ９０セットのパーセンテージは、実施例３で観察された結果と類似しているが、同一ではない。

【表5】

【0295】

Ａ－ＰＣＦのみであるため（収率が悪いため）、表６は、Ｂ－ＰＣＦ及びＢ－Ｄ３に関する、表示したＣＤマーカーが陽性である細胞のパーセンテージにおける倍率変化量を示している。表７は、二重陽性マーカーレベルに対する単独陽性ＣＤマーカーレベルの倍率変化量を示している。

【表6】

【表7】

【0296】

サイトケラチン及びビメンチン（Ｃ／Ｖ）との反応性に関する、Ｂ－ＰＣＦ、－Ｄ１、－Ｄ２、－Ｄ３、及び－Ｄ４ならびにＡ－Ｄ４のフローサイトメトリー結果を、調製物中に存在する単独陽性Ｖ＋細胞（図７、右下象限）及び二重陽性Ｃ＋／Ｖ＋細胞（図７、右上象限）のパーセンテージについて表８に示す。単独陽性（Ｖ＋）細胞レベルと二重陽性（Ｃ＋／Ｖ＋）細胞レベルとの比率は、Ｂ－ＰＣＦの約４２倍からＢ－Ｄ４の１．０３倍まで変化した。Ａ－Ｄ４調製物にＣ＋／Ｖ＋細胞は若干存在するが、Ｃ＋／Ｖ＋細胞パーセンテージに対するＶ＋細胞パーセンテージの比率は８．５倍である。

【表8】

【0297】

結論（実施例４）
図４に示した細胞分布は、両プロトコルで得られたＰＣＦ試料で類似しているように見える。しかしながら、Ｂ－Ｄ３の等高線プロットは２つの細胞集団が支配的であり、Ｂ－Ｄ３の側方散乱値が高い部分に非常に小さな集団がある。Ａ－ＰＣＦとＡ－Ｄ３との比較はできない。

【0298】

図５に見られるように、両プロトコルで作製されたＰＣＦ試料で認められる細胞では、散布図においてタイトなクラスタリングが示されている。しかしながら、プロトコルＢでＤ３まで培養された細胞は、ｘ軸（前方散乱－Ａ）に沿って細胞がシフトしていることから明らかなように、形状及びサイズが変化している。こうした変化はおそらく、細胞が培養される際に受ける影響に起因するものであり、このことから、組織を消化することで得たＰＣＦに存在する細胞の形態からシフトが生じていることが指し示される。

【0299】

両プロトコルで得られた細胞は、図６（ＣＤ９０／ＣＤ４４）に示すように、両ＰＣＦ試料に関して表面上類似したパターンでＣＤ９０及びＣＤ４４マーカーに反応した。

【0300】

表５に示したように、実施例３の結果とは対照的に、プロトコルＡによりＰＣＦ試料では、プロトコルＢによるＰＣＦ試料の値と比較して、表示したＣＤマーカーのパーセンテージがより高くなった。これはおそらく、ドナー間のばらつきに起因するものである。

【0301】

表６に示したように、Ｂ－Ｄ３試料では、表示したＣＤマーカーが陽性である細胞のパーセンテージがＢ－ＰＣＦ試料と比較して高かったことを、倍率変化量の両結果が明らかにした。これは実施例３の結果と同様である。

【0302】

本実施例で使用したＣＤマーカーセットは１つであった：ＣＤ４４／ＣＤ９０。両マーカーを共に発現する細胞（二重陽性－図６の上部象限）、または一方のマーカーのみを発現する細胞（単独陽性－図６の右下象限）のパーセンテージを表５に示した。各試料タイプについて、二重陽性細胞に対する単独陽性細胞のパーセンテージ変化量を表７に示す。ＰＣＦの倍率シフトは、実施例３ではＤ４よりも高かったが、本実施例では逆であった。おそらく、ドナーのばらつきがパターンの違いの原因である。

【0303】

プロトコルＢでプロセシングしたＢ－ＰＣＦからＢ－Ｄ１、－Ｄ２、－Ｄ３、及び－Ｄ４までの物質について、サイトケラチン／ビメンチン（Ｃ／Ｖ）に対する反応性を図７に示す。Ｂ－ＰＣＦに存在する細胞のうち、Ｃ＋／Ｖ＋二重陽性細胞は低レベルであり（２．２４％、右上象限）、かなりの部分はビメンチンのみ陽性である（９３．１％、右下象限）。ビメンチン単独陽性細胞集団内において（右下象限）、２つの集団が存在し、一方の集団はＣ欠損／Ｖ＋であると考えることができるが、他方の集団はサイトケラチンに対して低シグナルを示す。だが、これも陰性として考えるものとする。Ｃ欠損／Ｖ＋集団が経時的に減少していることから、これらの細胞は生存不能であるか、または培養中に形質転換することが示唆され得る。また、Ｂ－ＰＣＦではサイトケラチンのみが陽性である細胞（左上象限）は実質的になく、このことはＢ－Ｄ４まで持続している。

【0304】

プロトコルＢの細胞パターンは、図７に示したように、培養中にシフトし、Ｃ＋／Ｖ＋細胞の出現レベルが増加して、Ｄ４ではＣ＋／Ｖ＋細胞のパーセンテージが、Ｖ＋のみである細胞と実質的に同一となる。この経過は、表８に示した比率で説明される。

【0305】

対照的に、図７に示したＡ－Ｄ４試料では、Ｃ＋／Ｖ＋細胞レベルよりもＶ＋細胞のみのレベルが優り、比率がおよそ８．５であるため、プロトコルＢ及びプロトコルＡでプロセシングした培養４日後の細胞間には、ビメンチン単独陽性及びサイトケラチン／ビメンチン二重陽性の細胞レベルに明らかな差がある。

【0306】

図７に示しているプロットのＢ－Ｄ１、－Ｄ２、－Ｄ３、－Ｄ４培養物は、組織及び細胞を０日目（Ｄ０）に播種したものであるため、本質的には、それぞれの日の培養物に存在する細胞の独立した一面を反映している。培養時間の経過と共にＣ＋／Ｖ＋細胞レベルが増加していることは、プロトコルＢの方法で提示された組織片から、サイトケラチン陽性の上皮系前駆細胞がさらに出現したことを反映している可能性がある。表８に示したように、Ａ－Ｄ４培養物においてＣ＋／Ｖ＋細胞は存在するが、Ｖ＋のみの細胞レベルと比較して比率にかなりの差がある。

【0307】

実施例５．ネコ子宮由来細胞組成物の特性評価
ドナーのネコ子宮組織をプロトコルＢに従ってプロセシングした。得られた細胞集団を少なくとも４継代増殖させた。当該技術分野で公知の標準手順に従って、これらの細胞を収集し、固定し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００緩衝液で１５分間透過処理した。ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗サイトケラチン－１８抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートした抗ビメンチン抗体を用いて、透過処理した細胞を染色した。図８は、これらの染色細胞のフローサイトメトリープロットを表しており、Ｃ＋／Ｖ＋二重陽性細胞（右上象限）、ならびにＶ＋のみの単独陽性細胞（左上象限）及びＣ＋のみの単独陽性細胞（右下象限）の存在を示している。図８に示したように、Ｃ＋／Ｖ＋細胞に対するＶ＋細胞の比率は０．７４である。

【0308】

第４継代におけるネコ子宮由来細胞集団には、立方体様細胞（すなわち、上皮系前駆細胞）及び紡錘体様細胞（すなわち、間葉系前駆細胞）が含まれる（図９Ａ）。第４継代におけるネコ子宮由来細胞を細胞培養スライド上で増殖させ、固定し、透過処理し、（１）抗ビメンチン－ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ（図９Ｂ）、（２）抗サイトケラチン－１８－ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ（図９Ｃ）、ならびに（３）抗サイトケラチン－１８－ＦＩＴＣ及び抗ビメンチン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（図９Ｄ）と共にインキュベートした。これらの画像は、プロトコルＢでプロセシングした場合の不均一性細胞集団の存在を強調している。

【0309】

実施例６．ネコ子宮由来再生細胞によるネコＣＫＤの処置
ネコにおける慢性腎疾患（ＣＫＤ）に対する処置として、同種ネコ子宮由来再生細胞（ＵＲＣ）の使用を検討した。ＣＫＤに関連する高窒素血症及び糸球体濾過値の低下を伴う、片側性に腎摘出されたネコの腎機能の改善における、ＵＲＣの有効性を評価した。本明細書で使用されるＵＲＣは、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＤ、または類似のプロトコルに従って製造された不均一性細胞組成物を含み、当該細胞組成物は、ビメンチンのみ単独陽性の細胞集団及びビメンチン／サイトケラチン二重陽性の細胞集団（例えば、間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団）の両方を含む。いくつかの実施形態において、ビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞に対するビメンチンのみ単独陽性の細胞の比率は、およそ５０％：５０％または約５０％：５０％であるが、この比率は、±２０％（例えば、約４０％：６０％もしくは約６０％：４０％またはその間の任意の比率）ほど逸脱し得る。

【0310】

試験デザイン
本試験では、組み入れ基準を満たしている、腎不全の腎摘出されたネコ１８頭（雌１５頭及び雄３頭）を用いた。全てのネコに、同種ネコ子宮由来再生細胞（「獣医学的治験製品」、「ＩＶＰ」）（３０百万（Ｍ）細胞）を、単回静脈内（ＩＶ）注入により、１分間に百万細胞（１ｍＬ／分）の速度で、最初の５分間は０．５ｍＬ／分の注入速度で投薬した。ＩＶＰは、全てのネコに２回投与した（０／１日目及び１４／１５日目）。上記のように、ＩＶＰは、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＤ、または類似のプロトコルに従って調製した不均一性細胞組成物を含み、本質的に、ビメンチンのみ単独陽性の細胞集団及びビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞集団で構成される。

【0311】

主な測定変数は、血漿クレアチニン及び糸球体濾過値（ＧＦＲ、イオヘキソールクリアランス試験による）とした。試験の経過中、少なくとも５０％のネコにおいて、血漿クレアチニンレベルが２０％減少したか、またはＧＦＲが２０％増加した場合、個々のネコにおいてＩＶＰが有効であるとみなすことにした。さらに、ＩＶＰを奏功させるためには、全ネコの少なくとも５０％で、クレアチニンの減少またはＧＦＲの増加のいずれかが有効であることを実証する必要があった。臨床病理パラメータを測定するために、－７、７、１３、２９、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目に、血液試料を採取した。ＧＦＲ測定のために採取した血液試料は、投与前、ならびに－５、１３及び２８日目のイオヘキソール投与２、３、及び４時間後、ならびに５７、９９、１２１、１５０及び１８２日目のイオヘキソール投与２、３、及び４時間後に得た。

【0312】

第２の変数には、尿比重及び総尿タンパク質の分析（－７、７、１４、２８、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目に採取した試料を分析）、ならびに水及び飼料の摂取量（１週間間隔で測定）を含めた。

【0313】

各ネコについて、ＩＶＰに起因し得る重篤な有害事象が認められなければ、ＩＶＰは安全であるとみなすことにした。加えて、当該製品は、罹患した動物の数及び発生した事象のカテゴリーの点から、有害事象の発生率が低く、ネコにおいて忍容性が良好でなければならない。

【0314】

結果（実施例６）
主要変数

【0315】

血漿クレアチニンの平均値は、ベースラインと比較して、２８日目のみ有意に減少した（Ｐ＝０．０２８３）。この日、４頭の動物において本パラメータの２０％の減少が観察された。１３、２８、５７、９９、１２１及び１８２日目のＧＦＲにおいては、ベースラインと比較して平均値が有意に増加した（１３日目から９９日目まで（１３日目及び９９日目を含む）はＰ＜０．０００１、１２１日目及び１８２日目はそれぞれ、Ｐ＝０．００２９及びＰ＝０．０２２５）。５０％超のネコで、１３、２８、５７及び９９日目に、ＧＦＲにおける２０％の増加が示された。

【0316】

第２の変数

【0317】

統計解析の結果、１４、４２、７０、８４、１１２、１２６、１４０及び１５４日目の食餌摂取量がベースラインと比較して有意に増加したことが示されている（Ｐ＜０．０５）。また、４２日目から１６８日目まで（４２日目及び１６８日目を含む）の水の摂取量もベースラインと比較して有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。尿分析の結果、ベースラインと比較して、尿比重は１３日目のみ有意に減少し（Ｐ＜０．０００１）、尿タンパク質は１８１日目のみ有意に増加し（Ｐ＝０．０２２１）、尿クレアチニンは７、１３、２８、５６、９７、１２０及び１８１日目に有意に減少し（Ｐ＜０．０５）、尿タンパク質／クレアチニン比は１２０、１４９及び１８１日目に有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。

【0318】

試験物の調製
試験物（任意の所与の日に投薬するのに十分な量）は、投薬日にドライシッパーから取り出した。試験物が入ったＣｅｌｌＳｅａｌ（登録商標）バイアルを、解凍されるまで、３７℃（±１℃）に維持した水浴中で３～５分間保持した。バイアルから細胞懸濁液（１０×１０^６細胞／ｍＬ）を取り出すために、３または５ｍＬシリンジ及び１８ゲージ注射針を用いた。十分な量の細胞を、０．９％生理食塩水中の３．３％トレハロースを十分な量で含有するシリンジに入れ、ｍＬあたり１×１０ ６ ＵＲＣにした。各ネコに投薬する直前に、６０ｍＬシリンジ内の調製した試験物懸濁液の所定量を、何度か反転させて混合し、次いでシリンジポンプに装填した。

【0319】

試験物投与
単回ＩＶ注入でＩＶＰをネコに投薬した。ＩＶＰの投薬は、０／１日目及び１４／１５日目に行った。

【0320】

シリンジポンプを用いたＩＶ注入を介して試験物を投与した。全てのネコには、１分あたりおよそ百万細胞（およそ１ｍＬ／分）の速度で、試験物（およそ３０Ｍ細胞）が投与された。注入における最初の５分間は、１／２の速度（すなわち、およそ０．５ｍＬ／分）で細胞を投与した。有害事象がなかったため、次いで、細胞を通常の速度（１ｍＬ／分）で注入した。

【0321】

臨床化学
各ネコから以下のスケジュールで血液を採取した：－７日目の馴化中に１回、ならびに７、１３、２９、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目。

【0322】

任意の所与の日に、絶食状態で採血を行った。血液は、適切なサイズの針及びシリンジを用いて、直接静脈穿刺により、頸静脈から採取した。およそ２ｍＬの血液を採取し、適切にラベリングした採血管に直ちに移した。

【0323】

使用した採血管には以下のものが含まれる：

【0324】

１ｘエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ－０．７ｍＬ）、

【0325】

１ｘヘパリンリチウム（１．３ｍＬ）、

【0326】

ＥＤＴＡ及びヘパリンリチウム管を、血液と抗凝固剤との適切な混合が確実になされるように、穏やかに反転させた。ヘパリンリチウム管を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、分析のために血漿を除去した。

【0327】

イオヘキソールを用いた糸球体濾過値の測定
糸球体濾過値を以下のスケジュールでイオヘキソールクリアランス試験を用いて測定した：馴化中に１回（－５日目）ならびに１３、２８、５７、９９、１２１、１５０及び１８２日目。

【0328】

ネコを、手順の少なくとも６時間前から絶食させた。３００ｍｇヨウ素／ｋｇ（ＯＭＮＩＰＡＱＵＥ（登録商標）、イオヘキソール注入、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｉｎｃ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の用量を、およそ１０秒かけてＩＶ注入を介して投与した。血液試料は、注入前、ならびに－５、１３及び２８日目のイオヘキソール投与２、３、及び４時間後（±２分）、ならびに５７、９９、１２１、１５０及び１８２日目のイオヘキソール投与２、３、及び４時間後（±２分）に得た。頸静脈穿刺により、およそ２．５ｍＬの血液を、１本の標準血清管に採取した。標準血清管を、少なくとも３０分間凝血させた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。血清を２つのほぼ等しいアリコートに分け、ラベリングした２本のマイクロチューブに移した。血清を、採取後９０分以内に凍結保存器内（≦－７０℃）に移した。イオヘキソールのクリアランスについて、検証済みのＩＣＰ／ＭＳアッセイを用いて試料を測定した。

【0329】

尿比重及びタンパク質／クレアチニン比
各ネコから以下のスケジュールで尿を採取した：－７日目の馴化中に１回、ならびに７、１４、２８、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目。

【0330】

およそ１ｍＬの尿を、フリーキャッチ／カテーテル挿入／膀胱穿刺のいずれかによって採取し、添加剤を含有しないチューブに移した。カテーテル挿入または膀胱穿刺のいずれかを用いて行った採尿のために、プロポフォールを用いてネコを鎮静させて、採尿可能にした。採尿してから３時間以内に、屈折計を用いて尿比重を測定した。比重測定後、タンパク質／クレアチニン比について試料を分析した。

【0331】

体重
各ネコの体重は、馴化中（－７日目）に１回、及び５日目に開始し４週間±１日ごとに、校正済みの体重計を用いて測定した。

【0332】

給餌プログラム及びスケジュール
標準的な市販のキャットフードを推奨率で、すなわち、試験－７日目から試験９日目までは、およそ３００ｇ／ネコ／日でネコに与え、試験１０日目から試験終了までは、およそ４００ｇ／ネコ／日で与えた。採血（臨床病理）日に関して、試料採取前日の夕方に給餌を中止した。

【0333】

以下の期間：－３～３日目、１０～１７日目、２４～３１日目、３８～４５日目、５２～５９日目、６６～７３日目、８０～８７日目、９４～１０１日目、１０８～１１５日目、１２２～１２９日目、１３６～１４３日目、１５０～１５７日目及び１６４～１７１日目の間、提供した食餌の量を計量及び記録した。前日から消費されなかった食餌の量を、各ネコの囲いから除き、計量及び記録した。食餌は、種及び齢級に対し、エネルギー、タンパク質、ビタミン、及びミネラルについて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌの最新の要件を満たしているか、または超えているものにした。

【0334】

水の供給及び給水プログラム
試験中は、ネコがステンレススチール製ボウルを介して水を自由に摂取できるようにした。以下の期間：－３～３日目、１０～１７日目、２４～３１日目、３８～４５日目、５２～５９日目、６６～７３日目、８０～８７日目、９４～１０１日目、１０８～１１５日目、１２２～１２９日目、１３６～１４３日目、１５０～１５７日目及び１６４～１７１日目の間、提供した水の量（毎日およそ３００ｍｌ）を計量及び記録した。前日から残っている水の量を、各ネコの囲いから除き、計量及び記録した。

【0335】

バイオマーカー分析のための血清採取
潜在的な血清バイオマーカー分析のために、各ネコから以下の通りに血液を採取した：－７日目の馴化中に１回、ならびに７、１３、２９、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目。潜在的な尿バイオマーカー分析のために、各ネコから以下の通りに尿を採取した：－７日目の馴化中に１回、ならびに７、１４、２８、５６、９７、１２０、１４９及び１８１日目。

【0336】

適切にサイズを設定した注射針及びシリンジを用いて、およそ２ｍＬの血液を採取し、適切にラベリングした血清分離用チューブ（ＳＳＴ）に移した。血清分離用チューブを、少なくとも３０分間凝血させた後、３０００ｒｐｍで１０分間、室温にて遠心分離にかけた。血清を、およそ１５０μＬのアリコートに分け、適切にラベリングした２本のポリプロピレンマイクロチューブに入れ、採取してから９０分以内に≦－７０℃で凍結させた。血清試料をバイオマーカーについて分析した。

【0337】

およそ１ｍＬの尿を、膀胱穿刺／カテーテル挿入またはフリーキャッチにより採取し、添加剤を含有しない冷却したチューブに移した。チューブには、試験番号、動物ＩＤ、日付、及び採取時点をラベリングした。チューブは、凍結保存器に移すまで、湿った氷上に置いた。試料を、採取してから９０分以内に≦－７０℃で凍結させた。尿試料が入手可能か予測できないため（すなわち、尿試料を採取するために膀胱を触診した）、可能な限り所望の時点に近い試料を採取するよう努めた。

【0338】

有効性の分析方法
有効性を決定するために、以下の主要転帰を分析した：

【0339】

１）試験経過中の血清クレアチニンレベルの低下。

【0340】

２）試験経過中のＧＦＲの増加。

【0341】

測定分析を繰り返して、線形混合モデルにより、試験中の各試料について、血清クレアチニンレベル及びＧＦＲの両方における、ベースラインと比較した平均相対変化量を推定した。加えて、ベースライン及び最終試料の両方と比較して、血清クレアチニン及びＧＦＲの平均変化量を算出した。

【0342】

体重変化に関する記述統計量を算出した。

【0343】

各ネコについて、試験経過中に血漿クレアチニンレベルが２０％低下した場合、ＩＶＰが有効であるとみなすことにした。成功基準では、５０％のネコがＩＶＰの有効性を示さなければならない。または

【0344】

各ネコについて、試験経過中にネコにおけるＧＦＲの２０％の増加が達成された場合、ＩＶＰが有効であるとみなすことにした。成功基準では、５０％のネコがＩＶＰの有効性を示さなければならない。

【0345】

各ネコについて、ＩＶＰに起因し得る重篤な有害事象が認められなければ、ＩＶＰは安全であるとみなすことにした。加えて、当該製品は、罹患した動物の数及び発生した事象のカテゴリーの点から、有害事象の発生率が低く、ネコに対して忍容可能でなければならない。

【0346】

結果及び考察（実施例６）
１８頭の動物が組み入れ基準を満たした。全ての手順（すなわち、投薬、一般健康状態観察、臨床観察、獣医学的検査、体重測定、食餌摂取量測定、水摂取量測定、血液試料採取及び採尿）は、指定の時点で実施した。

【0347】

血漿クレアチニンレベル

【0348】

統計解析の結果は、血漿クレアチニンが、ベースラインと比較して２８日目のみ有意に減少したことを示している（Ｐ＝０．０２８３）。この日、４頭の動物において本パラメータの２０％の減少が観察された。

【0349】

ＧＦＲレベル
統計解析の結果は、１３、２８、５７、９９、１２１及び１８２日目に、ＧＦＲがベースラインと比較して有意に増加したことを示している（１３日目から９９日目まで（１３日目及び９９日目を含む）はＰ＜０．０００１、１２１日目及び１８２日目はそれぞれ、Ｐ＝０．００２９及びＰ＝０．０２２５）。５０％超のネコで、１３、２８、５７及び９９日目に、ＧＦＲにおける２０％の増加が示された。個々の動物についてのイオヘキソールのクリアランス結果、平均値、及び統計量を図１０に示す。

【0350】

体重

【0351】

試験経過中（すなわち、－７日目から１６８日目まで）、９頭のネコで体重が増加し、３頭のネコで体重が維持され、５頭のネコで体重が減少した（体重減少の範囲は０．１ｋｇ～０．８ｋｇ）。１２０日目に死亡した動物は、－７日目から１１２日目まで体重が増加していた。統計解析により、試験中のどの時点においても、ベースラインと比較して体重に有意差（Ｐ＞０．０５）はなかったことが示された。個々の動物についての体重値、平均値、及び統計量を図１１に示す。

【0352】

食餌摂取量

【0353】

統計解析の結果、１４、４２、７０、８４、１１２、１２６、１４０及び１５４日目の食餌摂取量がベースラインと比較して有意に増加したことが示されている（Ｐ＜０．０５）。

【0354】

水摂取量

【0355】

統計解析の結果、４２日目から１６８日目まで（４２日目及び１６８日目を含む）の水の摂取量がベースラインと比較して有意に増加したことが示されている（Ｐ＜０．０５）。

【0356】

尿検査

【0357】

個々の動物についての尿検査の結果、平均値、及び統計量を図１２に示す。ベースラインと比較した統計解析の結果により、以下のことが示されている：

【0358】

１）尿比重は、１３日目のみ有意に減少した（Ｐ＜０．０００１）。

【0359】

２）尿タンパク質は、１８１日目のみ有意に増加した（Ｐ＝０．０２２１）。

【0360】

３）尿クレアチニンは、７、１３、２８、５６、９７、１２０及び１８１日目に有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。

【0361】

４）尿タンパク質／クレアチニン比は、１２０、１４９及び１８１日目に有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。

【0362】

結論（実施例６）
１３、２８、５７、及び９９日目に、腎摘出したネコの少なくとも５０％で、イオヘキソールクリアランスにおける２０％の増加が認められたため、糸球体濾過値に基づき、ＩＶＰ（同種ネコ子宮由来再生細胞）は、ネコの慢性腎疾患の治療薬として有効である。ＧＦＲの統計的改善が、１５０日目を除き、６ヶ月間の評価期間を通して認められた。

【0363】

血漿クレアチニンの結果に基づき、血漿クレアチニンの減少は、２８日目のみで認められた。この日、２２％のネコにおいて、本パラメータの２０％の減少が達成された。

【0364】

ＩＶＰは、試験中２週間の間隔で２回投与した３０Ｍ細胞の用量において、忍容性が良好であった。

【0365】

実施例７．イヌ子宮由来再生細胞によるイヌＣＫＤの処置
イヌ（イヌ科動物）のＣＫＤは、実施例６に開示したものと類似の様式で、イヌ子宮由来再生細胞を用いて処置され得ると想定される。

【0366】

ドナーのイヌ子宮組織を、プロトコルＢ、プロトコルＣ、または類似のプロトコルに従って調製して、ビメンチンのみ単独陽性の細胞集団及びビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞集団（例えば、間葉系前駆細胞集団及び上皮系前駆細胞集団）の両方を含む不均一性細胞集団を得る。いくつかの実施形態において、ビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞に対するビメンチンのみ単独陽性の細胞の比率は、およそ５０％：５０％または約５０％：５０％であるが、この比率は、８０％：２０％または２０％：８０％（Ｖ＋／Ｃ－：Ｖ＋／Ｃ＋）ほどに逸脱し得る。

【0367】

実施例６のように、ＣＫＤを有するイヌ対象を、少なくとも１回のＩＶ投与において、総数３０百万細胞の本不均一性細胞集団で処置することができる。しかしながら、この量は、イヌの大きさ及び体重に応じて、合計で百万、５百万、１０百万、２０百万、２５百万、３０百万、３１百万、３２百万、３３百万、３４百万、３５百万、３６百万、３７百万、３８百万、３９百万、４０百万、５０百万、６０百万、７０百万、８０百万、９０百万、または１００百万個の細胞、あるいは前述の量のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数の細胞等、最適化してもよい。不均一性細胞組成物の投与後、イヌ対象において、腎臓機能にプラスの効果が認められている。

【0368】

実施例８．自家または同種子宮由来再生細胞を用いたイヌまたはネコ疾患の処置
イヌまたはネコ患者は疾患を呈する。疾患は、特発性であり得るか、または自己免疫疾患もしくは加齢に関連し得る。この疾患は、慢性腎疾患、アトピー性皮膚炎、免疫介在性関節炎、肝炎、肝疾患、炎症性腸疾患、骨関節炎、椎体内疾患（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、膵臓炎、線維症、硬化症、アミロイドーシス、免疫介在性多発性関節炎、または創傷であり得る。子宮組織から調製し、ビメンチンのみ単独陽性の細胞集団及びビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞集団の両方を含む、自家または同種不均一性細胞組成物を、イヌまたはネコ患者に投与する。この不均一性細胞組成物は、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＤまたは類似のプロトコルに従って調製することができる。いくつかの実施形態では、この不均一性細胞組成物における、ビメンチン／サイトケラチン二重陽性細胞に対するビメンチンのみ単独陽性の細胞の比率は、およそ５０％：５０％または約５０％：５０％であるが、この比率は、８０％：２０％または２０％：８０％（Ｖ＋／Ｃ－：Ｖ＋／Ｃ＋）に逸脱し得る。不均一性細胞組成物は、静脈内に、または別の経腸経路もしくは非経口経路で投与することができる。

【0369】

アトピー性皮膚炎に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、不快感及びそう痒症状の軽減を経験する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ステロイド、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン、シクロスポリン、オクラシチニブ、ロキベトマブ、抗ヒスタミン薬、ヒドロキシジン、クロルフェニラミン、または局所軟膏剤及びシャンプー等、アトピー性皮膚炎用の別の治療薬と共に投与する。他の実施形態においては、例えば、他の治療薬はアトピー性皮膚炎の処置において有意な効果を有しないか、他の治療薬は持続期間が短く複数回の適用を必要とするか、または他の治療薬はイヌもしくはネコ患者に有害な副作用を引き起こすため、不均一性細胞組成物を別の治療薬の代わりに投与する。

【0370】

骨関節炎または他の免疫介在性関節炎に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、関節痛及び炎症の軽減を経験する。当該組成物は、全身性にまたは関節内に投与することができる。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、ステロイド、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、多血小板血漿（ＰＲＰ）、グルコサミン、ＰＳＧＡＧ、ヒアルロン酸、またはオピエート等、骨関節炎または他の免疫介在性関節炎用の別の治療薬と共に投与する。他の実施形態においては、例えば、他の治療薬は骨関節炎または他の免疫介在性関節炎の処置において有意な効果を有しないか、他の治療薬は持続期間が短く複数回の適用を必要とするか、または他の治療薬はイヌもしくはネコ患者に有害な副作用を引き起こすため、不均一性細胞組成物を別の治療薬の代わりに投与する。

【0371】

乾性角結膜炎に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、涙液産生の完全もしくは部分的な回復、及び／または涙腺、結膜、及び角膜の炎症の軽減を経験する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、人工涙液、コルチコステロイド、シクロスポリン、ピメクロリムス、またはタクロリムス等、乾性角結膜炎用の別の治療薬と共に投与する。他の実施形態においては、例えば、他の治療薬は乾性角結膜炎の処置において有意な効果を有しないか、他の治療薬は持続期間が短く複数回の適用を必要とするか、または他の治療薬はイヌもしくはネコ患者に有害な副作用を引き起こすため、不均一性細胞組成物を別の治療薬の代わりに投与する。

【0372】

創傷に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、創傷のより迅速な治癒、感染リスクの低減、及び／または創傷に起因する痛みもしくは不快感の軽減を経験する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、局所抗菌薬等、創傷治癒用の別の治療薬と共に投与する。他の実施形態においては、例えば、他の治療薬は創傷の処置において有意な効果を有しないか、他の治療薬は持続期間が短く複数回の適用を必要とするか、または他の治療薬はイヌもしくはネコ患者に有害な副作用を引き起こすため、不均一性細胞組成物を別の治療薬の代わりに投与する。

【0373】

肝炎及び他の肝疾患に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、肝臓の炎症及び瘢痕化の軽減、ならびに肝機能の改善を経験する。

【0374】

炎症性腸疾患に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、腸管炎症の軽減、食欲の増加、及び嘔吐の減少を経験する。

【0375】

椎間板疾患に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、脊椎の炎症及び痛みの軽減を経験する。

【0376】

膵臓炎に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、膵臓の炎症の軽減、食欲の増加、及び嘔吐の減少を経験する。

【0377】

線維症に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、肝臓、肺、心臓、腎臓、または他の臓器等、臓器の線維瘢痕化の減少を経験する。

【0378】

硬化症に関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、視力の改善及び白内障様症状の軽減を経験する。いくつかの実施形態において、不均一性細胞組成物は、眼内に投与する。

【0379】

アミロイドーシスに関して、イヌまたはネコ患者は、不均一性細胞組成物の投与後に、腎臓、肝臓、または心臓等、全身に及ぶアミロイド沈着物の減少を経験する。

【0380】

実施例９．自家子宮由来再生細胞
先行実施例は全て、自家細胞を用いて適用することができる。本明細書に由来する不均一性細胞組成物を得るために使用される子宮組織は、疾患を有し、当該不均一性細胞組成物を必要としているイヌもしくはネコ患者から得ることができるか、または当該イヌもしくはネコ患者に由来し得る。いくつかの実施形態において、子宮組織は、イヌまたはネコ患者が若いときに、当該患者から得る。いくつかの実施形態において、子宮組織は、通常１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月齢等の幼齢時に行われる避妊手術（卵巣子宮切除術または子宮摘出術）中に、イヌまたはネコ患者から得る。いくつかの実施形態においては、子宮組織を凍結保存する。例えば、子宮組織は、低温（すなわち、液体窒素温度）で凍結保存培地中に保存する。イヌまたはネコ患者が本明細書に記載される不均一性細胞組成物を必要とする場合、子宮組織を解凍し、本明細書に記載されるプロトコルまたは類似のプロトコルに従ってプロセシングして、不均一性細胞組成物を製造する。次いで、不均一性細胞組成物を、免疫関連の負の効果をほとんどまたは全く引き起こさない自家組成物として、イヌまたはネコ患者に投与することができる。いくつかの実施形態においては、子宮組織を本明細書に記載されるプロトコルまたは類似のプロトコルに従ってプロセシングし、得られた不均一性細胞組成物を凍結保存する。イヌまたはネコ患者が不均一性細胞組成物を必要とする場合、不均一性細胞組成物を解凍し、免疫関連の負の効果をほとんどまたは全く引き起こさない自家組成物として、イヌまたはネコ患者に投与する。任意選択で、１回の子宮組織の提供からイヌまたはネコ患者に自家組成物を２回以上投与することができるように、不均一性細胞組成物を細胞培養液において増殖させて、凍結保存用の多数の細胞を得る。

【0381】

実施例１０．イヌ及びネコ子宮組織の酵素消化及び培養プロセス（プロトコルＣ）を用いて調製した臨床用量
イヌ及びネコドナーの卵巣摘出術から得た子宮組織を、外科手術後２４時間以内にプロセシングした。卵巣摘出術において、子宮を、存在している他の組織から切離することにより単離した。子宮組織を２ｍｍ×２ｍｍの組織片に細かく切り刻み、コラゲナーゼ及びサーモリシン（両方ともＶｉｔａＣｙｔｅ，Ｉｎｃ．によるもの、子宮組織のグラムあたりコラゲナーゼ１３ｍｇ及びサーモリシン０．２ｍｇ）で消化した。消化は、４．５ｍＬのＤＰＢＳ中、３７℃で１時間、定期的に手動で振盪しながら行った。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（ＨＧ、高グルコース、ダルベッコ変法イーグル培地）培養液を加えて反応をクエンチした。遊離細胞及び外植組織片で構成される消化物を、Ｔ２２５フラスコ（０．１ｇ組織／フラスコ）に蒔き、３７℃、５％ ＣＯ_２、湿度１００％でインキュベートした。培養液に、８ｎｇ／ｍＬ組換えヒト線維芽細胞増殖因子－基礎活性タンパク質（ｒｈＦＧＦ－２、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）、６ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１０％ ＦＢＳを補充した。Ｔ２２５フラスコを３日目にプロセシングして、組織小片または外植組織片及び使用済み培地を除去し、新鮮な培養液を添加した。フラスコが７０～８０％コンフルエンスに達し次第、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）で処理することにより遊離させ、洗浄し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００でカウントし、１ｍＬの凍結保存培地（ＣＳ１０、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）において凍結保存した。クライオバイアル（ＣｅｌｌＳｅａｌ，Ｓｅｘｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＣｅｌｌＳｅａｌバイアル専用の冷却チャンバーに移し、－８０℃のフリーザーに一晩置いた後、バイアルを、モニター可能な液体窒素（ＬＮ_２）気相保存器に移した。各バイアルには５ｘ１０^６個の細胞を含有させた。これらのバイアルを第１継代（Ｐ１）と指定した。細胞培養は、Ｔ２２５フラスコにおける１０％ ＦＢＳ、６ｍＭ Ｌ－グルタミン、８ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含むＤＭＥＭ（ＨＧ）中で続け、細胞が７０～８０％コンフルエンス近くに達した際に継代した。各継代において、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ処理により遊離させ、洗浄、カウントし、適切な培養フラスコ内に４０００～１００００細胞／ｃｍ^２で再播種した。培養サイクルの終了時点（例えば、第４継代または第５継代）で、子宮組織由来再生細胞（ＵＲＣ）を、ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結保存し、－８０℃のフリーザーに一晩移し、液体窒素気相保存器内に置いた。

【0382】

実施例１１．培養物におけるネコ子宮組織由来接着細胞
ネコ子宮組織由来細胞は、１０％ ＦＢＳ及びＦＧＦ－２（８ｎｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ中で、プロトコルＣ（実施例１０）に従って培養した場合、図１３Ａ（ＩＤ：Ｓ－００１、第４継代）に表されるような接着細胞を示す。

【0383】

図１３Ａ（Ｓ－００１）には２種の細胞型が明白に存在していることから、紡錘形状細胞及び立方体形状細胞の両方が、第４継代まで持続的に増殖していることが示される。継代培養には、接着細胞を酵素剤（例えば、ＴｒｙｐＬＥ，Ｇｉｂｃｏ）で処理し、プラスチック容器に固着した接着細胞を遊離させることが必要となる。剥離した細胞は、新鮮な培養容器内に播種する。したがって、図１３Ａに表されている例では、細胞が４回剥離及び再播種されている。ネコＵＲＣ調製物は、適切な凍結保存培地（例えば、ＣＳ１０、またはＣＳ５ ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結保存した剥離細胞で構成される。

【0384】

実施例１２．培養物におけるイヌ子宮組織由来接着細胞
イヌ子宮組織由来細胞は、１０％ ＦＢＳ及びＦＧＦ－２（８ｎｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ中で、プロトコルＢに従って培養した場合、図１３Ｂ（Ｓ－００２、第４継代）に示されるような接着細胞を示す。紡錘形状細胞は、第４継代までの培養プロセスを通じて存在する。継代培養には、接着細胞を酵素剤（ＴｒｙｐＬＥ，Ｇｉｂｃｏ）で処理し、プラスチック容器に固着した接着細胞を遊離させることが必要となる。剥離した細胞は、新鮮な培養容器内に播種する。したがって、図１３Ｂに表されている例では、細胞が４回剥離及び再播種されている。イヌＵＲＣ調製物は、適切な凍結保存培地（例えば、ＣＳ１０、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結保存した剥離細胞で構成される。

【0385】

実施例１３．イヌ及びネコＵＲＣ調製物の三系統分化
プロトコルＢまたはプロトコルＣによるイヌ及びネコＵＲＣ調製物は、適切な誘導培地中で培養した場合、両方とも脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成細胞系列に分化した。表９に三系統分化条件を示す。

【表9】

【0386】

各ドナーＵＲＣ調製物を、誘導培地に対する反応としての三系統分化について評価し、コントロールとして培養液で維持した細胞と対にした。染色完了後、Ａｍｓｃｏｐｅ ＭＤカメラを取り付けた位相差顕微鏡でウェルを撮像した。イヌ及びネコの両方における三系統分化の具体的なアッセイ条件は以下の通りである：

【0387】

脂肪生成：脂肪細胞分化を経る前駆細胞は、当該細胞の細胞質に脂質を含有する液胞を生じさせるが、これは成体脂肪細胞が脂質を貯蔵する方法と同様である。培養してから１４日後に、脂肪細胞分化アッセイ用の６ウェルプレート上のウェルを、細胞内の脂質液胞形成のエビデンスについて調べた。２１日間の播種期間後にウェルを固定した。固定プロセスでは、細胞の細胞質内に形成される脂質含有液胞（液滴）に優先的に保持される、オイルレッドＯを染色剤として用いた。染色手順の間、３０秒を超えて細胞を乾燥させないことが重要である。細胞の細胞質内に赤く染色された脂質「液滴」または液胞がある場合、細胞が脂肪細胞分化を経ているとみなした。

【0388】

軟骨形成分化：細胞を濃縮させた液滴を６ウェルプレート内に播種し、誘導培地で３週間インキュベートした。軟骨形成分化を経た前駆細胞は、通常、コラーゲンを含む種々の細胞外タンパク質を含有する「ノジュール」で増殖した。細胞外マトリックスに存在するコラーゲンの染色にはアルシアンブルーを用いた。

【0389】

骨形成分化：細胞を６ウェルプレート内に播種し、一晩インキュベートした後、試験ウェルの培地を誘導培地に切り替えた。インキュベーションは３週間続けた。骨形成誘導培地に反応した細胞では、骨形成系列に沿って分化している細胞によって合成された、ミネラル化した細胞外マトリックスの広範囲にわたる沈着が示された。骨芽細胞から分泌されたミネラル化細胞外マトリックスに存在するカルシウムを、アリザリンレッドを用いて染色した。

【0390】

図１４Ａ～Ｃに表した各画像セットは、三系統分化を樹立するために誘導培地で処理した際のネコ及びイヌＵＲＣ調製物の両方における陽性反応を示している。

【0391】

実施例１４．イヌ及びネコＵＲＣ調製物の単色陽性頻度
ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０（イヌ及びネコ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ４４（イヌ及びネコ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１０５（ネコ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭＨＣＩＩ（イヌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（イヌ及びネコ、７－ＡＡＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に反応する市販の直接標識抗体で細胞を分析した。前もって最適化した試薬中で、細胞を暗所、氷上にて３０分間インキュベートしてから反応性を評価した。まず、全てのイベントをＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色で評価し、生存可能単一細胞のイベントのみを、表面反応性ＣＤマーカーパネルとの反応性について分析した。試料はＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで評価した。データはＦｌｏＪｏ（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。

【0392】

血縁関係のない複数のネコ及びイヌＵＲＣ調製物を、それぞれプロトコルＢ及びプロトコルＣを用いて調製し、イヌまたはネコ細胞との反応性が認められている様々なＣＤマーカー試薬との反応性について評価した。表１０はネコＵＲＣ調製物の単色陽性頻度を示し、表１１はイヌＵＲＣ調製物の単色陽性頻度を示している。

【表10】

【表11】

【0393】

表１０及び表１１に示したＣＤマーカープロファイルは、一般的に、前駆細胞をどのように特性評価するかという、従来のコンセンサスに基づいている。ある細胞が間質細胞とみなされるための第１要件は、その細胞が、プラスチック接着性であること、及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて軟骨形成、骨形成及び脂肪生成細胞系列に分化誘導され得ることである。さらに、培養されたヒト「間葉系幹細胞」（ＭＳＣ）のＣＤマーカー単一陽性頻度は、以下の通りである：１）ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対する陽性反応性（例えば、＞９５％）、ならびに２）特にＣＤ３４及びＣＤ４５に対する陰性反応性（例えば、＜２％）。また、ヒトＭＳＣに対しては、ＨＬＡ－ＤＲが「陰性」であるという要件もあり、これは、非ヒトＭＳＣに対してＭＨＣＩＩが陰性であることを意味することになる。

【0394】

図１３Ａ～Ｂに示したように、ネコ及びイヌＵＲＣは、接着細胞として直ちに増殖する。図１４Ａ～Ｃに示したように、ネコ及びイヌＵＲＣ両方の代表的ドナーでは、軟骨形成、骨形成、及び脂肪生成細胞系列に分化することが示されている。表１０及び表１１でわかるように、培養したネコ及びイヌＵＲＣは、ＣＤ３４及びＣＤ４５に対して明らかに陰性であり、イヌＵＲＣがＭＨＣＩＩ陰性であるエビデンスがいくつかある。ＣＤ４４は前駆細胞と関連している。しかしながら、ＣＤ４４が明らかに陽性である一方で、ＣＤ９０及びＣＤ１０５は、イヌ及び／またはネコＵＲＣにおいて陽性ではあるが、ＭＳＣとみなされる細胞として一般的に認められている＞９５％のレベルには達していない。したがって、本明細書に開示される子宮組織由来ＵＲＣは、古典的なヒト由来ＭＳＣには似ていない。それにも関わらず、本明細書に開示されるネコ及びイヌＵＲＣは、プラスチック接着性に増殖し、３種の成体細胞系列（脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成）に分化し、幹細胞／前駆細胞に関連する伝統的なＣＤマーカープロファイルを示すことから、イヌ及びネコにおける子宮組織由来の前駆細胞としてのステータスが支持される。

【0395】

以下の実施例において確立されるように、イヌ及びネコＵＲＣ調製物のさらなる特徴により、本明細書におけるＵＲＣ調製物が特有の前駆細胞であることがさらに指し示される。

【0396】

実施例１５．免疫蛍光法によるネコ子宮組織由来接着細胞におけるビメンチン及びサイトケラチン－１８の二重発現
図１３Ａに表されているように、ネコＵＲＣ調製物には、継続的な継代及び再播種サイクルにおいて、２種の明確な形状の細胞型が持続的に存在したが、ネコ子宮組織由来細胞培養物に存在する細胞の一部が、同じ細胞内で、上皮細胞だけでなく前駆細胞にも関連する細胞特性を示すことがわかったのは驚きであった。ビメンチンは、前駆型細胞とみなされる細胞と関連しており、一方、サイトケラチン－１８は、上皮様細胞であり、通常はビメンチンを発現すると予想されないはずの細胞と関連している。

【0397】

免疫蛍光法（ＩＦ）の技術を用いて、接着性ＵＲＣ培養物におけるビメンチン及びサイトケラチン－１８の存在または非存在を、染色及び可視化プロセスを通じて可視化した。細胞を、増殖培養容器から得るか、または凍結保存細胞バイアルから得て、専用の培養チャンバー（Ｌａｂ Ｔｅｃｈ ＩＩ ＣＣ２ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ）に播種し、３７℃／５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートした。１０％ ＦＢＳ及び８ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含むＤＭＥＭにおける一晩のインキュベート中に、細胞が容器表面に接着した。一晩培養した後、培養液を除去し、チャンバーをＰＢＳで洗浄して培養液を除去した。細胞を、室温で１５分間固定した後（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｍａｇｅ－ｉＴ Ｆｉｘａｔｉｖｅ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｆｉｘａｔｉｖｅ、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、固定液を除去し、チャンバーをＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。透過処理試薬（Ｉｍａｇｅ－ｉＴ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えて細胞を透過処理し、室温で１５分間インキュベートした。ビメンチン及びサイトケラチンはどちらも細胞内の細胞骨格タンパク質であるため、透過処理が必要である。透過処理溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、処理した細胞層をＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて一晩ブロッキングした。ブロッキングした細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７染色剤で標識した抗ビメンチン試薬（ａｂｃａｍ）及びＦＩＴＣで標識した抗サイトケラチン－１８試薬（ａｂｃａｍ）をチャンバーに添加した。これにより、ビメンチンが存在する場合は赤で染色された構造が得られ、サイトケラチン－１８が存在する場合は緑で染色された構造が得られる。染色後、チャンバー（複数可）をｅＶＯＳ装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で画像化した。プロトコルＣを用いた、血縁関係のない２つのネコ子宮組織由来調製物の染色パターンを、図１５Ａ～Ｃ及び図１６Ａ～Ｃに表す。

【0398】

図１５Ａ～Ｃ及び図１６Ａ～Ｃに示したネコＵＲＣ調製物の各画像セットにおいて、上段の画像（図１５Ａ及び図１６Ａ）では、ビメンチン陽性細胞が多数示されている。中段の画像（図１５Ｂ及び１６Ｂ）では、少数のサイトケラチン陽性細胞が示されている。下段のマージされた画像（図１５Ｃ及び１６Ｃ）では、ビメンチン及びサイトケラチンの両方が陽性である細胞が同定されている。全てのビメンチン陽性細胞がサイトケラチンも陽性であることはなく、また、全てのサイトケラチン陽性細胞がビメンチンも陽性であることはない。しかしながら、血縁関係のない複数のネコドナーＵＲＣ調製物に、二重に染色された細胞集団が予想外にも存在していることは明らかである。したがって、二重に染色された細胞は、前駆様細胞及び上皮様細胞の安定した培養物において持続的に存在する、上皮細胞様特性（サイトケラチン陽性）及び前駆細胞様特性（ビメンチン陽性）の両方を持つより少数の細胞集団を同定するものである。

【0399】

実施例１６．ＣＤマーカー陽性頻度の評価により、ビメンチン、サイトケラチン、ＣＤ４４、及びＣＤ３２６を複数発現する細胞の存在が実証される
表面マーカー検出アッセイにおいて、細胞をその単色陽性頻度について評価してきた（表１０及び表１１）。しかしながら、実施例１５で指し示したように、固定及び透過処理した細胞において、ビメンチン及びサイトケラチンを検出することが可能である。フローサイトメトリー解析のために、変更を加えた染色アッセイを実施した。その際には、ＣＤ４４及びＣＤ３２６試薬を細胞と共にインキュベートし、余分な試薬だけを洗い流した後、実施例１５に記載したように細胞を固定、透過処理及びブロッキングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｍａｇｅ－ｉＴ Ｆｉｘａｔｉｖｅ－Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、標識化抗ビメンチン（イヌ及びネコ、ａｂｃａｍ）及び抗サイトケラチン－１８（イヌ及びネコ、ａｂｃａｍ）試薬と反応させた。試料はＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで評価した。データはＦｌｏＪｏ（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。

【0400】

それぞれプロトコルＣ及びプロトコルＢを用いた、血縁関係のない複数のネコ及びイヌドナー子宮組織由来の培養細胞調製物に由来する細胞を、ＣＤ４４、ＣＤ３２６、ビメンチン及びサイトケラチン－１８の同時発現について、フローサイトメトリーアッセイで調べた。ＣＤ４４は前駆細胞マーカーであり、ＣＤ３２６は上皮細胞マーカーである。評価した３ドナーのネコＵＲＣ調製物のビメンチン／サイトケラチン及びＣＤ４４／ＣＤ３２６に対する二重染色陽性頻度を表１２に示す。表１３に示すように、ＣＤ４４／ＣＤ３２６、ＣＤ４４／サイトケラチン、ＣＤ４４／ビメンチン及びビメンチン／サイトケラチンの二重陽性頻度について、複数のイヌドナーＵＲＣ調製物を評価した。

【表12】

【表13】

【0401】

表１２に示したように、各ネコドナー細胞調製物では、ビメンチン／サイトケラチンまたはＣＤ４４／ＣＤ３２６の両方の組み合わせに関し、前駆細胞様特性または上皮細胞様特性を同時発現する細胞の予想外の存在が実証されている。

【0402】

イヌドナー子宮組織に由来する細胞培養物の評価において、表１３に示したように、いくつかのマーカーの組み合わせを二重に発現する細胞の存在について調査した。

【0403】

ＣＤマーカーペアの発現プロファイルはいずれも、前駆細胞様特性及び上皮細胞様特性の両方を同時に発現する細胞の同定を支持するものである。

【0404】

ドナー間のばらつきはあるが、表１２及び表１３における各ドナーＵＲＣ調製物では、イヌ及びネコＵＲＣ調製物に関し、同一細胞において、前駆細胞様マーカー（ビメンチン及びＣＤ４４）と上皮細胞様マーカー（ＣＤ３２６及びサイトケラチン－１８）との両方が予想外に存在することが示されている。表１３に示したように、イヌＵＲＣ調製物に関するＣＤ４４及びビメンチンの二重発現パーセンテージの高さから、イヌＵＲＣにおけるビメンチンマーカーは前駆様細胞と関連していることが示唆される。したがって、ビメンチン及びサイトケラチンの組み合わせ二重陽性細胞により、前駆細胞様特性及び上皮細胞様特性の両方を示す細胞集団がＵＲＣにおいて同定される。このことはさらに、実施例１５における、同一細胞でビメンチン及びサイトケラチンを同時発現するネコＵＲＣの存在により、個々の細胞が前駆細胞様特性及び上皮細胞様特性の両方を同時発現することが指し示される、という解釈を支持するものである。こうした所見を補強するように、ＣＤ４４及びＣＤ３２６の両方を発現するイヌ及びネコ両ＵＲＣ、ならびにＣＤ４４及びサイトケラチンを同時発現するイヌ細胞が、測定可能なパーセンテージで存在する。こうした試薬の組み合わせにより、前駆細胞様及び上皮細胞様の両方であるネコ及びイヌＵＲＣが検出される。

【0405】

ネコＵＲＣ及びイヌＵＲＣ培養物における、前駆細胞様マーカー及び上皮細胞様マーカーの両方を発現する細胞の存在により、高継代数まで培養可能であり、故に、治療目的としても興味深い、子宮組織由来の特有な前駆細胞型の実在が実証される。

【0406】

実施例１７．アトピー性皮膚炎におけるイヌドナー子宮組織由来臨床用量の転帰
臨床用量はイヌドナーＳ－０１１から得た。Ｓ－０１１の子宮組織は、組織を酵素で消化し、得られた消化物を培養するために、プロトコルＢに記載したようにプロセシングした。培養液中で細胞を増殖させ、第４継代で、ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に３６百万細胞／クライオバイアルで凍結保存した。細胞を解凍し、ＰＢＳで希釈した後、アトピー性皮膚炎を有する適格なイヌ患者に、用量をＩＶ注入により投与した。２回分の臨床用量を２週間の投薬間隔を設けて注入し、その後、各イヌ患者の臨床症状をモニターした。イヌ患者は、処置前と、間隔をおいて処置後に、Ｐｒｕｒｉｔｕｓ Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇ Ｓｃｏｒｅ（ＰＶＡＳ、そう痒症（かゆみ）の重症度の指標）、Ｃａｎｉｎｅ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｅｘｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ－４（ＣＡＤＥＳＩ－４）、及びＣａｎｉｎｅ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｌｅｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＡＤＬＩ）を含む、いくつかの臨床測定基準により評価した。有効な臨床データを表１４に示す。

【表14】

【0407】

処置した４頭のイヌ患者に関し、３種の測定基準の平均値が処置前のベースライン値と比較して減少したという、臨床測定基準の傾向から、アトピー性皮膚炎と確定診断されたイヌ患者を処置することの臨床上の有益性が実証された。臨床測定基準における減少から、患者の臨床状態の改善が示唆された。

【0408】

ＰＶＡＳは、患者におけるそう痒症の重症度を評価するための有効なスケールである。このスケールは、「健常のイヌ－かゆみの問題なし」から「極めて重度のかゆみ／ほとんど継続する（かゆみを物理的に抑制する必要がある）」まである。自宅で見られるかゆみレベルの観察に基づいて、同一の飼い主が、各試験訪問時にこの評価を行う。ＣＡＤＥＳＩ－４は、イヌの皮膚の状態を評価するための有効な評価ツールである。ＣＡＤＥＳＩ－４は、前足及び後足、脇腹、ならびに鼠径部エリア等のイヌの特定部位に焦点を当て、紅斑（発赤）、苔癬化（皮膚の肥厚及び擦創（皮膚外傷））及び／または脱毛症（脱毛）の重症度を測定するものである。この評価は、各試験訪問時に同一の獣医が行う。ＣＡＤＬＩは、イヌの皮膚の状態を評価するための有効な評価ツールである。ＣＡＤＬＩは、ＣＡＤＥＳＩ－４評価ツールに類似しており、技術的に若干の違いがあるだけで、類似した様式で機能する。ＣＡＤＬＩは、イヌの皮膚のより一般的なエリアに焦点を当てるが、やはり、色素沈着過度（皮膚の色素レベル）をさらに含む、同一の重症度基準を評価するものである。この評価もまた、各試験訪問時に同一の獣医が行う。

【0409】

実施例１８．イヌ及びネコＵＲＣのサイトカインプロファイル
サイトカインは、前駆細胞によって分泌される重要分子であり、組織内の成体細胞及び免疫細胞の両方を調節するための、よく知られたパラクリン機構を構成する。イヌＵＲＣ及びネコＵＲＣのサイトカインプロファイルを、これらの細胞調製物の培養上清で得た。特異性のため、イヌ及びネコ上清は、市販のアッセイにより個別に分析した。培養液中にバックグラウンドレベルのサイトカインがない場合、血縁関係のない２つのイヌＵＲＣ（Ｓ－０１６及びＳ－００２）は、ガレクチン－３（細胞間接着、マクロファージ活性化に関与）、ＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１は、単球、メモリーＴ細胞及び樹状細胞を炎症部位に引き寄せる）、ＩＧＦＢＰ－２（インスリン様増殖因子結合タンパク質は、幹細胞性の維持、細胞遊走［走化性］に関与する）、及びＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子－血管新生）を恒常的に分泌することが判明した。ネコドナー（Ｓ－００１）は、ＭＩＰ－１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ（組織における血管新生及び細胞増殖を支持する血小板由来増殖因子）及びＩＬ－１０（免疫細胞の炎症促進性応答を抑えるように作用するインターロイキン－１０）を分泌することが判明した。

【0410】

実施例１９．混合リンパ球反応ならびにＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベル
ドナー由来の単球の増殖を抑制する能力について、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて前駆細胞を評価した。アッセイは、刺激（通常はコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）といったマイトジェンによる）して増殖させた単離ドナー末梢血単球（ＰＢＭＣ）を使用し（コントロール条件）、同じ条件ではあるが前駆細胞調製物を含めた場合（試験条件）と比較することに基づくものであった。ＵＲＣを加えることによりＰＢＭＣ／Ｃｏｎ Ａ条件での増殖レベルが低下したことから、ＵＲＣ調製物が炎症促進性条件において免疫を調節することができるというエビデンスが示される。加えて、ＰＢＭＣ／Ｃｏｎ Ａ／ＵＲＣ反応物の上清を、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ活性（ＩＤＯ、トリプトファンに対するＩＤＯ作用の主要代謝産物であるキヌレニンのレベル評価）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２、市販のＥＬＩＳＡで測定）のレベルについて分析した。ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２はどちらも、Ｔ細胞による免疫応答を下方制御することで炎症を抑制するバイオマーカー／エフェクター分子として確認されている。

【0411】

表１５は、ネコＰＢＭＣ ＭＬＲアッセイで評価した場合のネコＵＲＣ製剤による増殖抑制を、上清で得られたＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベルと共に示している。表１６は、イヌＰＢＭＣ ＭＬＲアッセイで評価した場合のイヌＵＲＣ製剤による増殖抑制を、上清で得られたＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベルと共に示している。注：ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベルをドナーＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ値と比較して、倍率増加を決定した。

【表15】

【表16】

【0412】

イヌ及びネコＵＲＣ調製物の両方でＭＬＲにおける増殖下方制御が示されたことから、ＵＲＣが、幹細胞／前駆細胞に一般的に関連する重要な免疫調節特性を有することが示唆された。さらに、イヌ及びネコＵＲＣ調製物の両方でＩＤＯ及びＰＧＥ_２が生じた。これらは、活性化した免疫細胞に対する幹細胞／前駆細胞の免疫調節行為に関与することが知られている。

【0413】

実施例２０．血縁関係のないネコドナー子宮組織由来ＵＲＣのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖挙動の違い
いくつかの血縁関係のないネコドナー組織を、プロトコルＣ（実施例１０）で消化した。各消化物の同等の部分を分割し、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭまたはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭ配合物（両方とも１０％ ＦＢＳ及び８ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含有する）のいずれかで培養した。各培養調製物を同一の様式で処理し、細胞の継代は、培養フラスコ内で培養物がおよそ７０～８０％コンフルエンスを示した際に行った。

【0414】

培養物は、接着細胞を酵素剤で剥離し、細胞をカウントし、新鮮な培地を含む新しい培養フラスコに細胞を再播種することによって継代した。したがって、培養物においては、継代に向けて次に再播種するのに十分な細胞を得るために、培養間隔中に細胞数を増加させる必要があった。表１７に示すように、各ネコＵＲＣ調製物について、継代数単位で、増殖停止／分化（ＳＧ／Ｄ）または増殖（Ｇ）として培養状態を評価した。なお、表１７中の「ＮＡ」は、前の継代で増殖が停止または分化（すなわち、成体細胞に変換）し、したがって、目下の継代のために播種する細胞がなかった培養物を指す。「Ｌ」はＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭを指し、「Ｃ」はＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭを指す。

【表17】

【0415】

ネコＵＲＣ調製物のうちの２つ（Ｓ－００４及びＳ－００７）では、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて第３継代で増殖停止または分化（増殖したとしてもゆっくりとした成体細胞への分化）した。ネコＵＲＣ調製物のうちの２つ（Ｓ－００４及びＳ－０２３）では、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて第４継代で増殖停止または分化（増殖したとしてもゆっくりとした成体細胞への分化）した。１つのＵＲＣ調製物（Ｓ－００５）のみが、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて第４継代で増殖した。しかし、第５継代では増殖できなかった。したがって、ＵＲＣ調製物の５／６がＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて第５継代より前に増殖できなくなり、１／６だけが第５継代で播種されたが増殖できなかった。対照的に、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて増殖させたＵＲＣ調製物の４／６は、第５継代で播種され、かつ増殖した。ＵＲＣ調製物の残りの２／６は、増殖が停止したか、または成体細胞に分化し、第５継代で播種されなかった。

【0416】

表１７に見られるように、共通の消化物から並行して培養した６つの血縁関係のないネコドナーＵＲＣ調製物は、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおいては十分に増殖せず、ＵＲＣのうちの１つだけが第５継代で播種されたが増殖できなかった。対照的に、ＵＲＣのうちの４つは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭにおいて、分化することなく第５継代の終わりまでロバストに増殖し、２つのＵＲＣだけが第４継代で十分に増殖できなかった（または分化した）。

【0417】

Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭとＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭとの間の組成の違いを表１８に示す。

【表18】

【0418】

組成の違いによる影響：

【0419】

イノシトール：イノシトールは、神経伝達、及びステロイドホルモンの結合に関与する、重要なｉｎ ｖｉｖｏ補助因子である。イノシトールは、細胞膜の代謝に関与することが判明しており、グルコースレベルに影響される。細胞はイノシトールを合成できるため、外因性イノシトールの２．８％の差による影響は不明である。

【0420】

フェノールレッド：フェノールレッドはｐＨ指示薬として使用され、培養物の健全性及び代謝活性の指標として作用し得る。フェノールレッドは、弱いエストロゲン活性を有すると同定されており、酸化還元反応の標的となることができ、ＭＳＣの分化活性に影響を与えることが示されている。こうした影響はいずれも、子宮組織由来細胞用の培地の培養効率に直接の関わりをもたないように思われる。

【0421】

重量モル浸透圧濃度／一塩基性リン酸ナトリウム：一塩基性リン酸ナトリウムは、培養液の重量モル浸透圧濃度に寄与する無機塩の１つであり、培地の緩衝能の一部である。この化学種のレベルがＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）培地において１５％高いことによる影響は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭの例示的ロットにおける重量モル浸透圧濃度が、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭの重量モル浸透圧濃度の上限値であるという、より高い値であることに認められる可能性がある。

【0422】

グルタミン：グルタミンは、タンパク質合成に必要とされる重要なアミノ酸である。Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭは、グルタミンを欠いている。しかしながら、完全培地が必要な場合はいつでも、グルタミンがサプリメントとして基本培地に添加された。グルタミンのレベルは、５．５ｍＭに達するように調整した。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）培地には、４ｍＭのグルタミンが含有されており、これは、グルタミンが補充されているＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおけるレベルのおよそ７３％である。

【0423】

全体として、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭで培養したＵＲＣ調製物では、相対的にかなり不十分であったＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭにおける増殖と比較して、第５継代の終わりまでロバストに増殖したことが示された。表１８に示したように、２種の培地間の差は限定的であるが、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭでは、グルタミンが２７％も大幅に低い。ある理論または機序に束縛されるものではないが、グルタミンのレベルが低いと、接着細胞が成体細胞に分化するのに好ましくない環境が創出される可能性がある。

【0424】

実施例２１．酵素消化によって得られた細胞の増殖に対するネコ子宮組織のデコンタミネーション処理の影響。
子宮組織は、無菌での卵巣摘出術中にイヌ及びネコから得られるが、微生物コンタミネーションのリスクが残る。したがって、臨床用量を創出するための代替プロトコルを評価した（プロトコルＤ）。プロトコルＤは、子宮組織を酵素消化した後に培養液中に入れる細胞の微生物コンタミネーションの可能性を最小化するプロトコルの１つであり、最初にデコンタミネーションステップを行った後、さらなるプロセスを必要とするものである。プロトコルＤのさらなる態様を表２０に記載する。プロトコルＤのデコンタミネーションステップでは、１％（ポリ）ビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液及び０．１％チオ硫酸ナトリウム溶液を使用し、続いてＰＢＳでリンスする。プロトコルＤのデコンタミネーション条件とは異なるものとして、子宮組織をＰＢＳで４回洗浄しリンスすることが含まれる条件も評価した。２つのデコンタミネーション方法の評価は、３頭のネコから卵巣摘出術により組織を採取し、非子宮組織を切離し、次いで、各ドナーの子宮組織を２等分することによって行った。その一方を以下のようにプロセシングした：

【0425】

１．子宮組織を、１０ｍＬのＰＢＳを含有する５０ｍＬのコニカルチューブに入れ、穏やかに混合して組織をＰＢＳに曝す。

【0426】

２．組織を移すために使用する鉗子を、７０％イソプロピルアルコールを用いて拭くことにより洗浄する。

【0427】

３．子宮組織を、第１のＰＢＳチューブから、１０ｍＬのＰＢＳを含有する第２の５０ｍＬコニカルチューブに移し、穏やかに混合して組織をＰＢＳに曝す。

【0428】

４．１％ ＰＶＰを５ｍＬ含有する５０ｍＬコニカルチューブに子宮組織を移す。穏やかに混合し、インキュベーションを２分間継続させる。

【0429】

５．ＰＶＰ溶液中で２分間インキュベーションし終えた後、ＰＶＰコニカルチューブから組織を取り出し、０．１％チオ硫酸ナトリウムを５ｍＬ含有する５０ｍＬコニカルチューブに子宮組織を入れる。子宮組織を０．１％チオ硫酸ナトリウム溶液中で１分間インキュベートさせておく。

【0430】

６．チオ硫酸ナトリウム溶液中で１分間インキュベーションし終えた後、チオ硫酸ナトリウムコニカルチューブから組織を取り出し、ＰＢＳを１０ｍＬ含有する５０ｍＬコニカルチューブに子宮組織を入れる。チューブを穏やかに混合して組織をＰＢＳに曝す。

【0431】

７．子宮組織をＰＢＳチューブから、ＰＢＳを１０ｍＬ含む別の５０ｍＬコニカルチューブに移す。チューブを穏やかに混合して組織をＰＢＳに曝す。

【0432】

子宮組織の他方は、それぞれＰＢＳを１０ｍＬ含有する４本の別々の５０ｍＬコニカルチューブに組織を入れることによってデコンタミネーションした。

【0433】

各組織片を細かく切り刻み、同一条件（コラゲナーゼ及びサーモリシン、１０分間隔でチューブを手動で振り混ぜながら３０分消化）で消化した。消化物をフラスコに入れ、完全培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、１０％ ＦＢＳ及び８ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２、０．４４μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ及び０．０５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン含有）中、３７℃／５％ ＣＯ_２／１００％湿度でインキュベートした。培養物をコンタミネーションについて毎日検査し、４日目に回収し、各ドナーの各デコンタミネーション処理に対する総細胞数を求めた。ＰＢＳでデコンタミネーションした組織の培養物に対する細胞収率を、各ドナーのＰＶＰ／チオ硫酸塩デコンタミネーション組織による培養物の対応する細胞収率で除算し、１００を乗じて、表１９に示したように、各ドナーのＰＶＰ／チオ硫酸塩（コントロール）処理細胞培養物と比較したＰＢＳ処理細胞培養物の％増殖値（細胞数）を得た。

【表19】

【0434】

いずれの条件でも、３つのドナー組織の培養物においてコンタミネーションは認められなかったが、ＰＢＳを使用した方が４日間の培養で平均細胞収率が大幅に増加した。現行のプロトコルＣでは、臨床用量を創出するための酵素消化プロセスの際、子宮組織をデコンタミネーションする手段としてＰＢＳを使用している。

【0435】

実施例２２．プロトコルＣとプロトコルＤの比較
プロトコルＣとプロトコルＤを区別する相違点がさらにいくつかある。その違いを表２０に列挙する。

【表20-1】

【表20-2】

【0436】

プロトコルＣとプロトコルＤとの間には、いくらかの重要な違いがある。

【0437】

１．組織プロセシング：

【0438】

Ａ）プロトコルＣでは、組織に害を与えないＰＢＳをデコンタミネーションに用いるのに対して、プロトコルＤにおける組織のデコンタミネーションでは、組織を強烈な化学物質に曝す。プロトコルＤのデコンタミネーション溶液は、組織細胞への影響に起因して、第１の培養間隔における細胞収率を減少させることが示されている。

【0439】

Ｂ）組織を消化する時間は、プロトコルＤでは３０分にすぎないのに対し、プロトコルＣでは６０分である。消化時間を長くすることにより、３０分にすぎない消化時間で生じた対応する組織消化物（７０～８０％コンフルエンスに達するまで５日を要した）と比較して、７０～８０％コンフルエンスにより早く達することができる（３日間）、消化物中の細胞組成物が得られることが示されている。

【0440】

２．消化物及び細胞の培養：

【0441】

Ａ）プロトコルＣでは、細胞及び外植組織片を３日目までそのまま培養液中に残しておくのに対し、プロトコルＤでは、１日目に培養液及び組織片を取り出し、その組織片を新鮮な培地と共に培養フラスコ内に戻す。どちらのプロトコルでも３日目に培養液を交換する。培養液を１日目に除去することの影響を評価するのは難しいが、明らかに、組織から拡散した生体分子、または細胞が周囲の液中に分泌した生体分子は、いずれもプロトコルＤでは失われるはずである。上の重要な相違点の項目１Ｂに示した実験結果から、３０分間消化した組織片では、６０分間消化した組織片と比較して、コンフルエンスに達するまでにおよそ２日長くかかったことが認められた。消化酵素への曝露を長くすると、インキュベーション時間が短い場合と比べて、組織マトリックスの破壊がより多く生じ、それによって、細胞及び生体分子が、組織マトリックスからより容易に離れ、培養液環境に入ることができ、その結果、コンフルエンスに達するまでの時間がより早くなる原因が生じた可能性がある。

【0442】

Ｂ）別の重大な違いであり得るのは、プロトコルＤの培養液にアムホテリシンＢ及びゲンタマイシンを使用していることである。これらの抗生物質はどちらも細胞に対して強烈なものであることが知られている。例えば、アムホテリシンＢは、培養中の細胞の生存率を低下させると報告されている。ペニシリン及びストレプトマイシンも培養中の細胞の生存率を一過性に低下させる。このタイプの挙動は、アムホテリシンＢ、及び他の抗生物質が、何らかの様式で細胞に負の影響を及ぼしている可能性を示唆している。したがって、プロトコルＣではアムホテリシンＢまたはゲンタマイシンを使用していないため、プロトコルＣの培養環境では生じない方法で、アムホテリシンＢ及びゲンタマイシンを含有するプロトコルＤの培養環境が培養細胞に影響を与えている可能性がある。

【0443】

Ｃ）プロトコルＣでは細胞の培養にＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭを用い、プロトコルＤではＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭを用いる。これら２種のＤＭＥＭ配合物における組成の違いを表１８に示す。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭのグルタミンレベルは、Ｌｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭのグルタミンレベルと比較しておよそ２７％低く、このことは、６つの血縁関係のないネコドナーＵＲＣ調製物の培養反応（表１７）で指し示されるように、プロトコルＤの培養液では、第５継代に達した調製物が６つのうち１つにすぎなかったことに対して、プロトコルＣで使用した培養液で増殖させた場合、第５継代に達したドナー調製物の数がより多いこと（６つのうちｎ＝４）を説明し得る。

【0444】

３．臨床用量を創出するための細胞増殖：

【0445】

Ａ）表２０に示したように、臨床用量を得るためのプロトコルＤで使用する製造プロセスでは、凍結保存細胞のマスターセルバンク（ＭＣＢ）ステージを生成させた後、４回の培養間隔が必要とされる。凍結保存細胞のＭＣＢステージを生成させた後、３回の培養間隔を採用する。プロトコルＤのＬｏｎｚａ（登録商標）ＤＭＥＭ配合物で増殖させたＵＲＣの不十分な増殖パターンを明らかにした、表１７に示しているデータを鑑みて、プロトコルＣにおいては、そのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭ配合物の優れた増殖パターンであれば、有用な用量が得られる可能性がより高い。

【0446】

Ｂ）臨床用量を凍結保存する前の細胞増殖に使用する技術における、大きな違いを表２０に示している。プロトコルＤは、スピナーフラスコ技術と呼ばれる、インペラーで浮遊状態に保たれるマイクロキャリア粒子の使用に依拠するものであった。細胞はマイクロキャリア粒子に接着し、培養間隔中、インペラーの回転によって浮遊し続ける。バイオリアクターは、スピナーフラスコ技術よりはるかに大規模な例であるが、ＣＯ_２及び酸素を能動的にモニターすることによって、気相の組成を非常に高度に制御するものである（必要に応じて窒素を導入することができる）。プロトコルＣは、臨床用量を創出するための細胞増殖に、スピナーフラスコまたはインペラーベースのバイオリアクター技術を用いないが、その代わりに、インペラーベースのバイオリアクターで生じる剪断力によって悪影響を受ける可能性がある細胞型に対して特別に設計された、特殊な高密度マルチプレートバイオリアクター技術に依拠する。プロトコルＣでは、剪断を誘発するインペラーベースのバイオリアクター環境を避け、静置培養を採用することで、ＵＲＣ調製物がより安定して増殖する。

【0447】

４．凍結保存製剤：

【0448】

Ａ）プロトコルＤでは、ＵＲＣ調製物の臨床用量を創出する過程で２種の配合物を使用する。第１の凍結保護配合物については、１０％ ＦＢＳを含有する培養液の使用を基礎とし、これをＤＭＳＯと混合して、最終的に１０％ ＤＭＳＯ／５％ ＦＢＳを含有する凍結保護物質を得た。この配合物は、臨床用量を生成させる前のあらゆる培養細胞の凍結保存に使用した。プロトコルＤの臨床用量は、２％ ＤＭＳＯ（最終）及び０．９％生理食塩水中の６％ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である市販の調製物（ＨＥＳＰＡＮ，Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）で構成される溶液中で凍結保存した。

【0449】

Ｂ）プロトコルＣでは、臨床用量を含む全ての細胞の凍結保存に、ＣＳ１０と呼ばれる市販の凍結保護物質（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用する。

【0450】

まとめると、イヌ及びネコＵＲＣの臨床用量についてのより最適な培養物及び収率を得るために開発されたプロトコルＣと、プロトコルＤとを比較すると、かなりの違いがある。その違いには、消化時間、培養液の抗生物質、培養液成分の組成（例えば、グルタミンレベル）、及び臨床用量を創出するための細胞増殖に使用されるバイオリアクター技術が含まれる。表１７に示したように、プロトコルＣのプロセシング及び培養アプローチでは、プロトコルＤのアプローチによる成績と比較して、より多くのドナー組織が臨床用量までプロセシングされ得ることが明らかである。

【0451】

実施例２３．ＵＲＣの投与
ＵＲＣ用量は、クリニックでの解凍を必要とする凍結保存用量として、またはクリニック到着時には患者に投与する用意ができている解凍済み用量として提供する。凍結保存用量をクリニックに提供する場合、凍結保存用量は、それを－１２０℃未満の温度に維持する適切な温度制御容器で出荷する。解凍済み用量をクリニックに提供する場合、解凍済み用量は、１℃～８℃の温度を維持する適切な温度制御容器で出荷する。ＵＲＣ凍結保存用量は、ＵＲＣを適切な凍結保護物質（例えば、ＣＳ１０、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結保存し、無菌の低温安定バイアル（例えば、ＣｅｌｌＳｅａｌ ｖｉａｌ，Ｓｅｘｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に収容する。ＵＲＣ解凍済み用量は、無菌シリンジ、またはヘッドスペースもしくは空隙のない同様の密閉された無菌容器に収容する。ＵＲＣ解凍済み用量は出荷前に解凍し、ＰＢＳ、乳酸リンゲル液、標準生理食塩水といった親和性のある液体、または生存可能な有核細胞の維持に適合する他の液体中に懸濁させる。

【0452】

ＵＲＣ凍結保存用量は、乾熱（例えば、加熱パッド）もしくは制御した乾熱を適用するように設計された機器（ＺｉｐＴｈａｗ，ＦｒｅＭｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または３７℃の水浴の使用、あるいは氷が見えなくなるまで室温で放置することを含む、いくつかの手段のうちの１つによって解凍する。ＵＲＣ凍結保存用量は、クライオバイアルから取り出し、シリンジ等の患者への投与に適切な容器に入れる。シリンジには、クライオバイアルのＵＲＣを装填する前に、ＰＢＳ、乳酸リンゲル液、標準生理食塩水、または生存可能な有核細胞の維持に適合する他の液体等の適切な希釈液をあらかじめ充填することができる。ＵＲＣは、希釈していない状態で、または患者に投与する前に、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈してから患者に投与することができる。ＵＲＣ解凍済み用量は、通常、クリニックに出荷する前に、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、または少なくとも１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、もしくは１０ｘに希釈する。ＵＲＣは、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、髄腔内（ＩＴ）、実質内（ＩＰ）、病巣内、局所（皮膚創傷）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、及び筋肉内（ＩＭ）注射を含む、種々の経路を介して投与することができる。シリンジ、注射針、カニューレ付きＩＶセット、エクステンションセット、Ｔコネクタセット及び他のコンポーネントを含む、専用の医療用コンポーネントを、言及した経路でＵＲＣを投与するために利用してもよい。ＵＲＣの投与は、手動で行うか、またはシリンジポンプを使用して投薬することができる。

【0453】

標的とする病理及び患者の状態は、ＵＲＣの投与方法に影響を及ぼし、注射回数、注射間隔、注射のための単一ルートの使用または混合ルートセットの使用、及び注射されるＵＲＣの数に影響を及ぼす可能性がある。ＵＲＣ用量には、通常、最小２０百万細胞から最大４０百万細胞までが含有されることになり、用量あたりの好ましい細胞数は、３０百万細胞～３６百万細胞である。

【0454】

実施例２４：アトピー性皮膚炎におけるイヌドナー子宮組織由来臨床用量の転帰
臨床用量はイヌドナーＳ－０１１から得た。組織を酵素で消化し、培養する消化物を得るために、Ｓ－０１１の子宮組織をプロトコルＢに示したようにプロセシングした。培養液中で細胞を増殖させ、第４継代で、ＣＳ５中に３６百万細胞／クライオバイアルで凍結保存した。細胞を解凍し、ＰＢＳで希釈した後、アトピー性皮膚炎を有する適格なイヌ患者に、用量をＩＶ注入で投与した。２回分の臨床用量を２週間の投薬間隔を設けて注入し、その後、各イヌ患者の臨床症状をモニターした。７頭のイヌ患者は、処置前と、間隔をおいて処置後に、Ｐｒｕｒｉｔｕｓ Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇ Ｓｃｏｒｅ（ＰＶＡＳ、そう痒症（かゆみ）の重症度の指標）、Ｃａｎｉｎｅ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｅｘｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ－４（ＣＡＤＥＳＩ－４）、及びＣａｎｉｎｅ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｌｅｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＡＤＬＩ）を含む、いくつかの臨床測定基準で評価した。有効な臨床データを表２１に示す。

【表21】

【0455】

処置した７頭のイヌ患者に関し、３種の測定基準の平均値が処置前のベースライン値と比較して減少するという、臨床測定基準の傾向から、アトピー性皮膚炎と確定診断されたイヌ患者を処置することの臨床上の有益性が実証される。臨床測定基準における減少から、患者の臨床状態の改善が示唆される。６頭の患者のうち５頭では、処置前からＤ９０評価までに、評価した３種の測定基準に関し大幅な改善が明らかに示された。

【0456】

ＰＶＡＳは、患者におけるそう痒症の重症度を評価するための有効なスケールである。このスケールは、「健常のイヌ－かゆみの問題なし」から「極めて重度のかゆみ／ほとんど継続する（かゆみを物理的に抑制する必要がある）」まである。自宅で見られるかゆみレベルの観察に基づいて、同一の飼い主が、各試験訪問時にこの評価を行う。

【0457】

ＣＡＤＥＳＩ－４は、イヌの皮膚の状態を評価するための有効な評価ツールである。ＣＡＤＥＳＩ－４は、前足及び後足、脇腹、ならびに鼠径部エリア等のイヌの特定部位に焦点を当て、紅斑（発赤）、苔癬化（皮膚の肥厚及び擦創（皮膚外傷））及び／または脱毛症（脱毛）の重症度を測定するものである。この評価は、各試験訪問時に同一の獣医が行う。ＣＡＤＬＩは、イヌの皮膚の状態を評価するための有効な評価ツールである。ＣＡＤＬＩは、ＣＡＤＥＳＩ－４評価ツールに類似しており、技術的に若干の違いがあるだけで、類似した様式で機能する。ＣＡＤＬＩは、イヌの皮膚のより一般的なエリアに焦点を当てるが、やはり、色素沈着過度（皮膚の色素レベル）をさらに含む、同一の重症度基準を評価するものである。この評価もまた、各試験訪問時に同一の獣医が行う。

【0458】

実施例２５：骨関節炎におけるイヌドナー子宮組織由来臨床用量の転帰
臨床用量はイヌドナーＳ－０１１から得た。組織を酵素で消化し、培養する消化物を得るために、Ｓ－０１１の子宮組織をプロトコルＢに示したようにプロセシングした。培養液中で細胞を増殖させ、第４継代で、ＣＳ５中に３６百万細胞／クライオバイアルで凍結保存した。細胞を解凍し、ＰＢＳで希釈した後、自然に生じた骨関節炎を有する適格なイヌ患者に、用量をＩＶ注入で投与した。２回分の臨床用量を２週間の投薬間隔を設けて注入し、その後、各イヌ患者の臨床症状をモニターした。Ｄ３０で６頭の患者を評価した。患者の転帰Ｃａｎｉｎｅ Ｂｒｉｅｆ Ｐａｉｎ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＣＢＰＩ）及びＣｌｉｅｎｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ（ＣＳＯＭ）は、獣医による跛行評価と共に、飼い主が各クリニック訪問時に評価した。処置前及びＤ３０のデータ値を表２２に示す。

【表22】

【0459】

飼い主による１２の評価のうち１１で、Ｄ３０におけるペットの状態が飼い主による評価で改善とされた。この改善は、ＣＢＰＩ及びＣＳＯＭの平均値にも示されており、Ｄ３０の平均値は、ＣＢＰＩ及びＣＳＯＭの両方で処置前群の平均値を十分に下回っている。担当獣医は、処置された６頭の患者のうち４頭で跛行に改善が見られ、Ｄ３０における平均跛行スコアが処置前群の平均跛行スコアを下回っていると判断した。表２２に示した早期治療効果は、２回分の治療用量を、２週間の間隔をあけてＩＶ注入により送達することで達成された。ヒト患者または獣医学上患者のいずれかにおける骨関節炎を処置するための標準的な治療手法は、関節内（すなわち、関節包内）注射による細胞注入である。

【0460】

実施例２６：難治性ネコ慢性歯肉口内炎におけるネコドナー子宮組織由来臨床用量の転帰
ネコ慢性歯肉口内炎（ＦＣＧＳ）と診断されたネコでは、口腔に重度の炎症が生じ、これにより、ネコの食欲及び水の摂取に影響が及び、その結果クオリティオブライフが低下する。処置は、罹患したネコの歯を、ほとんど、または全て抜くことに限られる。しかしながら、このような抜本的な医療行為の後であっても、かなりの数のネコ（およそ３０％）が重度の口部炎症を患い続け、それらのネコのクオリティオブライフは、経時的に低下し続ける。

【0461】

抜歯後も転帰不良が続く、組み入れ対象となるネコにおいて臨床試験を開始した。ＦＣＧＳ患者の処置に使用した用量は、ドナーＳ－０２５から得た（プロトコルＣに従ってプロセシング）。３６百万個の細胞を３０分かけて静脈内送達して、対象となった各患者を２回処置した。各ネコを、処置前及び処置後定期的にＳｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＳＤＡＩ）で評価した。この指標は、担当獣医により行われる疾患の重症度を評価するための半定量的スコアリングシステム（口部炎症パラメータを反映している）と、患者のクオリティオブライフに関連するパラメータについての飼い主による評価との組み合わせからなる。

【0462】

２回目の用量を注入した後、対象となった３頭の患者がＤ１４に達し、２頭はＤ１４において処置前と比較してＳＤＡＩ値がわずかに低下した。難治性ＦＣＧＳに罹患しているネコにおける改善には、炎症状態の解消のため数ヶ月を要することが報告されている。しかしながら、難治性ＦＣＧＳに罹患している患者では、いかなる有害事象もなく細胞療法に忍容性が示され、Ｄ１４までの初期にＳＤＡＩスコアがわずかに低下（改善）した。

【0463】

実施例２７：外植組織片を用いた培養細胞の収率、生存率及び表現型評価
酵素消化後の初期培養間隔において、組織のみ、細胞のみ、及び細胞を伴う組織の培養結果を評価するため、複数の血縁関係のないイヌ子宮組織ドナーを用いて、試験を実施した。

【0464】

組織消化条件及び凍結保存

【0465】

各イヌドナーの子宮を他の組織から切離し、ＢＳＣ内で小片に切り刻んだ。切り刻んだ後、組織をコラゲナーゼ及びサーモリシンにより、３７℃で６０分間、１０分ごとに手動で振盪しながら消化した。各例において、消化した組織及び細胞（Ｔ－ＰＣＦ）をクライオバイアルに入れ、１０％ ＤＭＳＯを含む市販の凍結保護溶液（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＣｒｙｏＳｔｏｒｅ ＣＳ１０）で、または培養液（１０％ ＦＢＳ含有）と１：１（ｖ：ｖ）で混合した培養液中の２０％ ＤＭＳＯ溶液で凍結保存した。

【0466】

Ｔ－ＰＣＦの培養

【0467】

Ｔ－ＰＣＦの各クライオバイアルをＬＮ_２気相保存器から回収し、３７℃の水浴中で氷の細片が残るまで解凍した。外植組織片と細胞との組み合わせ（Ｔ－ＰＣＦ）用にプロセシングした解凍済みクライオバイアルを、直ちに組織培養液（ＤＭＥＭ、高グルコース、１０％ ＦＢＳ、８ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２及び４ｍＭグルタミン）中に入れて希釈し、培養フラスコに入れ、５％ ＣＯ_２インキュベーター（湿度１００％）において３７℃でインキュベートした。同じドナー組織の消化から得た別のクライオバイアルを、４０μｍセルストレーナーに通して処理し、培養液でリンスして細胞のみ（ＰＣＦ）条件を得た。細胞ストレーナーを上下反対にし、培養液でリンスすることにより外植組織片を回収して、外植組織片のみ（Ｔｉｓｓｕｅ）条件を得た。ＰＣＦ及びＴｉｓｓｕｅ調製物の両方を培養フラスコに入れ、Ｔ－ＰＣＦ条件について記載した通りにインキュベートした。

【0468】

回収するまで、ＰＣＦ及びＴｉｓｓｕｅフラスコには新鮮な培養液を３日ごとに供給した。Ｔ－ＰＣＦフラスコには、Ｄ３に、外植組織片を取り出して供給した。

【0469】

３つの条件全てのフラスコを、５日間または７日間インキュベートした。回収日に、ＰＣＦ及びＴ－ＰＣＦフラスコの使用済み培地を除去し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を添加してフラスコをリンスし、続いてＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞を剥離した。回収した細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でカウントした。Ｔｉｓｓｕｅフラスコから使用済み培地及び外植組織片を除去し、次いで、ＰＣＦ及びＴ－ＰＣＦフラスコについて記載した通りに扱った。

【0470】

免疫表現型検査

【0471】

細胞は、ＣＤ３４－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ １Ｈ６）、ＣＤ４５－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ ＹＫＩＸ７１６．１３）、ＣＤ９０－ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ Ｔｈｙ－１）、ＣＤ３２６－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ Ｇ８．８）、ＣＤ４４－ＰｅＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ ＩＭ７）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）６３３または６３５ｎｍ励起用Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９７６）に反応する市販の直接標識抗体で分析した。ブロッキング剤の存在下、最適化した試薬と共に細胞を氷上暗所で３０分間インキュベートしてから反応性を評価した。まず、全てのイベントを生／死染色で評価し、生存可能単一細胞のイベントのみを、表面反応性ＣＤマーカーパネルとの反応性について分析した。加えて、別の反応において、細胞を製造業者の指示に従って固定、透過処理、及びブロッキングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｍａｇｅ－ｉＴ Ｆｉｘａｔｉｖｅ－Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｆｉｘａｔｉｖｅ、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、次いで、表面マーカーについて記載した通りに、標識化抗ビメンチン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｃｌｏｎｅ Ｖ９）及び抗サイトケラチン－１８－ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ，ｃｌｏｎｅ Ｃ－０４）試薬と反応させた。いくつかの調製物は、ＣＤ４４－ＰｅＣｙ７及びＣＤ３２６－ＰｅＣｙ７と共にインキュベートした後、固定、透過処理、ならびに抗ビメンチン及び抗サイトケラチン－１８による染色を行った。試料はＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで評価した。データは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で解析した。

【0472】

培養結果

【表23】

【0473】

免疫表現型検査の結果

【0474】

第２のＴ－ＰＣＦドナー試料セット（Ｓ－０３２、Ｓ－０３３）を、Ｔ２２５フラスコ内で培養した。ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０についての単色分析を行った。

【表24】

５つのドナーのうち４つにおいて、ＰＣＦ及びＴ－ＰＣＦの細胞収量が、どちらもＴｉｓｓｕｅの細胞収量よりも多かった。このことから、５日間培養したかまたは７日間培養したかを問わず、ＰＣＦ及びＴ－ＰＣＦの両条件の寄与により細胞数がより多くなったことが示唆される。したがって、培養環境中に存在する、切り刻まれ消化された子宮組織の外植組織片は、遊離した細胞と共に、臨床応用に重要な役割を果たす。

【0475】

実施例２８：臨床応用のためのプライミングされたネコ子宮組織由来再生細胞
第３継代で得た２つの血縁関係のないドナーネコＵＲＣを、数種の濃度のＩＦＮ－γでプライミングした。ネコ子宮組織をコラゲナーゼ／サーモリシンで消化し（定期的に手動で振盪しながら３７℃で１時間－例えば、プロトコルＣ）、外植組織片及び細胞を含有する消化物を、ＤＭＥＭ（高グルコース、６ｍＭグルタミン含有）／１０％ ＦＢＳ中で培養した。細胞増殖にも、高グルコース及び６ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭを１０％ ＦＢＳと共に用いた。ＩＤＯ活性の観点から、ネコＵＲＣに対するＩＦＮ－γの影響を、ＩＤＯ活性の代謝産物であるＬ－キヌレニンのレベルを評価することにより決定した。

【0476】

ＩＤＯ検出アッセイ：ＩＤＯの上方制御を用いて、ＩＦＮ－γプライミングに対する２つの血縁関係のないネコドナーＵＲＣ調製物の応答を評価した。

【0477】

Ｌ－キヌレニンの存在に対するアッセイ：ＩＤＯ１の活性はトリプトファンが供給されている場合にのみ検出できるため、細胞を６００μＭのトリプトファンの存在下で培養した。プライミングした細胞及びコントロール（非プライミング）細胞の細胞懸濁液を回収し、アッセイするまで－８０℃で保存した。培養上清試料の処理を行った。エールリッヒ試薬を用いてＬ－キヌレニンとの複合体を形成させ、それを４９０ｎｍで検出した。Ｌ－キヌレニンを倍数で段階希釈して作成した標準曲線を用いて、細胞培養上清中に存在するＬ－キヌレニンの量を確定した。

【0478】

サイトカインアッセイ：２つの血縁関係のないネコドナーのプライミング済み及び非プライミング（コントロール）ＵＲＣ調製物を、サイトカイン産生について評価した。ネコＵＲＣ調製物は、培養期間中１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γでプライミングした。それぞれの細胞調製物を４日間培養（１０％ ＦＢＳ含有培養液）してから、培養液上清を回収した。上清を全ての条件から採取し、ＰｈｅｎｏＶｉｓｔａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、ヒト用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘチップ及びマウス用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘチップを用いて分析するまで凍結状態を維持した。予備実験では、ネコのサイトカインについて、２つのデバイスで使用した抗体の一部に交差反応性があることが示された。細胞を増殖させた培養液（１０％ ＦＢＳ含有）を陰性コントロールとして用い、陰性コントロールの非特異的シグナルを他の分析物の結果から差し引いた上で報告した。結果は、各分析物に対しｐｇ／ｍＬで報告した。

【0479】

結果（実施例２８）：ＩＤＯ活性によって評価したＩＦＮ－γでの処理に対するネコＵＲＣの応答

【0480】

表２５は、様々なレベルのＩＦＮ－γの存在下で培養した場合のＳ－００５ ＵＲＣ及びＳ－００１ ＵＲＣの応答を示している。プライミング剤に対する応答は、ＩＤＯアッセイにおいて産生されたＬ－キヌレニンの量で測定した。非プライミングコントロール条件（０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ）と比較して、Ｌ－キヌレニン濃度の上昇が示されたことから、どちらのネコＵＲＣ調製物もＩＦＮ－γによるプライミングに応答した。ドナーＳ－００５では、ＩＦＮ－γを増加させてもＬ－キヌレニン産生はそれほど増加せず、用いた最低レベルのＩＦＮ－γに対して高い応答率が示された。対照的にＳ－００１では、ＩＦＮ－γの濃度が高くなるほどＬ－キヌレニンが誘発されて高レベルになるという滴定効果がより顕著に示されたが、試験した最高濃度においてプラトー効果を示すいくつかのエビデンスがあった。ＩＦＮ－γでのプライミングに対する応答は、ドナーによってばらつきがあることが報告されている（Ｂｏｙｔ，ｅｔ ａｌ．２０２０）。

【表25】

【0481】

ネコＵＲＣのサイトカインプロファイル

【0482】

サイトカインは、前駆細胞によって分泌される重要分子であり、組織内の成体細胞及び免疫細胞の両方の細胞活性（例えば、増殖、アポトーシス、免疫調節）を調節するための、よく知られたパラクリン機構を構成する。ネコＵＲＣのサイトカインプロファイルは、血縁関係のない２つのネコドナー（Ｓ－００５及びＳ－００１）の培養上清から得た。ヒトサイトカイン／タンパク質及びマウスサイトカイン／タンパク質を検出するための市販のＩｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｘｐｌｅｘデバイスを、当該方法に記載した通りに使用した。

【0483】

プライミングしたドナーＵＲＣ調製物のどちらにおいても、ＩＦＮ－γの存在に応答する特定の細胞型によって産生されるタンパク質ＩＰ－１０が非常に多く分泌されることが示された。パーフォリンもまた、非プライミングコントロール調製物に比べ、プライミングした調製物において有意に高いレベルで分泌される。全体として明白であるのは、プライミング剤としてＩＦＮ－γを用いると、ネコＵＲＣの非プライミングコントロール調製物と比較して、ネコＵＲＣの分泌プロファイルが変更されることである。

【表26-1】

【表26-2】

【0484】

プライミングしたＵＲＣ調製物の試験アッセイにおいて、ＩＤＯレベルが増加した結果、非プライミングコントロール調製物と比較して、相当なレベルのＬ－キヌレニンが分泌されたことから実証されるように、２つの血縁関係のないネコドナーＵＲＣ調製物は、ＩＦＮ－γでプライミングされた。ＩＦＮ－γでプライミングしたネコＵＲＣにおいて認められたＬ－キヌレニンのレベルが、非プライミングコントロールと比較して高いこと（表２５）により、プライミングしたネコＵＲＣ調製物では、ＩＤＯの存在レベルが上昇することが示される。ＩＤＯは、炎症促進性免疫細胞の活性を低下させることにより、免疫状態のメディエーターとして作用することが明らかになっている。

【0485】

サイトカイン発現の差にはエビデンスがあり、プライミングしたＵＲＣでは非プライミングＵＲＣよりも分泌レベルが高く（例えば、ＩＰ－１０、パーフォリン）、また、プライミングしたＵＲＣでは非プライミングＵＲＣよりも分泌レベルが低い（例えば、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６）。いくつかのサイトカインは、プライミング済みＵＲＣまたは非プライミングＵＲＣから同程度のレベルで分泌された（ＩＬ－４、ＩＬ－５）。Ｓ－００５及びＳ－００１の両方をプライミングするとＩＰ－１０が非常に高いレベルで分泌されることが判明した。これは、ドナーネコＵＲＣ調製物がＩＦＮ－γに曝されることにより変質したことをさらに確かにするものである。

【0486】

まとめると、これらの結果は、ＩＦＮ－γでプライミングされたネコＵＲＣにおける、臨床的有用性のある重要な変化を実証している。

【0487】

実施例２９：臨床応用のためのプライミングされたイヌ子宮組織由来再生細胞
ＩＦＮ－γの濃度及び培養中の曝露継続時間に関する、イヌＵＲＣから応答を誘発する条件を評価するために実験を行った。インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯまたはＩＤＯ１）活性の存在について、ＩＦＮ－γに曝露させたＵＲＣを評価した。ＩＤＯ１がトリプトファンを異化する際に産生される最初の代謝産物はＮ－ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）であり、次にこれが改変されてＬ－キヌレニンが生じる。プライミングしたイヌＵＲＣ及び非プライミングイヌＵＲＣに対して、ＮＦＫ及びＬ－キヌレニンの両方を評価した。

【0488】

リンパ球に対するイヌＵＲＣの免疫調節効果を評価するため、プライミングしたイヌＵＲＣを混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）でも評価した。このアッセイでは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をマイトジェン（コンカナバリンＡ、Ｃｏｎ Ａ）を用いて刺激し、ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ反応混合物にＭＳＣを添加した試験条件と比較する。ＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖応答の抑制は、プライミングしたＭＳＣの潜在的免疫調節能と関連している（Ｂｏｙｔ，２０２０）。

【0489】

加えて、プライミングしたイヌ細胞調製物のＣＤマーカープロファイルを、標準的なフローサイトメトリープロトコルに従って特性評価した。ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）を含むＣＤマーカーを評価した。ＭＨＣ－ＩＩは、ＩＦＮ－γに応答した細胞において上昇することが報告されているため、ＭＨＣ－ＩＩを調べた。したがって、評価した各ドナー調製物に関し、プライミングした細胞を、非プライミングコントロール培養物と比較して、ＭＨＣ－ＩＩの発現陽性頻度における変化について評価した。

【0490】

方法

【0491】

イヌＵＲＣ調製物の培養プライミングプロトコル

【0492】

イヌドナーＳ－０１１ ＵＲＣ調製物は、プロトコルＢ（すなわち、ＤＥ１０コラゲナーゼ、１０分ごとに手動で振盪しながら３７℃で６０分間）により得た。イヌドナーＳ－０１７、Ｓ－０２６、Ｓ－０２７、Ｓ－０２８及びＳ－０２９のＵＲＣは、プロトコルＣ（すなわち、コラゲナーゼ及びサーモリシン、１０分ごとに手動で振盪しながら３７℃で６０分間）により得た。

【0493】

ＩＦＮ－γへの曝露時間及びＩＦＮ－γ濃度の影響を評価するために、Ｇ０３３８及びＧ０３４０を用いて初期範囲実験を行った。Ｌ－キヌレニンアッセイを用いて、プライミングしたＵＲＣに存在するＩＤＯの活性を評価した。プライミング条件についての初期試験の後、組織培養容器にＰ３細胞を播種し、回収する４８時間前に、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γを補充した培養液を交換することにより、イヌＵＲＣ調製物をプライミングして、Ｐ４でプライミング済み細胞を創出した。

【0494】

その後、プライミングイベントを持続性にするために、第４継代後のプライミング済み細胞を、ＩＦＮ－γ非存在下で２日間培養し、ＩＤＯ活性（Ｌ－キヌレニンとして）について細胞を評価した。また、前もってプライミングし、凍結保存した細胞がＩＤＯ活性を保持することについても、プライミングし、凍結保存した細胞をアッセイ（Ｎ－ホルミルキヌレニンとして）用に解凍した後に評価した。

【0495】

ＣＤマーカー評価

【0496】

細胞は、ＣＤ３４－ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ １Ｈ６）、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ ＹＫＩＸ７１６．１３）、ＣＤ９０－ＡＰＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ Ｔｈｙ－１）、ＣＤ３２６－ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ Ｇ８．８）、ＭＨＣＩＩ－ＡＰＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃｌｏｎｅ ＹＫＩＸ３３４．２）、ＣＤ４４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ ＩＭ７）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）６３３または６３５ｎｍ励起用Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９７６）に反応する市販の直接標識抗体で分析した。ブロッキング剤の存在下、前もって最適化した試薬中、細胞を氷上暗所で３０分間インキュベートしてから反応性を評価した。まず、全てのイベントを生／死染色で評価し、生存可能単一細胞のイベントのみを、表面反応性ＣＤマーカーパネルとの反応性について分析した。試料はＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで評価した。データは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。

【0497】

三系統分化

【0498】

軟骨形成、骨形成、及び脂肪生成細胞系列への分化を評価するため、ＩＦＮ－γでプライミングした凍結保存細胞（Ｐ４）を解凍し、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、１０％ ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン及び８ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を補充したＤＭＥＭ（ＨＧ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で培養して、分化アッセイを開始した。コントロール培地にも誘導培地にも、ＩＦＮ－γを補充しなかった。

【0499】

軟骨形成

【0500】

細胞を濃度４ｘ１０^６細胞／ｍＬに希釈し、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルに、濃縮した細胞懸濁液の５０-μＬの液滴を３滴入れた。プレートを３７℃／５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートした。２４時間後、軟骨細胞分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）を実験ウェルに添加し、培養液をコントロールウェルに添加し、３７℃／５％ ＣＯ_２でインキュベートした。各ウェルの培地は、３日ごとに全量交換した。最低７日間インキュベートした後、ウェルから培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１ｍＬの１０％ホルマリン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加して、室温で一晩細胞を固定した。ホルマリンを吸引し、ウェルを脱イオン（ＤＩ）水で洗浄した。次いで、アルシアンブルー１ｍＬを各ウェルに添加し、室温で４５分間、穏やかに揺り動かしながらインキュベートした。ウェルから色素を吸引し、脱染色液（２：３［ｖ：ｖ］酢酸対純エタノール）をウェルに入れ、室温で１０分間インキュベートし、吸引した。２回目の脱染色後、脱染色液を吸引し、室温で乾燥させた後、Ａｍｓｃｏｐｅ ＭＤカメラを取り付けた位相差顕微鏡でウェルを撮像した。

【0501】

骨形成

【0502】

細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）における培養液中に５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で蒔き、３７℃／５％ ＣＯ_２のインキュベーター内に置いた。２４時間後、コントロールウェルの培地を交換し、実験ウェルの培地を吸引し、骨形成分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）を添加した。対応する培地を３日ごとに細胞に供給した。最低１２日後、ウェルから培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、各ウェルに１０％ホルマリン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１ｍＬずつ添加し、一晩インキュベートして細胞を固定した。ホルマリンを吸引し、ウェルをＤＩ水で洗浄した。洗浄液を吸引し、１％アリザリンレッド染色液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を各ウェルに１ｍＬずつ添加し、室温で３０分間、穏やかに揺り動かした。ウェルから染色液を吸引し、プレートをＤＩ水で洗浄して余分な染色液を除去した。室温で乾燥させた後、Ａｍｓｃｏｐｅ ＭＤカメラを取り付けた位相差顕微鏡でウェルを撮像した。

【0503】

脂肪生成

【0504】

解凍した細胞を、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）における培養液中に、およそ１００，０００細胞／ウェルの密度で蒔き、５％ ＣＯ_２／３７℃のインキュベーター内に入れた。培養液は３日目に交換した。細胞がコンフルエンスに達した後、半分のウェルの増殖培地を、脂肪生成分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）に交換し、コントロールウェルには新鮮な増殖培地を供給した。インキュベーションを１２日間または１５日間継続し、３日ごとにコントロール培地または分化培地を交換した。インキュベーション期間終了時に、ウェルから培地を吸引し、ＤＰＢＳを添加してウェルを洗浄した。洗浄液を吸引し、各ウェルに１０％ホルマリンを１ｍＬずつ添加して、細胞を室温で１５分間固定した後、ホルマリンを吸引した。細胞を６０％イソプロパノールで洗浄し、これを除去した後、０．３％オイルレッドＯ染色液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＬ添加し、室温で１５分間インキュベートした。その直後にオイルレッドＯ染色液を吸引し、蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）を添加し、吸引した。ｄＨ_２Ｏで合計４回洗浄してから、プレートを室温で乾燥させた。ウェルは、Ａｍｓｃｏｐｅ ＭＤカメラを取り付けた位相差顕微鏡で撮像した。

【0505】

サイトカイン分析

【0506】

複数の血縁関係のないイヌドナーのプライミング済み及び非プライミング（コントロール）ＵＲＣ調製物を、サイトカイン産生について評価した。イヌＵＲＣ調製物は、培養期間中１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γでプライミングした。それぞれの細胞調製物を４日間培養（１０％ ＦＢＳ含有培養液）してから、培養液上清を回収した。上清を全ての条件から採取し、分析するまで凍結状態を維持した。２つの試験アッセイセットを用いて上清を分析した。

【0507】

Ｃｏｄｅｐｌｅｘデバイスアッセイ

【0508】

プライミング済み及び非プライミング（コントロール）イヌドナー（ドナーＳ－０２６及びＳ－０２７）ＵＲＣ調製物の上清を、ＰｈｅｎｏＶｉｓｔａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、ヒトサイトカイン用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘデバイス及びマウスサイトカイン用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘデバイスを用いて分析した。予備実験では、イヌのサイトカインについて、２つのデバイスで使用した抗体の一部に交差反応性があることが示された。細胞を増殖させた培養液（１０％ ＦＢＳ含有）を陰性コントロールとして用い、陰性コントロールの非特異的シグナルを他の分析物の結果から差し引いた上で報告した。結果は、各分析物に対しｐｇ／ｍＬで報告した。

【0509】

Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙイヌサイトカインマイクロアレイ

【0510】

プライミング済み及び非プライミング（コントロール）イヌドナー（ドナーＳ－０１７及びＳ－０１１）ＵＲＣ調製物の上清を、商業的研究室におけるマイクロアレイ技術（Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４０，Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｅａｃｈｔｒｅｅ Ｃｏｒｎｅｒｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）で分析した。細胞を増殖させた培養液（１０％ ＦＢＳ含有）を陰性コントロールとして用いた。各サイトカインの結果は、「ｐｇ／ｍＬ」として報告している。補正係数を用いて、各サイトカインの「正味」分泌レベルを算出した。検出限界（ＬＯＤ、各アッセイに対してＲａｙｂｉｏｔｅｃｈが提供）の２Ｘまたは陰性コントロール値の２Ｘのいずれか大きい方を、各サイトカインの結果から差し引いた。調整した値は、注釈に基づいて分類した。つまり、調整した濃度値は、表６の脚注に示しているように、「０」、低、中、高、または超高のスコアでの濃度範囲に割り当てた。

【0511】

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及びＭＬＲ上清についてのＩＤＯ／ＰＧＥ_２評価

【0512】

イヌＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌベースの密度勾配遠心分離によって処理した、新たに採血した全血から得た。濃縮されたＰＢＭＣ層を回収し、カウントし、トリプトファンを最終濃度６００μＭまで補充した、１０％ ＦＢＳ及び１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む低グルコースＤＭＥＭで希釈した。ＰＢＭＣを、単独で、５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡと共に（ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ ＡにＵＲＣを含めて（１０：１ ＰＢＭＣ：ＵＲＣ）、１２ウェルプレートに入れた。調製物を３７℃／５％ ＣＯ_２中で４日間インキュベートし、３日目に全てのウェルに１０μＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を添加した。各条件から無細胞培地を採取し、インドール－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性（Ｌ－キヌレニンレベルとして）及びプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）についてアッセイするまで－８０℃で凍結保存した。細胞をフローバッファー（２％ ＦＢＳ、ＤＰＢＳ中２ｍＭ ＥＤＴＡ）に移し、２つのアリコートに分けた。アリコートの１つは、活性化Ｔ細胞を検出するためにＤｏｇ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。第２のアリコートは、ＢｒｄＵ ｆｌｏｗ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＢＤ）で処理し、抗ＢｒｄＵ－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ ＢＵ２０Ａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でシグナルを検出した。標識した調製物をＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによる）で読み取り、ＦｌｏｗＪｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。全ての試料について、活性化Ｔ細胞の割合（第１のアリコート）または増殖の程度（第２のアリコート）を測定した。いずれのマーカーでも、最大反応はＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ試料で認められ、一方、活性化または増殖における減少率は、ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ／ＵＲＣ試料を用いて算出した。

【0513】

ＩＤＯ検出アッセイ

【0514】

２種のアッセイが、細胞内に位置するＩＤＯの活性を検出するために内部で使用されている：１）Ｌ－キヌレニンの存在に対するアッセイ、及び２）Ｌ－ホルミルキヌレニンの存在に対するアッセイ。

【0515】

Ｌ－キヌレニンアッセイ：ＩＤＯ１の活性はトリプトファンが供給されている場合にのみ検出できるため、細胞を６００μＭのトリプトファンの存在下で培養した。プライミングした細胞及びコントロール（非プライミング）細胞の細胞懸濁液を回収し、アッセイするまで－８０℃で保存した。培養上清試料の処理をＲ＆Ｄ ＷＩ：Ｌ－ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅに記載されている通りに行った。エールリッヒ試薬を用いてＬ－キヌレニンとの複合体を形成させ、それを４９０ｎｍで検出した。Ｌ－キヌレニンを倍数で段階希釈して作成した標準曲線を用いて、細胞培養上清中に存在するＬ－キヌレニンの量を確定した。

【0516】

Ｎ－ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）アッセイ：細胞調製物を製造業者の説明書（Ａｂｃａｍ，ａｂ２３５９３６）に従って溶解し、続いて遠心分離ステップにより、無細胞上清を得た。上清、陽性コントロール及び陰性コントロール、ならびに標準物質を、製造業者の説明書に従って黒色マイクロタイタープレートで処理した。（ＮＦＫを生成するための）現状での最初のインキュベーションの後、ＮＦＫに結合する試薬を添加し、インキュベートした。２回目のインキュベーション期間の後、プレートを、蛍光プレートリーダーにおいて励起／発光４０２／４８８ｎｍで分析した。

【0517】

結果

【0518】

様々なプライミング条件に対する複数の血縁関係のないイヌＵＲＣ調製物の反応

【表27】

【0519】

プライミングした細胞の培養特性

【0520】

Ｓ－０１７の第３継代細胞を、０日目に同型培養で樹立した。２日目に全フラスコの培養液を１００％交換し、そのうちの２つのフラスコには１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを補充した培養液を入れた。およそ２日後にフラスコを回収した（総培養時間９５時間）。表２８に示したように、生存細胞のパーセンテージ、倍加時間（ＤＴ）及び集団倍加レベル（ＰＤＬ）を測定した。

【表28】

【0521】

複製プライミング済みＳ－０１７ＵＲＣ培養物及び複製非プライミングＳ－０１７ＵＲＣ培養物では、倍加時間及び集団倍加レベルが同様であった。したがって、ＵＲＣのプライミング剤としてＩＦＮ－γを使用しても、プライミングしたＵＲＣの増殖は妨げられない。

【0522】

プライミング済みＵＲＣ及び非プライミングＵＲＣのＣＤマーカープロファイル

【0523】

非プライミングイヌＵＲＣで評価される標準ＣＤマーカーセットは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４４及びＣＤ９０からなる。イヌＵＲＣをＩＦＮ－γでプライミングすると、ＭＨＣＩＩの発現が増加することが観察され、これは他のＭＳＣに関する文献で報告されている変化であるため、ＭＨＣＩＩの評価を既存のＣＤマーカーセットに追加した。表２９は、プライミング済みＵＲＣ調製物及び非プライミングコントロールＵＲＣ調製物についての単色頻度として、ＣＤマーカーに対するＱＣリリースプロファイル発現レベルを、ＭＨＣＩＩ発現を含めて示している。

【表29】

【0524】

表２９に示したように、プライミングした細胞では、非プライミングコントロール調製物と比較して、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ４４の発現パターンが類似している。

【0525】

ＣＤ９０頻度はプライミングした調製物でかなりのばらつきがあり、１０．２％（Ｓ－０２７）、１６．０％（Ｓ－０２６）及び９７．３％（Ｓ－０１７）のＣＤ９０発現頻度であった。表２９に記載した血縁関係のないドナーＵＲＣのそれぞれに関し、ＭＨＣＩＩ発現頻度は、非プライミングコントロール調製物と比較して、プライミングした調製物の方が大幅に高い。Ｓ－０２７プライミング調製物のＭＨＣＩＩ発現レベルは２７．２％と最も低かったが、Ｓ－０２７プライミング細胞のＭＨＣＩＩレベルの比率は、非プライミング細胞のＭＨＣＩＩレベルと比較して約３４Ｘ高い。また、Ｓ－０１７及びＳ－０２６では倍率増加がより高く認められたことから、ＩＦＮ－γプライミングプロトコルにより、非プライミングイヌＵＲＣと比較して顕著なＭＨＣＩＩ発現の増加が誘発されることが指し示される。

【0526】

非プライミング細胞におけるＭＨＣＩＩの発現レベルは、実質的に１％未満であることが認められ、一方、プライミングしたイヌＵＲＣ調製物におけるＭＨＣＩＩの最小発現レベルは２７．２％であった。対応するコントロール培養調製物に対するプライミングした培養調製物のＭＨＣＩＩ発現における倍率増加は、非プライミングコントロールＭＨＣＩＩ発現レベルに対する、プライミングした細胞のＭＨＣＩＩ発現の実質的な倍率増加を示している。表２９に示したように、Ｓ－０１７、Ｓ－０２６及びＳ－０２７に関し、非プライミング細胞のＭＨＣＩＩ発現に対するプライミング済み細胞のＭＨＣＩＩ発現の倍率増加は、それぞれ１３６０Ｘ、４１８Ｘ及び３４Ｘであった。

【0527】

ＩＦＮ－γに応答するＭＨＣＩＩの表面発現は、骨髄から単離されたヒトＭＳＣでは数日かかると報告されている。対照的に、プライミングしたイヌＵＲＣ細胞調製物について表２９に示したＭＨＣＩＩ表面発現レベルは、曝露してからわずか２日で得られた。ヒトＭＳＣに関して報告されている表面発現の遅さと比較して、ＵＲＣで認められたＭＨＣＩＩのより迅速な表面発現の潜在的利点の１つは、ＵＲＣ（プライミング済みまたは非プライミング）が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける炎症促進性環境に存在するＩＦＮ－γに対してより迅速に応答し得ることである。したがって、ＧａｌｌａｎｔのＵＲＣにおけるＭＨＣＩＩの表面発現速度は、他の種及び／または組織のＭＳＣと比較して、子宮組織由来ＵＲＣの生物学的特性を際立たせるものとみなすことができる。

【0528】

三系統分化

【0529】

軟骨形成、骨形成及び脂肪生成細胞系列への分化誘導培地に対する応答を評価するために、前もってＰ４で凍結保存したプライミング済みイヌＵＲＣを解凍し、培養液中に入れた。三系統分化アッセイの培養液にはＩＦＮ－γを補充しなかった。各分化条件について、３つのイヌＵＲＣ調製物の染色像を撮った（図示せず）。

【0530】

Ｓ－０１７では、軟骨形成誘導培地中で特徴的なアルシアンブルー染色ノジュールが示された。Ｓ－０２６及びＳ－０２７ ＵＲＣ調製物では、誘導培地像の隅に存在する薄暗くわずかに青に着色したノジュールが示しているように、Ｄ７で極めて確固としたノジュール形成が示された。軟骨形成のコントロール条件では、青く染色されたノジュールは見られなかった。ＵＲＣ調製物では、骨形成誘導培地条件において、特徴的なアリザリンレッド染色細胞外マトリックスが示されるが、３つのＵＲＣ調製物のコントロール条件においては、赤く染色された細胞外マトリックスは存在しない。最後に、脂肪生成誘導培地で培養したＵＲＣ細胞では、オイルレッドＯで赤く染色された細胞内液胞の存在が示される。こうした赤く染色された液胞は非常に小さく、細胞の一部に関連するマトリックスの染色がさらに付随している。

【0531】

プライミングした３つのイヌＵＲＣ調製物は、誘導培地存在下で、軟骨形成、骨形成、及び脂肪生成細胞系列への分化に成功したことを示した。プライミングしたＵＲＣ調製物の三系統分化により、ＵＲＣのプライミングにＩＦＮ－γを用いても、ＵＲＣの多能性は変化しなかったことが示唆される。

【0532】

イヌＵＲＣのサイトカインプロファイル

【0533】

サイトカインは、前駆細胞によって分泌される重要分子であり、組織内の成体細胞及び免疫細胞の両方の細胞活性（例えば、増殖、アポトーシス、免疫調節）を調節するための、よく知られたパラクリン機構を構成する。複数の血縁関係のないイヌドナーＵＲＣのサイトカインプロファイルを、培養した細胞調製物の培養上清で得た。ドナーＳ－０２６及びＳ－０２７の上清を、ＰｈｅｎｏＶｉｓｔａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、ヒトサイトカイン用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘチップ及びマウスサイトカイン用Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘチップを用いて分析した。ドナーＳ－０１１及びＳ－０１７の上清を、Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４０アッセイ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｅａｃｈｔｒｅｅ Ｃｏｒｎｅｒｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）で分析した。

【0534】

Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ ｃｏｄｅｐｌｅｘデバイスによるサイトカイン評価

【0535】

プライミング済み及び非プライミングイヌＵＲＣ上清をヒト及びマウス両デバイスで分析した結果を、方法のセクションで概説した要件を満たすサイトカインデータで表３０に示す。

【表30-1】

【表30-2】

【0536】

Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４０による評価

【0537】

プライミング済み及び非プライミングイヌＵＲＣ上清をＱｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４０マイクロアレイで分析した結果を、方法のセクションで概説した要件を満たすサイトカインデータで表３１に示す。

【表31-1】

【表31-2】

【0538】

ＭＳＣに関連する多種多様なサイトカイン及びタンパク質の分泌を評価するために、異なる検出技術に基づく２種のアッセイを使用した。重複する分析物がいくつかあったが、各アッセイは、ＩＰ－１０、ガレクチン－３、ランテス、インターロイキン（ＩＬ－２、４、５、６、８、９、１０、１２、１７Ａ）、及びパーフォリンを含む重要なサイトカインの分泌確認に貢献した。分泌されたサイトカインセットでは、いくつかの異なる作用機序が示されるため、培養上清における多種多様なサイトカイン分泌物により、イヌＵＲＣの潜在的な治療効果が裏付けられる。例えば、イヌＵＲＣは、プライミング済みまたは非プライミングのいずれでも、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、好中球、リンパ球、樹状細胞及び単球を含む、多種多様な免疫細胞を標的とするいくつかの走化性サイトカインを分泌する。ガレクチン－３は、炎症促進性細胞を減少させるメディエーターとして作用することが示されている。ＩＦＮ－γでプライミングしたイヌＵＲＣでは、非プライミングＵＲＣコントロール調製物と比較して、いくつかのサイトカイン（ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１）の分泌が亢進したが、非プライミングイヌＵＲＣが分泌するほとんどのサイトカインの分泌も維持されている。

【0539】

プライミングしたイヌＵＲＣのＭＬＲ及びＩＤＯ／ＰＧＥ_２活性

【0540】

プライミング済み及びコントロール（非プライミング）イヌドナー由来ＵＲＣ調製物セットのうちの１つ（Ｓ－０１７）を、ＭＬＲ上清中のＩＤＯ活性（Ｌ－キヌレニンで測定）及びＰＧＥ_２レベルの決定と共に、Ｃｏｎ Ａ活性化イヌドナーＰＢＭＣの抑制について評価した。２つの異なるＰＢＭＣドナー（Ｄａｉｓｙ及びＫａｔｏ）を用いた、プライミング済み及びコントロールＳ－０１７ ＵＲＣ調製物に関連するＭＬＲ阻害の結果を表３２に示す。４日間培養を継続してから、ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ単独のコントロール条件において、及びＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ／ＵＲＣの試験条件において、活性化Ｔ細胞のレベルを決定した。ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベルの倍率増加は、ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ／ＵＲＣ条件において見出されたＬ－キヌレニン及びＰＧＥ_２のレベルを、ＰＢＭＣ＋Ｃｏｎ Ａ単独条件におけるレベルで除算することにより決定した。

【表32】

【0541】

プライミングしたＳ－０１７ ＵＲＣ調製物を用いて生成されたＰＢＭＣ活性化抑制データでは、Ｄａｉｓｙから得たＰＢＭＣを用いたコントロールＳ－０１７調製物と比較して、抑制％において明白な増加が示された。ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２において、ＤａｉｓｙのＰＢＭＣを用いたＭＬＲに由来するＭＬＲ上清でより大きい倍率増加が見られたが、ＫａｔｏのＰＢＭＣを用いたＭＬＲでも、非プライミング細胞と比較して、Ｓ－０１７プライミング済み細胞でより大きい倍率増加が示された。これらの観察から、プライミングしたＵＲＣ調製物は、非プライミング調製物と比較して、ＰＢＭＣの活性化を抑制するのに優れていることが示唆される。この抑制は、ＩＤＯ及び／またはＰＧＥ_２によって媒介される可能性があり、これらの両方が免疫調節に関与することが文献で報告されている。

【0542】

プライミングしたイヌＵＲＣのＩＤＯ活性

【0543】

ＩＤＯ活性は、Ｌ－キヌレニン及びＮ－ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）を検出するアッセイで、プライミング済み及び非プライミングイヌＵＲＣ調製物において評価した。これらの化合物はどちらも細胞内に存在するＩＤＯ活性に起因するものであり、ＩＤＯ活性はトリプトファンに作用してＮＦＫを産生し、その次にＬ－キヌレニンが生じる。表８は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γに４８時間曝してプライミングした、４つの血縁関係のないイヌＵＲＣ調製物に関するＬ－キヌレニンのデータを示している。表９は、プライミングしたばかりのドナーＳ－０１１調製物及び前もってプライミング、凍結保存、及び解凍し、直ちにアッセイしたドナーＳ－０１１調製物のＮＦＫ活性を示している。

【表33】

【表34】

【0544】

プライミングしたイヌＵＲＣ調製物の各々でＩＤＯ酵素活性が存在し、非プライミングコントロール培養物での０～３μＭのＬ－キヌレニンレベルに対し、３７～１９９μＭのレベルが測定された（表８）。プライミングした調製物において、はるかに高いレベルのＬ－キヌレニンが検出されたことから、イヌＵＲＣ調製物では、ＩＦＮ－γでのプライミングに応答すると共に、ＩＤＯレベルが増加したことが示唆される。

【0545】

プライミングした細胞の評価で重要なことは、凍結保存し解凍したプライミング済み細胞がＩＤＯ活性を保持していることを示すことであった。ドナーＳ－０１１から得た凍結保存及び解凍プライミング済み細胞ペレットにおいて、ＩＤＯ活性の上昇が保持されているという予備的エビデンスは、凍結保存したＳ－０１１プライミング済み細胞ペレットが、対応する培養したばかりのＳ－０１１細胞ペレットにおいて産生されたＮＦＫのおよそ５８％を保持していたことを示すことによって確立された（表３３）。この結果により、プライミング状態が凍結保存及び解凍後も保持されることの予備的エビデンスがもたらされる。表３３に見られるように、血縁関係のないドナーＳ－０２８及びＳ－０２９の凍結保存及び解凍プライミング済み細胞でもまた、解凍してもＩＤＯ活性が保持されていることが示された。対応するドナーＳ－０２８及びＳ－０２９の非プライミングコントロール細胞調製物では、非常に低いレベルでＮＦＫが存在していることが示された。

【0546】

プライミングしたＵＲＣが、上で明らかにしたＰＢＭＣ活性化の抑制に見られるような免疫調節能を示し、このことはＭＬＲ培養上清中のＩＤＯ及びＰＧＥ_２レベルの上昇と関連していることが実証されたことから、ＩＦＮ－γでプライミングしたＵＲＣ調製物の治療目的での使用が支持される。重要なことは、ＵＲＣが凍結保存及び解凍後もプライミング状態（すなわち、ＩＤＯレベルの上昇）を保持していたことであり、このことは、解凍されたプライミング済みＵＲＣにおけるＮＦＫが、解凍された非プライミングコントロール調製物と比較して、はるかに高レベルで存在したことによって示されている。

【0547】

要約

【0548】

プライミングしたＵＲＣにおけるＭＨＣＩＩの表面発現が、対応する非プライミングコントロール調製物と比較して増加したことから示されるように、複数の血縁関係のないイヌドナーＵＲＣは、ＩＦＮ－γでのプライミングに応答した。プライミングしたＵＲＣは、成体免疫細胞で発現されるタンパク質であるＭＨＣＩＩを発現したが、プライミングしたＵＲＣ調製物は、誘導培地に応答して、脂肪生成、軟骨形成及び骨形成細胞系列に分化した。プライミングしたＵＲＣ調製物が三系統分化を経る可能性があることから、プライミングした細胞が、成体免疫細胞には見られない、前駆細胞に関連する特性である多能性という重要な特徴を保持していることが示唆される。さらに、ヒト骨髄由来ＭＳＣではＭＨＣＩＩの発現速度が遅いと報告されていることに対比して、イヌＵＲＣをＩＦＮ－γでプライミングすると、ＭＨＣＩＩの急速な表面発現が誘導された。また、プライミングしたＵＲＣでは、前駆細胞のＩＦＮ－γによるプライミングに関連して発現される酵素ＩＤＯの活性レベルも上昇した。ＩＦＮ－γでプライミングしたイヌＵＲＣでは、プライミングした細胞を凍結保存し、続いて解凍した後も、ＭＨＣＩＩの表面発現が保持された。また、凍結保存及び解凍したプライミング済みイヌＵＲＣでは、ＩＤＯ活性のレベルも上昇したまま保持された。

【0549】

ＭＬＲアッセイにおいて、プライミングしたＵＲＣ調製物がドナーＰＢＭＣの活性化を抑制することができたというエビデンスが得られた。この抑制作用は、ＩＤＯ活性の増加、ならびにＰＧＥ_２分泌の増加に関連していた。ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２レベルは、プライミング済みＵＲＣ調製物において、非プライミングＵＲＣ調製物と比較して高かった。ＩＤＯ活性及びＰＧＥ_２はどちらも、特に炎症促進性作用を直接下方制御することによる、免疫細胞の免疫調節に重要なメディエーターである。

【0550】

サイトカインの発現には差があり、プライミングしたＵＲＣでは非プライミングＵＲＣよりも分泌レベルが高く（例えば、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１）、また、プライミングしたＵＲＣでは非プライミングＵＲＣよりも分泌レベルが低い（ＨＧＦ、ＩＬ－２）。いくつかのサイトカインは、プライミング済みＵＲＣまたは非プライミングＵＲＣにより同程度のレベルで分泌された（ガレクチン－３）。ＩＰ－１０のレベル上昇が認められたことにより、イヌＵＲＣが、「成体」様細胞よりの細胞への移行を誘発する種々の薬剤に曝された場合に応答し得る方法とほぼ同様にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩＦＮ－γによるプライミングに応答していることが示される。したがって、ＩＦＮ－γでプライミングしたＵＲＣをｉｎ ｖｉｖｏ処置として用いると、炎症促進性環境が存在するｉｎ ｖｉｖｏ条件に対するより迅速な応答が支持され得る。
まとめると、こうした結果により、非プライミングイヌＵＲＣと比較して、プライミング済みイヌＵＲＣ（ＵＲＣ）の治療効果が高まるという、ＩＦＮ－γでのプライミングによるＵＲＣの変化が実証される。

【0551】

本明細書においては一般に、多数の実施形態を説明するために積極的な言い回しを用いて本発明を開示している。本発明はまた、物質もしくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、または手順等の内容が、全部または一部除外されている実施形態も含む。

【0552】

先述した実施形態の少なくともいくつかにおいて、ある実施形態で使用される１つ以上の要素を別の実施形態で互換的に使用することができるが、このような置き換えが技術的に実行可能でない場合を除く。特許請求される内容の範囲から逸脱することなく、上述した方法及び構造に対して様々な他の省略、付加及び修正がなされ得ることが、当業者には認識されるであろう。このような修正及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される内容の範囲内に入ることが意図される。

【0553】

本明細書で任意の複数形及び／または単数形の用語が実質的に使用されていることに関して、当業者は、文脈及び／または用途に対して適切であるように、複数形から単数形へ、及び／または単数形から複数形へと変換することができる。明確性のために、種々の単数形／複数形の交換が、本明細書で明白に示される場合がある。

【0554】

一般に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「オープン」である用語として意図されると当業者には理解されるであろう（例えば、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「を含むがそれに限定されない」と解釈されるべきであり、「を有する」という用語は「を少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「を含むがそれに限定されない」と解釈されるべきである等）。さらに、請求項を詳述する特定の数が意図される場合、このような意図は、請求項に明白に詳述されることになり、このような詳述がない場合にはこのような意図が存在しないと当業者には理解されよう。理解の一助として、例えば、以下の添付の特許請求の範囲には、請求項を詳述するために、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」という語句を前置きする語法が含有され得る。しかしながら、このような語句の使用は、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による請求項の詳述が、たとえ同じ請求項に「１つ以上」または「少なくとも１つ」という前置きの語句及び「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞が含まれる場合であっても、そのような請求項の詳述を含有する任意の特定の請求項を、そのような詳述事項を１つのみ含有する実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではない（例えば、「ａ」及び／または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）。同様のことが、請求項を詳述するために用いられる定冠詞の使用についても有効である。加えて、たとえ請求項を詳述する特定の数が明白に詳述されていても、当業者は、このような詳述が少なくとも詳述された数を意味すると解釈されるべきであることを認めるであろう（例えば、他の修飾語句がないありのままの「２つの詳述事項」という詳述は、少なくとも２つの詳述事項、または２つ以上の詳述事項を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ等」に類似した表記法が使用される場合、このような構造は一般に、当業者が理解するであろう当該表記法の意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」には、限定されないが、Ａ単独を、Ｂ単独を、Ｃ単独を、ＡとＢとを共に、ＡとＣとを共に、ＢとＣとを共に、及び／またはＡと、Ｂと、Ｃとを共に有するシステム等が含まれることになる）。「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ等」に類似した表記法が使用される場合、このような構造は一般に、当業者が理解するであろう当該表記法の意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」には、限定されないが、Ａ単独を、Ｂ単独を、Ｃ単独を、ＡとＢとを共に、ＡとＣとを共に、ＢとＣとを共に、及び／またはＡと、Ｂと、Ｃとを共に有するシステム等が含まれることになる）。さらに、明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替的な用語を提示する実質的に離接的な任意の単語及び／または語句は、当該用語の１つ、当該用語のいずれか、または当該用語の両方を含む可能性を企図するものと理解されるべきであることが当業者には理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されることになる。

【0555】

加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群により記載されている場合、それによって本開示が、マーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の亜群によっても説明されることを当業者は認めるであろう。

【0556】

当業者に理解されることになるように、例えば、文章により説明するという点から、ありとあらゆる目的で、本明細書に開示される全ての範囲は、可能な限りのありとあらゆるサブ範囲及びそのサブ範囲の組み合わせも包含する。列挙された任意の範囲は、少なくとも等しく２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解される同一の範囲について十分に記載し、効果を与えるものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に記述された各範囲は、下側の３分の１、中間の３分の１及び上側の３分の１等に容易に分解され得る。また、当業者に理解されることになるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」、及び同様のもの等の全ての言い回しには、言及された数が含まれ、上述した通り、その後にサブ範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されることになるように、範囲は、個々の各要素をそれぞれ含む。したがって、例えば、１～３の項目を有する群は、１、２、または３の項目を有する群を指す。同様に、１～５の項目を有する群は、１、２、３、４、または５の項目等を有する群を指す。

【0557】

種々の態様及び実施形態を本明細書に開示してきたが、他の態様及び実施形態も当業者には明らかとなるであろう。本明細書に開示した種々の態様及び実施形態は、例示を目的とするものであり、限定を意図するものではなく、真の範囲及び精神は、特許請求の範囲によって示される。

【0558】

限定されないが、公開及び未公開の出願、特許、ならびに参考文献を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、これによって本明細書の一部となる。参照により組み込まれる刊行物及び特許または特許出願が、本明細書に含有される開示内容と矛盾する場合において、本明細書は、そのような矛盾したあらゆる内容に取って代わる、及び／または優先することが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【国際調査報告】