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▶ ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】ＺＨＸ２の阻害により全性身疾患の転帰を改善する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241114BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241114BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241114BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241114BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241114BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20241114BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20241114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241114BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20241114BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241114BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241114BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241114BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241114BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241114BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241114BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P3/10
A61P25/00
A61P31/12
A61P31/04
A61P33/00
A61P31/10
A61P35/00
A61P37/00
A61P37/06
A61P29/00
A61K48/00
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K35/76
A61K31/7105
A61K31/713
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525315
(86)(22)【出願日】2022-10-20
(85)【翻訳文提出日】2024-06-25
(86)【国際出願番号】 US2022047263
(87)【国際公開番号】W WO2023076097
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/272,404
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507235354
【氏名又は名称】ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュー，スマント・シン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZB371
4C084ZB372
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC521
4C084ZC522
4C085AA14
4C085BA51
4C085BB11
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZB37
4C086ZC35
4C086ZC52
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZB37
4C087ZC35
4C087ZC52
(57)【要約】
本発明は、サイトカイン放出の変化又はサイトカインストームを引き起こす様々な疾患状態の治療に対する新規なアプローチを提供する。これらの疾患には、ウイルス感染症、免疫疾患及び他の非免疫疾患が含まれる。詳細には、本発明は、様々な疾患状態を治療するために、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させる方法を含む、ＺＨＸ２を標的とする方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者へのＺＨＸ２の阻害剤の投与を含む、ＺＨＸ２の阻害剤の投与を必要とする患者における疾患を治療するための方法であって、ＺＨＸ２の阻害剤の投与が患者におけるＺＨＸ２の枯渇をもたらす、方法。
【請求項2】
治療される疾患が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、他のコロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラなどのウイルス感染症、非呼吸器ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染などの非ウイルス感染症、免疫介在性疾患、心血管病理、糖尿病、メタボリックシンドローム、臓器移植、神経変性、がん並びに老化を含む、サイトカイン放出に影響を及ぼす炎症性疾患及び非炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＺＨＸ２の阻害剤が、ショートヘアピンＲＮＡＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルス、ＺＨＸ２に対する抗体又は抗体断片、ＺＨＸ２を標的とするｓｉＲＮＡ又は他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＺＨＸ２媒介受容体に結合するアンタゴニストを含む薬剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ｓｈＲＮＡがベクターに結合されているか又はベクターの一部である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
抗体又は抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び二価抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体に対する、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
ＺＨＸ２の阻害剤が、改変されたＺＨＸ２遺伝子をコードする１つ以上のＤＮＡ断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
ＺＨＸ２遺伝子をコードする１つ以上のＤＮＡ断片がＣＲＩＳＰＲによって改変されている、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
治療される疾患が、サイトカインの放出の増加を引き起こす疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
呼吸器ウイルス感染症が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の結果である、請求項２に記載の方法。
【請求項11】
ＺＨＸ２阻害剤の投与が、治療される患者においてＺＨＸ２ハイポモルフ状態をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６又はＮＦκＢタンパク質の活性化を変化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
薬理学的薬剤の投与を含む、薬理学的薬剤の投与を必要とする患者においてＺＨＸ２を阻害、中和又は枯渇させるための方法であって、薬理学的薬剤がＺＨＸ２遺伝子に結合又は相互作用し、薬理学的薬剤の結合がＺＨＸ２遺伝子に可逆的又は不可逆的な変化をもたらす、方法。
【請求項14】
薬理学的薬剤がＺＨＸ２遺伝子と直接的に結合又は相互作用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
薬理学的薬剤が、ＺＨＸ２遺伝子の上流又は下流のいずれかでＺＨＸ２遺伝子と間接的に結合又は相互作用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
薬理学的薬剤の投与を含む、薬理学的薬剤の投与を必要とする患者においてＺＨＸ２遺伝子発現を低減又はサイレンシングするための方法であって、薬理学的薬剤が、細胞の核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質を阻害又は遮断する、方法。
【請求項17】
核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質が、ＺＨＸ１、ＺＨＸ３、核因子ＹＡ、核因子ＹＢ、核因子ＹＣ、ＦｏｘＣ１及びエフリンＢ１／Ｂ２、又はＺＨＸ２と相互作用することが知られている他のタンパク質のうちの１つ以上から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
細胞の核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質を阻害又は遮断する薬理学的薬剤が、ＺＨＸ２遺伝子発現に可逆的又は不可逆的な変化を引き起こす、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
薬理学的薬剤の投与が、治療される患者においてＺＨＸ２ハイポモルフ状態をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項20】
薬理学的薬剤の投与が、治療される患者においてＺＨＸ２ハイポモルフ状態をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
政府助成金に関する記載
本発明は、国立衛生研究所から授与された、いくつかの助成金（１Ｒ０１ＤＫ１０９７１３、１Ｒ０１ＤＫ１１１１０２、１Ｒ０１ＤＫ１２９５２２、１Ｒ０１ＤＫ１２８２０３）に基づく政府支援を受けて行われた。政府は一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所から授与された、いくつかの助成金（１Ｒ０１ＤＫ１０９７１３、１Ｒ０１ＤＫ１１１１０２、１Ｒ０１ＤＫ１２９５２２、１Ｒ０１ＤＫ１２８２０３）に基づく政府支援を受けて行われた。政府は一定の権利を有する。
【0002】
本開示の一般的な分野は、サイトカイン放出又はサイトカインストームの変化をもたらす様々な疾患状態の治療に対する新規なアプローチである。これらの疾患には、ウイルス感染症及び非ウイルス感染症、免疫疾患及び他の非免疫疾患が含まれる。
【背景技術】
【0003】
ジンクフィンガー及びホメオボックス（ＺＨＸ）ファミリー転写因子（ＺＨＸ１、ＺＨＸ２及びＺＨＸ３）は体内の複数の臓器で発現されており、構造的及び機能的に重要な様々な遺伝子を制御している。Ｍａｃｅら、「Ｔｈｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ＺＨＸ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ９７（４）：７５３～７６４頁；Ｋａｗａｔａ Ｈら、「Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｚｉｎｃ －ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ （ＺＨＸ） ｆａｍｉｌｙ； ＺＨＸ２ ｆｏｒｍｓ ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｗｉｔｈ ＺＨＸ３」、（２００３） Ｇｅｎｅ． ３２３：１３３～１４０頁を参照されたい。肝臓において、ＺＨＸ２は、成体マウスのα－フェトプロテイン発現の主要な転写抑制因子である。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスは、試験された２５種の他のマウス系統とは異なり、ＺＨＸ２遺伝子の第１のイントロンにマウス内因性レトロウイルスを有しており、その結果、主に機能しない転写産物が生じ、成体ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＺＨＸ２のダウンレギュレーション及び高αフェトプロテインタンパク質レベルを引き起こす。Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃＪ ｍｉｃｅ ｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＺＨＸ２ ｇｅｎｅ」、（２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３９６～４０１頁を参照されたい。腎臓ポドサイトにおいて、ＺＨＸ２はＷＴ１の最も強力な転写抑制因子の１つであり、ＦＳＧＳの発病に関与している可能性が非常に高い（Ｍａｃｅら ２０２０）。腎臓において、ポドサイト（特殊な糸球体細胞）はＺＨＸタンパク質を主として細胞膜で発現するが、尿細管細胞においては、他の多くの臓器と同様に、ＺＨＸタンパク質の発現は主として核で生じる（Ｍａｃｅら ２０２０）。適切な組合せとＺＨＸ２発現状態の変更の設定において、全身性サイトカイン放出は、正常な（アミノペプチダーゼＡ／ＡＰＡ、エフリンＢ１）又は推定上の代替細胞膜アンカーからポドサイト核へのＺＨＸタンパク質の移動を誘導される可能性がある。ヒト及び実験的ＭＣＤとほとんどの形態のＦＳＧＳは、転写因子ＺＨＸ２のポドサイト発現低下と関連している。Ｍａｃｅら、「ＺＨＸ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９７：７５３～７６４頁を参照されたい。
【0004】
ウイルス感染は、自然免疫反応及び適応免疫反応の一環としてサイトカインの産生を引き起こす。本発明者らは以前、パンデミックの初期に記録された広範囲のサイトカインストームが臓器損傷に関与している可能性があることを疑い、サイトカイン介在性の末端臓器損傷の新規のエビデンスに基づくモデルを開発した。Ｈｕａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」 （２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９５（１０２２３）：４９７～５０６頁；（オンライン補足）を参照されたい。試験された３種類の臓器のうち、心臓病変に関する文献では、心臓トロポニンＩレベルの上昇（急性心筋梗塞に類似）、心筋炎、心筋壊死、心膜炎、不整脈及び心不全が示されている。Ｔｏｐｏ ２０２０；Ｉｎｃｉａｒｄｉら、「Ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：８１９～８２４頁を参照されたい。肝障害のエビデンスには、アミノトランスフェラーゼレベルの上昇、肝細胞障害、炎症及び脂肪肝が含まれる。Ｈｅｒｔａら、「ＣＯＶＩＤ－ １９ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ － Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ」、（２０２１） Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ４１ 補遺１：１～８頁を参照されたい。腎臓の症状発現が入院のＣＯＶＩＤ－１９患者において非常に多く見られ、４０％近くがタンパク尿を発症し、約３分の１が急性腎障害（ＡＫＩ）を発症する。Ｃｈｅｎｇら、「Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－ １９」、（２０２０年） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９７：８２９～８３８頁；Ｈｉｒｓｃｈら、「Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９８：２０９～２１８頁を参照されたい。重度のタンパク尿及び／又は腎機能障害のあるＣＯＶＩＤ－１９患者の腎生検研究では、巣状及び分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の虚脱型（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）及び急性腎障害が最も一般的に記録されている。Ｋｕｄｏｓｅら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３１：１９５９～１９６８頁；Ｎａｓｒら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ」、（２０２１） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ７７：４６５～４６８頁（２０２１）を参照されたい。初期の剖検研究ではウイルス粒子が疑われたが、生存患者の腎生検ではいかなるウイルス粒子も確認されなかった。Ｂｒａｄｌｅｙら、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｆａｔａｌ ＣＯＶＩＤ－ １９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ」、（２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９６：３２０～３３２頁も参照されたい。
【0005】
非呼吸器系ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症などの非ウイルス感染症、免疫介在性疾患、心血管病理、糖尿病、メタボリックシンドローム、神経変性及びがん、並びに老化を含む、サイトカイン放出に影響を及ぼす他の炎症性疾患及び非炎症性疾患が数多くある。
【0006】
しかし、サイトカイン放出及び様々な疾患状態の治療に対するＺＨＸ２阻害の有益な効果の可能性については、ほとんど知られていない。本発明は、これらのニーズに応えるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍａｃｅら、「Ｔｈｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ＺＨＸ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ９７（４）：７５３～７６４頁
【非特許文献2】Ｋａｗａｔａ Ｈら、「Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｚｉｎｃ －ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ （ＺＨＸ） ｆａｍｉｌｙ； ＺＨＸ２ ｆｏｒｍｓ ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｗｉｔｈ ＺＨＸ３」、（２００３） Ｇｅｎｅ． ３２３：１３３～１４０頁
【非特許文献3】Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃＪ ｍｉｃｅ ｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＺＨＸ２ ｇｅｎｅ」、（２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３９６～４０１頁
【非特許文献4】Ｈｕａｎｇら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ」 （２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９５（１０２２３）：４９７～５０６頁；（オンライン補足）
【非特許文献5】Ｉｎｃｉａｒｄｉら、「Ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）」、（２０２０） ＪＡＭＡ Ｃａｒｄｉｏｌ． ５：８１９～８２４頁
【非特許文献6】Ｈｅｒｔａら、「ＣＯＶＩＤ－ １９ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ － Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ」、（２０２１） Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ４１ 補遺１：１～８頁
【非特許文献7】Ｃｈｅｎｇら、「Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－ １９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９７：８２９～８３８頁
【非特許文献8】Ｈｉｒｓｃｈら、「Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ９８：２０９～２１８頁
【非特許文献9】Ｋｕｄｏｓｅら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９」、（２０２０） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３１：１９５９～１９６８頁
【非特許文献10】Ｎａｓｒら、「Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｉｏｐｓｙ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ」、（２０２１） Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ７７：４６５～４６８頁（２０２１）
【非特許文献11】Ｂｒａｄｌｅｙら、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｆａｔａｌ ＣＯＶＩＤ－ １９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ」、（２０２０） Ｌａｎｃｅｔ ３９６：３２０～３３２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
（発明の要旨）
本発明は、ＺＨＸ２を標的とするメカニズムを提供する。本発明は、様々な疾患状態を治療するために、ＺＨＸ２の阻害、遮断又は枯渇の方法を記載する。
本発明は、ＺＨＸ２を標的とするメカニズムを提供する。本発明は、様々な疾患状態を治療するために、ＺＨＸ２の阻害、遮断又は枯渇の方法を記載する。
【0009】
本発明者らは、ＺＨＸ２ハイポモルフモデルにおけるＺＨＸ２の枯渇がサイトカインストームに関連する状態にどのような影響を及ぼすのかについて既に実証している。初期の試験において、本発明者らは、ＺＨＸ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ及びＮＰＨＳ２プロモーター駆動型Ｃｒｅマウスを利用した。しかし、本発明者らはその後、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態の確立されたモデルであるＢＡＬＢ／ｃＪマウスと、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＺＨＸ２＋／＋）を使用して、ＺＨＸ２発現がサイトカインストーム関連の罹患率及び死亡率にどのように影響を及ぼすのかを説明した。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ－ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃＪ ｍｉｃｅ ｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｚｈｘ２ ｇｅｎｅ．」 （２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３９６～４０１１頁；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＴｎＩＩ－ａｌｐｈａ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＢＡＬＢ／ｃＪ Ｚｈｘ２ （Ａｆｒｌ） ａｌｌｅｌｅ」、（２００８） Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ １９：２６～３１頁；Ｇａｒｇａｌｏｖｉｃら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｈｘ２ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、（２０１０） Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ． ３：６０～６７頁；Ｃｒｅａｓｙら、「Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ ２ （Ｚｈｘ２） Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ Ｃｙｐ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ」、（２０１６） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． １７：７～１７頁；Ｊｉａｎｇら、「Ｚｈｘ２ （ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘｅｓ） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｊｏｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ」、（２０１７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２：６７６５～６７７４頁 （２０１７）；Ｅｒｂｉｌｇｉｎら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｚｈｘ２ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ」、（２０１８） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ． ３８：２０１６～２０２７頁を参照されたい。
【0010】
低用量では、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルは、個々のサイトカインとは異なり、ＺＨＸ２ハイポモルフマウス及びＺＨＸ２＋／＋マウスにおいて糸球体損傷及びアルブミン尿を誘発し、ＣＯＶＩＤ－１９関連のタンパク尿を模倣した。高用量では、ＣＯＶＩＤ－１９カクテルは、個々のサイトカインとは異なり、ＺＨＸ２＋／＋マウスにおいて急性心臓損傷、心筋炎、心膜炎、肝臓損傷及び腎臓損傷、並びに高死亡率を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疾患の一般的な臨床症状発現を誘発したが、ＺＨＸ２ハイポモルフマウスは比較的保護された。これらの臓器におけるシグナル伝達及び転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）、ＳＴＡＴ６及びＮＦκＢ経路の活性化は、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態において低減された及び／又は非同期であった。ゲノム配列決定及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用することにより、ＺＨＸ２の上流に挿入のあることがヒトＺＨＸ２ハイポモルフ状態の原因として特定された。
【0011】
したがって、ＺＨＸ２を含むＺＨＸタンパク質の糸球体発現が他の臓器及び腎臓の他の部分（主として核）におけるＺＨＸタンパク質とは異なる（ポドサイトに関連した細胞膜）ことを考慮し、本発明に記載の試験は、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態が疾患の例において他の臓器及び身体の他の部分にどのように影響を及ぼすかを判定するために実施した。
【課題を解決するための手段】
【0012】
したがって、本発明の実施形態において、患者の様々な疾患状態を治療するために、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させる方法が提供される。
【0013】
本発明の他の実施形態において、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させる方法は、ＳＴＡＴ５又はＳＴＡＴ６の非同期活性化をさらに含み得る。
【0014】
一部の実施形態において、ＺＸＨ２は、患者に薬剤の患者への投与によって阻害、中和又は枯渇させることが可能であり、その薬剤は、１つのＺＸＨ２に対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む。
【0015】
一部の実施形態において、ｓｈＲＮＡは市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合されていてもよいし、又はその一部であってもよい。
【0016】
他の実施形態において、薬剤は、ＺＸＨ２に対して向けられたモノクローナル抗体を含む。さらに他の実施形態において、薬剤は、ＺＸＨ２に対して向けられたモノクローナル抗体を含む。さらに他の実施形態において、薬剤は、ＺＸＨ２を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0017】
さらに他の実施形態において、薬剤は、ＺＨＸ２の発現を減少する薬理学的薬剤である。
【0018】
別の実施形態では、薬剤は、ＺＨＸ２遺伝子に、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的若しくは間接的に結合若しくは相互作用することによって、ＺＨＸ２発現を低減する薬理学的薬剤である。
【0019】
いずれかの実施形態において、本発明は、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させることによって、様々な疾患状態を治療する方法であって、疾患状態が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、他のコロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラなどのウイルス感染症、非呼吸器ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症などの非ウイルス感染症、免疫介在性障害、心血管病理、糖尿病、メタボリックシンドローム、臓器移植、神経変性及びがん、並びに老化を含む、サイトカイン放出に影響を及ぼす炎症性疾患及び非炎症性疾患を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1c】ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ｃ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。１／２倍（Ｘ／２）は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。
【図1d】ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。
【図1e】ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝マウス６匹）。
【図1f】ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ｆ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝マウス６匹）。
【図1g】ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
【図2a】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ａ）心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベルによって評価された急性心筋損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2b】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性レベルによって評価した急性肝臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2c】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｃ）質量分析法を使用して測定した血清クレアチニンによって評価した急性腎臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。
【図2d】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｄ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性心臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、線維破壊（青色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。
【図2e】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｅ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性肝臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、突出したクッファー細胞（緑色矢印）、再生変化（黄色矢印）、及び中心静脈周囲損傷（青色矢印）が認められた。
【図2f】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｆ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＰＡＳ染色切片（列１、２、４）及び腎臓電子顕微鏡（列３）を使用した急性腎臓損傷の組織学的評価（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。下の３列は近位尿細管を示し、最上列は遠位尿細管を示す。近位尿細管において、空胞化（赤色矢印）、刷子縁破壊（緑色矢印）、尿細管変性（黒色矢印）が認められた。遠位尿細管において、剥離のエビデンス（青色矢印）が存在した。泡沫細胞も認められた（白色矢印）。電子顕微鏡スケールバーＢＡＬＢ／ｃ、２．６６μｍ；ＢＡＬＢ／ｃＪ、２μｍ。
【図2g】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍（３Ｘ））によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスの心臓における組織学的変化の形態計測分析及び比較を示す表。
【図2i】（図２ｉ）ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腎臓における組織学的変化の形態計測分析及び比較を示す表。光学顕微鏡スケールバー２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図3】ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける全身性疾患に対する重度サイトカインストームの影響に対する枯渇戦略の有無によるサイトカインストーム誘発死亡率を示す。１群あたりの注射されたマウスの数を示す。代謝ケージに収容されたマウスにおけるコントロールＩｇＧ群の死亡率１／６又は１６．６％は、いずれの抗体枯渇戦略も行わない群の死亡率を反映している。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後１時間で静脈内注射された。死亡率は、いくつかの枯渇戦略の後に低下する。
【図4】ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全身性疾患に対する重度サイトカインストームの影響に対する枯渇戦略の有無によるサイトカインストーム誘発死亡率を示す。１群あたりの注射されたマウスの数をパネルａに示す。代謝ケージに収容されたマウスにおけるコントロールＩｇＧ群の死亡率５／６又は８３．３％は、いずれの抗体枯渇戦略も行わない群の死亡率を反映している。これは、図３のＢＡＬＢ／ｃＪマウスの死亡率と比較される数値である。この表の残りのデータは、マウスを通常のケージに収容することにより得られたものであり、死亡率は２／６又は３３．３％であった。このような状況下では、アルブミン尿のための定期採尿は行われなかった。
【図5a】ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ａ）８番染色体上のＺＨＸ２及び近傍遺伝子の模式図。
【図5b】ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ｂ）ＭＣＤ患者（ｎ＝９名の患者）、ＦＳＧＳ患者（ｎ＝１９名の患者）及びＣＯＶＩＤ－１９関連ＦＳＧＳ虚脱型（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）（ｎ＝８名の患者）の間で共有される挿入及び欠失のマッピング。１２２、５３３、６９４の最も一般的な共有挿入は、ヒトにおいては機能していないげっ歯類発現遺伝子Ｓｌｃ２２ａ２２の理論上の開始点又はその近くにマッピングされる可能性がある。１２２、２９３、４２３の別の共有挿入は、Ｓｌｃ２２ａ２２の理論上の終点近くに位置していた。これらのＩｎＤｅｌは、コントロールの対象（ｎ＝３３）又は１０００ゲノムプロジェクトでは認められなかった。Ｅｘはエクソンである。
【図5d】ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ｄ）患者とコントロールの対象との間に共通する８ｂｐの挿入（ＣＲＩＳＰＲ Ａ）、又はコントロールの対象及び１０００ゲノムプロジェクトには存在しない１２２、５３３、６９４の１０ｂｐの共有挿入（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）を含有する、単一細胞由来の培養ヒトポドサイト細胞株のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９支援ゲノム編集クローンの模式図。
【図5e】ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ｅ）上記ゲノム改変クローン（ＣＲＩＳＰＲ Ａ、３クローン、プールされたデータ；試験ＣＲＩＳＰＲ Ｂ、２クローン）における相対的ＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現を、親単一細胞由来の培養ヒトポドサイト細胞株（クローンあたりｎ＝７の鋳型）と比較した。点線は親細胞株における発現を表す。
【図5f】ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ｆ）コントロールの単一細胞由来の親細胞株と１２２、５３３、６９４に挿入された２つの変異クローンのうちの１つにおけるＺＨＸ２発現を比較したウェスタンブロット。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図6a】ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスとＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスとの間のＣＯＶＩＤカクテル誘発全身性障害（心臓、肝臓及び腎臓）のメカニズムの違いを示す。カクテルＤによる心臓、肝臓及び腎臓におけるＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６のシグナル伝達経路の非同期活性化が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに比べてＢＡＬＢ／ｃＪで認められた。カクテルＤの３倍用量を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス、各マウスの臓器は個別に評価）を、注射後の１５分、３０分、６０分に調べた。生理食塩水を注射したマウスはＳＴＡＴ経路シグナル伝達を活性化しなかったのでデータは示さない。（図６ａ）ＢＡＬＢ／ｃ（ＺＨＸ２正常発現）マウスとＢＡＬＢ／ｃＪ（ＺＨＸ２低発現）マウスの心臓、肝臓及び腎臓におけるラミンＢ１（核抽出物）及びＳＴＡＴ５（細胞質抽出物）との比率として表したｐＳＴＡＴ５ウェスタンブロット密度測定のグラフ比較。
【図6b】ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスとＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスとの間のＣＯＶＩＤカクテル誘発全身性障害（心臓、肝臓及び腎臓）のメカニズムの違いを示す。カクテルＤによる心臓、肝臓及び腎臓におけるＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６のシグナル伝達経路の非同期活性化が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに比べてＢＡＬＢ／ｃＪで認められた。カクテルＤの３倍用量を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス、各マウスの臓器は個別に評価）を、注射後の１５分、３０分、６０分に調べた。生理食塩水を注射したマウスはＳＴＡＴ経路シグナル伝達を活性化しなかったのでデータは示さない。（図６ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスとＢＡＬＢ／ｃＪマウスの心臓、肝臓及び腎臓におけるラミンＢ１（核抽出物）及びＳＴＡＴ６（細胞質抽出物）との比率として表したｐＳＴＡＴ６ウェスタンブロット密度測定のグラフ比較。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図7a】ＣＯＶＩＤサイトカインストームに関連した糸球体損傷のメカニズムを示す。（図７ａ）野生型及びＺＨＸ２ハイポモルフ（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）培養ヒトポドサイトをカクテルＣのヒト対応物カクテル（最終濃度ｘ／１００，０００、１つの条件あたりｎ＝３のプレート）とインキュベートした際のｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の活性化を評価するためのウェスタンブロット。
【図7b】ＣＯＶＩＤサイトカインストームに関連した糸球体損傷のメカニズムを示す。（図７ｂ）パネルｃの野生型及びＣＲＩＳＰＲ ＢポドサイトでインキュベートしたカクテルＣのウェスタンブロットの密度測定。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【図8a】マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ａ）カクテルＤ３倍又はコントロールの生理食塩水を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹）の全臓器タンパク質抽出物の定性ウェスタンブロットによるＮＦκＢ／ｐ－ｐ６５（肝臓、３０分）、ｐＳＴＡＴ６（腎臓、６０分）及びｐＳＴＡＴ５（心臓、１５分）活性化の例。
【図8b】マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ｂ）抗ラミンＢ１抗体を使用した、心臓、腎臓及び肝臓からの同等タンパク質負荷の核画分及び細胞質画分のウェスタンブロットによる核抽出物の純度試験の例。細胞質中のラミンＢ１のトレースは、核に輸送される前のタンパク質合成に関係し得る。
【図8c】マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ｃ）複数のマウスからの同等タンパク質負荷の心臓細胞質画分及び核画分におけるＧＡＰＤＨタンパク質の評価例。予想したように、ＧＡＰＤＨは両画分において発現しており、細胞質抽出物においてより高く発現されている。
【図8d】マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ｄ）同じフィルムで展開された別々のブロットでｐＳＴＡＴ６及びラミンＢ１を評価した、カクテルＤ（Ｃ’ｔａｉｌ Ｄ）又はコントロール生理食塩水注射試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウス心臓核タンパク質抽出物（１レーンあたり２０μｇタンパク質）のブロットの定量的ウェスタンブロットの例。各レーンにマウス番号の略号を示す。
【図8e】マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ｅ）同じフィルムで展開された別々のブロットでｐＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ５を評価した、カクテルＤ（Ｃ’ｔａｉｌ Ｄ）又はコントロール生理食塩水注射試験におけるＢＡＬＢ／ｃＪマウス心臓細胞質タンパク質抽出物（１レーンあたり２０μｇタンパク質）の定量ウェスタンブロットの例。各レーンにマウス番号の略号を示す。
【図9a】（図９ａ）一般のＣＯＶＩＤ－１９患者、年齢、性別、及び人種をマッチさせた健常なコントロール、並びにタンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＥＬＩＳＡにより評価された血漿ＩＬ－４Ｒαレベル。アッセイされた患者サンプルの数を以下に示す。
【図9c】（図９ｃ）質量分析法により測定した血清クレアチニンは、ＣＯＶＩＤサイトカインカクテル用量Ｘ／２モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス；１群あたりｎ＝６匹のマウス）では増加されない。スケールバー０．５μｍ。
【図10a】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ａ）異なる用量のカクテルＤ注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝４匹のマウス）における骨格筋損傷のマーカーである血漿クレアチンキナーゼ。
【図10b】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｂ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ａから得られた血清心筋トロポニンＩレベルのデータ。
【図10c】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｃ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ｂから得られた血清ＡＬＴレベルデータ。
【図10d】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｄ）図２ａ～ｃに対応する、カクテルＤ３倍又は単回サイトカイン用量３倍を注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの１８時間アルブミン尿。
【図10e】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｅ）図２ａ～ｃに対応する、単回サイトカイン用量３倍を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの１８時間アルブミン尿。カクテルＤ３倍後のそれらの死亡率が高いことを考慮すると、定時採尿のための代謝ケージ飼育は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは実現不可能である。
【図10f】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｆ）リアルタイムＰＣＲ（１群あたりｎ＝６の鋳型）で評価した、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較したＢＡＬＢ／ｃＪにおける心臓及び骨格筋のＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現の倍数差。肝臓における低レベルのＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現は既に発表されており、この現象の陽性コントロールとしての役目を果たす。３倍の差を有意であるとした。
【図10g】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｇ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス心臓とＢＡＬＢ／ｃマウス心臓との間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。
【図10h】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｈ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス肝臓とＢＡＬＢ／ｃマウス肝臓の間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。
【図10i】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｉ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス骨格筋とＢＡＬＢ／ｃマウス骨格筋との間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。またＳＴＡＴ５の発現がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて３．０６±０．４０倍高かった。
【図10j】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｊ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス糸球体とＢＡＬＢ／ｃマウス糸球体の間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。他のＩＬ－２Ｒ鎖はマウス糸球体においては発現しておらず、Ｚｈｘ１及びＺｈｘ３は既に発表されている（Ｍａｃｅら ２０２０）。
【図10k】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｋ）カクテルＤ用量３倍の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。多巣性足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が存在した。
【図10l】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｌ）カクテルＤ用量３倍の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。広範な足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が認められた。
【図10m】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｍ）カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色骨格筋。局所的炎症（黒色矢印）が一部の切片において認められた。
【図10n】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｎ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス；用量１／２倍（Ｘ／２））におけるカクテルＤモデルを誘導し、モデル誘導後の１時間のコントロールＩｇＧ又は抗体枯渇の組合せのアルブミン尿。
【図10o】サイトカインストームモデルに関する追加データ及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ｏ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス；用量１／２倍）におけるカクテルＣ誘導後、ＩＬ－４Ｒα、ＴＮＦＲ１、及びＩＬ－１０Ｒβに対する抗体、又はコントロールＩｇＧを使用した受容体遮断後のアルブミン尿。スケールバー（ｋ）０．５μｍ、（ｌ）０．５μｍ、（ｍ）２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明は、ＺＨＸ２を標的とするメカニズムを提供する。本発明は、様々な疾患状態を治療するために、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇の方法を記載する。本発明者らは、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させる開示のいずれかの方法は、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６又はＮＦκＢの活性化を変化させることをさらに含み得ると考える。
【0022】
ＺＨＸ２が、患者への薬剤の投与によって阻害、中和又は枯渇され得る方法であって、薬剤が、１つのＺＸＨ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む、方法が開示されている。本発明者らは、ｓｈＲＮＡは購入することが可能であり、またプラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む当技術分野において公知の任意のベクターに結合させる、又はその一部とすることができると考えている。
【0023】
ＺＨＸ２が、ＺＸＨ２に対して向けられたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の投与によって阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0024】
ＺＨＸ２が、ＺＸＨ２を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0025】
ＺＨＸ２が、ＺＨＸ２発現を減少する薬理学的薬剤の投与によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0026】
ＺＨＸ２が、ＺＨＸ２遺伝子に、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的若しくは間接的に結合若しくは相互作用する、又はこれらの部位で可逆的又は不可逆的な変化をもたらす薬理学的薬剤によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0027】
また、ＺＨＸ２が、核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質を阻害又は遮断する薬理学的薬剤によって、間接的にサイレンシング又は「オフ」にされ得ることも考えられる。このようなタンパク質の例には、ＺＨＸタンパク質、例えば、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３、核因子ＹＡ、核因子ＹＢ、核因子ＹＣ、ＦｏｘＣ１及びエフリンＢ１／Ｂ２、又はＺＨＸ２と相互作用することが公知である任意の他のタンパク質が含まれる。
【0028】
いずれかの実施形態において、本発明は、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させることによって、様々な疾患状態を治療する方法であって、疾患状態が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、他のコロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラなどのウイルス感染症、非呼吸器ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症などの非ウイルス感染症、免疫介在性障害、心血管病理、糖尿病、メタボリックシンドローム、臓器移植、神経変性及びがん、並びに老化を含む、サイトカイン放出に影響を及ぼす炎症性疾患及び非炎症性疾患を含む、方法を提供する。
【0029】
本開示を通じて、様々な数量は、例えば、量、サイズ、寸法、比率などは、範囲形式で示される。範囲形式での数量の説明は、単に便宜上のもので簡潔にするためであり、いかなる実施形態の範囲に対しても柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲についての説明は、文脈上明白に別のことが示されていない限り、その範囲内の可能性のあるすべての部分範囲とすべての個別の数値を詳しく開示したものと考えるものとする。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの詳しく開示された部分範囲及びその範囲内の個々の値、例えば１．１、２、２．３、４．６２、５、５．９などを有すると考えるものとする。これは範囲の広さに関係なく適用される。これらの介在する範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれる場合があり、また記載された範囲内において任意の特に除外される限定を条件として、本開示の範囲内に包含される。記載された範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、文脈上明白に別のことが指示されていない限り、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
【0030】
本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、いかなる実施形態も限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明白に別のことを示さない限り、複数形も含むことを意図する。本明細書で使用される場合の「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではないことはさらに理解されよう。本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語には、列挙された関連する項目の１つ以上の任意の組合せ及びすべての組合せが含まれる。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」という形式においてリストに含まれる項目は、（Ａ）；（Ｂ）；（Ｃ）；（Ａ及びＢ）；（Ｂ及びＣ）；（Ａ及びＣ）；又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味し得ることに留意されたい。同様に、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」という形式においてリストされる項目は、（Ａ）；（Ｂ）；（Ｃ）；（Ａ及びＢ）；（Ｂ及びＣ）；（Ａ及びＣ）；又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味し得る。
【0031】
特に明記されていない限り、又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、数値又は数値範囲に関する「約」という用語は、記載された数値及びその＋／－１０％の数値、又は範囲として挙げられた値については、挙げられた下限値の１０％を下回り、また挙げられた上限値の１０％を上回ることを意味すると理解する。
【0032】
本明細書に開示されるいずれかの実施形態において、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語には、既存の症状又は障害の進行又は重症度を抑制すること、遅延させること、停止させること、又は逆転させることが含まれる。
【0033】
本明細書で開示されるいずれかの実施形態において、「患者」という用語はヒトを指す。
【0034】
ＺＨＸ２阻害剤
本発明は、ＺＨＸ２がいくつかの異なる非限定的な方法によって中和又は阻害され得ることを企図している。例えば、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２（ｓｈ－ＺＨＸ２）に対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。一部の実施形態において、ｓｈ－ＺＨＸ２は市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合させる又はその一部とすることができる。代替的には、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２に対する抗体、二価抗体、又はモノクローナル抗体を含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。さらに、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。また、本明細書で企図されているように、ＺＨＸ２は、治療有効量の薬剤の投与によって中和又は阻害することができ、薬剤は、アンタゴニスト、又はＺＨＸ２結合タンパク質又はＤＮＡ配列に結合してＺＨＸ２の結合を防止するアンタゴニストを含み得る薬理学的薬剤である。また、本明細書で企図されているように、薬理学的薬剤は、ＺＨＸ２遺伝子、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的又は間接的に結合又は相互作用することができる。ＺＨＸ２阻害剤又はその組成物は、１日１回、１日２回以上、又は１週間に１回投与することができる。ＺＨＸ２阻害剤又はそれを含有する組成物は、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は静脈内投与を含む任意の従来の手段により対象に投与することができる。注射する場合、１回の投与につき単一の部位に注射することも、１回の投与につき複数の部位に注射することもできる。
本発明は、ＺＨＸ２がいくつかの異なる非限定的な方法によって中和又は阻害され得ることを企図している。例えば、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２（ｓｈ－ＺＨＸ２）に対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。一部の実施形態において、ｓｈ－ＺＨＸ２は市販されており、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む、当技術分野で公知の任意のベクターに結合させる又はその一部とすることができる。代替的には、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２に対する抗体、二価抗体、又はモノクローナル抗体を含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。さらに、本明細書に記載のように、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の治療有効量の投与によって中和又は阻害され得る。また、本明細書で企図されているように、ＺＨＸ２は、治療有効量の薬剤の投与によって中和又は阻害することができ、薬剤は、アンタゴニスト、又はＺＨＸ２結合タンパク質又はＤＮＡ配列に結合してＺＨＸ２の結合を防止するアンタゴニストを含み得る薬理学的薬剤である。また、本明細書で企図されているように、薬理学的薬剤は、ＺＨＸ２遺伝子、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的又は間接的に結合又は相互作用することができる。ＺＨＸ２阻害剤又はその組成物は、１日１回、１日２回以上、又は１週間に１回投与することができる。ＺＨＸ２阻害剤又はそれを含有する組成物は、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は静脈内投与を含む任意の従来の手段により対象に投与することができる。注射する場合、１回の投与につき単一の部位に注射することも、１回の投与につき複数の部位に注射することもできる。
【0035】
ＺＨＸ２抗体及び関連の阻害剤
より詳しくは、ＺＨＸ２阻害剤は、ＺＨＸ２に対して向けられたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。ＺＨＸ２に対して向けられた適切な抗体の例は、本明細書に開示されており、当業者に公知である。ＺＨＸ２抗体はまた、ＺＨＸ２を阻害する抗体断片若しくは二価抗体又はその断片も含み得る。本明細書に記載のように、ＺＨＸ２阻害剤は医薬組成物の一部であってもよく、この組成物は、ＺＨＸ２に対する抗体又はその断片のいずれかを含み得る。
より詳しくは、ＺＨＸ２阻害剤は、ＺＨＸ２に対して向けられたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。ＺＨＸ２に対して向けられた適切な抗体の例は、本明細書に開示されており、当業者に公知である。ＺＨＸ２抗体はまた、ＺＨＸ２を阻害する抗体断片若しくは二価抗体又はその断片も含み得る。本明細書に記載のように、ＺＨＸ２阻害剤は医薬組成物の一部であってもよく、この組成物は、ＺＨＸ２に対する抗体又はその断片のいずれかを含み得る。
【0036】
本明細書に記載の抗ＺＨＸ２抗体は、市販されているものを含め、当技術分野で公知の任意の手段によって作製又は入手することができる。また、抗体はＺＨＸ２と特異的に反応することができる又は特定のＺＨＸ２ポリペプチドもまたアンタゴニストとして使用することもできると考えられる。抗ＺＨＸ２は、本明細書では、ＺＨＸ２若しくはサイトカインに結合する抗体若しくはその断片、又はＺＨＸ２及び別の適切な標的に結合する二価抗体であり得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然のものである又は部分的に若しくは完全に合成的に生成されたものかを問わず、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインである又は抗原結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も網羅する。この用語は、「抗原結合断片」及び以下に記載のものなど、類似の結合断片を表す他の交換可能な用語をさらに含む。
【0038】
天然抗体及び天然免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されている。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、鎖内に規則的な間隔でジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＨ」又は「ＶＨ」）を有し、その後にいくつかの定常ドメイン（「ＣＨ」又は「ＣＨ」）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＬ」又は「ＶＬ」）を有し、その別の一端に定常ドメイン（「ＣＬ」又は「ＣＬ」）を有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられる。
【0039】
本明細書に記載のＺＨＸ２は、「合成遺伝子」に由来する「合成ポリヌクレオチド」に由来する「合成ポリペプチド」であり得るが、これは、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はアミノ酸配列若しくはその一部が、同等の天然配列と比較して、設計された、又は新規に合成された若しくは改変された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体又は抗原結合断片）又は合成遺伝子は、限定するものではないが、核酸配列又はアミノ酸配列の化学合成を含む、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。合成遺伝子は、典型的には、アミノ酸レベル又はポリヌクレオチドレベル（又はその両方）で天然遺伝子とは異なっており、また典型的には、合成発現制御配列のコンテキスト内に配置されている。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して、必ずしも異なるアミノ酸を有するタンパク質をコードするとは限らない。例えば、これらの配列はまた、異なるコドンを組み込んでいるが同じアミノ酸をコードする合成ポリヌクレオチド配列も含み得る（すなわち、ヌクレオチドの変化はアミノ酸レベルでのサイレント突然変異を表す。）。
【0040】
抗ＺＨＸ２抗体に関して、「抗原」という用語は、ＺＨＸ２又はそのタンパク質分子のいずれかの断片を指す。
【0041】
「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」又は「抗体の機能性断片」という用語は、本明細書では、ＺＨＸ２に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指すように交換可能に使用される。
【0042】
ＺＨＸ２抗体はまた、「ダイアボディ」が含まれることが想定され、これは２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインの間で対になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対になることが強いられ、２つの抗原結合部位が作製される。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４ ６４４８頁（１９９３）を参照されたい。
【0043】
ＺＨＸ２にはまた、非ヒト（例えばマウス）抗体の「キメラ」形態も含み得ることが想定され、これには非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体が含まれる。ほとんどの場合、キメラ抗体は、マウス Ｆｃ の代わりに、通常はヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部が挿入されたマウス抗体である。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５頁（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２９頁（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３～５９６頁（１９９２）を参照されたい。
【0044】
ＺＨＸ２抗体はまた、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す「モノクローナル抗体」も含み得ることが想定され、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生可能な変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含み得る従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法によって作製され得る又はファージ抗体から単離され得る。
【0045】
本明細書で使用する場合、「免疫反応性」とは、ＺＨＸ２上のアミノ酸残基の配列（「結合部位」又は「エピトープ」）に特異的であるが、他のペプチド／タンパク質と交差反応性である場合でも、ヒト使用への投与用に製剤化されるレベルでは毒性がない結合剤、抗体又はその断片を指す。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指し、塩橋及び水橋などの相互作用並びに他の従来の結合手段が含まれる。「優先的に結合する」という用語は、結合剤が、無関係なアミノ酸配列に結合するよりも高い親和性で結合部位に結合することを意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的な結合の平衡定数を指し、Ｋｄとして表される。リガンドに対する結合タンパク質の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）であり得る。本明細書で使用される場合、「結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）」という用語は、２つ以上の薬剤の複合体の希釈後の解離に対する抵抗性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの方法、又は当業者によく知られている任意の他の技術によって決定することができる。結合活性は、スキャッチャード分析などの方法、又は当業者によく知られている任意の他の技術によって決定することができる。
【0047】
「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することが可能な抗原又は他の巨大分子の部分を指す。
【0048】
「特異的」という用語は、抗体によって認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子に抗体がいかなる有意な結合も示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインがいくつかの抗原によって担持される特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、その場合、抗体はエピトープを担持する様々な抗原に結合することができる。「優先的に結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体が無関係なアミノ酸配列に結合するよりも高い親和性でエピトープに結合し、そのエピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応性がある場合でも、ヒト使用への投与用に製剤化されたレベルでは毒性がないことを意味する。
【0049】
「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指し、塩橋及び水橋などの相互作用並びに任意の他の従来の結合手段が含まれる。
【0050】
本明細書で検討されているように、ＺＨＸ２阻害剤は、遺伝子発現技術によって生成することができる。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシング又は低下を指す。これは、サイレンシングされた遺伝子の配列と二重鎖領域において相同性があるｓｉＲＮＡによって開始される、動物及び植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、生物にとって内因性であっても外因性であってもよく、染色体に組み込まれて存在する又はゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全に又は部分的に阻害される。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得る。標的ＲＮＡの機能は、完全又は部分的であり得る。
【0051】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８～２５ヌクレオチド長の二重鎖又は二本鎖領域を含む。多くの場合、ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に約２～４個の不対ヌクレオチドを含有する。ｓｉＲＮＡの二重鎖又は二本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子と実質的に相同である又は実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス鎖」であり、標的ＲＮＡ分子に相同な鎖は「センス鎖」であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖にも相補的である。ｓｉＲＮＡはまた、追加の配列も含有し得る。そのような配列の非限定的な例としては、連結配列、又はループ、及びステム、並びに他の折り畳み構造が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物及び脊椎動物におけるＲＮＡ干渉の誘発、並びに植物における転写後遺伝子サイレンシングの際の配列特異的ＲＮＡ分解の誘発で重要な媒介として機能するように思われる。
【0052】
また、本明細書で実施例に開示されているように、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用することにより、ＺＨＸ２をサイレンシング又は「オフ」にすることができることも検討される。
【0053】
また、ＺＨＸ２は、ＺＨＸ２遺伝子に、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的若しくは間接的に結合若しくは相互作用する薬理学的薬剤によって、サイレンシング若しくは「オフ」にされる可能性があり、又はこれらの部位で可逆的又は不可逆的な変化を起こす可能性があるとも考えられる。
【0054】
また、ＺＨＸ２が、核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質を阻害又は遮断する薬理学的薬剤によって、間接的にサイレンシング又は「オフ」にされ得ることも考えられる。このようなタンパク質の例には、他のＺＨＸタンパク質、例えば、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３、核因子ＹＡ、核因子ＹＢ、核因子ＹＣ、ＦｏｘＣ１及びエフリンＢ１／Ｂ２、又はＺＨＸ２と相互作用することが公知である任意の他のタンパク質が含まれる。
【0055】
一般的な方法
ＣＯＶＩＤのサイトカインカクテル及び関連の動物試験
実施されたすべての動物試験は、ラッシュ大学又はアラバマ大学バーミンガム校のＩＡＣＵＣによって承認された。すべての動物は、プロトコルに従って人道的扱いを受けた。Ｄｙｎａｂｅａｄによるマウス糸球体の分離、ふるい分けによるラット糸球体の分離、組織切片の組織保存、給餌しない代謝ケージでの１８時間の採尿、アルブミン尿及びタンパク尿の評価、リアルタイムＰＣＲ、共焦点イメージング、電子顕微鏡検査及びサンプル処理、光学顕微鏡検査のための組織学検査、ウェスタンブロット法及び共免疫沈降法の方法は、既に記載されており、公知である。以下を、血清サンプルを使用する市販のキットを使用してアッセイした；マウスＡＬＴ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｋ７５２－１００）、マウス心臓トロポニンＩタイプ３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢＰ３－００４５６）、マウスクレアチンキナーゼ（Ａｂｅａｍ ａｂ１５５９０１）及びヒトＩＬ－４Ｒα ＥＬＩＳＡ（Ａｂｅａｍ ａｂ４６０２２）。以下の抗体をウェスタンブロット用に購入した：抗ｐＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ｃａｔ ＃ ５６５５４、１：５００希釈）；抗ＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃ ５３９７、１：５００希釈）。ＺＨＸ１、ＺＨＸ２、及びＺＨＸ３に対する抗体は、既に記載されている。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｌｉｕら、「ＺＨＸ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，」 （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：３９６８１～３９６９２頁；Ｃｌｅｍｅｎｔら、「Ｅａｒｌｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，」 （２００７） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７２：３３７～３４７頁。
ＣＯＶＩＤのサイトカインカクテル及び関連の動物試験
実施されたすべての動物試験は、ラッシュ大学又はアラバマ大学バーミンガム校のＩＡＣＵＣによって承認された。すべての動物は、プロトコルに従って人道的扱いを受けた。Ｄｙｎａｂｅａｄによるマウス糸球体の分離、ふるい分けによるラット糸球体の分離、組織切片の組織保存、給餌しない代謝ケージでの１８時間の採尿、アルブミン尿及びタンパク尿の評価、リアルタイムＰＣＲ、共焦点イメージング、電子顕微鏡検査及びサンプル処理、光学顕微鏡検査のための組織学検査、ウェスタンブロット法及び共免疫沈降法の方法は、既に記載されており、公知である。以下を、血清サンプルを使用する市販のキットを使用してアッセイした；マウスＡＬＴ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｋ７５２－１００）、マウス心臓トロポニンＩタイプ３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢＰ３－００４５６）、マウスクレアチンキナーゼ（Ａｂｅａｍ ａｂ１５５９０１）及びヒトＩＬ－４Ｒα ＥＬＩＳＡ（Ａｂｅａｍ ａｂ４６０２２）。以下の抗体をウェスタンブロット用に購入した：抗ｐＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ｃａｔ ＃ ５６５５４、１：５００希釈）；抗ＳＴＡＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ ＃ ５３９７、１：５００希釈）。ＺＨＸ１、ＺＨＸ２、及びＺＨＸ３に対する抗体は、既に記載されている。Ｍａｃｅら ２０２０；Ｌｉｕら、「ＺＨＸ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，」 （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：３９６８１～３９６９２頁；Ｃｌｅｍｅｎｔら、「Ｅａｒｌｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，」 （２００７） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７２：３３７～３４７頁。
【0056】
すべてのサイトカイン、可溶性受容体、抗体はげっ歯類に静脈内注射され、以下にリストアップされている：
【0057】
【表1】
【0058】
枯渇試験に使用された抗体は、対応する組換えタンパク質を使用したウェスタンブロットによって特性決定された。各用量のサイトカインカクテルは、最終容量１００μＬの滅菌０．９％生理食塩水に溶解させた。ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）マウス及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｅｎｖｉｇｏ）マウスを８週齢で購入し、２週間馴化させ、ベースラインの１８時間採尿及び尾部血液サンプル採取を実施した。追加のベースライン採尿をＢＡＬＢ／ｃＪマウスに対して実施した。ほとんどのインビボ試験は、１０週齢～１５週齢の間に実施した。サイトカインカクテルの腎炎発症用量スペクトルは、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＬ４ｒ－／－（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）、ＺＨＸ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ＮＰＨＳ２ｃｒｅ／ｃｒｅに対して確立された。閾値腎炎原性用量（ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｉ１４ｒ－／－のＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンド、Ｘ／２；ＺＨＸ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ＮＰＨＳ２ｃｒｅ／ｃｒｅ、Ｘ／１５）を使用するマウスサイトカイン試験の際、血管内水分補給を維持するために、サイトカインカクテルの静脈内投与直後に１００μＬの０．９％生理食塩水を腹腔内投与した。中間カクテルモデル及び高カクテルモデルにおいて、６時間及び２３時間に０．９％生理食塩水１００μＬを２回、追加腹腔内注射した。サイトカイン枯渇試験において、マウスサイトカインカクテル投与後の１時間に、異なるマウス群に５０μｇのコントロールＩｇＧ又はそれぞれの抗体若しくは抗体の組合せを静脈内投与した。
【0059】
血漿クレアチニンの質量分析アッセイ
血清クレアチニンは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステムと、２ｘ５０ｍｍ、２μｍのＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ－ＧＥＬ ａｍｉｄｅ－８０ ＬＣカラムを組み合わせて使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５３連４重極質量分析計に接続したＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。オーブン温度は４０℃で固定した。移動相は、ＬＣＭＳグレードの水（３５％）及びＬＣＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ；６５％）中の１０ｍＭ酢酸アンモニウムで構成した。合成クレアチニン（２０μｇ／ｍｌ～０．１６μｇ／ｍｌ範囲；Ｓｉｇｍａ）及び同位体標識クレアチニン（Ｄ３－クレアチニン、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ標準及び内部標準として使用した。次いで、１０ｕｌのサンプル又は標準を５μｌの内部標準及び２３５ｕｌの１００％ＡＣＮと合わせ、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＬＣＭＳグレードの水に溶解した１０ｍＭ酢酸アンモニウムと６５％アセトニトリル２００μＬとを入れた新しいチューブに上清を移し、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行い、その後測定した。すべてのサンプルは２回測定した。
血清クレアチニンは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステムと、２ｘ５０ｍｍ、２μｍのＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ－ＧＥＬ ａｍｉｄｅ－８０ ＬＣカラムを組み合わせて使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５３連４重極質量分析計に接続したＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。オーブン温度は４０℃で固定した。移動相は、ＬＣＭＳグレードの水（３５％）及びＬＣＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ；６５％）中の１０ｍＭ酢酸アンモニウムで構成した。合成クレアチニン（２０μｇ／ｍｌ～０．１６μｇ／ｍｌ範囲；Ｓｉｇｍａ）及び同位体標識クレアチニン（Ｄ３－クレアチニン、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ標準及び内部標準として使用した。次いで、１０ｕｌのサンプル又は標準を５μｌの内部標準及び２３５ｕｌの１００％ＡＣＮと合わせ、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行った。ＬＣＭＳグレードの水に溶解した１０ｍＭ酢酸アンモニウムと６５％アセトニトリル２００μＬとを入れた新しいチューブに上清を移し、ボルテックスし、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離を行い、その後測定した。すべてのサンプルは２回測定した。
【0060】
ヒトゲノムＤＮＡ及びヒト腎生検の提供元
ネフローゼ症候群の患者３６名、コントロールとなる対象３３名、及び糖尿病性腎症の患者１６名からのゲノムＤＮＡサンプルは、以下の提供元から入手した。（ａ）ＤＮＡ、血液、尿サンプルを収集するためのＩＲＢ承認プロトコルＸ０８０８１３００１により取得した、アラバマ大学バーミンガム校のネフローゼ症候群患者の血漿からの不死化単球、（ｂ）糸球体疾患患者からの保存された腎生検又は健康な生きた血縁の腎ドナーからの移植前腎生検が含まれる、メキシコシティの国立心臓研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ）でのＩＲＢ承認の研究（ＣＯＮＡＣＹＴ ３４７５１Ｍ、ＣＯＮＡＣＹＴ １１－０５、ＤＰＡＧＡ－ＵＮＡＭ ＩＮ－２０１９０２）、（ｃ）ペルーのリマ、アルベルト・サボガル・エッサルド国立病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｓａｂｏｇａｌ Ｅｓｓａｌｕｄ）からのＩＲＢ免除の保存された腎生検、（ｄ）ポドサイト発現関連遺伝子に公知の変異を持つ、デューク分子生理学研究所（Ｄｕｋｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの既発表４３，４４のＦＳＧＳ患者の保存されたヒトＤＮＡ、（ｅ）１０００ゲノムプロジェクト及びＨＡＰＭＡＰプロジェクトからのＤＮＡを保存する、コーリエル細胞貯蔵機関（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）。症例とコントロールとの間の分析比較のため、１０００ゲノムプロジェクト・フェーズ３ Ｅｎｓａｍｂｌ ｖ８４を単一の追加コントロールとして含めた。
ネフローゼ症候群の患者３６名、コントロールとなる対象３３名、及び糖尿病性腎症の患者１６名からのゲノムＤＮＡサンプルは、以下の提供元から入手した。（ａ）ＤＮＡ、血液、尿サンプルを収集するためのＩＲＢ承認プロトコルＸ０８０８１３００１により取得した、アラバマ大学バーミンガム校のネフローゼ症候群患者の血漿からの不死化単球、（ｂ）糸球体疾患患者からの保存された腎生検又は健康な生きた血縁の腎ドナーからの移植前腎生検が含まれる、メキシコシティの国立心臓研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ）でのＩＲＢ承認の研究（ＣＯＮＡＣＹＴ ３４７５１Ｍ、ＣＯＮＡＣＹＴ １１－０５、ＤＰＡＧＡ－ＵＮＡＭ ＩＮ－２０１９０２）、（ｃ）ペルーのリマ、アルベルト・サボガル・エッサルド国立病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｎａｃｉｏｎａｌ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｓａｂｏｇａｌ Ｅｓｓａｌｕｄ）からのＩＲＢ免除の保存された腎生検、（ｄ）ポドサイト発現関連遺伝子に公知の変異を持つ、デューク分子生理学研究所（Ｄｕｋｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの既発表４３，４４のＦＳＧＳ患者の保存されたヒトＤＮＡ、（ｅ）１０００ゲノムプロジェクト及びＨＡＰＭＡＰプロジェクトからのＤＮＡを保存する、コーリエル細胞貯蔵機関（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）。症例とコントロールとの間の分析比較のため、１０００ゲノムプロジェクト・フェーズ３ Ｅｎｓａｍｂｌ ｖ８４を単一の追加コントロールとして含めた。
【0061】
Ａｇｉｌｅｎｔカスタムキャプチャー及びハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング
第８染色体上のＨＡＳ２とＺＨＸ２との間のゲノム間隔を分離するために、カスタムキャプチャーシーケンスパネルを作製した。標的間隔は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）のＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにアップロードされた。ゲノムＤＮＡライブラリーの調製及び間隔キャプチャーは、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＱＸＴ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキットを使用して行った。得られたＤＮＡライブラリーはＱＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）により定量化し、標準プロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００又はＮｅｘｔＳｅｑ ５００でペアエンド１００ｂｐシーケンスによりシーケンスした。約１，５００万個の配列が反応ごとに得られた。ＦＡＳＴＱファイルの生成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）のｂｃｌ２ｆａｓｔｑコンバーターを使用して行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェア（バージョン１２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を使用して、ペアのＩｌｌｕｍｉｎａ配列をｈｇ３８データベース（ＧＲＣｈ３８．ｐｌ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）と比較した。３ｂｐサイズ以上の挿入及び欠失、並びに最低２０シーケンスの読み取りを分析のために選択した。試験の対象及びコントロールの対象における挿入及び欠失のフィッシャー検定比較がＥｘｃｅｌ形式でエクスポートされ、その後、コントロールに存在するすべての挿入及び欠失がソフトウェア支援及び手動により除外された。ＩＧＶブラウザソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して続いて確認された挿入及び欠失のみを含めた。ホモ接合性の確立には、８５％超の配列にＩｎＤｅｌの存在すること、またその後ＩＧＶにより確認することが必要であった。挿入又は欠失の部位にわずかな不一致（１～２塩基対の位置の相違）が２つのソフトウェア間で時折認められた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試験の設計の間にサンガーシーケンスによって解決された。すべてのゲノムの番号付けは、ｈｇ３８及びＣＬＣゲノミクスソフトウェアに基づいている。
第８染色体上のＨＡＳ２とＺＨＸ２との間のゲノム間隔を分離するために、カスタムキャプチャーシーケンスパネルを作製した。標的間隔は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）のＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにアップロードされた。ゲノムＤＮＡライブラリーの調製及び間隔キャプチャーは、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＱＸＴ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキットを使用して行った。得られたＤＮＡライブラリーはＱＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）により定量化し、標準プロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００又はＮｅｘｔＳｅｑ ５００でペアエンド１００ｂｐシーケンスによりシーケンスした。約１，５００万個の配列が反応ごとに得られた。ＦＡＳＴＱファイルの生成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）のｂｃｌ２ｆａｓｔｑコンバーターを使用して行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェア（バージョン１２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を使用して、ペアのＩｌｌｕｍｉｎａ配列をｈｇ３８データベース（ＧＲＣｈ３８．ｐｌ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）と比較した。３ｂｐサイズ以上の挿入及び欠失、並びに最低２０シーケンスの読み取りを分析のために選択した。試験の対象及びコントロールの対象における挿入及び欠失のフィッシャー検定比較がＥｘｃｅｌ形式でエクスポートされ、その後、コントロールに存在するすべての挿入及び欠失がソフトウェア支援及び手動により除外された。ＩＧＶブラウザソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して続いて確認された挿入及び欠失のみを含めた。ホモ接合性の確立には、８５％超の配列にＩｎＤｅｌの存在すること、またその後ＩＧＶにより確認することが必要であった。挿入又は欠失の部位にわずかな不一致（１～２塩基対の位置の相違）が２つのソフトウェア間で時折認められた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試験の設計の間にサンガーシーケンスによって解決された。すべてのゲノムの番号付けは、ｈｇ３８及びＣＬＣゲノミクスソフトウェアに基づいている。
【0062】
ヒトゲノムにおけるＳｌｃ２２ａ２２の位置の仮定上の予測図
ＢＬＡＳＴに基づくマージンは、ヒトゲノムと一致するマウス遺伝子の２つの周辺部分を使用した。ＢＬＡＳＴ及びサイズに基づく投影は、ＢＬＡＳＴに基づくマージンをマウス遺伝子の両端のサイズまで拡張した。
ＢＬＡＳＴに基づくマージンは、ヒトゲノムと一致するマウス遺伝子の２つの周辺部分を使用した。ＢＬＡＳＴ及びサイズに基づく投影は、ＢＬＡＳＴに基づくマージンをマウス遺伝子の両端のサイズまで拡張した。
【0063】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した培養ヒトポドサイトのゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９に関する基本的な方法論は既に発表されている。Ｃｏｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」 （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９～８２３頁を参照されたい。確立された初期継代不死化ヒトポドサイト細胞株５１から単一細胞由来の細胞クローンが作製され、ゲノム編集試験に使用された。使用したオリゴヌクレオチド及びプライマーを表４に挙げている。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９に関する基本的な方法論は既に発表されている。Ｃｏｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」 （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９～８２３頁を参照されたい。確立された初期継代不死化ヒトポドサイト細胞株５１から単一細胞由来の細胞クローンが作製され、ゲノム編集試験に使用された。使用したオリゴヌクレオチド及びプライマーを表４に挙げている。
【0064】
【表2】
【0065】
ＣＲＩＳＰＲ Ｂ
ｓｇＲＮＡプラスミドの作製：１０ｂｐの挿入（ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ）を導入するために、挿入部位の４５ｂｐ下流の特定の部位（Ｃｈｒ８～１２２、５３３、６９４～１２２、５３３、６９５）を認識するｓｇＲＮＡをＢｅｎｃｈｌｉｎｇのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を使用して設計した。オリゴＧ００１６及びＧ００１７を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化及びアニールし、ＢｂｓＩで消化し、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇからの提供、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）にライゲーションした。ライゲーション産物をＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理して不必要な組換え産物を防止し、次いで、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。１０個のコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。プラスミドＤＮＡは、プライマーＫＩ１４５を使用して配列決定した（表４を参照されたい。）。
ｓｇＲＮＡプラスミドの作製：１０ｂｐの挿入（ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ）を導入するために、挿入部位の４５ｂｐ下流の特定の部位（Ｃｈｒ８～１２２、５３３、６９４～１２２、５３３、６９５）を認識するｓｇＲＮＡをＢｅｎｃｈｌｉｎｇのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を使用して設計した。オリゴＧ００１６及びＧ００１７を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化及びアニールし、ＢｂｓＩで消化し、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇからの提供、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）にライゲーションした。ライゲーション産物をＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理して不必要な組換え産物を防止し、次いで、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。１０個のコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。プラスミドＤＮＡは、プライマーＫＩ１４５を使用して配列決定した（表４を参照されたい。）。
【0066】
ドナープラスミドの作製：研究対象の挿入を含む患者Ｅ５８－１３のヒトゲノム配列は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、特定の患者ゲノムＤＮＡ、並びにプライマーＫＩ１９５及びＫＩ１９６を使用して増幅され、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位との間のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターにクローニングされた。ＫＩ２０７を使用してプラスミドＤＮＡを配列決定し、挿入の存在を確認した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）並びにプライマーのＫ１２１５及びＫ１２１６を使用してＰＡＭ配列に単一変異を作製し、このドナー鋳型プラスミドの切断を防止し、配列決定によってその変化を確認した。次に、このプラスミドをプライマーのＫ１２１９及びＫ１２２０を使用して線状で増幅し、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化し、残存する環状鋳型プラスミドを除去した。ＩＴＲ配列によって挟まれた抗生物質選択カセット（ピューロマイシン耐性及び切断型チミジンキナーゼ）を、プライマーのＫ１２１７及びＫ１２１８を使用してＰＢ－ＭＶ１ Ｐｕｒｏ－ＴＫプラスミド（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して挿入の７８ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミド（上記参照）ライゲーションした。ＮＥＢ（登録商標）５－アルファコンピテントイー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を２μｌのアセンブリ反応産物で形質転換した。１０コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、プライマーＫ１２１７を使用して配列決定し、正しいアセンブリを確認した。
ｓｇＲＮＡ及びドナープラスミドを使用するゲノム編集：腎臓病患者において確認されたＩｎＤｅｌをインビトロ複製するために、単一細胞由来の培養ヒトポドサイトを、特異的ｓｇＲＮＡを含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター並びに、ドナー配列及び抗生物質選択カセットを含有するドナープラスミドを用いたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム、０．２ｃｍキュベット、矩形波モード、１５０Ｖ、１０ミリ秒パルス）によってトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｇｉｂｃｏ）で１５日間のインキュベートにより非トランスフェクト細胞を除去した後、１０μｇの切除のみの（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ－ｏｎｌｙ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクター（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎｅ）をトランスフェクトし、抗生物質選択カセットを傷跡なく除去した。トランスフェクション後４日に、細胞を２．５μＭのガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、残存する切断型チミジンキナーゼ活性を持つ細胞を除去した。単一細胞をピックアップし、クローンを確立し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにプライマーＫＩ１８９及びＫＩ１８８を使用して標的領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲル精製し、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、挿入はＭｌ３フォワード・シーケンシング・プライマーを使用して配列決定した。配列は、天然のポドサイトゲノム配列及びドナーの鋳型配列とＢＬＡＳＴによりアラインメントした。
ｓｇＲＮＡ及びドナープラスミドを使用するゲノム編集：腎臓病患者において確認されたＩｎＤｅｌをインビトロ複製するために、単一細胞由来の培養ヒトポドサイトを、特異的ｓｇＲＮＡを含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター並びに、ドナー配列及び抗生物質選択カセットを含有するドナープラスミドを用いたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム、０．２ｃｍキュベット、矩形波モード、１５０Ｖ、１０ミリ秒パルス）によってトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｇｉｂｃｏ）で１５日間のインキュベートにより非トランスフェクト細胞を除去した後、１０μｇの切除のみの（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ－ｏｎｌｙ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクター（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎｅ）をトランスフェクトし、抗生物質選択カセットを傷跡なく除去した。トランスフェクション後４日に、細胞を２．５μＭのガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、残存する切断型チミジンキナーゼ活性を持つ細胞を除去した。単一細胞をピックアップし、クローンを確立し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにプライマーＫＩ１８９及びＫＩ１８８を使用して標的領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してゲル精製し、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、挿入はＭｌ３フォワード・シーケンシング・プライマーを使用して配列決定した。配列は、天然のポドサイトゲノム配列及びドナーの鋳型配列とＢＬＡＳＴによりアラインメントした。
【0067】
ＣＲＩＳＰＲ Ａ
全体的な方法は、使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド、並びに以下の部位固有の詳細を除いて、ＣＲＩＳＰＲ Ｂの場合と同じであった。８ｂｐの挿入物（ＴＧＧＡＴＧＧＡ）をＣｈｒ８～１２２、３０４、０９４～１２２、３０４、０９５）に導入し、挿入部位の７３ｂｐ上流の特定の部位を認識するようにｓｇＲＮＡを設計した。ドナープラスミドを作製する際、患者特異的ゲノムＤＮＡ（患者ＳＦ３）をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターのＳｐｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングした。ギブソンアセンブリの際、抗生物質耐性カセットを、挿入の５１ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミドとライゲートした。
全体的な方法は、使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド、並びに以下の部位固有の詳細を除いて、ＣＲＩＳＰＲ Ｂの場合と同じであった。８ｂｐの挿入物（ＴＧＧＡＴＧＧＡ）をＣｈｒ８～１２２、３０４、０９４～１２２、３０４、０９５）に導入し、挿入部位の７３ｂｐ上流の特定の部位を認識するようにｓｇＲＮＡを設計した。ドナープラスミドを作製する際、患者特異的ゲノムＤＮＡ（患者ＳＦ３）をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターのＳｐｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングした。ギブソンアセンブリの際、抗生物質耐性カセットを、挿入の５１ｂｐ上流のＴＴＡＡ領域で線状化プラスミドとライゲートした。
【0068】
動物モデルにおけるＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＮＦκＢ経路の試験
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）に通常の生理食塩水又はカクテルＤ用量３倍を注射し、１５分、３０分、６０分の時点で安楽死させた。マウスは、安楽死前に左心室注射によってプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）が灌流された。定性試験については、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤の存在下で、肝臓、心臓及び腎臓からＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して全タンパク質を抽出し、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５及びｐＳＴＡＴ５）、ＳＴＡＴ６（ＳＴＡＴ６及びｐＳＴＡＴ６）及びＮＦκＢ（ｐ６５及びホスホ－ｐ６５）経路の活性化を確認した。定量試験については、核抽出キット（Ｎｏｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ ＣＯ、ＵＳＡ、カタログ＃ ＮＢＰ－２－２９４４７）を使用して、各マウスのこれらの臓器から核画分及び細胞質画分を別々に抽出した。核内発現タンパク質ラミンＢ１のウェスタンブロットを両方の画分に対して実施し、核画分における優勢な発現を確認した。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを実施し、両方の画分中に存在することを確認した。ウェスタンブロットによる相対定量については、ｐＳＴＡＴタンパク質を核画分のラミンＢ１との比率として、細胞質画分では対応するＳＴＡＴタンパク質との比率として表した。両比率成分は常に同じ非飽和フィルム画像からスキャンされ、Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ６．１ソフトウェアを使用して、クローズクロップドバンドの手動検出、バックグラウンド減算、バンド識別、及び調整された総レーン体積計算により密度測定が実施された。以下のタンパク質に対する抗体を購入した：ＳＴＡＴ５（Ｄ２Ｏ６９、１：５００）、ｐ－ＳＴＡＴ５（Ｄ４７Ｅ７、１：１０００）、ＳＴＡＴ６（Ｄ３Ｈ４、１：５００）、Ｐ－ＳＴＡＴ６（Ｄ８Ｓ９Ｙ、１：１０００）、ＮＦ－κＢ ｐ－６５（Ｄ１４Ｅ１２、１：１０００）、Ｐ－ＮＦ－κＢ Ｐ－ｐ－６５（Ｓ５３６、１：１０００）、ＧＡＰＤＨ １４Ｃ１０、１：２０，０００）、すべてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ製、Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ラミンＢ１（ａｂｌ６０４８、１：５，０００、Ａｂｅａｍ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 英国）；ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（１：２０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝３匹のマウス）に通常の生理食塩水又はカクテルＤ用量３倍を注射し、１５分、３０分、６０分の時点で安楽死させた。マウスは、安楽死前に左心室注射によってプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）が灌流された。定性試験については、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤の存在下で、肝臓、心臓及び腎臓からＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して全タンパク質を抽出し、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５及びｐＳＴＡＴ５）、ＳＴＡＴ６（ＳＴＡＴ６及びｐＳＴＡＴ６）及びＮＦκＢ（ｐ６５及びホスホ－ｐ６５）経路の活性化を確認した。定量試験については、核抽出キット（Ｎｏｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ ＣＯ、ＵＳＡ、カタログ＃ ＮＢＰ－２－２９４４７）を使用して、各マウスのこれらの臓器から核画分及び細胞質画分を別々に抽出した。核内発現タンパク質ラミンＢ１のウェスタンブロットを両方の画分に対して実施し、核画分における優勢な発現を確認した。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを実施し、両方の画分中に存在することを確認した。ウェスタンブロットによる相対定量については、ｐＳＴＡＴタンパク質を核画分のラミンＢ１との比率として、細胞質画分では対応するＳＴＡＴタンパク質との比率として表した。両比率成分は常に同じ非飽和フィルム画像からスキャンされ、Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ６．１ソフトウェアを使用して、クローズクロップドバンドの手動検出、バックグラウンド減算、バンド識別、及び調整された総レーン体積計算により密度測定が実施された。以下のタンパク質に対する抗体を購入した：ＳＴＡＴ５（Ｄ２Ｏ６９、１：５００）、ｐ－ＳＴＡＴ５（Ｄ４７Ｅ７、１：１０００）、ＳＴＡＴ６（Ｄ３Ｈ４、１：５００）、Ｐ－ＳＴＡＴ６（Ｄ８Ｓ９Ｙ、１：１０００）、ＮＦ－κＢ ｐ－６５（Ｄ１４Ｅ１２、１：１０００）、Ｐ－ＮＦ－κＢ Ｐ－ｐ－６５（Ｓ５３６、１：１０００）、ＧＡＰＤＨ １４Ｃ１０、１：２０，０００）、すべてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ製、Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ、米国；ラミンＢ１（ａｂｌ６０４８、１：５，０００、Ａｂｅａｍ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 英国）；ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（１：２０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【0069】
インビトロでのＳＴＡＴ６シグナル伝達試験
野生型（ＣＲＩＳＰＲ改変ポドサイトの前駆体）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｂポドサイトを、熱不活化１０％ウシ胎児血清、１％インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－カタログ番号４１４０００４５）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で３３℃にて培養した。細胞を継代培養し、１０ｃｍの培養皿に５０，０００細胞／皿で３７℃にて３日間播種した。次に、培養培地を、熱不活性化０．２％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０と交換した。２４時間後、細胞をカクテルＣ又は風邪カクテル（Ｘ／１００，０００）で１０分間、２０分間及び３０分間処理した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して単離した（１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤がそれぞれ１錠ずつ含まれていた。）。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価した。
野生型（ＣＲＩＳＰＲ改変ポドサイトの前駆体）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｂポドサイトを、熱不活化１０％ウシ胎児血清、１％インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－カタログ番号４１４０００４５）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で３３℃にて培養した。細胞を継代培養し、１０ｃｍの培養皿に５０，０００細胞／皿で３７℃にて３日間播種した。次に、培養培地を、熱不活性化０．２％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０と交換した。２４時間後、細胞をカクテルＣ又は風邪カクテル（Ｘ／１００，０００）で１０分間、２０分間及び３０分間処理した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５３）及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ３２９５７）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：８９９００）を使用して単離した（１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤がそれぞれ１錠ずつ含まれていた。）。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価した。
【0070】
ＩＬ－４Ｒαアッセイ用のＣＯＶＩＤ－１９患者及びコントロール患者からヒト血漿
ヒト血漿の１００μＬアリコートは、次の提供元から入手した。（ａ）ラッシュ（Ｒｕｓｈ）大学のＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｂ）タンパク尿の存在に関して選択された、ラッシュ大学 ＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｃ）Ｚｅｎｂｉｏ（Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、米国）から購入した、年齢、性別、人種をａ群とマッチングさせた匿名化された血漿サンプル。
ヒト血漿の１００μＬアリコートは、次の提供元から入手した。（ａ）ラッシュ（Ｒｕｓｈ）大学のＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｂ）タンパク尿の存在に関して選択された、ラッシュ大学 ＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからの匿名化されたＩＲＢ承認の入院ＣＯＶＩＤ患者サンプル、（ｃ）Ｚｅｎｂｉｏ（Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、米国）から購入した、年齢、性別、人種をａ群とマッチングさせた匿名化された血漿サンプル。
【0071】
統計分析
すべてのグラフの値は、平均＋標準誤差である。２つの群に関与するタンパク尿、アルブミン尿、又は遺伝子発現の差異については、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１３で独立スチューデントｔ検定を使用した。特に指定のない限り、すべての有意性は両側検定である。
すべてのグラフの値は、平均＋標準誤差である。２つの群に関与するタンパク尿、アルブミン尿、又は遺伝子発現の差異については、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１３で独立スチューデントｔ検定を使用した。特に指定のない限り、すべての有意性は両側検定である。
【0072】
以下の実験の実施例をさらに参照されたい。
【実施例】
【0073】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明する目的で提供されており、本開示をいかなる形態に置いても限定することを意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在のところ好ましい実施形態を代表するものであり、単なる例示として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含されるそこでの変更及び他の使用は、当業者には自明である。
【0074】
［実施例１］
新規のＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームカクテルの開発
図１ａ～ｇは、ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ａ）ヒト疾患の状況におけるＣＯＶＩＤ－１９誘発性サイトカインストームの模式図。（図１ｂ）ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘの組成。（図１ｃ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。Ｘ／２は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。（図１ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。（図１ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｆ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
新規のＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームカクテルの開発
図１ａ～ｇは、ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームモデルの開発及び特性決定を示す。（図１ａ）ヒト疾患の状況におけるＣＯＶＩＤ－１９誘発性サイトカインストームの模式図。（図１ｂ）ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘの組成。（図１ｃ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに異なる用量のカクテルＤを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。Ｘ／２は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける閾値腎炎原性用量である。（図１ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに個々のＣＯＶＩＤカクテル成分の用量Ｘを注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝４匹のマウス）。（図１ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｆ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。（図１ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにそのままのカクテルＣの用量Ｘ／２を注射、又はポドサイトを標的とする個々の成分を欠いたカクテルＣの用量Ｘ／２を注射した後のアルブミン尿（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。すべての有意値は両側検定である。
【0075】
図９ａ～ｃ：（図９ａ）一般のＣＯＶＩＤ－１９患者、年齢、性別、及び人種をマッチさせた健常なコントロール、並びにタンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＥＬＩＳＡにより評価された血漿ＩＬ－４Ｒαレベル。アッセイされた患者サンプルの数を以下に示す。（図９ｂ）カクテルＤ用量Ｘ／２の注射後１日目のＢＡＬＢ／ｃＪマウス糸球体の電子顕微鏡画像。局所的な足突起消失（黒色矢印）、内皮空胞化（緑色丸）及び内皮肥大（青色丸）の領域が認められた。（図９ｃ）質量分析法により測定した血清クレアチニンは、ＣＯＶＩＤサイトカインカクテル用量Ｘ／２モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス；１群あたりｎ＝６匹のマウス）では増加されない。スケールバー０．５μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１。
【0076】
ＣＯＶＩＤカクテルＡ～Ｄは、集中治療室に入院しているＣＯＶＩＤ－１９患者をモデル化するために段階的に開発された（図１ｂ）。最初の５種のサイトカイン（図１ｂ）は、すべてのカクテルに共通である。循環ＩＬ－４Ｒαレベルもまた、タンパク尿を伴うＣＯＶＩＤ患者において上昇している（図９ａ）。集中治療室のＣＯＶＩＤ－１９罹患患者及び重度のＣＯＶＩＤ－１９疾患になりやすい高齢者とメタボリックシンドローム患者においては血漿ｓＡＣＥ２レベルが有意により高いことから、ＣＯＶＩＤ－１９受容体であるＡＣＥ２がＣＯＶＩＤ－１９カクテルに含まれていた。ＣＯＶＩＤ－１９罹患患者の血漿ＩＬ－１３及びＩＬ－４の高レベルは、この疾患におけるアレルギー経路の急性活性化を示唆している。カクテルＡからｓＩＬ－４Ｒαを除去し、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を加えることによりカクテルＢが作製され、カクテルＡにＩＬ－４を加えることによりカクテルＣが得られた。カクテルＣにＩＬ－１３を加えることによりカクテルＤが得られた。
【0077】
用量反応試験は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて、１／２倍が組織学的変化も誘発する（図９ｂ）、閾値腎炎原性用量であることを示した（図１ｃ）。個別に、組合せＸと同じ用量で使用されたこれらのサイトカインはいずれもアルブミン尿を引き起こさなかった（図１ｄ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対してＢＡＬＢ／ｃＪマウスでは、ベースラインのアルブミン尿がより低いことが報告されている。Ｍａｃｅら ２０２０を参照されたい。
【0078】
［実施例２］
ＣＯＶＩＤ－１９カクテルによって誘発される相乗的なマルチサイトカイン損傷の全身性症状発現
カクテルＤの高用量（３倍）の注射によりアルブミン尿を誘発されるとともに、血清心筋トロポニンＩ３型（ｃＴＰＩ３；心筋損傷、図２ａ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；急性肝臓損傷、図２ｂ）、血清クレアチニン（急性腎臓損傷、ＡＫＩ；図２ｃ）及び血漿クレアチンキナーゼ（ＣＫ、骨格筋損傷；図１０ａ）の上昇が生じた。
ＣＯＶＩＤ－１９カクテルによって誘発される相乗的なマルチサイトカイン損傷の全身性症状発現
カクテルＤの高用量（３倍）の注射によりアルブミン尿を誘発されるとともに、血清心筋トロポニンＩ３型（ｃＴＰＩ３；心筋損傷、図２ａ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；急性肝臓損傷、図２ｂ）、血清クレアチニン（急性腎臓損傷、ＡＫＩ；図２ｃ）及び血漿クレアチンキナーゼ（ＣＫ、骨格筋損傷；図１０ａ）の上昇が生じた。
【0079】
図２ａ～ｈは、ＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて高用量のカクテルＤ（３倍）によって誘発される全身性損傷の低減を示す。用量３倍はまた、低用量又は用量３倍の個々の成分と比較して、大きな損傷を有する。（図２ａ）心筋トロポニンＩ（ｃＴＰＩ３）レベルによって評価された急性心筋損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性レベルによって評価した急性肝臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｃ）質量分析法を使用して測定した血清クレアチニンによって評価した急性腎臓損傷（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。（図２ｄ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性心臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。心筋溶解（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、線維破壊（青色矢印）、好酸球増多（緑色矢印）、及び心膜炎（橙色矢印）が認められた。（図２ｅ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＨ＆Ｅ染色切片を使用した急性肝臓損傷の組織学的特徴（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。肝細胞損傷（赤色矢印）、炎症（黒色矢印）、突出したクッファー細胞（緑色矢印）、再生変化（黄色矢印）、中心静脈周囲損傷（青色矢印）が認められた。（図２ｆ）カクテルＤ３倍用量を注射したマウスからのＰＡＳ染色切片（列１、２、４）及び腎臓電子顕微鏡（列３）を使用した急性腎臓損傷の組織学的評価（１群あたりｎ＝３匹のマウス）。下の３列は近位尿細管を示し、最上列は遠位尿細管を示す。近位尿細管において、空胞化（赤色矢印）、刷子縁破壊（緑色矢印）、及び尿細管変性（黒色矢印）が認められた。遠位尿細管において、剥離のエビデンス（青色矢印）が存在した。泡沫細胞も認められた（白色矢印）。電子顕微鏡スケールバーＢＡＬＢ／ｃ、２．６６μｍ；ＢＡＬＢ／ｃＪ、２μｍ。（図２ｇ）ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスの心臓における組織学的変化の形態計測分析及び比較を示す表。（図２ｈ）ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスの肝臓における組織学的変化の形態計測分析及び比較を示す表。（図２ｉ）ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腎臓における組織学的変化の形態計測分析及び比較を示す表。光学顕微鏡スケールバー２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0080】
図１０ａ～ｎは、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおけるＺＨＸ２ハイポモルフ状態の特徴を示す。（図１０ａ）異なる用量のカクテルＤ注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝４匹のマウス）における骨格筋損傷のマーカーである血漿クレアチンキナーゼ。（図１０ｂ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ａから得られた血清心筋トロポニンＩレベルのデータ。（図１０ｃ）いくつかの単一サイトカイン注射群におけるレベルの増加がより少ないことをより高い解像度で示すために再プロットした、図２ｂから得られた血清ＡＬＴレベルデータ。（図１０ｄ）図２ａ～ｃに対応する、カクテルＤ３倍又は単回サイトカイン用量３倍を注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの１８時間アルブミン尿。（図１０ｅ）図２ａ～ｃに対応する、単回サイトカイン用量３倍を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの１８時間アルブミン尿。カクテルＤ３倍後のそれらの死亡率が高いことを考慮すると、定時採尿のための代謝ケージ飼育は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは実現不可能である。（図１０ｆ）リアルタイムＰＣＲ（１群あたりｎ＝６の鋳型）で評価した、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較したＢＡＬＢ／ｃＪにおける心臓及び骨格筋のＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現の倍数差。肝臓における低レベルのＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現は既に発表されており、この現象の陽性コントロールとしての役目を果たす。３倍の差を有意であるとした。（図１０ｇ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス心臓とＢＡＬＢ／ｃマウス心臓の間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。（図１０ｈ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス肝臓とＢＡＬＢ／ｃマウス肝臓の間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。（図１０ｉ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス骨格筋とＢＡＬＢ／ｃマウス骨格筋との間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、Ｚｈｘ１、Ｚｈｘ３、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。またＳＴＡＴ５の発現がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて３．０６±０．４０倍高かった。（図１０ｊ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス糸球体とＢＡＬＢ／ｃマウス糸球体との間でのサイトカイン受容体、Ａｃｅ２、並びにシグナル伝達経路タンパク質ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６及びＰ－６５（ＮＦκＢ）の発現のリアルタイムＰＣＲ比較（１群あたりｎ＝６の鋳型）。３倍の差を有意であるとした。他のＩＬ－２Ｒ鎖はマウス糸球体においては発現しておらず、Ｚｈｘ１及びＺｈｘ３は既に発表されている。（図１０ｋ）カクテルＤ用量３倍の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。多巣性足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が存在した。（図１０ｌ）カクテルＤ用量３倍の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓糸球体の電子顕微鏡写真。広範囲にわたる足突起消失（赤色矢印）、内皮肥大（緑色矢印）及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）のリモデリング（青色矢印）が存在した。（図１０ｍ）カクテルＤ３倍用量の注射後２４時間のＢＡＬＢ／ｃＪマウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色骨格筋。局所的炎症（黒色矢印）が一部の切片において認められた。（図１０ｎ）ＢＡＬＢ／ｃＪマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス；用量１／２倍）におけるカクテルＤモデルを誘導し、その後の、モデル誘導後の１時間のコントロールＩｇＧ又は抗体枯渇の組合せのアルブミン尿。（ｏ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝６匹のマウス；用量１／２倍）におけるカクテルＣ誘導後、ＩＬ－４Ｒα、ＴＮＦＲ１、ＩＬ－１０Ｒβに対する抗体、又はコントロールＩｇＧを使用した受容体遮断後のアルブミン尿。スケールバー（ｋ）０．５μｍ、（ｌ）０．５μｍ、（ｍ）２０μｍ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0081】
ｃＴＰＩ３、ＡＬＴ及びアルブミン尿もまた、カクテルよりも有意に低いレベルではあったがいくつかの個々のサイトカインについては３倍用量で増加した（図２ａ、ｂ；図１０ｂ～ｅ）。アルブミン尿評価のための代謝ケージでの定時採尿は、カクテルＤ３倍用量を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける高死亡率を考慮して実施されなかった（下記参照）。カクテルＤ３倍用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスと比較して有意により重度の心臓、肝臓及び急性腎臓損傷を誘発したが、このことは後者がＺＨＸ２ハイポモルフ状態によって保護されていることを示唆している。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの肝臓、腎臓及び糸球体のＺＨＸ２ハイポモルフ状態については既に記載されているが（Ｍａｃｅら、２０２０；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、２００５；Ｐｅｒｉｎｃｈｅｒｉら、２００８）、本発明者らは、心臓及び骨格筋においても同様の変化を見出した（図１０ｆ）。心臓、肝臓、骨格筋及び糸球体におけるサイトカイン受容体、ＡＣＥ２、他のＺＨＸタンパク質及び選択シグナル伝達経路タンパク質のｍＲＮＡ発現は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとの間では同様であった（図１０ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ；例外として、ＢＡＬＢ／ｃＪ糸球体ではＡｃｅ２がより高く、ＢＡＬＢ／ｃ骨格筋ではＳＴＡＴ５がより高い。）。心臓組織学（図２ｄ）では、心筋溶解、局所的な線維破壊及び好酸球増多、炎症（心筋炎）及び心膜炎が明らかになった。肝臓組織学（図２ｅ）では、実質的肝細胞損傷、突出したクッファー細胞、高頻度の変性変化と再生変化及び軽度の炎症が示された。腎臓の尿細管－間質区画の組織学的評価（図２ｆ）では、頻繁な空胞化、内腔の拡大、刷子縁破壊及び尿細管上皮細胞の剥離という形で近位尿細管損傷の証拠が明らかになった。上皮細胞の剥離、泡沫細胞及び空胞形成もまた遠位尿細管において認められた。カクテルＤ３倍注射後２４時間のこれらの臓器の形態計測学的差異がＢＡＬＢ／ｃマウスとＢＡＬＢ／ｃＪマウスとの間で認められた（図２ｇ、ｈ、ｉ）。しかし、重度又は広範な炎症のエビデンスは見られなかった。
【0082】
［実施例３］
重度のサイトカインストームモデル（カクテルＤ用量３倍）の誘導後の死亡率に対するＺＨＸ２発現の影響。
重度のサイトカインストームモデル（カクテルＤ用量３倍）の誘導後の死亡率に対するＺＨＸ２発現の影響。
【0083】
図３及び図４は、サイトカイン枯渇なし又はサイトカイン枯渇後のＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウス（図３）及びＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃ（図４）の死亡率を示す。１群あたりの注射されたマウスの数は分母に示す。各図のコントロールＩｇＧ群は、いかなる治療的サイトカイン枯渇もない各系統における死亡率を表している。代謝ケージを含む同等の飼育条件下では、この群の死亡率は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１／６マウス又は１６．６％；図３）と比較して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては非常に高い（５／６マウス又は８３．３％；図４）。図４の残りのデータは、マウスを通常のケージに収容することによって生成されたもので、死亡率は２／６又は３３．３％と低くかった。すべての枯渇抗体又はコントロールＩｇＧは、モデル誘導後１時間に静脈内注射された。
【0084】
［実施例４］
ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９を使用したＺＨＸ２ハイポモルフ状態の複製
大規模な全エクソーム配列解析試験では、ＺＸＨ２に関連する疾患原因型ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＣＯＶＩＤ－１９関連ＦＳＧＳ虚脱型）は特定されなかったため、コントロールの対象についてはＨＡＳ２（直近の上流遺伝子）の開始点（図５ａ）からＺＨＸ２の終点まで配列決定された。１０００ゲノムデータベースが追加のコントロールとして使用された。
ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９を使用したＺＨＸ２ハイポモルフ状態の複製
大規模な全エクソーム配列解析試験では、ＺＸＨ２に関連する疾患原因型ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＣＯＶＩＤ－１９関連ＦＳＧＳ虚脱型）は特定されなかったため、コントロールの対象についてはＨＡＳ２（直近の上流遺伝子）の開始点（図５ａ）からＺＨＸ２の終点まで配列決定された。１０００ゲノムデータベースが追加のコントロールとして使用された。
【0085】
図５ａ～ｆ：ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のゲノム基盤。非コードＤＮＡの挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）は、糸球体疾患の患者におけるＺＨＸ２発現に影響を及ぼす。（図５ａ）８番染色体上のＺＨＸ２及び近傍遺伝子の模式図。（図５ｂ）ＭＣＤ患者（ｎ＝９名の患者）、ＦＳＧＳ患者（ｎ＝１９名の患者）及びＣＯＶＩＤ－１９関連ＦＳＧＳ虚脱型（ｎ＝８名の患者）の間で共有される挿入及び欠失のマッピング。１２２、５３３、６９４の最も一般的な共有挿入は、ヒトにおいては機能していないげっ歯類発現遺伝子Ｓｌｃ２２ａ２２の理論上の開始点又はその近くにマッピングされる可能性がある。１２２、２９３、４２３の別の共有挿入は、Ｓｌｃ２２ａ２２の理論上の終点近くに位置していた。これらのＩｎＤｅｌは、コントロールの対象（ｎ＝３３）又は１０００ゲノムプロジェクトでは認められなかった。Ｅｘはエクソンである。（図５ｃ）上述した共有挿入の表形式の表示。（図５ｄ）患者とコントロールの対象との間に共通する８ｂｐの挿入（ＣＲＩＳＰＲ Ａ）、又はコントロールの対象及び１０００ゲノムプロジェクトには存在しない１２２、５３３、６９４の１０ｂｐの共有挿入（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）を含有する、単一細胞由来の培養ヒトポドサイト細胞株のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９支援ゲノム編集クローンの模式図。（図５ｅ）上記ゲノム改変クローン（ＣＲＩＳＰＲ Ａ、３クローン、プールされたデータ；試験ＣＲＩＳＰＲ Ｂ、２クローン）における相対的ＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現を、親単一細胞由来の培養ヒトポドサイト細胞株（クローンあたりｎ＝７の鋳型）と比較した。点線は親細胞株における発現を表す。（図５ｆ）コントロールの単一細胞由来の親細胞株と１２２、５３３、６９４に挿入された２つの変異クローンのうちの１つにおけるＺＨＸ２発現を比較したウェスタンブロット。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0086】
図１１ａ～ｃ：（図１１ａ）試験集団における単一挿入及び共有挿入並びに欠失（ＩｎＤｅｌ）。（図１１ｂ）疾患サブカテゴリー別に拡大されたＦＳＧＳ患者のＩｎＤｅｌ。（図１１ｃ）糖尿病性腎症患者（ｎ＝１３名）における共有ＩｎＤｅｌ。
【0087】
図１２ａ～ｃ：（図１２ａ）試験集団における単一ＩｎＤｅｌのリスト。（図１２ｂ）げっ歯類におけるＨａｓ２とＺＨＸ２との間のＳｌｃ２２ａ２２遺伝子、並びに大きさと心拍数の順に並べられた、大型動物及びヒトにおけるその遺伝子の欠如。（図１２ｃ）図５ｆに示したブロットからのポンソーレッド染色膜。
【0088】
ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアを使用して患者集団においてのみ確認された３ｂｐ以上の多重挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）を、第２のスクリーニング方法としてのＩＧＶを使用して確認し、両方の方法で存在するＩｎＤｅｌのみを含めた。ＭＣＤ患者９名のうちの６名、ＦＳＧＳ患者１９名のうちの１０名、及びＣＯＶＩＤ－１９ ＣＧ患者８名全員がＩｎＤｅｌを有していた。３つの挿入及び１つの欠失が２名以上の患者で共有されていた。１２２、５３３、６９４での挿入は、原発性ＭＣＤ、原発性ＦＳＧＳ又はホジキンリンパ腫ＦＳＧＳ先端病変を有する患者においてのみ存在した。
【0089】
ゲノムの種間分析により、マウス及びラットにおけるＨＡＳとＺＨＸ２との間に遺伝子Ｓｌｃ２２ａ２２が存在するが、ヒトを含む高等種においては機能しないことが示された。ヒトゲノムにおけるマウスＳｌｃ２２ａ２２（プロスタグランジントランスポーター）の残遺物の精細マッピングと分析は、１２２、５３３、６９４での共有挿入がこの遺伝子部位の起源に又はその近くに存在することを示した。上記のいずれの共通挿入も、欧米で慢性腎臓病に関連した最も一般的な糸球体疾患である、糖尿病性腎症患者においては認められなかった（図１１ｃ）。
【0090】
ＣＯＶＩＤ－１９サイトカインストームの非糸球体症状発現に対するＺＨＸ２ハイポモルフ状態の相対的耐性、並びにヒトＭＣＤ及びＦＳＧＳにおけるポドサイトＺＨＸ２発現の低下に関する先行文献をさらに調べるため、８番染色体の１２２、５３３、６９４での挿入を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用し、単一細胞由来の培養ヒトポドサイト細胞株で複製した（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ試験、図５ｄ）。比較のために、患者とコントロール（コントロールＣＲＩＳＰＲ Ａ）とにおいて認められた別の挿入も複製した。ＺＨＸ２ ｍＲＮＡ発現は、すべてのＣＲＩＳＰＲ Ａ細胞株クローン（プールしたデータ）で変化せず、ＣＲＩＳＰＲ Ｂに関して生成した両クローンにおいては有意なダウンレギュレーションが認められた（図５ｅ）。親細胞株と比較してＣＲＩＳＰＲ Ｂ株においてＺＨＸ２タンパク質の発現が低減していることがウェスタンブロットで確認された（図５ｆ、図１２ｃ）。
【0091】
［実施例５］
ＺＨＸ２＋／＋マウスと比較したＺＨＸ２ハイポモルフマウスにおける細胞シグナル伝達経路の非同期活性化。
ＺＨＸ２＋／＋マウスと比較したＺＨＸ２ハイポモルフマウスにおける細胞シグナル伝達経路の非同期活性化。
【0092】
ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスは重度サイトカインストームモデル誘導後にＺＨＸ２＋／＋ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して死亡率がはるかに低いので、ＴＮＦ－αとＩＬ－２又はＩＬ－４又はＩＬ－１３の組合せで枯渇させると、ＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率が解消される又は罹患率が低下し、本発明者らはそれらの受容体の下流のシグナル伝達経路を試験した。心臓、肝臓及び腎臓の全臓器タンパク質抽出物からの定性試験から、カクテルＤを注射したＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて、１５分、３０分及び６０分の時点でＮＦκＢ経路成分のｐ－ｐ６５（ＴＮＦα受容体の下流）、ｐＳＴＡＴ５（ＩＬ－２受容体の下流）及びｐＳＴＡＴ６（ＩＬ－４とＩＬ－１３受容体複合体の下流）のリン酸化が確認されたが、生理食塩水を注射したコントロールにおいては確認されなかった（図８ａの例）。次に、各臓器から核タンパク質及び細胞質タンパク質を抽出し、核抽出物中の核タンパク質ラミンＢ１（図８ｂの例）及び両画分中のＧＡＰＤＨ（図８ｃの例）の主要な発現について品質試験した。ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体及びＩＬ－１３受容体はＺＨＸ２と同じ細胞において発現されるが、ＴＮＦα受容体はほとんど血管において発現されるので、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて、核及び細胞質のｐＳＴＡＴ５及びｐＳＴＡＴ６タンパク質のウェスタンブロット及び密度測定定量を、ラミンＢ１、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６と比較した（図６ａ、ｂ、ウェスタンブロットの例は図８ｄ及び８ｅ）。生理食塩水群はシグナル伝達経路を活性化せず、図６には示していない。ほとんどのシナリオにおいて細胞質画分の相対的ｐＳＴＡＴ５発現は同等又はそれより低いにもかかわらず、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＢＡＬＢ／ｃＪにおいては３つの臓器すべてで核ｐＳＴＡＴ５の発現がより高い及び／又はより早いことが認められた（図６ａ）。全体的な相対的細胞質ｐＳＴＡＴ６生成はＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてはより低かったが、相対的核ｐＳＴＡＴ６発現は、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＢＡＬＢ／ｃＪにおいては同等であり、場合によっては高かった（図６ｂ）。これらのデータから、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＺＨＸ２欠損ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいては、ｐＳＴＡＴ５及びｐＳＴＡＴ６がより迅速にまた早期に核内に移動し、標的遺伝子の非同期活性化をＢＡＬＢ／ｃＪマウスで引き起こし、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるより重度の損傷及び高死亡率を防ぐことができることを示唆される。これは、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける細胞シグナル伝達経路の核内作用が疾患プロセスの極めて早期に起こり（非同期活性化）、そのため、これらの状態における他の疾患経路は、ＢＡＬＢ／ｃマウスで適切なタイミングで活性化された場合に起こるような相乗作用にはまだ準備ができていないことを意味する。
【0093】
［実施例６］
サイトカインカクテル誘発性糸球体損傷におけるＳＴＡＴ６経路及びＺＨＸ媒介メカニズム
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの肝臓及び腎臓における細胞質ｐＳＴＡＴ６試験と同様に（図６ｂ）、カクテルＣ誘導性ｐＳＴＡＴ６リン酸化は、野生型コントロールと比較して、ＣＲＩＳＰＲ Ｂ ＺＨＸ２ハイポモルフポドサイトにおいて３０分で有意に低下した（図７ａ、ｂ）。
サイトカインカクテル誘発性糸球体損傷におけるＳＴＡＴ６経路及びＺＨＸ媒介メカニズム
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの肝臓及び腎臓における細胞質ｐＳＴＡＴ６試験と同様に（図６ｂ）、カクテルＣ誘導性ｐＳＴＡＴ６リン酸化は、野生型コントロールと比較して、ＣＲＩＳＰＲ Ｂ ＺＨＸ２ハイポモルフポドサイトにおいて３０分で有意に低下した（図７ａ、ｂ）。
【0094】
（図７ａ）野生型及びＺＨＸ２ハイポモルフ（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）培養ヒトポドサイトをカクテルＣのヒト対応物カクテル（最終濃度１／１００，０００倍、１つの条件あたりｎ＝３のプレート）とインキュベートした際のｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の活性化を評価するためのウェスタンブロット。（図７ｂ）パネルａのカクテルＣでインキュベートした野生型及びＣＲＩＳＰＲ Ｂポドサイトのウェスタンブロットの密度測定。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、すべての値は両側検定に基づいている。
【0095】
図８ａ～ｅは、マウスに注射されたＣＯＶＩＤカクテルによって活性化されるインビボシグナル伝達メカニズムの例を示している。（図８ａ）カクテルＤ３倍又はコントロールの生理食塩水を注射したマウス（１群あたりｎ＝３匹）の全臓器タンパク質抽出物の定性ウェスタンブロットによるＮＦκＢ／ｐ－ｐ６５（肝臓、３０分）、ｐＳＴＡＴ６（腎臓、６０分）及びｐＳＴＡＴ５（心臓、１５分）活性化の例。（図８ｂ）抗ラミンＢ１抗体を使用した、心臓、腎臓及び肝臓からの同等タンパク質負荷の核画分及び細胞質画分のウェスタンブロットによる核抽出物の純度試験の例。細胞質中のラミンＢ１のトレースは、核に輸送される前のタンパク質合成に関係し得る。（図８ｃ）複数のマウスからの同等タンパク質負荷の心臓細胞質画分及び核画分におけるＧＡＰＤＨタンパク質の評価例。予想したように、ＧＡＰＤＨは両画分において発現しており、細胞質抽出物においてより高く発現されている。（図８ｄ）同じフィルムで展開された別々のブロットでｐＳＴＡＴ６及びラミンＢ１を評価した、カクテルＤ（Ｃ’ｔａｉｌ Ｄ）又はコントロール生理食塩水注射試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウス心臓核タンパク質抽出物（１レーンあたり２０μｇタンパク質）のブロットの定量的ウェスタンブロットの例。各レーンにマウス番号の略号を示す。（図８ｅ）同じフィルムで展開された別々のブロットでｐＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ５を評価した、カクテルＤ（Ｃ’ｔａｉｌ Ｄ）又はコントロール生理食塩水注射試験におけるＢＡＬＢ／ｃＪマウス心臓細胞質タンパク質抽出物（１レーンあたり２０μｇタンパク質）の定量ウェスタンブロットの例。各レーンにマウス番号の略号を示す。
【0096】
考察
本発明者らは以下のことを発見した。
本発明者らは以下のことを発見した。
【0097】
１）ＺＨＸ２ハイポモルフＢＡＬＢ／ｃＪマウスは、サイトカインカクテルに曝露された後、ＺＨＸ２＋／＋マウスと比較して、心臓損傷、肝臓損傷及び腎臓損傷の重症度がより低いことを示す。
【0098】
２）ヒトのハイポモルフ状態のゲノム基盤は、１２２、５３３、６９４でのこの欠失が、ヒトポドサイト細胞株のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９誘導型改変を使用してＺＨＸ２ハイポモルフ状態を誘導することを示している。図５を参照されたい。
【0099】
３）サイトカインストーム関連の疾患の発症には、サイトカイン間の相乗作用と異なる経路間の同期が必要である。カクテル誘導後のサイトカイン枯渇は、相乗作用を低減する。肝臓、心臓及び腎臓の細胞において、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６経路の活性シグナル伝達成分（ｐＳＴＡＴ５及びｐＳＴＡＴ６）が、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態のサイトカインストーム中に、他の分子イベントと同期せずに早く核内に入る。図６、図８を参照されたい。これは、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態においてＳＴＡＴ６経路の活性化が全体的に低下しているにもかかわらず起こる。この標的遺伝子の非同期的な時期の異なった早期活性化により、ＺＨＸ２ハイポモルフ状態においては重度疾患の発生は少ない。
【0100】
４）ＳＴＡＴ６経路の全体的な活性化の低下もまた、１２２、５３３、６９４欠失（ＣＲＩＳＰＲ Ｂ）を複製するように変異させたヒト培養ポドサイトにおいても認められる。図７ａ、ｂを参照されたい。
【0101】
５）ＺＨＸ２ハイポモルフは、サイトカインストームにおける死亡率を低減する。本発明者らがＺＨＸ２＋／＋マウス（図４）及びＺＨＸ２ハイポモルフマウス（図３）において高用量サイトカインストームモデルを比較した場合、ＺＨＸ２ハイポモルフマウスは、同じ条件下の死亡率が、ＺＨＸ２＋／＋マウスと比較して（５／６又は８３．３％；図４、コントロールＩｇＧ群）と比較して低い（１／６又は１６．６％、図３、コントロールＩｇＧ群）ことが認められた。
【0102】
本明細書の記載から理解されるように、多種多様な態様及び実施形態が本開示によって検討されており、その例には、限定するものではないが、以下に列挙されている態様及び実施形態が含まれる。
【0103】
ＺＨＸ２が、患者への薬剤の投与によって阻害、中和又は枯渇され得る方法であって、薬剤が、１つのＺＸＨ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを含む、方法が開示されている。本発明者らは、ｓｈＲＮＡは購入することが可能であり、またプラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド及び人工染色体を含む当技術分野において公知の任意のベクターに結合させる、又はその一部とすることができると考えている。
【0104】
ＺＨＸ２が、ＺＸＨ２に対して向けられたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の投与によって阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0105】
ＺＨＸ２が、ＺＸＨ２を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0106】
ＺＨＸ２が、ＺＨＸ２発現を減少させる薬理学的薬剤の投与によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0107】
ＺＨＸ２が、ＺＨＸ２遺伝子に、又はＺＨＸ２遺伝子の上流若しくは下流に直接的若しくは間接的に結合若しくは相互作用する、又はこれらの部位で可逆的若しくは不可逆的な変化をもたらす薬理学的薬剤によって、阻害、中和又は枯渇され得る方法が開示されている。
【0108】
また、ＺＨＸ２が、核内においてＺＨＸ２と相互作用するタンパク質を阻害又は遮断する薬理学的薬剤によって、間接的にサイレンシング又は「オフ」にされ得ることも考えられる。このようなタンパク質の例には、他のＺＨＸタンパク質、例えば、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３、核因子ＹＡ、核因子ＹＢ、核因子ＹＣ、ＦｏｘＣ１及びエフリンＢ１／Ｂ２、又はＺＨＸ２と相互作用することが公知である任意の他のタンパク質が含まれる。
【0109】
いずれかの実施形態において、本発明は、ＺＨＸ２を阻害、遮断又は枯渇させることによって、様々な疾患状態を治療する方法であって、疾患状態が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、他のコロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びエボラなどのウイルス感染症、非呼吸器ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症などの非ウイルス感染症、免疫介在性障害、心血管病理、糖尿病、メタボリックシンドローム、臓器移植、神経変性及びがん、並びに老化を含む、サイトカイン放出に影響を及ぼす炎症性疾患及び非炎症性疾患を含む、方法を提供する。
【0110】
本開示の実施形態が本明細書に記載されているが、そのような実施形態は単なる例として提供されていることを当業者には理解されたい。当業者であれば、本発明を逸脱することなく、数多くの変形、変更及び代替を思いつく。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義しており、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造とそれらの均等物がそれにより網羅されることが意図されている。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5B】
【図5C】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図10f】
【図10g】
【図10h】
【図10i】
【図10J】
【図10k】
【図10l】
【図10m】
【図10n】
【図10o】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【国際調査報告】