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特表2024-543056エダラボンデクスボルネオール含有組成物の認知障害の治療における応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】エダラボンデクスボルネオール含有組成物の認知障害の治療における応用

(51)【国際特許分類】

A61K 31/4152 20060101AFI20241112BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20241112BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20241112BHJP

A61K 31/045 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4152

A61P43/00 121

A61P25/28

A61K31/045

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527204

(86)(22)【出願日】2022-11-03

(85)【翻訳文提出日】2024-05-08

(86)【国際出願番号】 CN2022129456

(87)【国際公開番号】W WO2023078325

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】202111311631.1

(32)【優先日】2021-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523266350

【氏名又は名称】ニューロドーンファーマシューティカルカンパニーリミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】522447565

【氏名又は名称】シムサーファーマシューティカルカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、チョンピン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、レイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ロン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、シーパオ

(72)【発明者】

【氏名】レン、チンション

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC36

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA13

4C206CA14

4C206KA08

4C206MA02

4C206MA03

4C206MA04

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4C206NA05

4C206ZA15

4C206ZA16

4C206ZC75

(57)【要約】

組成物の認知障害の改善又は治療における応用であって、該組成物は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオール又はデクスボルネオールを含有し、該認知障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）及び他のタイプの認知症を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物の認知障害の改善又は治療における応用であって、前記組成物は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオール又はデクスボルネオールを含有する、応用。

【請求項2】

前記組成物は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びデクスボルネオールを含有する、ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

前記３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩とボルネオール又はデクスボルネオールとの重量比は１０：１～１：８である、ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項4】

前記３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩とボルネオール又はデクスボルネオールとの重量比は７．５：１～２．５：１である、ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項5】

前記３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩とボルネオール又はデクスボルネオールとの重量比は５：１である、ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項6】

前記３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩とボルネオール又はデクスボルネオールとの重量比は４：１である、ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項7】

前記組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、ことを特徴とする請求項１～６に記載の応用。

【請求項8】

前記認知障害は、アルツハイマー病、血管性認知症、軽度認知障害及び他のタイプの認知症を指す、ことを特徴とする請求項１～６に記載の応用。

【請求項9】

前記認知障害は、アルツハイマー病、血管性認知症及び軽度認知障害を指す、ことを特徴とする請求項１～６に記載の応用。

【請求項10】

前記認知障害は、アルツハイマー病を指す、ことを特徴とする請求項１～６に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１１月０８日に中国特許局に提出された、出願番号が２０２１１１３１１６３１．１であり、発明名称が「エダラボンデクスボルネオール含有組成物の認知障害の治療における応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容のすべては、参照により本出願に取り込まれる。

【0002】

本発明は製薬分野に属し、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩とボルネオールの組成物の認知障害の治療における応用に関する。

【背景技術】

【0003】

認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）は、獲得性認知機能障害を核とし、患者の日常生活能力、学習能力、仕事能力及び社会的コミュニケーション能力の明らかな減退を引き起こす症候群である。患者の認知機能障害は、記憶、学習、見当識、理解、判断、計算、言語、視空間機能、分析及び問題解決能力に関し、病気経過のある段階では、精神的、行動的、及び人格的な異常を伴うことが多い。認知症は変性性及び非変性性認知症を含み、前者はアルツハイマー（ＡＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、前頭側頭葉変性（ＦＴＬＤ）などを含み、後者は血管性認知症（ＶａＤ）、正常圧水頭症並びに外傷性脳損傷、感染、免疫、腫瘍、中毒及び代謝性疾患のような他の疾患による認知症を含む（２０１８年中国認知症及び認知障害診断ガイドライン、中華医学雑誌、２０１８．９８（１３），ｐ：９６５－９７０）。

【0004】

ＡＤは、発症の進行が遅く、経時的に悪化していく神経退行性疾患であり、現在、治癒、予防、又は病状の進行を遅らせることができない唯一の疾患である。２０２０年にＷＨＯが発表した世界トップ１０の死亡原因の中でＡＤは７位になった。ＡＤの最もよく見られる初期症状は短期記憶の喪失（最近の出来事を覚えることが困難である）であり、疾患が進行していくにつれて、症状は、言語障害、見当識障害（迷路しすいことを含む）、気分の不安定、動機の喪失、自理不能、及び多くの行動問題を含めて、徐々に現れる可能性がある。状況が悪化すると、患者はその原因で家庭又は社会から切り離され、次第に身体機能を失って死に至ることがある。病気経過が人それぞれであるが、診断後の平均余命は約３～９年である。

【0005】

国際アルツハイマー症協会が公開した『世界アルツハイマー報告書２０２１』によると、２０１９年時点で世界には合計５５００万人のアルツハイマー症患者がいるが、高齢化の傾向に伴い、ＡＤ患者は２０３０年には世界で７８００万人、２０５０年には１．２９億人に達すると予測されている。中国はすでに人口高齢化の急速な発展段階に入っており、高齢者人口の数が増加し続けている。２０１８年末までに、中国の６０歳以上の高齢者人口は２．４９億人に達し、総人口の１７．９％を占めており、６５歳以上の高齢者人口は１．６６億に達し、総人口の１１．９％を占めている。２０１７年の全国精神疾患の疫学調査によると、中国の６５歳以上の集団の老年期認知症罹患率は５．５６％である（ＴｈｅＬａｎｃｅｔＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１９．６（３）：ｐ．２１１－２２４）。近年のメタアナリシスによると、中国の６０歳以上の集団の認知症の総罹患率は５．３％である。６０歳以上の認知症患者は、約１０００～１１００万人であり、そのうちの６０％がＡＤである（ＴｈｅＬａｎｃｅｔＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０２０．１９（１）：ｐ．８１－９２．）。

【0006】

米国ＦＤＡに承認された五つの「既存薬」は、ＡＤ患者のいくつかの症状を緩和することができ、四つのコリンエステラーゼ抑制剤であるタクリン（肝毒性が原因で市場から撤退した）、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン及び一つのＮＭＤＡＲ拮抗薬であるメマンチンを含む（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０．２５（２４））。なお、２０１９年１１月に中国ＮＭＰＡにより条件付承認されたオリゴマン酸ナトリウムカプセル（九期一（登録商標）、ＧＶ－９７１、低分子酸性オリゴ糖）は、脳－腸軸を標的とし、軽度から中等度のＡＤ患者の認知機能を改善する（ＦｉｒｓｔＡｐｐｒｏｖａｌ．Ｄｒｕｇｓ，２０２０．８０（４）：ｐ．４４１－４４４）。２０２１年６月７日に米国ＦＤＡにより条件付承認されたａｄｕｃａｎｕｍａｂ（Ａｄｕｈｅｌｍ（登録商標）、ａｎｔｉ－Ａβマブ）という可溶性及び不可溶性Ａβアミロイドを標的とするＩｇＧ１モノクローナル抗体薬物は、軽度認知障害又は軽度ＡＤ患者を治療するためのものである（ＦｉｒｓｔＡｐｐｒｏｖａｌ．Ｄｒｕｇｓ，２０２１．８１（１２）：ｐ．１４３７－１４４３．）。しかし、現在、全ての承認された薬物は、まだＡＤを治癒することができず、臨床ではより効果的で、より疾患の進行を遅らせることができるＡＤ治療薬が必要である。

【0007】

３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン（エダラボン、ｅｄａｒａｖｏｎｅ）は、フリーラジカルを除去できる低分子化合物である。インビトロレベル（ｉｎｖｉｔｒｏ）では、エダラボンは、０．１５６～５ μＭの濃度範囲で、濃度依存的に、Ａβ_１－４２モノマーが凝集してＡβプロトフィブリル（ｆｉｂｒｉｌｓ）になることを抑制し、Ａβプロトフィブリルを解重合することができ、エダラボンは、ＡＳＨ－ＳＹ５Ｙ及び初代皮質ニューロンに対するβ_１－４２の神経毒性を低下させ、細胞生存率を向上させ、神経突起の成長を維持することができる。ＡＰＰ６９５タンパク質が安定的に発現するＳＹ－ＳＹ５Ｙ（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＰＰ６９５）において、エダラボン（０．３～３ μＭ）は、濃度依存的に、ＢＡＣＥ１発現及びＡＰＰ切断によるＡβの生成を減少させて、ＧＳＫ－３βの活性化を抑制し、ｔａｕリン酸レベルを低下させることができる（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１５．１１２（１６）：ｐ．５２２５－３０）。なお、エダラボンは、Ｈ_２Ｏ_２及びグルタミン酸誘導性初代海馬ニューロンの死亡を減少させ、ニューロンシナプスの成長を保護し、過剰酸化及び興奮性神経毒性を減少させることができる（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０２１．８５：ｐ．６８－７８）。インビボレベル（ｉｎｖｉｖｏ）では、エダラボンは、様々な認知症モデルラット又はマウスの認知機能を改善し、脳内酸化の指標、神経炎症、Ａβプラーク形成、ｔａｕリン酸化レベルを減少させるなどのことができる。スコポラミン誘導性ラット認知症モデルにおいて、エダラボンを１５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで７日間連続経口投与することは、スコポラミン誘導性空間学習及び長期記憶障害を改善することができる（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１３．９（４）：ｐ．２７１－２７６）。ラット海馬歯状回にオリゴマー化されたＡβ_１－４０を注射するモデルにおいて、Ａβを脳内注射するとともにエダラボン（５ｍｇ／ｋｇ）を同一部位で投与することは、ラットの水迷路中での空間学習及び記憶能力を有意に改善し、海馬における４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４－ＨＮＥ）付加物のレベルを低下させ、Ａβ注射で上昇したＡＣｈＥ及びＣｈＡＴ酵素活性を回復させることができる（ＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５．３６（１１）：ｐ．２０６７－２０７２）。側脳室にＳＴＺ（ＩＣＶ－ＳＴＺ）を注射して学習記憶障害を誘導する散発性ＡＤ（ＳＡＤ）ラットモデルにおいて、ＩＣＶ－ＳＴＺモデル作成後、１４日間連続してエダラボンを９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内注射により投与することは、ＩＣＶ－ＳＴＺモデルラットの水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）での空間学習及び記憶能力、及びステップダウン型受動的回避試験（ｓｔｅｐ－ｄｏｗｎｐａｓｓｉｖｅａｖｏｉｄａｎｃｅｔｅｓｔ）での非空間的長期記憶能力を有意に向上させることができ、ＳＴＺモデル作成による海馬及び皮質中の様々な酸化ストレス指標レベルの変化を有意に回復させることができ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４－ＨＮＥ付加物、・ＯＨ、タンパク質カルボニル（ＰＣ）、Ｈ_２Ｏ_２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンペルオキシダーゼを含む（ＧＰｘ）（ＮｅｕｒｏＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１３．３８：ｐ．１３６－１４５）。なお、エダラボン（１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を２８日間連続経口投与することは、同様に、ＩＣＶ－ＳＴＺラットの水迷路及び受動的回避試験における認知機能を改善し、ＳＴＺによる脳内酸化ストレス、コリン作動性異常及び炎症を低減することができる（ＥｕｒＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．４５（７）：ｐ．９８７－９９７）。ＡｌＣｌ_３／Ｄ－ガラクトース化学誘導性マウス認知障害モデルにおいて、エダラボンを１５日間連続腹腔内投与することは、マウスの水迷路及びステップダウン試験における認知機能を有意に改善することができる（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０２１．８５：ｐ．６８－７８）。なお、Ｌ－メチオニン誘導性ラット血管性認知症モデルにおいて、エダラボンを６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで９週間連続腹腔内投与することは、モデルラットの８アーム水迷路試験における空間学習及び記憶能力を有意に改善することができる（ＮａｕｎｙｎＳｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓＡｒｃｈＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０２０．３９３（７）：ｐ．１２２１－１２２８）。ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスモデルにおいて、エダラボン１２．６ｍｇ／ｋｇ（腹腔内注射、週に２回）の予防投与（３～９月齢）及び治療投与（９～１２月齢）は、いずれもマウスの水迷路試験における認知機能の欠陥を改善し、脳内Ａβプラークの沈着、ニューロン及び神経シナプスの喪失並びに神経炎症、ｔａｕタンパク質リン酸化（ｐＳｅｒ３９６、ｐＳｅｒ２６２、ｐＳｅｒ１９９及びｐＴｈｒ２３１）及び酸化ストレスなどを減少させることができる。同様に、エダラボンのマウスへの経口投与におけるバイオアベイラビリティー（３８％）に基づいて換算した後、マウス（３～１２月齢）に３３．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与（飲水投与）することは、同様に、脳内Ａβプラーク沈着を減少させ、マウスの認知機能を改善することができる（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１５．１１２（１６）：ｐ．５２２５－３０）。なお、ＡＰＰ／ＰＳ老齢マウス（１４～１７月齢）にエダラボン（８、２４及び７２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、飲水投与）を経口投与することは、老齢トランスジェニックマウスの認知機能を有意に改善することができる（ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，２０１８．Ｖｏｌｕｍｅ１２：ｐ．２１１１－２１２８）。ｔａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）モデルにおいて、９～１０月齢及び２１月齢のトランスジェニックマウスにエダラボンを２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３ヶ月連続経口投与（飲水投与）することは、動物の水迷路試験及び新規物体認識試験における認知機能を有意に改善し、動物の運動欠陥を改善し、脳組織の４－ＨＮＥ及び３－ＮＴ付加物の産生、ｔａｕリン酸化レベル及び神経炎症を減少させることができる（ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１２０３／ｒｓ．３．ｒｓ－３０６６２８／ｖ１）。

【0008】

エダラボンの化学構造式は以下のとおりであり、

【化1】

【0009】

デクスボルネオール（（＋）－ｂｏｒｎｅｏｌ）は、天然ボルネオールの主な成分であり（２０２０版中国薬典では、天然ボルネオールにおけるデクスボルネオール含有量が９６％以上であると規定されている）、二環式モノテルペン化合物であり、多くの漢方薬の揮発性油中に存在する。デクスボルネオールは、ＮＦ－κＢ及びｐ３８シグナル経路を調節し、炎症性神経炎を抑制し、脳内の複数の炎症促進因子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βなど）及び炎症性タンパク質（ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２）を減少させることができ（ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４．７４０：ｐ．５２２－３１、ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１７．８１１：ｐ．１－１１）、なお、さらに抑制性ＧＡＢＡＡＲ受容体を興奮させることができ、興奮性神経損傷を調節することができる（ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０２１．１２：ｐ．６０６６８２）。

【0010】

デクスボルネオールの化学構造式は以下のとおりであり、

【化2】

【0011】

非臨床動物実験によると、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン及びデクスボルネオールの組成物（質量比４：１～１：１）は、相乗的に、脳梗塞面積を減少させ（発行済み特許ＣＮ１０１８４８７１１Ｂ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を改善する（発行済み特許ＣＮ１０７６１３９７６Ｂ）ことができる。脳卒中を治療する新薬の研究開発において、エダラボンデクスボルネオール注射用濃溶液（３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オンとデクスボルネオールとの質量比が４：１である組成物）は、すでに２０２０年に虚血性脳卒中を治療するためのものとしてＮＭＰＡにより承認され、Ｙ－２舌下錠（３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オンとデクスボルネオールとの質量比が５：１である組成物）は、すでに中国で第ＩＩＩ相研究（中国臨床登録番号ＣＴＲ２０２１０２３３）、米国で第Ｉ相研究（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖＮＣＴ０３４９５２０６）を行った。

【0012】

従来技術によれば、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン及びデクスボルネオールの組成物が認知症及びそれに関連する認知機能障害に対して治療作用を有するか否かを予測することができず、従来の３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン及びデクスボルネオールの組成物が相乗的な作用を奏するか否かは判断することもできない。

【発明の概要】

【0013】

本発明の目的は、医薬組成物の、認知機能障害を改善又は治療する医薬品の製造における応用を提供することであり、前記の医薬組成物は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン（エダラボン）又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオールを含有する。

【0014】

本発明の別の目的は、医薬組成物の認知機能障害の改善又は治療における応用を提供することであり、ここで、それを必要とする患者に、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオールを含有する医薬組成物を投与する。

【0015】

本発明のもう一つの目的は、認知機能障害を治療するための医薬組成物を提供することであり、ここで、前記組成物は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオールを含む。

【0016】

本発明のさらなる目的は、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩と天然ボルネオールとの併用の、認知機能障害の治療における応用。

【0017】

さらに、前記医薬組成物中の３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオールの併用は、認知機能障害の治療における効力を相乗的に増大させることができる。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態において、前記認知機能障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）及び他のタイプの認知症であり、好ましくは、前記認知機能障害は、アルツハイマー病、血管性認知症及び軽度認知障害である。

【0019】

本発明の一実施形態において、前記医薬組成物は、アルツハイマー病の認知機能を改善することができる。

【0020】

本発明の別の実施形態において、前記医薬組成物は、アルツハイマー病の海馬領域の長期増強（ＬＴＰ）を回復させ、脳の海馬シナプスの機能を回復させることができる。

【0021】

本発明のさらなる実施形態において、前記医薬組成物は、アミロイドプラーク、アストロサイト増殖、ミクログリア増殖及びｔａｕタンパク質の過リン酸化などを含むアルツハイマー病の病理を改善することができる。

【0022】

本発明に記載の組成物において、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩：ボルネオールとの重量比は、１０：１～１：８であり、好ましくは、７．５：１～２．５：１であり、さらに好ましくは、５：１又は４：１である。

【0023】

本発明に記載のボルネオールは、好ましくは、天然ボルネオールであり、前記天然ボルネオールはデクスボルネオールとも呼ばれる。

【0024】

本発明に記載の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。

【0025】

賦形剤は、一般的には、薬物治療の活性な薬物成分（「ＡＰＩ」）とともに調製される薬理学的不活性物質である。剤形を生産する場合、原薬の便利で正確な分配を可能にするために、しばしば賦形剤を用いて、有効な活性成分を含有する製剤を増量する（したがって「増量剤」、「充填剤」又は「希釈剤」と呼ばれることが多い）。それは、薬物の吸収又は溶解の促進、又は他の薬効動力学的考慮などの異なる治療強化目的にもサポートすることができる。

【0026】

さらに具体的には、本発明の組成物は、単独で又は薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤と組み合わせて医薬組成物として調製することができ、且つ錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、エアゾール剤などの固体、半固体、液体又は気体形態の製剤として調製することができる。したがって、化合物の投与は、様々な形態で達成することができ、経口、頬、直腸、非経口、腹膜内、皮下、経皮、管内、関節内投与などを含む。活性剤は、投与後、全身的であってもよく、又は局所投与、壁内投与もしくは活性剤の量を移植部位に保持できるインプラントの使用によって局在化されてもよい。

【0027】

本発明で使用される組み合わせ療法は、各単一療法の用量が標準操作で現在使用されているものより低いことを許容するとともに、いずれかの単一療法を一般的に投与される場合の効果を超える効果を含めて、著しい効果を実現することができる。当業者であれば、用量レベルが、特定の化合物、症状の重症度及び副作用に対する被験者の感受性によって変化することを容易に理解するであろう。いくつかの特定の化合物は他のものよりも効果的である。特定の化合物の好ましい用量は、当業者により様々な手段で容易に確定することができる。好ましい手段は、特定の化合物の生理学的効果を測定することである。組み合わせ療法の使用は、各単一療法の用量が標準操作で現在使用されているものより低いことを許容するとともに、いずれかの単一療法を一般的に投与する場合に実現するものよりも大きな効果を含めて、著しい効果を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡβ_１－４２誘導性ニューロン損傷の保護を示した図である。

【図2】エダラボンデクスボルネオール組成物によるＩＣＶ－ＳＴＺの空間学習記憶認知機能の改善を示した図である。

【図3】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスの水迷路試験における認知機能に与える影響を示した図である。

【図4】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスのＹ字迷路試験における認知機能に与える影響を示した図である。

【図5】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスの脳切片の電気生理学に与える影響を示した図である。

【図6】エダラボンデクスボルネオール組成物が５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの脳内ＡＤ関連病理に与える影響を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

下記実施例は、例を挙げて本発明を説明し、本発明を限定するものであると見なされるべきではない。実施例で言及されるエダラボンは３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オンである。
実施例１：エダラボン及びデクスボルネオールの組成物によるＡβ_１－４２誘導性初代皮質ニューロン損傷に対する保護
１材料及び方法
１．１動物

【0030】

ＳＤ妊娠ラット、上海斯莱克実験動物有限責任公司（生産許可証番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１７－０００５）
１．２試薬及び消耗品

【0031】

【表1】

【0032】

１．３初代皮質ニューロンの製造
妊娠１８日間のＳＤ妊娠ラットを頸椎脱臼により屠殺し、ラットの子宮を解剖してＥ１８胎仔の脳を摘出し、胎仔の大脳皮質組織を氷冷ＤＭＥＭに分離し、解剖顕微鏡下で皮質組織上の髄膜及び血管を取り除き、皮質組織を氷冷ＤＭＥＭに移して切断し（薬１ｍｍ^３）、パンクレアチンにより３７℃で１０ｍｉｎ消化し、ＦＢＳで消化を停止し、パスツールピペットで軽く吹き飛ばした後に２００メッシュの篩を通過した。濾過された細胞懸濁液を１５ｍＬの遠心管に移し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を吸い出して捨てた後、３７℃で予熱された完全培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７＋ＧｌｕｔａＭａｘ＋１％Ｐ／Ｓ）で遠心管底部の細胞塊を軽く吹き飛ばし、血球計数板で計数し、完全培地で５×１０^５細胞／ｍＬまで希釈し、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレート内に接種し（１００ μＬ／ウェル）培養し、翌日、完全培地で半分の液を交換し、１１日目にニューロンが分化して成熟するまでインビトロ培養し、低酸素低グルコース負荷試験に用いた。
１．４Ａβ_１－４２誘導性初代皮質ニューロンの興奮性損傷試験

【0033】

インビトロで成熟した原代ニューロン培地を、異なる濃度（１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００．０μＭ）のエダラボン（Ｅ）、デクスボルネオール（Ｂ）又はエダラボンデクスボルネオール組成物（ＥＢ）を含有する完全培地に交換し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、オリゴマー化されたＡβ_１－４２（最終濃度５０ μＭ）を加え、２４ｈ培養し続け、ニューロンの生存率を検出した。ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙキットを用いて、原代ニューロン細胞の生存率を検出した。取扱説明書に従って試薬を１００ μＬ／ウェルで加え、１０ｍｉｎ振盪し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘ（ＭｏｌｅｃｕｌｅＤｅｖｉｃｅ）多機能性プレートリーダー上で化学発光値（ＬＵＭ）を読み取り、ニューロンの相対生存率を計算した。計算式：

【数1】

ＬＵＭ_{バックグラウンド}は、ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ試薬を細胞のない完全培地ウェルに加える場合のバックグラウンド読み取りである。

【0034】

【表2】

【0035】

１．５データ統計
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＯｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ一元配置分散分析を行った後、ＵｎｃｏｒｒｅｃｔｅｄＦｉｓｈｅｒ’ｓＬＳＤを用いて二つの群の間の差異を分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを表す。Ｅｘ又はＢｙは、ＤＭＳＯ群に比べて、＃ｐ＜０．０５であり、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１であり、＊＊ｐ＜０．０１であり、＊＊＊ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１，であり、ＥｘＢｙはＥｘ及びＢｙ群の両方に比べて有意差があった。
２実験結果

【0036】

オリゴマー化されたＡβ_１－４２は初代ニューロン生存細胞の生存率の低下を引き起こす。Ａβ_１－４２誘導前のエダラボン（３．７～１００ μＭ）又はデクスボルネオール（１．２～１００μＭ）のプレインキュベーション及び投与は、Ａβ誘導性神経毒性を濃度依存的に抑制し、細胞生存率を向上させることができる。異なる濃度のエダラボン（１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００．０μＭ）及びデクスボルネオール（１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００．０μＭ）の直交組成物は、Ａβによるニューロン損傷を抑制することができ、特にＥ５Ｂ４（３．３：１）、Ｅ５Ｂ３（９：１）、Ｅ４Ｂ５（１：３．３）、Ｅ４Ｂ４（１：１）、Ｅ４Ｂ３（３．３：１）、Ｅ３Ｂ５（１：９）、Ｅ３Ｂ４（１：３．３）、Ｅ３Ｂ３（１：１）、Ｅ３Ｂ２（３．３：１）、Ｅ３Ｂ１（９：１）及びＥ２Ｂ２（１：１）組成物の保護作用は、対応する個々の保護作用より有意に優れていた（エラー！参照元が見つかりません）。これにより、エダラボンとデクスボルネオールとのモル比９：１～１：９（質量比１０：１～１：８）の比率範囲での組成物は相乗的な作用を有すると仮判断された。
実施例２：エダラボン及びデクスボルネオールの組成物による側脳室ＳＴＺ注射誘導性認知症ラットの認知機能の改善
１実験材料
１．１実験動物

【0037】

Ｗｉｓｔａｒラット、雄性、体重２５０～３００ｇ、１１０匹、クリーングレード、上海斯莱克実験動物有限責任公司により提供され、許可証番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１２－０００２。手術前後に通常通り飼育し、室温を２３～２５℃に維持し、自由に摂食させ、飲水させた。
１．２試験機器

【0038】

Ｍｏｒｒｉｓ水迷路（Ｔｏｐｓｃａｎｌｉｔｅ２．０分析ソフトウェア、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓｔｅｍｓ）；ラット脳ステレオタキシック（カタログ番号５１６００、Ｓｔｏｅｌｉｎｇ）；分析天秤（カタログ番号ＡＬ１０４、ＭｅｌｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ）。
１．３被験薬物

【0039】

エダラボン注射液（必存（登録商標））、活性成分３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン。エダラボンデクスボルネオール組成物（重量比が７．５：１、５：１及び２．５：１である）は必要な場合に調製して使用し、溶媒対照は８％プロピレングリコールである。
２実験設計
２．１実験のグループ分け及び投与

【0040】

実験動物を５つの群に分け、即ち偽手術群、モデル群、エダラボン群（６ｍｇ／ｋｇ）、エダラボンデクスボルネオール（７．５：１）組成物（エダラボン６ｍｇ／ｋｇ、デクスボルネオール０．８ｍｇ／ｋｇ）、エダラボンデクスボルネオール（５：１）組成物（エダラボン６ｍｇ／ｋｇ、デクスボルネオール１．２ｍｇ／ｋｇ）、エダラボンデクスボルネオール（２．５：１）組成物（エダラボン６ｍｇ／ｋｇ、デクスボルネオール２．４ｍｇ／ｋｇ）である。モデル及び偽手術群動物に、対応する体積のブランク溶媒（８％プロピレングリコール）を投与し、全ての投与はいずれも腹腔内注射による投与であり、投与体積が１０ｍＬ／ｋｇである。
２．２実験手順

【0041】

実験において、偽手術群を除いて、手術に成功した動物を順にモデル及び各投与群にランダムに分けた。上記投与量設定原則に従って、各群の動物に、術後４時間に対応する薬物を静脈内注射し、その後に毎日一回投与し、１４日間連続投与し、１５日目にＭｏｒｒｉｓ水迷路実験を開始し、水迷路検出期間に、試験全体が終了するまで、毎日実験前に一回投与した。各群の動物に対していずれも水迷路試験を行い、隠しプラットフォーム逃避潜伏期間、撤去後の元ホームの所在象限の滞留時間である。
３実験方法
３．１ラット両側側脳室へのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）注射による認知症モデルの作成

【0042】

ラットを麻酔した後、腹臥位でステレオタキシックに固定し、背側頸正中切開を行い、頭蓋骨を露出し、ブレグマを座標とし、ブレグマより後方０．８ｍｍ、側方１．５ｍｍ、深さ３．６ｍｍの位置を側脳室注射点とした。マイクロインジェクタを用いて、両側脳室内にそれぞれＳＴＺ（人工脳脊髄液で調製した）を１０ μＬ注射し、１ｍｉｎ内に注射を完成し、針を３ｍｉｎ残した。注射終了後に皮膚を縫合した。初日用量は１．５ｍｇ／ｋｇであり、３日目に初日のＳＴＺ注射方法を繰り返すと、ＳＴＺの総注射量は３ｍｇ／ｋｇである。偽手術群動物の両側側脳室に同体積の人工脳脊髄液を注射した。
３．２Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験

【0043】

Ｍｏｒｒｉｓ水迷路プールは、直径が１６０ｃｍであり、高さが５０ｃｍであり、水深が２９ｃｍである。プラットフォームは、直径が１２ｃｍであり、高さが２７ｃｍであり、ＳＥ象限（目的象限）の水面下２ｃｍ位置に固定されていた。カメラレンズは、ラットの移動軌跡を同期記録するために、プールの中心から上方にプールの底部から２ｍ離れる位置に配置された。水温を２２±１℃に維持した。実験は合計５日間であり、隠しプラットフォーム試験及び空間探索試験を含む。最初の４日間は隠しプラットフォーム試験であり、最後の日は空間探索実験である。

【0044】

（１）隠しプラットフォーム試験（ｈｉｄｄｅｎｐｌａｔｆｏｒｍｔｒｉａｌ）

【0045】

本実験は４日間続き、試験時にプラットフォームの位置を目的象限（ＳＥ象限）に固定し、それぞれ四つの象限の水入り点から水に入れ、訓練時に動物をプールの壁の標識に面して軽く水に入れ、動物がプラットフォームを見つける時間（逃避潜伏期間、ｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙ）を記録し、そして動物をプラットフォーム上に１０ｓ滞留させた。９０ｓ以内にプラットフォームが見つからない場合、潜伏期間を９０ｓと記し、動物をプラットフォーム上に誘導して１０ｓ滞留させた。訓練が終了した後、ラットを飼育ケージに戻し、保温に注意した。毎日４つの水入り点で１回ずつ訓練し、４回の潜伏期間の平均値をこの日の成績として統計分析した。毎日、各動物の水入り点の順序は一致したが、グループ内の動物間の情報の交流を排除するために、同じケージ内の異なる動物の水入り順序は異なっていた。

【0046】

（２）空間探索試験（ｐｒｏｂｅｔｒｉａｌ）

【0047】

隠しプラットフォーム試験終了後２４ｈにプラットフォームを撤去した。そしてプラットフォームの対面の水入り点から水に入れ、ラットの１２０ｓ内の水泳経路を記録し、ラットの目的象限での滞留時間を統計し分析した。被験動物の空間測位能力及び空間探索過程における変化規律を観察した。
３．３データ統計

【0048】

データはＭｅａｎ ± ＳＥＭとして表された。各群の間の統計学的分析はＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を用いて分析し、２群以上の比較は、Ｏｎｅ－ｗａｙ又はＴｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡを用いて検出した後、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＬＳＤｔｅｓｔを用いて分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを表す。偽手術群に比べて、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１であり、モデル群に比べて、＊ｐ＜０．０５であり、＊＊ｐ＜０．０１であり、＊＊＊ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であり、＆ｐ＜０．０５、＆＆ｐ＜０．０１により、２群の比較を示した。
４実験結果

【0049】

水迷路隠しプラットフォーム試験では、偽手術群に比べて、側脳室ＳＴＺ（ＩＣＶ－ＳＴＺ）注射モデルは、逃避潜伏期間が有意に延長し、ＩＣＶ－ＳＴＺラットに認知機能障害が発生したことを示した。エダラボン（６ｍｇ／ｋｇ）又はエダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）の腹腔内注射は、ＩＣＶ－ＳＴＺラット逃避潜伏期間を有意に短縮することができる。エダラボン投与群に比べて、エダラボンデクスボルネオール（７．５：１、５：１及び２．５：１）組成物は、ＩＣＶ－ＳＴＺモデルラットに対する学習機能の向上がエダラボンよりも優れていた（エラー！参照元が見つかりませんＡ）。水迷路空間探索試験では、ＩＣＶ－ＳＴＺモデルラットは、目的象限での滞留時間が有意に短縮された。モデル群に比べて、エダラボン（６ｍｇ／ｋｇ）又はエダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）腹腔内注射投与群は、ラットの目的象限での滞留時間が有意に延長し、且つエダラボンデクスボルネオール組成物（５：１及び２．５：１）群はエダラボン群より有意に優れていた（エラー！参照元が見つかりませんＢ）。そのため、エダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）は、ＩＣＶ－ＳＴＺラットの認知機能欠陥を有意に改善することができ、且つその効力がエダラボンより明らかに優れていた。
実施例３：エダラボンデクスボルネオール組成物の長期投与が５×ＦＡＤトランスジェニックマウスのＡＤ認知機能及びＡＤ病理に与える影響
１材料及び方法
１．１試験動物

【0050】

野生型ＷＴマウス及び５×ＦＡＤトランスジェニックマウスは、いずれも中国薬科大学の司馬健研究チームにより提供された。
１．２被験薬物及び試薬

【0051】

エダラボン、即ちエダラボン注射液（必存（登録商標）、先声薬業）であり、活性成分が３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オンである。エダラボンデクスボルネオール組成物、即ちエダラボンデクスボルネオール注射用濃溶液（先必新（登録商標）、先声薬業）であり、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オンとデクスボルネオールとの質量比が４：１である。溶媒対照は８％のプロピレングリコールである。
１．３実験方法

【0052】

本試験では、４群に分け、各群のマウスは８週齢から投与を開始し、１６週間毎日連続投与した後、水迷路及びＹ字迷路行動学的実験を行い、行動学的検出が完了した後に動物を屠殺し、脳切片の電気生理学及び脳内ＡＤ病理を検出し、Ａβプラーク、ＧＦＡＰ及びＩｂａ－１などのバイオマーカー並びにｐ－Ｔａｕなどの検出を含む。
１．３．１動物の群分け及び投与

【0053】

ＷＴ：溶媒対照群：野生型マウス１０匹に、溶媒対照を、１０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。

【0054】

５×ＦＡＤ：溶媒群：５×ＦＡＤマウス１０匹に、溶媒対照を、１０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。

【0055】

５×ＦＡＤ：エダラボン群：５×ＦＡＤマウス１０匹に、エダラボン（必存（登録商標））６ｍｇ／ｋｇを、１０．０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。

【0056】

５×ＦＡＤ：組成物群：５×ＦＡＤマウス１０匹に、エダラボンデクスボルネオール（先必新（登録商標））７．５ｍｇ／ｋｇ（エダラボン：デクスボルネオール＝４：１、６ｍｇ／ｋｇのエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇのデクスボルネオールを含有する）を、１０．０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。
１．３．２水迷路実験：

【0057】

実験開始前、環境に順応させるためにマウスを試験室に３０ｍｉｎほど置く必要がある。

【0058】

実験の準備：水迷路の恒温プール（内径１２０ｃｍ、高さ５０ｃｍ）内に清水を注入し、水温を１８～２２℃ほどに制御し、プールの四つの頂点をそれぞれ「Ｓ」、「Ｎ」、「Ｗ」、「Ｅ」として記し、プラットフォームを「ＳＷ」方向に水面より１～２ｃｍ低い位置に置き、水の中に二酸化チタンを添加して、水を不透明の乳白色にした。

【0059】

パラメータ設定：試験時間を１ｍｉｎに設定し、マウスのプラットフォームでの滞留時間を２ｓに設定した。

【0060】

訓練：最初の５日間は水迷路の訓練段階であり、毎日四つの異なる方位からそれぞれマウスをプールに入れ、それらがプラットフォーム上に乗る前の軌跡、時間並びに各象限での経路及び時間を記録した。１ｍｉｎ以内にプラットフォームを見つけなかったマウスに対して、１ｍｉｎ終了後、プラットフォーム上に案内し、１０～１５ｓ滞留させた。マウスが放たれた具体的な方位は表１に示すとおりである。

【0061】

【表3】

【0062】

試験：訓練終了後１日目に試験を行った。試験時、プラットフォームを撤去し、試験時間が６０ｓであり、ＮＥ方位にマウスを投入し、試験中にマウスがプラットフォームを横断した回数及びプラットフォームの所在象限にいた時間を記録した。
１．３．３Ｙ字迷路実験：

【0063】

実験開始前、環境に順応させるためにマウスを試験室に３０ｍｉｎほど置く必要がある。

【0064】

訓練：Ｙ字迷路の片方のアームをシャッターで遮り、残りの２本のアームのうちの片方のアームの末端にマウスを置き、自由に１５ｍｉｎ探索させて録画した。

【0065】

試験：１ｈ訓練した後、シャッターを撤去し、アルコールでＹ字迷路の通路を拭き、前のマウスの匂いを取り除き、試験対象マウスを同じ位置に５ｍｉｎ置き、録画し、試験では、マウスが３本のアームに入った合計回数に対する新たに開放されたアームに入った回数の割合を記録した。
１．３．４脳切片の電気生理学的検出

【0066】

マウスの行動学的検出が終了した後に電気生理学的記録を行った。麻醉後に全てのマウスに安楽死を実施し、脳組織を迅速に回収し、４ ℃の酸素含有（９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２）人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（７５ｍＭショ糖、８７ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ）中、１．２５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、２１．４ｍＭＮａＨＣＯ_３、０．５ｍＭＣａＣｌ_２、７ｍＭＭｇＣｌ_２及び２０ｍＭグルコース）中に貯蔵した。海馬切片を振動ナイフにより４℃の酸素含有ＡＣＳＦ中で切断し、３２℃の酸素含有ＡＣＳＦ中にあった。次に、記録する前に切片を室温で１時間インキュベートした。海馬ＬＴＰは、二つの電気θパルス刺激（ＴＢＳ）により誘導された。Ｃｌａｍｐｅｘ及びＣｌａｍｐｆｉｔ８．２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いてデータの収集及び分析を行った。
１．３．５ＡＤ病理検出（免疫組織化学試験）

【0067】

動物行動学的検出が終了した後、マウスに対して心臓灌流を行った後に脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒドに２４ｈ固定し、３０％のショ糖で脱水させ、包埋剤で急速凍結し包埋し、脳切片（厚さ３０ μＭ）を行った。海馬領域がある脳切片を選択し、ＰＢＳで５ｍｉｎ×３回洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎで透過処理し、ＰＢＳで７ｍｉｎ×３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２．５％ＢＳＡ，０．３％Ｔｒｉｔｏｎ）を用いて１ｈブロックし、脳切片を一次抗体中に４℃で一晩放置した。翌日、脳切片を一次抗体から取り出し、ＰＢＳで５ｍｉｎ×３回洗浄し、脳切片を二次抗体中に入れ、室温で遮光して１ｈインキュベートし、脳切片を取り出し、ＰＢＳで５ｍｉｎ×３回洗浄し、ＤＡＰＩ含有抗蛍光消光剤を滴加し、マウントした。
１．４統計分析

【0068】

データはＭｅａｎ ± ＳＥＭとして表された。各群の間の統計学的分析はＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を用いて分析し、２群以上の比較は、Ｏｎｅ－ｗａｙ又はＴｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡを用いて検出した後、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＬＳＤｔｅｓｔを用いて分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを表す。ＷＴ群に比べて、＃＃ｐ＜０．０１であり、＃＃＃ｐ＜０．００１であり、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１であり、モデル群に比べて、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であり、＆ｐ＜０．０５，＆＆ｐ＜０．０１，＆＆＆＆ｐ＜０．０００１により、２群の比較を示した。
２．実験結果
２．１エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡＤトランスジェニックマウスの認知機能欠陥の改善

【0069】

Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験では、同齢の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、２４週齢の５×ＦＡＤマウスには認知機能欠陥が現れ、具体的には以下のとおりであり、隠しプラットフォーム訓練試験では、５×ＦＡＤマウスは、２～５日間の逃避期がＷＴマウスより有意に長く、プラットフォーム撤去試験では、５×ＦＡＤマウスは、目的象限での滞留時間及びプラットフォーム横断回数がいずれもＷＴマウスより明らかに少なかった。溶媒対照に比べて、８週齢から５×ＦＡＤマウスに６ｍｇ／ｋｇエダラボン又は７．５ｍｇ／ｋｇエダラボンデクスボルネオール組成物（６ｍｇ／ｋｇエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇデクスボルネオールを含有する）を１日１回腹腔内注射により投与し、１６週間連続投与して、５ｘＦＡＤマウスの水迷路隠しプラットフォーム試験での逃避潜伏期間を有意に短縮させ（エラー！参照元が見つかりませんＡ）、プラットフォーム撤去試験での目的象限における滞留時間及びプラットフォームを横断する回数を延長することができる（エラー！参照元が見つかりませんＢ、Ｃ）。エダラボン投与群に比べて、組成物投与は、隠しプラットフォーム試験の５日目に逃避潜伏期間がより短くなり、プラットフォーム撤去試験での目的象限における滞留時間がより有意に長くなり、プラットフォームを横断する回数もより多くなった（エラー！参照元が見つかりませんＡ、Ｂ及びＣ）。これにより、エダラボン及びエダラボン組成物は、いずれも５×ＦＡＤマウスの水迷路試験での学習記憶認知機能を改善することができ、且つ組成物の改善作用がエダラボンより有意に優れていることが示された。

【0070】

Ｙ－迷路では、同齢の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、２４週齢の５×ＦＡＤマウスには認知機能欠陥が現れ、具体的には以下のとおりであり、５×ＦＡＤマウスは、新たなアームへの進入率が有意に低下し、即ち空間参照記憶機能が低下した。溶媒対照に比べて、８週齢から５×ＦＡＤマウスに６ｍｇ／ｋｇエダラボン又は７．５ｍｇ／ｋｇエダラボンデクスボルネオール組成物（６ｍｇ／ｋｇエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇデクスボルネオールを含有する）を１日１回腹腔内注射により投与し、１６週間連続投与して、５×ＦＡＤマウスの新たなアームへの進入率を有意に増加させることができる。エダラボンに比べて、エダラボンデクスボルネオール組成物は、５×ＦＡＤマウスの新たなアームへの進入率を高める効力が有意に高かった（エラー！参照元が見つかりません）。これにより、エダラボン及びエダラボン組成物は、いずれも５×ＦＡＤマウスのＹ字迷路試験での空間参照記憶認知機能を改善することができ、且つ組成物の改善作用がエダラボンより有意に優れていることが示された。
２．２エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡＤマウス海馬領域シナプスの伝達機能の回復

【0071】

長期増強（ＬＴＰ）は、シナプス機能の可塑性を反映し、学習及び記憶の主なメカニズムの一つである。水迷路及びＹ－迷路検出が終了した後、電気生理学的検出により、５×ＦＡＤマウスの海馬の領域ＬＴＰが有意に損なわれることがわかった。５×ＦＡＤマウス群に比べて、組成物の投与はマウス海馬ＬＴＰを有意に回復させることができるが、エダラボンの投与は５×ＦＡＤマウスの海馬ＬＴＰに対して明らかな回復作用がなく、且つ組成物投与場合のＬＴＰ回復もエダラボン群より有意に優れていた（エラー！参照元が見つかりませんＡ、Ｂ及びＣ）。これにより、２４週齢の５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬領域シナプスの可塑性が損なわれており、一方、エダラボンデクスボルネオール組成物が海馬神経の可塑性を促進し、海馬ＬＴＰをより良好なレベルに回復できることが示された。
２．３エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡＤマウスの脳内ＡＤ病理の改善

【0072】

２４週齢の５×ＦＡＤマウスの脳内には、明らかなＡＤ病理が発生しており、βアミロイドプラーク、アストロサイト増殖、ミクログリア増殖及び海馬領域の神経細胞内ｔａｕタンパク質の過リン酸化を含む。溶媒対照群に比べて、８週齢から５×ＦＡＤマウスに６ｍｇ／ｋｇエダラボン又は７．５ｍｇ／ｋｇエダラボンデクスボルネオール組成物（６ｍｇ／ｋｇエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇデクスボルネオールを含有する）を１日１回腹腔内注射により投与し、１６週間連続投与して、脳内のＡＤ病理（βアミロイドプラーク、アストロサイト増殖、ミクログリア増殖）及び海馬領域のｔａｕリン酸化レベルを有意に低下させることができる。エダラボン投与群に比べて、エダラボンデクスボルネオール組成物は、ＡＤ病理（βアミロイドプラーク、アストロサイト増殖、ミクログリア増殖）の改善及びｔａｕリン酸化レベルの低下における効力に著しい優位性がある（エラー！参照元が見つかりません）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

【0002】

【背景技術】

【0003】

【0004】

【0005】

【0006】

【0007】

【0008】

エダラボンの化学構造式は以下のとおりであり、

【化1】

【0009】

デクスボルネオール（（＋）－ｂｏｒｎｅｏｌ）は、天然ボルネオールの主な成分であり（２０２０版中国薬典では、天然ボルネオールにおけるデクスボルネオール含有量が９６％以上であると規定されている）、二環式モノテルペン化合物であり、多くの漢方薬の揮発性油中に存在する。デクスボルネオールは、ＮＦ－κＢ及びｐ３８シグナル経路を調節し、炎症性神経炎を抑制し、脳内の複数の炎症促進因子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βなど）及び炎症性タンパク質（ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２）を減少させることができ（ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４．７４０：ｐ．５２２－３１、ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１７．８１１：ｐ．１－１１）、なお、さらに抑制性ＧＡＢＡＡ受容体を興奮させることができ、興奮性神経損傷を調節することができる（ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０２１．１２：ｐ．６０６６８２）。

【0010】

デクスボルネオールの化学構造式は以下のとおりであり、

【化2】

【0011】

【0012】

【発明の概要】

【0013】

【0014】

【0015】

【0016】

【0017】

【0018】

【0019】

本発明の一実施形態において、前記医薬組成物は、アルツハイマー病の認知機能を改善することができる。

【0020】

【0021】

【0022】

【0023】

本発明に記載のボルネオールは、好ましくは、天然ボルネオールであり、前記天然ボルネオールはデクスボルネオールとも呼ばれる。

【0024】

本発明に記載の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。

【0025】

【0026】

【0027】

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡβ_１－４２誘導性ニューロン損傷の保護を示した図である。

【図2】エダラボンデクスボルネオール組成物によるＩＣＶ－ＳＴＺの空間学習記憶認知機能の改善を示した図である。

【図3】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスの水迷路試験における認知機能に与える影響を示した図である。

【図4】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスのＹ字迷路試験における認知機能に与える影響を示した図である。

【図5】エダラボンデクスボルネオール組成物がＡＤトランスジェニックマウスの脳切片の電気生理学に与える影響を示した図である。

【図6】エダラボンデクスボルネオール組成物が５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの脳内ＡＤ関連病理に与える影響を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

【0030】

ＳＤ妊娠ラット、上海斯莱克実験動物有限責任公司（生産許可証番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１７－０００５）
１．２試薬及び消耗品

【0031】

【表1】

【0032】

【0033】

【数1】

【0034】

【表2】

【0035】

【0036】

オリゴマー化されたＡβ_１－４２は初代ニューロン生存細胞の生存率の低下を引き起こす。Ａβ_１－４２誘導前のエダラボン（３．７～１００ μＭ）又はデクスボルネオール（１．２～１００μＭ）のプレインキュベーション及び投与は、Ａβ誘導性神経毒性を濃度依存的に抑制し、細胞生存率を向上させることができる。異なる濃度のエダラボン（１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００．０μＭ）及びデクスボルネオール（１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００．０μＭ）の直交組成物は、Ａβによるニューロン損傷を抑制することができ、特にＥ５Ｂ４（３．３：１）、Ｅ５Ｂ３（９：１）、Ｅ４Ｂ５（１：３．３）、Ｅ４Ｂ４（１：１）、Ｅ４Ｂ３（３．３：１）、Ｅ３Ｂ５（１：９）、Ｅ３Ｂ４（１：３．３）、Ｅ３Ｂ３（１：１）、Ｅ３Ｂ２（３．３：１）、Ｅ３Ｂ１（９：１）及びＥ２Ｂ２（１：１）組成物の保護作用は、対応する個々の保護作用より有意に優れていた（図１）。これにより、エダラボンとデクスボルネオールとのモル比９：１～１：９（質量比１０：１～１：８）の比率範囲での組成物は相乗的な作用を有すると仮判断された。
実施例２：エダラボン及びデクスボルネオールの組成物による側脳室ＳＴＺ注射誘導性認知症ラットの認知機能の改善
１実験材料
１．１実験動物

【0037】

【0038】

【0039】

【0040】

【0041】

【0042】

【0043】

【0044】

（１）隠しプラットフォーム試験（ｈｉｄｄｅｎｐｌａｔｆｏｒｍｔｒｉａｌ）

【0045】

【0046】

（２）空間探索試験（ｐｒｏｂｅｔｒｉａｌ）

【0047】

【0048】

【0049】

水迷路隠しプラットフォーム試験では、偽手術群に比べて、側脳室ＳＴＺ（ＩＣＶ－ＳＴＺ）注射モデルは、逃避潜伏期間が有意に延長し、ＩＣＶ－ＳＴＺラットに認知機能障害が発生したことを示した。エダラボン（６ｍｇ／ｋｇ）又はエダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）の腹腔内注射は、ＩＣＶ－ＳＴＺラット逃避潜伏期間を有意に短縮することができる。エダラボン投与群に比べて、エダラボンデクスボルネオール（７．５：１、５：１及び２．５：１）組成物は、ＩＣＶ－ＳＴＺモデルラットに対する学習機能の向上がエダラボンよりも優れていた（図２Ａ）。水迷路空間探索試験では、ＩＣＶ－ＳＴＺモデルラットは、目的象限での滞留時間が有意に短縮された。モデル群に比べて、エダラボン（６ｍｇ／ｋｇ）又はエダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）腹腔内注射投与群は、ラットの目的象限での滞留時間が有意に延長し、且つエダラボンデクスボルネオール組成物（５：１及び２．５：１）群はエダラボン群より有意に優れていた（図２Ｂ）。そのため、エダラボンデクスボルネオール組成物（７．５：１、５：１及び２．５：１）は、ＩＣＶ－ＳＴＺラットの認知機能欠陥を有意に改善することができ、且つその効力がエダラボンより明らかに優れていた。
実施例３：エダラボンデクスボルネオール組成物の長期投与が５×ＦＡＤトランスジェニックマウスのＡＤ認知機能及びＡＤ病理に与える影響
１材料及び方法
１．１試験動物

【0050】

【0051】

【0052】

【0053】

ＷＴ：溶媒対照群：野生型マウス１０匹に、溶媒対照を、１０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。

【0054】

５×ＦＡＤ：溶媒群：５×ＦＡＤマウス１０匹に、溶媒対照を、１０ｍＬ／ｋｇの用量で、１日１回、ｉ．ｐ．投与した。

【0055】

【0056】

【0057】

実験開始前、環境に順応させるためにマウスを試験室に３０ｍｉｎほど置く必要がある。

【0058】

【0059】

パラメータ設定：試験時間を１ｍｉｎに設定し、マウスのプラットフォームでの滞留時間を２ｓに設定した。

【0060】

【0061】

【表3】

【0062】

【0063】

実験開始前、環境に順応させるためにマウスを試験室に３０ｍｉｎほど置く必要がある。

【0064】

【0065】

【0066】

【0067】

【0068】

【0069】

Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験では、同齢の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、２４週齢の５×ＦＡＤマウスには認知機能欠陥が現れ、具体的には以下のとおりであり、隠しプラットフォーム訓練試験では、５×ＦＡＤマウスは、２～５日間の逃避期がＷＴマウスより有意に長く、プラットフォーム撤去試験では、５×ＦＡＤマウスは、目的象限での滞留時間及びプラットフォーム横断回数がいずれもＷＴマウスより明らかに少なかった。溶媒対照に比べて、８週齢から５×ＦＡＤマウスに６ｍｇ／ｋｇエダラボン又は７．５ｍｇ／ｋｇエダラボンデクスボルネオール組成物（６ｍｇ／ｋｇエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇデクスボルネオールを含有する）を１日１回腹腔内注射により投与し、１６週間連続投与して、５ｘＦＡＤマウスの水迷路隠しプラットフォーム試験での逃避潜伏期間を有意に短縮させ（図３Ａ）、プラットフォーム撤去試験での目的象限における滞留時間及びプラットフォームを横断する回数を延長することができる（図３Ｂ、Ｃ）。エダラボン投与群に比べて、組成物投与は、隠しプラットフォーム試験の５日目に逃避潜伏期間がより短くなり、プラットフォーム撤去試験での目的象限における滞留時間がより有意に長くなり、プラットフォームを横断する回数もより多くなった（図３Ａ、Ｂ及びＣ）。これにより、エダラボン及びエダラボン組成物は、いずれも５×ＦＡＤマウスの水迷路試験での学習記憶認知機能を改善することができ、且つ組成物の改善作用がエダラボンより有意に優れていることが示された。

【0070】

Ｙ－迷路では、同齢の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、２４週齢の５×ＦＡＤマウスには認知機能欠陥が現れ、具体的には以下のとおりであり、５×ＦＡＤマウスは、新たなアームへの進入率が有意に低下し、即ち空間参照記憶機能が低下した。溶媒対照に比べて、８週齢から５×ＦＡＤマウスに６ｍｇ／ｋｇエダラボン又は７．５ｍｇ／ｋｇエダラボンデクスボルネオール組成物（６ｍｇ／ｋｇエダラボン及び１．５ｍｇ／ｋｇデクスボルネオールを含有する）を１日１回腹腔内注射により投与し、１６週間連続投与して、５×ＦＡＤマウスの新たなアームへの進入率を有意に増加させることができる。エダラボンに比べて、エダラボンデクスボルネオール組成物は、５×ＦＡＤマウスの新たなアームへの進入率を高める効力が有意に高かった（図４）。これにより、エダラボン及びエダラボン組成物は、いずれも５×ＦＡＤマウスのＹ字迷路試験での空間参照記憶認知機能を改善することができ、且つ組成物の改善作用がエダラボンより有意に優れていることが示された。
２．２エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡＤマウス海馬領域シナプスの伝達機能の回復

【0071】

長期増強（ＬＴＰ）は、シナプス機能の可塑性を反映し、学習及び記憶の主なメカニズムの一つである。水迷路及びＹ－迷路検出が終了した後、電気生理学的検出により、５×ＦＡＤマウスの海馬の領域ＬＴＰが有意に損なわれることがわかった。５×ＦＡＤマウス群に比べて、組成物の投与はマウス海馬ＬＴＰを有意に回復させることができるが、エダラボンの投与は５×ＦＡＤマウスの海馬ＬＴＰに対して明らかな回復作用がなく、且つ組成物投与場合のＬＴＰ回復もエダラボン群より有意に優れていた（図５Ａ、Ｂ及びＣ）。これにより、２４週齢の５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬領域シナプスの可塑性が損なわれており、一方、エダラボンデクスボルネオール組成物が海馬神経の可塑性を促進し、海馬ＬＴＰをより良好なレベルに回復できることが示された。
２．３エダラボンデクスボルネオール組成物によるＡＤマウスの脳内ＡＤ病理の改善

【0072】

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

認知障害の改善又は治療において使用するための組成物であって、３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びボルネオール又はデクスボルネオールを含有する、組成物。

【請求項2】

３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン又はその薬学的に許容可能な塩及びデクスボルネオールを含有する、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項3】