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▶ ハンチョウ リプロジェニックス バイオサイエンス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-19
(54)【発明の名称】多能性幹細胞から機能的膵島を生成する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20241112BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20241112BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241112BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241112BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12N5/10
C12N5/02
A61K35/39
A61P3/10
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532849
(86)(22)【出願日】2021-11-30
(85)【翻訳文提出日】2024-07-30
(86)【国際出願番号】 CN2021134632
(87)【国際公開番号】W WO2023097513
(87)【国際公開日】2023-06-08
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524206429
【氏名又は名称】ハンチョウ リプロジェニックス バイオサイエンス，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＧＺＨＯＵ ＲＥＰＲＯＧＥＮＩＸ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｆ，Ｂｉｄ．Ｄ Ｂｅｔｔａ Ｄｒｅａｍ Ｗｏｒｋｓ １８８ Ｌｉａｎｃｈｕａｎｇ Ｓｔｒ．，Ｙｕｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１１１００，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100112656
【弁理士】
【氏名又は名称】宮田 英毅
(74)【代理人】
【識別番号】100089118
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 宏明
(72)【発明者】
【氏名】デン，ホンクイ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ，ユエンユエン
(72)【発明者】
【氏名】リアン，ジェン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，シャオフェン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BB04
4B065BD25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB51
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZC35
(57)【要約】
本開示は、機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、ＩＳＸ９またはＩＳＸ９とＷｎｔ－Ｃ５９との組み合わせを補充した培地を使用することによって、膵臓前駆細胞から膵臓内分泌前駆細胞を生成する工程を含む方法を提供する。本方法で使用される培地、本方法によって生成された機能的ｈＰＳＣ－膵島を含む細胞の集団およびその使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、（１）前記ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた前記細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた前記細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた前記細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた前記細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた前記細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
前記第２の培養培地にＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９が補充される、方法。
【請求項2】
前記第２の培養培地にＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の培養培地が、ＡＬＫ５阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、Ｔ３およびＺｎＳＯ４のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２の培養培地が、ＡＬＫ５の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤のうちの１つまたは複数をさらに補充した基礎培地を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第３の培養培地が、上皮成長因子、プロテインキナーゼＣの活性化剤、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤およびビタミンＢ複合体成分のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記第４の培養培地に、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の阻害剤のうちの１つまたは複数が補充される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第４の培養培地にＷｎｔシグナル伝達の阻害剤がさらに補充される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤がＷｎｔ－Ｃ５９である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第５の培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を補充した基礎培地を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第５の培養培地にＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤および／またはＷｎｔ阻害剤がさらに補充される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｗｎｔ阻害剤がＷｎｔ－Ｃ５９である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第６の培養培地が、アクチビン受容体の活性化剤、Ｗｎｔ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
工程（１）が、前記第６の培養培地での培養後かつ工程（２）の前に、前記第７の培養培地での培養をさらに含み、前記第７の培養培地が、グルコース、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７、アクチビンＡおよびビタミンＣを補充した基礎培地を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
工程（１）～（６）のうちの１つまたは複数の培養が懸濁培養である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程（１）～工程（３）の培養が懸濁培養である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島を含む細胞の集団。
【請求項18】
請求項１７に記載の細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項19】
Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、またはそれらの任意の組み合わせを有する、または有するリスクがある哺乳動物を処置する方法であって、請求項１７に記載の細胞の集団または請求項１８に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項20】
Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのキットであって、請求項１～１６のいずれか一項に定義される第１～第７の培養培地の少なくとも１つを含む、キット。
【請求項21】
膵臓前駆細胞が膵臓内分泌前駆細胞に分化するのを誘導することにおける、ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、バイオテクノロジーに関し、より詳細には、機能的ｈＰＳＣ－膵島（ヒト多能性幹細胞由来膵島）をインビトロで生成するための方法、薬剤の組み合わせおよびキットに関する。本開示はまた、この方法によって得ることができ、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含む機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団、機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団を含む医薬組成物、機能的ｈＰＳＣ－膵島を投与することによって、糖尿病を有するか、または糖尿病を有するリスクがある哺乳動物を処置する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
細胞置換療法は、主に膵島β細胞の喪失によって引き起こされる１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）などの疾患の処置において有望である。ヒト膵島移植は、患者における内因性インスリン分泌を効果的に回復させることによってＴ１ＤＭを逆転させることが示されている。しかしながら、膵島移植の広範な適用は、ヒト膵島の容易にアクセス可能な供給源の欠如によって著しく妨げられる。
【0003】
中国特許出願公開第１０２８９９２８８号明細書は、ヒト膵島由来膵臓幹細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法を開示している。この方法は、ヒト膵島を回収し、そこから膵臓幹細胞を増殖させることから始まる。出発材料は、容易に入手できないドナー由来組織であり、当該方法の使用を制限する。
【0004】
いくつかの研究グループが、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からインスリン産生細胞を得るためのインビトロ方法を報告しており、この方法では、膵臓運命拘束性ＰＤＸ１＋前駆細胞のほぼ均一な集団を得ることができた（Ａ．Ｒｅｚａｎｉａ．Ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；３２（１１）：１１２１－３３；Ｆ．Ｗ．Ｐａｇｌｉｕｃａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９，４２８－４３９，Ｏｃｔ．９，２０１４）。しかしながら、これらの前駆細胞の高効率での膵臓β細胞へのその後の拘束には課題が残った。さらに、この幹細胞に基づく治療戦略の実現可能性は、特に非ヒト霊長類などのヒトと生理学的に類似した大型動物モデルでは体系的に評価されていない。マウスでの実験室における成功が証明された多能性幹細胞由来の膵島を用いた処置を、ヒトでの臨床応用に、特に齧歯類動物モデルを用いた検討が困難な移植および治療につなげるには、依然として不確実性が存在する。
【0005】
したがって、前臨床または臨床使用に適した機能的膵島を、容易に入手可能な供給源から分化させるための効率的かつ再現性のある方法の必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】中国特許出願公開第１０２８９９２８８号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ａ．Ｒｅｚａｎｉａ．Ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；３２（１１）：１１２１－３３
【非特許文献2】Ｆ．Ｗ．Ｐａｇｌｉｕｃａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９，４２８－４３９，Ｏｃｔ．９，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、前臨床研究およびトランスレーショナル研究の細胞の量および質の閾値を満たすための前提条件である、高効率かつ良好な再現性を有する分化プロトコルを確立した。本発明者らは、シグナル伝達経路を調節し、膵島の空間構造を再構築することによって、β細胞運命決定に対する膵臓前駆細胞の拘束から分化プロトコルを最適化することに集中した。２つの因子が重要であることが見出された：第１に、後部前腸管拘束細胞の高密度の三次元細胞凝集体の形成は、ＮＫＸ６．１＋Ｃペプチド＋細胞の効率的な生成を促進した。第２に、小分子ＩＳＸ９を段階５で添加すると、膵臓内分泌前駆細胞の最終分化が促進され、ＩＳＸ９をＷｎｔ－Ｃ５９と組み合わせて添加した場合、相乗効果が達成された。この最適化されたプロトコルにより、本発明者らは、移植後の非ヒト霊長類モデルにおいて安全かつ効率的であることが証明された比較的均一な膵島サイズの凝集体を効率的かつ再現可能に生成することができ、したがって本発明を完成させた。
【0009】
したがって、一般に、本開示は、機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法、本方法で使用される薬剤および組成物、本方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団、機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団を含む医薬組成物、糖尿病を有するかまたは糖尿病を有するリスクがある哺乳動物を処置する方法、および機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
第１の態様では、本開示は、機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地にＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９が補充される、方法を提供する。
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地にＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９が補充される、方法を提供する。
【0011】
さらなる実施形態では、第２の培養培地に、ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の小分子の組み合わせが補充される。
【0012】
本開示のいくつかの実施形態によれば、ＩＳＸ９、好ましくはまたＷｎｔ－Ｃ５９の添加は、膵臓前駆細胞の膵臓内分泌前駆細胞への分化を相乗的に促進する。
【0013】
第１の態様の別の実施形態では、第１の培養培地に、ＡＬＫ５阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＺｎＳＯ４のうちの１つまたは複数が補充される。
【0014】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明者らは、機能的な膵島を生成する方法を提供し、齧歯類モデルおよび非ヒト霊長類モデルを含む糖尿病動物モデルへのこれらの膵島の移植が、内因性インスリン分泌を効果的に回復させ、血糖コントロールを改善することを実証する。
【0015】
いくつかの実施形態では、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病マウスの腎被膜下への移植後、ｈＰＳＣ－膵島は、Ｃペプチド＋β細胞、ＧＣＧ＋α細胞およびＳＳＴ＋δ細胞の存在によって示されるように、顕著な血管新生および保存された細胞複雑性で生存した。移植マウスの空腹時血中グルコースレベルは、体重の増加を伴って生理学的レベルに回復した。グルコース負荷試験は、グルコース応答性ヒトＣペプチド分泌ならびに迅速なグルコースクリアランスを示した。空腹時ヒトＣペプチド分泌は、２から１２ｗｐｔまで着実に増加し、その後、非糖尿病マウスにおいて約１ｎｇ／ｍＬで最大３６週間維持された。注目すべきことに、ｈＰＳＣ－膵島移植糖尿病マウスの１５週生存率は、非移植コントロール群における２０％未満と比較して、８５％超であった。
【0016】
いくつかの実施形態では、非ヒト霊長類モデルにおける幹細胞由来膵島の１用量の門脈内注入後、空腹時血中グルコースレベルおよび平均食前血中グルコースレベルがすべてのレシピエントにおいて有意に低減した。重要なことに、移植後３ヶ月で、平均ＨｂＡ１ｃはピーク値と比較して２％超低下したが、平均外因性インスリン要求は移植後１５週間で４９％減少した。さらに、食事、グルコースおよびアルギニンに応答したＣペプチド放出がレシピエントにおいて観察された。注目すべきことに、これらの改善はまた、膵島置換療法が有意な臨床的および潜在的に生命を守る利益を与える、不安定な糖尿病患者の血糖状態に似た血糖状態を有するレシピエントマカクにおいても観察された。まとめると、本発明者らの知見は、前臨床状況における糖尿病処置のための多能性幹細胞由来膵島の実現可能性を実証し、これは、ｈＰＳＣ－膵島の臨床的トランスレーションのプロセスにおける重要な前進を示す。
【0017】
第２の態様において、本開示は、第１の態様の方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島の集合を提供する。機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団は、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を、そのような処置を必要とする対象においてこれらの膵島を移植することによって処置するために使用され得る。
【0018】
第３の態様において、本開示は、第１の態様の機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を、そのような処置を必要とする対象においてこれらの膵島を移植することによって処置するために使用され得る。
【0019】
第４の態様では、本開示は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、またはそれらの任意の組み合わせを有する、または有するリスクがある哺乳動物を処置する方法であって、治療有効量の第２の態様の機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団、または第３の態様の医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【0020】
第５の態様では、本開示は、機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのキットであって、第１～第７の培養培地のうちの少なくとも１つを含むキットを提供する。
【0021】
第５の態様の具体的な実施形態では、第２の培養培地はＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９を含む。第５の態様のさらなる実施形態において、第２の培養培地は、ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の小分子の組み合わせを含む。
【0022】
第６の態様では、本開示は、膵臓前駆細胞の膵臓内分泌前駆細胞への分化を誘導することにおけるＩＳＸ９単独またはＩＳＸ９とＷｎｔ－Ｃ５９との組み合わせの使用に関する。
【0023】
上記および他の目的、特徴および利点は、図面を参照して実施形態の以下の説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１は、インビボで糖尿病マウスにおける糖尿病を逆転させる、インビトロでの効率的なプロトコル生成機能的ｈＰＳＣ由来膵島の確立を示す。ａ、分化プロトコルの概略図。ｂ、左：段階６の細胞凝集物の代表的な明視野画像。スケールバー、５００μｍ。右：段階６の３日目（Ｓ６Ｄ３）の細胞凝集体におけるβ細胞マーカーの発現の代表的なフローサイトメトリー分析。ｃ、区分された段階６の凝集物における膵島ホルモンの代表的な免疫染色。スケールバー、５０μｍ。ｄ、フローサイトメトリーによって検出されたｈＰＳＣ－膵島における膵島ホルモン陽性細胞の割合（ｎ＝６）。（ｅ～ｈ）移植ｈＰＳＣ－膵島は、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおいて糖尿病を逆転させた。ｅ、１６ｗｐｔにおけるｈＰＳＣ－膵島移植片における膵島ホルモンおよびβ細胞の重要なマーカーの免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。ｆ、ｈＰＳＣ－膵島移植糖尿病マウスの空腹時血中グルコースレベル（ｎ＝２２）。ｇ、１６ｗｐｔにおけるｈＰＳＣ－膵島移植マウスにおけるグルコース負荷に応答したヒトＣペプチド分泌（ｎ＝１７）。ｈ、ｈＰＳＣ－膵島移植非糖尿病マウスにおける空腹時ヒトＣペプチド分泌の連続検出；１回目の検出は２ｗｐｔに行った（ｎ＝３１）。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示した。
【図2】図２は、免疫抑制糖尿病アカゲザルにおける血中グルコースレベルの安定化につながるｈＰＳＣ膵島の門脈内注入を示す。ｈＰＳＣ膵島の注入前および注入後の糖尿病サル－１＃（ａ、ｅ、ｉ）、サル－２＃（ｂ、ｆ、ｊ）、サル－３＃（ｃ、ｇ、ｋ）およびサル－４＃（ｄ、ｈ、ｌ）における血糖測定の長期追跡。（ａ～ｄ）ｈＰＳＣ－膵島の注入前および注入後のサルの毎日の空腹時血中グルコースレベル（注入手順は０日目に行われた）。（ｅ～ｈ）ｈＰＳＣ－膵島注入前後のサルの平均食事前血中グルコースレベル。Ｐ値は、注入前（－１ヶ月）レベルからの各群の変化の統計学的有意性を反映する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５。ｎ．ｓ．、有意ではない。データは平均±ＳＥＭとして提示した。（ｉ－ｌ）糖尿病誘発前、ｈＰＳＣ－膵島の注入前（０ｗｐｔ）および注入後のサルの糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベル。
【図3】図３は、ｈＰＳＣ－膵島移植された糖尿病マカクが、外因性インスリン要求の有意な減少および体重の全体的な増加を示したことを示す。ｈＰＳＣ膵島の注入前および注入後の糖尿病サル－１＃（ａ、ｅ）、サル－２＃（ｂ、ｆ）、サル－３＃（ｃ、ｇ）およびサル－４＃（ｄ、ｈ）における外因性インスリン要求および体重の長期追跡。（ａ～ｄ）週平均外因性インスリン用量。注入前の最終週および提出前の最終週における外因性インスリン要求をバーの上に示す。データは平均±ＳＥＭとして提示した。（ｅ～ｈ）サルの体重の追跡。
【図4】図４は、ｈＰＳＣ－膵島移植糖尿病アカゲザルにおけるＣペプチドの検出を示す。ｈＰＳＣ膵島の注入前および注入後の糖尿病サル－１＃（ａ、ｅ）、サル－２＃（ｂ、ｆ）、サル－３＃（ｃ、ｇ）およびサル－４＃（ｄ、ｈ）におけるＣペプチド分泌の長期追跡。（ａ～ｄ）糖尿病誘発前、注入前（０ｗｐｔ）および注入後の移植サルのランダムなＣペプチドレベル。（ｅ～ｈ）移植されたサルにおける空腹時および食後のＣペプチド分泌。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示した。
【図5】図５は、効率的なｈＰＳＣ－膵島生成プロトコルの確立およびｈＰＳＣ－膵島の特性評価を示す。ａ．段階４の終わりの膵臓前駆細胞マーカーおよび段階６の終わりのβ細胞マーカーに関して、プロトコルの様々な段階における平面培養と懸濁培養との間の分化効率を比較するフローサイトメトリー分析（ｎ＝５）。ｂ．Ｓ６Ｄ２で検出された、段階５で個別にまたは組み合わせて、小分子ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の添加を伴わない、および伴う、段階６の凝集体におけるβ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー（ｎ＝４）。ｃ、分化プロトコル全体にわたるフローサイトメトリーによる膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞およびβ細胞マーカーの連続する段階ごとの追跡（ｎ＝３）。（ｄ～ｈ）段階６の膵島様凝集体のインビトロ特性評価。ｄ、区分された段階６の凝集体における重要なβ細胞転写因子の代表的な免疫染色。スケールバー、５０μｍ。ｅ、静的グルコース刺激アッセイにおける段階６の凝集体（ｎ＝３）および初代ヒト膵島（ｎ＝２）のＣ－ペプチド分泌。上のバーに示すグルコース刺激指数。ｆ、動的灌流融合アッセイにおけるｈＰＳＣ－膵島のインスリン分泌。ｇ、段階６のβ細胞およびインスリン顆粒の超微細構造を示す電子顕微鏡法。スケールバー、２．５μｍ。ｈ、静的グルコース刺激アッセイにおけるｈＰＳＣ－膵島によるグルカゴン分泌。１つの代表的な分化バッチから得られたデータ；ｎ＝３、技術的反復。（ｉ－ｌ）ｈＰＳＣ－膵島は、糖尿病マウスに移植した場合、糖尿病を改善し、全生存を改善した。ｉ、左：腎被膜下のｈＰＳＣ－膵島移植片を示す腎摘出腎臓の代表的な画像。スケールバー、０．１ｃｍ。中央、右：ｈＰＳＣ－膵島移植片および移植片血管新生を示す腎臓切片のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織学。スケールバー、２００μｍ（中央）、７５μｍ（右）。ｊ、ｈＰＳＣ－膵島移植糖尿病マウスの体重の連続追跡（ｎ＝２２）。ｋ、１６ｗｐｔにおける、ｈＰＳＣ－膵島移植を伴う群（ｎ＝１７）および伴わない群（ｎ＝８）の健康（ｎ＝８）マウスおよびＳＴＺ誘発糖尿病マウスのＩＰＧＴＴに応答した血中グルコースレベル。ｌ、ｈＰＳＣ－膵島移植を伴うまたは伴わないＳＴＺ誘発糖尿病マウス群の生存率。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示した。
【図6】図６は、ｈＰＳＣ株にわたって安定に行われた確立された分化プロトコルを示す。同様のマーカー発現パターンおよび高血糖逆転能が、確立された分化プロトコルに供された３つの他のｈＰＳＣ株にわたって観察された。ａ、分化中の膵臓発達マーカーの代表的なフローサイトメトリーは、３つの他のｈＰＳＣ株にわたって進行段階に沿って同様の分布および効率を示した。ｂ、３つの他の独立したｈＰＳＣ株に由来するｈＰＳＣ－膵島切片の膵島ホルモンの代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。ｃ．糖尿病の一貫した回復を示す他の３つの独立したｈＰＳＣ株に由来するｈＰＳＣ膵島を移植した糖尿病マウスにおける空腹時血中グルコース（左）および体重（右）の長期追跡。ｄ．非糖尿病マウスにおける空腹時ヒトＣペプチド分泌の長期追跡。データは平均±ＳＥＭとして提示した。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、添付図面に示す実施形態を参照して、本開示を説明する。しかしながら、それらの説明は、本開示を限定するのではなく、単に例示目的で提供されていることを理解されたい。また、以下では、本開示の概念を不必要に不明瞭にしないために、公知の構造および技術の説明を省略する。
【0026】
定義
別段の記載がない限り、用語または表現は、以下の定義または意味を有するべきである。
別段の記載がない限り、用語または表現は、以下の定義または意味を有するべきである。
【0027】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、単一細胞レベルで自己再生および分化の両方を行う能力によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞および最終分化細胞を含む子孫細胞を産生し得る。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力を特徴とし得る。
【0028】
分化は、特殊化されていない（「拘束されていない」）またはあまり特殊化されていない細胞が、特殊化された細胞、例えば神経細胞または筋細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統内でより特殊化した（「拘束された」）位置を取ったものである。
【0029】
「拘束された」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、通常の状況下で、異なる細胞型に分化することができないか、またはあまり分化していない細胞型に戻ることができない点まで分化経路で進行した細胞を指す。
【0030】
これに関連して、「ｈＰＳＣ－膵島」とは、例えば本方法によって、ヒト多能性幹細胞に由来するＣペプチド陽性細胞、グルカゴン陽性細胞およびソマトスタチン陽性細胞を含む膵島を指す。
【0031】
「マーカー」は、本明細書で使用される場合、特定の状態（発達段階など）、細胞の特徴的な特性および／または同一性を示すために使用され得るように、目的の細胞において差次的に発現される核酸またはポリペプチド分子である。これに関連して、差次的発現は、未分化細胞または分化の別の段階の細胞と比較して、陽性マーカーについての増加したレベルおよび陰性マーカーについての低減したレベルを意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して目的の細胞において十分に高いまたは低いので、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを使用して目的の細胞を同定し、他の細胞と区別することができる。
【0032】
本明細書で使用される場合、特定のマーカーが検出限界を超え、細胞において十分に有意である場合、細胞は、特定のマーカーについて「陽性」であるか、「陽性」であるか、または「＋」である。適切な検出限界は、試験方法に応じて当業者が決定することができる。特に、フローサイトメトリーによる陽性（「ＦＣ」）は通常、約２％を超える。ポリメラーゼ連鎖反応フローサイトメトリー（「ＰＣＲ」）による陽性は、通常、約３５サイクル（Ｃｔ）以下である。
【0033】
本明細書で使用される場合、「懸濁培養」は、平面培養などの接着培養とは対照的に、表面に接着するのではなく培地に懸濁した細胞、単一細胞またはクラスタの培養物を指す。本方法の１つまたは複数の培養段階は、懸濁培養または平面培養を含むことができる。例えば、本方法の段階１、段階２および段階３で平面培養を行い、段階４、段階５および段階６で懸濁培養を行う。培養段階は、以下のセクションおよび実施例でより詳細に説明される。
【0034】
培養方法および培養培地
多能性幹細胞の機能的膵臓内分泌細胞への分化をインビトロ細胞培養物において再現しようとする試みにおいて、分化プロセスは多くの場合、多数の連続した段階を経て進行すると見なされる。図１（ａ）を参照すると、特に、分化プロセスは、一般に、複数の段階を経て進行すると見なされ、この段階的な分化において、「段階１」または「工程（１）」は、分化プロセスにおける第１の工程、すなわち、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化を指す。「段階２」または「工程（２）」は、第２の工程、すなわち、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。工程「段階３」または「（３）」は、第３の工程、すなわち、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階４」または「工程（４）」は、第４の工程、すなわち、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階５」または「工程（５）」は、第５の工程、すなわち、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階６」または「工程（６）」は、第６の工程、すなわち、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。
多能性幹細胞の機能的膵臓内分泌細胞への分化をインビトロ細胞培養物において再現しようとする試みにおいて、分化プロセスは多くの場合、多数の連続した段階を経て進行すると見なされる。図１（ａ）を参照すると、特に、分化プロセスは、一般に、複数の段階を経て進行すると見なされ、この段階的な分化において、「段階１」または「工程（１）」は、分化プロセスにおける第１の工程、すなわち、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化を指す。「段階２」または「工程（２）」は、第２の工程、すなわち、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。工程「段階３」または「（３）」は、第３の工程、すなわち、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階４」または「工程（４）」は、第４の工程、すなわち、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階５」または「工程（５）」は、第５の工程、すなわち、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「段階６」または「工程（６）」は、第６の工程、すなわち、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「機能的ｈＰＳＣ－膵島」は、ヒト多能性幹細胞に由来し、正常な膵臓における天然に存在する膵島の機能的特徴と類似または同一の１つまたは複数の機能的特徴を有する膵島である。機能的膵島の１つの代表的な機能は、ホルモンなどを分泌することである。本開示の機能的ｈＰＳＣ－膵島は、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含む主要な膵臓内分泌細胞を含有することを特徴とし得る。したがって、本開示の機能的ｈＰＳＣ－膵島は、ランゲルハンス島、例えば、Ｔ１ＤＭの機能不全または欠乏に起因する、または関連する疾患または症状を処置するため、緩和するため、または逆転させるために使用され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、症候もしくは合併症の軽減、疾患もしくは症状の進行の遅延、または疾患もしくは症状の完全な治癒を含む、対象における疾患もしくは症状またはその１つもしくは複数の症候もしくは合併症のコントロール、回復もしくは治癒を意味する。いくつかの実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、疾患もしくは症状、またはその１つもしくは複数の症候もしくは合併症の発生もしくは発症前に投与される予防目的のものを含む。有効な処置は、生理学的パラメータを測定し、形態を観察することによって、または同じ目的のために当技術分野で公知であるかもしくは将来開発される任意の手段によって決定することができる。膵島移植の関連において、有効な処置は、内因性インスリン分泌の回復および血糖コントロールの改善によって表すことができ、これは、空腹時血中グルコースレベルの低減、食前血中グルコースレベルの低減、ＨｂＡ１ｃレベルの低減、外因性インスリンの要求の低減、持続的な食後Ｃペプチド放出のうちの１つまたは複数によって特徴付けることができる。例えば、本開示の実施形態によれば、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞由来の膵島の移植が内因性インスリン分泌を効果的に回復させ、レシピエントにおける血糖コントロールを改善することを実証した。幹細胞由来膵島の１用量の門脈内注入後、空腹時血中グルコースレベルおよび平均食前血中グルコースレベルがすべてのレシピエントにおいて有意に低減した。例えば、レシピエントの平均ＨｂＡ１ｃは、移植前のレベルと比較して、移植後、例えば移植３ヶ月後に少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％減少し得る。例えば、外因性インスリンの平均サプリメントは、移植後、例えば移植後３ヶ月で、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％減少する。１つの具体的な実施形態では、移植後３ヶ月で、平均ＨｂＡ１ｃはピーク値と比較して２％超低下したが、平均外因性インスリン要求は４６％減少した。さらに、食事に応答した持続的なＣペプチド放出がすべてのレシピエントにおいて観察された。注目すべきことに、これらの改善はまた、膵島置換療法が有意な臨床的および潜在的に生命を守る利益を与える、不安定な糖尿病患者の血糖状態に似た血糖状態を有するレシピエントマカクにおいても観察された。
【0037】
本明細書で使用される場合、糖尿病という用語は、異常に高い血中グルコースレベル（高血糖症）をもたらす代謝障害を特徴とし得る症候群を指す。糖尿病の２つの最も一般的な形態は、インスリンの産生の縮小（１型）、またはインスリンに対する身体の応答の縮小（２型および妊娠）のいずれかに起因する。１型糖尿病（１型糖尿病、Ｉ型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、若年性糖尿病）は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の永続的な破壊をもたらす疾患である。２型糖尿病（インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、または成人発症糖尿病）は、主にインスリン抵抗性（インスリンに対する身体による応答の縮小）、相対的インスリン欠乏、および高血糖症を特徴とする代謝障害である。糖尿病に関連する合併症には、低血糖、ケトアシドーシス、または非ケトン性高浸透圧昏睡、心血管疾患、腎不全、網膜損傷、神経損傷、および微小血管損傷が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、哺乳動物は前糖尿病であり、これは、例えば、空腹時血中グルコース上昇または食後血中グルコース上昇を有すると特徴付けることができる。
【0038】
本開示の第１の態様によれば、機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法が提供され、本方法は、
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地は、ＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９を含む。
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地は、ＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９を含む。
【0039】
好ましい実施形態では、第２の培養培地はＩＳＸ９を含む。
【0040】
さらなる実施形態では、第２の培養培地は、ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の小分子の組み合わせを含む。
【0041】
本出願の培地は基礎培地を含む。本明細書に記載の「基礎培地」という用語は、細胞の生存および成長を支援するアミノ酸、ビタミン、炭水化物および塩などの栄養素を提供する組成物を指す。ほとんどの場合、基礎培地のみでは細胞の増殖を支援するには不十分であるため、通常、基礎培地にサプリメントを添加して、細胞の増殖および／または分化に不可欠な化合物を細胞に提供する。哺乳動物幹細胞を培養するのに適した例示的な基礎培地は当技術分野で公知であり、それにはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ由来培地、例えばＤＭＥＭ塩基性、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、ＭＣＢＤ、ＲＰＭＩ １６４０、ＣＭＲＬ１０６６などが含まれるが、これらに限定されない。
【0042】
基礎培地には、培養細胞の種類に応じて栄養素を補充することができる。補充栄養素は、市販のプレミックスを含むことができ、または必要に応じて配合することができる。例示的な栄養サプリメントには、Ｂ２７サプリメント、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＢＳＡ、Ｎ２およびＧｌｕｔａＭＡＸが含まれるが、これらに限定されない。
【0043】
例えば、Ｂ２７サプリメントまたはＢＳＡは、本出願の任意の段階の基礎培地に添加される。好ましくは、Ｂ２７は、０．０１～１０％、より好ましくは０．５～２％、例えば０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、最も好ましくは１％の量で添加されるか、または製造業者によって推奨される量で添加される。場合によっては、Ｂ２７サプリメントは、ＢＳＡまたはＦＢＳと同等の量で交換可能である。
【0044】
例えば、ＭＣＢＤ １３１を培地に添加することができる場合。
【0045】
細胞の分化を誘導するために、培養段階に応じて１つまたは複数の分化剤を培地に含めることができる。本明細書に記載の「分化剤」は、ｈＰＳＣから機能的ｈＰＳＣ－膵島への発達を促進する任意の薬剤を指す。本出願における分化剤は、ＫＧＦおよびＥＧＦなどの成長因子を含むことができる。分化剤は、既知または未知の機序によって、所望の細胞型の生成もしくは成長を改善もしくは増加させること、および／または１つまたは複数の望ましくない細胞型の生成もしくは成長を阻害もしくは低減させることによって機能することができる。本発明は、小分子、具体的にはＩＳＸ９および／またはＷｎｔ－Ｃ５９が、特に膵臓内分泌前駆細胞の最終分化中に、ｈＰＳＣから膵島への分化を促進するという予想外のことに少なくとも基づく。図１ａは、本発明の培養方法の各段階で用いられる分化剤の好ましい組み合わせの具体的な実施形態を示す。
【0046】
当業者はまた、特定の種類の製品の使用が本出願において必須ではないことを理解するであろう。任意の基礎培地または栄養サプリメントを機能的代替物で置換することができる。
【0047】
第１の培養培地（段階６）
第１の培養培地は、ＡＬＫ阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＺｎＳＯ４から選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む。（段階６）好ましい実施形態では、第１の培養培地は、ＡＬＫ５阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＺｎＳＯ４の組み合わせを補充した基礎培地を含む。
第１の培養培地は、ＡＬＫ阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＺｎＳＯ４から選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む。（段階６）好ましい実施形態では、第１の培養培地は、ＡＬＫ５阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＺｎＳＯ４の組み合わせを補充した基礎培地を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫ５を選択的に阻害するＡＬＫ５阻害剤、例えばＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、６１６４５２、ＲｅｐＳｏｘ（Ｅ－６１６４５２）、ＳＢ４３１５４２およびＡ８３－０１であり得る。ＡＬＫ阻害剤、例えばＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約１～５０μＭ、好ましくは約５～１５μＭ、またはより好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0049】
いくつかの実施形態では、アデニリルシクラーゼ活性化剤は、フォルスコリンである。アデニリルシクラーゼ活性化剤、例えばフォルスコリンは、約１～１００μＭ、好ましくは約５～１５μＭ、またはより好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0050】
いくつかの実施形態では、Ａｘｌ阻害剤は、Ｒ４２８またはその類似体である。Ａｘｌ阻害剤、例えばＲ４２８は、約０．１～１０μＭ、好ましくは約０．１～１μＭ、またはより好ましくは約０．５μＭの量で添加される。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＩκＢキナーゼ阻害剤は、Ｎ－アセチルシステインまたはその類似体である。ＩκＢキナーゼ阻害剤、例えばＮ－アセチルシステインまたはその類似体は、約０．５～２０ｍＭ、好ましくは約１～５ｍＭ、またはより好ましくは約２ｍＭの量で添加される。
【0052】
いくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンは、リオチロニンナトリウム（Ｔ３）である。甲状腺ホルモン、例えばＴ３は、約０．１～２０μＭ、好ましくは約０．５～１．５μＭ、またはより好ましくは約１μＭの量で添加される。
【0053】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、フォルスコリン、Ｒ４２８、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔ３およびＺｎＳＯ４を補充した基礎培地である。
【0054】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地に、Ｂ２７、ヘパリン、およびビタミンＣの少なくとも１つをさらに補充する。第１の培養培地中のＢ２７は、機能的に等価な量のＢＳＡまたはＦＢＳで置き換えることができる。
【0055】
好ましい実施形態では、第１の培養培地は、基礎培地に加えて、約１～５０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．１～１０μＭのＲ４２８、約０．１～２０μＭのＴ３、約１～１００μＭのフォルスコリン、約１～１００μＭのＺｎＳＯ４、および約０．５～２０ｍＭのＮ－アセチルシステインのうちの１つまたは複数を含む。
【0056】
好ましい実施形態では、第１の培養培地は、基礎培地に加えて、約５～１５μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．１～１μＭのＲ４２８、約０．５～１．５μＭのＴ３、約５～１５μＭのフォルスコリン、約５～１５μＭのＺｎＳＯ４、および／または約１～５ｍＭのＮ－アセチルシステインを含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．５％～２％のＢ２７、約５～１５μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．１～１μＭのＲ４２８、約０．５～１．５μＭのＴ３、約５～１５μＭのフォルスコリン、約５～１５μｇ／ｍＬのヘパリン、約５～１５μＭのＺｎＳＯ４、約１～５ｍＭのＮ－アセチルシステイン、および／または約０．１～０．５ｍＭのビタミンＣを含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．５μＭのＲ４２８、約１μＭのＴ３、約１０μＭのフォルスコリン、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約１０μＭのＺｎＳＯ４、約２ｍＭのＮ－アセチルシステイン、および／または約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む。
【0059】
好ましい実施形態では、本方法の段階６での培養を、第１の培養培地を使用して約２～６日間懸濁状態で実施して、膵臓内分泌前駆細胞から膵島を生成する。
【0060】
第２の培養培地（段階５）
膵臓内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞を、分化剤としてイソキサゾール９（ＩＳＸ９）または好ましくはＩＳＸ９とＷｎｔシグナル伝達阻害剤との組み合わせを含む第２の培養培地で培養することによって得られる（段階５）。
膵臓内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞を、分化剤としてイソキサゾール９（ＩＳＸ９）または好ましくはＩＳＸ９とＷｎｔシグナル伝達阻害剤との組み合わせを含む第２の培養培地で培養することによって得られる（段階５）。
【0061】
ＩＳＸ９は、約０．５～２００μＭ、好ましくは約０．５～１００μＭ、より好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0062】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤、例えばＷｎｔ－Ｃ５９は、約５～２０００ｎＭ、より好ましくは約１０～５００ｎＭ、より好ましくは約５０～２５０ｎＭ、またはさらにより好ましくは約１００ｎＭの量で添加される。
【0063】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地に、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤をさらに補充する。（段階５）
【0064】
例えば、ＡＬＫ阻害剤の阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤であり、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、６１６４５２、ＲｅｐＳｏｘ（Ｅ－６１６４５２）、ＳＢ４３１５４２およびＡ８３－０１などのＡＬＫ５を選択的に阻害するＡＬＫ５阻害剤であり得る。ＡＬＫ阻害剤、例えばＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約１～５０μＭ、好ましくは約５～１５μＭ、またはより好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0065】
例えば、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、例えばＬＤＮ１９３１８９は、約０．０１５～１０μＭ、好ましくは約０．０５～５μＭ、より好ましくは約０．１～１μＭ、またはさらにより好ましくは約０．３μＭの量で添加される。
【0066】
例えば、甲状腺ホルモンはＴ３である。甲状腺ホルモン、例えばＴ３は、約０．０５～５０μＭ、好ましくは約０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭ、さらにより好ましくは約１μＭの量で添加される。
【0067】
例えば、ＮＯＴＣＨシグナリングの阻害剤は、Ｘｘｉである。ＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤、例えばＸｘｉは、約０．００５～２μＭ、好ましくは約０．０５～１μＭ、またはより好ましくは約０．１μＭの量で添加される。
【0068】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地に、Ｙ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤をさらに補充する。Ｙ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤は、約０．５～２００μＭ、好ましくは約０．４～１００μＭ、またはより好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0069】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、ヘパリン、およびビタミンＣなどのＬ－グルタミンのうちの１つまたは複数をさらに補充する。
【0070】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地の基礎培地は、ＤＭＥＭ塩基性培地またはＭＣＢＤ培地である。
【0071】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．０１％～１０％のＢ２７、約０．５～２００μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．０１５～６μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．０５～２０μＭのＴ３、約０．５～２００μＭのＩＳＸ９、約０．５～２００μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．００５～２μＭのノッチ阻害剤Ｘｘｉ、約５～２０００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約０．５～２００μＭのＹ２７６３２、および約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、基礎培地に加えて、好ましくは１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約０．０２５ｘ～５ｘのＢ２７、約０．５～１００μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．０１５～１０μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．０５～５０μＭのＴ３、約０．５～１００μＭのＩＳＸ９、約０．５～１００μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．００５～２μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、約５～２０００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約０．５～２００μＭのＹ２７６３２、および／または約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約０．０５％～５％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、基礎培地に加えて、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．３μＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭのＴ３、約１０μＭのＩＳＸ９、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約１０μＭのＹ２７６３２、および／または約０．２５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約１％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0074】
好ましい実施形態では、本方法の段階５での培養を、第２の培養培地を使用して約３～１０日間、特に約４～６日間懸濁状態で実施して、膵臓前駆細胞から膵臓内分泌前駆細胞を生成する。
【0075】
第３の培養培地（段階４）
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞は、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの成長因子、ニコチンアミドなどのＢ複合体ビタミン、ＴＰＢなどのプロテインキナーゼＣの活性化剤、およびＳａｎｔ１などのソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤が補充された基礎培地を含む第３の培養培地中で、後部前腸管を培養することによって得られる（段階４）。
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞は、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの成長因子、ニコチンアミドなどのＢ複合体ビタミン、ＴＰＢなどのプロテインキナーゼＣの活性化剤、およびＳａｎｔ１などのソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤が補充された基礎培地を含む第３の培養培地中で、後部前腸管を培養することによって得られる（段階４）。
【0076】
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞は、ＥＧＦ、ニコチンアミド、ＴＰＢおよびＳａｎｔ１のうちの１つまたは複数、好ましくはＥＧＦ、ニコチンアミド、ＴＰＢおよびＳａｎｔ１の組み合わせを補充した第３の培養培地中で、後部前腸管を培養することによって得られる。
【0077】
例えば、ＥＧＦなどの成長因子は、約１～２０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０～２００ｎｇ／ｍＬ、またはさらにより好ましくは１００ｎｇ／ｍＬの量で添加される。
【0078】
例えば、ニコチンアミドなどのＢ複合体ビタミンは、約０．５～２００ｍＭ、好ましくは約１～１００ｍＭ、より好ましくは約５～５０ｍＭ、またはさらにより好ましくは約１０ｍＭの量で添加される。
【0079】
例えば、プロテインキナーゼＣの活性化剤、例えばＴＰＢは、約０．０１～１０μＭ、好ましくは約０．０２～５μＭ、より好ましくは約０．１～１μＭ、またはさらにより好ましくは約０．２μＭの量で添加される。
【0080】
例えば、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤、例えばＳａｎｔ１は、約０．０１２５～５μＭ、好ましくは約０．０２５～１μＭ、より好ましくは約０．０５～０．５μＭ、またはさらにより好ましくは約０．２５μＭの量で添加される。
【0081】
いくつかの実施形態では、第３の培養培地に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、およびビタミンＣなどのＬ－グルタミンのうちの１つまたは複数をさらに補充する。
【0082】
いくつかの実施形態では、第３の培養培地の基礎培地はＤＭＥＭ塩基性培地である。
【0083】
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．０１％～１０％のＢ２７、約５～２０００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．０１～４μＭのＴＰＢ、約０．５～２００ｍＭのニコチンアミド、約０．０１２５～５μＭのＳａｎｔ１および約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．０１％～１０％のＢ２７、約１～５００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．０１～１０μＭのＴＰＢ、約０．５～２００ｍＭのニコチンアミド、約０．０１２５～５μＭのＳａｎｔ１および／または約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、基礎培地に加えて、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．２μＭのＴＰＢ、約１０ｍＭのニコチンアミド、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および／または約０．２５ｍＭのビタミンＣを含み；任意で約１％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0086】
好ましい実施形態では、本方法の段階４での培養を、第３の培養培地を使用して約４～７日間、好ましくは５～６日間懸濁状態で実施して、後部前腸管から膵臓前駆細胞を生成する。
【0087】
第４の培養培地（段階３）
いくつかの実施形態では、後部前腸管は、分化剤としてＷｎｔ－Ｃ５９などのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤が補充された基礎培地を含む第４の培養培地中で原始腸管を培養することによって得られる。（段階３）
いくつかの実施形態では、後部前腸管は、分化剤としてＷｎｔ－Ｃ５９などのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤が補充された基礎培地を含む第４の培養培地中で原始腸管を培養することによって得られる。（段階３）
【0088】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤、例えばＷｎｔ－Ｃ５９は、約５～２０００ｎＭ、より好ましくは約１０～５００ｎＭ、より好ましくは約５０～２５０ｎＭ、またはさらにより好ましくは約１００ｎＭの量で添加される。
【0089】
さらなる実施形態では、第４の培地に、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤（Ｓａｎｔ１など）、およびＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（ＬＤＮ１９３１８９など）からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤をさらに補充する。
【0090】
いくつかの実施形態では、後部前腸管は、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ならびにレチノイン酸（ＲＡ）、Ｓａｎｔ１、およびＬＤＮ１９３１８９のうちの１つまたは複数、好ましくはレチノイン酸（ＲＡ）、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、およびＷｎｔ－Ｃ５９の組み合わせを補充した第４の培養培地中で原始腸管を培養することによって得られる。
【0091】
例えば、レチノイン酸（ＲＡ）は、約０．１～４０μＭ、好ましくは約０．５～１０μＭ、より好ましくは約１～５μＭ、またはさらにより好ましくは約２μＭの量で添加される。
【0092】
例えば、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤、例えばＳａｎｔ１は、約０．０１２５～５μＭ、好ましくは約０．０２５～１μＭ、より好ましくは約０．０５～０．５μＭ、またはさらにより好ましくは約０．２５μＭの量で添加される。
【0093】
例えば、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、例えばＬＤＮ１９３１８９は、約０．０１～２μＭ、好ましくは約０．０５～１μＭ、またはより好ましくは約０．１μＭの量で添加される。
【0094】
いくつかの実施形態では、第４の培養培地の基礎培地はＤＭＥＭ塩基性培地である。
【0095】
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．０１％～１０％のＢ２７、約０．１～４０μＭのレチノイン酸、約０．０５～２μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．０１２５～５μＭのＳａｎｔ１および／または約５～２０００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、基礎培地に加えて、約１％のＢ２７、約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および／または約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む。
【0097】
好ましい実施形態では、本方法の段階３での培養を、第４の培養培地を使用して約２～７日間、例えば２、３、４、５、６または７日間実施して、原始腸管から後部前腸管を生成する。
【0098】
第５の培養培地（段階２）
いくつかの実施形態では、原始腸管は、ＫＧＦ、ＦＧＦ２および／またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤、および／またはＷｎｔ－Ｃ５９などのＷｎｔ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む第５の培養培地中で、胚体内胚葉を培養することによって得られる（段階２）。
いくつかの実施形態では、原始腸管は、ＫＧＦ、ＦＧＦ２および／またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤、および／またはＷｎｔ－Ｃ５９などのＷｎｔ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む第５の培養培地中で、胚体内胚葉を培養することによって得られる（段階２）。
【0099】
いくつかの実施形態では、原始腸管は、ＫＧＦを補充した第５の培養培地中で胚体内胚葉を培養することによって得られる。
【0100】
いくつかの実施形態では、原始腸管は、ＫＧＦ、ＳＢ４３１５４２およびＷｎｔ－Ｃ５９を補充した第５の培養培地中で胚体内胚葉を培養することによって得られる。
【0101】
例えば、ＫＧＦなどの成長因子は、約２．５～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０～１００ｎｇ／ｍＬ、またはさらにより好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬの量で添加される。
【0102】
例えば、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤は、約０．２５～１００μＭ、好ましくは約０．５～５０μＭ、より好ましくは約１～１０μＭ、またはさらにより好ましくは約５μＭの量で添加される。
【0103】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤、例えばＷｎｔ－Ｃ５９は、約５～２０００ｎＭ、より好ましくは約１０～５００ｎＭ、より好ましくは約５０～２５０ｎＭ、またはさらにより好ましくは約１００ｎＭの量で添加される。
【0104】
いくつかの実施形態では、第５の培養培地の基礎培地はＭＣＢＤ １３１培地である。
【0105】
いくつかの実施形態では、第５の培養培地は、基礎培地に加えて、約０．２２５～９０ｍＭのグルコース、約０．０２５％～１０％のＢＳＡまたは０．０１％～１０％のＢ２７、約２．５～１０００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣ、約０．２５～１００μＭのＳＢ４３１５４２および／または約５～２０００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含み；任意で約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、第５の培養培地は、基礎培地に加えて、約４．５ｍＭのグルコース、約０．５％のＢＳＡまたは１％のＢ２７、約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約５μＭのＳＢ４３１５４２および／または約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含み；任意で約１％のＧｌｕｔａｍａｘを含む。
【0107】
好ましい実施形態では、本方法の段階２での培養を、第５の培養培地を使用して約１～４日間、例えば１、２、３または４日間実施して、胚体内胚葉から原始腸管を生成する。
【0108】
第６の培養培地（段階１）
いくつかの実施形態では、本方法は、アクチビンＡ、Ｃｈｉｒ９９０２１などのＷｎｔ活性化剤、ＰＩ１０３などのＰＩ３Ｋ阻害剤、およびＹ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む第６の培養培地中で、および任意でアクチビンＡを補充した基礎培地を含む第７の培養培地中で、多能性幹細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、アクチビンＡ、Ｃｈｉｒ９９０２１などのＷｎｔ活性化剤、ＰＩ１０３などのＰＩ３Ｋ阻害剤、およびＹ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される１つまたは複数の分化剤を補充した基礎培地を含む第６の培養培地中で、および任意でアクチビンＡを補充した基礎培地を含む第７の培養培地中で、多能性幹細胞を培養することを含む。
【0109】
例えば、第６または第７の培地中のアクチビンＡは、約２０～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０～５００ｎｇ／ｍＬ、またはより好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬの量で添加される。
【0110】
例えば、Ｃｈｉｒ９９０２１などのＷｎｔ活性化剤は、約０．３～１２０μＭ、好ましくは１～６０μＭ、より好ましくは３～２０μＭ、またはさらにより好ましくは約６μＭの量で添加される。
【0111】
例えば、ＰＩ１０３などのＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２．５～１０００ｎＭ、好ましくは５～５００ｎＭ、より好ましくは１０～１００ｎＭ、またはさらにより好ましくは約５０ｎＭの量で添加される。
【0112】
例えば、Ｙ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤は、約０．５～２００μＭ、好ましくは約０．４～１００μＭ、またはより好ましくは約１０μＭの量で添加される。
【0113】
さらなる実施形態では、第６の培養培地は、グルコース、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７およびビタミンＣのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、第６の培養培地の基礎培地はＭＣＢＤ １３１培地である。
【0115】
いくつかの実施形態では、胚体内胚葉は、多能性幹細胞を、約０．２２５～９０ｍＭのグルコース、約０．０１％～１０％のＢ２７、約２０～１０００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣ、約０．３～１２０μＭのＷｎｔ活性化剤、約２．５～１０００ｎＭのＰＩ３Ｋ阻害剤および／または約０．５～２００μＭのＲＯＣＫ阻害剤；および任意で約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘを補充した第６の培養培地中で培養することによって得られる。
【0116】
別のさらなる実施形態では、第７の培養培地は、グルコース、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７およびビタミンＣをさらに含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、第７の培養培地の基礎培地はＭＣＢＤ １３１培地である。
【0118】
いくつかの実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および／または約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地で約１日間、次いで、約０．２２５～９０ｍＭのグルコース、約０．０５％～２０％のＧｌｕｔａｍａｘ、約０．０１％～１０％のＢ２７、約５～２０００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび／または約０．０１２５～５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地で約２～４日間培養することを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および／または約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地で約１日間、次いで、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび／または約０．２５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地で約３日間培養することを含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞、例えば化学的人工多能性幹細胞であり得る。胚性幹細胞は、市販の胚性幹細胞であり得る。胚性幹細胞は、インビトロ受精胚に由来し得る。胚性幹細胞は、インビボで発達しておらず、受精後１４日以内である胚から得ることができる。
【0121】
特定の実施形態では、本方法は、（１）多能性幹細胞を、約４．５ｍＭグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地中で約１日間、次いで、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地中で約３日間培養して、胚体内胚葉を得ること；（２）胚体内胚葉を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約５μＭのＳＢ４３１５４２および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第５の培養培地中で約２日間培養して、原始腸管を得ること；（３）原始腸管を、約１％のＢ２７、約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第４の培養培地中で約４日間培養して、後部前腸管を得ること；（４）後部前腸管を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．２μＭのＴＰＢ、約１０ｍＭのニコチンアミド、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第３の培養培地中で約５日間～６日間懸濁培養して、膵臓前駆細胞を得ること；（５）膵臓前駆細胞を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．３μＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭのＴ３、約１０μＭのＩＳＸ９、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約１０μＭのＹ２７６３２および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第２の培養培地中で約６日間懸濁培養して、膵臓内分泌前駆細胞を得ること；および（６）膵臓内分泌前駆細胞を、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．５μＭのＲ４２８、約１μＭのＴ３、約１０μＭのフォルスコリン、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約１０μＭのＺｎＳＯ４、約２ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび約０．２５ｍＭのビタミンＣ培地を含む第１の培養物中で約２日間～４日間懸濁培養して、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を得ることを含む。
【0122】
第１の態様の好ましい実施形態では、本方法は、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成する。
【0123】
実施形態によれば、本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から最大およそ７０％の効率でＮＫＸ６．１＋Ｃ－ペプチド＋細胞を含有する比較的均一な膵島サイズの凝集体を産生する。分化プロセスの動的分析は、およそ９０％のＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞が初期段階４によって生成され、最終的に段階６で９０％のＣＨＧＡ＋ＮＧＮ３－内分泌細胞を生じたことを示した。特に、プロトコルは安定した性能を示し、分化バッチ全体で同様の結果を一貫して再現した。まとめると、これらのデータは、ｈＰＳＣからの膵臓内分泌分化を確実に促進するプロトコルの確立を示した。
【0124】
ｈＰＳＣ－膵島
本開示の第２の態様によれば、上記の方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団が提供される。機能的ｈＰＳＣ－膵島のこれらの集団は、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を、そのような処置を必要とする対象においてこれらの膵島を移植することによって処置するために使用され得る。
本開示の第２の態様によれば、上記の方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団が提供される。機能的ｈＰＳＣ－膵島のこれらの集団は、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を、そのような処置を必要とする対象においてこれらの膵島を移植することによって処置するために使用され得る。
【0125】
本開示の第３の態様によれば、上記の機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団を含む医薬組成物。医薬組成物は、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を、そのような処置を必要とする対象においてこれらの膵島を移植することによって処置するために使用され得る。
【0126】
本開示の第４の態様によれば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病またはそれらの任意の組み合わせを有するか、有するリスクがある哺乳動物を処置するための方法であって、上記の機能的ｈＰＳＣ－膵島の集団または上記の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【0127】
本開示の第５の態様によれば、機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのキットであって、上記の第１～第６の培養培地のうちの少なくとも１つを含むキットが提供される。
【0128】
本開示の第６の態様によれば、膵臓前駆細胞の膵臓内分泌前駆細胞への分化を誘導することにおける小分子ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の組み合わせが提供される。
【0129】
本発明の実施形態
１．Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地にＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９が補充される、方法。
１．Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、
（１）ｈＰＳＣを第６の培養培地で培養して、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（２）工程（１）で得られた細胞を第５の培養培地で培養して、原始腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（３）工程（２）で得られた細胞を第４の培養培地で培養して、後部前腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（４）工程（３）で得られた細胞を第３の培養培地で培養して、膵臓前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（５）工程（４）で得られた細胞を第２の培養培地で培養して、膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；
（６）工程（５）で得られた細胞を第１の培養培地で培養して、機能的ｈＰＳＣ－膵島に特徴的なマーカーを発現する細胞を得ること；を含み、
第２の培養培地にＩＳＸ９またはＷｎｔ－Ｃ５９、好ましくはＩＳＸ９が補充される、方法。
【0130】
２．第２の培養培地にＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９が補充される、請求項１に記載の方法。
【0131】
３．第１の培養培地が、ＡＬＫ５阻害剤、アデニリルシクラーゼ活性化剤、Ａｘｌ阻害剤、ＩκＢキナーゼ阻害剤、Ｔ３およびＺｎＳＯ４のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
【0132】
４．ＡＬＫ５阻害剤がＡＬＫ５阻害剤ＩＩまたはその類似体である、実施形態３に記載の方法。
【0133】
５．アデニリルシクラーゼ活性化剤がフォルスコリンまたはその類似体である、実施形態３または実施形態４に記載の方法。
【0134】
６．Ａｘｌ阻害剤がＲ４２８またはその類似体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
７．ＩκＢキナーゼ阻害剤がＮ－アセチルシステインまたはその類似体である、実施形態３～６のいずれか１つに記載の方法。
【0136】
８．第１の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性またはＭＣＢＤ１３１である、実施形態１～７のいずれか１つの方法。
【0137】
９．第１の培養培地にＢ２７、ヘパリンおよびビタミンＣのうちの１つまたは複数がさらに補充される、実施形態１～８のいずれか１つの方法。
【0138】
１０．第２の培養培地が、ＴＧＦ－βＲＩの阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、甲状腺ホルモンおよびＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤のうちの１つまたは複数をさらに補充した基礎培地を含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
【0139】
１１．ＴＧＦ－βＲＩの阻害剤がＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、実施形態１０に記載の方法。
【0140】
１２．ＢＭＰシグナル伝達阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、実施形態１０または実施形態１１に記載の方法。
【0141】
１３．甲状腺ホルモンがＴ３である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0142】
１４．ＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤が、Ｘｘｉなどのγ－セクレターゼ阻害剤である、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0143】
１５．第２の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性またはＭＣＢＤ１３１である、実施形態１０～１４のいずれか１つに記載の方法。
【0144】
１６．第２の培養培地に、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７、ヘパリン、Ｙ２７６３２およびビタミンＣのうちの１つまたは複数がさらに補充される、実施形態１０～１５のいずれか１つに記載の方法。
【0145】
１７．第３の培養培地が、上皮成長因子、プロテインキナーゼＣの活性化剤、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤およびビタミンＢ複合体成分のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
【0146】
１８．上皮成長因子がＥＧＦである、実施形態１７に記載の方法。
【0147】
１９．プロテインキナーゼＣの活性化剤がＴＰＢである、実施形態１７または実施形態１８に記載の方法。
【0148】
２０．ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤がＳａｎｔ１である、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0149】
２１．ビタミンＢ複合体の成分がニコチンアミドである、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の方法。
【0150】
２２．第３の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性またはＭＣＢＤ１３１である、実施形態１７～２１のいずれか１つの方法。
【0151】
２３．第３の培養培地に、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７およびビタミンＣのうちの１つまたは複数がさらに補充される、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の方法。
【0152】
２４．第４の培養培地に、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の阻害剤のうちの１つまたは複数が補充される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
【0153】
２５．ソニックヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤がＳａｎｔ１である、実施形態２４に記載の方法。
【0154】
２６．ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、実施形態２４または実施形態２５に記載の方法。
【0155】
２７．第４の培養培地にＷｎｔシグナル伝達の阻害剤がさらに補充される、実施形態２４～２６のいずれか１つに記載の方法。
【0156】
２８．Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤がＷｎｔ－Ｃ５９である、実施形態２７に記載の方法。
【0157】
２９．第４の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性またはＭＣＢＤ１３１である、実施形態２４～２８のいずれか１つの方法。
【0158】
３０．第４の培地にＢ２７がさらに補充される、実施形態２４～２９のいずれか１つに記載の方法。
【0159】
３１．第５の培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を補充した基礎培地を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
【0160】
３２．ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０またはＫＧＦである、実施形態３１に記載の方法。
【0161】
３３．第５の培養培地にＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤および／またはＷｎｔ阻害剤がさらに補充される、実施形態３１または実施形態３２に記載の方法。
【0162】
３４．ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ阻害剤がＳＢ４３１５４２である、実施形態３３のいずれか１つの方法。
【0163】
３５．Ｗｎｔ阻害剤がＷｎｔ－Ｃ５９である、実施形態３３または３４に記載の方法。
【0164】
３６．第５の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性またはＭＣＢＤ１３１である、実施形態３１～３５のいずれか１つの方法。
【0165】
３７．第５の培養培地に、グルコース、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７またはＢＳＡ、ＫＧＦおよびビタミンＣのうちの１つまたは複数がさらに補充される、実施形態３１～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0166】
３８．第６の培養培地が、アクチビン受容体の活性化剤、Ｗｎｔ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤のうちの１つまたは複数を補充した基礎培地を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0167】
３９．アクチビン受容体の活性化剤がアクチビンＡである、実施形態３８に記載の方法。
【0168】
４０．Ｗｎｔ活性化剤がＣｈｉｒ９９０２１である、実施形態３８～３９に記載の方法。
【0169】
４１．ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２である、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法。
【0170】
４２．ＰＩ３Ｋ阻害剤がＰＩ１０３である、実施形態３８～４１のいずれか１つの方法。
【0171】
４３．第６の培養培地の基礎培地がＤＭＥＭ塩基性培地またはＭＣＢＤ１３１培地である、実施形態３８～４２のいずれか１つの方法。
【0172】
４４．第６の培養培地に、グルコース、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７、ビタミンＣのうちの１つまたは複数がさらに補充される、実施形態３８～４３のいずれか１つに記載の方法。
【0173】
４５．工程（１）が、第６の培養培地での培養後かつ工程（２）の前に、第７の培養培地での培養をさらに含み、第７の培養培地が、グルコース、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７、アクチビンＡおよびビタミンＣを補充した基礎培地を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。
【0174】
４６．多能性幹細胞を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地で約１日間培養し、その後、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび／または約０．２５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地で約３日間培養することを含む、実施形態４５に記載の方法。
【0175】
４７．ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0176】
４８．工程（１）～（６）のうちの１つまたは複数の培養が懸濁培養である、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
【0177】
４９．工程（１）～工程（３）の培養が懸濁培養である、実施形態４８に記載の方法。
【0178】
５０．実施形態１～４９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる機能的ｈＰＳＣ－膵島を含む細胞の集団。
【0179】
５１．実施形態５０に記載の細胞の集団を含む医薬組成物。
【0180】
５２．Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、またはそれらの任意の組み合わせを有する、または有するリスクがある哺乳動物を処置する方法であって、実施形態５０に記載の細胞の集団または実施形態５１に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法。
【0181】
５３．Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのキットであって、
実施形態１～４９のいずれか１つに定義される第１～第７の培養培地の少なくとも１つを含む、キット。
実施形態１～４９のいずれか１つに定義される第１～第７の培養培地の少なくとも１つを含む、キット。
【0182】
５４．Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島をインビトロで生成する方法であって、
多能性幹細胞を、約４．５ｍＭグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地中で約１日間、次いで、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地中で約３日間培養して、胚体内胚葉を得ること；
胚体内胚葉を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約０．５％のＢＳＡまたは１％のＢ２７、約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約５μＭのＳＢ４３１５４２および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第５の培養培地中で約２日間培養して、原始腸管を得ること；
原始腸管を、約１％のＢ２７、約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第４の培養培地中で約４日間培養して、後部前腸管を得ること；
後部前腸管を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．２μＭのＴＰＢ、約１０ｍＭのニコチンアミド、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第３の培養培地中で約５日間～６日間培養して、膵臓前駆細胞を得ること；
膵臓前駆細胞を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．３μＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭのＴ３、約１０μＭのＩＳＸ９、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約１０μＭのＹ２７６３２および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第２の培養培地中で約６日間培養して、膵臓内分泌前駆細胞を得ること；
膵臓内分泌前駆細胞を、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．５μＭのＲ４２８、約１μＭのＴ３、約１０μＭのフォルスコリン、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約１０μＭのＺｎＳＯ４、約２ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび約０．２５ｍＭのビタミンＣ培地を含む第１の培養物中で約２日間～６日間培養して、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を得ることを含む、方法。
多能性幹細胞を、約４．５ｍＭグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、約５０ｎＭのＰＩ１０３および約１０μＭのＹ２７６３２を補充した第６の培養培地中で約１日間、次いで、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、約０．２５ｍＭのビタミンＣを補充した第７の培養培地中で約３日間培養して、胚体内胚葉を得ること；
胚体内胚葉を、約４．５ｍＭのグルコース、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約０．５％のＢＳＡまたは１％のＢ２７、約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、約０．２５ｍＭのビタミンＣ、約５μＭのＳＢ４３１５４２および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第５の培養培地中で約２日間培養して、原始腸管を得ること；
原始腸管を、約１％のＢ２７、約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を含む第４の培養培地中で約４日間培養して、後部前腸管を得ること；
後部前腸管を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約０．２μＭのＴＰＢ、約１０ｍＭのニコチンアミド、約０．２５μＭのＳａｎｔ１および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第３の培養培地中で約５日間～６日間培養して、膵臓前駆細胞を得ること；
膵臓前駆細胞を、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．３μＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭのＴ３、約１０μＭのＩＳＸ９、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、約１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、約１０μＭのＹ２７６３２および約０．２５ｍＭのビタミンＣを含む第２の培養培地中で約６日間培養して、膵臓内分泌前駆細胞を得ること；
膵臓内分泌前駆細胞を、約１％のＢ２７、約１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、約０．５μＭのＲ４２８、約１μＭのＴ３、約１０μＭのフォルスコリン、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約１０μＭのＺｎＳＯ４、約２ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび約０．２５ｍＭのビタミンＣ培地を含む第１の培養物中で約２日間～６日間培養して、Ｃペプチド＋細胞、グルカゴン＋細胞およびソマトスタチン＋細胞を含有する機能的ｈＰＳＣ－膵島を得ることを含む、方法。
【0183】
５５．膵臓前駆細胞が膵臓内分泌前駆細胞に分化するのを誘導することにおける、ＩＳＸ９およびＷｎｔ－Ｃ５９の使用。
【0184】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示し、本発明の理解を助けるために記載されており、その後に続く特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を決して限定すると解釈されるべきではない。
以下の実施例は、本発明を例示し、本発明の理解を助けるために記載されており、その後に続く特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を決して限定すると解釈されるべきではない。
【0185】
方法
細胞供給源および培養
線維芽細胞の化学的リプログラミングによる自家製ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、１：４０希釈したマトリゲルコーティング（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３１）プレートまたはディッシュ上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号８５８５０）中で培養した。培地を毎日交換した。培養物を５～６日ごとに１：１０～１：１５の分割比でＲｅｌｅＳＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号０５８７２）によって継代した。
細胞供給源および培養
線維芽細胞の化学的リプログラミングによる自家製ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、１：４０希釈したマトリゲルコーティング（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３１）プレートまたはディッシュ上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号８５８５０）中で培養した。培地を毎日交換した。培養物を５～６日ごとに１：１０～１：１５の分割比でＲｅｌｅＳＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号０５８７２）によって継代した。
【0186】
ｈＰＳＣ－膵島を生成するためのインビトロ分化
分化前に、接着性ｈＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＲ００５）を使用して単一細胞に分散させ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３３０－０３２）ですすぎ、１０ｍＭのＹ２７６３２を補充したｍＴＥＳＲ１中のマトリゲルコーティングプレートまたはディッシュに播種した。播種の２４時間後に分化を開始した。
分化前に、接着性ｈＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＲ００５）を使用して単一細胞に分散させ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３３０－０３２）ですすぎ、１０ｍＭのＹ２７６３２を補充したｍＴＥＳＲ１中のマトリゲルコーティングプレートまたはディッシュに播種した。播種の２４時間後に分化を開始した。
【0187】
分化プロセスで使用される小分子およびサイトカインの詳細な情報を表１に列挙する。
【表1】
【0188】
各段階での培地配合は以下の通りである（特に指示しない限り、割合は体積で計算される）：
【0189】
段階１（４日間）。４．５ｍＭのグルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ７０２１）、１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０－０６１）、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２５８７－０１０）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、０．２５ｍＭのビタミンＣ、６μＭのＣｈｉｒ９９０２１、５０ｎＭのＰＩ１０３および１０μＭのＹ２７６３２を１日目にのみ供給したＭＣＤＢ１３１（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７２－０１９）。２～４日目について、培養培地を、４．５ｍＭのグルコース、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２５ｍＭのビタミンＣを含むＭＣＤＢ１３１中で毎日リフレッシュした。
【0190】
段階２（２日間）。４．５ｍＭのグルコース、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４６１２）または１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、０．２５ｍＭのビタミンＣ、５μＭのＳＢ４３１５４２および１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を供給したＭＣＤＢ１３１。
【0191】
段階３（４日間）。１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＢ２７、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、０．２５μＭのＳａｎｔ１および１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９を供給したＤＭＥＭ－塩基性（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ｃ１１９６５５００ＢＴ）。段階３の終了時に、Ａｃｃｕｔａｓｅに曝露することによって細胞を分散させた。放出された細胞をＤＭＥＭ－塩基性ですすぎ、３００ｇで３分間スピンダウンした。次いで、細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した段階４の培地中の６ウェルＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）マイクロウェルプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号２７９４０）に播種し、プレートを３００ｇで５分間遠心分離することによってマイクロウェルの底部にスピンダウンした。次いで、細胞を３７℃で２０時間、５％ ＣＯ２でインキュベートし、生成された細胞クラスタを段階４の培地を含む超低接着６ウェルプレート（Ｂｅａｖｅｒｂｉｏ、カタログ番号４０４０６）に移した。懸濁した凝集体を、インキュベーターシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ－ＨＴ、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）中、回転速度９０ｒｐｍ、３７℃、５％ ＣＯ２および湿度８５％で培養した。
【0192】
段階４（５～６日間）。１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．２μＭのＴＰＢ、１０ｍＭのニコチンアミド、０．２５μＭのＳａｎｔ１および０．２５ｍＭのビタミンＣを補充したＤＭＥＭ塩基性。
【0193】
段階５（６日間）。１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＢ２７、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、０．３μＭのＬＤＮ１９３１８９、１μＭのＴ３、１０μＭのＩＳＸ９、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、０．１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤Ｘｘｉ、１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９、１０μＭのＹ２７６３２および０．２５ｍＭのビタミンＣを補充したＤＭＥＭ塩基性。
【0194】
段階６（２～４日間）。１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のＢ２７、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、０．５μＭのＲ４２８、１μＭのＴ３、１０μＭのフォルスコリン、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１０μＭの硫酸亜鉛、２ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび０．２５ｍＭのビタミンＣを供給したＤＭＥＭ－塩基性。
【0195】
フローサイトメトリー
分化した細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一細胞懸濁液に放出し、次いで、表面マーカーおよび細胞内マーカーについて染色した。使用した抗体を表２に列挙する。
分化した細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一細胞懸濁液に放出し、次いで、表面マーカーおよび細胞内マーカーについて染色した。使用した抗体を表２に列挙する。
【表2】
【0196】
免疫組織化学および免疫蛍光染色
凍結組織切片。細胞凝集体または組織をＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡ（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、カタログ番号ＢＬ５３９Ａ）で２時間（細胞凝集体）または２４時間（組織）、４℃で固定した。サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、３０％スクロース溶液中、４℃で一晩脱水した。サンプルにＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ、カタログ番号４５８３）溶液を重ね、液体窒素を用いて凍結し、－８０℃で保存した。凍結ミクロトームを用いて１０μｍの切片を切り出し、スライド上に置いた。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ溶液（ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋５％ロバ血清）で室温にて１時間透過処理した。スライドをＰＢＳＴ溶液で希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，５５５または６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコンジュゲートした二次抗体と共にＰＢＳＴ溶液中１：１０００で１時間インキュベートし、室温で５分間ＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して画像を捕捉した。
凍結組織切片。細胞凝集体または組織をＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡ（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、カタログ番号ＢＬ５３９Ａ）で２時間（細胞凝集体）または２４時間（組織）、４℃で固定した。サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、３０％スクロース溶液中、４℃で一晩脱水した。サンプルにＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ、カタログ番号４５８３）溶液を重ね、液体窒素を用いて凍結し、－８０℃で保存した。凍結ミクロトームを用いて１０μｍの切片を切り出し、スライド上に置いた。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ溶液（ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋５％ロバ血清）で室温にて１時間透過処理した。スライドをＰＢＳＴ溶液で希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，５５５または６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコンジュゲートした二次抗体と共にＰＢＳＴ溶液中１：１０００で１時間インキュベートし、室温で５分間ＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して画像を捕捉した。
【0197】
上記で使用したすべての抗体を表３に列挙する。
【表3】
【0198】
ｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４００４）を用いて製造者の説明書に従って抽出した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＧＤＮＡ除去およびｃＤＮＡ合成スーパーミックス（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＴ３１１－０３）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＫＫ４６０１）をｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用し、これをＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムで実施した。すべての相対発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、結果をΔΔＣｔ法を用いて分析した。プライマーを表４に列挙する。
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４００４）を用いて製造者の説明書に従って抽出した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＧＤＮＡ除去およびｃＤＮＡ合成スーパーミックス（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＴ３１１－０３）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＫＫ４６０１）をｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用し、これをＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムで実施した。すべての相対発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、結果をΔΔＣｔ法を用いて分析した。プライマーを表４に列挙する。
【表4】
【0199】
グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）
クレブスバッファーを以下のように調製した：脱イオンおよび滅菌濾過水に溶解した１２９ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２％のＢＳＡ。２．８ｍＭのグルコース、１６．７ｍＭのグルコースおよび３０ｍＭのＫＣｌを含有するクレブスバッファーを調製し、３７℃に加温した。
クレブスバッファーを以下のように調製した：脱イオンおよび滅菌濾過水に溶解した１２９ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２％のＢＳＡ。２．８ｍＭのグルコース、１６．７ｍＭのグルコースおよび３０ｍＭのＫＣｌを含有するクレブスバッファーを調製し、３７℃に加温した。
【0200】
静的ＧＳＩＳ。ｈＰＳＣ－膵島（２０～５０個のクラスタ）またはヒト膵島（２０～５０個の膵島）を収集し、２４ウェルプレートに入れ、次いで、クレブスバッファーで２回すすいだ。細胞を、クレブスバッファー、２．８ｍＭのグルコースを含有するクレブスバッファー、１６．７ｍＭのグルコースを含有するクレブスバッファーおよび３０ｍＭのＫＣｌを含有するクレブスバッファー中、３７℃で１時間連続してインキュベートした。各インキュベーション後に上清を回収し、各溶液交換時に新鮮なクレブスバッファーで細胞をすすいだ。検出が行われるまで、上清サンプルを－８０℃で凍結した。アッセイ後、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を単一細胞に分散させ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数した。
【0201】
動的ＧＳＩＳ。ｈＰＳＣ－膵島の動的機能を、自動化された灌流システム（Ｂｉｏｒｅｐ（登録商標）Ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＢｉｏＲｅｐ）を用いて評価した。ｈＰＳＣ－膵島を、グルコースクレブスバッファーおよびＫＣｌクレブスバッファーに曝露し、毎分１００μＬ／分の流速で収集した流出液を用いてアッセイした。２．８ｍＭのグルコースクレブスバッファーを最初の６０分間灌流して平衡化させた。次いで、溶液を以下のように切り替えた：２．８ｍＭのグルコースクレブスバッファーを１５分間、１６．７ｍＭのグルコースクレブスバッファーを３０分間、２．８ｍＭのグルコースクレブスバッファーを１５分間、および３０ｍＭのＫＣｌクレブスバッファーを１５分間。
【0202】
ＥＬＩＳＡ
Ｃペプチド、インスリンおよびグルカゴンのレベルを、ヒトＣペプチドＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ、カタログ番号８０－ＣＰＴＨＵ－Ｅ１０）、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ、カタログ番号８０－ＩＮＳＨＵＵ－Ｅ１０）およびヒトグルカゴンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、カタログ番号１０－１２７１－０１）を製造者の説明書に従って使用して検出した。
Ｃペプチド、インスリンおよびグルカゴンのレベルを、ヒトＣペプチドＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ、カタログ番号８０－ＣＰＴＨＵ－Ｅ１０）、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ、カタログ番号８０－ＩＮＳＨＵＵ－Ｅ１０）およびヒトグルカゴンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、カタログ番号１０－１２７１－０１）を製造者の説明書に従って使用して検出した。
【0203】
電子顕微鏡法
ｈＰＳＣ－膵島は、浙江大学のＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｒｙｏ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（ＣＣＥＭ）によって処理された。グリッドをＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡で検査した。
ｈＰＳＣ－膵島は、浙江大学のＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｒｙｏ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（ＣＣＥＭ）によって処理された。グリッドをＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡で検査した。
【0204】
マウスへの移植
すべてのマウス実験手順は、北京大学（中国）の動物保護ガイダンスに従って実施した。６～８週齢の雄ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／Ｃｒｌ（Ｓｃｉｄ／Ｂｅｉｇｅ）マウスをＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ，Ｌｔｄ．から購入した。
すべてのマウス実験手順は、北京大学（中国）の動物保護ガイダンスに従って実施した。６～８週齢の雄ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／Ｃｒｌ（Ｓｃｉｄ／Ｂｅｉｇｅ）マウスをＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ，Ｌｔｄ．から購入した。
【0205】
ＳＴＺ処置糖尿病マウスへの移植。糖尿病を、５日間連続して１６時間絶食させた後、７０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｅｌｌｅｃｋ、カタログ番号Ｓ１３１２）の腹腔内注射によって誘発した。左腎被膜下におよそ３×１０６個のｈＰＳＣ－膵島細胞を移植した。１６時間の絶食後の空腹時血中グルコースレベルを、尾部出血を使用して手持ち式グルコメーター（ＲＯＣＨＥ、カタログ番号０６８７０２７９００１）で毎週モニターした。動物の体重を毎週測定した。グルコース刺激ヒトＣペプチド分泌を、１６時間の絶食後およびグルコース注射の３０分後に血液サンプルを採取することによって評価した（２ｇ／ｋｇ、３０％溶液、ｉ．ｐ．）。グルコース負荷試験のために、グルコース（２ｇ／ｋｇ、３０％溶液）の腹腔内注射を１６時間の絶食後に行い、血中グルコースレベルを所定の時点（０分、５分、１５分、３０分、６０分、９０分および１２０分）でモニターした。ヒトＣペプチド分析まで血漿を－８０℃で凍結した。
【0206】
非ＳＴＺ処置健常マウスへの移植。左腎被膜下におよそ３×１０６個のｈＰＳＣ－膵島細胞を移植した。１６時間の絶食後の血液サンプルを、空腹時ヒトＣペプチド測定のために隔週で収集した。ヒトＣペプチド分析まで血漿を－８０℃で凍結した。
【0207】
非ヒト霊長類における移植
すべてのサル実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（倫理番号：ＤＷＬＬ２０１９０８０１３）によって承認された。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅからの４匹の雄アカゲザル（４歳、４～５．５ｋｇ）をｈＣｉＰＣ－膵島移植のレシピエントとして使用した。
すべてのサル実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（倫理番号：ＤＷＬＬ２０１９０８０１３）によって承認された。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅからの４匹の雄アカゲザル（４歳、４～５．５ｋｇ）をｈＣｉＰＣ－膵島移植のレシピエントとして使用した。
【0208】
糖尿病誘発。糖尿病を、以前に報告された方法に従って誘発した。簡潔には、一晩の絶食後、単回用量のＳＴＺ（９０ｍｇ／ｋｇ、Ａｄｏｏｑ、カタログ番号Ａ１０８６８）を静脈内注射した（５分以内）。ＳＴＺを０．１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ４．３～４．５）で希釈し、直ちに静脈内に迅速に投与し、続いて水和のために通常の生理食塩水（４０～５０ｍＬ）を投与した。水和後の悪心および嘔吐を防ぐために、オメプラゾール（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｌｏｓｅｃ（登録商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ ＡＢ）を注射した。血中グルコースを、ＳＴＺ注射後の最初の１２時間にわたって１時間ごとにモニターし、その後、１日に４回モニターした。ＳＴＺ処置の３日後に外因性インスリン注射を開始した。インスリンの短時間作用型（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｉｔａｌｉａ Ｓ．ｐ．Ａ．）およびインスリンの長時間作用型（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）を皮下注射した。血中グルコース、Ｃ－ペプチドおよびＨｂＡ１ｃのレベルをｈＰＳＣ－膵島移植の前に記録した。
【0209】
移植手術。移植手順は、レシピエントサルの糖尿病状態を確認した後に行った。プロポフォール（０．５ｍＬ／ｋｇ、Ｐｅｔｓｕｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のｉ．ｖ．投与後、サルを吸入可能なイソフルランで麻酔した。心拍数、体温、血中酸素化、および血圧を外科的手順中にリアルタイムでモニターした。血中グルコースレベルを維持するために５％グルコースを注入した。開腹後、合計約４～６×１０８個のｈＰＳＣ－膵島細胞を、空腸静脈を介して門脈に注入した。
【0210】
本血栓症を軽減するために、低分子量ヘパリンナトリウム（１５０ＩＵ／ｋｇ、ｉ．ｈ．Ｆｌｕｘｕｍ（登録商標）、Ａｌｆａｓｉｇｍａ Ｓ．ｐ．Ａ．）を術後２時間および８時間に皮下注射し、続いて約１週間にわたって１日３回注射した。抗生物質処置を７日間継続した。疼痛緩和薬を細胞注入後最初の３日間投与した。
【0211】
日常的な検査。Ｃペプチド分泌、体重、ＨｂＡ１ｃ、全血球計算、血清クレアチニンおよび肝機能分析を日常的に行った。全血球計算は、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ－２００ｉを使用して行った。ＨｂＡ１ｃ、血清クレアチニンおよび肝機能分析を、Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ－２０００を使用して評価した。
【0212】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータ分析を行った。統計学的有意性をｔ検定によって評価した。全体を通して、ｎは、特に明記しない限り、生物学的複製の数を表す。Ｐ値は以下のように示される：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータ分析を行った。統計学的有意性をｔ検定によって評価した。全体を通して、ｎは、特に明記しない限り、生物学的複製の数を表す。Ｐ値は以下のように示される：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５。
【0213】
実施例１．ｈＰＳＣ－膵島の特性評価
上記のような方法によって得られたｈＰＳＣ由来膵島（ｈＰＳＣ－膵島）をインビトロで特性評価した。
上記のような方法によって得られたｈＰＳＣ由来膵島（ｈＰＳＣ－膵島）をインビトロで特性評価した。
【0214】
免疫染色は、ほとんどのＣペプチド陽性細胞が、膵臓内分泌細胞および成熟β細胞の転写因子を共発現したことを示した（図５ｄ）。分泌されたＣペプチドのレベルは、ｈＰＳＣ－膵島および初代ヒト膵島において同程度であった（図５ｅ）。重要なことに、動的二相性インスリン分泌および高密度コア結晶化インスリン顆粒の存在を伴うグルコース負荷に応答する能力は、ｈＰＳＣ－膵島の成熟インスリン分泌機能を示唆した（図５ｆおよびｇ）。
【0215】
β細胞に加えて、グルカゴン（ＧＣＧ）陽性α細胞およびソマトスタチン（ＳＳＴ）陽性δ細胞も凝集体において同定された（図１ｃ）。ＧＣＧ分泌は検出可能であり、グルコース負荷時に抑制された（図５ｈ）。フローサイトメトリー分析により、ｈＰＳＣ－膵島は、平均でおよそ６０％のβ細胞、１１％のα細胞および７％のδ細胞を含有することが明らかにされた（図１ｄ）。
【0216】
さらに、ｈＰＳＣ－膵島の機能を、日常的に使用される免疫不全マウスモデルにおいて検証した。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病マウスの腎被膜下への移植後、ｈＰＳＣ－膵島は、移植の１６週間後（ｗｐｔ）のＣペプチド＋β細胞、ＧＣＧ＋α細胞およびＳＳＴ＋δ細胞の存在によって示されるように、顕著な血管新生および保存された細胞複雑性で生存した（図１ｅおよび図５ｉ）。移植マウスの空腹時血中グルコースレベルは、体重の増加を伴って生理学的レベルに回復した（図１ｆおよび図５ｊ）。グルコース負荷試験は、グルコース応答性ヒトＣペプチド分泌ならびに迅速なグルコースクリアランスを示した（図１ｇおよび図５ｋ）。空腹時ヒトＣペプチド分泌は、２から１２ｗｐｔまで着実に増加し、その後、非糖尿病マウスにおいて約１ｎｇ／ｍＬで最大３６週間維持された（図１ｈ）。注目すべきことに、ｈＰＳＣ－膵島移植糖尿病マウスの１５週生存率は、非移植コントロール群における２０％未満と比較して、８５％超であった（図５Ｉ）。これらの結果は、ｈＰＳＣ－膵島がマウスモデルにおいて糖尿病を逆転させ得ることを示した。
【0217】
実施例２．細胞株間の適合性
さらに、確立されたプロトコルは、別の３つの独立したｈＰＳＣ細胞株に由来するｈＰＳＣ－膵島における類似したインビトロ特徴およびインビボ機能性の再現によって示される、細胞株にわたる良好な適合性を示した（図６および表５）。注目すべきことに、ｈＰＳＣ－膵島を移植したすべてのマウスにおいて、腫瘍形成が何ら認められなかった（ｎ＝１９０）。
さらに、確立されたプロトコルは、別の３つの独立したｈＰＳＣ細胞株に由来するｈＰＳＣ－膵島における類似したインビトロ特徴およびインビボ機能性の再現によって示される、細胞株にわたる良好な適合性を示した（図６および表５）。注目すべきことに、ｈＰＳＣ－膵島を移植したすべてのマウスにおいて、腫瘍形成が何ら認められなかった（ｎ＝１９０）。
【表5】
【0218】
実施例３．非ヒト霊長類モデルにおけるｈＰＳＣ－膵島移植の有効性および安全性
次に、本発明者らは、マウスモデルと比較してヒトをより厳密に模倣する非ヒト霊長類モデルにおけるｈＰＳＣ－膵島移植の有効性および安全性を調査した。
次に、本発明者らは、マウスモデルと比較してヒトをより厳密に模倣する非ヒト霊長類モデルにおけるｈＰＳＣ－膵島移植の有効性および安全性を調査した。
【0219】
４匹の健康な成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）をこの試験に使用した（表６）。４匹のマカクはいずれも、単回の高用量ＳＴＺ注射後に糖尿病を発症し、２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血中グルコースレベルおよび０．１５ｎｇ／ｍＬ（０．０９±０．０３ｎｇ／ｍＬ）未満のＣペプチドレベルをもたらした（図２ａ～ｄおよび図４ａ～ｄ）。ＳＴＺ注射の３日後に外因性インスリンを投与した。４匹の糖尿病レシピエントの外因性インスリン要求は、細胞移植の１週間前では２～４ＩＵ／ｋｇ／日（２．８９±０．５８ＩＵ／ｋｇ／日）の範囲であり、以前の報告と同等であった（図３ａ～ｄ）。すべてのマカクを集中インスリン療法で処置したが、ＳＴＺ注射後１～２ヶ月以内に糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）のレベルが３．９±０．５％から７．２±１．４％に劇的に増加し、糖尿病の急速な進行を示した（図２ｉ～ｌ）。注目すべきことに、本発明者らは、サル－＃３が、１日以内に４０～５４５ｍｇ／ｄＬの範囲の血中グルコースレベルおよび細胞移植前に４０～４５０ｍｇ／ｄＬの範囲の空腹時血中グルコースレベルで変動することによって示される、不安定な糖尿病の特徴を示すことを観察した（図２ｃ）。
【0220】
マカク移植のためのすぐに使用可能な細胞源を作製するために、本発明者らは、ｈＰＳＣ－膵島のための凍結保存および回復プロトコルを最適化した。生成後、ｈＰＳＣ－膵島を単一細胞で凍結保存し、次いで、回収し、注入の２日前に再凝集させた。回収後のｈＰＳＣ－膵島の平均生存率および収率は、それぞれ８６．９％±１．６％および８２．０％±９．５％であった（表６）。
【表6-1】
【表6-2】
【0221】
回収したｈＰＳＣ－膵島を、門脈内注入によって単回用量で糖尿病マカクに移植した。ｈＰＳＣ－膵島移植の後、４匹のレシピエントはすべて、糖尿病症候の緩和を示した（図２および３）。第１に、空腹時血中グルコースレベルが経時的に低減および安定化し（図２ａ～ｄ）、特にサル－＃４において、明らかな下方傾向が移植後１ヶ月目に観察された（図２ｄ）。第２に、平均食前血中グルコースレベルもまた、ｈＰＳＣ－膵島注入後にすべてのレシピエントにおいて有意に低減した（図２ｅ～ｈ）。したがって、糖尿病患者の血糖コントロールのための普遍的な臨床測定であるＨｂＡ１ｃは、移植前の７．２±１．４％から提出日までに平均で５．０±０．２％に低減した（図２ｉ～ｌ）。注目すべきことに、これらの改善は、ＳＴＺ注射後に不安定な糖尿病様状態を示すレシピエントであるサル－＃３でも見られた（図２ｃ、ｇおよびｋ）。まとめると、これらの結果は、ｈＰＳＣ－膵島の移植がすべての糖尿病マカクにおいて高血糖を効果的に低下させ、全体的な血糖コントロールを改善することを明らかにした。
【0222】
さらに、外因性インスリン要求は、ｈＰＳＣ－膵島移植後に劇的に低減した（図３ａ～ｄ）。ｈＰＳＣ－膵島注入の１～２週間後に、外因性インスリン要求の低下がすべてのレシピエントにおいて認められ、これは、手術後の回復期における食欲の低減および移植時付近の強い免疫抑制に起因する可能性があった。外因性インスリン要求は、通常の食事への回復時に増加した。ｈＰＳＣ－膵島が生着し、インビボで成熟するにつれて、外因性インスリン要求が徐々に低減し、経時的に安定化した。ｈＣｉＰＳＣ－膵島注入の１５週間後、４名のレシピエントにおける外因性インスリン要求は、移植前のレベルと比較して、それぞれ３１％（２．１２から１．４６ＩＵ／ｋｇ／日まで）、６０％（３．５２から１．４１ＩＵ／ｋｇ／日まで）、５４％（３．０９から１．４１ＩＵ／ｋｇ／日まで）および５２％（２．８９から１．４０ＩＵ／ｋｇ／日まで）低減した（図３ａ～ｄ）。一方、レシピエントマカクの体重は、ｈＰＳＣ－膵島注入の６週間後に増加した（図３ｅ～ｈ）。
【0223】
Ｃペプチド分泌をすべてのマカクにおいて連続的にモニターした。ｈＰＳＣ－膵島注入後の最初の１～２ヶ月以内に、すべてのレシピエントにおいて分泌されたＣペプチドレベルの漸進的な増加が観察されており、このことは、インビボでのｈＰＳＣ－膵島の機能的成熟を示唆している（図４ａ～ｄ）。さらに、Ｃペプチド分泌は、すべてのレシピエントにおいて４～８ｗｐｔから開始する食事負荷に応答した（図４ｅ～ｈ）。サル－＃２では、空腹時レベルからの食後Ｃペプチドレベルの倍数変化は、８～１６ｗｐｔまで３を超えた（図４ｆ）。Ｃペプチド分泌のレベルは８ｗｐｔ以内にピークに達し、平均分泌レベルは８ｗｐｔにおいて０．３７±０．２９ｎｇ／ｍＬであり、移植前のレベル（０．０９±０．０３ｎｇ／ｍＬ）からの顕著な増加であった（図４ｅ～ｈ）。すべてのレシピエントにおける分泌Ｃペプチドレベルの有意な増加は、血糖コントロールの観察された改善および外因性インスリン要求の低減と一致していた。
【0224】
要約すると、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞に由来する膵島が、前臨床状況において長期間生存し、高血糖を軽減し、全体的な血糖コントロールを改善することができることを実証している。第１に、ｈＰＳＣ－膵島の移植は、ＨｂＡ１ｃを効果的に低減させ、内因性Ｃペプチド分泌を回復させ（図２～４）、疾患進行のコントロールを示す肯定的な結果である。臨床研究は、ＨｂＡ１ｃのあらゆるパーセンテージポイントの減少を糖尿病関連合併症のリスクの有意な減少と関連付けている。さらに、内因性Ｃペプチドの回復もまた、臨床的膵島移植における全体的な臨床的利益に関連する主な因子として認められている。第２に、本発明者らは、不安定な糖尿病の特徴を示す１匹のレシピエントマカクがｈＰＳＣ－膵島移植から利益を受けたことを観察した（図２ｃ、ｇおよびｋ）。臨床報告は、「脆性糖尿病」患者における主に生命を脅かす症候である難治性低血糖が臨床的膵島細胞移植で解消され得るという強い証拠を示した。より多くの動物を試験すべきであるが、本発明者らのデータは、この選択された群の不安定な糖尿病患者における血糖コントロールの改善および重度の低血糖の矯正におけるｈＰＳＣ－膵島注入の可能性を示唆している。最後に、効率的に凍結保存される能力は、ｈＰＳＣ－膵島を一貫して利用可能なすぐに使用可能な細胞供給源にし、これは臨床用途にとって特に重要であり、ヒトへの移植において非常に必要な柔軟性を与える。まとめると、糖尿病の霊長類モデルにおけるｈＰＳＣ－膵島の長期評価に関する最初の包括的な報告として、この研究で得られたデータは、糖尿病処置のための臨床研究における幹細胞由来膵島についての有益な洞察を提供することができた。
【0225】
本開示は、その実施形態を参照して上述されている。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって様々な修正、変更、および追加を行うことができることを理解されたい。したがって、本開示の範囲は、上記の特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】