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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】改善された等温増幅
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20241112BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241112BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531420
(86)(22)【出願日】2022-11-23
(85)【翻訳文提出日】2024-07-09
(86)【国際出願番号】 AU2022051403
(87)【国際公開番号】W WO2023092178
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】2021903771
(32)【優先日】2021-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524197150
【氏名又は名称】ジェネティック シグネチャーズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，ダグラス
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR75
4B063QR76
4B063QR77
4B063QR79
4B063QS24
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
標的核酸のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）の偽陽性の発生を低減させ、効率を増加させ、及び／又は感度を増加させる。
【解決手段】
標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；ｄＮＴＰ；鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；逆転写酵素；ＲＮＡポリメラーゼ；及びｒＮＴＰ並びに任意選択で核酸結合色素又はプローブを合わせて、ＬＡＭＰ試薬ミックスを形成すること、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と、標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートし、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰの不存在下で実施される同じ増幅と比較して効率及び／又は感度が増加することを含む方法。
【選択図】なし
標的核酸のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）の偽陽性の発生を低減させ、効率を増加させ、及び／又は感度を増加させる。
【解決手段】
標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；ｄＮＴＰ；鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；逆転写酵素；ＲＮＡポリメラーゼ；及びｒＮＴＰ並びに任意選択で核酸結合色素又はプローブを合わせて、ＬＡＭＰ試薬ミックスを形成すること、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と、標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートし、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰの不存在下で実施される同じ増幅と比較して効率及び／又は感度が増加することを含む方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）の偽陽性の発生を低減させ、効率を増加させ、及び／又は感度を増加させる方法であって、ａ）
ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、前記Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又は前記Ｆ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；及び
ｉｖ）ｒＮＴＰ；並びに
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を合わせてＬＡＭＰ試薬ミックスを形成すること、
ｂ）前記ＬＡＭＰ試薬ミックスを前記標的核酸と、前記標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートし、前記プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰの不存在下で実施される同じ増幅と比較して効率及び／又は感度が増加すること
を含む方法。
【請求項2】
前記プローブは、前記標的に特異的な蛍光プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記プロモーター配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｒＮＴＰの濃度は、約０．２５ｍＭ～約２．５ｍＭであり、ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、反応当たり約７．５単位～反応当たり約５０単位である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＬＡＭＰ試薬ミックスは、グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＧｕＨＣｌは、少なくとも約３０ｍＭの濃度におけるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記標的核酸は、重亜硫酸塩処理される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記複数のＬＡＭＰプライマーは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記ＬＦプライマー及び前記ＬＢプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｆ３プライマー及び前記Ｂ３プライマーの両方は、５’末端におけるプロモーター配列を含み、前記プロモーター配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｆ３プライマーは、５’末端におけるプロモーター配列を含み、前記プロモーター配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項13】
前記標的核酸は、病原体に特異的なＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記病原体は、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細菌は、サルモネラ属種（Salmonella spp）、ボルデテラ属種（Bordetella spp）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）、クロストリジウム属種（Clostridium spp）、クラミジア属種（Chlamydia spp）、クラミドフィラ属種（Chlamydophila spp）、リステリア属種（Listeria spp）；リンフォグラヌローマ属種（Lymphogranuloma spp）、シゲラ属種（Shigella spp）、ナイセリア属種（Neisseria spp）、スタフィロコッカス属種（Staphylococcus spp）、ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp）、リステリア属種（Listeria spp）、リーシュマニア属種（Lieshmania spp）、バチルス属種（Bacillus spp）、ボレリア属種（Borellia spp）、リケッチア属種（Ricketssia spp）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp）、ガーデネラ属種（Gardenella spp）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp）、エシェリキア属種（Escherichia spp）、ヘリコバクター属種（Helicobacter spp）、クレブシエラ属種（Klebsiella spp）、レジオネラ属種（Legionella spp）、マイコバケリウム属種（Mycobacerium spp）、マイコプラズマ属種（Mycoplasma spp）、モラキセラ属種（Moraxella spp）、パスツレラ属種（Pasteurella spp）、ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp）、トレポネーマ属種（Treponema spp）、ウレアプラズマ属種（Ureaplasma spp）、ビブリオ属種（Vibrio sp）、エルモナス属種（Aermonas spp）、及びエルシニア属種（Yersinia spp）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ウイルスは、パレコウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス科（togaviridae）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、ヘペウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、レトロウイルス オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、ハンタウイルス科（Hantaviridae）及びデルタウイルスから選択される、請求書１４に記載の方法。
【請求項17】
前記コロナウイルスは、コロナウイルスＨＫＵ－１、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３／２２９Ｅ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求書１６に記載の方法。
【請求項18】
前記寄生虫は、ブラストシスティス属種（Blastocystis spp）、ジアルジア属種（Giardia spp）、クリプトスポリジウム属種（Cryptosporidium spp）、サイクロスポラ属種（Cyclospora spp）、ブラストシスティス属種（Blastocystis spp）、ジエントアメーバ属種（Dientamoeba spp）、エントアメーバ属種（Entamoeba spp）、クリプトコッカス属種（Cryptococcus spp）、エンテロシトゾーン属種（Enterocytozoon spp）、エンセファリトゾーン属種（Encephalitozoon spp）、バベシア属種（Babesiaspp）；リーシュマニア属種（Leishmania spp）、シストソーマ属種（Schistosoma spp）、トリパノソーマ属種（Trypanosoma spp）、トリキモナス属種（Trichimonas spp）、トレポネーマ属種（Treponemaspp）、及びプラスムドイウム属種（Plasmdoium spp）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記真菌は、アスペルギルス属種（Aspergillus spp）、カンジダ属種（Candida spp）、ヒストプラズマ属種（Histoplasma spp）、フザリウム属種（Fusariumspp）、ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp）、パラコクコイデス属種（Paracoccoides spp）、コクシジオイデス属種（Coccidioides spp）、及びスケドスポリウム属種（Scedosporium spp）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
前記ＬＡＭＰ反応の前記感度は、少なくとも約１０％～約３０％だけ増加される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＬＡＭＰ反応の前記効率は、少なくとも約５％～約２０％だけ増加される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、マルチプレックス反応であって、ステップａ）において、第２の標的核酸用の第２の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーを含む第２の複数のＬＡＭＰプライマーを合わせることを含むマルチプレックス反応である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを各々含むＦ３プライマー及びＢ３プライマー、又は５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーと、前記標的核酸に相補的な少なくとも１つの配列とを含む複数のＬＡＭＰプライマー。
【請求項24】
ループ介在等温増幅反応（ＬＡＭＰ）反応を使用して標的核酸を検出するためのキットであって、ｉ）前記標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、前記Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又は前記Ｆ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）ｒＮＴＰ；及び
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を含むキット。
【請求項25】
前記プローブは、前記標的に特異的な蛍光プローブである、請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
前記標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ特異的病原体である、請求項２４又は２５に記載のキット。
【請求項27】
前記複数のＬＡＭＰプライマーは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーをさらに含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項28】
前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記ＬＦプライマー及び前記ＬＢプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない、請求項２７に記載のキット。
【請求項29】
前記ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、マルチプレックス反応である、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項30】
第２の標的核酸用の第２の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーを含む第２の複数のＬＡＭＰプライマーをさらに含む、請求項２９に記載のキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
[001] 本発明は、等温増幅反応を改善するための方法及びキットに関する。特に、本発明は、複数のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）プライマーを用いることにより、ＬＡＭＰ反応の効率及び／又は感度を増加させるための方法及びキットであって、ＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む方法及びキットに関する。
[001] 本発明は、等温増幅反応を改善するための方法及びキットに関する。特に、本発明は、複数のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）プライマーを用いることにより、ＬＡＭＰ反応の効率及び／又は感度を増加させるための方法及びキットであって、ＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む方法及びキットに関する。
【0002】
関連出願の相互参照
[002] 本出願は、参照により全体として組み込まれる２０２１年１１月２３日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０２１９０３７７１号の優先権を主張する。
[002] 本出願は、参照により全体として組み込まれる２０２１年１１月２３日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０２１９０３７７１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【0003】
背景
[003] サンプル中の核酸標的配列の検出は、通常、存在するＤＮＡの量が測定可能なほど多くなるまで、増幅されるべき標的配列を要求する。ＲＮＡ標的配列、例えば、ウイルスＲＮＡの検出は、増幅前にＲＮＡのＤＮＡへの転写を付加的に要求する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸増幅及び核酸検出法における中心的役割を担っている。しかしながら、ＰＣＲの１つの欠点は、ＤＮＡ変性を可能とし、ＤＮＡ断片を増幅させるために数秒～数分ごとに段階的に反応ミックスの温度を変更し、変性及び増幅のサイクルを複数回繰り返すためのサーマルサイクラーの必要性である。
[003] サンプル中の核酸標的配列の検出は、通常、存在するＤＮＡの量が測定可能なほど多くなるまで、増幅されるべき標的配列を要求する。ＲＮＡ標的配列、例えば、ウイルスＲＮＡの検出は、増幅前にＲＮＡのＤＮＡへの転写を付加的に要求する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸増幅及び核酸検出法における中心的役割を担っている。しかしながら、ＰＣＲの１つの欠点は、ＤＮＡ変性を可能とし、ＤＮＡ断片を増幅させるために数秒～数分ごとに段階的に反応ミックスの温度を変更し、変性及び増幅のサイクルを複数回繰り返すためのサーマルサイクラーの必要性である。
【0004】
[004] 等温増幅反応は、定温における標的核酸の検出を可能とし、したがってサーマルサイクリングの必要性により拘束されない。種々の等温増幅法が存在し、それらは全ていくつかの共通の特徴を共有する。例えば、ＤＮＡ鎖は熱変性されないため、等温法は、プライマー結合及び増幅反応の開始を可能とするための鎖置換活性を有するポリメラーゼに依存する。等温増幅法は、疾患のポイントオブケア診断及び市販の診断プラットフォームに適用されており、多大な成功を収めている。
【0005】
[005] ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、精巧な設備を要求せずに標的核酸を検出するために設計された等温増幅法である。ＬＡＭＰ反応は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ又はＲＮＡ標的核酸の区別される領域を認識するように特異的に設計される４～６つの異なるプライマーのセットを使用する。反応は、限られたリソースを用いて、例えば、インキュベーションのための水浴（典型的には６０～７０℃）を使用して実施され得、陽性結果は、濁度、比色変化、ラテラルフローリードアウト、蛍光ＤＮＡ結合色素又は標識プローブの添加により目視的に同定され得る。ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを臨床及び住宅環境において迅速に検出するためにＬＡＭＰ反応が採用されてきた。
【0006】
[006] 多くの等温法及びキットが目下存在するが、改善された効率及び／又は感度を有する既存の方法及びキットの改善が依然として必要とされている。
【0007】
[007] 本発明者らは、既存の等温増幅法の効率及び／又は感度を改善するための方法及びキットを開発した。特に、本発明者らは、予想外に、ＬＡＭＰの効率及び／又は感度が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＬＡＭＰプライマーを添加することにより、及びｒＮＴＰをＲＮＡポリメラーゼとともに添加することにより、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＬＡＭＰプライマー、ｒＮＴＰ、及びＲＮＡポリメラーゼの不存在下の同じ反応（同じ条件下）と比較して改善され得ることを見出した。
【0008】
[008] 本明細書に含められた文献、行為、材料、装置、物品などの任意の考察は、本技術に文脈を提供する目的のためのものにすぎない。これらの事項のいずれか又は全てが、本明細書の各請求項の優先日前に存在するために従来技術基準の一部を形成し、又は本技術に関連する分野における共通一般知識であったことの承認と解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
概要
[009] 第１の態様において、標的核酸のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）の偽陽性の発生を低減させ、効率を増加させ、及び／又は感度を増加させる方法であって、
ａ）
ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；及び
ｖｉ）ｒＮＴＰ並びに
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を合わせてＬＡＭＰ試薬ミックスを形成すること、
ｂ）ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と、標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートし、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰの不存在下で実施される同じ増幅と比較して効率及び／又は感度が増加すること
を含む方法が提供される。
[009] 第１の態様において、標的核酸のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）の偽陽性の発生を低減させ、効率を増加させ、及び／又は感度を増加させる方法であって、
ａ）
ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；及び
ｖｉ）ｒＮＴＰ並びに
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を合わせてＬＡＭＰ試薬ミックスを形成すること、
ｂ）ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と、標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートし、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰの不存在下で実施される同じ増幅と比較して効率及び／又は感度が増加すること
を含む方法が提供される。
【0010】
[010] 一実施形態において、プローブは、標的に特異的であり、例えば、Easybeacon（商標）プローブ（Pentabase製）である。
【0011】
[011] 一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターは、ＬＡＭＰプライマーの５’末端に存在する。
【0012】
[012] 標的核酸の増幅に好適な条件は、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約６０℃～約７０℃の温度で約１０分間～約４０分間インキュベートすることを含み得る。
【0013】
[013] 標的核酸の増幅に好適な条件は、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約６５℃の温度で約１０分間～約４０分間インキュベートすることを含み得る。
【0014】
[014] 一実施形態において、標的核酸の増幅に好適な条件は、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約４２℃の温度で約１分間～約１０分間インキュベートし、次いでＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約６０℃～約７０℃の温度で約１０分間～約４０分間さらにインキュベートすることを含み得る。
【0015】
[015] 一実施形態において、標的核酸の増幅に好適な条件は、ＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約４２℃の温度で約１分間～約１０分間インキュベートし、次いでＬＡＭＰ試薬ミックスを標的核酸と約６５℃の温度で約１０分間～約４０分間さらにインキュベートすることを含み得る。
【0016】
[016] 一部の実施形態において、プロモーターの配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される。一部の実施形態において、増幅を改善するためにランダムヌクレオチドがプロモーター配列の５’又は３’末端に付加され得る。
【0017】
[017] 一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号５の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、及び配列番号６の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列から選択される。
【0018】
[018] 一部の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及びＥ．コリ（E.coli）ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【0019】
[019] 一部の実施形態において、ＬＡＭＰ試薬ミックス中のｒＮＴＰの濃度は、約０．２５ｍＭ、好ましくは、２．５ｍＭ未満であり、ＬＡＭＰ試薬ミックス中のＲＮＡポリメラーゼの濃度は、反応当たり約７．５単位、好ましくは、反応当たり５０単位未満である。
【0020】
[020] 一実施形態において、ＬＡＭＰ試薬ミックスは、グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を含む。ＬＡＭＰ試薬ミックス中のＧｕＨＣｌの濃度は、少なくとも約３０ｍＭ～約６０ｍＭである。
【0021】
[021] 一部の実施形態において、標的核酸は、重亜硫酸塩処理される。
【0022】
[022] 一部の実施形態において、標的核酸は、その野生型（ＷＴ）形態である。
【0023】
[023] 一実施形態において、複数のＬＡＭＰプライマーは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーを含む。
【0024】
[024] 一部の実施形態において、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない。
【0025】
[025] 一部の実施形態において、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーの両方は、５’末端におけるプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される。
【0026】
[026] 一部の実施形態において、Ｆ３プライマーは、５’末端におけるプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、配列番号１のＴ７プロモーター、配列番号２～４のＴ３プロモーター、及び配列番号５～６のＳＰ６プロモーターから選択される。
【0027】
[027] 一部の実施形態において、Ｆ３プライマー又はＢ３プライマーは、５’末端におけるプロモーター配列を含有し、プロモーター配列は、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号５の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、及び配列番号６の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列から選択される。
【0028】
[028] 標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。一部の実施形態において、ＲＮＡ又はＤＮＡは、病原体に特異的である。
【0029】
[029] 病原体は、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫から選択される。
【0030】
[030] 細菌は、サルモネラ属種（Salmonella spp）、ボルデテラ属種（Bordetella spp.）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）、クロストリジウム属種（Clostridium spp）、クラミジア属種（Chlamydia spp）、クラミドフィラ属種（Chlamydophila spp）、リステリア属種（Listeria spp）；リンフォグラヌローマ属種（Lymphogranuloma spp）、シゲラ属種（Shigella spp）、ナイセリア属種（Neisseria spp.）、スタフィロコッカス属種（Staphylococcus spp）、ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp）、リステリア属種（Listeria spp）、リーシュマニア属種（Lieshmania spp）、バチルス属種（Bacillus spp）、ボレリア属種（Borellia spp）、リケッチア属種（Ricketssia spp）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp）、ガーデネラ属種（Gardenella spp）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp）、エシェリキア属種（Escherichia spp）、ヘリコバクター属種（Helicobacter spp.）、クレブシエラ属種（Klebsiella spp）、レジオネラ属種（Legionella spp）、マイコバクテリウム属種（Mycobacerium spp）、マイコプラズマ属種（Mycoplasma spp）;モラキセラ属種（Moraxella spp）、パスツレラ属種（Pasteurella spp）、ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp）、トレポネーマ属種（Treponema spp）、ウレアプラズマ属種（Ureaplasma spp）、ビブリオ属種（Vibrio sp）、エルモナス属種（Aermonas spp）、及びエルシニア属種（Yersinia spp）から選択され得る。
【0031】
[031] ウイルスは、パレコウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス科（togaviridae）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、ヘペウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、レトロウイルス オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、
フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、及びハンタウイルス科（Hantaviridae）並びにデルタウイルスから選択され得る。一実施形態において、コロナウイルスは、コロナウイルスＨＫＵ－１、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３／２２９Ｅ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、及びハンタウイルス科（Hantaviridae）並びにデルタウイルスから選択され得る。一実施形態において、コロナウイルスは、コロナウイルスＨＫＵ－１、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３／２２９Ｅ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0032】
[032] 寄生虫は、ブラストシスティス属種（Blastocystis spp）、ジアルジア属種（Giardiaspp）、クリプトスポリジウム属種（Cryptosporidium spp）、サイクロスポラ属種（Cyclospora spp）、ブラストシスティス属種（Blastocystis spp）、ジエントアメーバ属種（Dientamoeba spp）、エントアメーバ属種（Entamoeba spp）、クリプトコッカス属種（Cryptococcus spp）、エンテロシトゾーン属種（Enterocytozoon spp）、エンセファリトゾーン属種（Encephalitozoon spp）、バベシア属種（Babesiaspp）、リーシュマニア属種（Leishmania spp）、シストソーマ属種（Schistosoma spp）、トリパノソーマ属種（Trypanosoma spp）；トリキモナス属種（Trichimonas spp）、トレポネーマ属種（Treponemaspp.）、及びプラスムドイウム属種（Plasmdoium spp）から選択され得る。
【0033】
[033] 真菌は、アスペルギルス属種（Aspergillus spp）、カンジダ属種（Candidaspp）、ヒストプラズマ属種（Histoplasma spp）、フザリウム属種（Fusarium spp）、ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp）、パラコクコイデス属種（Paracoccoides spp）、コクシジオイデス属種（Coccidioides spp）、及びスケドスポリウム属種（Scedosporium spp）から選択され得る。
【0034】
[034] 一部の実施形態において、ＬＡＭＰ反応の感度は、少なくとも約１０％～約３０％だけ増加される。一実施形態において、ＬＡＭＰ反応の感度は、約１８分間未満の単一コピー検出レベルに至るまで改善される。
【0035】
[035] 一部の実施形態において、ＬＡＭＰ反応の効率は、少なくとも約５％～約２０％だけ増加される。
【0036】
[036] 一部の実施形態において、ＬＡＭＰは、マルチプレックス反応であって、ステップａ）において、第２の標的核酸用の第２の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーを含む第２の複数のＬＡＭＰプライマーを合わせることを含むマルチプレックス反応である。
【0037】
[037] 一実施形態において、標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを各々含むＦ３プライマー及びＢ３プライマー、又はＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーと、標的核酸に相補的な少なくとも１つの配列とを含む複数のＬＡＭＰプライマーが提供される。
【0038】
[038] 第２の態様において、本発明は、標的核酸を用いるループ介在等温増幅反応（ＬＡＭＰ）反応を検出するためのキットであって、
ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；
ｖｉ）ｒＮＴＰ；及び
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を含むキットに関する。
ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー；
ｉｉ）ｄＮＴＰ；
ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ；
ｉｖ）逆転写酵素；
ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；
ｖｉ）ｒＮＴＰ；及び
ｖｉｉ）任意選択で核酸結合色素又はプローブ
を含むキットに関する。
【0039】
[039] ＬＡＭＰ反応産物は、沈殿ピロリン酸マグネシウムの目視試験又は濁度モニタリング、インターカレートフルオロフォア又は蛍光プローブを用いる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の蛍光検出、ピロリン酸変換を介する生物発光レポーティングを含む当業者に公知の種々の方法を使用し、及びラテラルフロー装置の使用により検出され得る。
【0040】
[040] 一実施形態において、第２の態様のキットは、ＲＮＡ又はＤＮＡ特異的病原体を検出する。
【0041】
[041] 複数のＬＡＭＰプライマーは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーをさらに含み得る。
【0042】
[042] 一部の実施形態において、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない。
【0043】
[043] 一実施形態において、第２の態様のキットは、マルチプレックスＬＡＭＰ反応を検出するためのものである。
【0044】
[044] 一部の実施形態において、マルチプレックスＬＡＭＰ反応を検出するための第２の態様のキットは、第２の標的核酸用の第２の複数のＬＡＭＰプライマーであって、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＦ３プライマーを含む第２の複数のＬＡＭＰプライマーをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【0045】
定義
[045] 本明細書全体にわたり、文脈が特に要求しない限り、語「含む（comprise）」、又は変形、例えば、「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」は、記述される要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、いかなる他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群も除外しないと理解される。
[045] 本明細書全体にわたり、文脈が特に要求しない限り、語「含む（comprise）」、又は変形、例えば、「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」は、記述される要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、いかなる他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群も除外しないと理解される。
【0046】
[046] 文脈が特に要求し、又は特に別段の記述がない限り、単数の整数、ステップ又は要素として本明細書に引用される本発明の整数、ステップ、又は要素は、引用される整数、ステップ又は要素の単数形及び複数形の両方を明確に包含する。
【0047】
[047] 本明細書の文脈において、用語「a」、「an」及び「the」は、その冠詞の文法的対象物の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「サンプル」への言及は、１つのサンプル、又は２つ以上のサンプルを意味する。
【0048】
[048] 「少なくとも１つ」は、本明細書において使用される場合、１つ以上、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上に関する。
【0049】
[049] 本明細書の文脈において、用語「約」は、数字又は値への言及が絶対的な数字又は値と解釈されるべきではなく、典型的な許容誤差又は装置限界内を含む、当業者が当技術分野に従って理解するものに基づくその数字又は値の上下の許容変動を含むことを意味する。換言すると、用語「約」の使用は、同じ機能又は結果を達成する文脈において当業者が引用値と同等であるとみなす範囲又は概算値を指すと理解される。
【0050】
[050] 本明細書において使用される語句「及び／又は」は、そのように等位接続される要素、すなわち、ある場合には接続されて存在し、他の場合には接続されずに存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。非限定的な例として、「効率及び／又は感度」への言及は、一実施形態においては効率のみを指し、別の実施形態においては感度のみを指し、さらに別の実施形態においては、効率及び感度の両方を指し得る。
【0051】
[051] 本明細書において使用される用語「等温増幅」は、プロセスの間に形成される任意の二本鎖の鎖を分離するために熱を使用せずに標的核酸を反復的にコピーするプロセスを指す。一部の実施形態において、「等温増幅」は、単一温度で実施される増幅反応を指す。一部の実施形態において、「等温増幅」は、２つの異なる温度で実施される増幅反応を指す。等温増幅としては、限定されるものではないが、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ホールゲノム増幅（ＷＧＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び多重置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。本明細書に記載の方法及びキットは、種々の等温増幅技術、例えば、ＬＡＭＰ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ及びＭＤＡにおいて適用され得ることが想定される。
【0052】
[052] 「標的核酸」は、反復コピーの対象物である核酸配列又はより大きい核酸の部分配列（テンプレート）を指す。標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、インビボ又はインビトロで生物学的サンプルから得られ得る。本明細書において使用される用語「標的核酸」は、ｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡも包含する。
【0053】
[053] 本明細書において使用される場合、用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用される。一実施形態において、これは、生物学的及び環境的資源を含む、任意の資源から得られる代表的部分又は培養物を含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）から得られ、唾液、スワブサンプル、気管支洗浄物（ＢＡＬ）、体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、糞便若しくは尿）、器官、組織、細胞、器官若しくは組織の切片部分、又は生物学的対象から単離された細胞（例えば、疾患細胞を含有する領域）を包含し得る。環境サンプルとしては、環境材料、例えば、表面物質、土壌、泥、汚泥、下水、生物膜、水、及び工業サンプルが挙げられる。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能なサンプルタイプを限定するものと解釈されるべきではない。
【0054】
[054] 標的ＤＮＡ又はＲＮＡは、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源又はバクテリオファージ起源のものであり得る。例えば、標的ＤＮＡ又はＲＮＡは、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、若しくはウサギ）、又は霊長類（例えば、チンパンジー若しくはヒト）から得られ得る。標的ＤＮＡは、逆転写酵素の酵素を使用してＲＮＡテンプレート（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び他のバリアント）から生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。
【0055】
[055] 用語「プライマー」又は「プライマー配列」は、標的核酸テンプレートにハイブリダイズして標的核酸：プライマーハイブリッドを生成し、核酸合成を開始させるオリゴヌクレオチドを指す。当業者は、任意の等温増幅反応用の好適なプライマーを設計及び同定することができる。プライマーを設計するためのツールは、当技術分野において公知である。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はキメラ配列であり得る。一実施形態において、標的核酸配列のＬＡＭＰを検出するための複数のＬＡＭＰプライマーが提供される。本明細書において使用される用語「ＬＡＭＰプライマー」は、第１のアウタープライマーＦ３、第２のアウタープライマーＢ３、第１のインナープライマーＦＩＰ（又はプライマーＦ１ｃ及びＦ２）、第２のインナープライマーＢＩＰ（又はプライマーＢ１ｃ及びＢ２）、第１のループプライマーＬＦ、並びに第２のループ－プライマーＬＢを含む複数のプライマーを指す。ＬＡＭＰプライマーの標準的なセットに加え、一実施形態において、ＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含む。例えば、Ｆ３プライマー又はＢ３プライマーは、標的認識配列と一緒にＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有するように設計される。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位は、ＬＡＭＰプライマー配列の５’末端に存在する。
【0056】
[056] 本明細書において使用される「ＲＮＡポリメラーゼ」としては、限定されるものではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、及びＥ．コリ（E.coli）ＲＮＡポリメラーゼが挙げられ得る。例えば、用語「Ｔ７プロモーター」は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列に関し、用語「Ｔ３プロモーター」は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列に関し、用語「ＳＰ６プロモーター」は、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列に関する。プロモーター配列がそれぞれのＲＮＡポリメラーゼにより認識されると、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの転写を開始させる。任意の好適なＲＮＡポリメラーゼが本明細書に記載の方法及びキットに含められ得る。一実施形態において、Ｔ７プロモーターの核酸配列は、２０ヌクレオチド長であり、配列番号１に記載される。一実施形態において、Ｔ３プロモーターの核酸配列は、１７、２０又は２４ヌクレオチド長のいずれかであり、それぞれ配列番号２～４に記載される。一実施形態において、ＳＰ６プロモーターの核酸配列は２４又は１８ヌクレオチド長であり、それぞれ配列番号５及び６に記載される。
【0057】
[057] 本明細書において使用される場合、用語「鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ」は、そのＤＮＡ合成活性とは別に鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、核酸テンプレート鎖の配列をベースにしてテンプレート鎖を読み取ることによりＤＮＡ合成を継続する一方、テンプレート鎖にアニールされる相補鎖を置換し得る。等温増幅法に使用される鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング又は非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼであり得、これは、高温性又は中温性であり得る。任意の好適な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが本明細書に記載の方法及びキットに含められ得る。例えば、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔラージフラグメントポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）、Φ２９ファージ、ＭＳ－２ファージ、Ｚ－Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＦ、ＯｍｎｉＡｍｐポリメラーゼ、ＳＤポリメラーゼ及びそれらの任意の組み合わせから選択され得る。
【0058】
[058] 用語「ｄＮＴＰ」及び「ｒＮＴＰ」は、ヌクレオチド、すなわち、それぞれデオキシリボヌクレオチド三リン酸及びリボヌクレオチド三リン酸に関し、当業者に公知である。この用語は、ｄＮＴＰ及びｒＮＴＰの改変形態も包含し、但し、それらの改変形態がＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素及び／又はＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により認識されることを条件とする。
【0059】
[059] 本明細書において使用される場合、用語「逆転写酵素」は、ＲＮＡテンプレートから第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコピーし得る任意のＤＮＡポリメラーゼを指す。このような酵素は、一般にＲＮＡ指向又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと称される。一部の実施形態において、逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかをテンプレートとして使用してｃＤＮＡ鎖をコピーし得る。
【0060】
[060] 種々の等温増幅法に好適な増幅試薬は、当技術分野において公知である。例えば、慣用のＬＡＭＰ反応用の試薬ミックスは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡＭＰプライマー、及び標的ＤＮＡに付加されるｄＮＴＰを含む。慣用のＬＡＭＰ反応用の試薬ミックスは、標的核酸がＲＮＡ標的である場合、逆転写酵素をさらに含み得る。本明細書の文脈において、用語「ＬＡＭＰ試薬ミックス」は、ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、ＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー、ｉｉ）ｄＮＴＰ、ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｖ）逆転写酵素、ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、及びｖｉ）ｒＮＴＰを含む試薬ミックスを指す。
【0061】
[061] 本明細書において使用される「効率」は、増幅の検出可能なレベルに達するのに要する時間に基づき測定される。例えば、増幅効率が高ければ高いほど、増幅結果に達するのに要する時間は短くなる。
【0062】
[062] 本明細書において使用される「感度」は、検出限界、すなわち、所与の増幅条件下で確実に検出及び定量するために存在しなければならない標的核酸の最小量を指す。一実施形態において、感度は、閾値サイクル（Ｃｔ）値として表現される。Ｃｔ値は、サンプル中の核酸テンプレートの出発量の計算のためのツールとして機能し、蛍光シグナルがベースライン（ベースシグナル）から顕著に増加し始めるサイクル数を表す。一実施形態において、本発明の方法及びキットは、等温増幅反応の感度を１８分間未満の単一コピー検出レベルに至るまで改善する。
【0063】
[063] 本発明がより明確に理解され得るように、好ましい実施形態が以下の実施例を参照して記載される。
【0064】
実施形態の説明
方法
[064] 本発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターをＬＡＭＰプライマーに付加し、ｒＮＴＰをＲＮＡポリメラーゼとともに添加することにより、種々の等温増幅法の速度及び感度が改善されることを見出した。
方法
[064] 本発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターをＬＡＭＰプライマーに付加し、ｒＮＴＰをＲＮＡポリメラーゼとともに添加することにより、種々の等温増幅法の速度及び感度が改善されることを見出した。
【0065】
[065] 慣用のＬＡＭＰは、通常、６０℃～７０℃の定温で実施され、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ並びに、標的核酸上の６つの異なる認識部位を認識するように特異的に設計されるインナー及びアウタープライマーと称される４つのオリゴヌクレオチドのセットを用いる。２つのアウタープライマーは、非サイクルステップ間でのみ鎖置換における役割を担う一方、インナープライマーは、センス及びアンチセンス配列の両方を含み、ステムループ構造を有する典型的なＬＡＭＰ増幅産物の形成に寄与する。４つのオリゴヌクレオチドプライマーに加え、ＬＡＭＰアッセイは、増幅効率を改善するための２つの追加のプライマー、いわゆるループプライマーを含み、それにより標的配列当たり合計６つのプライマーをもたらし得る。標的核酸上の８つの区別される配列に及ぶ、異なるＬＡＭＰプライマーのこのような組み合わせは、より良好な特異度を提供する。
【0066】
[066] 本発明は、ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマーを使用することにより、ＬＡＭＰの効率及び／又は感度を増加させる方法を提供する。方法はまた、ｉｉ）ｄＮＴＰ、ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｖ）逆転写酵素、ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉ）ｒＮＴＰ、及び任意選択で核酸結合色素又はプローブを含む。構成成分は、合わせされてＬＡＭＰ試薬ミックスを形成する。試薬ミックスは、通常、使用直前に調製される。しかしながら、試薬ミックス又は試薬ミックスの一部の構成成分は事前に調製され得ることが想定され、例えば、プライマー、ｄＮＴＰ及びｒＮＴＰはプレミックスされ、酵素は使用直前に添加され得る。
【0067】
[067] 複数のＬＡＭＰプライマーは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーをさらに含む。
【0068】
[068] 好ましくは、Ｆ３及びＢ３プライマー又はＦ３プライマーのみが、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む。すなわち、他のプライマーはＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない。例えば、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含まない。
【0069】
[069] 試薬ミックスは、緩衝液溶液も含む。ＬＡＭＰ反応に好適な緩衝液溶液は、当技術分野において公知である。１つの好適な緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣＬ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のTween（登録商標）20を含むｐＨ８．８ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。当業者は、代替的な緩衝液を認識し、緩衝液の選択が使用されるポリメラーゼに部分的に依存的であることを理解する。例えば、上記緩衝液は、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いる使用に最適化される。
【0070】
[070] ＬＡＭＰ試薬ミックスが形成されると、標的核酸が添加され、試薬ミックス及び核酸が標的核酸の増幅に好適な条件下でインキュベートされる。
【0071】
[071] 一部の実施形態において、標的核酸又は標的核酸を含有すると疑われるサンプルは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して重亜硫酸塩処理され、それにより標的核酸の特異的メチル化形態の検出が容易になり得る。
【0072】
[072] 重亜硫酸塩処理が使用される実施形態において、試薬ミックス及びサンプルは、任意選択で、約４２℃で１～１５分間の期間インキュベートされてから５０～５５℃（例えば、５３℃）の昇温で５～４０分間、例えば、１５、２０、３０分間インキュベートされ得る。
【0073】
[073] 他の実施形態において、試薬ミックス及びサンプルは、任意選択で約４２℃で１～１５分間の期間インキュベートされてから６０～７０℃（例えば、６５℃）の昇温で５～４０分間、例えば、１５、２０、又は３０分間インキュベートされる。
【0074】
[074] 好ましくは、方法は、ＬＡＭＰ試薬ミックスに添加される特定のプライマーセットに要求される場合、グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を用いて実施される。ＧｕＨＣｌは、約３０ｎＭ～約９０ｎＭ、例えば、約３０ｍＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎｍ、又は約９０ｎＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態において、ＧｕＨＣｌは、ＬＡＭＰ試薬ミックス中に約６０ｎＭの濃度で存在する。
【0075】
[075] ＬＡＭＰ試薬ミックス中のｒＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼの濃度は、最適化され得る。一部の実施形態において、ＬＡＭＰ試薬ミックス中のｒＮＴＰの濃度は、約０．２５ｍＭ、好ましくは、約２．５ｍＭ未満であり、ＬＡＭＰ試薬ミックス中のＲＮＡポリメラーゼの濃度は、反応当たり約７．５単位、好ましくは、反応当たり約５０単位未満である。
【0076】
[076] 本明細書に例示されるとおり、プライマー配列の一部としてのＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の使用は、ＬＡＭＰ反応の効率及び／又は感度を改善する。同じアプローチは、他の等温増幅技術、例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ホールゲノム増幅（ＷＧＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び多重置換増幅（ＭＤＡ）の効率及び／又は感度を改善するために使用され得ることが想定される。
【0077】
等温増幅産物の検出
[077] 反応の進行は、核酸を検出するための当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定され得る。例えば、ＬＡＭＰ増幅産物は、直接又は間接的アプローチ、例えば、核酸結合色素又はプローブを使用して検出され得る。
[077] 反応の進行は、核酸を検出するための当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定され得る。例えば、ＬＡＭＰ増幅産物は、直接又は間接的アプローチ、例えば、核酸結合色素又はプローブを使用して検出され得る。
【0078】
[078] ＬＡＭＰ増幅産物の直接的検出は、蛍光レポーティングを用い得る。このアプローチは、インターカレート色素、例えば、臭化エチジウム、SYBR Green、EvaGreen及びYO-PRO-Iの使用に基づく。一般に、インターカレート色素は、二本鎖ＤＮＡ中への結合時に蛍光発光の大きい増加を示す非配列特異的蛍光色素である。この特性は、ＬＡＭＰ反応の間の蛍光を継続的に測定することにより核酸増幅をリアルタイムでモニタリングするために使用され得る。
【0079】
[079] より特異的な検出アプローチが開発されており、当技術分野において公知である（すなわち、標的核酸配列の存在下でのみ開花（florescence）、例えば、Real-time Detection and Monitoring of Loop Mediated Amplification(LAMP)Reaction Using Self-quenching and De-quenching Fluorogenic Probes.Gadkar VJ,Goldfarb DM,Gantt S,Tilley PAG.Sci Rep.2018 Apr 3;8(1):5548参照）。
【0080】
[080] ＬＡＭＰ増幅の間接的検出は周知であり、反応副生物としてのピロリン酸塩の形成に本質的に依存する。ＬＡＭＰ反応が進行するにつれ、核酸重合の間のＤＮＡ鎖中へのｄＮＴＰの取り込みによりピロリン酸イオンが放出される。これらのイオンは二価金属イオン、例えば、マグネシウムイオン（ＬＡＭＰ反応ミックス中に存在）と反応して白色の不溶性ピロリン酸マグネシウム沈殿物を産生する。この産物は、反応溶液の濁度の累積的増加をもたらし、ピロリン酸塩沈殿物は濁度を単位として測定され得る。或いは、ＬＡＭＰ増幅の検出は、反応中のマンガンイオン及びカルセイン（フルオレセインとしても公知）の取り込みを介して達成され得る。カルセインの蛍光は、マンガンイオンの結合により自然にクエンチされる。ＬＡＭＰ反応の副生物として産生されたピロリン酸塩は、沈殿を介して緩衝液からマンガンイオンを除去し、回復したカルセイン蛍光と連動する濁度の増加により、可視又はＵＶ光を用いる励起時の容易な目視によるリードアウトが可能になる。別の検出フォーマットは、ピロリン酸塩のＡＴＰへの酵素的変換であり、それはＤＮＡ合成の間に産生され、熱安定性ホタルルシフェラーゼにより生成される生物発光を介してモニタリングされる。
【0081】
[081] 一部の実施形態において、反応の進行を測定するためにプローブ（核酸プローブ）が使用される。好ましくは、プローブは、増幅される標的配列（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの標的配列）に特異的である。核酸プローブは、標的配列に結合し得る核酸への１つ以上のフルオロフォア及びクエンチャーのコンジュゲーションにより生成されることが多い。したがって、このタイプのプローブは核酸のリアルタイムの配列特異的定量に使用され、塩基対合して対合フルオロフォア及びクエンチャーで終結するステムを形成し得る５～７つの相補的ヌクレオチドのストレッチによりフランキングされる中央の標的特異的一本鎖ループを含み得る。特異的配列標的の不存在下では、プローブの５’及び３’末端におけるフルオロフォア及びクエンチャーの近接に起因して蛍光はクエンチされたままである。ループへの相補的核酸の結合は、フルオロフォア及びステムを強制的に対合解除する立体構造変化をもたらし、クエンチャーからのフルオロフォアの分離は配列特異的蛍光をもたらす。プローブは、標的に結合した場合にのみシグナルを産生し、したがって増幅産物の直接的尺度を提供する。
【0082】
[082] 本明細書に記載の方法は、当技術分野において公知の任意のプローブを用いて使用され得、当業者は、方法についての使用に好適な標的特異的プローブを同定又は設計することができる。
【0083】
[083] 一実施形態において、方法は、１つ以上のEasybeacon（商標）プローブを利用する。
【0084】
[084] いくつかの異なる標的核酸配列を同時に増幅させるためのマルチプレックス化は公知であり、当業者により達成され得る。
【0085】
[085] 一実施形態において、本明細書に記載のＬＡＭＰ反応は、第１及び第２の複数のＬＡＭＰプライマーと、第１及び第２の標的核酸を標的化するプローブとを合わせることにより、単一チューブ／反応中の２つの異なる標的核酸配列のマルチプレックス検出を可能とする。好ましくは、第１の複数のＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含み、第２の複数のＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む。
【0086】
[086] 一実施形態において、本明細書に記載のＬＡＭＰ反応は、第１、第２、及び第３の複数のＬＡＭＰプライマーと、第１、第２、及び第３の標的核酸を標的化するプローブとを合わせることにより、単一チューブ／反応中の３つの異なる標的核酸配列のマルチプレックス検出を可能とする。好ましくは、第１の複数のＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含み、第２の複数のＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含み、第３の複数のＬＡＭＰプライマーの少なくとも１つは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む。
【0087】
[087] 一実施形態において、ＬＡＭＰ反応は、多数のEasybeacon（商標）プローブを用いるマルチプレックス化に適する。
【0088】
[088] 一部の実施形態において、本明細書に記載のＬＡＭＰ反応は、サンプルからのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出なしで実施され、「無抽出ＬＡＭＰ」と称される。
【0089】
標的核酸
[089] 本明細書に記載の方法は、任意の標的核酸、例えば、ウイルス若しくは細菌に特異的なＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列又は疾患若しくは病態と特異的に関連するＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列を用いて使用され得る。
[089] 本明細書に記載の方法は、任意の標的核酸、例えば、ウイルス若しくは細菌に特異的なＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列又は疾患若しくは病態と特異的に関連するＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列を用いて使用され得る。
【0090】
[090] 一部の実施形態において、標的核酸は、例えば、生物学的サンプルが病原体を含有し、又は含有すると疑われる場合、病原体又は感染性因子からのものである。したがって、本明細書に提供される方法及びキットは、任意の公知の病原体又は感染性因子を検出するために有用である。
【0091】
[091] 方法及びキットは、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫の病原体及び感染性因子、例えば、ウイルス、例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ジカウイルス、ＨＩＶ、Ａ、Ｂ、及びＣ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、ＣＭＶ ＥＢＶ、ＨＰＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、ＲＳＶ、デングウイルス１～４型、チクングニヤ、パラインフルエンザ１～４型、アデノウイルス、ヒトライノウイルス、エンテロウイルス、水痘、例えば、ＶＺＶ、ヘルペスウイルス属（Herpesvirsus）、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、エプスタインバーウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ロタウイルス、ノロウイルスグループ１及び２、サポウイルス、アストロウイルス、ボカウイルス、エボラウイルス、フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、及びハンタウイルス科（Hantaviridae）を検出するために使用され得る。
【0092】
[092] 一実施形態において、ウイルス病原体は、パレコウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス科（togaviridae）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、ヘペウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、レトロウイルス オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、
フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、ハンタウイルス科（Hantaviridae）及びデルタウイルスから選択される。
フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ブニヤウイルス目（Bunyavirales）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、ハンタウイルス科（Hantaviridae）及びデルタウイルスから選択される。
【0093】
[093] 一実施形態において、ウイルスは、コロナウイルス、例えば、コロナウイルスＨＫＵ－１、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３／２２９Ｅ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0094】
[094] 一実施形態において、細菌は、サルモネラ属種（Salmonella spp）；ボルデテラ属種（Bordetella spp.）、例えば、Ｂ ペルツスシス（B pertussis）、Ｂ．ホルメシイ（B.holmesii）、Ｂ．パラペルツスシス（B.parapertussis）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）；クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、例えば、Ｃ．ディフィシレ（C.difficile）、Ｃ．ディフィシレ（C.difficile）リボタイプ０２７、Ｃ ディフィシレ（C difficle）リボタイプ０７８；クラミジア属種（Chlamydia spp.）、例えば、Ｃ．ニューモニエ（C.pneumoniae）、Ｃ．トラコマティス（C.trachomatis）；クラミドフィラ属種（Chlamydophila spp.）、例えば、Ｃ．プシッタキ（C.psittaci）；リステリア属種（Listeria spp）；リンフォグラヌローマ属種（Lymphogranuloma spp.）、例えば、シゲラ属種（Shigella spp）；ナイセリア属種（Neisseria spp.）、例えば、Ｎ．ゴノルロエア（N.gonorrhoaea）；スタフィロコッカス属種（Staphylococcus spp）；ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）、例えば、Ｓ アガラクティエ（S agalactiae）；リステリア属種（Listeria spp）；リーシュマニア属種（Lieshmania spp）；バチルス属種（Bacillus spp）；ボレリア属種（Borellia spp）；リケッチア属種（Ricketssia spp）；コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp）；ガーデネラ属種（Gardenella spp）；ヘモフィルス属種（Haemophilus spp.）、例えば、Ｈ．インフルエンゼ（H.influenzae）；エシェリキア属種（Escherichia spp）、例えば、Ｅ．コリ（E.coli）；ヘリコバクター属種（Helicobacter spp.）、例えば、Ｈ．ピロリ（H.pylori）；クレブシエラ属種（Klebsiella spp）；レジオネラ属種（Legionella spp.）、例えば、Ｌ プネモフィラ（L pnemophila）；マイコバケリウム属種（Mycobacerium spp.）、例えば、Ｍ．ツベルクローシス（M.tuberculosis）；マイコプラズマ属種（Mycoplasma spp.）、例えば、Ｍ，プネモニエ（M,pnemoniae）、Ｍ．ゲニタリウム（M.genitalium）、Ｍ．ホミニ（M.homini）；モラキセラ属種（Moraxella spp）；パスツレラ属種（Pasteurella spp）；ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp.）、例えば、Ｐ ジロベキイ（P jirovecii）；シュードモナス属種（Pseudomonas spp）；トレポネーマ属種（Treponema spp）；ウレアプラズマ属種（Ureaplasma spp.）、例えば、Ｕ．ウレアリティクム（U.urealyticum）；ビブリオ属種（Vibrio sp）、エルモナス属種（Aermonas spp.）、及びエルシニア属種（Yersinia spp.）、例えば、Ｙ ペスティス（Y pestis）から選択される。
【0095】
[095] 寄生虫病原体は、原生動物又は後生動物病原体、例えば、プラスモジア属（Plasmodia）種、リーシュマニア属（Leishmania）種、シストソーマ属（Schistosoma）種、及びトリパノソーマ属（Trypanosoma）種）、細菌（例えば、マイコバクテリウム属（Mycobacteria）、特に、Ｍ．ツベルクローシス（M.tuberculosis）、サルモネラ属（Salmonella）、ストレプトコッカス属（Streptococci）、Ｅ．コリ（E.coli）及びスタフィロコッカス属（Staphylococci）、及び真菌（例えば、カンジダ属（Candida）種及びアスペルギルス属（Aspergillus）種）であり得る。
【0096】
[096] 一実施形態において、寄生虫病原体は、ブラストシスティス属種（Blastocystis spp.）、例えば、Ｂ．ホミニス（B.hominis）；ジアルジア属種（Giardiaspp.）、例えば、Ｇ．インテスティナリス（G.intestinalis）、Ｇ．ランブリア（G.lamblia）；クリプトスポリジウム属種（Cryptosporidium spp）、サイクロスポラ属種（Cyclospora spp.）、例えば、Ｃ．カイエタネンシス（C.cayetanensis）；ブラストシスティス属種（Blastocystis spp）、ジエントアメーバ属種（Dientamoeba spp．）、例えば、Ｄ．フラギリス（D.fragilis）；エントアメーバ属種（Entamoeba spp.）、例えば、Ｅ．ヒストリティカ（E.histolytica）；クリプトコッカス属種（Cryptococcus spp）、エンテロシトゾーン属種（Enterocytozoon spp.）、例えば、Ｅ．ビエネウシ（E.bieneusi）；エンセファリトゾーン属種（Encephalitozoon spp.）、例えば、Ｅ．インテスティナリス（E.intestinalis）；バベシア属種（Babesia spp）；リーシュマニア属種（Leishmania spp）、シストソーマ属種（Schistosoma spp）、トリパノソーマ属種（Trypanosoma spp.）；トリキモナス属種（Trichimonas spp.）、例えば、Ｔ．バギナリス（T.vaginalis）；トレポネーマ属種（Treponema spp.）、例えば、Ｔ．パリデュム（T.pallidum）；及びプラスムドイウム属種（Plasmdoium spp）から選択される。
【0097】
[097] 一実施形態において、真菌病原体は、アスペルギルス属種（Aspergillus spp）、カンジダ属種（Candida spp）、ヒストプラズマ属種（Histoplasma spp）、フザリウム属種（Fusariumspp）、ニューモシスティス属種（Pneumocystis spp）、パラコクコイデス属種（Paracoccoides spp）、コクシジオイデス属種（Coccidioides spp）、又はスケドスポリウム属種（Scedosporium spp）である。
【0098】
[098] 本明細書に記載の方法及びキットは、本質的にあらゆる核酸含有生物、又は環境中の遊離核酸の検出及び同定に適用され得る。したがって、病原体又は感染性因子は、遺伝子情報（例えば、遺伝子配列）が利用可能な実質的にあらゆる病原体又は感染性因子であり得る。一部の実施形態において、標的核酸は、ヒト起源からのものである。このような場合、方法及びキットは、生物学的サンプル、例えば、法医分析用、ゲノタイピング用などに得られる生物学的サンプル中の標的核酸を検出するために用いられ得る。
【0099】
[099] 一部の実施形態において、疾患としては、例えば、癌、糖尿病、心疾患、高血圧、神経新生（neurogenerative）及び感染性疾患が挙げられ得る。一部の実施形態において、標的核酸は、特定の遺伝子病態と関連する。例えば、標的核酸は、ＰＡＭ識別が有利である一塩基多型（ＳＮＰ）を含み、それとしては、限定されるものではないが、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２突然変異、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びヘモクロマトーシス）が挙げられる。
【0100】
[0100] 慣用のＬＡＭＰは標的核酸用のマルチプルプライマーを利用するが、偽陽性結果の比較的高い発生が公知の制約である。慣用のＬＡＭＰアッセイは、増幅検出の間接的方法を使用し得、それらは、リアルタイムかエンドポイントかを問わず、慎重なプライマー設計、最適な反応条件及び偽陽性を否定するための堅牢性試験に依存する。対照的に、本明細書に記載の方法は、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＬＡＭＰプライマーを使用し、ＦＤＡ承認ＬＡＭＰ反応と比較して偽陽性結果の発生を低減させることが実証される（実施例９参照）。したがって、本明細書に記載のＴ７改変ＬＡＭＰプロトコルはＬＡＭＰ法の有用性を改善し、偽陽性の発生を低減させ得る。
【0101】
キット
[0101] 本発明はまた、本明細書に開示される方法を実施するためのキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、方法を実施するための全ての必要な試薬を含有する。例えば、一実施形態において、キットは、ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー、ｉｉ）ｄＮＴＰ、ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｖ）逆転写酵素、ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉ）ｒＮＴＰ、並びに任意選択でｖｉｉ）核酸結合色素及び／又はｖｉｉｉ）緩衝液を含む。キットは、本明細書に提供される検出及び／又は同定法を実施するための説明書をさらに含み得る。
[0101] 本発明はまた、本明細書に開示される方法を実施するためのキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、方法を実施するための全ての必要な試薬を含有する。例えば、一実施形態において、キットは、ｉ）標的核酸用の複数のＬＡＭＰプライマーであって、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーを含み、Ｆ３及びＢ３プライマーの両方又はＦ３プライマーは、５’末端におけるＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含む複数のＬＡＭＰプライマー、ｉｉ）ｄＮＴＰ、ｉｉｉ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｖ）逆転写酵素、ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉ）ｒＮＴＰ、並びに任意選択でｖｉｉ）核酸結合色素及び／又はｖｉｉｉ）緩衝液を含む。キットは、本明細書に提供される検出及び／又は同定法を実施するための説明書をさらに含み得る。
【0102】
[0102] 一実施形態において、キットは、反応ミックス用の構成成分を含有する１つ以上の容器を含み得、反応ミックスへの標的核酸の添加は、反応ミックス及び標的核酸が本明細書に記載の適切な温度でインキュベートされた場合、核酸増幅を推進する。
【0103】
[0103] 典型的には、本発明のキットは、例えば、洗浄試薬、及び／又は本発明の方法の性能において要求される他の試薬を含有する１つ以上の他の容器も含む。
【0104】
[0104] 本発明の文脈において、キットは、試薬が別個の容器中で含有される任意のキットを含み、小型ガラス容器、プラスチック容器又はプラスチック片若しくは紙片を含み得る。このような容器は、あるコンパートメントから別のコンパートメントへの試薬の効率的な移動を可能とし得る一方、サンプル及び試薬のクロスコンタミネーション、並びにあるコンパートメントから別のものへの定量的な各容器の薬剤又は溶液の添加を回避する。
【0105】
[0105] このようなキットは、試験サンプルを受ける容器、方法において使用される試薬を含有する容器、及び増幅された核酸の検出に要求される試薬を含有する容器も含み得る。
【0106】
[0106] 典型的には、本発明のキットは、キット構成成分を使用して適切な方法を実施するための説明書も含む。本発明のキット及び方法は、自動分析設備及びシステムと併せて使用され得る。
【0107】
[0107] 異なる標的核酸の検出、同定又は定量への適用のため、本発明の単一キットが適用可能であり、或いは、例えば、各標的に特異的な試薬を含有する異なるキットが要求され得る。本発明の方法及びキットは、任意の標的核酸を検出し、同定し、又は定量することが望ましい任意の状況において適用される。
【0108】
[0108] 本発明を目下、以下の具体例を参照してより詳細に記載するが、それらはいかなる形でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0109】
実施例
実施例１：材料及び方法
[0109] プライマー
[0110] 各プライマー（IDT）の１００ｍＭ原液を分子グレード水（Sigma RNBJ2199）中で調製した。次いで、プライマーを表１に示される比で混合して１０×作業溶液を得た。
実施例１：材料及び方法
[0109] プライマー
[0110] 各プライマー（IDT）の１００ｍＭ原液を分子グレード水（Sigma RNBJ2199）中で調製した。次いで、プライマーを表１に示される比で混合して１０×作業溶液を得た。
【0110】
【表1】
【0111】
[0111] 試験されるプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター及びＳＰ６プロモーターが挙げられる。表２に提供されるとおり、Ｔ７プロモーターの核酸配列は２０ヌクレオチド長であり、配列番号１に記載され、Ｔ３プロモーターの核酸配列は１７、２０又は２４ヌクレオチド長のいずれかであり、配列番号２～４に記載され、ＳＰ６プロモーターの核酸配列は２４又は１８ヌクレオチド長であり、配列番号５及び６に記載される。プロモーター配列は、表２中で太字及び下線で示される。ランダムヌクレオチドをプロモーター配列の５’又は３’末端で付加して増幅を改善することができる。
【0112】
【表2】
【0113】
[0112] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含有する５’テールを含むプライマーＢ３及びＦ３を合成した。これらのプライマーを、以下の反応において慣用のＬＡＭＰ Ｆ３及びＢ３プライマーに代えて用いた。
【0114】
[0113] 表３に記載されるとおり、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＭ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｅ遺伝子及びＲｄＲＰ遺伝子に対する、並びにインフルエンザＡ型Ｈ３標的を検出するためのインフルエンザＡ型のヘマグルチニン遺伝子に対するＬＡＭＰプライマーセットを設計した。本明細書において使用される他のプライマーも表３に記載する。
【0115】
【表3】
【0116】
【表4】
【0117】
【表5】
【0118】
サンプル調製
[0114] 重亜硫酸塩（Ｂ）及び野生型（ＷＴ）反応は両方とも良好であった。サンプルの重亜硫酸塩処理を以下のとおり実施した：ステップ１）１５０μＬの定量培養物、ＱＡＰ、ＲＮＡ又は陽性臨床サンプルを、EasyScreen SP006サンプルプロセシングキット（Genetic Signatures）からの２５０μＬの合わせた試薬１＋２に添加し；ステップ２）サンプルを９５℃で２０分間加熱し、手短にボルテックスに供し、次いで２秒間スピンさせ、室温に冷却しておき；ステップ３）次いで、材料をGS-mini上で製造業者の説明書（Genetic Signatures）に従って６０～２００μＬの最終溶出容量で精製し；ステップ４）サンプルを精製後に－７０℃で冷凍した。
[0114] 重亜硫酸塩（Ｂ）及び野生型（ＷＴ）反応は両方とも良好であった。サンプルの重亜硫酸塩処理を以下のとおり実施した：ステップ１）１５０μＬの定量培養物、ＱＡＰ、ＲＮＡ又は陽性臨床サンプルを、EasyScreen SP006サンプルプロセシングキット（Genetic Signatures）からの２５０μＬの合わせた試薬１＋２に添加し；ステップ２）サンプルを９５℃で２０分間加熱し、手短にボルテックスに供し、次いで２秒間スピンさせ、室温に冷却しておき；ステップ３）次いで、材料をGS-mini上で製造業者の説明書（Genetic Signatures）に従って６０～２００μＬの最終溶出容量で精製し；ステップ４）サンプルを精製後に－７０℃で冷凍した。
【0119】
[0115] 野生型４塩基精製をGS-mini上で製造業者の説明書（Genetic Signatures）に従って１００～４００μＬの最終溶出容量で実施し；サンプルを精製後に－７０℃で冷凍した。
【0120】
[0116] 反応をWarmStart比色ＬＡＭＰ２×ＬＡＭＰマスターミックス（New England Biolabs:NEB）中で調製した。これは１６ｍＭのＭｇＳＯ４、したがって１×最終反応中で８ｍＭのＭｇＳＯ４を含有した。追加の構成成分は、SYTO-9緑色蛍光核酸染色ミックス（Invitrogen）、Firescript逆転写酵素（Solis BioDyne）、１０×プライマーミックス（IDT）、ｒＮＴＰ（NEB）、ＲＮＡポリメラーゼ（NEB）、水及びサンプルを含んだ。試薬を表４に記載し、各構成成分の容量を表５に記載する。
【0121】
[0117] 試験ＬＡＭＰ反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ｒＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼテール（プロモーター）を有するプライマーを含有した。対照ＬＡＭＰ反応はＲＮＡポリメラーゼもｒＮＴＰも含有せず、プライマーをＲＮＡポリメラーゼテールなしで含めた。陰性サンプル「非テンプレート対照（ＮＴＣ）」は、テンプレート（核酸）を含有しなかった。
【0122】
[0118] 重亜硫酸塩処理（重亜硫酸塩ＬＡＭＰ）反応を、任意選択でＰＣＲサーマルサイクラー（BioRad CFX96）中で最初に４２℃で１～１０分間ランさせ、次いで同じＰＣＲサーマルサイクラー中で５３℃で３０～６０分間ランさせた。或いは、サンプルはヒートブロック、水浴又はインキュベーター上でランさせることができる。蛍光を１分間に１回測定して反応進行を評価した。
【0123】
[0119] 野生型４塩基ＬＡＭＰ反応を、任意選択でＰＣＲサーマルサイクラー（BioRad CFX96）中で最初に４２℃で１～１０分間ランさせ、次いで同じＰＣＲサーマルサイクラー中で６５℃で３０分間ランさせた。或いは、サンプルはヒートブロック、水浴又はインキュベーター上でランさせることができる。蛍光を１分間に１回測定して反応進行を評価した。
【0124】
[0120] ＬＡＭＰプライマーセットを含む標的核酸を表３に列記する。
【0125】
【表6】
【0126】
【表7】
【0127】
実施例２：インフルエンザＡ型ＬＡＭＰ
[0121] ＬＡＭＰ反応をSt Vincent’s Hospital Sydney,Australiaからの多数のインフルエンザＡ型陽性臨床サンプルに対して実施した。表６は、これらのサンプルに対して実施された野生型４塩基ＬＡＭＰインフルエンザＨ３タイピングアッセイの結果を示す。
[0121] ＬＡＭＰ反応をSt Vincent’s Hospital Sydney,Australiaからの多数のインフルエンザＡ型陽性臨床サンプルに対して実施した。表６は、これらのサンプルに対して実施された野生型４塩基ＬＡＭＰインフルエンザＨ３タイピングアッセイの結果を示す。
【0128】
【表8】
【0129】
[0122] ＬＡＭＰプライマーＦ３及びＢ３を、Ｔ７又はＳＰ６テール（Ｔ７又はＳＰ６プロモーター）のいずれかを用いて合成し、対照ＬＡＭＰ反応と比較した。表６に示されるとおり、テール付きプライマーを使用したデータは、検出された陽性サンプルの数の増加及び結果までの時間の低減の両方をもたらした。
【0130】
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬＡＭＰ
[0123] ＬＡＭＰ反応を２０２１年版の分子診断についての品質管理（2021 Quality Control for Molecular Diagnostics）（ＱＣＭＤ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パネルに対して実施した。表７は、これらのサンプルに対して実施された野生型４塩基ＬＡＭＰアッセイの結果を示す。
[0123] ＬＡＭＰ反応を２０２１年版の分子診断についての品質管理（2021 Quality Control for Molecular Diagnostics）（ＱＣＭＤ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パネルに対して実施した。表７は、これらのサンプルに対して実施された野生型４塩基ＬＡＭＰアッセイの結果を示す。
【0131】
【表9】
【0132】
[0124] 野生型４塩基ＬＡＭＰプライマーを使用して定量ＱＣＭＤパネルを増幅させた。Ｔ７、ＳＰ６又はＴ３ ５’テールを含有するＦ３プライマーを合成し、慣用のＬＡＭＰアッセイと比較した。表７に示されるとおり、ＲＮＡポリメラーゼテールを用いるＬＡＭＰを使用して実施された反応は、より迅速な結果までの時間をもたらした。より重要なことに、５つのサンプルの４つを検出したＳＰ６アッセイについて感度の増加が生成された一方、慣用のＬＡＭＰは５つのサンプルの２つを検出したにすぎなかった。
【0133】
実施例４：培養ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬＡＭＰ
[0125] St Vincent’s Hospital Sydney,Australiaからの重亜硫酸塩変換培養ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サンプルを使用してＬＡＭＰ反応を実施した。
[0125] St Vincent’s Hospital Sydney,Australiaからの重亜硫酸塩変換培養ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サンプルを使用してＬＡＭＰ反応を実施した。
【0134】
【表10】
【0135】
[0126] Ｔ７、ＳＰ６又はＴ３ ５’テールを含有するＬＡＭＰプライマーを合成し、対照（すなわち、慣用）ＬＡＭＰ反応と比較した。表８に示されるとおり、テール付きプライマーを使用したデータは、検出された陽性サンプルの数の増加及び結果までの時間の低減の両方をもたらした。表８は、テール付きプライマーを使用する場合、少なくとも１０倍の感度の増加を達成することができることを示す。
【0136】
実施例５：プライマータイトレーション
[0127] Ｔ７－ＬＡＭＰ（Ｎ遺伝子の検出）プライマー濃度の最適化は、７５，０００コピーを使用した最初の陽性結果の時間を約１７分間から１０．７６分間に至るまで低減させ、感度を１８分間未満の単一コピー検出レベルに至るまで改善した（表９）。データは、１．７５×の最適プライマー濃度を使用する場合、対照ＬＡＭＰと比較して感度の１０倍増加を達成することができることを示す。重亜硫酸塩及び野生型Ｔ７－ＬＡＭＰ反応は類似の感度を有し、最適化される場合に単一コピー標的を検出し得る。
[0127] Ｔ７－ＬＡＭＰ（Ｎ遺伝子の検出）プライマー濃度の最適化は、７５，０００コピーを使用した最初の陽性結果の時間を約１７分間から１０．７６分間に至るまで低減させ、感度を１８分間未満の単一コピー検出レベルに至るまで改善した（表９）。データは、１．７５×の最適プライマー濃度を使用する場合、対照ＬＡＭＰと比較して感度の１０倍増加を達成することができることを示す。重亜硫酸塩及び野生型Ｔ７－ＬＡＭＰ反応は類似の感度を有し、最適化される場合に単一コピー標的を検出し得る。
【0137】
【表11】
【0138】
実施例６：グアニジニウム塩酸塩
[0128] グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）の添加は、Ｔ７－ＬＡＭＰ反応の速度及び感度の増加において好ましい効果を有した。
[0128] グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）の添加は、Ｔ７－ＬＡＭＰ反応の速度及び感度の増加において好ましい効果を有した。
【0139】
【表12】
【0140】
実施例７：ｒＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼ濃度の最適化
[0129] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（５０，０００Ｕ／ｍＬ）タイトレーションを使用したＴ７－ＬＡＭＰ（Ｎ遺伝子の検出）の最適化は、対照反応と比較した場合、１２．５単位及びＴ７無添加と比較して反応において１０、７．５及び５単位のポリメラーゼを使用した場合に陽性の増加が見られることを示した。しかしながら、１０単位を反応に添加した場合、サンプル＃８について８分間超のタイムラグが存在する。
[0129] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（５０，０００Ｕ／ｍＬ）タイトレーションを使用したＴ７－ＬＡＭＰ（Ｎ遺伝子の検出）の最適化は、対照反応と比較した場合、１２．５単位及びＴ７無添加と比較して反応において１０、７．５及び５単位のポリメラーゼを使用した場合に陽性の増加が見られることを示した。しかしながら、１０単位を反応に添加した場合、サンプル＃８について８分間超のタイムラグが存在する。
【0141】
【表13】
【0142】
[0130] ｒＮＴＰ（２５ｍＭ）タイトレーションを使用したＴ７－ＬＡＭＰ（Ｎ遺伝子の検出）の最適化は、反応への約０．１７５μｌのｒＮＴＰの添加が最適範囲であり、４つのサンプルを検出した０．２μｌと比較して５つのサンプルの検出をもたらしたことを示した。ｒＮＴＰを反応に添加しなかった場合、結果までの時間は最大１５分間だけ遅延され、３つのサンプルのみが陽性と検出された。サンプル＃２は、最大濃度のｒＮＴＰ（０．２μｌ）及び添加ｒＮＴＰを有さなかったサンプルを除き全ての濃度のｒＮＴＰで検出された。最大１２分間の遅延は、０．１μｌを添加した場合に示された。
【0143】
【表14】
【0144】
実施例８：プローブベースＬＡＭＰ－マルチプレックス化
[0131] ＬＡＭＰ反応のマルチプレックス化を実施し、それは蛍光色素をＦＩＰプライマーの５’末端に付着させることを含み、３’クエンチャーを含有するＦＩＰに相補的な第２のプライマーを合成した。増幅が生じる場合、相補的オリゴが置換され、蛍光が放出される。以下のＮ遺伝子についての例を参照。
[0131] ＬＡＭＰ反応のマルチプレックス化を実施し、それは蛍光色素をＦＩＰプライマーの５’末端に付着させることを含み、３’クエンチャーを含有するＦＩＰに相補的な第２のプライマーを合成した。増幅が生じる場合、相補的オリゴが置換され、蛍光が放出される。以下のＮ遺伝子についての例を参照。
【化1】
【0145】
[0132] 別のアプローチは、プライミング部位を有さない標的核酸中の領域に対して、又は非必須プライマー、例えば、ＬＢ及びＬＦプライマーをプローブ結合部位として使用して慣用のEasybeacon（商標）プローブを設計することである。次いで、これらのプローブは結合し、続いてＤＮＡの新たな鎖の合成時に置換される。
【0146】
[0133] ＬＡＭＰアッセイとマルチプレックス化との適合性を決定するため、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２領域：ＲｄＲＰ、Ｏｒｆ１ａ、Ａｓ１ｅ、Ｎ遺伝子、Ｅ遺伝子、及びＭ遺伝子、並びに内因性ヒト対照（１２Ｓ ｒＲＮＡ）に対するEasybeacon（商標）プローブを合成した。Easybeacon（商標）プローブは、標的配列への結合の効率を改善するインターカレート擬似ヌクレオチド（Intercalating Pseudo Nucleotide）（ＩＰＮ）を含有する。プローブベースのシングルプレックス反応の組成を表１３に示す。
【0147】
【表15】
【0148】
[0134] ＬＡＭＰ反応のＬＢ（ループバック）及びＬＦ（ループフォワード）領域の両方に対するプローブを設計した。全てのプローブを最初にシングルプレックスで試験してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床サンプルを使用するプローブベース化学反応を使用して得られた蛍光のレベルを決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床サンプルをシングルプレックスで使用する５つの異なる蛍光プローブの性能（分で測定）を表１４に示す。以下のデータは、全ての領域及びフルオロフォアがＬＡＭＰ反応において強力なシグナルを産生し、そのいくつかは典型的なＲＴ－ＰＣＲシグナルよりも強いことを示す。
【0149】
【表16】
【0150】
[0135] ＬＡＭＰアッセイをマルチプレックス化することができるか否かを決定するため、プライマー及びプローブの種々の組み合わせをシングルプレックス、デュプレックス及びトリプレックスで試験した。アッセイにおいて使用されたプローブは、Easybeacon（商標）プローブ（Pentabase製）であった。ＬＡＭＰマルチプレックスミックスの組成を表１５に列記する。以下のデータは、マルチプレックス反応はトリプレックスで十分に機能したが、結果までの時間がわずかに遅延したことを示す。
【0151】
【表17】
【0152】
【表18】
【0153】
【表19】
【0154】
[0136] ＬＡＭＰアッセイを、内因性ヒト対照１２ＳヒトｒＲＮＡ標的の取り込みによっても試験した（表１８）。
【0155】
【表20】
【0156】
[0137] 表１８は、３つの個々の標的（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ遺伝子、ＲｄＲＰ及びＮ遺伝子）並びに内部プロセス対照（ヒト１２Ｓ ｒＲＮＡ）をマルチプレックス化して完全なアッセイを産生することが可能であることを示す。
【0157】
マルチプレックス化GSL ＬＡＭＰ及びリアルタイムＰＣＲの比較
プロスペクティブ研究
[0138] プロスペクティブ研究において、１２１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性サンプルを現地の病院から新たに回収し、ＵＴＭ中で希釈し、２つに分けた。ＴＧＡ承認GSLサンプル調製法（SP012）を使用して一方のセットを精製し、次いでＴＧＡ承認ＲＰ０１２キットを使用するＲＴ－ＰＣＲにより増幅させた。GS-miniを製造業者の説明書に従って使用して第２のセットを精製し、Ａｓ１ｅ、ＲｄＲＰ、Ｎ及びＭ遺伝子を標的として含有するQuadPlex GSLリアルタイムＬＡＭＰアッセイで増幅させた（表２０及び２１参照）。推定陽性は、ＲＴ－ＰＣＲにおいて２つの遺伝子の１つ又はＬＡＭＰアッセイにおいて３つの遺伝子の１つのみについて陽性であったサンプルである。
プロスペクティブ研究
[0138] プロスペクティブ研究において、１２１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性サンプルを現地の病院から新たに回収し、ＵＴＭ中で希釈し、２つに分けた。ＴＧＡ承認GSLサンプル調製法（SP012）を使用して一方のセットを精製し、次いでＴＧＡ承認ＲＰ０１２キットを使用するＲＴ－ＰＣＲにより増幅させた。GS-miniを製造業者の説明書に従って使用して第２のセットを精製し、Ａｓ１ｅ、ＲｄＲＰ、Ｎ及びＭ遺伝子を標的として含有するQuadPlex GSLリアルタイムＬＡＭＰアッセイで増幅させた（表２０及び２１参照）。推定陽性は、ＲＴ－ＰＣＲにおいて２つの遺伝子の１つ又はＬＡＭＰアッセイにおいて３つの遺伝子の１つのみについて陽性であったサンプルである。
【0158】
【表21】
【0159】
【表22】
【0160】
【表23】
【0161】
[0139] プロスペクティブ研究は、現地の病理検査機関から回収された１２１個の陽性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サンプルからなるものであった。推定陽性は、アッセイにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の１つのみが陽性であるサンプルである。GSL ＬＡＭＰアッセイを使用して、ＰＣＲにより推定陽性であった３つのサンプルをＬＡＭＰアッセイにおいて厳密に陽性と称した。推定陽性サンプルは、一般に陽性と称されず、したがってGSL ＬＡＭＰは１００％の感度（１２１／１２１個）を与えた一方、ＰＣＲは９７．５％の感度（１１８／１２１個）を与えた。
【0162】
レトロスペクティブ研究
[0140] レトロスペクティブ研究において、－８０℃で１８か月間超保管された８２個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をＵＴＭ中で希釈し、２つに分けた。次いで、サンプルを上記のとおりGSLリアルタイムＰＣＲ及びQuadplex GSL改変ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイで増幅させた。推定陽性サンプルは、１つの遺伝子のみが陽性である場合、総数に含めない。依然としてGSL ＬＡＭＰでＣｔ＞４０で検出されたサンプルが存在した。プロスペクティブ研究で回収されたサンプルを使用するｑＲＴ－ＰＣＲで使用すると１００％の一致が存在した。Ｃｔ値＞４０を有するサンプルの検出は、一般に、サンプル中の標的配列の１又は２コピーのみの存在を示し、GSL ＬＡＭＰ手順の改善された感度を実証する。データは、レトロスペクティブサンプルのわずかに低減された性能を示し、それはサンプル分解及びｑＲＴ－ＰＣＲ（＜１００ｂｐ）と比較して大きいサイズ（２５０ｂｐ）のＬＡＭＰアンプリコンにより引き起こされ得た。
[0140] レトロスペクティブ研究において、－８０℃で１８か月間超保管された８２個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をＵＴＭ中で希釈し、２つに分けた。次いで、サンプルを上記のとおりGSLリアルタイムＰＣＲ及びQuadplex GSL改変ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイで増幅させた。推定陽性サンプルは、１つの遺伝子のみが陽性である場合、総数に含めない。依然としてGSL ＬＡＭＰでＣｔ＞４０で検出されたサンプルが存在した。プロスペクティブ研究で回収されたサンプルを使用するｑＲＴ－ＰＣＲで使用すると１００％の一致が存在した。Ｃｔ値＞４０を有するサンプルの検出は、一般に、サンプル中の標的配列の１又は２コピーのみの存在を示し、GSL ＬＡＭＰ手順の改善された感度を実証する。データは、レトロスペクティブサンプルのわずかに低減された性能を示し、それはサンプル分解及びｑＲＴ－ＰＣＲ（＜１００ｂｐ）と比較して大きいサイズ（２５０ｂｐ）のＬＡＭＰアンプリコンにより引き起こされ得た。
【0163】
【表24】
【0164】
実施例９：Color GenomicsのＮ遺伝子プライマーとの比較
Color（https://www.color.com）のＬＡＭＰ Ｎプライマーの特異度を、一連の臨床抽出物及び非テンプレート対照に対して試験した。使用されたＮ遺伝子プライマーは、ＦＤＡによりEmergency use Authorisation（ＥＵＡ）が提供された「Color SARS-CoV-2 LAMP診断アッセイ」プライマーであった。この実験のため、Dudley DM,Newman CM,Weiler AM,Ramuta MD,Shortreed CG,Heffron AS,et al.(2020)Optimizing direct RT-LAMP to detect transmissible SARS-CoV-2 from primary nasopharyngeal swab samples.PLoS ONE15(12):e0244882に列記される配列に基づきプライマーを合成し、Ｔ７テール付きＦ３プライマーを添加した。約１８分後の表２３（下記）のデータから把握することができるとおり、ColorのＮ遺伝子プライマーを使用する非テンプレート対照（ＮＴＣ）アッセイを使用すると偽陽性増幅曲線が作成された。対照的に、本明細書に記載のＴ７ＬＡＭＰバリアントアッセイを使用すると、２５分間の増幅後でも偽陽性シグナルは生成されなかった。
Color（https://www.color.com）のＬＡＭＰ Ｎプライマーの特異度を、一連の臨床抽出物及び非テンプレート対照に対して試験した。使用されたＮ遺伝子プライマーは、ＦＤＡによりEmergency use Authorisation（ＥＵＡ）が提供された「Color SARS-CoV-2 LAMP診断アッセイ」プライマーであった。この実験のため、Dudley DM,Newman CM,Weiler AM,Ramuta MD,Shortreed CG,Heffron AS,et al.(2020)Optimizing direct RT-LAMP to detect transmissible SARS-CoV-2 from primary nasopharyngeal swab samples.PLoS ONE15(12):e0244882に列記される配列に基づきプライマーを合成し、Ｔ７テール付きＦ３プライマーを添加した。約１８分後の表２３（下記）のデータから把握することができるとおり、ColorのＮ遺伝子プライマーを使用する非テンプレート対照（ＮＴＣ）アッセイを使用すると偽陽性増幅曲線が作成された。対照的に、本明細書に記載のＴ７ＬＡＭＰバリアントアッセイを使用すると、２５分間の増幅後でも偽陽性シグナルは生成されなかった。
【0165】
[0141] 偽陽性増幅シグナルは、ＬＡＭＰ法の十分に文献報告された欠点である。表２３に示されるとおり、Ｔ７改変ＬＡＭＰプロトコルは、偽陽性の発生を低減させる。
【0166】
【表25】
【0167】
[0142] ＬＡＭＰ Ａｓ１ｅアッセイの特異度を、一連のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床抽出物、非テンプレート対照及び陽性インフルエンザＡ型サンプルに対して試験した。約１５分後のデータから把握することができるとおり、対照アッセイを使用すると偽陽性増幅曲線が作成された。追加的に、偽陽性シグナルは、既に試験されたインフルエンザＡ型臨床サンプルを使用すると見られた。しかしながら、Ｔ７ＬＡＭＰバリアントアッセイを使用すると、偽陽性シグナルは、ＮＴＣ及びインフルエンザＡ型サンプルの両方で２０分間の増幅後でも生成されなかった。偽陽性増幅シグナルは、ＬＡＭＰ法の十分に文献報告された欠点である。したがって、Ｔ７改変ＬＡＭＰプロトコルは、ＬＡＭＰ法の有用性を改善し、低い陽性シグナルの検出の増加をもたらす。追加的に、サンプル８、１０及び２９は、Ｔ７ｌａｍｐ Ａｓ１ｅアッセイにおいて６～１１分後に陽性であったが、対照アッセイにおいては陰性であった。
【0168】
【表26】
【0169】
実施例１０：公知のＬＡＭＰ反応との比較
[0143] Ｔ７プロモーターを種々の公開プロモーター配列（プロモーター配列については表２５参照）に付加することにより、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＬＡＭＰプライマーのＬＡＭＰ反応を改善する能力を試験し、具体的にはＴ７プロモーターをＦ３プライマーに付加した。
[0143] Ｔ７プロモーターを種々の公開プロモーター配列（プロモーター配列については表２５参照）に付加することにより、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを含むＬＡＭＰプライマーのＬＡＭＰ反応を改善する能力を試験し、具体的にはＴ７プロモーターをＦ３プライマーに付加した。
【0170】
【表27】
【0171】
【表28】
【0172】
[0144] 表２６のColor-ＯＲＦ１ａプライマーは、Color Genomics.SARS-CoV-2 LAMP Diagnostic Assay. 2020 https://www.color.com/wp-content/uploads/2020/05/LAMP-Diagnostic-Assay.pdf.に記載されている。
【0173】
[0145] 表２７の遺伝子－Ｎ－Ａプライマーは、Broughton JP,Deng X,Yu G,et al.CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.Nat Biotechnol.2020 Jul;38:870-874に記載されている。
【0174】
[0146] 表２８のYu-ＯＲＦ１ａプライマーは、Yu L,Wu S,Hao X,et al.Rapid Detection of COVID-19 Coronavirus Using a Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)Diagnostic Platform.[letter].Clin Chem 2020 Jul 1;66(7):975-977に記載されている。
【0175】
[0147] 表２９のEl-Tholoth-ＯＲＦ１ａは、El-Tholoth M,Bau HH,Song J.A single and two-stagem,closed tube,molecular test for the 2019 novel coronavirus (COVID-19)at home,clinic,and points of entry.ChemRxiv.2020に記載されている。
【0176】
[0148] 表３０のLamb-ＯＲＦ１ａプライマーは、Lamb LE,Bartolone SN,Ward E,Chancellor MB.Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2)by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification.PLoS One.2020;15に記載されている。
【0177】
[0149] 表２６～３０から把握することができるとおり、Ｔ７ＬＡＭＰアッセイは、感度及び偽陽性の低減に関して改善された性能をもたらす。
【0178】
【表29】
【0179】
【表30】
【0180】
【表31】
【0181】
【表32】
【0182】
【表33】
【0183】
実施例１１．Ｔ７ＬＡＭＰとリアルタイムＰＣＲとの比較
[0150] 表３１は、２８個のランダムに選択された、事前試験されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２サンプルの結果を示す。限られた利用性に起因してサンプルを試験前に少なくとも１０倍希釈した。把握することができるとおり、Ｔ７－ＬＡＭＰ手順は、目下、「ゴールドスタンダード」ＰＣＲ法の感度に接近している。
[0150] 表３１は、２８個のランダムに選択された、事前試験されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２サンプルの結果を示す。限られた利用性に起因してサンプルを試験前に少なくとも１０倍希釈した。把握することができるとおり、Ｔ７－ＬＡＭＰ手順は、目下、「ゴールドスタンダード」ＰＣＲ法の感度に接近している。
【0184】
【表34】
【0185】
実施例１２．無抽出ＬＡＭＰ
[0151] プロスペクティブ研究からの８０個の臨床サンプルを、４００ｍＭのＧｕＨＣｌ及びプロテイナーゼＫを含有する無抽出緩衝液で希釈した（７．５μＬの緩衝液及び１２．５μＬのサンプル）。次いで、サンプルを８０℃で１０分間加熱し、次いで、ラテラルフロー装置用の改変プライマーを含有するGSL ＬＡＭＰ反応に直接添加した。陽性シグナルは検出チャンバーを閉じて２～３分後に見られた。無抽出ＬＡＭＰ法の利点は、それがヒートブロックの使用を要求するにすぎず、結果を３０分以内に得ることができることであり、それはＲＮＡ又はＤＮＡの抽出を要求せず、したがってそれはリソースが限られた状況に特に有用である。データは、サンプルがＣｔ値＞３５でも依然として陽性であったが、Ｃｔ＞３７で陰性であったことも示す。
[0151] プロスペクティブ研究からの８０個の臨床サンプルを、４００ｍＭのＧｕＨＣｌ及びプロテイナーゼＫを含有する無抽出緩衝液で希釈した（７．５μＬの緩衝液及び１２．５μＬのサンプル）。次いで、サンプルを８０℃で１０分間加熱し、次いで、ラテラルフロー装置用の改変プライマーを含有するGSL ＬＡＭＰ反応に直接添加した。陽性シグナルは検出チャンバーを閉じて２～３分後に見られた。無抽出ＬＡＭＰ法の利点は、それがヒートブロックの使用を要求するにすぎず、結果を３０分以内に得ることができることであり、それはＲＮＡ又はＤＮＡの抽出を要求せず、したがってそれはリソースが限られた状況に特に有用である。データは、サンプルがＣｔ値＞３５でも依然として陽性であったが、Ｃｔ＞３７で陰性であったことも示す。
【0186】
【表35】
【0187】
実施例１３．サンプル
[0152] 上記実施例において同定されたサンプルのさらなる詳細を表３３に提供する。同じ説明であるが異なるサンプル番号を有するサンプル（例えば、臨床サンプル、インフルエンザＡ型陽性）は、異なる患者又は資源からのものである。
[0152] 上記実施例において同定されたサンプルのさらなる詳細を表３３に提供する。同じ説明であるが異なるサンプル番号を有するサンプル（例えば、臨床サンプル、インフルエンザＡ型陽性）は、異なる患者又は資源からのものである。
【0188】
【表36】
【0189】
実施例１４．Ｔ７配置位置
[0153] 上記のとおり、Ｔ７又はＳＰ６テール（Ｔ７又はＳＰ６プロモーター）のいずれかを用いて合成されたＬＡＭＰプライマーＦ３及びＢ３を用いたＬＡＭＰ反応は、対照ＬＡＭＰ反応と比較して改善された増幅感度及び効率を示した。表６に示されるとおり、テール付きプライマーを使用したデータは、検出された陽性サンプルの数の増加及び結果までの時間の低減の両方をもたらし、したがってＦ３及びＢ３アウタープライマーの両方をＲＮＡポリメラーゼプロモーター配置に使用することができることを実証した。
[0153] 上記のとおり、Ｔ７又はＳＰ６テール（Ｔ７又はＳＰ６プロモーター）のいずれかを用いて合成されたＬＡＭＰプライマーＦ３及びＢ３を用いたＬＡＭＰ反応は、対照ＬＡＭＰ反応と比較して改善された増幅感度及び効率を示した。表６に示されるとおり、テール付きプライマーを使用したデータは、検出された陽性サンプルの数の増加及び結果までの時間の低減の両方をもたらし、したがってＦ３及びＢ３アウタープライマーの両方をＲＮＡポリメラーゼプロモーター配置に使用することができることを実証した。
【0190】
[0154] 追加の試験時、本発明者らは、Ｆ３－Ｔ７及びＢ３－Ｔ７の混合物がＬＡＭＰアッセイの感度をさらに改善しなかったことを見出し、より多数のサンプルの試験時、全体的にＦ３－Ｔ７はＢ３－Ｔ７よりもわずかに良好に機能したことが見出された。
【0191】
[0155] 表３４は、種々のＬＡＭＰプライマーに対するＴ７プロモーターの配置の効果を示す。データは、Ｔ７テール（プライマー配列の５’末端における）についての最適な配置が、アウターＦ３プライマーセット上であることを示す。Ｔ７テールがインナーＦＩＰプライマー上に配置される場合、ＲｄＲＰ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子）領域１プライマーセットを使用すると結果までの時間の差は本質的に存在せず、ＲｄＲＰプライマーセット２を用いると、反応は実質的に阻害される。Ｔ７テールが内部ループＬＦプライマー上に配置される場合、Ｔ７テールなしの対照反応と比較してほとんど差が存在しない。対照的に、Ｔ７テールがＦ３（アウタープライマー）上に配置される場合、結果までの時間の減少及びさらにはＲｄＲＰ領域１についての陽性の増加が存在する（太字のＦ３－Ｔ７結果）。
【0192】
【表37】
【0193】
実施例１５．ナイセリア・ゴノルロホエア（Neisseria gonorrohoea）ＬＡＭＰ
[0156] 本明細書に記載のＬＡＭＰ反応は、細菌検出に使用することもできる。表３５は、Ｎ．ゴノルロホエア（N.gonorrohoea）の存在を検出するために使用された場合のGSL ＬＡＭＰの結果を示す。１６Ｓ ｒＲＮＡのユニーク領域に対するＬＡＭＰプライマーを設計し、通常のとおり増幅させた（表３６）。データから把握することができるとおり、わずか５～１０コピーをＬＡＭＰ増幅反応において検出することができる（表３５）。
[0156] 本明細書に記載のＬＡＭＰ反応は、細菌検出に使用することもできる。表３５は、Ｎ．ゴノルロホエア（N.gonorrohoea）の存在を検出するために使用された場合のGSL ＬＡＭＰの結果を示す。１６Ｓ ｒＲＮＡのユニーク領域に対するＬＡＭＰプライマーを設計し、通常のとおり増幅させた（表３６）。データから把握することができるとおり、わずか５～１０コピーをＬＡＭＰ増幅反応において検出することができる（表３５）。
【0194】
【表38】
【0195】
【表39】
【0196】
【表40】
【0197】
[0157] 表３７は、Ｎ．ゴノルロホエア（N.gonorrohoea）ＬＡＭＰ反応を使用した交差反応性研究の結果を示す。試験された細菌又はウイルス非標的生物のいずれについても交差反応性は観察されなかった。
【0198】
[0158] 具体的な実施形態及び上記実施例に示される本発明に対して、広く記載される本発明の主旨からも範囲からも逸脱せずに多数のバリエーション及び／又は改変を行うことができることが当業者により認識される。したがって、本実施形態は、全ての点において説明的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。特に、当業者は、本開示の利益を考慮して、本発明の原理による方法及びキットの使用に好適であり、それら及び他のタイプの適用に好適な条件及び／又はパラメータを同定し、選択し、最適化し、又は改変することができることが理解されるべきである。正確な使用、試薬の選択、変数、例えば、濃度、容量、インキュベーション時間、インキュベーション温度の選択などは、それが意図される特定の適用に大いに依存し得る。
【配列表】
【国際調査報告】