特表 2024-543184 ペプチドワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】ペプチドワクチン

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20241112BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241112BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/245 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/235 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20241112BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/113 Z

A61P37/04

A61K39/00 H

A61K39/245

A61K39/235

A61K39/21

A61K39/145

A61K39/12

A61P35/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P35/02

A61K31/7088

A61K39/395 T

A61K31/506

A61K31/519

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531702

(86)(22)【出願日】2022-11-28

(85)【翻訳文提出日】2024-07-29

(86)【国際出願番号】 GB2022053012

(87)【国際公開番号】W WO2023094839

(87)【国際公開日】2023-06-01

(31)【優先権主張番号】2117230.9

(32)【優先日】2021-11-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519336698

【氏名又は名称】アルゴノート・セラピューティクス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】ラ・サングエ，ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】バルザック，ヴォイチェフ

(72)【発明者】

【氏名】カー，シモン・マーク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C084AA19

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC01

4C084ZC20

4C084ZC75

4C085AA03

4C085BA51

4C085BA55

4C085BA65

4C085BA77

4C085BA78

4C085BA85

4C085BB11

4C085BB23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC42

4C086CB05

4C086EA16

4C086GA07

4C086GA08

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC01

4C086ZC20

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA31

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子から誘導される１つもしくは複数の免疫原性ペプチドまたはその誘導体；前記ペプチドのうちの１つまたは複数を含む医薬組成物、前記ペプチドのうちの１つまたは複数を含むワクチンおよび宿主へのペプチドを提示することが可能な薬剤の投与により哺乳動物対象において免疫応答を生起する方法をはじめとする、療法におけるそれらの使用を提供する。本発明はまた、宿主免疫を刺激することによるがんの治療での使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤の使用にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドまたはその誘導体。

【請求項2】

Ｅ２Ｆ結合性部位を含むプロモーターによりｌｎｃＲＮＡ遺伝子配列から転写される、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

免疫原性である、請求項１または２に記載のペプチド。

【請求項4】

ＰＲＭＴ５が阻害された場合に細胞において調節される、請求項１、２または３に記載のペプチド。

【請求項5】

ＰＲＭＴ５が阻害された場合に細胞において上方調節される、請求項４に記載のペプチド。

【請求項6】

免疫応答を誘導することが可能である、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。

【請求項8】

ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項７に記載の核酸。

【請求項9】

請求項７または８に記載の核酸を発現することが可能な発現ベクター。

【請求項10】

請求項７もしくは８に記載の核酸または請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

細菌、真菌（酵母を含む）、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸を含むワクチン。

【請求項13】

少なくとも５種類のｌｎｃＲＮＡ遺伝子ペプチドまたはそれらのペプチドをコードする核酸を含む、請求項１２に記載のワクチン。

【請求項14】

ペプチドワクチン、ＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルスベクターワクチンまたは樹状細胞ワクチンである、請求項１２または１３に記載のワクチン。

【請求項15】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスなど）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、またはフニンウイルスなど）、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、またはインフルエンザウイルスから誘導される、請求項１４に記載のワクチン。

【請求項16】

前記ベクターが、ＣｈＡｄＯｘベクターなどのサルアデノウイルスワクチンである、請求項に記載のワクチン。

【請求項17】

前記免疫原性ペプチドが、ＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ Ａ２またはＨＬＡ２４またはＨＬＡ ＡｌまたはＨＬＡ Ａ３を含む群から選択される１種類を含むヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子により提示される、請求項１２～１６のいずれか１項に記載のワクチン。

【請求項18】

キメラポリペプチド内に、ＰＲＭＴ５が阻害される場合にがん細胞により過剰発現される複数の、ｌｎｃＲＮＡによりコードされるペプチドを含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載のワクチン。

【請求項19】

前記複数の、ｌｎｃＲＮＡによりコードされるペプチドが直列に互いに連結されている、請求項１８に記載のワクチン。

【請求項20】

前記複数のペプチドが単一の核酸分子によりコードされる、請求項１８または１９に記載のワクチン。

【請求項21】

前記ワクチンを投与された宿主において免疫反応を刺激する、請求項１２～２０のいずれか１項に記載のワクチン。

【請求項22】

前記宿主免疫反応が、体液性応答または適応性細胞媒介性免疫応答である、請求項２１に記載のワクチン。

【請求項23】

対象へと投与された場合に抗がんＣＤ－８ Ｔ細胞の生成を刺激する、請求項１２～２２のいずれか１項に記載のワクチン。

【請求項24】

腫瘍特異的ワクチンを製造するための方法であって、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子によりコードされる、腫瘍により発現されるペプチドを特定するステップと；前記ペプチドのうちの１つもしくは複数または前記１つもしくは複数のペプチドをコードする核酸をワクチン中へと組み込むステップとを含む方法。

【請求項25】

請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、または請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチン、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項26】

治療における使用のための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

がんの治療での使用のための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項28】

ＰＲＭＴ５阻害剤と組み合わせた、がんの治療での使用のための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項29】

がんを有する、またはがんを有することが疑われる対象を治療する方法であって、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項２５に記載の医薬組成物を前記対象へと投与するステップを含む方法。

【請求項30】

白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺がん、肝臓がん、乳がん、頭頸部がん、神経芽腫、甲状腺がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、口腔扁平上皮細胞がん、膀胱がん、ライディッヒ細胞腫瘍、胆嚢管がんまたは胆管がんなどの胆管がん、膵臓がん、結腸がん、結腸直腸がんならびに卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮がんおよび子宮頸部上皮内がんを含む子宮頸がんを含む婦人科がんからなる群より選択され、任意選択的に、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病または急性非リンパ性白血病としても公知である）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病または慢性顆粒球性白血病としても公知である）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病および有毛細胞白血病からなる群より選択される白血病であるがんの治療での使用のための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項７もしくは８に記載の核酸、請求項１２～２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項31】

腫瘍ワクチン中に包含するためのペプチドを選択するための方法であって、（ｉ）患者由来の腫瘍細胞サンプルをＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップと、（ｉｉ）前記接触させた細胞における１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップと、（ｉｉｉ）上方調節または下方調節される１つまたは複数のペプチドを腫瘍ワクチン中に包含するために選択するステップを含む方法。

【請求項32】

腫瘍ワクチン中に包含するためにペプチドを選択するための方法であって、腫瘍タイプの細胞をＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップと、前記接触させた細胞による１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップおよび上方調節または下方調節される１つまたは複数のペプチドを腫瘍ワクチン中に包含するために選択するステップとを含む方法。

【請求項33】

ステップ（ｉｉｉ）に先立って、上方調節または下方調節されるペプチドが、ＭＨＣクラスＩなどのＭＨＣを介して細胞表面上に提示されるかまたは提示され易いか否かを決定するために評価される、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺がん、肝臓がん、乳がん、頭頸部がん、神経芽腫、甲状腺がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、口腔扁平上皮細胞がん、膀胱がん、ライディッヒ細胞腫瘍、胆嚢管がんまたは胆管がんなどの胆道がん、膵臓がん、結腸がん、結腸直腸がんならびに卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮がんおよび子宮頸部上皮内がんを含む子宮頸がんを含む婦人科がんから選択され、任意選択的に、前記がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病または急性非リンパ性白血病としても公知である）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病または慢性顆粒球性白血病としても公知である）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病および有毛細胞白血病からなる群より選択される白血病である、請求項３１、３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

体液性応答または細胞媒介性免疫応答などの宿主免疫応答を刺激することによるがんの治療での使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項36】

抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子化合物からなる群より選択される、請求項３５に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項37】

ＧＳＫ３３２６５９５（ペムラメトスタット）、ＰＦ－６９３９９９９、ＪＶＮＪ－６４６１９１７８（オナメトスタット）、ＬＬＹ－２８３およびＰＲＴ５４３からなる群より選択される小分子化合物である、請求項３５または３６に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項38】

対象への前記ＰＲＭＴ５阻害剤の投与が、前記対象がＣＤ８^＋Ｔ細胞を生成することを刺激する、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項39】

前記がんが、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺がん、肝臓がん、乳がん、頭頸部がん、神経芽腫、甲状腺がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、口腔扁平上皮細胞がん、膀胱がん、ライディッヒ細胞腫瘍、胆嚢管がんまたは胆管がんなどの胆道がん、膵臓がん、結腸がん、結腸直腸がんならびに卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮がんおよび子宮頸部上皮内がんを含む子宮頸がんを含む婦人科がんからなる群より選択され、任意選択的に、前記がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病または急性非リンパ性白血病としても公知である）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病または慢性顆粒球性白血病としても公知である）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病および有毛細胞白血病からなる群より選択される白血病である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項40】

前記がんが、任意によりホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；バーキットリンパ腫；および小リンパ球性リンパ腫からなる群より選択されるリンパ腫である、請求項３９に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【請求項41】

前記がんが急性リンパ芽球性白血病である、請求項３９に記載の使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１つまたは複数の免疫原性ペプチド、および宿主に対してペプチドを提示することが可能な薬剤の投与による、哺乳動物対象における免疫応答を生起するための方法を提供する。特に、本発明は、がんの治療などでの治療的使用のためのワクチンに関する。本発明はまた、宿主免疫を刺激することによりがんを治療するためのＰＲＭＴ５阻害剤の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）－Ｅ２Ｆ経路は、細胞周期における重要な制御ポイントである。この経路は、腫瘍細胞では多くの場合に調節解除され、この経路の調節解除は、がんの「特徴」（ｈａｌｌｍａｒｋ）と広く見なされる。古典的には、ｐＲｂ腫瘍抑制因子タンパク質は、それを通してｐＲｂが細胞周期進行に対して効果を発揮する転写ハブとして機能するＥ２Ｆ転写因子の、負の調節因子である。サイクリン／ＣＤＫ複合体およびｐＲｂの逐次的リン酸化の時間的な調節は、Ｇ１／Ｓ相遷移でＥ２Ｆを解放し、Ｅ２Ｆが細胞周期進行に必要とされる遺伝子の転写を駆動することを可能にする。古典的Ｅ２Ｆ標的遺伝子としては、十分に特性決定された細胞周期、ＤＮＡ合成およびアポトーシス標的、ならびに代謝制御、分化、老化およびオートファジーに関連付けられる他のものが挙げられる（Ｂｌａｎｃｈｅｔら、２０１１；ＤｅｎｃｈｉおよびＨｅｌｉｎ、２００５；ＫｅｎｔおよびＬｅｏｎｅ、２０１９；Ｍｕｎｒｏら、２０１２；Ｒｏｗｏｒｔｈら、２０１５；Ｗｕら、２００１；Ｙａｏら、２００８）。

【0003】

ｐＲｂ－Ｅ２Ｆ経路が、元来予想されたよりもはるかに大きな遺伝子ネットワークを調節することが明らかになってきており、このことは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）５によるＥ２Ｆ１サブユニット上のアルギニンメチル化の部位で生じる、影響力のある「リーダー－ライター」イベントを反映する（Ｂａｒｃｚａｋら、２０２０；Ｃｈｏら、２０１２；Ｚｈｅｎｇら、２０１３）。残基特異的メチル化は、生物学的レベルで増殖および細胞生育を促進する中央部アルギニン（Ｒ）リッチクラスター内で起こる（Ｃｈｏら、２０１２；Ｚｈｅｎｇら、２０１３）。重要なことに、全ゲノム解析は、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１制御下にある遺伝子の大きなレパートリーを特定した（Ｒｏｗｏｒｔｈら、２０１９）。これは、そのチューダードメインによってｍｅＲマークを読み取るｐ１００／ＴＳＮを介して起こり、それにより、Ｅ２Ｆ１を転写調節因子としてのその主な役割から選択的ＲＮＡスプライシングをはじめとする遺伝子発現制御の他のレベルに対する広い影響を有するものへと切り替える（Ｒｏｗｏｒｔｈら、２０１９）。広範なヒト腫瘍におけるＰＲＭＴ５の頻繁な過剰発現およびがん細胞周期においてＥ２Ｆが果たす重要な役割は、悪性疾患の駆動におけるＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸の重要性を強く主張する。ヒトゲノムのうちの大部分は、異なる構造エレメントおよび調節エレメントから構成される非古典的遺伝子により占められ、例えば、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子および長い非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡを含む（ＧｅｂｅｒｔおよびＭａｃＲａｅ、２０１９；Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。

【0004】

ｌｎｃＲＮＡ遺伝子は、哺乳動物細胞における転写の主な起源であり、典型的には２００ヌクレオチド超の長さを有する転写産物をコードするが、そのうちの大多数は非翻訳ＲＮＡとして存在すると考えられる（Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。

【0005】

ここで、本発明者らは、非コードがんゲノム内の、長い非コード（ｌｎｃ）遺伝子の発現の制御におけるＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸の新規かつ予期せぬ役割を記載する。ＲＮＡの非翻訳集団であると広く考えられるが、本発明者らは、一群のｌｎｃＲＮＡ転写産物が、翻訳され、かつペプチドへとさらにプロセシングされることができることを見出した。重要なことに、多くのｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドは、腫瘍細胞の抗原状況（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ）に寄与し、腫瘍細胞において免疫系に対してＭＨＣクラスＩタンパク質複合体により提示される。ＰＲＭＴ５およびＥ２Ｆ１の両方は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現に影響を及ぼし、それにより、ＭＨＣクラスＩ抗原により提示されるペプチドのレパートリーを制御する。ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸の薬理学的制御は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子から誘導される腫瘍関連抗原のプロファイルを変化させ、それにより、有効な適応免疫応答に影響を及ぼす。

【0006】

本明細書中に記載される通り、本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチド抗原から構成される独立型治療用ワクチンを設計し、これが免疫原性であり、かつ有効な抗腫瘍免疫応答を促進することを見出した。これらの結果は、ＰＲＭＴ５が、Ｅ２Ｆ活性を非コードゲノムおよび腫瘍細胞の抗原状況へと結び付けることを示す。したがって、ＰＲＭＴ５活性を操作することは、腫瘍細胞の免疫原性を制御するための治療戦略を提示する。

【0007】

がんワクチンおよび長期的腫瘍特異的免疫は、様々な腫瘍のヒトまたは動物治療の管理、および腫瘍再発の予防に対して有用であると判明し得る。本発明は、ワクチン免疫療法のための新規ツールおよび方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】ＨＣＴ１１６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。ＷＴ Ｅ２Ｆ１ ＤＭＳＯ処理細胞に対する、示される通りに４８時間にわたってＴ１－４４を用いて処理されたＷＴまたはＥ２Ｆ１ Ｃｒ細胞株において３０％レベル（ｑ＜０．０５）で上方調節または下方調節されたｌｎｃＲＮＡ転写産物の交差点を実証するＶｅｎｎ図表。

【図1B】ＨＣＴ１１６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。ＷＴ Ｅ２Ｆ１ ＤＭＳＯ処理細胞に対して、各細胞株および処理において統計学的に有意なレベル（ｑ＜０．０５）で差次的に上方調節および下方調節されるｌｎｃＲＮＡ転写産物の総数を表すための棒グラフ。変化倍率カットオフは、データに対して適用しなかった。

【図1C】ＨＣＴ１１６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。（ｉ）ＷＴ Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ１ Ｃｒ細胞株を、４８時間にわたって１μＭ Ｔ１－４４を用いて処理し、その後、示されるｌｎｃＲＮＡ転写産物の発現を決定するためのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った（それらのＥＮＳＥＭＢＬ転写産物名称によって標識される）。（ｉｉ）免疫ブロットもまた、Ｅ２Ｆ１の入力タンパク質レベルを表示するために含められ、ＳＤＭｅを、Ｔ１－４４活性に対するマーカーとして用いた。

【図1D】ＨＣＴ１１６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。（ｉ）ＷＴ Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ１ Ｃｒ細胞株を、４８時間にわたって１μＭ Ｔ１－４４を用いて処理し、その後、クロマチン抽出およびＥ２Ｆ１特異的抗体、またはＩｇＧ対照抗体を用いるＣｈＩＰ分析を行った。ＥＮＣＯＤＥからのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、各ｌｎｃＲＮＡ遺伝子（矢印によりマークされる）のＴＳＳ周囲の潜在的Ｅ２Ｆ１結合性部位（比較的小さな赤色四角形によりマークされる［矢印なし］）を特定するために用い、ｑＰＣＲでの使用のために、プライマーをこれらの部位の周囲で設計した。ＣＤＣ６およびアクチン遺伝子を、それぞれ、陽性および陰性対照として含めた。（ｉｉ）免疫ブロットもまた、Ｅ２Ｆ１の入力タンパク質レベルを表示するために含められ、ＳＤＭｅを、Ｔ１－４４の活性を示すために用いた。

【図2A】インビトロおよび腫瘍としてインサイチューで生育されたＣＴ２６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。ＣＴ２６（３０％変化、ｑ＜０．０５）ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット中でＴ１－４４処理後に差次的に上方調節または下方調節されたｌｎｃＲＮＡ転写産物の数の棒グラフ表示。

【図2B】インビトロおよび腫瘍としてインサイチューで生育されたＣＴ２６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。Ｅ２Ｆ１を標的化する２種類の異なるｓｉＲＮＡを、７２時間にわたってＣＴ２６細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの８時間後に１μＭ Ｔ１－４４を用いて追加的に処理し、その後、示されるｌｎｃＲＮＡ転写産物の発現を決定するためのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った（それらのＥＮＳＥＭＢＬ転写産物名称によって標識される）。免疫ブロットもまた、Ｅ２Ｆ１の入力タンパク質レベルを表示するために含められ、ＳＤＭｅを、Ｔ１－４４活性に対するマーカーとして用いた。

【図2C】インビトロおよび腫瘍としてインサイチューで生育されたＣＴ２６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。（ｉ）ｃｏｌｏｎ２６腫瘍（ｉ）でのＴ１－４４を用いる実験の模式的表示。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ビヒクルのみの対照と比較して、１９日間にわたって１００ｍｇ／ｋｇで経口投与されるＴ１－４４を用いて処置した；群当たりｎ＝７；（ｉｉ）平均値（±ＳＥＭ）として提示されるＴ１－４４処置（正方形）および未処置（円形）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける絶対腫瘍生育体積、ｎ＝７；（ｉｉｉ）１２日目での個別のマウスの絶対腫瘍体積の散布図（ｔ検定；^＊ｐ＜０．０５）、ｎ＝７；Ｔ１－４４処置（右側）および未処置（左側）。（ｉｖ）平均値として提示されるＴ１－４４処置（正方形）および未処置（三角形）Ｂａｌｂ／ｃマウスの相対的体重表示、ｎ＝７；（ｖ）処置（点線）および未処置マウス（実線－ｄ１６で終了）の生存曲線（ログランク（マンテル－コックス）検定；^＊ｐ＜０．０５）、ｎ＝７。

【図2D】インビトロおよび腫瘍としてインサイチューで生育されたＣＴ２６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。示される通りにＤＭＳＯまたはＴ１－４４を用いて処理したｃｏｌｏｎ２６腫瘍からＲＮＡを単離し、その後、示されるｌｎｃＲＮＡ転写産物の発現を決定するためのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った（それらのＥＮＳＥＭＢＬ転写産物名称によって標識される）。

【図2E】インビトロおよび腫瘍としてインサイチューで生育されたＣＴ２６細胞中に存在するｌｎｃＲＮＡ転写産物の差次的発現解析を示す図である。（ｉ）１００ｍｇ／ｋｇ Ｔ１－４４を用いた処置の１９日間後のＢａｌｂ／ｃマウスまたは未処置対照から１４日目に回収したｃｏｌｏｎ２６腫瘍中のＳＤＭｅの免疫組織化学染色の代表例（図２Ｃの実験を参照されたい）。元の倍率：２０倍、スケールバー、５０μｍ；および６３倍；スケールバー、１６μｍ。ｎ＝４；（ｉｉ）上記の通りであるが、免疫組織化学染色は抗ＣＤ８を用いて行った；（ｉｉｉ）上記の通りであるが、免疫組織化学染色は抗ＣＤ４を用いて行った；（ｉｖ）上記の通りであるが、免疫組織化学染色は抗ＣＤ１６３を用いて行った；（ｖ）結果を、ＩｍａｇｅＪ Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて定量化し、標準化された光学密度を、平均±ＳＤとして提示した。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを用いる対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った、ｎ＝４。対照を上側パネルに示し、Ｔ１－４４を下側パネルに示す。

【図3A】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。免疫ペプチドミクスプラットフォームのワークフローを示すための図表。細胞表面ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体から抽出したペプチドが、質量分析により検出され、社内ｌｎｃＲＮＡプロテオームデータベース、またはすべての審査されたマウスＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーからなるデータベースに対する比較により特定される。続いて、候補ペプチドは、それらの予測される免疫原性、ＭＨＣ結合親和性およびＲＮＡ発現プロファイルに基づいてランク付けされ、その後、樹状細胞に基づくがんワクチンの一部分としての選択に供される。

【図3B】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。ＣＴ２６細胞を、１μＭ Ｔ１－４４またはＤＭＳＯ（対照）を用いて７２時間にわたって処理し、その後、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対して特異的な抗体を用いる免疫沈降および質量分析のためのＭＨＣ結合型ペプチドの抽出を行った。実験は、生物学的複製（ｒｅｐ１、ｒｅｐ２）で行った。各処理および生物学的複製間での定性的免疫ペプチドミクス解析から特定されるＭＨＣ結合型ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドの重複が、Ｖｅｎｎ図表中に示される。３２８種類のペプチドを、Ｐｅａｋｓソフトウェアを用いて検出した。

【図3C】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉ）ＣＴ２６免疫ペプチドミクス解析からの特定されたｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドが結合した各ＭＨＣ対立遺伝子に関する予測上の対立遺伝子頻度を棒グラフ上に表示し、合計のうちのパーセンテージとして表される；（ｉｉ）各ＭＨＣ対立遺伝子に対する免疫ペプチドミクス解析から特定されたタンパク質コード遺伝子から誘導されるＭＨＣクラスＩ結合型ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドにおけるアミノ酸残基保存を実証する配列ロゴ。

【図3D】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。マウスｌｎｃＲＮＡデータベースから誘導されるとして特定された各ペプチドのペプチド長が、グラフ上に表示される。１９５種類のペプチドが、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアを用いる定量的解析において検出された。

【図3E】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。Ｇｍ３７２８３、Ｇｍ１７１７３、およびＧｍ３７４９４ ｌｎｃＲＮＡ転写産物の配列の一部分が、特定されたＭＨＣクラスＩ結合型ペプチド（四角形）を生じる、予測上のＯＲＦ（灰色強調で示される）と共に表示される（それぞれ、配列番号１７７、１７８および１７９）。アミノ酸配列は、配列番号１８０～１８７に示される。

【図3F】ＣＴ２６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉ）各回収画分（２５４ｎｍでの吸光度読み出し値により）中で検出された総ＲＮＡ量を示す、１μＭ Ｔ１－４４またはＤＭＳＯを用いて７２時間にわたって処理されたＣＴ２６細胞において行われた例示的ポリソームプロファイリングアッセイ。遊離未結合ＲＮＡを表す画分（画分１～５）；８０Ｓリボソーム画分（画分６）；および漸増ポリソームサイズを有するポリソーム画分（画分７～１２）が示される。（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩペプチドを生じる、７２時間にわたってＤＭＳＯまたは１μＭ Ｔ１－４４を用いて処理されたＣＴ２６細胞からのＧｍ３７４９４ ｌｎｃＲＮＡに関するポリソームプロファイリングアッセイが表示される。データは、各画分中の総ＲＮＡのうちのパーセンテージとして表される；ｎ＝３；（ｉｉｉ）示されるｌｎｃＲＮＡリボソームプロファイリングアッセイのうちのそれぞれからの重い（画分１０～１２）から軽い（画分６～９）ポリソーム比の算出による、ポリソームプロファイリングアッセイの定量化；（ｉｖ）免疫ブロットが、Ｔ１－４４活性の尺度としてＳＤＭｅレベルを実証するために含められる。

【図4A】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭ Ｔ１－４４またはＤＭＳＯ（対照）を用いて４８時間処理し、その後、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対して特異的な抗体を用いる免疫沈降および質量分析のためのＭＨＣ結合型ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドの抽出を行った。実験は、生物学的複製（ｒｅｐ１、ｒｅｐ２）で行った。各処理および生物学的複製間での定性的免疫ペプチドミクス解析から特定されるＭＨＣ結合型ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドの重複が、Ｖｅｎｎ図表中に示される。５５種類のペプチドを、定性的ＧＥＮＣＯＤＥ注釈付きデータベースから特定した。

【図4B】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉ）免疫ペプチドミクス解析からの特定されたｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドが結合した各ＭＨＣ対立遺伝子に関する予測上の対立遺伝子頻度を棒グラフ上に表示し、合計のうちのパーセンテージとして表される；（ｉｉ）各ＭＨＣ対立遺伝子に対する免疫ペプチドミクス解析から特定されたｌｎｃＲＮＡ遺伝子から誘導されるＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドにおけるアミノ酸残基保存を実証する配列ロゴ。

【図4C】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。ｌｎｃＲＮＡ ＧＥＮＣＯＤＥデータベース（ＰＲＯＧＥＮＥＳＩＳソフトウェア解析）から誘導されるとして特定された各ペプチドのペプチド長が、グラフ上に表示される。７６種類のペプチドが、定量的ＧＥＮＣＯＤＥデータベースから特定された。

【図4D】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉ）各回収画分（２５４ｎｍでの吸光度読み出し値により）中で検出された総ＲＮＡ量を示す、１μＭ Ｔ１－４４またはＤＭＳＯを用いて４８時間にわたって処理されたＨＣＴ１１６細胞において行われた例示的ポリソームプロファイリングアッセイ。遊離未結合ＲＮＡを表す画分（画分１～５）；８０Ｓリボソーム画分（画分６）；および漸増ポリソームサイズを有するポリソーム画分（画分７～１２）が示される；（ｉｉ）４８時間にわたってＤＭＳＯまたは１μＭのＴ１－４４を用いて処理されたＨＣＴ１１６細胞からのＭＡＬＡＴ１およびＡＣ０７９１３５．１のｌｎｃＲＮＡに関するポリソームプロファイリングアッセイが表示される。データは、各画分中の総ＲＮＡのうちのパーセンテージとして表される；ｎ＝３；（ｉｉｉ）４８時間にわたってＤＭＳＯまたは１μＭのＴ１－４４を用いて処理されたＨＣＴ１１６ ＷＴおよびＥ２Ｆ１ Ｃｒ細胞からの示されるｌｎｃＲＮＡリボソームプロファイリングアッセイのうちのそれぞれからの重い（画分１０～１２）から軽い（画分６～９）ポリソーム比の算出による、ポリソームプロファイリングアッセイの定量化；（ｉｖ）免疫ブロットが、Ｔ１－４４活性の尺度としてＳＤＭｅレベルを実証するために含められる。

【図4E-1】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉ）ＭＨＣクラスＩ上に提示されるペプチドをコードすることが見出されたヒトｌｎｃＲＮＡ転写産物からの予測上のＯＲＦの挿入のためのクローニングベクターとして用いたｐＳＦ－ＣＭＶ－ＮＥＯ－ＣＯＯＨ－ＦＬＡＧプラスミドの模式的表示。予測上のＯＲＦおよび上流配列の短いセクション（いずれかの内因性Ｋｏｚａｋ配列を含む）を、Ｃ末端３×ＦＬＡＧタグとインフレームでベクターのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）へとライゲーションした。

【図4E-2】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。（ｉｉ）ＭＡＬＡＴ１およびＡＣ０７９１３５．１ ｌｎｃＲＮＡ転写産物の配列の一部分が、特定されたＭＨＣクラスＩ結合型ペプチド（四角形）を生じる、予測上のＯＲＦ（灰色強調で示される）と共に表示される（配列番号１８８、１８９）。アミノ酸配列は、配列番号１８９～１９３に示される。このＯＲＦを、Ｃ末端ＦＬＡＧタグの上流でｐＳＦ－ＣＭＶ－ＮＥＯ－ＣＯＯＨ－３ｘＦＬＡＧベクターへとクローニングした。（ｉｉｉ）４μｇのＭＡＬＡＴ１およびＡＣ０７９１３５．１ ＯＲＦ－Ｆｌａｇプラスミドを４８時間にわたってＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクションし、その後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる免疫蛍光分析を行った。ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。（ｉｖ）４μｇのＭＡＬＡＴ１およびＡＣ０７９１３５．１ ＯＲＦ－ＦｌａｇプラスミドをＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクションし、その後、Ｆｌａｇ抗体を用いる免疫ブロット分析を行った。

【図4F】ＨＣＴ１１６細胞の免疫ペプチドミクス解析を示す図である。４μｇのＭＡＬＡＴ１（ＭＡＬ）またはＡＣ０７９１３５．１（ＡＣ）ＯＲＦ－Ｆｌａｇプラスミドおよび０．５μｇのＧＦＰプラスミドを７２時間にわたってＨＣＴ１１６ ＷＴ Ｅ２Ｆ１およびＨＣＴ１１６ Ｅ２Ｆ１Ｃｒ細胞にトランスフェクションした。最後の４８時間は、ＤＭＳＯまたは１μＭのＴ１－４４を用いても細胞を処理し、その後、示される抗体を用いる免疫ブロット分析を行った。ＳＤＭｅを、Ｔ１－４４化合物の活性を実証するために含めた。

【図5A】ＴＣＧＡおよびがん細胞株データセットを用いて正常組織に対して腫瘍における発現を比較する、ｌｎｃＲＮＡ転写産物をコードするペプチドのヒートマップを示す図である。青色ヒートマップ（上側）－正常組織に対応する腫瘍の解剖学的部位に応じる全サンプルの平均［ｌｏｇ２（ｆｐｋｍ＋０．００１）］として表される発現；赤色／緑色ヒートマップ（左下）－腫瘍／正常比の表示［Ｌｏｇ２（腫瘍／正常ＦＰＫＭ比）］、赤色（ＭＡＬＡＴ１において豊富）は正常でのより高い発現を表し、緑色は腫瘍組織でのより高い発現を表す；橙色ヒートマップ（中央下）－異なる結腸直腸がん細胞株での発現レベル［Ｌｏｇ２（ｆｐｋｍ＋０．００１）］；明青色（右下）－マイクロサテライト安定性患者および不安定性患者における未処理Ｚスコア標準化発現レベル。

【図5B】数種類のｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現に関する、副腎皮質がん（ｉ）、結腸直腸がん（ｉｉ）、および膵臓がん（ｉｉｉ）を有する患者の全生存期間のカプラン・マイヤー曲線を示す図である。Ｇｅｐｉａ２ツールを用いてプロットを作成した。各分析に関して、患者を２つの群に分け、一方は高発現（赤色線）であるか、または一方は低発現（青色線）であった。

【図5C】ＤＭＳＯ対照に対する、Ｔ１－４４を用いて処理したＣＴ２６細胞に対する免疫ペプチドミクス実験で特定されたマウスｌｎｃＲＮＡによりコードされる２０種類の選択されたペプチドの特性決定を示す図である。左から順番に、各列は、ペプチドの配列、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子名、転写産物登録ＩＤ；ペプチド長；正味ＭＨＣｐａｎスコアおよび対立遺伝子列は結合親和性予測解析からの結果を示す；ペプチド存在量変化倍率（Ｔ１－４４処理対ＤＭＳＯ処理）（ＰＲＯＧＥＮＥＳＩＳソフトウェアを用いて誘導される）；ＣＴ２６細胞における発現レベル（本発明者らの社内ＲＮＡ－ｓｅｑデータベースおよび他のデータベース－ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲソフトウェアに基づく）（低－ｌｏｇ２ＴＰＭ＜７．５；中－ｌｏｇ２ＴＰＭ ８．５～１１．５；高－ｌｏｇ２ＴＰＭ＞１１．５）；胸腺における発現（ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＴＬＡＳ－ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅおよびＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲソフトウェアに基づく）（低－ｌｏｇ２ＴＰＭ＜７．５；中－ｌｏｇ２ＴＰＭ ８．５～１１．５；高－ｌｏｇ２ＴＰＭ＞１１．５；カットオフ未満－発現なし）を特徴付け；最後の列は、免疫原性実験からの結果を表す。

【図6A】ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルにおけるがんワクチンとしてのｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩペプチドを示す図である。（ｉ）ｌｎｃＲＮＡから誘導されるとして特定されるＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドに対する免疫応答を測定するために用いた免疫原性アッセイの模式的表示。簡潔には、各５種類のペプチドのプールを含む４群（各群中４匹のマウス）へと分けられる２０種類のペプチド（各５０μｇ）を用いて、０日目にＢａｌｂ／ｃマウスにワクチン接種し、追加ワクチン接種を７日間後に行った。アジュバントとして、ＣＤ４０抗体およびｐｏｌｙ：ＩＣを用いた。陽性対照として、ＡＨ１ペプチド（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；配列番号１５６）ワクチン接種を用いた。追加免疫の７日間後にマウスを殺処分し、脾臓を取り出して、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイのための脾細胞を単離した。（ｉｉ）それぞれ別個のマウス由来の脾細胞を、その群がそれを用いてワクチン接種された個別の個々のペプチド（１５μＬ／ｍＬ）を用いて刺激した。各ペプチドを、示されるペプチドを用いて２回反復で試験し、インターフェロンγに基づくＥＬＩｓｐｏｔアッセイで活性を測定した。ＤＭＳＯを陰性対照として用いた。スポットを、ＥＬＩＳＰＯＴカウンタ上で定量化した。

【図6B】ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルにおけるがんワクチンとしてのｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩペプチドを示す図である。（ｉ）ｃｏｌｏｎ２６腫瘍負荷実験で用いた樹状細胞（ＤＣ）に基づくワクチン戦略の模式的表示。０日目での１５種類のｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドのプールおよび７日目での第２用量を用いてパルス刺激した樹状細胞（ＤＣ）を用いて、無作為化したＢａｌｂ／ｃマウスにワクチン接種した。対照として、未パルス刺激樹状細胞を用いた；ｎ＝６。（ｉｉ）平均値（±ＳＥＭ）として提示される未パルス刺激およびパルス刺激ＤＣ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける絶対腫瘍生育体積、ｎ＝６。（ｉｉｉ）１２日目での個別のマウスの絶対腫瘍体積の散布図（ｔ検定；^＊ｐ＜０．０５）、ｎ＝６；（ｉｖ）平均値として提示される未パルス刺激およびパルス刺激ＤＣ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスの相対的体重表示、ｎ＝７。

【図6C】ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルにおけるがんワクチンとしてのｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩペプチドを示す図である。Ｅ２Ｆ１－ＰＲＭＴ５軸によるｌｎｃＲＮＡ由来抗原提示の調節を示すためのモデル図。Ｅ２Ｆ１のＰＲＭＴ５標的化メチル化が、ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体に対する提示のためのペプチドエピトープを生成するようにプロセシングされることができるポリペプチドへとその後に翻訳される多数のｌｎｃＲＮＡの発現をはじめとする、多数の遺伝子に対するその転写活性に影響を及ぼすことが提案される。化合物Ｔ１－４４を用いるＰＲＭＴ５活性の薬理学的操作は、免疫原性ペプチドをコードする数種類のｌｎｃＲＮＡ転写産物の変化した発現をもたらす。本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ複合体によるこれらの免疫原性ペプチドの後続の提示が、観察される腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の増加した免疫細胞浸潤に寄与することを提案する。

【発明の概要】

【0009】

本発明の第１の態様によれば、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドまたはその誘導体が提供される。

【0010】

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様に従うペプチドをコードする核酸配列が提供される。

【0011】

本発明の第３の態様によれば、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターが提供される。好適には、ベクターは、本発明の第２の態様の核酸を発現することが可能な発現ベクターである。本発明の核酸を発現させることはまた、配列によりコードされるペプチドを生成することも含む。

【0012】

本発明の第４の態様によれば、本発明の第２の態様の核酸または本発明の第３の態様のベクター（例えば、発現ベクター）を含む宿主細胞が提供される。

【0013】

本発明の第５の態様によれば、本発明の第１の態様の少なくとも１種のペプチドまたは本発明の第２の態様の核酸または本発明の第３の態様のベクターを含むワクチンが提供される。

【0014】

本発明の第６の態様によれば、腫瘍特異的ワクチンを製造するための方法であって、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子によりコードされる、腫瘍により発現されるペプチドを特定するステップ；および前記ペプチドのうちの１つもしくは複数または前記１つもしくは複数のペプチドをコードする核酸をワクチンへと組み込むステップを含む方法が提供される。任意により、前記ペプチドはまた、免疫原性であるかまたはＭＨＣクラス１分子に結合することを確認するためにも試験される。

【0015】

本発明の第７の態様によれば、本発明の第１の態様のペプチド、本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

【0016】

本発明の第８の態様によれば、療法での使用のための、本発明の第７の態様の医薬組成物または本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンが提供される。好適には、療法はがんの治療である。特定の実施形態では、がんの治療は、ＰＲＭＴ５阻害剤と組み合わせた、本発明の第７の態様の医薬組成物または本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンの投与を含む。

【0017】

本発明の第９の態様によれば、腫瘍ワクチン中への包含のためにペプチドを選択するための方法であって、腫瘍細胞サンプルをＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップおよび接触させた（処理した）細胞による１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップおよび腫瘍ワクチン中への包含のために調節解除されかつ免疫原性である１つまたは複数のペプチドを選択するステップを含む方法が提供される。好適には、腫瘍細胞サンプルは、がん／腫瘍を有する患者から取得される。好適には、ペプチドは、腫瘍細胞において上方調節されるものである。

【0018】

つまり、本発明の第９の態様の変形では、腫瘍ワクチン中への包含のためにペプチドを選択するための方法であって、腫瘍タイプの細胞をＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップおよび接触させた細胞による１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップおよび腫瘍ワクチン中への包含のために上方調節される１つまたは複数のペプチドを選択するステップを含む方法が提供され、任意により、選択に先立って、ペプチドはまた、免疫原性であるか否かを決定または予測するためにも試験され、かつ１つまたは複数の免疫原性ペプチドが腫瘍ワクチン中への包含のために選択される。

【0019】

本発明の第１０の態様によれば、ワクチンを製造するための方法であって、本発明の第９の態様に従ってワクチン中への包含のためにペプチドを選択するステップおよび前記ペプチドを提示することが可能なワクチンを生成するステップを含む方法が提供される。

【0020】

本発明の第１１の態様によれば、免疫応答を刺激することによる、がんの治療における使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤が提供される。

【0021】

別途定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものに類似または均等である方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定的であることは意図されない。

【0022】

本発明の他の特徴および利点が、以下から明らかであろう。

【発明を実施するための形態】

【0023】

開示される方法は、本開示の一部分を形成する以下の詳細な説明を参照して、より容易に理解することができる。開示される方法は、本明細書中に記載されかつ／または示される具体的な方法に限定されないこと、および本明細書中で用いられる用語は例を用いて特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、かつ特許請求される方法の限定であることは意図されないことが理解されるべきである。

【0024】

本開示の方法は、別途示されない限り、当技術分野の技能の範囲内である、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の慣用の技術を利用するであろう。例示的な技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９８７）；ならびに「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４）などの文献中に完全に説明される。

【0025】

別途示されない限り、本明細書中で用いられる各遺伝子名は、遺伝子に対して割り当てられかつ本出願の出願日時点でＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）により提供される正式な記号に対応する。

【0026】

［定義］
特定の数値に対する参照は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。値の範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／または他の特定の値までを含む。さらに、範囲中に明記される値に対する参照は、その範囲内のそれぞれおよびすべての値を含む。すべての範囲は、包含的かつ結合可能である。

【0027】

明確性のために、別個の実施形態の文脈において本明細書中に記載される開示される方法の特定の特徴はまた、単一の実施形態中で組み合わせて提供される場合もあることが理解されるべきである。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈において記載される開示される方法の様々な特徴はまた、別個にまたはいずれかの下位組み合わせで提供される場合もある。

【0028】

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法上の目的語のうちの１つまたは２以上（すなわち、少なくとも１つ）を意味するために本明細書中で用いられる。

【0029】

選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの一方、両方、またはそれらの組み合わせのいずれかを意味することが理解されるべきである。

【0030】

用語「および／または」は、選択肢のうちの一方、または両方のいずれかを意味することが理解されるべきである。

【0031】

先行詞「約」を用いることにより、値が近似値として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。

【0032】

本明細書中で用いられる場合かつ別途明記されない限り、用語「約」は用語「概ね」と同義的に用いられることが理解されるべきである。例示的にかつ別途明記されない限り、用語「約」の使用は、挙げられる基準値の若干外側の値、例えば、±１５％、±１０％、±８％、±５％または簡便には±２％を示す。したがって、そのような値は、用語「約」または「概ね」を記載する請求項の範囲により包含される。

【0033】

本明細書中で用いる場合、用語「インビトロ」とは、試験管、培養ディッシュ、または生存生物の外側の他の場所において実行されるかまたは行われることを意味する。分析が生物の外側で行われるので、この用語はまた、エクスビボも含む。

【0034】

本明細書中で用いる場合、用語「単離されている」とは、その生来の状態では通常それに伴う成分を実質的または本質的に含まない物質を意味する。「対象から単離されている」の文脈では、これは、対象から取り出されることを意味することができる。特定の実施形態では、用語「取得されている」または「誘導されている」は、「単離されている」と同義的に用いられる。

【0035】

「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書中で用いる場合、本発明を用いて試験することができるいずれかの動物を含む。好適な対象としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、畜産動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタなど）、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。ある種の実施形態では、対象は非ヒト霊長類であり、特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0036】

＜本発明のペプチド＞
本発明は、部分的には、ＰＲＭＴ５の阻害に供された腫瘍細胞が、長い非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡ遺伝子によりコードされることが本発明者らにより特定された、細胞表面を含む腫瘍細胞における様々なペプチドの増加した発現をもたらすという認識に基づく。そのようなペプチドは、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される。差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡのバイオインフォマティクス解析は、これらのうちの大部分が、Ｅ２Ｆ結合性部位を伴うかまたは保持したことを見出し、このことは、これらがＥ２Ｆ１の転写制御下にあることを暗示した。

【0037】

本発明者らは、これらのペプチドのうちの多くが、免疫原性であり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合することが可能であり、かつ宿主免疫応答を生起し、これが腫瘍細胞生育の減速をもたらしたことを発見した。したがって、これらのペプチドは、ワクチン設計において利用することができる腫瘍関連抗原の新規供給源である。

【0038】

本発明の一態様はまた、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を刺激することによるがんの治療での使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤にも関する。腫瘍細胞を標的化するこの新規メカニズムは、ＰＲＭＴ５阻害の直接的ながん死滅作用に対する抵抗性を獲得したがんを治療する能力をはじめとする、新規臨床的用途を提案する。さらに、これらのペプチドに曝露された樹状細胞は、腫瘍細胞生育を減速させることが可能であり、このことは、これらのペプチドが、宿主免疫応答を刺激するための、かつしたがって、ワクチン中での使用に対して好適な薬剤として機能することができることを実証した。したがって、本発明のペプチドは、療法において、特にがんの治療において用いることができる。

【0039】

ヒトゲノムのうちの大部分は、異なる構造エレメントおよび調節エレメントから構成される非古典的遺伝子により占められ、例えば、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子および長い非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡを含む（ＧｅｂｅｒｔおよびＭａｃＲａｅ、２０１９；Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子（本明細書中でｌｎｃＲＮＡまたはｌｎｃ遺伝子と称される）は、哺乳動物細胞における転写の主な起源であり、典型的には２００ヌクレオチド超の長さを有する転写産物をコードする。しかしながら、ｌｎｃＲＮＡ転写産物のうちの少数がｍＲＮＡと同じ様式でプロセシングされることが示され、稀な場合に生物学的役割を果たすことが示唆されている一方で、それらのうちの大多数は非翻訳ＲＮＡとして存在すると考えられた（Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。

【0040】

本発明の第１の態様によれば、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドまたはその誘導体が提供される。

【0041】

好適には、ペプチドは免疫原性である。好適には、ペプチドはＭＨＣクラスＩ関連ペプチドまたはその誘導体である。好適には、ペプチドは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子により提示される。好適には、ペプチドは単離されている。

【0042】

用語「単離されている」とは、本明細書中で用いる場合、一般的に、成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離もしくは精製されており；かつ／または天然分子の比較的短い成分である、生物学的成分（核酸分子、タンパク質またはペプチドなど）を意味する。「単離されている」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸、タンパク質およびペプチドも包含する。

【0043】

好適には、ｌｎｃＲＮＡ転写産物は、予測上のＥ２Ｆ結合性部位を有する。

【0044】

好適には、ペプチドは、予測上のＥ２Ｆ結合性部位も有するｌｎｃＲＮＡ転写産物の一部分によりコードされるアミノ酸配列を有する。Ｅ２Ｆ結合性部位は、Ｅ２Ｆ１に結合する遺伝子のプロモーター中のＤＮＡ配列である。Ｅ２Ｆ１は転写因子であり；ＤＮＡ配列に結合したら、続いて、Ｅ２Ｆ１は遺伝子の転写を駆動することができる。カノニカルなＥ２Ｆ１結合性部位配列はＴＴＴＳＳＣＧＣであり、ここでＳはグアニンまたはシトシンである。

【0045】

好適には、ペプチドは、表１に開示されるもの、またはその中に開示されるペプチドの誘導体である。

【0046】

【0047】

ペプチドは、５アミノ酸を超えるいずれかの長さのものであり得る。典型的には、ペプチドは、６～３０アミノ酸長の範囲内、例えば８～２０アミノ酸長である。実施例において特定されるＭＨＣ１により提示される免疫原性ペプチドは、９アミノ酸の平均長さを有した。特定の実施形態では、免疫原性ペプチドは、８、９または１０アミノ酸長である。

【0048】

第１の態様のペプチドは、本発明のペプチドまたは本発明のｌｎｃＲＮＡ遺伝子ペプチドと本明細書中で称される場合がある。

【0049】

ペプチドのうちの１つの「誘導体」とは、ペプチドの免疫原性を維持するための要件下にある、アミノ酸欠失、付加または置換を含むことができる突然変異体または変異体ペプチドを意味する。つまり、５’または３’末端からの切断の場合など、実質的にペプチドの性質を変化させることなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。さらに、欠失および置換を、本発明のペプチドに対して行うことができる。ペプチドの置換、欠失または挿入による変異体は、組み換え法により調製し、かつ生来型ペプチドとの交差反応性についてスクリーニングすることができる。誘導体はまた、融合タンパク質も包含し、このとき、融合タンパク質の一部分が本発明のペプチドであり、他の部分のいくつかは他のペプチド配列である。「から誘導される」は、ペプチドがｌｎｃＲＮＡから発現されるポリペプチドの一部分である状況を含む。つまり、例示の目的で、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子が８０アミノ酸長のポリペプチドをコードする場合、そこから誘導されるペプチドは、８または９アミノ酸以上であるが８０アミノ酸よりも少ないペプチドなど、その比較的小さな一部分であり得る。

【0050】

したがって、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドは、翻訳されたポリペプチド全体またはその一部分、すなわち、ペプチドであり得る。好適には、ペプチドは免疫原性である。好適には、ペプチドは、例えば、抗原－ＭＨＣクラス１複合体として、ＭＨＣクラス１分子上に提示されることが可能である。

【0051】

特定の実施形態では、ペプチドの誘導体は、ペプチドとの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を含む。親ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドに関して、そのような誘導体ペプチドは、親ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの改変型変異体と称される場合がある。

【0052】

＜核酸および宿主細胞＞
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様に従うペプチドをコードする核酸配列が提供される。

【0053】

好適には、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである。

【0054】

本発明の第３の態様によれば、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターが提供される。プラスミド、コスミド、ウイルスベクターなどのいずれかのベクターを用いることができる。ベクターは、例えば、細菌形質転換、細胞培養およびベクター精製の標準的アプローチを用いて、インサート配列の多数のコピーを増幅するために用いることができる。ベクターはまた、コードされるタンパク質の発現を促進することもできる。

【0055】

特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、かつ本発明の第２の態様の核酸を発現することが可能である。本発明の第２の態様の核酸を発現させることはまた、配列によりコードされるペプチドを生成することも含む。

【0056】

本発明の第４の態様によれば、本発明の第２の態様の核酸または本発明の第３の態様のベクターを含む宿主細胞が提供される。

【0057】

いずれかの好適な宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞を用いることができ、特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌、真菌（酵母を含む）、および哺乳動物細胞からなる群より選択される。

【0058】

＜ワクチン＞
がんワクチンは、一般的に、タンパク質抗原／アジュバントワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルスベクターに基づくワクチン、腫瘍細胞ワクチン、および樹状細胞ワクチンの分類のうちの１つに関する。ワクチンのこれらのタイプのうちのいずれかを、本発明において利用することができる。

【0059】

本発明の第５の態様によれば、本発明の第１の態様に従う少なくとも１種のペプチドまたは本発明の第２の態様の核酸または本発明の第３の態様のベクターを含むワクチンが提供される。

【0060】

ワクチン技術は十分に進歩しており、身体の免疫細胞に対して本発明のペプチドを提示することが可能ないずれかのワクチンプラットフォームを利用することができる。好適には、ワクチンは、タンパク質抗原／アジュバントワクチン、ペプチドワクチン、ＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン、ベクターワクチンまたは樹状細胞ワクチンである。好適には、ベクターワクチンはウイルスベクターワクチンである。

【0061】

選択された抗原ペプチドがワクチン中に含められ、かつ免疫応答を惹起するために抗原提示細胞上に提示されるペプチドワクチンを用いることができる。ペプチドワクチンは、多くの場合、局所免疫応答をプライミングするためのアジュバントと共に同時投与される。ペプチドは、ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋特異的Ｔ細胞を刺激する必要があり、したがって、ペプチドワクチンのうちの大部分は、その免疫原性部分を含む入れ子状のＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む、８～３０アミノ酸長付近のペプチドを用いる。免疫原性部分は、ＭＨＣ１が結合するペプチドであり、そのような免疫原性ペプチドは、典型的には８、９または１０アミノ酸長であり、９アミノ酸長が最も普通であろう。好適には、多数の抗原が同時に標的化されてポリクローナル抗原Ｔ細胞応答を生じ、免疫応答を強化しかつ腫瘍細胞上でのいずれかの抗原欠損を軽減することができるように、多ペプチドワクチンが用いられる。

【0062】

ペプチドワクチンの利点は、化学合成することができ、大規模かつ他のがん治療と比較して低減されたコストで製造することができることである。

【0063】

がんワクチン中のペプチド抗原との遊離アジュバントの投与は、注入後にそれらの解離を生じ得る。これに対処するための１つの選択肢は、例えば、直接的コンジュゲート化により、アジュバントとペプチド抗原とを互いに連結することである。ペプチドは、抗原提示細胞へのより効率的な送達のために、脂質などの疎水性担体、脂肪酸およびＴＬＲアゴニストに連結することができる。

【0064】

本発明の特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のペプチドは、アジュバントにコンジュゲート化される。

【0065】

核酸に基づくワクチンは、細胞に侵入し、抗原エピトープ（例えば、本発明のペプチド）を転写、翻訳およびプロセシングして、それらがＭＨＣに対して提示されかつ宿主免疫応答を生起することができように設計される。

【0066】

ＤＮＡワクチンは、設計が簡単であり、生成するのが比較的安価であり、かつ合理的な安定性（２～８℃）および溶解度を有する。プラスミドＤＮＡワクチンは、抗原およびアジュバントの両方として機能するために設計することができ、ＣＧリッチ領域を含む非メチル化ＤＮＡはまた、アジュバントとしても機能することができる。プラスミドＤＮＡは、抗原提示細胞へと取り込まれるように設計することができ、ここで転写、翻訳され、ＭＨＣと組み合わせて細胞表面上に提示されるエピトープ（例えば、本発明の免疫原性ペプチド）と共にプロセシングされる。

【0067】

ＲＮＡワクチンは、宿主細胞ゲノムに取り込まれず、したがって、そのようなインテグレーションに伴う安全性の懸念を回避するという利点を有する。ＲＮＡワクチンは設計が容易であり、複数エピトープをコードすることができ、一本鎖であるのでＴＬＰ７および８もまた刺激し、したがってアジュバント機能を有する。ＲＮＡワクチンはまた、転写のために核へと送達する必要があるＤＮＡとは異なって、タンパク質への翻訳のために細胞質へと送達する必要のみを有する。しかしながら、ＲＮＡワクチンは、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）分解に対してはるかに感受性が高く、したがって、ＤＮＡベクターよりも脆弱である。

【0068】

ウイルスベクターは、多数のウイルスから設計および作製されてきた。最も一般的に用いられるウイルスベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルスおよびアルファウイルスに由来する。大多数は、これらの複製欠損型または弱毒化型である。ウイルスベクターの欠点は、免疫系により外来性と認識され、したがって、同じかまたは類似のベクターを用いる反復免疫化は、免疫系がこれらのベクターを中和し、したがってそれらの効果を弱めかつ効果的な反復投与を妨げることをもたらし得る。

【0069】

好適には、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスなど）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、またはフニンウイルスなど）、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、またはインフルエンザウイルスなどのウイルスに由来する。

【0070】

一部は二本鎖ＤＮＡウイルスであり（アデノウイルスなど）；一部は一本鎖ＲＮＡウイルスであり（フラビウイルスおよびアルファウイルスなど）、これはＤＮＡへのゲノムの逆転写およびその後にコードされるポリペプチドの後続の発現を必要とする。

【0071】

ＣｈＡｄＯｘ１ベクターは、好適なアデノウイルスベクターの例である。より最近、このベクターは、ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９として公知のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンに対するプラットフォームとして用いられた。本発明で利用することができる他の好適なアデノウイルスベクターとしては、限定するものではないが、Ａｄ５－Ｓ－ｎｂ２およびＡｄ２６－Ｓが挙げられる。

【0072】

ワクチン用途をはじめとする治療的使用のためのウイルスベクターの総説に関して、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（２０２０）を参照されたい。その中の表２は、２０２０年時点での前臨床および臨床がんワクチンのリストを提供し、利用されている特定のワクチンベクターを特定する。

【0073】

特定の実施形態では、本発明での使用のためのワクチンベクターは、ＣｈＡｄＯｘ１、Ａｄ５－Ｓ－ｎｂ２、Ａｄ２６－Ｓ、Ａｄ５／３５、ＳＦＶ（セムリキ森林ウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＫＵＮ、ＶＳＶΔＧ、ＨＳＶ－１ Ｔ－ＶＥＣおよびＶＥＥ（ベネズエラウマ脳炎ウイルス）からなる群より選択される。

【0074】

細胞ベースのワクチンもまた用いることができる。樹状細胞は、様々なメカニズムを介して腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を取り込みかつ提示し、腫瘍細胞に対するエフェクター応答をプライミングするそれらの能力を考慮して、がんワクチンに対して特に好適である。直接的な抗原提示の他に、ＤＣは、リンパ組織と非リンパ組織との間を移動し、かつ炎症およびリンパ球ホーミングを制御するためのサイトカインおよびケモカイン勾配を調節することができ、これらのすべてが、全身性かつ長期的な抗腫瘍作用にとって重要である。異なるＤＣ集団を用いることができるが、多くの証拠が、従来の１型ＤＣ（ｃＤＣ１）が腫瘍免疫において不可欠な役割を果たし、かつワクチン接種目的のための有望な代替的細胞タイプを代表することを示唆する。

【0075】

患者由来ＤＣを、確立されたプロトコールを用いてエクスビボで本発明の抗原ペプチドに対して曝露させ、かつ患者に再移植することができる。細胞は、同種または自家であり得る。ペプチドを用いて正しくパルス刺激された細胞は、続いて、インビボでの抗原提示が可能であるはずである。

【0076】

樹状細胞ワクチンアプローチを用いる場合、樹状細胞を、複数の免疫原性ペプチドに対して曝露させることができる。したがって、ワクチンは、本発明の免疫原性ペプチドの混合物であり得る。

【0077】

ウイルスワクチンに対して特に適している１つのアプローチは、これらのペプチドを直列に含むキメラポリペプチドへと複数の免疫原性ｌｎｃＲＮＡ遺伝子由来ペプチドを含め、これをワクチンの一部分として提示させることである。つまり、特定の実施形態では、ワクチンは、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、２０種類、２５種類、３０種類、３５種類、４０種類またはそれ以上の本発明のペプチドを含む。任意により、特に複数のペプチドを含む場合、それらのペプチドは、複数のペプチドを含むキメラポリペプチド内で提供される。これらのペプチドは、直列であり得、かつ１つもしくは複数のスペーサーアミノ酸および／またはプロテアーゼ切断部位により隔てられることができる。

【0078】

好適には、ワクチンは、少なくとも５種類のペプチド、少なくとも１０種類のペプチドまたは少なくとも１５種類の本発明のペプチドを含む。

【0079】

本発明の第６の態様によれば、腫瘍特異的ワクチンを製造するための方法であって、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される長い非コードＲＮＡ遺伝子によりコードされる、腫瘍により発現される免疫原性ペプチドを特定するステップ；および前記ペプチドのうちの１つもしくは複数または前記１つもしくは複数のペプチドをコードする核酸をワクチンへと組み込むステップを含む方法が提供される。

【0080】

ｌｎｃＲＮＡ発現は、腫瘍のタイプに対して特異的であり、したがって、ワクチンはペプチドがそれから誘導されたｌｎｃＲＮＡを発現する腫瘍に対して優先的に作用するであろう。

【0081】

＜ワクチンアジュバント＞
適応免疫応答を強化するために、注入部位へと免疫細胞を誘引することを助け、かつ流入領域リンパ節への抗原の細胞媒介輸送および抗原提示細胞の惹起を促進することができるアジュバントと共に、ワクチンを投与することができる。

【0082】

多数のワクチンアジュバントが、長年にわたって開発および試験されてきた。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－７２０などの油中水型エマルジョン；病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）；ポリリジンを含むポリイノシン酸－ポリシチジル酸およびカルボキシメチルセルロース（Ｐｏｌ－ＩＣＬＣ、ＴＬＲ３アゴニスト）、モノホスホリル（ｍｏｎｏｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピドＡ（ＭＰＬＡ）（ＴＬＲ４アゴニスト）、イミキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）、レシキモド（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニスト）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）（ＴＬＲ９アゴニスト）などのＴｏｌｌ様受容体アゴニスト；ＣＤ４０アゴニスト；インターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト；ＩＬ－２、ＩＬ１２、インターフェロンγ、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのサイトカインが挙げられる（総説に関して、Ｐａｓｔｏｎら、２０２１を参照されたい）。

【0083】

がんワクチンの大部分は、現在、アジュバントとしてＴＬＰアゴニストを用いている。

【0084】

好適には、ペプチドワクチンは、アジュバントに直接的に融合される。ペプチドは、抗原提示細胞へのより効率的な送達のために、脂質などの疎水性担体、脂肪酸およびＴＬＲアゴニストに連結することができる。

【0085】

特定の実施形態では、本発明のワクチンは、上記に開示されるものなどの好適なアジュバントと共に投与される。

【0086】

当業者は、選択されたワクチンとの使用のために適切なアジュバントを選択することができる。

【0087】

＜ワクチン送達系＞
抗原提示細胞（ＡＰＣ）中への核酸に基づくワクチンの送達は、エレクトロポレーションを用いて強化することができ、このとき、小さな電気パルスが細胞膜での一時的な孔の形成を誘導し、それを通して核酸がより容易に通過することができる。幾分かの局所的な組織損傷を引き起こすことに起因して、これは近傍への炎症性サイトカインを刺激し、したがって、アジュバント効果も有する。

【0088】

ポリマー性ナノ粒子、リポソーム、ミセル、カーボンナノチューブ、金ナノ粒子、メソポーラスシリカナノ粒子、およびウイルスナノ粒子などの様々なナノ粒子に基づく送達系もまた、ワクチン送達のために用いられてきた。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＥ、ＤＯＴＡＰ、コレステロール、Ｌｉｐｏｌｅｘなどのリポソームおよび脂質に基づくナノ粒子製剤が、特に一般的である。

【0089】

免疫応答を刺激するための抗原はまた、自己会合性ペプチドの一部分として送達することもでき、これらの系は、高い薬物積載性、生分解性および比較的小さなサイズをはじめとする、リポソームまたはナノ粒子を超える一定の利点を有する。グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｂ）（ＧＡＧ）結合性強化型形質導入（ＧＴ）送達系などの細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）に基づく遺伝子ベクターは、そのような１つの例である。

【0090】

＜組み合わせ＞
好適には、本発明のワクチンは、別の治療剤と組み合わせて投与される。がんワクチンは、強力な免疫応答を誘導する潜在能力を有するが、腫瘍細胞は、Ｔ細胞の機能およびＴ細胞による認識を妨げる、様々な免疫回避メカニズムを有する。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫応答を調節する細胞表面受容体である。ＴＭＥにおいては、チェックポイント受容体の発現は、Ｔ細胞活性化を抑制し、したがって、免疫応答を回避させることができる。細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、最も特性決定されたチェックポイント受容体である。ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を特異的に遮断する抗体は、腫瘍抗原の上首尾での認識および腫瘍細胞の殺傷を可能にするＴ細胞免疫抑制に対する潜在能力を有する。

【0091】

したがって、チェックポイント阻害剤分子は、ワクチンとの組み合わせに対して特に有用である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、その免疫抑制をもたらし得る。チェックポイント阻害剤の使用は、このＴＭＥ駆動型免疫抑制を軽減し、ワクチン効力を最大化することができる。

【0092】

現在臨床試験中の多数のがんワクチンは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１阻害剤などのチェックポイント阻害剤と組み合わせられる。本発明のワクチンと組み合わせた使用のための例示的チェックポイント阻害剤分子としては、イピリムマブなどのＣＴＬＡ－４を遮断するもの、ペムブロリズマブまたはニボルマブなどのＰＤ－１を遮断するもの、およびアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｍｕｍａｂ）またはデュルバルマブなどのＰＤＬ－１を遮断するものが挙げられる。

【0093】

＜医薬組成物＞
本発明の第７の態様によれば、本発明の第１の態様のペプチド、本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

【0094】

この文脈において、本発明の第１の態様のペプチド、本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンは、「薬剤」と称される場合がある。

【0095】

用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、本明細書中で用いる場合、ヒトへの投与に対して好適である、１つまたは複数の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤またはカプセル封入性物質を意味する。用語「賦形剤」は、適用を促進するために有効成分が組み合わせられる、天然または合成の有機または無機成分を示す。好適な賦形剤のタイプは、当技術分野で周知でありかつ医薬調製物中での使用のために商業的供給源から入手可能である、塩、緩衝剤、湿潤化剤、乳化剤、保存料、適合性担体、希釈剤、担体、ビヒクル、アジュバントおよびサイトカインなどの補助的な免疫増強剤である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕｓ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｋｉｂｂｅら、（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＡｎｓｅｌら、（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。任意により、医薬組成物は、１つもしくは複数の他の治療剤または化合物を含有する。好適な薬学的に許容される賦形剤は、比較的不活性であり、かつ、例えば、安定化、投与、加工または身体への、かつ好ましくは直接的な作用部位への送達に関して最適化されている調製物への活性化合物／薬剤の送達を促進することができる。

【0096】

医薬組成物は、溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、液体を含有するカプセル剤、散剤、持続放出製剤、坐剤、エマルジョン剤、エアロゾル剤、噴霧剤、懸濁液剤の形態、または使用に対して好適ないずれかの他の形態を採り得る。

【0097】

投与される場合、薬剤は、薬学的に許容される調製物／組成物中で投与される。

【0098】

投与は、腸内（例えば、経口）であり得、すなわち、物質は胃腸管を介して与えられるか、または非経口であり得、すなわち、物質は注入によるなど消化管とは別の経路により与えられる。大型生物学的分子または核酸分子（ある種のワクチンなど）は、典型的には、注入により非経口的に投与される。

【0099】

非経口投与（例えば、注入による）のための医薬組成物としては、有効成分／薬剤が溶解、懸濁されるか、またはそれ以外の様式で提供される（例えば、リポソームまたは他の微粒子中）水性または非水性、等張パイロジェン不含無菌液剤（例えば、溶液剤、懸濁液剤）が挙げられる。そのような液剤は、抗酸化剤、緩衝剤、安定化剤、保存料、懸濁化剤、および製剤を意図される患者の血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質などの、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を追加的に含有することができる。特定の実施形態では、組成物は、必要な場合および時点で容易に復元される粉末形態を提供するために、凍結乾燥されることができる。凍結乾燥粉末から復元される場合、水性液体は、投与に先立ってさらに希釈されることができる。例えば、投与のための所望の用量を達成するために、０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ、または等価物が入った輸液バッグ中へと希釈される。特定の実施形態では、そのような投与は、静脈内（ＩＶ）装置を用いる静脈内輸液を介し得る。

【0100】

好適には、薬剤は、ヒトへの静脈内投与に対して適した医薬組成物として、慣用の手順に従って製剤化される。典型的には、ＩＶ投与のための活性薬剤は、溶液中、例えば、無菌等張水性緩衝液中である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤も含むことができる。ＩＶ投与のための組成物は、任意により、注入部位での疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般的に、成分は、別個に、または例えば、アンプルなどの密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末もしくは水不含濃縮物として、単位剤型中に一緒に混合するかのいずれかで供給される。薬剤が輸液により投与される予定である場合、例えば、無菌医薬品グレード水または生理食塩液が入った輸液ボトルを用いて分配することができる。薬剤が注入により投与される場合、投与に先立って成分を混合することができるように、注射用無菌水または生理食塩液のアンプルを提供することができる。

【0101】

経口送達のための組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いる慣用の手段により調製される、錠剤、ロゼンジ錠、水性または油性懸濁液剤、顆粒剤、散剤、エマルジョン剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態であり得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁液剤の形態を採り得るか、または使用前の水または他の好適なビヒクルを用いる構成のための乾燥製品として提示することができる。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて、慣用の手段により調製することができる。調製物はまた、適切な場合、緩衝塩、香料、着色料および甘味料も含有することができる。経口組成物は、マンニトール、ラクトール、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準的なビヒクルを含むことができる。

【0102】

本発明に従う使用のための組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤を用いて、慣用の様式で製剤化することができる。つまり、薬剤および任意により別の治療または予防剤ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入もしくは送気（口または鼻のいずれかを介する）または経口、非経口もしくは粘膜（頬内、膣内、直腸、舌下など）投与による投与のための医薬組成物へと製剤化することができる。特定の実施形態では、局所または全身性非経口投与が用いられる。

【0103】

本発明の治療方法での使用のための医薬組成物は、有効量での投与のためのものである。「有効量」とは、単独で、またはさらなる用量と一緒に、所望の応答を生成する組成物の量である。

【0104】

好適には、薬剤は、医薬組成物が０．１～１ｍｇ、１～１０ｍｇ、１０～５０ｍｇ、５０～１００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、または５００ｍｇ～５ｇの薬剤を含む医薬組成物として投与することができる。

【0105】

薬物の好適な医薬組成物の調製および対象へと投与するための投与量は、当業者の能力の範囲内である。

【0106】

＜医学的使用＞
本発明の第８の態様によれば、療法での使用のための、本発明の第７の態様の医薬組成物または本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンが提供される。

【0107】

本発明のこの第８の態様の変形に従えば、がんに罹患している対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の本発明の第７の態様の医薬組成物または本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンを対象に投与するステップを含む方法が提供される。

【0108】

本発明のこの第８の態様の変形に従えば、がんを治療するためなどの療法のための医薬の製造での使用のための、本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンが提供される。

【0109】

特定の実施形態では、療法はがんの治療である。特定の実施形態では、がんの治療は、ＰＲＭＴ５阻害剤と組み合わせた、本発明の第７の態様の医薬組成物または本発明の第１の態様のペプチド、または本発明の第２の態様の核酸、または本発明の第５の態様のワクチンの投与を含む。

【0110】

ＰＲＭＴ５を阻害することが可能ないずれかの治療剤を、本発明のこの組み合わせ態様において利用することができる。特定の実施形態では、ＰＲＭＴ５阻害剤は、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子化合物からなる群より選択することができる。

【0111】

本発明のこの態様での使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤は、「薬剤」に関して上記に記載される通りの医薬組成物として製剤化することができる。投与量、投与経路および実際の治療レジメンは、当業者により決定されることができる。ＰＲＮＴ５阻害剤は、下記でさらに説明される。

【0112】

好適には、ＰＲＭＴ５阻害剤は、ＧＳＫ３３２６５９５（ペムラメトスタット（ｐｅｍｒａｍｅｔｏｓｔａｔ））、ＰＦ－６９３９９９９、ＪＶＮＪ－６４６１９１７８（オナメトスタット（ｏｎａｍｅｔｏｓｔａｔ））、ＬＬＹ－２８３およびＰＲＴ５４３からなる群より選択される小分子化合物である。

【0113】

併用治療の成分は、組み合わせてまたは互いに併用して投与することができる。併用治療は、複合調製物、例えば、本発明の単離されたペプチドまたはワクチンおよびＰＲＭＴ５阻害剤の複合調製物の形態であり得る。組み合わせは、成分の各々の別個の製剤、例えば、ワクチンおよびＰＲＭＴ５阻害剤の別個の製剤を含むことができる。

【0114】

組み合わせ中の成分（例えば、別個の製剤）は、併用治療方法に関して本明細書中に記載される通り、連続的に、別個にかつ／または同時に投与することができる。つまり、例えば、本発明のワクチンは、ＰＲＭＴ５阻害剤と別個に、連続的にまたは同時に投与することができる。

【0115】

一実施形態では、成分は同時に（任意により、反復的に）投与される。一実施形態では、成分は、連続的に（任意により、反復的に）投与される。一実施形態では、成分は、別個に（任意により、反復的に）投与される。

【0116】

当業者は、組み合わせ中の薬剤の別個の製剤が連続的または順次的に投与される場合、これはいずれの順序での薬剤の投与でもあり得ることを理解するであろう。

【0117】

別個の製剤の投与が連続的または別個である場合、第２（または後続）の製剤の投与における遅延は、併用治療の有益な治療効果を失うものであってはならない。理想的には、２種類の薬剤は、実質的に同時に、治療される対象体内に存在するであろう。好適には、２種類（またはそれ以上）の薬剤は、同じ治療レジメン中で対象に投与されるであろう。

【0118】

＜がん＞
がん細胞を用いるか、またはがんの治療のための方法もしくは使用を対象とする本発明の様々な態様は、いずれのがんにも当てはまる。好適には、がんは、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺がん、肝臓がん、乳がん、頭頸部がん、神経芽腫、甲状腺がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、口腔扁平上皮細胞がん、膀胱がん、ライディッヒ細胞腫瘍、胆嚢管がんまたは胆管がんなどの胆道がん、脳がん、膵臓がん、結腸がん、結腸直腸がんならびに卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮がんおよび子宮頸部上皮内がんを含む子宮頸がんをはじめとする婦人科がんからなる群より選択される。好適な実施形態では、がんは白血病であり、かつ急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）（急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）または急性非リンパ性白血病としても公知である）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）（慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ、ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）または慢性顆粒球性白血病としても公知である）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病および有毛細胞白血病からなる群より選択することができる。さらなる好ましい実施形態では、がんは急性リンパ芽球性白血病である。好適な実施形態では、がんはリンパ腫であり、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；バーキットリンパ腫；および小リンパ球性リンパ腫からなる群より選択することができる。

【0119】

特定の実施形態では、本明細書中に開示される方法および使用は、腫瘍の特定のタイプ、または特定の腫瘍、もしくは腫瘍の特定のステージを有する患者のサブセット、または個々の患者でさえも標的とするものなどの正確な医学アプローチを提供する。

【0120】

好適には、そのようながんの治療は、がんの発症を予防もしくは治療することによるか、がんの進行を予防もしくは治療することによるか、がんの再発を予防もしくは治療することによるか、またはがんの伝搬（転移を含む）を予防もしくは治療することにより、がんの効果的な治療を達成することができる。

【0121】

好適には、治療は、宿主（治療が施される対象）ががん細胞に対する免疫応答を生起することを誘導し、それにより、がん細胞の生育を遅延させるかまたは死滅させる。免疫応答は、体液性または細胞媒介性であり得る。

【0122】

＜ワクチン設計および合成＞
・本発明の第９の態様によれば、腫瘍ワクチン中への包含のためにペプチドを選択するための方法であって、腫瘍細胞サンプルをＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップおよび接触させた（処理した）細胞による１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップおよび調節解除される１つまたは複数のペプチドを腫瘍ワクチン中への包含のために選択するステップを含む方法が提供される。好適には、腫瘍細胞サンプルは、がん／腫瘍を有する患者から取得されるかまたは取得されている。調節解除されるとは、ＰＲＭＴ５阻害剤との接触の非存在下での発現と比較して、上方調節または下方調節されることを意味する。好適には、ＰＲＭＴ５阻害剤との接触の非存在下での発現レベルからの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の逸脱が見られる。特定の実施形態では、発現レベル（例えば、転写産物レベル）は、少なくとも３０％までなど、上方調節される。

【0123】

任意により、調節解除される転写産物は、免疫原性ペプチドをコードするか、例えば、コードされるペプチドが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、例えば、ＭＨＣクラス１を介して細胞表面上に提示されるかまたは提示され易いかを調べるために試験される。そのような試験は、実施例に記載されるものなどの免疫ペプチドミクス解析アプローチの使用を含むことができる。あるいは、ペプチドがＭＨＣクラス１分子（ｍｏｌｅｃｌｅｓ）に結合するか否かの予測を行うことができる（例えば、ＮｅｔＭＨＣ４．０オンラインアルゴリズムを用いるＨＬＡクラスＩペプチド予測）。

【0124】

好適には、ペプチドは、ＮｅｔＭＨＣ４．０オンラインアルゴリズムまたはＥｐｉＱｕｅｓｔ－Ｂなどの１つまたは複数のインシリコアルゴリズムを用いて、免疫原性であると予測することができる。

【0125】

ペプチドは、宿主動物への注入および抗体の検出をはじめとする様々な様式によるか、または免疫ペプチドミクス解析により、例えば実施例で用いられる免疫ペプチドミクス質量分析（ＭＳ）技術により、免疫原性であると決定することができる。腫瘍細胞をＰＲＭＴ５阻害剤と接触させた後に誘導される免疫原性ペプチドは、ＭＮＣクラスＩ分子に結合するであろう。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対して特異的な抗体を用いる免疫沈降およびそれに続く質量分析によるＭＨＣ結合型ペプチドの決定を行うことができる。

【0126】

実施形態では、方法は、そのタイプのがんを有するいずれかの患者に対して用いることができるワクチン中への包含のために適切なペプチドを選択するように、単一の腫瘍タイプの複数起源由来の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップを含む。

【0127】

細胞をＰＲＭＴ５阻害剤と接触させた場合に差次的に発現されると特定されるペプチドは、ＭＨＣ（ＭＨＣクラスＩなど）を介して細胞表面上に提示されるかまたは提示され易いかを決定するために、試験することができる。推定上は提示されるとは、好適なアルゴリズム（ＮｅｔＭＨＣ４．０など）を用いて提示されると予測されるものを意味する。免疫原性であると予測されるかまたは実証されるペプチドを、ワクチン中への包含のために選択することができる。

【0128】

つまり、本発明の第９の態様の変形では、腫瘍ワクチン中への包含のためにペプチドを選択するための方法であって、腫瘍タイプの細胞をＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップおよび接触させた細胞による１つまたは複数の、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされるペプチドの発現レベルを決定するステップおよび調節解除、好ましくは上方調節される１つまたは複数のペプチドを腫瘍ワクチン中への包含のために選択するステップを含む方法が提供される。ペプチドは、本発明の第１の態様のもののうちのいずれかであり得る。任意により、調節解除されると決定されるペプチドは、ＭＨＣを介して細胞表面上に提示されるかまたは提示され易く、したがって免疫原性であるかを決定するために評価される。ＭＨＣクラスＩなどのＭＨＣを介して細胞表面上に提示されるかまたは提示され易いものが、腫瘍ワクチン中への包含のために選択される。

【0129】

本発明の第９の態様の別の変形では、腫瘍ワクチン中への包含のために１つまたは複数のペプチドを選択するための方法であって、
（ｉ）腫瘍細胞サンプルをＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップおよびＰＲＭＴ５阻害剤との接触後に差次的に上方調節および下方調節されるｌｎｃＲＮＡ転写産物を特定するステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で特定された差次的に調節されるｌｎｃＲＮＡ遺伝子転写産物が免疫原性ペプチドをコードするか否かを決定するステップ；
（ｉｉｉ）腫瘍ワクチン中への包含のためにステップ（ｉｉ）で免疫原性であると決定される１つまたは複数のペプチドを選択するステップ
を含む方法が提供される。

【0130】

本発明の第９の態様の別の変形では、腫瘍ワクチン中への包含のために１つまたは複数のペプチドを選択するための方法であって、
（ｉ）腫瘍細胞サンプルをＰＲＭＴ５阻害剤と接触させるステップ；
（ｉｉ）（ｉ）のＰＲＭＴ５接触腫瘍細胞サンプルから腫瘍細胞溶解物を調製するステップ；
（ｉｉｉ）腫瘍細胞溶解物をカラム上の樹脂に結合したＭＨＣクラス１特異的抗体またはその抗体断片と接触させるステップ；および
（ｉｖ）腫瘍ワクチン中への包含のために１つまたは複数のペプチド結合型ペプチドを選択するステップ
を含む方法が提供される。

【0131】

好適には、ステップ（ｉｉ）での結合型ペプチドは、カラムから溶出（ｅｌｕｅｄ）され、続いて、質量分析により分析および特定される。この方法の後、選択されたペプチドを含むワクチンが生成される。

【0132】

つまり、本発明の第１０の態様によれば、ワクチンを製造するための方法であって、本発明の第９の態様に従ってワクチン中への包含のためにペプチドを選択するステップおよび前記ペプチドを提示することが可能なワクチンを生成するステップを含む方法が提供される。

【0133】

当業者は、利用することができる腫瘍細胞サンプルの多数の好適な例があることを理解するであろう。好適には、そのようなサンプルは、がんまたは前がん状態からの細胞を含み得る。好適な生物学的サンプルは、生検もしくは外科的切除からのサンプルなどの組織サンプル、または血液、血漿、血清、喀痰、唾液、胸水、腹水、尿等などの腫瘍細胞を含む生物流体サンプルであり得る。サンプルは、新鮮、凍結またはパラフィン包埋であり得る。

【0134】

＜ＰＲＭＴ５阻害剤処理＞
タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）５（ＰＲＭＴ５）は、アルギニンのモノメチル化および対称的ジメチル化を担い、その発現レベルおよびメチル転移活性は、ヒトがんの腫瘍形成、発症および不良な臨床転帰と密接な関係を有することが実証されてきた。ＰＲＭＴ５は、広範囲のがんにおいて過剰発現され、重要な発がん性の役割を暗示されてきた。Ｅ２Ｆ１は、ＰＲＭＴ５の重要な標的であり、メチル化マークがＥ２Ｆ１制御下の遺伝子ネットワークを拡大する。

【0135】

本発明者らは、ＰＲＭＴ５の薬理学的阻害が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現および、結果として、腫瘍細胞による抗原提示を変化させたことを見出した。ＰＲＭＴ５阻害に際して明らかな遅延した腫瘍生育は、腫瘍微小環境中へのｌｎｃＲＮＡ由来ペプチド特異的細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞およびヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球の流入を反映した。

【0136】

本発明の第１１の態様によれば、免疫応答を刺激することによる、がんの治療における使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤が提供される。

【0137】

つまり、ＰＲＭＴ５阻害剤の投与は、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を誘導した。このことは、がんを治療するための新規な作用機序および新規な臨床的アプローチを代表する。

【0138】

免疫応答は、体液性応答および／または細胞媒介性応答、例えば、適応性細胞媒介性応答であり得る。好適には、ＰＲＭＴ５阻害剤が対象へと投与される場合、これはＣＤ８^＋Ｔ細胞およびヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球の生成に対して対象を刺激する。

【0139】

ＰＲＭＴ５を阻害することが可能ないずれかの治療剤を、本発明のこの第１０の態様において利用することができる。特定の実施形態では、ＰＲＭＴ５阻害剤は、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子化合物からなる群より選択することができる。

【0140】

好適には、ＰＲＭＴ５阻害剤は、ＧＳＫ３３２６５９５（ペムラメトスタット）、ＰＦ－６９３９９９９、ＪＶＮＪ－６４６１９１７８（オナメトスタット）、ＬＬＹ－２８３およびＰＲＴ５４３からなる群より選択される小分子化合物である。

【0141】

異なる化学団（ｃｈｅｍｏｐｈｏｒｅ）を有するＰＲＭＴ５阻害剤化合物が公知である。ＤｅＦｒｅｉｔａｓら（２０１９）は、ＰＲＭＴ５阻害剤のうちの一部を総説し、それらの構造を示し、それらの作用機序の概要を記載する。

【0142】

以下の表は、様々な製薬会社により出願された特許公報および本発明において用いることができるであろうＰＲＭＴ５阻害剤を対象とする他の公報のうちの一部を列記する。

【0143】

【0144】

ＷＯ２０１４／１００７１９（Ｅｐｉｚｙｍｅ）中の化合物２０８は、ＧＳＫ３３２６５９５（ペムラメトスタット）である。

【0145】

ＷＯ２０１６／１７８８７０（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）中のＥｘａｍｐｌｅ２の化合物は、ＬＬＹ－２８３である。

【0146】

ＷＯ２０１７／０３２８４０（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）中の化合物８０は、ＪＮＪ－６４６１９１７８である。

【0147】

Ｄｅ Ｆｒｅｉｔａｓら（２０１９）もまた参照されたい。

【0148】

他の好適なＰＲＭＴ５阻害剤としては、以下のものが挙げられる：
（１）式Ｉの化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を開示する、ＷＯ２０１８／１６７２６９（Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、

【化1】

（式中、
Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、水素およびＣ_１－３アルキルから選択され；
Ｒ_２は、水素およびＲ_１４から選択され；
Ｘは、ＯまたはＮＲ_９であり、式中、Ｒ_９は、水素またはＣ_１－３アルキルであり；
Ｙ_１は、式ＡおよびＢのうちの一方から選択される基であり：

【化2】

式中、Ｒ’”は独立して、ＨおよびＣ_１－３アルキルから選択され；
Ｑは、ＣまたはＮであり；
Ｔは、縮合フェニル基および縮合５または６員ヘテロアリール基から選択され、このとき、各基は、ハロおよびＣ_１－３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基によって任意により置換されており；かつ
Ｒ_７およびＲ_８は、介在性窒素原子と一緒になって、３～１２員ヘテロシクロアルキル環を形成し、このとき、３～１２員ヘテロシクロアルキル環は、１つもしくは複数のＲ_１０によって任意により置換されているか；かつ／または１つもしくは複数のＣ_６－１２アリール、Ｃ_５－１２ヘテロアリール、Ｃ_３－８シクロアルキルおよび３～１２員ヘテロシクロアルキル環に任意により縮合しており、このとき、それぞれの縮合したＣ_６－１２アリール、Ｃ_５－１２ヘテロアリール、Ｃ_３－８シクロアルキルおよび３～１２員ヘテロシクロアルキル環は、１つもしくは複数のＲ_１４によって任意により置換されており；
Ｒ_１０は、式Ｌ_１－Ｌ_２－Ｒ_１１またはＬ_２－Ｌ_１－Ｒ_１１の基から選択され、式中、Ｌ_１は、式－［ＣＲ_１２Ｒ_１３］_ｎ－のリンカーであり、このとき、ｎは０～３の整数であり、かつＲ_１２およびＲ_１３は、各場合において、それぞれ独立してＨおよびＣ_１～Ｃ_２アルキルから選択され、
式中は、Ｌ_２は、存在しないかまたはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、［Ｏ（ＣＨ_２）_ｒ］_ｓ、［（ＣＨ_２）_ｒＯ］_ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＣＨ（ＯＲ’）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ’）もしくはＮ（Ｒ’）ＳＯ_２から選択されるリンカーであり、式中、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立して、水素およびＣ_１～Ｃ_２アルキルから選択され、このとき、ｒは１または２であり、かつｓは１～４であり、
Ｒ_１１は、水素、ＣＮ、ＮＯ_２、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６ハロアルコキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１２アリール、Ｃ_５－１２ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクロアルキル、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＲ^ｄ、－ＳＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、および－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄから独立して選択され、式中、Ｒ_１１は、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１２アリール、Ｃ_５－１２ヘテロアリールおよび３～１０員ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、各Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１２アリール、Ｃ_５－１２ヘテロアリールおよび３～１０員ヘテロシクロアルキルは、１つまたは複数のＲ_１４によって任意により置換されており；
各Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素およびＣ_１－６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ^ｄは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキルおよびＣ_６－１１アリールから独立して選択され、このとき、前記Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ_３－６シクロアルキルは、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の基によって任意により置換されており；
各Ｒ^ｅは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから独立して選択されるか；または
Ｒ^ｅおよびＲ^ｄは、同じ原子に連結される場合、それらが連結される原子と一緒になって、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基によって任意により置換されている３～７員ヘテロシクロアルキル環を形成し；かつ
Ｒ^１４は、ハロ、ＣＮ、ＮＯ_２、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６ハロアルコキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１２アリール、５～６員ヘテロアリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルＣ_６－１２アリール、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＲ^ｄ、－ＳＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、および－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄから独立して選択される）。

【0149】

（２）式Ｉの化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を開示する、ＷＯ２０１８／１６７２７６（Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）：

【化3】

（式中、
Ｙ^１は、式ＡおよびＢのうちの一方から選択される基であり：

【化4】

Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨおよびＮＲ^７から選択され；
Ｘ^１は、ＣおよびＮから選択され；
Ｙは、縮合アリール基および縮合ヘテロアリール基から選択され、このとき、各基は、１つまたは複数のＲ^１１によって任意により置換されており；
ｎは１であり、かつＬは、－（ＣＨ_２）_ｐＮ（Ｒ^ａ）Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－（ＣＨ_２）_ｐＮ（Ｒ^ａ）Ｓ（Ｏ_ｑ）－、－（ＣＨ_２）_ｐＳ（Ｏ_ｑ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－（ＣＨ_２）_ｐＮ（Ｒ^ｂ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－、－（ＣＨ_２）_ｐＮ（Ｒ^ｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および－（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｃ）－から選択されるか；または
ｎは０であり、かつＬは、Ｒ^ｄ（Ｒ^ｅ）ＮＣ（Ｏ）－、－Ｒ^ｄ（Ｒ^ｅ）ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－、Ｒ^ｄ（Ｒ^ｅ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ－、Ｒ^ｄ（Ｒ^ｅ）ＮＳ（Ｏ_ｑ）およびＲ^ｄ（Ｒ^ｅ）Ｎ－から選択され；
ｐは、０、１、２および３から選択される数であり；
ｑは、１および２から選択される数であり；
Ｚは、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されているＣ_６－１１アリール、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている（Ｃ_７－１６）アルキルアリール、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されているＣ_３－１１シクロアルキル、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている（Ｃ_４－１７）シクロアルキルアルキル、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている３～１５員ヘテロシクロアルキル、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている４～２１員アルキルヘテロシクロアルキル、１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている５～１５員ヘテロアリール、および１つまたは複数のＲ^１０によって任意により置換されている６～２１員アルキルヘテロアリールから選択され；
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＮＲ^ｅＲ^ｄ、ＯＲ^ｆ、および１つまたは複数のＲ^９によって任意により置換されているＣ_１－６アルキルから選択され；
Ｒ^２は、水素、ハロゲンおよび１つまたは複数のＲ^９によって任意により置換されているＣ_１－６アルキルから選択され；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、水素、ハロゲンおよび１つまたは複数のＲ^９によって任意により置換されているＣ_１－６アルキルから独立して選択され；
Ｒ^７は、水素、ヒドロキシル、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６ハロアルキル、フェニルおよびＣ_３－６シクロアルキルから選択され、このとき、前記Ｃ_１－６アルキル、フェニルおよびＣ_３－６シクロアルキルは、ヒドロキシル、ハロゲン、＝Ｏ、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の置換基によって任意により置換されており；
各Ｒ^９は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキルおよびフェニルから独立して選択され、このとき、前記Ｃ_１－６アルキル、フェニル、３～７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ_３－６シクロアルキルは、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＣＯＲ^ａ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、フェニル、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の基によって任意により置換されており；
各Ｒ^１０は、水素、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６ハロアルコキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＮＲ^ｅＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＲ^ｄ、－ＳＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＲ^ｄ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｄ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄ、および－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｅＲ^ｄから独立して選択され、このとき、前記Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリールおよび３～７員ヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシル、ハロゲン、＝Ｏ、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６ハロアルコキシ、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の基によって任意により置換されており；
Ｒ^１１は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキルおよびフェニルから選択され、このとき、前記Ｃ_１－６アルキル、フェニル、３～７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ_３－６シクロアルキルは、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の基によって任意により置換されており；
各Ｒ^ａ、Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは、水素およびＣ_１－６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ^ｄは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキル、Ｏ－Ｃ_１－６アルキルおよびＣ_６－１１アリールから独立して選択され、このとき、前記Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ_３－６シクロアルキルは、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の基によって任意により置換されており；
各Ｒ^ｅは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから独立して選択されるか；または
Ｒ^ｅおよびＲ^ｄは、同じ原子に連結される場合、それらが連結される原子と一緒になって、ヒドロキシル、＝Ｏ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、Ｃ_６－１１アリール、３～７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－６アルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基によって任意により置換されている３～７員ヘテロシクロアルキル環を形成し；かつ
Ｒ^ｆは、水素ならびにヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル、フェニル、３～７員ヘテロシクロアルキルおよびＯ－Ｃ_１－６アルキルから選択される１つまたは複数の置換基によって任意により置換されているＣ_１－６アルキルから独立して選択される）。

【0150】

（３）式Ｉの化合物、またはその重水素化形態、塩、溶媒和物、もしくは水和物を開示する、ＧＢ２１０８３８３．７（Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）：

【化5】

（式中、
Ｒ^１Ａは、式（Ａ１）により表され：

【化6】

Ｚは＝Ｏであり；
Ｔは、介在性炭素および窒素原子と一緒になって（例えば、式（Ａ１）中に示される）、単環式５～７員ヘテロシクロアルキル基、縮合二環式６～１０員ヘテロシクロアルキル基および架橋二環式６～９員ヘテロシクロアルキル基から選択され、このとき、単環式５～７員ヘテロシクロアルキル基、縮合二環式６～１０員ヘテロシクロアルキル基および架橋二環式６～９員ヘテロシクロアルキル基のそれぞれは、１つまたは複数のＲ^Ｓ１によって任意により置換されており；
Ｒ^Ｓ１は、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６アルコキシ、Ｃ_３－１２シクロアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ＣＮおよびニトロから選択され、このとき、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニルおよびＣ_３－１２シクロアルキルは、１つまたは複数のＲ^Ｓ２によってそれぞれ任意により置換されており；かつ
Ｒ^Ｓ２は、ヒドロキシ、ハロ、ＣＮおよびニトロから選択される）。

【0151】

これらのＰＲＭＴ５化合物のうちのいずれかを、本発明において用いることができる。

【0152】

特定の実施形態では、本発明での使用のためのＰＲＭＴ５阻害剤は、ＧＳＫ３３２６５９５（ペムラメトスタット）、ＰＦ－６９３９９９９、ＪＶＮＪ－６４６１９１７８（オナメトスタット）、ＬＬＹ－２８３およびＰＲＴ５４３からなる群より選択される小分子化合物である。

【0153】

例えば、化学療法剤または放射線療法を用いる効果的な抗がん治療は、これらの治療に対する抵抗性を発達させるがん細胞の能力により妨げられる。ＰＲＭＴ５阻害剤がまた、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答も刺激することができるという知見は、そのがんがＰＲＭＴ５の直接的な細胞標的化作用に対する抵抗性を発達させている患者または患者群を治療するためのＰＲＭＴ５阻害剤の使用を可能にするであろう。

【0154】

以下の実施例および付随する図面は、本発明を例示するために機能する。これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定することはまったく意図されないが、むしろそこからの均等物が当業者により認識されるであろう例として意図される。

【0155】

文脈から明らかでない限り、上記に列記される実施形態のうちのそれぞれは、本発明の態様のうちのいずれかでの使用に適用することができる。

【実施例】

【0156】

タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）５は、広範囲のがんにおいて過剰発現しており、重要な発がん性の役割が暗示されてきた。Ｅ２Ｆ１は、ＰＲＭＴ５の重要な標的であり、メチル化マークがＥ２Ｆ１制御下の遺伝子ネットワークを拡大する。本発明者らは、ここで、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸が、長い非コード（ｌｎｃ）遺伝子の大きな群が直接的な転写標的である非コードゲノムからの発現の制御において、追加的な予期せぬ役割を有することを示す。腫瘍細胞による抗原提示の解析は、多数のＭＨＣクラスＩタンパク質関連ペプチドが、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子中の小さなオープンリーディングフレームに由来したことを特定した。さらに、ＰＲＭＴ５の薬理学的阻害およびＥ２Ｆ１活性の操作が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現および、結果として、腫瘍細胞による抗原提示を変化させた。ＰＲＭＴ５阻害に際して明らかな遅延した腫瘍生育は、腫瘍微小環境中へのｌｎｃＲＮＡ由来ペプチド特異的細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の流入を反映した。独立した治療用ワクチンとして免疫系に対して提示される場合、ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドは、免疫原性であり、かつ重要なことに、強力な抗腫瘍免疫応答を駆動することが見出された。これらの結果は、ＰＲＭＴ５が、Ｅ２Ｆ経路を非コードゲノムおよび腫瘍細胞の抗原状況へと結び付けることを示す。したがって、ＰＲＭＴ５活性の薬理学的制御は、腫瘍細胞の免疫原性に影響を及ぼすための治療戦略を提案する。

【0157】

＜材料および方法＞
細胞株作製、培養、および化合物処理
ヒトｐ５３^－／－ＨＣＴ１１６ Ｅ２Ｆ１ ＣＲＩＳＰＲおよびＣＡＳ９対照細胞が、以前に記載されている（Ｂａｒｃｚａｋら、２０２０）。マウスＣＴ２６細胞を、ＡＴＣＣから取得した（ＣＲＬ－２６３８）。細胞を、１０％胎児ウシ血清（Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｈｅａｔｈｆｉｅｌｄ、ＵＫ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）中で培養した。すべての細胞株を、使用前にマイコプラズマ夾雑に関して試験した。選択的ＰＲＭＴ５阻害剤（Ｔ１－４４）（Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫにより合成された）は、以前に記載および特性決定されており（Ｂａｒｃｚａｋら、２０２０）、別途明記されない限り、１μＭ最終濃度で４８時間にわたって用いた。

【0158】

プラスミド／ｓｉＲＮＡトランスフェクション
製造業者の説明書の通りに、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて４８時間、プラスミドトランスフェクションを行った。製造業者の説明書の通りに、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて７２時間、２５ｎＭ ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡ干渉を行った。ｓｉＲＮＡに関する配列は、非標的化対照、５’－ＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１９５）；Ｅ２Ｆ１（ヒト）、５’－ＣＵＣＣＵＣＧＣＡＧＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵ－３’；Ｅ２Ｆ１（マウス）（カタログ番号：ＥＭＵ０７５１８１、Ｍｅｒｃｋ）（配列番号１９６）の通りである。

【0159】

免疫ブロットおよび抗体
免疫ブロットのために、細胞を、改変型ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０［ｖ／ｖ］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に回収し、３０分間氷上でインキュベートし、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロースへのトランスファーを行った。β－アクチン（ＡＣ－７４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｅ２Ｆ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、３７４２Ｓ）、対称的ジメチルアルギニン（ＳＤＭｅ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１３２２２Ｓ）、ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）、ＧＦＰ（Ｄ５．１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、２９５６Ｓ）、ＧＡＰＤＨ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の抗体を免疫ブロットで用いた。

【0160】

ＲＮＡ単離および定量的ＲＴ－ＰＣＲ
製造業者の説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、細胞からＲＮＡを単離した。１マイクログラムの総ＲＮＡを、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成のために用いた。オリゴ（ｄＴ）２０プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる逆転写を、製造業者の説明書の通りにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。続いて、示されるプライマーペアおよびＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＡｒｉａＭｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ｑＰＣＲ機器上で用いて、３回反復で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。結果は、３つの生物学的反復サンプルからΔΔＣｔ法を用いて、対照処理と比較した平均変化倍率として表した。グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーセットを、内部較正因子として用いた。別途示されない限り、エラーバーはＳＤを表す。

【0161】

ＲＮＡ配列決定
ＷＴ Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ１ Ｃｒ ＨＣＴ１１６、およびＣＴ２６細胞を、１μＭ濃度のＰＲＭＴ５阻害剤（Ｔ１－４４）または陰性対照としてのＤＭＳＯを用いて、４８時間（ＨＣＴ１１６）または７２時間（ＣＴ２６）にわたって処理した。ＷＴ Ｅ２Ｆ１、ＷＴ Ｅ２Ｆ１ Ｔ１－４４、Ｅ２Ｆ１ Ｃｒ、Ｅ２Ｆ１ Ｃｒ Ｔ１－４４、ＣＴ２６、およびＣＴ２６ Ｔ１－４４（３回反復）からの総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単離した。あるいは、インサイチューでマウス腫瘍から単離されたＲＮＡを、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析に対して用いた。ＲＮＡ配列決定は、ＢＧＩ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより行われた。簡潔には、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ）を、ＲＮＡサンプル品質管理目的のために用いた（ＲＮＡ濃度、ＲＩＮ値、２８Ｓ／１８Ｓ、および断片長分布）。ｍＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）法を用いて、総ＲＮＡから単離した。続いて、ｍＲＮＡを断片化し、ファーストストランド／セカンドストランドｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ断片を精製し、末端修復および単一ヌクレオチドＡ（アデニン）付加のためにＥＢバッファーを用いて分割した。その後、ｃＤＮＡ断片にアダプターを連結させた。好適なサイズを有するそれらのｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅のために選択した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを、それらのライブラリーの定量化および定性化において用いた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＰｌａｔｆｏｒｍを用いてＲＮＡ配列決定を行い、サンプル当たり５．１２Ｇｂを生成させた。

【0162】

長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）発現データの加工
ＰＲＭＴ５阻害剤またはＤＭＳＯ対照を用いて処理したｐ５３^－／－ＷＴ Ｅ２Ｆ１、ｐ５３^－／－Ｅ２Ｆ１ Ｃｒ ＨＣＴ１１６、およびＣＴ２６細胞に関するＦＡＳＴＱファイルを、３つの生物学的反復実験から作成した。ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ ｖ．０．４．３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）を用いて、アダプターおよび低品質塩基を除去するために、これらをトリミングした。

【0163】

ｋ－ｍｅｒ長３１および１００ｂｏｏｔｓｔｒａｐサンプルを含むｋａｌｌｉｓｔｏ（ｖ．０．４４．０）を用いて、ｌｎｃＲＮＡ発現解析を行った。ＧＥＮＣＯＤＥマウスｌｎｃＲＮＡ注釈バージョンＭ２２およびヒトｌｎｃＲＮＡ注釈バージョン３４を、ｋａｌｌｉｓｔｏインデックスを構築するための参照データセットとして用いた。ｌｎｃＲＮＡの差次的発現を、ｓｌｅｕｔｈパッケージ（ｖ０．３０．０）を用いて計算した。発現のｌｏｇ２（変化倍率）を、所与の条件に関するすべての複製にわたって平均した推定上のカウント値（ｋａｌｌｉｓｔｏにより提供される）から計算した。

【0164】

有意に差次的に発現された転写産物を、０．０５のＦＤＲ閾値（ｑ値）を用いて特定した。

【0165】

ＨＣＴ１１６ ｐ５３^－／－およびＨＣＴ１１６ ｐ５３^－／－Ｅ２Ｆ１ Ｃｒ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、登録コードＧＳＥ１４２４３０の下にＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に登録した。ＣＴ２６およびｃｏｌｏｎ２６腫瘍サンプルＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、登録コードＧＳＥ１８１４０１の下にＧＥＯに登録されている。

【0166】

プロテオミクス質量分析のためのデータ加工（ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドデータベース）
本発明者らのＨＣＴ１１６およびＣＴ２６ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（マウス：ＧＥＮＣＯＤＥ注釈；ヒト：ＦＡＮＴＯＭ５およびＧＥＮＣＯＤＥ注釈）において検出可能なレベルで発現されているすべてのｌｎｃＲＮＡのヌクレオチド配列を、３フレーム翻訳を用いてペプチド配列へと変換した。ペプチド配列データを、対応するｌｎｃＲＮＡの発現値に従って、非発現（ＴＰＭ＝０）；弱発現（０．５＜ＴＰＭ＜１．０）；発現（ＴＰＭ＞１．０）の３群へと分割した。非発現群を、ＭＳプロテオミクス実験のためのデコイデータベースとして用いた（下記に詳述される）。

【0167】

ＨＬＡクラスＩ免疫沈降
抗体を、セファロース－プロテインＡビーズ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いる標準的精製手順を用いて、ハイブリドーマ上清（それぞれ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－９５および－７９）から取得した。０．５ｍＬ／サンプルのセファロース－プロテインＡビーズ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を、５ｍｇ／サンプルのＷ６３２抗体（ＨＬＡクラスＩに対して特異的である、ＨＣＴ１１６に関して）、または抗体クローン３４．１．２ｓ（Ｈ－２Ｋｄ、Ｄｄ、Ｌｄを認識する、ＣＴ２６に関して）と共に、室温で３０分間インキュベートした。１０ｃｖ（カラム床体積）のホウ酸バッファー（５０ｍＭホウ酸塩、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて樹脂を洗浄し、室温で３０分間、ホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）中に１０ｃｖの４０ｍＭピメルイミド酸ジメチルを添加することにより、抗体を架橋した。１０ｃｖの氷冷０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて反応を停止させ、続いて、いずれの未結合抗体も除去するために１０ｃｖの０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ３．０の洗浄ステップを行い、１０ｃｖの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて最後に平衡化した。

【0168】

細胞ペレットを、軽く撹拌することにより、３ｍＬの溶解バッファー（１％ＩＧＥＰＡＬ６３０；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ；完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加、ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）中に溶解させた。サンプルを氷上で４５分間インキュベートした。続いて、４℃、５００ｇで１０分間および２０，０００ｇで１時間の連続的遠心分離ステップにより、溶解物を清澄化した。ペプチド－ＨＬＡクラスＩ複合体を、軽い撹拌下で４℃での一晩インキュベーションにより、免疫樹脂（ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｉｎ）上に捕捉した。続いて、重力流により溶解物を除去し、１０ｍＬ洗浄バッファー１（０．００５％ＩＧＥＰＡＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）、１０ｍＬ洗浄バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、１０ｍＬ洗浄バッファー３（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４５０ｍＭ ＮａＣｌ）および１０ｍＬ洗浄バッファー４（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）を用いて、連続的にカラムを洗浄した。ペプチド－ＨＬＡ複合体を、５ｃｖの１０％酢酸の添加により溶出させた。

【0169】

ＨＬＡペプチド精製戦略
サンプルをＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にロードし、１０００μＬ／分の流速で２～３５％バッファーＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）の１０分間勾配を適用することにより、モノリス型カラム（４．６×５０ｍｍ ＰｒｏＳｗｉｆｔ ＲＰ－１Ｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、比較的大きな複合体成分からペプチドを分離した。各サンプルを１５画分に分画し、ＨＬＡペプチドを含有するがβ２－ミクログロブリンを含有しない交互の画分を、２つの最終画分中にプールした。サンプルを乾燥させ、２０μＬのローディングバッファー（０．１％ＴＦＡ、１％ＡＣＮ）中に再懸濁し、ＭＳ分析まで－８０℃で保存した。

【0170】

ＬＣタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）
ＨＣＴ１１６細胞サンプルに関して、ＨＬＡペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかにより分析した。ＣＴ２６細胞サンプルは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で測定した。いずれかの質量分析計機器を、ＰｅｐＭａｐ Ｃ１８カラム、２μｍ粒径、７５μｍ×５０ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍと組み合わせた。２５０ｎＬ／分の流速および４０℃で、水中５％ＤＭＳＯ、０．１％ギ酸中の３％～２５％アセトニトリルの６０分間線形勾配を用いて、ペプチドを溶出させ、２０００ＶでのナノＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、質量分析計へと導入した。イオン移送管は、両方の機器に関して３０５℃に設定した。

【0171】

Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓにより分析したサンプルに関して、完全ＭＳに対する解像度は、４００，０００のＡＣＧ標的および３００～１５００ｍ／ｚのスキャン範囲を伴って１２０，０００に設定した。前駆体選択および単離は、２秒間のサイクル時間および１．２ａｍｕの四重極分離幅でＴｏｐＳｐｅｅｄを用いて行った。ＭＳ解像度は３０，０００に設定し、ペプチドイオンを、３００，０００のＡＧＣ標的を伴って１２０ｍｓの最大注入時間で蓄積させた。前駆体イオンを、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を用いて断片化し：衝突エネルギーは、２～４の荷電状態を有するペプチドに関して２８、および一価イオンに関して３２に設定した。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ上で分析したサンプルに関して、完全ＭＳ（３２０～１６００ｍ／ｚスキャン範囲）解像度は１２０，０００に設定し、３００，０００のＡＧＣ標的に設定した。ペプチドイオンは、１．６ａｍｕ分離幅で分離した。ＭＳ２解像度は、５０，０００のＡＧＣ標的で６０，０００に設定し、衝突エネルギーは、２～４の前駆体イオンの断片化の荷電状態を有するペプチドに関して２８、および１～４の荷電状態を有するものに関して２５に設定した。

【0172】

ＨＬＡ結合性予測
ＨＬＡクラスＩペプチド予測を、ＮｅｔＭＨＣ４．０オンラインアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）およびＳｅｑ２Ｌｏｇｏ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）またはＷｅｂＬｏｇｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）を用いて行った。

【0173】

クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
Ｅ２Ｆ１ ＣｈＩＰを、３μｇの適切な抗体（対照ウサギＩｇＧ、抗Ｅ２Ｆ１［Ａ３００－７６６Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および事前にブロッキングしたプロテインＡビーズを用いて、以前に記載された通りに行った（Ｃａｒｒら、２０１７）。回収されたＤＮＡを精製し、リアルタイムＰＣＲを、遺伝子プロモーター中に提案されるＥ２Ｆ部位が隣接したプライマーを用いて、ＡｒｉａＭｘ ＱＰＣＲ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて３回反復で行った。三重生物学的反復実験からのＥ２Ｆ１ ＣｈＩＰおよびＩｇＧ対照の両方に関する入力の富化パーセンテージを算出することにより、ＤＮＡ占有率を調査した。別途明記されない限り、すべての場合で、提示される図はＳＤを表示する。ＣＤＣ６およびアクチンプロモーターを、それぞれ、Ｅ２Ｆ１占有率に対する陽性および陰性対照として用いた。

【0174】

ヒトおよびマウスｌｎｃＲＮＡプロモーター解析
ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ；ＧＲＣｈ３７／ｈ１９アセンブリ）中に存在するバイオインフォマティクスツールを利用し、かつ３種類の細胞株（Ｋ５６２、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ）に関してＥＮＣＯＤＥプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ＥＮＣＯＤＥ／）からのＥ２ＦトラックについてのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを解析して、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子プロモーター特性決定を行った。「ＥＮＣＯＤＥ３由来の転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑクラスター」、「ｆａｃｔｏｒｂｏｏｋモチーフを含むＥＮＣＯＤＥ由来の転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑクラスター」、「ＥＮＣＯＤＥ３由来の転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク」、「ＥＮＣＯＤＥ３解析由来の転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑ均一ピーク」および「ＥＮＣＯＤＥ／Ｓｔａｎｆｏｒｄ／Ｙａｌｅ／ＵＳＣ／Ｈａｒｖａｒｄ由来のＣｈＩＰ－ｓｅｑによる転写因子結合性部位」トラックツールを、Ｅ２Ｆ１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークまたは適切な場合にはシグナルを表示するために用いた。ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータが注釈付きプロモーター（ＧＥＮＣＯＤＥおよびＦＡＮＴＯＭ６により注釈付けされる）周囲の１０００ｂｐ幅の領域内で明らかであった場合、潜在的なＥ２Ｆ１標的であるとして遺伝子をスコア付けした。マウスにおけるプロモーター特性決定に関してＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０アセンブリを用い、マウスＥ２Ｆ１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークデータを、ＧＥＯにおいて登録されたデータ（ＧＳＭ２８８３４９）を用いてカスタムトラックとしてロードした。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク候補は、ｌｎｃＲＮＡ転写開始部位（ＧＥＮＣＯＤＥ注釈）周囲の１０００ｂｐ幅領域を横断した。

【0175】

ポリソームプロファイリング
細胞を、３７℃で１０分間にわたって１００ｍｇ／ｍＬシクロヘキシミドを用いて処理し、１０分間にわたって１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて処理し、１００ｍｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを含有する氷冷１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した。２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬシクロヘキシミド、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１×ＲＮアーゼ阻害剤、および１×プロテアーゼ阻害剤から構成されるポリソーム溶解バッファーを、細胞を再懸濁するために用い、続いて、氷上で３０分間インキュベーション（時折転倒させる）し、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。ポリプロピレン１３．２ｍＬチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）中で、１０％および５０％スクロース溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含まず、かつＲＮアーゼ不含条件で調製したポリソーム抽出バッファー中に希釈したスクロース）を用いて、スクロース勾配を調製した。線形にするために、勾配を４℃で一晩静置した。溶解された細胞からの透明上清を１０～５０％スクロース勾配上にロードし（Ｎａｎｏｄｒｏｐにより測定された等量３００μｇのＲＮＡ）、４℃で９０分間、３９，０００ｒｐｍ（１９０，０００ｇ）（ＳＷ４０Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＯｐｔｉｍａＸＥ）で遠心分離した。手動採取により１２個のスクロース勾配画分を分離し、２５４ｎｍで吸光度を測定し（ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ポリソームプロファイルを記録した。

【0176】

ｌｎｃＲＮＡ ＯＲＦクローニング戦略
ＨＣＴ１１６およびＣＴ２６細胞においてＭＨＣクラスＩ上に積載されたペプチドを生成することが特定されたｌｎｃＲＮＡに関して、ペプチド配列を最初に逆翻訳し、ｌｎｃＲＮＡ転写産物へと戻した。続いて、ｌｎｃＲＮＡ転写産物をすべての３フレームにおいて翻訳し、すべてのＡＴＧコドン（開始メチオニンをコードする）と後続のインフレームＳＴＯＰコドンとの間に含まれる全配列を強調することにより、潜在的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を特定した。特定されたＭＨＣペプチドを含んだポリペプチドを生成するであろういずれかの潜在的ＯＲＦを、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを発現するプラスミドベクター（ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＮＥＯ－ＣＯＯＨ－３ｘＦＬＡＧ；ＯＧ６２９、ＯｘＧｅｎｅ）中へとクローニングするための配列として特定した。ＯＲＦ（ＳＴＯＰコドンを除く）および３０ｂｐ上流配列（内因性転写産物中に存在するいずれかのＫｏｚａｋ配列を含めるため）を増幅するためにプライマーを設計し、適切な場合にＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶに関する制限部位を含めた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０５３０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および鋳型としてのＨＣＴ１１６またはＣＴ２６細胞由来ｃＤＮＡ（定量的ＲＴ－ＰＣＲに関して上記に記載される通りに生成された）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、適切な場合にＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて消化した。消化した産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、消化済みベクターへとライゲーションした。トランスフェクションにおける使用に先立って、正しいクローニングを確認するためにすべてのプラスミドを配列決定した。

【0177】

機能的ゲノム解析－ＴＣＧＡ
ヒトがんにおけるペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡ転写産物の発現レベルの解析のために、Ｘｅｎａブラウザ（カリフォルニア大学）を用いた（ｈｔｔｐｓ：／／ｘｅｎａ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）。ＴＣＧＡ（がん組織；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｎｃｉ／ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ／ｃｃｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ｔｃｇａ）および遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ；健康組織；ｈｔｔｐｓ：／／ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／）サンプル由来の転写産物発現データを含んだＴＣＧＡ ＴＡＲＧＥＴ ＧＴＥｘデータセットを選択した。マイクロサテライト不安定性およびステージ決定の後続の詳細な解析のために、ＴＣＧＡ由来のデータセットを用いた。また、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ＞ｃｃｌｅ）を用いて、結腸直腸がん細胞株におけるｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現を分析した。Ｈｅａｔｍａｐｐｅｒツール（ｈｔｔｐ：／／ｈｅａｔｍａｐｐｅｒ．ｃａ／）を利用してヒートマップを作成した。詳細な生存期間解析に関して、ＧＥＰＩＡ２ツールを用いた（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｐｉａ２．ｃａｎｃｅｒ－ｐｋｕ．ｃｎ／＃ｉｎｄｅｘ）。

【0178】

Ｔ１－４４処置を用いるＣｏｌｏｎ２６マウス腫瘍モデル
すべての実験およびプロトコールは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｇｅｒｍａｎｙ（ここで実験が行われた）の動物福祉組織および地域当局により承認され、かつすべての適用可能な国際的、国家的および地域的法律およびガイドラインに従って行った。６～８週齢の１６匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（対照群および処置群当たり８匹のマウス）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１００μＬ／マウスの合計注入体積中のＰＢＳ中５×１０^５個Ｃｏｌｏｎ２６細胞の片側性皮下注入を行った。個々の腫瘍体積が５０～１５０ｍｍ^３に達した時点で、同等の群平均／中央値腫瘍体積を目指して、腫瘍体積に基づいてマウスを処置群へと割り当てた。無作為化から２４時間以内に、ビヒクルとして０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを用いて、１００ｍｇ／ｋｇ（投薬体積１０ｍＬ／ｋｇ）のＴ１－４４によって、経口投与（強制投与）によりマウスを毎日処置した。体重およびキャリパーによる腫瘍体積［ｍｍ^３］測定を、週２回行った。実験の１９日目または腫瘍潰瘍の場合には１０００ｍｍ^３超（片側）または当初体重の７０％未満での体重減少で、個々のマウスの打ち切りを行った。各群から、４個の急速凍結腫瘍をＲＮＡ単離のために収集し、４個のホルマリン固定サンプルを免疫組織化学染色のために作製した。

【0179】

マウスおよびワクチン接種
８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の群に、表２に示されるペプチドミックスをｉ．ｖ接種した（３０μｇ ｐｏｌｙＩＣおよび２５μｇ抗ＣＤ４０ ｍＡｂを含む５０μｇ／ペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ））。陽性対照として、ＡＨ１ペプチド（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；配列番号１５６）ワクチン接種を用いた（Ｈｕａｎｇら、１９９６）。ビヒクル単独マウスには、ＤＭＳＯ／ＰＢＳ＋上記の通りのアジュバントを用いてワクチン接種した。同じ製剤を用いて、７日間後にマウスにｉ．ｖ．追加免疫した。追加免疫の７日間後にマウスを殺処分し、脾臓を取り出した（群当たり４匹のマウス）。すべての動物は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ（オックスフォード大学）で特定病原体不在条件において飼育した。すべての操作は、英国動物（科学的処置）法１９８６に従って、英国内務省認可ＰＰＬ ＰＰ３４３０１０９の下に行った。すべての操作は、訓練されかつ免許を有する個人により行われた。

【0180】

【0181】

ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
殺処分前日に、４℃で、滅菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈された一次抗体（抗マウスＩＮＦｙ ｍＡｂクローンＡＮ１８、Ｍａｂｔｅｃｈ）と共に、Ｍｅｒｋマルチスクリーン９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ）をインキュベートした。次の日、抗体を除去し、２５０μＬ／ウェルでＰＢＳを用いてプレートを４回洗浄し、続いて、２００μＬ／ウェルのＲ１０（１０％熱不活性化ＦＣＳ、非必須アミノ酸、Ｌ－グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＳｉｇｍａから）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）、３７℃で２時間）を用いてブロッキングした。マウスを殺処分し、脾臓を取り出し、４０μｍセルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ）に通し、単一細胞懸濁物を遠心分離によりペレット化した。脾細胞を、３ｍＬのＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｏｎｚａ）中に３～５分間にわたって再懸濁して赤血球を溶解させ、続いて２０ｍＬのＰＢＳを用いて停止させ、その後、室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。脾細胞ペレットを５ｍＬのＲ１０中に再懸濁し、計数し、４×１０^５／ｍＬに細胞濃度を調整した。ブロッキングバッファーを除去し、その群が接種された個別の個々のペプチド（１５μｇ／ｍＬでの５０μＬのペプチド）を用いて刺激した５０μＬの細胞で置き換えた。各ペプチドは、２回反復で試験した。陽性対照としてコンカナバリンＡを用いて細胞を刺激した場合のみ、陰性対照ウェルはＤＭＳＯを含んだ。プレートを、３７℃（５％ＣＯ_２）インキュベーター中で一晩（１５～２０時間）インキュベートした。細胞およびペプチドを除去し、滅菌ＰＢＳを用いてウェルを７回洗浄した。アッセイ希釈剤（ＡＤ）（ＰＢＳ中２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中に１：２０００で希釈した二次抗体（ビオチンコンジュゲート化マウス抗ＩＮＦｙ、ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し（５０μＬ／ウェル）、室温で２時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳを用いてプレートを４回洗浄し、続いて、ＡＤ中に１：７５０で希釈した５０μＬの抗ビオチン－アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）（Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳを用いてプレートを４回洗浄し、続いて、５０μＬ ＢＣＰ／ＮＢＴ基質を各ウェルに添加し、陽性対照ウェルにおいてスポットが視認できるまで、５～１０分間発色させた。ＤＩ水中で３回プレートをリンスすることにより、反応を停止させた。ゴム底を除去し、ＤＩ水を用いてメンブレンを両面リンスし、続いて乾燥させた。ＥＬＩＳＰＯＴカウンタ（ＡＩＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でスポットを定量化した。

【0182】

Ｃｏｌｏｎ２６マウス腫瘍モデルにおける樹状細胞ワクチン戦略
すべての実験およびプロトコールは、ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ（ＨｏｎｇＫｏｎｇ）Ｌｉｍｉｔｅｄ（ここで実験が行われた）の動物福祉組織および地域当局により承認され、かつすべての適用可能な国際的、国家的および地域的法律およびガイドラインに従って行った。６～８週齢の１６匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ＿ＣＲＬ：５４７）（群当たり８匹のマウス：対照（未パルス刺激樹状細胞）およびペプチドパルス刺激樹状細胞）（Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，ＬＴＤ）に、１００μＬ／マウスの合計注入体積中のＰＢＳ中３×１０^５個Ｃｏｌｏｎ２６細胞の片側性皮下注入を行った。個々の腫瘍体積が６０～８０ｍｍ^３に達した時点で、同等の群平均／中央値腫瘍体積になるように、腫瘍体積に基づいてマウスを処置群へと割り当てた。無作為化から２４時間以内に、１×１０^６細胞／０．２ｍＬの未パルス刺激またはパルス刺激樹状細胞を用いてマウスを静脈内的にワクチン接種した。ワクチンを調製するために、マウス骨髄細胞を回収した。次に、ＧＭ－ＣＳＦ（２５０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－４（５ＩＵ／ｍＬ）含有培地を用いて細胞を処理し、５％ＣＯ_２中、３７℃でインキュベートした。３日目に培地を半交換した。６日目に、樹状細胞を成熟させるためにＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＬＰＳを用いて細胞を処理した。２４時間のインキュベーション後、ＤＣ細胞を回収し、表現型をＦＡＣＳ（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６）により分析した。続いて、２×１０^５個のＤＣ細胞／ｍＬを、７５μｇ／ｍＬ（１５種類のペプチド、各５μｇ／ｍＬ）でペプチド（ｔａｂ．Ｘ）を用いてパルス刺激し、５時間インキュベートした。回収および培地を用いるＤＣ細胞の洗浄後、注入に対して準備ができた。２回目のワクチン接種を、７日目に行った。体重および腫瘍体積［ｍｍ^３］を、キャリパー測定により週２回行った。実験の１２日目または腫瘍潰瘍の場合には３０００ｍｍ^３超（片側）または当初体重の８０％未満での体重減少で、個々のマウスの打ち切りを行った。各群から、ホルマリン固定サンプルを免疫組織化学染色のために作製した。

【0183】

免疫組織化学染色
ＦＦＰＥスライドを、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて５分間洗浄し、続いて、１００％エタノール中で３分間２回、７０％エタノール中で３分間および水道水中で５分間洗浄した。次に、抗原復旧溶液（用いる抗体に応じてクエン酸ナトリウムバッファーまたはＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ）と共に、２０分間にわたって水浴中９９℃でサンプルをインキュベートした。精製水を用いた３回の洗浄後、新たに作製した６％メタノール／Ｈ_２０_２と共に１５分間サンプルをインキュベートし、水道水中で洗浄した。次のステップにおいて、スライドを、１％ＰＢＳＴ中で５分間洗浄し、ブロッキング血清溶液（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ）中で２０分間ブロッキングし、１％ＰＢＳＴ中で５分間再度洗浄し、一次抗体のＳＤＭｅ（１：５０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＤ８（１：１１０００、Ａｂｃａｍ）、ＣＤ４（１：８０００、Ａｂｃａｍ）、ＦｏｘＰ３（１：４０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＤ１６３（１：５０００、Ａｂｃａｍ）と共に４℃で一晩インキュベートした。次の日、スライドを、１％ＰＢＳＴを用いて５分間洗浄し、続いて、室温で二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ）と共に３０分間インキュベートした。次のステップにおいて、ＡＢＣ溶液（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ－ＨＲＰ Ｋｉｔ、ペルオキシダーゼ、ウサギＩｇＧ、ＰＫ－４００１）を添加して３０分間おき、スライドを、１％ＰＢＳＴ中で洗浄し、ＤＡＢ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ ＤＡＢ）と共に１０分間インキュベートした。続いて、スライドを、精製水中で洗浄し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で対比染料した。Ｌｅｉｃａ顕微鏡を用いて結果を分析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を用いて半定量データとして提示した。

【0184】

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）による対応のない両側スチューデントｔ検定および一元配置分散分析検定を用いて、統計解析を行った。別途示されない限り、データはＳＥを表示した平均として示す。０．０５未満のＰ値を有意と見なし、ｐ＜０．０５に関して（^＊）、ｐ＜０．０１に関して（^＊＊）、ｐ＜０．００１に関して（^＊＊＊）、およびｐ≦０．０００１に関して（^＊＊＊＊）の星印により標識する。

【0185】

［実施例１：ヒトｌｎｃＲＮＡ遺伝子のＥ２Ｆ１およびＰＲＭＴ５対照発現］
本発明者らは、小分子活性部位阻害剤Ｔ１－４４を用いた、ＨＣＴ１１６結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞におけるｌｎｃＲＮＡ遺伝子の発現に対するＰＲＭＴ５活性の薬理学的阻害、およびＥ２Ｆ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の影響を調査した（Ｂａｒｃｚａｋら、２０２０）。ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子発現における変化（３０％超の変化）についてマイニングし、これにより、ｌｎｃＲＮＡ転写産物が各条件間で差次的に発現されたことが明らかになった。本発明者らは、上方調節されたかまたは下方調節されたかのいずれかであったｌｎｃＲＮＡを特定し（３０３種類の下方調節と比較して２３７種類の上方調節）、異なる条件間で明らかなｌｎｃＲＮＡ発現の幾分かの重複を伴った（図１ＡおよびＢ）。差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡは、本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（１８，３７７種類の総ｌｎｃＲＮＡ転写産物）内で検出可能なレベルで存在する総ｌｎｃＲＮＡのうちの約３％を代表した。選択された群のｌｎｃＲＮＡ転写産物の発現をｑＰＣＲにより個別に測定した場合、ＬＮＣＯＣ１などはＴ１－４４処理に際して増加した一方で、ＣＥＲＮＡ１、ＣＣＮＴ２－ＡＳ１およびＵＢＬ７－ＡＳ１は減少した遺伝子発現パターンが明らかであった（図１Ｃ）。同様に、ｌｎｃＲＮＡ発現はＥ２Ｆ１活性により影響を受け；例として、ＬＩＮＣ０１１２８およびＫＣＴＤ２１－ＡＳ１転写産物はＥ２Ｆ１ ＫＯ細胞において比較的高レベルで発現された（図１Ｃ）。

【0186】

本発明者らは、注釈付きＥ２Ｆ１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットを調査することにより、Ｅ２Ｆ１の直接的な標的であるか否かを評価するために、一群のｌｎｃＲＮＡ遺伝子を選択した（Ｄｕｎｈａｍら、２０１２）。ＰＲＭＴ５およびＥ２Ｆ１を操作した際に差次的に発現されるとスコア付けされたｌｎｃＲＮＡ転写産物のうちの多くが、転写産物開始部位（ＴＳＳ）に非常に近接するかまたは転写される配列の本体内にＣｈＩＰ－ｓｅｑ読み出し値を有した遺伝子に由来した。この情報は、本発明者らが予測上のＥ２Ｆ結合性部位の周囲でプライマーを設計することを促し、その後、本発明者らは、Ｅ２Ｆ１との関連を確認するための遺伝子特異的ＣｈＩＰ実験においてこれらのプライマーを用いた。例えば、Ｅ２Ｆ１は、ＷＴ Ｅ２Ｆ１発現性ＨＣＴ１１６細胞においてＫＣＴＤ２１－ＡＳ１、ＣＥＲＮＡ１、ＣＣＮＴ２－ＡＳ１、およびＵＢＬ７－ＡＳ１遺伝子中でクロマチン結合型であったが、Ｅ２Ｆ１ ＫＯ細胞は、予期された通りにＥ２Ｆ１富化を示さなかった（図１Ｄ）。Ｔ１－４４を用いる細胞の処理は、ＣｈＩＰ結合型Ｅ２Ｆ１に対して顕著な影響を有しなかった（図１Ｄ）。

【0187】

本発明者らは、全ゲノムレベルで、Ｅ２Ｆ結合性部位を保有するか、または確立されたタンパク質コードＥ２Ｆ標的遺伝子の非常に近傍に位置する、差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡの割合を評価した。

【0188】

注目すべきことに、潜在的な直接的Ｅ２Ｆ１標的遺伝子としてスコア付けされる（ＥＮＣＯＤＥからのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを用いた、ＴＳＳの５００ｂｐ以内での読み出し値）ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット中で、統計学的に有意なレベル（ｑ＜０．０５）で差次的に調節されるｌｎｃＲＮＡ遺伝子のパーセンテージは３９．２％であり、追加の３８．９％のｌｎｃＲＮＡ遺伝子は、ゲノムレベルで既知のＥ２Ｆ標的遺伝子に近接するかその範囲内に位置した（同じかもしくは反対の鎖上でのＥ２Ｆ１標的遺伝子の遺伝子境界が重複するか、または同じかもしくは反対の鎖上でのＥ２Ｆ１標的遺伝子の遺伝子境界内に含まれた）が、それ自体が直接的なＥ２Ｆ標的であるようには見えなかった。２１．９％は非Ｅ２Ｆ１標的であった。したがって、ここで特定されたｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちの大多数は、Ｅ２Ｆ経路との密接な関係を有する。

【0189】

［実施例２：Ｅ２Ｆ１、ＰＲＭＴ５およびマウスゲノム］
本発明者らは、マウスＣＲＣ ＣＴ２６細胞株における全ゲノムＲＮＡｓｅｑ解析を追求した。ＲＮＡｓｅｑ解析を、対照処理と比較して、化合物Ｔ１－４４を用いて処理されたインビトロで生育されたＣＴ２６細胞において行った。本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡ転写産物に焦点を合わせてＰＲＭＴ５の作用を評価するために、ＲＮＡｓｅｑデータセットをマイニングした。ｌｎｃＲＮＡのセットが、顕著に調節されることが見出され（３０％カットオフで）、対照処理と比較してＰＲＭＴ５阻害に際して１０９種類が上方調節され、２８２種類が下方調節された（図２Ａ）。本発明者らは、単一遺伝子レベルで解析した場合にｌｎｃＲＮＡ転写産物が調節されたことを確認し；例えば、Ｇｍ４４１４８、Ｇｍ４６５６５、Ｐｔｐｒｖ、Ｅｐｂ４１ｌ４ａｏｓおよびＧ６３００３０Ｊ０９Ｒｉｋ転写産物は、ＰＲＭＴ５を操作した際に差次的に発現された（図２Ｂ）。マウスｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちの多くは、Ｅ２Ｆ１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに従って、Ｅ２Ｆ１標的であると示された。注目すべきことに、差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡのうちの８３．９％は、それらのＴＳＳに対して非常に近接したＥ２Ｆ結合性部位ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを含んだ遺伝子に由来するが、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちの追加の８．９％は、ゲノムレベルでＥ２Ｆ標的遺伝子に近接するかまたはその範囲内に位置した。本発明者らは、ｓｉＥ２Ｆ１処理細胞における発現も評価し、これらの細胞では、発現レベルは多くの場合に下方調節され（図２Ｂ）、このことは、ＰＲＭＴ５およびＥ２Ｆ１によるマウスｌｎｃＲＮＡ遺伝子の調節を強調した。

【0190】

本発明者らは、インビボで生育する同系ｃｏｌｏｎ２６腫瘍におけるｌｎｃＲＮＡ遺伝子発現の解析の後に続けて、Ｔ１－４４処理の影響を評価した。Ｔ１－４４による腫瘍保有マウスの処理は、腫瘍生育における顕著な遅延を引き起こす：

【0191】

潜在的な直接的Ｅ２Ｆ１標的遺伝子としてスコア付けされる（ＧＥＯからのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ［ＧＳＭ２８８３４９］を用いて、ＴＳＳの５００ｂｐ以内での読み出し値）ＣＴ２６ ＲＮＡ－ｓｅｑデータ中で統計学的に有意なレベル（ｑ＜０．０５）で差次的に調節されるｌｎｃＲＮＡ遺伝子のパーセンテージは８３．９％であるか、またはそれ自体は直接的な標的ではないが、８．９％は他の潜在的なＥ２Ｆ１標的遺伝子と関連付けられることが見出された（同じかもしくは反対の鎖上でのＥ２Ｆ１標的遺伝子の遺伝子境界が重複するか、または同じかもしくは反対の鎖上でのＥ２Ｆ１標的遺伝子の遺伝子境界内に含まれた）。非Ｅ２Ｆ１標的は、７．２％に相当する。

【0192】

Ｔ１－４４処理腫瘍と比較して生育中の腫瘍に対して行ったＲＮＡｓｅｑは、２種類の処理条件間で差次的に（３０％カットオフ）調節されるｌｎｃＲＮＡ転写産物を特定した。単一ｌｎｃＲＮＡ遺伝子レベルでは、４９３０４７３Ａ０２Ｒｉｋ、Ｇｍ４５４４１、Ｇｍ１５１５６、Ｌｎｃｐｐａｒａ、Ｋｃｎｍｂ４ｏｓ１、Ｌｎｃｅｎｃ１およびＥｐｂ４１ｌ４ａｏｓ転写産物は、化合物Ｔ１－４４を用いる処理に際して上方調節された（図２Ｃ）。さらに、ＣＴ２６ ＲＮＡ－ｓｅｑにおいて特定されたＥｐｂ４１ｌ４ａｏｓ、Ｇｍ４４１４８およびＧｍ４６５６５をはじめとするｌｎｃＲＮＡのうちの一部は、ｃｏｌｏｎ２６腫瘍において同じ傾向に従った。したがって、本発明者らは、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸が、ヒトがん細胞株において見られるのと同様に、インサイチューで生育する腫瘍をはじめとするマウス腫瘍細胞においてｌｎｃＲＮＡ遺伝子発現を調節すると結論付ける。

【0193】

［実施例３：ＰＲＭＴ５は腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において免疫応答を調節する］
有効な抗腫瘍応答の促進でのＴＭＥの役割により、本発明者らは、ＰＲＭＴ５阻害に際して遅延した腫瘍生育（図２Ｃ）が、調節解除された遺伝子発現により引き起こされるＴＭＥ中での事象を反映したか否かを試験した。Ｔ１－４４処理に際した腫瘍生育の阻害は、腫瘍生検内でのＳＤＭｅマークの低減されたレベルと同時に起こり（図２Ｅ）、したがって、ＰＲＭＴ５の触媒的阻害を確認した。ＴＭＥのさらなる調査に際して、本発明者らは、Ｔ１－４４処理が、細胞傷害性ＣＤ８の流入およびヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球での穏当な増加により最も明らかに証明される、浸潤性リンパ球集団に対する著しい影響を有し；腫瘍関連マクロファージなどの他の関連する細胞集団に対して、Ｔ１－４４処理の作用は最小限であったことを見出した（図２Ｅ）。ＣＤ８ Ｔリンパ球の増加したレベルが適応免疫応答に対する影響に起因した可能性があると考えられ、ＣＤ８ Ｔリンパ球は主にそれらのＴ細胞受容体を介してＭＨＣクラスＩ抗原複合体と関与するので、Ｔ１－４４処理がＭＨＣクラスＩタンパク質複合体を介する抗原提示に影響したと考えるのが妥当である。

【0194】

ＭＨＣクラスＩ複合体のペプチド抗原内容物が化合物Ｔ１－４４を用いるＣＴ２６細胞の処理に際して変化したか否かに取り組むために、本発明者らは、未処理細胞と比較して、処理細胞においてＭＨＣクラスＩ複合体により提示されるペプチドのレパートリーを評価するための質量分析（ＭＳ）免疫ペプチドミクス解析を行った（図３ＡおよびＢ）。結果は、ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドの大きな群を明らかにし、その多くが細胞のタンパク質に由来した。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子発現の調節におけるＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸の役割を考慮して、本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡがＭＨＣクラスＩペプチドレパートリーに寄与するか否かを調べることに着手した。本発明者らは、本発明者らのＣＴ２６ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおいて検出可能なレベルで発現されるｌｎｃＲＮＡ転写産物の全３フレームからの予測上の転写を含む社内プロテオームデータベースを作成した。続いて、免疫ペプチドミクス解析から検出されたペプチドを、この社内データベースまたはすべての審査されたマウスＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質エントリーを含む標準的なプロテオームデータベースのいずれかに対してマッチさせた（図３Ａ）。特に、本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子に由来する３８２種類のペプチド（９残基の平均サイズを有する）を特定し、これは解析中で検出された総ペプチドのうちの６．５％を代表した（図３Ｂ～Ｄ）。ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドは、マウスＭＨＣクラスＩ対立遺伝子Ｈ－２－Ｋｄ、Ｄｄ、Ｌｄ、Ｑａ１、Ｑａ２に対する高い親和性が予測され、効果的なＭＨＣクラスＩ結合性に必要な保存された残基を示した（図３Ｃ）。免疫ペプチドミクスにおいて特定されたペプチド配列の選択を、その後、合成ペプチド配列に対して比較することにより、質量分析を用いて確認した。最も重要なことに、データをＴ１－４４処理細胞ペプチドと対照細胞ペプチドとの間で比較した場合、定性的および定量的差異の両方が、ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドの集団内で明らかであった。

【0195】

本発明者らは、ペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡの調節におけるＰＲＭＴ５およびＥ２Ｆ１の役割を調べ、Ｇｍ２０６２１、１１１００３８Ｂ１２Ｒｉｋおよび４９３３４０６Ｊ０９Ｒｉｋなどのそれらのうちの多くが、ＰＲＭＴ５阻害に際して、インビトロでおよび腫瘍として生育されたＣＴ２６細胞において上方調節されたことを見出した。さらに、ｌｎｃＲＮＡの発現プロファイルは、一般的に、ペプチドにおける類似の定性的変化と相関し、例えば、Ｔ１－４４処理に際して、Ｇｍ３７２８３（ペプチド配列ＨＩＦＳＬＨＨＦ；配列番号１７６）およびＧｍ１７１７３（ペプチド配列ＲＬＡＱＬＱＴＴＩ；配列番号１６６）は上方調節され、かつ４７３２４６３Ｂ０４Ｒｉｋ（ペプチド配列ＲＧＰＬＬＥＫＬＦ；配列番号１６７）は下方調節された。本発明者らはまた、ｓｉＥ２Ｆ１サイレンシングを用いてこれらのｌｎｃＲＮＡの発現に対するＥ２Ｆ１の影響を評価し、試験したセットのうちでは、ｌｎｃＲＮＡはＥ２Ｆ１依存的様式で調節されたことを見出した。実際には、ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちの大多数は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットを参照してＥ２Ｆ標的遺伝子であることが見出され；約８１％が直接的Ｅ２Ｆ１標的であり、さらなる８％は他のＥ２Ｆ１標的遺伝子と関連するかまたは重複した。

【0196】

ＭＨＣクラスＩ関連ペプチドは、通常、より大きなタンパク質から生成され、これがタンパク質分解に供され、リソソーム内小胞系へと注ぎ込まれる（Ｒｏｃｋら、２０１６）。ｌｎｃＲＮＡは一般的に非コード性であると見なされるが（ＨａｒｔｆｏｒｄおよびＬａｌ、２０２０；Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）、本発明者らはｌｎｃＲＮＡ遺伝子に由来するペプチドを特定したので、本発明者らは、それらが、小さなペプチドを送達するために潜在的にプロセシングされ得るであろうタンパク質をコードすることができるか否かを試験することを希望した。ペプチドを生じたｌｎｃＲＮＡのうちの多くに関して、本発明者らは、ペプチドがそれに由来したであろう理論上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を特定することができ（図３Ｅ）；ＯＲＦのうちの大部分は、１００残基未満を有する小さなコードポリペプチドであったが、ｌｎｃＲＮＡのうちの別の群は、より大きなＯＲＦを有したことが明らかであった。さらに、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子に由来する転写産物は、例えば、Ｇｍ３７４９４、Ｇｍ３７２８３、およびＧｍ１７１７３をはじめとする、リボソームの転写性ポリソーム画分を用いて注釈付けすることができた（図３Ｅ）。Ｇｍ３７２８３およびＧｍ４７７６１などの一部の場合には、それらの注釈は、ＰＲＭＴ５阻害に際して強化され（図３Ｆｉｉｉ）、これは次に、誘導されたペプチド（それぞれ、ＨＩＦＳＬＨＨＦ；配列番号１７６およびＹＹＩＰＧＬＫＧＩ；配列番号１９４）の増大したレベルと同時に起こった。

【0197】

本発明者らは、その後、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子ＲＮＡが検出可能タンパク質へと直接的に翻訳できるか否かを試験し、本発明者らはこれを、Ｃ末端でＦＬＡＧエピトープを用いてタグ付けされた発現ベクターへと予測上のＯＲＦ ｃＤＮＡをクローニングすることにより行った。例として、Ｇｍ２９２５３ ｌｎｃＲＮＡは、２６ｋＤポリペプチドをコードする理論上のＯＲＦを有した。Ｇｍ２９２５３ ＯＲＦの異所性発現から誘導される特異的ポリペプチドは、免疫染色および免疫ブロッティングによりトランスフェクションされた細胞中で検出され、予測上のＯＲＦに関する予測された分子量を伴った。したがって、本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドを生じるｌｎｃＲＮＡが、リボソームに会合することができ、かつさらにポリペプチドへと翻訳されることができ、これがＭＨＣクラスＩタンパク質複合体へとペプチドを送達するためにその後にプロセシングされると結論付ける。

【0198】

［実施例４：ヒト腫瘍細胞におけるｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩ関連ペプチド］
本発明者らは、Ｔ１－４４処理細胞を未処理細胞と比較する、ヒトＨＣＴ１１６細胞におけるＭＨＣクラスＩ関連ペプチドに対する類似の免疫ペプチドミクス解析を行い、これもまたヒトｌｎｃＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドの重要なセットを強調し（すべての社内データベースから特定された１１８種類の固有ペプチド；図４Ａ～Ｃ）；細胞性タンパク質に由来する追加のより多くのセットもまた明らかであった。個別のｌｎｃＲＮＡペプチド配列を、その合成ペプチド対応物に対して質量分析由来ペプチド配列を比較することにより確認した。ペプチドのサイズは、ヒトＨＬＡ ＭＨＣクラスＩ結合性に必要とされる予測される保存された残基を含む平均９残基であり（図４ＢおよびＣ）、ヒトＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－Ｃ対立遺伝子ＭＨＣクラス１タンパク質に対して高親和性を有すると予測された（図４Ｂ）。さらに、定量的分析は、ペプチドのうちの４２％（ＧＥＮＣＯＤＥ注釈を用いてｌｎｃＲＮＡデータベースから特定される通り）が、３０％以上の変化を伴ってＴ１－４４処理に際して調節されたことを示し、１０％が上方調節され、３２％が下方調節され、５８％が変化しなかった。

【0199】

本発明者らは、ｑＰＣＲによりＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドを生じるヒトｌｎｃＲＮＡの発現を測定し、Ｔ１－４４処理に際して、多くが差次的に発現され、かつ発現変化のうちの一部がＭＨＣクラスＩ関連ペプチドにおいて見られる類似の相対的変化を反映したことを見出した。例えば、ＨＥＬＬＰＡＲ（ペプチド配列ＬＳＬＳＬＳＬＱＦＳ；配列番号１２７）およびＲＰ１１－６６０Ｌ１６．２（ペプチド配列ＲＬＡＴＨＩＤＧＡ；配列番号３６）ｌｎｃＲＮＡに由来するペプチドの増大したレベルは、Ｔ１－４４処理に際する増大したｌｎｃＲＮＡ発現を反映した一方で、ＡＣ０７９１３５．１（ペプチド配列ＡＥＫＰＰＧＳＶＡ；配列番号１０６）、ＲＰ１１－３１９Ｇ６．１（ペプチド配列ＥＥＴＹＦＨＬＦ；配列番号２０）およびＶＰＳ９Ｄ１－ＡＳ１（ペプチド配列ＲＬＬＱＥＴＨＱＡ；配列番号３８）ｌｎｃＲＮＡをはじめとする示された低減した発現は、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合したペプチドの低減したレベルと同時に起こった。ｌｎｃＲＮＡのうちの多くの発現はまた、Ｅ２Ｆ１によっても影響を受け、Ｅ２Ｆ１ ＫＯ細胞株における増加した（ＡＣ００４９４３．２、ＰＰＭ１Ｆ－ＡＳ１、ＡＣ０１８４４５．６）かまたは減少した発現（Ｃ５ｏｒｆ３４－ＡＳ１、ＲＰ１１－３１９Ｇ６．１、ＡＣ０７９１３５．１）のいずれかを示した。

【0200】

本発明者らは、ヒトがん細胞において、ペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡのうちの多くが、Ｅ２Ｆ１標的遺伝子を代表することを確認した。本発明者らは、Ｅ２Ｆ１結合性部位を特定するためにＣｈＩＰｓｅｑデータを用い、これらの部位の周辺でプライマーを設計し、続いて、ＣｈＩＰにより、クロマチン結合型Ｅ２Ｆ１の存在を確認した。Ｅ２Ｆ１は、ペプチドを生成したｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちの多くのプロモーターで富化されていることが観察され；それぞれＧＥＮＣＯＤＥおよびＦＡＮＴＯＭデータベース由来のｌｎｃＲＮＡのうちの約３９％および７７％が直接的Ｅ２Ｆ１標的遺伝子であるように見えた一方で、ペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡ遺伝子のうちのさらに２６％（ＧＥＮＣＯＤＥ）および１４％（ＦＡＮＴＯＭ）が、それぞれ、他のＥ２Ｆ１標的遺伝子と関連付けられた。Ｅ２Ｆ１動員に対するＴ１－４４処置の影響は、軽度であるように見えた。

【0201】

本発明者らは、ＨＣＴ１１６細胞中で発現されるヒトｌｎｃＲＮＡ内のＯＲＦに対して類似の解析を行った。ＭＨＣ結合型ペプチドを生じたｌｎｃＲＮＡ ＯＲＦのうちの大部分が１００残基未満であり、１２ｋＤ未満のポリペプチドを生じ、すべてのＯＲＦを比較した場合、弱い翻訳開始配列が明らかであった。本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡが、リボソームの翻訳性ポリソーム画分に会合することができるか否かを試験し、多数のｌｎｃＲＮＡ、例えば、ＭＡＬＡＴ１、ＡＣ０７９１３５．１、およびＶＰＳ９Ｄ１－ＡＳ１がそれを行うことができたことを見出し（図４Ｄ）；一部の場合、例えば、ＭＡＬＡＴ１およびＶＰＳ９Ｄ１－ＡＳ１では、ＰＲＭＴ５阻害およびＥ２Ｆ１ ＫＯ条件に際して沈降シフトが見られた（図４Ｄ）。

【0202】

続いて、本発明者らは、ヒトｌｎｃＲＮＡ転写産物が、発現ベクター中にｃＤＮＡとして予測上のＯＲＦをクローニングすることにより、タンパク質へと直接的に翻訳されることができるか否かに取り組んだ。試験した２つの例ＭＡＬＡＴ１およびＡ００７９１３５．１に関して、ＭＨＣ関連ペプチドを含むＯＲＦから誘導される小さなタンパク質を、免疫染色および免疫ブロッティングにより検出することができた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。加えて、これらのｌｎｃＲＮＡポリペプチドの発現がＰＲＭＴ５阻害剤を用いる処理後に誘導された一方で、対照プラスミドからのＧＦＰの発現は影響されず、このことは、ｌｎｃＲＮＡ由来ポリペプチドの翻訳は、ＰＲＭＴ５によりさらに調節されることができることを示唆した（図４Ｆ）。

【0203】

［実施例５：ヒトがんに対する関連性］
ＭＡＬＡＴ１およびＤＡＮＣＲなどのＭＨＣ結合型ペプチドをコードするＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１応答性ｌｎｃＲＮＡのうちの一部が、ヒトがんにおいて調節解除された発現を示すことが既に公知であることは、注目に値する（Ｚｈａｏら、２０２１）。したがって、本発明者らは、悪性疾患における発現パターンに関して十分に特性が決定されていないペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡ（ここで特定される）のうちの一部を評価した。これらのエクササイズのうちの一部として、本発明者らは、ある範囲のがんおよび正常組織にわたるＭＡＬＡＴ１およびＤＡＮＣＲ発現を確認した（図５Ａ）。他のｌｎｃＲＮＡの発現パターンは可変的であり；例えば、ＶＰＳ９Ｄ１－ＡＳ１は、一部のがんでの高発現および一般的には正常組織において低発現を伴う、不均一な発現を示した。このことは、がんおよび正常組織において均一な低発現を有したＣＴＣ－４５９Ｆ４と対照的であった。

【0204】

ＣＲＣ細胞株における発現の詳細な解析では、ｌｎｃＲＮＡ発現は、ある範囲の腫瘍細胞株にわたって検出され、細胞株のパネルに対して、一部のｌｎｃＲＮＡ遺伝子は高発現を示し、他のものはより低い発現を示した（図５Ａ）。興味深いことに、ｌｎｃＲＮＡ発現を、ヒト結腸直腸がん、胃がんおよび食道がんから調製されたＲＮＡにおいて解析した場合、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）下位群およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）下位群における発現間に明らかな区別が見られ；例えば、結腸直腸がんでは、ｌｎｃＲＮＡ発現のうちの大部分はＭＳＳ下位群において起こり、ＭＳＩ下位群では起こらず、これは胃がんおよび食道がんでは比較的目立たなかった（図５Ａ）。したがって、一般的に、ｌｎｃＲＮＡの発現は疾患特異的である。

【0205】

ヒト疾患におけるｌｎｃＲＮＡの予後的重要性を評価することにはさらに興味が持たれ、この評価で本発明者らは副腎皮質（ＡＣ）がん、ＣＲＣおよび膵臓がん（ＰＣ）に注目し、腫瘍生検の集合にわたって発現レベルを測定し、この情報を生存期間に関連付けた。ＰＲＭＴ５レベルは、高レベルが予後不良に相関したので、予後的重要性を有し；Ｅ２Ｆ１発現は類似の傾向に従った（図５Ｂｉ）。一部のｌｎｃＲＮＡは同様に挙動し、高発現が予後不良に相関した（例えば、ＤＡＮＣＲおよびＬＩＮＣ０００９４；図５Ｂｉ）。しかしながら、この相関は、ＣＲＣおよびＰＣではあまり明らかでなかった（図５Ｂｉｉおよび図５Ｂｉｉｉ）。一般的に、ｌｎｃＲＮＡ発現の予後値は、ＡＣにおいて非常に良好であるが、ＣＲＣおよびＰＣでは非常に可変的であるように見える。

【0206】

［実施例６：ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドによる免疫原性および腫瘍生育阻害］
本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドがマウスにおいて免疫原性であるか否かを試験した。マウスｌｎｃＲＮＡ遺伝子によりコードされ、免疫ペプチドミクス解析において特定された２０種類のペプチドを、ＭＨＣクラスＩに対するそれらの予測上の高親和性、正常マウス組織中でのそれらの対応物ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の低発現およびＰＲＭＴ５阻害に際する差次的調節に基づく免疫学的分析のために選択した（図５Ｃ）。５種類のペプチドのプールを、マウスを免疫化するために用い、ペプチドの関連プールを用いて各マウス由来の細胞を再刺激することによるＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔのために、１４日目に脾細胞を回収した。マウスを免疫化するために用いられたペプチドのうち、本発明者らは、免疫原性であった１５種類のペプチドを特定し、これらは未免疫化マウスと比較してＩＦＮγ活性化型Ｔ細胞における顕著な増加をもたらした（図６Ａ）。本発明者らは、陽性免疫原性対照ペプチド（ＡＨ１）およびさらに免疫原性を示すことができなかった数種類のｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドを含めた（図６Ａ）。これらの結果は、ｌｎｃＲＮＡ由来ＭＨＣクラスＩ結合型ペプチドが免疫原性であり、かつ有効なＴ細胞応答を刺激するという証拠を提供する。

【0207】

本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドに対するＴ細胞応答は、がんワクチンの文脈で送達された場合に治療上の利益へと変換されるか否か、すなわち、抗腫瘍応答を増強するか否かを試験することに興味を持った。この問題に対処するために本発明者らが採ったアプローチは、エクスビボ樹状細胞送達プラットフォームを用いることであった。骨髄樹状細胞をマウスから回収し、成熟させ、続いてプールした免疫原性ペプチドを用いてパルス刺激した。７日間後、ペプチドパルス刺激された樹状細胞および対照樹状細胞を、確立された同系ｃｏｌｏｎ２６腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスへと導入し、腫瘍生育に対するいずれかの作用をモニタリングした。著しいことに、ペプチドパルス刺激した樹状細胞の移入は、抗腫瘍応答を強化し、これは対照処理樹状細胞と比較してｃｏｌｏｎ２６腫瘍の遅延した生育として反映された（図６Ｂ）。樹状細胞送達の文脈では、ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドは、ｃｏｌｏｎ２６腫瘍（ペプチドが当初それから誘導された）の生育を妨げ、したがって治療上の利益を提供することができる。

【0208】

［考察］
Ｇ１期からＳ期への制御を介した細胞生育および分裂の調節因子としてのｐＲｂ－Ｅ２Ｆ経路の古典的な見方は、近年顕著に発展してきた。Ｅ２Ｆの作用は非定型であり、通常の転写作用ではなくむしろ選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子を含む、はるかに広いレパートリーの標的遺伝子がＥ２Ｆ経路制御に供されることが現在明らかである（Ｒｏｗｏｒｔｈら、２０１９）。どの遺伝子制御メカニズムが優勢であるかを決定することにより、Ｅ２Ｆ１中の小さなＲリッチ領域を標的とするＰＲＭＴ５により媒介されるアルギニンメチル化は、Ｅ２Ｆ１による遺伝子発現制御に対する主要な影響である（Ｚｈｅｎｇら、２０１３）。がんにおけるＰＲＭＴ５の頻繁な過剰発現（ＢｅｄｆｏｒｄおよびＣｌａｒｋｅ、２００９；ＢｅｄｆｏｒｄおよびＲｉｃｈａｒｄ、２００５；Ｊａｎｓｓｏｎら、２００８；ＹａｎｇおよびＢｅｄｆｏｒｄ、２０１３）を考慮して、Ｅ２Ｆ活性の調節でのその役割は、非常に重要である可能性が高い。本研究において、本発明者らは、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸の影響をｌｎｃＲＮＡ遺伝子の制御へと、およびさらに免疫認識での役割へと広げる、予期せぬ観察のセットを開示した。本発明者らの研究の主要な知見は、多数のｌｎｃＲＮＡ遺伝子が、直接的にＥ２Ｆ経路制御下で、ＭＨＣクラスＩタンパク質と集合し、その後に免疫系により認識される小さなペプチドをコードすることを示す。

【0209】

ヒトゲノム解析は、約２８，０００種類のヒトｌｎｃＲＮＡ遺伝子（ＦＡＮＴＯＭ５データベース）（Ｈｏｎら、２０１７）を暗示する他のものを伴う、１７，０００種類超のｌｎｃＲＮＡ遺伝子（ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ３８）（Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）が見られることを示唆してきた。ｌｎｃＲＮＡは通常、２００ヌクレオチド長であり、少数が、ｍＲＮＡと同様の様式でプロセシングおよびスプライシングされると記載されてきた（Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。ｌｎｃＲＮＡが生物学的に重要であるか否かは、議論の対象の主題のままであり；一部は、例えば、クロマチン生物学における、細胞機能の原因とされてきた（Ｓｃｈｌａｃｋｏｗら、２０１７；Ｖｏｓら、２０１８）。他の研究では、ｌｎｃＲＮＡは、ＲＮＡ生物発生に影響を及ぼし得る（Ｓｔａｔｅｌｌｏら、２０２１）。さらに、ｌｎｃＲＮＡ発現は、がんと関連付けられてきた。例えば、ＭＡＬＡＴ１は非常に保存されたｌｎｃＲＮＡであり、細胞および組織において多量に発現され、転写および転写後レベルの両方での遺伝子の調節において役割を果たす可能性がある（Ｅｎｇｒｅｉｔｚら、２０１４；Ｙａｎｇら、２０１３）。ＭＡＬＡＴ１は、転移性肺がんにおいて上昇した発現を示すとして当初特定され、同じことが、異なる固形腫瘍またはリンパ性腫瘍において記載されてきた。マウス転移性がんモデルでは、ＭＡＬＡＴ１欠損は原発腫瘍の分化および転移の顕著な低減をもたらした（Ａｒｕｎら、２０１６）。

【0210】

がん細胞（ヒトおよびマウス）に対するＭＨＣクラスＩタンパク質のペプチド組成の詳細な免疫ペプチドミクス解析を通して、本発明者らは、次にＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により調節される遺伝子であることが示された、著しい割合のｌｎｃＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドを特定した。これらのペプチドのうちの多くは、ＰＲＭＴ５活性の薬理学的阻害に際して調節され、加えてＥ２Ｆ１標的遺伝子であり、このことは、ＰＲＭＴ５およびＥ２Ｆ１が一緒に、がん細胞の免疫原性、および次に従って、腫瘍に対する免疫応答を調節することを示す。興味深いことに、ＭＡＬＡＴ１は、コード配列中のＯＲＦによりコードされるより大きなポリペプチドから誘導されるペプチドをコードすることを本発明者らが見出した１つのｌｎｃＲＮＡであった。バイオインフォマティクスアプローチを用いて、腫瘍関連抗原はゲノムの非カノニカルな部分に由来することができるが、生物学的基礎および治療上の重要性が大多数の部分に関して未だ解明されていないことは、注目に値する（Ｃｈｏｎｇら、２０２０；Ｌａｕｍｏｎｔら、２０１８；Ｚｈａｎｇら、２０１８）。本明細書中に記載される結果は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示機構のペプチド組成に寄与する上でのｌｎｃＲＮＡ遺伝子の新規かつ重要な役割を堅固に確立する。

【0211】

ｌｎｃＲＮＡ遺伝子は、がんにおいて異常に発現され、増加したかまたは減少した発現を示す場合がある（Ｈｕａｒｔｅ、２０１５）。本明細書中に記載される結果の文脈では、変化した発現レベルは、がん細胞により免疫系へと提示されるペプチドのスペクトルにおける定量的差異および、それにより、免疫認識に対する影響へと変換されることができるであろう。これらの観察は、翻って、ＰＲＭＴ５により調節されるがん関連経路を明らかにし；すなわち、ｌｎｃＲＮＡ発現の制御を介した多数のヒトがんにおける広く報告されたＰＲＭＴ５の増加したレベルは、免疫系に対して提示されるペプチドレパートリーを変化させることにより、腫瘍細胞の免疫原性に対して影響を及ぼす。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子から誘導されるペプチドは自己抗原であり、したがって、理論上はそのようなペプチド抗原を標的とするＴ細胞は、中枢および末梢寛容メカニズムにより発達中に除去されるはずであることは、特筆すべきである。しかしながら、本発明者らは、試験されたペプチドのうちの多くが活性なＴ細胞応答を駆動することができたことを見出し、このことは、このクラスのｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドに対して存在するいずれかの寛容が部分的であるかまたは覆されることができることを示唆する。本発明者らが合成的ｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドに対するＴ細胞応答に関する証拠を獲得したという事実により、本発明者らは、これが腫瘍に対する抗がん応答へと変換されるか否かを試験した。これに関して、本発明者らは、ペプチドがそれから元来特定され、かつ重要なことにＭＨＣクラスＩタンパク質の文脈において天然に発現および提示されるｃｏｌｏｎ２６モデルを用いた。本発明者らの結果は、これが実際に当てはまることを示唆した。つまり、ｃｏｌｏｎ２６同系マウスモデルにおいて、エクスビボペプチド積載樹状細胞を介して送達されたｌｎｃＲＮＡ由来ペプチドは、有効な抗がん免疫応答を刺激することができた。

【0212】

結果は、ＰＲＭＴ５－Ｅ２Ｆ１軸により制御され、かつＭＨＣクラスＩ関連抗原として古典的経路を介して免疫系に対して提示される、腫瘍関連抗原の予期せぬ豊富な供給源として、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子を強調する（図６Ｃ）。それ自体が高いがん関連性を有する酵素であるＰＲＭＴ５の薬理学的操作を通してそれらの発現に影響を及ぼす能力は、腫瘍細胞の免疫原性を制御し、最終的に特異的なタイプのがんに合わせることができるがんワクチンをさらに開発するための新規アプローチを可能にする。本発明者らの研究はまた、細胞周期進行の基本的な調節因子であり、多くの場合にがんにおいて調節解除されるｐＲｂ－Ｅ２Ｆ経路を、抗原提示および免疫応答と統合もし、したがって、がん細胞増殖と免疫系との間の相互作用を確立する。

【0213】

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【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】