知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-543186Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく新規なゲノム編集システムおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく新規なゲノム編集システムおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241112BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241112BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241112BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/55 ZNA
C12N15/11 Z
C12N9/22
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N7/01
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531724
(86)(22)【出願日】2022-11-17
(85)【翻訳文提出日】2024-07-19
(86)【国際出願番号】 CN2022132596
(87)【国際公開番号】W WO2023098485
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】202111445474.3
(32)【優先日】2021-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518222745
【氏名又は名称】上海科技大学
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＴＥＣＨ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９３ Ｍｉｄｄｌｅ Ｈｕａｘｉａ Ｒｏａｄ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】季泉江
(72)【発明者】
【氏名】陳未中
(72)【発明者】
【氏名】馬佳誠
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA30
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は生物医薬の分野に属し、ＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼとして用いられるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの使用および極小型ゲノム編集システムを開示し、前記ゲノム編集システムは、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび／または前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびにガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。本発明に記載の極小型ゲノム編集システムは原核細菌および真核細胞のゲノムにおける少なくとも一つの標的配列に対して遺伝子編集を行うことができる。また、本発明は、前記ゲノム編集システムの使用および編集方法を開示する。本発明の遺伝子編集システムまたは方法によって標的遺伝子を正確にノックアウトまたは切断することができ、切断効率が高く、標的遺伝子の正確な編集を実現させる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼとして用いられるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの使用。
【請求項2】
遺伝子編集システムにおけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸の使用。
【請求項3】
遺伝子編集システムであって、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび／または前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびにガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことを特徴とするシステム。
【請求項4】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、（Ｉ）ＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性を有する、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはその断片、
（ＩＩ）ＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性を有する、（Ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも３０％の配列相同性を有するバリアント、
（ＩＩＩ）さらに核局在化シグナル断片を含む、上記（Ｉ）または（ＩＩ）、
（ＩＶ）、さらに、
（ａ）修飾または突然変異の前よりも顕著に減少したエンドヌクレアーゼ活性を有するようにさせるか、エンドヌクレアーゼ活性をなくす、一つまたは複数の修飾または突然変異、ならびに／あるいは
（ｂ）ほかの機能活性を有するポリペプチドまたはドメインを含む、上記（Ｉ）または（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、
（Ｖ）エンドヌクレアーゼ活性を有する、上記（Ｉ）または（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、であることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子編集システム。
【請求項5】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは８００個アミノ酸以下であり、ならびに／あるいは、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性を有することを特徴とする、請求項３または４に記載の遺伝子編集システム。
【請求項6】
標的配列におけるＰＡＭ配列を認識し、ならびに／あるいは、ＰＡＭ配列の後の長さが１２～４０ｂｐであり、好ましくは２０ｂｐである核酸断片を標的することを特徴とする、請求項３～５のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【請求項7】
前記ＰＡＭ配列はＡＡＮ、ＧＡＮであり、ここで、Ｎは縮重塩基で、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧの任意の塩基を表すことを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子編集システム。
【請求項8】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＮ末端からＣ末端まで、配列番号１で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくとも３０％の配列同一性を有するバリアントを含み、ＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン１、配列番号２で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくとも３０％の配列同一性を有するバリアントを含み、かつＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン２を含むことを特徴とする、請求項３～７のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【請求項9】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは配列番号３～１１７で示されるアミノ酸配列のいずれか一つ、または配列番号３～１１７で示されるアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも３０％の配列相同性を有し、かつＲＮＡによってガイドされる核酸結合活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする、請求項３～７のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【請求項10】
前記ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズ可能な遺伝子標的領域（ｉ）、
ｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）、
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）を含み、
ここで、前記ｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）と前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）がハイブリダイズし、ステム－ループ構造を形成し、
前記ガイドＲＮＡは一本鎖で、前記核酸標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）が順に連結してなるか、あるいは、前記ガイドＲＮＡは二本鎖を含み、その一方の鎖は前記遺伝子標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）が連結してなり、もう一方の鎖は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）であることを特徴とする、請求項３～７のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【請求項11】
（１）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの発現構築体、（２）完全なガイドＲＮＡの発現構築体を含み、
前記完全なガイドＲＮＡはガイドＲＮＡ骨格、および当該ガイドＲＮＡ骨格の３’末端付加の標的配列に相応するＲＮＡ配列を含み、前記標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが１２～４０ｂｐの核酸断片であり、好ましくは、ＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片であることを特徴とする、請求項５または６に記載の遺伝子編集システム。
【請求項12】
前記ガイドＲＮＡ配列は前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに相応し、ここで、前記Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ Ｃ２Ｃ９（配列番号３）に相応するｔｒａｃｒメイト配列は配列番号１１８で示され、前記ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列は配列番号１１９で示され、一体に連結して得られたガイドＲＮＡ骨格配列は配列番号１２０で示されることを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子編集システム。
【請求項13】
遺伝子編集方法であって、標的遺伝子を請求項３～１２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムと接触させることで、標的遺伝子の編集を実現させることを特徴とする、方法。
【請求項14】
ｉ）前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入する工程、ｉｉ）前記ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞に導入する工程、
ｉｉｉ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼによって媒介され、標的遺伝子に一つまたは複数の切口が生じるか、前記標的遺伝子をターゲティング、編集、修飾または操作する工程を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子編集方法。
【請求項15】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは加工または未加工の様態のガイドＲＮＡによって標的遺伝子にガイドされることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の遺伝子編集方法。
【請求項16】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼとガイドＲＮＡが複合体を形成し、前記標的遺伝子におけるＰＡＭ配列を認識し、ならびに／あるいは、前記遺伝子編集システムの標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが１２～４０ｂｐの核酸断片であり、好ましくは、ＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の遺伝子編集方法。
【請求項17】
さらに、異質ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を細胞に導入する工程を含むことを特徴とする請求項１４に記載の遺伝子編集方法。
【請求項18】
体内、インビトロ細胞または無細胞の環境において標的遺伝子および／またはその関連ポリペプチドに対して遺伝子編集を行うことにおける請求項３～１２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムまたは請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法の使用であって、前記インビトロ細胞は細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、ウイルス細胞、植物細胞および動物細胞を含むことを特徴とする、使用。
【請求項19】
体内、インビトロ細胞または無細胞の環境において標的遺伝子および／またはその関連ポリペプチドに対して遺伝子編集を行うことにおける請求項３～１２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムまたは請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法の使用であって、前記遺伝子編集は、遺伝子切断、遺伝子削除、遺伝子挿入、点突然変異、転写抑制、転写活性化、塩基編集およびガイド編集からなる群より選ばれることを特徴とする、使用。
【請求項20】
遺伝修飾された細胞であって、請求項３～１２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムまたは請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法によって遺伝子編集を行って得られた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医薬の分野に属し、極小型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく新規なゲノム編集システム、および当該システムの原核細菌および真核細胞におけるゲノム編集方法と使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、近年開発された新規な遺伝子編集システムである。当該システムは主にＣａｓエンドヌクレアーゼおよび相応するガイドＲＮＡから構成される。ＣａｓエンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡと特異的に結合し、相補的塩基対形成によってゲノムの特定の部位を標的として認識して切断し、ゲノムＤＮＡの二本鎖を断裂させる。そして、生体の内在または外来のＤＮＡ修復機構、たとえば、末端連結の相同組換えおよび非相同組み換えの修復機構によって断裂したゲノムＤＮＡを修復することで、修復の過程においてゲノムの特定の部位の編集を実現させる。
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる細胞または種に対する遺伝学的操作は、幅広く生命科学、医学、農学などの分野の基礎研究、生物技術の開発、および疾患の治療手段の研究開発に応用することができる。たとえば、遺伝病や癌などの疾患の突然変異遺伝子を矯正すること、農作物に対して遺伝子工学的改造を行い、その性能を向上させること、微生物のゲノムを正確に改造し、高付加価値の化合物の生産を促進すること、病原微生物のゲノムを切断して病原微生物を殺傷し、感染の治療に使用するなどが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの利便性と効率性のため、既に幅広く医学、生物、農学などの分野で応用されている。
【0004】
現在、広く使用されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集システムは、主にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａの２種類を含む。その２種類のゲノム編集システムにおいて、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質であるヌクレアーゼＣａｓ９およびＣａｓ１２ａはいずれも１０００超のアミノ酸を含有する大型タンパク質で、よってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａの細胞への送達の過程に大きな問題がある。たとえば、生体の遺伝子治療の過程において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステムは常にレンチウイルスベクターにパッケージングして使用する必要がある。しかし、レンチウイルスベクターのパッケージング容量に限りがあるため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステムの巨大な分子サイズによってレンチウイルスベクターのパッケージング効率が制限され、パッケージングの難易度が高まり、これらのシステムの遺伝子治療などの分野における幅広い応用が大きく制限される。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ、ＰＡＭ配列またはＰＡＭ部位）の有限性のため、選べるゲノムの部位が制限され、医学や生物学などの分野におけるさらなる応用が影響される。そのため、効率的でかつ小分子量の新規なゲノム編集システムの発見と開発が切望されている。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、極小型ゲノム編集システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９システムを含む）および方法を提供する。本発明のゲノム編集システムによれば、原核細菌および真核細胞の標的部位に対して正確な切断を行うことで、遺伝子の正確なノックアウトまたは編集を実現させることができる。また、本発明は新規なＲＮＡ編集可能なエンドヌクレアーゼを提供す
る。さらに、本発明はガイドＲＡＮ（ｇＲＮＡ）および／または標的配列を含むほかの構成要素、および様々な応用においてそれらを生成および使用する方法に関する。このような応用の例は、転写を調節する方法、ならびに新規なヌクレアーゼおよびほかの構成要素、たとえば、核酸および／またはポリペプチドで遺伝子（たとえばＤＮＡやＲＮＡ）をターゲティング、編集および／または操作する方法を含む。さらに、本発明は前記編集システムのエレメントを含む組み換え細胞およびキットなどに関する。
る。さらに、本発明はガイドＲＡＮ（ｇＲＮＡ）および／または標的配列を含むほかの構成要素、および様々な応用においてそれらを生成および使用する方法に関する。このような応用の例は、転写を調節する方法、ならびに新規なヌクレアーゼおよびほかの構成要素、たとえば、核酸および／またはポリペプチドで遺伝子（たとえばＤＮＡやＲＮＡ）をターゲティング、編集および／または操作する方法を含む。さらに、本発明は前記編集システムのエレメントを含む組み換え細胞およびキットなどに関する。
【0006】
本発明の一つの側面では、ゲノムにおける少なくとも一つの標的配列に対して遺伝子編集を行うゲノム編集システムであって、以下のものを含有するゲノム編集システムを提供する：
（ａ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびに
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをコードする核酸。
（ａ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびに
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをコードする核酸。
【0007】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはそれにマッチするガイドＲＮＡと複合体を形成する。
【0008】
一つの好適な実施形態において、前記ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ゲノム編集システムである。
【0009】
一つの好適な実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ゲノム編集システムは以下のものを含有する：
（１）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの発現構築体、
（２）完全なガイドＲＮＡの発現構築体、
前記完全なガイドＲＮＡはガイドＲＮＡ骨格、および当該ガイドＲＮＡ骨格の３’末端付加の標的配列に相応するＲＮＡ配列を含み、前記標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが１２～４０ｂｐの核酸断片、好ましくはＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片である。本発明に記載のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは本分野の通常のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼであってもよい。好適に、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの大きさは好ましくは８００個アミノ酸以下である。より好適に、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの由来は以下のアミノ酸配列のいずれか一つまたは以下のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つ配列番号３～１１７である。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅＣ２Ｃ９（ＡｃＣ２Ｃ９）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＣ２Ｃ９（ＣｇＣ２Ｃ９）、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａＣ２Ｃ９（ＲｄＣ２Ｃ９）およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓＣ２Ｃ９（ＭｉｌＣ２Ｃ９）などからなる群より選ばれる。
（１）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの発現構築体、
（２）完全なガイドＲＮＡの発現構築体、
前記完全なガイドＲＮＡはガイドＲＮＡ骨格、および当該ガイドＲＮＡ骨格の３’末端付加の標的配列に相応するＲＮＡ配列を含み、前記標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが１２～４０ｂｐの核酸断片、好ましくはＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片である。本発明に記載のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは本分野の通常のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼであってもよい。好適に、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの大きさは好ましくは８００個アミノ酸以下である。より好適に、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの由来は以下のアミノ酸配列のいずれか一つまたは以下のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つ配列番号３～１１７である。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅＣ２Ｃ９（ＡｃＣ２Ｃ９）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＣ２Ｃ９（ＣｇＣ２Ｃ９）、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａＣ２Ｃ９（ＲｄＣ２Ｃ９）およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓＣ２Ｃ９（ＭｉｌＣ２Ｃ９）などからなる群より選ばれる。
【0010】
本発明の好適な実施例において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは配列表における配列番号３で示されるＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼである。
【0011】
ある実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ある実施形態において、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡコード配列は配列表における配列番号１２１で示されるか、あるいは配列番号１２１と少なくとも３０％，少なくとも３５％，少なくとも４０％，少なくとも４５％，少なくとも５０％，少なくとも５５％，少なくとも６０％，少なくとも６５％，少なくとも７０％，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を持つバリアントである。
【0012】
ある実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするＲＮＡは
ｍＲＮＡである。
ｍＲＮＡである。
【0013】
ある実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする配列はヒトコドンに応じて最適化されたコード配列で、好ましくは配列表における配列番号１２２で示されるか、あるいは配列番号１２２と少なくとも３０％，少なくとも３５％，少なくとも４０％，少なくとも４５％，少なくとも５０％，少なくとも５５％，少なくとも６０％，少なくとも６５％，少なくとも７０％，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を持つバリアントである。
【0014】
ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はリポソームまたは脂質ナノ粒子の中に調製されている。ある実施形態において、前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は前記ｇＲＮＡまたは前記ｇＲＮＡをコードする核酸も含む。
【0015】
ある実施形態において、前記システムはｇＲＮＡと予備配位したＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを含むことで、標的遺伝子（たとえば、標的ＤＮＡ）の配列におけるＰＡＭ配列を認識するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、すなわち、正確にＤＮＡ配列の横に局在化し、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡからなる複合体が標的遺伝子におけるＰＡＭ配列を認識することを含む。
【0016】
ここで、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのガイドＲＮＡの骨格配列は配列表における配列番号１２０で示される。
【0017】
ある実施形態において、前記完全なガイドＲＮＡ発現構築体はガイドＲＮＡ骨格の発現ＤＮＡ配列、および当該発現ＤＮＡ配列の３’末端に付加された標的配列に相応するＲＮＡ配列の発現ＤＮＡ配列を含み、ここで、前記標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの断片である。
【0018】
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ゲノム編集システムが好適に認識するＰＡＭ部位はＡＡＮおよび／またはＧＡＮである。
【0019】
ある実施形態において、本発明に記載のシステムは、さらに、異質ポリヌクレチオド配列含有ドナー鋳型を含んでもよく、ここで、前記異質ポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入されることができる。ある実施形態において、異質ポリヌクレオチドのドナー鋳型はｇＲＮＡと物理的に連結している。
【0020】
もう一つの側面では、本発明は、標的遺伝子座における二本鎖ＤＮＡをターゲティング、編集、修飾または操作する方法であって、上記のようなシステムにおけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、完全なガイドＲＮＡおよび前記二本鎖ＤＮＡを混合することを含み、前記完全なガイドＲＮＡは、５’－前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに相応するガイドＲＮＡ骨格＋前記二本鎖ＤＮＡにおける標的配列に相応するＲＮＡ配列－３’である方法を提供する。ある実施形態において、前記方法は二本鎖ＤＮＡを切断するために用いられる。
【0021】
ある実施形態において、本発明は、細胞において上記のように標的遺伝子座における二本鎖ＤＮＡをターゲティング、編集、修飾または操作する方法を提供する。ある実施形態において、前記方法は、さらに、ポリヌクレオチドのドナー鋳型を細胞に導入する工程を含み、前記ドナー鋳型はドナーの一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドのドナー鋳型である。
【0022】
本発明のある実施形態において、相同組換え修復、非相同末端結合またはマイクロホモロジー媒介末端結合によってＤＢＳにおいてＤＮＡを修復する。
【0023】
上記のように、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに相応する好適なガイドＲＮＡの骨格は、配列表における配列番号１２０で示される。その３’末端に異なる標的配列に対する標的ＲＮＡ配列を加えると、完全なガイドＲＮＡになる。
【0024】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに対する好適な限定は上記の通りで、好ましくは、由来が配列番号３～１１７などからなる群で、より好ましくは、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ Ｃ２Ｃ９（ＡｃＣ２Ｃ９）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｃ２Ｃ９（ＣｇＣ２Ｃ９）、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ
Ｃ２Ｃ９（ＲｄＣ２Ｃ９）およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ Ｃ２Ｃ９（ＭｉＣ２Ｃ９）から選ばれ、さらに好ましくは、配列表における配列番号３またはそのバリアントで示される。前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのヒトコドンに応じて最適化されたより好適なコード配列は配列表における配列番号１２２で示される。前記バリアントは配列番号３のアミノ酸残基と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有し、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ結合活性および／または二本鎖ＤＮＡ切断活性が残っている。
Ｃ２Ｃ９（ＲｄＣ２Ｃ９）およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ Ｃ２Ｃ９（ＭｉＣ２Ｃ９）から選ばれ、さらに好ましくは、配列表における配列番号３またはそのバリアントで示される。前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのヒトコドンに応じて最適化されたより好適なコード配列は配列表における配列番号１２２で示される。前記バリアントは配列番号３のアミノ酸残基と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有し、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ結合活性および／または二本鎖ＤＮＡ切断活性が残っている。
【0025】
本発明に記載の切断方法は本分野の通常のものであってもよく、たとえば、本発明の好適な実施例において、前記切断方法は５０～２００ｍＭ ＮａＣｌおよび／または５～２０ｍＭ ＭｇＣｌ２の条件下で行われる。たとえば、ＮａＣｌの濃度は５０～１００ｍＭ、１００～１５０ｍＭ、１５０～２００ｍＭである。たとえば、ＭｇＣｌ２の濃度は５～１０ｍＭ、１０～１５ｍＭ、１５～２０ｍＭである。好適に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの緩衝溶液で行われる。
【0026】
前記切断方法は、反応温度が３４～４３℃であり、たとえば、３４～３７℃、３７～４０℃、４０～４３℃であり、好ましくは３７℃であり、反応時間が好ましくは３０～６０ｍｉｎである。
【0027】
もう一つの側面では、前述のゲノム編集システムを標的配列を含有する原核細菌または真核細胞内に導入してゲノム編集を行うことを含む、ゲノム編集方法を提供する。
【0028】
本発明に記載の原核細菌は大腸菌、肺炎クレブシエラ菌などの原核微生物を含むが、これらに限定されない。
【0029】
本発明に記載の真核細胞は哺乳動物細胞、酵母などの真核生物細胞を含むが、これらに限定されない。
【0030】
前述のゲノム編集方法における「遺伝子編集」は本分野の通常のもの、たとえば、遺伝子切断、遺伝子削除、遺伝子挿入、点突然変異、転写抑制、転写活性化、塩基編集およびガイド編集などでもよいが、これらに限定されない。
【0031】
もう一つの側面では、本発明は、ゲノム編集におけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの使用を提供する。
【0032】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび前記遺伝子編集に対するさらなる限定は上記の通りであ
る。
る。
【0033】
当該ゲノム編集システムのヌクレアーゼの大きさは８００個アミノ酸以下である。
【0034】
もう一つの側面では、本発明は、修飾された細胞であって、前述のシステムまたは方法のいずれか一つのによって細胞のゲノムを編集された細胞を提供する。一つの実施形態において、前記修飾された細胞は、（ａ）前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびに（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含み、ここで、前記ｇＲＮＡは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列にガイドすることができる。ある実施形態において、前記修飾された細胞は、さらに、異質ポリヌクレチオド配列含有ドナー鋳型を含み、ここで、前記異質ポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入されることができる。
【0035】
本発明の積極的な進歩効果は以下のことを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９は出願人が発見した新規なゲノム編集システムで、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含み、当該システムはサイズが小さく（Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、一般的に、８００個アミノ酸以下である）、複雑なＰＡＭが必要でない（認識するＰＡＭ部位はＡＡＮなどであるという特徴）。完全なガイドＲＮＡのガイドおよび局在化機能により、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは体内、インビトロ細胞または無細胞の環境において正確に局在化、ターゲティングし、ゲノムＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡの二本鎖の断裂を実現させることができる。宿主細胞自身または外来の修復機構を利用し、当該システムは効率的かつ正確に生体内またはインビトロ細胞または無細胞の環境におけるゲノム編集を実現させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９は出願人が発見した新規なゲノム編集システムで、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含み、当該システムはサイズが小さく（Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、一般的に、８００個アミノ酸以下である）、複雑なＰＡＭが必要でない（認識するＰＡＭ部位はＡＡＮなどであるという特徴）。完全なガイドＲＮＡのガイドおよび局在化機能により、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは体内、インビトロ細胞または無細胞の環境において正確に局在化、ターゲティングし、ゲノムＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡの二本鎖の断裂を実現させることができる。宿主細胞自身または外来の修復機構を利用し、当該システムは効率的かつ正確に生体内またはインビトロ細胞または無細胞の環境におけるゲノム編集を実現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】ＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭの同定の流れおよび結果の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９は５’－ＡＡＮタイプのＰＡＭ配列および少量の５’－ＧＡＮ配列（ここで、Ｎは縮重塩基で、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができることが示された。ここで、横座標－１、－２、－３、－４、－５、－６はそれぞれＮＴＳ鎖（非標的鎖）における標的ＤＮＡ領域の配列の５’末端の上流に位置する１、２、３、４、５、６個目のＤＮＡ塩基を表す。その上のアルファベットはＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡ配列に対する嗜好性を表し、アルファベットが占める比率が高いほど、当該塩基に対するＡｃＣ２Ｃ９の嗜好性が強いことを示す。
【図2】ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｉＣ２Ｃ９のＰＡＭの同定結果の図である。結果から、ＣｇＣ２Ｃ９は５’－ＡＡＳタイプのＰＡＭ配列（ここで、Ｓは縮重塩基で、ＣはまたはＧのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができ、ＲｄＣ２Ｃ９（Ｂ）およびＭｉＣ２Ｃ９（Ｃ）は５’－ＡＡＮタイプのＰＡＭ配列（ここで、Ｎは縮重塩基で、Ａ、ＴはまたはＣのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができることが示された。
【図3】ＣＲＩＳＰＲ－ＡｃＣ２Ｃ９システムによって肺炎クレブシエラ菌の生細胞において遺伝子ノックアウトを行ったＰＣＲ結果の図である。結果から、選定されたｄｈａ遺伝子はＣＲＩＳＰＲ－ＡｃＣ２Ｃ９システムによって正確にノックアウトされることができたことが示された。
【図4】ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって基質ＤＮＡを切断した結果の図である。結果から、基質ＤＮＡはＡｃＣ２Ｃ９によって正確に二つのＤＮＡ断片に切断されたことが示された。
【図5】ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの異なる温度（Ａ）、異なるＮａＣｌ濃度（Ｂ）、異なるＭｇＣｌ２濃度（Ｃ）および異なる２価イオン（Ｄ）の条件における反応活性の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９は４０℃、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の条件下で活性が最も高いことが示された。
【図6】（Ａ）はＡｃＣ２Ｃ９の完全なガイドＲＮＡの配列の概略図である。（Ｂ）はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの条件下で、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって基質ＤＮＡを切断した結果の図である。
【図7】ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって４種類の５８ｂｐの蛍光標識ＤＮＡ基質を切断した結果の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９の標的鎖における主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の２１～２２ｎｔの箇所で、非標的鎖における主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の１５～１６ｎｔの箇所であることが示された。
【図8】ＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドが媒介するヒト細胞における遺伝子編集の結果の図である。（Ａ）はＩｎｄｅｌ実験のＴＢＥ－ＰＡＧＥゲルの図である。選ばれた５つの異なる遺伝子部位のうち、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはＶＥＧＦＡ、ＨＥＸＡおよびＤＮＭＴ１という三つの遺伝子に対する効率的な遺伝子編集の実現に成功した。（Ｂ）はＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドが媒介するヒト細胞においてＶＥＧＦＡ遺伝子の編集後のハイスループットシーケンシングの統計結果の図である。図に示すように、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは正確に標的配列に挿入または欠失の突然変異を導入することができた。
【図9】ＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における４７箇所の部位における遺伝子編集の効率の図である。
【図10】ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＬＥＡ、Ｕ－２ＯＳ、Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率の図である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下、具体的な実施例を組み合わせて、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。また、本発明の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができ、それらの等価の様態も本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【0038】
用語「Ｃ２Ｃ９」、「Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼ」、「Ｃ２Ｃ９ポリペプチド」、「Ｃ２Ｃ９タンパク」、「Ｃ２Ｃ９タンパク質」は入れ替えて使用することができる。
【0039】
用語「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「単一ｇＲＮＡ」および「キメラｇＲＮＡ」は入れ替えて使用することができる。
【0040】
なお、本発明における用語「一」または「一つ」の実体とは一つまたは複数の当該実体を指すため、用語「一」（または「一つ」）、「一つまたは複数」および「少なくとも一つ」は本明細書において入れ替えて使用することができる。
【0041】
用語「相同性」または「同一性」または「類似性」とは二つのペプチドの間または二つの核酸分子の間の配列の類似性をいう。相同性は異なるペプチドまたは核酸分子における相応する位置を比較することによって決定することができ、比較される分子の配列における同一の位置が異なる配列において同様の塩基またはアミノ酸に占められた場合、当該分子は当該位置において相同である。配列の間の相同の程度は配列が共有するマッチまたは相同の位置数の関数によって決定する。「関連しない」又は「非相同の」配列は、本発明に開示された配列の一つと相同性が２０％未満であるべきである。
【0042】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（あるいはポリペプチドまたはポリペプチド領域）がもう一つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（あるいはポリペプチドまたはポリペプチド領域と所定の百分率（たとえば、２０％、３０％、４０％、５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％）の配列相同性を有するとは、アラインメントの場合、アラインメントされる二つの配列において当該百分率の塩基（またはアミノ酸）が同様であることである。当該アラインメントおよび百分率相同性または配列同一性は本分野で既知のソフトおよび方法によって決定することができる。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載のようである。好適に、配列のアラインメントの場合、デフォルトのパラメーターを使用する。中では、選べるアラインメントプログラムの一つはＢＬＡＳＴで、デフォルトのパラメーターを使用する。特に、プログラムＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰによってアラインメントを行う場合、以下のデフォルトのパラメーターを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的意義で等価と思われるポリヌクレオチドとは、上記で限定された百分率相同性を有し、同様または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％）の配列相同性を有するとは、アラインメントの場合、アラインメントされる二つの配列において当該百分率の塩基（またはアミノ酸）が同様であることである。当該アラインメントおよび百分率相同性または配列同一性は本分野で既知のソフトおよび方法によって決定することができる。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載のようである。好適に、配列のアラインメントの場合、デフォルトのパラメーターを使用する。中では、選べるアラインメントプログラムの一つはＢＬＡＳＴで、デフォルトのパラメーターを使用する。特に、プログラムＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰによってアラインメントを行う場合、以下のデフォルトのパラメーターを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的意義で等価と思われるポリヌクレオチドとは、上記で限定された百分率相同性を有し、同様または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【0043】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、当該ポリヌクレオチドの配列は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）の四つのヌクレオチド塩基を代表するアルファベットからなる。ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、当該ポリヌクレオチドの配列は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）の四つのヌクレオチド塩基を代表するアルファベットからなる。そのため、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットで表示される。当該アルファベットの表示は中央演算処理装置を持つコンピューターにおけるデータベースに入力し、バイオインフォマティクスの応用、たとえば、機能ゲノミクスや相同性検索に使用することができる。用語「多型性」とは一つよりも多い様態の遺伝子またはその一部の共存をいい、「遺伝子の多型性領域」とは遺伝子が同一の位置に異なるヌクレオチドの表現の様態（すなわち、異なるヌクレオチド配列）があることである。遺伝子の多型性領域は単一のヌクレオチドでもよく、異なる対立遺伝子において異なる。
【0044】
本発明において、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は入れ替えて使用することができ、任意の長さのヌクレオチドの重合の様態をいい、デオキシリポヌクレオチドであってもリポヌクレオチドであってもよく、あるいはそのアナログであってもよい。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を実行してもよい。ポリヌクレオチドの実例は、遺伝子または遺伝子断片（プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグを含む）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブとプライマーを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、たとえば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログも含む。ポリヌクレオチドに修飾が存在する場合、当該修飾はポリヌクレオチドの組み立ての前またはその後に付与されてもよい。ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後、さらに修飾され、たとえば、カップリングによって標識成分で標識されてもよい。当該用語は同時に二本鎖および一本鎖のポリヌクレオチド分子を指す。別途に説明または要求しない限り、本発明に開示されたポリヌクレオチドのあらゆる実施形態はその二本鎖の様態および既知または二本鎖の様態が構成できると予想可能な二本の相補的な一本鎖の様態のうちのいずれかを含む。
【0045】
ポリヌクレオチドに使用される場合、用語「コード」とはポリヌクレオチドがポリペプチドを「コード」することで、その天然の状態において、あるいは当業者に公知の方法によって操作された場合、転写および／または翻訳によって標的ポリペプチドおよび／またはその断片を生成するか、あるいは当該標的ポリペプチドおよび／またはその断片をコードするｍＲＮＡを生成することができることを意味する。アンチセンス鎖とは当該ポリヌクレオチドと相補的な配列で、それからコード配列を推定することができる。
【0046】
用語「ゲノムＤＮＡ」は生物のゲノムのＤＮＡを表し、細菌、古細菌、真菌、原生生物、ウイルス、植物または動物のゲノムのＤＮＡを含む。
【0047】
用語ＤＮＡを「操作する」とは結合、一本鎖に切口を入れること、あるいはＤＮＡの二本鎖を切断すること、あるいはＤＮＡまたはＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾または編集することを含む。ＤＮＡを操作することは前記ＤＮＡによってコードされるＲＮＡまたはポリペプチドの発現をサイレンシング、活性化または調節すること（転写しないようにすること、または転写活性を低下させること、または翻訳しないようにすること、または翻訳のレベルを低下させること）、あるいはポリペプチドとＤＮＡの結合を防止または増強することができる。切断は多くの方法、たとえば、ホスホジエステル結合の酵素触媒または化学的加水分解によって行うことができ、一本鎖の切断であってもよく、二本鎖の切断であってもよく、ＤＮＡ切断は平滑末端または突出末端の発生につながる。
【0048】
用語「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「基本的に相補的」とは、核酸（たとえば、ＲＮＡ）が、適切な体外および／または体内の温度と溶液のイオン強度の条件において配列特異的に、逆平行に別の核酸と非共有的に結合し、すなわち、ワトソン・クリック型塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対の形成、「アニーリング」または「ハイブリダイズ」をすることができるようにするヌクレオチド配列を含むことである。
【0049】
本分野において、ポリヌクレオチドの配列はそれが特異的にハイブリダイズできる標的核酸の配列と１００％相補的であることが必要ではないと理解されている。ポリヌクレオチドは一つまたは複数の領域においてハイブリダイズしてもよい。ポリヌクレオチドはそれが標的とする標的核酸配列における標的領域の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列相補性を有してもよい。本分野において、既知のＢＬＡＳＴプログラムおよびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムにより、通常のように核酸における特定の核酸配列の領域の間の百分率相補性を決定することができる。
【0050】
本発明において、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は入れ替えて使用することができ、任意の長さのアミノ酸の重合の様態を表し、コードおよび非コードのアミノ酸、化学的または生物化学的に修飾または誘導されたアミノ酸、および修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含んでもよい。
【0051】
用語「結合ドメイン」とは、非共有的に別の分子と結合することができるタンパク質ドメインである。結合ドメインは、たとえば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ－結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ－結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質－結合タンパク質）に結合してもよい。タンパク質ドメイン－結合タンパク質の場合、その自体（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するように）および／または一つまたは複数の異なるタンパク質の一つまたは複数の分子と結合してもよい。
【0052】
用語「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質における類似する側鎖を有するアミノ酸残基の交換性を表す。例示的な保存的アミノ酸置換の組は、バリン－ロイシン－イソロイシン
、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリンおよびアスパラギン－グルタミンである。
、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリンおよびアスパラギン－グルタミンである。
【0053】
用語特定のＲＮＡを「コード」するＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリペプチドはタンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、あるいはＤＮＡポリペプチドはタンパク質に翻訳されないＲＮＡ（たとえば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｇＲＮＡで、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードしてもよい。「タンパク質コード配列」あるいは特定のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下で、体内または体外でｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。
【0054】
用語「ベクター」または「発現ベクター」はレプリコン、たとえば、プラスミド、ファージ、ウイルスやコスミドで、それに別のＤＮＡ断片、すなわち、「挿入断片」を付加させることで、細胞における付加の断片の複製を実現させることができる。
【0055】
用語「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結したＤＮＡコード配列を含む。「操作可能に連結」とは並列連結で、各成分はこれらが予期されるように作用を発揮させる関係にある。本発明において、用語「組み換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築体」は入れ替えて使用することができ、ベクターおよび少なくとも一つの挿入断片を含むＤＮＡ分子を表す。組み換え発現ベクターは、通常、挿入断片を発現および／または増幅させる目的あるいはほかの組み換えヌクレオチド配列を構築するために生成される。
【0056】
外来ＤＮＡ、たとえば、組み換え発現ベクターが既に細胞内に導入された場合、細胞は既に前記ＤＮＡによって「遺伝的に修飾」または「形質転換」または「形質移入」される。外来ＤＮＡの存在は永久または一時的な遺伝的改変につながる。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれているか、組み込まれていない。
【0057】
用語「標的ＤＮＡ」は「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明において、用語「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーＤＮＡ」または「プロトスペーサー様配列」は入れ替えて使用することができ、標的ＤＮＡに存在する核酸配列を表し、十分な結合のための条件が存在すると、ｇＲＮＡのＤＮＡ－標的領域がそれと結合する。ＲＮＡ分子は標的ＤＮＡにおける標的配列と結合、ハイブリダイズまたは相補する配列を含むことで、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡにおける特定の位置（標的配列）にターゲティングする。「切断」とはＤＮＡ分子の共有結合の主鎖の断裂である。
【0058】
用語「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」は入れ替えて使用することができ、ポリヌクレオチドを切断するための内部切断の核酸分解の触媒活性を有することを指す。ヌクレアーゼの「切断ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」とは、ヌクレアーゼにおけるＤＮＡ切断のための触媒活性を有するポリペプチド配列またはドメインである。切断ドメインは一つのポリペプチド鎖に含まれてもよく、あるいは切断活性は二つまたは複数のポリペプチドの結合によって生じてもよい。
【0059】
用語「局在化ポリペプチド」または「ＲＮＡ－結合部位ガイドポリペプチド」とは、結合するＲＮＡを特定のＤＮＡ配列にターゲティングするポリペプチドである。
【0060】
用語「ガイド配列」またはＤＮＡ－標的領域（または「ＤＮＡ－標的配列」）は、本発明において「プロトスペーサー様」配列と呼ばれる標的ＤＮＡにおける特定の配列と相補的なヌクレオチド配列（標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。
【0061】
用語「組み換え」とは二つのポリヌクレオチドの間で遺伝情報を交換する過程である。本発明において使用される「相同組換え修復（ＨＤＲ）」は、たとえば、細胞において二本鎖の断裂を修復する期間で発生する特殊化様態のＤＮＡ修復を表す。この過程はヌクレオチド配列の相同性が必要で、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二本鎖の断裂を経た分子）の修復に供する鋳型として使用し、遺伝情報がドナーから標的に移るようになる。ドナーのポリヌクレオチドが標的分子と異なり、ドナーのポリヌクレオチドの一部または全部の配列が標的ＤＮＡに組み込まれると、相同組換え修復は標的分子の配列の改変（たとえば、挿入、欠失、突然変異）につながることがある。
【0062】
用語「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）」とは相同の鋳型が不要な場合、断裂末端同士を直接連結することによってＤＮＡにおける二本鎖の断裂を修復することである。ＮＨＥＪは、二本鎖の断裂部位の近くのヌクレオチド配列の欠失につながることが多い。
【0063】
用語「治療」は疾患または症状の発生を防止すること、疾患または症状を抑制すること、あるいは疾患を軽減することを含む。
【0064】
本発明において、用語「個体」、「被験者」、「宿主」および「患者」は入れ替えて使用することができ、診断、治療または療法を行おうとする任意の哺乳動物の被験者、特にヒトを表す。
【0065】
本発明は、ｉ）ｇＲＮＡと相互作用するＲＮＡ－結合部分、ならびに活性部分を含むＣＲＩＳＰＲ編集システムに適用される極小型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼを提供する。
【0066】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、標的遺伝子（たとえば、標的ＤＮＡ）における転写を調節する活性、切断活性（エンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの活性）、遺伝子編集活性などの少なくとも一つの活性を有し、遺伝子編集を実現させるタイプは、遺伝子切断、遺伝子削除、遺伝子挿入、点突然変異、転写抑制、転写活性化および塩基編集などを含むが、これらに限定されない。前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは任意の生物種由来のものであってもよい。
【0067】
非制限的な例示として、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ編集システムのヌクレアーゼとして有用である。
【0068】
本発明において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントが改善された所望の特徴、たとえば、機能、活性、動態学、半減期などを有するように、修飾、突然変異、ＤＮＡ組み換えなどの手段によってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントを形成することもできる。前記修飾は、たとえば、アミノ酸の欠失、挿入または置換であってもよく、さらに、たとえば、異なるヌクレアーゼ由来の相同または異質の切断ドメイン（たとえば、ＣＲＩＳＰＲ－関連ヌクレアーゼのＨＮＨドメイン）でＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの「切断ドメイン」を置き換えることであってもよい。本分野で既知のＤＮＡ結合および／またはＤＮＡ修飾タンパク質の任意の修飾方法、たとえば、メチル化作用、脱メチル作用、アセチル化作用などにより、たとえば、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡ標的性を変えることができる。前記ＤＮＡ組み換えとは、異なる由来のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡ配列の間で配列の断片を交換することで、ＲＮＡ－ガイドのエンドヌクレアーゼ活性を有する合成タンパク質をコードするキメラＤＮＡ配列を生成することである。前記修飾、突然変異、ＤＮＡ組み換えなどは単一で使用しても組み合わせて使用してもよい。
【0069】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＮ末端からＣ末端まで、
配列番号１で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む、ドメイン１、
配列番号２で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくと３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む、ドメイン２、を含む。
配列番号１で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む、ドメイン１、
配列番号２で示されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と少なくと３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む、ドメイン２、を含む。
【0070】
前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは以下のものであってもよい：
（Ｉ）野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有し、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの活性が残っているバリアント、
（ＩＩ）上記（Ｉ）のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントにおいて、構築されたＣ２Ｃ９ＣＲＩＳＰＲシステムが無細胞反応、原核細胞、または真核細胞の環境において適切な活性を有するように、さらに、ほかの構成要素、たとえば、核局在化シグナル断片を含むバリアント、
（ＩＩＩ）野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは上記（Ｉ）および（ＩＩ）のバリアントの相応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント、
（ＩＶ）上記野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれか一つのバリアントで、さらに、以下のものを含むバリアント、
（ａ）顕著に減少したか、検出不能なヌクレアーゼ活性を有するＣ２Ｃ９を生成する、一つまたは複数の修飾または突然変異、ならびに
（ｂ）ほかの機能活性を有するポリペプチドまたはドメイン。
（ＩＶ）（ｂ）における適切なポリペプチドはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそのバリアントのＣ末端ドメインと連結している。
（Ｉ）野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有し、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの活性が残っているバリアント、
（ＩＩ）上記（Ｉ）のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントにおいて、構築されたＣ２Ｃ９ＣＲＩＳＰＲシステムが無細胞反応、原核細胞、または真核細胞の環境において適切な活性を有するように、さらに、ほかの構成要素、たとえば、核局在化シグナル断片を含むバリアント、
（ＩＩＩ）野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは上記（Ｉ）および（ＩＩ）のバリアントの相応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント、
（ＩＶ）上記野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれか一つのバリアントで、さらに、以下のものを含むバリアント、
（ａ）顕著に減少したか、検出不能なヌクレアーゼ活性を有するＣ２Ｃ９を生成する、一つまたは複数の修飾または突然変異、ならびに
（ｂ）ほかの機能活性を有するポリペプチドまたはドメイン。
（ＩＶ）（ｂ）における適切なポリペプチドはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそのバリアントのＣ末端ドメインと連結している。
【0071】
（ＩＶ）におけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは、標的ＤＮＡ配列に二本鎖の断裂を導入することではなく、修飾または突然変異によって任意の塩基を任意の可能なほかの塩基対に転換させることができる。
【0072】
（ＩＶ）におけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは（Ｉ）～（ＩＩＩ）のバリアントと異質配列からなる融合体またはキメラポリペプチドであってもよい。前記異質配列は、光によって誘導される転写調節物、小分子／薬物応答転写調節物、転写因子、転写阻害タンパク質などを含むが、これらに限定されない。融合体またはキメラポリペプチドを形成する場合、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは（Ｉ）～（ＩＩＩ）のバリアントは完全なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のものであってもよい。たとえば、触媒活性のエンドヌクレアーゼドメインを含有するＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはＦｏｋｌドメインと融合し、キメラタンパク質を形成するか、あるいは修飾によってエンドヌクレアーゼドメイン活性を失ったＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはＦｏｋｌドメインと融合し、キメラタンパク質を形成するか、あるいは、エピジェネティック修飾因子、タグ、造影剤、転写調節剤、ヒストン、遺伝子ドメイン活性を調節するほかの構成要素などがＣ２Ｃ９ヌクレアーゼと融合してキメラタンパク質を製造する。ある実施形態において、異質配列は追跡または精製しやすいタグ（たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰのような蛍光タンパク質、Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）を提供してもよい。ある実施形態において、異質配列はＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの細胞内局在化を提供してもよい。
【0073】
ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの修飾様態である。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの修飾様態はＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの天然に存在するヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸の変化を含む。たとえば、ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの修飾様態は５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の相応する野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を有する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの修飾様態は顕著なヌクレアーゼ活性を有さないが、ｇＲＮＡと相互作用する能力が残っている。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの修飾様態はヌクレアーゼ活性を有さない。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性またはＤＮＡに対する結合親和力が大幅に減少または増強しない場合、変わったか消されたＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する突然変異ポリペプチドである。
【0074】
ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９はほかの酵素成分またはほかの成分と合わせて使用することで、さらにＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの様々な潜在的な応用を開発してもよい。（ＩＶ）におけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントの非制限的な例として、たとえば、不活性化したＣ２Ｃ９と塩基デアミナーゼの融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく一塩基編集システムの開発、不活性化したＣ２Ｃ９と逆転写酵素の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくＰｒｉｍｅ編集システム、不活性化したＣ２Ｃ９と転写活性化因子の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく転写活性化システム、不活性化したＣ２Ｃ９と核酸エピジェネティック酵素の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくエピジェネティックシステム、不活性化したＣ２Ｃ９を利用するＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく転写抑制システムである。
【0075】
Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは、以下のような特定の性質を有してもよいが、これらに限定されない：
増強または低下した標的部位と結合する能力を有するか、あるいは標的部位と結合する能力が残っている；
増強または低下したエンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を有するか、あるいはエンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性が残っている；
シトシン、グアニンまたはアデニン塩基に作用可能なデアミナーゼ活性を有し、脱アミノ部位を介して複製し細胞内において修復して、それぞれグアニン、チミンおよびグアニンが生成する；
標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有し、標的ＤＮＡにおける特定の位置の標的ＤＮＡの転写を増加か減少してもよい；
変えられたＤＮＡ標的性を有する；
増加または低下または維持した安定性；
標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、低下した標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力を有する；
標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、低下した標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力を有する；
低下した標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両者を切断する能力を有する；
ＤＮＡに関連するポリペプチド（たとえば、ヒストン）を修飾する酵素活性を有し、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、リボシル化活性などのうちの一つまたは複数（これらの酵素活性によってタンパク質に対する共有結合修飾を触媒する；たとえば、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントはメチル化作用、アセチル化作用、ユビキチン化、リン酸化作用などにより、ヒストンを修飾することにより、ヒストン関連ＤＮＡの構造の変化を引き起こすことで、ＤＮＡの構造と特性を制御する）でもよい。
増強または低下した標的部位と結合する能力を有するか、あるいは標的部位と結合する能力が残っている；
増強または低下したエンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を有するか、あるいはエンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性が残っている；
シトシン、グアニンまたはアデニン塩基に作用可能なデアミナーゼ活性を有し、脱アミノ部位を介して複製し細胞内において修復して、それぞれグアニン、チミンおよびグアニンが生成する；
標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有し、標的ＤＮＡにおける特定の位置の標的ＤＮＡの転写を増加か減少してもよい；
変えられたＤＮＡ標的性を有する；
増加または低下または維持した安定性；
標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、低下した標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力を有する；
標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、低下した標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力を有する；
低下した標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両者を切断する能力を有する；
ＤＮＡに関連するポリペプチド（たとえば、ヒストン）を修飾する酵素活性を有し、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、リボシル化活性などのうちの一つまたは複数（これらの酵素活性によってタンパク質に対する共有結合修飾を触媒する；たとえば、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントはメチル化作用、アセチル化作用、ユビキチン化、リン酸化作用などにより、ヒストンを修飾することにより、ヒストン関連ＤＮＡの構造の変化を引き起こすことで、ＤＮＡの構造と特性を制御する）でもよい。
【0076】
ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは切断活性を有さない。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは一本鎖の切断活性を有する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは二本鎖の切断活性を有する。
【0077】
増強した活性または能力を有するとは、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに対し、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％向上した活性または能力を有することである。
【0078】
低下した活性および能力を有するとは、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに対し、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の活性または能力を有することである。
【0079】
本発明において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは好ましくは配列番号３～１１７などからなる群由来のものである。
【0080】
ある実施形態において、異なるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの様々な酵素学的特性（たとえば、異なるＰＡＭ配列に対する嗜好）を利用するため、異なる種由来のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは異なる応用、たとえば、酵素触媒活性の増加または減少、細胞毒性レベルの増加または減少、ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖断裂、二本鎖断裂などの間のバランスの改変、の提供に有利である。
【0081】
ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ由来のもので、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも約９０％（たとえば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のうちのいずれか）の配列相同性を有するバリアントを含み、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ Ｃ２Ｃ９または「ＡｃＣ２Ｃ９」はＰＡＭ配列ＡＡＮを認識することができる。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のもので（配列番号５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｃ２Ｃ９または「ＣｇＣ２Ｃ９」はＰＡＭ配列ＡＡＮを認識することができる。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＲｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ由来のもので（配列番号２０）、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ Ｃ２Ｃ９または「ＲｄＣ２Ｃ９」はＰＡＭ配列ＡＡＧを認識することができる。ある実施形態において、前記ＲｄＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはＰＡＭ配列ＡＡＡ、ＡＡＴまたはＡＡＣを認識することができる。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ由来のもので（配列番号１２）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ Ｃ２Ｃ９または「ＭｉＣ２Ｃ９」はＰＡＭ配列ＡＡＮを認識することができる。前記ＡＡＮはＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧおよびＡＡＴを含む。
【0082】
異なる種由来のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは同一の種由来の異なるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは標的ＤＮＡにおいて異なるＰＡＭ配列が必要であることがあるため、選択された特定のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに対し、ＰＡＭ配列の要求は前記ＰＡＭ配列と異なることがある。
【0083】
ある実施形態において、これらの小さいＣ２Ｃ９は本発明の下記の任意のシステム、組成物、キットおよび方法に使用してもよい。
【0084】
一つの好適な実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ
ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ由来のもので、ＡｃＣ２Ｃ９で、その配列が配列表における配列番号３で示される。
ｃｒａｎｉｅｌｌａｅ由来のもので、ＡｃＣ２Ｃ９で、その配列が配列表における配列番号３で示される。
【0085】
ある実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは以下のものである：
（Ｉ）配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の配列相同性を有し、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに対して増加、減少または維持した活性を有するバリアント、
（ＩＩ）上記（Ｉ）のＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントで、構築されたＣ２Ｃ９ＣＲＩＳＰＲシステムが無細胞反応、原核細胞、または真核細胞の環境において適切な活性を有するように、さらに、ほかの構成要素、たとえば、核局在化シグナルを含むバリアント、
（ＩＩＩ）配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは上記（Ｉ）および（ＩＩ）のバリアントの相応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント、
（ＩＶ）上記配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれか一項のバリアントで、さらに、以下のものを含むバリアント：
（ａ）顕著に減少したか、検出不能なヌクレアーゼ活性を有するＣ２Ｃ９を生成する、一つまたは複数の修飾または突然変異、ならびに
（ｂ）ほかの機能活性を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも２０％（たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の配列相同性を有し、野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに対して増加、減少または維持した活性を有するバリアント、
（ＩＩ）上記（Ｉ）のＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントで、構築されたＣ２Ｃ９ＣＲＩＳＰＲシステムが無細胞反応、原核細胞、または真核細胞の環境において適切な活性を有するように、さらに、ほかの構成要素、たとえば、核局在化シグナルを含むバリアント、
（ＩＩＩ）配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは上記（Ｉ）および（ＩＩ）のバリアントの相応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント、
（ＩＶ）上記配列番号３の野生型ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれか一項のバリアントで、さらに、以下のものを含むバリアント：
（ａ）顕著に減少したか、検出不能なヌクレアーゼ活性を有するＣ２Ｃ９を生成する、一つまたは複数の修飾または突然変異、ならびに
（ｂ）ほかの機能活性を有するポリペプチド。
【0086】
本発明によって提供されるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはアミノ酸の数が少ない。一つの好適な実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列が配列番号３で示される場合、ＰＡＭ配列ＡＡＮと相互作用する。切断部位は、通常、ＰＡＭ配列の上流の１～３個の塩基対以内に存在する。異なる種由来のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは同一の種由来の異なるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは標的ＤＮＡにおいて異なるＰＡＭ配列が必要であることがあるため、選択された特定のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに対し、ＰＡＭ配列の要求は前記ＰＡＭ配列と異なることがある。Ｃ２Ｃ９はＰＡＭ配列「ＡＡＮ」またはほかの適切な標的ＰＡＭ配列を標的とするように工学的に改変することができる。
【0087】
ある実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（たとえば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有してＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの活性が残っている。
【0088】
別途に説明しない限り、用語「Ｃ２Ｃ９」、「Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼ」は野生型Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそのすべてのバリアントを含み、当業者は通常の手段によってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントのタイプを決定することができるが、上記で挙げられたものに限らない。
【0089】
また、本発明は、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチドを含む核酸を提供する。一つの実施形態において、本発明は、コドンが最適化されたポリヌクレオチド配列であって、一つまたは複数の機能性Ｃ２Ｃ９ドメインをコードするか、あるいは元の天然ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと同様の機能を有するポリペプチドをコードする配列を提供する。そのため、当業者は特定の標的種において本発明に記載のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを使用し、ヌクレオチド配列または組み換え核酸に対してコドンの最適化を行うことができる。天然ヌクレオチド配列の配列番号１２１を１００％未満（たとえば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満）の同一性を有するように、本分野で既知のほかの方法をコドンの最適化に使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、コードされるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの標的細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態におい
て、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは、大腸菌細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは、真菌細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは昆虫細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。
て、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは、大腸菌細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは、真菌細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。ある実施様態において、本発明のポリヌクレオチドは昆虫細胞における発現が増加するようにコドンが最適化されている。
【0090】
一つの実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸は配列表における配列番号１２２で示される。一つの実施形態において、本発明は、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのコドンが最適化されたポリヌクレオチド配列であって、配列番号１２１と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列相同性を有する配列を提供する。一つの好適な実施形態において、前記ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのヒトコドンに応じて最適化されたより好ましいコード配列は配列表における配列番号１２２で示され、一つまたは複数の機能性Ｃ２Ｃ９ドメインをコードするか、あるいは元の天然ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと同様の機能を有するポリペプチドをコードする。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号１２１～１２２と少なくとも約９０％（たとえば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のいずれか）の配列相同性を有する。
【0091】
ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡである。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はＲＮＡである。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸は発現ベクター、たとえば、組み換え発現ベクターである。宿主細胞に適合であれば、任意の適切な発現ベクターを使用してもよく、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスベクター（たとえば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルスから誘導されるベクター、たとえば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルス）などを含むが、これらに限定されない。
【0092】
ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は操作可能に制御エレメント、たとえば、転写制御エレメント、たとえば、プロモーターに連結している。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は操作可能に誘導型プロモーターに連結している。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は操作可能に構成型プロモーターに連結している。転写制御エレメントは真核細胞、たとえば、哺乳動物細胞、あるいは原核細胞（たとえば、細菌や古細菌細胞）において作用を発揮してもよい。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、原核と真核細胞の両者においてＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が発現されるように、複数の制御エレメントに操作可能に連結している。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、操作可能に細胞または体外の環境において発現するための適切な核局在化シグナルに連結している。
【0093】
本発明において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、それに対して多くの修飾を容易に行うことができるように、人工合成の手段によって合成すること、たとえば、化学的方法によって合成することができる。前記修飾は本分野で公知の任意の修飾様態を使用してもよい。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼを
コードするポリヌクレオチド配列は、多くの修飾、たとえば、転写活性の増強、酵素活性の改変、翻訳または安定性（たとえば、タンパク質の加水分解、分解に対する耐性）または特異性の向上、溶解性の改変、送達の改変、宿主細胞における先天性免疫応答の減少を容易に導入することができるように、一つまたは複数の修飾を含む。前記修飾は本分野で公知の任意の修飾様態を使用してもよい。ある実施形態において、修飾によって細胞に導入されるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の一つまたは複数のゲノムの遺伝子座を編集する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸配列は修飾された核酸、たとえば、コドンが最適化されたものである。前記修飾は単一の修飾であってもよく、組み合わせの修飾であってもよい。
コードするポリヌクレオチド配列は、多くの修飾、たとえば、転写活性の増強、酵素活性の改変、翻訳または安定性（たとえば、タンパク質の加水分解、分解に対する耐性）または特異性の向上、溶解性の改変、送達の改変、宿主細胞における先天性免疫応答の減少を容易に導入することができるように、一つまたは複数の修飾を含む。前記修飾は本分野で公知の任意の修飾様態を使用してもよい。ある実施形態において、修飾によって細胞に導入されるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の一つまたは複数のゲノムの遺伝子座を編集する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸配列は修飾された核酸、たとえば、コドンが最適化されたものである。前記修飾は単一の修飾であってもよく、組み合わせの修飾であってもよい。
【0094】
本発明において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は核酸ミメティックでもよい。たとえば、優れたハイブリダイズ性質を有するポリヌクレオチドミメティックのペプチド核酸などが挙げられる。
【0095】
本発明において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼ、またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは任意の生物または体外の環境に適用され、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物または動物を含むが、これらに限定されない。相応的に、適用する標的細胞は、真核細胞および原核細胞、たとえば、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、植物細胞または動物細胞を含むが、これらに限定されない。前記真菌細胞は哺乳動物細胞および植物細胞を含み、前記原核細胞は大腸菌および肺炎クレブシエラ菌を含む。適用する標的細胞は任意のタイプの細胞でもよく、幹細胞、体細胞などを含む。前記細胞は体内におけるものであってもインビトロにおけるものであってもよい。ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは当該Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸はリポソームまたは脂質ナノ粒子の中に調製されている。
【0096】
また、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９遺伝子編集システムの構築における前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼの使用を提供する。
【0097】
また、本発明は体内、インビトロ細胞または体外の環境における適切なＰＡＭ配列であって、ＡＡＮおよび／またはＧＡＮであるＰＡＭ配列を提供する。
【0098】
また、本発明は原核、真核および体外の環境における適切なＰＡＭ配列および適切なガイドを提供する。本発明によって提供されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ヌクレアーゼ、たとえば、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼを標的遺伝子における特定の標的配列にガイドする。
【0099】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡは以下のものを含む：
標的遺伝子における標的配列と相補的なヌクレオチド配列の第一断片（「遺伝子標的配列」または「遺伝子標的断片」とも呼ぶ）、ならびに
Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼと相互作用する第二断片（「タンパク質結合配列」または「タンパク質結合断片」とも呼ぶ）。
標的遺伝子における標的配列と相補的なヌクレオチド配列の第一断片（「遺伝子標的配列」または「遺伝子標的断片」とも呼ぶ）、ならびに
Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼと相互作用する第二断片（「タンパク質結合配列」または「タンパク質結合断片」とも呼ぶ）。
【0100】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡはリピートスペーサーアレイを含み、ここで、前記スペーサーは遺伝子における標的配列と相補的な核酸配列を含む。
【0101】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡは以下のものを含む：
ｉ．標的配列とハイブリダイズ可能な遺伝子標的領域（たとえば、ＤＮＡ－標的領域）、ｉｉ．ｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、
前記ガイドＲＮＡは一本鎖で、前記ＤＮＡ－標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）が順に連結してなるか、あるいは、前記ガイ
ドＲＮＡは二本の鎖を含み、その一方の鎖は前記遺伝子標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）が連結してなり、もう一方の鎖は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）である。
ｉ．標的配列とハイブリダイズ可能な遺伝子標的領域（たとえば、ＤＮＡ－標的領域）、ｉｉ．ｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、
前記ガイドＲＮＡは一本鎖で、前記ＤＮＡ－標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）が順に連結してなるか、あるいは、前記ガイ
ドＲＮＡは二本の鎖を含み、その一方の鎖は前記遺伝子標的領域（ｉ）とｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）が連結してなり、もう一方の鎖は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）である。
【0102】
ここで、前記遺伝子標的領域（ｉ）は、好ましくはＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片に相応するＲＮＡ配列である。
【0103】
ここで、前記ｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）とハイブリダイズし、ステム－ループ構造を形成する。
【0104】
ここで、前記ｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）と一体に連結し、一本のガイドＲＮＡ骨格配列を形成することができる。
【0105】
ここで、標的配列とハイブリダイズする遺伝子標的領域（ｉ）およびｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）が連結したＲＮＡ配列（ｃｒＲＮＡ）と、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）とは、二本の単独のＲＮＡ配列として、同時に存在する場合、Ｃ２Ｃ９エンドヌクレアーゼ活性を媒介することができる。あるいは、ガイドＲＮＡ骨格配列および標的配列とハイブリダイズするＤＮＡ－標的領域（ｉ）が連結して得られる、標的配列に対する完全なガイドＲＮＡ発現構築体は、同様にＣ２Ｃ９エンドヌクレアーゼ活性を媒介することができる。
【0106】
ｇＲＮＡの遺伝子標的領域は、標的遺伝子における配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、当該遺伝子標的領域はハイブリダイズ（すなわち、塩基対合）によって配列特異的に標的遺伝子と相互作用する。たとえば、ｇＲＮＡが標的遺伝子における任意の必要な配列とハイブリダイズするように、遺伝子工学の手段によってｇＲＮＡの遺伝子標的領域を修飾することができる。ｇＲＮＡは上記遺伝子標的配列を介して結合したポリペプチドを標的遺伝子における特定のヌクレオチド配列にガイドする。
【0107】
前記ステム－ループ構造はＣ２Ｃ９ヌクレアーゼと相互作用するタンパク質結合構造を形成する。ある実施形態において、前記ｇＲＮＡのタンパク質結合構造は４つのステム－ループ構造を含み、ｔｒａｃｒメイト配列（ｉｉ）は、通常、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ｉｉｉ）との間で相補的塩基対形成によって対合する。ｇＲＮＡの塩基配列を改造することによってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの活性を向上させるか、非特異的な認識を減少させることができる。
【0108】
ある実施形態において、標的遺伝子はＤＮＡ配列である。ある実施形態において、標的遺伝子はＲＮＡ配列である。
【0109】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。一つの好適な実施形態において、前記ｇＲＮＡの配列は配列番号１２３で示される。
【0110】
ある実施形態において、標的遺伝子の標的配列は１２～４０ヌクレオチドの長さを有してもよく、たとえば、１３～２０、１８～２５、２２～３２、２６～３７、３０～３８、３２～４０ヌクレオチドの長さでもよい。ガイドＲＮＡの標的領域（ｉ）と標的遺伝子の標的配列の間の相補性百分率は少なくとも５０％（たとえば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）であってもよい。
【0111】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡは、さらに、転写ターミネーターを含む。
【0112】
また、本発明は、修飾型ｇＲＮＡであって、修飾によって標的遺伝子における任意の必要な配列とのハイブリダイズを実現させること；あるいは、ｇＲＮＡを修飾することによってｇＲＮＡ自身の特性を改変すること、たとえば、修飾によってｇＲＮＡの安定性を増強することで、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する耐性を増強することを含むが、これらに限定されず、細胞における半減期を延長させること；あるいは、修飾によってｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼ）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ゲノム編集複合体の形成またはその安定性を増強すること；あるいは、修飾によってゲノム編集複合体の特異性を増強すること；あるいは、修飾によってゲノム編集複合体とゲノムにおける標的配列の間の相互作用の開始部位、安定性または動態学を増強すること；あるいは、修飾によって細胞に導入されるＲＮＡによる先天性免疫反応の可能性または程度を低下させることなどができるｇＲＮＡを提供する。本発明において、ｇＲＮＡを修飾することによってＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９システム（下記のように）の多くの特性を改変すること、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ゲノム編集複合体の形成、標的活性、特異性、安定性または動態学の特性を増強することができる。本分野で既知の修飾手段によってＲＮＡを修飾することができ、ピリミジンのリボース、塩基残基またはＲＮＡの３’末端の逆方向の塩基における２’－フルオロ、２’－アミノの修飾などを含むが、これらに限定されない。本発明において、任意の一つの修飾または複数の修飾の組み合わせによってｇＲＮＡを修飾することができる。ある実施形態において、修飾によって細胞に導入されるｓｇＲＮＡは、任意の一つまたは複数のゲノムの遺伝子座を編集する。
【0113】
本発明は、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸は発現ベクター、たとえば、組み換え発現ベクターである。宿主細胞に適合すれば、任意の適切な発現ベクターを使用してもよく、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスベクター（たとえば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルスから誘導されるベクター、たとえば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルス）などを含むが、これらに限定されない。
【0114】
ある実施形態において、同様の細胞において同時に複数のｇＲＮＡを用いて、同時に同様の標的遺伝子または異なる標的遺伝子における異なる位置の転写を調節する。同時に複数のｇＲＮＡを使用する場合、同様の発現ベクターまたは異なる発現ベクターに存在してもよく、同時に発現してもよい。同様のベクターに存在する場合、同様の制御エレメントにおいて発現することができる。
【0115】
ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は操作可能に制御エレメント、たとえば、転写制御エレメント、たとえば、プロモーターに連結している。ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は操作可能に誘導型プロモーターに連結している。ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は操作可能に構成型プロモーターに連結している。転写制御エレメントは真核細胞、たとえば、哺乳動物細胞、あるいは原核細胞（たとえば、細菌や古細菌細胞）において作用を発揮することができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、原核と真核細胞の両者においてｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が発現されるように、複数の制御エレメントに操作可能に連結している。
【0116】
本発明において、前記ｇＲＮＡは、それに対して多くの修飾を容易に行うことができるように、人工合成の手段によって合成すること、たとえば、化学的方法によって合成するこ
とができる。前記修飾は本分野で既知の任意の修飾手段を使用することができ、たとえば、ｐｏｌｙＡテールの使用、５’キャップアナログの付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’または３’末端に含まれるチオリン酸化２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスファターゼ処理による５’末端のホスファートの除去などが挙げられる。
とができる。前記修飾は本分野で既知の任意の修飾手段を使用することができ、たとえば、ｐｏｌｙＡテールの使用、５’キャップアナログの付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’または３’末端に含まれるチオリン酸化２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスファターゼ処理による５’末端のホスファートの除去などが挙げられる。
【0117】
ある実施形態において、前記ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、たとえば、活性、安定性または特異性の増強、送達の改変、宿主細胞における先天性免疫応答の減少またはほかの増強に使用される、一つまたは複数の修飾を含む。
【0118】
ある実施形態において、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の活性、細胞分布または細胞摂取を増強する一つまたは複数の標的部分または結合体をｇＲＮＡに化学的に連結している。前記標的部分または結合体は機能基と共有結合する結合体基を含んでもよく、結合体基はレポーター分子、ポリアミン、ポリエチレングリコールを含む。ある実施形態において、薬効学的性質を増強する基をｇＲＮＡに連結しており、薬効学的性質を増強する基は摂取を改善する基、分解に対する耐性を増強する基および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイズを増強する基を含む。
【0119】
本発明において、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は核酸ミメティックであってもよい。たとえば、優れたハイブリダイズ性質を有するポリヌクレオチドミメティックのペプチド核酸などが挙げられる。
【0120】
本発明において、前記ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは任意の生物または体外の環境に適用され、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物または動物を含むが、これらに限定されない。相応的に、適用する標的細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、植物細胞または動物細胞を含むが、これらに限定されない。適用する標的細胞は任意のタイプの細胞であってもよく、幹細胞、体細胞などを含む。
【0121】
また、本発明は、組み換え発現ベクターであって、（ｉ）ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。一つの実施形態において、標的遺伝子における転写を調節する部位は前記ｇＲＮＡによって決定する。
【0122】
また、本発明は、（ａ）前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたは前述の前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、ならびに／あるいは、（ｂ）前述の一つまたは複数のｇＲＮＡまたは前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９システムを提供する。ここで、前記ｇＲＮＡは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼを標的配列にガイドすることができる。
【0123】
ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼはそのままタンパク質として提供される。たとえば、スフェロプラスト形質転換用外因性タンパク質および／または核酸形質転換真菌の手段を使用してもよい。任意の適切な方法、たとえば、注射の手段などによってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを細胞に導入することができる。
【0124】
本発明に記載のシステムにおいて、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは宿主細胞において複合体を形成し、標的遺伝子（たとえば、標的ＤＮＡ）の配列におけるＰＡＭ配列を認識することができる。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９遺伝子編集システムの標的配列はＰＡＭ配列の後の長さが２０ｂｐの核酸断片（たとえば、ＤＮＡ断片）である。一つの実施形態において、前記複合体は選択的に宿主細胞における標的ＤＮＡの転写を調節することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９遺伝子編集システムは標的ＤＮＡの二本鎖を切断し、ＤＮＡの断裂につながる。標的鎖（ｇＲＮＡと相補的に対合するＤＮＡ一本鎖で、Ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｎｄまたはＴＳ鎖とも呼ばれる）の主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の２１－２２ｎｔの箇所で、一方、非標的鎖（ｇＲＮＡと相補的に対合しないＤＮＡ一本鎖で、Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｎｄまたはＮＴＳ鎖とも呼ばれる）の主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の１５－１６ｎｔの箇所である。
ｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｎｄまたはＴＳ鎖とも呼ばれる）の主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の２１－２２ｎｔの箇所で、一方、非標的鎖（ｇＲＮＡと相補的に対合しないＤＮＡ一本鎖で、Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｎｄまたはＮＴＳ鎖とも呼ばれる）の主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の１５－１６ｎｔの箇所である。
【0125】
一つの実施形態において、前記システムはｇＲＮＡとＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの複合体を含む。
【0126】
一つの実施形態において、前記システムは組み換え発現ベクターを含む。一つの実施形態において、前記システムは組み換え発現ベクターを含み、前記組み換え発現ベクターは、（ｉ）ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ｇＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列と相補的なヌクレオチド配列を含む第一領域、および（ｂ）Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼと相互作用する第二領域を含み、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは、（ａ）前記ｇＲＮＡと相互作用するＲＮＡ－結合部分、および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここで、標的ＤＮＡ内の転写を調節する部位は前記ｇＲＮＡによって決定する。
【0127】
ある実施形態において、前記システムは配列番号３で示されるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを含む（あるいはそれからなる）。ある実施形態において、前記システムはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を含み、前記核酸は配列番号１２１または配列番号１２２と少なくとも約９０％（たとえば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有する。ある実施形態において、前記システムはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を含み、前記核酸は配列番号１２１または配列番号１２２の配列を含む（あるいはそれからなる）。ある実施形態において、前記システムにおけるｇＲＮＡは単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ある実施形態において、前記システムは、さらに、一つまたは複数の別のｇＲＮＡまたは一つまたは複数の別のｇＲＮＡをコードする核酸を含む。
【0128】
ある実施様態において、前記システムは細胞または体外の環境において発現するための適切なプロモーターおよび／または適切な核局在化シグナルを含み、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は（ｉ）細胞または体外の環境において発現するための適切なプロモーター、および／または（ｉｉ）適切な核局在化シグナルに操作可能に連結している。
【0129】
ある実施様態において、前記システムでは、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は（ｉ）細胞または体外の環境において発現するための適切なプロモーター、および／または（ｉｉ）適切な核局在化シグナルに操作可能に連結している。
【0130】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含むＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、ならびに（ｂ）前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列にガイドすることができるｇＲＮＡを含む、システムを提供する。
【0131】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含むＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、あるいは配列番号１２１もしくは配列番号１２２のいずれか一つのポリヌクレオチド配列または配列番号１２１もしくは配列番号１２２のいずれか一つのポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含むＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびに（ｂ）前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列にガイドすることができるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含む、シ
ステムを提供する。ある実施形態において、前記ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
ステムを提供する。ある実施形態において、前記ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
【0132】
本発明に記載のシステムは一つのｇＲＮＡを含んでもよく、あるいは同時に複数のｇＲＮＡを含んでもよい。ある実施形態において、前記システムは同時に複数のｇＲＮＡを含むことで、同時に同様の標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡにおける異なる位置を修飾する。一つの実施形態において、二つまたはそれ以上のガイドＲＮＡは同様の遺伝子または転写体または遺伝子座を標的とする。一つの実施形態において、二つまたはそれ以上のガイドＲＮＡは異なる関連しない遺伝子座を標的とする。ある実施形態において、二つまたはそれ以上のガイドＲＮＡは異なるが関連する遺伝子座を標的とする。
【0133】
本発明に記載のシステムにおける各構成部分はベクターの手段で送達することができる。たとえば、ポリヌクレオチドについて、使用できる方法はナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、小分子ＲＮＡ－結合体、キメラ体およびＲＮＡ－融合タンパク質複合体などを含むが、これらに限定されない。
【0134】
ある実施形態において、前記Ｃ２Ｃ９またはｇＲＮＡはベクターに構築され、Ｃ２Ｃ９および／またはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は制御エレメント、たとえば、転写制御エレメント、たとえば、プロモーターに操作可能に連結していてもよい。転写制御エレメントは真核細胞（たとえば、哺乳動物細胞）あるいは原核細胞（たとえば、細菌や古細菌細胞）において作用を発揮してもよい。ある実施形態において、ｇＲＮＡをおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、二つの原核生物においてガイドＲＮＡおよび／または局在化修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現されるように、複数の制御エレメントに操作可能に連結している。ある実施形態において、ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は同一のベクターに構築されている。ある実施形態において、ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は異なるベクターに構築されている。ある実施形態において、ｇＲＮＡをおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は操作可能に構成型プロモーターに連結している。ある実施形態において、ｇＲＮＡをおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は操作可能に誘導型プロモーターに連結している。
【0135】
本発明に記載のシステムは、さらに、一つまたは複数のドナー鋳型を含んでもよい。ある実施形態において、前記ドナー鋳型は標的遺伝子に挿入するためのドナー配列を含む。ある実施形態において、前記ドナー鋳型はドナーカセットを含み、当該ドナーカセットは片側または両側の横にｇＲＮＡ標的部位がある。ある実施形態において、前記ドナー鋳型のドナーカセットの両側の横にｇＲＮＡ標的部位があり、ここで、当該ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、当該システムにおけるｇＲＮＡのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補配列である。ドナー配列は、通常、それが置き換えるゲノム配列と異なり、すなわち、ドナー配列は、通常、ゲノム配列に対する塩基の改変、挿入、欠失、逆位または転位を含み、かつ相同組換え修復に十分な相同性がある。ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡでもよい。ある実施形態において、前記ドナー配列は外因性配列である。ある実施形態において、前記ドナー配列はドナーＤＮＡ配列（ドナーの一本鎖または二本鎖ＤＮＡを含む）で、ここで、標的ＤＮＡ配列は相同組換え修復によって編集する。ある実施形態において、ドナー鋳型はシステムにおけるｇＲＮＡと物理的に連結している。ある実施形態において、完全なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のもの、あるいはｇＲＮＡがドナー鋳型と連結していることで、一つまたは複数のｇＲＮＡ分子によって一つまたは複数の特定の標的遺伝子（たとえば、標的ＤＮＡ）の部位にガイドすることにより、外因性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進する。
【0136】
本発明に記載のシステムは、さらに、二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼを含み、完全なＣ２Ｃ
９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、あるいはｇＲＮＡが二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼに連結していることで、一つまたは複数のｇＲＮＡ分子によって一つまたは複数の特定のＤＮＡ標的部位にガイドすると、エンドヌクレアーゼによる切断をガイドしてもよい。
９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、あるいはｇＲＮＡが二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼに連結していることで、一つまたは複数のｇＲＮＡ分子によって一つまたは複数の特定のＤＮＡ標的部位にガイドすると、エンドヌクレアーゼによる切断をガイドしてもよい。
【0137】
本発明に記載のシステムは細胞における複数の位置でＤＮＡを編集または修飾することで、遺伝子治療に使用することができ、疾患の遺伝子治療、生物学の研究、農作物の耐性の改良や生産量の向上などを含むが、これらに限定されない。
【0138】
本発明において、前記システムは任意の生物または体外の環境に適用され、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物または動物を含むが、これらに限定されない。相応的に、適用する標的細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、植物細胞または動物細胞を含むが、これらに限定されない。適用する標的細胞は任意のタイプの細胞でもよく、幹細胞、体細胞などを含む。前記細胞は体内におけるものであってもよく、インビトロにおけるものであってもよい。
【0139】
また、本発明は、前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システムのうちの一つまたは複数を含み、さらに、許容される担体、媒体などを含んでもよい、組成物を提供する。前記許容される担体、媒体は、たとえば、無菌水または生理食塩水、安定化剤、賦形剤、抗酸化剤（アスコルビン酸など）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、ほかの有機酸など）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎなど）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、バインダーなどが挙げられる。そして、ほかの低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンやリシンなどのアミノ酸、多糖や単糖などの糖質または炭水化物、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコールを含んでもよい。注射のための水溶液を調製する場合、たとえば、生理食塩水、ブドウ糖やほかの補助薬物、たとえば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムを含有する等張溶液を使用してもよく、適切な可溶化剤、たとえば、アルコール（エタノールなど）、多価アルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧなど）、ノニオン性界面活性剤（ツイン８０、ＨＣＯ－５０）などを併用してもよい。ある実施形態において、組成物はｇＲＮＡと核酸を安定化させる緩衝液を含む。
【0140】
また、本発明は前述のシステムまたは組成物を含むキットを提供する。前記キットは、さらに、希釈緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬などの別の試薬から選ばれる一つまたは複数を含んでもよい。ある実施形態において、前記キットは、（ａ）上記のようなＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびに（ｂ）ｇＲＮＡまたは前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含み、ここで、前記ｇＲＮＡは前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列にガイドすることができる。ある実施形態において、前記キットは、さらに、異質ポリヌクレチオド配列含有ドナー鋳型を含み、ここで、前記異質ポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入されることが可能である。
【0141】
本発明は、前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物およびキットの使用であって、体内、インビトロ細胞または無細胞のシステムにおける以下のいずれか一つを含むが、これらに限定されない用途に用いられる使用を提供する：標的遺伝子を切断する；
標的遺伝子の発現を制御する；
標的遺伝子を遺伝的に修飾する；
標的遺伝子関連ポリペプチドを遺伝的に修飾する；
標的遺伝子の任意の必要な位置における意図的で制御される損傷；
標的遺伝子の任意の必要な位置における意図的で制御される修復；
二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的遺伝子を修飾する（Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは酵素活性を有し、二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的遺伝子を修飾する。前記酵素活性はＣ２Ｃ９自身が有するもの、あるいはたとえば酵素活性を有する異質ポリペプチドをＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに融合させてキメラＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを形成して得られたものであってもよく、前記酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱アミノ作用活性、ディスムターゼ活性、アルキル化活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ＤＮＡ損傷活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性などを含むが、これらに限定されない）。
標的遺伝子の発現を制御する；
標的遺伝子を遺伝的に修飾する；
標的遺伝子関連ポリペプチドを遺伝的に修飾する；
標的遺伝子の任意の必要な位置における意図的で制御される損傷；
標的遺伝子の任意の必要な位置における意図的で制御される修復；
二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的遺伝子を修飾する（Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは酵素活性を有し、二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的遺伝子を修飾する。前記酵素活性はＣ２Ｃ９自身が有するもの、あるいはたとえば酵素活性を有する異質ポリペプチドをＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに融合させてキメラＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを形成して得られたものであってもよく、前記酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱アミノ作用活性、ディスムターゼ活性、アルキル化活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ＤＮＡ損傷活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性などを含むが、これらに限定されない）。
【0142】
ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＤＮＡである。ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＲＮＡである。
【0143】
本発明において、前記Ｃ２Ｃ９はほかの酵素成分またはほかの成分と合わせて使用することで、さらにＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの様々な潜在的な応用を開発してもよい。非制限的な例として、たとえば、不活性化したＣ２Ｃ９と塩基デアミナーゼの融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく一塩基編集システムの開発、不活性化したＣ２Ｃ９と逆転写酵素の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくＰｒｉｍｅ編集システム、不活性化したＣ２Ｃ９と転写活性化因子の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく転写活性化システム、不活性化したしたＣ２Ｃ９と核酸エピジェネティック酵素の融合によるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくエピジェネティックシステム、不活性化したＣ２Ｃ９を利用するＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく転写抑制システムが挙げられる。
【0144】
本発明のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物およびキットは研究の分野、診断の分野、工業の分野（たとえば、微生物工学）、薬物の発見（たとえば、ハイスループットスクリーニング）、標的の確認、画像学の分野および治療の分野などに使用することができる。研究の分野への使用は、たとえば、標的核酸の転写の上方調節によるたとえば、発育、生長、代謝（たとえば、特定の酵素のレベルを制御することによって正確に生合成の経路を制御および調節する）、遺伝子発現などに対する影響を確認することであってもよい。
【0145】
本発明において、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物およびキットなどは任意の生物に適用され、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物または動物を含むが、これらに限定されない。相応的に、適用する標的細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、植物細胞または動物細胞（たとえば、げっ歯類動物細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類動物細胞）を含むが、これらに限定されない。適用する標的細胞は任意のタイプの細胞でもよく、幹細胞、体細胞などを含む。
【0146】
本発明に記載のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、システム、組成物および方法などが真核細胞に適用される場合、たとえば、哺乳動物細胞に使用されてもよい。ある実施形態において、前記細胞はヒト胎児細胞ではないか、ヒト胎児細胞由来のものではない。ある実施形態において、前記細胞はヒト胚胎細胞ではないか、ヒト胚胎細胞由来のものではない。ある実施形態において、本発明はヒト胎児またはヒト胚胎の破壊に関しない。ある実施形態において、前記被験者または個体はヒト胎児または胚胎ではない。
【0147】
本発明に記載のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮ
Ａまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物およびキットなどが原核細胞に適用される場合、たとえば、大腸菌に使用される。ある実施形態において、細菌細胞における遺伝子発現の遮断に使用される。ある実施形態において、適切なｇＲＮＡおよび／または適切なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を標的細胞の染色体に導入し、前記核酸は誘導型プロモーターの制御下において翻訳して発現され、ここで、コードされるｇＲＮＡおよびＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの両者は複合体を形成し、標的ＤＮＡの興味のある位置で切断する。そのため、ある実施形態において、工学的改変の手段により、細菌ゲノムに適切なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸配列および／またはプラスミドにおけるｇＲＮＡが含まれ、誘導型プロモーターの制御下において、ｇＲＮＡおよびＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの発現を誘導することによって任意の標的の遺伝子の発現を制御する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは酵素活性を有し、二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的ＤＮＡを修飾する。前記酵素活性はＣ２Ｃ９自身が有するもの、あるいはたとえば酵素活性を有する異質ポリペプチドをＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに融合させてキメラＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを形成して得られたものでもよく、前記酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱アミノ作用活性、ディスムターゼ活性、アルキル化活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ＤＮＡ損傷活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性などを含むが、これらに限定されない。本発明において、所望の相補核酸配列をｇＲＮＡの遺伝子標的領域（たとえば、ＤＮＡ－標的領域）に入っているように遺伝子工学的改変を行うことによって標的遺伝子における任意の位置の標的遺伝子の遺伝的修飾を制御することができる。本発明において、所望の相補核酸配列をＣ２Ｃ９に入っているように遺伝子工学的改変を行うことによって標的遺伝子における任意の位置の標的核酸の遺伝的修飾を制御することができる。ある実施形態において、細菌の標的ＤＮＡにおける任意の必要な位置のＤＮＡの意図的で制御される損傷に使用される。ある実施形態において、細菌の標的ＤＮＡにおける任意の必要な位置のＤＮＡの配列の特異的で制御される修復に使用される。
Ａまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物およびキットなどが原核細胞に適用される場合、たとえば、大腸菌に使用される。ある実施形態において、細菌細胞における遺伝子発現の遮断に使用される。ある実施形態において、適切なｇＲＮＡおよび／または適切なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を標的細胞の染色体に導入し、前記核酸は誘導型プロモーターの制御下において翻訳して発現され、ここで、コードされるｇＲＮＡおよびＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの両者は複合体を形成し、標的ＤＮＡの興味のある位置で切断する。そのため、ある実施形態において、工学的改変の手段により、細菌ゲノムに適切なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸配列および／またはプラスミドにおけるｇＲＮＡが含まれ、誘導型プロモーターの制御下において、ｇＲＮＡおよびＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの発現を誘導することによって任意の標的の遺伝子の発現を制御する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは酵素活性を有し、二本鎖断裂を導入する以外の手段によって標的ＤＮＡを修飾する。前記酵素活性はＣ２Ｃ９自身が有するもの、あるいはたとえば酵素活性を有する異質ポリペプチドをＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに融合させてキメラＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを形成して得られたものでもよく、前記酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱アミノ作用活性、ディスムターゼ活性、アルキル化活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ＤＮＡ損傷活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性などを含むが、これらに限定されない。本発明において、所望の相補核酸配列をｇＲＮＡの遺伝子標的領域（たとえば、ＤＮＡ－標的領域）に入っているように遺伝子工学的改変を行うことによって標的遺伝子における任意の位置の標的遺伝子の遺伝的修飾を制御することができる。本発明において、所望の相補核酸配列をＣ２Ｃ９に入っているように遺伝子工学的改変を行うことによって標的遺伝子における任意の位置の標的核酸の遺伝的修飾を制御することができる。ある実施形態において、細菌の標的ＤＮＡにおける任意の必要な位置のＤＮＡの意図的で制御される損傷に使用される。ある実施形態において、細菌の標的ＤＮＡにおける任意の必要な位置のＤＮＡの配列の特異的で制御される修復に使用される。
【0148】
また、本発明は、細胞あるいは体内、インビトロ細胞または無細胞システムにおいて標的遺伝子（たとえば、標的ＤＮＡ）をターゲティング、編集、修飾または操作する方法であって、前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物、キットなどを体内、インビトロ細胞または無細胞システムに導入し、標的遺伝子をターゲティング、編集、修飾または操作することを含む方法を提供する。
【0149】
一つの実施形態において、前記方法は以下のことを含む：
（ａ）前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を体内、インビトロ細胞または無細胞システムに導入する；ならびに
（ｂ）前記ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはインサイチュでこのようなｓｇＲＮＡを生成することに適する核酸（たとえば、ＤＮＡ）を導入する；ならびに
（ｃ）細胞または標的遺伝子をＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）たはインサイチュでこのようなｓｇＲＮＡを生成することに適する核酸と接触させることで、前記標的遺伝子に一つまたは複数の切断、切り口または編集を生じさせ、ここで、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは加工または未加工の様態のｇＲＮＡによって前記標的遺伝子にガイドされる。
（ａ）前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸を体内、インビトロ細胞または無細胞システムに導入する；ならびに
（ｂ）前記ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはインサイチュでこのようなｓｇＲＮＡを生成することに適する核酸（たとえば、ＤＮＡ）を導入する；ならびに
（ｃ）細胞または標的遺伝子をＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）たはインサイチュでこのようなｓｇＲＮＡを生成することに適する核酸と接触させることで、前記標的遺伝子に一つまたは複数の切断、切り口または編集を生じさせ、ここで、前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは加工または未加工の様態のｇＲＮＡによって前記標的遺伝子にガイドされる。
【0150】
ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＤＮＡである。ある実施形態において、標的ＤＮＡはＤＮＡ関連タンパク質と結合していない体外の裸のＤＮＡでもよい。ある実施形態において、標的ＤＮＡは体外細胞における染色体ＤＮＡである。ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＲＮＡである。ある実施形態において、標的ＤＮＡを前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含む標的複合体と接触させ、ｇＲＮＡは標的ＤＮＡと
相補的なヌクレオチド配列を含むことで、標的複合体に標的特異性を提供し、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼが部位特異的な活性を提供する。ある実施形態において、標的複合体は標的ＤＮＡを修飾することで、たとえば、ＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化作用、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復などにつながる。ある実施形態において、標的複合体は標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（たとえば、ヒストン、ＤＮＡ－結合タンパク質など）を修飾することで、たとえば、標的ＤＮＡ関連ポリペプチド－ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などにつながる。
相補的なヌクレオチド配列を含むことで、標的複合体に標的特異性を提供し、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼが部位特異的な活性を提供する。ある実施形態において、標的複合体は標的ＤＮＡを修飾することで、たとえば、ＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化作用、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復などにつながる。ある実施形態において、標的複合体は標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（たとえば、ヒストン、ＤＮＡ－結合タンパク質など）を修飾することで、たとえば、標的ＤＮＡ関連ポリペプチド－ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などにつながる。
【0151】
本発明に記載の方法において、体内に使用される場合、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物および／またはドナーポリヌクレオチドをそのまま個体に投与する。
【0152】
本発明に記載の方法において、公知の方法によってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列の核酸を細胞に導入することができる。同様に、公知の方法によってｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入することができる。公知の方法は、ＤＥＡＥ－デキストランを介する形質移入、リポソームを介する形質移入、ウイルスまたはファージ感染、リポフェクション、形質移入、接合、プロトプラスト融合、ポリエチレンイミを介する形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ジーンガン、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、ナノ粒子を介する核酸送達などを含む。たとえば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム形質移入、マイクロインジェクション、リポフェクションなどによってプラスミドを送達する。ウイルスベクターによる送達について、細胞をｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび／またはキメラＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸ならびに／あるいはドナーポリヌクレオチドを含むウイルス粒子と接触させる。
【0153】
ある実施形態において、本発明に記載の方法では、ヌクレアーゼが細胞における標的ＤＮＡを切断することによって二本鎖断裂が生じ、さらに細胞が、通常、以下の手段によって修復する：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復。
【0154】
非相同末端結合において、断裂末端同士をそのまま連結することによって二本鎖断裂を修復する。前記過程において、切断部位で少量の塩基対を挿入または欠失させてもよい。そのため、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡに対する切断は標的ＤＮＡ配列を切断し、細胞を外因性のドナーポリヌクレオチドが提供されていないまま前記配列を修復させることによって標的ＤＮＡ配列から核酸材料を削除することに使用することができる。そのため、前記方法は遺伝子のノックアウトまたは標的ＤＮＡにおける選ばれた遺伝子座への遺伝物質のノックインに使用することができる。
【0155】
相同組換え修復において、切断される標的ＤＮＡ配列と相同性を有するドナーポリヌクレオチドは切断される標的ＤＮＡ配列の鋳型の修復に使用されることで、遺伝情報がドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへ移るようになる。そのため、新たな核酸材料を部位へ挿入／複製することができる。ある実施形態において、標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと接触させる。ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入する。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復による標的ＤＮＡに対する修飾は、たとえば、遺伝子矯正、遺伝子置換、遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、遺伝子破壊、遺伝子突然変異、配列置換などにつながる。
【0156】
ある実施形態において、標的遺伝子を含む細胞は体外のものである。ある実施形態において、標的遺伝子を含む細胞は体内のものである。ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレ
アーゼをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここで、ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは組み換え発現ベクターである。ある実施形態において、前記方法は同様または異なる組み換えベクターによってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび一つまたは複数のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入し、細胞をｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと接触させることで、ベクターを細胞に吸収させる。
アーゼをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここで、ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは組み換え発現ベクターである。ある実施形態において、前記方法は同様または異なる組み換えベクターによってＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび一つまたは複数のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入し、細胞をｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと接触させることで、ベクターを細胞に吸収させる。
【0157】
本発明の上記方法は、細胞における複数の位置のＤＮＡの編集または修飾に使用することもできる。
【0158】
本発明の上記方法は、標的ＤＮＡの転写の調節に使用することもできる。
【0159】
ある実施形態において、本発明によって提供される方法は、完全なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のもの、あるいはｇＲＮＡ部分を二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼに連結することで、一つまたは複数のｃｒＲＮＡ分子によって一つまたは複数の特定のＤＮＡ標的部位にガイドすると、エンドヌクレアーゼによる切断をガイドすることを含む。別のある実施形態において、本発明によって提供される方法は、二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼと連結したＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを細胞に入る二つまたはそれ以上のＲＮＡとしてまたはＤＮＡにコードされる、一つのプロモーターの制御下にあるｇＲＮＡとともに細胞に導入し、各ｇＲＮＡはリピートスペーサーアレーを含み、ここで、前記スペーサーはＤＮＡにおける標的配列と相補的な核酸配列を含み、かつ前記リピート配列はステム－ループ構造を含む。ある実施形態において、本発明で提供される方法は、完全なＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはその一部または完全に欠陥のもの、ｇＲＮＡをドナーの一本鎖または二本鎖ＤＮＡのドナー鋳型に連結することで、一つまたは複数のｇＲＮＡ分子によって一つまたは複数の特定のＤＮＡ標的部位にガイドすることにより、外因性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進する。
【0160】
また、本発明は、標的遺伝子－関連ポリペプチドのための方法であって、標的遺伝子を標的複合体と接触させることを含み、前記標的複合体は前述のＣ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードする核酸、ならびにｇＲＮＡまたはインサイチュでこのようなｓｇＲＮＡを生成することに適する核酸を含む。
【0161】
ある実施形態において、標的遺伝子－関連ポリペプチドはヒストン、ＤＮＡ－結合タンパク質などである。ある実施形態において、標的複合体は標的ＤＮＡ関連ポリペプチドを修飾することで、たとえば、標的ＤＮＡ関連ポリペプチド、たとえば、ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などにつながる。
【0162】
ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＤＮＡである。ある実施形態において、標的ＤＮＡは体外細胞における染色体ＤＮＡである。ある実施形態において、標的ＤＮＡは体内細胞における染色体ＤＮＡなどである。ある実施形態において、前記標的遺伝子は標的ＲＮＡである。ある実施形態において、標的ＤＮＡを前記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含む標的複合体と接触させ、ｇＲＮＡおよびＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは複合体を形成し、ｇＲＮＡは標的ＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列を含むことで、標的複合体に標的特異性を提供し、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼが部位特異的な活性を提供する。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２Ｃ９システムでは、修飾されたポリヌクレオチドを使用し、修飾を細胞におけるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡならびに／あるいはｇＲＮＡに導入することで、任意の一つまたは複数のゲノムの遺伝子座を編集する。
【0163】
また、本発明は、上記Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、システム、組成物で宿主細胞に対して遺伝修飾を行った細胞を提供する。
【0164】
本発明において、ｇＲＮＡおよび／またはＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよび／または組み換え発現ベクターおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効投与量は当業者にとって通常のものである。異なる投与経路および治療される病症の特性によって決定することができる。
【0165】
Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼは出願人が発見したＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムに適する新規なヌクレアーゼで、相応するガイドＲＮＡによってガイドされると正確に標的遺伝子に局在化し、ゲノムＤＮＡの切断を行い、ゲノムＤＮＡの二本鎖断裂を実現させる。Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼのバリアントは、異なる特徴または有利な特徴を有することがある。これらのＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそのバリアントは未曾有のゲノム編集の別の可能性を提供する。Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそのバリアントは、それらを使用するシステムによっては、異なる活性を有することがある。Ｃ２Ｃ９は分子量においてＣａｓ９およびＣａｓ１２ａの半分またはそれ以下しかないにもかかわらず、Ｃ２Ｃ９はＣａｓ９およびＣａｓ１２ａに近いか類似するゲノム切断効率を有し、原核細菌および真核細胞において効率的なゲノム編集を実現させることができるため、生物技術および遺伝子治療などの分野において広い応用の将来性がある。
【0166】
本発明によって提供されるＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは既に報告されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対して有利な特性、たとえば、原核、真核および／または体外の環境におけるより高い活性を示すことができる。ある実施形態において、Ｃ２Ｃ９は以下の一つまたは複数を兼ねる：小さいサイズ、高い編集活性、および短いＰＡＭ配列だけが必要。本発明において、ＲＮＡ－ガイドのヌクレアーゼの小さいサイズとは長さが約８００個アミノ酸以下のヌクレアーゼである。
【0167】
本発明において、前記細菌または原核細菌は大腸菌、肺炎クレブシエラ菌、バクテロイデス・オバツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、アシネトバクター・ルヴォフィイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉｉ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、バクテロイデス・オレイシプレヌス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｌｅｉｃｉｐｌｅｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、バクテロイデス・マシリエンシス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラバクテロイデス・メルダエ（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ）、フソバクテリウム・モルティフェラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ）およびビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）などであってもよい。
【0168】
本発明において、前記真核細胞は是哺乳動物細胞、真菌などの真核生物細胞を含むが、こ
れらに限定されない。前記真菌は酵母、アスペルギルスを含み、たとえば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、 クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ ・メリニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｌｉｎｉｉ）、カンジダ・オレオフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）群、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ）およびアスペルギルス・バージカラー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）などであってもよい。
れらに限定されない。前記真菌は酵母、アスペルギルスを含み、たとえば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、 クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ ・メリニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｌｉｎｉｉ）、カンジダ・オレオフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）群、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ）およびアスペルギルス・バージカラー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）などであってもよい。
【0169】
本発明の実施例において、極小型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２Ｃ９ヌクレアーゼに基づく新規なゲノム編集方法を開示した。本発明において、ガイドＲＮＡのガイドおよび局在化機能により、Ｃ２Ｃ９は正確にゲノムＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡの二本鎖断裂を実現させることができることを示す。宿主細胞自身または外来の修復機構を利用し、当該システムは効率的かつ正確に生細胞においてゲノム編集を実現させることができる。
【実施例】
【0170】
以下、実施例を合わせて本発明の実施形態を明確に、完全に説明するが、もちろん、記載される実施例は本発明を説明するための一部の実施例にすぎず、本発明の範囲に対する限定とされない。実施例において、具体的な条件が記載されていないものは、通常の条件またはメーカーのお薦めの条件で行われた。使用された試薬または装置はメーカーが未記載の場合、市販品として購入できる通常の製品と見なされる。
【0171】
各実施例で使用される生物材料の由来は以下のとおりである：
肺炎クレブシエラ菌ＮＣＴＣ９６３３菌株（米国ＡＴＣＣ社から購入、カタログ番号：１３８８３）；感受性大腸菌ＤＨ５α菌株（Ｊｉｎｇｓｕ Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：ＣＷ０８０８Ｓ）。各実施例で使用されるＬＢ液体培地はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ａ５０７００２－０２５０；ＬＢ固体培地はＳａｎｇｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ａ５０７００３－０２５０；アプラマイシンは米国ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社から購入、カタログ番号：Ｂ１５２１－１Ｇ；カナマイシンは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ｋ１０３０２４－５ｇ。
実施例１：ＡｃＣ２Ｃ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）同定プラスミドｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌおよびｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭの構築
肺炎クレブシエラ菌ＮＣＴＣ９６３３菌株（米国ＡＴＣＣ社から購入、カタログ番号：１３８８３）；感受性大腸菌ＤＨ５α菌株（Ｊｉｎｇｓｕ Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：ＣＷ０８０８Ｓ）。各実施例で使用されるＬＢ液体培地はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ａ５０７００２－０２５０；ＬＢ固体培地はＳａｎｇｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ａ５０７００３－０２５０；アプラマイシンは米国ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社から購入、カタログ番号：Ｂ１５２１－１Ｇ；カナマイシンは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号：Ｋ１０３０２４－５ｇ。
実施例１：ＡｃＣ２Ｃ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）同定プラスミドｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌおよびｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭの構築
【0172】
（１．１）ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドの配列は配列番号１２４で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそれに相応するガイドＲＮＡ発現カセットのＤＮＡ配列（その配列は配列番号１２５である）およびｐ１５ａプラスミドの骨格（その配列は配列番号１２６である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってその二つのＤＮＡ断片をｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドに組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した後、ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを得た。
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそれに相応するガイドＲＮＡ発現カセットのＤＮＡ配列（その配列は配列番号１２５である）およびｐ１５ａプラスミドの骨格（その配列は配列番号１２６である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってその二つのＤＮＡ断片をｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドに組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した後、ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを得た。
【0173】
（１．２）ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭプラスミドの配列は配列番号１２７で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、以下の二つのプライマーを合成された。
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、以下の二つのプライマーを合成された。
【0174】
ＰＡＭｐｒｉｍｅｒＦ：５’－ａｔｃｇＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧ－３’（配列番号１２８）
【0175】
ＰＡＭｐｒｉｍｅｒＲ：５’－ｇｇｃｃＣＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡ－３’（配列番号１２９）
【0176】
上記二つのプライマーをアニーリングし、具体的な反応系は、５μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）、１０μＬＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＦ（１０μＭ）、１０μＬＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＲ（１０μＭ）、２５μＬ ｄｄＨ２Ｏである。９５℃で５ｍｉｎ加熱した後、１～２時間内でゆっくり室温に降温させ、二つの一本鎖プライマーを塩基対合によって二本鎖ＤＮＡを形成させた。その後、ｄｄＨ２Ｏで得られた産物を２０倍希釈した。
【0177】
上記で得られた二本鎖ＤＮＡをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ技術によってｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＣｏｎｔｒｏｌプラスミドのＢｓａＩ部位に挿入し、具体的な反応系は、１μＬ １０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液、１μＬ上記２０倍希釈されたリン酸化二本鎖ＤＮＡ、２０ｆｍｏｌｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド、０．５μＬ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４００ｕｎｉｔｓ／μＬ）、０．５μＬＢｓａＩ－ＨＦ（２０ｕｎｉｔｓ／μＬ）で、最後に全体積が１０μＬになるように適量のｄｄＨ２Ｏを入れた。当該反応で使用された緩衝液および酵素はいずれもＮＥＢ社製である。ＰＣＲ装置において反応を行い、サイクルは、３７℃で２ｍｉｎ；１６℃で５ｍｉｎ、計２５サイクル；さらに８０℃で１５ｍｉｎである。
【0178】
当該１０μＬの反応物で大腸菌の感受性ＤＨ５α菌株を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。形質転換液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培地に生長した形質転換菌株を移して保存し、同時にプラスミドを抽出してＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭプラスミドを得た。
実施例２ ＰＡＭ同定用基質プラスミドｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙの構築
（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭプラスミドを得た。
実施例２ ＰＡＭ同定用基質プラスミドｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙの構築
【0179】
ｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙプラスミドの配列は配列番号１３０で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
商品ｐＵＣ１９プラスミドを鋳型とし、６Ｎランダム配列付きのプライマー６Ｎ－Ｆ（その配列は配列番号１３１）および普通のプライマー６Ｎ－Ｒ（その配列は配列番号１３２）で環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）を行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化処理した後、大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、カルベニシリン含有ＬＢＡプレートに塗布し、塗布器で１０万超の単一クローンをかき取って収集し、混合後、プラスミドを抽出し、ＰＡＭ同定基質プラスミドｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙを得た。
実施例３ ＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定
商品ｐＵＣ１９プラスミドを鋳型とし、６Ｎランダム配列付きのプライマー６Ｎ－Ｆ（その配列は配列番号１３１）および普通のプライマー６Ｎ－Ｒ（その配列は配列番号１３２）で環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）を行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化処理した後、大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、カルベニシリン含有ＬＢＡプレートに塗布し、塗布器で１０万超の単一クローンをかき取って収集し、混合後、プラスミドを抽出し、ＰＡＭ同定基質プラスミドｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙを得た。
実施例３ ＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定
【0180】
実施例１で構築されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドで大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、さらに７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体プレートに塗布した。翌日、単一クローンを取って１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地において培養し、ＯＤ ６００＝０．５になると細菌を収集した後、氷の上で予め冷却された滅菌１０％ｖ／ｖグリセリンで菌体を２回洗浄し、最終的に１ｍＬの滅菌１０％ｖ／ｖグリセリン溶液で細菌を再懸濁させ、ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを持つＤＨ５α感受性細胞を得た。
【0181】
実施例１で構築されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭプラスミドを持つＤＨ５α感受性細胞を製造し、その製造過程は上記ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを持つＤＨ５α感受性細胞の製造過程と同様である。
【0182】
１００ｎｇの実施例２で構築されたｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙプラスミドを取り、エレクトロポレーションによってｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを持つＤＨ５α感受性細胞に導入し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体プレートに塗布した。それぞれ塗布器で１０万超の単一クローンをかき取って収集し、混合後、プラスミドを抽出し、対照ライブラリー（ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ）を得た。
【0183】
１００ｎｇの実施例２で構築されたｐＵＣ１９－６Ｎ－ｌｉｂｒａｒｙプラスミドを取り、エレクトロポレーションによってｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＰＡＭプラスミドを持つＤＨ５α感受性細胞に導入し、ＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭ欠失ライブラリー（ＰＡＭ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ）を製造した。その製造過程は対照ライブラリーの工程と同様である。
【0184】
それぞれｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙおよびＰＡＭ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙを鋳型とし、プライマーＰＡＭ－１Ｆ（その配列は配列番号１３３である）およびＰＡＭ－１Ｒ（その配列は配列番号１３４である）を使用し、第一ラウンドのＰＣＲを行い、電気泳動によって産物を検出し、さらに１μＬの第一ラウンドのＰＣＲ産物を鋳型とし、プライマーＰＡＭ－２Ｆ（その配列は配列番号１３５である）およびＰＡＭ－２Ｒ（その配列は配列番号１３６である）を使用し、第二ラウンドのＰＣＲを行い、電気泳動によって産物を検出した。それぞれＶＡＨＴＳ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズ（Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で産物を精製した。それぞれＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００プラットフォームによってハイスループットシークエンシングを行い、それぞれ１Ｇｂ元のデータを得、６Ｎランダム配列の情報を抽出し、ＰＡＭ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙにおける配列の頻度をｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙにおける配列の頻度と比較し、ｗｅｂｌｏｇｏを構築することで、ＡｃＣ２Ｃ９嗜好のＰＡＭ情報を得た。
【0185】
図１はＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭの同定の流れおよび結果の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９は５’－ＡＡＮタイプのＰＡＭ配列および少量の５’－ＧＡＮ配列（ここで、Ｎは縮重塩基で、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができることが示された。ここで、横座標－１、－２、－３、－４、－５、－６はそれぞれＮＴＳ鎖（非標的鎖）における標的ＤＮＡ領域の配列の５’末端の上流に位置する１、２、３、４、５、６個目のＤＮＡ塩基を表す。その上のアルファベットはＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼのＤＮＡ配列に対する嗜好性を表し、アルファベットが占める比率が高いほど、ＡｃＣ２Ｃ９の当該塩基に対する嗜好性が強いことを示す。
実施例４ ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｉＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定
実施例４ ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｉＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定
【0186】
ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｌｉＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定の工程はＡｃＣ２Ｃ９に類似する。
【0187】
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｌｉＣ２Ｃ９ヌクレアーゼおよびそれに相応するガイドＲＮＡ発現カセットのＤＮＡ配列（その配列は配列番号１３７～１３９である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってそれぞれこの三つのヌクレアーゼＤＮＡ断片をｐ１５ａプラスミド骨格（その配列は配列番号１２６である）とｐ１５ａ－ＣｇＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌ（その配列は配列番号１４０である）、ｐ１５ａ－ＲｄＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌ（その配列は配列番号１４１である）およびｐ１５ａ－ＭｉＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌ（その配列は配列番号１４２である）に組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した。
【0188】
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に以下のプライマーの合成を依頼した。
【0189】
ＣｇＰＡＭｐｒｉｍｅｒＦ：５’－ｔｃｃｃＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧ－３’（配列番号１４３）
【0190】
ＲｄＰＡＭｐｒｉｍｅｒＦ：５’－ｔｔｃｃＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧ－３’（配列番号１４４）
【0191】
ＭｉＰＡＭｐｒｉｍｅｒＦ：５’－ｇｃｃｔＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧ－３’（配列番号１４５）
【0192】
ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｌｉＣ２Ｃ９に相応するプライマーをそれぞれＰＡＭｐｒｉｍｅｒＲ：５’－ｇｇｃｃＣＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡ－３’（配列番号１２９）とをアニーリングし、具体的な反応系は、５μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）、１０μＬ ｐｒｉｍｅｒＦ（１０μＭ）、１０μＬ ｐｒｉｍｅｒＲ（１０μＭ）、２５μＬ ｄｄＨ２Ｏである。９５℃で５ｍｉｎ加熱した後、１～２時間内でゆっくり室温に降温させ、二つの一本鎖プライマーを塩基対合によって二本鎖ＤＮＡを形成させた。その後、ｄｄＨ２Ｏで得られた産物を２０倍希釈した。上記で得られた二本鎖ＤＮＡをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ技術それぞれによってｐ１５ａ－ＣｇＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｐ１５ａ－ＲｄＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌおよびｐ１５ａ－ＭｉＣ２Ｃ９ＣｏｎｔｒｏｌプラスミドのＢｓａＩ部位に挿入し、具体的な反応系は、１μＬ
１０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液、１μＬ上記２０倍希釈されたリン酸化二本鎖ＤＮＡ、２０ｆｍｏｌプラスミド、０．５μＬ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４００ｕｎｉｔ
ｓ／μＬ）、０．５μＢｓａＩ－ＨＦ（２０ｕｎｉｔｓ／μＬ）で、最後に全体積が１０μＬになるように適量のｄｄＨ２Ｏを入れた。当該反応で使用された緩衝液および酵素はいずれもＮＥＢ社製である。ＰＣＲ装置において反応を行い、サイクルは、３７℃で２ｍｉｎ；１６℃で５ｍｉｎ、計２５サイクル；さらに８０℃で１５ｍｉｎである。当該１０μＬの反応物で大腸菌の感受性ＤＨ５α菌株を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。形質転換液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培地に生長した形質転換菌株を移して保存し、同時にプラスミドを抽出してＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐ１５ａ－ＣｇＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４６である）、ｐ１５ａ－ＲｄＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４７である）、およびｐ１５ａ－ＭｉＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４８である）プラスミドを得た。
リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）、１０μＬ ｐｒｉｍｅｒＦ（１０μＭ）、１０μＬ ｐｒｉｍｅｒＲ（１０μＭ）、２５μＬ ｄｄＨ２Ｏである。９５℃で５ｍｉｎ加熱した後、１～２時間内でゆっくり室温に降温させ、二つの一本鎖プライマーを塩基対合によって二本鎖ＤＮＡを形成させた。その後、ｄｄＨ２Ｏで得られた産物を２０倍希釈した。上記で得られた二本鎖ＤＮＡをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ技術それぞれによってｐ１５ａ－ＣｇＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｐ１５ａ－ＲｄＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌおよびｐ１５ａ－ＭｉＣ２Ｃ９ＣｏｎｔｒｏｌプラスミドのＢｓａＩ部位に挿入し、具体的な反応系は、１μＬ
１０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液、１μＬ上記２０倍希釈されたリン酸化二本鎖ＤＮＡ、２０ｆｍｏｌプラスミド、０．５μＬ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４００ｕｎｉｔ
ｓ／μＬ）、０．５μＢｓａＩ－ＨＦ（２０ｕｎｉｔｓ／μＬ）で、最後に全体積が１０μＬになるように適量のｄｄＨ２Ｏを入れた。当該反応で使用された緩衝液および酵素はいずれもＮＥＢ社製である。ＰＣＲ装置において反応を行い、サイクルは、３７℃で２ｍｉｎ；１６℃で５ｍｉｎ、計２５サイクル；さらに８０℃で１５ｍｉｎである。当該１０μＬの反応物で大腸菌の感受性ＤＨ５α菌株を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。形質転換液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培地に生長した形質転換菌株を移して保存し、同時にプラスミドを抽出してＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐ１５ａ－ＣｇＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４６である）、ｐ１５ａ－ＲｄＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４７である）、およびｐ１５ａ－ＭｉＣ２Ｃ９ＰＡＭ（その配列は配列番号１４８である）プラスミドを得た。
【0193】
ＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｉＣ２Ｃ９のＰＡＭ嗜好性を同定した。その操作工程は実施例３におけるＡｃＣ２Ｃ９のＰＡＭ同定工程と完全に同様である。
【0194】
図２はＣｇＣ２Ｃ９、ＲｄＣ２Ｃ９およびＭｉＣ２Ｃ９のＰＡＭの同定結果の図である。結果から、ＣｇＣ２Ｃ９は５’－ＡＡＳタイプのＰＡＭ配列（ここで、Ｓは縮重塩基で、ＣはまたはＧのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができ、ＲｄＣ２Ｃ９（Ｂ）およびＭｉＣ２Ｃ９（Ｃ）は５’－ＡＡＮタイプのＰＡＭ配列（ここで、Ｎは縮重塩基で、Ａ、ＴはまたはＣのいずれか一つの塩基を表す）を効率的に認識することができることが示された。
実施例５ 肺炎クレブシエラ菌ゲノム編集用ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９およびｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドの構築
実施例５ 肺炎クレブシエラ菌ゲノム編集用ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９およびｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドの構築
【0195】
ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドの配列は配列番号１４９で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
実施例１におけるｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを鋳型とし、それぞれＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの遺伝子およびｐ１５ａプラスミド骨格を増幅した。
実施例１におけるｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを鋳型とし、それぞれＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの遺伝子およびｐ１５ａプラスミド骨格を増幅した。
【0196】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの遺伝子を増幅する５’プライマー配列ＡｃＣ２Ｃ９Ｆ：
ｔｃａｔｃｔｇｔｇｃａｔａｔａｇｃｔａｔａｃｔｇａｔｔｔｃｇｔｃａｇａｃｔｃａｃａ（配列番号１５０）
ｔｃａｔｃｔｇｔｇｃａｔａｔａｇｃｔａｔａｃｔｇａｔｔｔｃｇｔｃａｇａｃｔｃａｃａ（配列番号１５０）
【0197】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの遺伝子を増幅する３’プライマー配列ＡＣＣ２Ｃ９Ｒ：
ｃｇｃｃａａｃｃａｇｃｃａＣＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＧ（配列番号１５１）
ｃｇｃｃａａｃｃａｇｃｃａＣＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＧ（配列番号１５１）
【0198】
ｐ１５ａプラスミド骨格を増幅する５’プライマー配列ｐ１５ａＦ：
ＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＡＧＧｔｇｇｃｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔａｃｔｇｔｔ（配列番号１５２）
ＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＡＧＧｔｇｇｃｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔａｃｔｇｔｔ（配列番号１５２）
【0199】
ｐ１５ａプラスミド骨格を増幅する３’プライマー配列ｐ１５ａＲ：
ａｔｃａｇｔａｔａｇｃｔａｔａｔｇｃａｃａｇａｔｇａａａａｃｇｇｔｇｔａａａａａａｇａ（配列番号１５３）
ａｔｃａｇｔａｔａｇｃｔａｔａｔｇｃａｃａｇａｔｇａａａａｃｇｇｔｇｔａａａａａａｇａ（配列番号１５３）
【0200】
Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のＰｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬でそれぞれＡｃＣ２Ｃ９遺伝子断片およびｐ１５ａプラスミド骨格を増幅し、反応系は、２５μＬ ２ｘＰｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１．５μＬ５’プライマー（１０μＭ）、１．５μＬ ３’プライマー（１０μＭ）、０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２０μＬ ｄｄＨ２Ｏである。ＰＣＲ反応系を調製した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、サイクルは、９８℃で２ｍｉｎ；その後９８℃で２０ｓ、５５℃で２０ｓ、７２℃で３ｍｉｎ、計３０サイクル；最後に７２℃で５ｍｉｎである。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製のＳａｎＰｒｅｐカラム式ＰＣＲ産物精製キットでＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。ＰＣＲ産物の精製の具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。
鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２０μＬ ｄｄＨ２Ｏである。ＰＣＲ反応系を調製した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、サイクルは、９８℃で２ｍｉｎ；その後９８℃で２０ｓ、５５℃で２０ｓ、７２℃で３ｍｉｎ、計３０サイクル；最後に７２℃で５ｍｉｎである。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製のＳａｎＰｒｅｐカラム式ＰＣＲ産物精製キットでＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。ＰＣＲ産物の精製の具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。
【0201】
得られたＡｃＣ２Ｃ９遺伝子断片およびｐ１５ａプラスミド骨格をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって一つのプラスミドに組み立てた。具体的な反応系は、５μＬＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ社）、２０ｆｍｏｌ ＡｃＣ２Ｃ９遺伝子断片、２０ｆｍｏｌ ｐ１５ａプラスミド骨格で、全体積が１０μＬになるように適量のｄｄＨ２Ｏを入れた。５０℃で１時間反応させた。１０μＬの反応物で大腸菌の感受性ＤＨ５α菌株を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。形質転換液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培養プレートに生長した形質転換菌株を移して保存し、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製のＳａｎＰｒｅｐカラム式プラスミドＤＮＡミニプレップキットによってプラスミドを抽出して後の実験に供し、プラスミド抽出の具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。同時にプラスミドをＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング確認を行い、最終的にｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを得た。
【0202】
ｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドの配列は配列番号１５４で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに相応するガイドＲＮＡ発現カセットのＤＮＡ配列（その配列は配列番号１５５である）およびｐＳＧＫＰプラスミドの骨格（その配列は配列番号１５６である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってその二つのＤＮＡ断片をｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドに組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した後、ｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを得た。
実施例６ 肺炎クレブシエラ菌ゲノムｄｈａ遺伝子を標的とするｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドの構築
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼに相応するガイドＲＮＡ発現カセットのＤＮＡ配列（その配列は配列番号１５５である）およびｐＳＧＫＰプラスミドの骨格（その配列は配列番号１５６である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってその二つのＤＮＡ断片をｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドに組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した後、ｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを得た。
実施例６ 肺炎クレブシエラ菌ゲノムｄｈａ遺伝子を標的とするｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドの構築
【0203】
ｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドの配列は配列番号１５７で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
まず、肺炎クレブシエラ菌の標的遺伝子に特定のＡＡＧ（本実施例において選ばれたＡｃＣ２Ｃ９が認識するＰＡＭ配列はＡＡＧである）配列の後の２０塩基のＤＮＡ断片（この２０塩基はスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）と呼ばれ、ＡＡＮがそれに含まれていない）を選定した後、当該ｓｐａｃｅｒ配列を実施例１で構築されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドに挿入した。本工程の特徴は、ｓｐａｃｅｒ断片がｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＣｏｎｔｒｏｌプラスミドのＢｓａＩ部位に挿入できるように、当該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端にａｔｃｇを加える必要があることにある。同時に、ｓｐａｃｅｒの逆相補配列を合成し、逆相補配列の５’末端にｇｇｃｃを加える必要がある。たとえば、本実施例で選定されたｄｈａ遺伝子ｓｐａｃｅｒのＤＮＡ配列（配列番号１５８）は、５’－ＴＧＴＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧ－３’で、二つのプライマーの具体的な配列の設計は以下の通りである。
まず、肺炎クレブシエラ菌の標的遺伝子に特定のＡＡＧ（本実施例において選ばれたＡｃＣ２Ｃ９が認識するＰＡＭ配列はＡＡＧである）配列の後の２０塩基のＤＮＡ断片（この２０塩基はスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）と呼ばれ、ＡＡＮがそれに含まれていない）を選定した後、当該ｓｐａｃｅｒ配列を実施例１で構築されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドに挿入した。本工程の特徴は、ｓｐａｃｅｒ断片がｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９ＣｏｎｔｒｏｌプラスミドのＢｓａＩ部位に挿入できるように、当該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端にａｔｃｇを加える必要があることにある。同時に、ｓｐａｃｅｒの逆相補配列を合成し、逆相補配列の５’末端にｇｇｃｃを加える必要がある。たとえば、本実施例で選定されたｄｈａ遺伝子ｓｐａｃｅｒのＤＮＡ配列（配列番号１５８）は、５’－ＴＧＴＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧ－３’で、二つのプライマーの具体的な配列の設計は以下の通りである。
【0204】
ＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＦ（ｄｈａ－ｓｐＦ）：５’－ａｔｃｇＴＧＴＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧ－３’（配列番号１５９）
【0205】
ＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＲ（ｄｈａ－ｓｐＲ）：５’－ｇｇｃｃＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＡ－３’（配列番号１６０）
【0206】
上記二つのプライマーをアニーリングし、具体的な反応系は、５μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）、１０μＬＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＦ（１０μＭ）、１０μＬＰＡＭ ｐｒｉｍｅｒＲ（１０μＭ）、２５μＬ ｄｄＨ２Ｏである。９５℃で５ｍｉｎ加熱した後、１～２時間内でゆっくり室温に降温させ、二つの一本鎖プライマーを塩基対合によって二本鎖ＤＮＡを形成させた。その後、ｄｄＨ２Ｏで得られた産物を２０倍希釈した。
【0207】
上記で得られた二本鎖ＤＮＡをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ技術によって実施例４で構築されたｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドのＢｓａＩ部位に挿入し、具体的な反応系は、１μＬ １０×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液、１μＬ上記２０倍希釈されたリン酸化二本鎖ＤＮＡ、２０ｆｍｏｌ ｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド、０．５μＬ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４００ｕｎｉｔｓ／μＬ）、０．５μＬＢｓａＩ－ＨＦ（２０ｕｎｉｔｓ／μＬ）で、最後に全体積が１０μＬになるように適量のｄｄＨ２Ｏを入れた。当該反応で使用された緩衝液および酵素はいずれもＮＥＢ社製である。ＰＣＲ装置において反応を行い、サイクルは、３７℃で２ｍｉｎ；１６℃で５ｍｉｎ、計２５サイクル；さらに８０℃で１５ｍｉｎである。
【0208】
当該１０μＬの反応物で大腸菌の感受性ＤＨ５α菌株を形質転換させ、７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。形質転換液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培地に生長した形質転換菌株を移して保存し、同時にプラスミドを抽出してＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドを得た。
実施例７ ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド含有肺炎クレブシエラ菌のエレクトロポレーション感受性細胞の製造
（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってシークエンシング検証を行い、最終的にｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドを得た。
実施例７ ｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド含有肺炎クレブシエラ菌のエレクトロポレーション感受性細胞の製造
【0209】
肺炎クレブシエラ菌ＮＣＴＣ９６３３菌株（米国ＡＴＣＣ社から購入、カタログ番号：１３８８３）をＬＢ固体培養プレートに画線し、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。培養プレートに生長した一つの単一クローン集落を取り、３ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃のシェーカーにおいて２５０ｒｐｍの回転数で一晩振とうした。翌日、１ｍＬの菌液を取って１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に接種し、３７℃のシェーカーにおいて続いて振とうした。菌液のＯＤ６００が０．３に達すると、菌液を氷の上に置いて１０分冷却した。４℃の遠心機において８０００ｒｐｍの回転数で５分遠心して菌を回収し、培地上清を捨て、底部の細菌沈殿を２０ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）グリセリン（高圧で滅菌し、氷の上で予め冷却した）で再懸濁させた。同様の回転数で遠心し、上清を捨て、底部の細菌沈殿を再び２０ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）グリセリンで再懸濁させた。同様の回転数でもう一度遠心し、上清を捨てた後、底部の細菌沈殿を１ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）グリセリンで再懸濁させた。得られた細菌のエレクトロポレーション感受性細胞を分けてＥＰチューブに、５０μＬずつ菌液を入れた。分けた菌液をまず液体窒素において快速に冷凍した後、－８０℃の冷蔵庫に入れて保存した。なお、再懸濁時に動作が軽く、ピペットで軽く吹いて混ぜる手段によって細菌を再懸濁させてもよい。
【0210】
１本の新しく製造された肺炎クレブシエラ菌のエレクトロポレーション感受性細胞を取り
、氷の上に５～１０分置いた後、１μｇの実施例４で製造されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを入れた。均一に混合した後、１ｍｍエレクトロポレーションセル （Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に移し、室温でＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ電撃装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）において電撃を行った。電撃のパラメーターは、１８００Ｖ、２００Ω、２５μＦである。電撃後、すぐに１ｍＬのＬＢ液体培地を入れ、均一に混合した後、きれいなＥＰチューブに移し、３７℃のシェーカーにおいて１～２時間振とうした。１００μＬの菌液を取って７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。菌液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。一つの単一クローン集落を取り、３ｍＬの７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ液体培地の中で３７℃のシェーカーにおいて２５０ｒｐｍの回転数で一晩振とうした。翌日、１ｍＬの細菌菌液を取って１００ｍＬの新鮮な７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃のシェーカーにおいて続いて振とうした。菌液のＯＤ６００が０．２に達すると、菌液に１ｍＬの２０％ｗ／ｖのアラビノースを入れ、菌液を続いて２ｈ振とうした後、菌液を氷の上に置いて１０分冷却した。４℃の遠心機において８０００ｒｐｍの回転数で５分遠心して菌を回収し、培地上清を捨て、底部の細菌沈殿を２０ｍＬの１０％ｖ／ｖグリセリン（高圧で滅菌し、氷の上で予め冷却した）で再懸濁させて２回洗浄した。最後に同様の回転数でもう一度遠心し、上清を捨てた後、底部の細菌沈殿を１ｍＬの１０％ｖ／ｖグリセリンで再懸濁させた。得られた細菌のエレクトロポレーション感受性細胞を分けてＥＰチューブに、５０μＬずつ菌液を入れた。分けた菌液をまず液体窒素において快速に冷凍した後、－８０℃の冷蔵庫に入れて保存した。なお、再懸濁時に動作が軽く、ピペットで軽く吹いて混ぜる手段によって細菌を再懸濁させてもよい。
実施例８ ＡｃＣ２Ｃ９システムによる肺炎クレブシエラ菌生細胞の効率的な遺伝子削除の実現
、氷の上に５～１０分置いた後、１μｇの実施例４で製造されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを入れた。均一に混合した後、１ｍｍエレクトロポレーションセル （Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に移し、室温でＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ電撃装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）において電撃を行った。電撃のパラメーターは、１８００Ｖ、２００Ω、２５μＦである。電撃後、すぐに１ｍＬのＬＢ液体培地を入れ、均一に混合した後、きれいなＥＰチューブに移し、３７℃のシェーカーにおいて１～２時間振とうした。１００μＬの菌液を取って７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ固体培養プレートに敷いた。菌液が固体培養プレートに吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。一つの単一クローン集落を取り、３ｍＬの７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ液体培地の中で３７℃のシェーカーにおいて２５０ｒｐｍの回転数で一晩振とうした。翌日、１ｍＬの細菌菌液を取って１００ｍＬの新鮮な７５μｇ／ｍＬアプラマイシン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃のシェーカーにおいて続いて振とうした。菌液のＯＤ６００が０．２に達すると、菌液に１ｍＬの２０％ｗ／ｖのアラビノースを入れ、菌液を続いて２ｈ振とうした後、菌液を氷の上に置いて１０分冷却した。４℃の遠心機において８０００ｒｐｍの回転数で５分遠心して菌を回収し、培地上清を捨て、底部の細菌沈殿を２０ｍＬの１０％ｖ／ｖグリセリン（高圧で滅菌し、氷の上で予め冷却した）で再懸濁させて２回洗浄した。最後に同様の回転数でもう一度遠心し、上清を捨てた後、底部の細菌沈殿を１ｍＬの１０％ｖ／ｖグリセリンで再懸濁させた。得られた細菌のエレクトロポレーション感受性細胞を分けてＥＰチューブに、５０μＬずつ菌液を入れた。分けた菌液をまず液体窒素において快速に冷凍した後、－８０℃の冷蔵庫に入れて保存した。なお、再懸濁時に動作が軽く、ピペットで軽く吹いて混ぜる手段によって細菌を再懸濁させてもよい。
実施例８ ＡｃＣ２Ｃ９システムによる肺炎クレブシエラ菌生細胞の効率的な遺伝子削除の実現
【0211】
１本の実施例６で製造されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド含有肺炎クレブシエラ菌のエレクトロポレーション感受性細胞を取り、氷の上に５～１０分置き、溶けると２００ｎｇの実施例５で製造されたｐＳＧＫＰ－ＡｃＣ２Ｃ９－ｄｈａプラスミドおよび最終濃度が５μＭのｄｈａ遺伝子相同組換え修復鋳型（その配列は配列番号１６１である）を入れ、軽く均一に混合した。ピペットで均一に混合された細菌プラスミド混合物を予め冷却された１ｍｍエレクトロポレーションセル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に移し、氷の上に５ｍｉｎ静置した。エレクトロポレーションセルの外壁の凝結水を拭き取り、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ電撃装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）において電撃を行った。電撃のパラメーターは、１８００Ｖ、２００Ω、２５μＦである。電撃後、すぐに１ｍＬのＬＢ培養液を入れて電撃後の細胞を洗い出し、無菌のＥＰチューブに移し、３７℃のシェーカーにおいて２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの回転数で１ｈ再生培養した。菌液を７５μｇ／ｍＬアプラマイシンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ固体培地に塗布し、菌液が吸収されると、３７℃のインキュベーターにおいて逆さまで一晩培養した。
【0212】
生長した集落を集落ＰＣＲを行って編集の効果を検証した。
【0213】
ｄｈａ遺伝の集落ＰＣＲ検証の５’プライマー：
５’－ＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＡ－３’（配列番号１６２）
５’－ＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＡ－３’（配列番号１６２）
【0214】
ｄｈａ遺伝の集落ＰＣＲ検証の３’プライマー：
５’－ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡ－３’（配列番号１６３）
５’－ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡ－３’（配列番号１６３）
【0215】
図３はＣＲＩＳＰＲ－ＡｃＣ２Ｃ９システムによって肺炎クレブシエラ菌の生細胞において遺伝子ノックアウトを行ったＰＣＲ結果の図である。結果から、選定されたｄｈａ遺伝子はＣＲＩＳＰＲ－ＡｃＣ２Ｃ９システムによって正確にノックアウトされることができたことが示された。
実施例９ ＡｃＣ２Ｃ９タンパク質異質発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９の構築
実施例９ ＡｃＣ２Ｃ９タンパク質異質発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９の構築
【0216】
実施例１におけるｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを鋳型とし、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの遺伝子の配列を増幅し、ＡｃＣ２Ｃ９を発現するｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド（その配列は配列番号１６４）の構築に使用した。
【0217】
ＡｃＣ２Ｃ９遺伝子を増幅する５’プライマー配列ｐＥＴ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｆ（５’プライマー）：
５’－ｔＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１６５）：
５’－ｔＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１６５）：
【0218】
ＡｃＣ２Ｃ９遺伝子を増幅する３’プライマー配列ｐＥＴ－ＡｃＣ２Ｃ９Ｒ（３’プライマー）：
５’－ｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃｔｔａａｇｃＴＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧＴＴＴＣＧ－３’（配列番号１６６）：
５’－ｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃｔｔａａｇｃＴＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧＴＴＴＣＧ－３’（配列番号１６６）：
【0219】
Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のＰｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬でＡｃＣ２Ｃ９遺伝子断片を増幅したが、反応系は、２５μＬ ２ｘＰｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１．５μＬ ５’プライマー（１０μＭ）、１．５μＬ ３’プライマー（１０μＭ）、０．５μｌ実施例４で製造されたｐ１５ａ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミド（１００ｎｇ／μＬ）、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２０μＬ ｄｄＨ２Ｏである。ＰＣＲ反応系を調製した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ったが、サイクルは、９８℃で２ｍｉｎ；その後９８℃で２０ｓ、５５℃で２０ｓ、７２℃で１ｍｉｎ、計３０サイクル；最後に７２℃で５ｍｉｎである。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製のＳａｎＰｒｅｐカラム式ＰＣＲ産物精製キットでＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。ＰＣＲ産物の精製の具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。
【0220】
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．で、ｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏプラスミド骨格（その配列は配列番号１６７）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってその二つのＡｃＣ２Ｃ９遺伝子断片をｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏプラスミド骨格とｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドに組み立てた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した後、ｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドを得た。
実施例１０ ＡｃＣ２Ｃ９による効率的な体外二本鎖ＤＮＡ切断の実現
実施例１０ ＡｃＣ２Ｃ９による効率的な体外二本鎖ＤＮＡ切断の実現
【0221】
切断基質の製造。肺炎クレブシエラ菌のゲノムを鋳型とし、５’ＦＡＭ標識のプライマーで切断基質を増幅した。切断基質を増幅する５’プライマーの配列は５’－ＣＣＧＣＡＴＡＴＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＡＡ－３’（配列番号１６８）で、切断基質を増幅する３’プライマーの配列は５’－ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＡ－３’（配列番号１６９）である。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製のＳａｎＰｒｅｐカラム式ＰＣＲ産物精製キットでＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
【0222】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの製造。実施例８で構築されたｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡｃＣ２Ｃ９プラスミドで大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。翌日、形質転換体を１ＬのＬＢ培地に接種し、３７℃の条件において振とう培養を行った。ＯＤ６０
０が０．６に達すると、培養液に０．５ｍＬの１Ｍ ＩＰＴＧを入れ、温度を１６℃に降温させて続いて一晩培養した。一晩培養された菌株を収集し、超音波で破砕した後、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ－ＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーカラムによって精製した。その後、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ
分子篩（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。精製後のタンパク質を限外ろ過チューブで濃縮した後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの緩衝液において保存した。
０が０．６に達すると、培養液に０．５ｍＬの１Ｍ ＩＰＴＧを入れ、温度を１６℃に降温させて続いて一晩培養した。一晩培養された菌株を収集し、超音波で破砕した後、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ－ＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーカラムによって精製した。その後、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ
分子篩（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。精製後のタンパク質を限外ろ過チューブで濃縮した後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの緩衝液において保存した。
【0223】
切断基質を標的とする完全なガイドＲＮＡ（その配列は配列番号１７０である）の製造。完全なガイドＲＮＡの製造は体外転写によって実現させた。その転写鋳型ＤＮＡはＧｅｎｅｗｉｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって合成され、その配列が配列番号１７１である。完全なガイドＲＮＡは上記鋳型でＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社）によって転写してなる。具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。製造後の完全なガイドＲＮＡはフェノール／クロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈殿で精製した。
【0224】
体外切断実験は１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの条件において行われた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９および２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応時間はそれぞれ０分、１分、２分、５分、１５分および３０分で、反応温度は３７℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。
【0225】
図４はＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって基質ＤＮＡを切断した結果の図である。結果から、基質ＤＮＡはＡｃＣ２Ｃ９によって正確に二つのＤＮＡ断片に切断されたことが示された。
実施例１１ ＡｃＣ２Ｃ９の最適な反応条件の検出
実施例１１ ＡｃＣ２Ｃ９の最適な反応条件の検出
【0226】
ＡｃＣ２Ｃ９の最適な反応条件を検出するために、本発明は体外切断実験を利用して異なる反応条件においてＡｃＣ２Ｃ９の活性を検出した。
【0227】
切断基質。実施例１０に記載の通りである。
【0228】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの製造。実施例１０に記載の通りである。
【0229】
切断基質を標的とする完全なガイドＲＮＡ。実施例１０に記載の通りである。
（１）温度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
（１）温度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
【0230】
体外切断実験は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの条件において行われた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９および２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応時間はそれぞれ０分、５分、１０分、２０分、４０分および６０分で、反応温度はそれぞれ３０℃、３４℃、３７℃、４０℃、４３℃、４６℃および５０℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。切断のバンドの量と全ＤＮＡ基質量の比率からＡｃＣ２Ｃ９の切断効率を決定した。
（２）ＮａＣｌ濃度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
（２）ＮａＣｌ濃度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
【0231】
体外切断実験の反応緩衝液は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴで、それぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを入れた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９および２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応時間はそれぞれ０分、５分、１０分、２０分、４０分および６０分で、反応温度は３７℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。切断のバンドの量と全ＤＮＡ基質量の比率からＡｃＣ２Ｃ９の切断効率を決定した。
（３）ＭｇＣｌ２濃度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
（３）ＭｇＣｌ２濃度によるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
【0232】
体外切断実験の反応緩衝液は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴで、それぞれ０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を入れた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９および２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応時間はそれぞれ０分、５分、１０分、２０分、４０分および６０分で、反応温度は３７℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。切断のバンドの量と全ＤＮＡ基質量の比率からＡｃＣ２Ｃ９の切断効率を決定した。
（４）異なる２価イオンによるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
（４）異なる２価イオンによるＡｃＣ２Ｃ９活性に対する影響
【0233】
体外切断実験の反応緩衝液は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴで、それぞれ１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２およびＮｉＣｌ２を入れた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９および２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応時間はそれぞれ０分、５分、１０分、２０分、４０分および６０分で、反応温度は３７℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。切断のバンドの量と全ＤＮＡ基質量の比率からＡｃＣ２Ｃ９の切断効率を決定した。
【0234】
図５はＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの異なる温度（Ａ）、異なるＮａＣｌ濃度（Ｂ）、異なるＭｇＣｌ２濃度（Ｃ）および異なる２価イオン（Ｄ）の条件における反応活性の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９は４０℃、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の条件において活性が最も高いことが示された。４０分反応した場合、ＡｃＣ２Ｃ９は４０℃における切断効率が９８．８％に、１００ｍＭ ＮａＣｌにおける切断効率が９８．７％に、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２における切断効率が９８．９％に達した。
実施例１２ 完全なガイドＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡに分けた後の活性の検出
実施例１２ 完全なガイドＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡに分けた後の活性の検出
【0235】
切断基質を標的とする完全なガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ（標的配列とハイブリダイズするＤＮＡ－標的領域とｔｒａｃｒメイト配列が連結してなるＲＮＡ配列）を含む。完全なガイドＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡに分けた後の生物活性の有無を検証するために、本発明は体外二本鎖ＤＮＡ切断実験を行った。
【0236】
基質を切断した。実施例１０に記載の通りである。
【0237】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼを製造した。実施例１０に記載の通りである。
【0238】
ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１７２）の製造。ｔｒａｃｒＲＮＡの製造は体外転写によって実現させ、その転写鋳型ＤＮＡはＧｅｎｅｗｉｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって合成され、その配列が配列番号１７３である。ｔｒａｃｒＲＮＡは上記鋳型でＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社）によって転写してなる。具体的な工程はキットのマニュアルに従って行われた。製造後のｔｒａｃｒＲＮＡはフェノール／クロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈殿で精製した。
【0239】
ｃｒＲＮＡ（配列番号１７４）の製造。ｃｒＲＮＡの製造は体外転写によって実現させ、その転写鋳型ＤＮＡはＧｅｎｅｗｉｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって合成され、その配列が配列番号１７５である。ｃｒＲＮＡの転写および精製の工程はｔｒａｃｒＲＮＡと同様である。
【0240】
体外切断実験は１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの条件において行われた。反応系の全体積は２０μＬで、それに３０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９、２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２μＭ ｃｒＲＮＡが含まれている。反応時間は３０分で、反応温度は３７℃であった。反応終了後、５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎＫを入れて反応を停止させた。反応物を６％ｗ／ｖのＴＢＥアクリルアミドゲルによって分離し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＧＥＬＤＯＣゲルイメージング装置において４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの条件において、基質ＤＮＡは同様に正確に二つのＤＮＡ断片に切断されたことがわかり、完全なガイドＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡに分けた後も同様に生物活性を有することが示された。
【0241】
図６（Ａ）はＡｃＣ２Ｃ９の完全なガイドＲＮＡの配列の概略図で、（Ｂ）はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの条件において、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって基質ＤＮＡを切断した結果の図である。
実施例１３ ＡｃＣ２Ｃ９の二本鎖ＤＮＡを切断する切口部位の同定
実施例１３ ＡｃＣ２Ｃ９の二本鎖ＤＮＡを切断する切口部位の同定
【0242】
短い蛍光標識合成ＤＮＡを標的とする完全なガイドＲＮＡの製造。実施例９に記載の通りである。
【0243】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼの製造。実施例９に記載の通りである。
【0244】
切断基質の製造。切断基質は４種の５８ｂｐの蛍光標識合成ＤＮＡ配列である。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって二つの塩基対相補のプライマーを合成され、その配列はそれぞれ５’－ＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＧＡＡＧ－３’（配列番号１７６）および５’－ＣＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡ ＣＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣ－３’（配列番号１７７）である。それぞれ二つのプライマーの５’末端または３’末端にＦＡＭ蛍光基で標識した。
【0245】
体外切断実験は１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴの条件において行われた。反応系の全体積は１０μ
Ｌで、それに２０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９、２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応温度は３７℃であった。反応時間は３０分であった。反応終了後、１０μＬ ２×カルボキサミド仕込み緩衝液（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を入れて反応を停止させた。反応物を２０％のＴＢＥ－Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥによって分離し、４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。
Ｌで、それに２０ｎＭ切断基質、２μＭ ＡｃＣ２Ｃ９、２μＭ完全なガイドＲＮＡが含まれている。反応温度は３７℃であった。反応時間は３０分であった。反応終了後、１０μＬ ２×カルボキサミド仕込み緩衝液（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を入れて反応を停止させた。反応物を２０％のＴＢＥ－Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥによって分離し、４８８ｎｍの青色光で励起して画像を得た。
【0246】
図７はＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼによって４種類の５８ｂｐの蛍光標識ＤＮＡ基質を切断した結果の図である。結果から、ＡｃＣ２Ｃ９の標的鎖における主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の２１－２２ｎｔの箇所で、非標的鎖における主な切断部位はＰＡＭ部位の３’末端の下流の１５－１６ｎｔの箇所であることが示された。
実施例１４ ＡｃＣ２Ｃ９の哺乳動物細胞遺伝子編集プラスミドｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓの構築
実施例１４ ＡｃＣ２Ｃ９の哺乳動物細胞遺伝子編集プラスミドｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓの構築
【0247】
本実施例に記載のＡｃＣ２Ｃ９は好適なヒトコドンに応じて最適化されたＡｃＣ２Ｃ９コード遺伝子を使用した。
【0248】
ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドの配列は配列番号１７８で、その具体的な構築方法は以下の通りである：
ヒト由来一過性発現プラスミド骨格（その配列は配列番号１７９である）、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット配列（その配列は配列番号１８０である）、ヒトコドンに応じて最適化されたＡｃＣ２Ｃ９コード遺伝子発現カセット配列（その配列は配列番号１８１である）およびヒト細胞におけるＡｃＣ２Ｃ９に相応するガイドＲＮＡ（配列番号１２３）発現カセット（その配列は配列番号１８２である）はいずれもＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって合成され、四つの断片はＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドに組み立てられた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、カルベニシリン含有ＬＢＡプレートに塗布し、単一クローンを取って増幅培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによって同定した後、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドを得た。
実施例１５ ＡｃＣ２Ｃ９によるヒト生細胞における効率的な遺伝子編集の実現
ヒト由来一過性発現プラスミド骨格（その配列は配列番号１７９である）、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット配列（その配列は配列番号１８０である）、ヒトコドンに応じて最適化されたＡｃＣ２Ｃ９コード遺伝子発現カセット配列（その配列は配列番号１８１である）およびヒト細胞におけるＡｃＣ２Ｃ９に相応するガイドＲＮＡ（配列番号１２３）発現カセット（その配列は配列番号１８２である）はいずれもＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって合成され、四つの断片はＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドに組み立てられた。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、カルベニシリン含有ＬＢＡプレートに塗布し、単一クローンを取って増幅培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによって同定した後、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドを得た。
実施例１５ ＡｃＣ２Ｃ９によるヒト生細胞における効率的な遺伝子編集の実現
【0249】
ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼでヒト生細胞における効率的な遺伝子編集を実現させることができた。ヒト胚胎腎臓細胞ＨＥＫ２９３を鋳型としてその遺伝子編集の効果を示す。
【0250】
ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドに標的ｓｐａｃｅｒ配列を挿入した。本実施例において、ヒトゲノムにおけるＶＥＧＦＡ、ＥＭＸ１、ＨＥＸＡ、ＤＮＭＴ１およびＦＡＮＣＦという計５つの遺伝子を標的配列として選び、それぞれこれらの標的配列に１つの２０ｂｐの標的配列ＤＮＡを選んだ。それぞれオリゴヌクレオチド配列Ｇｕｉｄｅ１－Ｆ、Ｇｕｉｄｅ１－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ２－Ｆ、Ｇｕｉｄｅ２－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ３－Ｆ、Ｇｕｉｄｅ３－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ４－Ｆ、Ｇｕｉｄｅ４－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ５－ＦおよびＧｕｉｄｅ５－Ｒ（配列はそれぞれ配列番号１８３～１９２である）を合成した。それぞれＧｕｉｄｅ１－ＦとＧｕｉｄｅ１－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ２－ＦとＧｕｉｄｅ２－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ３－ＦとＧｕｉｄｅ３－Ｒ、Ｇｕｉｄｅ４－ＦとＧｕｉｄｅ４－Ｒ、およびＧｕｉｄｅ５－ＦとＧｕｉｄｅ５－Ｒをアニーリングした後、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってこの５つの標的配列ＤＮＡをそれぞれｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドに挿入し、それぞれｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ１、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ２、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ３、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ４およびｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ５プラスミド（配列はそれぞれ配列番号１９３～１９７である）に構築した。
【0251】
一過性発現プラスミドが媒介するヒト細胞遺伝子編集。凍結保存されたＨＥＫ２９３細胞を再生させた。２日後、ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに継代し、各ウェルの細
胞数は約１．５×１０５個であった。１６～１８時間後、０．７５μＬのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でそれぞれ５００ｎｇｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ１、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ２、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ３、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ４およびｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ５プラスミドを細胞に形質移入した。続いて７２時間培養した。付着細胞を消化し、ゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝子に相応する増幅プライマー（Ｇｕｉｄｅ１－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ１－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ２－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ２－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ３－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ３－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ４－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ４－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ５－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ５－ＩｎｄｅｌＲ、その配列はそれぞれ配列番号１９８～２０７である）でＰＣＲによって遺伝子断片を増幅した。ゲルからＰＣＲ産物を回収した。ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ社）でＰＣＲ産物をアニーリングした。その後、Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １（ＮＥＢ社）を入れ、３７℃で１５ｍｉｎ酵素切断した。５０ｍＭ ＥＤＴＡを入れて反応を停止させた後、反応物を６％のＴＢＥ－ＰＡＧＥによって分離し、４Ｓ Ｒｅｄ ｄｙｅ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で染色して画像を得た。
胞数は約１．５×１０５個であった。１６～１８時間後、０．７５μＬのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でそれぞれ５００ｎｇｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ１、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ２、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ３、ｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ４およびｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓ－ｇｕｉｄｅ５プラスミドを細胞に形質移入した。続いて７２時間培養した。付着細胞を消化し、ゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝子に相応する増幅プライマー（Ｇｕｉｄｅ１－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ１－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ２－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ２－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ３－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ３－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ４－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ４－ＩｎｄｅｌＲ、Ｇｕｉｄｅ５－ＩｎｄｅｌＦとＧｕｉｄｅ５－ＩｎｄｅｌＲ、その配列はそれぞれ配列番号１９８～２０７である）でＰＣＲによって遺伝子断片を増幅した。ゲルからＰＣＲ産物を回収した。ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ社）でＰＣＲ産物をアニーリングした。その後、Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １（ＮＥＢ社）を入れ、３７℃で１５ｍｉｎ酵素切断した。５０ｍＭ ＥＤＴＡを入れて反応を停止させた後、反応物を６％のＴＢＥ－ＰＡＧＥによって分離し、４Ｓ Ｒｅｄ ｄｙｅ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で染色して画像を得た。
【0252】
図８はＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドが媒介するヒト細胞における遺伝子編集の結果の図である。（Ａ）はＩｎｄｅｌ実験のＴＢＥ－ＰＡＧＥゲルの図である。選ばれた５つの異なる遺伝子部位のうち、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼはＶＥＧＦＡ、ＨＥＸＡおよびＤＮＭＴ１遺伝子に対する効率的な遺伝子編集の実現に成功した。（Ｂ）はＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドが媒介するヒト細胞においてＶＥＧＦＡ遺伝子の編集後のハイスループットシーケンシングの統計結果の図である。図に示すように、ＡｃＣ２Ｃ９ヌクレアーゼは正確に標的配列に挿入または欠失の突然変異を導入することができた。
実施例１６ ＡｃＣ２Ｃ９のヒト生細胞における複数の部位の編集効率の検出
実施例１６ ＡｃＣ２Ｃ９のヒト生細胞における複数の部位の編集効率の検出
【0253】
ＡｃＣ２Ｃ９の異なる遺伝子部位における普遍性を検証するために、ヒトゲノムにおけるＶＥＧＦＡ、ＡＡＶＳ１、ＰＤＣＤ１、ＨＥＸＡ、ＥＭＸ１、ＴＰ５３、ＤＮＭＴ１およびＦＡＮＣＥ遺伝子の標的配列に、続いて４７の標的部位を選んだ。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって配列Ｇｕｉｄｅ６－Ｆ-Ｇｕｉｄｅ５２－Ｆ（配列はそれぞれ配列番号２０８～２５４である）およびＧｕｉｄｅ６－Ｒ-Ｇｕｉｄｅ５２－Ｒ（配列はそれぞれ配列番号２５５～３０１である）が合成さた。
【0254】
実施例１５と同様の工程に従い、相応するプライマーをアニーリングした後、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってこの４７の標的配列のＤＮＡをそれぞれｐＡｃＣ２Ｃ９Ｈｓプラスミドに挿入し、構築に成功したプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってそれぞれＨＥＫ２９３細胞に形質移入して遺伝子編集を行った。編集後の細胞を収集してゲノムを抽出し、編集部位を増幅した後、産物をＪｉａｎｇｘｉ ＨａｐｌｏＸ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ.に送ってハイスループットシークエンシングを行い、細胞編集効率を検出した。
【0255】
図９はＡｃＣ２Ｃ９一過性発現プラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の４７箇所の部位における遺伝子編集の効率の図で、遺伝子編集効率が最も高かった部位は部位１５で、効率が７３．７％に達した。
実施例１７ アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が媒介するＡｃＣ２Ｃ９のヒト生細胞における遺伝子編集
実施例１７ アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が媒介するＡｃＣ２Ｃ９のヒト生細胞における遺伝子編集
【0256】
Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によってＡＡＶ２プラスミド骨格（その配列は配列番号３０２である）およびそれぞれＶＥＧＦＡ、
ＡＡＶＳ１、ＰＤＣＤ１遺伝子を標的とするＡｃＣ２Ｃ９発現カセット（その配列はそれぞれ配列番号３０３～３０５である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってＡＡＶ２プラスミド骨格を三つのＡｃＣ２Ｃ９発現カセットと組み立て、ＡＡＶ２－ＡｃＶＥＧＦＡ（その配列は配列番号３０６である）、ＡＡＶ－ＡｃＡＡＶＳ１（その配列は配列番号３０７である）およびＡＡＶ２－ＡｃＰＤＣＤ１（その配列は配列番号３０８である）を得た。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した。
ＡＡＶＳ１、ＰＤＣＤ１遺伝子を標的とするＡｃＣ２Ｃ９発現カセット（その配列はそれぞれ配列番号３０３～３０５である）を全遺伝子合成された。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ技術によってＡＡＶ２プラスミド骨格を三つのＡｃＣ２Ｃ９発現カセットと組み立て、ＡＡＶ２－ＡｃＶＥＧＦＡ（その配列は配列番号３０６である）、ＡＡＶ－ＡｃＡＡＶＳ１（その配列は配列番号３０７である）およびＡＡＶ２－ＡｃＰＤＣＤ１（その配列は配列番号３０８である）を得た。大腸菌ＤＨ５α商品の感受性細胞を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ培地プレートに塗布してスクリーニングした。単一のクローンを取って拡大培養し、プラスミドを抽出し、シークエンシングによってプラスミドの配列を同定した。
【0257】
構築して得られたプラスミドをＧｕａｎｇｚｈｏｕ Ｐａｃｋｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に送ってＡＡＶ生産を行い、それぞれ三つの部位を標的とするＡｃＣ２Ｃ９システムを含有するＡＡＶを得た。凍結保存されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＬＥＡ、Ｕ－２ＯＳ、Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ細胞を再生させた。ヒト細胞を２４ウェルプレートに継代し、各ウェルの細胞数は約０．５×１０５個であった。２４時間後、各ウェルに０．５×１０１０コピー数のＡＡＶを入れて形質移入した。続いて７２時間培養した後、付着細胞を消化し、ゲノムＤＮＡを抽出した。編集部位を増幅した後、産物をＪｉａｎｇｘｉ ＨａｐｌｏＸ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ.に送ってハイスループットシークエンシングを行い、細胞編集効率を検出した。
【0258】
図１０はＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＬＥＡ、Ｕ－２ＯＳ、Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ細胞における３つの異なる遺伝子部位（ＶＥＧＦＡ、ＡＡＶＳ１、ＰＤＣＤ１）の編集効率の図である。ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率がそれぞれ１８．２％、３９．４％、１３．５％で、ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞ＨＬＥＡ細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率がそれぞれ８．４％、２２．１％、１２．２％で、ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞Ｕ－２ＯＳ細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率がそれぞれ１１．８％、２９．２％、２９．８％で、ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞Ｈｕｈ－７細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率がそれぞれ５．１％、１１．９％、５．６％で、ＡｃＣ２Ｃ９システムを発現するＡＡＶのヒト細胞ＨｅｐＧ細胞における３つの異なる遺伝子部位の編集効率がそれぞれ３．９％、７．４％、６．０％であった。
【0259】
以上の実施例は本発明の技術的解決策を説明するためのものに過ぎず、それを制限するものではない。好適な実施例を参照して本発明を詳しく説明したが、当業者には、本発明の具体的な実施形態を変更するか、一部の技術的特徴に対して同等の入れ替えを行うことできることがわかる。発明の構想の趣旨および範囲を超えない限り、当業者が想到できる変化および利点はいずれも本発明で保護を要求される技術的解決策の範囲に入っている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図】
【図5】
【図】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】