特表 2024-543390 冷却工程を利用したオイル回収率が向上したバイオオイル抽出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-21

(54)【発明の名称】冷却工程を利用したオイル回収率が向上したバイオオイル抽出方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/64 20220101AFI20241114BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20241114BHJP

   C11B 1/10 20060101ALI20241114BHJP

【ＦＩ】

C12P7/64

C12N1/12 C

C11B1/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527435

(86)(22)【出願日】2022-12-14

(85)【翻訳文提出日】2024-05-09

(86)【国際出願番号】 KR2022020311

(87)【国際公開番号】W WO2023146127

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】10-2022-0012556

(32)【優先日】2022-01-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507406611

【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，ア・ヨン

(72)【発明者】

【氏名】アン，ジュンガプ

(72)【発明者】

【氏名】イ，イン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD85

4B064CA08

4B064CC01

4B064CE02

4B064DA10

4B064DA20

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065BD01

4B065BD03

4B065BD04

4B065BD08

4B065BD09

4B065BD15

4B065BD16

4B065CA41

4B065CA43

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、冷却工程を利用してオイル回収率が向上したバイオオイル抽出方法に関し、本発明の微細藻類を含む培養液の細胞を破砕した懸濁液を冷却する工程を追加したバイオオイル抽出方法は、高いオイル回収率を示し、オイル回収率を上昇させるために他の添加物を投入しないため、オイルを回収し、残った副産物を飼料化することができ、持続可能な生産が可能であり、回収したオイルは飼料用組成物または食品用組成物などで有用に活用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）微細藻類培養液から細胞破砕液を得るステップ；
２）前記細胞破砕液を遠心分離して上澄液を回収するステップ；
３）前記上澄液を冷却するステップ；
４）前記冷却した上澄液を加熱するステップ；および
５）前記加熱した上澄液を遠心分離してオイルを回収するステップ；を含む微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項2】

前記１）ステップの微細藻類は、シゾキトリウム属菌株である、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項3】

前記１）ステップの細胞破砕液は、酵素処理または物理的処理で破砕したものである、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項4】

前記物理的な処理は、微細藻類培養液をビードミル、フレンチプレッシャー、ホモジナイザー、またはマイクロフルイダイザーを利用して物理的に破砕させる、請求項３に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項5】

前記２）ステップの遠心分離は、３０００ｇ～４６００ｇで行われる、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項6】

前記３）の冷却するステップは、３５℃以下の温度で行われる、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項7】

前記３）の冷却するステップは、３０分～４時間行われる、請求項６に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項8】

前記４）の加熱するステップは、５５℃以上の温度で行われる、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項9】

前記４）の加熱するステップは、３０分～４時間行われる、請求項８に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項10】

前記方法は、抽出されたオイルのオイル回収率を向上させる、請求項１に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【請求項11】

前記オイル回収率は、７５％以上である、請求項１０に記載の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互引用
本出願は、２０２２年０１月２７日付韓国特許出願第１０－２０２２－００１２５５６号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本発明は、冷却工程を利用したバイオオイルを抽出する方法に関し、当該方法を通じて、微細藻類から高いオイル回収率でバイオオイルを抽出することができる。

【背景技術】

【0003】

高血圧、狭心症、心筋梗塞などの心臓血管疾患を予防する多くの利点を有するオメガ－３系の高度不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）は、一般に人体内では合成されず、人間が摂取しなければならないため、必須脂肪酸と見なされている。このようなＤＨＡは、主に魚類の油に多量含有されている。一般にサケ、イワシ、マグロなどに多く含まれているため、魚類の肝臓から多く抽出しており、タラの肝臓から抽出した原料が全世界的に最も多く使用されてきている。しかし、このような漁油からのＤＨＡオイルの生産は多くの問題点を招いている。魚類の乱獲による海洋生態系の破壊と海洋環境汚染物質である水銀、重金属、ダイオキシンなど有機汚染物質が漁油に多量含まれており、人体が有害な物質に晒され得る危険性が持続的に提起されてきた。

【0004】

微細藻類から抽出したオメガ－３であるＤＨＡは、魚油由来のオメガ－３ＤＨＡの問題点を解決している。海洋微細藻類の一種であるスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微生物は多価不飽和脂肪酸を生産することができる。微細藻類によるオメガ－３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造方法は、Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ（Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ Ｂ． Ｂ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２９：８０５－８１１ （１９６９））により知られている。このような微細藻類によるＤＨＡオイルの生産は、１００％清浄条件で純粋な微細藻類だけを培養する方式を選ぶことで、海洋生態系を破壊する危険性が全くない。また、培養方式による大量生産が可能であり、安定した品質で供給が可能である。さらに、漁油より不飽和脂肪酸の含有量が高く、重金属など不純物の抽出の危険性が低いことから注目されており、その市場も増加する傾向にある。

【0005】

微細藻類から多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含むオイルを製造する一般的な方法は、目的物質を含む微細藻類を反応器において発酵して培養して回収および乾燥し、溶媒を利用した抽出過程を経る。しかし、有機溶媒を利用した抽出は防爆設備が必要となり、溶媒回収工程により抽出の製造費用上昇の原因となる。また、オイル内の残留溶媒の危険性がある。このような問題点を解決するために、有機溶媒を使用せずに細胞からオイルを抽出する方法に対する要求が存在する。無溶媒抽出の場合、ヘキサンのような有機溶媒を不使用または最小化してオイルを得る方法で、酵素分解反応、熱処理などのような方法が無溶媒抽出の一つの方法として挙げられる。無溶媒抽出の場合、通常オイルと他の極性の物質との比重差を利用して遠心分離や自然浸漬のような方法でオイルを得ることができ、人体に有害な有機溶媒の使用を排除することによって得られる長所がある。しかし、微細藻類からオイルを分離することに妨害する微生物の外壁に由来するリン脂質が乳化剤の役割を果たして、オイル回収率を減少させるという問題点がある。

【0006】

このような問題点を解決する方法として、ｐＨ調整のための酸および塩基類の化学物質の添加または塩化ナトリウムのような多量の塩の物質を投入する方法がある（ＵＳ１６／４７３８０５）。しかし、このような方法は、オイルを抽出して残った副生産物を飼料化することができず、装備の急速な腐食化を招く。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国公開特許ＵＳ２０１９／０３２３０４３Ａ

【特許文献2】米国特許出願ＵＳ１６／４７３８０５

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ Ｂ． Ｂ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２９：８０５－８１１ （１９６９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本出願の一実施形態は
１）微細藻類培養液から細胞破砕液を得るステップ；
２）細胞破砕液を遠心分離して上澄液を回収するステップ；
３）上澄液を冷却するステップ；
４）冷却した上澄液を加熱するステップ；および
５）加熱した上澄液を遠心分離してオイルを回収するステップ；を含む微細藻類培養液からオイルを抽出する方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本出願で開示されるそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用され得る。つまり、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲内にある。また、下記記述された具体的な叙述により本出願の範囲が制限されるものではない。また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験だけを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれると意図される。

【0011】

本出願の一実施形態は、
１）微細藻類培養液から細胞破砕液を得るステップ；
２）細胞破砕液を遠心分離して上澄液を回収するステップ；
３）上澄液を冷却するステップ；
４）冷却した上澄液を加熱するステップ；および
５）加熱した上澄液を遠心分離してオイルを回収するステップ；を含む微細藻類培養液からオイルを抽出する方法を提供する。

【0012】

本明細書で使用される用語「微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」は、肉眼で見ることができず、顕微鏡でしか見ることができない程度の小さな藻類を意味し、微細藻類には多様な種類が含まれ、光合成が不可能で従属栄養だけで生長する菌株まで含まれる。このような微細藻類は、二酸化炭素を固定化させることができ、蛋白質および脂質含有量が高いため、食品、飼料または燃料生産用バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）として活用され得る。具体的に、微細藻類に含有された脂質成分は、液体燃料で使用されるバイオディーゼルオイル生産の原料として使用することができる。

【0013】

本明細書で、微細藻類は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ヤポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、またはハリフトロス（Ｈａｌｉｐｈｔｈｏｒｏｓ）属菌株であり、より好ましくはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属菌株であり、最も好ましくはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属菌株であり得る。

【0014】

本明細書で使用された用語「培養液」は、微細藻類を培養して生成された産物を含むもので、用語「発酵液」と同様の意味で使用され得、具体的に微細藻類を含む培養液、または培養液から微細藻類が除去された培養濾液であり得るが、これに制限されるのではない。

【0015】

微細藻類培養液は、微細藻類培養培地に微細藻類を接種し、当該技術分野に公知の培養方法により製造され得る。

【0016】

本明細書で使用された用語「破砕液」は、破砕された細胞の内容物を含有する溶液を称すもので、微細藻類培養液に酵素を処理して破砕するか、または物理的な方法で破砕して得ることができる。

【0017】

本明細書で使用される用語「上澄液」は、遠心分離した液体で上部に位置した液体を意味することができ、「上層液」と同様の意味で使用され得る。また、本明細書において、微細藻類を培養液に酵素を処理するか、または物理的方法で破砕した細胞破砕液を遠心分離したステップでの「上澄液」は、「乳化層」または「乳化液」または「破砕された懸濁液」と同様の意味で使用され得る。また、上澄液の回収後、冷却および／または熱処理を行った後に遠心分離したステップでの上澄液は、「オイル」が含まれたものであり得る。

【0018】

本発明のステップ１）において、細胞破砕液は、微細藻類培養液に酵素を処理して破砕したものであり得る。

【0019】

微細藻類培養液の破砕に使用される酵素は、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、β－グルカナーゼ（ｂｅｔａ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）、マンナナーゼ（ｍａｎｎａｎａｓｅ）、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、またはこれらの組み合わせであり得、好ましくはアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）であり得るが、これに制限されるのではない。

【0020】

本発明でステップ１）において、細胞破砕液は、物理的方法で破砕したものであり得る。

【0021】

「物理的方法」は、微細藻類の細胞壁を破壊することができる装備（つまり、破砕機）を利用して微細藻類を破砕させる方法を意味し、ビードミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌ）、フレンチプレッシャー（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ホモジナイザー（Ｂｒａｕｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）またはマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を利用することができ、好ましくはビードミルまたはホモジナイザーを利用することができ、より好ましくはビードミルを利用することができる。

【0022】

本発明において、２）のの遠心分離ステップは、３０００ｇ～４６００ｇ、３２００ｇ～４４００ｇ、３４００ｇ～４２００ｇ、または３６００ｇ～４０００ｇで、１分～１０分、３分～８分、または４分～６分間行うことができる。

【0023】

本発明の実施例において、冷却処理前の遠心分離過程の有無によるオイル回収率を比較した結果、微細藻類培養液に遠心分離過程なしに冷却処理と熱処理の温度調節工程を経た場合のオイル回収率は低く、微細藻類培養液を遠心分離して回収した上澄液を冷却処理と熱処理過程を経た場合、オイル回収率が大幅に上昇することを確認した。

【0024】

本発明において、３）の冷却するステップは、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、５℃～４５℃、５℃～４０℃、または５℃～３５℃の温度で行うことができる。

【0025】

３）の冷却するステップは、３０分以上行うことができ、４０分以上行うことができ、５０分以上行うことができ、３０分～４時間行うことができるが、これに限定されない。

【0026】

３）の冷却するステップを行う時間は、１）の細胞破砕液を得るステップにより変わり得る。具体的に、１）ステップの細胞破砕液を酵素を処理して得た場合、３）の冷却するステップは、１時間～５時間行うことができ、１時間３０分～４時間３０分間行うことができ、２時間～４時間行うことができ、２時間３０分～３時間３０分間行うことができるが、これに限定されない。１）ステップの細胞破砕液を物理的な方法を利用して得た場合、３）の冷却するステップは、３０分～３時間３０分間行うことができ、３０分～３時間行うことができ、３０分～２時間３０分間行うことができ、３０分～２時間行うことができ、３０分～１時間３０分間行うことができるが、これに限定されない。

【0027】

本発明において、４）の加熱するステップは、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、５０℃～７５℃、５０℃～７０℃、５０℃～６５℃、５５℃～７５℃、５５℃～７０℃、または５５℃～６５℃の温度で行うことができる。

【0028】

４）の加熱するステップは、３０分以上行うことができ、４０分以上行うことができ、５０分以上行うことができ、３０分～４時間行うことができるが、これに限定されない。

【0029】

本発明の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法は、オイル回収率を向上させることができる。

【0030】

本明細書において「オイル（ｏｉｌ）」は、「バイオオイル（ｂｉｏ－ｏｉｌ）」と同様の意味で使用され、微細藻類に含まれている全ての種類のオイルを意味し、例えば、多価不飽和脂肪酸（例えば、オメガ－３不飽和脂肪酸およびオメガ－６不飽和脂肪酸）、ラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（Ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（Ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）およびアラキン酸（Ａｒａｃｈｉｄｉｃ ａｃｉｄ）のような飽和脂肪酸、リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）およびステロイド（Ｓｔｅｒｏｉｄ）系の化合物を含む。

【0031】

本明細書において、用語「オイル回収率」は、細胞内のオイル含有量、つまり、粗脂肪含有量のうち、実験を通じてオイルを抽出した時に抽出可能なオイルの量を意味する。

【0032】

本発明の微細藻類培養液からオイルを抽出する方法によりオイルを抽出する場合、微細藻類内の粗脂肪総重量を基準としてオイル回収率は７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上であり得る。

【0033】

本発明の実施例において、微細藻類の細胞破砕液に遠心分離した後、冷却処理した後に熱処理すればオイル回収率が大幅に上昇することを確認したところ、微細藻類培養液から得た細胞破砕液を遠心分離するステップ、冷却するステップおよび加熱するステップを含む本発明のオイルを抽出する方法は、オイル回収率を高め、他の添加物を投入しないため、オイルを回収し、残った副産物を飼料化することができ、持続可能な生産が可能な方法で有用に使用することができる。

【発明の効果】

【0034】

本発明の微細藻類を含む培養液の細胞を破砕した懸濁液を冷却する工程を含むバイオオイル抽出方法は、高いオイル回収率を示し、オイル回収率を上昇させるために他の添加物を投入しないため、オイルを回収し、残った副産物を飼料化することができ、持続可能な生産が可能であり、回収したオイルは飼料用組成物または食品用組成物などで有用に活用され得る。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体的な例を説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。

【0036】

実施例１．酵素処理を利用した細胞破砕液のバイオオイルの抽出
実施例１－１．酵素処理で細胞壁を破砕した微細藻類の細胞破砕液の収得
微細藻類のシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．菌株を５Ｌ発酵槽で培養液全体に対して３５％のグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）炭素源を供給し、６０時間培養を行った。

【0037】

種菌培養（Ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）の目的で滅菌されたＭＪＷ０２培地を利用して５００ｍＬフラスコで３０℃、１５０ｒｐｍ条件で約２０時間培養を行った。

【0038】

種菌培養したフラスコは、５Ｌ培養器（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）で分注および接種され、滅菌されたＭＪＷ０２培地および培養環境３０℃、５００ｒｐｍ、１．５ｖｖｍ条件で培養を行って培養液を得た。

【0039】

培養液を６０℃に加温した後、培養液の重量に対してアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４ＦＧ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を０．２％（ｗ／ｗ）投入し、６０℃で３時間攪拌反応させて細胞外壁が破砕された細胞破砕液を準備した。

【0040】

実施例１－２．冷却工程の有無によるオイル回収率の比較
実施例１－１で得た細胞破砕液を３８００ｇで５分間遠心分離した後、上澄液をスポイトまたはピペットを利用して回収し、これから冷却処理の有無によるオイル回収率の向上の有無を確認した。

【0041】

具体的に、実施例１－１の微細藻類培養を下記表１に示す１－Ａ、１－Ｂ、１－Ｃ、１－Ｄ、１－Ｅおよび１－Ｆの工程順序と工程条件でそれぞれ処理した後、オイル回収率を比較した。昇温速度および冷却速度は±０．５℃／ｍｉｎに調節し、設定温度に到達後、工程条件での時間だけ加熱および冷却した。オイル回収率は、投入した培養液での脂肪重量に対する回収したオイルの比を測定して下記数式を利用して計算した。回収したオイルの重量は最終の遠心分離ステップ後の上澄液をスポイトまたはピペットを活用して回収した後に測定した。
オイル回収率（％）＝回収オイル重量／（培養液重量＊固形分％）Ｘ１００

【0042】

【表1】

【0043】

その結果、表１に示すように、上澄液に加熱処理や冷却処理しない場合（Ｃａｓｅ １－Ａ）は、オイル回収率が０％であって、６０℃で約１時間加熱処理後、直ちに遠心分離した場合（Ｃａｓｅ １－Ｂ）はオイル回収率が２０％であった。より高い温度である７５℃で１時間加熱処理した場合（Ｃａｓｅ １－Ｃ）は、オイル回収率が２２％となり、オイル回収率が向上しないことを確認した。

【0044】

これに対して、上澄液に３０℃で３時間冷却処理した後、６０℃で１時間加熱処理した場合（Ｃａｓｅ １－Ｄ）と、２５℃で３時間冷却処理をした後、６０℃で１時間加熱処理した場合（Ｃａｓｅ １－Ｅ）は、８８％の高いオイル回収率を示し、冷却処理した後に再び加熱処理すれば、オイル回収率が大幅に上昇することを確認した。

【0045】

しかし、加熱処理なしに冷却工程だけを経たＣａｓｅ １－Ｆのような場合には、むしろオイル回収率が８％と低かった。その理由としては、微細藻類から抽出したオイルに含まれている常温では固体である飽和脂肪酸が、遠心分離により回収し難いため、抽出収率が低いと判断される。

【0046】

実施例１－３．冷却処理前の遠心分離過程の有無によるオイル回収率の比較
酵素処理を通じて細胞が破砕された微細藻類細胞破砕液の冷却処理前の遠心分離過程の有無によるオイル回収率を比較するために下記のような実験を行った。

【0047】

具体的に、実施例１－１の微細藻類細胞破砕液を下記表２に示す２－Ａおよび２－Ｂの工程順序と工程条件でそれぞれ処理した後、オイル回収率を比較した。昇温速度および冷却速度は±０．５℃／ｍｉｎに調節し、設定温度に到達後に工程条件での時間だけ加熱および冷却した。オイル回収率は実施例１－２と同様な方法で測定した。

【0048】

【表2】

【0049】

その結果、表２に示すように、酵素処理された微細藻類細胞破砕液に遠心分離過程なしに冷却処理と加熱処理の温度調節工程を経た場合のオイル回収率は９％と低かった（Ｃａｓｅ ２－Ａ）。これに対して、遠心分離して回収した上澄液をＣａｓｅ２－Ａと同一の温度調節工程を経た場合、オイル回収率が９２％と大幅に上昇することを確認した（Ｃａｓｅ ２－Ｂ）。これによって、酵素処理された微細藻類細胞破砕液を遠心分離過程なしにそのまま利用する場合、温度調節工程を経てもオイル回収が難しかったが、遠心分離過程を通じて微細藻類細胞外壁とオイルが混在された上澄液を利用する場合、冷却処理と加熱処理の温度調節工程を経れば顕著にオイル回収率が上昇することを確認した。

【0050】

実施例２．物理的な処理を利用した細胞破砕液のバイオオイルの抽出
実施例２－１．物理的処理で細胞壁を破砕した微細藻類細胞破砕液の収得
微細藻類のシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．菌株を５Ｌ発酵槽で培養液全体に対して３５％のグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）炭素源を供給して６０時間培養を行った。

【0051】

種菌培養（Ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）の目的で滅菌されたＭＪＷ０２培地を利用して５００ｍＬフラスコで３０℃、１５０ｒｐｍの条件で約２０時間培養を行った。

【0052】

種菌培養したフラスコは、５Ｌ培養器（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）で分注および接種されて滅菌されたＭＪＷ０２培地および培養環境３０℃、５００ｒｐｍ、１．５ｖｖｍ条件で培養を行って培養液を得た。

【0053】

培養が終わった微細藻類培養液をビードミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌ）装備（Ｄｙｎｏ－ｍｉｌｌ ＥＣＭ－ＭＵＬＴＩ ＬＡＢ）を利用し、ビードサイズ（Ｂｅａｄ ｓｉｚｅ）が０．８ｍｍであるものを反応器の６５％程度まで充填し、３０℃で維持し、３６００ｒｐｍ回転速度、０．１５ｋｇ／ｍｉｎの培養液の注入速度で１ｐａｓｓを行い、細胞破砕率が９０％以上、バイオマス濃度が１００ｇ／Ｌ以上、ｐＨは７、温度は３０℃である細胞破砕液を得た。

【0054】

実施例２－２．冷却工程の有無によるオイル回収率の比較
実施例２－１で得た物理的な処理による微細藻類細胞破砕液を利用して冷却処理によるオイル回収率の向上の有無を確認した。

【0055】

具体的に、実施例２－１で得た物理的な処理による微細藻類細胞破砕液を利用して下記表３に示す３－Ａ、３－Ｂ、３－Ｃ、３－Ｄ、３－Ｅおよび３－Ｆの工程順序と工程条件でそれぞれ処理した後、オイル回収率を比較した。サーキュレーター（Ｊｕｌａｂｏ ＦＰ５０－ＨＥ）に５００ｍｌ二重ジャケットを連結して温度を調節し、その二重ジャケットの中に工程液を投入して実験を行った。昇温速度および冷却速度は±１℃／ｍｉｎに調節し、設定温度に到達後、下表の工程条件での時間だけ加熱および冷却した。オイル回収率は実施例１－２と同様な方法で測定した。

【0056】

【表3】

【0057】

その結果、表３に示すように、微細藻類細胞破砕液に加熱処理や冷却処理しない場合（Ｃａｓｅ ３－Ａ）は、オイル回収率が１．５％と低く、６０℃で約１時間熱処理後、直ちに遠心分離した場合（Ｃａｓｅ ３－Ｂ）は、オイル回収率が３３．７％であった。より高い温度である７５℃で１時間熱処理した場合（Ｃａｓｅ ３－Ｃ）はオイル回収率が３２．３％とオイル回収率が向上しないことを確認した。

【0058】

反面、微細藻類細胞破砕液に２５℃で１時間冷却処理した後、６０℃で１時間熱処理した場合（Ｃａｓｅ ３－Ｄ）と、微細藻類細胞破砕液に１５℃で１時間冷却処理した後、６０℃で１時間加熱処理した場合（Ｃａｓｅ ３－Ｅ）は、それぞれ７６％、７５．８％の高いオイル回収率を示し、５℃で１時間冷却処理した場合（Ｃａｓｅ ３－Ｆ）も７８．４％の高いオイル回収率を示すことを確認して、物理的処理による微細藻類細胞破砕液に冷却処理をした後に再び加熱処理をすれば、オイル回収率が大幅に上昇することを確認した。

【0059】

実施例２－３．冷却処理前の遠心分離過程の有無によるオイル回収率の比較
物理的処理を通じて細胞が破砕された微細藻類細胞破砕液の冷却処理前の遠心分離過程の有無によるオイル回収率を比較するために下記のような実験を行った。

【0060】

具体的に、ビードミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌ）装備（Ｄｙｎｏ－ｍｉｌｌ ＥＣＭ－ＭＵＬＴＩ ＬＡＢ）で、回転速度２４００ｒｐｍ、培養液の注入速度０．１５ｋｇ／ｍｉｎの条件で２ｐａｓｓを行うことを除き、実施例２－１と同様の方法で物理的な処理を利用して細胞壁を破砕した微細藻類細胞破砕工程液を得た。得た細胞破砕工程液を５０ｍｌのファルコン（ｆａｌｃｏｎ）に入れてサーモミックス（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ）で温度調節し、６００ｒｐｍで攪拌して実験を行った。遠心分離する前である物理的な処理により細胞が破砕された微細藻類懸濁液を利用して下記表１に示す４－Ａおよび４－Ｂの工程順序と工程条件でそれぞれ処理した後、オイル回収率を比較した。加熱速度および冷却速度は±１℃／ｍｉｎに調節して設定温度に到達後、下表の工程条件での時間だけ加温および冷却した。オイル回収率は実施例１－２と同様な方法で測定した。

【0061】

【表4】

【0062】

その結果、表４に示すように、ビードミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌ）処理を経た微細藻類細胞破砕液に遠心分離過程なしに冷却処理と加熱処理の温度調節工程を経た場合のオイル回収率は４８．３％と低かった（Ｃａｓｅ ４－Ａ）。これに対して、ビードミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌ）処理を経た微細藻類細胞破砕液を３８００ｇで５分間遠心分離して回収した細胞外壁物質とオイルが混在された上澄液がＣａｓｅ ４－Ａと同一の冷却および加熱処理を経ればオイル回収率が９５．４％と上昇することを確認した（Ｃａｓｅ ４－Ｂ）。

【国際調査報告】