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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】修飾されたタンパク質又はポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241112BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241112BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20241112BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241112BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241112BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241112BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
A61P35/00
A61P3/00
A61P37/00
A61P31/00
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 Q
A61K39/395 U
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531051
(86)(22)【出願日】2022-11-29
(85)【翻訳文提出日】2024-05-23
(86)【国際出願番号】 CN2022134923
(87)【国際公開番号】W WO2023093899
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】202111429892.3
(32)【優先日】2021-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】520392096
【氏名又は名称】上海盛迪医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＨＥＮＧＤＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１２８８ Ｈａｉｋｅ Ｒｏａｄ， Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｔｏｗｎ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】王 楠
(72)【発明者】
【氏名】楊 暁峰
(72)【発明者】
【氏名】張 偉
(72)【発明者】
【氏名】曹 志亮
(72)【発明者】
【氏名】葉 浩
(72)【発明者】
【氏名】沈 余紅
(72)【発明者】
【氏名】廖 成
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB07
4C084ZB26
4C084ZB32
4C084ZC21
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB07
4C086ZB26
4C086ZB32
4C086ZC21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZB32
4C087ZC21
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
予備の抗薬物抗体への結合が低減された、修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン及び上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを提供する。具体的に、上記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端は、アミノ酸修飾を含む。さらに、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドの製薬的使用、医薬組成物、コード核酸及び調製方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインであって、Ｘ１Ｘ２（Ｘ３）ｎ又はＶＴＶＸ１Ｘ２（Ｘ３）ｎで示されるアミノ酸配列のＣ末端を含み、そのうち、Ｘ１はＳ、Ｆ及びＲから選ばれ、Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｓから選ばれ、Ｘ３はＡであるか又は存在せず、ｎは０～５の整数であり、ｎが０である場合、Ｘ３は存在せず、
ｎが１～５である場合、Ｘ３はＡであり、
好ましくは、前記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、下記の（ａ）～（ｅ）、即ち、
（ａ）ＳＡＡ又はＶＴＶＳＡＡ、
（ｂ）ＦＰ又はＶＴＶＦＰ、
（ｃ）ＦＰＡ又はＶＴＶＦＰＡ、
（ｄ）ＲＳ又はＶＴＶＲＳ、及び
（ｅ）ＲＳＡ又はＶＴＶＲＳＡ
の何れか１つからなるＣ末端を含む、修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項2】
修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ヒト生殖細胞系列に由来する重鎖フレームワーク配列を含み、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１２位に１１２Ｆ又は１１２Ｒのアミノ酸修飾が存在し、選択的に、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらにヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１３位に１１３Ｐのアミノ酸修飾が存在し、又は１１３位はＳであり、
好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１２位と１１３位には、下記の（ｆ）～（ｈ）、即ち、
（ｆ）１１２Ｆと１１３Ｐ、
（ｇ）１１２Ｒと１１３Ｓ、及び
（ｈ）１１２Ｆと１１３Ｓ
の何れか１つのアミノ酸残基の組み合わせが存在する、修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項3】
修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ヒト生殖細胞系列に由来する重鎖フレームワーク配列を含み、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１２位はＳであり、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１３位に１１３Ａ、１１３Ｐのアミノ酸修飾が存在し、かつ１１３位の後にさらに１～５個のアミノ酸残基のアミノ酸伸長があり、前記アミノ酸伸長は、Ａ、ＡＡ又はＡＡＡが好ましい、修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項4】
ＶＨ単一ドメイン抗体又はナノボディから選ばれ、前記ＶＨ単一ドメイン抗体は、ヒト由来のものが好ましく、ナノボディはラクダ由来又はヒト化のものが好ましい、前記請求項の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項5】
未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメインに比べて、前記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、予備の抗薬物抗体（ｐｒｅ－ＡＤＡ）又は抗薬物抗体（ＡＤＡ）への結合が低減され、前記未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメインは、アミノ酸配列ＶＴＶＳＳ（配列番号１８９）のＣ末端を有する、前記請求項の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項6】
標的抗原に特異的に結合し、かつ、ａ）前記標的抗原に特異性を有する３つの相補性決定（ＣＤＲ）領域と、
ｂ）４つのフレームワーク（ＦＲ）領域と、
を含む、前記請求項の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項7】
ａ）ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１４位、４１位、１０８位における１つ又は複数のアミノ酸修飾、好ましくは、１４Ａ、１４Ｋ、１４Ｑ若しくは１４Ｔ、及び／又は４１Ａ、及び／又は１０８Ａ若しくは１０８Ｑ、及び／又は、ｂ）ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１位及び／又は８８位におけるアミノ酸修飾、好ましくは、１１Ｋ、１１Ｒ、１１Ｄ若しくは１１Ｅ、及び／又は８８Ｅ、８８Ｄ、８８Ｒ若しくは８８Ｋ、
を含む、前記請求項の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項8】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、４－１ＢＢに特異的に結合し、好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号６及び１５～１８の何れか１つのアミノ酸配列におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義され、
より好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、それぞれ配列番号７、８及び９で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はそれぞれ配列番号７、８及び１９で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
最も好ましくは、前記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２１、３０～３５の何れか１つで示されるか又はそれに対して少なくとも９０％、任意選択的に少なくとも９５％の同一性を有する、
前記請求項の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項9】
Ｃ末端に請求項１～８の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインが含まれる、タンパク質又はポリペプチド。
【請求項10】
抗体であり、好ましくは、一価、二価、多価、単一特異性、二重特異性、多重特異性抗体である、請求項９に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項11】
少なくとも２つの異なる抗原を標的とするか、又は同じ抗原の少なくとも２つの異なるドメイン若しくはエピトープを標的とし、好ましくは、前記少なくとも２つの抗原の中の少なくとも１つ又は前記同じ抗原は４－１ＢＢである、
請求項９又は１０に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項12】
免疫グロブリンＦｃ領域、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域をさらに含む、請求項９～１１の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項13】
前記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端は、直接的に又はリンカーを介して前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結される、請求項１２に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項14】
治療又は予防用抗体である、請求項９～１３の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項15】
請求項１～８の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン、請求項９～１４の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを包含又は発現する、ベクター。
【請求項17】
請求項１～８の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン、請求項９～１４の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド、請求項１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載のベクター、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターを含む、医薬組成物。
【請求項18】
対象の体内におけるｐｒｅ－ＡＤＡ又はＡＤＡへの結合が低減された薬剤を調製するための請求項１～８の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン、請求項９～１４の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドの使用。
【請求項19】
疾患を予防又は治療する方法であって、それを必要とする対象に予防又は治療有効量の請求項１～８の何れか一項に記載の修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン、請求項９～１４の何れか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドを投与することを含み、好ましくは、前記疾患は、細胞増殖性疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患又は感染性疾患であり、より好ましくは、前記細胞増殖性疾患はがんである、方法。
【請求項20】
免疫グロブリン単一可変ドメインのｐｒｅ－ＡＤＡ又はＡＤＡへの結合を低減する方法であって、前記方法は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端がＸ１Ｘ２（Ｘ３）ｎ又はＶＴＶＸ１Ｘ２（Ｘ３）ｎで示されるアミノ酸配列のＣ末端を含むようにすることを含み、そのうち、Ｘ１はＳ、Ｆ及びＲから選ばれ、Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｓから選ばれ、Ｘ３はＡであるか又は存在せず、ｎは０～５の整数であり、ｎが０である場合、Ｘ３は存在せず、
ｎが１～５である場合、Ｘ３はＡであり、
好ましくは、前記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、下記の（ａ）～（ｅ）、即ち、
（ａ）ＳＡＡ又はＶＴＶＳＡＡ、
（ｂ）ＦＰ又はＶＴＶＦＰ、
（ｃ）ＦＰＡ又はＶＴＶＦＰＡ、
（ｄ）ＲＳ又はＶＴＶＲＳ、及び
（ｅ）ＲＳＡ又はＶＴＶＲＳＡ
の何れか１つからなるＣ末端を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、２０２１年１１月２９日に提出された中国特許出願（出願番号ＣＮ２０２１１１４２９８９２．３）に基づく優先権を主張する。
【0002】
本開示は、バイオ医薬分野に関し、具体的に、予備の抗薬物抗体への結合が低減された、修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン及び上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドに関する。上記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端は、アミノ酸修飾を含む。本開示は、さらに、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドの製薬的使用、医薬組成物、コード核酸及び調製方法に関する。
【背景技術】
【0003】
抗体薬物の免疫原性は一般的な現象である。前臨床試験と臨床試験に関する報告によると、市販又は開発中の種々の抗体薬物は、動物の体内で抗薬物抗体（ａｎｔｉ－ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＤＡ）を誘発するようになるが、産生されたＡＤＡは、抗体薬物の治療効果及び体内代謝などの特性に影響を及ぼす可能性がある。当該現象に対して、キメラ抗体の調製、抗体のヒト化改変、完全ヒト抗体の開発などを含む、回避又は緩和するための様々な技術及び方法が長年にわたって開発されてきた。
【0004】
しかし、完全ヒト抗体であっても、免疫原性の産生を完全に回避することができず、その原因の一つは、ヒトの体内に天然の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの断片に結合可能な自己抗体、即ち、予備の抗薬物抗体（ｐｒｅ－ａｎｔｉ－ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｐｒｅ－ＡＤＡ）が存在することである。これらのｐｒｅ－ＡＤＡは、ヒトの体内にわたって存在する様々な免疫グロブリンにエピトープ特異性を有し、エピトープは、Ｆｃ領域内のエピトープ、可変領域／ＣＤＲ領域内のエピトープ、重鎖中のヒンジ領域内のエピトープなどを含む。機能的には、現在の研究によれば、これらのｐｒｅ－ＡＤＡは、感染症、生体の免疫系の恒常性維持などに関連しているが、多くの具体的な機能がまだ十分に認識されていない。
【0005】
ｐｒｅ－ＡＤＡは、内因性免疫グロブリンに加え、治療用のタンパク質又はポリペプチド（モノクローナル抗体を含む）若しくはポリペプチド分子に結合することができる。治療用のタンパク質又はポリペプチド分子に結合するｐｒｅ－ＡＤＡは、当該分子を維持、消失、中和して、その機能と代謝に影響を与えることで、臨床応答及び生物学的利用能の変化を引き起こし、さらに過敏反応などの副作用及び特殊な現象の発生を招くことになる。
【0006】
単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）は、ヒトと非ヒト霊長類に由来するＩｇＧ分子の重鎖可変領域（ＶＨ）のｓｄＡｂ及びラクダ／アルパカに由来する重鎖（ＶＨＨ）のｓｄＡｂを含み、臨床開発に入る前に、ＡＤＡが低減されるように、免疫原性に関連する検出及び最適化を行うことが一般的である。しかし、ヒト化改変が行われても、これらの分子は、依然としてｐｒｅ－ＡＤＡに結合する可能性がある。ｓｄＡｂ及びその誘導体の構造に基づく薬物分子は、臨床開発中に強い免疫関連の副作用を生じさせ、かつ副作用がｐｒｅ－ＡＤＡの結合と密接に関係していることが報告されている。
【0007】
従って、ｓｄＡｂ及びその誘導体のｐｒｅ－ＡＤＡへの結合程度を低減可能な改変方法を提供することは、対応する薬剤のより良い開発、その臨床的価値の活用のために非常に有益である。本開示では、ｓｄＡｂのｐｒｅ－ＡＤＡへの結合を低減するための一連の改変方法が試験され、かつ望ましい候補分子を得ることに成功した。それらの改変方法及びそれらにより産生された候補分子は、今後、ｓｄＡｂベースの治療用生体高分子のｐｒｅ－ＡＤＡへの結合を低減し、さらに薬剤の臨床的治療効果を最適化するために広く使用されることが期待される。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、抗薬物抗体（ａｎｔｉ－ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＤＡ）、予備の抗薬物抗体（ｐｒｅ－ＡＤＡ）への結合が低減された免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。また、本開示は、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、関連製品のコード核酸、調製方法、医薬組成物、製薬的使用、検出的使用を提供する。
【0009】
免疫グロブリン単一可変ドメイン
第１の態様において、本開示の幾つかの実施形態は免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、それは、
Ｘ１Ｘ２（Ｘ３）ｎ又はＶＴＶＸ１Ｘ２（Ｘ３）ｎで示されるアミノ酸配列のＣ末端を含み、そのうち、Ｘ１はＳ、Ｆ及びＲから選ばれ、Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｓから選ばれ、Ｘ３はＡであるか又は存在せず、ｎは０～５の整数であり、
ｎが０である場合、Ｘ３は存在せず、
ｎが１～５である場合、Ｘ３はＡであり、
幾つかの具体的な実施形態において、上記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、下記の（ａ）～（ｅ）、即ち、
（ａ）ＳＡＡ又はＶＴＶＳＡＡ（配列番号３７）、
（ｂ）ＦＰ又はＶＴＶＦＰ（配列番号３８）、
（ｃ）ＦＰＡ又はＶＴＶＦＰＡ（配列番号３９）、
（ｄ）ＲＳ又はＶＴＶＲＳ（配列番号４５）、及び
（ｅ）ＲＳＡ又はＶＴＶＲＳＡ（配列番号４６）
の何れか１つからなるＣ末端を含む。
第１の態様において、本開示の幾つかの実施形態は免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、それは、
Ｘ１Ｘ２（Ｘ３）ｎ又はＶＴＶＸ１Ｘ２（Ｘ３）ｎで示されるアミノ酸配列のＣ末端を含み、そのうち、Ｘ１はＳ、Ｆ及びＲから選ばれ、Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｓから選ばれ、Ｘ３はＡであるか又は存在せず、ｎは０～５の整数であり、
ｎが０である場合、Ｘ３は存在せず、
ｎが１～５である場合、Ｘ３はＡであり、
幾つかの具体的な実施形態において、上記修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、下記の（ａ）～（ｅ）、即ち、
（ａ）ＳＡＡ又はＶＴＶＳＡＡ（配列番号３７）、
（ｂ）ＦＰ又はＶＴＶＦＰ（配列番号３８）、
（ｃ）ＦＰＡ又はＶＴＶＦＰＡ（配列番号３９）、
（ｄ）ＲＳ又はＶＴＶＲＳ（配列番号４５）、及び
（ｅ）ＲＳＡ又はＶＴＶＲＳＡ（配列番号４６）
の何れか１つからなるＣ末端を含む。
【0010】
幾つかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、そのＣ末端は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３若しくはＶＴＶＸ１Ｘ２Ｘ３で示されるアミノ酸配列を含むか又は上記アミノ酸配列で終結され、そのうち、Ｘ１はＳ、Ｆ、Ｒから選ばれ、Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｓから選ばれ、又はＸ２は存在せず、Ｘ３はＡから選ばれ、又はＸ３は存在しない。
【0011】
幾つかの実施形態において、上記Ｘ１Ｘ２Ｘ３若しくはＶＴＶＸ１Ｘ２Ｘ３は、下記の（１）～（１０）、即ち、
（１）ＳＡＡ若しくはＶＴＶＳＡＡ（配列番号３７）、
（２）ＦＰ若しくはＶＴＶＦＰ（配列番号３８）、
（３）ＦＰＡ若しくはＶＴＶＦＰＡ（配列番号３９）、
（４）ＲＰ若しくはＶＴＶＲＰ（配列番号４０）、
（５）Ｒ若しくはＶＴＶＲ（配列番号４１）、
（６）ＲＡ若しくはＶＴＶＲＡ（配列番号４２）、
（７）ＦＳ若しくはＶＴＶＦＳ（配列番号４３）、
（８）ＳＰ若しくはＶＴＶＳＰ（配列番号４４）、
（９）ＲＳ若しくはＶＴＶＲＳ（配列番号４５）、及び
（１０）ＲＳＡ若しくはＶＴＶＲＳＡ（配列番号４６）
から選ばれる何れか１つである。
（１）ＳＡＡ若しくはＶＴＶＳＡＡ（配列番号３７）、
（２）ＦＰ若しくはＶＴＶＦＰ（配列番号３８）、
（３）ＦＰＡ若しくはＶＴＶＦＰＡ（配列番号３９）、
（４）ＲＰ若しくはＶＴＶＲＰ（配列番号４０）、
（５）Ｒ若しくはＶＴＶＲ（配列番号４１）、
（６）ＲＡ若しくはＶＴＶＲＡ（配列番号４２）、
（７）ＦＳ若しくはＶＴＶＦＳ（配列番号４３）、
（８）ＳＰ若しくはＶＴＶＳＰ（配列番号４４）、
（９）ＲＳ若しくはＶＴＶＲＳ（配列番号４５）、及び
（１０）ＲＳＡ若しくはＶＴＶＲＳＡ（配列番号４６）
から選ばれる何れか１つである。
【0012】
幾つかの実施形態において、Ｃ末端が下記の何れか１つで示されるアミノ酸配列を含むか又は上記アミノ酸配列で終結される免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する：ＳＡ、ＳＡＳ、ＳＡＳＴ（配列番号４７）、ＳＡＳＴＫ（配列番号４８）、ＳＡＳＴＫＧ（配列番号４９）、ＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号５０）、ＳＡＴ、ＳＡＴＶ（配列番号５１）、ＳＡＡＳ（配列番号５２）、ＳＡＡＳＴ（配列番号５３）、ＳＡＡＳＴＫ（配列番号５４）、ＳＡＡＳＴＫＧ（配列番号５５）、ＳＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号５６）、ＦＳ、ＦＳＡ、ＦＳＡＳ（配列番号５７）、ＦＳＡＳＴ（配列番号５８）、ＦＳＡＳＴＫ（配列番号５９）、ＦＳＡＳＴＫＧ（配列番号６０）、ＦＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号６１）、ＦＳＴ、ＦＳＴＶ（配列番号６２）、ＦＰＡＳ（配列番号６３）、ＦＰＡＳＴ（配列番号６４）、ＦＰＡＳＴＫ（配列番号６５）、ＦＰＡＳＴＫＧ（配列番号６６）、ＦＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号６７）、ＲＰＡ、ＲＰＡＡ（配列番号６８）、ＲＰＡＳＴ（配列番号６９）、ＲＰＡＳＴＫ（配列番号７０）、ＲＰＡＳＴＫＧ（配列番号７１）、ＲＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号７２）、ＲＰＴ、ＲＰＴＶ（配列番号７３）、ＲＰＡＡＳＴ（配列番号７４）、ＲＰＡＡＳＴＫ（配列番号７５）、ＲＰＡＡＳＴＫＧ（配列番号７６）、ＲＰＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号７７）、ＲＡＡ、ＲＡＳＴ（配列番号７８）、ＲＡＳＴＫ（配列番号７９）、ＲＡＳＴＫＧ（配列番号８０）、ＲＡＳＴＫＧＰ（配列番号８１）、ＲＡＡＳＴ（配列番号８２）、ＲＡＡＳＴＫ（配列番号８３）、ＲＡＡＳＴＫＧ（配列番号８４）、ＲＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号８５）、ＲＡＴ、ＲＡＴＶ（配列番号８６）、ＳＡＡＧ（配列番号８７）、ＳＡＡＧＧ（配列番号８８）、ＦＰＧ、ＦＰＧＧ（配列番号８９）、ＦＰＡＧ（配列番号９０）、ＦＰＡＧＧ（配列番号９１）、ＲＡＧ、ＲＡＧＧ（配列番号９２）、ＲＳ、ＲＳＡ、ＲＳＡＡ（配列番号９３）、ＲＳＡＡＡ（配列番号９４）、ＲＳＡＳ（配列番号９５）、ＲＳＡＳＴ（配列番号９６）、ＲＳＡＳＴＫ（配列番号９７）、ＲＳＡＳＴＫＧ（配列番号９８）、ＲＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号９９）、ＲＳＧ又はＲＳＧＧ（配列番号１００）、ＶＴＶＳＡ（配列番号１０１）、ＶＴＶＳＡＳ（配列番号１０２）、ＶＴＶＳＡＳＴ（配列番号１０３）、ＶＴＶＳＡＳＴＫ（配列番号１０４）、ＶＴＶＳＡＳＴＫＧ（配列番号１０５）、ＶＴＶＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号１０６）、ＶＴＶＳＡＴ（配列番号１０７）、ＶＴＶＳＡＴＶ（配列番号１０８）、ＶＴＶＳＡＡＳ（配列番号１０９）、ＶＴＶＳＡＡＳＴ（配列番号１１０）、ＶＴＶＳＡＡＳＴＫ（配列番号１１１）、ＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧ（配列番号１１２）、ＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号１１３）、ＶＴＶＳＡＴ（配列番号１１４）、ＶＴＶＳＡＴＶ（配列番号１１５）、ＶＴＶＦＳ（配列番号１１６）、ＶＴＶＦＳＡ（配列番号１１７）、ＶＴＶＦＳＡＳ（配列番号１１８）、ＶＴＶＦＳＡＳＴ（配列番号１１９）、ＶＴＶＦＳＡＳＴＫ（配列番号１２０）、ＶＴＶＦＳＡＳＴＫＧ（配列番号１２１）、ＶＴＶＦＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号１２２）、ＶＴＶＦＳＴ（配列番号１２３）、ＶＴＶＦＳＴＶ（配列番号１２４）、ＶＴＶＦＰＡＳ（配列番号１２５）、ＶＴＶＦＰＡＳＴ（配列番号１２６）、ＶＴＶＦＰＡＳＴＫ（配列番号１２７）、ＶＴＶＦＰＡＳＴＫＧ（配列番号１２８）、ＶＴＶＦＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号１２９）、ＶＴＶＲＰＡ（配列番号１３０）、ＶＴＶＲＰＡＡ（配列番号１３１）、ＶＴＶＲＰＡＳＴ（配列番号１３２）、ＶＴＶＲＰＡＳＴＫ（配列番号１３３）、ＶＴＶＲＰＡＳＴＫＧ（配列番号１３４）、ＶＴＶＲＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号１３５）、ＶＴＶＲＰＡＡ（配列番号１３６）、ＶＴＶＲＰＴ（配列番号１３７）、ＶＴＶＲＰＴＶ（配列番号１３８）、ＶＴＶＲＰＡＡＳＴ（配列番号１３９）、ＶＴＶＲＰＡＡＳＴＫ（配列番号１４０）、ＶＴＶＲＰＡＡＳＴＫＧ（配列番号１４１）、ＶＴＶＲＰＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号１４２）、ＶＴＶＲＡＡ（配列番号１４３）、ＶＴＶＲＡＳＴ（配列番号１４４）、ＶＴＶＲＡＳＴＫ（配列番号１４５）、ＶＴＶＲＡＳＴＫＧ（配列番号１４６）、ＶＴＶＲＡＳＴＫＧＰ（配列番号１４７）、ＶＴＶＲＡＡＳＴ（配列番号１４８）、ＶＴＶＲＡＡＳＴＫ（配列番号１４９）、ＶＴＶＲＡＡＳＴＫＧ（配列番号１５０）、ＶＴＶＲＡＡＳＴＫＧＰ（配列番号１５１）、ＶＴＶＲＡＴ（配列番号１５２）、ＶＴＶＲＡＴＶ（配列番号１５３）、ＶＴＶＳＡＡＧ（配列番号１５４）、ＶＴＶＳＡＡＧＧ（配列番号１５５）、ＶＴＶＦＰＧ（配列番号１５６）、ＶＴＶＦＰＧＧ（配列番号１５７）、ＶＴＶＦＰＡＧ（配列番号１５８）、ＶＴＶＦＰＡＧＧ（配列番号１５９）、ＶＴＶＲＡＧ（配列番号１６０）、ＶＴＶＲＡＧＧ（配列番号１６１）、ＶＴＶＲＳ（配列番号１６２）、ＶＴＶＲＳＡ（配列番号１６３）、ＶＴＶＲＳＡＡ（配列番号１６４）、ＶＴＶＲＳＡＡＡ（配列番号１６５）、ＶＴＶＲＳＡＳ（配列番号１６６）、ＶＴＶＲＳＡＳＴ（配列番号１６７）、ＶＴＶＲＳＡＳＴＫ（配列番号１６８）、ＶＴＶＲＳＡＳＴＫＧ（配列番号１６９）、ＶＴＶＲＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号１７０）、ＶＴＶＲＳＧ（配列番号１７１）又はＶＴＶＲＳＧＧ（配列番号１７２）。
【0013】
第２の態様において、本開示の幾つかの実施形態は免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、そのＣ末端は、Ｘ４Ｘ５若しくはＶＴＶＸ４Ｘ５で示されるアミノ酸配列を含むか又は上記アミノ酸配列で終結され、そのうち、
Ｘ４はＦ又はＲから選ばれ、Ｘ５は存在してもしなくてもよく、Ｘ５は存在する場合、１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、また、例えば、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９個）のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長は、例えば、Ｐ、ＰＡ、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号１７３）、ＰＡＡ、ＰＡＡＡ（配列番号１７４）、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ（配列番号１７５）、ＡＳＴＫＧ（配列番号１７６）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１７７）、ＰＡＳ、ＰＡＳＴ（配列番号１７８）、ＰＡＳＴＫ（配列番号１７９）、ＰＡＳＴＫＧ（配列番号１８０）、ＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号１８１）、ＰＴ、ＰＴＶ、ＰＧ、ＰＧＧ、ＰＡＧ、Ｓ、ＳＡ、ＳＡＡ、ＳＡＡＡ（配列番号１８２）、ＳＡＳ、ＳＳＡＳＴ（配列番号１８３）、ＳＳＡＳＴＫ（配列番号１８４）、ＳＳＡＳＴＫＧ（配列番号１８５）、ＳＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号１８６）、ＳＲＳＧ（配列番号１８７）又はＳＲＳＧＧ（配列番号１８８）であり、或いは
Ｘ４はＳであり、Ｘ５は１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、また、例えば、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９個）のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長は、例えば、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ、ＡＳＴＫＧ、ＡＳＴＫＧＰ、Ｔ、ＴＶ、Ｇ、ＧＧである。
Ｘ４はＦ又はＲから選ばれ、Ｘ５は存在してもしなくてもよく、Ｘ５は存在する場合、１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、また、例えば、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９個）のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長は、例えば、Ｐ、ＰＡ、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号１７３）、ＰＡＡ、ＰＡＡＡ（配列番号１７４）、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ（配列番号１７５）、ＡＳＴＫＧ（配列番号１７６）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１７７）、ＰＡＳ、ＰＡＳＴ（配列番号１７８）、ＰＡＳＴＫ（配列番号１７９）、ＰＡＳＴＫＧ（配列番号１８０）、ＰＡＳＴＫＧＰ（配列番号１８１）、ＰＴ、ＰＴＶ、ＰＧ、ＰＧＧ、ＰＡＧ、Ｓ、ＳＡ、ＳＡＡ、ＳＡＡＡ（配列番号１８２）、ＳＡＳ、ＳＳＡＳＴ（配列番号１８３）、ＳＳＡＳＴＫ（配列番号１８４）、ＳＳＡＳＴＫＧ（配列番号１８５）、ＳＳＡＳＴＫＧＰ（配列番号１８６）、ＳＲＳＧ（配列番号１８７）又はＳＲＳＧＧ（配列番号１８８）であり、或いは
Ｘ４はＳであり、Ｘ５は１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、また、例えば、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９個）のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長は、例えば、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ、ＡＳＴＫＧ、ＡＳＴＫＧＰ、Ｔ、ＴＶ、Ｇ、ＧＧである。
【0014】
幾つかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、そのＣ末端は、Ｘ４Ｘ５若しくはＶＴＶＸ４Ｘ５で示されるアミノ酸配列を含むか又は上記アミノ酸配列で終結され、そのうち、
Ｘ４はＦ又はＲから選ばれ、Ｘ５は１～５個のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長はＰ、ＰＡ、Ｓ、ＳＡが好ましく、又は
Ｘ４はＳであり、Ｘ５は１～５個のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長はＡＡが好ましく、
例えば、上記Ｘ４Ｘ５若しくはＶＴＶＸ４Ｘ５は、
ＳＡＡ若しくはＶＴＶＳＡＡ、
ＦＰ若しくはＶＴＶＦＰ、
ＦＰＡ若しくはＶＴＶＦＰＡ、
ＲＳ若しくはＶＴＶＲＳ、又は
ＲＳＡ若しくはＶＴＶＲＳＡ
から選ばれる何れか１つである。
Ｘ４はＦ又はＲから選ばれ、Ｘ５は１～５個のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長はＰ、ＰＡ、Ｓ、ＳＡが好ましく、又は
Ｘ４はＳであり、Ｘ５は１～５個のアミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し、上記アミノ酸伸長はＡＡが好ましく、
例えば、上記Ｘ４Ｘ５若しくはＶＴＶＸ４Ｘ５は、
ＳＡＡ若しくはＶＴＶＳＡＡ、
ＦＰ若しくはＶＴＶＦＰ、
ＦＰＡ若しくはＶＴＶＦＰＡ、
ＲＳ若しくはＶＴＶＲＳ、又は
ＲＳＡ若しくはＶＴＶＲＳＡ
から選ばれる何れか１つである。
【0015】
第３の態様において、本開示の幾つかの実施形態は、ヒト生殖細胞系列に由来するフレームワーク配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【0016】
幾つかの実施形態において、それは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１２位に、例えば、１１２Ｆ、１１２Ｒ又は１１２Ａから選ばれるアミノ酸修飾が存在する。
【0017】
幾つかの実施形態において、それは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１３位に、例えば、１１３Ｐ、１１３Ａ又は１１３Ｓであるアミノ酸修飾が存在する。
【0018】
幾つかの実施形態において、１１２Ｆのアミノ酸修飾が存在する場合、１１３位に１１３Ｐ、１１３Ａ又は１１３Ｓのアミノ酸修飾が同時に存在し、或いは、１１２Ｒのアミノ酸修飾が存在する場合、及び／又は１１３位に１１３Ｐ又は１１３Ａのアミノ酸修飾が存在する。
【0019】
幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、１１２位と１１３位に、１１２Ｆと１１３Ｐ、１１２Ｆと１１３Ａ、１１２Ｆと１１３Ｓ、１１２Ｒと１１３Ｐ、１１２Ｒと１１３Ａ、１１２Ｒと１１３Ｓ、１１２Ａと１１３Ｐ、１１２Ａと１１３Ａ、１１２Ａと１１３Ｓ、１１２Ｓと１１３Ｐから選ばれる何れか１つのアミノ酸修飾の組み合わせが存在する。
【0020】
幾つかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、それは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１２位に１１２Ｆ又は１１２Ｒのアミノ酸修飾が存在し、
選択的に、さらにヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１３位に１１３Ｐのアミノ酸修飾が存在し、又は１１３位はＳであり、
幾つかの具体的な実施形態において、上記ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１２位と１１３位には、
１１２Ｆと１１３Ｐ、
１１２Ｒと１１３Ｓ、及び
１１２Ｆと１１３Ｓ
の何れか１つのアミノ酸残基の組み合わせが存在する。
選択的に、さらにヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１３位に１１３Ｐのアミノ酸修飾が存在し、又は１１３位はＳであり、
幾つかの具体的な実施形態において、上記ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１２位と１１３位には、
１１２Ｆと１１３Ｐ、
１１２Ｒと１１３Ｓ、及び
１１２Ｆと１１３Ｓ
の何れか１つのアミノ酸残基の組み合わせが存在する。
【0021】
第４の態様において、本開示の幾つかの実施形態は、ヒト生殖細胞系列に由来するフレームワーク配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【0022】
幾つかの実施形態において、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１２位は、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列に対する１１３位におけるアミノ酸修飾を含むＳであり、上記修飾は１１３Ａ、１１３Ｐから選ばれる。
【0023】
幾つかの実施形態において、１１３位の後に、さらに１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、また、例えば、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９個）のアミノ酸残基のアミノ酸伸長があり、上記アミノ酸伸長は、例えば、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ、ＡＳＴＫＧ、ＡＳＴＫＧＰ、ＴＶ、Ｔ、Ｇ、ＧＧである。
【0024】
幾つかの実施形態において、上記Ｃ末端は、上記免疫グロブリン単一可変ドメインが上記アミノ酸修飾を含むように、アミノ酸修飾（例えば、置換又は取替、欠失、付加）により産生することができる。
【0025】
幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下のものをさらに含んでもよい：
１）ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１４位、４１位、１０８位における１つ又は複数のアミノ酸修飾である。幾つかの具体的な実施形態において、１４位の修飾は、１４Ａ、１４Ｋ、１４Ｑ、１４Ｔ（例えば、Ｐ１４Ａ、Ｐ１４Ｋ、Ｐ１４Ｑ、Ｐ１４Ｔ）を含むが、これらに限定されず、４１位の修飾は４１Ａ（例えば、Ｐ４１Ａ）を含むが、これらに限定されず、１０８位の修飾は１０８Ａ、１０８Ｑ（例えば、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０８Ｑ）を含むが、これらに限定されない。ここにＷＯ２０１３０２４０５９Ａにおける関連変異が全体として組み込まれている。
１）ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１４位、４１位、１０８位における１つ又は複数のアミノ酸修飾である。幾つかの具体的な実施形態において、１４位の修飾は、１４Ａ、１４Ｋ、１４Ｑ、１４Ｔ（例えば、Ｐ１４Ａ、Ｐ１４Ｋ、Ｐ１４Ｑ、Ｐ１４Ｔ）を含むが、これらに限定されず、４１位の修飾は４１Ａ（例えば、Ｐ４１Ａ）を含むが、これらに限定されず、１０８位の修飾は１０８Ａ、１０８Ｑ（例えば、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０８Ｑ）を含むが、これらに限定されない。ここにＷＯ２０１３０２４０５９Ａにおける関連変異が全体として組み込まれている。
【0026】
２）ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１位、１３位、１４位、１５位、８２位、８２ａ又は８２ｂ位、８３位、８４位、１０７位、１０８位における１つ又は複数のアミノ酸修飾である。ここにＷＯ２０１２１７５７４１Ａにおける関連変異が全体として組み込まれている。
【0027】
３）ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に対する１１位及び／又は８８位にあるアミノ酸修飾である。幾つかの具体的な形態において、１１位の修飾は、１１Ｋ、１１Ｒ、１１Ｄ、１１Ｅ（例えば、Ｌ１１Ｋ、Ｌ１１Ｒ、Ｌ１１Ｄ、Ｌ１１Ｅ）を含むが、これらに限定されず、８８位の修飾は、８８Ｅ、８８Ｄ、８８Ｒ、Ａ８Ｋ（例えば、Ａ８８Ｅ、Ａ８８Ｄ、Ａ８８Ｒ、Ａ８８Ｋ）を含むが、これらに限定されない。幾つかの具体的な形態において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、１１Ｅ／８８Ｅ、１１Ｅ／８８Ｄ、１１Ｅ／８８Ｋ、１１Ｅ／８８Ｒ、１１Ｄ／８８Ｅ、１１Ｄ／８８Ｄ、１１Ｄ／８８Ｋ、１１Ｄ／８８Ｒ、１１Ｋ／８８Ｅ、１１Ｋ／８８Ｄ、１１Ｋ／８８Ｋ、１１Ｋ／８８Ｒ、１１Ｒ／８８Ｅ、１１Ｒ／８８Ｄ、１１Ｒ／８８Ｋ又は１１Ｒ／８８Ｒ（例えば、Ｌ１１Ｅ／Ａ８８Ｅ、Ｌ１１Ｅ／Ａ８８Ｄ、Ｌ１１Ｅ／Ａ８８Ｋ、Ｌ１１Ｅ／Ａ８８Ｒ、Ｌ１１Ｄ／Ａ８８Ｅ、Ｌ１１Ｄ／Ａ８８Ｄ、Ｌ１１Ｄ／Ａ８８Ｋ、Ｌ１１Ｄ／Ａ８８Ｒ、Ｌ１１Ｋ／Ａ８８Ｅ、Ｌ１１Ｋ／Ａ８８Ｄ、Ｌ１１Ｋ／Ａ８８Ｋ、Ｌ１１Ｋ／Ａ８８Ｒ、Ｌ１１Ｒ／Ａ８８Ｅ、Ｌ１１Ｒ／Ａ８８Ｄ、Ｌ１１Ｒ／Ａ８８Ｋ又はＬ１１Ｒ／Ａ８８Ｒ）から選ばれる組み合わせを有する。ここにＷＯ２０１６１１８７３３における関連変異が全体として組み込まれている。
【0028】
幾つかの実施形態において、上記ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列は、ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列であってもよい。
【0029】
幾つかの実施形態において、未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメインに比べて、上記本開示に提供される修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、低減された副作用、及び／又は向上した安全性を有する。例えば、低減された免疫原性を有する。
【0030】
幾つかの具体的な実施形態において、未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメインに比べて、上記本開示に提供される修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、血清に存在するｐｒｅ－ＡＤＡ又はＡＤＡへの結合が低減されている。低減された結合能は、当該分子が、低減された親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）又は低減された親和力（ａｖｉｄｉｔｙ）でｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）に結合することを意味する。例えば、上記本開示に提供される修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）へのＫＤは、未修飾のｓｄＡｂのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）へのＫＤの１．５倍又はそれ以上（例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、８倍）である。また、例えば、上記本開示に提供される修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）への結合は、未修飾のｓｄＡｂのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）への結合に比べて、１０％以上（例えば、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％）低減されており、採用可能な検出方法は、この分野で通常のもの、例えば、本開示の実施例１に示されるＥＬＩＳＡである。ＫＤは平衡解離定数を指し、当業者には、ＫＤの値が小さいほど、結合が強くなることが理解される。
【0031】
幾つかの実施形態において、上記本開示に提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）又はナノボディであってもよい。例えば、ＶＨ ｓｄＡｂ又はＶＨＨである。上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト又は非ヒトのもの、例えば、ヒトＶＨ ｓｄＡｂ又はヒト化したラクダＶＨＨであってもよい。上記免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ、ナノボディ）は、ファージディスプレイで得られたもの、又はキメラの、ラクダの、ヒト化のものであってもよい。上記免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ、ナノボディ）は、配列が最適化されたもの、例えば、ヒト化、親和性成熟、Ｔ細胞エピトープの除去、抗体脱アミドの低減及び／又は抗体異性化の低下によって配列が改変されたものであってもよい。上記免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ）は、翻訳後修飾されたもの、例えば、リーダー配列の切断、様々なグリコシル化とリン酸化モードにおける様々な糖部分の添加、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合の混在（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）、異性化、Ｃ末端リジンの切断及びＮ末端グルタミンの環化が行われたものであってもよい。
【0032】
幾つかの実施形態において、上記本開示に提供される免疫グロブリン単一可変ドメインの標的抗原への結合（例えば、一価結合）は、標的抗原のＣＤＲ領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む）への特異的結合を含み、上記ｓｄＡｂは、例えば、約５μＭ～約１ｐＭの範囲内のＫＤで標的抗原に結合し、また、例えば、約５００ｎＭ～約１０ｐＭ、約２００ｎＭ～約１０ｐＭ、約５０ｎＭ～約１０ｐＭ、約１０ｎｍ～約１０ｐＭの範囲内のＫＤで上記標的抗原に結合する。
【0033】
幾つかの実施形態において、上記本開示に提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、その変異体を含み、上記変異体は、親免疫グロブリン単一可変ドメインに比べて１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸変異を有し、上記アミノ酸変異は、保存的な取替、置換若しくは修飾、及び／又は機能に影響を及ぼさない欠失、付加であってもよく、上記アミノ酸変異はＣＤＲ領域及び／又はＦＲ領域に発生されてもよく、上記変異体は、親免疫グロブリン単一可変ドメインに比べて、同様又は非常に類似の生物学的機能、ｐｒｅ－ＡＤＡ又はＡＤＡへの結合親和性を有する。幾つかの具体的な実施形態において、上記変異体は、例えば、上記免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸保存的置換変異体である。
【0034】
幾つかの実施形態において、上記本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、別の分子と融合するか又は複合し、融合物又は複合体の形態で存在する。上記別の分子は、別の免疫グロブリン単一可変ドメイン、タンパク質又はポリペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＰＥＧ分子を含むが、これらに限定されない。幾つかの具体的な実施形態において、上記本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは上記融合物又は複合体のＣ末端に位置又は暴露し、例えば、当該融合物又は複合体が１つのポリペプチド鎖からなる場合、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは当該ポリペプチド鎖のＣ末端に位置又は暴露し、当該融合物又は複合体が２つ又は複数のポリペプチド鎖で重合されてなる場合、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、少なくともその１つのポリペプチド鎖のＣ末端、又は２つ、複数のポリペプチド鎖のＣ末端に位置又は暴露する。
【0035】
タンパク質又はポリペプチド
本開示は、上記本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８個）を含むタンパク質又はポリペプチドを提供する。
本開示は、上記本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８個）を含むタンパク質又はポリペプチドを提供する。
【0036】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチドは、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインと他のポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）との融合タンパク質又はポリペプチドである。
【0037】
幾つかの実施形態において、上記少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記タンパク質又はポリペプチドのＣ末端に位置する。
【0038】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチドは、抗体（その抗原結合断片を含む）である。
【0039】
幾つかの実施形態において、上記抗体は、単一特異性抗体（モノクローナル抗体）又は二重特異性抗体（二重抗体）、多重特異性抗体（例えば、三重抗体、四重抗体）である。
【0040】
幾つかの実施形態において、上記抗体は、一価、二価、三価、四価、五価又は六価のものである。
【0041】
幾つかの実施形態において、上記抗体は重鎖及び軽鎖を含み、上記少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記重鎖のＣ末端及び／又は上記軽鎖のＣ末端に位置する。
【0042】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）が１つのポリペプチド鎖で構成される場合、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、当該ポリペプチド鎖のＣ末端に位置し、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）が２つのポリペプチド鎖で構成／重合されてなる場合、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つのポリペプチド鎖の１つ又は２つのＣ末端に位置してもよく、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）が３つ、４つ又はそれ以上のポリペプチド鎖で構成／重合されてなる場合、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、その中の１つ、２つ、それ以上又は全てのポリペプチド鎖のＣ末端に位置してもよい。本開示において、上記ポリペプチド鎖のＮ末端に対する他の免疫グロブリン可変ドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ ｓｄＡｂ又はＶＬ ｓｄＡｂ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ポリペプチドの連結を排斥しない。
【0043】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）は免疫グロブリンＦｃ領域を含み、例えば、上記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。幾つかの具体的な実施形態において、上記Ｆｃ領域は、エフェクター機能が増加又は減少されたものであり、上記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。幾つかの具体的な実施形態において、上記Ｆｃ領域は、ＦｃγＲへの結合が増強又は減弱されたものである。幾つかの具体的な実施形態において、上記Ｆｃ領域は、重鎖ミスマッチ防止変異を含むもの、例えば、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫＩＨ）である。幾つかの具体的な実施形態において、エフェクター機能が増強された例示的なＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｋ、Ｆ２４１Ａ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｖ、Ｆ２９６Ａ、Ｙ２９６Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｉ３３２Ｅという置換又はその任意の組み合わせを含み、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ、Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ、Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ、Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ又はＫ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅである。幾つかの実施形態において、エフェクター機能が低減された例示的なＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１上のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ４上のＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４上のＮ２９７Ａという置換を含み、さらに、ハイブリッドＩｇＧ２／４Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃを使用してもよい。
【0044】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）では、本開示の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端がＦｃ領域（例えば、そのＣＨ３）のＣ末端に直接的に又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結される。幾つかの実施形態において、上記抗体では、本開示の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端が抗体の軽鎖（例えば、そのＣＬ）のＣ末端に直接的に又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結される。本開示において、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端に対する他の免疫グロブリン可変ドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ ｓｄＡｂ又はＶＬ ｓｄＡｂ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ポリペプチドの連結を排斥しない。幾つかの実施形態において、上記リンカーは通常のものであり、例えば、（ＧｍＳｎ）ｈ又は（ＧＧＮＧＴ）ｈ又は（ＹＧＮＧＴ）ｈ又は（ＥＰＫＳＳ）ｈを含むが、これらに限定されず、そのうち、ｍ、ｎはそれぞれ独立的に１～８の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８）から選ばれ、ｈは独立的に１～２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）から選ばれる。例えば、リンカーは、Ｇ４Ｓ、ＧＳ、ＧＡＰ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）５又はＡＳＧＳである。
【0045】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８個）の抗原結合ドメインを含み、幾つかの具体的な形態において、上記少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８個）の抗原結合ドメインは、２つの異なる抗原を標的とするか、又は複数（例えば、３、４個）の異なる抗原を標的とし、或いは同じ抗原の２つ又は複数（例えば、３、４、５、６個）の異なるドメイン又はエピトープを標的とする。
【0046】
幾つかの実施形態において、上記抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４０、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１を含む）、ＶＥＧＦ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＡＳＧＰＲ、ＨＳＡ、ＴＧＦβＲ２及び４－１ＢＢを含むが、これらに限定されない。
【0047】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）は、疾患／病状を治療又は予防するための治療又は予防用のものであり、上記疾患／病状は、細胞増殖性疾患（例えば、腫瘍）、代謝性疾患、自己免疫疾患又は感染性疾患を含むが、これらに限定されない。
【0048】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）は、アルブミン又はポリペプチド（ＨＳＡ）、ＨＳＡ結合ドメイン（例えば、抗ＨＳＡ抗体、抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体）、ＰＥＧ分子又は免疫グロブリンＦｃ領域などの半減期延長ドメインをさらに含む。
【0049】
本開示は、上記本開示に係るｓｄＡｂを含み、又は上記本開示に係るタンパク質又はポリペプチドを含む複合体又は誘導体をさらに提供する。上記複合体は、例えば、任意の検出可能な標識を含んでもよい。
【0050】
例示的な免疫グロブリン単一可変ドメイン
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインの例として、本開示は、４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドをさらに提供する。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインの例として、本開示は、４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドをさらに提供する。
【0051】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、配列番号６、１５～１８の何れか１つで示されるアミノ酸配列におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義される。
【0052】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の何れか１つ又はその任意の組み合わせを含む。
【0053】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８、９で示され、又は配列番号７、８、１８で示される。それは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されるＣＤＲである。
【0054】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化、親和性成熟、Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）の除去／低減、抗体脱アミドの低減及び／又は抗体異性化の低下によって改変されたものである。幾つかの具体的な実施形態において、上記ヒト化に使用されるヒト生殖細胞系列テンプレートの重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＩＧＨＶ３－６４＊０４、ＩＧＨＶ３－２３＊０３及び／又はＩＧＨＶ３－７４＊０１に由来する。幾つかの実施形態において、ＦＲ１はＩＧＨＶ３－６４＊０４、ＦＲ２はＩＧＨＶ３－２３＊０３、ＦＲ３はＩＧＨＶ３－７４＊０１に由来する。
【0055】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、１５～１８、２０～３５の何れか１つで示されるか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する。
【0056】
本開示において、「少なくとも８０％の（配列）同一性」は、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の（配列）同一性をカバーし、「少なくとも９０％の（配列）同一性」は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の（配列）同一性をカバーし、「少なくとも９５％の（配列）同一性」は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の（配列）同一性をカバーする。
【0057】
幾つかの実施形態において、アミノ酸配列が配列番号２１、３０～３５の何れか１つで示され、配列番号２０、２２～２９の何れか１つで示される４－１ＢＢに特異的に結合するｓｄＡｂに比べてｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）への結合が低減された、４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【0058】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を提供する。上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６個）であってもよく、同一でも異なってもよい。上記抗体は、例えば、単一、二重又は多重特異性抗体である。
【0059】
幾つかの実施形態において、上記タンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含み、例えば、上記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、エフェクター機能が低下した、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣが低減されたＦｃ領域である。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、配列番号１０～１２の何れか１つで示されるか、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0060】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下から選ばれる少なくとも１つの活性を有する：
（ａ）≦１０－７のＫＤ値でヒト４－１ＢＢ又はそのエピトープに結合すること、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂ（即ち、ＣＤ３２ｂ）で架橋されていない場合、４－１ＢＢシグナル伝達経路を弱く活性化するか又は活性化せず、例えば、１００ｎの抗体濃度で、ＦｃγＲＩＩｂで架橋されていない場合の活性化の程度が、ＦｃγＲＩＩｂで架橋された場合の飽和抗体濃度条件下での活性の１０％以下であること、
（ｃ）ＦｃγＲＩＩｂで架橋された場合、４－１ＢＢシグナル伝達経路を比較的強く活性化するか又は強く活性化し、例えば、ＥＣ５０が１ｎＭ未満であること、
（ｄ）Ｔ細胞を活性化し、及び／又はＴ細胞の増殖を促進すること、及び
（ｅ）腫瘍の増殖を阻害すること。
（ａ）≦１０－７のＫＤ値でヒト４－１ＢＢ又はそのエピトープに結合すること、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂ（即ち、ＣＤ３２ｂ）で架橋されていない場合、４－１ＢＢシグナル伝達経路を弱く活性化するか又は活性化せず、例えば、１００ｎの抗体濃度で、ＦｃγＲＩＩｂで架橋されていない場合の活性化の程度が、ＦｃγＲＩＩｂで架橋された場合の飽和抗体濃度条件下での活性の１０％以下であること、
（ｃ）ＦｃγＲＩＩｂで架橋された場合、４－１ＢＢシグナル伝達経路を比較的強く活性化するか又は強く活性化し、例えば、ＥＣ５０が１ｎＭ未満であること、
（ｄ）Ｔ細胞を活性化し、及び／又はＴ細胞の増殖を促進すること、及び
（ｅ）腫瘍の増殖を阻害すること。
【0061】
そのうち、（ｂ）、（ｃ）における４－１ＢＢシグナル伝達経路の活性化検出については、例えば、実施例５の４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが参照される。
【0062】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン結合４－１ＢＢのＫＤ値は、≦１×１０－７Ｍ、例えば、≦１×１０－８Ｍ、又は≦１×１０－９Ｍ、又は≦１×１０－１０Ｍであってもよい。
【0063】
幾つかの実施形態において、上記４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、腫瘍の増殖を少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％阻害することができる。
【0064】
幾つかの実施形態において、上記本開示に係る４－１ＢＢに特異的に結合するｓｄＡｂと同じエピトープに結合するか又は競合的に結合し、或いは、上記本開示に係る４－１ＢＢに特異的に結合するｓｄＡｂの４－１ＢＢへの結合を遮断し、或いは、４－１ＢＢへの結合が上記本開示に係る４－１ＢＢに特異的に結合するｓｄＡｂにより遮断されるタンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体）を提供する。
【0065】
ポリヌクレオチド及びベクター
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）をコードする核酸分子を提供する。上記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。本開示の幾つかの実施形態によれば、上記核酸は、基本的に単離した核酸である。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）をコードする核酸分子を提供する。上記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。本開示の幾つかの実施形態によれば、上記核酸は、基本的に単離した核酸である。
【0066】
本開示に係る核酸は、ベクターの形態であってもよく、ベクター中に存在してもよく、及び／又はベクターの一部であってもよく、当該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターである。ベクターは、特に発現ベクターであってもよく、即ち、ＰＤ－１結合タンパク質又はポリペプチドのインビトロ及び／又はインビボで（即ち、適切な宿主細胞、宿主有機体及び／又は発現系で）の発現を可能にするベクターであってもよい。当該発現ベクターは一般的に、少なくとも１つの本開示の核酸を含み、１つ又は複数の適切な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に操作可能に連結される。特定の宿主における発現に対して上記要素及びその配列を選択することは、当業者の常識である。本開示のｓｄＡｂ、上記ｓｄＡｂを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の発現に有用又は必要な調節要素及び他の要素は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子である。
【0067】
本開示に係る核酸は、本開示に係るポリペプチドのアミノ酸配列についての情報に基づき、既知の方法（例えば、自動ＤＮＡ合成及び／又は組換えＤＮＡ技術）により調製又は取得されてもよく、及び／又は適切な天然源から単離されてもよい。
【0068】
宿主細胞
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を発現するか又は発現できる、及び／又は本開示の核酸若しくはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を発現するか又は発現できる、及び／又は本開示の核酸若しくはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
【0069】
細菌細胞は、例えば、グラム陰性菌株（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）菌株及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株）及びグラム陽性菌株（例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）菌株及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株）の細胞を含む。
【0070】
真菌細胞は、例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種の細胞を含み、又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）とピキアメタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））及びハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種の細胞を含む。
【0071】
哺乳動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などを含む。
【0072】
しかしながら、本開示は、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞及びこの分野における異種タンパク質又はポリペプチドを発現するための任意の他の細胞を使用してもよい。
【0073】
調製方法
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を調製するための方法であって、上記の宿主細胞において上記目的タンパク質又はポリペプチドを発現し、かつ当該宿主細胞から目的タンパク質又はポリペプチドを単離する方法を提供する。選択的に、精製工程を含んでもよく、例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製し、非特異的に結合した成分を洗い流し、さらにＰＨ勾配法により、結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出して収集する。選択的に、通常の方法によりろ過して濃縮する。可溶性の混合物及びポリマーは、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに－７０℃などで冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を調製するための方法であって、上記の宿主細胞において上記目的タンパク質又はポリペプチドを発現し、かつ当該宿主細胞から目的タンパク質又はポリペプチドを単離する方法を提供する。選択的に、精製工程を含んでもよく、例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製し、非特異的に結合した成分を洗い流し、さらにＰＨ勾配法により、結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出して収集する。選択的に、通常の方法によりろ過して濃縮する。可溶性の混合物及びポリマーは、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに－７０℃などで冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
【0074】
本開示に係る工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローニングして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。哺乳動物類の発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することにより、安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において拡大培養することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製して収集することができる。抗体は、通常の方法によりろ過して濃縮することができる。可溶性の混合物及びポリマーは、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。
【0075】
組成物
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメを含むンタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を含む組成物を提供する。例えば、疾患（例えば、がん）への治療、緩和又は予防有効量の本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメを含むンタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を含む組成物を提供する。例えば、疾患（例えば、がん）への治療、緩和又は予防有効量の本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0076】
幾つかの具体的な実施形態において、上記医薬組成物の単位用量には、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が０．０１～９９重量％含まれてもよく、或いは医薬組成物の単位用量における本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の含有量は０．１～２０００ｍｇであり、幾つかの具体的な実施形態では１～１０００ｍｇである。
【0077】
幾つかの実施形態において、上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を含む製品又は生産品を提供する。選択的に、製品は、容器及びラベルを含む。容器は、例えば、バイアル、注射器及び試験管である。容器には、病状（例えば、がん、自己免疫疾患、代謝性疾患）の治療に有効な組成物が収容される。容器における、又は容器に接続されるラベルは、上記組成物が、選択された病状（例えば、がん、自己免疫疾患、代謝性疾患）の治療に用いられることを示す。
【0078】
幾つかの実施形態において、上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を含む医薬組成物を提供する。上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）は、疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、代謝性疾患）を治療又は緩和する有効量であってもよく、医薬組成物には、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターがさらに含まれてもよい。
【0079】
上記免疫グロブリン単一可変ドメインが４－１ＢＢに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである場合、上記病状は、例えば、肺がん、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、肝がん、黒色腫、腎がん、扁平上皮がん、血液系がん又はその任意の組み合わせから選ばれるがんなどである。
【0080】
治療方法及び製薬的使用
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）及びその医薬組成物を疾患又は病状の治療・緩和・予防・診断に使用する方法を提供する。
上記本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）及びその医薬組成物を疾患又は病状の治療・緩和・予防・診断に使用する方法を提供する。
【0081】
幾つかの実施形態において、疾患を改善、緩和、治療又は予防する方法であって、対象に改善、緩和、治療又は予防有効量の本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）及びその医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0082】
幾つかの実施形態において、疾患を改善、緩和、治療又は予防する薬剤の調製に用いられる本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）及びその医薬組成物の使用を提供する。
【0083】
幾つかの実施形態において、上記疾患は、増殖性病状、又は制御不能な細胞増殖を特徴とする任意の他の疾患や病状である（例えば、がんであり、本開示において、がんと腫瘍は入れ替えて使用されてもよい）。幾つかの実施形態において、上記がんは固形腫瘍又は血液腫瘍である。幾つかの実施形態において、上記がんは進行性又は転移性である。幾つかの実施形態において、上記がんは、肺がん、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、肝がん、黒色腫、腎がん、扁平上皮がん、血液系がん又はその任意の組み合わせから選ばれる。
【0084】
幾つかの実施形態において、対象の感染症又は自己免疫疾患を治療又は予防する方法であって、上記対象に治療又は予防有効量の本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）及びその医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、上記感染症は、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の異なる程度の機能障害を特徴とする、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどの病原体感染である。幾つかの実施形態において、上記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病、クローン病、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ及び乾癬性関節炎から選ばれる。
【0085】
検出
インビボ又はインビトロで使用可能な本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の検出的使用を提供する。
インビボ又はインビトロで使用可能な本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の検出的使用を提供する。
【0086】
さらに、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）による副作用（免疫原性、ＡＤＡ又はｐｒｅ－ＡＤＡへの結合を含む）を検出する方法、システム又は装置を提供し、それは、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）により試料、例えば、対象からの血清試料を処理することを含み、上記対象は、疾患の治療又は予防のために本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が投与される対象であり得る。
【0087】
幾つかの実施形態において、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）は、それがタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するか否かを予測する方法に使用される。例えば、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）には、タンパク質若しくはポリペプチド干渉が発生されるか、或いはヒト血液若しくは血清にある干渉因子（例えば、ｐｒｅ－ＡＤＡ）に結合する高い又は増加したリスクがあるか否かを確認することに使用される。
【0088】
幾つかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が免疫アッセイ（例えば、ＡＤＡ又はｐｒｅ－ＡＤＡアッセイ）においてタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するか否かを測定するための方法を提供し、上記方法は、
（ｉ）上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を、ヒト対象から得られ、かつＣ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本開示における「未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメイン」）のＣ末端を認識及び／又は結合するその能力によって選択／単離された抗体と接触させるステップと、
（ｉｉ）上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が上記免疫アッセイにおいて上記抗体に結合するか否かを確認するステップと、
を少なくとも含む免疫アッセイを行うことを含む。ステップ（ｉｉ）における上記抗体への結合は、上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がそのようなタンパク質又はポリペプチド干渉を発生することができる（或いは発生するリスクが高い又は増加される）ことを意味する。
（ｉ）上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を、ヒト対象から得られ、かつＣ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本開示における「未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメイン」）のＣ末端を認識及び／又は結合するその能力によって選択／単離された抗体と接触させるステップと、
（ｉｉ）上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が上記免疫アッセイにおいて上記抗体に結合するか否かを確認するステップと、
を少なくとも含む免疫アッセイを行うことを含む。ステップ（ｉｉ）における上記抗体への結合は、上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がそのようなタンパク質又はポリペプチド干渉を発生することができる（或いは発生するリスクが高い又は増加される）ことを意味する。
【0089】
幾つかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメイン、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質若しくはポリペプチド又は抗体が免疫アッセイにおいてタンパク質又はポリペプチド干渉を発生する程度を予測するための方法を提供し、上記方法は、
（ｉ）本開示に係る任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を、ヒト対象から得られ、かつそのＣ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端を認識及び／又は結合するその能力によって選択／単離された抗体と接触させるステップと、
（ｉｉ）上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が上記免疫アッセイにおいて上記抗体に結合するか否か、及び結合程度の強さ（幾つかの実施形態では、上記結合程度の強さは、同一の実験又は同等の検出条件下で、Ｃ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメインの上記抗体への結合程度と比較される）を確認するステップと、
を少なくとも含む免疫アッセイを行うことを含み、
ここで、ステップ（ｉｉ）において結合が発生され、又は結合程度が強いことは、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がタンパク質又はポリペプチド干渉を発生することができ、或いはタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するリスクが高い又は増加されることを意味し、ステップ（ｉｉ）において結合が発生されず、又は結合程度が弱いことは、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がタンパク質又はポリペプチド干渉を発生せず、或いはタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するリスクが低いことを意味し、例えば、上記免疫アッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。
（ｉ）本開示に係る任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を、ヒト対象から得られ、かつそのＣ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端を認識及び／又は結合するその能力によって選択／単離された抗体と接触させるステップと、
（ｉｉ）上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が上記免疫アッセイにおいて上記抗体に結合するか否か、及び結合程度の強さ（幾つかの実施形態では、上記結合程度の強さは、同一の実験又は同等の検出条件下で、Ｃ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメインの上記抗体への結合程度と比較される）を確認するステップと、
を少なくとも含む免疫アッセイを行うことを含み、
ここで、ステップ（ｉｉ）において結合が発生され、又は結合程度が強いことは、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がタンパク質又はポリペプチド干渉を発生することができ、或いはタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するリスクが高い又は増加されることを意味し、ステップ（ｉｉ）において結合が発生されず、又は結合程度が弱いことは、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がタンパク質又はポリペプチド干渉を発生せず、或いはタンパク質又はポリペプチド干渉を発生するリスクが低いことを意味し、例えば、上記免疫アッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。
【0090】
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗体はポリクローナル抗体である。幾つかの形態において、上記抗体は、対象から得られ、かつポリクローナル抗体を得る原材料として適用される生体試料から、少なくとも１つの免疫親和性クロマトグラフィーステップと、任意選択的に、上記試料からポリクローナル抗体を単離及び／又は精製するための１つ又は複数の他のステップとを含む方法により取得可能なポリクローナル抗体であり、上記免疫親和性クロマトグラフィーでは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）を親和性構造部分又は抗原として使用し、ここで、上記親和性構造部分又は抗原として使用される上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、そのＣ末端がアミノ酸配列ＶＴＶＳＳで終結される。
【0091】
幾つかの実施形態において、そのＣ末端が配列ＶＴＶＳＳで終結される免疫グロブリン単一可変ドメイン（即ち、本開示における「未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメイン」）、上記ｓｄＡｂを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）が抗薬物抗体アッセイにおいてタンパク質又はポリペプチド干渉を発生する傾向を低減するための方法を提供し、或いは免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記ｓｄＡｂを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）がタンパク質又はポリペプチド干渉を発生する傾向を低減するためのＣ末端修飾の使用であって、その末端に配列ＶＴＶＳＳがある免疫グロブリン単一可変ドメイン（即ち、本開示における「未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメイン」）に比べて、タンパク質又はポリペプチド干渉を発生する傾向が低減されるか又は基本的に低減されるように、上記本開示に提供される方法により免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端を修飾することを含む使用を提供する。
【0092】
幾つかの実施形態において、インビトロ検出方法、システム又は装置は、例えば、
（ｉ）試料を本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と接触させること、
（ｉｉ）任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と試料との間で形成された複合物を検出すること、及び／又は
（ｉｉｉ）参照試料（例えば、対照試料）を任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と接触させること、及び
（ｉｖ）参照試料と比較することにより、複合物形成の程度を確認することであって、対照試料又は対象中と比較して、試料又は対象における複合物に形成された変化（例えば、統計的に有意な変化）が、試料における上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の、試料からの対象のインビボでのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）への結合程度を示すこと、
を含み得る。
（ｉ）試料を本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と接触させること、
（ｉｉ）任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と試料との間で形成された複合物を検出すること、及び／又は
（ｉｉｉ）参照試料（例えば、対照試料）を任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）と接触させること、及び
（ｉｖ）参照試料と比較することにより、複合物形成の程度を確認することであって、対照試料又は対象中と比較して、試料又は対象における複合物に形成された変化（例えば、統計的に有意な変化）が、試料における上記任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）の、試料からの対象のインビボでのｐｒｅ－ＡＤＡ（又はＡＤＡ）への結合程度を示すこと、
を含み得る。
【0093】
検出は、複合物を形成する位置又は時間を確認することを含んでもよい。免疫グロブリン単一可変ドメイン、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）も、検出可能な物質で標識し、上記標識により検出が達成される。好適な検出可能な物質は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質を含む。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学などの通常の検出アッセイを使用することができる。検出の目的のために、本開示に係るｓｄＡｂ、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）は、フルオロフォア発色団で標識することができる。
【0094】
幾つかの実施形態において、試薬キットをさらに提供し、上記試薬キットは、上記結合タンパク質又はポリペプチド、ポリヌクレオチドを含み、さらに診断マニュアルを含んでもよい。試薬キットは、少なくとも１つの付加的な試薬、例えば、マーカーや付加的な診断剤をさらに含んでもよい。インビボでの使用に対して、抗体は、医薬組成物として調製することができる。
【0095】
本開示は、ＷＯ２０１２１７５７４１Ａの検出方法を全体として援用している。
【0096】
用語の定義
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本開示で別途明確に定義しない限り、本開示に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本開示で別途明確に定義しない限り、本開示に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
【0097】
文脈で特に明記のない限り、明細書及び特許請求の範囲の全体において、「含む」、「有する」、「含有する」などの言葉は、排他的又は網羅的な意味ではなく、包括的な意味、即ち、「含むが、これらに限定されない」という意味を持っていると理解すべきである。
【0098】
本開示に使用されるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0099】
「４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド」又は「４－１ＢＢ」は、ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー９とも呼ばれ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞、Ｂ細胞及び好中球などの細胞表面に発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは共刺激分子に属し、免疫細胞が活性化された後に発現される。ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドは、ＮＣＢＩ登録番号がＮＰ＿００１５５２．２である。本開示において、「４－１ＢＢ」は、本開示に記載される既知又は野生型の４－１ＢＢ、及び任意の天然に産生されたスプライス変異体、アミノ酸変異体又はアイソフォームを含む（が、これらに限定されない）ようなタンパク質又はポリペプチド若しくはその断片、変異体の何れかを任意選択的に含んでもよい。
【0100】
「抗体」又は「免疫グロブリン」は、所望の抗原結合活性を示せば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体及び抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むが、これらに限定されない。「抗原結合断片」は、単鎖抗体（即ち、全長重鎖と軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ／ＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価又は三価又は四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ及び上記の何れか１つのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６、Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９－２１７を参照）。
【0101】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、一般的に、他の可変ドメインと相互作用しない場合（例えば、通常の４本鎖モノクローナル抗体のＶＨとＶＬドメインの間に必要なＶＨ／ＶＬ相互作用がない場合）に機能的抗原結合部位を形成することができる免疫グロブリン可変ドメイン（重鎖又は軽鎖ドメインであってもよく、ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＬドメインを含む）を指すために使用される。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」の実例は、ナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ（例えば、ラクダ化ヒトＶＨ）を含む）、ＩｇＮＡＲ、ドメイン、ＶＨドメインとしての又はＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えば、ｄＡｂｓＴＭ）及びＶＬドメインとしての又はＶＬドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えば、ｄＡｂｓＴＭ）を含む。重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＨＨドメイン）に基づく及び／又は由来する免疫グロブリン単一可変ドメインは、一般的に好ましい。免疫グロブリン単一可変ドメインの一具体的な実例としては、以下に定義されるような「ＶＨＨドメイン」（又は、「ＶＨＨ」と略称）である。本開示において、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単ドメイン抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、互換的に使用されてもよい。
【0102】
「ＶＨＨ」は、ナノボディ、ＶＨＨ抗体、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨドメイン、重鎖単一ドメイン抗体とも呼ばれ（単一ドメイン抗体と呼ばれることもある）、重鎖抗体の可変領域を指す（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ Ｃ，Ｓｏｎｇａ ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ Ｒ．：「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ」，Ｎａｔｕｒｅ３６３，４４６－４４８（１９９３））。「ＶＨＨ」は、通常のテトラペプチド鎖抗体における重鎖可変領域（ＶＨ）と区別するために使用される。ＶＨＨは、そのドメイン特異性により、他の抗原結合ドメインを必要とせずに、単独でエピトープに結合することができる。通常のテトラペプチド鎖抗体では、ＶＨドメインとＶＬドメインの両方が共にエピトープを認識するが必要である。ＶＨＨドメインは、単一の免疫グロブリンドメインで形成された小さくて安定的かつ効率的な抗原認識ユニットである。幾つかの実施形態において、４－１ＢＢを例とする、「抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体」、「４－１ＢＢ ＶＨＨ」、「４－１ＢＢ ＶＨＨ抗体」及び「４－１ＢＢナノボディ」は、互換的に使用されてもよい。
【0103】
ＶＨＨは、一般的に、１１０～１２０個、例えば１１２～１１５個のアミノ酸からなる。しかし、より長い及びより短い配列も、本開示に記載の目的に適用されると留意すべきである。ＶＨＨ及びＶＨＨ含有ポリペプチドの他の構造特性と機能特性について、次のようにまとめることができる：ＶＬが存在しないと共にＶＬと相互作用しない場合に、ＶＨＨは抗原と機能的に結合する。通常のテトラペプチド鎖抗体のＶＨ及びＶＬドメイン自体は、単独で抗原結合分子又は免疫グロブリン単一可変ドメインとして実用化することに適しておらず、ＶＨ及びＶＬドメインは、機能的抗原結合ユニットが提供されるように、ある形態によるか又は組み合わせる必要がある（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖの形態による）。ＶＨＨは、単一でかつ比較的小さい機能的抗原結合ユニット、ドメイン又はポリペプチドとして使用することができる。それらのユニークな特性のために、ＶＨＨドメイン（単独で、又は大きなポリペプチドの一部としてもよい）を使用することで、通常のＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又は通常の抗体断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）を使用する場合よりも優れた顕著な利点が多く提供される：
－単一のドメインによって高親和性及び高選択性で抗原に結合するだけでよく、これにより、２つの単独なドメインが存在する必要がなく、当該２つのドメインが適切な空間配座及び配置で存在することを確保する必要もない（例えば、ｓｃＦｖは、一般的に特に設計されたリンカーを使用する必要がある）こと、
－ＶＨＨドメインは、単一の遺伝子によって発現可能であり、かつ翻訳後に折り畳みや修飾を必要としないこと、
－ＶＨＨドメインは、多価及び多特異的フォーマットに容易に改変することができること、
－ＶＨＨドメインは、可溶性が高くて凝集傾向がないこと、
－ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、タンパク質又はポリペプチダーゼ及び他の変性剤又は条件に対して非常に安定的であり、かつそれで、調製、貯蔵又は輸送中に冷凍機器を使用しなくてもよく、コストや時間の節約及び環境保全が達成されること、
－ＶＨＨドメインは、調製されやすくて比較的安価で、さらに生産に必要な規模においても同様であること、
－ＶＨＨドメインは、通常のテトラペプチド鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的小さい（約１５ ｋＤａ又はサイズが通常のＩｇＧの１／１０である）ので、高い組織浸透性を示すと共に、高用量で投与することができること、及び
－ＶＨＨドメインは、いわゆるキャビティ（ｃａｖｉｔｙ）結合特性を示すことができること（通常のＶＨドメインに比べて、ＶＨＨは、延長したＣＤＲ３ループを有するので、通常のテトラペプチド鎖構造抗体及びその抗原結合断片が到達できない標的エピトープに到達することができる）。
－単一のドメインによって高親和性及び高選択性で抗原に結合するだけでよく、これにより、２つの単独なドメインが存在する必要がなく、当該２つのドメインが適切な空間配座及び配置で存在することを確保する必要もない（例えば、ｓｃＦｖは、一般的に特に設計されたリンカーを使用する必要がある）こと、
－ＶＨＨドメインは、単一の遺伝子によって発現可能であり、かつ翻訳後に折り畳みや修飾を必要としないこと、
－ＶＨＨドメインは、多価及び多特異的フォーマットに容易に改変することができること、
－ＶＨＨドメインは、可溶性が高くて凝集傾向がないこと、
－ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、タンパク質又はポリペプチダーゼ及び他の変性剤又は条件に対して非常に安定的であり、かつそれで、調製、貯蔵又は輸送中に冷凍機器を使用しなくてもよく、コストや時間の節約及び環境保全が達成されること、
－ＶＨＨドメインは、調製されやすくて比較的安価で、さらに生産に必要な規模においても同様であること、
－ＶＨＨドメインは、通常のテトラペプチド鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的小さい（約１５ ｋＤａ又はサイズが通常のＩｇＧの１／１０である）ので、高い組織浸透性を示すと共に、高用量で投与することができること、及び
－ＶＨＨドメインは、いわゆるキャビティ（ｃａｖｉｔｙ）結合特性を示すことができること（通常のＶＨドメインに比べて、ＶＨＨは、延長したＣＤＲ３ループを有するので、通常のテトラペプチド鎖構造抗体及びその抗原結合断片が到達できない標的エピトープに到達することができる）。
【0104】
標的抗原又はエピトープに結合するＶＨＨを得る方法は、この前、既にＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０（２０００）１８５－１９５、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（２０１２）１３７１３－１３７２１、Ｄｅｆｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８（１２），ｐｐ．２６４５－２６５２，１７ Ｊｕｎｅ，２００９及びＷＯ９４／０４６７８という文献に開示された。
【0105】
ヒトの通常のテトラペプチド鎖抗体のＶＨドメインにおける対応する位置における１つ又は複数のアミノ酸残基で元のＶＨＨ（例えば、ラクダ科由来のＶＨＨ）のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を置換することにより、ＶＨＨドメインを「ヒト化」することができる（本開示では「配列最適化」とも呼ばれ、「配列最適化」は、ヒト化の他に、潜在的な翻訳後修飾部位の除去など、改良した特性をＶＨＨに付与する他の修飾をカバーしてもよい）。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ又は複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含んでもよく、かつ一具体的な実施形態において、ＩＧＨＶ３のヒトフレームワーク領域配列を含んでもよい。ヒト化の方法としては、例えば、リサーフェシング法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、ＣＤＲユニバーサルフレームワークグラフト法（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｔｏ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）、フレームワークシャッフリング法（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）などである。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のホームページから取得可能である。
【0106】
（タンパク質又はポリペプチドの）「ドメイン」は、折り畳まれたタンパク質又はポリペプチド構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質又はポリペプチドの単一の機能を担う。多くの場合には、タンパク質又はポリペプチドの他の部分及び／又はドメインの機能を失うことなく、付加され、除去され、又は他のタンパク質に移転されてもよい。本開示における幾つかの実施形態において、「ドメイン」は、抗体と抗原の結合部位として使用されてもよい。
【0107】
「可変ドメイン」は、基本的にこの分野及び下記でそれぞれ「フレームワーク領域１」（ＦＲ１）、「フレームワーク領域２」（ＦＲ２）、「フレームワーク領域３」（ＦＲ３）、及び「フレームワーク領域４」（ＦＲ４）という４つの「フレームワーク領域」からなるドメインを指し、ここで、上記フレームワーク領域は、この分野及び下記でそれぞれ「相補性決定領域１」（ＣＤＲ１）、「相補性決定領域２」（ＣＤＲ２）、及び「相補性決定領域３」（ＣＤＲ３）という３つの「相補性決定領域」で離間される。従って、可変ドメインの一般的な構造（又は配列）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４と示されてもよい。可変ドメインは、抗原結合部位を有するため、抗原に対する特異性が付与される。
【0108】
「フレームワーク領域（ＦＲ）」又は「フレームワーク」は、ＣＤＲのステントとして使用される可変ドメインにおける一部を指す。
【0109】
例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１，２５－３８（１９９９）の図２に示すように、ＶＨＨドメインに使用されるアミノ酸残基は、ＫａｂａｔらによるＶＨドメインの一般的な番号付け方法に従って番号付けされる（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、公開案第９１号）。ところが、この分野でＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて公知されているように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は、異なる可能性があり、かつＫａｂａｔ番号で示されるアミノ酸残基の総数に対応しない可能性がある（即ち、Ｋａｂａｔ番号に基づく１つ又は複数の位置は、実際の配列において占められていない可能性があり、又は実際の配列はＫａｂａｔ番号の許容する数よりも多いアミノ酸残基を含む可能性がある）と留意すべきである。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに基づく番号は、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号に対応するか又は対応しない可能性があることを意味する。
【0110】
当業者は、多くの既知の番号付け案の何れか１つによって抗体ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができ、既知の番号付け案は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記参照（「Ｋａｂａｔ」番号付け案）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け案）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付け案）、Ｌｅｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付け案）及びＨｏｎｅｇｇｅ＆Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０（「ＡＨｏ」番号付け案）という文献に記載された番号付け案を含み、それらは、それぞれ援用により全体として組み込まれている。この分野ではＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けする代替的な方法が知られており、上記代替的な方法は同様にＶＨＨドメインにも使用可能である。しかしながら、特に明記のない限り、本開示の明細書、特許請求の範囲及び図面においては、上記のようなＫａｂａｔによるＶＨＨドメインに適した番号に従う。
【0111】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持すると共に、ヒトにおいて低い免疫原性を有する抗体である。例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持すると共に、そのヒト対応物（即ち、定常領域及び可変領域のフレームワーク領域部分）で抗体の残りの部分を置き換えることにより達成してもよい。
【0112】
「親和性成熟」の抗体、特にＶＨＨ又はドメイン抗体は、１つ又は複数のＣＤＲにおいて１つ又は複数の変化を有し、上記変化により、標的抗原への親和性がその親抗体に比べて増加される。親和性成熟の抗体は、この分野で既知の方法によって調製することができる。
【0113】
「Ｆｃ領域」又は「断片結晶化可能領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するためであり、天然Ｆｃ領域及び改変されたＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、同一又は異なる２つのサブユニットを含む。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位置におけるアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシ末端へ延びると定義される。本明細書に記載の抗体に用いられる好適なＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域の境界は変化してもよく、例えば、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）の欠失、又はＦｃ領域のＣ末端グリシンとリジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４６と４４７）の欠失である。特に説明のない限り、Ｆｃ領域の番号付け規則はＥＵ番号付けシステムであり、ＥＵインデックスとも呼ばれる。
【0114】
「未修飾の免疫グロブリン単一可変ドメイン」、例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、フレームワーク構造における３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。天然に存在する免疫グロブリン鎖の遺伝学において、Ｖ領域がＣＤＲ３の始まりで終結され、かつＣＤＲ３の残部がＤ及びＪ領域によって提供される（Ｖ－Ｄ－Ｊ融合物をもたらす）ことに鑑みて、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＣＤＲ３の全てを含むと共に、そのＣ末端がＦＲ４残基で終結される。ＶＨ ｓｄＡｂは、そのＣ末端が残基ＬＶＴＶＳＳで終結される。ＶＨＨ ｓｄＡｂは、そのＣ末端が残基ＶＴＶＳＳで終結される。ＶＬ ｓｄＡｂは、そのＣ末端がＶＥＩＫＲで終結される。「修飾された免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、本開示に記載されたような免疫グロブリン単一可変ドメインであり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端の３次元配座を改変する修飾をさらに有する。修飾された免疫グロブリン単一可変ドメインは、本開示のようなＣ末端付加、伸長又はタグ及び／又はあるアミノ酸置換を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
【0115】
「予備の抗薬物抗体」又は「ｐｒｅ－ＡＤＡ」は、薬剤（例えば、タンパク質又はポリペプチド系薬剤、さらに例えば、抗体薬）が施用又は投与される対象又は個体に既に存在しているＡＤＡである。予備の抗薬物抗体は、初めて実験に使用される対象又は個体（即ち、この前に薬剤が投与されたことのない対象又は個体）にあり得る。
【0116】
「抗原」とは、抗原を認識する抗体が産生され、又は発現ライブラリー（例えば、特にファージ、酵母又はリボソームディスプレイライブラリー）がスクリーニングされるように、免疫適格性脊椎動物を免疫化するための分子である。本開示において、抗原はより広義に定義されており、抗体により特異的に認識される標的分子を含み、かつ抗体を産生するための免疫化プロセス又は抗体を選択するためのライブラリースクリーニングに使用される分子の一部又は模倣体を含む。
【0117】
「エピトープ」又は互換的に使用可能な「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原における任意の抗原決定基を指す。抗原決定基は、一般的に、例えばアミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面基を含み、かつ、一般的に、特定の３次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有する。エピトープは、「線状」エピトープ又は「配座」エピトープであってもよい。線状エピトープにおいて、抗原と相互作用分子（例えば、抗体）との間の相互作用部位の全ては、抗原の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。配座エピトープにおいて、相互作用部位は、互いに分離したアミノ酸残基に跨って存在する。
【0118】
「特異性」は、標的抗原結合分子又は抗原結合分子の結合可能な異なるタイプの抗原又はエピトープの数を指す。その特異性は、抗原結合分子の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）及び／又は親和力（ａｖｉｄｉｔｙ）に基づいて確認することができる。抗原と抗原結合分子との解離平衡定数（ＫＤ）で示される親和性は、エピトープと抗原結合分子上の抗原結合部位との結合強度の目安であり、ＫＤ値が小さいほど、エピトープと抗原結合分子との結合強度が強くなる（又は、親和性は、１／ＫＤである会合定数（ＫＡ）で示されてもよい）。当業者に知られるように、具体的な関心抗原によっては、既知の方法で親和性を測定することができる。親和力は、抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はそれを含むポリペプチド）と関連抗原との結合強度の目安である。親和力は、その抗原結合分子上の抗原結合部位との親和性、及び抗原結合分子に存在する関連結合部位の数に関係している。
【0119】
「結合親和性」又は「親和性」は、本開示において、２つの分子（例えば、抗体又はその一部と抗原）間の非共有相互作用の強度の目安として使用される。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（ＫＤ）を決定することにより定量化することができる。例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して複合物の形成及び解離の動態を測定することでＫＤを決定することができる。一価複合物の結合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ結合速度定数ｋａ（又はｋｏｎ）及び解離速度定数ｋｄ（又はｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａという方程式によりｋａ及びｋｄに関連する。解離定数の値は、周知の方法により直接決定することができ、かつ、例えばＣａｃｅｃｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４，Ｂｙｔｅ ９：３４０－３６２）に記載されたような方法により、複雑な混合物に対しても算出することができる。例えば、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５４２８－５４３２）に開示されたような二重ろ過ニトロセルロースフィルター結合アッセイにより、ＫＤを決定することができる。標的抗原に対する抗体の結合能を評価する他の標準的なアッセイは、この分野で既知のものであり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡとフローサイトメトリー分析、及び本開示の他所で例示された他のアッセイを含む。抗体の結合動態と結合親和性は、この分野で知られている標準的なアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、例えばＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム又はＫｉｎＥｘＡにより評価されてもよい。各抗体／抗原複合物のＫＤ値を比較することにより、異なる分子との相互作用に関連する結合親和性を比較し、例えば、異なる抗体による所定の抗原への結合親和性を比較することができる。同様に、相互作用の特異性は、目的相互作用（例えば、抗体と抗原の間の特異的相互作用）のＫＤ値と非目的相互作用（例えば、標的抗原に結合しない既知の対照抗体）のＫＤ値を決定して比較することで評価することができる。
【0120】
「相同性」、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性である。２つの比較される配列における位置が何れも同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンに占められる場合、上記分子は当該位置で相同である。２つの配列間の相同性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００をかける関数である。例えば、配列の最適アラインメントを行う際に、２つの配列中の１０個の位置のうち、６個がマッチングしており、又は相同である場合は、２つの配列が６０％相同であり、２つの配列中の１００個の位置のうち、９５個がマッチングしており、又は相同である場合は、２つの配列が９５％相同である。
【0121】
「変異体」は、本開示に係るヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に適当な置換、挿入や欠失などの変異修飾を行った場合に得られた、本開示に係るヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に対して異なる百分率の配列同一性レベルを有するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を指す。上記配列同一性は、少なくとも８５％、９０％又は９５％であってもよく、非限定的な実施例として、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％を含む。２つの配列間の配列比較及び同一性の百分率測定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのホームページから取得可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定により行うことができる。
【0122】
「保存的置換」は、元のアミノ酸残基と類似の特性を有する別のアミノ酸残基に置換されることを指す。それは、ポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性に影響が少ないか又は実質的にない。上記保存的アミノ酸置換は、この分野で公知のものであり、例えば、保存的アミノ酸置換は、下記の群（ｉ）～（ｖ）における１つのアミノ酸が同一の群における別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい：
（ｉ）小さい脂肪族非極性又は弱極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、
（ｉｉ）極性負電荷残基及びその（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、
（ｉｉｉ）極性正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、
（ｉｖ）大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに
（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
（ｉ）小さい脂肪族非極性又は弱極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、
（ｉｉ）極性負電荷残基及びその（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、
（ｉｉｉ）極性正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、
（ｉｖ）大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに
（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【0123】
特に好ましくは、保存的アミノ酸置換は、ＡｌａがＧｌｙ又はＳｅｒで置換され、ＡｒｇがＬｙｓで置換され、ＡｓｎがＧｌｎ又はＨｉｓで置換され、ＡｓｐがＧｌｕで置換され、ＣｙｓがＳｅｒで置換され、ＧｌｎがＡｓｎで置換され、ＧｌｕがＡｓｐで置換され、ＧｌｙがＡｌａ又はＰｒｏで置換され、ＨｉｓがＡｓｎ又はＧｌｎで置換され、ＩｌｅがＬｅｕ又はＶａｌで置換され、ＬｅｕがＩｌｅ又はＶａｌで置換され、ＬｙｓがＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕで置換され、ＭｅｔがＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅで置換され、ＰｈｅがＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒで置換され、ＳｅｒがＴｈｒで置換され、ＴｈｒがＳｅｒで置換され、ＴｒｐがＴｙｒで置換され、ＴｙｒがＴｒｐ又はＰｈｅで置換され、ＶａｌがＩｌｅ又はＬｅｕで置換されることである。
【0124】
「復帰変異」とは、ヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸残基を、元の抗体の対応する位置におけるアミノ酸残基に変異させることを意味し、一般的に、ヒト化抗体による免疫原性の低下と共に引き起こされる活性の低減を回避するために、上記ヒト化抗体の可変領域に対して最も少ない逆変異を行うことで、抗体の活性を維持することができる。本開示において、「復帰変異」は、ＣＤＲにおける変異も含む。
【0125】
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」は、ＤＮＡ及びＲＮＡをカバーしており、単鎖又は二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。核酸が別の核酸配列と共に機能的関係に置かれる場合、核酸は「効果的に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、上記コード配列に効果的に連結されている。
【0126】
「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のＤＮＡセグメントをそれに連結可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。本開示におけるベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。
【0127】
「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に使用されてもよく、かつそのような名称は何れも子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、移転数を考慮せずに、初代被験細胞及びそれより誘導された培養物を含む。また、意図するかしないかの変異のために、あらゆる子孫は、ＤＮＡ含有量において精確に同じであり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞からスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる名称を指す場合は、文脈から明らかになる。
【0128】
「宿主細胞」は、その中に発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、微生物（例えば、細菌）、植物又は動物細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。好適な微生物は、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。好適な動物宿主細胞株は、ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞株）、ＮＳ０細胞、２９３細胞を含む。
【0129】
「医薬組成物」は、１種又は複数種の本開示に記載される化合物又はその生理学的／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと、生理学的／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤などの他の化学成分とを含む混合物を示す。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮するためのものである。
【0130】
「薬学的に許容されるベクター」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わせる場合に、当該成分が生物学的活性を保つことを許容すると共に、対象の免疫系と反応しない任意の材料を含む。例としては、任意の標準的な薬剤ベクター、例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び種々の湿潤剤などを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施例において、エアロゾル又は非経口投与に用いられる希釈剤は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は生理（０．９％）食塩水である。このようなベクターを含む組成物は、周知の通常方法により調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、及びＲ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照）。
【0131】
「与える」、「投与」及び「処理」は、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器や生物流体に使用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器や生物流体との接触を意味する。「与える」、「投与」及び「処理」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究及び実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、ここで、上記流体は細胞と接触する。「与える」、「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に使用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究及び診断的使用を意味する。
【0132】
「有効量」は、医学的病状の症状又は病状を改善又は予防するために十分な量を含む。有効量は、さらに、診断の許容又は促進に十分な量を指す。対象に使用される有効量は、治療される病状、対象の全体的健康状態、投与の方法経路と用量、及び副作用の重症度といった要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用が回避される最大用量又は投与計画であってもよい。本開示の対象は、動物又はヒト対象であってもよい。
【0133】
「対象」、「患者」は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトを意味する。
【0134】
「治療」とは、対象に経口又は外用治療剤、例えば、本開示に係る何れか１つの抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、或いは抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子を投与することを意味し、上記患者は１つ又は複数の疾患症状を有し、そして上記治療剤がそれらの症状に治療作用を有することが知られている。通常、治療される患者又は集団には、１つ又は複数の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を阻害する。何れかの具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」ともいう）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者において必要な治療効果を発生させる能力など、種々の要因により変化することができる。当該症状の重症度又は進行状況の評価に医者又は他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が軽減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、それぞれの目標疾患症状の緩和において無効な可能性があるが、この分野で知られている任意の統計学的検定方法、例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、ＭａｎｎとＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において目標疾患症状を軽減するはずであることが確認された。
【0135】
「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質又はポリペプチド配列」などにおいて）は、本開示においてさらに限定的に解釈する必要がない限り、一般的に、関連するアミノ酸配列を含むだけでなく、上記配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列も含むと理解すべきである。
【0136】
「任意選択的」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、必ずしも生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。
【図面の簡単な説明】
【0137】
【図1】健常な個体の血清にｐｒｅ－ＡＤＡを有する頻度検出結果である。
【図2】ｓｄＡｂのｐｒｅ－ＡＤＡへの結合に対する異なるアミノ酸修飾方法の影響検出結果である。
【図3】健常な個体の血清にアミノ酸修飾されたｓｄＡｂに対するｐｒｅ－ＡＤＡを有する頻度検出結果である。
【図4】測定待ちの抗体のヒト４－１ＢＢ抗原へのＦＡＣＳ結合試験結果である。
【図6】抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体Ｃ５及びそのヒト化した抗体Ｃ５＿Ｖ１、Ｃ５＿Ｖ２、Ｃ５＿Ｖ３のＨＥＫ２９３細胞表面ヒト４－１ＢＢに結合するＦＡＣＳ検出結果であり、Ｕｒｅｌｕｍａｂが対照として使用されている。
【図7】抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体Ｃ５及びそのヒト化した抗体Ｃ５＿Ｖ１、Ｃ５＿Ｖ２、Ｃ５＿Ｖ３のＮＦ－κＢシグナル伝達経路への活性化作用の検出結果であり、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、アイソタイプＩｇＧ１抗体が対照として使用されている。
【図8】Ｃ５＿Ｖ２及びＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩのＨＥＫ２９３細胞表面ヒト４－１ＢＢへの結合のＦＡＣＳ検出結果であり、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、アイソタイプＩｇＧ１抗体が対照として使用されている。
【図9】異なるＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩアミノ酸修飾変異体のｐｒｅ－ＡＤＡへの結合の検出結果である。
【図10】健常な個体の血清にＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩアミノ酸修飾変異体に対するｐｒｅ－ＡＤＡを有する頻度の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【0138】
以下、実施例に合わせて本開示をさらに説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限するものではない。
【0139】
本開示の実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹが参照される。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
【0140】
実施例１．単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に対するｐｒｅ－ＡＤＡの検出
本開示は、単一ドメイン抗体に対してｐｒｅ－ＡＤＡの測定を行い、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）の方法を採用し、ＥＬＩＳＡは、抗体ｐｒｅ－ＡＤＡの効果を測定するためによく使用される検出方法である。本実験に用いられた血清は、健常人の１人分の血清（上海信帆生物科技有限公司）であり、二次抗体は抗ヒト抗体λ鎖のＨＲＰ標識抗体である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０７０－０５）。
本開示は、単一ドメイン抗体に対してｐｒｅ－ＡＤＡの測定を行い、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）の方法を採用し、ＥＬＩＳＡは、抗体ｐｒｅ－ＡＤＡの効果を測定するためによく使用される検出方法である。本実験に用いられた血清は、健常人の１人分の血清（上海信帆生物科技有限公司）であり、二次抗体は抗ヒト抗体λ鎖のＨＲＰ標識抗体である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０７０－０５）。
【0141】
先の研究によれば、ＧＳＫ特許ＷＯ２０１３０２４０５９Ａ中のｓｄＡｂ（配列１及び配列１６）に由来するＰ２－１、Ｐ２－２の抗体配列が合成されたが、そのうち、Ｐ２－１はＷＯ２０１３０２４０５９Ａにおける配列１のＮ末端融合Ｈｉｓ６タグであり、Ｐ２－２はＷＯ２０１３０２４０５９Ａにおける配列１６のＮ末端融合Ｈｉｓ６タグである。Ｐ２－１、Ｐ２－２は、本開示において対応する配列番号が配列番号１及び配列番号２である。また、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと同じアミノ酸配列を有するＩｇＧ１分子が合成されたが、上記ＩｇＧ１分子は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３及び配列番号４で示される。
【0142】
上記ＥＬＩＳＡアッセイは、以下の通りである：
１）抗原の被覆：ＰＢＳによりＰ２－１とＰ２－２を含む測定待ちの抗体試料をそれぞれ２ｎｇ／μＬの有効最終濃度に希釈し、９６ウェルプレートに加え、５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートし、
２）ブロッキング：上清を捨て、ＰＢＳＴで１回洗浄し、４％のＭ－ＰＢＳＴブロッキング液を加え、１５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートし、
３）血清によるインキュベート：ＰＢＳＴで１回洗浄し、３０μＬ／ウェルの１人分の血清（ＰＢＳにより１：５の比率で希釈）を加え、室温で１ｈインキュベートし、
４）洗浄：上清を捨て、ＰＢＳＴで８回洗浄し、
５）二次抗体インキュベート：希釈した二次抗体（４％のＭ－ＰＢＳＴで希釈し、希釈比率は対応する明細書を参照）を加え、５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートした。
６）洗浄：上清を捨て、ＰＢＳＴで８回洗浄し、
７）発色：５０μＬの基質ＡＢＴＳを加え、暗所で２０ｍｉｎ程度インキュベートし、その後ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によりＯＤ４１５を検出した。
１）抗原の被覆：ＰＢＳによりＰ２－１とＰ２－２を含む測定待ちの抗体試料をそれぞれ２ｎｇ／μＬの有効最終濃度に希釈し、９６ウェルプレートに加え、５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートし、
２）ブロッキング：上清を捨て、ＰＢＳＴで１回洗浄し、４％のＭ－ＰＢＳＴブロッキング液を加え、１５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートし、
３）血清によるインキュベート：ＰＢＳＴで１回洗浄し、３０μＬ／ウェルの１人分の血清（ＰＢＳにより１：５の比率で希釈）を加え、室温で１ｈインキュベートし、
４）洗浄：上清を捨て、ＰＢＳＴで８回洗浄し、
５）二次抗体インキュベート：希釈した二次抗体（４％のＭ－ＰＢＳＴで希釈し、希釈比率は対応する明細書を参照）を加え、５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートした。
６）洗浄：上清を捨て、ＰＢＳＴで８回洗浄し、
７）発色：５０μＬの基質ＡＢＴＳを加え、暗所で２０ｍｉｎ程度インキュベートし、その後ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によりＯＤ４１５を検出した。
【0143】
今回の実験では、合計４０人の健常ドナーの血清試料の各抗体試料に対するバックグラウンド反応性を検出し、陰性対照ＰＢＳ群、Ｐ２－１群、Ｐ２－２群、ＩｇＧ１群に分け、結果を図１に示している。その結果、陰性対照ＰＢＳ群に比べて、Ｐ２－１群は、血清試料の約５７．５％が検出可能なｓｄＡｂ反応性ｐｒｅ－ＡＤＡを有するが、免疫原性が低減されるように改変されたＰ２－２群は、血清試料の約１２．５％が検出可能なｓｄＡｂ反応性ｐｒｅ－ＡＤＡを有することが示され、それは、ＧＳＫ文献に報告されたデータと基本的に一致している。本開示のｐｒｅ－ＡＤＡ陽性は、測定待ちの試料群のＩｇＧ１群に対応する一点シグナルの差異が＋５０％以上である試料が陽性試料と見なされることを意味し、その逆は陰性試料であり、以下同様である。
【0144】
＞Ｐ２－１（配列番号１）
＞Ｐ２－２（配列番号２）
＞ＩｇＧ１分子の重鎖（配列番号３）
＞ＩｇＧ１分子の軽鎖（配列番号４）
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【0145】
実施例２．単一ドメイン抗体のＶＨフレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸改変
ｐｒｅ－ＡＤＡの単一ドメイン抗体フレームワークへの結合が低減できるか否かを研究するために、単一ドメイン抗体Ｐ２－４２を親クローンとして選択し、部位特異的変異導入技術によりＰ２－４２のフレームワーク領域に対してアミノ酸修飾（付加、置換、欠失を含む）を行い、各修飾変異体を得て、構造が表１を参照する。表１及び表２中のクローンの親クローンは、何れもＰ２－４２である。
ｐｒｅ－ＡＤＡの単一ドメイン抗体フレームワークへの結合が低減できるか否かを研究するために、単一ドメイン抗体Ｐ２－４２を親クローンとして選択し、部位特異的変異導入技術によりＰ２－４２のフレームワーク領域に対してアミノ酸修飾（付加、置換、欠失を含む）を行い、各修飾変異体を得て、構造が表１を参照する。表１及び表２中のクローンの親クローンは、何れもＰ２－４２である。
【0146】
上記Ｐ２－４２は、Ｃ末端がＶＴＶＳＳで終結されたＶＨＨ抗体であり、クローンＰ２－４３～Ｐ２－５８は、Ｐ２－４２のみに対するＣ末端修飾の変異体であり、表１で行われたＣ末端修飾（付加、置換を含む）のアミノ酸残基以外、他の配列が変更されなかった。上記位置は、何れもヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に基づいて番号付けされた。
【0147】
実施例１中のＥＬＩＳＡ方法により上記修飾変異体を測定・検証し、使用された血清は、実施例１中の検出が行われてかつ結果としてｐｒｅ－ＡＤＡ陽性を示した８つの１人分の血清試料であり、結果は図２と表１を参照する。表１の結果により、親クローンに対する各修飾変異体の平均シグナル低減百分率（％）及び陽性個体数が示されている。平均シグナルの低減（％）が大きいほど、当該修飾変異体は、ｐｒｅ－ＡＤＡへの結合能が低くなり、ヒト体内における予備のｐｒｅ－ＡＤＡにより中和される可能性も低くなることを意味する。
【0148】
本開示の平均シグナル低減％の算出式は、以下の通りである：
平均シグナル低減％＝（対応する試料群の算術平均シグナル値ーＰ２－４２群の算術平均シグナル値）／Ｐ２－４２群の算術平均シグナル値×１００％
その結果、Ｐ２－５３、Ｐ２－５４、Ｐ２－５５、Ｐ２－５６、Ｐ２－５７及びＰ２－５８という６つの分子のｐｒｅ－ＡＤＡ結合シグナルは、明らかに低減された。
平均シグナル低減％＝（対応する試料群の算術平均シグナル値ーＰ２－４２群の算術平均シグナル値）／Ｐ２－４２群の算術平均シグナル値×１００％
その結果、Ｐ２－５３、Ｐ２－５４、Ｐ２－５５、Ｐ２－５６、Ｐ２－５７及びＰ２－５８という６つの分子のｐｒｅ－ＡＤＡ結合シグナルは、明らかに低減された。
【0149】
【表1】
【0150】
ここで、ＶＴＶＳＳ、ＶＴＶＳＳＡ、ＶＴＶＳＦ、ＶＴＶＳＧ、ＶＴＶＳＬ、ＶＴＶＳＲ、ＶＴＶＳＴ、ＶＴＶＳＶは、それぞれ、配列番号１８９～１９６で示される。
【0151】
実施例３．単一ドメイン抗体の修飾変異体に対するｐｒｅ－ＡＤＡの検出
Ｐ２－５３、Ｐ２－５４、Ｐ２－５５、Ｐ２－５６、Ｐ２－５７及びＰ２－５８という６つの分子について、本実施例は、さらに４０個の健常ドナーの血清試料における各修飾変異体に対するｐｒｅ－ＡＤＡの頻度を検出することで、変異の効果を検証し、使用された血清は健常人の１人分の血清である（実施例１中の４０個の試料と同様）。
Ｐ２－５３、Ｐ２－５４、Ｐ２－５５、Ｐ２－５６、Ｐ２－５７及びＰ２－５８という６つの分子について、本実施例は、さらに４０個の健常ドナーの血清試料における各修飾変異体に対するｐｒｅ－ＡＤＡの頻度を検出することで、変異の効果を検証し、使用された血清は健常人の１人分の血清である（実施例１中の４０個の試料と同様）。
【0152】
実施例１中のＥＬＩＳＡ方法により上記修飾変異体を測定・検証し、図３は各変異体のシグナル阻害レベルを示し、表２は各変異体の平均シグナル阻害（％）及びｐｒｅ－ＡＤＡ陽性の頻度を示す。
【0153】
その結果、何れのクローンも平均シグナル低減が４０％近く又はそれを超えたので、何れの修飾も単一ドメイン抗体のｐｒｅ－ＡＤＡへの結合を明らかに低減することができる。
【0154】
【表2】
【0155】
実施例４．抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のスクリーニング及び準備
本開示に使用されたタンパク質又はポリペプチドは、ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（Ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｈ５２２７）、ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（ビオチン／Ｈｉｓタグ）（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｖｉｔａｇ（商標）、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｈ８２Ｅ３）、及びサル４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｃ５２Ｈ４）であり、アミノ酸配列は、始まりも終わりもＬｅｕ２４－Ｇｌｎ１８６である。
本開示に使用されたタンパク質又はポリペプチドは、ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（Ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｈ５２２７）、ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（ビオチン／Ｈｉｓタグ）（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｖｉｔａｇ（商標）、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｈ８２Ｅ３）、及びサル４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ／Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ Ｔａｇ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号４１Ｂ－Ｃ５２Ｈ４）であり、アミノ酸配列は、始まりも終わりもＬｅｕ２４－Ｇｌｎ１８６である。
【0156】
１．アルパカ免疫、力価検出及びファージライブラリーの親和性パニング
Ｈｉｓタグ付きのヒト４－１ＢＢ組換えタンパク質又はポリペプチド（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ－Ｈ５２２７）でアルパカを免疫し、２週間に１回、合計４回免疫した。初回免疫時に、０．５ｍｇの抗原原と１ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を均一に混合して皮下注射し、後の３回の免疫では、０．２５ｍｇの抗原と１ｍＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を均一に混合して皮下注射した。免疫前にブランク血清を採取し、３回目の免疫後の１週間と４回目の免疫後の１週間にそれぞれ末梢血５０ｍＬを採取し、ＰＢＭＣを単離し、全ＲＮＡを抽出し、純度を検出し、ＤＮＡに逆転写し、２ラウンドのネステッドＰＣＲ後に、ナノボディの標的断片をファージディスプレイベクターに連結した。エレクトロポレーションして、ファージライブラリーを得た。
Ｈｉｓタグ付きのヒト４－１ＢＢ組換えタンパク質又はポリペプチド（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ－Ｈ５２２７）でアルパカを免疫し、２週間に１回、合計４回免疫した。初回免疫時に、０．５ｍｇの抗原原と１ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を均一に混合して皮下注射し、後の３回の免疫では、０．２５ｍｇの抗原と１ｍＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を均一に混合して皮下注射した。免疫前にブランク血清を採取し、３回目の免疫後の１週間と４回目の免疫後の１週間にそれぞれ末梢血５０ｍＬを採取し、ＰＢＭＣを単離し、全ＲＮＡを抽出し、純度を検出し、ＤＮＡに逆転写し、２ラウンドのネステッドＰＣＲ後に、ナノボディの標的断片をファージディスプレイベクターに連結した。エレクトロポレーションして、ファージライブラリーを得た。
【0157】
＞ヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチド配列（配列番号５）
【化5】
【0158】
ヒトとサルを同時に認識する抗４－１ＢＢナノボディを得るために、２ラウンドのヒト、サル抗原のクロススクリーニングの戦略を用いた。第１及び第２ラウンドのスクリーニングの抗原は、それぞれ、ヒト４－１ＢＢとサル４－１ＢＢ、又はサル４－１ＢＢとヒト４－１ＢＢを使用した。各ラウンドのスクリーニングは、何れもＧｌｙ－ＨＣｌ酸溶離方法を使用し、４－１ＢＢに特異的に結合するファージを溶離した。第１及び第２ラウンドの力価測定プレートから、それぞれ９６個のクローン（合計１９２個のクローン）をランダムに選択し、ファージＥＬＩＳＡを用いて陽性クローンをスクリーニングし、４５０ ｎｍでの光学密度を検出した。陽性クローンをシークエンシングした。シークエンシングの結果に基づき、配列アラインメント及び系統樹解析を行い、Ｈ２７、Ｈ１７０、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ１４５などを含む１４本のユニークな配列をスクリーニングし、そのうち、Ｃ５の配列は以下の通りであり、Ｈ２７、Ｈ１７０、Ｃ３、Ｃ１４５などの配列は示されていない。
【0159】
＞Ｃ５（配列番号６）
【化6】
【表3】
【0160】
２．ＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質又はポリペプチドの発現・精製
Ｃ５の配列をＣ２２０Ａ、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異（Ｅｕシステムによって番号付けされた）付きのヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（配列番号１０で、下線部が変異である）に連結した。連結されたＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質又はポリペプチドの配列は、以下の通りである。また、ヒトＩｇＧ１のＦｃにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ａ（Ｅｕ番号付けシステムによる）などの変異を導入することにより、抗体ＦｃγＲ媒介性のエフェクター機能（例えば、配列番号１０で示される）を完全に除去し、ヒトＩｇＧ４のＦｃにＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号付けシステムによる）を導入することにより、抗体分子を安定化して半分子の形成（例えば、配列番号１１で示される）を阻止し、それらは何れも選択可能なＩｇＧ Ｆｃである。配列番号１０～１２において、下線部はＦｃ変異である。
Ｃ５の配列をＣ２２０Ａ、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異（Ｅｕシステムによって番号付けされた）付きのヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（配列番号１０で、下線部が変異である）に連結した。連結されたＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質又はポリペプチドの配列は、以下の通りである。また、ヒトＩｇＧ１のＦｃにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ａ（Ｅｕ番号付けシステムによる）などの変異を導入することにより、抗体ＦｃγＲ媒介性のエフェクター機能（例えば、配列番号１０で示される）を完全に除去し、ヒトＩｇＧ４のＦｃにＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号付けシステムによる）を導入することにより、抗体分子を安定化して半分子の形成（例えば、配列番号１１で示される）を阻止し、それらは何れも選択可能なＩｇＧ Ｆｃである。配列番号１０～１２において、下線部はＦｃ変異である。
【0161】
＞ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ２２０Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ変異を含む）（配列番号１０）
（配列番号１０）
＞ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ２２０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ変異を含む）（配列番号１１）
＞ヒトＩｇＧ４－Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ変異を含む）（配列番号１２）
＞ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１３）
配列番号１４で示される、Ｃ５が配列番号１０に連結された抗体配列を例として挙げる。
＞Ｃ５－Ｆｃ（配列番号１４）
プラスミドを構築し、細胞に一過性トランスフェクションし、抗体を発現して精製した。検出により、標的抗体を得た。
【化7】
＞ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ２２０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ変異を含む）（配列番号１１）
【化8】
【化9】
【化10】
＞Ｃ５－Ｆｃ（配列番号１４）
【化11】
【0162】
実施例５．抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体の抗原結合活性及びそのアゴニスト活性の検出
１、４－１ＢＢ抗原への結合能の検出
フローサイトメーターにより、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドへの結合活性を検出した。
１、４－１ＢＢ抗原への結合能の検出
フローサイトメーターにより、抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドへの結合活性を検出した。
【0163】
ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）にヒト４－１ＢＢタンパク質又はポリペプチドを発現する遺伝子（ＣＤ１３７ ｃＤＮＡ ＯＲＦ Ｃｌｏｎｅ、Ｈｕｍａｎ、Ｃ－ＯＦＰＳｐａｒｋ ｔａｇ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、Ｃａｔ＃ＨＧ１００４１－ＡＣＲ）を一過性トランスフェクションすることにより得られ、細胞培地は、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１１９９５０６５）である。実験培地は、２％のウシ胎児血清を含む滅菌ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４０）である。実験培地でＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞を２回洗浄し、１×１０５個／ウェルでＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞を９６ウェルＵ底プレートに接種し、異なる濃度の測定待ちの抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体ＶＨＨ－Ｆｃ試料を加え、細胞を４℃で１ｈインキュベートした後、実験培地で２回洗浄し、そしてヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃Ａ１１０１３）を加えて２回洗浄した後、フローサイトメーターにより蛍光シグナル値を読み取った。Ｕｒｅｌｕｍａｂモノクローナル抗体を陽性対照として使用し、各抗体のＭＦＩ値を図４に示している。
【0164】
その結果、かかる抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞表面の４－１ＢＢに対して異なる程度の結合能を有し、そのうち、Ｃ５は良好な細胞膜表面抗原結合活性を有する。
【0165】
２、４－１ＢＢシグナル伝達経路に対するアゴニスト活性の検出
４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢレポーター遺伝子を使用して抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のアゴニスト活性を評価した。
４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢレポーター遺伝子を使用して抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のアゴニスト活性を評価した。
【0166】
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）にヒト４－１ＢＢを発現する遺伝子（ＣＤ１３７ ｃＤＮＡ ＯＲＦ Ｃｌｏｎｅ、Ｈｕｍａｎ、Ｃ－ＯＦＰＳｐａｒｋ ｔａｇ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、Ｃａｔ＃ＨＧ１００４１－ＡＣＲ）及びＮＦ－κＢレポーター遺伝子（ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａから購入、Ｃａｔ＃Ｅ８４９Ａ）を一過性トランスフェクションし、ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢダブルトランスフェクション細胞を取得し、４－１ＢＢの活性化は、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化レベルで特徴付けることができる。ＦｃγＲＩＩｂプラスミド（ＣＤ３２Ｂ／Ｆｃｇｒ２ｂ ｃＤＮＡ ＯＲＦ Ｃｌｏｎｅ、Ｈｕｍａｎ、Ｎ－Ｈｉｓ ｔａｇ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、Ｃａｔ＃ＨＧ１０２５９－ＮＨ）をＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクションして、ＦｃγＲＩＩｂ高発現ＨＥＫ２９３細胞を得た。細胞培地は、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１１９９５０６５）である。ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢ細胞（２×１０６／ｍＬ）を５０μＬで９６ウェル細胞培養プレートに播種し、４０μＬの培地又はＦｃγＲＩＩｂを発現するＨＥＫ２９３細胞（２．５×１０６／ｍＬ）を加え、１０×勾配希釈された測定待ちの抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体を１０μＬ／ウェルで加え、３７℃で６ｈ培養した。細胞を取り出し、各ウェルに等体積のＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７９４０）を加え、暗所で５ｍｉｎインキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、２１５０）で蛍光シグナルを測定し、ＥＣ５０値及びＥｍａｘ値（対照無抗体群の蛍光強度）を算出し、ＥＣ５０値で抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のインビトロ細胞アゴニスト活性を評価した。結果を図５及び表４に示している。
【0167】
その結果、ＦｃγＲＩＩｂ（即ち、ＣＤ３２ｂ）陽性架橋が付加されていない場合、かかる抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナル伝達経路への活性化が何れもＵｒｅｌｕｍａｂ対照よりも弱いことが示され、本開示に係る抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は安全性がより高いことが示唆され、ＦｃγＲＩＩｂ架橋が付加された後、かかる抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナル伝達経路への顕著な活性化を示し、Ｃ５は、活性化能力が最も強くてかつＵｒｅｌｕｍａｂ対照に相当している。活性の結果をまとめて、ＦｃγＲＩＩｂ架橋前に低いバックグラウンド活性化を有すると共に、ＦｃγＲＩＩｂ架橋後にさらに強い活性化活性を有する配列Ｃ５をスクリーニングし、ヒト化した。
【0168】
【表4】
【0169】
実施例６．抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体の改変
１、ヒト化改変
Ｋａｂａｔ番号付けシステムによってＣ５配列のＣＤＲ及びＦＲ領域（ヒトフレームワーク領域、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）のアミノ酸番号を標識し、ＦＲ１＋ＣＤＲ１配列、ＦＲ２＋ＣＤＲ２配列、ＦＲ３＋ＣＤＲ３配列をそれぞれ抗体生殖細胞系列データベースとアラインメントし、それぞれ相同性の高いＦＲヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ＦＲ１はＩＧＨＶ３－６４＊０４、ＦＲ２はＩＧＨＶ３－２３＊０３、ＦＲ３はＩＧＨＶ３－７４＊０１に由来する。ヒト体内に生じる免疫原性が低減されるように、上記各ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域をそれぞれ原配列に置換挿入した。抗体の構造及び機能に影響を及ぼす重要なアミノ酸に対して復帰変異を行うことで、結合力及び活性を回復させた。各ヒト化配列は、以下の通りである。
１、ヒト化改変
Ｋａｂａｔ番号付けシステムによってＣ５配列のＣＤＲ及びＦＲ領域（ヒトフレームワーク領域、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）のアミノ酸番号を標識し、ＦＲ１＋ＣＤＲ１配列、ＦＲ２＋ＣＤＲ２配列、ＦＲ３＋ＣＤＲ３配列をそれぞれ抗体生殖細胞系列データベースとアラインメントし、それぞれ相同性の高いＦＲヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ＦＲ１はＩＧＨＶ３－６４＊０４、ＦＲ２はＩＧＨＶ３－２３＊０３、ＦＲ３はＩＧＨＶ３－７４＊０１に由来する。ヒト体内に生じる免疫原性が低減されるように、上記各ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域をそれぞれ原配列に置換挿入した。抗体の構造及び機能に影響を及ぼす重要なアミノ酸に対して復帰変異を行うことで、結合力及び活性を回復させた。各ヒト化配列は、以下の通りである。
【0170】
＞Ｃ５＿Ｖ１（配列番号１５）
＞Ｃ５＿Ｖ２（配列番号１６）
＞Ｃ５＿Ｖ３（配列番号１７）
上記３つのヒト化配列をそれぞれヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（配列番号１０）に連結した。プラスミドを構築し、一過性トランスフェクションし、発現して精製した。具体的な過程は以下の通りである：培養液をトランスフェクション試薬６０μＬに希釈した後にプラスミド１５μｇと均一に混合し、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした後、混合トランスフェクション溶液を細胞液３０ｍＬに１滴ずつ滴下し、シェーカーに置いて１週間培養して発現させ、上清を収集した。次に、それに対してＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性精製を行い、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）で溶離し、最後に１×ＰＢＳ緩衝液で透析し、凍結保存した。
【化12】
【化13】
【化14】
【0171】
２、ＴＣＥ部位の除去
その後、Ｃ５＿Ｖ２配列に対してＴ細胞エピトープ予測（Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ、ＴＣＥ）を行い、ＴＣＥの数が低減されるように、予測結果に基づいてＣ５＿Ｖ２のＣＤＲ３配列を改変した。ＣＤＲ３領域のＦ変異をＹに変異させて（Ｆ９９Ｙ、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる）ＴＣＥ最適化版のＣ５＿Ｖ２配列を取得し、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩと命名し、その配列は以下の通りである：
＞Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ（配列番号１８）
即ち、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ中のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７で示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号８で示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＨＰＬＴＹＴＩＡＴＭＮＤＹＤＹ（配列番号１９）で示される。
その後、Ｃ５＿Ｖ２配列に対してＴ細胞エピトープ予測（Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ、ＴＣＥ）を行い、ＴＣＥの数が低減されるように、予測結果に基づいてＣ５＿Ｖ２のＣＤＲ３配列を改変した。ＣＤＲ３領域のＦ変異をＹに変異させて（Ｆ９９Ｙ、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる）ＴＣＥ最適化版のＣ５＿Ｖ２配列を取得し、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩと命名し、その配列は以下の通りである：
＞Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ（配列番号１８）
【化15】
【0172】
上記Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ、Ｃ５、Ｃ５＿Ｖ１、Ｃ５＿Ｖ２、Ｃ５＿Ｖ３の配列をヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（配列番号１０）に連結した。プラスミドを構築し、一過性トランスフェクションし、発現して精製し、後の検出に用いた。
【0173】
実施例７．改変された抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体の抗原結合活性、アゴニスト活性の検出
１、４－１ＢＢ抗原への結合能の検出
ヒト化抗体は、実施例２に記載されたようなＦＡＣＳ検出方法により抗原結合活性を検出した。結果を図６、表５に示している。
１、４－１ＢＢ抗原への結合能の検出
ヒト化抗体は、実施例２に記載されたようなＦＡＣＳ検出方法により抗原結合活性を検出した。結果を図６、表５に示している。
【0174】
その結果、かかるヒト化抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞表面の４－１ＢＢに対して異なる程度の結合能を有し、Ｃ５＿Ｖ１、Ｃ５＿Ｖ２、Ｃ５＿Ｖ３は、何れも良好な結合活性を維持している。
【0175】
【表5】
【0176】
２、４－１ＢＢシグナル伝達経路に対するアゴニスト活性の検出
実施例２に記載されたようなＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子実験により、ヒト化抗体の４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢシグナルへの活性化を検出し、結果を図７、表６に示している。
実施例２に記載されたようなＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子実験により、ヒト化抗体の４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢシグナルへの活性化を検出し、結果を図７、表６に示している。
【0177】
その結果、ＦｃγＲＩＩｂ架橋が付加された後、かかるヒト化抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体は、４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナル伝達経路への活性化を示し、Ｃ５、Ｃ５＿Ｖ１、Ｃ５＿Ｖ２、Ｃ５＿Ｖ３の活性化能力は、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＷＯ２００５０３５５８４Ａによる）対照に相当する。
【0178】
【表6】
【0179】
実施例５に記載されたようなＦＡＣＳ検出方法により、Ｃ５＿Ｖ２とＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩの抗原への結合活性を比較し、結果を図８、表７に示している。その結果、かかるＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩは、ＨＥＫ２９３－Ｈｕ４－１ＢＢ細胞表面の４－１ＢＢに対して良好な結合活性を維持し、Ｃ５＿Ｖ２に相当する。
【0180】
【表7】
【0181】
実施例８．抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体のＶＨフレームワーク（ＦＲ）に対するアミノ酸改変及びｐｒｅ－ＡＤＡの検出
本開示に係る抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩに対して表８に示すようにＣ末端改変を行った。
本開示に係る抗４－１ＢＢ単一ドメイン抗体Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩに対して表８に示すようにＣ末端改変を行った。
【0182】
【表8】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【0183】
＞Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－４２（配列番号３６）
実施例２の実験方法に従ってＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩのＣ末端改変した各変異体にＥＬＩＳＡ検出を行い、結果を表９に示している。その結果、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５３、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５４、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５５、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５６、Ｃ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５７及びＣ５＿Ｖ２－ＹＴＩ－５８という６つの分子は、ｐｒｅ－ＡＤＡ結合シグナルが明らかに低減された。
【化32】
【0184】
【表9】
【0185】
【表10】
【0186】
以上、本開示の具体的な実施形態を説明したが、当業者は、それらが単に例示的な説明であり、本開示の原理及び主旨から逸脱することなく、これらの実施形態に種々の変更や修正を行うことができると理解すべきである。従って、本開示の請求範囲は、添付される特許請求の範囲によって限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】