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特表2024-543376ケトンを含む日焼け止めのイミン類似体を含む日焼け止め組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】ケトンを含む日焼け止めのイミン類似体を含む日焼け止め組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/898 20060101AFI20241114BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20241114BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20241114BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20241114BHJP
A61K 8/35 20060101ALI20241114BHJP
A61K 8/41 20060101ALI20241114BHJP
A61K 8/46 20060101ALI20241114BHJP
A61K 8/44 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
A61K8/898
C12N9/10 ZNA
C12N9/02
A61Q17/04
A61K8/35
A61K8/41
A61K8/46
A61K8/44
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527351
(86)(22)【出願日】2022-11-09
(85)【翻訳文提出日】2024-07-09
(86)【国際出願番号】 US2022079573
(87)【国際公開番号】W WO2023086839
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】17/524,222
(32)【優先日】2021-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521387785
【氏名又は名称】キュリー カンパニー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ミルチェック，エリカ エム．
(72)【発明者】
【氏名】シンデル，ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】ザバドス，ゾルト
【テーマコード（参考）】
4C083
【Ｆターム（参考）】
4C083AB372
4C083AB432
4C083AC012
4C083AC072
4C083AC112
4C083AC182
4C083AC211
4C083AC212
4C083AC342
4C083AC352
4C083AC372
4C083AC392
4C083AC422
4C083AC471
4C083AC472
4C083AC531
4C083AC532
4C083AC551
4C083AC552
4C083AC581
4C083AC582
4C083AC662
4C083AC782
4C083AC791
4C083AC792
4C083AC852
4C083AD022
4C083AD092
4C083AD161
4C083AD162
4C083AD212
4C083AD242
4C083AD262
4C083AD352
4C083AD392
4C083CC19
4C083EE12
4C083EE17
(57)【要約】
少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物および日焼け止め活性成分であって、少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応して、ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物および日焼け止め活性成分が、本明細書で開示される。このイミン類似体は、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、日焼け止め組成物または日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾されてもよい。また、日焼け止め組成物または日焼け止め成分のうちのいずれかを、化粧品的または薬学的に許容される担体とともに含む化粧品調製物または医薬調製物も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、前記ケトン含有ＵＶフィルターおよび前記少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応して前記ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物。
【請求項2】
前記ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、請求項１に記載の日焼け止め組成物。
【請求項3】
前記ケトン含有ＵＶフィルターの前記イミン類似体形態が、さらに修飾されて、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め組成物を目的の標的に結合させることができる基質を提供する、請求項１または２に記載の日焼け止め組成物。
【請求項4】
少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め活性成分であって、前記ケトン含有ＵＶフィルターおよび前記第一級または第二級アミンが反応して、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有するイミン類似体を形成する、日焼け止め活性成分。
【請求項5】
前記ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、請求項４に記載の日焼け止め活性成分。
【請求項6】
前記ケトン含有ＵＶフィルターの前記イミン類似体形態が、さらに修飾されて、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供する、請求項４または５に記載の日焼け止め活性成分。
【請求項7】
請求項１もしくは２に記載の日焼け止め組成物または請求項４もしくは５に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
【請求項8】
請求項３に記載の日焼け止め組成物または請求項６に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１１日に出願された米国特許出願公開第１７／５２４，２２２号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月１１日に出願された米国特許出願公開第１７／５２４，２２２号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦支援研究に関する記述
本発明は、一部には、米国科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって授与された助成金第２０２６０５７号に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、一部には、米国科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって授与された助成金第２０２６０５７号に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
参照による組み込み
２０２２年１１月７日に作成され、本明細書とともに提出された２４，２３５バイトのサイズを有するＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のファイルにおいて提供される配列表は、その全体が参照により組み込まれる。
２０２２年１１月７日に作成され、本明細書とともに提出された２４，２３５バイトのサイズを有するＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のファイルにおいて提供される配列表は、その全体が参照により組み込まれる。
【0004】
分野
本分野は、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有するケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を含む日焼け止め組成物に関する。
本分野は、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有するケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を含む日焼け止め組成物に関する。
【背景技術】
【0005】
紫外線（ＵＶ）フィルターは、ＵＶ光を遮断または吸収する化合物、混合物、または材料である。ＵＶフィルターの主な用途の１つは、日焼けおよび他の日光／ＵＶ関連の損傷から皮膚を保護するための日焼け止め剤としてのそれらの使用である。過剰なＵＶ線は、日焼け、光老化および皮膚がんを引き起こすおそれがあるため、日焼け止め剤などのケア製品は、通常、それらがフィルターする特定の波長についての分類を含む。ＵＶ分類には、ＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０～３２０ｎｍ）およびＵＶＣ（２００～２８０ｎｍ）が含まれる。広域スペクトル日焼け止め剤は、ＵＶＡおよびＵＶＢ光線の両方から保護する。
【0006】
ＵＶ吸収性化合物は、日焼け止め剤だけでなく、他のパーソナルケア製品、例えば、口紅、シャンプー、ヘアスプレー、ボディーソープ、および防虫剤にも使用される。ケミカルフィルターは、紫外線を吸収するか、反射するかまたは散乱させることによってＵＶ線から保護する。反射および散乱は、無機ＵＶフィルター、例えば、二酸化チタンおよび酸化亜鉛によって達成される。吸収、主にＵＶＢの吸収は、有機ＵＶフィルターによって行われる。
【0007】
欧州連合は、ＵＶＡ保護のＵＶＢ保護に対する比によって広域スペクトル保護を決定しており、太陽光線保護指数（ＳＰＦ）の数の３分の１がＵＶＡ保護であることを要求している。現在、欧州の日焼け止め剤に使用されているＥＵに認可されたＵＶＡフィルターは８種ある。ＥＵに認可されたＵＶＡフィルターのいくつかは、トリアジン含有ＵＶフィルターである。それらは、いくらかのＵＶＢ保護も提供する。残念ながら、そのような化合物は、米国での使用がまだＦＤＡに認可されておらず、そのような認可がいつなされるかは明らかでない。
【0008】
したがって、これらのトリアジン含有ＵＶフィルターの有効性に匹敵するか、またはそれを上回る可能性さえある、ＦＤＡに認可されたＵＶフィルターを使用する新たな日焼け止め剤を開発する必要性が、依然として存在する。
【発明の概要】
【0009】
第１の実施形態では、少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物が開示される。
【0010】
第２の実施形態では、ケトン含有ＵＶフィルターは、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される。
【0011】
第３の実施形態では、ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態は、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、日焼け止め組成物を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾されてもよい。
【0012】
第４の実施形態では、少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め活性成分であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応して、ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍもしくはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め活性成分が開示される。好ましくは、ケトン含有ＵＶフィルターは、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される。
【0013】
第５の実施形態では、日焼け止め活性成分のケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態は、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾される。
【0014】
第６の実施形態では、本明細書に記載される日焼け止め組成物または日焼け止め活性成分のうちの少なくとも１つと、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む化粧品調製物または医薬調製物が開示される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】オキシベンゾンと比較したイミン－１、イミン－２、およびイミン－３のアセトニトリル中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図2】オキシベンゾンと比較したカルバメート－１のアセトニトリル中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図3】オキシベンゾンと比較したイミン－４、イミン－５、およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－６のアセトニトリル中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図4】Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６のエタノール中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図5】アボベンゾンと比較したイミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７のアセトニトリル中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図6】ほぼ等しい濃度のスルイソベンゾンと比較したＮ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８のエタノール中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図7】イミン－１０のエタノール中のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル特性を示す図である。
【図8】アボベンゾン、オキシベンゾン、スルイソベンゾン、ＤＨＨＢ、および下記の実施例に記載されるイミンの構造を、ＣｈｅｍＤｒａｗによって決定されたそれらの推定ＬｏｇＰ値とともに描写している図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
配列の簡単な説明
以下の配列は、連邦規則集第３７編第１．８２１～１．８２５条（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§１．８２１－１．８２５）（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件－配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ－ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａ－ｂｉｓ）、ならびに実施細則のセクション２０８および附属書類Ｃの配列表要件に準拠する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は、連邦規則集第３７編第１．８２２条（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２）に記載される規則に準拠する。
以下の配列は、連邦規則集第３７編第１．８２１～１．８２５条（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§１．８２１－１．８２５）（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件－配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ－ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａ－ｂｉｓ）、ならびに実施細則のセクション２０８および附属書類Ｃの配列表要件に準拠する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は、連邦規則集第３７編第１．８２２条（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２）に記載される規則に準拠する。
【0017】
配列番号１は、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）の野生型トランスグルタミナーゼ（Ｔｇアーゼ）配列のアミノ酸配列に対応する。
【0018】
配列番号２は、配列番号１の配列のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して三重突然変異（Ｎ２８２Ｅ、Ｈ２８９Ｉ、およびＳ２９９Ｋ）を有する。
【0019】
配列番号３は、配列番号１のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して四重突然変異（Ｎ２８２Ｋ、Ｇ２８３Ａ、Ｓ２８４Ｐ、およびＳ２９９Ｖ）を有する。
【0020】
配列番号４は、配列番号１のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して二重突然変異（Ｓ１９９ＡおよびＳ２９９Ａ）を有する。
【0021】
配列番号５は、配列番号１のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して二重突然変異（Ｓ１９９ＡおよびＳ２９９Ｖ）を有する。
【0022】
配列番号６は、配列番号１のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して三重突然変異（Ｓ２Ｐ、Ｓ１９９ＧおよびＳ２９９Ｖ）を有する。
【0023】
配列番号７は、配列番号１のバリアントに対応し、このバリアントは配列番号１に比して単一突然変異（Ｓ２Ｐ）を有する。
【0024】
配列番号８は、ポリヒスチジンタグを有する配列番号１、すなわち、ポリヒスチジンタグを有する野生型Ｔｇアーゼに対応する。
【0025】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。
【0026】
文脈で別様に明確に指示されない限り、単数形を使用する語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【0027】
本出願全体を通して、さまざまな実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本明細書に記載される実施形態の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様に、すべての可能な部分範囲を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～２、１～３、１～４および１～５、２～３、２～４、２～５、２～６、３～４、３～５、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を有するとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【0028】
本開示では、多くの用語および略号が使用される。別段の記載がない限り、以下の定義が適用される。
【0029】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で別様に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含めて、複数の化合物を含むことができる。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、例えば、本明細書で互換的に使用することができる。
【0030】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、値または範囲のある程度の変動性、例えば、記述された値または記述された範囲の限界から１０％以内、５％以内、または１％以内を許容することができる。
【0031】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。特定のアミノ酸を特定するために本明細書で使用される以下の略号は、表１に見出すことができる。
【0032】
【表1】
【0033】
「および／または」および「または」という用語は、本明細書で互換的に使用され、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの他方を含むかまたは含まないかについての特定の開示を指す。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句に使用される「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを範囲に含むことを意図している：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【0034】
「アボベンゾン」という用語は、ＵＶＡ線を吸収し、日焼け止め剤の中の成分として使用される化合物Ｃ２０Ｈ２２Ｏ３（ＣＡＳ登録番号７０３５６－０９－１）を指す。ＵＶＡ線は、皮膚がんおよび皮膚老化の原因となるＵＶ光のタイプである。しかし、アボベンゾンは、日光で分解するため、これは通常、有効であるように他の成分と組み合わされる。アボベンゾンは、３％までの濃度でＦＤＡによって認可されている。アボベンゾンはＰａｒｓｏｌ（登録商標）の商標で販売されている。
【0035】
「組成物」という用語は、２つまたはそれ以上の物質または化合物の組合せを指す。
【0036】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの活用形は、互換的に使用され、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。本明細書において態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で記載される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という言葉で記載される他の類似の態様も提供されることが理解される。
【0037】
「からなる」という用語は、「含み、かつ限定される」ことを意味する。
【0038】
「から本質的になる」という用語は、組成物の指定の材料、または方法の指定のステップ、および材料または方法の基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない追加の材料またはステップを意味する。
【0039】
アミノ酸残基の位置に関して本明細書で使用される場合、「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」または「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」または「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」は、タンパク質もしくはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基、またはタンパク質もしくはペプチド中の列挙された残基と類似するか、相同であるかもしくは同等であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用される場合、「対応する領域」は一般に、関連するタンパク質または参照タンパク質における類似の位置を指す。
【0040】
当業者は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の改変を、開示されるアミノ酸配列に関連する機能を保ちながら行い得ることを理解するであろう。例えば、所与の部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない遺伝子の変更が一般的であることは、当技術分野で周知である。
【0041】
「化粧品」という用語は、ほとんどのパーソナルケア、スキンケア、メーキャップおよび化粧品を指す。化粧品は、体臭を変え、身体の外観を変化させ、身体を洗浄し、身体を良好な状態に維持し、身体に香りを付け、および／または身体を保護する目的で、人体の任意の部分と接触して配置されることが意図される任意の物質または調製物である。化粧品としては、石鹸、シャンプーおよびコンディショナー、保湿剤、バスボム、染毛剤、香水、口紅、マスカラ、マニキュア液、デオドラントおよび多くの他の製品が挙げられるが、これらに限定されない。「化粧品調製物」はすぐに使用することができる形態である。
【0042】
「ＤＨＨＢ」という用語は、分子式Ｃ２４Ｈ３１ＮＯ４（ＣＡＳ登録番号３０２７７６－６８－７）を有するジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエートを指す。ＤＨＨＢは、ＵＶ－Ａ範囲に高度の吸収を有するＵＶフィルターである。これは２００５年に欧州で認可された。
【0043】
「に由来する」という用語は、「から生じる」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」、「から精製される」および「から作製される」という用語を範囲に含み、一般に、１つの指定の材料が、その起源を別の指定の材料に見出すか、または別の指定の材料を参照して記載することができる特徴を有することを示す。
【0044】
「イミン」という用語は、一般式Ｒ２Ｃ＝ＮＲを有する有機窒素化合物のクラスのうちのいずれかを指し、それらは「エナミン」と互変異性である。互変異性体は、容易に相互変換する化合物の構造異性体である。したがって、本明細書で使用される「イミン」という用語は、「イミン」およびその対応する構造異性体である「エナミン」の両方を指す。「構造異性体」および「互変異性体」いう用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0045】
本明細書で使用される「単離された」、「精製された」、「分離された」、および「回収された」という用語は、それに天然に結び付いている少なくとも１つの構成要素から取り出された材料（例えば、タンパク質、核酸、または細胞）を指す。例えば、これらの用語は、本来の状態において、例えば、無傷の生物学的システムにおいて見出されるように通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指すことができる。単離された核酸分子には、核酸分子を通常発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0046】
「ケトン含有ＵＶフィルター」という用語は、ａ）構造：Ｒ２Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒは種々の炭素含有置換基であり得、すなわち、Ｒは水素原子ではない）によって示されるように炭素原子が酸素原子に共有結合しているカルボニル部分を含む任意の化合物または化合物の混合物を指し、ｂ）そのような化合物または化合物の混合物は、ＵＶ光を遮断するかまたは吸収することもできる。
【0047】
「リジルオキシダーゼ」（「ＬＯＸ」）という用語（タンパク質－リジン６－オキシダーゼとしても知られる）は、コラーゲンおよびエラスチン前駆体におけるリジン残基からのアルデヒドの形成を触媒する銅依存性酵素を指す。これらのアルデヒドは反応性が高く、他のリジルオキシダーゼ由来のアルデヒド残基と、または非修飾リジン残基と自発的な化学反応を起こす。その結果、コラーゲンおよびエラスチンの架橋がもたらされる。ＬＯＸタンパク質は、動物、他の真核生物、ならびに細菌および古細菌において同定されている（Grau-Bove, et al. (2015) Scientific Reports 5: Article number: 10568に総説されている）。
【0048】
本明細書における「突然変異」という用語は、置換、挿入、および欠失（切断を含む）を含むがこれらに限定されない、親配列に導入され、それによって「突然変異体」が生じる変化を指す。突然変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質には見出されない新たな特徴、特性、機能、表現型、または形質の生成が挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載される事象、状況、または材料が起こっても起こらなくてもよく、または存在しても存在しなくてもよいことを意味し、その記載は、その事象、状況、または材料が起こるかまたは存在する場合、およびそれが起こらないかまたは存在しない場合を含む。
【0050】
「オキシベンゾン」という用語は、分子式Ｃ１４Ｈ１２Ｏ３（ＣＡＳ登録番号１３１－５７－７）を有する有機化合物を指す。これは日焼け止め剤として使用されるベンゾフェノン誘導体である。これは６％までの濃度でＦＤＡによって認可されている。これはＵＶＢ線および一部のＵＶＡ線を吸収する。
【0051】
「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸の重合体を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法合同委員会（ＪＣＢＮ）に従って定義されるアミノ酸の１文字コードおよび３文字コードが、本開示全体を通して使用される。１文字Ｘは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。１つのポリペプチドが、遺伝暗号の縮重性に起因して、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。突然変異は、親アミノ酸の１文字コードの後に、位置番号、続いてバリアントアミノ酸の１文字コードを続けることによって命名することができる。例えば、８７位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に突然変異させることは、「Ｇ０８７Ｓ」または「Ｇ８７Ｓ」と表される。改変を記載する場合、位置の後に括弧内に列挙された複数のアミノ酸が続くことは、列挙されたアミノ酸のいずれかによるその位置での置換のリストを示す。例えば、６（Ｌ、Ｉ）は、６位がロイシンまたはイソロイシンで置換され得ることを意味する。場合によっては、配列中に、置換を定義するためにスラッシュ（／）が使用され、例えば、Ｆ／Ｖは、その位置がフェニルアラニンまたはバリンをその位置に有し得ることを示す。
【0052】
「医薬調製物」という用語は、その完成した剤形で提示される、すなわち、すぐに使用することができる、ヒトでの使用または獣医学的使用を意図した薬物を指す。
【0053】
「第一級アミン」という用語は、水素原子のうちの１つが、例えば、非置換もしくは置換アルキル、環状アルキルまたは芳香族／ヘテロ芳香族基を含むがこれらに限定されないものによって置き換えられている、アンモニアの有機誘導体を指す。
【0054】
「第二級アミン」という用語は、水素原子のうちの２つが、例えば、非置換もしくは置換アルキルおよび／または芳香族／ヘテロ芳香族基を含むがこれらに限定されないものによって置き換えられている、アンモニアの有機誘導体を指す。
【0055】
「スルイソベンゾン」という用語は、分子式Ｃ１４Ｈ１２Ｏ６Ｓ（ＣＡＳ登録番号４０６５－４５－６）を有する５－ベンゾイル－４－ヒドロキシ－２－メトキシベンゼンスルホン酸を指す。これは１０％までの濃度でＦＤＡによって認可されている。これはＵＶＡおよびＵＶＢ光線を除去するように働く。これは日焼け止め剤および他のパーソナルケア製品においてＵＶフィルター成分として使用される。
【0056】
「日焼け止め剤」および「日焼け止め組成物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＵＶ線を遮断するかまたは吸収することができる任意の化合物、物質、混合物、または材料を指す。これは光保護局所剤とみなすことができる。
【0057】
「日焼け止め活性成分」という用語は、この場合にはＵＶＡおよびＵＶＢ線の遮断、反射または吸収を伴う、所望の化学的または生物学的効果を生じる化合物または物質の部分を指す。
【0058】
「目的の標的」という用語は、Ｔｇアーゼまたはその任意のバリアントの基質として働くように修飾された任意のケトン含有ＵＶフィルターのイミン形態への結合に好適な、任意の外因性タンパク質もしくはペプチド、例えば、皮膚科学的に関連性のあるタンパク質、または人体もしくは動物体の任意の部分を指す。Ｔｇアーゼまたはその任意のバリアントは、続いて、修飾イミンが人体の関連性のある部分、すなわち、目的の標的にコンジュゲートされる／結合する反応を触媒する。例えば、目的の標的としては、グルタミン－グリシン、コラーゲン、ケラチンおよび／またはエラスチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0059】
「トランスグルタミナーゼ」（ＴｇアーゼＥＣ ２．３．２．１３）という用語は、ペプチド結合したグルタミン基のγ－カルボキシ－アミド基がアシルドナーであるアシル転移反応を触媒することができる酵素を指す。種々の化合物において第一級アミノ基はアシルアクセプターとして機能し、ペプチド結合したグルタミンの一置換γ－アミドがその後に形成される。ペプチド鎖中のリジン残基のε－アミノ基がアシル受容体として働く場合、Ｔｇアーゼは分子内または分子間γ－グルタミル－ε－リシル架橋を形成する。触媒反応は、グルタミンの脱アミノ化および酵素の活性部位でのタンパク質－グルタミル－チオエステルの形成を経て進行する。チオエステル中間体のカルボニル部分での第２のタンパク質のリシルε－アミノ基による求核攻撃は、一般的なペプチダーゼによるタンパク質分解に対して主として耐性であるイソペプチド架橋タンパク質を生成する（Mariniello, et al. (2007) J Agr Food Chem. 55:4717-4721）。
【0060】
Ｔｇアーゼによって形成される結合は、タンパク質分解性の崩壊（タンパク質分解）に対して高い耐性を示す。微生物起源のＴｇアーゼはカルシウム非依存性であり、これはそれらの実用的な使用にとって大きな利点である。Ｔｇアーゼは、バイオテクノロジーおよび食品加工産業において多くの用途が見出されており、それは「ミートグルー（ｍｅａｔ ｇｌｕｅ）」という名を得ている。ペプチド架橋活性は、食品加工、バイオテクノロジー、医薬品、医療機器、個人用および家庭用品、ならびに皮革および繊維処理の範囲にわたる種々の産業目的に有用であることが示されている。最も一般的に使用されるＴｇアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、本明細書では以下、Ｔｇアーゼと称される、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）由来の微生物トランスグルタミナーゼである。
【0061】
「ＵＶフィルター」という用語は、ＵＶ光を遮断するか、反射するかまたは吸収する任意の化合物、混合物、物質、または材料を指す。
【0062】
「ＵＶ光」という用語は、可視光とＸ線との間の電磁スペクトルの範囲にある１０ｎｍ～４００ｎｍの波長を有する電磁放射線の形態を指す。ＵＶ光には、ＵＶＡ、ＵＶＢ、およびＵＶＣの３つのタイプまたはバンドがある。ＵＶＡは３２０～４００ｎｍの範囲の波長を有する。これはオゾン層によっては吸収されない。ＵＶＡ光線はＵＶＡ１およびＵＶＡ２にさらに分類される。ＵＶＡ１は波長が３４０～４００ｎｍの間であり、ＵＶＡ２は波長が３２０～３４０ｎｍの間である。ＵＶＢは２９０～３２０ｎｍの範囲の波長を有する。これはほとんどオゾン層によって吸収されるが、一部は地表に到達する。ＵＶＣは１００～２９０ｎｍの範囲の波長を有する。これはオゾン層および地球の大気によって完全に吸収される。
【0063】
関連（および誘導体）タンパク質は、「バリアント」または「突然変異体」タンパク質を範囲に含み、これらの用語は本明細書において互換的に使用される。バリアントタンパク質は、別の（すなわち、親）タンパク質と、および／または互いに、少数のアミノ酸残基が異なる。バリアントは、それが由来する親タンパク質と比較して、１つまたは複数のアミノ酸突然変異（例えば、アミノ酸の欠失、挿入または置換）を含み得る。代替的、または追加的に、バリアントは、配列アラインメントツール、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、およびＣＬＵＳＴＡＬを使用して決定されるように、参照タンパク質または核酸と、指定される程度の配列同一性を有し得る。例えば、バリアントタンパク質または核酸は、参照配列と少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには９９．５％の、およびそれらの間の整数パーセンテージのアミノ酸配列同一性を有し得る。
【0064】
「可視光」という用語は、ＵＶ光と赤外光との間の電磁スペクトルの範囲にある４００ｎｍ～７００ｎｍの波長を有する、ヒトの眼によって知覚される電磁放射線の形態を指す。可視光の中でも、４００ｎｍ～４５０ｎｍの波長を有する高エネルギー可視光（ＨＥＶＬ）は、酸化ストレス、フリーラジカル生成、および皮膚への真皮細胞損傷を引き起こすことから特に重要である。
【0065】
「可視光フィルター」という用語は、ＵＶ光を遮断するか、反射するかまたは吸収する任意の化合物、混合物、物質、または材料を指す。
【0066】
アミノ酸配列または核酸配列に関する「野生型」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列がネイティブ性のまたは天然に存在する配列であることを示す。本明細書で使用される場合、「天然に存在する」という用語は、天然に見出されるあらゆるもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、または核酸配列）を指す。反対に、「天然に存在しない」という用語は、天然に見出されないあらゆるもの（例えば、実験室で作製された組換え／操作された核酸およびタンパク質配列、または野生型配列の改変）を指す。
【0067】
上記で考察したように、日焼け止め剤または日焼け防止剤とも称される紫外線フィルターは、エネルギーの吸収、反射または分散を通じて入射する太陽線に直接干渉する光保護剤配合物中に存在する要素である。それらは、その作用機序に基づいて２つのカテゴリーに分類される：化学的または有機的日焼け止め剤、および鉱物ベースまたは有機的日焼け止め剤。
【0068】
米国では、日焼け止め製品は一般用医薬品（ＯＴＣ）に分類される。これは、それらが厳密に規制されており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による販売前登録を必要とすることを意味する。日焼け止め剤に関する規制には、一般用医薬品としての日焼け止め薬品のヒト使用に関するモノグラフ（Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｏｖｅｒ－Ｔｈｅ－Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ（２１ ＣＦＲ ３５２）および日焼け止め剤イノベーション条例（Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ａｃｔ）が含まれる。２０１９年２月に米国ＦＤＡは、日焼け止め剤および他のサンケア関連製品の製造および販売に関連する規制を変更する規則案を発表した。この規則案は、ＦＤＡ承認申請なしに市販されている非処方薬であるＯＴＣ日焼け止め剤を、最新の科学と併せて、消費者が安全かつ効果的な予防的サンケアの選択肢をより確実に利用できるようにすることを目的としている。
【0069】
現在市販されている１６種の日焼け止め活性成分のうち、２種の成分、酸化亜鉛および酸化チタンは、日焼け止め剤に使用するためのＧＲＡＳＥ（一般に安全かつ有効と認められている（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ））である。パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびサリチル酸トロラミンという２つの成分は、日焼け止め剤用としてはＧＲＡＳＥではないと考えられた。残りの１２種の成分であるシノキサート、ジオキシベンゾン、エンスリゾール、ホモサラート、メラジメート、オクチノキサート、オクチサレート、オクトクリレン、パディメートＯ、スルイソベンゾン、オキシベンゾンおよびアボベンゾンは、肯定的なＧＲＡＳＥ判定を行うには安全性データが不十分であると考えられた。
【0070】
対照的に、欧州連合は日焼け止め剤を化粧品とみなしている。この分類は米国の分類とは非常に異なるので、欧州の日焼け止め剤に使用されるいくつかの成分、例えば、トリアジン含有ＵＶフィルターは、現在、米国市場では監視なしでは許可されていない。米国における日焼け止め剤の開発に関して何が起こるかはまだ見通せない。したがって、新しい日焼け止め活性成分の必要性は引き続き存在する。
【0071】
本明細書に開示されるのは、少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、ケトン含有ＵＶフィルターが反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止または減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物である。
【0072】
したがって、少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、ケトン含有ＵＶフィルターは反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体は、ａ）ＵＶフィルターおよび可視光フィルターとして使用される、ｂ）耐水性である、ならびに／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する組成物が、本明細書に開示される。
【0073】
これは、可視光フィルター機能を提供するための別の構成要素（例えば、酸化鉄顔料）を添加する必要なしに達成され、可視光フィルターに関連する欠点を回避することができ、より少ない活性成分が皮膚と接触することで、アレルギー反応および／または皮膚の刺激のリスクが最小限になる可能性がある。さらに、本明細書に記載される日焼け止め組成物は、多構成要素系よりも容易に、好適にはより低いコストで製造することができる。さらに、それぞれが独自の吸収プロファイルを有するＵＶフィルターおよび可視光フィルターとして２つの成分をそれぞれ使用することとは対照的に、本明細書に開示される日焼け止め組成物は、ＵＶ光から可視光の範囲にわたって連続的な光保護を提供する。このため、ＵＶフィルター成分と可視光フィルター成分との間の吸収プロファイルの（潜在的に不完全な）重複から生じる、可能な波長範囲ギャップおよび／または保護の程度の変動が回避される。本明細書に記載される日焼け止め組成物の実施形態では、そのような日焼け止め組成物は、他の可視光フィルターを含まないか、または実質的に含まない。例えば、酸化鉄などの顔料を含まないか、または実質的に含まない。
【0074】
本明細書に記載される日焼け止め組成物の可視光フィルターは、好ましくは、４００ｎｍ～４５０ｎｍの波長の可視光を遮断するかまたは吸収する。
【0075】
ケトン含有ＵＶフィルターの例としては、アボベンゾン、オキシベンゾン、スルイソベンゾン、エンザカメン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、およびエカムスルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいケトン含有ＵＶフィルターは、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート（ＤＨＨＢ）、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンである。ケトン含有ＵＶフィルターと反応して所望のイミン類似体を生成することができるほとんどのアミンは、イミン類似体が、ａ）ＵＶＡ－１、ＵＶＡ－２、および／もしくはＵＶＢ領域、ならびに４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に光吸収(absorbance)を拡張することができる、ｂ）耐水性である、ならびに／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性も有するならば、有用であることが期待される。そのような有用なアミンの例としては、アミノ酸、カダベリン、プトレシン、ヒドラジン、アジピン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ベンジルアミン、アニリン、アモジメチコン、トロメタミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ジメチルアミノプロピルアミン、アミノメチルプロパノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0076】
少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応器に添加される場合、それらは反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成することができる。好ましくは、イミン類似体は、ＣｈｅｍＤｒａｗによって計算されたそれらの推定ｌｏｇＰ値とともに図８に示されるイミン－１、イミン－２、イミン－４、イミン－５、イミン－６、イミン－７、イミン－８、イミン－９、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン７、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン８、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン９、および／またはイミン－１０のうちの１つまたは複数から選択される。一部の場合には、得られたイミン類似体は、図８に示されるように、例えば、二量体－イミン６を二量体化することができる。別の態様では、得られたイミン類似体は、ケトン含有ＵＶフィルターと第一級または第二級アミンとの反応生成物とみなすことができる。本実施形態のイミン類似体は、ＵＶフィルターおよび可視光フィルターとして同時に機能し、ならびに／または耐水性であり、ならびに／または皮膚浸透性を低下させる。
【0077】
驚いたことに、および予想外に、ケトン含有ＵＶフィルターのこのイミン類似体の形成は、ａ）ＵＶＡ－１、ＵＶＡ－２、および／またはＵＶＢ領域ならびに４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に光吸収を拡張することができ、ｂ）耐水性であり、ならびに／またはｃ）皮膚浸透を防止または減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有することが見出された。これは、本明細書で考察されるこれらの特性のうちの少なくとも１つを有する初のイミン含有日焼け止め組成物または日焼け止め成分であると考えられる。これは、本明細書に提供される以下の実施例および図面においてより詳細に示される。
【0078】
さらなる一実施形態では、ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を可視光フィルターとして含む本明細書に開示される日焼け止め組成物の使用であって、前記イミン類似体が、ケトン含有ＵＶフィルターと第一級または第二級アミンとの反応生成物である、使用がある。
【0079】
化学的ＵＶフィルターは、その光保護特性を維持するために、例えば皮膚の表面上に留まることが必要とされる。日焼け止め製品におけるＵＶフィルターの皮膚浸透は回避されるべきである。皮膚浸透によるＵＶ保護の低下に加えて、光線過敏反応も起こり得る。
【0080】
局所送達の成功は、皮膚などの生物学的バリアを克服する能力に依存する。日焼け止め剤の安全に関しては、目的は毒性を回避するために局所製剤からの化学物質の皮膚浸透を制限することである。５００ダルトン規則は、皮膚吸収を可能にするためには、化合物の分子量（ＭＷ）は５００ダルトン未満であるべきと仮定している（Bos et al., Exp Dermatol 2000: 9:165-169）。したがって、この規則に基づけば、日焼け止め組成物中のＵＶフィルターは、皮膚浸透の可能性を減らすために、少なくとも５００ダルトンのＭＷを有するべきである。
【0081】
ＭＷに加えて、物質が植物、動物、ヒトもしくは他の生体組織によって吸収されるか否か、または水によって容易に運び去られ、広められるか否かを評価する際に有用な別の値は、Ｌｏｇ Ｐ値である。これは、広範な系に影響を与える重要な分子物理特性である。分配係数（Ｐ）は、平衡状態にある２種の非混和性溶媒の混合物における化合物の濃度の比である。したがって、この比は、これらの２種の液体における溶質の溶解度、特に非イオン化溶質の溶解度の比較である。溶媒の一方が水であり、他方が非極性溶媒である場合、Ｌｏｇ Ｐ値は、親油性または疎水性の尺度である。親油性は、組織膜を通過する透過性の重要な決定因子である。ｌｏｇ Ｐの負の値は、化合物が水相に対してより高い親和性を有すること、すなわち、より親水性であることを意味する。Ｌｏｇ Ｐの正の値は、脂質相におけるより高い濃度、すなわち、化合物がより親油性であることを示す。
【0082】
一般に、５００ダルトン未満のＭＷおよび１～３のＬｏｇ Ｐを有する小型で中程度に親油性の分子は、皮膚に非常によく浸透することが期待されると考えられている。このことを考慮すると、４～６の範囲のＬｏｇ Ｐを有する中程度に親油性の分子は、日焼け止め剤におけるＵＶフィルターとしての使用に好適であると考えられる。
【0083】
「耐水性」または「非常に耐水性」という用語は、日焼け止め組成物に関して「防水性」という用語を置き換えるものである。「耐水性」または「非常に耐水性」という用語は、日焼け止め製品によって提供される太陽光線保護が、それぞれ４０分間または８０分間続く微温浴の後に５０％未満減少する場合に使用することができる。日焼け止め剤が皮膚に「付着する」と、水中で、または激しい汗を誘発する運動を行った場合に洗い流される可能性が低くなる。
【0084】
上述したように、オキシベンゾンは、第一級または第二級アミンと接触させることでそのイミン類似体を形成することができるケトン含有フィルターである。２当量のオキシベンゾンまたは類似のケトン含有化合物を、１当量のジアミン、例えば、ヘキサメチレンジアミンと組み合わせて、イミンを介してオキシベンゾンを二量体化することも可能である。これは図８に描写されている。得られた二量体は、ＵＶ保護の範囲を４００ｎｍまたはそれを上回る可視範囲に拡大することによってもたらされるすべての利点を保ちながら、５００ダルトンを超えるＭＷおよび１～３の範囲を上回るＬｏｇ Ｐを有する。
【0085】
本明細書に記載されるＵＶフィルターに加えて、本実施形態の日焼け止め組成物は、好適には、水、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、増粘剤、保存料、キレート剤、および／または他の慣用的な成分を適切な量で含む。好ましくは、日焼け止め組成物は、１．０～２０％ ｗ／ｗ％の本明細書に記載されるＵＶフィルターを含む。
【0086】
別の態様では、本明細書に開示されるケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体は、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、日焼け止め組成物または日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾されてもよい。
【0087】
Ｃａ２＋非依存性微生物トランスグルタミナーゼ（Ｔｇアーゼ）ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）のバリアントであるＴｇアーゼ酵素が存在する。ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）由来の野生型酵素は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対応する。
【0088】
配列番号１のＴｇアーゼバリアントは、野生型Ｔｇアーゼのポリペプチド配列中の１つまたは複数のアミノ酸を突然変異させること、およびグルタミンアミノ酸残基とアミン（またはヒドロキシルアミン）アクセプターとの間のトランスグルタミナーゼアミド基転移活性を観察することによって得ることができる。突然変異置換を有するタンパク質の組換え発現のための方法は以前に記載されており、当技術分野で周知であり、これには例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などがある。点突然変異の組合せは、エラープローンＰＣＲ、遺伝子シャフリング、分子育種などを含むいくつかの方法を使用して生成することができる。
【0089】
Ｔｇアーゼバリアントおよび野生型Ｔｇアーゼは、配列番号８のアミノ酸残基３３４～３３９で例示されるように、それらのＣ末端にポリヒスチジンペプチド延長部をさらに含み得る。ポリヒスチジンペプチドは、精製目的のための有用なタグであり、酵素活性に影響を及ぼさない。典型的には、ポリヒスチジンペプチドは、６～８残基の長さである（配列番号９）。
【0090】
Ｔｇアーゼバリアントは、そのＮ末端にメチオニン残基をさらに含み得る。成熟野生型ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）Ｔｇアーゼ酵素は、この酵素をコードする遺伝子配列によってコードされるＮ末端メチオニン残基を欠く。一部の実施形態では、Ｔｇアーゼバリアントは、Ｎ末端メチオニン残基を有しない成熟ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）Ｔｇアーゼのバリアントとして発現される。他の実施形態では、Ｔｇアーゼは、Ｔｇアーゼが発現される発現ベクターによって提供され得る追加のＮ末端メチオニン残基を有する成熟Ｔｇアーゼとして発現される。目的のＴｇアーゼバリアントは、配列番号２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列中に見出すことができる。
【0091】
上記のように、「目的の標的」は、Ｔｇアーゼまたはその任意のバリアントの基質として機能するように修飾された任意のケトン含有ＵＶフィルターのイミンまたはエナミン形態への結合に好適な、任意の外因性タンパク質もしくはペプチド、例えば、皮膚科学的に関連性のあるタンパク質、または人体もしくは動物体の任意の部分を指す。Ｔｇアーゼまたはその任意のバリアントは、続いて、修飾イミンまたはエナミンが人体の関連性のある部分、すなわち、目的の標的にコンジュゲートされる／結合する反応を触媒する。例えば、目的の標的としては、グルタミン－グリシン、コラーゲン、ケラチンおよび／またはエラスチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0092】
同じく本開示の範囲に含まれるのは、本明細書に開示される日焼け止め組成物または日焼け止め活性成分のうちのいずれかを、化粧品的または薬学的に許容される担体とともに含む化粧品調製物または医薬調製物である。例えば、本明細書に開示されるケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体のうちのいずれかを、さらに修飾して、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、日焼け止め組成物または日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供してもよく、またはしなくてもよい。
【0093】
好適な化粧品的および薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。化粧品的に許容される担体の例としては、水および／または水溶性溶媒、水性ゲル、アルコール性ゲル、軟膏、油、アルコール性または水性流体、油中水型エマルジョン、シリコーン中水型エマルジョンなどが挙げられるが、これらに限定されない。化粧品的に許容される担体の非限定的な例としては、グリセリン、Ｃ１～４アルコール、有機溶媒、脂肪アルコール、脂肪エーテル、脂肪エステル、ポリオール、グリコール、植物油、鉱油、リポソーム、層状脂質材料が挙げられる。
【0094】
有機溶媒の例としては、モノアルコールおよびポリオール、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピルアルコール、ベンジルアルコール、およびフェニルエチルアルコール、またはグリコールもしくはグリコールエーテル、例えば、モノメチル、モノエチルおよびモノブチルエーテル、もしくはエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、ジプロピレングリコール、ならびにジエチレングリコールのアルキルエーテル、例えば、ジエチレングリコールのモノエチルエーテルまたはモノブチルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。有機溶媒の他の好適な例は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、プロパンジオール、およびグリセリンである。有機溶媒は揮発性または不揮発性化合物であり得る。
【0095】
一部の事例では、化粧品的に許容される担体は、水、水と少なくとも１つの化粧品的に許容される有機溶媒との混合物、または少なくとも１つの化粧品的に許容される有機溶媒を含んでもよい。加えて、化粧品的に許容される担体は、エタノール、グリコールエーテル、例えばジプロピレングリコールｎ－ブチルエーテル、イソデカン、鉱油、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロールおよびそれらの混合物であってもよく、またはそれらを含んでもよい。
【0096】
医薬担体または薬物担体は、薬物投与の選択性、有効性、および／または安全性を改善するのに役立つ、薬物送達のプロセスにおいて使用される任意の基質である。薬物担体は、全身循環への薬物の放出を制御するために使用することができる。
【0097】
薬学的に許容される担体の例としては、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、ミクロスフェア、高分子ミセル、ナノファイバー、タンパク質－薬物複合体および／または軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。
【0098】
本明細書に開示される上記のものの非限定的な実施形態：
１．少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物。
２．ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート（ＤＨＨＢ）、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、実施形態１に記載の日焼け止め組成物。
３．ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態が、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め組成物を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾される、実施形態２に記載の日焼け止め組成物。
４．少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め活性成分であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび第一級または第二級アミンが反応して、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有するイミン類似体を形成する、日焼け止め活性成分。
５．ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、実施形態４に記載の日焼け止め活性成分。
６．ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態が、さらに修飾され、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供する、実施形態４または５に記載の日焼け止め活性成分。
７．実施形態１もしくは２に記載の日焼け止め組成物または実施形態４もしくは５に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
８．実施形態３に記載の日焼け止め組成物または実施形態６に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
１．少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め組成物であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンが反応してケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体を形成し、前記イミン類似体が、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、日焼け止め組成物。
２．ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート（ＤＨＨＢ）、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、実施形態１に記載の日焼け止め組成物。
３．ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態が、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め組成物を目的の標的に結合させることができる基質を提供するようにさらに修飾される、実施形態２に記載の日焼け止め組成物。
４．少なくとも１種のケトン含有ＵＶフィルターおよび少なくとも１種の第一級または第二級アミンを含む日焼け止め活性成分であって、ケトン含有ＵＶフィルターおよび第一級または第二級アミンが反応して、ａ）ＵＶ保護を４００ｎｍまたはそれを上回る可視領域に拡張することができる、ｂ）耐水性である、および／またはｃ）皮膚浸透を防止もしくは減少させる、からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有するイミン類似体を形成する、日焼け止め活性成分。
５．ケトン含有ＵＶフィルターが、アボベンゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、スルイソベンゾン、およびオキシベンゾンからなる群から選択される、実施形態４に記載の日焼け止め活性成分。
６．ケトン含有ＵＶフィルターのイミン類似体形態が、さらに修飾され、トランスグルタミナーゼもしくはその任意のバリアントおよび／またはリジルオキシダーゼと反応して、前記日焼け止め活性成分を目的の標的に結合させることができる基質を提供する、実施形態４または５に記載の日焼け止め活性成分。
７．実施形態１もしくは２に記載の日焼け止め組成物または実施形態４もしくは５に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
８．実施形態３に記載の日焼け止め組成物または実施形態６に記載の日焼け止め活性成分と、化粧品的または薬学的に許容される担体とを含む、化粧品調製物または医薬調製物。
【実施例】
【0099】
本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)は、本開示とともに使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【0100】
本開示を、以下の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は特定の実施形態を示しているが、単なる例示として与えられることを理解されたい。
【0101】
上記の考察および実施例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな使用および条件に適合させるためにさまざまな変更および修正を行うことができる。
【0102】
[実施例１]
オキシベンゾン系列のイミンの合成および分析、芳香族性の探索
ａ．イミン－１の合成
オキシベンゾン系列のイミンの合成および分析、芳香族性の探索
ａ．イミン－１の合成
【0103】
【化1】
【0104】
トルエン（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３０１ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１当量）およびベンジルアミン（１６９ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、テトライソプロポキシチタン（７４７ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を８０℃に１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を水（２０ｍＬ）での希釈によってクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。粗生成物を１－［２－（４－メチルフェノキシ）エチル］－２－［（２－フェノキシエチル）スルファニル］－１Ｈ－ベンゾイミダゾール（ＭＥＴＢ）（３ｍＬ）とともに２５℃で１５分間粉砕して濾過した。濾過ケーキを真空下で乾燥させて、イミン－１（１７１ｍｇ、収率４１％）を緑色固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により確認した。
【0105】
ｂ．イミン－２の合成
【0106】
【化2】
【0107】
トルエン（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）およびアニリン（１４７ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、テトライソプロポキシチタン（７４７ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を８０℃にして１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を水（２０ｍＬ）中での希釈によってクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。粗生成物をＭＥＴＢ（３ｍＬ）とともに２５℃で１５分間粉砕して濾過した。濾過ケーキを真空下で乾燥させて、イミン－２（７５ｍｇ、収率１８％）を緑色固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により確認した。
【0108】
ｃ．イミン－３の合成
【0109】
【化3】
【0110】
トルエン（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（１０９ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、テトライソプロポキシチタン（７４７ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を８０℃にして１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を水（２０ｍＬ）中での希釈によってクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０ｕｍ；移動相：［水（ＮＨ３Ｈ２Ｏ＋ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３５％～７５％、１０分間）により精製して、イミン－３（８２ｍｇ、収率２５％）をオフホワイトの固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により確認した。
【0111】
ｄ．ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
イミン－１、イミン－２、およびイミン－３を合成し、精製して単離した（上記を参照）。３種すべての化合物を、５ｍＭ（図１）または０．０５ｍＭ（図１、挿入図）の最終濃度になるまでアセトニトリル中に別々に溶解させ、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性をアセトニトリル中のオキシベンゾンと比較した。結果を図１に示す。
イミン－１、イミン－２、およびイミン－３を合成し、精製して単離した（上記を参照）。３種すべての化合物を、５ｍＭ（図１）または０．０５ｍＭ（図１、挿入図）の最終濃度になるまでアセトニトリル中に別々に溶解させ、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性をアセトニトリル中のオキシベンゾンと比較した。結果を図１に示す。
【0112】
シッフ塩基の形成は、スペクトルのＵＶおよび可視範囲におけるＵＶ吸収特性を変化させる。図１は、アミンとの反応によってイミンを形成させることによって、オキシベンゾンの吸収特性をモジュレートし得ることを示す。ヒドロキシルアミン－シッフ塩基（イミン－３）は、ＵＶＡ遮断の喪失およびＵＶＢ遮断の減少をもたらしたが、イミン－１およびイミン－２は、ＵＶＡ－１、ＵＶＡ－２およびＵＶＢ吸収特性の両方を改善した。
【0113】
[実施例２]
カルバメートの合成（米国特許第５４９０９８０号明細書）
カルバメートの合成（米国特許第５４９０９８０号明細書）
【0114】
【化4】
【0115】
米国特許５４９０９８０号明細書は、オキシベンゾンのフェノール性酸素をアルキル－ジアミンで官能化したトランスグルタミナーゼ適合オキシベンゾン由来カルバメートを提唱した。提唱されたカルバメートのＵＶフィルター特性を評価するために、カルバメート－１を当技術分野で公知の方法を用いて調製した。しかし、フェノール性酸素での官能化は、ＵＶフィルター特性を低下させ、ＵＶＡ遮断が減少した。
【0116】
ジクロロメタン（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（１６１ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、（４－ニトロフェニル）カルボノクロリデート（２６５ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）を２５℃で添加した。反応物を２５℃で２時間撹拌した。Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（２８４ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ－エチルジイソプロピルアミン（１７０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）を添加して、反応物を２５℃で２時間撹拌した。反応混合物を水（１０ｍＬ）中に注ぎ入れ、エチルアセテート（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＭｇ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（ＨＣｌ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５０％～８０％、１０分間）により精製して、カルバメート－１（１６５ｍｇ、収率２６％）を白色固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）により確認した。
ａ．ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
米国特許第５４９０９８０号明細書に最初に記載されたカルバメート－１を合成し、精製して単離した（上記を参照）。カルバメート－１をアセトニトリル中に溶解させて０．０５ｍＭの最終濃度にし、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を、最終濃度０．０５ ｍＭのアセトニトリル中のオキシベンゾンと比較した。図２における結果は、カルバメート－１（フェノール性酸素に官能化を有する）が、ＵＶフィルター特性の低下をもたらし、より具体的には、ＵＶＡ遮断が減少したことを示す。
ａ．ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
米国特許第５４９０９８０号明細書に最初に記載されたカルバメート－１を合成し、精製して単離した（上記を参照）。カルバメート－１をアセトニトリル中に溶解させて０．０５ｍＭの最終濃度にし、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を、最終濃度０．０５ ｍＭのアセトニトリル中のオキシベンゾンと比較した。図２における結果は、カルバメート－１（フェノール性酸素に官能化を有する）が、ＵＶフィルター特性の低下をもたらし、より具体的には、ＵＶＡ遮断が減少したことを示す。
【0117】
[実施例３]
Ｔｇアーゼ基質であるオキシベンゾン系列のイミンの合成および分析
Ｔｇアーゼ基質であるオキシベンゾン系列のイミンの合成および分析
【0118】
ａ．イミン－４の合成
【0119】
【化5】
【0120】
メタノール（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）およびＮα－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－リジン（Ｎα－Ｂｏｃ－リジン－ＯＨ）（３８８ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ナトリウムメトキシド（５Ｍの３９４μＬ、１．５当量）を２５℃で添加した。反応混合物を８０℃に１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈することによってクエンチし、エチルアセテート（３０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を廃棄した。水相を凍結乾燥させて粗生成物を得て、これを逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（ＨＣｌ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～６０％、１０分間）により精製した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－４（３５０ｍｇ、５３７μｍｏｌ、収率４１％）を緑色固体として単離し、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により確認した。
【0121】
Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－４（３５０ｍｇ、７６７μｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ中の溶液（１０ｍＬ）に、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍの１．１５ｍＬ、６当量）を２５℃で添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌して、ＬＣＭＳによってモニターした。反応混合物を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を酢酸エチル（５ｍＬ）とともに２５℃で３０分間粉砕して濾過した。濾過ケーキを真空下で乾燥させてイミン－４（１３９ｍｇ、収率４６％）を黄色固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）により確認した。
【0122】
ｂ．イミン－５の合成
【0123】
【化6】
【0124】
メタノール（５ｍＬ）中のオキシベンゾン（５００ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、１当量）およびグルタミン（３８４ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ナトリウムメトキシド（５Ｍの８７６μＬ、２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を６５℃にして１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターしたところ、約４３％の所望の生成物が形成されたことが明らかになった。懸濁液を濾過し、濾過ケーキをメタノール（５ｍＬ×３）で洗浄した。合わせた濾液を濃縮した。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって、さらにＳＦＣ（カラム：ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（２５０ｍｍ＊３０ｍｍ、１０μｍ）によって精製して、イミン－５（１９ｍｇ、収率２％）を灰色固体として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）により確認した。
【0125】
ｃ．イミン－６の合成
【0126】
【化7】
【0127】
トルエン（３ｍＬ）中のオキシベンゾン（３４１ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＮ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（３００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、テトライソプロポキシチタン（７４７．１４ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、７７５．８４μＬ、２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を８０℃にして１２時間加熱し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を水（２０ｍＬ）での希釈によってクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＭｇ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、酢酸エチル：石油エーテル＝０～３０％）によって精製して、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６（４５０ｍｇ、収率８０％）を黄色の油状物として得て、ＬＣＭＳにより確認した。
【0128】
【化8】
【0129】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－イミン－６（４５０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、１．３２ｍＬ、５当量）を添加した。反応物を２５℃で２時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を真空下で濃縮して、標的６（９５ｍｇ、収率２７％）を緑色油状物として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）により確認した。
【0130】
ｄ．ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
イミン－４、イミン－５、およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－６を合成し、精製して単離した（上記を参照）。３種すべての化合物を、５ｍＭの最終濃度になるまでアセトニトリル中に別々に溶解させ（図３）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６は、０．０５ｍＭの最終濃度になるまでアセトニトリル中で希釈し（図３、挿入図）、ＵＶ／Ｖｉｓによって分析した。イミン－６はアセトニトリル中での溶解性が乏しいため、このデータについてはイミン－６の代わりにＮ－Ｂｏｃ－イミン－６を利用した。スペクトル特性を、アセトニトリル中の同じ濃度のオキシベンゾンと比較した。図３は、オキシベンゾンに由来する３種のイミンの吸収スペクトルを描写しており、３種のイミンがＵＶＡ－１、ＵＶＡ－２およびＵＶＢ領域ならびにスペクトルの可視領域（４００ｎｍを上回る）を範囲に含むことを示している。
イミン－４、イミン－５、およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－６を合成し、精製して単離した（上記を参照）。３種すべての化合物を、５ｍＭの最終濃度になるまでアセトニトリル中に別々に溶解させ（図３）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６は、０．０５ｍＭの最終濃度になるまでアセトニトリル中で希釈し（図３、挿入図）、ＵＶ／Ｖｉｓによって分析した。イミン－６はアセトニトリル中での溶解性が乏しいため、このデータについてはイミン－６の代わりにＮ－Ｂｏｃ－イミン－６を利用した。スペクトル特性を、アセトニトリル中の同じ濃度のオキシベンゾンと比較した。図３は、オキシベンゾンに由来する３種のイミンの吸収スペクトルを描写しており、３種のイミンがＵＶＡ－１、ＵＶＡ－２およびＵＶＢ領域ならびにスペクトルの可視領域（４００ｎｍを上回る）を範囲に含むことを示している。
【0131】
プロトン性溶媒中でのＢｏｃ保護イミンの溶液安定性を把握するために、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６をエタノール中にて触媒の氷酢酸の存在下で調製した。手短に述べると、エタノール（０．３ｍＬ）中のオキシベンゾン（０．１０ｇ、０．４３８ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（０．０９４ｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、触媒の氷酢酸（１μＬ）を添加した。反応混合物を９００ｒｐｍ、７０℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。単一の生成物ピークへの出発材料の完全な反応がＬＣＭＳによって観察され、完了が示された。続いて、反応物を０．０４ｍＭの最終濃度までエタノール中で希釈し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって分析した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－６は、出発ケトンおよびアミンに戻ることなく、エタノール中にて高温（７０℃）で２４時間にわたって安定であった（図４）。さらに、Ｂｏｃ保護基は、反応およびＵＶ／Ｖｉｓ分析を通して無傷のままであった。図４における結果は、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン６の吸収が、ＵＶＡおよびＵＶＢ領域ならびにスペクトルの可視領域（４００ｎｍを上回る）を範囲に含むことを示す。
【0132】
[実施例４]
アボベンゾンイミン、イミン－７の合成および分析
アボベンゾンイミン、イミン－７の合成および分析
【0133】
【化9】
【0134】
トルエン（８０ｍＬ）中のアボベンゾン（２ｇ、６．４４ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（１．３９ｇ、６．４４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、４Ａ分子篩（２ｇ、９．９０ｍｍｏｌ、１．５４当量）、続いてＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（Ｒ）１５水素形態（２ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）をＮ２下にて２５℃で添加した。添加後に、反応混合物を１１０℃で７２時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。この懸濁液を濾過し、濾過ケーキをＤＣＭ（２０ｍＬ×３）で洗浄した。合わせた濾液を濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、酢酸エチル：石油エーテル＝０～２５％）によって精製した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－７（１．０９ｇ、１．９９ｍｍｏｌ、収率約３０％）を黄色油状物として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により確認した。
【0135】
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－イミン－７（３００ｍｇ、５９０μｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｎ２下にて２５℃でＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、７３７μＬ、５当量）を添加した。添加後に、反応混合物を２５℃で４時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。混合物を濃縮して乾燥させ、イミン－７（１５０ｍｇ、３３２μｍｏｌ、収率約５０％）を黄色油状物として得て、ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）により確認した。
【0136】
ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７を合成し、精製して、分取ＨＰＬＣを使用して単離した（上記を参照）。イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７をアセトニトリル中に溶解させ、５ｍＭ（図５）および０．０５ｍＭ（図５、挿入図）の推定濃度にした。両方の溶液をＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７の濃度（０．０５ｍＭ）は推定値であり、吸光度シグナルは予想されるよりも低い。化合物の純度の低さは、ＨＰＬＣ精製による付加塩および残留ｔ－ブタノールの存在（ＮＭＲによって確認される）に起因する可能性が高い。吸光係数が官能化されていないアボベンゾンと等しいかまたはそれを上回る可能性が高いことから、スペクトル特性は定性的目的でのみアセトニトリル中のアボベンゾンと比較した。結果を図５に示す。
イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７を合成し、精製して、分取ＨＰＬＣを使用して単離した（上記を参照）。イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７をアセトニトリル中に溶解させ、５ｍＭ（図５）および０．０５ｍＭ（図５、挿入図）の推定濃度にした。両方の溶液をＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。イミン－７およびＮ－Ｂｏｃ－イミン－７の濃度（０．０５ｍＭ）は推定値であり、吸光度シグナルは予想されるよりも低い。化合物の純度の低さは、ＨＰＬＣ精製による付加塩および残留ｔ－ブタノールの存在（ＮＭＲによって確認される）に起因する可能性が高い。吸光係数が官能化されていないアボベンゾンと等しいかまたはそれを上回る可能性が高いことから、スペクトル特性は定性的目的でのみアセトニトリル中のアボベンゾンと比較した。結果を図５に示す。
【0137】
[実施例５]
Ｔｇアーゼ基質であるスルイソベンゾン由来イミンの合成および分析
Ｔｇアーゼ基質であるスルイソベンゾン由来イミンの合成および分析
【0138】
【化10】
【0139】
エタノール（０．３ｍＬ）中のスルイソベンゾン（０．１０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（０．０７０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、触媒の氷酢酸（１μＬ）を添加した。添加後に、反応混合物を７０℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８を濃縮し、さらに精製することなく使用した。ＬＣＭＳは、５０６、４０７、および４３２のｍ／ｚを有する単一ピークを示した。
【0140】
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－イミン－８（０．３２μｍｏｌ、１当量）を、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、７３７μＬ、５当量）により２５℃で４時間処理する。混合物を濃縮して、イミン－８を得る。
【0141】
あるいは、還流エタノール中でのスルイソベンゾン（１当量）と１－６－ヘキサメチレンジアミン（１当量）との反応によって、イミン－８を直接調製した。
【0142】
ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８を合成し、精製して単離した（上記を参照）。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８をエタノール中に溶解させて、それぞれ０．０３２ｍＭおよび８ｍＭの最終濃度にして（図６）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を同程度の濃度のエタノール中のスルイソベンゾンと比較した。図６における結果は、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８がＵＶＢ領域で吸光度を保ち、ＵＶＡ領域まで吸光度を拡張したことを示している。
Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８を合成し、精製して単離した（上記を参照）。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８をエタノール中に溶解させて、それぞれ０．０３２ｍＭおよび８ｍＭの最終濃度にして（図６）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を同程度の濃度のエタノール中のスルイソベンゾンと比較した。図６における結果は、Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－８およびイミン－８がＵＶＢ領域で吸光度を保ち、ＵＶＡ領域まで吸光度を拡張したことを示している。
【0143】
[実施例６]
Ｔｇアーゼ基質であるジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート由来イミンの合成および分析
Ｔｇアーゼ基質であるジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート由来イミンの合成および分析
【0144】
【化11】
【0145】
トルエン（０．３ｍＬ）中のジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート（ＤＨＨＢ）（０．１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミン（０．０７０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、触媒の氷酢酸（１μＬ）を添加した。添加後に、反応混合物を９５℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳによってモニターした。反応物を濃縮し、さらに精製することなく使用して、深橙色の油状物を得た。ＬＣＭＳは、５９５および４９５のｍ／ｚを有する単一ピークを示した。
【0146】
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－イミン－９（０．３２μｍｏｌ、１当量）を、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、７３７μＬ、５当量）により２５℃で４時間処理する。混合物を濃縮して、イミン－９を得る。あるいは、還流エタノール中でのＤＨＨＢ（１当量）と１－６－ヘキサメチレンジアミン（１当量）との反応によって、イミン－９を直接調製した。Ｎ－Ｂｏｃ－イミン－９およびイミン－９は両方とも、吸光度スペクトルの赤方偏移をもたらし、これは可視領域にまで拡張される（データは示さず）。
【0147】
[実施例７]
高分子量重合体上でのオキシベンゾンイミンの合成および分析
高分子量重合体上でのオキシベンゾンイミンの合成および分析
【0148】
【化12】
【0149】
オキシベンゾン（１００．０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１当量）に、アモジメチコン（９１０．０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１．２当量）を２５℃で添加した。反応混合物を、連続的に混合しながら９５℃にして１６時間加熱した。加熱するとオキシベンゾンは溶融し、バイアルの底に不混和相を形成した。反応が進行するにつれて、オキシベンゾン相は収縮し、アモジメチコン相は透明な黄色になった。バイアル中で単一の透明な黄色の相になるまで反応を継続させることによって、イミン－１０を得た。この実施例に記載される高分子量イミン重合体は、ＵＶＡ範囲ならびに可視範囲において吸光度が増加しており（図７）、その高分子量のために皮膚浸透を回避する。イミン－１０は、シリコーン骨格の疎水性のために耐水性を有すると考えられる。
【0150】
ＵＶＡおよびＵＶＢ吸収特性
イミン－１０をまずメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル中に溶解させ、続いてエタノール中で５ｍＭおよび０．０４ｍＭの最終濃度に希釈し（図７）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を、同程度の濃度のオキシベンゾンと比較した。図７における結果は、イミン－１０がＵＶＢ領域において吸光度を保ち、ＵＶＡおよび可視領域に吸光度が拡張されたことを示す。
イミン－１０をまずメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル中に溶解させ、続いてエタノール中で５ｍＭおよび０．０４ｍＭの最終濃度に希釈し（図７）、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｃａｒｙ－５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）によって分析した。スペクトル特性を、同程度の濃度のオキシベンゾンと比較した。図７における結果は、イミン－１０がＵＶＢ領域において吸光度を保ち、ＵＶＡおよび可視領域に吸光度が拡張されたことを示す。
【0151】
[実施例８]
ペプチドへの日焼け止め剤リンカーの共有結合付加
ペプチドへの日焼け止め剤リンカーの共有結合付加
【0152】
【化13】
【0153】
Ｃｂｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙジペプチド（９０％アセトニトリル水溶液に溶解させた１０ｇ／Ｌストック溶液の１００μＬ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中にて野生型トランスグルタミナーゼまたはバリアント（配列番号２および７）の溶液に添加した（８００μｇ／Ｌ、最終濃度０．０３ｇ／Ｌ）。この溶液に、好適な溶媒中に溶解させた実施例３～６に記載のイミン生成物（表２で特定される溶媒に溶解させた１０ｇ／Ｌストック溶液の１００μＬ）を添加した。この懸濁液を、一定に撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。トランスグルタミナーゼ（野生型またはバリアント）によって触媒されたイミンへのジペプチドの共有結合付加を、ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳによって確認した。出発物質の生成物への変換を、ピーク面積を使用して計算した。相対的な反応性は、すべての変換を最も反応性の低いイミンについて得られたデータで除算することによって計算される。トランスグルタミナーゼの非存在下では、ペプチドへのイミンの共有結合付加は観察されなかった。イミンの反応性は、水性反応物への添加時のイミンの溶解度に依存した。より水溶性の高いイミンは、イミン－ペプチド生成物へのより高い変換をもたらす。
【0154】
【表2】
【0155】
[実施例９]
日焼け止め組成物製剤
本明細書に記載されるＵＶフィルターのうちのいずれかを含む日焼け止め組成物は、表３に記載されるように製剤化することができる。以下に記載される製剤は、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョンの両方に好適である。
日焼け止め組成物製剤
本明細書に記載されるＵＶフィルターのうちのいずれかを含む日焼け止め組成物は、表３に記載されるように製剤化することができる。以下に記載される製剤は、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョンの両方に好適である。
【0156】
【表3】
【0157】
[実施例１０]
日焼け止め剤の耐水性の決定
インビトロ試験方法（Markovic et al, Alured's Cosmetics and Toiletries, 116(9):61-28 (2001)の方法に基づく）
日焼け止め剤の適用前に、Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）Ｎ－１９（ＩＭＳ， Ｉｎｃ．）の大きなストリップ（２０×１０ｃｍ）を、製造元の推奨に従って水和させる（室温で９０～９５％の相対湿度で１６～１８時間）。Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）は、組成、湿潤性、ｐＨ、イオン強度、およびヒト皮膚の表面トポグラフィーの特性を模倣する。本明細書に記載されるイミンまたはエナミンを含有する製剤の測定量（６～７ｍｇ）を、３５ｍｍスライドマウントに取り付けられたＶｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）（２８×３８ｍｍ）のあらかじめ水和された小片上に適用する。エマルジョンを、ゴム手袋をはめた指を使用して、最初の円運動により、続いて直線運動させて約１分間は、慎重に広げる。続いて、試料を加湿チャンバー（室温で９０～９５％の相対湿度）に２０分間入れて、エマルジョンを凝集させる。分光光度計を使用して、２５０～３５０ｎｍの波長範囲で、１試料当たり４つのＵＶスペクトルを収集する。試料を９０°回転させた後に各スペクトルを収集し、各試料について４つの別個の領域スキャンを得る。試料を、２ビーム分光光度計の参照ビーム中で、未処理の参照試料に対してスキャンする。３１０および２９１ｎｍで吸収の読み取りを行い、初期吸光度Ａｉとして名付ける。続いて、試料を温度制御された水浴中（２５±０．２℃）に８０分間浸漬し、パドル型インペラを使用して５０ｒｐｍで一定に混合する。水浴の容量は、分散された日焼け止め剤の高濃縮および再吸着の可能性を防ぐのに十分な大きさ（２０００ｍｌ）である。浸漬後に試料を水から取り出し、軽く振って大きな水滴を除去し、相対湿度を５０％に調節した室内の空気中に３０分間吊るす。その後、試料を湿度室に戻して１２０分間置く。最終的な吸光度の読み取り値Ａｆを、最初のものと同じ方法で得る。耐水性の百分率は、（Ａｆ／Ａｌ）×１００として計算される。試料の評価を４通りずつ行い、試験される各製剤について３２回の読み取り値（４試料×４方向×２波長）を得る。試料が水和されたままであることが重要であり、試料があまりに多くの水分を失うと、Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）は不透明になり、分光光度分析に適さなくなる。各ブランク対照試料（日焼け止め剤を含まない）を正確に同じ方法で処理して、測定する。対照試料は、製剤で処理した試料から日焼け止め剤が移行しないように、別の水浴中に浸漬する。
日焼け止め剤の耐水性の決定
インビトロ試験方法（Markovic et al, Alured's Cosmetics and Toiletries, 116(9):61-28 (2001)の方法に基づく）
日焼け止め剤の適用前に、Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）Ｎ－１９（ＩＭＳ， Ｉｎｃ．）の大きなストリップ（２０×１０ｃｍ）を、製造元の推奨に従って水和させる（室温で９０～９５％の相対湿度で１６～１８時間）。Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）は、組成、湿潤性、ｐＨ、イオン強度、およびヒト皮膚の表面トポグラフィーの特性を模倣する。本明細書に記載されるイミンまたはエナミンを含有する製剤の測定量（６～７ｍｇ）を、３５ｍｍスライドマウントに取り付けられたＶｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）（２８×３８ｍｍ）のあらかじめ水和された小片上に適用する。エマルジョンを、ゴム手袋をはめた指を使用して、最初の円運動により、続いて直線運動させて約１分間は、慎重に広げる。続いて、試料を加湿チャンバー（室温で９０～９５％の相対湿度）に２０分間入れて、エマルジョンを凝集させる。分光光度計を使用して、２５０～３５０ｎｍの波長範囲で、１試料当たり４つのＵＶスペクトルを収集する。試料を９０°回転させた後に各スペクトルを収集し、各試料について４つの別個の領域スキャンを得る。試料を、２ビーム分光光度計の参照ビーム中で、未処理の参照試料に対してスキャンする。３１０および２９１ｎｍで吸収の読み取りを行い、初期吸光度Ａｉとして名付ける。続いて、試料を温度制御された水浴中（２５±０．２℃）に８０分間浸漬し、パドル型インペラを使用して５０ｒｐｍで一定に混合する。水浴の容量は、分散された日焼け止め剤の高濃縮および再吸着の可能性を防ぐのに十分な大きさ（２０００ｍｌ）である。浸漬後に試料を水から取り出し、軽く振って大きな水滴を除去し、相対湿度を５０％に調節した室内の空気中に３０分間吊るす。その後、試料を湿度室に戻して１２０分間置く。最終的な吸光度の読み取り値Ａｆを、最初のものと同じ方法で得る。耐水性の百分率は、（Ａｆ／Ａｌ）×１００として計算される。試料の評価を４通りずつ行い、試験される各製剤について３２回の読み取り値（４試料×４方向×２波長）を得る。試料が水和されたままであることが重要であり、試料があまりに多くの水分を失うと、Ｖｉｔｒｏ－Ｓｋｉｎ（登録商標）は不透明になり、分光光度分析に適さなくなる。各ブランク対照試料（日焼け止め剤を含まない）を正確に同じ方法で処理して、測定する。対照試料は、製剤で処理した試料から日焼け止め剤が移行しないように、別の水浴中に浸漬する。
【0158】
[実施例１１]
Ｔｇアーゼベクターの構築および突然変異誘発
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）ベクター
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼをコードする遺伝子を、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、公開されているアミノ酸配列（Kanaji, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(16):11565-11572）に基づいて大腸菌（E. coli）における発現のためにコドン最適化し、合成して、ｐＵＣ １９由来発現ベクター上にクローニングした。
Ｔｇアーゼベクターの構築および突然変異誘発
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）ベクター
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼをコードする遺伝子を、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、公開されているアミノ酸配列（Kanaji, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(16):11565-11572）に基づいて大腸菌（E. coli）における発現のためにコドン最適化し、合成して、ｐＵＣ １９由来発現ベクター上にクローニングした。
【0159】
大腸菌（E. coli）ベクター
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼをコードする遺伝子を、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、公表されているアミノ酸配列（Kanaji, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(16):11565-11572）に基づいて、大腸菌（E. coli）における発現のためにコドン最適化し、合成した。ＤＮＡを、大腸菌（E. coli）における発現のためにＴ７プロモーターの制御下にあるｐＥＴ９ａベクター上にクローニングした。
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼをコードする遺伝子を、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、公表されているアミノ酸配列（Kanaji, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(16):11565-11572）に基づいて、大腸菌（E. coli）における発現のためにコドン最適化し、合成した。ＤＮＡを、大腸菌（E. coli）における発現のためにＴ７プロモーターの制御下にあるｐＥＴ９ａベクター上にクローニングした。
【0160】
Ｔｇアーゼバリアントの作製
当技術分野で公知の部位特異的変異誘発法を使用して、成熟Ｔｇアーゼ遺伝子に突然変異を導入した。
当技術分野で公知の部位特異的変異誘発法を使用して、成熟Ｔｇアーゼ遺伝子に突然変異を導入した。
【0161】
[実施例１２]
無細胞タンパク質合成を使用したＴｇアーゼバリアントの発現
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼバリアントを、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、製造元の指示に従って、市販の無細胞タンパク質合成キットにおいて同時に発現させた。
無細胞タンパク質合成を使用したＴｇアーゼバリアントの発現
プロ配列および成熟Ｔｇアーゼバリアントを、ＰＣＴ／ＵＳ２０／４９２２６に記載されているように、製造元の指示に従って、市販の無細胞タンパク質合成キットにおいて同時に発現させた。
【0162】
[実施例１３]
大腸菌におけるＴｇアーゼバリアントの発現および精製
Ｔｇアーゼ発現プラスミドを保有する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を振盪フラスコ内で増殖させ、ホモジナイゼーションによって溶解させ、遠心分離によってＴｇアーゼを細胞デブリから単離した。得られた半精製酵素（清澄化溶解物）を、透析前にＮｉ－ＩＭＡＣ樹脂上のアフィニティーカラムによってさらに精製した。精製Ｔｇアーゼを－８０℃で保存した。
大腸菌におけるＴｇアーゼバリアントの発現および精製
Ｔｇアーゼ発現プラスミドを保有する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を振盪フラスコ内で増殖させ、ホモジナイゼーションによって溶解させ、遠心分離によってＴｇアーゼを細胞デブリから単離した。得られた半精製酵素（清澄化溶解物）を、透析前にＮｉ－ＩＭＡＣ樹脂上のアフィニティーカラムによってさらに精製した。精製Ｔｇアーゼを－８０℃で保存した。
【0163】
[実施例１４]
Ｔｇアーゼ比活性の測定
本明細書の実施例では、比色ヒドロキサメート活性アッセイ（Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960）を使用して、Ｔｇアーゼ比活性を測定した。手短に述べると、ヒドロキサム酸アッセイは、Ｎ－カルボベンゾキシ－Ｌ－グルタミルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－ＧｌｙまたはＣＢＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）をアミンアクセプター基質として、ヒドロキシルアミンをアミンドナーとして使用する。トランスグルタミナーゼの存在下では、ヒドロキシルアミンが取り込まれてＺ－グルタミルヒドロキサマート－グリシンが形成され、これを３７℃で５～６０分間インキュベートした後に、５２５ｎｍで検出可能な鉄（ＩＩＩ）との有色錯体が生じる。Ｌ－グルタミン酸γ－モノヒドロキサメート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を標準物質として使用して較正を行った。Ｔｇアーゼの１単位は、１分当たり１μｍｏｌのγ－グルタミルヒドロキシルアミンのペプチド誘導体の形成を触媒する酵素の量として定義される。
Ｔｇアーゼ比活性の測定
本明細書の実施例では、比色ヒドロキサメート活性アッセイ（Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960）を使用して、Ｔｇアーゼ比活性を測定した。手短に述べると、ヒドロキサム酸アッセイは、Ｎ－カルボベンゾキシ－Ｌ－グルタミルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－ＧｌｙまたはＣＢＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）をアミンアクセプター基質として、ヒドロキシルアミンをアミンドナーとして使用する。トランスグルタミナーゼの存在下では、ヒドロキシルアミンが取り込まれてＺ－グルタミルヒドロキサマート－グリシンが形成され、これを３７℃で５～６０分間インキュベートした後に、５２５ｎｍで検出可能な鉄（ＩＩＩ）との有色錯体が生じる。Ｌ－グルタミン酸γ－モノヒドロキサメート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を標準物質として使用して較正を行った。Ｔｇアーゼの１単位は、１分当たり１μｍｏｌのγ－グルタミルヒドロキシルアミンのペプチド誘導体の形成を触媒する酵素の量として定義される。
【0164】
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によりそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0165】
【化14】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】