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特表2024-543124効率的なトランスフルクトシル化活性を有する突然変異体ＦＴアーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】効率的なトランスフルクトシル化活性を有する突然変異体ＦＴアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20241112BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241112BHJP
G16B 15/20 20190101ALI20241112BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12N1/19
C12N15/09 Z
G16B15/20
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024530524
(86)(22)【出願日】2022-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-07-02
(86)【国際出願番号】 IN2022051021
(87)【国際公開番号】W WO2023089639
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】202141053708
(32)【優先日】2021-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524192890
【氏名又は名称】レベレイションズ バイオテック プライベート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ビーラム，ラヴィ チャンドラ
(72)【発明者】
【氏名】シンハ，ディパンウィタ
(72)【発明者】
【氏名】バブー，ムスク バラス
(72)【発明者】
【氏名】サンカラ，ディーピカー
(72)【発明者】
【氏名】ラホティ，シュラッダ
(72)【発明者】
【氏名】アニルダーン，アルパ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA60Y
4B065AA77X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC01
4B065BD25
4B065CA29
4B065CA41
(57)【要約】
【課題】
本発明は、フルクトオリゴ糖の効率的な及びコスト効果が高い産生のための、トランスフルクトシル化活性を有する改善された微生物酵素に関する。
【解決手段】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属から突然変異体ＦＴアーゼ遺伝子ファミリーを得ることを対象とする。新規ＦＴアーゼの組換え発現のための核酸、ペプチド配列、突然変異体タンパク質、ベクター及び宿主細胞も提供される。種々の突然変異、例えば、限定されるものではないが、点突然変異及び欠失突然変異並びにそれらの組み合わせが本明細書に提示される。本発明は、分泌タンパク質としての新規組換えＦＴアーゼ突然変異体の発現のプロセスにも関する。酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
【選択図】なし
本発明は、フルクトオリゴ糖の効率的な及びコスト効果が高い産生のための、トランスフルクトシル化活性を有する改善された微生物酵素に関する。
【解決手段】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属から突然変異体ＦＴアーゼ遺伝子ファミリーを得ることを対象とする。新規ＦＴアーゼの組換え発現のための核酸、ペプチド配列、突然変異体タンパク質、ベクター及び宿主細胞も提供される。種々の突然変異、例えば、限定されるものではないが、点突然変異及び欠失突然変異並びにそれらの組み合わせが本明細書に提示される。本発明は、分泌タンパク質としての新規組換えＦＴアーゼ突然変異体の発現のプロセスにも関する。酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変ポリペプチドであって、限定されるものではないが、単一の点突然変異若しくは複数の点突然変異又は欠失突然変異或いはそれらの組み合わせから選択される突然変異を含むアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）のＦＴアーゼである改変ポリペプチド。
【請求項2】
前記点突然変異は、限定されるものではないが、Ｎ３２Ｒ、Ｒ１６６Ｙ、Ｈ２４０Ｆ、Ｈ４３Ｑ、Ｎ３２Ｋ、Ｔ１５５Ｗ、Ｒ２８６Ｉ、Ｖ３８２Ｌ、Ｑ４０６Ｒ、Ａ３７１Ｅ、Ｔ２９３Ｑ、Ｆ１１８Ｙ、Ｈ４３Ｙ、Ｒ１６６Ｎ、Ｆ２５９Ｗ、Ｈ４３Ｆ、Ｈ４３Ａ、Ｔ１５５Ｙ、Ｌ３２２Ｙ、Ｆ５６８Ｙ、Ｔ２９３Ｆ、Ａ３７１Ｍ、Ｔ２９３Ｖ、Ｌ７８Ｒ、Ｈ４３Ｖ、Ｆ１８２Ｐ、Ｒ２８６Ｖ、Ｈ４３Ｓ、Ｈ４３Ｎ、Ｔ１５５Ｍ、Ｉ３２４Ｑ、Ｑ５８６Ｋ、Ｔ２９３Ｈ、Ｅ４０５Ｗ、Ｔ２９３Ｙ、Ｌ７８Ｗ、Ｈ４３Ｌ、Ｆ１８２Ｒ、Ｖ３４３Ｆ、Ｐ１３１Ｒ、Ｈ４３Ｋ、Ｒ１６６Ｌ、Ｖ３４３Ｑ、Ｑ５８６Ｙ、Ｔ２９３Ｉ、Ｎ２９０Ｌ、Ａ１８８Ｈ、Ｎ２９０Ｋ、Ｈ４３Ｒ、Ｆ１８２Ａ、Ｖ３４３Ｌ、Ｔ１５５Ｌ、Ｖ１２７Ｉ、Ｒ１６６Ｑ、Ｖ３４３Ｋ、Ｑ５８６Ｖ、Ｔ２９３Ｋ、Ｎ２９０Ｍ、Ａ１８８Ｋ、Ｎ２９０Ｑ、Ｈ４３Ｔ、Ｆ１８２Ｄ、３８１Ｒ、Ｔ１５５Ｖ、Ｖ１２７Ｍ、Ｈ１８０Ｙ、Ｖ３４３Ｙ、Ｑ５８６Ｗ、Ｔ２９３Ｌ、Ｎ２９０Ｒ、Ｄ１９１Ａ、Ｑ３２７Ｃ、Ｈ４３Ｍ、Ｆ１８２Ｖ、Ａ３８１Ｌ、Ｒ１６６Ｋ、Ｐ１３１Ｈ、Ｈ１８０Ｒ、Ｖ３４３Ｉ、Ａ１８８Ｒ、Ｔ２９３Ｒ、Ｑ３２７Ａ、Ｄ１９１Ｎ、Ｑ３２７Ｉ、Ｈ４３Ｉ、Ｆ１８２Ｔ、Ｌ４４０Ｒ、Ｒ１６６Ｈ、Ｐ１３１Ｆ、Ｆ１８２Ｍ、Ａ３８１Ｖ、Ｄ１９１Ｋ、Ｔ２９３Ｓ、Ｑ３２７Ｄ、Ｄ１９１Ｗ、Ｑ３２７Ｋ、Ｖ１２５Ｆ、Ｆ１８２Ｌ、Ｑ５８６Ｒ、Ｆ１８２Ｅ、Ｐ１３１Ｑ、Ｆ１８２Ｈ、Ａ３８１Ｋ、Ｄ１９１Ｒ、Ｔ２９３Ｗ、Ｑ３２７Ｅ、Ａ３７１Ｌ、Ｑ３２７Ｖ、Ｖ１２７Ａ、Ｆ１８２Ｗ、Ｎ３２Ｑ、Ａ３８１Ｉ、Ｔ１３２Ｌ、Ｆ１８２Ｓ、Ａ３８１Ｐ、Ｑ３２７Ｇ、Ａ１８８Ｆ、Ｑ３２７Ｆ、Ａ３７１Ｖ、Ｑ４０６Ｋ、Ｐ１３１Ｙ、Ｆ１８２Ｎ、Ｎ３２Ｖ、Ｑ５８６Ｆ、Ｔ１３２Ｍ、Ｙ２３２Ｗ、Ａ３８１Ｑ、Ｑ３２７Ｈ、Ａ１８８Ｑ、Ｑ３２７Ｒ、Ｅ４０５Ｆ、Ｑ４０６Ｍ、Ｐ１３１Ｗ、Ｆ１８２Ｋ、Ｈ４３Ｗ、Ｎ３２Ｄ、Ｔ１３２Ｖ、Ｈ２４０Ｒ、Ａ３８１Ｔ、Ｑ３２７Ｌ、Ｄ１９１Ｅ、Ｑ４０６Ｌ、Ｅ４０５Ｇ、Ｓ３２９Ｎ、Ｔ１５５Ｒ、Ｆ１８２Ｑ、Ｈ４３Ｅ、Ｎ３２Ｉ、Ｔ１３２Ｉ、Ｈ２４０Ｋ、Ａ３８１Ｙ、Ｑ３２７Ｍ、Ｄ１９１Ｆ、Ｔ２９３Ｍ、Ｅ４０５Ｌ、Ｓ３２９Ｔ、Ｔ１５５Ｋ、Ｒ１９６Ｋ、Ｈ４３Ｄ、Ｎ３２Ｙ、Ｔ１５５Ｉ、Ｆ２５９Ｙ、Ｖ３８２Ｉ、Ｑ３２７Ｎ、Ｄ１９１Ｑ、Ｔ２９３Ｎ、Ｅ４０５Ｎ、Ｙ４０４Ｗ、Ｖ４４Ｌ、Ｋ１９９Ｒ、Ｒ４５９Ｔ、Ｎ６５４Ｋ、Ｌ４４Ｖ、Ｒ１９９Ｋ、Ｔ４５９Ｒ、Ｋ６５４Ｎから選択される、請求項１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項3】
前記欠失突然変異は、限定されるものではないが、３２～６５４ａａ、３２～１９４ａａ、１～１９４ａａから選択される、請求項１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項4】
ポリペプチド配列は、限定されるものではないが、配列番号９～２１８から選択される、請求項１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチド配列は、配列番号９～６６から選択される、請求項４に記載の改変ポリペプチド。
【請求項6】
請求項１に記載の改変ポリペプチドをコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド。
【請求項7】
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、ＦＡＫ、ＦＡＫＳ、ＡＴ、ＡＡ、ＧＡ、ＩＮ、ＩＶ、ＫＰ、ＬＺ及びＳＡ又はそのバリアントを含む群から選択されるシグナルペプチドにさらに融合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項8】
ａ．ＦＡＫは、配列番号２１９のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ｂ．ＦＡＫＳは、配列番号２２９のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｃ．ＡＴは、配列番号２２０のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｄ．ＡＡは、配列番号２２１のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｅ．ＧＡは、配列番号２２２のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｆ．ＩＮは、配列番号２２３のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｇ．ＩＶは、配列番号２２４のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｈ．ＫＰは、配列番号２２５のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
ｉ．ＬＺは、配列番号２２６のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、及び
ｊ．ＳＡは、配列番号２２７のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
前記シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を可能にする、請求項７に記載の改変ポリペプチド。
【請求項9】
プロモーターに作動可能に結合されている、請求項６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項10】
ＦＴアーゼ遺伝子のための前記プロモーターは、ＡＯＸ１、ＡＤＨ３、ＤＡＳ、ＦＬＤ１、ＬＲＡ３、ＴＨＩ１１、ＧＡＰ、ＹＰＴ１、ＴＥＦ１、ＧＣｗ１４及びＰＧＫ１を含む群から選択される構成的、誘導性プロモーターである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項11】
ｐＰＩＣＺαＡ、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＰＩＣＺαＣ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＧＡＰＺαＢ、ｐＧＡＰＺαＣ、ｐＰＩＣ３、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ＰＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＨＩＬ－Ｄ２及びｐＨＩＬ－Ｓ１並びにＦＴアーゼの分泌又は細胞内発現のために構成された発現ベクターを含む群から選択される、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項12】
請求項９に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞であって、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）及びハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）を含む群から選択される組換え宿主細胞。
【請求項13】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｍｕｔ＋、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１Ｈ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＭＤ１１６８Ｈ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＭＤ１１６８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｘ３３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＧＳ１１５又は任意の他のピキア・パストリス（Pichia pastoris）宿主株を含む群から選択される、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項14】
請求項１に記載のアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の改変ＦＴアーゼを発現することができる組換え宿主細胞を産生する方法であって、ａ．請求項６に記載の改変核酸分子を合成するステップと、
ｂ．前記改変核酸分子を保有するベクターを構築するステップと、
ｃ．宿主細胞をステップ（ｂ）の前記ベクターで形質転換して、組換え宿主細胞を得るステップと
を含む方法。
【請求項15】
前記改変核酸分子は、請求項２に記載の少なくとも１つ以上の点突然変異若しくは請求項３に記載の欠失突然変異又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１に記載のアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の改変ＦＴアーゼを発現させるプロセスであって、ａ．アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）のＦＴアーゼを発現することができる組換え宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して、発酵ブロスを得ることと、
ｂ．前記発酵ブロスから上清を回収することであって、前記上清は、組換えＦＴアーゼを含有する、回収することと、
ｃ．組換えＦＴアーゼを精製することと
を含むプロセス。
【請求項17】
前記発酵培地は、基礎塩培地である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項18】
前記発酵ブロスのｐＨは、４．０～７．５の範囲に維持され、前記発酵ブロスの温度は、１５℃～４５℃の範囲に維持される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項19】
活性部位を含むＦＴアーゼタンパク質にわたるアミノ酸の突然変異を同定するプロセスであって、ステップは、ａ．バイオインフォマティクスツールを使用して、ＦＴアーゼ酵素のａｐｏ構造をシミュレーションすることと、
ｂ．根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の変動に基づいてトラジェクトリーをクラスタリングして、ユニークな立体構造を同定することと、
ｃ．前記ＦＴアーゼ酵素が突然変異についてのシミュレーション残基の過程中に採用した前記ユニークな立体構造を同定することと、
ｄ．ステップ（ｃ）の前記同定されたユニークな立体構造を、各アミノ酸が別のアミノ酸と行ったペアワイズ相互作用について分析することと、
ｅ．残基のペア間のファンデルワールス及び水素結合についての適切な重みを提供することにより、指標相互作用強度として前記アミノ酸の前記ペアワイズ相互作用を定量することと、
ｆ．前記シミュレーションの前記過程を通して前記相互作用強度のより大きい標準偏差を有することが見出された各アミノ酸の１９個の突然変異を生成することと、
ｇ．－ΔΔＧ値に従って同様の又はより良好な安定性を有する安定化突然変異を同定及び選択することと
を含む、プロセス。
【請求項20】
前記タンパク質は、アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）から選択される、請求項１９に記載のプロセス。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、フルクトオリゴ糖の効率的な及びコスト効果が高い産生のための、トランスフルクトシル化活性を有する改善された微生物酵素を得ることに向けられた遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）から突然変異体ＦＴアーゼ遺伝子ファミリーを得ることを対象とする。
本発明は、フルクトオリゴ糖の効率的な及びコスト効果が高い産生のための、トランスフルクトシル化活性を有する改善された微生物酵素を得ることに向けられた遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）から突然変異体ＦＴアーゼ遺伝子ファミリーを得ることを対象とする。
【背景技術】
【0002】
背景
フルクトースオリゴマーは、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）としても公知であり、一連の同族オリゴ糖を構成する。フルクトオリゴ糖は、通常、式ＧＦｎによって表され、主に２、３及び４つのフルクトシル単位がグルコースのβ－２，１位で結合している１－ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）及びβ－フルクトフラノシルニストース（ＧＦ４）から構成される。
フルクトースオリゴマーは、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）としても公知であり、一連の同族オリゴ糖を構成する。フルクトオリゴ糖は、通常、式ＧＦｎによって表され、主に２、３及び４つのフルクトシル単位がグルコースのβ－２，１位で結合している１－ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）及びβ－フルクトフラノシルニストース（ＧＦ４）から構成される。
【0003】
フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、多くの有益な特性、例えば低甘味強度及びプレバイオティックとしての有用性によって特徴付けられる。低甘味強度（スクロースと比較して約３分の１～３分の２）及び低発熱量（およそ０～３ｋｃａｌ／ｇ）に起因して、フルクトオリゴ糖は、種々の食品中で糖代用品として使用され得る。さらに、プレバイオティックとして、フルクトオリゴ糖は、結腸癌に対する保護剤としての使用、免疫系の種々のパラメータの向上、ミネラル吸着の改善、血清脂質及びコレステロール濃度に対する有益な効果並びに肥満及び糖尿病の管理のための血糖管理の効果付与について報告されている（Dominguez, Ana Luisa, et al.“An overview of the recent developments on fructooligosaccharide production and applications.”Food and bioprocess technology 7.2 (2014): 324-337）。
【0004】
しかしながら、フルクトオリゴ糖は、果実、野菜及び蜂蜜中の天然構成成分として微量で見出されるにすぎない。このような低濃度に起因して、食料からフルクトオリゴ糖を抽出することは、事実上不可能である。
【0005】
トランスフルクトシル化活性を有する微生物酵素によるスクロースからの酵素的合成を介してフルクトオリゴ糖を産生する試みが行われてきた。しかしながら、従来の試みの主な制約は、より低い触媒効率、より低いＦＯＳ収率をもたらす、グルコースによる酵素のフィードバック阻害及び組換え宿主系中で発現される酵素によるスクロースの変換のためのより長い期間の条件であった。さらに、トランスフルクトシル化活性を示す微生物酵素の工業的産生は、酵素の大規模発現、酵素安定性、発酵及び精製プロセスに伴う追加の制限に起因して困難である。
【0006】
フルクトオリゴ糖の商業規模産生は、効率的な酵素の同定及び大量産生を要求する。上記の制限に起因して、効率的なトランスフルクトシル化活性を有する微生物酵素の産生は、したがって、フルクトオリゴ糖の産生コストを増加させるコストがかさむ事案である。
【0007】
したがって、次いでフルクトオリゴ糖の産生のコストを低下させる、優れたトランスフルクトシル化活性を有する効率的で安価で工業的に有用な酵素を同定及び提供することが長期にわたって継続的に必要とされている。
【0008】
ＦＴアーゼ遺伝子／タンパク質ファミリーとしては、いくつかの酵素、例えば、限定されるものではないが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からのβ－フルクトフラノシダーゼ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）からのフルクトシルトランスフェラーゼ、アスペルギルス・フィジエンシス（Aspergillus fijiensis）からのアラビナナーゼ／レバンスクラーゼ／インベルターゼ及びアスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）からのフルクトシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３及び４）によって表される。これらの酵素は、トランスフルクトシル化活性を示し、したがってフルクトオリゴ糖の産生で重要である。
【0009】
β－フルクトフラノシダーゼ及びフルクトシルトランスフェラーゼは、アスペルギルス属（Aspergillus）から産生されているが、効率的及びコスト効率的な酵素が依然として要求されている。本発明は、より良好な酵素を良好な量で得ることができるような種々の突然変異体及び種々の株を生成することにより、先行技術における上記の課題に対処することを試みる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
発明の概要
技術的課題
本発明で解決される技術的課題は、優れたトランスフルクトシル化活性を有する新規酵素を提供することである。
技術的課題
本発明で解決される技術的課題は、優れたトランスフルクトシル化活性を有する新規酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
課題に対する解決手段
課題は、ユニーク酵素工学及びアスペルギルス属（Aspergillus）からのＦＴアーゼの突然変異体を開発するためのバイオインフォマティクスベースアプローチを用いることによって解決された。
課題は、ユニーク酵素工学及びアスペルギルス属（Aspergillus）からのＦＴアーゼの突然変異体を開発するためのバイオインフォマティクスベースアプローチを用いることによって解決された。
【0012】
発明の概要
本発明は、新規ＦＴアーゼ、例えば、限定されるものではないが、β－フルクトフラノシダーゼ又はフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の組換え発現のための核酸、ペプチド配列、突然変異体タンパク質、ベクター及び宿主細胞に関する。種々の突然変異体、例えば、限定されるものではないが、点突然変異体及び欠失突然変異体並びにそれらの組み合わせが本明細書に提示される。本発明は、分泌タンパク質としての新規組換えＦＴアーゼ突然変異体の発現のプロセスにも関する。酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
本発明は、新規ＦＴアーゼ、例えば、限定されるものではないが、β－フルクトフラノシダーゼ又はフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の組換え発現のための核酸、ペプチド配列、突然変異体タンパク質、ベクター及び宿主細胞に関する。種々の突然変異体、例えば、限定されるものではないが、点突然変異体及び欠失突然変異体並びにそれらの組み合わせが本明細書に提示される。本発明は、分泌タンパク質としての新規組換えＦＴアーゼ突然変異体の発現のプロセスにも関する。酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
【0013】
最後に、酵素は、フルクトオリゴ糖の高い収率を得るために使用され得る。
【0014】
図面の簡単な説明
本開示の特徴は、添付図と併せて以下の詳細な説明から詳細に明らかになる。図が本開示によるいくつかの実施形態を示すにすぎず、その範囲を限定するとみなされるべきではないという理解のもと、本開示は、添付図の使用を通してさらに説明される。
本開示の特徴は、添付図と併せて以下の詳細な説明から詳細に明らかになる。図が本開示によるいくつかの実施形態を示すにすぎず、その範囲を限定するとみなされるべきではないという理解のもと、本開示は、添付図の使用を通してさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】いくつかの代表的なアスペルギルス属（Aspergillus）からの天然ＦＴアーゼの多重配列アラインメントを示す。
【図2a-1】天然ｆｏｐＡ遺伝子と改変ｆｏｐＡ遺伝子との多重配列アラインメントを示す。
【図2a-2】天然ｆｏｐＡ遺伝子と改変ｆｏｐＡ遺伝子との多重配列アラインメントを示す。
【図2b-1】天然ｆｔ遺伝子と改変ｆｔ遺伝子との多重配列アラインメントを示す。
【図2b-2】天然ｆｔ遺伝子と改変ｆｔ遺伝子との多重配列アラインメントを示す。
【図3】ｐＰＩＣＺαＡベクターの構築スキームを表す。
【図4-1】（ａ）：Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：Ｔ１５５Ｒ；（ｃ）：Ｔ２９３Ｗ及びＲ２８６Ｖ、を含有する組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡに対して実施された制限消化分析の結果を示す。
【図4-2】（ｄ）：Ｔ４５９Ｒ；（ｅ）：Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：Ｆ１８２Ｐ；（ｇ）：３２～６５４ａａ、３２～１９４ａａ及び１～１９４ａａ突然変異体、を含有する組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡに対して実施された制限消化分析の結果を示す。
【図5-1】インテグレーション（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ１５５Ｒを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図5-2】インテグレーション（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ２８６Ｖを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図5-3】インテグレーション（ｅ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ４５９Ｒを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図5-4】インテグレーション（ｇ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｆ１８２Ｐを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図6-1】種々の突然変異体ＦＴアーゼタンパク質の発酵追跡中の異なる時間間隔で回収されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ１５５Ｒ。
【図6-2】種々の突然変異体ＦＴアーゼタンパク質の発酵追跡中の異なる時間間隔で回収されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ２８６Ｖ。
【図6-3】種々の突然変異体ＦＴアーゼタンパク質の発酵追跡中の異なる時間間隔で回収されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。（ｅ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ４５９Ｒ；（ｇ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｆ１８２Ｐ。
【図7-1】突然変異体酵素によるスクロースからのＦＯＳの形成を示すＴＬＣを示す。（ａ）：Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：Ｔ１５５Ｒ。
【図7-2】突然変異体酵素によるスクロースからのＦＯＳの形成を示すＴＬＣを示す。（ｃ）：Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：Ｒ２８６Ｖ。
【図7-3】突然変異体酵素によるスクロースからのＦＯＳの形成を示すＴＬＣを示す。（ｅ）：Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：Ｔ４５９Ｒ；（ｇ）：Ｆ１８２Ｐ。
【図8-1】突然変異体酵素によって形成されたＦＯＳサンプルのＨＰＬＣ分析クロマトグラフを示す。（ａ）：Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：Ｔ１５５Ｒ。
【図8-2】突然変異体酵素によって形成されたＦＯＳサンプルのＨＰＬＣ分析クロマトグラフを示す。（ｃ）：Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：Ｒ２８６Ｖ。
【図8-3】突然変異体酵素によって形成されたＦＯＳサンプルのＨＰＬＣ分析クロマトグラフを示す。（ｅ）：Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：Ｔ４５９Ｒ。
【図8-4】突然変異体酵素によって形成されたＦＯＳサンプルのＨＰＬＣ分析クロマトグラフを示す。（ｇ）：Ｆ１８２Ｐ。
【図9-1】（ａ）：Ｎ３２Ｒ、Ｈ４３Ｙ、Ｈ４３Ｖ、Ｈ４３Ｌ、Ｖ１２５Ｆ、Ｖ１２７Ａ、Ｐ１３１Ｙ；（ｂ）：Ｆ１８２Ｒ、Ｆ１８２Ａ、Ｆ１８２Ｄ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｔ、Ｔ２９３Ｆ、Ｔ２９３Ｈを含有する組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡに対して実施された制限消化分析の結果を示す。
【図9-2】（ｃ）：Ｔ２９３Ｒ、Ｔ２９３Ｌ、Ｔ２９３Ｓ、Ｑ３２７Ｌ；（ｄ）：Ｑ３２７Ｎ、Ｖ３４３Ｆを含有する組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡに対して実施された制限消化分析の結果を示す。
【図10-1】インテグレーション（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｈ４３Ｙ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｈ４３Ｌを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図10-2】インテグレーション（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｑ３２７Ｎ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ３４３Ｆを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株におけるタンパク質発現をスクリーニングするためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図11】ＦＴアーゼ中の安定化点突然変異を同定するためのワークフローを示す。
【図12】ｆｔ遺伝子及びｆｏｐＡ遺伝子の比較配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
配列及び配列表の簡単な説明
【0017】
【表1】
【0018】
【表2】
【0019】
【表3】
【0020】
【表4】
【0021】
【表5】
【0022】
【表6】
【0023】
【表7】
【0024】
【表8】
【0025】
【表9】
【0026】
定義
特に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本方法が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は均等な任意のベクター、宿主細胞、方法及び組成物もベクター、宿主細胞、方法及び組成物の実施又は試験で使用され得るが、代表的な説明がここで記載される。
特に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本方法が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は均等な任意のベクター、宿主細胞、方法及び組成物もベクター、宿主細胞、方法及び組成物の実施又は試験で使用され得るが、代表的な説明がここで記載される。
【0027】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限間の各介在値並びにその記述範囲中の任意の他の記述値又は介在値は、本方法及び組成物に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立に含めることができ、記述範囲の任意の具体的に除外される限度に従ってそれぞれの範囲も本方法及び組成物に包含される。記述範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除外する範囲も本方法及び組成物に含まれる。
【0028】
明確性のため、別個の実施形態に関連して記載される方法のある特徴は、単一の実施形態との組み合わせでも提供され得ることが認識される。逆に、簡潔性のため、単一の実施形態に関連して記載される方法及び組成物の種々の特徴は、別個に又は任意の好適な下位の組み合わせでも提供され得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、特に文脈が明示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素も除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の引用に関する「唯一」、「のみ」などのような排他的用語の使用又は「否定的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
【0029】
本開示を読むことで当業者に明らかなとおり、本明細書に記載及び説明される個々の実施形態の各々は、区別される構成要素及び特徴を有し、それらは、本方法の範囲からも趣旨からも逸脱することなく、他の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか又はそれと組み合わされ得る。任意の引用される方法は、引用される事象の順序又は論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。
【0030】
用語「宿主細胞」には、発現構築物の対象のためのレシピエントであり得るか又はあり得た個々の細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれる。本発明の目的のための宿主細胞は、本発明の目的のために好適に使用され得るピキア・パストリス（Pichia pastoris）の任意の株を指す。本発明の目的のために使用され得る株の例としては、ピキア属（Pichia）の野生型、ｍｕｔ＋、ｍｕｔ Ｓ、ｍｕｔ－株、例えばＫＭ７１Ｈ、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、Ｘ３３が挙げられる。
【0031】
用語「組換え株」又は「組換え宿主細胞」は、本発明の発現構築物又はベクターで形質移入又は形質転換された宿主細胞を指す。
【0032】
用語「発現ベクター」は、挿入される核酸配列の、宿主中への形質転換後の発現を可能にするように設計される任意のベクター、プラスミド又はビヒクルを指す。
【0033】
用語「プロモーター」は、遺伝子の転写がいずれの箇所で開始するかを定義するＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位の直接上流又は５’末端に位置する。ＲＮＡポリメラーゼ及び必要な転写因子がプロモーター配列に結合し、転写を開始させる。プロモーターは、構成的又は誘導性プロモーターのいずれかであり得る。構成的プロモーターは、その関連遺伝子の発現が、通常、環境及び発生因子によって条件付けされないため、その関連遺伝子の継続的転写を可能にするプロモーターである。構成的プロモーターは、遺伝子工学で極めて有用なツールであり、なぜなら、構成的プロモーターは、誘導物質を有さない条件下で遺伝子発現を駆動し、一般に使用される誘導性プロモーターよりも良好な特徴を示すことが多いためである。誘導性プロモーターは、生物又は非生物及び化学又は物理的因子の存在又は不存在によって誘導されるプロモーターである。誘導性プロモーターは、遺伝子工学で極めて強力なツールであり、なぜなら、それらに作動可能に結合している遺伝子の発現を、生物の又は特定の組織若しくは細胞タイプにおける発生又は成長のある段階でオン又はオフに切り替えることができるためである。
【0034】
用語「作動可能に結合している」は、一方の機能が他方によって調節されるような単一核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現を調節し得る場合、コード配列と作動可能に結合している（すなわち、そのコード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。
【0035】
用語「転写」は、遺伝子配列のＲＮＡコピーを作製するプロセスを指す。このコピーは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と呼ばれ、細胞核を出て細胞質に入り、細胞質において、そのコピーは、それがコードするタンパク質の合成を指向する。
【0036】
用語「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の配列をタンパク質合成中にアミノ酸の配列に翻訳するプロセスを指す。遺伝子コードは、遺伝子中の塩基対の配列と、それがコードする対応するアミノ酸配列との間の関係を記載する。細胞質中では、リボソームがｍＲＮＡの配列を３塩基ずつのグループで読み取ってタンパク質を組み立てる。
【0037】
用語「発現」は、コード配列によってコードされる産物の生物学的産生を指す。ほとんどの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列は、転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が形成される。次いで、メッセンジャーＲＮＡが翻訳されて、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物が形成される。発現のプロセスは、転写のＲＮＡ産物に対するさらなるプロセシングステップ、例えばイントロンを除去するためのスプライシング及び／又はポリペプチド産物の翻訳後プロセシングも含み得る。
【0038】
本明細書で使用される用語「改変ポリペプチド／ポリヌクレオチド」は、限定されるものではないが、シグナルペプチドに融合されているβ－フルクトフラノシダーゼ及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼ突然変異体から選択されるポリペプチドＦＴアーゼ又はそれをコードするポリヌクレオチドを指すために使用される。機能バリアントには、本明細書に記載のβ－フルクトフラノシダーゼ及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼ突然変異体とかなりの又は顕著な配列同一性又は類似性を有し、それらの生物学的活性を保持する任意の核酸が含まれる。
【0039】
前駆体ペプチド／タンパク質に関して本明細書で使用される用語「バリアント」は、シグナルペプチド又は酵素の活性を実質的に減少させないアミノ酸置換、付加、欠失又は変更を有するペプチドを指す。バリアントには、構造及び機能バリアントが含まれる。バリアントという用語には、非置換親アミノ酸に代わる置換アミノ酸の使用も含まれる。
【0040】
機能的に類似するアミノ酸を提供するアミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つのグループ（表１）は、互いについてのバリアントとみなされるアミノ酸の例である。
【0041】
【表10】
【0042】
用語「点突然変異」は、ヌクレオチドが別のヌクレオチドに交換されるようなＤＮＡの単一ヌクレオチドの変化を表す突然変異、又はヌクレオチドが欠失されるか若しくは単一ヌクレオチドがＤＮＡ中に挿入され、それによりＤＮＡが通常又は野生型遺伝子配列と異なるようになる突然変異の大きいカテゴリーを指す。
【0043】
用語「欠失突然変異」は、遺伝子材料の損失を伴う突然変異のタイプを指す。これは、単一ミッシングＤＮＡ塩基対を伴う小規模のものであり得るか、又は染色体の一部分を伴う大規模のものであり得る。
【0044】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合によって互いに連結している２つ以上のアミノ酸残基を指すために本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然発生アミノ酸の人工化学模倣体である、アミノ酸ポリマー並びに天然発生アミノ酸ポリマー、改変残基を含有するもの及び非天然発生アミノ酸ポリマーに当てはまる。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと称される短鎖及び一般にタンパク質と称される長鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。同様に、「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸を指し、それには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが含まれる。タンパク質は、天然発生アミノ酸及びペプチド結合又は合成ペプチド模倣構造から構成され得る。したがって、「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、本明細書で使用される場合、天然発生及び合成アミノ酸の両方を意味する。「アミノ酸」には、イミノ酸残基、例えばプロリン及びヒドロキシプロリンが含まれる。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置のいずれかであり得る。
【0045】
用語「シグナルペプチド」又は「シグナルペプチド配列」は、ポリペプチドを細胞の細胞膜（原核生物では原形質膜及び真核生物では小胞体膜）にわたって又はその中に指向する、新たに合成される分泌又は膜ポリペプチドのＮ末端に通常存在するペプチド配列として本明細書で定義される。これは、通常、続いて除去される。特に、前記シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路中に指向することが可能であり得る。
【0046】
本明細書で使用される用語「前駆体ペプチド」は、アスペルギルス属（Aspergillus）からのそれぞれのＦＴアーゼに作動可能に結合しているシグナルペプチド（リーダー配列としても公知）を含むペプチドを指す。シグナルペプチドは、ピキア属（Pichia）宿主細胞内部の翻訳後修飾中に開裂除去され、成熟ＦＴアーゼ突然変異体が培地中に放出される。
【0047】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の具体的な実施形態によって記載される。当業者は、本明細書の開示を読んだ後に本発明の他の利点及び機能を容易に理解することができる。本明細書に記載の種々の詳細は、異なる条件及び用途に基づき、ここで開示される本発明の範囲から逸脱せずに改変され得る。
本発明は、以下の具体的な実施形態によって記載される。当業者は、本明細書の開示を読んだ後に本発明の他の利点及び機能を容易に理解することができる。本明細書に記載の種々の詳細は、異なる条件及び用途に基づき、ここで開示される本発明の範囲から逸脱せずに改変され得る。
【0048】
禁忌が示されるか又は特に記述のない限り、本明細書全体にわたり、用語「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、１つ以上を意味し、用語「又は」は、及び／又はを意味する。
【0049】
「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」、「含有している」、「包含する（include）」、「包含する（includes）」及び「包含している」の使用は、限定的であることを意図されない。上記の概要及びこの詳細な説明の両方が例示及び説明にすぎず、限定的なものでないことを理解されたい。
【0050】
本明細書で使用される場合、バイオテクノロジー用語は、以下の説明的定義によって説明されるとおり、その慣用的な意味を有する。
【0051】
特に定義のない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【0052】
上記は、以下の本開示の詳細な説明がより良好に理解され得るように、本開示の特徴及び技術的利点を広く概述している。開示される概念及び具体的な実施形態を、開示される方法を改変するか又は本開示の同じ目的を実施するための基礎として容易に利用できることが当業者によって認識されるべきである。
【0053】
フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素は、保持型機序を介して、フルクトースオリゴ糖であるフルクタンの産生を触媒するグルコースヒドロラーゼ３２ファミリー（ＧＨ３２）のメンバーである。この酵素によって行われる基質結合及び触媒作用の構造基礎を提供するアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）からの酵素ＦＴ（ＡｊＦＴ）の三次元構造は、解明されている。Chuankhayan et. al.［１］によって解明された構造のうち、ＡｊＦＴのａｐｏ構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＦ７）及びケストース結合（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＤＲ）構造が本研究に関連する。
【0054】
本発明は、限定されるものではないが、分泌タンパク質としてのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からのβ－フルクトフラノシダーゼ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）からのフルクトシルトランスフェラーゼ、アスペルギルス・フィジエンシス（Aspergillus fijiensis）からのアラビナナーゼ／レバンスクラーゼ／インベルターゼ、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）からのフルクトシルトランスフェラーゼ、アスペルギルス属（Aspergillus）から得られるそれらの突然変異体を含む、生物学的に活性で可溶性の組換えＦＴアーゼの効率的な産生のための核酸、ベクター及び組換え宿主細胞を開示する。さらに本発明は、組換えβ－フルクトフラノシダーゼ及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼ突然変異体の商業規模産生のプロセスを提供する。代表例であるが、限定的でない例として、本発明者らは、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）のｆｔ遺伝子によってコードされるフルクトシルトランスフェラーゼ及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のｆｏｐＡ遺伝子によってコードされるβ－フルクトフラノシダーゼに言及する。
【0055】
本発明は、異種宿主中の新規組換えＦＴアーゼ突然変異体の高い収率を達成するための多次元アプローチを企図する。限定されるものではないが、フルクトシルトランスフェラーゼ又はβ－フルクトフラノシダーゼ、アラビナナーゼ／レバンスクラーゼ／インベルターゼから選択されるＦＴアーゼについてのコドン最適化遺伝子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の発現のために突然変異によって改変されている。突然変異は、点突然変異若しくは欠失突然変異又はそれらの組み合わせであり得る。
【0056】
一実施形態では、β－フルクトフラノシダーゼ及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼについてのコドン最適化遺伝子は、異種宿主細胞中の発現のために改変されている。さらに、改変遺伝子は、１つ以上のシグナルペプチドに融合されている。
【0057】
一実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ－フルクトフラノシダーゼをコードするコドン最適化核酸は、配列番号６によって表される。
【0058】
一実施形態では、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）の改変フルクトシルトランスフェラーゼをコードするコドン最適化核酸は、配列番号８によって表される。
【0059】
別の実施形態では、改変核酸は、１つ以上のシグナルペプチドに融合されている。
【0060】
別の実施形態では、シグナルペプチドは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子（ＦＡＫ）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子全長型（ＦＡＫＳ）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼ（ＧＡ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromycesmaxianus）のイヌリナーゼ（ＩＮ）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のインベルターゼ（ＩＶ）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のキラータンパク質（ＫＰ）、ガルス・ガルス（Gallus gallus）のリゾチーム（ＬＺ）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）の血清アルブミン（ＳＡ）から選択される。
【0061】
別の実施形態では、シグナルペプチドは、表２に提供される。
【0062】
【表11】
【0063】
別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の回収されたβ－フルクトフラノシダーゼ及びアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）からのフルクトシルトランスフェラーゼを特性評価して生物活性断片を同定した。保存されたＦＴアーゼの以下の生物活性断片が触媒活性の要因であることが見出され、以下の表３に提供される。
【0064】
【表12】
【0065】
別の実施形態では、全ての分泌シグナルペプチド配列において、４つのアミノ酸（ＬＥＫＲ）のストレッチを、表４に提供されるプレタンパク質の効率的なＫｅｘ２プロセシングのために付加した。
【0066】
【表13】
【0067】
【表14】
【0068】
別の実施形態では、改変核酸は、発現ベクター中でクローニングされる。
【0069】
別の実施形態では、発現ベクターは、アスペルギルス属（Aspergillus）からの組換えＦＴアーゼの分泌又は細胞内発現のために構成される。
【0070】
さらに別の実施形態では、発現ベクターは、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＰＩＣＺαＣ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＧＡＰＺαＢ、ｐＧＡＰＺαＣ、ｐＰＩＣ３、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ＰＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＨＩＬ－Ｄ２及びｐＨＩＬ－Ｓ１を含む群から選択される。
【0071】
別の実施形態では、シグナルペプチドに融合されている改変ＦＴアーゼ遺伝子の発現は、好ましくは、構成的又は誘導性プロモーターによって駆動される。
【0072】
別の実施形態では、発現させる核酸は、プロモーターに作動可能に結合されている。
【0073】
別の実施形態では、構成的又は誘導性プロモーターは、以下の表５に列記される群から選択される。
【0074】
【表15】
【0075】
別の実施形態では、プロモーターは、メタノールによって誘導され、グルコースによって抑制されるＡＯＸ１プロモーターである。
【0076】
一実施形態では、改変された目的遺伝子（シグナルペプチドをコードする核酸に融合されているＦＴアーゼ遺伝子）を含有する発現ベクターは、適切な宿主中で形質転換される。
【0077】
一実施形態では、アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の改変ＦＴアーゼを発現することができる組換え宿主細胞を産生する方法であって、
ａ．請求項６に定義されるアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）からの改変核酸分子を合成するステップと、
ｂ．改変核酸分子を保有するベクターを構築するステップと、
ｃ．宿主細胞をステップ（ｂ）のベクターで形質転換して、組換え宿主細胞を得るステップと
を含む方法である。
ａ．請求項６に定義されるアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）からの改変核酸分子を合成するステップと、
ｂ．改変核酸分子を保有するベクターを構築するステップと、
ｃ．宿主細胞をステップ（ｂ）のベクターで形質転換して、組換え宿主細胞を得るステップと
を含む方法である。
【0078】
一実施形態では、β－フルクトフラノシダーゼ及び／又はフルクトシルトランスフェラーゼについてのコドン最適化遺伝子は、異種宿主細胞中の発現のために改変されている。
【0079】
一実施形態では、異種組換え宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）などを含む群から選択される原核生物宿主である。
【0080】
別の実施形態では、異種組換え宿主細胞は、真核生物宿主である。真核生物宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）及びハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などを含む群から選択され得る。
【0081】
別の実施形態では、目的遺伝子を含有する発現ベクターは、酵母細胞中で形質転換される。
【0082】
別の実施形態では、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
【0083】
さらに別の実施形態では、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）宿主細胞は、ｍｕｔ＋、ｍｕｔ Ｓ又はｍｕｔ－株である。Ｍｕｔ＋は、メタノール資化性が陽性である表現型を表す。
【0084】
さらに別の実施形態では、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）宿主細胞株は、ＫＭ７１Ｈ、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、Ｘ３３を含む群から選択される。
【0085】
別の実施形態では、本発明は、ＦＴアーゼ前駆体ペプチドであって、アスペルギルス属（Aspergillus）のＦＴアーゼが１つ以上のシグナルペプチドに融合されている、ＦＴアーゼ前駆体ペプチドを提供する。
【0086】
重要な実施形態では、アスペルギルス属（Aspergillus）のＦＴアーゼの突然変異体及び突然変異体を生成するプロセスが提供される。突然変異は、単一、二重又は三重点突然変異及び欠失突然変異体並びにまたそれらの突然変異の組み合わせであり得る。
【0087】
別の実施形態では、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５に記載のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からの改変β－フルクトフラノシダーゼの核酸配列が提供される。
【0088】
別の実施形態では、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６７～２１８に記載のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からの改変β－フルクトフラノシダーゼのペプチド配列が提供される。
【0089】
別の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２１９に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子全長型（ＦＡＫ）、配列番号２２９に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子全長型（ＦＡＫＳ）、配列番号２２０に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）、配列番号２２１の記載のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）、配列番号２２２に記載のアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼ（ＧＡ）、配列番号２２３に記載のクルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces maxianus）のイヌリナーゼ（ＩＮ）、配列番号２２４に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のインベルターゼ（ＩＶ）、配列番号２２５に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のキラータンパク質（ＫＰ）、配列番号２２６に記載のガルス・ガルス（Gallus gallus）のリゾチーム（ＬＺ）、配列番号２２７に記載のホモ・サピエンス（Homo sapiens）の血清アルブミン（ＳＡ）及びそれらのバリアントを含む群から選択される。
【0090】
さらに別の実施形態では、突然変異体は、慣用の遺伝子工学技術により、及びバイオインフォマティクスベースツールを利用することにより産生されたものである。点突然変異が予測され、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のコドン最適化β－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子及び／又はアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ｆｔ遺伝子中に導入された。慣用の遺伝子工学、例えばＰＣＲなど、ソフトウェアＧＲＯＭＡＣＳを使用する分子動力学シミュレーションを利用するバイオインフォマティクスツール及びコドンバイアスの導入などのアプローチが本発明で使用された。
【0091】
一実施形態では、以下に提示されるフルクトシルトランスフェラーゼ突然変異体が提供される。
点突然変異体：
Ｖ４４Ｌ、Ｔ１５５Ｒ、Ｔ２９３Ｗ、Ｒ２８６Ｖ、Ｔ４５９Ｒ、Ｒ１９９Ｋ、Ｆ１８２Ｐ
欠失突然変異体：
３２～６５４ａａ、３２～１９４ａａ、１～１９４ａａ
点突然変異体：
Ｖ４４Ｌ、Ｔ１５５Ｒ、Ｔ２９３Ｗ、Ｒ２８６Ｖ、Ｔ４５９Ｒ、Ｒ１９９Ｋ、Ｆ１８２Ｐ
欠失突然変異体：
３２～６５４ａａ、３２～１９４ａａ、１～１９４ａａ
【0092】
一実施形態では、アスペルギルス属（Aspergillus）からの組換えＦＴアーゼの産生のプロセスが提供される。
【0093】
本発明の態様は、改変／突然変異組換えＦＴアーゼ遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞の発酵に関する。発酵の完了後、発酵ブロスは、遠心分離に供され、精密濾過を使用して濾過され、組換え酵素が分離される。回収された組換え酵素は、タンジェンシャルフロー限外濾過又は蒸発を使用して濃縮され、最終的に濃縮された酵素が配合される。
【0094】
一実施形態では、アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の改変ＦＴアーゼを発現させるプロセスであって、
ａ．アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）のＦＴアーゼを発現することができる組換え宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して、発酵ブロスを得ることと、
ｂ．発酵ブロスから上清を回収することであって、上清は、組換えＦＴアーゼを含有する、回収することと、
ｃ．組換えＦＴアーゼを精製することと
を含むプロセスである。
ａ．アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）のＦＴアーゼを発現することができる組換え宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して、発酵ブロスを得ることと、
ｂ．発酵ブロスから上清を回収することであって、上清は、組換えＦＴアーゼを含有する、回収することと、
ｃ．組換えＦＴアーゼを精製することと
を含むプロセスである。
【0095】
別の実施形態では、発酵培地は、以下の表６に記載の基礎塩培地である。
【0096】
【表16】
【0097】
さらに別の実施形態では、発酵ブロスからの上清は、遠心分離を使用して回収される。
【0098】
一実施形態では、発酵槽培養を開始するための植菌物又はスターター培養物の割合は、２．０％～１５．０％（ｖ／ｖ）の範囲である。
【0099】
別の実施形態では、発酵培地のｐＨは、４．０～７．５の範囲に維持され、なぜなら、分泌される酵素は、このｐＨ範囲で適切なフォールディングを受け、生物学的に活性であるためである。
【0100】
さらに別の実施形態では、発酵プロセスの温度は、１５℃～４０℃の範囲である。
【0101】
別の実施形態では、発酵プロセスのための時間は、５０～１５０時間の範囲である。
【0102】
さらなる実施形態では、発酵ブロスは、連続オンライン遠心分離を使用して２０００×ｇ～１５０００×ｇの範囲の速度で遠心分離される。
【0103】
遠心分離後に得られた上清は、精密濾過に供され、精製されて生物学的に活性な組換え／突然変異体ＦＴアーゼが回収される。
【0104】
一実施形態では、遠心分離後に得られた上清は、タンジェンシャルフロー濾過ベースの限外濾過系を使用して濃縮される。
【0105】
不純物を除去し、及び回収された培養物上清を濃縮するために使用され得るタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）系で使用される膜のカットオフサイズは、５～１００ｋＤａの範囲であり得る。
【0106】
別の実施形態では、遠心分離は、分泌される酵素の高い収率及び純度に起因してプロセスに要求されない。
【0107】
本発明で得られるＦＴアーゼ濃度は、２～５グラム／Ｌ以上の範囲であり、純度が高く、約８５％以上であることが見出される。
【0108】
一実施形態では、活性部位を含むＦＴアーゼタンパク質鎖にわたるアミノ酸の突然変異を同定するプロセスであって、ステップは、
ａ．バイオインフォマティクスツールを使用して、ＦＴアーゼ酵素のａｐｏ構造をシミュレーションすることと、
ｂ．根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の変動に基づいてトラジェクトリーをクラスタリングして、ユニークな立体構造を同定することと、
ｃ．ＦＴアーゼ酵素が突然変異についてのシミュレーション残基の過程中に採用したユニークな立体構造を同定することと、
ｄ．ステップ（ｃ）の同定されたユニークな立体構造を、各アミノ酸が別のアミノ酸と行ったペアワイズ相互作用について分析することと、
ｅ．残基のペア間のファンデルワールス及び水素結合についての適切な重みを提供することにより、指標相互作用強度としてアミノ酸のペアワイズ相互作用を定量することと、
ｆ．シミュレーションの過程を介して相互作用強度のより大きい標準偏差を有することが見出された各アミノ酸の１９個の突然変異を生成することと、
ｇ．－ΔΔＧ値に従って同様の又はより良好な安定性を有する安定化突然変異を同定及び選択することと
を含む、プロセスである。
ａ．バイオインフォマティクスツールを使用して、ＦＴアーゼ酵素のａｐｏ構造をシミュレーションすることと、
ｂ．根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の変動に基づいてトラジェクトリーをクラスタリングして、ユニークな立体構造を同定することと、
ｃ．ＦＴアーゼ酵素が突然変異についてのシミュレーション残基の過程中に採用したユニークな立体構造を同定することと、
ｄ．ステップ（ｃ）の同定されたユニークな立体構造を、各アミノ酸が別のアミノ酸と行ったペアワイズ相互作用について分析することと、
ｅ．残基のペア間のファンデルワールス及び水素結合についての適切な重みを提供することにより、指標相互作用強度としてアミノ酸のペアワイズ相互作用を定量することと、
ｆ．シミュレーションの過程を介して相互作用強度のより大きい標準偏差を有することが見出された各アミノ酸の１９個の突然変異を生成することと、
ｇ．－ΔΔＧ値に従って同様の又はより良好な安定性を有する安定化突然変異を同定及び選択することと
を含む、プロセスである。
【実施例】
【0109】
実施例
以下の実施例は、特に、本発明が実施される様式を記載する。しかし、本明細書に開示される実施形態は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例は、特に、本発明が実施される様式を記載する。しかし、本明細書に開示される実施形態は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【0110】
実施例１：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの発現のための改変核酸
β－フルクトフラノシダーゼの天然ｃＤＮＡ（配列番号５）を、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の発現の最大化のためにコドン最適化した。（配列番号６）によって表されるβ－フルクトフラノシダーゼのコドン最適化ヌクレオチド配列を、表７に定義される１つ以上の点突然変異若しくは表８に定義される欠失突然変異又はそれらのその組み合わせから選択される突然変異を誘導することによってさらに改変し、それらは、コドン最適化ヌクレオチド配列中で誘導された。改変β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、配列番号９～２１８によって表される。
β－フルクトフラノシダーゼの天然ｃＤＮＡ（配列番号５）を、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の発現の最大化のためにコドン最適化した。（配列番号６）によって表されるβ－フルクトフラノシダーゼのコドン最適化ヌクレオチド配列を、表７に定義される１つ以上の点突然変異若しくは表８に定義される欠失突然変異又はそれらのその組み合わせから選択される突然変異を誘導することによってさらに改変し、それらは、コドン最適化ヌクレオチド配列中で誘導された。改変β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、配列番号９～２１８によって表される。
【0111】
【表17】
【0112】
【表18】
【0113】
β－フルクトフラノシダーゼをコードする発現カセットを、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の発現の最大化のために改変した。改変オープンリーディングフレームは、シグナルペプチドに融合されているβ－フルクトフラノシダーゼをコードする改変ヌクレオチド配列を含有する。核酸は、コードされるシグナルペプチドが前駆体ペプチドの効率的なＫｅｘ２プロセシングのための４つのアミノ酸（ＬＥＫＲ）の追加のストレッチを含有するように設計した。
【0114】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の発現に好ましいコドンを希少コドンに代えて使用した。β－フルクトフラノシダーゼをコードする改変オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を改変シグナルペプチドと融合させた。シグナルペプチドと融合しているアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ－フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を翻訳することにより、組換え前駆体タンパク質を得た。シグナルペプチドをピキア属（Pichia）宿主細胞内部の翻訳後修飾中に開裂除去し、成熟組換えβ－フルクトフラノシダーゼを培地中に放出させた。
【0115】
実施例２：突然変異体の開発
実施例２（ａ）：バイオインフォマティクスアプローチ：
本発明者らは、タンパク質ＡｎＦＴ、すなわちアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からの酵素ＦＴのより大きい安定化をもたらし得る、活性部位を含むタンパク質鎖にわたるアミノ酸の突然変異を同定することを求めた。このようなアミノ酸を同定するため、ＡｎＦＴのａｐｏ構造を、ソフトウェアＧＲＯＭＡＣＳを使用する２５ｎｓの分子動力学シミュレーションに供した。
実施例２（ａ）：バイオインフォマティクスアプローチ：
本発明者らは、タンパク質ＡｎＦＴ、すなわちアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からの酵素ＦＴのより大きい安定化をもたらし得る、活性部位を含むタンパク質鎖にわたるアミノ酸の突然変異を同定することを求めた。このようなアミノ酸を同定するため、ＡｎＦＴのａｐｏ構造を、ソフトウェアＧＲＯＭＡＣＳを使用する２５ｎｓの分子動力学シミュレーションに供した。
【0116】
シミュレーションに続き、ＣＡ原子の根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の変動に基づいてトラジェクトリーをクラスタリングして、タンパク質がシミュレーションの過程中に採用したユニークな立体構造を同定した。クラスターの代表的構造（クラスター中心）を選択した。
【0117】
これらの構造を、各アミノ酸が別のアミノ酸と行った相互作用について分析した。アミノ酸のペアワイズ相互作用を、残基ペア間のファンデルワールス及び水素結合についての適切な重みを提供することによって指標相互作用強度として定量した。
アミノ酸ｉ及びｊ間の相互作用の強度、Ｓｉｊ＝Ｗｔ／ｒｉｊ
式中、Ｗｔは、所与の相互作用のタイプについての重みであり、ｒｉｊは、残基ｉ及びｊの原子間の距離である。２つの残基間で計算される相互作用の強度は、２つの残基の原子間の相互作用の強度の代数和である。
アミノ酸ｉ及びｊ間の相互作用の強度、Ｓｉｊ＝Ｗｔ／ｒｉｊ
式中、Ｗｔは、所与の相互作用のタイプについての重みであり、ｒｉｊは、残基ｉ及びｊの原子間の距離である。２つの残基間で計算される相互作用の強度は、２つの残基の原子間の相互作用の強度の代数和である。
【0118】
これは、Ｎ個の残基のタンパク質についてのＮ×Ｎ行列を与え、各要素は、相互作用強度を表し、０は、相互作用がないことを表す。行列中の各行の総和は、所与のアミノ酸の全体的な相互作用強度を簡易に与える。
例えば、残基１００の総相互作用強度＝総和（残基１００と他のあらゆる残基との相互作用強度）
例えば、残基１００の総相互作用強度＝総和（残基１００と他のあらゆる残基との相互作用強度）
【0119】
５Åの半径をカットオフとして選択して相互作用を分析及び定量した。相互作用強度が、三次構造を介した安定化を正確に反映するように、連続アミノ酸間では相互作用を想定しなかった。より大きい相互作用強度は、アミノ酸のより大きい安定化及びしたがってタンパク質の安定化を意味する。
【0120】
分子動力学シミュレーション、その後のクラスタリングから生じたＡｎＦＴ構造のアンサンブルは、５～６つの異なる立体構造（クラスター中心）からなるものであった。立体構造の各々について、相互作用強度行列を生成し、各アミノ酸の個々の相互作用強度を上記のとおり計算した。
【0121】
アンサンブルにわたる各アミノ酸の相互作用強度の変動を、標準偏差の統計的パラメータを使用して試験した。種々の立体構造間の相互作用のより大きい標準偏差は、フレキシブルな残基を示した一方、より低い標準偏差は、十分にネットワーク化された残基を示した。フレキシブルな残基を標的化して突然変異体を生成した。突然変異のための最も安定的な部位の同定のためのスキームの概要を図１１に説明する。
【0122】
さらに、シミュレーションの過程にわたって相互作用強度のより大きい標準偏差を有することが見出されたこのような各アミノ酸を、タンパク質中で生じる全ての他の１９個の天然アミノ酸に突然変異させた。
【0123】
さらに、安定化のエネルギーを突然変異アミノ酸について野生型に対して計算し、それらを、野生型及び安定化突然変異体についてのΔＧ間の差を示すパラメータΔΔＧによって表した。この分析は、MolSoft製の市販ソフトウェアICMを使用して実施した。１９個の他のアミノ酸への各アミノ酸の突然変異についてのΔΔＧ（ｋｃａｌ／モル）値を計算し、さらなる安定化を示さないか、又はより良好な安定化を示した突然変異を選択した。こうして選択された突然変異のリストを以下の表９に各突然変異についてのΔΔＧ（ｋｃａｌ／モル）値とともに挙げる。
【0124】
【表19】
【0125】
上記と同様の実践をケストース結合ＡｎＦＴ構造に対して実施して、ケストース結合部位中のアミノ酸の相互作用の強度及びタンパク質の安定性に対するそれらの突然変異の効果を分析した。その分析の結果を以下の表１０に示す。
【0126】
【表20】
【0127】
上記のとおり、分子動力学シミュレーション、トラジェクトリー分析、個々のアミノ酸の相互作用強度及びタンパク質に対する突然変異体の安定化影響についての突然変異体の特性評価の組み合わせを利用して、点突然変異のための少なくとも１７２個の部位を同定した。さらに、ＦＴアーゼのａｐｏ構造に関する先行技術における構造研究に基づき、欠失に好適な部位も同定した。
【0128】
実施例２（ｂ）：遺伝子工学アプローチ：
バイオインフォマティクスアプローチに基づき、ＦＴアーゼタンパク質についての機能ドメインの代替形態を着想及びクローニングしてプロセスについてのそれらの有効性をさらに試験した。クローニング作業のため、プライマーを、コドン最適化全長ＦＴアーゼ遺伝子を有するテンプレートとして使用される組換えプラスミドからのＤＮＡの特定のストレッチをＰＣＲ増幅させるように設計した。したがって、増幅されたＰＣＲ産物は、要求される欠失を含有し、遺伝子からの所望のストレッチを保持した。これらのＰＣＲ産物を、それぞれの発現ベクター中において適合する方針でクローニングし、例えばベクターｐＰＩＣＺαＡのＭＣＳ中の対応する部位におけるＸｈｏＩ及びＳａｃＩＩ断片としてクローニングした。
バイオインフォマティクスアプローチに基づき、ＦＴアーゼタンパク質についての機能ドメインの代替形態を着想及びクローニングしてプロセスについてのそれらの有効性をさらに試験した。クローニング作業のため、プライマーを、コドン最適化全長ＦＴアーゼ遺伝子を有するテンプレートとして使用される組換えプラスミドからのＤＮＡの特定のストレッチをＰＣＲ増幅させるように設計した。したがって、増幅されたＰＣＲ産物は、要求される欠失を含有し、遺伝子からの所望のストレッチを保持した。これらのＰＣＲ産物を、それぞれの発現ベクター中において適合する方針でクローニングし、例えばベクターｐＰＩＣＺαＡのＭＣＳ中の対応する部位におけるＸｈｏＩ及びＳａｃＩＩ断片としてクローニングした。
【0129】
突然変異ヌクレオチドを担持するプライマーを介してＦＴアーゼ遺伝子の配列中に点突然変異を導入した。これらのプライマーを介して生成されたＰＣＲ産物は、対応する部位における突然変異配列を含有した。次いで、ここで点突然変異を担持しているこれらのＰＣＲ産物を、所望の発現ベクター中において適合する方針に従ってクローニングした。
【0130】
実施例３：組換えプラスミドでの形質転換による組換え宿主細胞の開発
このプロセスで使用されるベクターは、ｐＰＩＣＺαＡであった。ベクターは、改変オープンリーディングフレーム及び誘導性プロモーターＡＯＸ１を含有した。組換えタンパク質をコードする改変配列をｐＰＩＣＺαＡベクター中にクローニングした。
このプロセスで使用されるベクターは、ｐＰＩＣＺαＡであった。ベクターは、改変オープンリーディングフレーム及び誘導性プロモーターＡＯＸ１を含有した。組換えタンパク質をコードする改変配列をｐＰＩＣＺαＡベクター中にクローニングした。
【0131】
それぞれのＦＴアーゼ遺伝子をコードする改変核酸を、定型の分子生物学手順を使用して、ｐＰＩＣＺαＡベクターのＭＣＳ中に存在するＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限部位間でクローニングして、シグナル配列であるＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルファ因子（ＦＡＫ）をインフレームで入れて発現カセットを作出した。ｐＰＩＣＺαＡについてのベクター地図を図３に表す。
【0132】
２５μｇ／ｍｌのZeocinを含有する低塩ＬＢ培地上で推定組換えプラスミドを選択し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限消化分析によってスクリーニングした。
【0133】
組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡ－ＦＴアーゼを、１９８０ｂｐ断片の放出をもたらしたＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限消化分析によって確認した。制限消化分析の結果を図４に示す。
【0134】
図９は、（ａ）：Ｎ３２Ｒ、Ｈ４３Ｙ、Ｈ４３Ｖ、Ｈ４３Ｌ、Ｖ１２５Ｆ、Ｖ１２７Ａ、Ｐ１３１Ｙ；（ｂ）：Ｆ１８２Ｒ、Ｆ１８２Ａ、Ｆ１８２Ｄ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｔ、Ｔ２９３Ｆ、Ｔ２９３Ｈ；（ｃ）：Ｔ２９３Ｒ、Ｔ２９３Ｌ、Ｔ２９３Ｓ、Ｑ３２７Ｌ；（ｄ）：Ｑ３２７Ｎ、Ｖ３４３Ｆを含有する組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡに対して実施された制限消化分析の結果を示す。
【0135】
その後、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞を線形化組換えｐＰＩＣＺαＡ－ＦＴアーゼＤＮＡでエレクトロポレーションした。１００μｇ／ｍｌのZeocinを含有する酵母エキスペプトンデキストロースソルビトール寒天（ＹＰＤＳＡ）上でピキア属（Pichia）インテグラントを選択した。
【0136】
インテグレーションをコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）でスクリーニングした。ｃＰＣＲのため、ピキア属（Pichia）インテグラントの各々からのテンプレートをアルカリ溶解法によって生成した。
【0137】
ピキア属（Pichia）インテグラントをＢＭＤ１培地中で４８時間成長させ、さらに最初にＢＭＭ２培地で、次いで連続的にＢＭＭ１０培地で誘導し、それは、培養培地中０．５％のメタノールの最終濃度を提供した。９６時間の誘導期間の終了時、異なるクローンからの培養物上清を回収した。回収された上清の各々からの総タンパク質を２０％のＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析した。
【0138】
ＦＴアーゼタンパク質の誘導時、図５に示されるとおり、およそ１１０ｋＤａのサイズでバンドが見られた。
【0139】
算出分子量は、約７０．８５ｋＤａであった。分子量の増加は、グリコシル化に起因し得た。
【0140】
実施例４：アスペルギルス属（Aspergillus）の突然変異体ＦＴアーゼを発現する組換えピキア・パストリス（Pichia pastoris）の発酵
実施例１に記載の改変ＦＴアーゼ遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞の発酵を５０Ｌの発酵槽中で実施した。発酵は、本明細書に記載の基礎塩培地中で実施した。
実施例１に記載の改変ＦＴアーゼ遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞の発酵を５０Ｌの発酵槽中で実施した。発酵は、本明細書に記載の基礎塩培地中で実施した。
【0141】
プレシード及びシード植菌物の調製：
プレシードをグリセロールストックから２５ｍＬの無菌ＹＥＰＧ培地中で植菌し、温度制御オービタルシェーカー中で３０℃において一晩成長させることによって生成した。シードを生成するため、植菌物をバッフル付き振盪フラスコにおいて、基礎塩培地中、温度制御オービタルシェーカー内で３０℃において、１５～２５のＯＤ６００に達するまで成長させた。
プレシードをグリセロールストックから２５ｍＬの無菌ＹＥＰＧ培地中で植菌し、温度制御オービタルシェーカー中で３０℃において一晩成長させることによって生成した。シードを生成するため、植菌物をバッフル付き振盪フラスコにおいて、基礎塩培地中、温度制御オービタルシェーカー内で３０℃において、１５～２５のＯＤ６００に達するまで成長させた。
【0142】
発酵プロセス
シード培養物を用いる発酵槽の植菌から最終回収までの発酵のプロセス全体は、約１３０時間を要した。基礎塩培地を調製し、発酵槽中で現場滅菌した。
シード培養物を用いる発酵槽の植菌から最終回収までの発酵のプロセス全体は、約１３０時間を要した。基礎塩培地を調製し、発酵槽中で現場滅菌した。
【0143】
発酵プロセスのために最適化された基礎塩培地の組成を表６に提供する。
【0144】
ピキア属（Pichia）微量ミネラル（ＰＴＭ）塩溶液を、表１１に挙げられる構成成分を用いて調製した。ＰＴＭ塩を溶解させ、１Ｌの容量にメスアップし、フィルター滅菌した。ＰＴＭ塩溶液を基礎塩培地の滅菌後に初期培地容量１リットル当たり４ｍｌの割合で含めた。
【0145】
【表21】
【0146】
成長期：
成長期は、５０Ｌの発酵槽中の基礎塩培地に５％のシード培養物を植菌することによって開始し、約２４時間継続させた。溶解酸素（ＤＯ）レベルを継続的にモニタリングし、４０％未満に降下しないようにした。
成長期は、５０Ｌの発酵槽中の基礎塩培地に５％のシード培養物を植菌することによって開始し、約２４時間継続させた。溶解酸素（ＤＯ）レベルを継続的にモニタリングし、４０％未満に降下しないようにした。
【0147】
１８時間後、炭素源（グリセロール）の枯渇を示すＤＯスパイクが観察された。５０％のグリセロール（供給物１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩を有する）を、ＯＤ６００が２００に達するまで約６時間供給することにより、グリセロール供給バッチを開始した。
【0148】
誘導期：
十分なバイオマスが生成されたら、グリセロール供給を中止し、メタノール供給を開始することによって誘導期を開始した。メタノール（供給物１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩が補給された）を初期発酵容量１リットル当たり０．５ｇ～３ｇの割合で供給した。ＤＯを４０％に維持し、メタノール供給をそれに従って調整した。
十分なバイオマスが生成されたら、グリセロール供給を中止し、メタノール供給を開始することによって誘導期を開始した。メタノール（供給物１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩が補給された）を初期発酵容量１リットル当たり０．５ｇ～３ｇの割合で供給した。ＤＯを４０％に維持し、メタノール供給をそれに従って調整した。
【0149】
培養物上清を酵素活性アッセイによって分析することにより、ＦＴアーゼ遺伝子の誘導を定期的にモニタリングした。ＯＤ６００が６００に達し、湿潤バイオマスが培養ブロス１リットル当たり約５６０グラムに達するまで、誘導期を約１００時間継続させた。
【0150】
発酵を約１３０時間後に停止し、発酵槽ブロス中の酵素活性を発酵の終了時にＤＮＳ法（Miller, 1959）によって決定した。１単位は、１００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５、５５℃中の１０％のスクロース溶液から１マイクロモルの還元糖（グルコース均等物）を放出するために要求される酵素の量と定義される。培養ブロス中の組換えＦＴアーゼの総量をブラッドフォードアッセイによって推定した。
【0151】
発酵条件：
検討される発酵パラメータは、表１２に挙げるとおりであった。これらの必須パラメータを発酵プロセス中にモニタリングした。
検討される発酵パラメータは、表１２に挙げるとおりであった。これらの必須パラメータを発酵プロセス中にモニタリングした。
【0152】
【表22】
【0153】
実施例５：細胞回収及び精製
酵素の回収を８０００ＲＰＭでの連続遠心分離によって実施した。遠心分離後に得られた澄明な上清を、０．１ミクロンカットオフスパイラル型ＴＦＦ膜を使用する精密濾過に供した。濾液を、１０ｋＤａカットオフスパイラル型ＴＦＦ膜を使用する限外濾過及び透析濾過にさらに供し、十分に濃縮し、所望の活性に到達させた。３５～５０％のグリセロール及び食品グレード保存剤を最終調製物中に含めることによって酵素を配合した。酵素の最終純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定されたとおり、８５％であることが観察された。
酵素の回収を８０００ＲＰＭでの連続遠心分離によって実施した。遠心分離後に得られた澄明な上清を、０．１ミクロンカットオフスパイラル型ＴＦＦ膜を使用する精密濾過に供した。濾液を、１０ｋＤａカットオフスパイラル型ＴＦＦ膜を使用する限外濾過及び透析濾過にさらに供し、十分に濃縮し、所望の活性に到達させた。３５～５０％のグリセロール及び食品グレード保存剤を最終調製物中に含めることによって酵素を配合した。酵素の最終純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定されたとおり、８５％であることが観察された。
【0154】
組換えＦＴアーゼ酵素を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の発酵中の異なる時間間隔で回収されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析も実施した。精製後の組換えＦｔアーゼ酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析も実施した。
【0155】
図５は、インテグレーション（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ１５５Ｒ；（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ２８６Ｖ；（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ４５９Ｒ；（ｇ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｆ１８２Ｐを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株中のタンパク質発現のスクリーニングについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【0156】
図６は、種々の突然変異体Ｆｔアーゼタンパク質の発酵追跡中の異なる時間間隔で回収されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ４４Ｌ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ１５５Ｒ；（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ２９３Ｗ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ２８６Ｖ；（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｒ１９９Ｋ；（ｆ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｔ４５９Ｒ；（ｇ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｆ１８２Ｐ。
【0157】
図１０は、インテグレーション（ａ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｈ４３Ｙ；（ｂ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｈ４３Ｌ；（ｃ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｑ３２７Ｎ；（ｄ）：ｐＰＩＣＺαＡ－Ｖ３４３Ｆを有するピキア・パストリス（Pichia pastoris）組換え株中のタンパク質発現のスクリーニングのためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【0158】
Ｆｔアーゼ濃度は、約２．４グラム／Ｌであることが見出された。バッチのほとんどでは、濃度は、２～５グラム／Ｌであった。組換えＦｔアーゼの純度は、約８５％であることが観察された。
【0159】
実施例６：Ｆｔアーゼ活性の推定
Ｆｔアーゼの活性を推定するための試験を実施した。推定試験のため、Ｆｔアーゼ酵素の作用に起因して生成された還元糖の量を、ＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）法（G. L. Miller，“Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal. Chem., 1959, 31, 426-428）を使用して算出した。
Ｆｔアーゼの活性を推定するための試験を実施した。推定試験のため、Ｆｔアーゼ酵素の作用に起因して生成された還元糖の量を、ＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）法（G. L. Miller，“Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal. Chem., 1959, 31, 426-428）を使用して算出した。
【0160】
酵素活性アッセイの実施のため、１０％のスクロース（１００ｍＭのクエン酸緩衝液中で溶解）を基質として使用した。Ｆｔアーゼを発酵ブロスから回収し、限外濾過を介して処理した。次いで、限外濾過されたサンプルを１００ｍＭのクエン酸緩衝液中で段階希釈によって２５，０００倍希釈し、使用した。反応容量は、２．５ｍＬであった。ｐＨを５．５に維持し、反応を１５分間継続させた。
【0161】
インキュベーション後、３ｍＬのＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）を各反応混合物に添加し、１０分間煮沸し、冷却し、５４０ｎｍにおける吸光度を分光光度的に読み取った。異なる濃度におけるグルコースのＯＤを、表１３に示されるとおり測定した。その後、反応後の吸光度測定値に基づき、酵素活性を表１４に示されるとおり算出した。
【0162】
【表23】
【0163】
【表24】
【0164】
異なるクローンのＦＴアーゼ活性をメタノール誘導の９６時間後に推定した。各クローンの上清をＴＣＡ沈殿に供した。次いで、ＴＣＡプレップされたサンプルをＦＴアーゼ活性について（ＤＮＳ法により）上記の参照文献に従って試験した。各構築物の複数のクローンをＦＴアーゼ活性について試験した。代表的なクローンからのデータを表１５に提示した。２９０単位／ｍｌであることが見出された野生型分子のＦＴアーゼ活性を実験対照とみなした。
【0165】
突然変異体バリアント、すなわち、限定されるものではないが、Ｎ３２Ｒ、Ｈ４３Ｖ、Ｖ１２５Ｆ、Ｖ１２７Ａ、Ｐ１３１Ｙ、Ｔ１５５Ｒ、Ｆ１８２Ｐ、Ｆ１８２Ｒ、Ｆ１８２Ａ、Ｆ１８２Ｄ、Ｆ１８２Ｖ、Ｆ１８２Ｔ、Ｒ２８６Ｖ、Ｔ２９３Ｆ、Ｔ２９３Ｈ、Ｔ２９３Ｌ、Ｔ２９３Ｓ、Ｔ２９３Ｗ、Ｈ４３Ｙ、Ｈ４３Ｌ、Ｑ３２７Ｎ、Ｑ３２７Ｌ及びＶ３４３ＦのＦＴアーゼ活性が驚くべきことに良好であることが見出された。
【0166】
【表25】
【0167】
【表26】
【0168】
実施例７：スクロース及び組換えＦＴアーゼ酵素からのフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の生成
フルクトオリゴ糖の形成における酵素の能力を理解するための試験を実施した。９０％（ｗ／ｖ）のスクロースの１００ｍＬ溶液を１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で調製した。これに、５１６９２単位／ｍｌの活性（合計５０００単位の酵素と同等）を有する９６．７μＬのＦＴアーゼ酵素を添加した。
フルクトオリゴ糖の形成における酵素の能力を理解するための試験を実施した。９０％（ｗ／ｖ）のスクロースの１００ｍＬ溶液を１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で調製した。これに、５１６９２単位／ｍｌの活性（合計５０００単位の酵素と同等）を有する９６．７μＬのＦＴアーゼ酵素を添加した。
【0169】
反応物を２５０ｍＬのコニカルフラスコ中で設定し、６５℃及び２２０ｒｐｍでインキュベートした。規則的な時間間隔でサンプルを採取し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上で分析した。
【0170】
グルコース、スクロース、フルクトース及びＦＯＳ（ケストース、ニストース及びフルクトフラノシルニストースを含有）を薄層クロマトグラフィー分析のための標準として使用した。使用された移動相は、ｎ－ブタノール：氷酢酸：水（４：２：２ｖ／ｖ）であり、使用された展開／染色溶液は、尿素リン酸であった。
【0171】
図７は、スクロース及び組換えＦＴアーゼ酵素からのフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の生成について行われたＴＬＣ分析を示す。
【0172】
サンプルを、フルクトオリゴ糖の産生の定量的推定のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にさらに供した。４．６（ＩＤ）×１５０ｍｍ（長さ）及び５μｍ（粒子サイズ）を有するアミンカラム（Zorbax NH2カラム、Agilent Technologies）を使用してＨＰＬＣ分析を行った。異なる濃度のグルコース、フルクトース、ケストース、ニストース、フルクトフラノシルニストース及びスクロースの標準溶液を標準曲線作成のためにランさせた。
【0173】
図８は、ＦＯＳサンプルのＨＰＬＣ分析クロマトグラムを示す。
【0174】
実施例８：アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の組換えＦＴアーゼの特性評価
限定されるものではないが、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）のフルクトシルトランスフェラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ－フルクトフラノシダーゼから選択されるアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の回収されたＦＴアーゼを特性評価して、生物活性断片を同定した。上記の表３に説明されるとおり、以下の生物活性断片が保存され、触媒活性の要因であることが見出された。
限定されるものではないが、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）のフルクトシルトランスフェラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ－フルクトフラノシダーゼから選択されるアスペルギルス属種（Aspergillus sp.）の回収されたＦＴアーゼを特性評価して、生物活性断片を同定した。上記の表３に説明されるとおり、以下の生物活性断片が保存され、触媒活性の要因であることが見出された。
【0175】
上記と同様のアプローチをアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）のＦＴアーゼの突然変異体の作出に用いた。Ａ．ニガー（A. niger）及びＡ．ジャポニクス（A. japonicus）中のＦＴアーゼのタンパク質配列は、図１２に説明されるとおり、６５４個の遺伝子座のうちの４つの遺伝子座、すなわち４４、１９９、４５９及び６５４でのみ異なる。活性に関して、両方の酵素（遺伝子ｆｔ及びｆｏｐＡからのもの）は、互いに同等であることが見出された。
【0176】
利点：
１．酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
２．酵素は、フルクトオリゴ糖の高い収率を得るために使用され得る。
１．酵素は、濾過後に高い純度を示し、それは、コストがかさむクロマトグラフィー手順の必要性を除外する。
２．酵素は、フルクトオリゴ糖の高い収率を得るために使用され得る。
【図1】
【図2a-1】
【図2a-2】
【図2b-1】
【図2b-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】