▶ ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20241112BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20241112BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20241112BHJP
C12N 9/78 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241112BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/34 ZNA
C12Q1/26
C12N9/78
C12N15/62 Z
C12N15/55
C12N15/31
C12Q1/25
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531071
(86)(22)【出願日】2022-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-07-22
(86)【国際出願番号】 US2022080345
(87)【国際公開番号】W WO2023097226
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】63/264,513
(32)【優先日】2021-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】18/058,115
(32)【優先日】2022-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591021970
【氏名又は名称】ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バイシビラ，ロムアルダス
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン，ショーン・アール
(72)【発明者】
【氏名】サン，ジーイー
(72)【発明者】
【氏名】エバンス，トーマス・シー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR20
4B063QR42
4B063QS24
4B063QX01
(57)【要約】
とりわけ、二本鎖核酸を脱アミノ化するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質を、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び／又は９９のいずれかに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに接触させて、脱アミノ化されたシトシンを含む脱アミノ化産物を作製するステップを含んでよい。方法を実施するための酵素及びキットも提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本鎖核酸を脱アミノ化するための方法であって、シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質と
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び９９のいずれかに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを接触させて、
脱アミノ化したシトシンを含む脱アミノ化産物を作製するステップ
を含む方法。
【請求項2】
二本鎖ＤＮＡ基質が、修飾されたシトシンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
修飾されたシトシンが、５ｆＣ、５ＣａＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ、５ｇｈｍＣ、又はピロロ－Ｃである、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項4】
脱アミノ化産物を配列決定する、又は脱アミノ化産物を増幅して増幅産物を作製する、及び増幅産物を配列決定して、それぞれの場合に、シーケンスリードを作製するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
シーケンスリードを分析して二本鎖ＤＮＡ基質中の修飾されたシトシンを特定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
二本鎖ＤＮＡ基質が真核生物又は細菌ＤＮＡである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
二本鎖ＤＮＡ基質がヒトｃｆＤＮＡである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び９９のいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
二本鎖ＤＮＡ基質が、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及びＤＮＡベータ－グルコシルトランスフェラーゼで前処理されている、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが、ＭＧＹＰＤａ８２９（配列番号９６）、ＭＧＹＰＤａ０６（配列番号４）、ＣｒＤａ０１（配列番号１２）、ＡｖＤａ０２（配列番号２１）、ＣｓＤａ０１（配列番号９）、ＬｂｓＤａ０１（配列番号１０）、ＦｌＤａ０１（配列番号８）、ＭＧＹＰＤａ２６（配列番号７）、ＭＧＹＰＤａ２３（配列番号６）、キメラ＿１０（配列番号９７）及びＡｎｃＤａ０４（配列番号９５）の配列番号のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
二本鎖ＤＮＡ基質が、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼで前処理されているが、ＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼでは前処理されていない、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｓｅＤａ０１（配列番号３）及びＬｂＤａ０２（配列番号１）の配列番号のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
二本鎖ＤＮＡ基質が、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼでもＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼでも前処理されない、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
二本鎖ＤＮＡ基質が、少なくとも１つのＮ４ｍＣを含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
二本鎖ＤＮＡ基質が細菌ＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが、ＭＧＹＰＤａ２０（配列番号１１）、ＮｓＤａ０１（配列番号２７）、及びＡｓｈＤａ０１（配列番号４０）の配列番号のいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１３～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
二本鎖ＤＮＡ基質を作製するために、（ａ）ヘアピンアダプターをＤＮＡの二本鎖断片にライゲートしてライゲーション産物を作製するステップ；
（ｂ）ライゲーション産物中のヘアピンアダプターの二本鎖領域に遊離の３’末端を酵素的に生成するステップ；並びに
（ｃ）鎖置換又はニック翻訳ポリメラーゼ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及び修飾されたｄＣＴＰを含むｄＣＴＰフリー反応混合物中で遊離の３’末端を伸長させるステップをさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
修飾されたｄＣＴＰが、５ｍｄＣＴＰ、ピロロ－ｄＣＴＰ、５ｈｍｄＣＴＰ又はＮ４ｍｄＣＴＰである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが、ＭＧＹＰＤａ２０（配列番号１１）、ＮｓＤａ０１（配列番号２７）、ＡｓｈＤａ０１（配列番号４０）の配列番号のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
天然に存在するタンパク質のＣ終端デアミナーゼドメインに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む酵素であって、（ａ）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を有し、及び
（ｂ）天然に存在するタンパク質のＮ終端を含まない
酵素。
【請求項21】
３００以下のアミノ酸長である、請求項２０に記載の酵素。
【請求項22】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び９９のいずれかに対して少なくとも８０％同一である、請求項２０又は２１に記載の酵素。
【請求項23】
触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）又はニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）と融合されている、請求項２０～２２のいずれかに記載の酵素。
【請求項24】
（ａ）請求項２０～２２のいずれかに記載の酵素；及び（ｂ）反応緩衝液
を含むキット。
【請求項25】
ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及びＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼをさらに含む；又はＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼをさらに含み、ＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼを含まない、
請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼもＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼもない、請求項２４に記載のキット。
【請求項27】
５ｍｄＣＴＰ、ピロロ－ｄＣＴＰ、５ｈｍｄＣＴＰ及びＮ４ｍｄＣＴＰから選択される修飾されたｄＣＴＰをさらに含む、請求項２４～２６のいずれかに記載のキット。
【請求項28】
（ａ）シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質；並びに（ｂ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び９９のいずれかに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、
を含む反応混合物。
【請求項29】
二本鎖ＤＮＡ基質がシトシン及び少なくとも１つの修飾されたシトシンを含む、請求項２８に記載の反応混合物。
【請求項30】
修飾されたシトシンが、５ｆＣ、５ｃａＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ又はピロロ－Ｃである、請求項２９に記載の反応混合物。
【請求項31】
二本鎖ＤＮＡ基質が、真核生物又は細菌ＤＮＡを含む、請求項２８～３０のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項32】
二本鎖ＤＮＡ基質がヒトｃｆＤＮＡである、請求項２８～３１のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項33】
デアミナーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、及び９９のいずれかに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２８～３２のいずれかに記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２２年１１月２２日提出の米国特許出願第１８／０５８，１１５号の利益を主張するものであり、前記出願は２０２１年１１月２４日提出の米国特許仮出願第６３／２６４，５１３号の利益を主張しており、これらの出願は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【0002】
配列表は、２０２２年１１月２２日作成の、１．４９ＧＢのサイズを有する配列表ＸＭＬ、「ＮＥＢ－４５１．ｘｍｌ」として本明細書と一緒に提供される。配列表ＸＭＬの内容は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【背景技術】
【0003】
多くの生物では、ゲノム中のシトシンは、例えば、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に共有結合的に修飾することができる。これらのエピジェネティックな変化は、遺伝子発現を含む多種多様な現象で役割を果たしていると考えられている。ＤＮＡメチル化の全体的又は局所的変化は、がんで起こることが知られている初期イベントの１つである。ヒトでのメチル化プロファイルの特定は、疾患過程を研究するためのキーとなるステップであり、診断目的に益々使用されている。
【0004】
修飾されたシトシンを特定するための現在の方法は、シトシンをウラシルに変換し、修飾されたシトシンは脱アミノ化されないままである脱アミノ化ステップを含む。これらの脱アミノ化ＤＮＡ分子中のウラシルは増幅中チミンにコピーされ、増幅産物を配列決定した後、開始配列中の修飾されたシトシンはそれぞれ、配列決定された増幅産物において「Ｃ」として容易に特定することができ、シトシンはそれぞれ配列決定された増幅産物において「Ｔ」として現れる。
【0005】
ＤＮＡは、化学的に（例えば、亜硫酸水素塩を使用して；Ｆｒｏｍｍｅｒら、ＰＮＡＳ １９９２年 ８９：１８２７～１８３１頁参照）又はＤＮＡデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ａを使用して、例えば、Ｓｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２１年 ３１：２９１～３００頁及びＶａｉｓｖｉｌａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２１年 ３１：１２８０～１２８９頁参照）を使用して酵素的に脱アミノ化しうる。しかし、これらのアプローチの両方が一本鎖基質を必要とする。したがって、修飾されたシトシンを分析するための現在のワークフローは、典型的には変性ステップを含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｆｒｏｍｍｅｒら、ＰＮＡＳ １９９２年 ８９：１８２７～１８３１頁
【非特許文献2】Ｓｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２１年 ３１：２９１～３００頁
【非特許文献3】Ｖａｉｓｖｉｌａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２１年 ３１：１２８０～１２８９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
現在のワークフローから変性ステップをなくすことが、望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
（発明の要旨）
本開示は、一部の実施形態では、例えば、二本鎖ＤＮＡ基質に対して活性であるシトシンデアミナーゼを含む１つ以上の望ましい特性を有するデアミナーゼに関する。これらの酵素は、（例えば、ＤＮＡを変性させずに）二本鎖ＤＮＡ基質中のシトシンを脱アミノ化しうる。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化することに加えて一本鎖ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化しうる。グアニンに隣接するシトシン（「ＣＧ」）は、開示されたデアミナーゼにより、他の配列コンテクスト（「ＣＨ」、Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ）中のシトシンと同じ程度によく脱アミノ化される、それほどよく脱アミノ化されない、又はそれよりもよく脱アミノ化されることもある。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、デアミナーゼ、及び、任意選択的に、緩衝剤、１つ以上の修飾されたシトシンの脱アミノ化感受性を変更する１つ以上の酵素（例えば、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及び／又はＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼ）を含みうる。
本開示は、一部の実施形態では、例えば、二本鎖ＤＮＡ基質に対して活性であるシトシンデアミナーゼを含む１つ以上の望ましい特性を有するデアミナーゼに関する。これらの酵素は、（例えば、ＤＮＡを変性させずに）二本鎖ＤＮＡ基質中のシトシンを脱アミノ化しうる。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化することに加えて一本鎖ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化しうる。グアニンに隣接するシトシン（「ＣＧ」）は、開示されたデアミナーゼにより、他の配列コンテクスト（「ＣＨ」、Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ）中のシトシンと同じ程度によく脱アミノ化される、それほどよく脱アミノ化されない、又はそれよりもよく脱アミノ化されることもある。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、デアミナーゼ、及び、任意選択的に、緩衝剤、１つ以上の修飾されたシトシンの脱アミノ化感受性を変更する１つ以上の酵素（例えば、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及び／又はＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼ）を含みうる。
【0009】
本開示は、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質を脱アミノ化するための方法に関する。例えば、二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化するステップは、例えば、基質を変性せずに二本鎖ＤＮＡ基質と二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを接触させて、二本鎖基質中のシトシンを脱アミノ化するステップ、又は他の方法で基質の鎖を解く若しくは他の方法で分離する任意の薬剤（例えば、ジャイレース又はヘリカーゼ）を使用して、脱アミノ化産物を生み出すステップを含みうる。一部の実施形態では、方法は、脱アミノ化反応の産物（本明細書では「脱アミノ化産物」と呼ばれる脱アミノ化二本鎖ＤＮＡ分子である）の少なくとも１つの鎖を配列決定してシーケンスリードを生み出すステップを含んでよい。方法は、脱アミノ化産物を増幅して増幅産物を作製し、次に増幅産物を配列決定してシーケンスリードを生み出すステップを含んでよい。開示されたシトシンデアミナーゼは、ＤＮＡ基質中にも存在する修飾されたシトシン（例えば、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、５ｃａＣ、５ｇｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ）を脱アミノ化せずにシトシンを脱アミノ化してもよい又はシトシンも脱アミノ化し基質中の１つ以上の修飾されたシトシンも脱アミノ化してよい。したがって、二本鎖ＤＮＡ基質中の修飾されたシトシン（例えば、５ｍＣ又は５ｈｍＣ）の位置は、シーケンスリードの解析により特定することができる。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼの一部はＮ４ｍＣを脱アミノ化しないが、他の修飾されたシトシンを脱アミノ化することはでき、他のデアミナーゼは５ｍＣと５ｈｍＣを脱アミノ化せず、５ｈｍＣを脱アミノ化しないが５ｍＣを脱アミノ化することができるデアミナーゼもあり、５ｇｈｍＣを脱アミノ化しないが５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣを脱アミノ化することができるデアミナーゼもあり、５ｆｃと５ｃａＣを脱アミノ化しない他のデアミナーゼはしかし５ｍＣと５ｈｍＣを脱アミノ化することができる。したがって、１つ以上の修飾されたシトシンの位置は、基質を選択された特異性を有するデアミナーゼと接触させることにより、及び任意選択的に、基質を１つ以上の修飾されたシトシンの脱アミノ化感受性を変更する１種以上の酵素を用いて前処理することにより、二本鎖基質において決定しうる。例えば、方法は、二本鎖ＤＮＡ基質を（ａ）ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及びＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼを用いて又は（ｂ）ＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼではなく、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼを用いて前処理するステップを含んでよい。これらの酵素は、二本鎖核酸中の５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣを修飾してそれらの残基をある特定の二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに対して抵抗性にする。一部の実施形態では、方法は、例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼが５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣを脱アミノ化しない場合に、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼともＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼとも接触させていない（以前に又は同時に）二本鎖核酸と接触させるステップを含んでよい。
【0010】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、少なくとも１つのＮ４ｍＣ又はピロロ－ｄＣを含んでよい。Ｎ４ｍＣは、原核生物及び古細菌に見出される。したがって、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、原核生物でも古細菌でもよい。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、ヘアピンアダプターをＤＮＡの二本鎖断片にライゲートしてライゲーション産物を作製するステップ、ライゲーション産物中のヘアピンアダプターの二本鎖領域に遊離の３’末端を酵素的に作製するステップ、並びに鎖置換又はニック翻訳ポリメラーゼ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及び修飾されたｄＣＴＰを含むｄＣＴＰフリー反応混合物で遊離の３’末端を伸長させるステップにより、作ってもよい。この方法では、修飾されたｄＣＴＰは新しい鎖中に組み込まれて、修飾されたＣを有する二本鎖核酸を作製する。
【0011】
例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び反応緩衝液を含む、方法を実施するための酵素及びキットも提供される。
【0012】
本特許のファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図を含む。カラー図付の本特許のコピーは、請求があり必要料金が支払われ次第、特許商標庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、同心円状に配置された説明的活動データにより取り囲まれたシトシンデアミナーゼの最大尤度系統樹のトポロジーを示し、それぞれの系統樹終端、酵素名、及び活動結果のセットが放射軸に沿って整列されている。これらの環に示される種々の基質に対する酵素的活動結果は、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードシーケンシングベースの検出法を用いてインビトロスクリーニングアッセイにより測定された（実施例３）。環の全面積は全活動に対応し、色付けされた領域の相対的サイズは指示された基質に対する相対的活性を示す。最内部の環は、一本鎖ＤＮＡ（赤色領域）と比べた二本鎖ＤＮＡ（青色領域）での非修飾システインに対する相対的脱アミノ化活性を示す。中間の環は、二本鎖ＤＮＡ中の５－メチル化シトシンに対する活性を示す。最外部の環は、二本鎖ＤＮＡ中の５－ヒドロキシメチル化シトシンに対する活性を示す。酵素名は、その系統発生的ファミリーに従って色付けされている。
【図2A】図２Ａ～Ｃは、実施例３のスクリーニング法に従ってアッセイされるシトシンデアミナーゼについての酵素活性を示す。活性は、試料中の全シトシンのうちの脱アミノ化された割合として表現される。図２Ａは、二本鎖ＤＮＡ対一本鎖ＤＮＡに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｂは、ＣＧコンテクスト対ＣＨ（ＣＡ、ＣＣ、及びＣＴの組合せ）コンテクスト中の非修飾シトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｃは、すべての配列コンテクスト中のシトシン対５－メチルシトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。
【図2B】図２Ａ～Ｃは、実施例３のスクリーニング法に従ってアッセイされるシトシンデアミナーゼについての酵素活性を示す。活性は、試料中の全シトシンのうちの脱アミノ化された割合として表現される。図２Ａは、二本鎖ＤＮＡ対一本鎖ＤＮＡに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｂは、ＣＧコンテクスト対ＣＨ（ＣＡ、ＣＣ、及びＣＴの組合せ）コンテクスト中の非修飾シトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｃは、すべての配列コンテクスト中のシトシン対５－メチルシトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。
【図2C】図２Ａ～Ｃは、実施例３のスクリーニング法に従ってアッセイされるシトシンデアミナーゼについての酵素活性を示す。活性は、試料中の全シトシンのうちの脱アミノ化された割合として表現される。図２Ａは、二本鎖ＤＮＡ対一本鎖ＤＮＡに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｂは、ＣＧコンテクスト対ＣＨ（ＣＡ、ＣＣ、及びＣＴの組合せ）コンテクスト中の非修飾シトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。図２Ｃは、すべての配列コンテクスト中のシトシン対５－メチルシトシンに対するデアミナーゼ例についての活性結果を示す。
【図3A】図３Ａ～３Ｄは、ＤＮＡ中の修飾されたシトシンの位置を特定するためのワークフロー例を示す。図３Ａは、ｓｓＤＮＡのＡＰＯＢＥＣ３Ａ脱アミノ化のワークフロー例を示し、図３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａが、ｄｓＤＮＺＡを脱アミノ化するシトシンデアミナーゼにより置換されるワークフロー例を示す。図３Ｂは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対して活性であるｄｓＤＮＡデアミナーゼの使用によりＤＮＡ変性ステップが除かれる単一ポットワークフロー例を示す。示されるように、ＤＮＡデアミナーゼは、中間精製及び変性ステップなしでＴＥＴ及びＢＧＴとの反応に続いて反応混合物に添加し、それによってゲノムＤＮＡ上の標的メチル化部位の検出及びメチロームマッピングを増強することができる。図３Ｃは、ＢＧＴでの前処理を必要としない又は含むこともなく５ｆＣも５ｃａＣも脱アミノ化しないデアミナーゼと基質を接触させるワークフロー例を示す。図３Ｄは、基質が単一酵素であるｄｓＤＮＡデアミナーゼと接触されるメチローム分析ワークフロー例を示す。
【図3B】図３Ａ～３Ｄは、ＤＮＡ中の修飾されたシトシンの位置を特定するためのワークフロー例を示す。図３Ａは、ｓｓＤＮＡのＡＰＯＢＥＣ３Ａ脱アミノ化のワークフロー例を示し、図３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａが、ｄｓＤＮＺＡを脱アミノ化するシトシンデアミナーゼにより置換されるワークフロー例を示す。図３Ｂは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対して活性であるｄｓＤＮＡデアミナーゼの使用によりＤＮＡ変性ステップが除かれる単一ポットワークフロー例を示す。示されるように、ＤＮＡデアミナーゼは、中間精製及び変性ステップなしでＴＥＴ及びＢＧＴとの反応に続いて反応混合物に添加し、それによってゲノムＤＮＡ上の標的メチル化部位の検出及びメチロームマッピングを増強することができる。図３Ｃは、ＢＧＴでの前処理を必要としない又は含むこともなく５ｆＣも５ｃａＣも脱アミノ化しないデアミナーゼと基質を接触させるワークフロー例を示す。図３Ｄは、基質が単一酵素であるｄｓＤＮＡデアミナーゼと接触されるメチローム分析ワークフロー例を示す。
【図3C】図３Ａ～３Ｄは、ＤＮＡ中の修飾されたシトシンの位置を特定するためのワークフロー例を示す。図３Ａは、ｓｓＤＮＡのＡＰＯＢＥＣ３Ａ脱アミノ化のワークフロー例を示し、図３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａが、ｄｓＤＮＺＡを脱アミノ化するシトシンデアミナーゼにより置換されるワークフロー例を示す。図３Ｂは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対して活性であるｄｓＤＮＡデアミナーゼの使用によりＤＮＡ変性ステップが除かれる単一ポットワークフロー例を示す。示されるように、ＤＮＡデアミナーゼは、中間精製及び変性ステップなしでＴＥＴ及びＢＧＴとの反応に続いて反応混合物に添加し、それによってゲノムＤＮＡ上の標的メチル化部位の検出及びメチロームマッピングを増強することができる。図３Ｃは、ＢＧＴでの前処理を必要としない又は含むこともなく５ｆＣも５ｃａＣも脱アミノ化しないデアミナーゼと基質を接触させるワークフロー例を示す。図３Ｄは、基質が単一酵素であるｄｓＤＮＡデアミナーゼと接触されるメチローム分析ワークフロー例を示す。
【図3D】図３Ａ～３Ｄは、ＤＮＡ中の修飾されたシトシンの位置を特定するためのワークフロー例を示す。図３Ａは、ｓｓＤＮＡのＡＰＯＢＥＣ３Ａ脱アミノ化のワークフロー例を示し、図３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａが、ｄｓＤＮＺＡを脱アミノ化するシトシンデアミナーゼにより置換されるワークフロー例を示す。図３Ｂは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対して活性であるｄｓＤＮＡデアミナーゼの使用によりＤＮＡ変性ステップが除かれる単一ポットワークフロー例を示す。示されるように、ＤＮＡデアミナーゼは、中間精製及び変性ステップなしでＴＥＴ及びＢＧＴとの反応に続いて反応混合物に添加し、それによってゲノムＤＮＡ上の標的メチル化部位の検出及びメチロームマッピングを増強することができる。図３Ｃは、ＢＧＴでの前処理を必要としない又は含むこともなく５ｆＣも５ｃａＣも脱アミノ化しないデアミナーゼと基質を接触させるワークフロー例を示す。図３Ｄは、基質が単一酵素であるｄｓＤＮＡデアミナーゼと接触されるメチローム分析ワークフロー例を示す。
【図4A】図４Ａ～４Ｃは、図３Ｃと同様に、ＢＧＴグリコシルトランスフェラーゼ前処理を必要としない又は含むこともなく、使用されるｄｓＤＮＡデアミナーゼであるＣｓｅＤａ０１が５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化しない５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するワークフローの結果例を示す。図４Ａは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、一本鎖と二本鎖基質の両方でシトシンＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｈｍＣを効率的に脱アミノ化することを示す。図４Ｂは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、シーケンスバイアスを見せず、脱アミノ化効率が、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧとＣｐＨコンテクストの両方についてｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡ基質の両方で９５％よりも大きかったことを示す。図４Ｃは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化せず、ＢＧＴグルコシル化ステップなしで５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するのに有用である可能性があることを示す。
【図4B】図４Ａ～４Ｃは、図３Ｃと同様に、ＢＧＴグリコシルトランスフェラーゼ前処理を必要としない又は含むこともなく、使用されるｄｓＤＮＡデアミナーゼであるＣｓｅＤａ０１が５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化しない５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するワークフローの結果例を示す。図４Ａは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、一本鎖と二本鎖基質の両方でシトシンＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｈｍＣを効率的に脱アミノ化することを示す。図４Ｂは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、シーケンスバイアスを見せず、脱アミノ化効率が、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧとＣｐＨコンテクストの両方についてｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡ基質の両方で９５％よりも大きかったことを示す。図４Ｃは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化せず、ＢＧＴグルコシル化ステップなしで５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するのに有用である可能性があることを示す。
【図4C】図４Ａ～４Ｃは、図３Ｃと同様に、ＢＧＴグリコシルトランスフェラーゼ前処理を必要としない又は含むこともなく、使用されるｄｓＤＮＡデアミナーゼであるＣｓｅＤａ０１が５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化しない５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するワークフローの結果例を示す。図４Ａは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、一本鎖と二本鎖基質の両方でシトシンＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｈｍＣを効率的に脱アミノ化することを示す。図４Ｂは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、シーケンスバイアスを見せず、脱アミノ化効率が、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧとＣｐＨコンテクストの両方についてｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡ基質の両方で９５％よりも大きかったことを示す。図４Ｃは、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化せず、ＢＧＴグルコシル化ステップなしで５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するのに有用である可能性があることを示す。
【図5A】図５Ａ～５Ｂは、ＣｓｅＤａ０１及びＴＥＴ２を使用して５ｍＣの単一チューブ酸化を実施する結果例を示す。Ｘ軸ラベルはデアミナーゼの段階希釈を示し、１×は最も濃縮された酵素であり、３２×は１×と比べて３２の倍数での希釈液である。図５Ａは、一本鎖基質の効率的脱アミノ化を図示する結果を示す。図５Ｂは、二本鎖基質の効率的脱アミノ化を図示する結果を示す。
【図5B】図５Ａ～５Ｂは、ＣｓｅＤａ０１及びＴＥＴ２を使用して５ｍＣの単一チューブ酸化を実施する結果例を示す。Ｘ軸ラベルはデアミナーゼの段階希釈を示し、１×は最も濃縮された酵素であり、３２×は１×と比べて３２の倍数での希釈液である。図５Ａは、一本鎖基質の効率的脱アミノ化を図示する結果を示す。図５Ｂは、二本鎖基質の効率的脱アミノ化を図示する結果を示す。
【図6A】図６Ａ～６Ｂは、シトシンを効率的にウラシルに脱アミノ化する修飾感受性デアミナーゼである、ＭＧＹＰＤａ２０を使用する結果例を示す。しかし、ＭＧＹＰＤａ２０は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ中の５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシンを脱アミノ化しない。このデアミナーゼを使用して、これらの修飾された塩基を保護しなくても５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図６Ａは、ＭＧＹＰＤａ２０ ＤＮＡデアミナーゼがシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図６Ｂは、ＭＧＹＰＤａ２０ ＤＮＡデアミナーゼがシーケンスバイアスを見せないことを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図6B】図６Ａ～６Ｂは、シトシンを効率的にウラシルに脱アミノ化する修飾感受性デアミナーゼである、ＭＧＹＰＤａ２０を使用する結果例を示す。しかし、ＭＧＹＰＤａ２０は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ中の５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシンを脱アミノ化しない。このデアミナーゼを使用して、これらの修飾された塩基を保護しなくても５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図６Ａは、ＭＧＹＰＤａ２０ ＤＮＡデアミナーゼがシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図６Ｂは、ＭＧＹＰＤａ２０ ＤＮＡデアミナーゼがシーケンスバイアスを見せないことを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図7A】図７Ａ～７Ｂは、別の修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＮｓＤａ０１を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護しなくても５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図７Ａは、ＮｓＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、シトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図７Ｂは、ＮｓＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼがシーケンスバイアスを見せないことを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図7B】図７Ａ～７Ｂは、別の修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＮｓＤａ０１を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護しなくても５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図７Ａは、ＮｓＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、シトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図７Ｂは、ＮｓＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼがシーケンスバイアスを見せないことを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図8A】図８Ａ～８Ｂは、ＣｐＧ特異的修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＲｈＤａ０１を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護してもしなくてもＣｐＧコンテクストにおいて５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図８Ａは、ＲｈＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧコンテクストにおいてシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図８Ｂは、ＲｈＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧ配列特異性を見せることを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図8B】図８Ａ～８Ｂは、ＣｐＧ特異的修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＲｈＤａ０１を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護してもしなくてもＣｐＧコンテクストにおいて５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図８Ａは、ＲｈＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧコンテクストにおいてシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図８Ｂは、ＲｈＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧ配列特異性を見せることを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図9A】図９Ａ～Ｂは、ＣｐＧ特異的修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＭｍｇＤａ０２を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護してもしなくてもＣｐＧコンテクストにおいて５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図９Ａは、ＭｍｇＤａ０２ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧコンテクストにおいてシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図９Ｂは、ＭｍｇＤａ０２ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧ配列特異性を見せることを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図9B】図９Ａ～Ｂは、ＣｐＧ特異的修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＭｍｇＤａ０２を使用する結果例を示し、このデアミナーゼを使用して、修飾された塩基を保護してもしなくてもＣｐＧコンテクストにおいて５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出しうる。図９Ａは、ＭｍｇＤａ０２ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧコンテクストにおいてシトシンＣを効率的に脱アミノ化するが、５ｍＣも５ｈｍＣも５ｇｈｍＣも脱アミノ化しないことを示す。図９Ｂは、ＭｍｇＤａ０２ ＤＮＡデアミナーゼが、ＣｐＧ配列特異性を見せることを示す。シーケンスロゴは、イー・コリゲノム中で＞＝９０％の脱アミノ化効率を有するシトシン部位を使用して作成された。
【図10】図１０は、修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼである、ＭＧＹＰＤａ２０を使用してヒトにおいて５ｍＣを位置付けるために１－チューブ－１－酵素 ＥＭ－ｓｅｑ法を使用する結果例を示す。この図は、修飾感受性ＤＮＡデアミナーゼである、ＭＧＹＰＤａ２０を使用して、ヒトＧＭ１２８７８ゲノム中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを正確に検出しうることを示す。これらの実験では、２種類のアダプターが使用され、Ｃはすべて５ｍＣ又はピロロ－ｄＣにより置き換えられた。どちらの場合でも、ヒトＧＭ１２８７８ゲノム中の全体のメチル化レベルは正確に特定された。
【図11A】図１１は、異なるメチルトランスフェラーゼ配列特異性を有する異なるゲノム、すなわち、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＪＤＲ－２（ＣＣＧＧ標的配列）及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２（ＣＡＣＣＧＴ標的配列）のＮ４ｍＣ含有基質由来のＣｓｅＤａ０１デアミナーゼにより脱アミノ化されない部位のシーケンスロゴを使用する結果例を示す。ＡＰＯＢＥＣ３Ａの真核生物デアミナーゼファミリーは、Ｎ４ｍＣを脱アミノ化するが、細菌デアミナーゼはＮ４ｍＣを脱アミノ化せず、したがって、新たに特徴付けられた細菌デアミナーゼを使用してＮ４ｍＣ修飾を検出しうる。図１１Ａは、検出されたＮ４ｍＣモチーフが、パエニバシラス種ＪＤＲ－２中の予想されるＣＣＧＧメチルトランスフェラーゼモチーフに一致することを示す。図１１Ｂは、検出されたＮ４ｍＣモチーフが、サルモネラ・エンテリカＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２由来のＣＡＣＣＧＴと一致することを示す。
【図11B】図１１は、異なるメチルトランスフェラーゼ配列特異性を有する異なるゲノム、すなわち、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＪＤＲ－２（ＣＣＧＧ標的配列）及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２（ＣＡＣＣＧＴ標的配列）のＮ４ｍＣ含有基質由来のＣｓｅＤａ０１デアミナーゼにより脱アミノ化されない部位のシーケンスロゴを使用する結果例を示す。ＡＰＯＢＥＣ３Ａの真核生物デアミナーゼファミリーは、Ｎ４ｍＣを脱アミノ化するが、細菌デアミナーゼはＮ４ｍＣを脱アミノ化せず、したがって、新たに特徴付けられた細菌デアミナーゼを使用してＮ４ｍＣ修飾を検出しうる。図１１Ａは、検出されたＮ４ｍＣモチーフが、パエニバシラス種ＪＤＲ－２中の予想されるＣＣＧＧメチルトランスフェラーゼモチーフに一致することを示す。図１１Ｂは、検出されたＮ４ｍＣモチーフが、サルモネラ・エンテリカＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２由来のＣＡＣＣＧＴと一致することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本開示は、二本鎖ＤＮＡ（二重形態で、変性なし）を脱アミノ化するための二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、変異体、先祖、融合物、組成物、システム、器具、方法、及びワークフローを提供する。これらのデアミナーゼの適用は、例えば、とりわけ、ＥＭ－ｓｅｑ、メチル－ＳＮＰ－ｓｅｑ、及びＮ４ｍＣ検出を含む。
【0015】
本開示の態様は、提供される説明、図面、配列、実施形態、セクション見出し、及び実施例に照らして理解できるが、それらのどれも決して本開示の全範囲を限定するものと解釈されるべきではない。したがって、本明細書で示される技術革新は本開示の全容及び精神に鑑みて解釈されるべきである。
【0016】
本明細書に記載され図解される個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲又は精神から逸脱することなくその他いくつかの実施形態のうちのいずれかの成分及び／又は特徴から容易に分離できる又はこれらと組み合わせることができる個別の成分及び特徴を有する。いずれかの列挙された方法は、列挙されたイベントの順番に又は論理的に可能な他のいかなる順番にでも実行できる。本明細書で必要とされると別段はっきり述べられていなければ、本明細書で開示されるそれぞれの成分、特徴、及び方法ステップは任意選択的であり、本開示はそれぞれの任意の要素がはっきりと排除されうる実施形態を想定する。
【0017】
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。それでも、ある特定の用語は、本開示の実施形態に関連して並びに参照の明瞭さ及び容易さのために本明細書で定義される。
【0018】
一般的に理解されている用語及び記号の供給源は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５年）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年）； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）；Ｇａｉｔ、編者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４年）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ、ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）並びに同類のものなどの標準的専門書及び教科書を含みうる。
【0019】
本明細書で及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に指示しなければ、複数の参照対象を含む。例えば、用語「１つのタンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、１つ以上のタンパク質、すなわち、単一のタンパク質及び複数のタンパク質のことである。任意の要素は、任意の要素の列挙と関連して「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」、「だけ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語法が使用される場合、又は否定的限定が明記される場合にははっきりと排除しうる。
【0020】
数値範囲は、その範囲を定義する数を含める。すべての数が、整数の上及び下の整数の中間点を包含すると理解されるべきである、すなわち、数２は、１．５～２．５を包含する。数２．５は２．４５～２．５５を包含する、等々。試料数値が提供される場合、それぞれが単独で値の範囲での中間値を表してよく、明記されなければ全体で範囲の端を表しうる。
【0021】
本開示の文脈では、「緩衝液」及び「緩衝剤」とは、それ自体がｐＨの変化に抵抗し、溶液中に存在する場合は、そのような溶液がより高い又はより低いｐＨを有する化学的実体又は組成物（例えば、酸又はアルカリ）と接触した場合は、そのような溶液にｐＨの変化に抵抗させる化学的実体又は組成物のことである。開示された組成物、キット、及び方法において使用しうる適切な天然に存在しない緩衝剤の例は、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、トリシン、及びＴｒｉｓを含む。開示された組成物、キット、及び方法において使用しうる適切な緩衝剤の追加の例は、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、ＢＥＳ、ビシン、ＣＡＰＳ、炭酸／重炭酸、ＣＨＥＳ、クエン酸、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ヒスチジン、ＭＯＰＳＯ、リン酸、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、及びトリエタノールアミンを含む。
【0022】
本開示の文脈では、「デアミナーゼ基質」とは、任意選択的に、もっぱら二本鎖、部分的に二本鎖及び部分的に一本鎖、又はもっぱら一本鎖でもよいポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子のことである。デアミナーゼ基質は、１つ以上のシトシン、１つ以上の修飾されたシトシン、１つ以上のアデニン、１つ以上の修飾されたアデニン、又はその組合せを含んでよい。ＤＮＡ基質は、１つ以上のアダプターを含んでよい。
【0023】
本開示の文脈では、「二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡ中のシトシンをウラシルに脱アミノ化する及び／又は二本鎖ＤＮＡ中のアデニンをヒポキサンチンに脱アミノ化するヒドロリアーゼのことである。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、一本鎖ＤＮＡ中のそれぞれシトシン及び／又はアデニンを脱アミノ化するのと同じくらいよく又はそれよりも良好に二本鎖ＤＮＡ中のシトシン及び／又はアデニンを脱アミノ化しうる。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、シトシン二本鎖ＤＮＡを脱アミノ化しうるが、一本鎖ＤＮＡ中のシトシンは脱アミノ化しない。二本鎖ＤＮＡは修飾感受性でありうる。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡ中の非修飾シトシン又はアデニンを脱アミノ化しうるが、１つ以上の対応する修飾されたシトシンもアデニンも脱アミノ化しない。
【0024】
本開示の文脈では、「二重鎖」及び「二本鎖」とは、２つのポリヌクレオチド鎖（例えば、別々の分子又は単一分子の空間的に分離された部分）が互いに対合するそれぞれの鎖の相補的塩基と（例えば、ワトソン－クリック塩基対で）互いに逆平行でらせん状に配置されているポリヌクレオチドの任意の立体構造のことである。対合した塩基は、互いに対して積み重ねられて、塩基のπ電子を共有させる。
【0025】
二重鎖安定性は、部分的に、２つの鎖での相補的塩基対ミスマッチ（もしあれば）の比、二重鎖での３つの水素結合を有するペア（例えば、Ｇ：Ｃ）対２つの水素結合を有するペア（例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ）の比、並びに一般的により高い安定性と関連するより高い比及びより長い鎖を有する鎖の長さと関係していることがある。二重鎖安定性は、部分的に、例えば、温度、ｐＨ、塩分、並びに／又はいずれかの緩衝液（複数可）変性剤（複数可）（例えば、ホルムアミド）、クラウディング剤（複数可）（例えば、ＰＥＧ）、洗浄剤（複数可）（例えば、ＳＤＳ）、界面活性剤（複数可）、多糖（複数可）（例えば、デキストラン硫酸）、キレート剤（複数可）（例えば、ＥＤＴＡ）、及び核酸（複数可）（例えば、サケ精子ＤＮＡ）の存在、濃度及び性質を含む周囲の状態と関係していることがある。二重鎖ポリヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ塩基、ヘアピンループ、一本鎖（５’及び／又は３’）末端を含む、１つ以上の不対塩基を含みうる。
【0026】
二重鎖ポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ基質）は、いかなる所望の長さでも持ちうる。例えば、二重鎖ポリヌクレオチドは、≦５０ヌクレオチド、１０～２００ヌクレオチド、８０～４００ヌクレオチド、５０～５００ヌクレオチド、≦５００ヌクレオチド、≦１ｋｂ、≦２ｋｂ、≦５ｋｂ又は≦１０ｋｂの長さを有しうる。二重鎖ポリヌクレオチドは、いかなる所望の数の、例えば、１００ヌクレオチドにつき≦１、１００ヌクレオチドにつき≦２、１００ヌクレオチドにつき≦３、１００ヌクレオチドにつき≦５、又は１００ヌクレオチドにつき≦１０のミスマッチ又は不対ヌクレオチドを有してよい。
【0027】
本開示の文脈では、「融合タンパク質」とは、その天然の状態では結合していない２つ以上のポリペプチド成分で構成されているタンパク質のことである。融合タンパク質は、２つ、３つ若しくは４つ又はそれよりも多い異なるタンパク質の組合せでもよい。例えば、融合タンパク質は、そのそれぞれの天然の状態では結合していない２つの天然に存在するポリペプチドを含みうる。融合タンパク質は、２つのポリペプチドを含み、そのうちの１つは天然に存在し、残りの１つは天然に存在しなくてよい。用語ポリペプチドは、２つの異種アミノ酸配列の融合物に限定されることを意図されていない。融合タンパク質は、タンパク質のＮ終端、Ｃ終端、及び／又は中間部分に付加された１つ以上の異種ドメインを有してもよい。融合タンパク質の２つの部分が「異種」である場合、その２つの部分は天然の状態では同じタンパク質の一部ではない。融合タンパク質の例は、別の酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）、抗体、マルトース結合ドメイン（ＭＢＰ）などの固定化に適した結合ドメイン、ヒスチジンタグ（「Ｈｉｓ－タグ」）、キチン結合ドメイン、アルファメーティング因子若しくはＳＮＡＰ－タグ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ（例えば、米国特許第７，９３９，２８４号及び米国特許第７，８８８，０９０号参照））、ＤＮＡ結合ドメイン、及び／又はアルブミンに融合された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを含むタンパク質であって、デアミナーゼが、任意選択的に、その他の成分（複数可）よりもＮ終端近くに又はＣ終端近くに置かれたタンパク質を含む。結合ペプチドを使用して、タンパク質試薬の製造中のデアミナーゼの可溶性又は収量を改善しうる。融合タンパク質の他の例は、デアミナーゼと異種ターゲティング配列、リンカー、エピトープタグ、蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及び／又は機能的に類似するペプチドなどの検出可能な融合パートナーの融合物を含む。融合タンパク質の成分は、１つ以上のペプチド結合、ジスルフィド結合、及び／又は他の共有結合により結合しうる。
【0028】
本開示の文脈では、「修飾されたシトシン」とは、天然に存在する及び天然には存在しない修飾を含むシトシンの任意の共有結合修飾のことである。修飾されたシトシンは、例えば、１－メチルシトシン（１ｍＣ）、２－Ｏ－メチルシトシン（ｍ２Ｃ）、３－エチルシトシン（ｅ３Ｃ）、３，Ｎ４－エチレノシトシン（ｅｔｈｙｌｅｎｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（εＣ）、３－メチルシトシン（３ｍＣ）、４－メチルシトシン（４ｍＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ＣａＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、Ｎ４－メチルシトシンン（Ｎ４ｍＣ）、及びピロロ－シトシン（ピロロ－Ｃ）を含む。修飾されたヌクレオチドの追加の例は、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｎａｍｏｄ．ｈｏｆｆｍａｎｌａｂ．ｏｒｇ．に見出しうる。
【0029】
本開示の文脈では、「天然には存在しない」とは、自然界には存在しないポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、又は組成物のことである。そのようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、又は組成物は、１つ以上の点で天然に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、又は組成物と異なっていてよい。例えば、ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は炭水化物）は、成分構成要素（例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又は糖分子）の種類及び配置が異なっていてよい。ポリマーは、それが連結されている分子（複数可）に関して天然に存在するポリマーと異なっていてよい。例えば、「天然には存在しない」タンパク質は、ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）、脂質、炭水化物、又は任意の他の分子への化学結合（例えば、ペプチド結合、リン酸結合、ジスルフィド結合、エステル結合、及びエーテル結合などを含む共有結合）を有することにより、天然に存在するタンパク質とは、その二次、三次、又は四次構造が異なる場合がある。同様に、「天然には存在しない」ポリヌクレオチド又は核酸は、その核酸の５’末端側、３’末端側、及び／又は５’末端と３’末端の間に（例えば、メチル化）１つ以上の他の修飾（例えば、付加された標識又は他の部分）を含有してもよい。「天然には存在しない」組成物は、以下の点：（ａ）自然界では結合していない成分を有する；（ｂ）自然界では見られない濃度で成分を有する；（ｃ）さもなければ天然に存在する組成物中で見られる１つ以上の成分を除く；（ｄ）自然界では見られない形態、例えば、乾燥した、凍結乾燥した、結晶性、水性を有する；及び（ｅ）自然界で見られる成分を超えた１つ以上の追加の成分（例えば、緩衝剤、洗浄剤、色素、溶媒又は保存剤）を有する、のうちの１つ以上が天然に存在する組成物とは異なってもよい。
【0030】
アミノ酸に関して、「位置」とは、アミノ終端からカルボキシ終端まで番号付けされたペプチド又はポリペプチドの一次配列中でそのようなアミノ酸が占める場所のことである。例えば、アライメントアルゴリズム（例えば、デフォルトパラメータ（例えば、期待閾値０．０５、ワードサイズ３、クエリ範囲での最大マッチ０、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップイグジステンス１１エクステンション１、及び条件付きコンポジショナルスコアマトリックス調整）又はカスタムパラメータを使用するＢＬＡＳＴ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２１５（３）：４０３～４１０頁））を使用して２つの一次配列が整列された場合に２つの位置が互いに向き合っているところでは１つの一次配列中の位置は、２つ目の一次配列中の位置と一致しうる。１つの配列中のアミノ酸位置は、モチーフの整列によるデータベース中の１つ以上の他の配列（複数可）内で特定することができる機能的に等価なモチーフ又は構造的モチーフ内の位置と一致しうる。これに類似して、ヌクレオチドに関して、「位置」とは５’末端から３’末端まで番号付けされたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中でそのようなヌクレオチドが占める場所のことである。
【0031】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の出版物、特許、又は特許出願が参照により組み込むことが明確に個々に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込む。本開示において参照される試薬は、入手可能な材料及び技法を使用して作製される、指示された供給源から入手される、並びに／又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手されてもよい。
【0032】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ
本開示は、天然に存在する及び天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに関する。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質と関係しているが、これとは異なりうる。天然に存在するタンパク質は、デアミナーゼドメインが最もＣ終末端に位置するもっと大きくマルチドメイン構造の単一ドメインとしてデアミナーゼを含むことが多い。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質の切詰め型を構成してよく、その場合、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する配列の一部に対して高度な同一性を有するが、例えば、対応する天然に存在するタンパク質の構造的及び／若しくは機能的ドメイン又はサブユニットを欠くことがある。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する酵素と比べていかなる数の挿入、欠失、又は置換を有していてもよい。例えば、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する酵素に対して１００％未満の同一性、９９％未満の同一性、９８％未満の同一性、９０％未満の同一性、８５％未満の同一性、８０％未満の同一性、７０％未満の同一性、６０％未満の同一性、５０％未満の同一性、４０％未満の同一性、３０％未満の同一性、又は２０％未満の同一性を有しうる。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、発現及び／又は精製タグを含みうる。本明細書に開示される天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質のＣ終端デアミナーゼドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、若しくは少なくとも９８％同一である、又は少なくとも９９％同一である）アミノ酸配列を有してよく、そこでは二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を有するが対応する天然に存在するタンパク質のＮ終端（たとえあっても）を含まない。一部の実施形態では、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、対応する天然に存在するタンパク質のＮ終端アミノ酸のうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、又は少なくとも１００を欠く。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、３００以下のアミノ酸長、例えば、２００以下のアミノ酸長又は１５０以下のアミノ酸長である。
本開示は、天然に存在する及び天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに関する。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質と関係しているが、これとは異なりうる。天然に存在するタンパク質は、デアミナーゼドメインが最もＣ終末端に位置するもっと大きくマルチドメイン構造の単一ドメインとしてデアミナーゼを含むことが多い。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質の切詰め型を構成してよく、その場合、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する配列の一部に対して高度な同一性を有するが、例えば、対応する天然に存在するタンパク質の構造的及び／若しくは機能的ドメイン又はサブユニットを欠くことがある。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する酵素と比べていかなる数の挿入、欠失、又は置換を有していてもよい。例えば、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在する酵素に対して１００％未満の同一性、９９％未満の同一性、９８％未満の同一性、９０％未満の同一性、８５％未満の同一性、８０％未満の同一性、７０％未満の同一性、６０％未満の同一性、５０％未満の同一性、４０％未満の同一性、３０％未満の同一性、又は２０％未満の同一性を有しうる。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、発現及び／又は精製タグを含みうる。本明細書に開示される天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、天然に存在するタンパク質のＣ終端デアミナーゼドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、若しくは少なくとも９８％同一である、又は少なくとも９９％同一である）アミノ酸配列を有してよく、そこでは二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を有するが対応する天然に存在するタンパク質のＮ終端（たとえあっても）を含まない。一部の実施形態では、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、対応する天然に存在するタンパク質のＮ終端アミノ酸のうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、又は少なくとも１００を欠く。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、３００以下のアミノ酸長、例えば、２００以下のアミノ酸長又は１５０以下のアミノ酸長である。
【0033】
一部の実施形態によれば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、配列番号１～１５２のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、転写され、翻訳され、及び／又はプロセシングされると、配列番号１～１５２のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を生じる核酸配列によりコードされていてよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、９９のいずれかに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有しうる。一部の実施形態では、天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、それに対応する天然に存在するタンパク質のＮ終端、例えば、Ｎ終端アミノ酸の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０又は少なくとも１００を欠く。配列アラインメント及び構造情報を使用して変異体を設計することが可能である。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、野生型タンパク質の断片を含有してよく、断片はデアミナーゼドメインを含有するが、野生型タンパク質のうちデアミナーゼドメインのＣ終端側及び／又はＮ終端側でありうる他のドメインを欠く。天然に存在しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼの例は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３３、４０、４９、５０、６３、９５、９６、９７、９９を含む。
【0034】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは融合タンパク質でもよい。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、どちらかの末端に精製タグ（例えば、Ｈｉｓタグ又は同類の物）を有しうる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、融合タンパク質がゲノム中で部位特異的ＣからＴ置換に影響を及ぼすことができるように、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン）又は核酸ガイドエンドヌクレアーゼのタンパク質成分（例えば、触媒活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）又はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）又はＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ））に融合してもよい。「塩基編集」の方法例は、例えば、出版物では特にＫｏｍｏｒら、（Ｎａｔｕｒｅ ５３３：４２０～４２４頁）に記載されている。
【0035】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、任意選択的に、シトシンを脱アミノ化するがアデニンを脱アミノ化しない（「ｄｓＤＮＡシトシンデアミナーゼ」）、アデニンを脱アミノ化するが、シトシンを脱アミノ化しない（「ｄｓＤＮＡアデニンデアミナーゼ」）、又はアデニンとシトシンの両方を脱アミノ化してよい（それ以外は等しい条件下では一方のほうがもう一方よりも良好な基質になりうることを認識して）。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは修飾感受性でもよい。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、シトシンを脱アミノ化するが、二本鎖ＤＮＡ中で１つ以上の修飾されたシトシンは脱アミノ化しないことがある。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、シトシンを脱アミノ化するが、５ｍＣもＮ４ｍＣも脱アミノ化しないことがある、又は二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、Ｃ及び５ｍＣを脱アミノ化するが、５ｈｍＣも５ｇｈｍＣもＮ４ｍＣも脱アミノ化しないことがある。
【0036】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物
本開示は、例えば、反応混合物を含む二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物を提供する。一部の実施形態によれば、デアミナーゼ組成物は、（ａ）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び（ｂ）二本鎖ＤＮＡを含みうる。デアミナーゼ組成物は、例えば、デアミナーゼ変異体（例えば、配列番号１～１５２の１つ以上に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有する）を含んでよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、１つ以上の他の触媒活性がなくてよい。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、所望の試験条件（例えば、時間、温度、ｐＨ、塩分、モデル基質及び／又は他の条件）、例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物の特定の使用条件を再現することを意図した又は使用範囲についての条件を表すことを意図された条件下で、それぞれの場合に、ｄｓＤＮＡを切断するヌクレアーゼがない、ｓｓＤＮＡを切断するヌクレアーゼがない、ポリメラーゼ活性がない、ＤＮＡ修飾活性がない、及び／又はプロテアーゼ活性がなくてもよい。
本開示は、例えば、反応混合物を含む二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物を提供する。一部の実施形態によれば、デアミナーゼ組成物は、（ａ）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び（ｂ）二本鎖ＤＮＡを含みうる。デアミナーゼ組成物は、例えば、デアミナーゼ変異体（例えば、配列番号１～１５２の１つ以上に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有する）を含んでよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、１つ以上の他の触媒活性がなくてよい。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、所望の試験条件（例えば、時間、温度、ｐＨ、塩分、モデル基質及び／又は他の条件）、例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物の特定の使用条件を再現することを意図した又は使用範囲についての条件を表すことを意図された条件下で、それぞれの場合に、ｄｓＤＮＡを切断するヌクレアーゼがない、ｓｓＤＮＡを切断するヌクレアーゼがない、ポリメラーゼ活性がない、ＤＮＡ修飾活性がない、及び／又はプロテアーゼ活性がなくてもよい。
【0037】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び１つ以上の二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを含む組成物は、例えば、液体、ゲル、フィルム、粉末、ケーキ、及び／又は任意の乾燥若しくは凍結乾燥形態を含む任意の望ましい形態を有しうる。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び支持物又はマトリックス、例えば、磁性材料、アガロース、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、及び／又はキチンを含む、例えば、フィルム、ゲル、ファブリック、又はビーズを含みうる。
【0038】
一部の実施形態では、反応混合物は、シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質及び二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを含みうる。二本鎖ＤＮＡ基質は、シトシン及び少なくとも１つの修飾されたシトシン、例えば、５ｆＣ、５ＣａＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ又はピロロ－Ｃを含みうる。二本鎖ＤＮＡ基質は、真核生物ＤＮＡ（例えば、植物又は動物）又は細菌性でもよい。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、哺乳動物、例えば、ヒト由来でよい。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、ヒトｃｆＤＮＡでよい。反応混合物は、本明細書に記載されるように、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ（例えば、ＴＥＴ２）及びＤＮＡベータ－グルコシルトランスフェラーゼ並びに／又はリガーゼ、ポリメラーゼ、プロテイナーゼＫ、及び／若しくは熱不安定性プロテイナーゼＫのうちの１つ以上をさらに含んでよい。反応混合物は、巻き戻し剤（例えば、ジャイレース、トポイソメラーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、又はヘリカーゼ）がなく及び／又は変性剤がないこともある。
【0039】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ方法
本開示は、デアミナーゼを使用して、例えば、ＤＮＡ中の修飾されたヌクレオチドの種類及び／又は位置を特定するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、任意の所望の長さの二本鎖ＤＮＡ基質を提供するステップを含んでよい。例えば、二本鎖ＤＮＡ基質は、≦５０ヌクレオチド、１０～２００ヌクレオチド、８０～４００ヌクレオチド、５０～５００ヌクレオチド、≦５００ヌクレオチド、≦１ｋｂ、≦２ｋｂ、≦５ｋｂ又は≦１０ｋｂの長さを有してよい。二本鎖ＤＮＡ基質は、一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は目的の他のＤＮＡの断片でよく、いかなる所望の供給源（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、植物、昆虫、微生物、ウイルス、又は合成ＤＮＡ）であっても又はそれから生じてもよい。ＤＮＡ基質は、一部の実施形態では、生体試料から（例えば、ゲノムＤＮＡ）を抽出する、及び、任意選択的に、ゲノムＤＮＡを断片化することにより調製しうる。一部の実施形態では、ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡを機械的に断片化するステップ（例えば、超音波処理、噴霧化、又は剪断により）又はＤＮＡを酵素的に断片化するステップ（例えば、二本鎖ＤＮＡ「ｄｓＤＮＡ」断片化混合物を使用して）を含んでよい。断片化用の酵素の例は、とりわけ、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｒａｓｈｅａｒ、及びＦＳシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）を含む。一部の実施形態では、脱アミノ化のためのＤＮＡはすでに断片化されていてもよい（例えば、ＦＦＰＥ試料及び循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の場合のように）。
本開示は、デアミナーゼを使用して、例えば、ＤＮＡ中の修飾されたヌクレオチドの種類及び／又は位置を特定するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、任意の所望の長さの二本鎖ＤＮＡ基質を提供するステップを含んでよい。例えば、二本鎖ＤＮＡ基質は、≦５０ヌクレオチド、１０～２００ヌクレオチド、８０～４００ヌクレオチド、５０～５００ヌクレオチド、≦５００ヌクレオチド、≦１ｋｂ、≦２ｋｂ、≦５ｋｂ又は≦１０ｋｂの長さを有してよい。二本鎖ＤＮＡ基質は、一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は目的の他のＤＮＡの断片でよく、いかなる所望の供給源（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、植物、昆虫、微生物、ウイルス、又は合成ＤＮＡ）であっても又はそれから生じてもよい。ＤＮＡ基質は、一部の実施形態では、生体試料から（例えば、ゲノムＤＮＡ）を抽出する、及び、任意選択的に、ゲノムＤＮＡを断片化することにより調製しうる。一部の実施形態では、ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡを機械的に断片化するステップ（例えば、超音波処理、噴霧化、又は剪断により）又はＤＮＡを酵素的に断片化するステップ（例えば、二本鎖ＤＮＡ「ｄｓＤＮＡ」断片化混合物を使用して）を含んでよい。断片化用の酵素の例は、とりわけ、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｒａｓｈｅａｒ、及びＦＳシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）を含む。一部の実施形態では、脱アミノ化のためのＤＮＡはすでに断片化されていてもよい（例えば、ＦＦＰＥ試料及び循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の場合のように）。
【0040】
一部の実施形態によれば、方法は、ＤＮＡ末端（例えば、断片化されたＤＮＡの末端）をポリッシュするステップを含んでよい。例えば、ＤＮＡ末端は、（ａ）もしあれば、３’オーバーハングヌクレオチドを切り取るプルーフリーディングポリメラーゼ、（ｂ）もしあれば、５’オーバーハングを埋めるプルーフリーディング及び／若しくは非プルーフリーディングポリメラーゼ、並びに／又は（ｃ）もしあれば、リン酸化されていない５’末端をリン酸化するポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）と接触させてよい。一部の実施形態では、方法は、ＤＮＡ末端（例えば、平滑末端）を非プルーフリーディングポリメラーゼと接触させて、鋳型由来ではないＡテール（例えば、アデニンを含む単一塩基オーバーハング）を３’末端に付加するステップを含んでよい。方法は、一部の実施形態によれば、１つ以上のアダプターをＤＮＡ末端にライゲートするステップを含んでよい。アダプターは、１つ以上の試料タグ、独特な分子識別子（ＵＭＩ）、修飾されたヌクレオチド、プライマー配列（例えば、シーケンシング用の）を含んでよい。一部の実施形態では、アダプターは、使用されるデアミナーゼに対する基質ではないシトシン（又はアデニン）を含んでよい。必要であれば、ポリッシング産物及び／又はライゲーション産物は、例えば、該当する場合は、酵素、未反応ヌクレオチド及び／又はアダプターからポリッシング産物又はライゲーション産物を分離するために精製してよい。
【0041】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）デアミナーゼ基質と（ｂ）グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｔ４－ＢＧＴ）及び／又は１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼを接触させて修飾されたデアミナーゼ基質を作製するステップを含んでよい。ＢＧＴは、５ｈｍＣをグルコシル化して５ｇｈｍＣを形成してもよい。ＴＥＴは５ｍＣを５ｃａＣに酸化してもよい。それに続いて亜硫酸水素ナトリウム又はアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素サブユニット３Ａ（ＡＰＯＢＥＣ３Ａ）を用いて処理した場合、修飾されたデアミナーゼ基質中５ｇｈｍＣを除くすべてのＣが脱アミノ化されると考えられる。本明細書で開示されるデアミナーゼは、脱アミノ化（例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ａを用いて）に先立ってＤＮＡを変性する必要をなくす可能性があり、メチル化感受性を提供しうる。
【0042】
方法は、シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質と二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを接触させて脱アミノ化したシトシンを含む脱アミノ化産物を作製するステップを含んでよい。二本鎖ＤＮＡ基質は、１つ以上の修飾されたシトシン、例えば、５ｆＣ、５ＣａＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ及びピロロ－Ｃ、４ｍＣ、εＣ、３ｍＣ、ｅ３Ｃ、ｍ２Ｃ、並びに１ｍＣから選択される１つ以上の修飾されたシトシンをさらに含みうる。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ基質は、脱アミノ化の前又はその最中に変性される必要はない。したがって、方法は、変性ステップなしで実行することができる。一部の実施形態では、脱アミノ化法は、シトシンを含む二本鎖ＤＮＡ基質と二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを接触させて、脱アミノ化したシトシンを含む脱アミノ化産物を作製するための反応混合物を生成するステップを含んでよい。
【0043】
脱アミノ化法は、脱アミノ化産物を増幅させて増幅産物を作製し、それによって最初の鎖中の任意の脱アミノ化したＣを増幅産物中のＴにコピーするステップをさらに含んでよい。脱アミノ化法は、非対称（又は「Ｙ」）アダプター、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５／Ｐ７アダプターを脱アミノ化産物上にライゲートし、アダプター中の配列に相補的なプライマーを使用して脱アミノ化産物を増幅するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態では、方法は、脱アミノ化産物を配列決定する又は脱アミノ化産物を増幅して増幅産物を作製し増幅産物の配列を決定して、それぞれの場合に、シーケンスリードを生み出すステップを含んでよい。脱アミノ化産物及び／又は増幅産物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５年 ３０９：１７２８頁参照）を含む任意の適切なシステムを使用して配列を決定しうる。一部の実施形態では、脱アミノ化産物は、増幅せずに、例えば、ナノポア又はＰａｃＢｉｏシーケンシングにより、直接配列を決定しうる。シーケンシングステップは、反応毎に少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１Ｍ、少なくとも１０Ｍ、少なくとも１００Ｍ、少なくとも１Ｂ又は少なくとも１０Ｂシーケンスリードを生じうる。一部の場合、リードはペアエンドリードでもよい。方法は、シーケンスリードを分析して二本鎖ＤＮＡ基質中の修飾されたシトシンを特定するステップを含んでよく、そこでは修飾されたシトシンは、デアミナーゼ抵抗性なので「Ｃ」として特定できる。
【0044】
修飾されたシトシン（例えば、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｇｈｍＣ、Ｎ４ｍＣ）により「ブロック」される又は修飾されたシトシンを脱アミノ化しない二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、修飾されたシトシンの分析のための様々な「ＥＭ－ｓｅｑ」様ワークフローにおいて使用しうる。ＥＭ－ｓｅｑの現在の実施では、一本鎖基質を好むデアミナーゼを用いる。したがって、現在のＥＭ－ｓｅｑワークフローは変性ステップがある（図３Ａ、Ｓｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０２１年 ３１：２９１～３００頁及びＶａｉｓｖｉｌａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２１年 ３１：１２８０～１２８９頁参照）。本ワークフローでは、変性ステップは取り除くことができ、それによって、ＥＭ－ｓｅｑワークフローはより速くより効率的になっている。
【0045】
脱アミノ化法例のワークフローは、図３Ｂ～Ｄに示されている。図３Ｂに図示されるように、二本鎖ＤＮＡ基質は、二本鎖ＤＮＡをＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ（例えば、ＴＥＴ２）及びＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼで前処理して、開始ＤＮＡ中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、例えば、ＭＧＹＰＤａ８２９、ＭＧＹＰＤａ０６、ＣｒＤａ０１、ＡｖＤａ０２、ＣｓＤａ０１、ＬｂｓＤａ０１、ＦｌＤａ０１、ＭＧＹＰＤａ２６、ＭＧＹＰＤａ２３、キメラ＿１０及びＡｎｃＤａ０４に対して抵抗性の形態に変換することにより調製しうる。図示されるワークフローで有用である二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、ＭＧＹＰＤａ８２９（配列番号９６）、ＭＧＹＰＤａ０６（配列番号４）、ＣｒＤａ０１（配列番号１２）、ＡｖＤａ０２（配列番号２１）、ＣｓＤａ０１（配列番号９）、ＬｂｓＤａ０１（配列番号１０）、ＦｌＤａ０１（配列番号８）、ＭＧＹＰＤａ２６（配列番号７）、ＭＧＹＰＤａ２３（配列番号６）、キメラ＿１０（配列番号９７）及びＡｎｃＤａ０４（配列番号９５）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。図示されるように、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、いかなる精製、変性又は巻き戻し剤の添加もなしで反応に添加することができる。
【0046】
図３Ｃに示されるように、二本鎖ＤＮＡ基質は、二本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼは使用せずに、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ（例えば、ＴＥＴ２）で前処理して、開始ＤＮＡ中の５ｍＣを二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、例えば、ＣｓｅＤａ０１及びＬｂＤａ０２に対して抵抗性の形態に変換することにより調製しうる。図示されるワークフローで有用である二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、ＣｓｅＤａ０１（配列番号３）及びＬｂＤａ０２（配列番号１）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。この実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、いかなる精製、変性又は巻き戻し剤の添加もなしで反応に添加することができる。
【0047】
図３Ｄに示されるように、二本鎖核酸は、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼとでもＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼとでも（修飾されたシトシンを選択された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに対して抵抗性の形態に変換する他のいかなる酵素とでも）ワークフローのどの時点でも接触させなくてよい。例えば、選択された二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、５－ヒドロキシメチルシトシン及び５－メチルシトシンによりブロックされうる。図示されたワークフローで有用である二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、ＭＧＹＰＤａ２０（配列番号１１）、ＮｓＤａ０１（配列番号２７）、及びＡｓｈＤａ０１（配列番号４０）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。
【0048】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、シトシン修飾であり一部の二本鎖ＤＮＡデアミナーゼに対して抵抗性である少なくとも１つのＮ４ｍＣ（Ｎ４－メチル－シトシン）を含んでよい。Ｎ４ｍＣを検出するのに有用である二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、配列番号１～２８のうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。例えば、Ｎ４ｍＣを検出するのに有用である二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、ＣｓｅＤａ０１（配列番号３）及びＬｂＤａ０１（配列番号１９）二本鎖ＤＮＡデアミナーゼのうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。これらの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ基質は、原核生物又は古細菌ＤＮＡであってもよく又はこれを含んでもよい。
【0049】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、「メチル－ＳＮＰ－ｓｅｑ」ワークフローで使用しうる（例えば、Ｙａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２２年；ｇｒ．２７７０８０．１２２参照）。例えば、方法は、２０２２年８月２２日提出の米国特許仮出願第６３／３９９，９７０号に記載されるように、二本鎖ＤＮＡ基質を作製するために、（ａ）ヘアピンアダプターをＤＮＡの二本鎖断片にライゲートしてライゲーション産物を作製するステップ、（ｂ）ライゲーション産物中のヘアピンアダプターの二本鎖領域に遊離の３’末端を酵素的に生成するステップ、並びに（ｃ）鎖置換又はニック翻訳ポリメラーゼ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及び修飾されたｄＣＴＰを含むｄＣＴＰフリー反応混合物中で遊離３’末端を伸長させるステップを含んでよく、前記特許出願は参照により本明細書に組み込む。修飾されたｄＣＴＰの例は、５ｍｄＣＴＰ、ピロロ－ｄＣＴＰ、及びＮ４ｍｄＣＴＰ、とりわけ、ポリメラーゼにより組み込むことができる修飾されたｄＣＴＰを含む。デアミナーゼは、ＭＧＹＰＤａ２０（配列番号１１）、ＮｓＤａ０１（配列番号２７）、ＡｓｈＤａ０１（配列番号４０）のうちのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。
【0050】
一部の実施形態によれば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、及び、任意選択的に、緩衝剤（例えば、貯蔵緩衝液、反応緩衝液）、賦形剤、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２）、タンパク質（例えば、アルブミン、酵素）、安定化剤、洗浄剤（例えば、イオン性、非イオン性、及び／又は両性イオン洗浄剤（例えば、オクトキシノール、ポリソルベート２０））、ポリヌクレオチド、細胞（例えば、無傷の、消化された、又は任意の無細胞抽出物）、生体液又は分泌物（例えば、粘液、膿）、アプタマー、クラウディング剤、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、又はさらなる多糖）、デンプン、セルロース、ガラス形成剤（例えば、凍結乾燥用）、脂質、オイル、水性媒体、支持体（例えば、ビーズ）及び／又はその（天然には存在しない）組合せの（１つ以上を含む）うちのいずれかを含みうる。組合せは、例えば、収載された成分（例えば、塩及び緩衝液）のうちの２つ以上又は単一の収載された成分の複数（例えば、２つの異なる塩又は２つの異なる糖）を含んでよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物に含まれうるタンパク質の例は、１つ以上の修飾されたシトシンの脱アミノ化感受性を変更する１つ以上の酵素（例えば、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ及び／又はＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼ）を含む。
【0051】
二本鎖ＤＮＡデアミナーゼキット
本開示は、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを含むデアミナーゼキットに関する。キットは、本明細書に記載される成分のうちのいずれを含んでもよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物又はキットは、例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び、任意選択的に、貯蔵緩衝液（例えば、緩衝剤を含む及びグリセロールを含む又は欠く）及び／又は反応緩衝液を含んでよい。デアミナーゼ組成物又はデアミナーゼキット用の反応緩衝液は、濃縮した形態でよく、緩衝液は、１種以上の添加剤（例えば、グリセロール）、１種以上の塩（例えば、ＫＣｌ）、１種以上の還元剤、ＥＤＴＡ、１種以上の洗浄剤、１種以上の非イオン性界面活性剤、１種以上のイオン性（例えば、アニオン性又は両性イオン性）界面活性剤、及び／又はクラウディング剤を含んでよい。ｄＮＴＰを含むキットは、全部で４つのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰのうちの１つ、２つ、３つを含んでよい。キットは、１種以上の修飾されたヌクレオチドをさらに含んでよい。
本開示は、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを含むデアミナーゼキットに関する。キットは、本明細書に記載される成分のうちのいずれを含んでもよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ組成物又はキットは、例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ及び、任意選択的に、貯蔵緩衝液（例えば、緩衝剤を含む及びグリセロールを含む又は欠く）及び／又は反応緩衝液を含んでよい。デアミナーゼ組成物又はデアミナーゼキット用の反応緩衝液は、濃縮した形態でよく、緩衝液は、１種以上の添加剤（例えば、グリセロール）、１種以上の塩（例えば、ＫＣｌ）、１種以上の還元剤、ＥＤＴＡ、１種以上の洗浄剤、１種以上の非イオン性界面活性剤、１種以上のイオン性（例えば、アニオン性又は両性イオン性）界面活性剤、及び／又はクラウディング剤を含んでよい。ｄＮＴＰを含むキットは、全部で４つのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰのうちの１つ、２つ、３つを含んでよい。キットは、１種以上の修飾されたヌクレオチドをさらに含んでよい。
【0052】
キットの１種以上の成分は、単一ステップ反応用の１つの容器に含まれていてよく、又は１種以上の成分は１つの容器に含まれているが、逐次使用若しくは平行使用のために他の成分とは分離されていてもよい。例えば、キットは単一チューブに２つの成分（例えば、デアミナーゼ及び貯蔵緩衝液）を含み、他の成分はすべて別々の個別チューブに含んでよく、それぞれの場合、内容物はいずれかの所望の形態（例えば、液体、乾燥、凍結乾燥）で提供される。キット中の１つのチューブは、例えば、ＤＮＡ（例えば、脱アミノ化ＤＮＡ）を受け入れ増幅するためのマスターミックスを含有してよい。例えば、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼはチューブのキャップに置かれてよく、鋳型核酸を転写するための成分はチューブの本体に置かれる。要望通りに、例えば、脱アミノ化反応が完了すると、チューブを軽く叩く、揺する、引っ繰り返す、回転させる、又は他の方法で動かして、置かれた二本鎖ＤＮＡデアミナーゼを脱アミノ化反応混合物と接触させてもよい。キットは、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼと反応緩衝液を単一チューブに又は異なるチューブに含んでもよく、単一チューブに含まれる場合、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼと緩衝液はチューブ中の同じ位置又は別々の位置に存在してもよい。例えば、キットは、上記の二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ、及び反応緩衝液（例えば、５×又は１０×緩衝液）を含んでよい。キットの内容物は、所望の方法又は工程で使用するために処方しうる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼ（例えば、ＴＥＴ２）及びＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼをさらに含んでよい、又は（ｂ）ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼをさらに含み、ＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼを含まなくてよい。一部の実施形態では、キットは、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼもＤＮＡベータグルコシルトランスフェラーゼも含まない。一部の実施形態では、キットは、５ｈｍｄＣＴＰ、５ｆｄＣＴＰ、５ｃａｄＣＴＰ、５ｍｄＣＴＰ、ピロロ－ｄＣＴＰ及びＮ４ｍｄＣＴＰから選択される修飾されたｄＣＴＰ並びに／又は鎖置換若しくはニック翻訳ポリメラーゼをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、リガーゼ、ポリメラーゼ、プロテイナーゼＫ、及び／又は熱不安定性プロテイナーゼＫをさらに含んでよい。二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、凍結乾燥する又はグリセロールを含む緩衝貯蔵液中にあってもよい。
【0053】
本開示の恩恵を受ける者にとって明らかになるように、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、様々なゲノム解析法、特に、１つ以上の修飾されたシトシンの位置及び／若しくは種類を特定する並びに／又はシトシンのメチル化状態を判定することを目標とする方法において使用しうる。他の実施形態では、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、塩基編集、すなわち、ゲノム中で部位特異的ＣからＴ置換を生み出すための融合タンパク質の成分であることが可能である。
【0054】
実施形態
本開示は、以下のすべてを含む米国特許仮出願第６３／２６４，５１３号に開示される実施形態にさらに関する。
本開示は、以下のすべてを含む米国特許仮出願第６３／２６４，５１３号に開示される実施形態にさらに関する。
【0055】
実施形態１．配列番号１～８のいずれかとの少なくとも９０％配列同一性を含み、配列番号３に１００％同一性は含まないポリペプチド。
【0056】
実施形態２．配列番号１～３のいずれかとの少なくとも９０％配列同一性を含み、配列番号３に１００％同一性は含まない、実施形態１に記載されるポリペプチド。
【0057】
実施形態３．配列番号１又は２のいずれかとの少なくとも９０％配列同一性を含む、実施形態１に記載されるポリペプチド。
【0058】
実施形態４．二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中のシトシンを配列バイアスなしで脱アミノ化することができる、実施形態１～３のいずれかに記載されるポリペプチド。
【0059】
実施形態５．一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中のシトシンを配列バイアスなしで脱アミノ化することができる、実施形態１～３のいずれかに記載されるポリペプチド。
【0060】
実施形態６．融合タンパク質を含む、実施形態１～５のいずれかのポリペプチド。
【0061】
実施形態７．ポリペプチドが凍結乾燥されている、実施形態１～６のいずれかのポリペプチド。
【0062】
実施形態８．ポリペプチドが基質上に固定化される、実施形態１～７のいずれかのポリペプチド。
【0063】
実施形態９．ポリペプチドが混合物中の１種以上の試薬と組み合わされ、混合物中の１種以上の試薬が第２のポリペプチドを含む、実施形態１～８のいずれかのポリペプチド。
【0064】
実施形態１０．第２のポリペプチドが、リガーゼ、ポリメラーゼ、メチルシトシン（ｍＣ）ジオキシゲナーゼ、ＤＮＡグルコシルトランスフェラーゼ、プロテイナーゼＫ、及び熱不安定性プロテイナーゼＫからなる群から選択される、実施形態９のポリペプチド。
【0065】
実施形態１１．混合物中の１種以上の試薬が、デアミナーゼの可逆的阻害剤をさらに含む、実施形態９～１０のいずれかのポリペプチド。
【0066】
実施形態１２．混合物がＤＮＡをさらに含む、実施形態１～１１のいずれかのポリペプチド。
【0067】
実施形態１３．（ａ）ゲノムＤＮＡを含有する反応混合物と配列バイアスのない二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）デアミナーゼと組み合わせるステップ；
（ｂ）ゲノムＤＮＡ中のシトシンの少なくとも５０％を、ｄｓＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変換する変性ステップなしでウラシルに脱アミノ化するステップ、
を含むメチローム解析のための方法。
（ｂ）ゲノムＤＮＡ中のシトシンの少なくとも５０％を、ｄｓＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変換する変性ステップなしでウラシルに脱アミノ化するステップ、
を含むメチローム解析のための方法。
【0068】
実施形態１４．（ａ）に先立って、ｍＣをヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）に変換するために、ゲノムＤＮＡに対するメチルシトシン（ｍＣ）ジオキシゲナーゼを反応混合物に添加する、実施形態１３に記載の方法。
【0069】
実施形態１５．（ａ）に先立って、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）修飾試薬を反応混合物に添加する、実施形態１３～１４のいずれかに記載の方法。
【0070】
実施形態１６．（ｂ）が、ＤＮＡデアミナーゼをプロテイナーゼＫ又は熱不安定性プロテイナーゼＫを用いて不活化するステップをさらに含む、実施形態１３～１５のいずれかに記載の方法。
【0071】
実施形態１７．（ｂ）が、変換シトシンを含有するＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、実施形態１３～１６のいずれかに記載の方法。
【0072】
実施形態１８．増幅されたＤＮＡの配列を決定するステップをさらに含む、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
【0073】
実施形態１９．ゲノムＤＮＡ中のメチルシトシン（ｍＣ）の位置を決定するステップをさらに含む、実施形態１３～１８のいずれかに記載の方法。
【0074】
実施形態２０．二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及び任意選択的に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中のシトシンを配列バイアスなしで脱アミノ化することができるデアミナーゼを含むキット。
【0075】
実施形態２１．ジオキシゲナーゼとは別の容器にメチルジオキシゲナーゼをさらに含む、実施形態２０に記載のキット。
【0076】
実施形態２２．ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）修飾酵素をジオキシゲナーゼと同じ容器に又は異なる容器にさらに含む、実施形態２０又は２１に記載のキット。
【実施例】
【0077】
［実施例１］ ＤＮＡデアミナーゼのインビトロでの発現
候補ＤＮＡデアミナーゼ遺伝子は先ずコドン最適化され、次に、隣接配列がそれぞれの末端に、特に、５’末端にはＴ７プロモーターを含む配列及び３’末端にはＴ７ターミネーターを含む配列を付加された。これらの配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）に直鎖状ｇＢｌｏｃｋとして注文された。インビトロタンパク質合成用の鋳型ＤＮＡは、鋳型及び隣接プライマーとしてｇＢｌｏｃｋを使用してＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いて作製された。ＰＣＲ産物は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製された。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１００～４００ｎｇのＰＣＲ断片を鋳型ＤＮＡとして使用し、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓインビトロタンパク質合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って使用して分析量のＤＮＡデアミナーゼを合成した。
候補ＤＮＡデアミナーゼ遺伝子は先ずコドン最適化され、次に、隣接配列がそれぞれの末端に、特に、５’末端にはＴ７プロモーターを含む配列及び３’末端にはＴ７ターミネーターを含む配列を付加された。これらの配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）に直鎖状ｇＢｌｏｃｋとして注文された。インビトロタンパク質合成用の鋳型ＤＮＡは、鋳型及び隣接プライマーとしてｇＢｌｏｃｋを使用してＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いて作製された。ＰＣＲ産物は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製された。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１００～４００ｎｇのＰＣＲ断片を鋳型ＤＮＡとして使用し、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓインビトロタンパク質合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って使用して分析量のＤＮＡデアミナーゼを合成した。
【0078】
［実施例２］ 一本鎖及び二本鎖基質上での脱アミノ化アッセイ
インビトロで発現されたＤＮＡデアミナーゼの活性を試験するため、２μｌアリコートのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ試料を、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する緩衝液で３００ｎｇのΦＸ１７４ Ｖｉｒｉｏｎ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ基質）又はΦＸ１７４ ＲＦ Ｉ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ基質）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。脱アミノ化ΦＸ１７４ ＤＮＡは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５０ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及びポジティブエレクトロスプレイイオン化法（＋ＥＳＩ）で作動する６４９５Ｃトリプル四重極質量検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ上で消化されたＤＮＡを注入することにより実施された。ＵＨＰＬＣは、メタノール及び１０ｍＭの含水酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実行した。ＭＳデータ収集は、ダイナミックマルチプルリアクションモニタリング（ＤＭＲＭ）法で実施された。それぞれのヌクレオシドは、その特異的ＭＳ／ＭＳトランジションに関連する抽出クロマトグラムで特定された：ｄＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２８．１→１１２．１で；ｄＵ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２９．１→１１３．１で；ｄｍＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４２．１→１２６．１で；及びｄＴ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４３．１→１２７．１で。既知の量のヌクレオシドを用いた外部検量線を使用して、分析された試料内でのその比が計算された。
インビトロで発現されたＤＮＡデアミナーゼの活性を試験するため、２μｌアリコートのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ試料を、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する緩衝液で３００ｎｇのΦＸ１７４ Ｖｉｒｉｏｎ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ基質）又はΦＸ１７４ ＲＦ Ｉ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ基質）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。脱アミノ化ΦＸ１７４ ＤＮＡは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５０ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及びポジティブエレクトロスプレイイオン化法（＋ＥＳＩ）で作動する６４９５Ｃトリプル四重極質量検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ上で消化されたＤＮＡを注入することにより実施された。ＵＨＰＬＣは、メタノール及び１０ｍＭの含水酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実行した。ＭＳデータ収集は、ダイナミックマルチプルリアクションモニタリング（ＤＭＲＭ）法で実施された。それぞれのヌクレオシドは、その特異的ＭＳ／ＭＳトランジションに関連する抽出クロマトグラムで特定された：ｄＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２８．１→１１２．１で；ｄＵ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２９．１→１１３．１で；ｄｍＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４２．１→１２６．１で；及びｄＴ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４３．１→１２７．１で。既知の量のヌクレオシドを用いた外部検量線を使用して、分析された試料内でのその比が計算された。
【0079】
［実施例３］ ＮＧＳ脱アミノ化アッセイ
５０ｎｇのイー・コリＣ２５６６ゲノムＤＮＡは対照の修飾されたＤＮＡと組み合わされた：
５０ｎｇのイー・コリＣ２５６６ゲノムＤＮＡは対照の修飾されたＤＮＡと組み合わされた：
【0080】
【表1】
【0081】
ＤＮＡ調製
次に、ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓマイクロＴＵＢＥ（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に移し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２装置を使用して、３００ｂｐまで剪断した。５０μｌの剪断物質はＰＣＲストリップチューブに移して、ライブラリー構築を開始した。末端修復、Ａ－テーリング及びＩｌｌｕｍｉｎａ適合性アダプターを使用するアダプターライゲーションのために製造業者の説明書に従って、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｕｌｔｒａ ＩＩ試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。ライゲートされた試料は１１０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１７μｌの水中に溶出された。
次に、ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓマイクロＴＵＢＥ（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に移し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２装置を使用して、３００ｂｐまで剪断した。５０μｌの剪断物質はＰＣＲストリップチューブに移して、ライブラリー構築を開始した。末端修復、Ａ－テーリング及びＩｌｌｕｍｉｎａ適合性アダプターを使用するアダプターライゲーションのために製造業者の説明書に従って、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｕｌｔｒａ ＩＩ試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。ライゲートされた試料は１１０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１７μｌの水中に溶出された。
【0082】
脱アミノ化
ＤＮＡは、次に、上記の通りに合成された１μｌのｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。５μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は、５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用する高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシング実行について実施された。ベースコール（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）及びデマルチプレキシング（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。ＣｓｅＤａ０１の結果は図４Ａ及び４Ｂに示されている。
ＤＮＡは、次に、上記の通りに合成された１μｌのｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。５μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は、５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用する高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシング実行について実施された。ベースコール（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）及びデマルチプレキシング（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。ＣｓｅＤａ０１の結果は図４Ａ及び４Ｂに示されている。
【0083】
［実施例４］ １－チューブ－３－酵素 ＥＭ－ｓｅｑ（ｄｓＤＮＡデアミナーゼＭＧＹＰＤａ８２９＋ ＴＥＴ２＋ ＢＧＴ）
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製し、ライブラリーは２９μｌの水中に溶出させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、０．０４ｍＭのＵＤＧ－グルコース（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、１６μｇのｍＴＥＴ２、１０ＵのＴ４－ＢＧＴ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有する５０μｌの反応容積中でＤＮＡを酸化させた。反応は、Ｆｅ（ＩＩ）溶液を最終反応濃度４０μＭまで添加することにより開始し、次に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１μｌのＭＧＹＰＤａ８２９ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して３７℃、インキュベーション時間３時間でＤＮＡを脱アミノ化した。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間及び６０℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション終了時、ＤＮＡは、７０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用して精製された。試料は１６μｌの水に溶出され、１５μｌは新たなチューブに移された。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００ ＤＮＡ分析装置で分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは配列決定され、下に記載される通りに分析された。
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製し、ライブラリーは２９μｌの水中に溶出させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、０．０４ｍＭのＵＤＧ－グルコース（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、１６μｇのｍＴＥＴ２、１０ＵのＴ４－ＢＧＴ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有する５０μｌの反応容積中でＤＮＡを酸化させた。反応は、Ｆｅ（ＩＩ）溶液を最終反応濃度４０μＭまで添加することにより開始し、次に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１μｌのＭＧＹＰＤａ８２９ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して３７℃、インキュベーション時間３時間でＤＮＡを脱アミノ化した。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間及び６０℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション終了時、ＤＮＡは、７０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用して精製された。試料は１６μｌの水に溶出され、１５μｌは新たなチューブに移された。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００ ＤＮＡ分析装置で分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは配列決定され、下に記載される通りに分析された。
【0084】
生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅソフトウェアにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ２０１２）を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。次に、整列されたリードは、２つのポストプロセスＱＣステップを受けた：１、同じ整列開始位置（５’末端）を共有するアライメントペアはＰＣＲ複写物と見なされて破棄された；２、ヒトゲノムに整列し、非ＣｐＧコンテクストに過剰のシトシン（例えば、７５ｂｐで３よりも多い）を含有したリードは、おそらく変換エラーから生じているので取り除かれた。それぞれのカバーされたシトシン位置のＴ（変換されメチル化されていない）及びＣ（変換されず修飾された）の数は、次に、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子を使用して残りの良質なアライメントから計算され、メチル化レベルはＣの数／（Ｃの数＋Ｔの数）として計算された。図３Ｃはこのワークフローを図示する。
【0085】
［実施例５］ ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼは５ｃａＣ及び５ｆＣを脱アミノ化しない
１つの修飾されたシトシンを有する（５ｃａＣ又は５ｆＣ）１５００ｎｇのオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＣ（５ｃａＣ）ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＴＴＧＧ；配列番号１５７）又はＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＣ（５ｆＣ）ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＴＴＧＧ；配列番号１５８は、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中で４時間、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼで処理され、３７℃で１時間インキュベートされた。脱アミノ化されたオリゴヌクレオチドは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製された。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５００ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及び６１３５ ＸＴ ＭＳ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣを使用して、メタノール及び１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実施した。それぞれのピークの種類はＭＳにより確かめた。それぞれのヌクレオシドの相対量は、２６０ｎｍでのそれぞれのピークの積分又はそのそれぞれのＵＶ吸収極大により決定された。結果は図４Ｃに示されている。
１つの修飾されたシトシンを有する（５ｃａＣ又は５ｆＣ）１５００ｎｇのオリゴヌクレオチド（ＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＣ（５ｃａＣ）ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＴＴＧＧ；配列番号１５７）又はＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＣ（５ｆＣ）ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＴＴＧＧ；配列番号１５８は、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中で４時間、ＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼで処理され、３７℃で１時間インキュベートされた。脱アミノ化されたオリゴヌクレオチドは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製された。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５００ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及び６１３５ ＸＴ ＭＳ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣを使用して、メタノール及び１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実施した。それぞれのピークの種類はＭＳにより確かめた。それぞれのヌクレオシドの相対量は、２６０ｎｍでのそれぞれのピークの積分又はそのそれぞれのＵＶ吸収極大により決定された。結果は図４Ｃに示されている。
【0086】
［実施例６］ ｄｓＤＮＡデアミナーゼＣｓｅＤａ０１＋ＴＥＴ２を使用する１－チューブ－２－酵素 ＥＭ－ｓｅｑ
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製し、ライブラリーは２９μｌの水中に溶出させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、及び１６μｇのｍＴＥＴ２を含有する５０μｌの反応容積中でＤＮＡを酸化させた。反応は、Ｆｅ（ＩＩ）溶液を最終反応濃度４０μＭまで添加することにより開始し、次に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１μｌのＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して３７℃、インキュベーション時間３時間でＤＮＡを脱アミノ化した。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間及び６０℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション終了時、ＤＮＡは、７０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用して精製された。試料は１６μｌの水に溶出され、１５μｌは新たなチューブに移された。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００ ＤＮＡ分析装置で分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは配列決定され、下に記載される通りに分析された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅソフトウェアにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ２０１２）を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。次に、整列されたリードは、２つのポストプロセスＱＣステップを受けた：１、同じ整列開始位置（５’末端）を共有するアライメントペアはＰＣＲ複写物と見なされて破棄された；２、ヒトゲノムに整列し、非ＣｐＧコンテクストに過剰のシトシン（例えば、７５ｂｐで３よりも多い）を含有したリードは、おそらく変換エラーから生じているので取り除かれた。次に、それぞれのカバーされたシトシン位置のＴ（変換されメチル化されていない）の及びＣ（変換されず修飾された）の数は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子を使用して残りの良質なアライメントから計算され、メチル化レベルはＣの数／（Ｃの数＋Ｔの数）として計算された。図３Ｃはこのワークフローを図示する。
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製し、ライブラリーは２９μｌの水中に溶出させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、及び１６μｇのｍＴＥＴ２を含有する５０μｌの反応容積中でＤＮＡを酸化させた。反応は、Ｆｅ（ＩＩ）溶液を最終反応濃度４０μＭまで添加することにより開始し、次に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１μｌのＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して３７℃、インキュベーション時間３時間でＤＮＡを脱アミノ化した。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間及び６０℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション終了時、ＤＮＡは、７０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用して精製された。試料は１６μｌの水に溶出され、１５μｌは新たなチューブに移された。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００ ＤＮＡ分析装置で分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは配列決定され、下に記載される通りに分析された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅソフトウェアにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ２０１２）を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。次に、整列されたリードは、２つのポストプロセスＱＣステップを受けた：１、同じ整列開始位置（５’末端）を共有するアライメントペアはＰＣＲ複写物と見なされて破棄された；２、ヒトゲノムに整列し、非ＣｐＧコンテクストに過剰のシトシン（例えば、７５ｂｐで３よりも多い）を含有したリードは、おそらく変換エラーから生じているので取り除かれた。次に、それぞれのカバーされたシトシン位置のＴ（変換されメチル化されていない）の及びＣ（変換されず修飾された）の数は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子を使用して残りの良質なアライメントから計算され、メチル化レベルはＣの数／（Ｃの数＋Ｔの数）として計算された。図３Ｃはこのワークフローを図示する。
【0087】
［実施例７］ ＤＮＡデアミナーゼＣｓｅＤａ０１はＴＥＴ２緩衝液中で極めて効率的に機能し、単一チューブ５ｍＣ酸化及びＤＮＡ脱アミノ化反応を行わせる
ＴＥＴ２緩衝液中でＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼの活性を試験するため、２μｌのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、０．０４ｍＭ、を含有する緩衝液で３００ｎｇのΦＸ１７４ Ｖｉｒｉｏｎ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ基質）又はΦＸ１７４ ＲＦ Ｉ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ基質）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。脱アミノ化ΦＸ１７４ ＤＮＡは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５０ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及びポジティブエレクトロスプレイイオン化法（＋ＥＳＩ）で作動する６４９５Ｃトリプル四重極質量検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ上で消化されたＤＮＡを注入することにより実施された。ＵＨＰＬＣは、メタノール及び１０ｍＭの含水酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実行した。ＭＳデータ収集は、ダイナミックマルチプルリアクションモニタリング（ＤＭＲＭ）法で実施された。それぞれのヌクレオシドは、その特異的ＭＳ／ＭＳトランジションに関連する抽出クロマトグラムで特定された：ｄＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２８．１→１１２．１で；ｄＵ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２９．１→１１３．１で；ｄｍＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４２．１→１２６．１で；及びｄＴ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４３．１→１２７．１で。既知の量のヌクレオシドを用いた外部検量線を使用して、分析された試料内でのその比が計算された。結果は図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、及び５Ｂに示される。
ＴＥＴ２緩衝液中でＣｓｅＤａ０１ ＤＮＡデアミナーゼの活性を試験するため、２μｌのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのナトリウム－Ｌ－アスコルビン酸、２０ｍＭのａ－ＫＧ、２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、０．０４ｍＭ、を含有する緩衝液で３００ｎｇのΦＸ１７４ Ｖｉｒｉｏｎ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ基質）又はΦＸ１７４ ＲＦ Ｉ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ基質）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。脱アミノ化ΦＸ１７４ ＤＮＡは、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ及びＤＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して定量化された。１５０ｎｇの脱アミノ化ＤＮＡを、ヌクレオシド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いてヌクレオシドまで消化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｇ７１１７Ａダイオードアレイ検出器及びポジティブエレクトロスプレイイオン化法（＋ＥＳＩ）で作動する６４９５Ｃトリプル四重極質量検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ上で消化されたＤＮＡを注入することにより実施された。ＵＨＰＬＣは、メタノール及び１０ｍＭの含水酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）からなる勾配移動相を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（２．１×１００ｍｍ、２．５μｍ）上で実行した。ＭＳデータ収集は、ダイナミックマルチプルリアクションモニタリング（ＤＭＲＭ）法で実施された。それぞれのヌクレオシドは、その特異的ＭＳ／ＭＳトランジションに関連する抽出クロマトグラムで特定された：ｄＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２８．１→１１２．１で；ｄＵ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２２９．１→１１３．１で；ｄｍＣ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４２．１→１２６．１で；及びｄＴ［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ２４３．１→１２７．１で。既知の量のヌクレオシドを用いた外部検量線を使用して、分析された試料内でのその比が計算された。結果は図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、及び５Ｂに示される。
【0088】
［実施例８］ 修飾感受性デアミナーゼはシトシンをウラシルに効率的に脱アミノ化するが、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ中の５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシンを脱アミノ化しない
５０ｎｇのイー・コリＣ２５６６ゲノムＤＮＡを、２ｎｇの非メチル化ラムダ、ファージＸＰ１２（シトシンはすべて５－メチルシトシンである）及びＴ４ファージＤＮＡ（シトシンはすべて５－ヒドロキシメチルシトシンである）対照ＤＮＡと組み合わせ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。次に、ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及びライブラリー溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。その後、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌの修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼ（例えば、ＭＧＹＰＤａ２０又はＮｓＤａ０１）を使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。ベースコール及びデマルチプレキシングは標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、イー・コリＣ２５６６ゲノム並びにラムダ、ファージＸＰ１２、及びＴ４対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。
５０ｎｇのイー・コリＣ２５６６ゲノムＤＮＡを、２ｎｇの非メチル化ラムダ、ファージＸＰ１２（シトシンはすべて５－メチルシトシンである）及びＴ４ファージＤＮＡ（シトシンはすべて５－ヒドロキシメチルシトシンである）対照ＤＮＡと組み合わせ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。次に、ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及びライブラリー溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。その後、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌの修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼ（例えば、ＭＧＹＰＤａ２０又はＮｓＤａ０１）を使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。ベースコール及びデマルチプレキシングは標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、イー・コリＣ２５６６ゲノム並びにラムダ、ファージＸＰ１２、及びＴ４対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。
【0089】
Ｒ２リードの５’末端の最初の５ｂｐは、末端修復エラーを減らすために取り除かれ、同じアライメント開始位置（５’末端）を共有する整列リードペアはＰＣＲ複写物と見なされ破棄された。次の脱アミノ化イベント（Ｃ－＞Ｔ）は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子プログラムを使用して、残りの良好なアライメント配列を参照配列と比較することによりコールされた。次に、個々のゲノム由来のカバーされたすべてのシトシンの２０ｂｐ隣接配列（１０ｂｐ上流及び１０ｂｐ下流）が抽出され、シトシン部位は、その脱アミノ化率（＞＝９０％、＞＝５０％、＞＝２５％又は＜＝１０％）に基づいて異なる群に分割された。それぞれのシトシン群の隣接配列は、脱アミノ化配列優先度を推測するために、ＷｅｂＬｏｇｏ３を使用して配列ロゴを作成するのに使用された。結果は、ＭＧＹＰＤａ２０は図６Ａ及び６Ｂに、ＮｓＤａ０１は図７Ａ及び７Ｂに、ＲｈＤａ０１＿ｅｘｔＮ１０は図８Ａ及び８Ｂに、並びにＭｍｇＤａ０２は図９Ａ及び９Ｂに示される。
【0090】
［実施例９］ 修飾感受性ｄｓＤＮＡデアミナーゼＭＧＹＰＤａ２０を使用して１－チューブ－１－酵素 ＥＭ－ｓｅｑ法をヒトでの５ｍＣを位置付けるのに適用させる
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製され、ライブラリーは１７μｌの分子グレード水に溶出された。次に、ＤＮＡは、１μｌのＭＧＹＰＤａ２０ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間３時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。５μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー、２０μＭの脱アミノ化ＤＮＡ及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を組み合わせてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定され、下に記載される通りに分析された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅソフトウェアにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ２０１２）を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。次に、整列されたリードは、２つのポストプロセスＱＣステップを受けた：１、同じ整列開始位置（５’末端）を共有するアライメントペアはＰＣＲ複写物と見なされて破棄された；２、ヒトゲノムに整列し、非ＣｐＧコンテクストに過剰のシトシン（例えば、７５ｂｐで３よりも多い）を含有したリードは、おそらく変換エラーから生じているので取り除かれた。次に、それぞれのカバーされたシトシン位置のＴ（変換されメチル化されていない）及びＣ（変換されず修飾された）の数は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子を使用して残りの良質なアライメントから計算され、メチル化レベルはＣの数／（Ｃの数＋Ｔの数）として計算された。図３Ｄはこのワークフローを図示する。結果は図１０に示される。
５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは実施例３に従って調製され、ライブラリーは１７μｌの分子グレード水に溶出された。次に、ＤＮＡは、１μｌのＭＧＹＰＤａ２０ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間３時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。５μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー、２０μＭの脱アミノ化ＤＮＡ及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を組み合わせてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定され、下に記載される通りに分析された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅソフトウェアにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ２０１２）を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列を含む複合参照配列に位置付けした。次に、整列されたリードは、２つのポストプロセスＱＣステップを受けた：１、同じ整列開始位置（５’末端）を共有するアライメントペアはＰＣＲ複写物と見なされて破棄された；２、ヒトゲノムに整列し、非ＣｐＧコンテクストに過剰のシトシン（例えば、７５ｂｐで３よりも多い）を含有したリードは、おそらく変換エラーから生じているので取り除かれた。次に、それぞれのカバーされたシトシン位置のＴ（変換されメチル化されていない）及びＣ（変換されず修飾された）の数は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子を使用して残りの良質なアライメントから計算され、メチル化レベルはＣの数／（Ｃの数＋Ｔの数）として計算された。図３Ｄはこのワークフローを図示する。結果は図１０に示される。
【0091】
［実施例１０］ ＭＧＹＰＤａ２０ ＤＮＡデアミナーゼを使用するメチル－ＳＮＰ－ｓｅｑライブラリーの調製
全ヒトゲノムメチル－ＳＮＰ－ｓｅｑシーケンシングのため、脱アミノ化効率をモニターするために中にスパイクされた４ｍｇのＮＡ１２８７８ ｇＤＮＡ及び４０ｎｇの非メチル化ラムダＤＮＡが使用された。ゲノムＤＮＡは、ＣｏｖａｒｉｓＳ２超音波処理器を使用する２５０ｂｐの超音波処理プロトコルを使用して断片化された。２つの技術的複写物が設定された。断片化されたｇＤＮＡは末端修復され、ｄＡテールされ（ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅ７５４６モジュール）、次に、ＮＥＢリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ、Ｍ０３６７）を使用してカスタムヘアピンアダプターにライゲートされた。不完全ライゲーション産物（１つのアダプターだけがライゲートされている又はアダプターがライゲートされていない断片）は、２つのエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ ｅｘｏＩＩＩ及びＮＥＢ ｅｘｏＶＩＩ）を使用して取り除かれた。ＵＤＧ及びＥｎｄｏＶＩＩＩで処理された後、両末端のヘアピンアダプター中のウラシル位置に２つのニック部位が作り出された。ニック部位は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＧＰ及び５－メチル－ｄＣＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩにより３’終端に向かって翻訳された。ニックトランスレーションは、ＤＮＡポリメラーゼＩが逆鎖上でもう一方のニックに遭遇すると二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。こうして得られた断片は、ヘアピンアダプターにライゲートされた１つの末端及びもう一方の側では平滑末端を有する。平滑末端は、ｄＡ－テールされ、メチル化Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターでライゲートされた。ライゲートされた産物は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼＭＧＹＰＤａ２０を用いて３７℃で３時間脱アミノ化された。脱アミノ化されたＤＮＡ産物はＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（ＮＥＢ、Ｍ０５９７）を使用して増幅された。こうして得られた指標を付けられたライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用に使用された。ヒトメチル－ＳＮＰ－ｓｅｑライブラリーは、１００ｂｐの対末端リードについてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００シーケンサーを使用して配列決定された。
全ヒトゲノムメチル－ＳＮＰ－ｓｅｑシーケンシングのため、脱アミノ化効率をモニターするために中にスパイクされた４ｍｇのＮＡ１２８７８ ｇＤＮＡ及び４０ｎｇの非メチル化ラムダＤＮＡが使用された。ゲノムＤＮＡは、ＣｏｖａｒｉｓＳ２超音波処理器を使用する２５０ｂｐの超音波処理プロトコルを使用して断片化された。２つの技術的複写物が設定された。断片化されたｇＤＮＡは末端修復され、ｄＡテールされ（ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅ７５４６モジュール）、次に、ＮＥＢリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ、Ｍ０３６７）を使用してカスタムヘアピンアダプターにライゲートされた。不完全ライゲーション産物（１つのアダプターだけがライゲートされている又はアダプターがライゲートされていない断片）は、２つのエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ ｅｘｏＩＩＩ及びＮＥＢ ｅｘｏＶＩＩ）を使用して取り除かれた。ＵＤＧ及びＥｎｄｏＶＩＩＩで処理された後、両末端のヘアピンアダプター中のウラシル位置に２つのニック部位が作り出された。ニック部位は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＧＰ及び５－メチル－ｄＣＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩにより３’終端に向かって翻訳された。ニックトランスレーションは、ＤＮＡポリメラーゼＩが逆鎖上でもう一方のニックに遭遇すると二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。こうして得られた断片は、ヘアピンアダプターにライゲートされた１つの末端及びもう一方の側では平滑末端を有する。平滑末端は、ｄＡ－テールされ、メチル化Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターでライゲートされた。ライゲートされた産物は、二本鎖ＤＮＡデアミナーゼＭＧＹＰＤａ２０を用いて３７℃で３時間脱アミノ化された。脱アミノ化されたＤＮＡ産物はＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（ＮＥＢ、Ｍ０５９７）を使用して増幅された。こうして得られた指標を付けられたライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用に使用された。ヒトメチル－ＳＮＰ－ｓｅｑライブラリーは、１００ｂｐの対末端リードについてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００シーケンサーを使用して配列決定された。
【0092】
［実施例１１］ ＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼでＮ４ｍＣ修飾されたＤＮＡの検出
５０ｎｇのパエニバシラス属種ＪＤＲ－２（ＣＣＧＧ標的配列）及びサルモネラ・エンテリカＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２（ＣＡＣＣＧＴ標的配列）ＤＮＡは０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及び溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。次に、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌのＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、参照配列並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列に位置付けした。Ｒ２リードの５’末端の最初の５ｂｐは、末端修復エラーを減らすために取り除かれ、同じアライメント開始位置（５’末端）を共有する整列リードペアはＰＣＲ複写物と見なされ破棄された。次の脱アミノ化イベント（Ｃ－＞Ｔ）は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子プログラムを使用して、残りの良好なアライメント配列を参照配列と比較することによりコールされた。Ｎ４ｍＣ修飾された部位は、それが大部分脱アミノ化されている（Ｃ－＞Ｔ変換率＜＝２０％）場合はコールされる。すべてのコールされたＮ４ｍＣ部位の隣接する２０ｂｐ配列が抽出され、ＷｅｂＬｏｇｏ３を使用する配列ロゴが作成された。結果は、図１１Ａ及び１１Ｂに示される。
５０ｎｇのパエニバシラス属種ＪＤＲ－２（ＣＣＧＧ標的配列）及びサルモネラ・エンテリカＦＤＡＡＲＧＯＳ＿３１２（ＣＡＣＣＧＴ標的配列）ＤＮＡは０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及び溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。次に、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌのＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、参照配列並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列に位置付けした。Ｒ２リードの５’末端の最初の５ｂｐは、末端修復エラーを減らすために取り除かれ、同じアライメント開始位置（５’末端）を共有する整列リードペアはＰＣＲ複写物と見なされ破棄された。次の脱アミノ化イベント（Ｃ－＞Ｔ）は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子プログラムを使用して、残りの良好なアライメント配列を参照配列と比較することによりコールされた。Ｎ４ｍＣ修飾された部位は、それが大部分脱アミノ化されている（Ｃ－＞Ｔ変換率＜＝２０％）場合はコールされる。すべてのコールされたＮ４ｍＣ部位の隣接する２０ｂｐ配列が抽出され、ＷｅｂＬｏｇｏ３を使用する配列ロゴが作成された。結果は、図１１Ａ及び１１Ｂに示される。
【0093】
［実施例１２］ ＣｓｅＤａ０１ ｄｓＤＮＡデアミナーゼ及びＭＧＹＰＤａ２０ ｄｓＤＮＡデアミナーゼを用いてＮ４ｍＣ及び５ｍＣ修飾されたＤＮＡの検出
５０ｎｇのＮＥＢ１５６９サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）Ｍ及びＮＥＢ３９４アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＨゲノムＤＮＡは、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。次に、ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及びライブラリー溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。次に、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌのｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。ベースコール及びデマルチプレキシングは標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、ＮＥＢ１５６９サーマス属種Ｍ及びＮＥＢ３９４アシネトバクター種Ｈを含む複合参照配列並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列に位置付けした。Ｒ２リードの５’末端の最初の５ｂｐは、末端修復エラーを減らすために取り除かれ、同じアライメント開始位置（５’末端）を共有する整列リードペアはＰＣＲ複写物と見なされ破棄された。次の脱アミノ化イベント（Ｃ－＞Ｔ）は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子プログラムを使用して、残りの良好なアライメント配列を参照配列と比較することによりコールされた。Ｎ４ｍＣ修飾はＣｓｅＤａ０１デアミナーゼ処理ライブラリーからコールされる。Ｎ４ｍＣ修飾された部位は、大部分が脱アミノ化されていない場合（Ｃ－＞Ｔ変換率＜＝２０％）はコールされる。５ｍＣ修飾検出では、差次的メチル化分析を、同一試料のＭＧＹＰＤａ２０デアミナーゼ処理ライブラリー（Ｎ４ｍＣと５ｍＣの両方を検出する）とＣｓｅＤａ０１デアミナーゼ処理ライブラリー（Ｎ４ｍＣのみを検出する）の間で行って、ＭＧＹＰＤａ２０ライブラリーでのみ検出される修飾された部位（すなわち、５ｍＣ）を特定した。差次的にメチル化された部位は、Ｍｅｔｈｙｌｋｉｔプログラムを使用して、ＳＬＩＭ補正Ｑ値＜＝０．０１及びメチル化差異＞＝８０％を用いたロジスティック回帰法によりコールされた。メチルトランスフェラーゼ認識配列を特定するため、すべての修飾された部位の４ｂｐ上流及び４ｂｐ下流を含む９ｂｐの隣接配列が抽出され、独特の９ｂｐ配列は、配列のそれぞれのペア間の差異に基づいて階層的リンケージ法を使用してクラスター化された。配列ロゴは、異なるメチルトランスフェラーゼ認識モチーフを表すそれぞれのクラスターについてＷｅｂＬｏｇｏ３を使用して作成された。
５０ｎｇのＮＥＢ１５６９サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）Ｍ及びＮＥＢ３９４アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＨゲノムＤＮＡは、０．１ｎｇのＣｐＧメチル化ｐＵＣ１９及び１ｎｇの非メチル化ラムダ対照ＤＮＡと組み合わせ、５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で５０μｌまで作製した。次に、ＤＮＡは、剪断サイズ２４０～２９０ｂｐ及びライブラリー溶出容積１５μｌの水を用いた実施例３に従って調製した。次に、ＤＮＡは、上記の通りに合成された１μｌのｄｓＤＮＡデアミナーゼを使用して、５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、３７℃、インキュベーション時間１時間で脱アミノ化された。脱アミノ化反応後、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（Ｐ８１１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１μＭのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘプライマー及び２５μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５Ｕマスターミックス（Ｍ０５９７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をＤＮＡに添加し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応試料は５０μｌの再懸濁ＮＥＢＮｅｘｔ試料精製ビーズと混合され、製造業者の説明書に従って精製された。ライブラリーは１５μｌの水中に溶出された。ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００中に挿入されたチップを使用して高感度ＤＮＡ分析により分析され定量化された。全ゲノムライブラリーは、Ｉｌｌｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットホームを使用して配列決定された。１５０サイクル（２×７５ｂｐ）のペアエンドシーケンシングはすべてのシーケンシングランについて実施された。ベースコール及びデマルチプレキシングは標準Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインを用いて実行された。生のリードは先ずＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅにより整えられ、３’末端からアダプター配列及び低質の塩基を取り除いた。アダプター／クオリティートリミングに起因する不対リードもこの工程中に取り除かれた。整えられたリード配列はＣからＴに変換され、次に、デフォルトＢｏｗｔｉｅ２設定付きのＢｉｓｍａｒｋプログラムを使用して、ＮＥＢ１５６９サーマス属種Ｍ及びＮＥＢ３９４アシネトバクター種Ｈを含む複合参照配列並びにラムダ及びｐＵＣ１９対照の完全配列に位置付けした。Ｒ２リードの５’末端の最初の５ｂｐは、末端修復エラーを減らすために取り除かれ、同じアライメント開始位置（５’末端）を共有する整列リードペアはＰＣＲ複写物と見なされ破棄された。次の脱アミノ化イベント（Ｃ－＞Ｔ）は、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化抽出子プログラムを使用して、残りの良好なアライメント配列を参照配列と比較することによりコールされた。Ｎ４ｍＣ修飾はＣｓｅＤａ０１デアミナーゼ処理ライブラリーからコールされる。Ｎ４ｍＣ修飾された部位は、大部分が脱アミノ化されていない場合（Ｃ－＞Ｔ変換率＜＝２０％）はコールされる。５ｍＣ修飾検出では、差次的メチル化分析を、同一試料のＭＧＹＰＤａ２０デアミナーゼ処理ライブラリー（Ｎ４ｍＣと５ｍＣの両方を検出する）とＣｓｅＤａ０１デアミナーゼ処理ライブラリー（Ｎ４ｍＣのみを検出する）の間で行って、ＭＧＹＰＤａ２０ライブラリーでのみ検出される修飾された部位（すなわち、５ｍＣ）を特定した。差次的にメチル化された部位は、Ｍｅｔｈｙｌｋｉｔプログラムを使用して、ＳＬＩＭ補正Ｑ値＜＝０．０１及びメチル化差異＞＝８０％を用いたロジスティック回帰法によりコールされた。メチルトランスフェラーゼ認識配列を特定するため、すべての修飾された部位の４ｂｐ上流及び４ｂｐ下流を含む９ｂｐの隣接配列が抽出され、独特の９ｂｐ配列は、配列のそれぞれのペア間の差異に基づいて階層的リンケージ法を使用してクラスター化された。配列ロゴは、異なるメチルトランスフェラーゼ認識モチーフを表すそれぞれのクラスターについてＷｅｂＬｏｇｏ３を使用して作成された。
【0094】
［実施例１３］ 候補選択
ＨＭＭＥＲ３（Ｅｄｄｙ、Ｓ．Ｒ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭ Ｓｅａｒｃｈｅｓ．ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７、ｅ１００２１９５（２０１１））シトシンデアミナーゼ配列プロファイルのリストが精選された。２９プロファイルは、Ｐｆａｍ（Ｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．ら、Ｐｆａｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ２０２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４９、Ｄ４１２～Ｄ４１９（２０２１））データベース（ＴＭ１５０６、ＬｐｘＩ＿Ｃ、ＦｄｈＤ－ＮａｒＱ、及びＡＩＣＡＲＦＴ＿ＩＭＰＣＨａｓを除外する。これらはデアミナーゼをコードしない）からのＣＤＡクラン（ＣＬ０１０９）に由来しており、１７プロファイルは、Ｉｙｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９、９４７３～９４９７頁、２０１１年）により定義されたデアミナーゼファミリーの多重配列アライメント（ＭＳＡ）から築かれ、１つのプロファイルは、Ｚｈａｎｇら、（Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ７、１８、２０１２年）に見られる多重配列アライメントから築かれた。
ＨＭＭＥＲ３（Ｅｄｄｙ、Ｓ．Ｒ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭ Ｓｅａｒｃｈｅｓ．ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７、ｅ１００２１９５（２０１１））シトシンデアミナーゼ配列プロファイルのリストが精選された。２９プロファイルは、Ｐｆａｍ（Ｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．ら、Ｐｆａｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ２０２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４９、Ｄ４１２～Ｄ４１９（２０２１））データベース（ＴＭ１５０６、ＬｐｘＩ＿Ｃ、ＦｄｈＤ－ＮａｒＱ、及びＡＩＣＡＲＦＴ＿ＩＭＰＣＨａｓを除外する。これらはデアミナーゼをコードしない）からのＣＤＡクラン（ＣＬ０１０９）に由来しており、１７プロファイルは、Ｉｙｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９、９４７３～９４９７頁、２０１１年）により定義されたデアミナーゼファミリーの多重配列アライメント（ＭＳＡ）から築かれ、１つのプロファイルは、Ｚｈａｎｇら、（Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ７、１８、２０１２年）に見られる多重配列アライメントから築かれた。
【0095】
一部の候補配列は、Ｉｙｅｒら、（２０１１）及びＺｈａｎｇら、（２０１２）に収載されるＭＳＡから直接選択された。他の候補配列は、６つの異なるデータベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｍｇｎｉｆｙ、ＩＭＧ／ＶＲ、ＩＭＧ／Ｍ、廃水処理植物メタゲノム、及びＧｅｎＢａｎｋ（それぞれ、Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．ＵｎｉＰｒｏｔ：ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ｉｎ ２０２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４９、Ｄ４８０～Ｄ４８９（２０２１）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ａ．Ｌ．ら、ＭＧｎｉｆｙ：ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎ ２０２０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４８、Ｄ５７０～Ｄ５７８（２０２０）；Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ、Ｄ．ら、ＩＭＧ／ＶＲ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５、ｇｋｗ１０３０（２０１７）；Ｃｈｅｎ、Ｉ．Ｍ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ＩＭＧ／Ｍ ｄａｔａ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｖ．６．０：ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４９、Ｄ７５１～Ｄ７６３（２０２１）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、Ｃ．Ｍ．ら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｏｖｅｒ １０００ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２、２００９（２０２１）；及びＤａ、Ｂ．ら、ＧｅｎＢａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１、（２０１３））に対する上記のプロファイルのｈｍｍｓｅａｒｃｈヒットから選択された。
【0096】
試験されたデアミナーゼの大半が、さらに大きなタンパク質との融合物として、例えば、多形性毒素系の一部として見出された。デアミナーゼドメインの境界を確定するために、ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２（Ｊｕｍｐｅｒ、Ｊ．ら、Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ．Ｎａｔｕｒｅ １～１１（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２１－０３８１９－２）構造予測が作成され可視化された。Ｎ終端切詰め部位は一般には、デアミナーゼドメインのヘリックス１前のいくつかのアミノ酸で選択された。
【0097】
便宜上、それぞれのスクリーニングされた配列は短い名前が付けられた。名前は恣意的であるが、その配列のデータベース又は起源の種にどういうわけか関係している。Ｄａ＝デアミナーゼ、ＭＧＹＰ＝Ｍｇｎｉｆｙタンパク質、Ｈｍ＝ホットメタゲノム、ＶＲ＝ＩＭＧ／ＶＲ、ＷＷＴＰ＝廃水処理植物、キメラ＝キメラ配列、Ａｎｃ＝先祖配列再構築。他の接頭辞は大部分が、メタゲノムデータの供給源生物又は供給源環境の名称から得られる２文字又は３文字である。一部の配列は、形態ｅｘｔＮ＃、ｅｘｔＣ＃、ｄ＃、Ｃｄ＃の接頭辞又は接尾辞も有しており、これは、名称が添付されていない候補と比べて、それぞれ残基の指示された数のＮ終端伸長、Ｃ終端伸長、Ｎ終端欠失、及びＣ終端欠失を示す。
【0098】
アミノ酸配列アライメントはすべてグローバルペアモードを使用するＭＡＦＦＴ（ｖ７．４９０）（Ｋａｔｏｈ、Ｋ．＆Ｓｔａｎｄｌｅｙ、Ｄ．Ｍ．ＭＡＦＦＴ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ Ｕｓａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３０、７７２～７８０頁（２０１３））を使用して計算された。系図は、ｒａｘｍｌ－ｎｇ（ｖ．１．１）（Ｋｏｚｌｏｖ、Ａ．Ｍ．、Ｄａｒｒｉｂａ、Ｄ．Ｆｌｏｕｒｉ、Ｔ．Ｍｏｒｅｌ、Ｂ．＆Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ、Ａ．ＲＡｘＭＬ－ＮＧ：ａ ｆａｓｔ、ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３５、４４５３～４４５５頁（２０１９））を使用して作成された。先祖配列再構築は、ｒａｘｍｌ－ｎｇ（ｖ．１．１）を使用して系統樹から構築された。
【0099】
［実施例１４］ 要約表
２９のデアミナーゼについてのアッセイ結果は下の表１に示されており、そこではＡＰＯＢＥＣ３Ａ（一本鎖ＤＮＡデアミナーゼ）は負の対照としての働きをする。表中のその他の２８のデアミナーゼ（二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ）はすべて二本鎖ＤＮＡ基質に対して有意な活性を有する。
２９のデアミナーゼについてのアッセイ結果は下の表１に示されており、そこではＡＰＯＢＥＣ３Ａ（一本鎖ＤＮＡデアミナーゼ）は負の対照としての働きをする。表中のその他の２８のデアミナーゼ（二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ）はすべて二本鎖ＤＮＡ基質に対して有意な活性を有する。
【0100】
本明細書に開示される二本鎖ＤＮＡデアミナーゼは、例えば、下の表２に示される応用を含む、数多くの方法、工程、及びワークフローで使用しうる。脱アミノ化産物は、１つ以上の修飾されたシトシンを含有することがあり、例えば、そこでは、基質ｄｓＤＮＡはそのような修飾されたシトシンを含んでいたのであり、作動的デアミナーゼはそのような修飾されたシトシンを脱アミノ化しない又は不十分にしか脱アミノ化しない。収載された方法／応用のそれぞれが、（ａ）（ｉ）脱アミノ化産物を配列決定する、及び／又は（ｉｉ）脱アミノ化産物を増幅して（例えば、ＰＣＲにより）、増幅産物を作製し、増幅産物を配列決定して、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）のそれぞれにおいて、シーケンスリードを作製するステップ、並びに（ｂ）任意選択的にシーケンスリードからｄｓＤＮＡ基質において修飾されたシトシンの種類及び／又は位置を判定するステップをさらに含みうる。
【0101】
１００を超えるデアミナーゼについてのスクリーニング結果は下の表３に示されており、そこではＡＰＯＢＥＣ３Ａ（一本鎖ＤＮＡデアミナーゼ）は負の対照としての働きをする。多くが、試験された条件下で二本鎖ＤＮＡデアミナーゼ活性を有することが観察された。試験された酵素の関連性は、図１に図示されており、この観点では、試験された特定の条件で限られた又は中程度の活性を示したデアミナーゼは、代替の又は最適化された条件下ではより高度な活性を有しうる。
【0102】
本明細書で開示されるある特定の二本鎖ＤＮＡデアミナーゼの名称及び配列番号は、２０２２年１１月２４日提出の米国特許仮出願第６３／２６４，５１３号に含まれる対応する名称と一緒に表４に示されている。
【0103】
【表2】
【0104】
【表3】
【0105】
【表4】
【0106】
【表5】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】