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特表2024-543466バチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】バチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/75 20060101AFI20241114BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241114BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/75 Z
C12N15/31 ZNA
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527833
(86)(22)【出願日】2022-11-11
(85)【翻訳文提出日】2024-07-04
(86)【国際出願番号】 US2022079687
(87)【国際公開番号】W WO2023091878
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】63/279,813
(32)【優先日】2021-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509240479
【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク
(74)【代理人】
【識別番号】110003579
【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(72)【発明者】
【氏名】マ、ツェン
(72)【発明者】
【氏名】フリッシュ、ライアン
(72)【発明者】
【氏名】ポール、ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ドイグ、スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】ロビダ－スチューブ、ステーシー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA60
(57)【要約】
本開示のある特定の実施形態は、強化されたタンパク質生産性表現型を含む組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、そのような組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を構築するための組成物及び方法などに関する。本明細書に記載の組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、好適な条件下で増殖／培養／発酵される場合、目的タンパク質の強化された産生のために特に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた、ｐｒｓＡ遺伝子カセット。
【請求項2】
下流（３’）ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）に作動可能に連結した上流（５’）ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含む、請求項１に記載のカセット。
【請求項3】
前記ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列が、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含む、請求項２に記載のカセット。
【請求項4】
前記ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含む、請求項２に記載のカセット。
【請求項5】
目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生し、且つａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、組み換え型バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
【請求項6】
前記同じＰＯＩを産生する対照バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比べて、増加した量の前記ＰＯＩを産生し、前記対照細胞が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた前記同じｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、請求項５に記載の組み換え型細胞。
【請求項7】
前記同じＰＯＩを産生する対照バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比べて、増加した量の前記ＰＯＩを産生し、前記対照細胞が、前記同じｐｒｓＡ遺伝子カセットの導入された非組み込みコピーを含む、請求項５に記載の組み換え型細胞。
【請求項8】
カセットが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）を含む、請求項５に記載の組み換え型細胞。
【請求項9】
カセットが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含むプロモーター配列を含む、請求項５に記載の組み換え型細胞。
【請求項10】
前記ＰＯＩが酵素である、請求項５に記載の組み換え型細胞。
【請求項11】
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞において、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、ＰＯＩを産生するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得るか、又は構築することと、前記細胞中にａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットを導入することと、前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で、前記組み換え型細胞を発酵することと、を含む、方法。
【請求項12】
前記組み換え型細胞が、前記同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて、増加した量の前記ＰＯＩを産生し、前記対照細胞が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた前記同じｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記組み換え型細胞が、前記同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて、増加した量の前記ＰＯＩを産生し、前記対照細胞が、前記同じｐｒｓＡ遺伝子カセットの導入された非組み込みコピーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記カセットが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記カセットが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記ＰＯＩが酵素である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２７９，８１３号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２７９，８１３号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、工業用タンパク質産生などの分野に関する。本開示のある特定の実施形態は、タンパク質生産性が強化された表現型を含む組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（菌株）、そのような組み換え型（改変された）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を構築するための組成物及び方法などに関する。
【0003】
配列表の参照
「ＮＢ４２００９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０２２年１１月１０日に作成され、サイズは１０３ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「ＮＢ４２００９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０２２年１１月１０日に作成され、サイズは１０３ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、それらの優れた発酵特性と高い収量（例えば、培養物１リットル当たり最大２５グラム；Ｖａｎ Ｄｉｊｌ ａｎｄ Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業用関連タンパク質を産生するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞は、食品、織物、洗濯用途、医療機器洗浄、医薬品産業などに必要とされる酵素（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼなど）のそれらの産生について良く知られている。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生物（例えば、内毒素としても知られるリポ多糖類（ＬＰＳ））を全く含まないタンパク質を産生するので、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（ＥＦＳＡ）の「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの産生物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【0005】
したがって、微生物宿主細胞を介したタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体など）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、１つ以上の目的タンパク質を産生及び分泌させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては非常に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合は、タンパク質収量の小さな改善が極めて重要な意味を有する。例えば、多くの異種タンパク質の発現は、収率などに関して依然として予測不能である。本明細書で以降に記載されるように、本開示は、強化されたタンパク質産生能力を有するバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞）を得て構築するための高度に望ましい、未だ満たされていない要求に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書で以降に記載されるように、本開示のある特定の態様は、本明細書に例示される組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株などの組み換え型（改変された）微生物宿主細胞を設計し、構築するための組成物及び方法に関し、この組み換え型菌株は、好適な条件下で培養される場合、目的タンパク質の強化された産生のために、特に有用であり得る。したがって、本開示のある特定の実施形態は、とりわけ、１つ以上の定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座における導入及び組み込みのために好適な１つ以上のｐｒｓＡ遺伝子発現カセット、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列、ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（オープンリーディングフレーム）、対照細胞、組み換え型細胞、目的タンパク質、目的タンパク質をコードする発現構築物（カセット）などを提供する。
【0007】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｐｒｓＡ遺伝子発現カセットを提供する。ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子カセットは、下流の（３’）ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）に作動可能に連結した上流（５’）ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含む。関連する態様では、ｐｒｓＡ遺伝子カセットは、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットと称されてもよい。他の関連する態様では、本開示は、所望の宿主細胞の定義されたゲノム遺伝子座における組み込みに好適な２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを提供する。ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列は、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含み、及び／又はｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含む。
【0008】
したがって、ある特定の他の実施形態は、目的タンパク質を産生し、定義された遺伝子座で組み込まれた、導入された２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。ある特定の態様では、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生し、且つ定義されたゲノム遺伝子座（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ遺伝子座）で組み込まれた、導入された２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを有する組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて、増加した量のＰＯＩを産生し、対照細胞は、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた同じｐｒｓＡ遺伝子カセットを含むか、又は対照細胞は、同じｐｒｓＡ遺伝子カセットの非組み込みコピーを含む。ある特定の実施形態では、目的タンパク質（ＰＯＩ）は酵素である。
【0009】
ある特定の他の実施形態は、一般に、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を構築することと、この細胞に定義されたゲノム遺伝子座（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ遺伝子座）において、組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを細胞中に導入することと、ＰＯＩの産生に好適な条件下で、組み換え型細胞を発酵することと、を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞において、目的タンパク質を産生するための方法を提供する。特定の態様は、同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量のＰＯＩを産生する組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関し、対照細胞は、ｃａｔＨ遺伝子座において、組み込まれた同じ２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを含むか、又は対照細胞は、同じｐｒｓＡ遺伝子カセットの非組み込みコピーを含む。方法のある特定の実施形態では、ｐｒｓＡ遺伝子カセットは、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含み、及び／又は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを含む。方法のある特定の他の実施形態では、目的タンパク質（ＰＯＩ）は酵素である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）プライマー配列８６０である。
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）プライマー配列８６０である。
【0011】
配列番号２は、合成オリゴヌクレオチドプライマー配列８６１である。
【0012】
配列番号３は、合成オリゴヌクレオチドプライマー配列１６３６である。
【0013】
配列番号４は、合成オリゴヌクレオチドプライマー配列１６３７である。
【0014】
配列番号５は、合成オリゴヌクレオチドフォワードプライマー配列である。
【0015】
配列番号６は、合成オリゴヌクレオチドリバースプライマー配列である。
【0016】
配列番号７は、合成オリゴヌクレオチドフォワードプライマー配列である。
【0017】
配列番号８は、合成オリゴヌクレオチドリバースプライマー配列である。
【0018】
配列番号９は、合成オリゴヌクレオチドフォワードプライマー配列である。
【0019】
配列番号１０は、合成オリゴヌクレオチドリバースプライマー配列である。
【0020】
配列番号１１は、合成ＤＮＡ編集テンプレートである。
【0021】
配列番号１２は、「ｐＲＦ１００５」という名称の配列検証済みプラスミド分離物である。
【0022】
配列番号１３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｓｅｒＡ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
【0023】
配列番号１４は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｌｙｓＡ遺伝子のＯＲＦ配列である。
【0024】
配列番号１５は、ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミドのＤＮＡ配列である。
【0025】
配列番号１６は、ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子のＤＮＡ配列である。
【0026】
配列番号１７は、最初の９ｂｐ及び最後の９ｂｐを除いて、ｒｇｈＲ２遺伝子ＣＤＳの欠失を有するΔｒｇｈＲ２対立遺伝子の１５２３ｂｐのＰＣＲ産物である。
【0027】
配列番号１８は、インタクトなｒｇｈＲ２対立遺伝子の１９２２ｂｐのＰＣＲ産物である。
【0028】
配列番号１９は、ΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子のＤＮＡ配列である。
【0029】
配列番号２０は、ｄｌｔＡ－２遺伝子ＣＤＳの７００ｂｐの欠失を有するΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子の２０６７ｂｐのＰＣＲ産物である。
【0030】
配列番号２１は、インタクトなｄｌｔＡ－２対立遺伝子の２７６７ｂｐのＰＣＲ産物である。
【0031】
配列番号２２は、導入された（２ｎｄ）コピーｐｒｓＡカセットの組み込みのために、ａｍｙＬ遺伝子座を標的とする線状ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列である。
【0032】
配列番号２３は、ａｍｙＬ遺伝子座に対して、上流の（５’）ホモロジーアームのＤＮＡ配列である。
【0033】
配列番号２４は、ｃａｔＨプロモーターのＤＮＡ配列である。
【0034】
配列番号２５は、ＣａｔＨタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【0035】
配列番号２６は、配列番号２８のｓｐｏＶＧターミネーターに作動可能に連結された配列番号２７のｃａｔＨターミネーターから構成されるデュアルターミネーター配列をコードするＤＮＡ配列である。
【0036】
配列番号２７は、ｃａｔＨターミネーターをコードするＤＮＡ配列である。
【0037】
配列番号２８は、ｓｐｏＶＧターミネーターをコードするＤＮＡ配列である。
【0038】
配列番号２９は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐｒｓＡプロモーターのＤＮＡ配列である。
【0039】
配列番号３０は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰｒｓＡタンパク質をコードするＯＲＦ配列である。
【0040】
配列番号３１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬターミネーターのＤＮＡ配列である。
【0041】
配列番号３２は、ａｍｙＬ遺伝子座に対して、下流の（３’）ホモロジーアームである。
【0042】
配列番号３３は、導入された（２ｎｄ）コピーａｍｙＬ組み込みカセットａｍｙＬ：：ｃａｔＨ－ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡのＤＮＡ配列である。
【0043】
配列番号３４は、２６９８ｂｐの配列である。
【0044】
配列番号３５は、３５６２ｂｐの配列である。
【0045】
配列番号３６は、レポーター「アミラーゼ１」（Ａｍｙ１）タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【0046】
配列番号３７は、合成ｐ３プロモーターのＤＮＡ配列である。
【0047】
配列番号３８は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲのＤＮＡ配列である。
【0048】
配列番号３９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
【0049】
配列番号４０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーターのＤＮＡ配列である。
【0050】
配列番号４１は、合成ｐ２プロモーターのＤＮＡ配列である。
【0051】
配列番号４２は、レポーター「アミラーゼ２」（Ａｍｙ２）タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【0052】
配列番号４３は、配列番号３０によってコードされた天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰｒｓＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【0053】
詳細な説明
本明細書に記載されるように、本開示のある特定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法に関する。特に、本開示のある特定の態様は、組み換え型細胞が増殖され／培養され／発酵される場合に、目的タンパク質の強化された産生のために特に有用である組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（菌株）を提供する。より詳細には、本明細書で以降に記載されるように、且つ以下の実施例で更に記載されるように、本出願人は、驚くべきことに、定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座で組み込まれた、導入されたｐｒｓＡ遺伝子発現カセットの２ｎｄコピーを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットの同じ導入された２ｎｄコピーを有する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量の目的タンパク質を産生することができることを観察した。したがって、本開示のある特定の態様は、とりわけ、１つ以上の予め定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座における導入及び組み込みのために好適な１つ以上のｐｒｓＡ遺伝子発現カセット、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列、ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（オープンリーディングフレーム）、対照細胞、組み換え型細胞、目的タンパク質をコードする発現構築物（カセット）などを提供する。
本明細書に記載されるように、本開示のある特定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法に関する。特に、本開示のある特定の態様は、組み換え型細胞が増殖され／培養され／発酵される場合に、目的タンパク質の強化された産生のために特に有用である組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（菌株）を提供する。より詳細には、本明細書で以降に記載されるように、且つ以下の実施例で更に記載されるように、本出願人は、驚くべきことに、定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座で組み込まれた、導入されたｐｒｓＡ遺伝子発現カセットの２ｎｄコピーを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットの同じ導入された２ｎｄコピーを有する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量の目的タンパク質を産生することができることを観察した。したがって、本開示のある特定の態様は、とりわけ、１つ以上の予め定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座における導入及び組み込みのために好適な１つ以上のｐｒｓＡ遺伝子発現カセット、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列、ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（オープンリーディングフレーム）、対照細胞、組み換え型細胞、目的タンパク質をコードする発現構築物（カセット）などを提供する。
【0054】
Ｉ．定義
本明細書に記載される組成物及び方法を考慮して、以下の用語及び語句が定義される。本明細書で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。
本明細書に記載される組成物及び方法を考慮して、以下の用語及び語句が定義される。本明細書で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。
【0055】
本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0056】
特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにも更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。但し書きの例としては、「ｗｈｅｒｅｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｗｈｅｒｅｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ２ｎｄ ｃｏｐｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｓＡ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ（組み換え型細胞が、同じ目的タンパク質を産生する対照細胞と比べて、増加した量の目的タンパク質を産生し、対照細胞が、ｐｒｓＡ遺伝子カセットの非組み込み２ｎｄコピーを含む）」などが挙げられる。
【0057】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他の一部の実施形態の何れかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法は何れも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【0058】
本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者には公知である「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種が含まれ、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、それらに限定されない。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属は、再分類されている種、例えば、以下に限定されないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むことが意図されている。
【0059】
本明細書で使用する場合、用語「組み換え型」又は「非天然」は、少なくとも１つの操作された遺伝子変化を有するか、若しくは異種核酸分子の導入によって改変されている生物、微生物、細胞、核酸分子、若しくはベクターを指し、又は異種若しくは内在性核酸分子又は遺伝子の発現が制御され得るように変更されている細胞（例えば、微生物細胞）を指す。組み換え型はまた、１つ以上のそのような改変を有する非天然細胞に由来するか、又は非天然細胞の子孫である細胞を指す。遺伝子変化としては、例えば、タンパク質をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、核酸分子の付加、欠失、置換、又は細胞の遺伝物質の他の機能的変化が挙げられる。例えば、組み換え型細胞は、天然の（野生型）細胞内で同一又は相同の形態では見出されない遺伝子又は他の核酸分子を発現し得るか（例えば、融合又はキメラタンパク質）、或いは、過剰発現される、過小発現される、最小限で発現される、又は全く発現されないなどの内在性遺伝子の変更された発現パターンを提供し得る。「組み換え」、「組み換える（こと）」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であり、この集合体は、キメラ遺伝子を発生させる。
【0060】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列、及びそれらの断片若しくは部分、並びにセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。本明細書に記載のポリヌクレオチド（若しくは核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。
【0061】
したがって、用語「遺伝子」は、あるタンパク質のコーディング配列の全て又は一部を含む、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びにコーディング配列（ＣＤＳ）を含み得る。
【0062】
本明細書で使用する場合、用語「コーディング配列」（略して「ＣＤＳ」）は、その（コードされた）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定するヌクレオチド配列を指す。コーディング配列の境界は、一般にオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」）によって決定され、それは、通常、ＡＴＧ開始コドンで開始する。コーディング配列には、通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組み換え型ヌクレオチド配列が含まれる。
【0063】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コーディング配列（ＣＤＳ）は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよく（例えば、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター）、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよく、合成核酸セグメントを含んでいてもよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。更に、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることは確認されている。
【0064】
本明細書で使用する場合、「ｐＲＦ８７９」と名付けられたプラスミドは、国際公開第２０２１１４６４１１号パンフレットに記載される配列番号７８のｐＲＦ８７９プラスミドを意味する。
【0065】
本明細書で使用する場合、「ｐＺＭ２２１」と名付けられたプラスミドは、国際公開第２０２１１４６４１１号パンフレットに記載される配列番号８４のｐＺＭ２２１プラスミドを意味する。
【0066】
本明細書で使用する場合、「ｐＲＦ１００５」と名付けられたプラスミド（配列番号１２）は、ｃａｔＨ遺伝子座を標的化するＣａｓ９プラスミドであり、配列番号１１の編集テンプレートを含む。
【0067】
本明細書で使用する場合、「野生型（天然）ｐｒｓＡ」は、「野生型（天然）ＰｒｓＡタンパク質」をコードする。
【0068】
本明細書で使用する場合、野生型（天然）バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター」は、配列番号２９に記載されるＤＮＡ配列を含む。
【0069】
本明細書で使用する場合、野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ＰｒｓＡ遺伝子コーディング（ＣＤＳ）」は、配列番号３０に記載されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、天然ＰｒｓＡタンパク質をコードする。ある特定の態様では、機能的ＰｒｓＡタンパク質は、「タンパク質シャペロン」機能又は活性を含む。
【0070】
ある特定の実施形態では、野生型ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０に対して約８０％以上の（ヌクレオチド）配列同一性を含む。他の態様では、野生型ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。他の実施形態では、野生型ｐｒｓＡ遺伝子プロモーターは、配列番号２９に対して約８５％の配列同一性を含む。ある特定の態様では、野生型ｐｒｓＡ遺伝子プロモーターは、配列番号２９に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。
【0071】
本明細書で使用する場合、本開示のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、内在性（天然の）「ｐｒｓＡ遺伝子」（すなわち、天然のＰｒｓＡタンパク質をコードする）を含み、天然ＰｒｓＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、組み込み発現カセット）が同じバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入される場合、導入されたポリヌクレオチドは、本明細書では、「第２の（２ｎｄ）コピーｐｒｓＡ遺伝子」と称され得る。
【0072】
本明細書で使用する場合、語句「２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子」は、配列番号３０のＯＲＦに対して少なくとも８０％の同一性を有するｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを含む導入されたポリヌクレオチドを意味する。ある特定の態様では、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号２９のｐｒｓＡプロモーター領域に対して少なくとも８５％の同一性を含む機能的ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター領域から発現され得る。ある特定の実施形態では、導入された２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子は、下流（３’）ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結した少なくとも上流（５’）ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含む（例えば、５’－［ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター］－［ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳ］－３’）。
【0073】
本明細書で使用する場合、「ＢＦ１４０」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレットに一般的に記載されるように、ｓｅｒＡ１遺伝子の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）及び導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含む。
【0074】
本明細書で使用する場合、「ＢＦ４１２」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレットに一般的に記載されるように、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）及び欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子を含む。
【0075】
本明細書で使用する場合、「ＢＦ７７２」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、国際公開第ＷＯ２０２１／１４６４１１号パンフレットに一般的に記載されるように、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、及び欠失されたｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）を含む。
【0076】
本明細書で使用する場合、「ＺＭ１３１９」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、欠失されたｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）、及びａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）（例えば、５’－［ｐｒｓＡプロモーター］－ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＯＲＦ）］－３’）を含む。
【0077】
本明細書で使用する場合、「ＺＭ１３２２」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）分離株は、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、欠失されたｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）、及びｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）（例えば、５’－［ｐｒｓＡプロモーター］－ｐｒｓＡ遺伝子コーディング（ＯＲＦ）］－３’）を含む。
【0078】
本明細書で使用する場合、「ＺＭ１３２５」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、欠失されたｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）、及びａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）（例えば、５’－［ｐｒｓＡプロモーター］－ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＯＲＦ）］－３’）を含む。
【0079】
本明細書で使用する場合、「ＢＦ６１３」と名付けられたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）分離株は、ｓｅｒＡ１の欠失（ΔｓｅｒＡ１；配列番号１３）、ｌｙｓＡの欠失（ΔｌｙｓＡ；配列番号１４）、導入されたｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、欠失されたｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）、及びｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）（例えば、５’－［ｐｒｓＡプロモーター］－ｐｒｓＡ遺伝子コーディング（ＯＲＦ）］－３’）を含む。
【0080】
本明細書で使用する場合、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株「ＬＤＮ６６５」は、Ａｍｙ１の２つのコピーと、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡの２ｎｄコピーとを含むアミラーゼ１（Ａｍｙ１）レポーター菌株である。
【0081】
本明細書で使用する場合、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株「ＺＭ１３５１」は、Ａｍｙ１の２つのコピーと、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡの２ｎｄコピーとを含むアミラーゼ１（Ａｍｙ１）レポーター菌株である。
【0082】
本明細書で使用する場合、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株「ＷＡＡＡ５７」は、Ａｍｙ２の２つのコピーと、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡの２ｎｄコピーとを含むアミラーゼ２（Ａｍｙ２）レポーター菌株である。
【0083】
本明細書で使用する場合、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株「ＷＡＡＡ１９７」は、Ａｍｙ２の２つのコピーと、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡの２ｎｄコピーとを含むアミラーゼ２（Ａｍｙ２）レポーター菌株である。
【0084】
本明細書で使用する場合、用語「アミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）１」又は「アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）１」タンパク質（略して、「Ａｍｙ１」）はアミラーゼレポータータンパク質を指し、Ａｍｙ１レポーターをコードするＤＮＡは、配列番号３６に記載されている。
【0085】
本明細書で使用する場合、用語「アミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）２」又は「アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）２」タンパク質（略して、「Ａｍｙ２」）はアミラーゼレポータータンパク質を指し、Ａｍｙ２レポーターをコードするＤＮＡは、配列番号４２に記載されている。
【0086】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。したがって、本開示のある特定の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性（例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．））細胞又はグラム陰性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【0087】
本明細書で使用する場合、「改変」細胞及び「娘」細胞などの語句は、改変細胞が由来する親細胞中に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換え型細胞を指す。ある特定の態様では、「非改変」細胞、「親」細胞及び／又は「対照」細胞などの語句は、本開示の改変細胞と比較されるか、又はそれに関連する場合に使用され得る。
【0088】
本明細書で使用する場合、対照細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現が、「改変」細胞における同じＰＯＩの発現と比較される場合、「改変」及び「改変」細胞が、同一条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。ある特定の実施形態では、目的タンパク質の増加した量は、内在性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の目的タンパク質（例えば、天然プロテアーゼ、天然アミラーゼなど）であってもよく、又は本開示の組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において発現される異種目的タンパク質（例えば、組み換え型プロテアーゼ、組み換え型アミラーゼなど）であってもよい。ある特定の態様では、ＰＯＩは、培養培地（培養液）中に分泌される。
【0089】
本明細書で使用する場合、タンパク質産生を「増加させる」又は「増加した」タンパク質産生は、増加した量の産生されたタンパク質（例えば、目的のタンパク質）を意味する。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。特定の実施形態では、目的タンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。タンパク質産生の増加は、例えば、親細胞と比較して、より高い最大レベルのタンパク質若しくは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性、セルラーゼ活性など）として、又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。
【0090】
本明細書で使用する場合、用語「改変」及び「遺伝子改変」は互換的に使用され、以下を含む：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／又は（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ以上の遺伝子のランダム変異誘発。
【0091】
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。したがって、用語「発現」には、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などのポリペプチドの産生に関与する任意の工程が含まれる。
【0092】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、そのコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【0093】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、分泌リーダー（即ち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコーディング配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接してリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【0094】
本明細書で使用する場合、「関心対象のタンパク質コーディング配列の遺伝子に連結した関心対象の遺伝子の発現を制御する機能的プロモーター配列（又はそれらのオープンリーディングフレーム）」は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞におけるコーディング配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は、５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーターなど）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域が、タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している、ポリヌクレオチドを対象としている。
【0095】
本明細書で使用する場合、「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、配列内又はその下流（３’非コーディング配列）に位置し、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。
【0096】
本明細書で使用する場合、用語「導入すること（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターなどを「細菌細胞に導入すること」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入すること」などの句で使用する場合、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための当該技術分野で知られる方法を含み、こうした方法としては、以下に限定されないが、プロトプラスト融合、天然又は人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション、接合などが挙げられる。
【0097】
本明細書で使用する場合、「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換え型ＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、一般的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ又は遺伝子）を細胞に挿入することによって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換対象の細胞には天然に存在しない配列）であってもよい。したがって、形質転換は、一般的に、ＤＮＡが、染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来性ＤＮＡを宿主細胞に導入することを指す。
【0098】
本明細書で使用する場合、「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」、及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡを指す。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接された入来配列を更に含む。更に別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
【0099】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の破壊」又は「遺伝子破壊」は互換的に使用され、宿主細胞が機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生することを実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。したがって、本明細書で使用する場合、遺伝子破壊としては、フレームシフト突然変異、未成熟終止コドン（すなわち、機能的タンパク質が作製されないように）、タンパク質内部欠失の活性を排除又は低減させる置換（機能的タンパク質が作製されないように）、コーディング配列を破壊する挿入、転写に必要な天然プロモーターとオープンリーディングフレームとの間の作動可能な連結を除去する突然変異などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0100】
本明細書で使用する場合、「入来配列」は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）染色体に導入されるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１つ以上の目的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（即ち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。いくつかの実施形態では、入来配列は、１つ以上の目的タンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。いくつかの実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために遺伝子に挿入され得る。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。更に別の実施形態では、入来配列は、２つのホモロジーボックスを含む。
【0101】
本明細書で使用する場合、「ホモロジーボックス」は、宿主細胞染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、ホモロジーボックスは、本発明に従って、欠失する、破壊される、不活化される、ダウンレギュレートされる等の遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコーディング領域と約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指示し、染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。ある特定の態様では、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ；１ｂｐ～５．０ｋｂ；１ｂｐ～２．５ｋｂ；１ｂｐ～１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスはまた、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、ホモロジーボックスに隣接されるが、ここでホモロジーボックスは、遺伝子のコーディング領域に直接隣接する核酸配列を含む。
【0102】
本明細書で使用する場合、用語「選択可能マーカーコーディングヌクレオチド配列」は、宿主細胞内で発現することができ、選択可能マーカーの発現が、発現した遺伝子を含有する細胞に、対応する選択的作用物質の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチド配列を指す。
【0103】
本明細書で使用する場合、用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が目的入来ＤＮＡを取り込めたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。一般的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
【0104】
「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体上に所在するマーカーである。存在する選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者にはよく知られている。上記のように、マーカーは抗微生物剤耐性マーカー（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｅｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ及びｎｅｏＲ）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムに存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体組み込みカセット及び組み込みプラスミドの染色体増幅を含む実施形態において、特に有用である。本明細書により有用な他のマーカーとしては、セリン（例えば、ｓｅｒＡ）、リジン（例えば、ｌｙｓＡ）、トリプトファン、及び検出マーカー（例えば、β－ガラクトシダーゼ）などの栄養要求性マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0105】
本明細書で使用する場合、宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」、又はバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
【0106】
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、典型的には細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運び、及び通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外エレメントを指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構造に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。
【0107】
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、且つ多くの細菌及び一部の真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは宿主細胞のゲノム中に組み込まれるようになり、いくつかの実施形態では、プラスミドは親細胞中に存在し、娘細胞内で失われる。
【0108】
本明細書で使用する場合、「形質転換カセット」は、遺伝子（又は、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
【0109】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間を輸送するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」（すなわち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。
【0110】
「発現ベクター」は、細胞内に異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【0111】
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換え又は合成的に生成される核酸構築物（すなわち、これらは、上述したベクター若しくはベクターエレメントである）を指す。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も含まれる。ある特定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。
【0112】
本明細書で使用する場合、「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に突然変異を導入する際に使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。例えば、ある特定の実施形態では、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞は、それらの中に１つ以上の「ターゲティングベクター」を導入することによって改変される（例えば、形質転換される）。
【0113】
本明細書で使用する場合、用語「目的タンパク質」又は「ＰＯＩ」は、組み換え型宿主細胞において、発現することが所望される目的とするタンパク質を指す。ある特定の態様では、改変された宿主細胞は、同じＰＯＩを発現する対照細胞と比べて、ＰＯＩを増加したレベルで発現する。したがって、本明細書で使用するＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質などであってよい。ある特定の態様では、本開示の改変細胞は、対照細胞と比べて、増加した量の異種ＰＯＩを産生する。特定の実施形態では、改変細胞によって産生された増加した量のＰＯＩは、対照細胞と比べて、少なくとも約０．５％～１．０％増加されている（又は高い）。
【0114】
語句「目的遺伝子」（略して、「ＧＯＩ」）は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸（遺伝子、ＯＲＦ、ポリヌクレオチド）に言及する場合に本明細書で使用される。「目的タンパク質（ＰＯＩ）」をコードする「目的遺伝子（ＧＯＩ）」は、天然型遺伝子、変異遺伝子又は合成遺伝子であってよい。
【0115】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語はまた、自然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって、改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
【0116】
ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリザーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせ）などの商業的に関連する工業用の目的タンパク質をコードする。
【0117】
本明細書で使用する「バリアント」ポリペプチドは、一般的には組み換えＤＮＡ技術による、１個以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失による親（若しくは参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。バリアントポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドと異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。
【0118】
好ましくは、バリアントポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、「バリアント」ポリヌクレオチドは、バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、この「バリアントポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の程度の配列相同性／同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（又は、その相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、バリアントヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。
【0119】
本明細書で使用する場合、用語「突然変異」は、核酸配列内の任意の変更又は変化を指す。点突然変異、欠失突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、スプライシング突然変異などを含む数種のタイプの突然変異が存在する。突然変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株を通しての継代によって）行われ得る。
【0120】
本明細書で使用する場合、ポリペプチド若しくはその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸とまた別のアミノ酸との取り換え（すなわち、置換）を意味する。
【0121】
本明細書で定義する場合、「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
【0122】
本明細書で定義する場合、「異種」遺伝子、「非内在性」遺伝子又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物中では見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子（若しくはＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する場合、用語「外来」遺伝子（複数可）は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
【0123】
本明細書で定義する場合、「異種制御配列」は、天然では目的遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内在性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一又は異なる制御配列／ＤＮＡコーディング（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
【0124】
本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内在性であっても外来性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、一般的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【0125】
用語「由来する」には、用語「～から生じた」、「～から得られた」、「～から入手可能な」及び「から作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。
【0126】
本明細書で使用する場合、用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド又は相同ポリペプチドに関する。２つ以上のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、それらの相同のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味している。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列が、本明細書で定義するように相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）を使用して２つの配列をアラインさせることにより好適に調べることができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）。ＤＮＡ配列比較のために以下の設定でＧＡＰを使用：ＧＡＰ作成ペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３。
【0127】
本明細書で使用する場合、用語「同一性パーセント（％）」は、配列アライメントプログラムを使用してアラインさせたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
【0128】
本明細書で使用する場合、用語「比生産性」は、所定の期間にわたって、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生するタンパク質の総量を指す。
【0129】
本明細書で定義する場合、用語「精製された」、「単離された」又は「濃縮された」は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、それが本来結合している、天然型の一部若しくは全部の構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを指す。そのような単離若しくは精製は、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質又は酵素を除くための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、又は勾配による分離などの当該技術分野で知られる分離技術によって実施することができる。精製又は単離した生体分子組成物には、その後更に、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。
【0130】
本明細書で使用する場合、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。ある特定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及びホモロジーボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各ホモロジーボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどこに新規な構築物が組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
【0131】
ＩＩ．ＡＭＹＬ遺伝子座からの第２のコピーＰＲＳＡ遺伝子の発現はタンパク質産生を強化させる
ＰｒｓＡタンパク質をコードするバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子は、いくつかの菌体外タンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）の分泌を減少させる非致死的突然変異によって最初に定義された（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ ａｎｄ Ｓａｒｖａｓ，１９８８）。ＰｒｓＡタンパク質はシャペロンとして作用することが記載されており、細胞膜を超えて移動する（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。国際公開第１９９４／１９４７１号パンフレットはグラム陽性細菌発現系を記載しており、ここでは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）の導入されたコピーが、様々な上流プロモーター及びソースを使用して過剰発現され（過剰産生）、特にＰｒｓＡタンパク質過剰産生が、野生型よりも多量であることを意味することを明記している。同様に、米国特許公開第２０１０／０２５５５３４号パンフレットは、強力な上流プロモーターに作動可能に連結し、且つａｂｒＢ、ｄｌｔＡ、ｄｌｔＢ、ｄｌｔＣ、ｄｌｔＤ及びｄｌｔＥから選択される１つ以上の欠失又は不活性化遺伝子を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳの導入されたコピーの過剰発現を記載している。これらの特許公開の結論として、組み換え型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株におけるｐｒｓＡ（ＰｒｓＡ）の過剰発現（過剰産生）は、導入されたｐｒｓＡ遺伝子過剰発現カセットを含まないＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株と比較して、強化されたタンパク質産生をもたらした。最近では、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレットが、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入されたコピー（２ｎｄコピー）を含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を記載しており、導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ遺伝子は、天然ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結した天然ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター領域（例えば、５’－［天然ｐｒｓＡ ｐｒｏ］－［天然ｐｒｓＡ ＯＲＦ］－３’）を含んでいた。この公開に記載されるように、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株が、対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株と比較して、増加した量のレポータータンパク質を産生した。
ＰｒｓＡタンパク質をコードするバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子は、いくつかの菌体外タンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）の分泌を減少させる非致死的突然変異によって最初に定義された（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ ａｎｄ Ｓａｒｖａｓ，１９８８）。ＰｒｓＡタンパク質はシャペロンとして作用することが記載されており、細胞膜を超えて移動する（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。国際公開第１９９４／１９４７１号パンフレットはグラム陽性細菌発現系を記載しており、ここでは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）の導入されたコピーが、様々な上流プロモーター及びソースを使用して過剰発現され（過剰産生）、特にＰｒｓＡタンパク質過剰産生が、野生型よりも多量であることを意味することを明記している。同様に、米国特許公開第２０１０／０２５５５３４号パンフレットは、強力な上流プロモーターに作動可能に連結し、且つａｂｒＢ、ｄｌｔＡ、ｄｌｔＢ、ｄｌｔＣ、ｄｌｔＤ及びｄｌｔＥから選択される１つ以上の欠失又は不活性化遺伝子を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳの導入されたコピーの過剰発現を記載している。これらの特許公開の結論として、組み換え型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株におけるｐｒｓＡ（ＰｒｓＡ）の過剰発現（過剰産生）は、導入されたｐｒｓＡ遺伝子過剰発現カセットを含まないＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株と比較して、強化されたタンパク質産生をもたらした。最近では、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレットが、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入されたコピー（２ｎｄコピー）を含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を記載しており、導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ遺伝子は、天然ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結した天然ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター領域（例えば、５’－［天然ｐｒｓＡ ｐｒｏ］－［天然ｐｒｓＡ ＯＲＦ］－３’）を含んでいた。この公開に記載されるように、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株が、対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株と比較して、増加した量のレポータータンパク質を産生した。
【0132】
一般的に上述したように、当節された又は可変的なｐｒｓＡ遺伝子発現レベルの対照的な結果は、プロモーター及び遺伝子座の選択が重要なことであることを示している。特に、以下の表１で示されるように、本出願人は、アミラーゼレポータータンパク質を発現し（表１、第２欄）、及び導入された２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む（表１、第１欄）組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株をスクリーニングした。
【表1】
【0133】
例えば、表１に提示されるように、異種プロモーター（例えば、異種プロモーター（ｐｒｏ）１－４；略して「５’－［ｈｅｔ ｐｒｏ＿１］」など）の制御下で、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを発現する組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株のタンパク質生産性（アミラーゼ活性）を、その天然プロモーター（すなわち、５’－［ｐｒｓＡ ｐｒｏ］）の制御下で、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを発現する組み換え型菌株のタンパク質生産性と比較した。表１で明らかなように、タンパク質生産性は、その天然ｐｒｓＡプロモーターの制御下で、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを発現する菌株の生産性と比較する場合、異種プロモーターの制御下で、２ｎｄコピーｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳを発現する菌株において低減し、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳの発現を推進するためのプロモーター領域のチョイス／選択が重要であり、容易に予測できる取り組みであることを更に実証している。
【0134】
より詳細には、本明細書で以降に記載され、以下の実施例で記述されるように、本出願人は、驚くべきことに、最適化され且つ定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ発現カセットの導入された２ｎｄコピーを含む組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞が、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ発現カセットの同じ導入された２ｎｄコピーを含む対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量のレポータータンパク質を産生することができることを観察した。したがって、本開示のある特定の態様は、本明細書に記載され、企図された１つ以上のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノム遺伝子座を標的とし、そこで組み込むように特別に設計されたｐｒｓＡ組み込み（発現）構築物に関する。
【0135】
より具体的には、以下に記載される実施例１及び２は、一般に、定義されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノム遺伝子座での標的化ｐｒｓＡ遺伝子組み込み（２ｎｄコピー）に好適なプラスミドの設計及び構築、２ｎｄコピーｐｒｓＡ組み込みカセットを試験し、スクリーニングするのに好適な組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株の設計及び構築などを記載する。特に、実施例１及び２に一般的に記載されるように、ｐｒｓＡ（組み込み）カセットの導入された２ｎｄコピーを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞が構築され、ここではｐｒｓＡカセットが、ｃｓｔＨ遺伝子座又はａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた。
【0136】
実施例３に記載されるように、レポータータンパク質（Ａｍｙ１）をコードする発現カセットが、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３（ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡカセットを含む）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＺＭ１３２５（ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡカセットを含む）中に導入された。例えば、表６（実施例３）に示されるように、２つのＡｍｙ１産生菌株（ＬＤＮ６６５及びＺＭ１３５１）を、標準的な小スケール条件を使用してＡｍｙ１の産生についてアッセイを行い、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを含む菌株（ＬＤＮ６６５）と比べて、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを有する菌株（ＺＭ１３５１）において、Ａｍｙ１産生の改善を実証している。
【0137】
実施例４に更に記載されるように、第２のアミラーゼレポータータンパク質（Ａｍｙ２）をコードする発現カセットを、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５中に導入した。例えば、表７（実施例４）に示されるように、２つのＡｍｙ２産生菌株（ＷＡＡＡ５７及びＷＡＡＡ１９７）を、標準的な小スケール条件を使用してＡｍｙ２の産生についてアッセイを行い、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを含む菌株（ＷＡＡＡ５７）と比べて、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた２ｎｄコピーｐｒｓＡカセットを含む菌株（ＷＡＡＡ１９７）において、Ａｍｙ２産生の改善を実証している。
【0138】
したがって、本開示のある特定の態様は、本明細書に記載のｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳへの配列同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）、及び／又は本明細書に記載のｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列への相同性を含むｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列に関する。ある特定の関連する態様では、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、活性（機能的）ＰｒｓＡタンパク質をコードする。例えば、ある特定の実施形態では、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号４３の成熟ＰｒｓＡアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％の同一性を含むＰｒｓＡタンパク質をコードする。ある特定の態様では、配列番号４３のＰｒｓＡタンパク質に対して、少なくとも５０％の同一性を含むＰｒｓＡタンパク質は、機能的又は活性ＰｒｓＡタンパク質として更に定義される。
【0139】
ＩＩＩ．組み換え型ポリヌクレオチド及び分子生物学
一般的に本明細書で上述され、以降に記載されるように、本開示のある特定の態様は、目的タンパク質を産生する組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株に関する。より詳細には、以下の実施例に提示されるように、組み換え型ポリヌクレオチド（ベクター、発現カセットなど）、組み換え型（改変された）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株などは、日常的な分子生物学技法及び微生物学技法並びに当業者に既知の方法を使用して容易に構築される。したがって、本開示は一般に、組み換え遺伝学の分野におけるルーチンの手法に頼っている。本開示で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が含まれる。同様に、当業者は、ポリヌクレオチド配列を細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）など）中に導入するための好適な方法を十分に認識している。
一般的に本明細書で上述され、以降に記載されるように、本開示のある特定の態様は、目的タンパク質を産生する組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株に関する。より詳細には、以下の実施例に提示されるように、組み換え型ポリヌクレオチド（ベクター、発現カセットなど）、組み換え型（改変された）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株などは、日常的な分子生物学技法及び微生物学技法並びに当業者に既知の方法を使用して容易に構築される。したがって、本開示は一般に、組み換え遺伝学の分野におけるルーチンの手法に頼っている。本開示で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が含まれる。同様に、当業者は、ポリヌクレオチド配列を細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）など）中に導入するための好適な方法を十分に認識している。
【0140】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、とりわけ、定義された遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ発現カセットの導入された２ｎｄコピーを含む組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、目的タンパク質を産生し、且つ定義された遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ発現カセットの導入された２ｎｄコピーを含む組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の設計及び構築のための組成物及び方法、増加した量の目的タンパク質を産生するための組成物及び方法などに関する。
【0141】
ある特定の実施形態では、ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）は、配列番号３０のＤＮＡ配列に対して相同性を含む。例えば、ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０のｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに対して、少なくとも約５０％の同一性を含む。ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０のｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％及び最大１００％の同一性を含む。ある特定の実施形態では、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳは、配列番号３０のｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳに対して、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％又は１００％の同一性を含む。
【0142】
ある特定の他の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列は、配列番号２９のＤＮＡ配列に対して相同性を含む。例えば、ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーターは、配列番号２９のｐｒｓＡ遺伝子プロモーターに対して、少なくとも約５０％の同一性を含む。ある特定の態様では、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーターは、配列番号２９のｐｒｓＡ遺伝子プロモーターに対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％及び最大１００％の同一性を含む。ある特定の実施形態では、ｐｒｓＡ遺伝子プロモーターは、配列番号２９のｐｒｓＡ遺伝子プロモーターに対して、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％又は１００％の同一性を含む。
【0143】
したがって、本開示のある特定の態様は、ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳの２ｎｄコピーをコードする組み換え型ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド、ベクター、ＤＮＡ構築物など）、組み換え型宿主細胞、発現カセット、組み換え型ポリヌクレオチドを構築するための組成物及び方法、組み換え型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞などに関する。
【0144】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（遺伝子、ベクター、プラスミド、ＤＮＡエレメントなど）は遺伝子改変されてもよく、遺伝子改変としては、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又は遺伝子若しくはそのＯＲＦ内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子崩壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御（例えば、ＲＮＡの干渉）、（ｆ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子の特異的突然変異誘発及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発が含まれる。ある特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当該技術分野において周知の方法、例えば、挿入、破壊、置換、又は欠失を使用して、遺伝子の発現を増加させることによって、及び／又は遺伝子の発現を減少させる（又は消失させる）ことによって構築される。改変又は不活化対象の遺伝子部分は、例えば、コーディング領域（ＣＤＳ、ＯＲＦ）、又はコーディング領域を発現させるために必要とされる調節（ＤＮＡ）エレメントであり得る。そのような調節配列又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼす部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター配列、転写活性化因子配列などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0145】
遺伝子欠失技術は、遺伝子（複数可）の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するように構築されているプラスミドを用い、相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、ｐＥ１９４などの温度感受性プラスミド上で、このプラスミドが細胞内で定着できる許容温度で第２の選択可能マーカーと会合して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入され得る。続いて、細胞を非許容温度にシフトさせて、相同フランキング領域の１つで染色体に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択する。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーによる選択によって達成される。組み込み後、第２の相同フランキング領域での組み換え事象を、細胞を選択せずに数世代にわたって許容温度にシフトさせることによって刺激する。細胞をプレーティングして単一コロニーを得て、このコロニーを両方の選択可能マーカーの消失について試験する。したがって、当業者は、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコーディング配列及び／又は遺伝子の非コーディング配列中のヌクレオチド領域を容易に同定し得る。他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、それらの転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。
【0146】
或る特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって構築される。例えば、天然の目的タンパク質（又はその目的の機能的バリアントタンパク質）をコードする野生型遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆｌ又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによって、それらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによってＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集を介して改変されてもよく、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化されたＤＮＡ切断はＤＮＡ修復のための基質となり、提供された編集テンプレート（例えば、天然の遺伝子プロモーター配列を異種プロモーターで置き換えるための編集テンプレート）と組み換えることができる。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、目的の遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、目的遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対してＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＮＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。
【0147】
ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集テンプレートを利用できるように、ヌクレオチド編集テンプレートが提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’側は、編集テンプレートを生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’側に融合させることができ、そのテンプレートは、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集テンプレートは、多数の様々な方法を使用して細胞に同時に送達され得る。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。
【0148】
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、化学的変異誘発及び転座を含むが、それらに限定されない当該技術分野において周知の方法を使用して、ランダム変異誘発又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が変更されている変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることによって実施され得る。更に、変異誘発は、これらの変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。このような薬剤を使用する場合、変異誘発は、一般的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で変異誘発対象の親細胞をインキュベートするステップ、及び遺伝子の減少した発現を示す、又は発現を示さない変異細胞を選択するステップによって実施される。
【0149】
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を迂回するためにＰＣＲ融合を使用する、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡ構築物の作成などの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットは、（１）統合的プラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コーディング配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム突然変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増加させること、（５）二重交差組み込みを最適化すること、（６）部位特異的突然変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。当業者は、ポリヌクレオチド配列を最近細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））中に導入するために好適な方法を十分に認識している。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入、並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法が知られており、本開示における使用に適している。形質転換法は、本開示のＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するのに特に好ましい。
【0150】
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、直接的に形質転換させられる（すなわち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡ構築物を増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために中間細胞が使用されない）。ＤＮＡ構築物の宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなく、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られるそれらの物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、以下に限定されないが、塩化カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。追加の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換される。更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において既知の方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から欠失、又は実質的に切除される。いくつかの実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、一方、固有の染色体領域を除去する。
【0151】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子の発現において使用するためのプロモーター及びプロモーター配列、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はそれらのバリアント配列は、一般に当業者に知られている。本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において機能的であるように選択され、これらには、天然型プロモーター配列、合成プロモーター配列、及び／又はそれらのプロモーター配列の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されず、そのプロモーター（配列）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中で作動可能／機能的である。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中で異種（外来）タンパク質を産生することができる合成（操作された）プロモーターの例としては、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）及びＣａｓｔｉｌｌｏ－Ｈａｉｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）によって記載されるプロモーターシステムが挙げられるが、これらに限定されない。他の特定の例示的なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター、変異ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｔｕｆプロモーター、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃｉｔＺプロモーター、又はバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞に由来する任意の他の機能的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、目的タンパク質又はｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳの発現を推進するために使用される。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において広範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。
【0152】
ＩＶ．目的タンパク質の産生ためのバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞の発酵
ある特定の実施形態では、本開示は、目的タンパク質を産生する組み換え型微生物細胞を提供する。より詳細には、ある特定の態様は、一般的に、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する改変された（組み換え型）微生物細胞に関する。したがって、特定の実施形態は、目的タンパク質の産生のための微生物細胞を増殖、培養、発酵などに関する。一般に、当該技術分野でよく知られた発酵方法が、微生物細胞を発酵させるために使用される。
ある特定の実施形態では、本開示は、目的タンパク質を産生する組み換え型微生物細胞を提供する。より詳細には、ある特定の態様は、一般的に、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する改変された（組み換え型）微生物細胞に関する。したがって、特定の実施形態は、目的タンパク質の産生のための微生物細胞を増殖、培養、発酵などに関する。一般に、当該技術分野でよく知られた発酵方法が、微生物細胞を発酵させるために使用される。
【0153】
いくつかの実施形態では、細胞を、バッチ発酵条件下で増殖させるか、又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行わせる。一般に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することは頻繁に行われる。バッチ系の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。バッチ培養内で、細胞は静的誘導期を経て高増殖対数期に進み、最終的に増殖速度が低下又は停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
【0154】
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。一般的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系内で実際の基質濃度を測定することは困難であるので、このためｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの排気ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ発酵及び流加発酵は、当該技術分野において一般的であり、よく知られている。
【0155】
連続発酵は規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために等量の馴化培地を同時に除去するオープンシステムである。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。
【0156】
培養／発酵は一般に、水性無機塩培地、有機増殖因子、炭素及びエネルギー源物質、分子状酸素、及び、当然に、使用される微生物宿主の出発接種材料を含む増殖培地中で行われる。
【0157】
適切な微生物増殖を確実にし、微生物変換プロセスで細胞による炭素及びエネルギー源の吸収を最大にし、発酵培地において最大細胞密度で最大細胞収率を達成するには、炭素及びエネルギー源、酸素、吸収可能な窒素、並びに微生物接種材料に加えて、好適な量の無機栄養素を適切な割合で供給する必要がある。
【0158】
水性無機培地の組成は、当該技術分野で知られているように、使用する微生物及び基質に部分的に依存して、広範囲にわたって変えることができる。無機培地には、窒素に加えて、好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及びナトリウムが、好適な可溶性の吸収可能なイオン性の複合形態で含まれ、また、好ましくは、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及びヨウ素などのいくつかの微量元素も、これもまた好適な可溶性の吸収可能な形態で含まれるが、これらは全て当該技術分野で知られていることである。
【0159】
発酵反応は、微生物種が盛んに増殖するのを助けるのに有効な好適な酸素分圧で、発酵槽の内容物を維持するために提供される、空気、酸素富化空気、又は実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素含有ガスによって必要な分子状酸素が供給される好気的プロセスである。
【0160】
発酵温度はいくらか変化することができるが、大部分の微生物細胞に対して、温度は、一般的に、約２０℃～４０℃の範囲内であろう。
【0161】
微生物はまた、吸収可能な窒素源を必要とする。吸収可能な窒素源は、任意の窒素含有化合物、又は微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出することができる任意の化合物であり得る。タンパク質加水分解物などの、様々な有機窒素源化合物を使用することができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素などの安価な窒素含有化合物、及びリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は他の様々なアンモニウム化合物などの各種アンモニウム塩を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模な操作に便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）をバブリングして使用することができる。同時に、そのようなアンモニアは、ｐＨ制御を助けるために用いることもできる。
【0162】
水性微生物発酵物（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０～８．０の例示的な範囲であるべきである。微生物の好ましいｐＨ範囲は、使用する培地及び特定の微生物にある程度まで依存し、したがって、当業者ならば容易に決定できることであるが、培地の変化と共にいくらか変化する。
【0163】
制限因子として炭素含有基質を制御することができるようなやり方で醗酵を行うことが好ましく、それによって炭素含有基質の細胞への良好な転換が提供され、相当量の未転換基質による細胞の汚染が回避される。後者は、水溶性基質では、微量の残存物は容易に洗い流せるので、問題にならない。しかしながら、非水溶性基質の場合には問題となる可能性があり、好適な洗浄工程などの追加の生成物処理工程が必要になる。
【0164】
上記のように、このレベルに到達する時間は重要ではなく、特定の微生物及び実施する発酵プロセスによって変化し得る。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度の決定方法、及び所望の炭素源レベルが達成されているか否かの決定方法は、当該技術分野ではよく知られている。
【0165】
必要ならば、水性無機培地を発酵槽に供給する前に、炭素及びエネルギー源物質の一部又は全部及び／又はアンモニアなどの吸収可能な窒素源の一部を水性無機培地に加えることができる。
【0166】
反応器に導入される流れの各々は、所定の速度に制御するか、炭素及びエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽排ガス中の酸素又は二酸化炭素、乾燥細胞重量により測定可能な細胞密度、透光度などの、モニタリングによって決定可能な必要性に応じて制御することが好ましい。炭素及びエネルギー源の効率的な利用と一致して、可能な限り迅速な細胞増殖速度を得、基質の供給に対して可能な限り高い微生物細胞の収率を得るために、各種材料の供給速度は変化させることができる。
【0167】
バッチ又は好ましい流加操作においては、全ての装置、反応器、又は発酵手段、槽又は容器、配管、付随する循環又は冷却装置などは、最初に、通常、蒸気を使用して、例えば、約１２１℃で少なくとも約１５分間、滅菌する。次いで、酸素を含む必要な栄養素の全て、及び炭素含有基質を存在下で、滅菌した反応器に選択された微生物の培養物を接種する。使用する発酵槽の種類は重要ではない。
【0168】
Ｖ．目的タンパク質
目的タンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩのバリアントであってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質（即ち、タンパク質は四次（４°）構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニット）から構成される。ある特定の態様では、本開示の組み換え型細胞は、１つ以上の内在性目的タンパク質、１つ以上の異種目的タンパク質、それらの組み合わせなどを発現／産生する。
目的タンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩのバリアントであってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質（即ち、タンパク質は四次（４°）構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニット）から構成される。ある特定の態様では、本開示の組み換え型細胞は、１つ以上の内在性目的タンパク質、１つ以上の異種目的タンパク質、それらの組み合わせなどを発現／産生する。
【0169】
ある特定の実施形態では、改変細胞は、親（又は対照）細胞と比べて増加した量のＰＯＩを産生することができ、増加した量のＰＯＩは、少なくとも約０．０１％の増加、少なくとも約０．１０％の増加、少なくとも約０．５０％の増加、少なくとも約１．０％の増加、少なくとも約２．０％の増加、少なくとも約３．０％の増加、少なくとも約４．０％の増加、少なくとも約５．０％の増加、又は５．０％超の増加である。ある特定の態様では、増加した量のＰＯＩは、酵素活性をアッセイすることによって、タンパク質機能をアッセイすることによって、比生産性（Ｑｐ）をアッセイ／定量することによってなどで決定される。例えば、当業者は、タンパク質の発現、産生、分泌などの検出、アッセイ、測定などのために、当該技術分野において既知の日常的な方法及び技法を利用することができる。
【0170】
ある特定の実施形態では、ＰＯＩ又はそのバリアントＰＯＩは、酵素である。ある特定の態様では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アリールエステラーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスホジエステラーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0171】
関連する態様では、ＰＯＩ又はそのバリアントＰＯＩは、酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｕｍｂｅｒ）：ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６から選択される酵素である。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＯＩは、オキシドレダクターゼ酵素である。他の実施形態では、ＰＯＩは、トランスフェラーゼ酵素である。他の実施形態では、ＰＯＩは、ヒドロラーゼ酵素である。他の実施形態では、ＰＯＩは、リアーゼ酵素である。ある特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、イソメラーゼ酵素である。更に他の実施形態では、ＰＯＩはリガーゼ酵素である。
【0172】
ある特定の態様では、酵素は、プロテアーゼ（例えば、中性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ）及びアルカリ（又は「セリン」）プロテアーゼである。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）サブチリシンタンパク質（酵素）は、本開示において使用される典型的なセリンプロテアーゼである。多種多様なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）サブチリシン、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７及びサブチリシン３０９が同定及び配列決定されている。本開示のいくつかの実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、変異体（ｍｕｔａｎｔ）（すなわち、バリアント）プロテアーゼを産生する。したがって、ある特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、プロテアーゼをコードする発現構築物を含む。ある特定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、アミラーゼをコードする発現構築物を含む。多種多様なアミラーゼ酵素及びその変異体が、当業者に知られている。
【0173】
他の実施形態では、改変細胞内で発現及び産生されるＰＯＩ又はバリアントＰＯＩは、ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ Ｅ７など）、及びそれらのバリアント、それらの断片などである。他のタイプの目的タンパク質（又はその変異体）は、食品又は作物に栄養価を提供することのできるタンパク質であり得る。非限定的な例としては、抗栄養因子の形成を阻害できる植物タンパク質、及びより望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物より高いリジン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。
【0174】
上記で簡潔に述べたように、細胞内及び細胞外で発現されたタンパク質の活性を検出及び測定するための当業者に知られる様々なアッセイがある。特に、プロテアーゼについては、２８０ｎｍでの吸光度として測定される、又はフォリン法を使用して比色定量により測定されるカゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある。他の典型的なアッセイとしては、スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－パラ－ニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットは、本明細書に記載されるアミラーゼ活性のために有用なＣｅｒａｌｐｈａ α－アミラーゼ活性アッセイを開示している。宿主細胞中の目的タンパク質の分泌レベルを決定し、発現されたタンパク質を検出するための手段には、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体何れかを用いるイムノアッセイの使用が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【0175】
ＶＩ．例示的な実施形態
本明細書に開示する組成物及び方法の非限定的な実施形態は、以下の通りである。
本明細書に開示する組成物及び方法の非限定的な実施形態は、以下の通りである。
【0176】
１．バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた、ｐｒｓＡ遺伝子カセット。
【0177】
２．下流（３’）ｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）に作動可能に連結した上流（５’）ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列を含む、実施形態１に記載のカセット。
【0178】
３．ｐｒｓＡ遺伝子プロモーター配列が、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含む、実施形態２に記載のカセット。
【0179】
４．ｐｒｓＡ遺伝子ＣＤＳが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含む、実施形態２に記載のカセット。
【0180】
５．目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生し、且つａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、組み換え型バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
【0181】
６．同じＰＯＩを産生する対照バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比べて、増加した量のＰＯＩを産生し、対照細胞が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた同じｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、実施形態５に記載の組み換え型細胞。
【0182】
７．同じＰＯＩを産生する対照バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比べて、増加した量のＰＯＩを産生し、対照細胞が、非組み込みｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、実施形態５に記載の組み換え型細胞。
【0183】
８．カセットが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）を含む、実施形態５に記載の組み換え型細胞。
【0184】
９．カセットが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含むプロモーター配列を含む、実施形態５に記載の組み換え型細胞。
【0185】
１０．ＰＯＩが酵素である、実施形態５に記載の組み換え型細胞。
【0186】
１１．バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、ＰＯＩを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得るか、又は構築することと、細胞中にａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子カセットを導入することと、ＰＯＩの産生のために好適な条件下で組み換え型細胞を発酵することと、を含む、方法。
【0187】
１２．組み換え型細胞が、同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて、増加した量のＰＯＩを産生し、対照細胞が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた同じｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、実施形態１１に記載の方法。
【0188】
１３．組み換え型細胞が、同じＰＯＩを産生する対照Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて、増加した量のＰＯＩを産生し、対照細胞が、非組み込みｐｒｓＡ遺伝子カセットを含む、実施形態１１に記載の方法。
【0189】
１４．カセットが、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を含むｐｒｓＡ遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）を含む、実施形態１１に記載の方法。
【0190】
１５．カセットが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の同一性を含むプロモーター配列を含む、実施形態１１に記載の方法。
【0191】
１６．ＰＯＩが酵素である、実施形態１１に記載の方法。
【実施例】
【0192】
本発明の特定の態様は、以下の実施例に照らして更に理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。本明細書で使用される、標準の組み換え型ＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。本明細書に記載されるように、全ての発現カセットは、国際公開第２０１９／０４０４１２号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、宿主菌株中に形質転換された。
【0193】
実施例１
ｃａｔＨ遺伝子座を標的化するプラスミドｐＲＦ１００５の構築
本実施例では、ｃａｔＨ遺伝子座を標的化するＣａｓ９プラスミドｐＲＦ１００５を構築し、これは、編集テンプレート（配列番号１１）を含む。プライマー８６０（配列番号１；表２）及び８６１（配列番号２；表２）を使用して、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるｐＲＦ９４６からのＰＣＲによってプラスミド骨格を増幅させ、編集テンプレートインサートを、プライマー１６３６（配列番号３；表２）及び１６３７（配列番号４；表２）を使用して、合成テンプレートからのＰＣＲによって増幅させた。２つの部分を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを使用して、製造業者の指示に従って組み立てて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。配列が確認された単離物を、ｐＲＦ１００５（配列番号１２）として保存した。プラスミドｐＲＦ１００５を用いて、ｃａｔＨ遺伝子をａｍｙＬ遺伝子座において欠失させた。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いてプラスミドを増幅し、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プラスミドを形質転換用に好適な基質にした。
ｃａｔＨ遺伝子座を標的化するプラスミドｐＲＦ１００５の構築
本実施例では、ｃａｔＨ遺伝子座を標的化するＣａｓ９プラスミドｐＲＦ１００５を構築し、これは、編集テンプレート（配列番号１１）を含む。プライマー８６０（配列番号１；表２）及び８６１（配列番号２；表２）を使用して、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるｐＲＦ９４６からのＰＣＲによってプラスミド骨格を増幅させ、編集テンプレートインサートを、プライマー１６３６（配列番号３；表２）及び１６３７（配列番号４；表２）を使用して、合成テンプレートからのＰＣＲによって増幅させた。２つの部分を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを使用して、製造業者の指示に従って組み立てて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。配列が確認された単離物を、ｐＲＦ１００５（配列番号１２）として保存した。プラスミドｐＲＦ１００５を用いて、ｃａｔＨ遺伝子をａｍｙＬ遺伝子座において欠失させた。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いてプラスミドを増幅し、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プラスミドを形質転換用に好適な基質にした。
【表2】
【0194】
実施例２
改変宿主菌株の構築
本明細書に記載の組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、任意の好適なＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主を使用して、当業者によって構築することができる（例えば、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレット及び同第２０２１／１４６４１１号パンフレットを参照されたい；各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ある特定の態様では、宿主改変は、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレットに一般的に記載されるように、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡの欠失を含むＢＦ１４０（ΔｓｅｒＡ１＿ΔｌｙｓＡ）などのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株中に導入され得る。他の態様では、宿主改変は、国際公開第２０２１／１４６４１１パンフレットに一般的に記載されるように、限定されないが、改変ｄｌｔＡ遺伝子及び／又は改変ｒｇｈＲ２遺伝子が含まれる１つ以上の遺伝子改変を更に含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株（例えば、ＢＦ１４０）中に導入され得る。
改変宿主菌株の構築
本明細書に記載の組み換え型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株は、任意の好適なＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主を使用して、当業者によって構築することができる（例えば、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレット及び同第２０２１／１４６４１１号パンフレットを参照されたい；各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ある特定の態様では、宿主改変は、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレットに一般的に記載されるように、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡの欠失を含むＢＦ１４０（ΔｓｅｒＡ１＿ΔｌｙｓＡ）などのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株中に導入され得る。他の態様では、宿主改変は、国際公開第２０２１／１４６４１１パンフレットに一般的に記載されるように、限定されないが、改変ｄｌｔＡ遺伝子及び／又は改変ｒｇｈＲ２遺伝子が含まれる１つ以上の遺伝子改変を更に含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株（例えば、ＢＦ１４０）中に導入され得る。
【0195】
本実施例において、一連の宿主改変を、国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレットに記載されるように、ｓｅｒＡ１（配列番号１３）及びｌｙｓＡ遺伝子（配列番号１４）の欠失を含み、且つｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ１４０中に導入した。より具体的には、国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレットに記載されるように、欠失されたｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子を、ＢＦ１４０菌株中で最初に構築した。簡単に言うと、ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有するＢＦ１４０の変形型をコンピテントにした（国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）。１００μｌのコンピテント細胞を、５μｌのｐＲＦ８７９（配列番号７８；国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）ＲＣＡと混合し、１４００ＲＰＭ及び３７℃で１．５時間インキュベートした。混合物を、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上にプレーティングし、プラスミドで形質転換された細胞を選択した。標準的ＰＣＲ技法及び以下の表３のプライマーを使用して、コロニーを、ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号１６）、最初の９ｂｐ及び最後の９ｂｐを除くｒｇｈＲ２コーディング配列の欠失についてスクリーニングした。ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号１６）を有するコロニーは、以下の表３に記述されるフォワードプライマー（配列番号５）及びリバースプライマー（配列番号６）を使用して、１５２３ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号１７）を産生し、一方、インタクトなｒｈｇＲ２遺伝子を含有する親細胞は、１９２２ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号１８）を産生する。ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子を含有するコロニーを、ＢＦ４１２として保存した。
【表3】
【0196】
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有するＢＦ４１２の変形型をコンピテントにした（国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）。１００μｌのコンピテント細胞を、５μｌのｐＺＭ２２１（配列番号８４；国際公開第２０２１１４６４１１号パンフレット）ＲＣＡと混合し、１４００ＲＰＭ及び３７℃で１．５時間インキュベートした。混合物を、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上にプレーティングした。標準的ＰＣＲ技法、及び以下の表４に記述されるフォワードプライマー（配列番号７）及びリバースプライマー（配列番号８）を使用して、コロニーをΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子（配列番号１９）、ｄｌｔＡコーディング配列の７００ｂｐの欠失についてスクリーニングした。ΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子を有するコロニーは、表４中のプライマーを用いて２０６７ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号２０）を産生し、一方、インタクトなｄｌｔＡ遺伝子を含有する親細胞は、２７６７ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号２１）を産生する。これは、標準的な電気泳動技術を使用して区別することができる。ｄｌｔＡの７００ｂｐの内部欠失（配列番号１９）を含有するコロニーを、ＢＦ７７２として保存した。
【表4】
【0197】
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有する菌株ＢＦ７７２の変形型をコンピテントにし（国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）、ｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）（配列番号２２）の組み込みのために、ａｍｙＬ遺伝子座を標的化する線形ＰＣＲ産物で形質転換した。例えば、標的化構築物（カセット）は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｐｏＶＧターミネーター（配列番号２８）に作動可能に連結したＣａｔＨターミネーター（配列番号２７）から構成される、デュアルターミネーター（配列番号２６）に作動可能に連結した、ＣａｔＨタンパク質（配列番号２５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、ｃａｔＨプロモーター（配列番号２４）に作動可能に連結したａｍｙＬ遺伝子座に対して上流（５’）相同性アーム（配列番号２３）を含む。構築物は、ａｍｙＬ遺伝子座に対して下流相同性アーム（配列番号３２）に作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ遺伝子からのターミネーター（配列番号３１）に作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐｒｓＡ ＣＤＳ（配列番号３０）に作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐｒｓＡプロモーター（配列番号２９）を更に含む。
【0198】
１０ｐｐｍのクロラムフェにコールを含有するＬ寒天上で形成したコロニーを、コロニーＰＣＲを使用してスクリーニングし、以下の表５に記述されるフォワードプライマー（配列番号９）及びリバースプライマー（配列番号１０）を用いた標準的なＰＣＲ技法を使用してａｍｙＬ遺伝子座の改変を確認した。ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたカセット（配列番号３３）を含有するコロニーは、３５６２ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。ＰＣＲ産物（配列番号３５）を、サンガー法を使用して配列決定し、分離株をＺＭ１３１９として保存した。
【表5】
【0199】
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有するＺＭ１３１９の変形型をコンピテントにした（国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）。１００μｌのコンピテント細胞を、５μｌのｐＲＦ１００５ ＲＣＡと混合し、１４００ＲＰＭ及び３７℃で１．５時間インキュベートした。混合物を、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上にプレーティングした。標準的なＰＣＲ技法、及び表５に記述されるフォワードプライマー（配列番号９）及びリバースプライマー（配列番号１０）を使用して、コロニーを、ａｍｙＬ：：ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡカセット（配列番号３３）を維持しながらの、ｃａｔＨプロモーター（配列番号２４）の３’末端をコードするＤＮＡ及びＣａｔＨタンパク質（配列番号２５）をコードするＤＮＡ配列の欠失についてスクリーニングした。
【0200】
ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡカセット（ａｍｙＬ：：ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡカセット；配列番号３３）を含有する正確なコロニーは、２６９８ｂｐのＰＣＲ（配列番号３４）を産生したが、これとは対照的に、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡカセット（ａｍｙＬ：：ｃａｔＨ－ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡカセット；配列番号２２）を含有する親コロニーは、３５６２ｂｐの長さのＰＣＲ産物（配列番号３５）を産生した。この違いは、標準的なゲル電気泳動技術を使用して、及びサンガー法を用いたＰＣＲ産物の配列決定によって視覚的に評価された。分離株を、ＺＭ１３２２として保存した。
【0201】
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１５）を含有するＺＭ１３２５と名付けられたＺＭ１３２２の変形型を、アミラーゼレポーター産生のための宿主菌株として以下の実施例で使用し、ＺＭ１３２５菌株は、導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡカセットが、ＺＭ１３２５菌株中のａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれていることを除いて、以前に記載された宿主菌株ＢＦ６１３（国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット）と比較して同じ宿主改変を含有しており、一方、同じ導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡカセットが、ＢＦ６１３菌株中のｃａｔＨ遺伝子座において組み込まれていた。
【0202】
実施例３
ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた第２のコピーｐｒｓＡ遺伝子を含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたアミラーゼ１産生
本実施例では、バリアントα－アミラーゼ（本明細書では、「アミラーゼ１」、略して「Ａｍｙ１」）をコードする発現カセットを、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５（すなわち、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失を含む）中に導入した。より詳細には、菌株ＢＦ６１３が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有し、一方、ＺＭ１３２５が、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた同じ導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有することを除いては、ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５は、同質遺伝子菌株である。
ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた第２のコピーｐｒｓＡ遺伝子を含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたアミラーゼ１産生
本実施例では、バリアントα－アミラーゼ（本明細書では、「アミラーゼ１」、略して「Ａｍｙ１」）をコードする発現カセットを、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５（すなわち、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失を含む）中に導入した。より詳細には、菌株ＢＦ６１３が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有し、一方、ＺＭ１３２５が、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた同じ導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有することを除いては、ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５は、同質遺伝子菌株である。
【0203】
例えば、アミラーゼ１（Ａｍｙ１；配列番号３６）の第１の（１ｓｔ）カセットがｓｅｒＡ１遺伝子座に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号１３）に作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ１（配列番号３６）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ａｍｙｌシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号３７）を含有する。Ａｍｙ１（配列番号３６）の第２の（２ｎｄ）カセットがｌｙｓＡ遺伝子座に組み込まれ、ｌｙｓＡ ＯＲＦ（配列番号１４）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ１（配列番号３６）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐ２プロモーター（配列番号４１）を含有する。これにより、ＬＤＮ６６５（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ１の２つのコピーを有する菌株ＢＦ６１３）及びＺＭ１３５１（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ１の２つのコピーを有する菌株ＺＭ１３２５）と名付けられたＡｍｙ１産生菌株をもたらした。
【0204】
２つのＡｍｙ１産生菌株（ＬＤＮ６６５及びＺＭ１３５１）を、標準的な小スケール条件（国際公開第２０１８／１５６７０５号パンフレット及び同第２０１９／０５５２６１号パンフレットに記載されるように（各々が、参照により本明細書に組み込まれる））を使用して、α－アミラーゼの産生についてアッセイした。例えば、産生されたアミラーゼレポータータンパク質（Ａｍｙ１）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法又はＣｅｒａｌｐｈａアッセイを使用して定量化し、このアッセイの結果を表６に示され、これは、ｃａｔＨ遺伝子座（ＬＤＮ６６５）の代わりに、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）を含む菌株（ＺＭ１３５１）において、Ａｍｙ１産生の改善を実証している。
【表6】
【0205】
実施例４
ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた第２のコピーｐｒｓＡ遺伝子を含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたアミラーゼ２産生
本実施形態では、異なるアミラーゼレポータータンパク質［トリプル－Ａ ２１５０８－１］（本明細書では、「アミラーゼ２」、略して「Ａｍｙ２」）をコードする発現カセットを、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５（すなわち、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失を含む）中に導入した。上述したように、菌株ＢＦ６１３が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有し、一方、ＺＭ１３２５が、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた同じ導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有することを除いては、ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５は同質遺伝子菌株である。例えば、Ａｍｙ２（配列番号４２）の第１の（１ｓｔ）カセットがｓｅｒＡ１遺伝子座に組み込まれ、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ２（配列番号４２）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結した、合成ｐ３プロモーター（配列番号３７）に作動可能に連結したｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号１３）を含有する。Ａｍｙ２の第２の（２ｎｄ）カセットがｌｙｓＡ遺伝子座に組み込まれ、ｌｙｓＡ ＯＲＦ（配列番号１４）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ２（配列番号４２）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐ２プロモーター（配列番号４１）を含有する。これにより、ＷＡＡＡ５７（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ２の２つのコピーを有する菌株ＢＦ６１３）、及びＷＡＡＡ１９７（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ１の２つのコピーを有する菌株ＺＭ１３２５）と名付けられたＡｍｙ２産生菌株をもたらした。
ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた第２のコピーｐｒｓＡ遺伝子を含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における強化されたアミラーゼ２産生
本実施形態では、異なるアミラーゼレポータータンパク質［トリプル－Ａ ２１５０８－１］（本明細書では、「アミラーゼ２」、略して「Ａｍｙ２」）をコードする発現カセットを、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５（すなわち、ｓｅｒＡ１及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失を含む）中に導入した。上述したように、菌株ＢＦ６１３が、ｃａｔＨ遺伝子座で組み込まれた導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有し、一方、ＺＭ１３２５が、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれた同じ導入された（２ｎｄコピー）ｐｒｓＡ発現カセットを含有することを除いては、ＢＦ６１３及びＺＭ１３２５は同質遺伝子菌株である。例えば、Ａｍｙ２（配列番号４２）の第１の（１ｓｔ）カセットがｓｅｒＡ１遺伝子座に組み込まれ、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ２（配列番号４２）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結した、合成ｐ３プロモーター（配列番号３７）に作動可能に連結したｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号１３）を含有する。Ａｍｙ２の第２の（２ｎｄ）カセットがｌｙｓＡ遺伝子座に組み込まれ、ｌｙｓＡ ＯＲＦ（配列番号１４）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号４０）に作動可能に連結した、Ａｍｙ２（配列番号４２）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナルペプチド配列（配列番号３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号３８）に作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐ２プロモーター（配列番号４１）を含有する。これにより、ＷＡＡＡ５７（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ２の２つのコピーを有する菌株ＢＦ６１３）、及びＷＡＡＡ１９７（すなわち、ｌｙｓＡ及びｓｅｒＡ遺伝子座でＡｍｙ１の２つのコピーを有する菌株ＺＭ１３２５）と名付けられたＡｍｙ２産生菌株をもたらした。
【0206】
２つのＡｍｙ２産生菌株（ＷＡＡＡ５７及びＷＡＡＡ１９７）を、アミラーゼの産生についてアッセイし（実施例３に記載される標準的な小スケール条件を使用して）、レポーターアッセイの結果を表７に示し、ｃａｔＨ遺伝子座（ＷＡＡＡ５７）の代わりに、ａｍｙＬ遺伝子座で組み込まれたｐｒｓＡ遺伝子の導入された（２ｎｄコピー）を含む菌株（ＷＡＡＡ１９７）におけるＡｍｙ２産生の改善を実証している。
【表7】
【0207】
参考文献
国際公開第１９９４／１９４７１号パンフレット
国際公開第２００２／１４４９０号パンフレット
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレット
国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレット
国際公開第２０１９／４０４１２号パンフレット
国際公開第２０２１／１４６４１１号パンフレット
国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット
米国特許出願公開第２０１００２５５５３４号明細書
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【国際調査報告】