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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】機能的ニューロンの生成のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20241114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241114BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20241114BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793 ZNA
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527574
(86)(22)【出願日】2022-11-10
(85)【翻訳文提出日】2024-05-22
(86)【国際出願番号】 US2022079651
(87)【国際公開番号】W WO2023086894
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】63/278,902
(32)【優先日】2021-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524175099
【氏名又は名称】アクセント バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マッコム， リヤ ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
(57)【要約】
ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストを含む細胞培養培地、および多能性細胞からの種々の機能的神経細胞型の生成のためのその使用が、本明細書において提供される。グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レセプターＲＥＴ（膜貫通レセプターチロシンキナーゼｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）アゴニストを含む分化細胞培養培地で培養することによって種々の機能的神経細胞型を生成するためのインビトロ方法が本明細書において提供され、好ましくは、その分化細胞培養培地はタンパク質を本質的に含まない。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
機能的神経細胞を含む細胞集団を生成するための方法であって、１種または複数種のグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レセプター膜貫通レセプターチロシンキナーゼｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＴ）アゴニストを含む分化細胞培養培地で誘導神経前駆細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストがＤＮＳＰ－１１、ＢＴ－１８、ＢＴ－４４、ＸＩＢ４０３５、ＢＴ－１３およびＱ５２５から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストがＢＴ－１３および／またはＱ５２５であり、ＢＴ－１３が約２μＭ～約２０μＭ、好ましくは約５μＭの濃度で前記細胞培養培地に存在し、かつ／またはＱ５２５が約１ｎＭ～約１００ｎＭの濃度で前記培養培地に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記分化細胞培養培地が、ＧＤＮＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびＴＧＦβのうちの１つまたは複数を含まず、好ましくはＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦβを含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記分化細胞培養培地がタンパク質を本質的に含まない、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記分化細胞培養培地が、Ｎ－２サプリメントおよび／またはＢ－２７サプリメントを補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記分化細胞培養培地が、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびインスリンレセプターアクチベーターを含み、Ｎ－２サプリメントおよび／またはＢ－２７サプリメントを含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記インスリンレセプターアクチベーターがデメチルアステリキノンＢ１（ＤＭＡＱ－Ｂ１）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記分化細胞培養培地がノッチ経路インヒビターを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ノッチ経路インヒビターがＤＡＰＴ（Ｎ－［２Ｓ－（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル－１，１－ジメチルエチルエステル－グリシン）またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ－ｃＡＭＰ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記誘導神経前駆細胞が、約４日～約１１０日、約４日～約６０日、約５日～約４０日、または約１６日～約３２日の期間、分化培地で培養される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記機能的神経細胞がドーパミン前駆細胞、ドーパミン神経芽細胞、線条体ニューロン、神経上皮幹細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン、皮質介在ニューロン、コリン作動性ニューロン、セロトニン介在ニューロン、小脳ニューロン、感覚ニューロン、および運動ニューロンから選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記機能的神経細胞がドーパミン作動性ニューロンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞集団中の細胞のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のインヒビターを含み、必要に応じて有効量のＴＧＦβシグナル伝達経路のインヒビターを含む誘導培地で、哺乳動物多能性細胞を培養することによって前記誘導神経前駆細胞が生成される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のインヒビターがＬＤＮ１９３１８９であり、かつ／または前記ＴＧＦβシグナル伝達経路のインヒビターがＳＢ－４３１５４２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記誘導培地がＷＮＴシグナル伝達経路のアクチベーターおよび／またはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）のアクチベーターをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路のアクチベーターがＧＳＫ３インヒビター、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１であり、かつ／または前記ＳＨＨのアクチベーターがスムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記誘導培地が、ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）アゴニストを含まず、かつ／またはＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターを含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記誘導培地が、ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）アゴニストを含まず、ＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
機能的神経細胞を含む集団を生成するための方法であって、（ｉ）誘導神経前駆細胞を生成するのに十分な条件下にて誘導培地で哺乳動物多能性細胞を培養する工程；および
（ｉｉ）有効量のＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストを含む分化培地で該誘導神経前駆細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項22】
前記哺乳動物多能性細胞がヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
神経前駆細胞から機能的ニューロンを生成するために有用な細胞培養培地であって、該細胞培養培地は、ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト、好ましくはＢＴ－１３と、ノッチ経路インヒビター、好ましくは、ＤＡＰＴおよび／またはｄｂ－ｃＡＭＰとを含む、無タンパク質ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地であり、
該培養培地はＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦβを含まない、
細胞培養培地。
【請求項24】
前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地がＮ２サプリメントおよび／またはＢ２７サプリメントを補充されている、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項25】
前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地が、インスリンレセプターアクチベーター、好ましくはＤＡＱ－Ｂ１を含み、Ｎ２サプリメントおよび／またはＢ２７サプリメントを含まない、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項26】
前記ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストが、ＧＦＲα１とは無関係にＲＥＴを選択的に活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
機能的神経細胞を含む細胞集団を生成するための方法であって。神経前駆細胞集団を生成するのに適切な条件下にてｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養培地でヒト多能性幹細胞をインキュベートする工程であって、好ましくは、該ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養培地は、ＬＤＮ１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１およびスムーズンドアゴニストを含み、ＦＧＦ８を含まない、工程、ならびに
１種または複数種のＧＮＤＦレセプターＲＥＴアゴニストとノッチ経路インヒビター、好ましくは、ＤＡＰＴおよび／またはｄｂ－ｃＡＭＰとを含む、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養培地で、機能的ニューロンの集団を生成するのに十分な時間、該生成された神経前駆細胞集団をインキュベートする工程であって、該ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養はＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦ－βを含まない、工程
を含む、方法。
【請求項28】
前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養培地がＮ－２およびＢ－２７を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ細胞培養培地が、インスリンレセプターアクチベーター分子、好ましくはＤＭＡＱ－Ｂ１を含み、Ｎ－２およびＢ－２７を含まない、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０２１年１１月１２日出願された米国仮特許出願第６３／２７８，９０２号に基づく利益を主張し、この米国仮特許出願の全開示が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年１１月１２日出願された米国仮特許出願第６３／２７８，９０２号に基づく利益を主張し、この米国仮特許出願の全開示が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
（発明の背景）
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（胚性サブタイプおよび誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）サブタイプを含む）は、種々の適用（ヒトの発生または疾患のモデリング１、薬物スクリーニング、および細胞ベースの治療剤が挙げられる）のために機能的最終細胞型（例えば、成熟ニューロン）を誘導するための供給源細胞として広範に使用されている。インビトロでのｈＰＳＣからの機能的細胞型の誘導は、細胞の運命を漸進的に指定するために正確な量、時期、および順序で多くの生化学的シグナル（例えば、増殖因子モルフォゲンおよび低分子）がその細胞に提示される、胚盤胞環境からの前駆細胞の天然の発生プロセスを模倣することを含む。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（胚性サブタイプおよび誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）サブタイプを含む）は、種々の適用（ヒトの発生または疾患のモデリング１、薬物スクリーニング、および細胞ベースの治療剤が挙げられる）のために機能的最終細胞型（例えば、成熟ニューロン）を誘導するための供給源細胞として広範に使用されている。インビトロでのｈＰＳＣからの機能的細胞型の誘導は、細胞の運命を漸進的に指定するために正確な量、時期、および順序で多くの生化学的シグナル（例えば、増殖因子モルフォゲンおよび低分子）がその細胞に提示される、胚盤胞環境からの前駆細胞の天然の発生プロセスを模倣することを含む。
【0003】
ｈＰＳＣから機能的ニューロンサブタイプをインビトロで誘導するための現行の方法は、内在的シグナル伝達プロセスを再現するために細胞培養培地に補充される組換えタンパク質の使用に大きく依存する。例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＮＦ）が、ニューロン維持において重要な役割を果たすＧＤＮＦ媒介性ＲＥＴシグナル伝達を活性化するために、ｈＰＳＣからのニューロン分化のための多くのプロトコルで普及している。パーキンソン病の動物モデルにおいて有効性を示した、ｈＰＳＣからドーパミン作動性ニューロン前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）または神経芽細胞を誘導するためのプロトコルは、その分化プロトコルの期間のうちの７５％もの頻度でＧＤＮＦの添加を必要とする。ハンチントン病の動物モデルにおいて有効性を示したｈＰＳＣ由来線条体ニューロンの生成もまた、その分化プロセスの成熟段階の間に相当な量のＧＤＮＦを必要とする。さらに、ＧＤＮＦの使用は、種々の神経障害（脳卒中、神経障害性疼痛、統合失調症、自閉症、癲癇、および学習障害／記憶障害が挙げられる）のための細胞治療候補であるいくつかのさらなるｈＰＳＣ由来のニューロンサブタイプ（例えば、神経上皮幹細胞、介在ニューロン、コリン作動性ニューロン、およびセロトニンニューロン）の生成においても、普及している。
【0004】
大脳を越えて延びているので、小脳変性症をモデル化するためにｈＰＳＣから誘導されており、小脳変性症治療の可能性を有する小脳ニューロンは、成熟状態に達するために相当な量のＧＤＮＦ－一部の場合では１００日を超える曝露－を必要とする。ｈＰＳＣから誘導された末梢感覚ニューロン（侵害受容器、機械受容器、および自己受容器を含む）もまた、個別化した神経障害処置モデル化のために機能的ニューロンを生成するためのＧＤＮＦの使用に大きく依存する。変性状態（ＳＭＡおよびＡＬＳが挙げられる）のモデル化または治療のためのｈＰＳＣからの運動ニューロンの分化および成熟は、その分化時間のほぼ５０％の間、ＧＤＮＦを必要とする。
【0005】
これらの神経細胞型の大多数が、神経組織の再生を含む一定範囲の神経学的適応症のための細胞補充療法の候補であるが、ヒトにおける移植のための臨床グレードの細胞を作製することが、これらの候補療法を診療所へ移す際の重大なボトルネックとして現れている。その適応症に依存して、数百万個の細胞が患者への単回投与のために必要とされ、これは、単一の同種製品のために１年当たり１０１４個の細胞までの推定製造負荷の量である。これらの細胞治療候補の臨床開発および商業化のために必要な現行適正製造プロセス（ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ）（ｃＧＭＰ）グレードの細胞のために、組換えタンパク質が、最も高価な原材料の一つである。例えば、ｈＰＳＣからのドーパミン作動性ニューロンの生成のための４０日プロトコルにおいて、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびＴＧＦ－βが細胞培養培地に３０日間補充され、これは、試薬の総費用のうちの５０％を占める。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
（発明の要旨）
グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レセプターＲＥＴ（膜貫通レセプターチロシンキナーゼｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）アゴニストを含む分化細胞培養培地で培養することによって種々の機能的神経細胞型を生成するためのインビトロ方法が本明細書において提供され、好ましくは、その分化細胞培養培地はタンパク質を本質的に含まない。一部の態様において、機能的神経細胞が、本明細書において記載されている方法にしたがって誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）（幹細胞由来）神経前駆細胞から生成される。他の態様において、機能的神経細胞が、本明細書において記載されている方法にしたがって哺乳動物多能性細胞から生成される。
グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レセプターＲＥＴ（膜貫通レセプターチロシンキナーゼｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）アゴニストを含む分化細胞培養培地で培養することによって種々の機能的神経細胞型を生成するためのインビトロ方法が本明細書において提供され、好ましくは、その分化細胞培養培地はタンパク質を本質的に含まない。一部の態様において、機能的神経細胞が、本明細書において記載されている方法にしたがって誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）（幹細胞由来）神経前駆細胞から生成される。他の態様において、機能的神経細胞が、本明細書において記載されている方法にしたがって哺乳動物多能性細胞から生成される。
【0007】
種々の機能的神経細胞型を生成するために有用な細胞培養培地もまた本明細書において提供され、その細胞培養培地は１種または複数種のＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストを含む。好ましい態様において、その細胞培養培地は、ＧＮＤＦ、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）およびＴＧＦβを含まず、好ましくは、タンパク質を本質的に含まない。
（図面の説明）
（図面の説明）
【図面の簡単な説明】
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（発明の詳細な説明）
（定義）
（定義）
【0014】
本明細書において使用される「アクチベーター」とは、分子または経路のシグナル伝達機能（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達、ＳＨＨシグナル伝達など）の活性化を増加、誘導、刺激、活性化、促進、または増強する、化合物を指す。
【0015】
本明細書において使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」とは、少なくとも細胞２個の群を指す。非限定的な例において、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。その集団は、１種の細胞型を含む純粋な集団（例えば、ドーパミン作動性ニューロンの集団、または未分化幹細胞の集団）であり得る。あるいは、その集団は、１種よりも多い細胞型を含み得る（例えば、混合細胞集団）。
【0016】
本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」とは、培養中に無限の期間分裂して、特殊化した細胞を生じる能力を有する、細胞を指す。
【0017】
本明細書において使用される場合、用語「胚性幹細胞」および「ＥＳＣ」とは、着床前期胚から誘導され、培養中に分化せずに長期間分裂可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織へと成長することが公知である、原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞とは、ヒト胚に由来する胚性幹細胞を指す。本明細書において使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」とは、培養中に分化せずに長期間分裂可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織へと成長することが公知である、初期ヒト胚（胚盤胞期までを含む）に由来する種類の多能性幹細胞を指す。
【0018】
本明細書において使用される場合、用語「胚性幹細胞株」とは、分化せずに何日間、何か月から何年間までも増殖を可能にするインビトロ条件下にて培養されてきた、胚性幹細胞の集団を指す。
【0019】
本明細書において使用される場合、用語「ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト」は、膜貫通レセプターチロシンキナーゼＲＥＴを間接的または直接的に活性化する分子を含む。ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）（ＡＲＴＮ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）およびペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰＮ）（これらすべては、膜貫通レセプターチロシンキナーゼＲＥＴを通じてシグナル伝達する）から選択される、ＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）の活性を増加させることによって、ＲＥＴを間接的に活性化し得る。ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストによるＲＥＴの直接的活性化は、ＧＦＬタンパク質とは無関係に生じる。例として、ＢＴ－１３およびＢＴ－１８はＲＥＴを直接的に活性化するが、ＸＩＢ４０３５は、ＧＤＮＦまたはＡＲＴＮの活性化を増加させることによってＲＥＴを間接的に活性化する。
【0020】
用語「ドーパミン作動性ニューロン」は、チロシンヒドロキシラーゼを発現する神経細胞を包含することが意図され、詳細にはこの用語はチロシンヒドロキシラーゼを発現する神経細胞を含むことが意図され、ドーパミン前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）およびドーパミン神経芽細胞を含む。
【0021】
本明細書において使用される場合、用語「多能性」とは、生物の３つの発生胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む）へと成長する能力を指す。
【0022】
本明細書において使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、体細胞中への特定の胚遺伝子（例えば、ＯＣＴ４導入遺伝子、ＳＯＸ２導入遺伝子、およびＫＬＦ４導入遺伝子であるが、これらに限定はされない）の導入によって形成される種類の多能性幹細胞を指す（例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６、６６３～６７６（２００６）（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【0023】
本明細書において使用される場合、用語「ニューロン」とは、神経系の主要な機能的単位である、神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体ならびにその突起（軸索および１つまたは複数の樹状突起）からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
【0024】
本明細書において使用される場合、用語「未分化」とは、特殊化した細胞型へと未だに成長していない細胞を指す。
【0025】
本明細書において使用される場合、用語「分化」とは、特殊化していない胚細胞が特殊化した細胞（例えば、神経細胞、心臓細胞、肝細胞、または筋細胞）の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、細胞表面に埋まっているタンパク質が関与するシグナル伝達経路を通常は介して、その細胞の遺伝子と、その細胞の外側の物理的条件および化学的条件との相互作用によって制御される。
【0026】
本明細書において使用される場合、細胞に関連する用語「分化を誘導すること」とは、その初期状態（ｄｅｆａｕｌｔ）の細胞型（遺伝子型および／または表現型）から非初期状態（ｎｏｎ－ｄｅｆａｕｌｔ）の細胞型（遺伝子型および／または表現型）へ変化させることを指す。したがって、「幹細胞において分化を誘導すること」とは、その幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）がその幹細胞とは異なる特徴（例えば、遺伝子型（例えば、遺伝子解析（例えば、マイクロアレイ）によって決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、中脳ドーパミン（ＤＡ）細胞もしくはその前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）のタンパク質マーカー（例えば、ＥＮ－１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、およびＬＬＭＸ１Ａ）の発現の変化）を有する子孫細胞へと分裂するのを誘導することを指す。
【0027】
本明細書において使用される場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」または「バイオマーカー」とは、特定の細胞もしくは細胞型を識別する、遺伝子またはタンパク質を指す。細胞についてのマーカーは１つのマーカーに限定されない可能性があり、マーカーとは、指定のマーカー群が、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から識別し得るような、マーカーの「パターン」を指し得る。
【0028】
誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）または哺乳動物多能性細胞からの機能的ニューロンの生成におけるＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦβの必要性を除去する細胞培養培地添加物としてのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストの使用が、本明細書において提供される。
【0029】
一部の態様において、誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）（ｉＮＰＣ）からニューロンを生成するためのインビトロ方法が提供され、その方法は、ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストを含む分化細胞培養培地でそのｉＮＰＣを培養する工程を含む。一部の態様において、本方法にしたがう使用のためのｉＮＰＣは、マーカーであるＰａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＣＤ１３３を発現する。
【0030】
好ましい実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストは、構造：
を有するＢＴ－１３（Ｎ，Ｎ－ジエチル－３－［４－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）－ベンゾイル］ピペラジン－１－イル］－４－メトキシベンゼンスルホンアミド）および／または構造：
を有するＢＴ－１８（［４－［５－［（６，７－ジメトキシ－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－２－イル）スルホニル］－２－メトキシフェニル］ピペラジン－１－イル］－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）－フェニル］メタノン）および／または ＢＴ－４４である。一部の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、ＢＴ－１３、ＢＴ－１８および／またはＢＴ－４４を約２μＭ～約２０μＭの濃度で含む。他の実施形態において、その分化細胞培養培地は、約２μＭ～約１０μＭもしくは約５μＭのＢＴ－１３、ＢＴ－１８および／またはＢＴ－４４を含む。
【化1】
【化2】
【0031】
関連する実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストはＸＩＢ４０３５（アミノキノール；
）であり、好ましくは、その分化細胞培養培地は約１０ｎＭ～約１０００ｎＭのＸＩＢ４０３５を含む。
【化3】
【0032】
他の実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストはＱ５２５
であり、好ましくは、その分化細胞培養培地は約１ｎＭ～約１００ｎＭのＱ５２５を含む。
【化4】
【0033】
他の実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストは、Ｊｍａｅｆｆら、ＪＢＣ、２９５（１９）：６５３２～６５４２（２０２０）の表３に列挙されたもの（その各々の構造はその参考文献（その内容全体が参照により本明細書に援用される）の表１で特定されている）から選択される。一部の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は約１ｎＭ～約１００ｎＭのＱ５２５またはＱ５０８を含む。
【0034】
他の実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストは、ドーパミンニューロン刺激ペプチド－１１（ＤＮＳＰ－１１；ＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬ（配列番号１））である。
【0035】
他の実施形態において、そのＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストは、Ｒｕｎｅｂｅｒｇ－Ｒｏｏｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、９６：３３５～３４５（２０１６）；Ｊｍａｅｆｆら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、９８：１～１２（２０２０）；Ｍａｈａｔｏら、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．、３５：２４５～２５５（２０２０）；Ｓｉｄｏｒｏｖａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、８：３６５（２０１７）；およびＳｉｄｏｒｏｖａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２１（１８）６５７５（２０２０）（それらの各々の内容全体が参照により本明細書に援用される）において記載されているものから選択される。本方法にしたがって有用な他のＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストとしては、米国特許第８，９０１，１２９号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているもの（例えば、ＢＴ１０、ＢＴ１６、ＢＴ１７またはＢＴ２９２６５１）が挙げられる。
【0036】
一部の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ－１３またはＱ５２５）を含み、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路インヒビター（例えば、ＤＡＰＴ（Ｎ－［２Ｓ－（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル－１，１－ジメチルエチルエステル－グリシン）および／またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ－ｃＡＭＰ）、ＲＯ４９２９０９７、ＢＭＳ－９０６０２４、ＹＯ－０１０２７、ＬＹ－４１１５７５、もしくはタンゲレチン）をさらに含む。一部の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、ＤＡＰＴを（例えば、５μＭ～２０μＭ、好ましくは約１０μＭの濃度で）含む。
【0037】
一部の実施形態において、その分化細胞培養培地は、血清を含まず、（ｉ）ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１３２００３３）（必要に応じて、グルタミン（例えば、ｇｌｕｔａｍａｘ）および／またはＮ２サプリメント（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１７５０２０４８）および／またはＢ２７サプリメント（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１７５０４０４４）および／またはアスコルビン酸を補充している）と、（ｉｉ）ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ１３またはＱ５２５）と、（ｉｉｉ）ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路インヒビター（好ましくは、ＤＡＰＴおよび／またはｄｂ－ｃＡＭＰ）とを含む。アスコルビン酸の存在は、本方法にしたがって機能的ニューロンを生成するために必要ではないが、細胞の健康および維持に寄与し得る。
【0038】
一部の態様において、その分化細胞培養培地中のＢ－２７サプリメントおよびＮ－２サプリメントは、１種または複数種のインスリンレセプターアクチベーター分子、好ましくは、選択的インスリンレセプターアクチベーター（例えば、デメチルアステリキノンＢ１（ＤＭＡＱ－Ｂ１、別名ＤＡＱＢ１）（好ましくは、１０μＭ～１００μＭの間の濃度）、または５，８－ジアセチルオキシ－２，３－ジクロロ－１，４－ナフトキノン（ＤＤＮ））で置換される。したがって、一部の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、無血清であり、（ｉ）ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， １１３２００３３）と、（ｉｉ）インスリンレセプターアクチベーター（好ましくは、ＤＡＱＢ１）と、（ｉｉｉ）ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ１３またはＱ５２５）と、（ｉｖ）ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路インヒビター（好ましくは、ＤＡＰＴおよび／またはｄｂ－ｃＡＭＰ）とを含み、その培地は、Ｂ－２７サプリメントおよびＮ－２サプリメントを含まない。必要に応じて、その分化細胞培養培地は、鉄輸送分子 例えば、ヒノキチオール（５μＭ～５０μＭ）および／またはＢＳＡの代替物（例えば、組換えヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））（１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）を含む。一部の態様において、その分化細胞培養培地は、完全に化学的に定義された無血清・ゼノフリー培地（例えば、ＣＴＳ ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅサプリメント（１２６１８０１２））である。ゼノフリーによって、その培養培地はウシまたは他の非ヒトの動物由来成分を含まないことが、意図される。
【0039】
特に好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦβのうちの１つまたは複数を含まない。特に好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦβを実質的に含まない。他の好ましい実施形態において、その分化細胞培養培地は、タンパク質を本質的に含まない．
【0040】
一部の態様において、本明細書において記載されている方法にしたがう使用のための誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）は、哺乳動物多能性細胞を神経誘導培地中でその誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）を誘導するのに適切な時間培養することによって、得られる。典型的には、多能性細胞は、以下のマーカーを発現する：Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １／８１。
【0041】
一部の実施形態において、その多能性細胞はヒト多能性細胞である。別の実施形態において、その多能性細胞は非ヒト哺乳動物多能性細胞である。好ましい実施形態において、その多能性細胞は幹細胞である。一部の態様において、その幹細胞は、胚性幹細胞、好ましくは、ヒト胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞株ＳＡ０１、ＶＵＢ０１、ＨＵＥＳ ２４、Ｈ１、Ｈ９、ＷＴ３、ＨＵＥＳ１）である。他の態様において、その幹細胞は非ヒト（例えば、マウス、齧歯類または霊長類）胚性幹細胞である。他の態様において、その幹細胞は成体ヒト幹細胞である。他の好ましい実施形態において、その幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子の強制発現を誘導することによって、非多能性の代表的には成体体細胞から人工的に誘導された種類の多能性幹細胞である。例えば、ヒト皮膚線維芽細胞が、４種の山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃ）を使用して、多能性幹細胞へと初期化され得る。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ、Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．、Ｃｅｌｌ、２００６；１２６（４）：６６３～６７６（この内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【0042】
一部の態様において、誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）を哺乳動物多能性幹細胞から生成するために、その多能性幹細胞のニューロン誘導が、（一般的には、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路およびＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害することによって）その幹細胞をＳＭＡＤ経路の二重インヒビターの存在下でフィーダー細胞を必要とせずに培養することによって、開始される。
【0043】
幹細胞をＢＭＰインヒビターの存在下で培養することは、ＢＭＰおよびそのレセプターに対して直接作用することによろうと、またはそれらの発現を阻害することによろうと、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害可能なあらゆる培養条件を含む。ＢＭＰシグナル伝達経路の適切なインヒビターとしては、ＬＤＮ１９３１８９、ＤＭＨ１、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ピペリジン－１－イル－エトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イル－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン）、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１２８５４、およびＭＬ３４７、ＬＤＮ２１４１１７が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態において、そのＢＭＰインヒビターはＬＤＮ１９３１８９である。その培養物中のＢＭＰインヒビターの濃度は、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するのに有効な濃度である。
【0044】
幹細胞をＴＧＦβインヒビターの存在下で培養することは、ＴＧＦβに対して直接作用してその機能を阻害することによろうと、またはＴＧＦβ自体の生成を阻害することによろうと、ＴＧＦβを阻害可能なあらゆる培養条件を含む。ＴＧＦβシグナル伝達経路の適切なインヒビターとしては、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ２０８、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ－５０５１２４、ＧＷ７８８３８８およびＥＷ－７１９７が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態において、そのＴＧＦβインヒビターはＳＢ－４３１５４２である。その培養物中のＴＧＦβインヒビターの濃度は、ＴＧＦβを阻害するのに有効な濃度である。
【0045】
好ましい実施形態において、その誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）は、底板ベースの前駆細胞（例えば、中脳底板細胞）である。一部の実施形態において、中脳運命へのパターン形成のために、幹細胞は、ＳＭＡＤ経路のインヒビターと、（ｉ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）のアクチベーター、（ｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路のアクチベーター、および任意選択の（ｉｉｉ）ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）アゴニストとを含む、誘導培地中で、培養される。中脳前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を生成するための代表的な方法としては、米国特許第１０，８５８，６２５号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）において記載されている方法が挙げられる。
【0046】
本明細書において使用される用語「ソニックヘッジホッグアゴニスト」または「ＳＨＨアゴニスト」は、組換えソニックヘッジホッグ、プルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）およびＳＡＧ（これはスムーズンドアゴニストを表し、クロロベンゾチオフェン含有化合物である）をを含む。Ｓｈｈはまた、組換え哺乳動物デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）または組換え哺乳動物インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）で置換され得る。活性化されたスムーズンド（ＳＭＯ）もまた、使用され得る。好ましい実施形態において、そのＳＨＨアクチベーターはＳＡＧである。
【0047】
ＷＮＴシグナル伝達経路の適切なアクチベーターとしては、ＧＳＫ－３βインヒビター、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、Ａ１０７０７２２、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、Ｂｉｋｉｎｉｎ、ＩＭ－１２、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＬＹ２０９０３１４、ＡＺＤ１０８０、ＡＺＤ２８５８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、およびＩｎｄｉｒｕｂｉｎが挙げられる。好ましい実施形態において、そのＷＮＴアクチベーターはＣＨＩＲ９９０２１である。
【0048】
本明細書において使用される「ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）アゴニスト」とは、ＦＧＦＲを活性化し得る分子（例えば、ＦＧＦＲに結合し、そのレセプターの二量体化を誘導し、シグナル伝達Ｐ１３Ｋ経路およびＲａｓ／ＥＲＫ経路を活性化する、分子）を意味する。ＦＧＦＲアゴニストの非限定的な例としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８およびＳＵＮ１１６０２が挙げられる。好ましい実施形態において、そのＦＧＦＲアゴニストはＦＧＦ８（例えば、組換え生成されたＦＧＦ８）である。
【0049】
一部の好ましい態様において、その神経誘導培地は、（ｉ）ＢＭＰシグナル伝達を阻害するためのＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）と、（ｉｉ）ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するためのＳＢ－４３１５４２（ＳＢ）（例えば、１０ｍＭ）と、（ｉｉｉ）組換えＦＧＦ８と、（ｉｖ）ソニックヘッジホッグシグナル伝達を活性化するためのスムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ；３－クロロ－Ｎ－［トランス－４－（メチルアミノ）シクロヘキシル］－Ｎ－［３－（ピリジン－４－イル）ベンジル］－１－ベンゾチオフェン－２－カルボキサミド）と、（ｉｖ）ＷＮＴシグナル伝達を活性化するためのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、例えば、１０ｍＭ）とを含む。あるいは、ＣＴ９９０２１（ＧＳＫ３インヒビター）が、ＷＮＴシグナル伝達を活性化するために使用され得る。
【0050】
他の態様において、その神経誘導培地は、（ｉ）ＢＭＰシグナル伝達を阻害するためのＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）と、（ｉｉ）ソニックヘッジホッグシグナル伝達を活性化するためのスムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ；３－クロロ－Ｎ－［トランス－４－（メチルアミノ）シクロヘキシル］－Ｎ－［３－（ピリジン－４－イル）ベンジル］－１－ベンゾチオフェン－２－カルボキサミド）と、（ｉｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達を活性化するためのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、例えば、１０ｍＭ）とを含み、その神経誘導培地はＴＧＦβシグナル伝達のインヒビター（例えば、ＳＢ－４３１５４２（ＳＢ））を含まず、かつ／またはその神経誘導培地はＦＧＦ８を含まない。一部の態様において、ｉＰＳＣまたはＥＳＣが、Ｏｃｔ４／ＰＯＵ５Ｆ１、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現によって同定される。
【0051】
一部の態様において、神経前駆細胞が、Ｐａｘ６、ＮｅｓｔｉｎおよびＣＤ１３３の発現によって同定される。
【0052】
一部の態様において、中脳前駆細胞が、以下のマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）の発現によって同定される：ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＸＴ２、ＥＮ１／２、ＧＢＸ２、Ｗｎｔ１、ＣＮＰＹ１、ＳＰＲＹ１、およびＰａｘ８。
【0053】
一部の態様において、成熟ドーパミン作動性ニューロンが、以下のマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）の発現によって同定される：チロシンヒドロキシラーゼ、ＣＯＲＩＮ、Ｎｕｒｒ１、ＧＲＫ２、Ｐｉｔｘ３、ＤＡＴ、ＬＲＴＭ１、ＡＬＣＡＭ、ＤＲＤ２、ＤＢＨ、ＣＨＲＮＢ３。
【0054】
一部の態様において、哺乳動物幹細胞から分化した神経細胞を生成するための方法が提供され、その方法は、（ｉ）神経誘導培地でその幹細胞を培養する工程であって、その培養する工程は誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）の生成をもたらす、工程；および（ｉｉ）ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（好ましくは、ＢＴ１３）を含む分化培地でその誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）を培養する工程であって、その培養する工程は分化した神経細胞の集団の生成をもたらす、工程を含む。一部の実施形態において、その幹細胞は、工程（ｉ）にしたがって神経誘導培地で約１０日間～約１２日、９日間～１１日間または約１０日培養される。
【0055】
有利なことに、本方法にしたがう哺乳動物幹細胞からの機能的ニューロンの生成は、工程（ｉ）の神経誘導培地においてＦＧＦＲアゴニスト（例えば、ＦＧＦ８）の存在を必要としない。したがって、一部の好ましい実施形態において、哺乳動物幹細胞から神経細胞を生成するための方法が提供され、その方法は、（ｉ）（ａ）ＢＭＰシグナル伝達のインヒビターと（ｂ）ＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターと（ｃ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）のアクチベーターと（ｄ）ＷＮＴのアクチベーターとを含む神経誘導培地でその幹細胞を培養する工程であって、その神経誘導培地はＦＧＦＲアゴニストを含まない、工程；および（ｉｉ）ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（好ましくは、ＢＴ１３）を含む分化培地でその神経前駆細胞を培養する工程であって、それにより神経細胞が生成される、工程を含む。
【0056】
他の好ましい実施形態において、本方法にしたがう哺乳動物幹細胞からの機能的ニューロンの生成は、工程（ｉ）の神経誘導培地にＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターを含むことなく実施される。したがって、哺乳動物幹細胞から神経細胞を生成するための方法が提供され、その方法は、（ｉ）（ａ）ＢＭＰシグナル伝達のインヒビターと（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）のアクチベーターと（ｃ）ＷＮＴのアクチベーターとを含む神経誘導培地でその幹細胞を培養する工程であって、その神経誘導培地はＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターを含まない、工程；および（ｉｉ）ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ１３またはＱ５２５）を含む分化培地でその神経前駆細胞を培養する工程であって、それにより神経細胞が生成される、工程を含む。関連する実施形態において、工程（ｉ）の神経誘導培地は、ＴＧＦβシグナル伝達のインヒビターを含み、ＦＧＦＲアゴニストを含まない。
【0057】
種々の分化した神経細胞が、例えば、工程（ｉｉ）にしたがってＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ１３またはＱ５２５）を含む分化培地で神経前駆細胞が培養される日数を変化させることによって、本方法にしたがって生成され得る。一部の態様において、本明細書において記載されている方法にしたがって生成される分化した神経細胞は、ドーパミン前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、ドーパミン神経芽細胞、線条体ニューロン、神経上皮幹細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン、皮質介在ニューロン、コリン作動性ニューロン、セロトニン介在ニューロン、小脳ニューロン、感覚ニューロン、および運動ニューロンから選択される。
【0058】
下記の表１は、本方法にしたがって哺乳動物多能性細胞から生成され得る種々の神経細胞型を、可能性のあるそれらの医学的用途、先行技術の方法にしたがって各細胞型を生成するのに必要なＧＤＮＦの日数、その神経細胞型を同定するためのマーカー、およびその先行技術の方法を記載している参考文献（それらの各々の内容は参照により本明細書に援用される）とともに、示す。下記のプロトコルの各々について、ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ１３またはＱ５２５）が、本方法にしたがってＧＤＮＦの代わりに（プロトコルによってはＢＤＮＦ、ＴＧＦβおよび他のタンパク質の代わりに）使用される。
【0059】
【表1-1】
【表1-2】
【0060】
本方法にしたがって生成されるニューロンの型は、１種または複数種の表面マーカーの発現によって同定され得る。一部の態様において、ドーパミン作動性ニューロンが生成される。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼの発現、ならびに必要に応じてＤＡＴ、ＣＯＲＩＮ、ＧＩＲＫ２、ＰＩＴＸ３およびＮＵＲＲ１のうちの１つまたは複数の発現によって、同定され得る。他の態様において、線条体ニューロンが生成される。線条体ニューロンは、ＤＡＲＰＰ３２、ＣＩＴＰ２、ＣＡＬＢＩＮＤＩＮ、およびＧＡＢＡのうちの１つまたは複数の発現によって同定され得る。
【0061】
活動電位を発生する能力はニューロンの成熟および機能の特徴であり、種々のニューロン表現型が別個の特定の発火パターンを示す。したがって、本方法にしたがって生成されるニューロンの機能性は、１種または複数種の表面マーカーの発現のほかに、例えば、パッチクランプ法の電気生理学を使用して、またはＡｄｉｌ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、７、４０５７３（２０１７）（その内容全体が参照により本明細書に援用される）において記載されている膜電位イメージング法を使用して、ニューロンが活動電位を発生する能力を評価することによって、確認され得る。機能的中脳ドーパミン作動性ニューロンは、例えば、２Ｈｚ～５Ｈｚで周期的スパイクの発火パターンを示す。本方法にしたがって生成されるニューロンはまた、動物モデル（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ３４４ラット）中に（例えば、線条体に）移植され得、その移植されたニューロンの生存が、後の時点で（例えば、移植の６週間後に）評価され得る。
【0062】
一部の実施形態（例えば、胚様体由来のニューロスフェアベースの誘導を利用する）において、工程（ｉ）の後で、工程（ｉｉ）にしたがって分化培地で培養するために、細胞クラスターが単一細胞へと（例えば、１１日目に）分離される。他の実施形態において、２次元単層ベースの方法（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした２次元表面）が使用される。他の実施形態において、３次元細胞培養ベースの方法が使用され、例えば、その方法では、細胞が生体材料（例えば、アルギン酸塩、コラーゲン、ヒアルロン酸またはＡｄｉｌ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、７、４０５７３（２０１７）（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている材料）に包埋される。
【0063】
一部の態様において、本明細書において記載されているとおり分化培地で培養する工程は、望ましいニューロン（例えば、表１を参照のこと）を生成するのに十分な時間、行われる。一般に、本明細書において記載されているとおり分化培地で培養する工程は、約４日間～約１１０日間の期間、行われる。一部の態様において、本明細書において記載されているとおり分化培地で培養する工程は、約４日間～約６０日間、または約５日間～約４０日間または約１６日間～約３２日間の期間、行われる。
【0064】
関連する態様において、本方法にしたがって生成される細胞集団が提供される。本方法にしたがって生成される細胞集団は、典型的には、分化した神経細胞に加えて、他の細胞型を含み得る。一実施形態において、本発明の集団は、その集団が、分化したニューロンに特徴的な少なくとも１種のバイオマーカー（例えば、ＴＨ遺伝子産物）の高発現を示す細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％含むという点で、特徴付けられる。
【0065】
分化した神経細胞に特徴的な他のバイオマーカーは、生成されるニューロンの型に依存するが、そのバイオマーカーとしては、表１に列挙されているマーカーのうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0066】
遺伝子発現を測定するために当該分野で公知の任意の方法、詳細には、定量的方法（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲもしくはマイクロアレイ、または遺伝子レポーター発現を使用する方法）、あるいは定性的方法（例えば、特定のバイオマーカー（細胞表面マーカーが挙げられる）を示す細胞を識別する、免疫染色法またはセルソーティング法）が、使用され得る。
【0067】
一部の態様において、哺乳動物多能性幹細胞から、または誘導神経前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）から、機能的ニューロンを生成するために有用な細胞培養分化培地が提供され、その分化培地は、ＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニスト（例えば、ＢＴ－１３またはＱ５２５）を含む。一部の実施形態において、その分化培地は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性ニューロンを生成するために有用である。一部の実施形態において、その培養培地は、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路インヒビター（例えば、ＤＡＰＴおよび／またはｄｂ－ｃＡＭＰ）をさらに含む。好ましい実施形態において、その培養培地はＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦ－βを含まない。他の好ましい実施形態において、その培養培地はタンパク質を本質的に含まない。一部の態様において、その細胞培養培地は、Ｎ２サプリメントおよびＢ１７サプリメントを補充された、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む。他の態様において、その細胞培養培地は、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とインスリンレセプターアクチベーター（好ましくは、ＤＭＡＱ－Ｂ１）とを含み、Ｎ２サプリメントを含まず、Ｂ１７サプリメントを含まない。
【実施例】
【0068】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を例示し、以下の実施例は本発明の範囲を限定することは決して意図されない。本発明がその好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、本出願を読んだ当業者にはその種々の改変形が明らかである。
【0069】
（実施例１）
（方法）
（方法）
【0070】
（ヒト多能性幹細胞培養物） ヒト人工多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ１８９４５）を、１％ Ｍａｔｒｉｇｅｌの層上に単層形態で継代培養し、増殖中はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地で維持した。８０％コンフルエンシーで、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を使用してＨ９を継代し、１：８分割で再播種した。
【0071】
（３次元ｈＰＳＣ培養物の播種） Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液を使用してｈＰＳＣを単一細胞へと分離し、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｒｏｃｋインヒビター、ＲＩ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地に再懸濁した。ｈＰＳＣを計数し、規定した密度で氷上の１１％ ＡＸｇｅｌに再懸濁した。ＡＸｇｅｌに懸濁した細胞をマルチウェル組織培養プレートに分配し、３７℃になるまで１５分間加熱し、その後、１０μＭ ＲＩを含む事前に加温したＥ８培地を各ウェルに添加した。３次元細胞懸濁物を、ＲＩを含むＥ８に２日間（－２日目～０日目）維持した。
【0072】
（３次元ドーパミン作動性ニューロンの分化） ０日目から開始して、ＡＸｇｅｌ中のｈＰＳＣを分化培地に移して、神経系列決定およびその後の中脳ドーパミン作動性ニューロンへの特殊化を誘導した。１１日目から開始して、タンパク質ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびＴＧＦ－βの代わりにＧＤＮＦアゴニストＢＴ－１３（５μＭ）またはＱ５２５（５ｎＭ）を含む成熟培地に、神経前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を移した。培地処方物は表２にしたがった：
【0073】
【表2】
【0074】
【表3】
【0075】
（免疫細胞化学） この実験の終点で、冷却した培地で温かい培地を置換することによって細胞凝集物をＡＸｇｅｌから収集し、１０μｇ／ｍＬラミニンでコーティングした８チャンバ培養スライドにプレートし、インキュベーターで一晩培養して、凝集物をその表面に接着させた。その後、その培養スライドに接着した凝集物を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して１５分間固定した。凝集物をＰＢＳ中で各５分間ずつ２回洗浄し、ＰＢＳ中の０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ＋５％ロバ血清において１０分間インキュベートして細胞を透過処理した。透過処理後、凝集物を５％ロバ血清中で各５分間ずつ５回洗浄し、ＰＢＳ＋ロバ血清中に希釈した目的の一次抗体（希釈の詳細は表３中）とともにインキュベートし、４℃で一晩保管した。一次染色後、凝集物をＰＢＳ中で各５分間ずつ２回洗浄し、対応する二次抗体を含む溶液（希釈の詳細は表３中）中でインキュベートし、３７℃で２時間インキュベートした。二次染色後、凝集物をＰＢＳ中で各５分間ずつ２回洗浄し、培養スライドを、画像化するためのカバーガラスに取り付けた。
【0076】
（顕微鏡法） ＡＸｇｅｌ中に懸濁した生きた細胞凝集物を、ＱＢ３－Ｂｅｒｋｅｌｅｙを通じてＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙで利用可能な透過光顕微鏡法用のＥＶＯＳ ＸＬ Ｃｏｒｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、この実験の間、定期的に画像化した。ＱＢ３－Ｂｅｒｋｅｌｅｙを通じてＨｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙで利用可能なＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ自動共焦点蛍光顕微鏡を使用して、固定し染色し取り付けた細胞凝集物を２０倍対物レンズまたは４０倍対物レンズで画像化した。レーザーの曝露時間および出力を、画像化セット内の蛍光チャネルについて一定に維持した。
【0077】
（結果および考察）
【0078】
ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびＴＧＦ－βをＢＴ－１３またはＱ５２５で置換することが、機能的バイオマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼを発現するｈＰＳＣ由来ニューロンを生成するのには十分である。
【0079】
ｈＰＳＣ由来ドーパミン作動性ニューロンは、多くの齧歯類動物研究および非ヒト霊長類動物研究においてパーキンソン病のための細胞治療剤として安全性および有効性を実証しており、ヒトでの治験が開始されている。それらの顕著な進歩および臨床への橋渡しの見込みを理由として、Ａｄｉｌら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、７：４０５７３（２０１７）において記載されている３次元分化システムにおいて組換えタンパク質ＦＧＦ８、ＴＧＦ－β、ＢＤＮＦ、およびＧＤＮＦを除去し、１０日目から開始してＢＴ－１３またはＱ５２５で置換した（図１（ＢＴ－１３）および図５（Ｑ５２５））、最小タンパク質培地処方物についての重要なユースケースとして、ｈＰＳＣ由来ドーパミン作動性ニューロンの生成を選択した。分化の最初の６日の間ＦＧＦ８を除去することは、その３次元凝集物の増殖にもパターン形成にも影響を与えなかった（図２）。２０日目までに、チロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン生成における律速酵素およびドーパミン作動性ニューロンの機能的バイオマーカー）の発現を、分化中の凝集物すべての内部の神経細胞体で検出した（図３および図５）。ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびＴＧＦ－βをＢＴ－１３またはＱ５２５によって置換することは、分化のためにＧＤＮＦを必要とするすべてのニューロンサブタイプ（表１を参照のこと）に適用可能である。本明細書において提示した結果は、構造的に関連がない２種のＲＥＴアゴニストが各々、多能性細胞からの機能的ドーパミン作動性ニューロンの生成においてＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＴＧＦ－βの代わりになり得、したがって、本明細書において記載されている方法における任意のＧＤＮＦレセプターＲＥＴアゴニストの使用を支持することを、示す。
【0080】
その後、臨床開発および商業化のためにｈＰＳＣ由来ドーパミン作動性ニューロンを製造するために１リットルバイオリアクターまでスケールアップしｃＧＭＰを採用する費用をモデル化し、最小タンパク質ＢＴ－１３置換培地処方物と比較したオリジナルの培地処方物を使用する費用を、比較した（図４）。最適な移植および有効性のための分化の段階は、活発な調査の領域のままである。より短い分化時間は、移植後にオフターゲット分化または望ましくない細胞過剰増殖をもたらし得る、拘束されていない増殖性前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を含む純化されていない細胞集団のリスクを冒し、一方、より長い分化時間は、移植のストレスおよび移植中の細胞死の増加のストレスに対して強靭性がより低い、より成熟した拘束された細胞のリスクを冒す。したがって、本発明者らは、この費用分析に以下の２つのシナリオを含めた：ドーパミン前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の移植のための２５日の分化、およびドーパミン神経芽細胞の移植のための４０日の分化（図４）。ＢＴ－１３を含む最小タンパク質処方物は、より長い分化プロトコルにおいて、材料の費用を５０％よりも多く減少可能である。ＧＤＮＦに代えて低分子で置換することの使用は、ｈＰＳＣ由来ニューロンを生成するための培地の費用を５０％よりも多く減少する。
【0081】
本発明の物質および方法が好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載されている方法に対して変化形が適用され得ることが、当業者には明らかである。当業者にとって明らかであるすべての同様なそのような置換形および改変形は、本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】