特表 2024-543442 肝癌手術後、予後予測のためのバイオマーカーとしてのＳＯＲＤ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-21

(54)【発明の名称】肝癌手術後、予後予測のためのバイオマーカーとしてのＳＯＲＤ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20241114BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

G01N33/574 E

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527707

(86)(22)【出願日】2022-11-11

(85)【翻訳文提出日】2024-06-06

(86)【国際出願番号】 KR2022017789

(87)【国際公開番号】W WO2023085864

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】10-2021-0155200

(32)【優先日】2021-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522040229

【氏名又は名称】アンスティテュ パストゥール コリア

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ ＫＯＲＥＡ

(71)【出願人】

【識別番号】515267910

【氏名又は名称】ジ アサン ファウンデーション

(71)【出願人】

【識別番号】509159333

【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ウルサン ファウンデイション フォー インダストリー コーオペレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】キム カンモ

(72)【発明者】

【氏名】ソ ヘンラン

(72)【発明者】

【氏名】リ スヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム ジンスン

(72)【発明者】

【氏名】ソン ヨンファ

(72)【発明者】

【氏名】キム サンファ

(57)【要約】

本発明は、手術前、肝癌患者から得た血液試料内のＳＯＲＤマーカー、あるいはＡＦＰマーカーを共に検出して、肝癌手術前に手術後、予後を予測するための方法、組成物及びキットに関するものであって、適切な手術対象に対する意思決定を助け、生存率が低いと予想される患者の不要な手術を避けるようにするという利点を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝癌手術後、予後診断に必要な情報を提供するために、肝癌患者から得た血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出する、方法。

【請求項2】

前記情報は、肝癌手術前に提供されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記血液試料は、血清であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法は、
－肝癌患者の血清内に含まれたＳＯＲＤレベルを検出する段階と、
－前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階と、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を診断する情報を提供することを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記方法は、
－肝癌患者の血清内に含まれたＡＦＰレベルを検出する段階と、
－前記血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階と、
をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、そして、前記血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を予測する情報を提供することを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＳＯＲＤまたはＡＦＰレベルの検出は、免疫分析法または免疫染色法によって行われることを特徴とする、請求項４または６に記載の方法。

【請求項9】

前記免疫分析法または免疫染色法は、ＳＯＲＤまたはＡＦＰに特異的に結合する抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用組成物であって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、組成物。

【請求項11】

前記組成物は、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物は、血清タンパク質検出用組成物であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用キットであって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含むものである、キット。

【請求項14】

前記キットは、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記血液試料は、血清であり、
前記キットは、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、または血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上及び血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、肝癌手術後、悪い予後を予測する情報を提供することを指示する説明書を含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２１年１１月１１日付の大韓民国出願第１０－２０２１－０１５５２００号に基づいた優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたあらゆる内容は、本出願に援用される。

【0002】

本発明は、肝癌手術後、予後予測のためのバイオマーカーに関する。

【背景技術】

【0003】

最近のバイオマーカー発掘過程を見れば、開発コストは増加するが、成功比率は減少する傾向を示している。これは、一定部分の基礎研究と臨床研究との間の乖離感に起因する。基礎研究者は、実験の便宜性のために細胞株を使用して実験を進めるが、細胞株で表われる現象は、個体レベルで表われる反応と相当な差異点を示している。

【0004】

このような問題点を解決するために、個体の環境と類似に細胞株を培養する３次元立体培養システムが脚光を浴びており、基礎研究と臨床研究との間の乖離感を狭める方案として台頭しつつある。

【0005】

単層培養（２Ｄ培養、培養細胞が培地上で一層に広がっているもの）とは異なって、細胞を生体と類似している３次元環境で培養することができる３次元立体培養（３Ｄ培養）は、比較的高い効率で細胞及び組織の特異的な機能を長期間保持する特徴が多数の論文で報告されており、毒性薬物に対する敏感度を２Ｄ培養と３Ｄ培養、そして、ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｙｓｔｅｍと比べた時、３Ｄ培養の結果は、驚くほどにｉｎ ｖｉｖｏ ｓｙｓｔｅｍと類似しているということが論文で報告されている。

【0006】

一方、肝癌または肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）は、成人癌で最も平凡な類型であって、手術で切除が不可能な場合は、１年内に死亡する場合が多く、手術的切除を行う場合にも、５年内に５０％以上で再発所見を示すなど、予後が極めて悪い癌の１つとして知られている。このような臨床的現実を考慮する時、癌の予後を早期に予測することができる技術は、癌治療の最も現実的代案であり、次世代肝癌診療のガイドラインとも言える。

【0007】

現在、肝癌関連診断、予後判定、治療評価バイオマーカーとして最もよく知られたマーカーは、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ）－ＩＩなどがあるが、特異度、敏感度で満足できない。肝細胞癌診断において、血中α胎児タンパク質（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）の有用性はよく知られている。進行した肝細胞癌の診断だけではなく、肝硬変症患者で自然経過中、毎年３－１０％で肝細胞癌が発病するために、早期発見のための定期的なＡＦＰ測定が必要である。しかし、ＡＦＰは、肝細胞癌だけではなく、アルコール性肝炎、慢性肝炎や肝硬変症のような良性疾患でも高濃度で上昇するために、擬陽性が多く、実際の陽性率が５０－６０％に過ぎない。ＰＩＶＫＡ－ＩＩは、ＤＣＰ（ｄｅｓ－ｒ－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）、すなわち、凝固作用のない異常プロトロンビンで血清ＡＦＰとは独立して肝細胞癌の診断でそれぞれ４８．２％及び９５．９％の敏感度と特異度とが報告されている。このような生物学的指標は、現在、臨床的に用いられているが、あらゆる肝癌の生物学的特性を反映することができない。

【0008】

また、肝細胞癌手術前に予後を正確に予測することができるバイオマーカー検査は、いまだに開発されることができず、予後因子として意味を有するものがあるとしても、正確度が低くて、まだ選別検査として使われることができない実情である。

【0009】

本明細書の全体にわたって多数の文献が参照され、その引用が表示されている。引用された文献の開示内容は、その全体として本明細書に参考として組み込まれて、本発明が属す技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、肝癌予後を早期診断することができる方法、特に、肝癌患者が手術後、生存または再発する確率を手術前に診断することができる分子診断法を開発しようと努力した。その結果、本発明者らは、血液試料内のＳＯＲＤ（Ｌ－ｉｄｉｔｏｌ－２ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）タンパク質が肝癌手術後、予後と密接な関連があり、手術前に手術後、予後の予測に用いられるということを確認することにより、本発明を完成した。

【0011】

したがって、本発明の目的は、血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出して肝癌手術予後を手術前に診断する方法を提供することである。

【0012】

本発明の他の目的は、血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出する肝癌手術予後早期診断用組成物を提供することである。

【0013】

本発明の他の目的は、血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出する肝癌予後早期診断用キットを提供することである。

【0014】

より具体的に、本発明は、次の具現例を提供する。

【0015】

具現例１．肝癌手術後、予後診断に必要な情報を提供するために、肝癌患者から得た血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出する方法。

【0016】

具現例２．具現例１において、前記情報は、肝癌手術前に提供されることを特徴とする方法。

【0017】

具現例３．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記血液試料は、血清であることを特徴とする方法。

【0018】

具現例４．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記方法は、

【0019】

－肝癌手術前に肝癌患者の血清内に含まれたＳＯＲＤレベルを検出する段階；及び

【0020】

－前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階；

【0021】

を含むことを特徴とする方法。

【0022】

具現例５．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を診断する情報を提供することを特徴とする方法。

【0023】

具現例６．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記方法は、

【0024】

－肝癌手術前に肝癌患者の血清内に含まれたＡＦＰ（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）レベルを検出する段階；及び

【0025】

－前記血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階；

【0026】

をさらに含むことを特徴とする方法。

【0027】

具現例７．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、そして、前記血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を予測する情報を提供することを特徴とする方法。

【0028】

具現例８．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記ＳＯＲＤまたはＡＦＰレベルの検出は、免疫分析法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または免疫染色法（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）によって行われることを特徴とする方法。

【0029】

具現例９．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記免疫分析法または免疫染色法は、ＳＯＲＤまたはＡＦＰに特異的に結合する抗体を用いて行われることを特徴とする方法。

【0030】

具現例１０．血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用組成物であって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含む組成物。

【0031】

具現例１１．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記組成物は、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むことを特徴とする組成物。

【0032】

具現例１２．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記組成物は、血清タンパク質検出用組成物であることを特徴とする組成物。

【0033】

具現例１３．血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用キットであって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含むものであるキット。

【0034】

具現例１４．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記キットは、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むことを特徴とするキット。

【0035】

具現例１５．先行する具現例のうち何れか１つにおいて、前記血液試料は、血清であり、前記キットは、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、または血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上及び血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、肝癌手術後、悪い予後を予測する情報を提供することを指示する説明書を含むことを特徴とするキット。

【0036】

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

【課題を解決するための手段】

【0037】

本発明の１つの観点は、肝癌手術後、予後診断に必要な情報を早期に、望ましくは、肝癌手術前に提供するために、肝癌患者から得た血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出する方法を提供することである。

【0038】

肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）は、アジアで有病率と発生率とが高い最も平凡な類型の原発性肝癌である。肝切除術は、肝細胞癌腫初期または切除可能な肝細胞癌腫患者に選択される治療法であるが、結果は満足できない。高い再発率によって、これらの患者の生存率は依然として低い。肝切除術後、単一肝細胞癌腫（２ｃｍ）患者で５年再発率は、６８％であり、肝細胞癌腫の再発は、患者の長期生存に悪影響を及ぼす。したがって、肝細胞癌腫に対する切除後、再発を予測することは、適切な手術候補の選択に重要である。以前の研究では、手術前、血清α胎児タンパク（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）数値と腫瘍サイズ及び末梢血管侵犯のような腫瘍の多様な組織学的特徴が、切除術後、再発の独立した予測因子であるという点に注目した。しかし、組織学的特徴は、手術前に評価することができないために制限的である。また、ＡＦＰは、肝細胞癌腫を正確に予測する敏感度と特異度とが相対的に低く（Ｔａｔｅｉｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００８（２）：１７－３０）、ＡＦＰと手術結果の関連性に対しては，依然として議論中である状態である（Ｂｌａｎｋ，ｎｃｅ ｏｆ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｎｏｒｍａｌ ｉｓ ｎｏｔ ｔｈｅ ｎｅｗ ｎｏｒｍａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２０１４（２１）：９８６－９９４；Ｓｈｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｓ ｓｅｒｕｍ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｆｔｅｒ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ？ Ａ ｔｅｓｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｒｉｓｋｓ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２０１２（１９）：３６８７－３６９６）。これにより、切除手術以後、肝細胞癌腫患者の結果を予測するための新たな予後マーカーが依然として必要である。

【0039】

多様な肝疾患によって誘発される炎症、壊死、肝再生は、肝細胞癌腫の発生を促進する重要な役割を果たす。肝細胞癌腫の９０％以上が肝損傷及び炎症と関連して発生して炎症関連癌の明らかな例になる。ソルビトールを果糖に転換させるポリオール経路の酵素であるソルビトール脱水素酵素（ＳＯＲＤ）は、肝損傷を反映する。ＳＯＲＤは、ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と類似に肝に主に集中されている。

【0040】

本発明の目的は、肝損傷を反映する酵素であるソルビトール脱水素酵素（ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＳＯＲＤ）数値が、無再発生存（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＲＦＳ）期間と関連があるか否かを確認するものであった。ＳＯＲＤレベル≧１５ｎｇ／ｍＬがさらに短い無再発生存（ＲＦＳ）と関連があるという本発明の発見は、ＨＣＣで如何なる患者が手術にさらに適するかを決定するのに助けになる。

【0041】

一具現例において、本発明の方法は、インビトロ方法である。本発明の方法は、肝癌手術前に肝癌患者の血清内に含まれたＳＯＲＤレベルを検出する段階；及び前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階；を含むことができ、前記血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を診断する情報を提供することができる。

【0042】

特に、望ましい具現例において、血清ＡＦＰ及びＳＯＲＤレベルは、ＲＦＳに対する２種の独立した予後因子として使われる。具体的に、前記方法は、肝癌手術前に肝癌患者の血清内に含まれたＡＦＰレベルを検出する段階；及び前記血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを判別する段階；をさらに含む。

【0043】

患者を手術前、血清ＳＯＲＤ及び／またはＡＦＰレベルに階層化した時、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合、肝癌手術後、悪い予後を診断する情報を提供し、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上でありながら同時に血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である患者は、最も低いＲＦＳ比率として鮮明に不良な予後を示した。

【0044】

このように、手術前、血清ＳＯＲＤは、切除後、肝細胞癌腫に対する効果的な予後因子であり、特に、血清ＡＦＰ数値のように確認時に、手術のための適切な患者選択には臨床的に役に立つと期待される。

【0045】

本発明の予後診断方法において、ＳＯＲＤ及び／またはＡＦＰタンパク質の発現レベルを分析することは、当業者に公知の多様な方法を通じて実施することができる。望ましくは、前記分析は、免疫分析または免疫染色プロトコルによって実施される。

【0046】

前記免疫分析または免疫染色フォーマットは、放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、キャプチャーＥＬＩＳＡ、抑制または競争分析、サンドイッチ分析、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製を含むが、これらに限定されるものではない。前記免疫分析または免疫染色の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０；Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４；及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９などの文献に記載されており、前記文献は、本明細書に参考として組み込まれる。

【0047】

例えば、本発明の方法が放射能免疫分析方法によって実施される場合、放射能同位元素（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）で標識された抗体（前記マーカーに特異的に結合する抗体）が用いられる。

【0048】

本発明の方法がＥＬＩＳＡ方式で実施される場合、本発明の特定の実施例は、（ｉ）分析しようとする未知の試料を固体基質の表面にコーティングする段階；（ii）一次抗体としての前記マーカー特異抗体と前記試料とを反応させる段階；（iii）前記段階（ii）の結果物を酵素が結合された二次抗体と反応させる段階；及び（iv）前記酵素の活性を測定する段階；を含みうる。

【0049】

前記固体基質として適したものは、炭化水素ポリマー（例えば、ポリスチレン及びポリプロピレン）、ガラス、金属またはゲル、またはマイクロタイタープレートなどがある。

【0050】

前記二次抗体に結合された酵素は、発色反応、蛍光反応、発光反応または赤外線反応を触媒する酵素を含むが、これに限定されず、例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ及びシトクロムＰ４５０を含む。前記二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が用いられ、西洋ワサビペルオキシダーゼが用いられる場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムニトラート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、癌フレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ－ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ－ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が用いられる。

【0051】

本発明の方法がキャプチャーＥＬＩＳＡ方式で実施される場合、本発明の特定の実施例は、（ｉ）捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）として前記分子マーカーに対する抗体を固体基質の表面にコーティングする段階；（ii）捕獲抗体と試料とを反応させる段階；（iii）前記段階（ii）の結果物をシグナルを発生させるレーベルが結合されており、前記分子マーカーに対する検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と反応させる段階；及び（iv）前記レーベルから発生するシグナルを測定する段階；を含む。

【0052】

前記検出抗体は、検出可能なシグナルを発生させるレーベルを有しているが、前記レーベルは、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むが、これらに限定されるものではない。多様なレーベル及びレーベリング方法は、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。

【0053】

前記ＥＬＩＳＡ方法及びキャプチャーＥＬＩＳＡ方法で最終的な酵素の活性測定またはシグナルの測定は、当業者に公知の多様な方法によって実施される。もし、レーベルとしてビオチンが用いられた場合には、ストレプトアビジンに、ルシフェラーゼが用いられた場合には、ルシフェリンにシグナルを容易に検出することができる。

【0054】

一方、本発明の方法は、従来の流細胞分析方法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｍ．Ｇ．，ｅｄ．１９９０，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；Ｒｏｂｅｒｔ Ｄａｖｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２３：４７７－４８２（２００５）または免疫親和性精製方法（Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）によって実施される。

【0055】

前記分子マーカーに特異的に結合する抗体は、当業者に通常実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１－５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）またはファージ抗体ライブラリー方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７（１９９１））によって製造可能である。抗体の製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｚｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１に詳細に記載されており、前記文献は，本明細書に参考として組み込まれる。

【0056】

前述した免疫分析過程による最終的なシグナルの強度を分析することにより、肝癌の手術以後、予後を予測することができる。

【0057】

本発明の他の観点は、血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用組成物であって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含むものである組成物を提供することである。

【0058】

望ましい具現例において、前記肝癌手術予後早期診断用組成物は、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むものであり、血清タンパク質検出用組成物である。

【0059】

本発明のさらに他の観点は、血液試料からＳＯＲＤマーカーを検出するための肝癌手術予後早期診断用キットであって、ＳＯＲＤタンパク質に特異的に結合する抗体を含むものであるキットを提供することである。

【0060】

望ましい具現例において、前記肝癌手術予後早期診断用キットは、ＡＦＰタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むものである。

【0061】

前記キットは、血液試料として血清を使用する血清タンパク質検出用キットであり、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、または、望ましくは、血清ＳＯＲＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以上及び血清ＡＦＰレベルが４００ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、肝癌手術後、悪い予後を診断する情報を提供することを指示する説明書を含みうる。

【0062】

本発明の肝癌手術予後早期診断用キットが免疫分析に適用される場合、本発明のキットは選択的に、二次抗体及び標識の基質を含みうる。また、本発明のキットは、前記試薬成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントで製作される。

【発明の効果】

【0063】

本発明は、肝癌患者から得た血液試料内のＳＯＲＤマーカー、望ましくは、ＡＦＰマーカーを共に検出することによって、肝癌手術前に手術後、予後を予測する技術を提供する。したがって、本発明は、適切な手術対象に対する意思決定を助け、生存率が低いと予想される患者で不要な手術を避けるようにする。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1A】治療目的切除術後、肝細胞癌腫患者の無再発生存（ＲＦＳ）に対するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットであって、患者を手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜１５ｎｇ／ｍＬ及び≧１５ｎｇ／ｍＬ）によって、２つのグループに階層化したものを示した図面である。

【図1B】治療目的切除術後、肝細胞癌腫患者の無再発生存（ＲＦＳ）に対するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットであって、患者を手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜５、５－１０、１０－１５、≧１５ｎｇ／ｍＬ）によって、４つのグループに階層化したものを示した図面である。

【図2】多様な患者下位グループで手術前、血清ＳＯＲＤレベルによる無再発生存のフォレストプロットであって、血清ＳＯＲＤレベルが低い（＜１５ｎｇ／ｍＬ）患者と比較して上昇した血清ＳＯＲＤレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ）を有した患者の危険比率を示した図面である。

【図3】ＡＦＰ及びＳＯＲＤの血清レベルに階層化された無再発生存に対するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットであって、性別及びＩＣＧ－Ｒ１５（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｔ １５ ｍｉｎｕｔｅｓ）について調整された危険比率を示した図面である。

【発明を実施するための形態】

【0065】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されないということは当業者にとって自明である。

【0066】

実施例

【0067】

Ｉ．材料及び方法

【0068】

１．研究設計及び母集団

【0069】

２０１１年１月から２０１２年１２月までソウル峨山病院で、肝細胞癌腫で肝切除術を受け、末梢血液をソウル峨山病院バイオ資源センターに保管した１５０人の記録をランダムに抽出して分析に含ませた。患者は、いずれも今後の研究でこの情報を使用するための事前同意書に署名した。除外基準は、（ａ）肝移植を受けた患者、（ｂ）不完全に腫瘍が切除された患者、（ｃ）ＢＣＬＣ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｃｌｉｎｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ）ＢまたはＣ期に分類された患者で構成された。このようなＢＣＬＣ ＢまたはＣ患者は、後で拡張分析に含ませた。究極的に、９２人の患者が１次分析に含まれ、１２０人の患者が拡張分析に含まれた。研究プロトコルは、事前同意書署名に基づいてソウル峨山病院機関審査委員会の承認を受けた（Ｎｏ．２０２０－１１７３）。この研究は、ヘルシンキ宣言によって行われた。

【0070】

２．ＳＯＲＤ測定

【0071】

ＳＯＲＤは、ソウル峨山病院Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒで採取した血清試料で測定した。血清サンプルは、－１９６°Ｃで新鮮冷凍状態で保管された。サンプルを解凍した後、酵素反応を始める前に２４時間の十分な事前培養時間を使用した。これは、血清の代謝産物、特に、ケトンが血清のＳＯＲＤと反応することができるために測定の正確度を高めた。ＳＯＲＤの基準血清レベルは、製造会社の指針に従いＨｕｍａｎ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定された。

【0072】

３．危険要素及び結果

【0073】

Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類による肝機能予備評価、ＡＬＢＩ等級（ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｇｒａｄｅ）及びＩＣＧ－Ｒ１５を含む臨床病理学データを収集した。肝切除術は、Ｃｏｕｉｎｏｕｄ分類によって４個以上の分節が切除された場合、大切除術に分類され、４個未満の分節が切除された場合、小切除術に分類された。腫瘍サイズは、手術標本で最も大きな腫瘍の直径と定義された。

【0074】

関心結果は、無再発生存期間（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＲＦＳ）であった。ＲＦＳは、手術日と再発あるいは死亡日との間の時間間隔と定義された。血清ＡＦＰ（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＩＶＫＡ－ＩＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ－ＩＩ）を含む腫瘍標識子の測定と共にダイナミックコンピュータ断層撮影または磁気共鳴映像を行った（切除術後、１ヶ月、その後、最初の２年間は、３ヶ月間隔に、翌年には、３～６ヶ月ごとに）。あらゆる患者は、手術日から腫瘍再発または死亡日まで、または２０２０年１２月３１日まで追跡された。

【0075】

４．統計分析

【0076】

技術統計は、中央値で表示された（連続及び範疇型変数のそれぞれに対する百分率がある四分位範囲及び数字）。連続型変数は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを使用して比較された。範疇型変数は、Ｆｉｓｈｅｒの正確なテストまたはカイ二乗テストを適切に使用して比較された。事件発生までの時間に対する生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析を使用して決定され、手術前、ＳＯＲＤレベルによるログ順位テストを使用して比較された。ＲＦＳに対するＨＲ（ｈａｚａｒｄ ｒａｔｉｏ）及び９５％ ＣＩ（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して計算された。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数は、ＲＦＳに対する手術前、ＳＯＲＤレベルとその他の予後因子との間に推定された。統計分析は、Ｒ統計ソフトウェアバージョン３．５．０（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ；ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用して行った。あらゆるテストは、両側からなり、ｐ＜０．０５は、統計的に有意なものと見なされた。

【0077】

ＩＩ．結果

【0078】

１．患者の基本特性

【0079】

総９２人の肝細胞癌腫に対する治療目的の肝切除術を受けた患者が研究に含まれた。患者らの中央年齢は、５５．０歳であり、ほとんどが男性（７６／９２、８２．６％）であり、ＨＣＣの病因は、慢性Ｂ型肝炎であり（８２／９２、８９．１％）、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ点数が５（８０／９２、８７．０％）であり、小切除術を受けた（７４／９２、８０．４％）。肝機能特性、治療方法及び臨床病理学的要因を含むその他の人口統計は、表１に示されている。患者を、手術前、血清ＳＯＲＤレベルによって２つのグループに分けた時、７３人は、手術前、ＳＯＲＤが１５ｎｇ／ｍＬ未満であり、１９人は、手術前、ＳＯＲＤが１５ｎｇ／ｍＬ以上であった。あらゆる基準特性は、切除類型を除き、２つのグループ間に類似した。手術前、ＳＯＲＤが１５ｎｇ／ｍＬ以上である患者は、手術前、ＳＯＲＤが１５ｎｇ／ｍＬ未満である患者よりも頻繁に大切除術を受けた。このような研究母集団の基本特性を下記表１に示した。

【0080】

【表1】

【0081】

非正規分布に従う連続変数は、中央値（四分位範囲［ＩＱＲ］）で報告した。範疇型変数は、百分率（％）がある数字で報告した。

【0082】

＊大切除術は、４個以上の肝分節を切除すると定義し、残りは、小切除術と見なした。

【0083】

ＡＦＰ、α－胎児タンパク；ＡＬＢＩ等級、アルブミン－ビリルビン等級；ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノ転移酵素；ＩＣＧ－Ｒ１５、１５分でインドシアニングリーン保有率；ＩＮＲ、国際標準化比率；ＩＵ、国際単位；ＩＱＲ、四分位範囲；ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ビタミンＫ欠乏または拮抗剤－ＩＩによって誘導されたタンパク質；ＳＯＲＤ、ソルビトール脱水素酵素；ＴＡＣＥ、頸動脈動脈化学塞栓術。

【0084】

２．ＳＯＲＤレベルによる再発

【0085】

追跡観察期間、中央値５７．１ヶ月間４３人の患者で再発が観察された。再発した患者と再発していない患者との間に血清ＳＯＲＤ数値中央値が、それぞれ１０．０ｎｇ／ｍＬ及び７．１ｎｇ／ｍＬと有意差があった。再発がある患者とない患者とにおいて、肝機能（Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ点数、アルブミン－ビリルビン（ＡＬＢＩ）等級、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）除去率）を含む他の基本特性とサイズ、顕微鏡的血管侵犯及びエドモンスン等級のような腫瘍要因には有意差がなかった。

【0086】

治療目的切除術後、肝細胞癌腫患者の無再発生存（ＲＦＳ）に対するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットを血清ＳＯＲＤレベルに階層化して得られた無再発生存（ＲＦＳ）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定値は、図１に示した。図１Ａは、手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜１５ｎｇ／ｍＬ及び≧１５ｎｇ／ｍＬ）によって２つのグループに階層化された患者を示し、図１Ｂは、手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜５、５－１０、１０－１５、≧１５ｎｇ／ｍＬ）によって４つのグループに階層化された患者を示す。全体としてＨＣＣの治療目的切除後、中央値及び２年ＲＦＳ比率は、それぞれ１００．３ヶ月及び７６．３％であった。被験者を手術前、血清ＳＯＲＤレベルによって２つのグループ（≧１５ｎｇ／ｍＬ対＜１５ｎｇ／ｍＬ）に階層化した時、血清ＳＯＲＤレベルが低い患者の場合、８３．０％（ｐ＜０．００１）のＲＦＳ比率を有するものと比較して、高いレベルを有したグループは、２年ＲＦＳ比率が５０．１％であって、さらに悪い結果を示した（図１Ａ）。患者を手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜５、５－１０、１０－１５、≧１５ｎｇ／ｍＬ）によって４つのグループに分類した時、ＲＦＳは、レベルが＜１５ｎｇ／ｍＬである患者では類似した（図１Ｂ）。しかし、ＲＦＳは、ＳＯＲＤレベルが≧１５ｎｇ／ｍＬである患者では他のグループと比較して有意に低かった。

【0087】

バルセロナ肝癌（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ；ＢＣＬＣ）Ｂ期またはＣ期の疾患患者が拡張分析に含まれた時、結果は、基準血清ＳＯＲＤレベルが≧１５ｎｇ／ｍＬである患者でさらに悪い結果を有した元分析結果と類似した。

【0088】

３．無再発生存と関連した予後因子

【0089】

単変量及び多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を行って、治療目的の肝切除術後、ＲＦＳに対する予後因子を調査した（下記表２参照）。

【0090】

【表2】

【0091】

＊ 大切除術は、４個以上の肝分節を切除すると定義された。

【0092】

ＡＦＰ、α－胎児タンパク；ＡＬＢＩ等級、アルブミン－ビリルビン等級；ＣＩ、信頼区間；ＨＲ、危険比率；ＩＣＧ－Ｒ１５、１５分でインドシアニングリーン保有率；ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ビタミンＫ欠乏または拮抗剤－ＩＩによって誘導されたタンパク質；ＳＯＲＤ、ソルビトール脱水素酵素。

【0093】

多変量回帰分析で高い血清α胎児タンパク（ＡＦＰ）レベル（≧４００ｎｇ／ｍＬ；危険比率（ＨＲ）、２．０３、９５％信頼区間（ＣＩ、１．０１－４．０７、ｐ＝０．０４７））及び高い血清ＳＯＲＤレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ；ＨＲ、３．４６、９５％ ＣＩ １．７６－６．８１、ｐ＜０．００１）がＲＦＳに対する独立した予後因子と確認された（表２参照）。

【0094】

患者下位グループで手術前、血清ＳＯＲＤレベルによる無再発生存のフォレストプロットは、図２に示したが、血清ＳＯＲＤレベルが低い（＜１５ｎｇ／ｍＬ）患者と比較して高い血清ＳＯＲＤレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ）を有した患者のＲＦＳに対する危険比率を意味する。下位グループ分析が行われた時、手術前、ＳＯＲＤレベルが高い患者は、手術前、ＳＯＲＤレベルが低い患者に比べてあらゆる下位グループでＲＦＳがさらに悪いと確認された（図２参照）。

【0095】

参考までに、ＲＦＳに対する手術前、ＳＯＲＤレベルの効果の大きさは、血清ＡＦＰレベルが低い患者（＜４００ｎｇ／ｍＬ；ＨＲ、２．２２；９５％ ＣＩ、０．９９－５．００；ｐ＝０．０５４）に比べて高い血清ＡＦＰレベル（≧４００ｎｇ／ｍＬ；ＨＲ、８．８７；９５％ ＣＩ、２．１４－３６．７８；ｐ＝０．００３）を有した患者でさらに高かった。これは、手術前、血清ＳＯＲＤレベルが血清ＡＦＰレベルが高い患者で特に結果をよく予測し、血清ＡＦＰレベルと共に再発危険が高い患者をさらに階層化することができるということを示唆する。この結果に基づいて患者を手術前、血清ＳＯＲＤとＡＦＰに階層化した時、ＡＦＰとＳＯＲＤ数値がいずれも上昇した患者は、ＲＦＳ比率が最も低く、予後が明らかに良くなかった（ＨＲ、２２．０８；９５％ ＣＩ、６．９１－７０．５０；ｐ＜０．００１））。他の２つのグループのＲＦＳ比率は、類似していると確認された（ＨＲ、１．４０；９５％ ＣＩ、０．７１－２．７８；ｐ＝０．３０）（図３参照）。

【0096】

４．血清ＳＯＲＤと相関関係がある因子

【0097】

Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数は、ＳＯＲＤレベルと相関関係がある要因を調査するために計算された。ＳＯＲＤレベルは、１５分（ＩＣＧ－Ｒ１５）（ｒ＝０．２７、ｐ＝０．００８）及びＡＳＴ（ｒ＝０．２３、ｐ＝０．０２７）でのインドシアニングリーン保有率と量との相関関係があり、アルブミン（ｒ＝－０．２６）と負の相関関係があった（ｒ＝－０．２６；ｐ＝０．０１１）。ＳＯＲＤレベルとＡＦＰ（ｒ＝０．００２、ｐ＝０．９９）及びビタミンＫ欠乏または拮抗剤－ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）によって誘導されたタンパク質を含む他の腫瘍標識子の間には、相関関係がなかった（ｒ＝０．０８、ｐ＝０．４６）。

【0098】

ＨＣＣの病理学的特性と手術前、血清ＳＯＲＤレベルとの相関関係を評価する時、微小血管侵犯またはＥｄｍｏｎｓｏｎ－Ｓｔｅｉｎｅｒ等級の存在は、手術前、ＳＯＲＤレベルと関連がなかった。しかし、ＡＬＢＩ等級が高い被験者は、血清ＳＯＲＤレベルがさらに高い傾向があった。ＢＣＬＣ ＢまたはＣを有した患者が拡張分析に含まれた時、ＡＬＢＩ等級がさらに高いか、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ点数がさらに高い患者は、手術前、血清ＳＯＲＤレベルがさらに高いと確認された。これは、基準手術前、ＳＯＲＤレベルが肝機能を反映することができるということを示す。

【0099】

ＩＩＩ．討論

【0100】

この研究は、肝細胞癌腫で治療目的切除術を受けた患者で手術前、血清ＳＯＲＤレベルと手術結果との関連性を評価した。手術前、血清ＳＯＲＤレベル（＜１５ｎｇ／ｍＬ）が低い患者の２年ＲＦＳが８３．０％であることに比べて、手術前、血清ＳＯＲＤレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ）が高い患者は、２年に５０．１％と有意にさらに予後が良くなかった。多変量Ｃｏｘ回帰分析時に、高いＳＯＲＤレベルは、ＨＣＣに対する完治目的切除術後、ＲＦＳと関連した統計的に有意な予後因子と確認された。参考までに、下位グループ分析で手術前、ＳＯＲＤレベルは、特に低い血清ＡＦＰレベル（＜４００ｎｇ／ｍＬ）を有した患者と比較して高い血清ＡＦＰレベル（≧４００ｎｇ／ｍＬ）を有した患者で手術結果をよく予測した。患者を手術前、血清ＡＦＰ及びＳＯＲＤレベルに階層化した時、手術前、ＡＦＰ及びＳＯＲＤレベルがいずれも上昇した患者は、鮮明に不良な予後を示した。

【0101】

ＳＯＲＤは、身体の多様な組織に存在するが、主に肝から見つけられる酵素である。一般的に、血清ＳＯＲＤ数値は低いが、肝損傷がある場合、ＡＬＴ及びＡＳＴと共に数値が増加する。これは、上昇したＳＯＲＤレベルが肝細胞損傷を示すということを示唆する。慢性肝細胞損傷及び肝細胞壊死は、筋線維芽細胞の活性化を起こして肝線維症と肝硬変症とを誘発する。肝硬変症で持続的な肝細胞損傷は、テロメアを破壊し、活性酸素種を放出し、細胞微小環境で傍分泌信号を変更することにより、発癌に寄与する。また、以前のｐｒｏｔｅｏｍｉｃ研究では、肝細胞癌腫患者の肝組織でＳＯＲＤ発現が低いほど生存率が低いという事実が明らかになった（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ．Ａｖａｉｌａｂｅ ｏｎｌｉｎｅ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１４０２６３－ＳＯＲＤ／ｐａｔｈｏｌｏｇｙ／ｌｉｖｅｒ＋ｃａｎｃｅｒ（ａｃｃｅｓｓｅｄ ｏｎ ２６ Ｊｕｌｙ）。

【0102】

肝でＳＯＲＤ活性が低いか、ない時、ソルビトールは、肝細胞に蓄積される。ソルビトールを含む糖アルコールがＳＯＲＤ活性の不足によって肝に蓄積されれば、肝癌発生に寄与することができる。また、ＳＯＲＤ活性の不足が癌細胞でポリオール経路のような当該経路を活性化させれば、ソルビトールの追加蓄積に寄与し、これは、ＨＣＣの不良な分化の促進に寄与することができる。

【0103】

本発明において、高い血清ＡＦＰレベル（≧４００ｎｇ／ｍＬ）及び高い血清ＳＯＲＤレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ）は、多変量Ｃｏｘ回帰分析を基盤とするＲＦＳに対する２種の独立した予後因子と確認されたが、本研究で手術結果を予測するためのＳＯＲＤの効果の大きさは、ＡＦＰよりもさらに大きかった。興味深くも、相互作用（下位グループ）分析は、ＳＯＲＤとＡＦＰとが手術結果予測に相互作用し、ＡＦＰ数値が上昇した患者でＳＯＲＤの予測能力が向上するということを示した。この結果は、ＳＯＲＤが完治目的のＨＣＣ切除術を受けた肝細胞癌腫患者でＡＦＰの予後能力を補完できるということを示唆する。実際に、ＳＯＲＤ及びＡＦＰ数値がいずれも上昇した患者は、６ヶ月未満のＲＦＳ中央値であって、深刻な予後を示した。

【0104】

完治目的切除術後、肝細胞癌腫の再発に対するよく知られた他の予後因子としては、微小血管侵犯と腫瘍サイズとがある。しかし、現在、研究でこのような組織学的要因は、ＲＦＳと有意な関連がなかった。これは、いずれもＢＣＬＣ ０期またはＡ期であり、小さな腫瘍（中央値、３．０ｃｍ）がある患者の特性のためである。進行性ＢＣＬＣ病期と大きな腫瘍サイズを有した患者は、完治目的の切除が治療の標準ではないために、この研究に含まれなかった。以前の研究では、特に、初期段階の肝細胞癌腫患者で微小血管侵犯が長期間の手術結果に影響を及ぼさないと言及した。

【0105】

我々が分かる限り、肝細胞癌腫に対する他の予後因子と血清ＳＯＲＤ数値との相関関係を調査した以前の研究はない。この研究でＳＯＲＤレベルと腫瘍サイズ、ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ－ＩＩのような腫瘍予後因子との間には、有意な関連性がなかった。しかし、ＳＯＲＤレベルは、肝損傷または肝機能を反映するＡＳＴレベル、ＩＣＧ－Ｒ１５及びＡＬＢＩ等級と量との関連があった。ＳＯＲＤレベルは、ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ－ＩＩのような既存の他の腫瘍標識子と比較して予後を予測し、肝機能を反映するという利点がある。しかし、肝機能を評価するＳＯＲＤレベルの有効性を確認するためには、追加研究が必要である。それにも拘らず、組織サンプルとは異なって、血液サンプルを得ることがさらに容易であるために、ＳＯＲＤは、ＨＣＣ患者の臨床でさらに効率的であり、有用な予後予測因子として活用されうる。

【0106】

結論的に、手術前、血清ＳＯＲＤの上昇したレベル（≧１５ｎｇ／ｍＬ）は、治療目的の切除術後、肝細胞癌腫患者で悪い予後と有意に関連した。しかも、手術前、血清ＳＯＲＤ及びＡＦＰレベルは、共に活用時に結果をさらによく予測することができ、ＳＯＲＤ（≧ １５ｎｇ／ｍＬ）及びＡＦＰ（≧４００ｎｇ／ｍＬ）レベルがいずれも上昇した患者で特に悪い予後を予測することができた。このような結果に基づいて、臨床で血清ＳＯＲＤを単独で、またはＡＦＰレベルと共に使用すれば、手術的治療が適切な患者を選別するに当たって、意思決定を助け、手術後、生存率が低いと予想される患者では、不要な手術を避けることができると期待する。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】