特表 2024-543248 トランスジェニック哺乳動物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-20

(54)【発明の名称】トランスジェニック哺乳動物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/0276 20240101AFI20241113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20241113BHJP

   C12N 5/12 20060101ALI20241113BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20241113BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241113BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20241113BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20241113BHJP

【ＦＩ】

A01K67/0276 ZNA

C12N5/10

C12N5/0781

C12N5/12

C07K16/18

C12N5/0735

C12P21/08

C07K1/14

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527321

(86)(22)【出願日】2022-11-09

(85)【翻訳文提出日】2024-07-05

(86)【国際出願番号】 US2022079533

(87)【国際公開番号】W WO2023086815

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/263,855

(32)【優先日】2021-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518278007

【氏名又は名称】トリアニ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔｒｉａｎｎｉ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】バロウズ，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー，ヴェルナー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァプル，マティアス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE00

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA00

(57)【要約】

本開示は、ネコ可変ドメインを有する免疫グロブリンを発現するトランスジェニック哺乳動物を記載し、治療用のネコ抗体の開発のためのネコ可変ドメインを有する免疫グロブリンを発現するトランスジェニックげっ歯類を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

内在性げっ歯類免疫グロブリン可変遺伝子座が欠失し、かつネコ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列を含む部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座および内在性げっ歯類免疫グロブリン可変遺伝子座に基づく非コード調節配列と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類であって、
トランスジェニックげっ歯類の部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が機能的であり、かつネコ可変ドメイン領域およびげっ歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン鎖を発現する、トランスジェニックげっ歯類。

【請求項2】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列を含む、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項3】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、ネコカッパＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列、ネコラムダＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列、またはその組み合わせを含む、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項4】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ、ネコカッパＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列、ネコラムダＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列、またはその組み合わせを含む、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項5】

げっ歯類がマウスである、請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項6】

非コード調節配列が、各Ｖ遺伝子セグメントに先行するプロモーター、スプライス部位、およびＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成のための組換えシグナル配列を含む、請求項１から５のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項7】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、ＡＤＡＭ６遺伝子をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項8】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、Ｐａｘ－５活性化遺伝子間反復（ＰＡＩＲ）エレメントをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項9】

部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が、重鎖遺伝子間制御領域１由来のＣＴＣＦ結合部位をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類。

【請求項10】

請求項１から９のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類由来のＢリンパ球系譜細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載のＢリンパ球系譜細胞に由来するハイブリドーマ細胞。

【請求項12】

請求項１０に記載のＢリンパ球系譜細胞に由来する不死化細胞。

【請求項13】

請求項１０に記載のＢリンパ球系譜細胞、請求項１１に記載のハイブリドーマ、または請求項１２に記載の不死化細胞由来のネコ可変ドメインおよびげっ歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全部。

【請求項14】

請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯類を生成するための方法であって、
ａ）げっ歯類細胞のゲノムにおいて、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座の上流に部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的部位を、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座の下流に部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的部位を組み込むこと、ここで、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座は、（ｉ）Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、（ｉｉ）ＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、（iii）ＶλおよびＪλ遺伝子セグメント、または（ｉｖ）ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントおよびＣλ遺伝子を含む、
ｂ）部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むベクターを供給すること、ここで、部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々はネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子コード配列およびげっ歯類の非コード調節配列を含み、部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座は部位特異的リコンビナーゼの標的部位に挟まれており、標的部位はステップａ）でげっ歯類細胞に導入された標的部位と組換え可能である、
ｃ）ステップｂ）のベクターおよび標的部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入すること、
ｄ）前記細胞のゲノムと部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座との間で組換えイベントが起こるようにし、その結果、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座が部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座と置換されること、
ｅ）ステップｄ）で生成された部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を含む細胞を選択すること、および、
ｆ）前記細胞を用いて、部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を含むトランスジェニックげっ歯類を創出すること、
を含む方法。

【請求項15】

細胞がげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

細胞がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

導入ステップの後、供給ステップの前に、標的部位の第１セットを認識するリコンビナーゼの導入によって内在性免疫グロブリン可変遺伝子座を欠失させるステップをさらに含み、ここで、欠失させるステップは、げっ歯類細胞のゲノムにおいて互いに組換えできない少なくとも２つの標的部位を所定の位置に残す、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

ベクターがネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

ベクターがκまたはλのいずれかのＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む、請求項１４から１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

ベクターが、内在性の宿主起源のＶ遺伝子プロモーター、スプライス部位および組換えシグナル配列をさらに含む、請求項１４から１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

ベクターがＡＤＡＭ６遺伝子をさらに含む、請求項１４から２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

ベクターがＰａｘ－５活性化遺伝子間反復エレメントをさらに含む、請求項１４から２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

ベクターが重鎖遺伝子間制御領域１由来のＣＴＣＦ結合部位をさらに含む、請求項１４からから２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

治療的または診断的使用のための抗体を生産する方法であって、
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類の抗体産生細胞からクローニングされたネコ可変ドメインを有する抗体を発現させること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、ネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列およびげっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列を含む；および、
（ｉｉ）治療的または診断的使用にとって適しているネコ可変ドメインを有する抗体を単離すること、
を含む方法。

【請求項25】

抗体がトランスジェニックげっ歯類のＢ細胞からクローニングされる、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

請求項２４または２５に記載の方法によって生産された治療用または診断用抗体。

【請求項27】

ネコ可変ドメインを有する治療用または診断用抗体を生産する方法であって、
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類由来の抗体産生細胞によって発現される抗体のネコ可変ドメインをクローニングすること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、ネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列およびげっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列を含む；および
（ｉｉ）トランスジェニックげっ歯類によって発現された抗体のネコ可変ドメインを含む治療用または診断用抗体を生産すること、
を含む方法。

【請求項28】

ネコ可変ドメインが、トランスジェニックげっ歯類由来のＢ細胞によって発現される抗体からクローニングされる、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項２７または２８に記載の方法によって生産された治療用または診断用抗体。

【請求項30】

ネコ可変ドメインを含むモノクローナル抗体を生産する方法であって、
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類由来のＢ細胞を供給すること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、げっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列に埋め込まれたネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列を含む；
（ｉｉ）Ｂ細胞を不死化すること；および
（ｉｉｉ）不死化Ｂ細胞によって発現されるネコ可変ドメインを含むモノクローナル抗体またはその抗体をコードする遺伝子を単離すること、
を含む方法。

【請求項31】

（ｉｖ）Ｂ細胞によって発現されるネコ可変ドメインをクローニングすること；および
（ｖ）トランスジェニックげっ歯類のＢ細胞からクローニングされたネコ可変ドメインを含む治療用または診断用抗体を生産すること、
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ネコ可変ドメインを含む抗体を生産する方法であって、内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類を供給することを含み、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、げっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列に埋め込まれたネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列を含み、トランスジェニックげっ歯類の免疫グロブリン遺伝子座は、ネコ可変ドメインを含む抗体を発現する、方法。

【請求項33】

トランスジェニックげっ歯類によって発現されるネコ可変領域を含む抗体またはその抗体をコードする遺伝子を単離することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

（ｉ）標的抗原に対して特異的である抗体を発現するトランスジェニックげっ歯類からＢ細胞を取得すること；
（ｉｉ）Ｂ細胞を不死化すること；および
（ｉｉｉ）不死化Ｂ細胞から標的抗原に対して特異的である抗体を単離すること、
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

特定の抗原に対して特異的であるＢ細胞からネコ可変領域をクローニングすることをさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記Ｂ細胞からクローニングされたネコ可変領域を用いて治療用または診断用抗体を生産することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

請求項３２から３６のいずれかに記載の方法によって生産された治療用または診断用抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリン分子の生産に関し、ネコモノクローナル抗体の生成のための抗原特異的抗体分泌細胞を産生可能なトランスジェニック哺乳動物を生成するための方法を含む。

【背景技術】

【0002】

以下の説明では、背景と導入の目的で、ある特定の論文および方法について記載する。ここに含まれるいかなる内容も、先行技術を「認める」として解釈されるものではない。出願人は、適切な場合には、本明細書で言及された論文および方法が、適用される法令規定の下で先行技術に該当しないことを証明する権利を明示的に留保する。

【0003】

抗体は、（ｉ）多様な分子形態の抗原を標的とできる精巧な結合特性を示すこと、（ｉｉ）処置されたヒトや動物において忍容性が高く、望ましい薬物動態を示す生理的分子であること、（ｉｉｉ）感染媒介物を自然に排除する強力な免疫学的特性を有することから、重要な生物学的医薬品として登場した。さらに、実験動物から抗体を迅速に単離する確立した技術も存在し、体内には本来存在しない実質的にあらゆる外来物質に対して、特異的な抗体反応を容易に起こすことができる。

【0004】

その最も基本的な形では、抗体は２本の同一の重鎖（Ｈ）を含み、それぞれ同一の軽鎖（Ｌ）と対になっている。Ｈ鎖およびＬ鎖のＮ末端の両方に、可変ドメイン（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）があり、対のＨ－Ｌ鎖にユニークな抗原結合特異性をもたらしている。

【0005】

抗体のＶ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域をコードするエキソンは生殖系列のＤＮＡには存在しない。代わりに、各Ｖ_Ｈエキソンは、免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座に存在するランダムに選択されたＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの遺伝子再構成によって生成される。同様に、各Ｖ_Ｌエキソンは、軽鎖遺伝子座に存在するランダムに選択されたＶ_ＬとＪ_Ｌ遺伝子セグメントの染色体再構成によって生成される。

【0006】

哺乳動物では通常、Ｈ鎖を発現する２つの対立遺伝子、カッパ（κ）Ｌ鎖を発現する２つの対立遺伝子、ラムダ（λ）Ｌ鎖を発現する２つの対立遺伝子（それぞれの親から１つずつの対立遺伝子）がゲノムに含まれる。免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座には複数のＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントがあり、免疫グロブリンκ（ＩＧＫ）および免疫グロブリンλ（ＩＧＬ）Ｌ鎖遺伝子座にも複数のＶ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントがある(Collins and Watson (2018) Immunoglobulin Light Chain Gene Rearrangements, Receptor Editing and the Development of a Self-Tolerant Antibody Repertoire. Front. Immunol. 9:2249. (doi: 10.3389/fimmu.2018.02249))。

【0007】

重鎖遺伝子座には、異なる抗体クラス（アイソタイプ）を発現するためのエキソンも存在する。例えばネコ動物では、コードされるアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２、ＩｇＥ、およびＩｇＡ２である。

【0008】

Ｂ細胞の発生中、まずＨ鎖可変遺伝子セグメントを含む２本の相同染色体のうちの１本で遺伝子再配列が起こる。プレＢ細胞では、得られたＶ_Ｈエキソンは続いて、ＩｇＭ Ｈ鎖（μＨ鎖）発現のために、ＲＮＡレベルでＣ_μエキソンにスプライシングされる。プレＢ細胞によって合成されたμＨ鎖の大部分は小胞体（ＥＲ）に保持され、μＨ鎖の部分的にフォールディングされていないＣ_Ｈ１領域と小胞体常在シャペロンＢｉＰとの非共有結合的相互作用によって最終的に分解される(Haas and Wabl, Nature, 306:387-9, 1983; Bole et al., J Cell Biol. 102:1558, 1986)。しかし、ごく一部のμＨ鎖は、不変のλ５タンパク質とＶｐｒｅＢタンパク質を含む代替軽鎖複合体と会合する。この会合がＢｉＰを置換し、μＨ鎖／λ５／ＶｐｒｅＢ複合体がＩｇα／βシグナル分子ヘテロ二量体とともにプレＢ細胞受容体（ｐｒｅＢＣＲ）としてＥＲを出て、分泌経路を介して細胞膜まで輸送されることを可能にする。

【0009】

その後、機能的なＬ鎖が産生されるまで、Ｖ_Ｌ－Ｊ_Ｌの再構成がＬ鎖対立遺伝子に一度に起こり、その後、Ｌ鎖ポリペプチドはＩｇＭ Ｈ鎖ホモダイマーと会合して、完全に機能的な抗原特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を形成し、未熟Ｂ細胞の表面に発現する。

【0010】

未熟Ｂ細胞は二次リンパ臓器に移動し、そこで同族抗原に反応できる成熟Ｂ細胞に分化し、抗体分泌形質細胞やメモリーＢ細胞に分化する。Ｔ細胞の助けを借りて、Ｂ細胞は抗体のアイソタイプをＩｇＭからＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥに変化させるアイソタイプスイッチングや、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列を変化させる体細胞超変異を起こすことができる。これらの変異はＶ_ＨおよびＶ_Ｌエキソンにランダムに導入されるが、免疫抗原に対して高い親和性を有するＢ細胞は、免疫抗原に対する親和性が低いか全くないＢ細胞に比べて、抗原をより多く取り込み、抗原を処理し、およびＴ濾胞ヘルパー細胞に抗原を提示できるため、優先的に活性化される。その結果、体細胞超変異は相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３に濃縮されるようになるが、それはこれらが抗原と相互作用するＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域の領域だからである。

【0011】

様々なマウス免疫グロブリンをコードする遺伝子は、広範囲にわたって特徴付けられてきた。例えば、BlankensteinとKrawinkelはマウスの可変重鎖領域についてEur.J. Immunol., 17:1351-1357(1987)に記載している。ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関する情報は少ないが、リンパ系の悪性腫瘍やウイルスに対する反応の研究では、Ｖ_Ｈ領域配列がいくつか含まれている［例えば、Routら、Vet. Clin. Pat. 45:48 Suppl. 1 (2019) および Luら、 Scientific Reports 7:12713 (2017)]。Luらはまた、ネコＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２、およびＩｇＡの配列も特徴付けた。ネコカッパＬＣ遺伝子座とラムダＬＣ遺伝子座は広範に特徴づけられ、ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）情報システムで完全にアノテーションされている。

【0012】

変化した免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスなどのトランスジェニック動物の生成は、このようなトランスジェニック動物を様々な研究開発用途、例えば創薬および様々な生物学的システムの基礎研究への利用を可能にした。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスの生成は、国際出願番号WO 90/10077およびWO 90/04036に記載されている。WO 90/04036には、ヒト免疫グロブリン「ミニ」遺伝子座を組み込んだトランスジェニックマウスが記載されている。WO 90/10077には、トランスジェニック動物の生成に使用する免疫グロブリン支配的制御領域(immunoglobulin dominant control region)を含むベクターが記載されている。

【0013】

マウスの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を、例えばヒト免疫グロブリン配列で改変し、創薬目的の部分的または完全なヒト抗体を創出する方法が数多く開発されてきた。このようなマウスの例としては、例えば、米国特許第7,145,056；7,064,244；7,041,871；6,673,986；6,596,541；6,570,061；6,162,963；6,130,364；6,091,001;6,023,010；5,593,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318；5,789,650；5,661,016；5,612,205；および5,591,669に記載されているものを含む。

【0014】

薬として機能する抗体の使用は、ヒトの疾患の予防または治療に限定されない。ネコなどの家畜は、例えば癌、アトピー性皮膚炎、および慢性疼痛など、ヒトの疾患に似た疾患を患う。神経成長因子を標的とするモノクローナル抗体（ｂｅｄｉｎｖｅｔｍａｂ）は、すでにネコの変形性関節症の処置のために獣医学的使用がされているが、癌またはアトピー性皮膚炎の処置に対してはまだ認可されていない。しかし、臨床使用の前に、マウスで作られたモノクローナル抗体をネコ化する必要があった。すなわち、レシピエントであるネコの有害な免疫反応を防ぐために、アミノ酸配列をマウスからネコへと変更する必要があった。

【発明の概要】

【0015】

この概要は、以下の詳細な説明でさらに記載する概念の抜粋を簡略化して紹介するために提供される。本概要は、特許請求される保護対象の重要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、特許請求される保護対象の範囲を限定するために使用することを意図したものでもない。特許請求される保護対象の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面に図示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【0016】

本明細書は、ネコ免疫グロブリン可変領域を有するマウス抗体を生産するための方法を記載する。一態様において、トランスジェニック哺乳動物またはインビトロ細胞培養で生産できるネコ可変領域を有する抗体が提供される。

【0017】

一態様において、非ネコ哺乳動物細胞または非ネコ哺乳動物が提供され、そのゲノムは異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座(heterologous partly feline immunoglobulin locus)を含む。一態様において、異種遺伝子座はネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子のコード配列および非ネコ哺乳動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づく非コード配列を含む。一態様において、非ネコ哺乳動物細胞または哺乳動物は、ネコ重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）可変領域ならびに非ネコ哺乳動物宿主細胞または哺乳動物に内在する定常領域を含む、キメラＢ細胞受容体（ＢＣＲ）または抗体を発現できる。一態様において、トランスジェニック哺乳動物宿主細胞または哺乳動物は、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部または全部が除去されたゲノムを有する。

【0018】

非ネコ哺乳動物宿主でキメラネコモノクローナル抗体を生産するためには、宿主ゲノムはキメラネコ免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖を発現する遺伝子座を少なくとも１つ有する必要がある。一態様において、宿主ゲノムは、キメラネコ免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をそれぞれ発現する１つの重鎖遺伝子座および２つの軽鎖遺伝子座を含む。

【0019】

いくつかの態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｈコード配列および非ネコ哺乳動物宿主の内在性Ｖ_Ｈ遺伝子座に存在する非コード配列を含む。いくつかの態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｈコード配列、および非ネコ哺乳動物宿主の内在性Ｖ_Ｈ遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列、ならびに非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメント中に存在する非コード配列を含む。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列、ならびに非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントに存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。

【0020】

他の態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｌコード配列および非ネコ哺乳動物宿主の内在性Ｖ_Ｌ遺伝子座に存在する非コード配列を含む。他の態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｌコード配列および非ネコ哺乳動物宿主の内在性Ｖ_Ｌ遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｌコード配列およびネコＪ_Ｌ遺伝子セグメントコード配列、ならびに非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントに存在するおよび非コード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｌコード配列およびネコＪ_Ｌ遺伝子セグメントコード配列、ならびに非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントに存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。

【0021】

一態様において、非ネコ哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスまたはラットである。

【0022】

一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む非ネコ哺乳動物細胞を生成する方法が提供される。一態様において、本方法は以下を含む：ａ）非ネコ哺乳動物宿主細胞のゲノムに２つ以上のリコンビナーゼ標的部位を導入し、内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子、Ｄ_Ｈ遺伝子、およびＪ_Ｈ遺伝子、または内在性Ｖ_Ｌ遺伝子およびＪ_Ｌ遺伝子を含むゲノム領域の上流に少なくとも１つの部位、下流に少なくとも１つの部位を組み込むこと、ｂ）非ネコ哺乳動物宿主細胞に、リコンビナーゼ仲介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介して、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子、またはネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子のコード配列、および非ネコ哺乳動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に存在する非コード配列に基づく非コード配列を含む、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を導入すること。

【0023】

別の態様において、この方法は、ＲＭＣＥを介して非ネコ哺乳動物宿主細胞に異種部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を導入する前に、２つの異種リコンビナーゼ標的部位に挟まれる宿主動物のゲノム中の内在性免疫グロブリン可変領域を欠失させることを含む。

【0024】

一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列、ネコＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列、ならびに非ネコ哺乳動物宿主のゲノムにおける内在性Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントの上流に存在する配列に基づくネコＤ_Ｈ遺伝子セグメントの上流の非コード調節配列またはスキャフォールド配列（Ｐｒｅ－Ｄ配列、図１）を含む。一態様において、上流のスキャフォールド配列は、雄の生殖能力に関係するＡｄａｍ６ａ（図１）などの非免疫グロブリン遺伝子を含む［Nishimuraら、Developmental Biol. 233(1): 204-213 (2011)]。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、同じ染色体上の内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子座の上流および内在性Ｊ_Ｈ遺伝子座の下流にあらかじめ導入されたリコンビナーゼ標的部位を用いて宿主細胞に導入される。

【0025】

一態様において、スキャフォールド配列は他の生物種由来の天然に存在する核酸配列を含む。一態様において、スキャフォールド配列は、他の生物種由来の天然に存在する核酸配列に基づいて設計でき、例えば、スキャフォールド配列は、例えば、１つ以上の核酸置換、挿入、欠失、または他の修飾によって修飾された他の生物種由来の天然に存在する核酸配列を含むことができる。一態様において、スキャフォールド配列は人工配列を含むことができる。一態様において、スキャフォールド配列は、ネコゲノムの免疫グロブリン遺伝子座に存在する配列と他の配列、例えば他の種のスキャフォールド配列とを組み合わせたものを含む。

【0026】

別の態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコ免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子セグメントコード配列、ネコＪ_Ｌ遺伝子セグメントコード配列、および非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性Ｌ鎖遺伝子座に存在する非コード配列に基づく非コード配列を含む。一態様において、非コード配列には調節配列またはスキャフォールド配列が含まれる。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、同じ染色体上の内在性免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子座の上流および内在性Ｊ_Ｌ遺伝子座の下流にあらかじめ導入されたリコンビナーゼ標的部位を用いて宿主細胞に導入される。

【0027】

一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は単一核酸として合成され、単一核酸領域として非ネコ哺乳動物宿主細胞に導入される。異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、２つ以上の連続したセグメントで合成され、哺乳動物宿主細胞に別々のセグメントとして導入されることもある。異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、非ネコ哺乳動物宿主細胞に導入する前に、組換え法を用いて生産し、単離することもできる。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座は、以下のようにインシリコで作製できる。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座のゲノム配列を、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列と同様に、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎまたはＴｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ （ＩＭＧＴ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍから取得する。マウスのＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列は、例えば市販のソフトウェアを用いて、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列とインシリコ置換される。有利には、Ｖ_Ｈ、Ｄ、およびＪ_Ｈコード配列は、介在するマウスの非コード配列をそのまま残して置換することができる。同様に、部分的ネコ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座は、以下のようにインシリコで作製できる：マウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のゲノム配列、ならびにネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎまたはＴｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ （ＩＭＧＴ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍから取得する。マウスのＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列は、例えば市販のソフトウェアを用いて、ネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列とインシリコ置換される。ここでも、Ｖ_ＬとＪ_Ｌのコード配列は、間にあるマウスの非コード配列をそのまま残して置き換えることができる。インシリコ配列に基づいて、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むＤＮＡ配列を合成する方法が知られている。

【0028】

別の態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む非ネコ哺乳動物細胞を生成する方法が提供される。一態様において、本方法は以下を含む：ａ）非ネコ哺乳動物宿主細胞のゲノムに、互いに組換え不可能な２つ以上の配列特異的組換え部位を導入することであって、少なくとも１つの組換え部位が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上流に導入され、少なくとも１つの組換え部位が同じ内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の下流に導入されること；ｂ）ｉ）ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子コード配列、およびｉｉ）宿主細胞ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づく非コード調節配列またはスキャフォールド配列を有する、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むベクターを供給すること、ここで、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、宿主細胞の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を挟んでいるものと同じ２つの配列特異的組換え部位によって挟まれている；ｃ）ステップｂ）のベクターおよび２つの組換え部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを宿主細胞に導入すること；ｄ）細胞のゲノムと異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座との間で組換えイベントが起こるようにし、その結果、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座と置換されるようにすること。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子セグメントコード配列、ならびにｉ）ネコＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列、ｉｉ）非ネコ哺乳動物宿主のゲノム中に内在的に存在する各Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを挟んでいる非コード調節配列またはスキャフォールド配列、およびｉｉｉ）非ネコ哺乳動物宿主細胞の内在性ゲノムに基づくプレＤ配列を含む。一態様において、リコンビナーゼ標的部位は、内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子座の上流および内在性Ｊ_Ｈ遺伝子座の下流に導入される。

【0029】

一態様において、げっ歯類の内在性免疫グロブリン可変遺伝子座が欠失し、げっ歯類の内在性免疫グロブリン可変遺伝子座に基づくネコ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列および非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類が提供される。一態様において、トランスジェニックげっ歯類の異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は機能的であり、ネコ可変ドメイン領域とげっ歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン鎖を発現する。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコカッパ（κ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコラムダ（λ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、トランスジェニックげっ歯類由来のＢリンパ球系譜細胞が提供される。一態様において、Ｂリンパ球系譜細胞から得られたネコ可変ドメインおよびげっ歯類定常ドメイン配列を含む免疫グロブリン分子の一部または全体が提供される。一態様において、Ｂリンパ球系譜細胞に由来するハイブリドーマ細胞が提供される。一態様において、ハイブリドーマ細胞由来のネコ可変ドメインとげっ歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全体が提供される。一態様において、Ｂリンパ球系譜細胞に由来する不死化細胞が提供される。一態様において、不死化細胞由来のネコ可変ドメインとげっ歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全体が提供される。一態様において、トランスジェニックげっ歯類が提供され、ここで、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、トランスジェニックげっ歯類が提供され、この場合、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座はネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコカッパ（κ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコラムダ（λ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、げっ歯類はマウスである。一態様において、非コード調節配列は、内在性の宿主の以下の配列の１つ以上を含む：各Ｖ遺伝子セグメントに先行するプロモーター、スプライス部位、およびＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成のための組換えシグナル配列。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、内在性の宿主の以下の配列の１つ以上をさらに含む：ＡＤＡＭ６遺伝子、Ｐａｘ－５－活性化遺伝子間反復（ＰＡＩＲ）エレメント、および重鎖遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１）からのＣＴＣＦ結合部位。

【0030】

一態様において、非ネコ細胞は哺乳動物細胞である。一態様において、非ネコ哺乳動物細胞は哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0031】

一態様において、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座で置換された非ネコ哺乳動物細胞が選択され、単離される。一態様において、細胞は非ネコ哺乳動物ＥＳ細胞、例えばげっ歯類ＥＳ細胞である。一態様において、少なくとも１つの単離された非ネコ哺乳動物細胞を用いて、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現するトランスジェニック非ネコ哺乳動物を創出する。一態様において、少なくとも１つの単離された非ネコ哺乳動物ＥＳ細胞を用いて、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現するトランスジェニック非ネコ哺乳動物を創出する。

【0032】

一態様では、トランスジェニックげっ歯類を生成する方法が提供される。一態様において、この方法は以下を含む：ａ）げっ歯類細胞のゲノムの内在性免疫グロブリン可変遺伝子座の上流に部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的部位を、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座の下流に部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的部位を組み込むこと。一態様において、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座はＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。一態様において、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座は、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含む。一態様において、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座は、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。一態様において、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座はＶλ、Ｊλ遺伝子セグメントおよびＣλ遺伝子を含む。一態様において、この方法は以下を含む：ｂ）異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むベクターを供給すること。一態様において、前記異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、キメラネコ免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子セグメントの各々は、ネコ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列およびげっ歯類の非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座は、部位特異的リコンビナーゼの標的部位に挟まれている。一態様において、標的部位はげっ歯類細胞に導入された標的部位と組換え可能である。一態様において、この方法は以下を含む：ｃ）ベクターと標的部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼをげっ歯類細胞に導入すること。一態様において、この方法は以下を含む：ｄ）細胞のゲノムと異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座との間で組換えイベントが起こるようにすることであって、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座が異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座と置換されるようにすること。一態様において、この方法は以下を含む：ｅ）ステップｄ）で生成された異種部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を含む細胞を選択すること；およびその細胞を用いて、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変遺伝子座を含むトランスジェニックげっ歯類を創出すること。一態様において、細胞はげっ歯類胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。一態様において、細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0033】

一態様において、この方法は、ステップａ）の後、ステップｂ）の前に、標的部位の第１セットを認識するリコンビナーゼを導入することにより、内在性免疫グロブリン可変遺伝子座を欠失させるステップをさらに含み、ここで、欠失させるステップは、げっ歯類細胞のゲノムにおいて互いに組換えできない標的部位の少なくとも１つのセットを所定の位置に残す。一態様において、ベクターはネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈのコード配列を含む。一態様において、ベクターはネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ネコカッパ（κ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、ラムダ（λ）Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列を含む。一態様において、ベクターはさらに、プロモーター、スプライス部位、および組換えシグナル配列のうちの１つ以上を含む。

【0034】

一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むトランスジェニック非ネコ哺乳動物を生成する方法が提供される。一態様において、この方法は、ａ）非ネコ哺乳動物宿主細胞のゲノムに、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を挟み、互いに組換え不可能な１つ以上の配列特異的組換え部位を導入すること、を含む。一態様において、この方法は、ｂ）ｉ）ネコ可変領域遺伝子コード配列、およびｉｉ）内在性宿主免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づく非コード調節配列またはスキャフォールド配列を有する、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むベクターを供給すること、を含む。一態様において、コード配列および非コード調節配列またはスキャフォールド配列は、ａ）の宿主細胞のゲノムに導入されたものと同じ配列特異的組換え部位によって挟まれている。一態様において、この方法は、ｃ）ステップｂ）のベクターと、１組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入すること、を含む。一態様において、この方法は、ｄ）ａ）の細胞のゲノムと異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換えイベントが起こるようにすること、を含む。一態様において、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座と置換される。一態様において、この方法は、ｅ）部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞を選択すること；およびｆ）その細胞を用いて、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック哺乳動物を創出すること、を含む。

【0035】

一態様において、トランスジェニック非ネコ哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスやラットである。

【0036】

一態様において、少なくとも１０^３の多様なライブラリーメンバーを含む免疫グロブリンライブラリー（レパートリーとも呼ばれる）が提供される。

【0037】

一態様において、本明細書に記載される部分的ネコ抗体を含む抗体のレパートリーが提供される。一態様において、レパートリーには、それぞれが同じ標的抗原を特異的に認識する多様な抗体が含まれる。このようなレパートリーは、同じ抗体タイプまたは構造の抗体ライブラリーと呼ぶことができ、抗体は抗原結合部位が異なり、例えば、同じエピトープを認識する親抗体の抗体バリアントを生成する。一態様において、抗体ライブラリーは、親和性成熟した、または他の方法で最適化された抗体バリアントを含む。一態様において、抗体ライブラリーは、標的抗原を特異的に認識するが、かかる抗原の異なるエピトープを特異的に認識する抗体を含む。

【0038】

一態様において、抗体レパートリーがスクリーニングされ、各ライブラリーメンバーが、例えば抗体産物を生産するために、所望の構造的または機能的特性に従って選択される。

【0039】

一態様において、本明細書に記載した部分的ネコ抗体を含む抗体のレパートリーが提供される。一態様において、レパートリーには、異なる標的抗原を認識する多様な抗体が含まれる。一態様において、レパートリーは、非ネコ哺乳動物を多成分抗原で免疫することによって得られ、多成分抗原は、ウイルスや細菌を含むが、これらに限定されるものではなく、多くの異なる標的抗原を有することができ、それぞれの抗原が複数のエピトープを含むことができる。

【0040】

一態様において、レパートリーは抗体のナイーブライブラリーであり、これは「プレ免疫レパートリー」とも呼ばれる。一態様において、プレ免疫レパートリーは、骨髄から最近出てきた成熟しているが抗原未経験のＢ細胞によって発現される。

【0041】

一態様において、抗体のレパートリーは、各々異なる抗原結合部位によって特徴付けられる、少なくとも約１０^３抗体、例えば少なくとも約１０^４、約１０^５、約１０^６ _、または約１０^７を包含する多様性によって特徴付けられることができる。

【0042】

一態様において、ネコ可変領域遺伝子コード配列および宿主ゲノムの内在性非ネコ免疫グロブリン遺伝子座に基づく非コード調節配列またはスキャフォールド配列を有する異種免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現する非ネコ哺乳動物細胞が提供される。一態様において、非ネコ哺乳動物細胞は、非ネコ哺乳動物細胞または哺乳動物に内因性のそれぞれの定常領域と結合した完全ネコＨ鎖またはＬ鎖可変ドメインを含むキメラ抗体を発現する。

【0043】

一態様において、ネコ可変領域遺伝子コード配列および宿主ゲノムの内在性非ネコ免疫グロブリン遺伝子座に基づく非コード調節配列またはスキャフォールド配列を有する異種免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現する非ネコトランスジェニック哺乳動物が提供される。一態様において、非ネコトランスジェニック哺乳動物は、非ネコ哺乳動物細胞または哺乳動物に内在性のそれぞれの定常領域と結合した完全ネコ型Ｈ鎖またはＬ鎖可変ドメインを含むキメラ抗体を発現する。

【0044】

一態様において、完全ネコ可変配列を有する部分的ネコ抗体を発現可能なトランスジェニック非ネコ哺乳動物由来のＢ細胞が提供される。一態様において、特定の抗原に特異的なモノクローナル抗体の供給源として不死化Ｂ細胞が提供される。

【0045】

一態様において、診断、予防、および治療用の抗体の生産または最適化に使用するための、Ｂ細胞からクローニングされたネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子配列が提供される。

【0046】

一態様において、完全ネコ免疫グロブリン可変領域配列を有する部分的ネコモノクローナル抗体を産生可能な非ネコハイブリドーマ細胞が提供される。

【0047】

一態様において、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマからＨ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン可変ドメインをコードするＶ_ＨおよびＶ_Ｌエキソンを除去し、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌエキソンをネコ定常領域を含むように改変し、それにより、ネコに注射しても免疫原性を示さない完全ネコ抗体を生成する方法が提供される。

【0048】

一態様において、治療用または診断用のネコ抗体を生産する方法が提供される。
一態様において、この方法は以下を含む：
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む異種免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類の抗体産生細胞からクローニングされたネコ可変ドメインを有する抗体を発現させること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、ネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列およびげっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列を含む；および、
（ｉｉ）治療的または診断的使用にとって適しているネコ可変ドメインを有する抗体を単離すること。

【0049】

一態様において、抗体はトランスジェニックげっ歯類のＢ細胞からクローニングされる。一態様において、げっ歯類はマウスである。一態様において、本明細書に記載の方法によって生産される治療用または診断用抗体が提供される。

【0050】

一態様において、ネコ可変ドメインを有する治療または診断用抗体を生産する方法が提供される。一態様において、この方法は以下を含む：
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む異種免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類由来の抗体産生細胞によって発現される抗体のネコ可変ドメインをクローニングすること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、ネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列およびげっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列を含む；および
（ｉｉ）トランスジェニックげっ歯類によって発現された抗体のネコ可変ドメインを含む治療用抗体または診断用抗体を生産すること。

【0051】

一態様において、ネコ可変ドメインは、トランスジェニックげっ歯類のＢ細胞によって発現された抗体からクローニングされる。一態様において、げっ歯類はマウスである。一態様において、本明細書に記載の方法によって生産される治療用抗体または診断用抗体が提供される。

【0052】

一態様において、ネコ可変ドメインを含むモノクローナル抗体を生産する方法が提供される。一態様において、この方法は以下を含む：
（ｉ）内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む異種免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類由来のＢ細胞を供給すること、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、げっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列に埋め込まれたネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列を含む；
（ｉｉ）Ｂ細胞を不死化すること；および
（ｉｉｉ）不死化Ｂ細胞によって発現されるネコ可変ドメインを含むモノクローナル抗体またはその抗体をコードする遺伝子を単離すること。

【0053】

一態様において、この方法は以下のステップを含む：
（ｉｖ）Ｂ細胞によって発現されるネコ可変ドメインをクローニングすること；および
（ｖ）トランスジェニックげっ歯類のＢ細胞からクローニングされたネコ可変ドメインを含む治療用または診断用抗体を生産すること。

【0054】

一態様において、ネコ可変ドメインを含む抗体を生産する方法が提供される。一態様において、本方法は、内在性げっ歯類免疫グロブリン遺伝子座可変領域が欠失され、免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるキメラＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つ、および／または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるキメラＶ_ＬおよびＪ_Ｌ可変遺伝子セグメントの各々の少なくとも１つを含む異種免疫グロブリン遺伝子座可変領域と置換されたゲノムを有するトランスジェニックげっ歯類を供給することを含み、ここで各キメラ遺伝子セグメントは、げっ歯類免疫グロブリン可変領域非コード遺伝子セグメント配列に埋め込まれたネコＶ、Ｄ、またはＪ免疫グロブリン可変領域コード配列を含み、トランスジェニックげっ歯類の異種免疫グロブリン遺伝子座は、ネコ可変ドメインを含む抗体を発現する。

【0055】

一態様において、この方法は、トランスジェニックげっ歯類によって発現されたネコ可変領域を有する抗体またはその抗体をコードする遺伝子を単離することを含む。一態様において、本方法は以下を含む：（ｉ）標的抗原に特異的な抗体を発現するトランスジェニックげっ歯類からＢ細胞を得ること；（ｉｉ）Ｂ細胞を不死化すること；および（ｉｉｉ）不死化Ｂ細胞から標的抗原に特異的な抗体を単離すること。

【0056】

一態様において、この方法は、特定の抗原に特異的なＢ細胞からネコ可変領域をクローニングすることを含む。一態様において、げっ歯類はマウスである。一態様において、この方法は、Ｂ細胞からクローニングされたネコ可変領域を用いて治療用または診断用抗体を生産することを含む。一態様において、本明細書に記載の方法により生産される治療用または診断用抗体が提供される。

【0057】

これらおよびその他の態様については、以下に詳述する。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】１２番染色体のテロメア末端に位置するマウスＩｇｈ遺伝子座（上部）（Ｖ（ＩｇｈＶ）、Ｄ（ＩｇｈＤ）、Ｊ（ＩｇｈＪ）、およびＣ（ＩｇｈＣ）遺伝子セグメントを含む）、６番染色体上に位置するＩｇκ遺伝子座（中部）（Ｖ（ＩｇｋＶ）、Ｊ（ＩｇｋＪ）、およびＣ（ＩｇｋＣ）遺伝子セグメントを含む）、および１６番染色体上に位置するＩｇλ遺伝子座（下部）（（Ｉｇｌ（Ｖ）、ＩｇｌＪ（Ｊ）、およびＩｇｌＣ（Ｃ）遺伝子セグメントを含む）を記載する。またＩｇｈ遺伝子座には、１）ＰＡＩＲエレメント、これはＶＤＪ再構成において遠位ＶＨ遺伝子セグメントを確実に利用するためのＩｇｈループ形成に重要なシス制御配列である、２）Ａｄａｍ６ａ雄性受胎可能化遺伝子、３）遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１）、これはＩｇｈ遺伝子座の秩序だった系譜特異的な再構成を制御する部位を含む、４）重鎖イントロンエンハンサーであるＥμ、５）スイッチ領域であるＳμ、６）アイソタイプスイッチングを制御するシス作用エレメントである３’制御領域（３’ＲＲ）が示される。また、Ｉｇκ遺伝子座には５’（Ｅ５’）エンハンサーおよび３’（Ｅ３’）エンハンサー、ならびにＩｇλ遺伝子座には３つのエンハンサーのＥλ ２－４、Ｅλ、およびＥλ ３－１が示される。

【0059】

【図2】非ネコ哺乳動物宿主細胞のゲノムにおけるＨ鎖可変領域遺伝子座の上流領域への、配列特異的組換え部位の第１セットを導入するための相同組換えによるターゲティング戦略を示す概略図である。

【0060】

【図3】相同性ターゲティングベクターを介した、非ネコ哺乳動物細胞のゲノムにおけるＨ鎖可変領域遺伝子座の下流領への、配列特異的組換え部位の第２セットの導入を示す概略図である。この図はまた、非ネコ哺乳動物宿主細胞のゲノムからの選択マーカーならびに内在性免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座の欠失も示している。

【0061】

【図4】内在性免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座を欠失させるためにあらかじめ改変された非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムに、異種部分的ネコ免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座を導入するＲＭＣＥ戦略を示す概略図である。

【0062】

【図5】マウスゲノムの内在性免疫グロブリンκＬ鎖遺伝子座への、異種部分的ネコ免疫グロブリンκＬ鎖可変領域遺伝子座の導入を示す概略図である。

【0063】

【図6】マウスゲノムの内在性免疫グロブリンλＬ鎖遺伝子座への、異種部分的ネコ免疫グロブリンλＬ鎖可変領域遺伝子座の導入を示す模式図である。

【0064】

定義
本明細書で使用される用語は、当業者によって理解されるような平易かつ通常の意味を有することが意図されている。以下の定義は、閲覧者が本発明を理解するのを助けることを意図したものであるが、特に指示しない限り、かかる用語の意味を変化させたり、その他の方法で限定したりすることを意図したものではない。

【0065】

本明細書で使用する「遺伝子座(locus)」なる用語は、それぞれゲノムに内在的に存在するか、ゲノムに導入される（または導入されようとしている）染色体セグメントまたは核酸配列を意味する。例えば、免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリンＨまたはＬ鎖ポリペプチドの発現を指示する、その遺伝子の一部または全部（すなわち、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＶ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメント、ならびに定常領域遺伝子である）および介在する非コード配列（すなわち、イントロン、エンハンサーなどである）を含み得る。「遺伝子座」（例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座）なる用語は、より大きな遺伝子座（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座の部分）の特定の部分を意味しうる。同様に、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座は、より大きな遺伝子座の特定の部分（例えば、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンＬ鎖遺伝子座の部分）を意味しうる。

【0066】

本明細書で使用する「免疫グロブリン可変領域遺伝子」なる用語は、可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、結合（Ｊ）遺伝子セグメントを意味し、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変ドメインの一部をそれぞれコードする、免疫グロブリン重鎖可変領域のＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメント、あるいは免疫グロブリン軽鎖可変領域のＶ_ＬまたはＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。本明細書で使用する「免疫グロブリン可変領域遺伝子座」なる用語は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＶ_Ｌ、またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントと、例えば非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む介在する非コード配列を含む、染色体セグメントまたは核酸鎖の一部または全体を意味する。

【0067】

本明細書で使用する「遺伝子セグメント」なる用語は、免疫グロブリン分子の重鎖または軽鎖可変ドメインの一部をコードする核酸配列を意味する。遺伝子セグメントは、コード配列と非コード配列を含み得る。遺伝子セグメントのコード配列は、リーダーペプチドや重鎖または軽鎖可変ドメインのＮ末端部分などのポリペプチドに翻訳可能な核酸配列である。遺伝子セグメントの非コード配列とは、コード配列を挟む配列であり、プロモーター、５’非翻訳配列、リーダーペプチドのコード配列を挟むイントロン、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）、およびスプライス部位を含み得る。免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子座の遺伝子セグメントには、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント（それぞれＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、およびＩＧＨＪとも呼ばれる）が含まれる。免疫グロブリンκおよびλ軽遺伝子座の軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントと呼ばれうる。κ軽鎖では、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖ_κおよびＪ_κ遺伝子セグメント、またはＩＧＫＶおよびＩＧＫＪと呼ぶことができる。同様に、λ軽鎖では、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖ_λおよびＪ_λ遺伝子セグメント、またはＩＧＬＶおよびＩＧＬＪと呼ぶことができる。

【0068】

重鎖定常領域はＣ_ＨまたはＩＧＨＣと呼ばれうる。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２、ＩｇＥ、またはＩｇＡをコードするネコのＣ_Ｈ領域エキソンは、それぞれ、Ｃ_μ、Ｃ_δ、Ｃ_γ１ａ、Ｃ_γ２、Ｃ_ε、またはＣ_αと呼ばれうる。同様に、免疫グロブリンκまたはλ定常領域は、それぞれＣ_κまたはＣ_λ、ＩＧＫＣまたはＩＧＬＣと呼ばれうる。

【0069】

本明細書で使用する「部分的ネコ(Partly feline)」とは、ネコおよび非ネコ哺乳動物宿主の両方の所定の遺伝子座に見られる配列に対応する配列を含む核酸、またはその発現タンパク質およびＲＮＡ産物を意味する。本明細書で使用する「部分的ネコ」とは、ネコおよび非ネコ哺乳動物由来の両方に由来する核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座も意味する。一態様において、「部分的ネコ」は、例えば、げっ歯類、例えばマウス由来の核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を意味する。一態様において、部分的ネコ核酸は、ネコ免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変領域遺伝子セグメントのコード配列、および非ネコ哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の非コード調節配列またはスキャフォールド配列に基づく配列を有する。

【0070】

非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内在性非コード調節配列またはスキャフォールド配列に関連して使用される場合、「に基づく(based on)」なる用語は、哺乳動物宿主細胞ゲノムの対応する内在性遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列を意味する。一態様において、「に基づく」なる用語は、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列が、宿主哺乳動物の内在性遺伝子座の非コード調節配列またはスキャフォールド配列と比較的高い程度の相同性を共有することを意味する。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の非コード配列は、宿主哺乳動物の内在性遺伝子座に見出される対応する非コード配列と、少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の相同性を共有する。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の非コード配列は、宿主哺乳動物の内在性遺伝子座に見られる対応する非コード配列と同じである。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の非コード配列は、宿主哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子座から保持されている。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の非コード配列は、宿主哺乳動物の内在性遺伝子座に存在する対応する非コード配列と同じである。一態様において、ネココード配列は宿主哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子座の非調節配列またはスキャフォールド配列に埋め込まれている。一態様において、非ネコ宿主動物はラットまたはマウスなどのげっ歯類である。

【0071】

「キメラ」とは、２種以上の動物由来のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、または２種以上の動物由来のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、例えば抗体を意味する。「キメラ」免疫グロブリン遺伝子座とは、２種以上の動物由来の核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を意味する。一態様において、キメラ免疫グロブリン遺伝子座はネコ核酸配列およびマウス核酸配列を含む。一態様において、キメラ免疫グロブリンは２種以上の動物由来のタンパク質配列を含む。一態様において、キメラ免疫グロブリンはネコの配列とマウスの配列を含む。一態様において、キメラ免疫グロブリンはネコ可変ドメインとマウス定常ドメインを含む。一態様において、キメラ免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列、またはネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列ならびに非ネコ非コード配列を含む。一態様において、キメラ免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列、またはネコＶ_ＬおよびＪ_Ｌコード配列、ならびにマウス非コード配列を含む。

【0072】

本明細書で使用する「挟む(flanking)」とは、例えば参照配列の上流または下流にあるヌクレオチド配列などの配列を意味する。一態様において、挟む(flanking)配列は参照配列に隣接(adjacent)している。一態様において、一対の配列が参照配列を挟み、第１の配列が参照配列の上流にあり、第２の配列が参照配列の下流にある。

【0073】

「内在性(endogenous)」とは、生物または細胞内に天然に存在する核酸配列またはポリペプチドを意味する。

【0074】

「異種(heterologous)」とは、生物または細胞内に天然には存在しない核酸配列またはポリペプチドを意味する。

【0075】

「非コード調節配列(Non-coding regulatory sequences)」とは、（ｉ）Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成、（ｉｉ）アイソタイプスイッチング、（ｉｉｉ）Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成後の全長免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖の適切な発現、または（ｉｖ）例えば免疫グロブリンＨ鎖の膜型および分泌型を生成するための交互スプライシング、に対して必須であることが知られている配列を意味する。「非コード調節配列」は、さらに以下の配列を含み得る：ＣＴＣＦおよびＰＡＩＲ配列などのエンハンサーおよび遺伝子座制御エレメント(Proudhonら,Adv. Immunol.128:123-182(2015))；各内在性Ｖ遺伝子セグメントに先行するプロモーター；スプライス部位；イントロン；または各Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントを挟む組換えシグナル配列。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の「非コード調節配列」は、非ネコ哺乳動物宿主細胞の内在性免疫グロブリン遺伝子座に見出される対応する非コード配列と、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大約１００％の相同性を共有する。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の「非コード調節配列」は、非ネコ哺乳動物宿主細胞の内在性免疫グロブリン遺伝子座に見られる対応する非コード配列と同じ配列を有する。

【0076】

「スキャフォールド配列」とは、宿主細胞ゲノムの内在性免疫グロブリン遺伝子座に存在する遺伝子セグメントに介在する配列を意味する。ある態様において、スキャフォールド配列は、機能的な非免疫グロブリン遺伝子、例えばＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂの発現に必須な配列によって挟まれている。一態様において、スキャフォールド配列は、他の種由来の天然に存在する核酸配列を含み得る。一態様において、スキャフォールド配列は、他の種由来の天然に存在する核酸配列に基づく異種配列でありうる。一態様において、スキャフォールド配列は人工配列を含み得る。一態様において、スキャフォールド配列は、ネコゲノムの免疫グロブリン遺伝子座に存在する配列と他の配列、例えば他の種のスキャフォールド配列とを組み合わせたものを含む。「非コード調節配列またはスキャフォールド配列」という語句は包括的な意味を持ち、免疫グロブリン遺伝子座における非コード調節配列とスキャフォールド配列の両方を意味しうる。

【0077】

「特異的に結合する」とは、抗体または免疫グロブリンが、他の抗原に結合するよりもはるかに高い親和性で特定の抗原のエピトープまたは抗原決定基に結合する能力を意味する。

【0078】

「相同性ターゲティングベクター」なる用語は、相同組換えによって哺乳動物宿主細胞の内在性ゲノムを改変するために使用される核酸配列を意味する。相同性ターゲティングベクターは、例えば、非ネコ哺乳動物宿主のゲノムに存在する、改変されるべき遺伝子座を挟む対応する内在性配列と相同性を有するターゲティング配列を含みうる。一態様において、相同性ターゲティングベクターは少なくとも１つの配列特異的組換え部位を含む。一態様において、相同性ターゲティングベクターは非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む。一態様において、相同性ターゲティングベクターは１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。一態様において、相同性ターゲティングベクターは、宿主細胞ゲノムの特定の領域に配列特異的組換え部位を導入するために使用しうる。

【0079】

「部位特異的組換え」または「配列特異的組換え」とは、２つの適合する組換え配列（「配列特異的組換え部位」または「部位特異的組換え配列」とも呼ばれる）間でＤＮＡが再構成するプロセスを意味する。部位特異的組換えは、以下の３つのイベントのいずれかを含み得る：ａ）組換え部位に挟まれるあらかじめ選択された核酸の欠失、ｂ）組換え部位に挟まれるあらかじめ選択された核酸のヌクレオチド配列の逆位、およびｃ）異なる核酸鎖上に位置する組換え部位に近接した核酸配列の相互交換。この核酸セグメントの相互交換は、異種核酸配列を宿主細胞のゲノムに導入するターゲティング戦略として利用できることが理解される。

【0080】

「ターゲティング配列」なる用語は、細胞のゲノム中のＤＮＡ配列と相同性のある配列を意味し、改変される免疫グロブリン遺伝子座の領域を挟んでいるか、その領域に隣接している。挟む配列または隣接する配列は、遺伝子座自体、あるいは宿主細胞のゲノム中のコード配列の上流または下流に存在する。ターゲティング配列は、宿主細胞、例えばＥＳ細胞へのトランスフェクションに使用できる組換えＤＮＡベクターに挿入され、組換え部位の配列などの宿主細胞ゲノムに挿入されるべき配列が、ベクターのターゲティング配列によって挟まれるようにする。

【0081】

本明細書で使用する「部位特異的ターゲティングベクター」なる用語は、配列特異的組換え部位をコードする核酸、異種部分的ネコ遺伝子座、および場合により選択マーカー遺伝子を含むベクターを意味する。一態様において、「部位特異的ターゲティングベクター」は、リコンビナーゼを介した部位特異的組換えを用いて宿主の内在性免疫グロブリン遺伝子座を改変するために用いられる。ターゲティングベクターの組換え部位は、改変されるべき免疫グロブリン遺伝子座に隣接して、宿主細胞のゲノム配列に（例えば、相同性ターゲティングベクターを介して）挿入された別の対応する組換え部位との部位特異的組換えに適している。免疫グロブリン遺伝子座の組換え部位に異種部分的ネコ配列を組み込むと、内在性遺伝子座が異種部分的ネコ領域で置換される。

【0082】

本明細書で使用する「導入遺伝子」なる用語は、細胞、特に哺乳動物宿主動物の細胞のゲノムに人為的に挿入された、または挿入されようとしている遺伝物質を表すために使用される。本明細書で使用する「導入遺伝子」なる用語は、部分的ネコ核酸、例えば異種発現コンストラクトまたはターゲティングベクターの形態の部分的ネコ核酸を意味する。

【0083】

「トランスジェニック動物」とは、染色体外エレメントとしてその細胞の一部に存在する異種核酸配列、またはその生殖細胞系列のＤＮＡに（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中に）安定的に組み込まれた異種核酸配列を有する、非ネコ動物、通常は哺乳動物を意味する。本発明では、例えば宿主動物の胚や胚性幹細胞を当該技術分野で周知の方法に従って遺伝子操作することにより、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系列に部分的ネコ核酸を導入する。

【0084】

「ベクター」には、プラスミドおよびウイルス、ならびに自己複製するか否かを問わず、細胞の形質転換やトランスフェクションに使用できるＤＮＡおよびＲＮＡ分子が含まれる。

【発明を実施するための形態】

【0085】

本明細書に記載される技術の実施は、特に断らない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および配列決定技術に関する従来の技術および記載を用いることができ、これらは当業者の技術範囲内である。このような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、および標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適した技術の具体例は、本明細書の実施例を参照することにより知ることができる。しかし、もちろん、他の同等の従来手順も使用できる。このような従来の技術や記載は、Greenら、Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; DieffenbachとVeksler, Eds. (2007), PCR Primer: A Laboratory Manual; BowtellとSambrook (2003), DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual; Mount (2004), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis; Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual;およびGreenとSambrook (2012), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (すべてCold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London; Nelson and Cox (2021), Lehninger, Principles of Biochemistry 8e, W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.;およびBergら (2019) Biochemistry, 93, Macmillan Pub., New York, N.Yに見出すことができ、これらのすべては、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0086】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「遺伝子座」への言及は、１つまたは複数の遺伝子座を指し、「方法」への言及は、当業者に既知の同等のステップおよび方法への言及などを含む。

【0087】

本明細書で使用される場合、「または(or)」なる用語は、代替案のみを指すことが明示的に示されていない限り、または代替案が相互に排他的でない限り、「および／または(and/or)」を意味し得る。「含んでいる(including)」、「含む(includes)」、および「含まれる(included)」なる用語は限定的なものではない。

【0088】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたすべての刊行物は、現在記載されている本発明に関連して使用され得る装置、製剤、および方法論を記載および開示する目的で、参照により援用される。

【0089】

値の範囲が規定されている場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値、およびその範囲内の他の規定値または介在値は、本発明に包含されると理解される。これらの小さい範囲の上限と下限は、独立に小さい範囲に含まれることがあり、また、記載された範囲内で特に除外された制限を条件として、本発明に包含される。記載された範囲に限界値の一方または両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除いた範囲も本発明に含まれる。

【0090】

以下の記述では、本発明のより深い理解を提供するために、数多くの具体的な詳細を述べる。しかし、当業者には、本発明はこれらの具体的な詳細の１つまたは複数がなくても実施できることが明らかであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないために、当業者に周知の特徴や当業者に周知の手順は記載していない。

【0091】

液性免疫系では、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成と呼ばれるプロセスによって、ＩＧＨ鎖遺伝子座およびＩＧＬ鎖遺伝子座の組み合わせ多様性と結合多様性によって、多様な抗体レパートリーが産生される。発生中のＢ細胞では、最初に起こる遺伝子再構成現象は重鎖遺伝子座の１つのＤ遺伝子と１つのＪ遺伝子の間で起こり、これらの２つの遺伝子セグメント間のＤＮＡが欠失する。このＤ－Ｊ遺伝子再構成に続いて、新たに形成されたＤＪ複合体の上流領域から１つのＶ遺伝子セグメントが結合し、再構成されたＶＤＪエキソンが形成される。新しく生成されたＶＤＪエキソンの組換えＶ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントの間にある他のすべての配列は、各Ｂ細胞のゲノムから欠失される。この再構成されたエキソンは最終的にＨ鎖ポリペプチドの可変領域としてＢ細胞表面に発現し、Ｌ鎖ポリペプチドと結合してＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を形成する。マウスとネコＩｇ遺伝子座は、それらが含む特徴の数と、Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成によってコード領域がどのように多様化するかにおいて非常に複雑であるが、この複雑さは各可変領域遺伝子セグメントの構造の基本的な詳細には適用されない。Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントは、その組成と機構において一様である。例えば、Ｖ遺伝子は以下の免疫グロブリン遺伝子座の本質的に不変の順序で配置される特徴を有する：短い転写プロモーター領域（長さ６００ｂｐ以下）；抗体鎖のシグナルペプチドの大部分をコードするエキソン；イントロン；抗体鎖のシグナルペプチドの一部と抗体可変ドメインの大部分をコードするエキソン、およびＶ（Ｄ）Ｊ再構成に必要な３’組換えシグナル配列。同様に、Ｄ遺伝子セグメントは以下の特徴を有する：５’組換えシグナル配列、コード領域、および３’組換えシグナル配列。Ｊ遺伝子セグメントは以下の特徴を有する：５’組換えシグナル配列、コード領域、および３’スプライス供与体配列。

【0092】

一態様において、ネコ可変領域コード配列および哺乳動物宿主ゲノムの免疫グロブリン遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列、例えば宿主哺乳動物がマウスの場合にはマウスゲノム非コード配列、を含む異種部分的ネコ核酸配列を含む非ネコ哺乳動物細胞が提供される。

【0093】

ネコゲノムのＶ_Ｈ領域は、約２４個のＶ_Ｈ遺伝子セグメントと５個のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントの数はまだ正確に定義されていないが、すべての遺伝子セグメントがアビシニアンネコ種のネコ染色体Ｂ３にマップされている。カッパ（κ）コード領域はネコＡ３染色体にマップされ、約２００ｋｂに及び、約１２個の機能的Ｖκ、５個のＪκ、および１個のＣκ遺伝子を含む。ラムダ（λ）コード領域はネコＤ３染色体にマップされ、約１０００ｋｂに及び、約３２の機能的Ｖλ、１０個の機能的Ｊλ、および１２個のＣλ遺伝子を含むが、そのうち機能的なのは５つだけである。ネコＩＧＬ遺伝子座には、明らかに非機能的なＶλ遺伝子セグメントが高頻度（約６２／９４）に含まれる。一態様において、部分的ネコＨ鎖およびκおよびλのＬ鎖遺伝子座において、すべてのＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメント、ならびにすべてのＶ_ＬおよびＪ_Ｌセグメントは、Ｂ細胞分化中の再構成およびトランスジェニックマウスの部分的ネコ抗体レパートリーへの寄与を促進するために、マウスＲＳＳによって挟まれている。

【0094】

ヒトやマウスと同様に、ネコは２種類のＩｇ軽鎖（κおよびλ）を発現する。しかし、κ／λ比はこれらの動物で大きく異なる。マウスでは血清抗体中の軽鎖の約９６％がκ型であるが、ヒトではκ型はＩｇＬ鎖全体の６６％を占めるのみである。一方、ネコにおけるＬ鎖レパートリーはλが支配的である（９５％）。

【0095】

Ｉｇｈ、ＩｇκまたはＩｇλ遺伝子座に組み入れられた部分的ネコ核酸配列は、トランスジェニック動物がネコκまたはλ可変領域と対になったネコ重鎖可変領域を含む抗体を産生することを可能にする。部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座には、宿主ゲノム（例えばげっ歯類）の介在配列内に、宿主における効率的な抗体産生と抗原認識を促進するのに役立つ調節配列およびその他のエレメントが保持されている。

【0096】

一態様において、ネココード配列および免疫グロブリンＶ_Ｈ、Ｖλ、またはＶκ遺伝子座からの非ネコ非コード調節配列またはスキャフォールド配列を含む、合成された、または組換え的に生産された、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座が提供される。

【0097】

一態様において、合成Ｈ鎖ＤＮＡセグメントは、以下のエレメントの１つ以上を含む：雄の生殖能に必要なＡＤＡＭ６遺伝子、Ｉｇｈ遺伝子座の収縮(contraction)に関与するＰａｘ－５－活性化遺伝子間反復（Pax-5-Activated Intergenic Repeats）（ＰＡＩＲ）エレメント、正常なＶＤＪ再構成の制御に関与する重鎖遺伝子間制御領域１からのＣＴＣＦ結合部位［（Proudhonら Adv. Immunol., 128:123-182 (2015)］、またはそれらの組み合わせ。マウスのＩｇｈ遺伝子座におけるこれらの内在性非コード調節配列とスキャフォールド配列の位置を図１に示し、左から右に以下を説明する：約１００の機能的重鎖可変領域遺伝子セグメント；ＰＡＩＲ、ＶＤＪ遺伝子再構成のためのＩｇｈ遺伝子座の収縮に関与するＰａｘ－５－活性化遺伝子間反復；Ａｄａｍ６ａ、雄の生殖機能に必要なディスインテグリンおよびメタロペプチダーゼドメイン６Ａ遺伝子；プレＤ領域、最遠位のＤ_Ｈ遺伝子セグメントであるＩｇｈｄ－５の上流にある２１６０９ｂｐの断片；Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの使用を制御するＣＴＣＦインシュレーター部位を含む遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１）；Ｄ_Ｈ、多様性遺伝子セグメント（マウス系統により１０－１５）；４つの結合Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント；Ｅμ、ＶＤＪ遺伝子再構成に関与するイントロンエンハンサー；Ｓμ、アイソタイプスイッチングのためのμスイッチ領域；８つの重鎖定常領域遺伝子：Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂ、Ｃ２γａ／ｃ、Ｃε、およびＣα；アイソタイプスイッチングと体細胞超変異を制御する３’制御領域（３’ＲＲ）。図１は、ProudhonらAdv. Immunol., 128:123-182 (2015)から引用した図を改変した。

【0098】

一態様において、哺乳動物宿主細胞に組み込まれる異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、既知のネコＶ_Ｈ遺伝子セグメントのすべてまたは相当数を含む。しかし、場合によっては、そのようなＶ_Ｈ遺伝子セグメントのサブセットを使用することが望ましいこともある。一態様において、ネコＶ_Ｈコード配列が１つだけ、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座に含まれることがある。

【0099】

一態様において、非ネコ哺乳動物または哺乳動物細胞は、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子コード配列を含む、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む。一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、非ネコ哺乳動物宿主の内在性Ｉｇｈ遺伝子座に基づく非コード調節配列およびスキャフォールド配列、例えばプレＤ配列を含む。一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座は、完全に組換えられたＶ（Ｄ）Ｊエキソンを含む。

【0100】

一態様において、トランスジェニック非ネコ哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスであり、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子、ならびにげっ歯類の介在（非コード調節またはスキャフォールド）配列に基づく、例えばプレＤ領域を含む介在配列を含む異種の部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む。一態様において、トランスジェニックげっ歯類は、それぞれ、ネコＶκまたはＶλコード配列、およびネコＪκまたはＪλコード配列、ならびにげっ歯類のＩｇｌ遺伝子座に存在する非コード調節配列またはスキャフォールド配列などの介在配列を含む、部分的ネコＩＧＬ遺伝子座をさらに含む。

【0101】

一態様において、マウスゲノムの内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子座全体が欠失し、２４個の機能的ネコＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよびマウスゲノムのＪ５５８Ｖ_Ｈ遺伝子座の非コード配列と置換される。一態様において、異種免疫グロブリン遺伝子座はネコＤ_Ｈおよび５Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。一態様において、異種免疫グロブリン遺伝子座はマウスプレＤ領域を含む。一態様において、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈコード配列はげっ歯類の非コード配列に埋め込まれている。

【0102】

一態様において、相同組換えと部位特異的組換えを組み合わせて、トランスジェニック細胞や動物を生成する。一態様において、相同性ターゲティングベクターを用いて、哺乳動物宿主細胞ゲノムに、内在性免疫グロブリン遺伝子座の所望の位置で配列特異的組換え部位を導入する。一態様において、配列特異的組換え部位は相同組換えによって哺乳動物宿主細胞のゲノムに挿入され、哺乳動物宿主細胞内の他の遺伝子の発現またはコード配列には影響を与えない。一態様において、免疫グロブリン遺伝子が転写および翻訳されて抗体を産生する能力は、組換え部位および場合により選択マーカー遺伝子などの付加的配列が挿入された後も維持される。しかし、いくつかの場合では、他の異種配列を免疫グロブリン遺伝子座配列に挿入することが可能であり、その結果得られる抗体分子のアミノ酸配列は挿入によって変化するが、抗体は所望の目的に十分な機能性を保持する。一態様において、１つ以上の多型(polymorphism)が定常領域エキソン内の内在性遺伝子座に導入され、それにより異なるＩｇ対立遺伝子を区別できるように同型マーカーが提供される。

【0103】

一態様において、相同性ターゲティングベクターは、宿主細胞ゲノムに配列特異的組換え部位および１つ以上の選択マーカー遺伝子を挿入するだけでなく、内在性免疫グロブリン遺伝子座内の配列を置換するために使用される。本明細書で使用されるような選択マーカー遺伝子は、相同組換えを起こしていない細胞、またはターゲティングベクターのランダムな組み込みを保有する細胞を同定し、排除するために利用できることが当業者には理解される。

【0104】

米国特許第6,689,610号；第6,204,061号；第5,631,153号；第5,627,059号；第5,487,992号；および第5,464,764号に記載されている方法が知られており、これらの各々は参照によりその全体が援用される。

【0105】

部位／配列特異的組換え
部位／配列特異的組換えは、リコンビナーゼによる認識に必要な短い特異的ＤＮＡ配列が組換えが起こる唯一の部位である点で、相同組換えとは異なる。特定のＤＮＡ鎖または染色体上のこれらの部位の方向に依存して、これらの特定の配列を認識する特殊なリコンビナーゼは、ｉ）ＤＮＡの切除、またはｉｉ）ＤＮＡの逆位または回転を触媒できる。部位特異的組換えは、これらの部位が同じ染色体上に存在しない場合、２本のＤＮＡ鎖の間でも起こりうる。バクテリオファージや酵母由来の多くの部位特異的組換えシステムは、それぞれリコンビナーゼとその認識部位を含み、真核細胞で機能することが示されており、これらには、バクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘシステム、酵母ＦＬＰ－ＦＲＴシステム、および部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのＤｒｅシステムが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第7,422,889号；第7,112,715号；第6,956,146号；第6,774,279号；第5,677,177号；第5,885,836号；第5,654,182号；および第4,959,317号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に援用される。

【0106】

部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーの他の系も使用でき、これには、バクテリオファージλインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼ、およびリコンビナーゼのセリンファミリーに属するシステム、例えば、バクテリオファージΦＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

【0107】

部位特異的組換えは２つの異なるＤＮＡ鎖間で起こりうるので、部位特異的組換えを利用して、リコンビナーゼ仲介カセット交換（ＲＭＣＥ）と呼ばれるプロセスにより、異種免疫グロブリン遺伝子座を宿主細胞ゲノムに導入できる。ＲＭＣＥプロセスは、リコンビナーゼタンパク質の野生型および変異型配列特異的組換え部位を用いて利用できる。例えば、標的とする染色体部位は、一端が野生型ＬｏｘＰ部位で、他端が変異型ＬｏｘＰ部位で挟まれていてもよい。同様に、ベクターは、一端で野生型ＬｏｘＰ部位により、他端で変異型ＬｏｘＰ部位により挟まれた、宿主細胞ゲノムに挿入される異種配列を含むことができる。ベクターがＣｒｅリコンビナーゼの存在下で宿主細胞にトランスフェクトされると、各ＤＮＡ鎖上の野生型ＬｏｘＰ部位と変異型ＬｏｘＰ部位は互いに組換え不適合であるため、Ｃｒｅリコンビナーゼは同じＤＮＡ鎖上で切除反応を触媒するのではなく、内在性ＤＮＡ鎖とベクターのＤＮＡとの間でＲＭＣＥを触媒する。このように、一方のＤＮＡ鎖上のＬｏｘＰ部位は、他方のＤＮＡ鎖上のＬｏｘＰ部位としか組換えせず、同様に、一方のＤＮＡ鎖上の変異ＬｏｘＰ部位は、他方のＤＮＡ鎖上の変異ＬｏｘＰ部位としか組換えしない。

【0108】

一態様において、ＲＭＣＥのために同じリコンビナーゼによって認識される配列特異的組換え部位の変異体が使用される。このような配列特異的組換え部位の変異体の例としては、逆反復配列の組合せを含むものや、変異スペーサー配列を有する組換え部位を含むものがある。例えば、安定したＣｒｅ－ｌｏｘＰ組込み組換え(integrative recombination)を行うために、２種類の変異型リコンビナーゼ部位が利用できる。どちらも、８ｂｐのスペーサー領域または１３ｂｐの逆方向反復内の、Ｃｒｅ認識配列の配列変異を利用している。ｌｏｘ５１１[HoessらNucleic Acids Res, 14:2287-2300 (1986)]、ｌｏｘ５１７１、およびｌｏｘ２２７２[LeeとSaito, Gene, 216:55-65 (1998)]、ｍ２、ｍ３、ｍ７、およびｍ１１[Langerら Nucleic Acids Res, 30:3067-3077 (2002)]などのスペーサー変異体は、それ自身とは容易に組換えるが、野生型部位との組換え率は著しく低下する。このクラスの変異体は、非相互作用Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換え部位および非相互作用ＦＬＰ組換え部位を用いたＲＭＣＥによるＤＮＡ挿入に利用されてきた[BaerとBode, Curr Opin Biotechnol, 12:473ー480 (2001); Albertら Plant J, 7:649-659 (1995); SeiblerとBode, Biochemistry, 36:1740-1747 (1997); SchlakeとBode, Biochemistry, 33:12746-12751 (1994)]。

【0109】

逆方向反復変異体は、変異型リコンビナーゼ部位の別の一種である。例えば、ＬｏｘＰ部位は、変化した塩基を左逆方向反復（ＬＥ変異体）または右逆方向反復（ＲＥ変異体）中に含むことができる。ＬＥ変異体であるｌｏｘ７１は、左逆方向反復の５’末端の５ｂｐが野生型配列からＴＡＣＣＧに変化している[Arakiら Nucleic Acids Res, 25:868-872 (1997)]。同様に、ＲＥ変異体であるｌｏｘ６６は、３’末端の５塩基がＣＧＧＴＡに変化している。逆方向反復変異体は、プラスミド挿入物を染色体ＤＮＡに組み込むために使用され、ＬＥ変異体は、「ドナー」ＲＥ変異体が組み換わる「標的」染色体ｌｏｘＰ部位として指定される。組換え後、ｌｏｘＰ部位は挿入セグメントを挟んでシスに位置する。組換えのメカニズムは、組換え後、一方のｌｏｘＰ部位が二重変異体（ＬＥとＲＥの両方の逆反復変異を含む）となり、もう一方が野生型となるようなものである[LeとSadowski, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 80:1-42 (2005); LeeとSadowski, J Mol Biol, 326:397-412 (2003)]。二重変異体は野生型部位と十分に異なっているため、Ｃｒｅリコンビナーゼに認識されず、挿入されたセグメントは切除されない。

【0110】

一態様において、配列特異的組換え部位は、抗体発現に使用される調節配列またはコード配列の破壊を避けるために、コード配列または調節配列ではなく、イントロンに導入される。

【0111】

配列特異的組換え部位の導入は、従来の相同組換え技術によって達成できる。このような技術は、例えばGreenとSambrook (2012) (Molecular cloning: a laboratory manual 4th ed.(Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) およびNagy, A. (2003).(Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)などの文献に記載されている。

【0112】

ゲノムへの特異的組換えは、当該技術分野で知られているように、ポジティブまたはネガティブ選択用に設計されたベクターを用いて容易に行うことができる。置換反応を受けた細胞の同定を容易にするために、適切な遺伝子マーカー系を採用し、例えば選択組織培養培地を用いて細胞を選択できる。一態様において、異種配列の２つの端点にある、または隣接する核酸配列、例えばマーカー系や遺伝子は、異種核酸を含む細胞の選択後に除去できる。

【0113】

一態様において、内在性免疫グロブリン遺伝子座が欠失した細胞は、マーカー遺伝子を用いてポジティブ選択でき、このマーカー遺伝子は、組換えイベントの後または結果として、場合によって細胞から除去できる。使用しうるポジティブ選択系は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）などのマーカー遺伝子の２つの非機能性部分が組換えイベントを介して一緒になることの利用に基づく。一態様において、内在性免疫グロブリン遺伝子座と異種免疫グロブリン遺伝子座との置換が成功すると、２つの非機能性部分が機能的に結合する。一態様において、機能的に再構成されたマーカー遺伝子の両側には、さらなる配列特異的組換え部位（置換反応に用いた配列特異的組換え部位とは異なる）があり、適切な部位特異的リコンビナーゼを用いて、マーカー遺伝子をゲノムから切除できる。別の態様において、細胞は毒物または薬物に暴露されるとネガティブに選択される。例えば、ターゲティングコンストラクトが相同組換えによって組み込まれず、ゲノムにランダムに組み込まれた細胞は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子が相同領域の外側に位置する場合、ＨＳＶ－ＴＫの発現を保持する。このような細胞は、ガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体を用いて選択できる。

【0114】

一態様において、リコンビナーゼは精製タンパク質として提供される。一態様において、リコンビナーゼは、宿主細胞に一過性にトランスフェクトされたベクターコンストラクトから発現されたタンパク質として、あるいは宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれたタンパク質として提供される。あるいは、異種免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を、リコンビナーゼを発現する動物と交配することもできる。

【0115】

一態様において、２セット以上の配列特異的組換え部位が操作されたゲノム内に含まれ、ＲＭＣＥを複数回繰り返して非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムに部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座を挿入できる。

【0116】

一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座はＣＲＩＳＰＲ技術を用いて導入される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを標的組換えに用いることができる[Heら Nuc. Acids Res., 44:e85, (2016)]。

【0117】

トランスジェニック動物の生成
一態様において、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物、例えばげっ歯類、例えばマウスを生成するための方法が提供される。

【0118】

一態様において、トランスジェニック動物のＢ細胞が細胞当たり２つ以上の機能的ＶＨ領域を発現できるように、トランスジェニック動物のゲノムが改変される、すなわち、２０１６年８月２４日に出願された、「Enhanced Production of Immunoglobulins」、WO20170/35252に記載されているように、細胞は二重特異性抗体を産生し、その開示は参照により本明細書に援用される。

【0119】

一態様において、トランスジェニック動物のＢ細胞が重鎖を含み軽鎖を含まない抗体を発現できるように、すなわち重鎖のみの抗体を産生するようにトランスジェニック動物のゲノムを改変する。

【0120】

一態様において、宿主細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞細胞であり、これを用いてトランスジェニック哺乳動物を創出できる。一態様において、この方法は、異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む胚性幹細胞を単離すること、およびＥＳ細胞を用いて異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を生成することを含む。

【実施例】

【0121】

以下の実施例は、本発明の製造方法および使用方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されたものであり、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図したものではなく、また以下の実験が実施された実験の全てまたは唯一の実験であることを表明または暗示することを意図したものでもない。当業者であれば、本明細書に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多数の変形または修正がなされ得ることが理解されよう。したがって、これらの例は例示であり、限定的なものではない。

【0122】

使用されている用語や数値（例えば、ベクトル、量、温度など）に関する正確性を確保できるよう努めたが、いくらかの実験誤差や偏差は考慮されるべきである。特に断りのない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧または大気圧に近い状態である。

【0123】

実施例は、組換え部位を挟む５’ベクターおよび３’ベクターの両方によるターゲティングと、ＲＭＣＥを介した合成ＤＮＡの導入を例示している。本明細書を読めば、当業者には、５’ベクターのターゲティングが最初に行われ、その後に３’ベクターが続くか、あるいは３’ベクターのターゲティングが最初に行われ、その後に５’ベクターが続くことが明らかであろう。いくつかの場合においては、二重の検出メカニズムで同時にターゲティングを行うこともできる。各実施例では、５’または３’ベクターを適切に組み込んだ細胞を選択するために、いくつかの異なる戦略を用いているが、Ｉｇｈ、Ｉｇκ、またはＩｇλ遺伝子座を標的とする場合、若干の修正を加えれば、このような戦略は互換性があることも明らかであろう。

【0124】

実施例１：非ネコ哺乳動物宿主細胞ゲノムの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座への異種部分的ネコ免疫グロブリン可変領域遺伝子座の導入
非哺乳動物ＥＳ細胞のゲノム遺伝子座に異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を導入する例示的方法を図２から４に示す。図２は、内在性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの上流（５’）に部位特異的組換え配列を導入する方法を示している。ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ－チミジンキナーゼ融合タンパク質（ｐｕｒｏ－ＴＫ）（２０３）を含む５’相同性ターゲティングベクター（２０１）が提供され、このベクターは、２つの異なる組換え酵素認識部位（例えば、ＦｌｐおよびＣｒｅそれぞれに対するＦＲＴ（２０７）およびｌｏｘＰ（２０５））、およびそれぞれの野生型対応部位／部位（すなわち野生型ＦＲＴ（２０７）および野生型ｌｏｘＰ（２０５））と組換える能力を欠く２つの異なる変異部位（例えば、改変変異体ＦＲＴ（２０９）および変異体ｌｏｘＰ（２１１））で挟まれている。ターゲティングベクターは、細胞のネガティブセレクションに用いるジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）ｃＤＮＡ（２１７）を含む。ターゲティングベクターは、場合により緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの視覚的マーカーも含む（図示せず）。領域２１３および２１５は、内在性非ネコ遺伝子座における、内在性非ネコＶ_Ｈ遺伝子セグメント（２１９）を含むゲノム領域の５’である連続領域（２２９）のそれぞれ５’および３’部分と相同である。相同性ターゲティングベクター（２０１）は、内在性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント（２１９）、プレＤ領域（２２１）、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント（２２３）、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント（２２５）、および免疫グロブリン定常遺伝子領域遺伝子（２２７）を含む免疫グロブリン遺伝子座（２３１）を有するＥＳ細胞に導入される（２０２）。相同性ターゲティングベクター（２０１）からの部位特異的組換え配列およびＤＴＲ ｃＤＮＡは、内在性マウスＶ_Ｈ遺伝子座の５’の部位で非ネコゲノムに組み込まれ（２０４）、２３３に示されるゲノム構造を生じる。

【0125】

マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来）を、既知の手順に従って、５’ベクター（２０１）を用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。エレクトロポレーションの前に、ベクターＤＮＡは原核生物のプラスミド配列またはそれに付随するポリリンカーのみを切断するレアカット制限酵素で直鎖化される。トランスフェクトされた細胞はプレーティングされ、約２４時間後に５’ベクターをＤＮＡに組み込んだ細胞を選択する。ゲノムに５’ベクター（２０１）が組み込まれていないＥＳ細胞は、培養液にピューロマイシンを含ませることで選択（死滅）させることができる；ゲノムに５’ベクター（２０１）が安定に組み込まれ、ピューロＴＫ遺伝子を恒常的に発現しているＥＳ細胞のみが、ピューロマイシンに耐性を示す。

【0126】

薬剤耐性ＥＳ細胞のコロニーは、約１週間後に肉眼で見えるようになった後、プレートから物理的に取り出される。採取したコロニーをバラバラにし、マイクロウェルプレートに再プレーティングし、数日間培養する。その後、各クローン細胞は、一部の細胞はアーカイブとして凍結保存され、残りは分析目的のＤＮＡ単離に使用されるように分けられる。５’ベクター導入の一次スクリーニングは、サザンブロット法、またはサザンブロット法などの二次スクリーニングによる確認を伴うＰＣＲ法で行うことができる。

【0127】

ＥＳ細胞クローンのＤＮＡは、広く行われている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを用いてＰＣＲでスクリーニングされる。このアッセイでは、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、５’ベクター（２０１）とゲノムＤＮＡの間で共有される同一性領域の外側にマップし、他方は５’ベクター内、例えばＰｕｒｏ－ＴＫ遺伝子（２０３）内にマップする。標準的なデザインによれば、これらのアッセイは、５’ターゲティングベクターと内在性マウスＩｇｈ遺伝子座との間で相同組換えを起こしたＥＳ細胞のクローンにのみ存在するＤＮＡを検出する。

【0128】

サザンブロットアッセイは、プローブと処理物の組み合わせによって、クローン中の標的遺伝子座の構造が相同組換えによって適切に改変されていることを同定できるように選択された３つのプローブと複数の制限酵素で処理したゲノムＤＮＡを用いて、広く用いられている手順に従って行われる。プローブの１つは、５’ターゲティングベクターとゲノムＤＮＡの間で共有される同一性領域の５’側を挟むＤＮＡ配列にマップし、２つ目のプローブは同一性領域の外側だが３’側にマップし、３つ目のプローブはベクター内のゲノム同一性の２つのアームの間の新規ＤＮＡ内、例えばＰｕｒｏ－ＴＫ遺伝子内にマップする（２０３）。サザンブロットでは、修飾された配列、すなわち、５’ターゲティングベクターとの相同組換えによって修飾されたＩｇｈ遺伝子座の一部に対応する、予想される制限酵素生成ＤＮＡ断片の存在が、外部プローブ(external probe)の１つとＰｕｒｏ－ＴＫプローブによって検出され、同定される。外部プローブは、変異型断片を検出し、相同染色体上の免疫グロブリンＩｇｈ遺伝子座の非変異型コピーからの野生型断片も検出する。

【0129】

ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータから予想されるゲノム構造を有し、核型分析から染色体異常が検出されないＥＳ細胞クローンは、さらなる使用のために選択される。

【0130】

図３に示されるように、３’相同性ターゲティングベクター（３０１）が提供され、このベクターは、ＨＰＲＴ欠損ＥＳ細胞におけるポジティブセレクションに使用できる任意のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子（３３５）；ネオマイシン耐性遺伝子（３３７）；ＦｌｐおよびＣｒｅそれぞれのためのリコンビナーゼ認識部位ＦＲＴ（３０７）およびｌｏｘＰ（３０５）を含む。領域３２９および３３９は、内在性Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント（３２５）の下流および定常領域遺伝子（３２７）の上流にある内在性マウス遺伝子座の連続領域（３４１）のそれぞれ５’および３’部分と相同である。相同性ターゲティングベクターは、内在性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント（３１９）、プレＤ領域（３２１）、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント（３２３）、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント（３２５）、および定常領域遺伝子（３２７）を含む改変マウス免疫グロブリン遺伝子座（３３１）に導入される（３０２）。相同性ターゲティングベクターの部位特異的組換え配列（３０７、３０５）である、ＨＰＲＴ遺伝子（３３５）およびネオマイシン耐性遺伝子（３３７）は、内在性マウス定常領域遺伝子（３２７）の上流でマウスゲノムに組み込まれ（３０４）、３３３で示されるゲノム構造が得られる。

【0131】

３’ベクター（３０１）で改変された許容可能なクローンは、選択のためにピューロマイシンの代わりにネオマイシンまたはＨＰＲＴ選択が使用される以外は、５’ベクター（２０１）で使用されるものと本質的に同一の設計の手順およびスクリーニングアッセイを用いて同定される。ＰＣＲアッセイ、プローブ、および処理物も、３’ベクターによって改変されたゲノム領域に合わせて調整される。ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。

【0132】

３’ベクターと５’ベクターの両方によって変異させられたＥＳ細胞のクローン、すなわち、両方の操作された変異を有する二重標的細胞(doubly targeted cells)は、ベクターターゲティングと解析の後に単離される。クローンは、相同染色体とは対照的に、同じ染色体上で遺伝子ターゲティングを受けたものでなければならない（すなわち、ターゲティングベクターによって創出された人工変異は、別々の相同ＤＮＡ鎖上のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖上のシスでなければならない）。シス配置のクローンとトランス配置のクローンは、２つの遺伝子ターゲティングベクター（３０３および３３７）のゲノム同一性アームの間に存在する新規ＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いたメタフェーズスプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどの分析的手順によって区別される。この２つのタイプのクローンは、ターゲティングベクターがシスに組み込まれた場合、ＨＰＲＴ（３３５）およびネオマイシン耐性（３３７）遺伝子を欠失させるＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、各クローンからの細胞の一部をＧ４１８／ネオマイシン耐性について試験する「兄弟選択(sibling selection)」スクリーニング手順によってクローンの薬剤耐性表現型を分析することによっても、互いに区別できる。得られたシス由来クローンの大部分は、Ｇ４１８／ネオマイシンにも感受性であり、対照的にトランス由来クローンは薬剤に対する耐性を保持しているはずである。重鎖遺伝子座にシス配置の操作をされた変異を有する細胞の二重標的クローンが、さらなる使用のために選択される。

【0133】

２つの組換え部位が哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれると、次に内在性免疫グロブリン遺伝子座は、ゲノムに組み込まれた配列特異的組換え部位に対応するリコンビナーゼ、例えばＦｌｐまたはＣｒｅのいずれかを導入することによって組換えを受ける。ＦｌｐまたはＣｒｅ（３０６）の存在下で、ＤＴＲ遺伝子（３１７）、内在性Ｉｇｈ可変領域遺伝子座（３１９、３２３、３２５）、プレＤ領域（３２１）、ＨＰＲＴ（３３５）およびネオマイシン耐性（３３７）遺伝子を含む野生型ＦＲＴまたは野生型ＬｏｘＰ部位の間のすべての介在配列が欠失され、３３９で示されるゲノム構造が生じる。この手順は、第２のターゲティングが、そのホモログ上ではなく、同じ染色体上（すなわち、トランスではなくシス）で起こったことに依る。もしターゲティングが意図したようにシスで起こるなら、ジフテリア毒素に対する感受性を引き起こすＤＴＲ遺伝子（３１７）は宿主細胞ゲノムから欠失（削除）しているはずなので、細胞は培地中に導入されたジフテリア毒素によるネガティブ選択には感受性がない。同様に、第１または第２のターゲティングベクターのランダムインテグレーションを保有するＥＳ細胞は、欠失されていないＤＴＲ遺伝子の存在によってジフテリア毒素に感受性を示す。

【0134】

免疫グロブリン重鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方に配列欠失を有するＥＳ細胞クローンに、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターおよび、ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列をマウスの非コード配列に埋め込んだ部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むベクターを再導入する。図４は、内在性Ｖ_Ｈ遺伝子座とＪ_Ｈ遺伝子座の間の介在配列を含む、重鎖可変領域領域をコードする内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一部が欠失したマウスゲノムへの、異種部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の導入を示している。非ネコ宿主ゲノムに挿入されるべき部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座を含む部位特異的ターゲティングベクター（４４１）が、ＲＭＣＥにより宿主細胞（４３９）の改変ゲノムに導入される（４０２）。部分的ネコＶ_Ｈ遺伝子座（４１９）、マウスプレＤ領域（４２１）、部分的ネコＤ_Ｈ遺伝子座（４２３）、部分的ネコＪ_Ｈ遺伝子座（４２５）、ならびに隣接変異型ＦＲＴ(franking mutant FRT)（４０９）、変異型ＬｏｘＰ（ｌｏｘ５１７１；４１１）、野生型ＦＲＴ（４０７）、および野生型ＬｏｘＰ（４０５）部位を含む部位特異的ターゲティングベクター（４４１）を、ＲＭＣＥにより宿主細胞に導入する（４０２）。具体的には、部分的ネコＶ_Ｈ遺伝子座（４１９）は、２４の機能的ネコＶ_Ｈ遺伝子セグメントコード配列および内在性非ネコゲノム中に存在する３’非ネコＲＳＳおよび介在配列を含む；プレＤ領域（４２１）は、内在性非ネコゲノム中に上流に存在する２１．６ｋｂの非ネコゲノムの配列を含む；Ｄ_Ｈ領域（４２３）は、非ネコＲＳＳによって挟まれ、内在性非ネコＤ_Ｈ領域に存在する介在配列に埋め込まれたネコＤ_Ｈ遺伝子セグメントのコドンを含む；およびＪ_Ｈ遺伝子座（４２５）は、５’非ネコＲＳＳを有する５つのネコＪ_Ｈ遺伝子セグメントのコドンを含み、内在性非ネコゲノムに存在する介在配列に埋め込まれる。一態様において、宿主細胞ゲノムのＩｇｈ遺伝子座を改変して、図３に関連して述べたように、介在配列を含む内在性のＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントをすべて削除する。この改変の結果、内在性の非ネコＩｇｈ遺伝子座（４３９）は、上流に変異型ＦＲＴ部位（４０９）と変異型ＬｏｘＰ部位（ｌｏｘ５１７１；４１１）、下流に野生型ＦＲＴ（４０７）と野生型ＬｏｘＰ（４０５）で挟まれたｐｕｒｏ－ＴＫ融合遺伝子（４０３）と共に残る。適切なリコンビナーゼ（４０４）を導入すると、部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座がｌｏｘ５１７１（４１１）部位と野生型ｌｏｘＰ（４０５）部位間で内在性マウス定常領域遺伝子（４２７）の上流のゲノムに組み込まれ、４４３で示されるＤＮＡ領域が創出される。

【0135】

ＲＭＣＥを受けず、部分的ネコＩｇｈ遺伝子座を組み込まなかったＥＳ細胞は、ｐｕｒｏ－ＴＫ融合遺伝子を保持しており（４０３）、組織培養培地にガンシクロビルを含めることで排除される。

【0136】

現在アノテートされている機能的ネコＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの配列を配列番号１～１３に示す。ネコＩＧＨ遺伝子座は完全にはアノテートされていないので、本明細書に記載の動物、細胞、および方法に使用できる遺伝子セグメントがさらに存在する。

【0137】

異種部分的ネコ免疫グロブリン領域のインテグレーションは、サザンブロット法、またはサザンブロット法などの二次スクリーニングによる確認を伴うＰＣＲ法によって検出できる。スクリーニング方法は、挿入されたＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、またはＪ_Ｈ遺伝子座の存在、ならびに介在配列を検出するように設計されている。ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。

【0138】

マウス重鎖遺伝子座に部分的ネコ免疫グロブリン重鎖可変領域（４４３）を保有するＥＳ細胞クローンを、標準的な手順に従ってＤＢＡ／２系統のマウス胚盤胞にマイクロインジェクションし、ＥＳ細胞由来のキメラマウスを創出する。ＥＳ細胞由来の被毛への寄与が最も高いオスのキメラマウスが、メスマウスとの交配に選ばれる。これらの交配から得られた子孫は、部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の存在について分析される。部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座を保有するマウスを用い、マウスのコロニーを作る。

【0139】

実施例２：マウスゲノムの免疫グロブリンカッパ鎖遺伝子座への異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の導入
マウスのＩｇκ遺伝子座の一部を部分的ネコＩｇκ遺伝子座と置換する方法を図５に示す。この方法は、第１の部位特異的リコンビナーゼ認識配列をマウスゲノムに導入することを含み、この部位特異的リコンビナーゼ認識配列は、マウスゲノムの内在性Ｖ_Ｋ（５１５）およびＪ_Ｋ（５１９）領域遺伝子セグメントのクラスターの５’または３’のいずれかに導入できる。次いで、第２の部位特異的リコンビナーゼ認識配列をマウスゲノムに導入し、この第２の部位特異的リコンビナーゼ認識配列は、第１の配列特異的組換え部位と組み合わせて、定常領域遺伝子（５２１）の上流のＶ_ＫおよびＪ_Ｋ遺伝子セグメントのクラスターを含む遺伝子座全体を挟む。関連する部位特異的リコンビナーゼを用いて、隣接領域(flanked region)を欠失させ、部分的ネコ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と置換する。

【0140】

Ｖ_Ｋ（５１５）およびＪ_Ｋ（５１９）遺伝子セグメントの両側に部位特異的組換え配列を導入するために用いられたターゲティングベクターは、リコンビナーゼによって依然として効率的に認識されるが、未改変部位とは組換えしないように改変された付加的な部位特異的組換え配列も含む。この部位は、Ｖ_ＫおよびＪ_Ｋ遺伝子セグメントクラスターの欠失後、ＲＭＣＥを介して異種免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を改変Ｖ_Ｋ遺伝子座に挿入する第２の部位特異的組換えイベントに使用できるように、ターゲティングベクターに配置される。この実施例では、異種免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座は、ネコＶ_ＫおよびＪ_Ｋ遺伝子セグメント、およびマウスＩｇκ可変領域非コード配列を含む合成核酸である。

【0141】

上記に説明したプロセスを達成するために、２つの遺伝子ターゲティングベクターが構築される。一方のベクター（５０３）は、遺伝子座の５’末端、すなわち最遠位Ｖ_Ｋ遺伝子セグメント（５１５）の上流から取得したマウスゲノムＤＮＡ（５２５および５４１）を含む。もう一方のベクター（５０５）は、Ｊ_Ｋ遺伝子セグメント（５１９）の下流（３’）かつ定常領域遺伝子（５２１）の上流の遺伝子座内から取得したマウスゲノムＤＮＡ（５４３および５４９）を含む。

【0142】

５’ベクター（５０３）の主な特徴は以下の通りである：ポリオーマウイルスからの２つの変異転写エンハンサーと結合した単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターによる転写制御下にある、ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子（５２３）；κ鎖遺伝子座の最遠位可変領域遺伝子の上流にマッピングされた６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ（５２５）；ＦｌｐリコンビナーゼのＦＲＴ認識配列（５２７）；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡの一部（５２９）；翻訳開始配列（５３５、「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に埋め込まれたメチオニンコドン）；Ｃｒｅリコンビナーゼの変異ｌｏｘＰ認識配列（ｌｏｘ５１７１）（５３１）；転写終結／ポリアデニル化配列（５３３）；ＣｒｅリコンビナーゼのｌｏｘＰ認識配列（５３７）；マウスホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子由来プロモーターの転写制御下で、切断型チミジンキナーゼ（ｐｕ－ＴＫ）に融合したピューロマイシン耐性を付与するタンパク質を含む融合タンパク質をコードする遺伝子（５３９）；ベクター中の５’末端の６Ｋｂ配列の近くにマッピングされ、ネイティブな相対配向で配置される２．５ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ（５４１）。

【0143】

３’ベクター（５０５）の主な特徴は以下の通りである：Ｊ_κ遺伝子座（５１９）とＣ_κ遺伝子座（５２１）の間のイントロン内にマッピングされた６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ（５４３）；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターの転写制御下にある、ヒトヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする遺伝子（５４５）；マウスホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子プロモーターの制御下にある、ネオマイシン耐性遺伝子（５４７）；ＣｒｅリコンビナーゼのｌｏｘＰ認識配列（５３７）；ゲノム中でベクターの５’末端に含まれる６ＫｂのＤＮＡ断片のすぐ下流にマップされる３．６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ（５４９）、これらの２つの断片はマウスゲノム内と相対的に同じ向きである；ポリオーマウイルスからの２つの変異転写エンハンサーと結合した単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターによる転写制御下にある、ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子（５２３）。

【0144】

Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に、既知の手順に従ってエレクトロポレーションにより３’ベクター（５０５）をトランスフェクトする。エレクトロポレーションに先立ち、ベクターＤＮＡは原核生物のプラスミド配列またはそれに付随するポリリンカーのみを切断するレアカット制限酵素で直鎖化される。トランスフェクトされた細胞はプレーティングされ、約２４時間後、ネオマイシン類似薬Ｇ４１８を用いて、３’ベクターをＤＮＡに組み込んだ細胞をポジティブ選択下に置く。相同組換えによってではなく、ベクターをＤＮＡに組み込んだ細胞にはネガティブ選択もある。非相同組換えではＤＴＡ遺伝子が保持されることになり、この遺伝子が発現すると細胞が死滅する。一方、ＤＴＡ遺伝子はマウスＩｇκ遺伝子座とのベクター相同性領域の外側にあるため、相同組換えによって欠失される。薬剤耐性ＥＳ細胞のコロニーは、約１週間後に肉眼で見えるようになった後、プレートから物理的に取り出される。ピックしたコロニーをバラバラにし、マイクロウェルプレートに再プレートし、数日間培養する。その後、各クローン細胞は、一部の細胞はアーカイブとして凍結保存され、残りは分析目的のＤＮＡ単離に使用されるように分割される。

【0145】

ＥＳ細胞クローンのＤＮＡは、遺伝子ターゲティングアッセイを用いてＰＣＲでスクリーニングされる。このアッセイでは、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター（５０５）とゲノムＤＮＡ（５０１）の間で共有される同一性の領域の外側にマップし、他方はベクター内のゲノム同一性の２つのアームの間の新規ＤＮＡ内、例えばＨＰＲＴ（５４５）またはネオマイシン耐性（５４７）遺伝子内にマップする。これらのアッセイは、３’ベクター（５０５）と内在性マウスＩｇκ遺伝子座との間で相同組換えを起こしたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにのみ存在するＤＮＡ断片を検出する。ＰＣＲポジティブのクローンは増殖のために選択され、その後サザンブロットアッセイを用いてさらに解析される。

【0146】

サザンブロットアッセイは、既知の手順に従って行われる；３種類のプローブおよび複数の制限酵素で処理したゲノムＤＮＡを用いる。それらは、プローブと処理物の組み合わせによって、クローン中の標的遺伝子座の構造や、相同組換えによって適切に改変されているかどうかについての結論を導き出せるように選択される。プローブの１つは、３’カッパターゲティングベクター（５０５）とゲノムＤＮＡの間で共有される同一性領域の５’側に隣接するＤＮＡ配列にマップする；第２のプローブも同一性領域の外側にマップするが、３’側にマップする；第３のプローブは、ベクター内のゲノム同一性の２つのアームの間の新規ＤＮＡ内、例えばＨＰＲＴ（５４５）またはネオマイシン耐性（５４７）遺伝子内にマップする。サザンブロットでは、正しく変異した、すなわち、３’カッパターゲティングベクター（５０５）との相同組換えにより変異したカッパ遺伝子座の一部に対応する、予想される制限酵素生成ＤＮＡ断片の存在が、外部プローブの１つとネオマイシン耐性またはＨＰＲＴ遺伝子プローブによって検出され、同定される。外部プローブは、変異型断片を検出し、相同染色体上の免疫グロブリンκ遺伝子座の非変異型コピーからの野生型断片も検出する。

【0147】

ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータに基づいて、予想される正しいゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンは、さらなる使用のために選択される。

【0148】

３’ベクター（５０５）で使用したものと本質的に同じデザインの手順とスクリーニングアッセイを用いて、受容可能なクローンを５’ベクター（５０３）で改変する。ただし、Ｇ４１８／ネオマイシン選択法の代わりにピューロマイシン選択法を使用し、５’ベクター（５０３）によって改変されたゲノム領域に適合するようにプロトコルを調整する。５’ベクター（５０３）のトランスフェクション実験の目的は、３’ベクター（５０５）と５’ベクター（５０３）の両方によって予想される形で変異した、すなわち両方の操作された変異を有する二重標的細胞ＥＳ細胞のクローンを単離することである。これらのクローンでは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって、２つのベクターによってκ遺伝子座に導入されたｌｏｘＰ部位の間で組換え（５０２）が起こり、５０７に示したゲノムＤＮＡの配置が生じる。

【0149】

さらに、クローンは、相同染色体ではなく、同じ染色体上で遺伝子ターゲティングを受けたものでなければならない；すなわち、ターゲティングベクターによって創出された操作された変異は、別々の相同ＤＮＡ鎖上のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖上のシスでなければならない。シス配置のクローンとトランス配置のクローンは、２つの遺伝子ターゲティングベクター（５０３および５０５）のゲノム同一性アームの間に存在する新規ＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いたメタフェーズスプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどの分析的手順によって区別される。この２つのタイプのクローンは、ターゲティングベクターがシスに組み込まれるとｐｕ－Ｔｋ（５３９）、ＨＰＲＴ（５４５）、およびネオマイシン耐性（５４７）遺伝子を欠失させるＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、５’ベクターによって導入されたチミジンキナーゼ遺伝子（５０３）に対するガンシクロビル選択に耐えるコロニーの数を比較し、クローンからの細胞の一部がピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する耐性を試験される「兄弟選択」スクリーニング手順によって、生き残ったクローンの薬剤耐性表現型を分析することによっても区別できる。変異がシス配置の細胞は、トランス配置の細胞よりも約１０^３多くのガンシクロビル耐性クローンを産生すると予想される。得られたシス由来のガンシクロビル耐性クローンの大部分は、ピューロマイシンとＧ４１８／ネオマイシンの両方にも感受性であるはずで、対照的にトランス由来のガンシクロビル耐性クローンは両方の薬剤に耐性を保持しているはずである。κ鎖遺伝子座にシス配置の操作された変異を保有する細胞のクローンは、さらなる使用のために選択される。

【0150】

二重標的クローン細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（５０２）を発現するベクターで一過性にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞はその後、上に要約した分析実験と同様にガンシクロビル選択下に置かれる。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’ベクター（５０３）と３’ベクター（５０５）により創出された２つの人工変異の間に予想される欠失（５０７）が存在するかどうかをＰＣＲとサザンブロットで分析する。これらのクローンでは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって、２つのベクターによってκ鎖遺伝子座に導入されたｌｏｘＰ部位（５３７）の間で組換えが起こる。ｌｏｘＰ部位は２つのベクターで同じ相対的な向きに配置されているため、組換えでは２つのｌｏｘＰ部位の間のゲノム間隔全体を含むＤＮＡ環が切除される。この環は複製起点を持たないため、有糸分裂の際に複製されず、そのためクローン細胞がクローン拡大をする際にクローン細胞から失われる。得られたクローンは、もともと２つのｌｏｘＰ部位の間にあったＤＮＡが欠失したものである。ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータに基づいて、予想される正しいゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンは、さらなる使用のために選択される。

【0151】

免疫グロブリンカッパ鎖遺伝子座の２つの相同コピーのうちの１つに配列の欠失を有するＥＳ細胞クローンを、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターと、Ｖκ（５５１）およびＪκ（５５５）遺伝子セグメントを含む部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を含むベクター（５０９）とで再トランスフェクトする（５０４）。このベクターの主な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位（５３１）；ネオマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレーム（５４７）、これは、開始メチオニンコドンを欠くが、メチオニン開始コドン（５３５）の下流のｌｏｘ５１７１部位（５３１）の中断されないオープンリーディングフレームとインフレームで連続している；ＦＲＴ部位（５２７）；１２個のネコＶκ遺伝子セグメントのアレイ（５５１）であって、各々が、３’側でマウスＲＳＳによって挟まれ、かつマウス非コード配列に埋め込まれたネココード配列を含むアレイ；場合により、マウスκ鎖遺伝子座のＪκ領域遺伝子セグメントのクラスターのすぐ上流からの１３．５ＫｂのゲノムＤＮＡ断片（図示せず）；５’側でマウスＲＳＳによって挟まれ、マウス非コードＤＮＡに埋め込まれた、５つのネコＪκ領域遺伝子セグメントを含むＤＮＡ（５５５）；ｌｏｘ５１７１部位（５３１）とは相対的な向きが反対のｌｏｘＰ部位（５３７）。

【0152】

機能的ネコＶκおよびＪκ遺伝子コード領域の配列を配列番号１４～３０に示す。

【0153】

トランスフェクトされたＥＳクローンはＧ４１８選択下に置かれ、ＲＭＣＥを経た細胞のクローンが濃縮される。ＲＭＣＥでは、５’ベクター（５０３）と３’ベクター（５０５）によってそれぞれそこに置かれたｌｏｘ５１７１部位（５３１）とｌｏｘＰ部位（５３７）の間の欠失した内在性免疫グロブリンκ鎖遺伝子座に、部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を含むドナーＤＮＡ（５０９）の全体が組み込まれる。ＲＭＣＥを適切に経た細胞だけが、ネオマイシン耐性遺伝子（５４７）を発現する能力を持つが、それはその発現に必要なプロモーター（５２９）および開始メチオニンコドン（５３５）はベクター（５０９）には存在せず、改変宿主細胞のＩｇκ遺伝子座（５０７）にすでに存在しているからである。５０９の配列を使って創出されたＤＮＡ領域を５１１に示す。ＦＲＴ部位（５２７）の間に位置する５’ベクター（５０３）からの残りのエレメントは、以下に記載するように、Ｆｌｐ媒介組換え（５０６）を介してインビトロまたはインビボで除去され、その結果、５１３に示すように、部分的ネコ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が生じる。

【0154】

Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンは、ＰＣＲとサザンブロッティングによって解析され、不要な再構成または欠失がなく、期待されるＲＭＣＥプロセスを経たかどうかが判定される。ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。このような異常のあるクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータに基づいて、予想される正しいゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンは、さらに使用するために選択される。

【0155】

内在性マウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子座（５１３）に部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を有するＥＳ細胞クローンを、標準的な手順に従ってＤＢＡ／２系統のマウス胚盤胞にマイクロインジェクションし、部分的ＥＳ細胞由来のキメラマウスを創出する。ＥＳ細胞由来の被毛への寄与が最も高いオスのキメラマウスが、メスマウスとの交配に選ばれる。交配に使用する雌マウスはＣ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統で、生殖細胞系列で発現するＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持ち、５’ベクターからＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子（５２０）および他のエレメントを欠失させる。これらの交配から得られた子孫は、部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の存在とネオマイシン耐性遺伝子の欠損について分析される。部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を保有するマウスを使い、マウスのコロニーを作る。

【0156】

実施例１に記載したようにして生成した部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを、部分的ネコ免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を有するマウスと交配させることができる。その子孫を交配させ、最終的に部分的ネコＩｇｈおよび部分的ネコＩｇκの両方をホモ接合体で有するマウスを生成する。このようなマウスは、ネコ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む部分的ネコ重鎖を産生する。また、ネコカッパ可変ドメインおよびマウスカッパ定常ドメインを含む部分的ネコカッパタンパク質も産生する。これらのマウスから回収されたモノクローナル抗体には、ネコカッパ可変ドメインと対になったネコ重鎖可変ドメインが含まれる。

【0157】

一態様において、部分的ネコＩｇｈおよび部分的ネコＩｇκの両方についてホモ接合体であるマウスを、実施例３で生成した部分的ネコラムダ遺伝子座についてホモ接合体であるマウスと交配し、３つの遺伝子座すべてについてホモ接合体であるマウスを創出する。

【0158】

当業者であれば、Ｉｇκ遺伝子座を標的とするためにここで用いた５’ベクター（５０３）およびその後の戦略を、Ｉｇｈ遺伝子座を標的とする代替戦略として、図２の５’ベクター（２０１）の代わりに用いることもできることを認識するであろう。この場合、５’ベクター（５０３）は、Ｉｇκ遺伝子座に相同なゲノムＤＮＡ領域（５２５および５４１）を、Ｉｇｈ遺伝子座に相同なゲノムＤＮＡ領域（図２の２１３および２１５）と置換するように改変される。

【0159】

実施例３：マウスゲノムの免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座への異種部分的ネコ免疫グロブリン遺伝子座の導入
マウスＩｇλ遺伝子座の一部を部分的ネコＩｇλ遺伝子座と置き換える方法を図６に示す。この方法は、内在性マウス免疫グロブリンλ遺伝子座のＶλ２／Ｖλ３遺伝子セグメント（６１３）の上流およびＣλ１遺伝子セグメント（６１７の右端のボックス）の下流、ならびにＥλエンハンサー（６２３）の上流または下流と同一性を共有するターゲティングベクター（６０３）を含む相同組換えプロセスによって、野生型マウス免疫グロブリンラムダ遺伝子座（６０１および図１、下）から、Ｖλ２／Ｖλ３遺伝子セグメント（６１３）、Ｊλ２／Ｃλ２遺伝子クラスター（６１５）、およびＶλ１－Ｊλ３／Ｃλ３－Ｊλ１／Ｃλ１遺伝子クラスター（６１７）を含む約２００ＫｂのＤＮＡを欠失させることを含む。このベクターは、約２００Ｋｂの内在性マウスゲノムＤＮＡを、異種免疫グロブリンラムダ遺伝子座がＲＭＣＥを介して改変Ｖλ遺伝子座を置換する後続の部位特異的組換えを可能にするように設計されたエレメントで置換する（６０４）。この実施例では、異種免疫グロブリンラムダ遺伝子座は、ネコＩｇλコード配列とマウスＩｇλ非コード配列を含む合成核酸である。

【0160】

約２００Ｋｂの欠失を達成し、部位特異的組換え部位を挿入するための遺伝子ターゲティングベクター（６０３）の主な特徴は以下の通りである：ジフテリア毒素のＡサブユニット（ＤＴＡ、６５９）をコードする遺伝子または単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（図示せず）などのネガティブ選択遺伝子；免疫グロブリンラムダ遺伝子座におけるマウスＶλ２／Ｖλ３可変領域遺伝子セグメントの５’から４ＫｂのゲノムＤＮＡ（６２５）；ＦＲＴ部位（６２７）；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡ（６２９）；翻訳開始配列（「コザック」コンセンサス配列に埋め込まれたメチオニンコドン）（６３５）；Ｃｒｅリコンビナーゼの変異ｌｏｘＰ認識配列（ｌｏｘ５１７１）（６３１）；転写終結／ポリアデニル化配列（６３３）；ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（６３７）、ただし、このオープンリーディングフレームは、Ｐｏｌｒ２ａプロモーターおよびその隣の翻訳開始配列に対してアンチセンス鎖上にあり、そしてそれ自身の転写終結／ポリアデニル化配列（６３３）が続く；ＣｒｅリコンビナーゼのｌｏｘＰ認識配列（６３９）；ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームと同じ、アンチセンス鎖上の翻訳開始配列（「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に埋め込まれたメチオニンコドン）（６３５）；ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレームの転写を指示するように配向されたニワトリベータアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント（６４１）、ここで、翻訳はｌｏｘＰ部位（６３５）の下流の開始コドンで開始し、ｌｏｘＰ部位を経て、ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレームへと後ろ向きに続き、これらはすべてＰｏｌｒ２ａプロモーターおよびその隣の翻訳開始配列に対してアンチセンス鎖上にある；Ｆｌｐリコンビナーゼのための変異した認識部位（６４３）；Ｅλエンハンサーエレメント（６２３）を含むゲノムＤＮＡ（６４５）。

【0161】

Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、既知の手順に従って、ターゲティングベクター（６０３）を用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクト（６０２）する。相同組換えは、内在性のマウス免疫グロブリンラムダ遺伝子座を、約２００Ｋｂの領域においてターゲティングベクター（６０３）由来の部位特異的組換え部位と置換し、６０５に描かれているゲノムＤＮＡ配置をもたらす。

【0162】

エレクトロポレーションに先立ち、ベクターＤＮＡは原核生物のプラスミド配列またはそれに付随するポリリンカーのみを切断するレアカット制限酵素で直鎖化される。トランスフェクトされた細胞はプレーティングされ、約２４時間後、ピューロマイシンを用いたポジティブ薬物選択下に置く。相同組換えによってではなく、ベクターをＤＮＡに組み込んだ細胞にはネガティブ選択もある。非相同組換えではＤＴＡ遺伝子（６５９）が保持されることになり、この遺伝子が発現すると細胞が死滅する。一方、ＤＴＡ遺伝子はマウスＩｇλ遺伝子座とのベクター相同性領域の外側にあるため、相同組換えによって欠失される。薬剤耐性ＥＳ細胞のコロニーは、１週間以上経って肉眼で見えるようになった後、プレートから物理的に取り出される。これらのコロニーをバラバラにし、マイクロウェルプレートに限界希釈で再プレーティングし、数日間培養する。その後、各クローン細胞は分割され、一部はアーカイブとして凍結保存され、残りは分析目的のＤＮＡ単離に使用される。

【0163】

ＥＳ細胞クローンのＤＮＡは、既知の遺伝子ターゲティングアッセイを用いてＰＣＲでスクリーニングされる。これらのアッセイでは、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方はターゲティングベクターとゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域の外側にマップし、他方はベクター内のゲノム同一性の２つのアームの間の新規ＤＮＡ内、例えばｐｕｒｏ遺伝子（６３７）内にマップする。これらのアッセイは、ターゲティングベクター（６０３）と内在性ＤＮＡ（６０１）との間で相同組換えを起こしたトランスフェクト細胞由来のクローンにのみ存在するＤＮＡ断片を検出する。

【0164】

トランスフェクションで得られたＰＣＲポジティブのクローンを選択し、サザンブロットアッセイを用いてさらに解析する。サザンブロットには、３種類のプローブおよび複数の制限酵素で処理されたクローン由来のゲノムＤＮＡが含まれ、プローブと処理物の組み合わせによって、ＥＳ細胞ＤＮＡが相同組換えによって適切に改変されたかどうかを同定できるように選択されている。

【0165】

ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。異常の証拠を示すクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータに基づいて、予想される正しいゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンは、さらなる使用のために選択される。

【0166】

免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座の２つの相同コピーの１つに配列の欠失を有するＥＳ細胞クローンを、ネコＶλおよびＪλ領域遺伝子セグメントコード配列を含む部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座を含むベクター（６０７）とともにＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする（６０４）。このベクター（６０７）の主な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位（６３１）；ネオマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレーム（６４７）、これは、開始メチオニンコドンを欠くが、ｌｏｘ５１７１部位（ダイアグラム６０５内の６３１）の中断されないオープンリーディングフレームとインフレームで連続している；ＦＲＴ部位（６２７）；３２個の機能的ネコλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、各遺伝子セグメントは、３’側でマウスＲＳＳによって挟まれ、かつマウスラムダ非コード配列に埋め込まれたネコラムダコード配列を含むアレイ（６５１）；Ｊ－Ｃユニットのアレイであって、各ユニットは、ネコＪλ遺伝子セグメントおよびマウスラムダ遺伝子座からの非コード配列に埋め込まれたマウスラムダ定常ドメイン遺伝子セグメントを含むアレイ（６５５）であり、Ｅλ２－４エンハンサーエレメントを含む（図１）。ネコＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、およびＪλ４－１１をコードするものである。他のＪλ遺伝子セグメント、Ｊλ３およびＪλ１２は非機能性ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）であり、一方、マウスラムダ定常ドメイン遺伝子セグメントはＣλ１、Ｃλ２、またはＣλ３、またはそれらの組み合わせである；Ｆｌｐリコンビナーゼの変異した認識部位（６４３）；ハイグロマイシン耐性を付与するオープンリーディングフレーム（６５７）であって、コンストラクト中の免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードする情報に対してアンチセンス鎖上に位置するオープンリーディングフレーム；ｌｏｘ５１７１部位に対して相対的な向きが反対であるｌｏｘＰ部位（６３９）。

【0167】

ＲＣＭＥは、ＲＣＭＥベクター（６０７）由来の部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座を、改変された内在性マウスＩｇλ遺伝子座に挿入し、その結果、６０９に描かれているゲノムＤＮＡ構成が得られる。

【0168】

機能的ネコＶλおよびＪλ遺伝子コード領域の配列を配列番号３１－７３に示す。

【0169】

トランスフェクトされたクローンはＧ４１８またはハイグロマイシン選択下に置かれ、ＲＭＣＥ過程を経た細胞のクローンが濃縮される。ＲＭＣＥ過程では、遺伝子ターゲティングベクターによってそこに置かれたｌｏｘ５１７１部位とｌｏｘＰ部位の間の欠失した内在性マウス免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座に、部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖可変体が組み込まれる。ターゲティングベクター（６０３）からの残りのエレメントは、ＦＬＰ媒介組換え（６０６）を介してインビトロまたはインビボで除去され（下記参照）、その結果、６１１で示されるように、最終的に部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座が生じる。

【0170】

６１１の部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座の１つの配置のより詳細な図を６１３に示すが、これは例として提供されているに過ぎない。ネコＶλおよびＪλ遺伝子セグメントおよびマウスのＣλ遺伝子セグメントの他の配置と数、ならびにエンハンサーエレメントの他の位置と数も可能である。

【0171】

Ｇ４１８／ハイグロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンは、ＰＣＲとサザンブロッティングによって分析され、不要な再構成や欠失を伴わずに、期待されるリコンビナーゼ仲介カセット交換過程を経たかどうかが判定される。ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロットポジティブクローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生じる最も一般的な染色体異常を区別するためにデザインされたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析する。異常の証拠を示すクローンは、以降の使用から除外される。サザンブロットのデータに基づいて、予想される正しいゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンは、さらなる使用のために選択される。

【0172】

マウス免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座に部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座（６１１）を有するＥＳ細胞クローンを、既知の手順に従ってＤＢＡ／２系統のマウス胚盤胞にマイクロインジェクションし、部分的ＥＳ細胞由来キメラマウスを創出する。ＥＳ細胞由来の被毛への寄与が最も高いオスのキメラマウスが、メスマウスとの交配に選ばれる。ここで選択した雌マウスはＣ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統で、生殖細胞系列に発現するＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持ち、ＦＲＴ隣接選択マーカーを欠失させる。これらの交配から得られた子孫は、部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座の存在、およびＲＭＣＥステップで創出されたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子とｍＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性遺伝子の欠損について分析される。部分的ネコ免疫グロブリンラムダ鎖遺伝子座を有するマウスを用い、マウスのコロニーを作る。

【0173】

一態様において、部分的ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子座および部分的ネコ免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座（実施例１および２に記載）に対してホモ接合体であるマウスを、部分的ネコ免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子座を有するマウスと交配する。このタイプの交配から生まれたマウスは、部分的ネコＩｇｈ遺伝子座をホモ接合体、部分的ネコＩｇκ遺伝子座とＩｇλ遺伝子座をホモ接合体としている。これらのマウスから回収されたモノクローナル抗体には、ある場合ではネコカッパ可変ドメインと、他の場合ではネコラムダ可変ドメインと対になったネコ重鎖可変ドメインが含まれる。

【0174】

配列情報
ＩＧＨＶ
配列番号１: > LOC101082137
Atggagtttgtgctgggctgggttctcctggttgctcttttaaaaggtgtccagtgtgacgtgcagctggtggagtctgggggagacctggtgaagcctggggggtccctgagactcacctgtgtagcctctggattcaccttcagtagttccagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtgggtcgcatatatttatgatgatggaagtagcacatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctgtatctgcagatgaacaacctgaagaccgaggacacggccacatattactgtgcaagagacacggtgaggggacctcactgggagcccagacacaaacctccctgcaggaggggatcagcaccaccagggggcgcacactatgcacaactctggtttgtgttcccaggagcaggtgcagatggaggttacaggcaggtttcctgtcagggtctggggcttcctctccacacagcagtttccccagggagcctctctggacacaggattctgtactttcctgttcattccttgactta

【0175】

配列番号２: > LOC101093781
Atggagtttgtgctgggctgggttttcctggttgctcttttaaaaggtgtccagtgtgacgtgcagctggtggagtctgggggagacctggtgaagcctggggggtccctgagactcacctgtgtggcctctggattcaccttcagtagctatggaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtgggtcgcatatattagatatgatggaagtagcacatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctgtatctgcagatgaacagcctgaagaccgaggacacggccacatattactgtgcaagagacacgctgaggggacctcactgggagcccacacacaaacctccctgcaggaggggatcagcaccaccagggggcgcacactatgcacaattctggtttgtgttcccaggagcaggtgcagatggaggttacaggcaggtttcctgtcagggtctggggcttcctctccacacagcagtttctccagggagcctctctggtcacaggattctgtgtttatctattaactctctgaattag

【0176】

配列番号３: > LOC111559009
atggagtttgtgctgggctgggttttcctggttgctcttttaaaaggtgtccagtgtgacgtgcagctggtggagtctgggggagacctggtgaagcctggggggtccctgagactcacctgtgtggcctctggattcaccttcagtagctactacatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtgggtctcatggattaatactgatggaagtagcacaagctacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctgtatctgcagatgaacagcctcaagaccgaggacacggccacatattactgtgcgagagacacagtgaggggacctcactgggagcccagacacaaacctccctgcaggaggggatcagcaccaccagggggcgcacactatgcacaattctcctttgtgttcccaggcgcaggtgcagatggaggttacaggcaggtttcctgtcagggtctggggcttcctctccacacagcagtttccccagggagcctccctggttatatgattctgtgtttacctattaactctctgaattag

【0177】

配列番号４: > LOC111560938
atgcagatgctgtggtccctcctctgcctgctggcagctcccctgggtgtcctatctcaacttacacttcgggagtccggcccaggactggtgaagccttcacaatccctctctctcacctgcgttgtctccggaggctctgttaccagcagttactactggaactggatccgccagcgccctgggagagggttggagtggctggggtactggtcaggtagcaccagctacaacccggctttccagggccgcatctccatcactgctgacacagcccagaaccagttctccctgcagctgagctccatgaccaccgaggacacggccgtgtattactgtgcaagaagcacagtgagggaaagtcagtgtgagctcagtcacaaaccttggtgcagggacctggaggggctgggctgcaggggcgctcaggatccacaagagggcacacaggacctaccaggggaactagggcatcagggggtgcttagggccccttaccacagggaccagcccagaaacaggggcagagcaggagtgaggtccccactgtcagtatctggagctttctcttcctggcactctgatcctatggggacctccctttctttcttgcttgcgttcccttttgtttcagtcccagtgtg

【0178】

ＩＧＨＤ
配列番号５: >DH206
GCATAGCGGAAGCTGGTCC

【0179】

配列番号６: >DH447
GGTAGTAGCGGGTGGGCT

【0180】

配列番号７: >DH1151
TTACTACGATAGCGACTATGCC

【0181】

配列番号８: >DH2663
TCTATAACTACGGGTGGTAC

【0182】

ＩＧＨＪ
配列番号９: JH1
Cctatgattacttccagttttggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcag

【0183】

配列番号１０: JH2
caatacttttggtatctggggccaaggtacccaggtcaccgtctcccaag

【0184】

配列番号１１: JH3
actactttgactactggggccaaggagccctggtgacggtgtcctcag

【0185】

配列番号１２: JH4
Actactttgactactggggccaaggagccctggtgacggtgtcctcag

【0186】

配列番号１３: JH5
attactacggtatcgatctctggggccatggaaccatagtcacagtgtcctcag

【0187】

ＩＧＫＶ
配列番号１４: >IMGT000050|IGKV1-10*01
atgaaggcccccgctcagctcctgggcctcctgctgctctggctcccaggagccagctgc
gaaatccagatgacccagtctccatcctcgctgtctgcatctccaggagacagagtcacc
atcacctgccgggcgagtcagaacgttaacacgtggttagcctggtatcagcagaaaccg
gggaaagttcctaagcttctgatctatcgtgcatccacgttgcaaactggggtcccctcg
cggttcagcggcagtgggtctgggacagatttcaccctcaccatcagcagcctggagcct
gaagacgctgccacttactactgtcagcagcataacagcggcatc

【0188】

配列番号１５: >IMGT000050|IGKV1-17*01
atgaaggcccccgctcagctcctgggcctcctgctgctctggctcccaggagccagctgt
gaaatccagatgacccagtctccatcctcgctgtctgcatctccaggagacagagtcacc
atcacctgccgggcgagtcagaatgttaacacgtggttagcctggtatcagcagaaaccg
gggaaagttcctaagcttctgatctatcgtgcatccacgttgcaaactggggtcccctcg
cggttcagcggcagtgggtctgggacagatttcaccctcaccatcagcagcctggagcct
gaagacgctgccacttactactgccagcaaagtagcaatctccctcc

【0189】

配列番号１６: >IMGT000050|IGKV2-4*01
atgaggttccctgctcagctgctggggctgctgatgctctggatcccaggatccagtggg
gatgtcgtgatgacgcagacccctctgtccctgcccgtcacccctggagagccggcctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcacagtaatggaaatacttatctgaattgg
tacctgcagaagccaggccagtctccacggcgactgatctataaggtttccaaccgggac
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccctgagaatc
agcagggtggaggctgacgacgtcggagtttattactgccagcaaggtacacatgctcct
cg

【0190】

配列番号１７: >IMGT000050|IGKV2-5*01
atgaggttccctgctcagctgctggggctgctgatgctctggatcccaggatccagtggg
gatgtcgtgatgacgcagacccctctgtccctgcccgtcacccctggagagccggcctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcacagtaatggaaatacttatctgaattgg
tacctgcagaagccaggccagtctccacggcgactgatctataaggtttccaaccgggac
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccctgagaatc
agcagggtggaggctgacgacgtcggagtttattactgccagcaaggtacacatgctcct
cg

【0191】

配列番号１８: >IMGT000050|IGKV2-9*01
atgaggttccctgctcagctgctggggctgctgatgctctggatcccaggatccagtggg
gatgtcgtgatgacgcagacccctctgtccctgcccgtcacccctggagagccggcctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcacagtaatggaaacacctatttacattgg
tacctgcagaagccaggccagtctccacggcgactgatctatagggtttccaaccgggac
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccctgagaatc
agcagggtggaggctgacgacgtcggagtttattactgcctgcaaggtacacacagacct
cc

【0192】

配列番号１９: >IMGT000050|IGKV2-12*01
atgaggttccctgctcagctcctgggactcatcatgctctggatcccaggatccagtggg
gatattgtgatgacgcagacccctctgtccctgtccgtcacccctggagagccagcctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcacagtgatggaaatacttatctgaattgg
tacctgcagaagccaggccagtctccacggcgcttgatctatcttgtttccaaccgggac
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccctgagaatc
agcagggtggaggctgacgacgtcggtgtttattactgcggtcaagctttacagtatcct
cc

【0193】

配列番号２０: >IMGT000050|IGKV2-13*01
atgaggttccctgctcagctcctggggctgctagtgctttggttccctggatccggtgcg
gatgtcgtgatgacacagacccctctgtccctgcctgtcacccctggagagccggcctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcacagtgatggaaatacttatctgaattgg
tacctgcagaagccaggccagtctccacggcgactgatctataaggtttccaaccgggac
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccctgagaatc
agcagggtagaggctgacgacgtcggagtttattactgcctgcaaggtacaaagtatcct
ac

【0194】

配列番号２１: >IMGT000050|IGKV2-14*01
atgaggttccctgctcagctcctggggctgctagtgctttggttccctggatccagtggg
gatgtcatgatgacccagacccttctgtccctgcccgtcgcccctggacagccgggctca
atctcctgcagggccagtcagagcctcctgcccagcaatggatactcctatttaagttgg
tacctgcagaagacaggccagtctccacagcgcccgatctatcaggtttccaaccgggcc
tctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactcaaaatc
aacagagtggaggctgaggatgtgggagtttattgctgcttgcaagatatacaacttcct
ct

【0195】

配列番号２２: >IMGT000050|IGKV4-1*01
atggtgacccagaggcaggtcctcctatccttgttgctgtgggtctcaggtgcctgtggg
gcgatcacgatgacgcagtctccaggctccctggctgggtctccaggtcagcaggtcacc
atgaactgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccagcagaaacca
gggcagcatcctaagctgctcatctactcagcttccacccgggcatctggagtccccgac
cgattcagtggcagtgggtccgggacggatttcaccctcaccatcagcaacctccaggct
gaagacgtggcgagttactactgtcagcagtattacagctctcctcc

【0196】

配列番号２３: >IMGT000050|IGKV6-6*01
atggtgtctccatcacagcttcttgggcttctgctcctctgggttccagcctccagtggt
gaggttgtgctgacccagtcctcagccttcctgtccaggactctaaaagaaaaagccacc
atcacctgccgagccaatcagggcatcagcaccatcttgcactggtatcagcagaaacca
aatcaggctccgaagctccttgtgaagtatgcttcccagtccgtctcgggagcgccgtcg
cggttcagcggcagtgggtctgggacagatttcaccctcaccatcagcagcccggagcct
gaagacgctgccacttactactgccagcaaagtaacaatctccctcg

【0197】

配列番号２４: >IMGT000050|IGKV8-3*01
atgggggtcctgacccagctcctctgccttctgctggcctgcctcccagctgccggcggg
accactgagttgacccagtctcccacccatctctctgtgtccctgacagacagcgtgtcc
gtcatctgcagggccagtgagagcattagtgatcacttaagctggtatcagcagaaacca
ggccagcctcccaagcttatcatctatgatgccgataacctagagtctggcgtctcagac
cgcttctctgggattcagtctggcacagaattcatcctcaaaatcagcacagtcgaggct
gatgacgccgccgcttattactgccagcagggttatgcgcttcctcc

【0198】

配列番号２５: >IMGT000050|IGKV8-16*01
atgggggtcctgacccagctcctctgccttctgctggcctgcctcccagctgccagcggg
accgctgagttgacccagtctcccacccatctctctgtgtccctgacagacagcgtgtcc
ctcatctgcagggccaatgagagcgttagtgattacttaagctggtatcagcagaaacca
ggccagcctcccaagcttatcatctatgatgccgataatctagagtctggcgtctcagac
cgcttctctgggattcagtctgacacagaattcatcctcaaaatcagcacagtcgaggct
gatgacgccgccatttattactgccagcaggattatgcgcttcctcc

【0199】

ＩＧＫＪ
配列番号２６: >IMGT000050|IGKJ1*01
gtggacgtttggccaaggaaccaagctggaagtcaaac

【0200】

配列番号２７: >IMGT000050|IGKJ2*01
tgtacaatttcggccaggggacgaagctggagataaaac

【0201】

配列番号２８: >IMGT000050|IGKJ3*01
gttcactttcggccaggggaccaaactggagatgaaac

【0202】

配列番号２９: >IMGT000050|IGKJ4*01
gctcactttcggcccaggtaccaagctggagatcaaac

【0203】

配列番号３０: >IMGT000050|IGKJ5*01
gaccacctttggccaagggacacatctggagattaaac

【0204】

ＩＧＬＶ
配列番号３１: >IMGT000038|IGLV1-32*01
atggcttggtctccggtccttctcaccctcctcgctcactgcacagggtcctgggcccagtctgtactggctcagccatcctcggtgtcaggctccttgggccagagggtcaccatctcctgctctggaagcagttccaacatcggtagcaattatgtgagctggtaccaacaactcccaggcacaacccccaaaaccataatctattgggataatagcagaccctcgggggtctctgaacgattctctggctccaagtctggcagcacaggcaccctgaccatcactgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgctcagcatgggatggtagtctgagagctca

【0205】

配列番号３２: >IMGT000038|IGLV1-36*01
atggcctggtctcctctcctcctcatcctcctcgctcactgcacagtgtcctgggcccag
tctaggctgactcagccgccctcagtgtctggttctctgggccagagggtcaccatctcc
tgcgctggaagcagctctaatattggtggttatggtgtgaactggcaccaacaattccca
ggaatggcccccaaaaccatcatctatggtaatagcaatcgaccctctggggtcccagat
cgattctccggctccaagtctggcaacacaggcaccctgaccatcactgggctccaggct
gaggacgaggctgattattactgctcatcgtgggacagcagtagcagtgctcg

【0206】

配列番号３３: >IMGT000038|IGLV1-36*01
atggcctggtctcctctcctcctcatcctcctcgctcactgcacagtgtcctgggcccag
tctaggctgactcagccgccctcagtgtctggttctctgggccagagggtcaccatctcc
tgcgctggaagcagctctaatattggtggttatggtgtgaactggcaccaacaattccca
ggaatggcccccaaaaccatcatctatggtaatagcaatcgaccctctggggtcccagat
cgattctccggctccaagtctggcaacacaggcaccctgaccatcactgggctccaggct
gaggacgaggctgattattactgctcatcgtgggacagcagtagcagtgctcg

【0207】

配列番号３４: >IMGT000038|IGLV1-37*01
atggcctggtcccctctcctcctcaccctcctcattcactgcacagggtcctgggcccag
tctgtgttgagtcagccaccctcagtgtctggggccctgggccagacggtcaccatcccc
tgcgctggaggtgccaacaacatcggtattgctggtgggaactggtaccaacagcttcca
ggaaaggcccctaaactcctcatctatgatagtagcgatcgaccctcaggggtccctgaa
cgattctctggctccaagtctggcaacacaggctccttgaccatcactgggctccaggct
gaggacgaggctgattattactgccagtctcttgactttactcaaggtgctga

【0208】

配列番号３５: >IMGT000038|IGLV1-40*01
atggcctggacccctcttctcctcaccctacttgctcactgtacagggtcctgggcccag
tctgtgctgactcagccaccatcagtgtctgggaccctaggccagaggatcaccatctcc
tgcaccggaagcagctccaacatcgggggtggtaatgctgtgagctggtaccaacaagtc
ccaggaatgggccccaaaaccgtcatctattggaataacagcaaaccctcgggggtccca
gatagattctccggctcaaagtctggcagttcaggcaccctgaccatcactgggctgcag
gctgaggacgaggctgattattactgctcagcgtgggatgatagtctcagtgctca

【0209】

配列番号３６: >IMGT000038|IGLV1-42*01
atggcctggtctcctttccttctcactctcctcgctcactgcacagggtcctgggcccag
tctgtgctgactcagccgccctcagtgtcggggtccctgggccagagggtcaccatctcc
tgcactggaagcagctccaacatcgggggtggtaattatgtgagctggtaccaacaagtc
ccaggaacggcccccaggctcctgatttatgagaataacaaacgaccctccggggtcccc
gatcgattctctggctccaagtctggcagctcaggctccctgaccatcactgggctgcag
gctgacgacgaggctgattattattgtgcatcatgggacaatagtctcagtgctca

【0210】

配列番号３７: >IMGT000038|IGLV1-51*01
atggcctggttccctcttctcctgacccttctcatccactgcacagggtcctgggcccag
tctgtgctgactcagccgccctcagtgtctggggccctggggcagacggtcaccatctcc
tgcgctggaagtaggagcaacatcggtattgctggtgtgaactggtaccaacagcttcca
ggaaaggcccctaaactcctctctatgctaatagacagaaacaaccctcatgggttccct
gaacgaatccgcgaatctcctggctccaagtctggcaacacaggctccttgaccatcact
gggctccaggctgaggacgaggctgattattactgctcagcatgggatgctattctgaaa
gctca

【0211】

配列番号３８: >IMGT000038|IGLV1-56*01
atggcctggtcctttctcctcctcaccctcctcgctcactgcacagggtcctgggctcag
tctgtgctgactcagccgccctcagtgtctggggccctgggccagagggtcaccatctcc
tgcactggaagcagctccaacatcgggcgtggtaattatgtgagctggtaccaacaactc
tcaggaacagctcccaaactcctcatctatggtaatagcaatcgaccctcgggggtccca
gatcgattttctggctccaagtctggcagcacaggctccttgaccatcactgggctgcag
gctgaggacgaggctgattattactgtgcagcgtgggacagcagtctcaatgctca

【0212】

配列番号３９: >IMGT000038|IGLV1-61*01
atgtcctggtctcctgtccttctcgccctcttcactcactgcacagggtcctgggcccag
tctgtactgactcagccaccctcggtgtcaggctccttgggccagagggtcaccatctcc
tgcactggaagcagctcccacatcagtaacaattttgtgaactggtaccaacaactccca
ggcacaacccccaaaaccataatcctttgggatgatagcagaccctcgggggtctctgaa
cgattctctggctccaagtctggcagcacaggcaccctgaccatcactgggctccaggct
gaggacgaggctgattattactgctcagcatgggatgatagtctgagagctca

【0213】

配列番号４０: >IMGT000038|IGLV1-63*01
atggcctggttccctcttctcctcaccctcctcatctactgcacagggtcctgggcccag
tctgagctgactcagccgccctcagtgtctgggggcctgggccagacggtcaccatctcc
tgcgctggaagtaggagcaacattggtattgctggtgtgaactggtaccaacagcatcca
ggaaaggcccctaaactcctcatctatggtagtagcaatcgaccctcaggggtccctgac
agattttctggctccaagtctggcaacacaggctccttgaccatcactgggctccaggcc
gaggacgaggctgattattattgcctgtctgttgacgttacgcgaggtgctga

【0214】

配列番号４１: >IMGT000038|IGLV1-70*01
atggcctggttccctcttctcctcaccctcctcatctactgcacaggttcctgggcccag
tctgagctgactcaaccgccctcagtgtctgggggcctgggccagacggtcaccatctcc
tgcgctggaagtgccaacaacatcggtagaattggtgtgaactggtaccaacagtttcca
ggaaaagcccctaaactcctcatctccgcttatagcaatcaaccctcacgggtttctggt
cgattttctggctccacgtctggcaacacaggctccttgaccatcactgggctccaggcc
gaggacgaggctgattattactgcacgtctgctgaccctattcaaagtgctca

【0215】

配列番号４２: >IMGT000038|IGLV2-24*01
atggcctgggctctggtcctcctcagtctcctcactcaggacacagggtcctgggcccag
tctgccctgaatcagcctccctcactgtccggggatctgggacgcacagtcaccatctcc
tgtgctggcagcagcaatgacattgggagatatagtgacgtctcctggtaccaacagctc
gaaggcacatcccccaaactcctgattcataatgtaaattcccggccttcagggatccct
gatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccttgaccatctctgggctccag
gctgaagatgaggctgattattactgttgctcatatgctagtagtaatactctc

【0216】

配列番号４３: >IMGT000038|IGLV3-2*01
atggcctggacccctcttctcctcagtatcctggctcactgcacaggttccatggcctcc
tacgtgctgacccagcccccgtcggtgtcagtgaacctgggacagacagccagaatcacc
tgtgggggaaacaacattggaagtaaacatgcttactggtaccagcagaagccaggccag
gcccccatgctggtcatttactatagcagcaaccggccctcagggatccctgaccgattc
tctggcaccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcggggcccaggctgaggac
gaggctgactattactgtcaggtgtgggataacagtggtaatgct

【0217】

配列番号４４: >IMGT000038|IGLV3-5*01
atggcctggacccctctcctcctcagtgtcctggcatactacacaggctccgtgacctca
aacagggtgactcagcccccttccatttcagtggccctgggagagatggcaaggatcacc
tgtgagggaaacaacatcggaaatacatatgtttcctggtaccagcagaagccgaaccag
gtgcccctgatgattatttatcaggatagcaaccggccttcagggatccctgaccgattc
tctggctctaactctgggaacacggccaccctgactgtcagcggggcccgggctgaggat
gaggctgactattactgtctgtctgctcacagcagtagtaacgtt

【0218】

配列番号４５: >IMGT000038|IGLV3-6*01
atggcctggacccctctcctcctcggcctcctcgctcactgcacaggttctgtggcttcc
tatgagctgactcagcccccatcagtgtcagtgaacctgggacagacggccaggatcaca
tgtggaggaaacaacattggaaataaagatgcttactggtaccagcagaagtcaggccag
gcccccatgctgattatctatgaggacagcaaacggccctcagggatccctgaccgattc
tctggcaccaactcagggaacatggccaccttgaccatcagcggggcccgggccgaagat
gaggctgactattactgccaggtgtgggacagcagtagtgatgct

【0219】

配列番号４６: >IMGT000038|IGLV3-7*01
atggcctggacccctctcatcctcagcctcctcacttactgcacaggttccatagcctcc
tatgtgctgactcagcccccctcagtgtcggtgagcctgggacagacggccaggaccacc
tgtggaggaaacaacattgaaagcaaaagtgttcactggtaccagcagaagtcaggccaa
acccctgtgctgattatctatagtgatagcaaccggccctcaggaatccccgaccgattc
tcaggcaccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcggggcccgggccgaggac
gaggctgactattactgtcaggtgtgggacagtagtagtgatgct

【0220】

配列番号４７: >IMGT000038|IGLV3-11*01
atggcctggacccctctcctgctccccctccttactctttgcacaggattcgtggcctcc
agtgaggtgactcagccgccctcagtgtcagtggccctgggacagacggctagaatcacc
tgctctggagatatgatggagaaaaaatataccaattggcaccagcagaagccaggtcaa
gcccccatacagatcatttataaggatagtgagcggccctcagggatccctgaccgattc
tctagctccagttcagggaaaacagtcaccctgaccatcagcggggcccgggccgaagac
gaggctgactactactgtcagtcttatgacatcagtagtaatgct

【0221】

配列番号４８: >IMGT000038|IGLV3-13*01
atggcctggacccctctcctcctcggcctcctcgctcactgcacaggctccgtggcctcc
tatgtgctgactcagcccccatcagtggcagtgaacctgggacagacggccaggatcaca
tgtggaggaaacaacattggaagtagttatgcttactggtaccagcagaagtcaggccag
gcccctgtgctgattatctataaggatagcaaccggccctcagggatccctgaccgattc
tcaggcaccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcggggcccgggccgaggac
gaggctgactattactgtcagtcatatgacagcaactatgatcct

【0222】

配列番号４９: >IMGT000038|IGLV3-17*01
atggcctggactcctctcctgctccccctccttattctctgcacaggttctgtgacagct
tctgaactgactcagccacctgcggtgtctgtggccttgggacagacggccacgattaca
tgcgagggagacagcttcgaaagcagtatgattaactggtatcagcagaaatcaggccaa
gcccccgtgctggtcatttatgaggatagtgagcagcccacagggattcctgacagattc
tctggctccaactcgggggatgcagccactctgaccatcaccggggcccaggctgaggac
gaggctgactattactgtcagtcctatgataacagtggtgatgct

【0223】

配列番号５０: >IMGT000038|IGLV3-20*01
atggcctggacccctctcctccttggcctcctcgctcactgcacaggctccgtggcctcc
tatgtgctgactcagcccccatcagtggcagtgaacctgggacagacagccaggatcaca
tgtggaggaaacaacattggaagtagttatgcttactggtaccagcagaagtcaggccag
gcccctgtgctgattatctatgaggacagcaaacggccctcagggatccctgaccgattc
tcaggcaccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcggggcccgggccgaggac
gaggctgactattactgtcaggtgtgggataacagtggtaatgct

【0224】

配列番号５１: >IMGT000038|IGLV3-23*01
atggcctggacccctctcctcctcggcctcctcgcttactgcacaggctccatggcctcc
tacgtgctgactcagcccccgtcagtgtcaatgaacctgggaaagacggccaggatcacg
tgtggaggaaacaacattggaagtaaatatgcttactggtaccagcagaagccaggccgg
gccccgatgatgattatctatgatgatagcaaaaggtcctcaaggacccctgaccgattc
tcaggcaccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcggggcccaggccgaggac
gaggccaactattactgtcaggtgtggggtggcaatagtgatcct

【0225】

配列番号５２: >IMGT000038|IGLV4-15*01
atggactgggctcccttctacctcctgcccttcattttctctacaggtttctgtgctctg
cctgtgctgacccaggctccatctgcatctgcctcacttggagcctcagtcaagctcacc
tgcaccctgagcagtgaacacagcaattactttgtttggtggtatcaacagagaccagag
aaggcccctcggtatttgatgaaggttaacagtgatggaagccacatcaaaggagacgga
atccccagtcgcttctcaggctcaagctctggggctgatcgctacttaaccatctccaac
atccagcctgaggatgaggctgactattactgtggtgagaagcatacaattgatggtcaa
accggttaagc

【0226】

配列番号５３: >IMGT000038|IGLV5-30*01
atggcctggattcctcccctcctagtgctcctctgtcactgcacatgttccatctcccaa
tttgtggtgacccagccaccttccctctctgcatctctgggaacaacagccagactcacc
tgcaccctcaacagtgaaaggactgatatttaccccatattctggtaccagcaaaagcca
gggagccttcctcgttacctccttacctatgtaacagactcaaataagcatcaaggctct
ggggtccccagccgcttctctggatccaaagatacctctgccaatgcagggattttgctc
atttccgggattcaatcagaggatgaggcagactattactgtcagtcatttgatgttggt
gacgga

【0227】

配列番号５４: >IMGT000038|IGLV5-34*01
atggcctggatccccatcctcctcgtgttcctctgtcactgcacaggttccctgtcccag
cctgtcgtgactcagccagcctccctctctgcatctctgggagccacagccagactcacc
tgcaccctgagcagggacatcaatgctggaggctactacatatactggtaccaacagaag
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagattcaaataagcaccagggc
cccggggtccccagccgcttctccgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgcaacttggcacagt
agtgctggt

【0228】

配列番号５５: >IMGT000038|IGLV5-46*01
atggcctggacccatgctctcctcgtgctcttctgccactgcacaggttccctgtcccag
cctgtcgtgactcagccaccctccctctctgcatctctgggagcaacagccagactcacc
tgcaccctcagcagggaagtgagcgttggtagtaaaagcatatactggtaccaacagaag
ccagggagccctcctcggtatttcctgtactactactcagactccagcaatgagctggga
cccggggtccccagtcgagtgtctgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgctatagcacatggc
agtggaagcagctttggttact

【0229】

配列番号５６: >IMGT000038|IGLV5-48*01
atggcttggactcttctagtcctcatgcttgtgtctcaatggacaggttccctgtcccag
cctgtgctgacccagccgtcctccctgtctgcatctcctggaacaacagccagactcacc
tgcaccctgagcagcgggttcagtgttggaggctactacataaattggttccagcagaag
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagattcaaataagcaccagggc
cctggggtccccagccgcttctccgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggccgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgctatagcacatggc
agtggaagcagctaccgttact

【0230】

配列番号５７: >IMGT000038|IGLV5-49*01
atggcctggatccccgtcctcctcgtgctcctctgtcactgcgcaggttccctgtcccag
cctgtcgtgactcagccaccctccctctctgcatctctgggagcaacagccagactcacc
tgcaccctcagcagggaagtgagcgttggtagtaaaagcatatactggtaccaacagaag
ccagggagccctcctcggtatttcctgtactactactcagactccagcaatgagctggga
cccggggtccccagtcgagtgtctgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgctatagcacatggc
agtggaagcagctaccgttact

【0231】

配列番号５８: >IMGT000038|IGLV5-55*01
atggcctggactcctgtcctcctcatgctcctctcccattgtgcaggttccctgtcccag
cctgtgctgacccagccgtcctccctgtctgcatctccgggaacaacagccagactcacc
tgcaccctgagcagcggcttcaatgttggaggctactacataagttggttccagcagaag
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagactcagataagcaccagggc
cccggggtccccagccgcttctccgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggccgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgctacagatcatggc
agtggttact

【0232】

配列番号５９: >IMGT000038|IGLV5-66*01
atggcttggcctcttctcgtcctcatactcctgtctcactgcacaggttccctgtcccag
cctgtgctgacccagccgccctccctgtctgcatctccgggaacaacagccagactcacc
tgcaccctgagcagcggcttcaatgttggaggctactacataagttggttccagcagaag
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagactcagataagcaccagggc
cccggggtccccagccgcttctccgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggccgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgctacaggttatggc
agtgggagcagctaccgttact

【0233】

配列番号６０: >IMGT000038|IGLV5-68*01
atggcctggatctccgtcctcctcgtgctcctctgtcactgcgcaggttccctgtctcag
cctgtcgtgactcagccagcctccctctctgcatctctgggagcaacagccagactcacc
tgcacgctgagcagggacatcaatgttggaggctactacatatactggtaccaacagaat
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagactccagtacacagttggga
cctggggtccccagccgcttctccggatccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgcaatcgggcacagt
agtgctggt

【0234】

配列番号６１: >IMGT000038|IGLV5-71*01
atggcctggatccccatcctcctcgtgctcctctgtcactgcacaggttccctgtcccag
cctgtcttgactcagccagcctccctctctgcatctctgggagcaacagccagactcacc
tgcaccctgagcagggacatcaacgttggaagctataacatatactggtaccaacagaag
ccagggagccctccccggtatctcctgtactactactcagactcagataagcaccagggc
cctggcgtccccagccgcttctctgggtccaaagatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgactattactgtgcaatctggcacagt
agtgctggt

【0235】

配列番号６２: >IMGT000038|IGLV5-79*01
atggcttggaccccttttttccttgtgttcctggctcactgcacaggttccctgtctcag
ccggtgctgacccagccaccctccctctctgcatctctgggaacttctgtgagacttacc
tgtaccctgagcagtggcttcagagttggtgatttctggataaactggtaccagcagaat
ccagggaaccctccccggtatctcctgtactaccactcagactcagataaacaccagggc
tccggggtccccagccgcttctctggatccagtgatgcctcggccaatgcagggcttctg
ctcatctctgggctgcagcctgaggatgaggctgactattactgtagcacatggcatggc
aactctaagtctta

【0236】

配列番号６３: >IMGT000038|IGLV12-26*01
atggcctgggctcttctcctgttcacacttctgtctcactgcacaggggccacttcccag
gaagtagtgactcaggaaacttcactctcaacaactcctggaggaacagtcacactcacc
tgtggctccagtactggggctgtcaccaccagtaattatgccagctgggtccaacagaag
ccctaccagagattccagggtctgataggtgggaccagctaccggaacccaggggtccct
gcccgattctctggctccctggttggacagaaggccgtcctcaccatcacgggggcgcag
tcagaggatgaagctgagtattactgtgttctgtggttcagcaaccattac

【0237】

ＩＧＬＪ
配列番号６４: >IMGT000038|IGLJ1*01
ttgggtgttcggcggaggtacccatctgagcgtcctag

【0238】

配列番号６５: >IMGT000038|IGLJ2*01
tcatattttcggtggagggacccatctgactgtcctcg

【0239】

配列番号６６: >IMGT000038|IGLJ4*01
ttatgttttcggcggagggaccaaggtgaccgtcctcg

【0240】

配列番号６７: >IMGT000038|IGLJ5*01
tcctattttcggcggagggacccgtctgaccgtcctcg

【0241】

配列番号６８: >IMGT000038|IGLJ6*01
ttttgtttttggcagagggacctggctgacggtcctag

【0242】

配列番号６９: >IMGT000038|IGLJ7*01
tgctttgttcggcggagggacccatctgaccgtcctcg

【0243】

配列番号７０: >IMGT000038|IGLJ8*01
ttgggtgtttggcgatggaacccagctgactgtattag

【0244】

配列番号７１: >IMGT000038|IGLJ9*01
tattgtgttcggcggagggacccatctgaccgtcctcg

【0245】

配列番号７２: >IMGT000038|IGLJ10*01
ttgggtgtttggcgatggaacccagctgactgtattag

【0246】

配列番号７３: >IMGT000038|IGLJ11*01
tattgtgttcggcggagggacccatctgaccgtcctcg

【0247】

プレＤ
これはＩｇｈｄ－５ＤＨ遺伝子の上流にある２１６０９ｂｐの断片である。プレＤ配列はマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの１２番染色体に見られ、アセンブリ：GRCm38.p4、アノテーションリリース106、配列ＩＤ：NC_000078.6
全配列は以下に示す２つの１００ｂｐ配列の間にある：
NC_000078.6の113526905-113527004位に相当するＩｇｈｄ－５ＤＨ遺伝子セグメントの上流：
配列番号７４:
ATTTCTGTACCTGATCTATGTCAATATCTGTACCATGGCTCTAGCAGAGATGAAATATGAGACAGTCTGATGTCATGTGGCCATGCCTGGTCCAGACTTG

【0248】

NC_000078.6の113526905-113527004位に相当するＡｄａｍ６ａ遺伝子の上流２ｋｂ：
配列番号７５: GTCAATCAGCAGAAATCCATCATACATGAGACAAAGTTATAATCAAGAAATGTTGCCCATAGGAAACAGAGGATATCTCTAGCACTCAGAGACTGAGCAC

【0249】

Ａｄａｍ６ａ
Ａｄａｍ６ａ(a disintegrin and metallopeptidase domain 6A)は雄の生殖機能に関与する遺伝子である。Ａｄａｍ６ａの配列は、マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの１２番染色体に見られ、アセンブリ：GRCm38.p4、アノテーションリリース106、配列ＩＤ: NC_000078.6の113543908-113546414位。
Ａｄａｍ６ａ配列ＩＤ：OTTMUSG00000051592 (VEGA)

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【配列表】

2024543248000001.xml

【国際調査報告】