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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチド標識による抗体の高効力の標識化
(51)【国際特許分類】
C07K 1/13 20060101AFI20241114BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241114BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
C07K1/13
C12N15/11 Z ZNA
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529124
(86)(22)【出願日】2022-11-14
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 EP2022081746
(87)【国際公開番号】W WO2023084070
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】2116442.1
(32)【優先日】2021-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524181632
【氏名又は名称】アクトム ジーエムビーエイチ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ジェニー，チャバ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA54
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、オリゴヌクレオチドによる抗体の高効率の選択的標識化のための方法を含む。本方法は、抗体からのグリカンの選択的除去及びそれらを人工的なグリコシド、特にオリゴヌクレオチドを含むＮ－グリコシドで置き換えることを含み得る。プロセスは、抗体Ｃ’Ｅループのオリゴヌクレオチド誘導性の方向付けにより、比較的程度は低いがＣγ２－Ｃγ３ドメインにより、促進されると考えられる。本方法は、抗体の高効力の標識化をもたらす。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
オリゴヌクレオチドによって抗体を標識化するためのプロセスであって、（ａ）前記抗体を反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと前記抗体との間で共有結合を形成するステップを含み；
前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度が少なくとも１μＭである、
プロセス。
【請求項2】
（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化して、脱グリコシル化抗体を形成するステップ；（ｂ）前記脱グリコシル化抗体を反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと前記脱グリコシル化抗体との間で共有結合を形成するステップ、
を含み；
前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度が少なくとも１μＭである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記反応基が、一級アミン又はスルフヒドリル基と反応して、共有結合を形成することが可能である、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項4】
一級アミンと反応することが可能な前記反応基が、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物及びフルオロフェニルエステルから選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項5】
スルフヒドリル基と反応することが可能な前記反応基が、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリルアロイ（ａｃｒｙｌｉｃ ａｌｌｏｙ）、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢチオール及びジスルフィド還元剤から選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項6】
抗体をオリゴヌクレオチドによって標識化するためのプロセスであって（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されるＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化すること；
（ｂ）官能基を前記脱グリコシル化された抗体に結合して、修飾抗体を形成すること；
（ｃ）前記修飾抗体を反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、前記オリゴヌクレオチドと前記修飾抗体との間で共有結合を形成すること
を含み；
前記反応基が前記官能基と反応して、共有結合を形成し；
前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度が少なくとも１μＭである、
プロセス。
【請求項7】
前記官能基及び反応基が、アジド基及びシクロアルキニル基又はアルキニル基；チオール基及びＮ－マレイミド基、ヨードアセトアミド、クロロアクテアミド（ｃｈｌｏｒｏａｃｔｅａｍｉｄｅ）又はジスルフィド基；ケトン又はアルデヒド基及びヒドラジン、アシルヒドラジン，アニリン又はアルコキシアミンから選択される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記シクロアルキニル基がシクロオクチン基である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項9】
前記官能基を含む糖部分を結合することによって、修飾されたＧｌｃＮＡｃ部分が形成される、請求項６～８の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記糖部分が、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して酵素的に結合されるガラクトサミン部分である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項11】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１～１０の何れかに記載のプロセス。
【請求項12】
前記Ｎ－グリコシル化アミノ酸がアスパラギン２９７である、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項13】
前記オリゴヌクレオチドが、３０～１５０個のヌクレオチドを含有する、請求項１～１２の何れかに記載のプロセス。
【請求項14】
前記脱グリコシル化が、Ｆｃ特異的エンドグリコシダーゼを使用して行われる、請求項２～１３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項15】
請求項１～１４の何れか１項に記載のプロセスによりオリゴヌクレオチドによって標識化された抗体。
【請求項16】
（ｉ）反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド；及び任意選択的に（ｉｉ）修飾されたＧｌｃＮＡｃ部分を形成することが可能な官能基を含む化合物；及び／又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ特異的エンドグリコシダーゼ；及び／又は
（ｉｖ）β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ
を含むオリゴヌクレオチドによって抗体を標識化するための、請求項１～１４の何れか１項に記載のプロセスでの使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、オリゴヌクレオチドによる抗体の高効率の選択的標識化のための方法を含む。本方法は、抗体からのグリカンの選択的除去及び人工的なグリコシド、特にオリゴヌクレオチドを含むＮ－グリコシドによるそれらの置き換えを含み得る。本プロセスは、抗体Ｃ’Ｅループのオリゴヌクレオチド誘導性の方向付けにより、及び程度は低いがＣγ２－Ｃγ３ドメインにより、促進されると考えられる。本方法は、抗体の高効力の標識化をもたらす。
【背景技術】
【0002】
抗体－ＤＮＡコンジュゲーションの２つの主要なアプローチは、非共有結合（例えばビオチン－ストレプトアビジン）又は共有結合によるコンジュゲーション方法である。非共有結合による方法は、適用中に標識解離が起こる傾向があり、その結果、標識ホッピング（ｌａｂｅｌ ｈｏｐｐｉｎｇ）及び短い貯蔵寿命をもたらす。共有結合によるコンジュゲーション方法は、部位特異的及び非選択的コンジュゲーションに従い区別される。さらなる目的は、標識化された抗体又は厳密に定義された数のＤＮＡ標識を持つ抗体を得るための抗体の修飾である。標識の度合いは、抗体－ＤＮＡコンジュゲートの多くの適用、特に一意的分子識別子を伴う標識戦略に影響する。ランダムな標識戦略は、コンジュゲーション反応の統計的挙動により妨げられ、抗体あたり１標識という度合いは、単標識抗体、二重標識抗体及び非標識抗体の混合物を含有するコンジュゲートをもたらす。この挙動は、非共有結合による（ビオチン－ストレプトアビジン）又は共有結合によるコンジュゲーション方法の両方に共通するが、これは、両方のアプローチが統計的反応ステップを有するからである。部位特異的コンジュゲーションを使用する戦略は、既定数のＤＮＡ標識を有する抗体－ＤＮＡコンジュゲートを作製することが可能である。しかし、コンジュゲーション反応が網羅的（１００％の効率）ではない場合、これは望ましくない統計的挙動も導入する。
【0003】
短いオリゴヌクレオチド配列（３０ｂｐ未満）は、コンジュゲーション反応の促進を示さないが、それでもなお統計的コンジュゲーションを発揮する（ＭｃＭａｈｏｎ ＮＰ，Ｊｏｎｅｓ ＪＡ，Ｋｗｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｅｒｍｉｔ ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｕｓｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔ．２０２０；２５（０５）：１．ｄｏｉ：１０．１１１７／１．ｊｂｏ．２５．５．０５６００４）。
【0004】
結果的に、抗体の網羅的なＤＮＡコンジュゲーションを達成する方法が非常に望ましい。
【0005】
低分子の選択的標的化で使用される化学選択的ライゲーション反応は、かなりの制約－二分子共有結合反応の固有の動力学的特性を有する。現在の化学選択的ライゲーション反応は、１０４～１０５Ｍ－１ｍｉｎ－１の次数の二分子速度定数を特徴とする（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５－４８１，Ｓａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｅｓｋｉｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９７３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，４２７７－４２８７）。共有結合反応が比較的低い速度定数を有するので、有用な速度で反応を進行させるためには高濃度の試薬が必要である。生体分子の化学選択的コンジュゲーションは、反応物の達成可能な低濃度、拡散律速、立体的な問題及び反応パートナー間の不都合な相互作用ゆえに、反応物の分子量が増大するにつれて次第に効果が低くなる。Ｍａｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．は、６０ｂｐのオリゴヌクレオチドとの抗体コンジュゲーション反応が許容できないほど低い収率を有することを実証している（Ｍａｅｒｌｅ Ａ Ｖ．，Ｓｉｍｏｎｏｖａ ＭＡ，Ｐｉｖｏｖａｒｏｖ ＶＤ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＤＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＥ ａｎｄ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１９；１４（１）：１－１９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２０９８６０）。非部位特異的アプローチを使用してオリゴヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするために使用される単純なクリックケミストリー反応を含む高収率のコンジュゲーション反応の効力は変動し、一般的には３０％未満であり、５０ｂｐよりも大きいオリゴヌクレオチドの場合は僅か５％と低い。（Ｗｉｅｎｅｒ Ｊ，Ｋｏｋｏｔｅｋ Ｄ，Ｒｏｓｏｗｓｋｉ Ｓ，Ｌｉｃｋｅｒｔ Ｈ，Ｍｅｉｅｒ Ｍ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｔｉｃｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０（１）：１－１２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－５８２３８－６）。
【0006】
選択的炭水化物修飾のアプローチは、糖の化学的、酵素的酸化（Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ １９８７；Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８８）及びグリコシルトランスフェラーゼによる蛍光標識糖の酵素的転移（Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｂｒｏｓｓｍｅｒ １９８８；Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｂｒｏｓｓｍｅｒ １９９１）まで、多種多様である。細胞表面の複合糖質へのシアル酸誘導体の代謝的組み込みのための戦略も開発されている（Ｋａｙｓｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｋｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｌｅｍｉｅｕｘ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ １９９８；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．１９９８）。様々な活性化糖の化学合成及びＬ－ガラクトースから始まるそれらの酵素的転移がＨａｌｌｇｒｅｎ及びＨｉｎｄｓｇａｕｌ（１９９５）により記載された。ビオチン化された糖がフコシルトランスフェラーゼによりＮ－アセチルラクトサミン誘導体に転移された方法、さらにＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ及び二重直交標識としてアジドを使用したその転移も開発された（Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３）。最後に、組み換えウシβ４Ｇａｌ－Ｔ１の突然変異体を使用したケト修飾を有するＵＤＰ－Ｇａｌのヌクレオチド糖を転移させる戦略が作成された（Ｋｈｉ ｄｅｋｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。
【0007】
化学選択的ライゲーション反応の低い二分子速度定数は、それらに先行して反応パートナーの速い非共有結合がある場合、克服され得る。この原理の例は、アプタマーが反応性の求電子基により官能化され、好中球細胞表面上の標的タンパク質（エラスターゼ）に非共有結合による会合を通じて結合する場合であり、これは、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｊ．，Ｓｅｎｎｅｌｌｏ，Ｊ．及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，８０９－８１６）により記載されている。結合すると、反応性ホスホン酸エステルは、酵素の活性部位内のセリン残基と不可逆的な共有結合付加体を形成する。しかし、これは、各標的に対する標識の複雑な一意的設計を必要とし、抗体及び低分子の反応性の化学選択的化学基以外の構造エレメントを有する標識に対しては、このような戦略が考案されなかった。
【0008】
シミュレーションによって、ＩｇＧ抗体のＦｃ Ｎ－グリカンの高振幅運動が示され、このとき、グリカン残基は、Ｆｃ表面に動的に結合及び離脱し、オープンな立体構造で酵素的修飾のためにバルク溶媒にグリカン末端を露出する。これは、２つの別個の状態を有するＦｃグリカン接近性に関するＮＭＲ試験と一致する：この別個の状態の一方では、グリカンがポリペプチド表面と相互作用を有し、埋め込まれるが、他方は、グリカンが溶媒に自由に露出し、グリカン－ポリペプチド相互作用を受けない状態である（Ｌｅｅ ＨＳ，Ｉｍ Ｗ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＩｇＧ１ Ｆｃ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７；７（１）：１－１０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－１２８３０－５）。この挙動は、異なるグリカン形態で検出されており、Ｎ－グリコシドを含む天然のグリカンなど、類似の分子量を有する他の糖含有化合物に拡大され得る。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、オリゴヌクレオチドによる抗体の選択的な網羅的標識化のための第１の方法を提供する。これは、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体の網羅的標識化が必要である適用、例えば、タンパク質からの検出シグナルをＤＮＡレベルに翻訳するために使用される方法、タンパク質分析アッセイのための高マルチプレックス戦略において有利である（Ａｌｉ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４３，３３２４－３３４１（２０１４），Ｋａｒａｋｕｓ Ｕ，Ｔｈａｍａｍｏｎｇｏｏｄ Ｔ，Ｃｉｍｉｎｓｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｂａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９５５－３；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ａ．，Ｔｒａｎ，Ｂ．，Ａｓｓａｒｓｓｏｎ，Ｅ．＆ Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９，ｅ１０２－ｅ１０２（２０１１））。これらは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術又は連続蛍光ハイブリダイゼーション法と組み合わせた場合に有用であり、タンパク質を、例えばＣＩＴＥｓｅｑ又はＳＡＢＥＲと並行して定量することができる。（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７）；Ｓａｋａ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＡＢＥＲ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，１０８０－１０９０（２０１９））。これらの適用は全て、一貫した数値的結果を生じるために、既知の標識結合価及び効力を有する化学的に定義された抗体コンジュゲートを必要とする。
【0010】
本発明はまた、抗体Ｃ’Ｅループ又は／及びＣγ２－Ｃγ３ドメインとオリゴヌクレオチドなどのペイロードとの間での高速の非共有結合ステップを適用することによって有効なコンジュゲーションを促進するために結合スキームを使用する任意の方法においても有利である。
【0011】
本発明の目的は、オリゴヌクレオチドによる抗体の選択的で高効率の標識化方法を提供することである。これは、抗体とオリゴヌクレオチドとの親和性結合が起こることを可能にする反応混合物中で少なくとも１μＭのオリゴヌクレオチドの濃度を使用することによって達成され得る。これはまた、例えば、存在するならば最内側のＧｌｃＮＡｃ部分の後の天然の保存されたアスパラギンＮ－グリカンをエンドグリコシダーゼに基づいて除去することを含む、コンジュゲーション可能な（ハンドル）糖部分を、ＩｇＧのアスパラギン－２９７又はＩｇＧの立体構造的に関連するアミノ酸に導入し、官能化Ｎ－グリコシドの結合の促進を確実にし、統計的コンジュゲーション反応の制約を克服するために官能化Ｎ－グリコシドペイロードをコンジュゲーションハンドルと反応させることによっても達成することができる。
【0012】
ペイロードは、効率的なコンジュゲーション反応が物理的、化学的又は立体構造的な効果により制限される、高分子量部分である。
【0013】
ペイロードは有利には、オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアなどのさらなる標識化部分に連結され得る。
【0014】
第１の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドによって抗体を標識化するためのプロセスであって、
（ａ）抗体を、反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと抗体との間で共有結合を形成させること
を含み、
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は少なくとも１μＭである、プロセスを提供する。
（ａ）抗体を、反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと抗体との間で共有結合を形成させること
を含み、
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は少なくとも１μＭである、プロセスを提供する。
【0015】
生理的ｐＨにおいて、抗体は、オリゴヌクレオチドに対する親和性を有する。この親和性結合は、オリゴヌクレオチドをその場で保持するために十分であり、それにより、オリゴヌクレオチドに連結した反応基と抗体上の基との間のその後のコンジュゲーション反応の効率が増加し、それによりオリゴヌクレオチドを抗体に共有結合により連結する。
【0016】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と互換的に使用され、抗体が所望の生物学的活性を示し、少なくとも１つの重鎖の少なくともＣＨ２部分を含有する限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、例えば二特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれるそれらの重鎖の定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要クラスの何れかのメンバー：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、又はそのサブクラス、（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる及び周知のサブユニット構造及び三次元立体構造を有する。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。「抗体」という用語はまた、抗体のコンジュゲート、例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧとのコンジュゲートも含むことが意図される。
【0017】
さらに、文脈上特に必要としていない限り、「抗体」という用語は、完全な抗体、並びにｓｃＦｖ－ＣＨ２－ＣＨ３融合タンパク質を含む、完全な抗体の抗原結合領域及びＣＨ２ドメインを含む抗体断片を包含することを理解すべきである。抗体は、ハイブリドーマによって、又は組み換えＤＮＡ技術、ファージディスプレイ若しくは酵母ディスプレイ技術などの合成手段によって、又はトランスジェニックマウスを使用して、又は液相若しくは固相ペプチド合成によって、作製され得る。
【0018】
抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体である。好ましくは、抗体は市販されている。好ましくは、抗体は、診断方法で使用されることが公知である。好ましくは、抗体は、治療で使用されることが公知である。本発明での使用のための適切な抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びそれらの組み合わせを含む。
【0019】
反応混合物中のオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１μＭである。好ましくは、オリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１０μＭ又は少なくとも５０μＭ又は少なくとも７０μＭ又は少なくとも１００μＭ又は少なくとも５００μＭであり、より好ましくはオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１ｍＭである。このオリゴヌクレオチドの濃度は、共有結合の速度を増加させ、その結果、ほぼ１００％の抗体が標識化される。抗体の「ほぼ１００％」又は「１００％に近い」抗体が標識化されるとは、本明細書中で使用される場合、抗体の９０％超、好ましくは９５％超、より好ましくは９８％超、最も好ましくは９９％超が標識化されることを意味する。オリゴヌクレオチドは、重鎖間のポケットに拡散し、非共有結合を形成すると考えられる。これは、ポケット内に存在するオリゴヌクレオチドの濃度を増加させ、それにより共有結合反応の動力学が改善される。オリゴヌクレオチドの急速な非共有結合による会合が先行するので、化学選択的ライゲーション反応の低い二分子速度定数が克服される。
【0020】
好ましくは、抗体内の各重鎖は、オリゴヌクレオチドによって標識化される。従って、抗体分子が２つの重鎖を有する場合、これは、２つのオリゴヌクレオチドによって標識化される。できる限り１００％に近い抗体が標識化されることが望ましい。非標識抗体を標識化され抗体から分離することは困難であり得る。非標識抗体の存在によって、生成されるシグナルが低減され、バックグラウンドノイズが増加する。
【0021】
抗体を標識化するために使用されるオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも３０塩基長、例えば少なくとも４０塩基長、少なくとも５０塩基長、少なくとも６０塩基長、少なくとも７０塩基長、少なくとも８０塩基長、少なくとも９０塩基長又は少なくとも１００塩基長である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、４０～１５０個のヌクレオチド、例えば５０～１２０個の又は６０～１００個のヌクレオチドを含有する。
【0022】
オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得、１本鎖又は２本鎖であり得る。核酸を形成するヌクレオチドは、例えば、分子の安定性を向上させる、そのバイオアベイラビリティを改善する、さらなる活性をそれに付与する、及び／又はさらなる負電荷を提供するために、化学修飾され得る。例えば、ピリミジン塩基を６又は８位で、プリン塩基を５位で、ＣＨ３又はＩ、Ｂｒ又はＣｌなどのハロゲンにより修飾してもよい。ピリミジン塩基の修飾はまた、Ｎ２Ｈ３、０６－ＣＨ３、Ｎ６－ＣＨ３及びＮ２－ＣＨ３も含む。糖部分の２’位での修飾、「糖修飾」は一般的に、ＮＨ２、Ｆ又はＯＣＨ３基を付加する。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾も含み得る。
【0023】
或いは、モルホリノヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用することができる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、異なるモルホリノサブユニットから構築され、そのそれぞれが、６員モルホリン環に連結される４個の遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニン及びチミン）のうち１つを含有する。サブユニットを、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間連結によって連結すると、モルホリノオリゴヌクレオチドが得られる。ＬＮＡ単量体は、フラノース環立体構造が、２’－Ｏ位を４’－Ｃ位に接続するメチレンリンカーにより制限されることを特徴とする。ＰＮＡは、骨格が糖ではなくシュードペプチドであるＤＮＡのアナログである。
【0024】
反応基を、オリゴヌクレオチドに直接連結してもよい。或いは、反応基を、スペーサーを介してオリゴヌクレオチドに連結してもよい。スペーサーは、直鎖状又は分岐状Ｃ１～Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９～Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択され得る。任意選択的に、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、置換されてもよく、任意選択的に前記基は、１個又は複数のヘテロ原子、好ましくは１～１００個のヘテロ原子により中断されてもよく、前記ヘテロ原子は、好ましくはＯ、Ｓ及びＮＲ１１からなる群から選択され、ここでＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。最も好ましくは、ヘテロ原子はＯである。
【0025】
適切なスペーサーは、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む同等物）、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール又はポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ－ジアミノアルカンを含み、ここでｘは、アルカンにおける炭素原子の数である。好ましくは、スペーサーは、ポリエチレングリコール、より好ましくは２，２’－［オキシビス（２，１－エタンジイルオキシ）］ジエタノール（ＰＥＧ４）である。
【0026】
好ましくは、本発明は、オリゴヌクレオチドによって抗体を標識化するためのプロセスであって
（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化し；
（ｂ）脱グリコシル化抗体を反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと脱グリコシル化抗体との間に共有結合を形成すること
を含み、
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度が少なくとも１μＭである、
プロセスを提供する。
（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化し；
（ｂ）脱グリコシル化抗体を反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと脱グリコシル化抗体との間に共有結合を形成すること
を含み、
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度が少なくとも１μＭである、
プロセスを提供する。
【0027】
「グリカン」という用語は、本明細書中で、タンパク質に連結される単糖又はオリゴ糖鎖を指す。グリカンは、１つの糖のＣ－１炭素を介してタンパク質に結合し、これをさらに置換しなくてもよく（単糖）、又はそのヒドロキシル基のうち１個若しくは複数でさらに置換してもよい（オリゴ糖）。一般的には、天然に存在するグリカンは、１～約１０個の糖部分を含む。
【0028】
糖タンパク質のグリカンは、単糖であり得る。一般的には、糖タンパク質の単糖グリカンは、タンパク質に共有結合された単一のＮ－アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース又はフコースからなる。
【0029】
グリカンは、直鎖状又は分岐状オリゴ糖でもあり得る。タンパク質に直接結合した糖は、コア糖と呼ばれる。タンパク質に直接結合せず、少なくとも２個の他の糖に結合した糖は、内部糖と呼ばれる。末端糖は、タンパク質に直接結合しないが、単一の他の糖に結合する、即ちその、他のヒドロキシル基の１個又は複数でさらなる糖置換基を保有しない糖である。疑義を避けるために、糖タンパク質のオリゴ糖には複数の末端糖が存在してもよいが、コア糖は１つのみである。タンパク質に直接結合したオリゴ糖の末端は、還元末端と呼ばれる。オリゴ糖の他方の末端は、グリカンの非還元末端と呼ばれる。
【0030】
グリカンは、Ｏ－結合グリカン、Ｎ－結合グリカン又はＣ－結合グリカンであり得る。Ｎ－結合グリカンにおいて、単糖又はオリゴ糖グリカンは、タンパク質のアミノ酸におけるＮ－原子を介して、一般的にはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖におけるアミド窒素を介して、タンパク質に結合する。例えば、グリカンは、Ｎ－グリコシド結合を介してタンパク質に結合する。その側鎖上でグリカンにより置換されるアスパラギンは一般的に、配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、ここでＸは、プロリン以外の何れかのアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はスレオニンの何れかである。多様な鎖がＮ－結合グリカンに関して存在する。
【0031】
免疫グロブリンのＮ－グリコシル化は周知である。免疫グロブリンは一般に、ジスルフィド結合により連結された２本の重鎖及び２本の軽鎖から構成される。鎖は、定常ドメイン及び可変ドメインにさらに分類される。定常領域、特に重鎖の定常領域内には、アスパラギン上に多くの既知の保存されたＮ－グリコシル化部位がある。抗体又は免疫グロブリンが２つの重鎖を含む場合、好ましくは両方の重鎖がグリコシル化され、即ち少なくとも１個のグリカンが各重鎖上に存在する。ＣＨ２領域内のグリコシル化部位の位置は、アイソタイプに応じて変動する。例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンにおいて、保存されたＮグリコシル化部位は、アスパラギン２９７（一般的な文献によるアミノ酸番号）であり、ＩｇＡ１についてはアスパラギン１４４であり、ＩｇＡ２についてはアスパラギン１３３及び／又はアスパラギン２０５であり；ＩｇＭについてはアスパラギン２０７であり；ＩｇＥについてはアスパラギン１４６及びアスパラギン２５２がグリコシル化され得；ＩｇＤについては、グリコシル化部位はアスパラギン２２５である。好ましくは、免疫グロブリンが２つの重鎖を含む場合、両方の重鎖が１つ以上の保存されたＮグリコシル化部位でグリコシル化される。
【0032】
Ｎ－グリコシル化されたアミノ酸は、好ましくはアスパラギン２９７である。
【0033】
図１で示されるように、Ｎ－グリコシル化されたアミノ酸は、グリカンに結合し、最も内側のコアＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分がアミノ酸に直接結合する。このＧｌｃＮＡｃ部分は、複数のガラクトース、マンノース、フルクトース及び／又はさらなるＮ－アセチルグルコサミン部分に結合して、グリカンを形成する。最初のステップとして、抗体を脱グリコシル化して、グリカンから糖単位の１つ又は複数を除去することができ、好ましくは最も内側の又はコアのＮ－アセチルグルコサミンを残す。好ましくは最も内側のコアＮ－アセチルグルコサミンのみを残す。
【0034】
シアリダーゼ及び／又はガラクトシダーゼ及び／又はエンドグリコシダーゼなどの酵素を使用して、脱グリコシル化を行うことができる。エンドグリコシダーゼを使用して、最も内側のＧｌｃＮＡｃ部分の後の天然の保存されたアスパラギンＮ－グリカンを除去することができる。適切なエンドグリコシダーゼとしては、ペプチド－Ｎ－グリコシダエ（Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｅ）Ｆ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、Ｅｎｄｏ Ｆ１、Ｅｎｄｏ Ｆ２及びＥｎｄｏ Ｆ３を含むエンドグリコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）及びエンドグリコシダーゼＳ２（Ｅｎｄｏ Ｓ２）が挙げられる。特に好ましいのは、Ｆｃ特異的エンドグリコシダーゼＥｎｄｏＳ２（Ｇｅｎｏｖｉｓ）又はＥｎｄｏＳ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）であり、これらは、Ｆｃグリカンを、ＩｇＧのいくつかのサブクラス及び種において最も内側のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分へと加水分解する。
【0035】
或いは、Ｎ－グリコシル化アミノ酸に結合した単一のＮ－アセチルグルコサミン部分のみを有する抗体は、スワインソニンの存在下での又は改変された宿主生物におけるモノクローナル抗体の発現によって形成され得る。
【0036】
グリカンの除去は、核酸に対する抗体内の結合表面の改善をもたらすと考えられる。グリカンが存在しないことにより、抗体とオリゴヌクレオチドとの間の親和性結合の増加が可能となる。この親和性結合は、オリゴヌクレオチドをその場で有効に保持するので、修飾された脱グリコシル化抗体にオリゴヌクレオチドを共有結合させる続く反応の効率を増強する。
【0037】
１つの選択肢において、オリゴヌクレオチド上の反応基を抗体に架橋する。適切な架橋反応を行う方法及び適切な反応基は当技術分野で公知であり、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０１２）「Ｅａｓｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｄｉｎｇ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ」に記載される通りである。オリゴヌクレオチドを、抗体内で一級アミンと反応可能な反応基又はスルフヒドリル基にコンジュゲートして、オリゴヌクレオチドを抗体に連結する共有結合を形成してもよい。抗体（特にＩｇＧ抗体）は一般に、反応基と反応してオリゴヌクレオチドに結合することができる１０～１５個の容易に利用可能なリジンアミンを有する。或いは、光化学反応を行って、求核基又は活性水素基を通じてオリゴヌクレオチドを抗体に連結することができる。
【0038】
一級アミンと反応することが可能な適切な反応基としては、イソチオシアネート、イソシアネート，アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物及びフルオロフェニルエステルが挙げられる。好ましくは、反応基はＮＨＳエステル又はイミドエステルである。
【0039】
スルフヒドリル基と反応することが可能な適切な反応基としては、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリル合金、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢチオール及びジスルフィド還元剤が挙げられる。
【0040】
適切な光反応基としては、アリールアジド、アジドメチルクマリン、ベンゾフェノン、アントラキノン、ある特定のジアゾ化合物、ジアジリン及びソラレン誘導体が挙げられる。
【0041】
アミン反応性反応基
一級アミンは、各ポリペプチド鎖のＮ－末端及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）アミノ酸残基の側鎖に存在する。これらの一級アミンは生理的ｐＨで正に荷電しているので、これらは、天然のタンパク質三次構造の外面上で主に生じ、これらは、水性媒体に導入されるコンジュゲーション試薬に容易に接近可能である。一級アミンは、特に求核性であり、それにより、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物及びフルオロフェニルエステルを含むいくつかの反応基とのコンジュゲーションが容易になる。これらの殆どが、アシル化又はアルキル化の何れかによってアミンにコンジュゲートする。ＮＨＳエステル及びイミドエステルは、タンパク質架橋試薬及び標識試薬に組み込まれる最も一般的なアミン特異的官能基である。
一級アミンは、各ポリペプチド鎖のＮ－末端及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）アミノ酸残基の側鎖に存在する。これらの一級アミンは生理的ｐＨで正に荷電しているので、これらは、天然のタンパク質三次構造の外面上で主に生じ、これらは、水性媒体に導入されるコンジュゲーション試薬に容易に接近可能である。一級アミンは、特に求核性であり、それにより、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物及びフルオロフェニルエステルを含むいくつかの反応基とのコンジュゲーションが容易になる。これらの殆どが、アシル化又はアルキル化の何れかによってアミンにコンジュゲートする。ＮＨＳエステル及びイミドエステルは、タンパク質架橋試薬及び標識試薬に組み込まれる最も一般的なアミン特異的官能基である。
【0042】
ＮＨＳエステル
ＮＨＳエステルは、カルボキシラート分子のカルボジイミド活性化によって形成される反応基である。ＮＨＳエステル活性化架橋剤は、生理的条件から僅かにアルカリ条件（ｐＨ７．２～９）で一級アミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。この反応は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を放出する。ＮＨＳエステル架橋反応は、最も一般的には、ｐＨ７．２～８．５で０．５～４時間、室温（２０℃）又は４℃でリン酸緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はホウ酸緩衝液中で行われる。
ＮＨＳエステルは、カルボキシラート分子のカルボジイミド活性化によって形成される反応基である。ＮＨＳエステル活性化架橋剤は、生理的条件から僅かにアルカリ条件（ｐＨ７．２～９）で一級アミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。この反応は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を放出する。ＮＨＳエステル架橋反応は、最も一般的には、ｐＨ７．２～８．５で０．５～４時間、室温（２０℃）又は４℃でリン酸緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はホウ酸緩衝液中で行われる。
【0043】
スルホ－ＮＨＳエステルは、それらがＮ－ヒドロキシスクシンイミド環上にスルホナート基（－ＳＯ３）を含有することを除き、ＮＨＳエステルと同一である。この荷電基は、反応化学に影響を及ぼさないが、それを含有する架橋剤の水溶性を増加させる傾向がある。さらに、荷電基は、スルホ－ＮＨＳ架橋剤が細胞膜に浸透することを防ぐので、細胞表面架橋手順において使用することができる。ＮＨＳ及びスルホ－ＮＨＳの例は、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）及びスベリン酸ビス（スクシンイミジル）（ＢＳ３又はスルホ－ＤＳＳ）アミン－と－アミンとの架橋剤である。ＤＳＳは、水中で直接溶解性ではないが、一旦溶解すると、細胞膜を通じて浸透し、細胞内で作用することができる。ＢＳ３は水溶性であるが、帯電すると、細胞膜に浸透することができず、インタクトな細胞の表面へのＢＳ３架橋を制限する。
【0044】
イミドエステル
イミドエステル架橋剤は一級アミンと反応して、アミジン結合を形成する。イミドエステル架橋剤は、アルカリｐＨでアミンと急速に反応するが、半減期は短い。ｐＨがよりアルカリになるにつれて、半減期が長くなり、アミンとの反応性が増加し；従ってｐＨ８よりもｐＨ１０で行った場合の方が、架橋がより有効である。ｐＨ１０を下回る反応条件は、副反応をもたらし得るが、アミジン形成はｐＨ８～１０の間が好都合である。単官能アルキルイミデートを用いた試験から、１つのみの官能イミドエステル基とのコンジュゲーションがｐＨ＜１０で形成され得ることが示される。中間体Ｎ－アルキルイミデートは、より低いｐＨ範囲で形成し、すぐ近傍で別のアミンと架橋されて、Ｎ，Ｎ’－アミジン誘導体をもたらすか、又はアミジン結合に変換されるかの何れかである。
イミドエステル架橋剤は一級アミンと反応して、アミジン結合を形成する。イミドエステル架橋剤は、アルカリｐＨでアミンと急速に反応するが、半減期は短い。ｐＨがよりアルカリになるにつれて、半減期が長くなり、アミンとの反応性が増加し；従ってｐＨ８よりもｐＨ１０で行った場合の方が、架橋がより有効である。ｐＨ１０を下回る反応条件は、副反応をもたらし得るが、アミジン形成はｐＨ８～１０の間が好都合である。単官能アルキルイミデートを用いた試験から、１つのみの官能イミドエステル基とのコンジュゲーションがｐＨ＜１０で形成され得ることが示される。中間体Ｎ－アルキルイミデートは、より低いｐＨ範囲で形成し、すぐ近傍で別のアミンと架橋されて、Ｎ，Ｎ’－アミジン誘導体をもたらすか、又はアミジン結合に変換されるかの何れかである。
【0045】
スルフヒドリル反応性架橋
スルフヒドリルは、チオールとも呼ばれ、タンパク質においてシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）アミノ酸の側鎖に見出される。一対のシステインスルフヒドリル基は、天然の三級又は四級タンパク質構造の基礎としてポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖間のジスルフィド架橋（－Ｓ－Ｓ－）により連結されることが多い。一般的には、遊離又は還元スルフヒドリル基（－ＳＨ）のみが、チオール反応性化合物との反応に利用可能である。
スルフヒドリルは、チオールとも呼ばれ、タンパク質においてシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）アミノ酸の側鎖に見出される。一対のシステインスルフヒドリル基は、天然の三級又は四級タンパク質構造の基礎としてポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖間のジスルフィド架橋（－Ｓ－Ｓ－）により連結されることが多い。一般的には、遊離又は還元スルフヒドリル基（－ＳＨ）のみが、チオール反応性化合物との反応に利用可能である。
【0046】
スルフヒドリルは殆どのタンパク質中に存在するが、一級アミンほど豊富ではないので、スルフヒドリル基を介した架橋は、より選択的且つ正確である。タンパク質中のスルフヒドリル基は、ジスルフィド結合に関与することが多いので、これらの部位での架橋は一般的に、基礎をなすタンパク質構造を有意に修飾しないか又は結合部位を遮断しない。利用可能な（即ち遊離の）スルフヒドリル基の数は容易に制御又は改変することができ；これらは、天然のジスルフィド橋を還元することにより生成され得るか、又は２－イミノチオラン（トラウト試薬）、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ）若しくはＮ－スクシンイミジルＳ－アセチル（チオテトラエチレングリコール）（ＳＡＴ（ＰＥＧ）４）などのスルフヒドリル付加試薬を使用して一級アミンと反応させることによって、分子に導入され得る。
【0047】
スルフヒドリル反応性化学基は当技術分野で周知であり、ハロアセチル、マレイミド，アジリジン、アクリル合金、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢチオール及びジスルフィド還元剤を含む。これらの基の殆どは、アルキル化（通常はチオエーテル結合を形成）又はジスルフィド交換（ジスルフィド結合を形成）の何れかによってスルフヒドリルにコンジュゲートする。
【0048】
ハロアセチルは、式Ｒ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ハロ（式中、Ｒは、オリゴヌクレオチド及び任意選択的なリンカーである）を有する。好ましいハロアセチルとしては、ヨードアセチル又はブロモアセチル基が挙げられる。
【0049】
マレイミド基は、構造Ｈ２Ｃ２（ＣＯ）２ＮＲ（式中、Ｒは、オリゴヌクレオチド及び任意選択的なリンカーである）を有する。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５～７．５の間である場合、スルフヒドリル基と特異的に反応し、その結果、安定なチオエーテル結合の形成をもたらす。
【0050】
ピリジルジスルフィドは、構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－（Ｃ５Ｈ５Ｎ）（式中、Ｒは、オリゴヌクレオチド及び任意選択的なリンカーである）を有する。ピリジルジスルフィドは、広いｐＨ範囲（最適ｐＨはｐＨ４～５）にわたりスルフヒドリル基と反応して、ジスルフィド結合を形成する。反応時に、分子の－ＳＨ基と試薬の２－ピリジルジチオール基との間でジスルフィド交換が起こる。結果として、ピリジン－２－チオンが放出され、これを分光光度計により測定し、反応の進行をモニターすることができる（Ａｍａｘ＝３４３ｎｍ）。
【0051】
光反応性架橋
光活性化可能な（又は光化学）架橋反応は、反応を開始させるために光からのエネルギーを必要とする。光反応基は、紫外線又は可視光に曝露された時に反応性になる化学的に不活性の化合物である。架橋適用のための試薬において使用される光反応基の実質的に全てのタイプが、分子を活性化するために紫外線光（ＵＶ光）に曝露されなければならない。光反応基の使用は、オリゴヌクレオチドを抗体に付加し、抗体との親和性結合が起こることを可能にするので有利であり得る。次に、混合物をＵＶ光に曝露して、抗体とオリゴヌクレオチドとの間で共有結合の形成を引き起こすことができる。
光活性化可能な（又は光化学）架橋反応は、反応を開始させるために光からのエネルギーを必要とする。光反応基は、紫外線又は可視光に曝露された時に反応性になる化学的に不活性の化合物である。架橋適用のための試薬において使用される光反応基の実質的に全てのタイプが、分子を活性化するために紫外線光（ＵＶ光）に曝露されなければならない。光反応基の使用は、オリゴヌクレオチドを抗体に付加し、抗体との親和性結合が起こることを可能にするので有利であり得る。次に、混合物をＵＶ光に曝露して、抗体とオリゴヌクレオチドとの間で共有結合の形成を引き起こすことができる。
【0052】
抗体に対する共有結合を形成させるためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる反応基として使用され得る光反応基としては、アリールアジド、アジドメチルクマリン、ベンゾフェノン、アントラキノン、ある種のジアゾ化合物、ジアジリン及びソラレン誘導体が挙げられる。好ましい基は、アリールアジド及びジアジリンである。
【0053】
アリールアジドは、アジド基（Ｎ＝Ｎ＝Ｎ）で置換されるアリール基を含む。アリールアジドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。ＵＶ光に曝露すると、ニトレン基が形成され、これは二重結合又はＣＨ及びＮＨ部位への挿入を伴う付加反応を開始することができる。
【0054】
ジアジリン基は、式Ｒ－ＣＨＮ２を有し、式中、Ｒは、オリゴヌクレオチド及び任意選択的なリンカーである。ＵＶ光に曝露された場合、カルベン中間体が形成され、これは、求核性又は活性水素基を含有するアミノ酸側鎖と共有結合を形成し得る。
【0055】
或いは、抗体が本発明のプロセスで脱グリコシル化されている場合、グリカンの一部又は全てをオリゴヌクレオチドで置き換えることができる。このプロセスを行うための方法は、米国特許第９９８７３７３６号明細書に記載の方法を含め、当技術分野で公知である。この方法は、グリカンに低分子を連結させるために以前使用されている。これは、オリゴヌクレオチドなどの大きい分子を連結させるために以前使用されていない。
【0056】
別の態様では、本発明は、（ａ）存在するならば最も内側のＧｌｃＮＡｃ部分の後の、天然の保存されたアスパラギンＮ－グリカンのエンドグリコシダーゼに基づく除去を含む、コンジュゲーション可能な糖の導入、（ｂ）官能性Ｎ－グリコシドの結合及び（ｃ）官能性Ｎ－グリコシドペイロードをコンジュゲーションハンドルと反応させることを含む方法に関する。
【0057】
従って、本方法は、
（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化するステップ；
（ｂ）修飾抗体脱グリコシル化抗体に官能基を結合して修飾抗体を形成するステップ；
（ｃ）修飾抗体修飾抗体を反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと修飾抗体との間で共有結合を形成するステップ、
を含み得、
ここで、反応基は官能基と反応して、共有結合を形成し；及び
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は、少なくとも１μＭである。
（ａ）抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内の保存されたＮ－グリコシル化アミノ酸を脱グリコシル化するステップ；
（ｂ）修飾抗体脱グリコシル化抗体に官能基を結合して修飾抗体を形成するステップ；
（ｃ）修飾抗体修飾抗体を反応基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドと反応させて、オリゴヌクレオチドと修飾抗体との間で共有結合を形成するステップ、
を含み得、
ここで、反応基は官能基と反応して、共有結合を形成し；及び
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は、少なくとも１μＭである。
【0058】
抗体は、官能基を連結することによって修飾される。好ましくは、修飾されたＧｌｃＮＡｃ部分は、官能基を含む糖部分を結合することによって形成される。これは、糖部分を好ましくは抗体上のＮ－アセチルグルコサミン部分に連結する酵素の存在下で、１個又は複数の官能基を有する糖部分と抗体を接触させることによって達成され得る。適切な酵素としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばｐ（１，４）－ガラクトトランスフェラーゼ、ｐ（１，３）－Ｎ－ガラクトトランスフェラーゼ、β（１，４）－ガラクトトランスフェラーゼが挙げられる。β（１，４）－ガラクトトランスフェラーゼは、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）及びＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）を含む米国特許第７，４８２，１３３号明細書に記載のものなどの突然変異体触媒ドメインを含有し得る。
【0059】
本明細書中で使用される場合、「糖」という用語は、単糖を指すために使用され、「糖部分」という用語は、単糖誘導体を指し、これは１個又は複数の官能基を含有する。糖部分は好ましくは、糖又はアミノ糖、例えばガラクトース、マンノース、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、フコース又はシアル酸に由来する。より好ましくは、糖部分は、好ましくはガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、グルコース、Ｎ－アセチルガラクトサミン又はＮ－アセチルグルコサミンに由来する。
【0060】
糖部分は、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシド二リン酸などのヌクレオチドをさらに含み得る。このようなヌクレオチドの例としては、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）が挙げられる。好ましくは、ヌクレオチドはＵＤＰである。適切なヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸は、国際公開第２００９／１０２８２０号パンフレットに記載される。
【0061】
ヌクレオチドを含む糖部分の例としては、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルアジドガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－ガラクトサミン（６－ＡｚＧａｌ－ＵＤＰ）、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルアジドガラクトサミン（４－ＡｚＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ）、ＵＤＰ－６－アジド－６－デオキシ－Ｄ－グルコース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ）、ＵＤＰ－６－アジド－６－デオキシ－Ｄ－グルコース（６－ＡｚＧｌｃ－ＵＤＰ）、６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ－ＵＤＰ、２－ケトＧａｌ－ＵＤＰ、２－Ｎ－プロピオニルＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ、２－（ブト－３－イオニック酸（ｙｏｎｉｃ ａｃｉｄ）アミド）－２－デオキシ－ガラクトース－ＵＤＰ、６－クロロ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ）、６－チオ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ）２－クロロ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ）、２－チオ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ）、６－クロロアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ）、６－チオアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ）、２－クロロアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ）、２－チオアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ）、３－チオプロパノイルアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ－ＵＤＰ）及び４－チオブタノイルアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＢｕＳＨ－ＵＤＰ）が挙げられる。好ましくは、糖部分は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルアジドガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ）又は６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰである。
【0062】
好ましくは、糖部分は、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して酵素的に結合するガラクトサミン由来部分である。
【0063】
官能基の酵素的結合は一般的に、４～５０℃、好ましくは１０～４５℃、最も好ましくは３０～３７℃で行われる。
【0064】
官能基の酵素的結合は一般的に、約ｐＨ４～約ｐＨ９、好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ８．０、最も好ましくはｐＨ６～ｐＨ７．５で行われる。
【0065】
本明細書中で使用される場合、「官能基」は、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基から選択され得る。
【0066】
本明細書中で使用される場合、「アジド基」は、－Ｎ３Ｒｎ（式中、各Ｒは、水素、ハロゲン及び（任意選択的に置換される）Ｃ１～Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択され、ｎは０、１又は２である）として定義される。好ましくは、ＲはＨであり、ｎは１又は２である。より好ましくは、ｎは０である。
【0067】
適切なアジド含有糖部分は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルアジドガラクトサミン（ＵＰＤ－ＧａｌＮＡｚ）を含む。
【0068】
本明細書中で使用される場合、「ケト基」は、－Ｒ１（Ｏ）Ｒ２基として定義され、式中、Ｒ１は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基であり、Ｒ２は、水素、ハロゲン及び任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択される。好ましくは、Ｒ２は水素である。
【0069】
本明細書中で使用される場合、「チオール基」は、－Ｒ２ＳＨ基として定義され、式中、Ｒ２は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基である。好ましくは、Ｒ３は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。
【0070】
本明細書中で使用される場合、「チオール基の前駆体」は、本明細書中で－Ｒ３ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３基として定義され、この式中、Ｒ３、その上、その好ましい実施形態は、チオール基に関して上記で定義される通りである。最も好ましくは、前記チオール－前駆体は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、－ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３又は－ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、好ましくは－ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３である。修飾糖タンパク質の調製のためのプロセスの間に、チオール前駆体がチオール基に変換される。
【0071】
本明細書中で使用される場合、「スルホニルオキシ基」は、－Ｒ４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５基として定義され、式中、Ｒ４は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基であり、Ｒ５は、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。好ましくは、Ｒ４は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。Ｒ５は、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル基、Ｃ６～Ｃ１２アリール基、Ｃ７～Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７～Ｃ１２アリールアルキル基である。より好ましくは、Ｒ５は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。最も好ましくは、スルホニルオキシ基は、メシラート基、－ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホナート基（－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５）又はトシラート基（－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）である。
【0072】
本明細書中で使用される場合、「ハロゲン化アセトアミド基」は、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６Ｘ基として定義され、式中、Ｒ６は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基であり、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。好ましくは、Ｒ６は、水素又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。好ましくは、Ｘは、Ｃｌ又はＢｒであり、より好ましくは、ＸはＣｌである。
【0073】
本明細書中で使用される場合、「メルカプトアセトアミド」は、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ７ＳＨ基として定義され、式中、Ｒ７は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基である。好ましくは、Ｒ７は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。好ましい例としては、メルカプトエタノイルアミド基、メルカプトプロパノイルアミド基、メルカプトブタノイルアミド基及びメルカプト－ペンタノイルアミド基、好ましくはメルカプトプロパノイルアミド基が挙げられる。
【0074】
本明細書中で使用される場合、「スルホニル化ヒドロキシアセトアミド」は、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１０基として定義され、式中、Ｒ９は、任意選択的に置換されるＣ１～Ｃ６アルキル基であり、Ｒ１０は、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。好ましくは、Ｒ９は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。Ｒ１０は、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル基、Ｃ６～Ｃ１２アリール基、Ｃ７～Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７～Ｃ１２アリールアルキル基である。より好ましくは、Ｒ１０は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。最も好ましくは、スルホニルオキシ基は、メシラート基－ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホナート基－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５）又はトシラート基－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）である。
【0075】
本明細書中で使用される場合、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素として定義される。好ましくは、ハロゲンは塩素又は臭素である。
【0076】
本明細書中で使用される場合、「アリール」基は、Ｃ６～Ｃ１２単環式又は二環式構造を指す。任意選択的に、アリール基は、１個又は複数の置換基により置換され得る。アリール基の例は、フェニル及びナフチルである。
【0077】
本明細書中で使用される場合（ａｓ ｕｓｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ａｓ）、「アリールアルキル」及び「アルキルアリール」は、少なくとも７個の炭素原子を含む基を指し、単環式及び二環式構造を含み得る。任意選択的に、アリールアルキル基及びアルキルアリールは、１個又は複数の置換基により置換され得る。アリールアルキル基は、例えばベンジルである。アルキルアリール基は、例えば４－ｔ－ブチルフェニルである。
【0078】
本明細書中で使用される場合、「アルキル」基は、１～８個の炭素原子を含有し得る。これは、直鎖状又は分岐状又は環状であり得る。非置換アルキル基は、環状部分も含有し得る。任意選択的に、アルキル基は、１個又は複数の置換基により置換される。好ましくは、アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基である。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、２－プロピル、ｔ－ブチル、ペンチル、シクロペンチル、１－ヘキシル、シクロへキシルなどが挙げられる。
【0079】
本明細書中で使用される場合、「アルキニル」基は、炭素－炭素三重結合を含み、２～１０個の炭素原子を含有し得る。末端アルキニルは、三重結合が炭素鎖の末端の位置に配置されるアルキニル基である。任意選択的に、アルキニル基は、１個又は複数の置換基により置換され、及び／又は酸素、窒素及び硫黄の群から選択されるヘテロ原子により中断される。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルなどが挙げられる。
【0080】
本明細書中で使用される場合、「シクロアルキニル」基は、環状アルキニル基であり、３～１０個の炭素原子を含有し得る。任意選択的に、シクロアルキニル基は、１個又は複数の置換基により置換される。シクロアルキニル基の例は、シクロオクチニルである。好ましいシクロアルキニル基は、ジベンゾシクロオクチンである。
【0081】
本明細書中で使用される場合、「ヘテロシクロアルキニル」基は、酸素、窒素及び硫黄の群から選択されるヘテロ原子により中断されるシクロアルキニル基である。任意選択的に、ヘテロシクロアルキニル基は、１個又は複数の置換基により置換される。ヘテロシクロアルキニル基の例は、アザシクロオクチニルである。
【0082】
本明細書中で使用される場合、「任意選択的に置換される」とは、基が、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８～Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ及びシリル基からなる群から選択される１個又は複数の置換基で置換され得ることを意味する。本明細書中で使用される場合、シリル基は、式（Ｒ１２）３Ｓｉ－により表され得、式中、Ｒ１２は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、式中、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択的に置換され、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個又は複数のヘテロ原子により任意選択的に中断される。
【0083】
官能基を含むものとして本明細書中で定義される修飾抗体は、反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと反応して、オリゴヌクレオチドと修飾抗体との間で共有結合を形成する。オリゴヌクレオチドは、官能基及び反応基の反応により形成される共有結合を含むリンカーを介して修飾抗体にコンジュゲートされるようになる。
【0084】
オリゴヌクレオチド及び修飾抗体を結合する反応は一般的に、４～５０℃、好ましくは１０～４５℃、最も好ましくは３０～３７℃で行われる。一般的には、反応は４℃で一晩行われる。
【0085】
オリゴヌクレオチド及び修飾抗体を結合する反応は一般的に、約ｐＨ４～約ｐＨ９、好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ８．０、最も好ましくはｐＨ６～ｐＨ７．５で行われる。
【0086】
反応基は、官能基と反応して共有結合を形成する。修飾抗体上の官能基と共有結合を形成する適切な反応基は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第９，９８７，３７３号明細書に記載されるものである。
【0087】
官能基がアジド基である場合、修飾抗体とオリゴヌクレオチドコンジュゲートとの連結は、好ましくは環化付加反応を介して起こる。この場合、反応基は、好ましくは、アルキニル基、好ましくは末端アルキニル基、及びシクロアルキニル基からなる群から選択される。反応基がアジド基であり、官能基がアルキニル基、好ましくは末端アルキニル基及びシクロアルキニル基からなる群から選択されるように反応基及び官能基が逆である場合でも、類似の反応が起こり得る。好ましいシクロアルキニル基としては、ジベンゾシクロオクチンが挙げられる。
【0088】
官能基がケト基である場合、修飾抗体とオリゴヌクレオチドコンジュゲートとの連結は、好ましくは、ヒドロキシルアミン誘導体又はヒドラジンとの選択的コンジュゲーションを介して起こり、それぞれオキシム又はヒドラゾンをもたらす。この場合、反応基は、好ましくは、一級アミノ基、例えば－ＮＨ２基、アミノオキシ基、例えば－Ｏ－ＮＨ２又はヒドラジニル基、例えば－Ｎ（Ｈ）ＮＨ２である。反応基がケト基であり、官能基一級アミノ基であるように反応基及び官能基が逆である場合でも、類似の反応が起こり得る。
【0089】
官能基がアルキニル基である場合、修飾抗体とオリゴヌクレオチドコンジュゲートとの連結は、好ましくは、環化付加反応、好ましくは１，３－双極子環化付加を介して起こる。この場合、反応基は、好ましくは、１，３－双極子、例えばアジド、ニトロン又はニトリルオキシドである。反応基がアルキニル基であり、官能基が１，３－双極子であるように反応基及び官能基が逆である場合でも、類似の反応が起こり得る。
【0090】
官能基がチオール基である場合、修飾抗体とオリゴヌクレオチドコンジュゲートとの連結は、好ましくはマイケル型付加反応を介して起こる。この場合、反応基は、好ましくは、マイケル型付加の場合はＮ－マレイミジル基、求核性置換反応の場合はハロゲン化アセトアミド基又はチオール－エン反応の場合は末端アルケンである。反応基がチオール基であり官能基がＮ－マレイミジル基、ハロゲン化アセトアミド基又は末端アルケンであるように反応基及び官能基が逆である場合でも、類似の反応が起こり得る。
【0091】
官能基がハロゲン、ハロゲン化アセトアミド基、スルホニルオキシ基又はスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基である場合、修飾抗体とオリゴヌクレオチドコンジュゲートとの連結は、好ましくはチオールとの反応を介して起こり、チオエーテルを形成する。この場合、反応基は、好ましくは、チオール基を含む。反応基がハロゲン、ハロゲン化アセトアミド基、スルホニルオキシ基又はスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基であり、官能基がチオールであるように反応基及び官能基が逆である場合でも、類似の反応が起こり得る。
【0092】
しかし、反応基は、アルコール基又はアミン基も含み得る。
【0093】
好ましい一選択肢では、官能基及び反応基は、アジド基及びシクロアルキニル基又はアルキニル基；チオール基及びＮ－マレイミド基、ヨードアセトアミド、クロロアクテアミド（ｃｈｌｏｒｏａｃｔｅａｍｉｄｅ）又はジスルフィド基；ケトン又はアルデヒド基及びヒドラジン、アシルヒドラジン、アニリン又はアルコキシアミンから選択される。
【0094】
好ましくは、官能基及び反応基は、アジド基及びシクロアルキニル基から選択され、好ましくは、シクロアルキニル基は、シクロオクチン基、より好ましくはジベンゾシクロオクチンである。
【0095】
別の態様では、本発明は、本発明によるプロセスにより得られるオリゴヌクレオチドによって標識化された抗体を提供する。
【0096】
別の態様では、本発明は、抗体をオリゴヌクレオチドによって標識化するための本発明のプロセスでの使用のためのキットであって、
（ｉ）反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド；及び任意選択的に
（ｉｉ）官能基及び反応基が共有結合を形成するために反応することが可能である、修飾されたＧｌｃＮＡｃ部分を形成することが可能な官能基を含む化合物；及び／又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ特異的なエンドグリコシダーゼ；及び／又は
（ｉｖ）β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ
を含むキットを提供する。
（ｉ）反応基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド；及び任意選択的に
（ｉｉ）官能基及び反応基が共有結合を形成するために反応することが可能である、修飾されたＧｌｃＮＡｃ部分を形成することが可能な官能基を含む化合物；及び／又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ特異的なエンドグリコシダーゼ；及び／又は
（ｉｖ）β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ
を含むキットを提供する。
【0097】
キットの好ましい実施形態は、本発明のプロセスに関する記載の通りである。キットは、本明細書中に記載される本発明の方法を行うための説明書をさらに含み得る。
【0098】
本発明による方法は、５０ｂｐよりも大きいオリゴヌクレオチドに関する抗体コンジュゲーションの９０％以上の効力を達成することが可能である。好ましくは、方法は、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上、最も好ましくは１００％の効力を達成する。１００％の効力は、存在する各抗体が少なくとも１つのオリゴヌクレオチドによって標識化されることを意味する。好ましくは、抗体分子内の各重鎖は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドによって標識化される。
ここで、次の図面を参照して本発明を例示する。
ここで、次の図面を参照して本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【0099】
【発明を実施するための形態】
【0100】
実施例
実施例１ トラスツズマブ抗体のＤＮＡ標識化
通常、炭水化物処理前に抗体の再緩衝化が必要である。収集チューブに取り付けられた１００ｋＤａ遠心分離限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）に、溶液中の１５０μｇのトラスツズマブ抗体を添加する。抗体を添加した後、フィルターユニットにＴＢＳ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）を５００μｌまで満たし、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離した。フロースルーを廃棄した。５００μｌのＴＢＳを添加し、４℃にて１４，０００ｇで１０分間、もう一度フィルターを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。フィルターを上下逆にして新しい収集チューブに入れ、これを短時間遠心分離して（１０００ｇ、２０秒）、再緩衝化した抗体試料を収集した。試料は、約３０μｌの最小体積を有するはずである。そうではない場合、十分なＴＢＳを添加して３０μｌの最小体積を得る。
実施例１ トラスツズマブ抗体のＤＮＡ標識化
通常、炭水化物処理前に抗体の再緩衝化が必要である。収集チューブに取り付けられた１００ｋＤａ遠心分離限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）に、溶液中の１５０μｇのトラスツズマブ抗体を添加する。抗体を添加した後、フィルターユニットにＴＢＳ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）を５００μｌまで満たし、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離した。フロースルーを廃棄した。５００μｌのＴＢＳを添加し、４℃にて１４，０００ｇで１０分間、もう一度フィルターを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。フィルターを上下逆にして新しい収集チューブに入れ、これを短時間遠心分離して（１０００ｇ、２０秒）、再緩衝化した抗体試料を収集した。試料は、約３０μｌの最小体積を有するはずである。そうではない場合、十分なＴＢＳを添加して３０μｌの最小体積を得る。
【0101】
抗体ヒンジ領域上の炭水化物の修飾は、ＩｇＧのいくつかのサブクラス及び種において最も内側のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分までＦｃグリカンを加水分解する、Ｆｃ特異的なエンドグリコシダーゼＥｎｄｏＳ２（Ｇｅｎｏｖｉｓ）又はＥｎｄｏＳ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によるアスパラギン－２９７の脱グリコシル化から始まる。酵素は、高－マンノース、ハイブリッド、複合型及び二分型のグリカンを含む、全てのグリコフォームを除去する。２６μｌのＧｌｙｃｌＮＡＴＯＲレジン（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ中に取り付けたＭｏｂｉｃｏｌ ”Ｆ”スピンカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ）に移した。レジンの洗浄は、２ｍｌのＴＢＳを含有するシリンジを連結することによって行った。短い遠心分離（１０００ｇ、２０秒）によってレジンを排液した。抗体結合を、３０μｌの抗体溶液をレジンに添加し、室温で３時間インキュベートすることによって行った。Ｍｏｂｉｃｏｌカラムを新しく清潔な１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに取り付けたものを使用して、短時間の遠心分離（１０００ｇ、２０秒）によって、消化された抗体を収集した。抗体を残さず収集するために、１０μｌのＴＢＳをレジンに添加し、短時間遠心分離した（１０００ｇ、２０秒）。プールした抗体溶液は、およそ４０μｌの体積を有するはずである。
【0102】
β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼＹ２８９Ｌ＊（ＧａｌＴ）を使用して、アジド含有ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルアジドガラクトサミン二ナトリウム塩（ＵＰＤ－ＧａｌＮＡｚ）を露出したＧｌｃＮＡｃ部分に酵素的に結合させて、アルキン保有標識と反応性があるアジド－活性化抗体を生成した。０．５μｌの緩衝液添加物（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を抗体溶液に添加した。２０μｌのＴＢＳ中でＧａｌＴ（Ｙ２８９８Ｌ）酵素を溶解し、１．３μｌの溶解したＧａｌＴを抗体溶液に添加した。３μｌの再構成したＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ（４０μｌ ＴＢＳ中）を抗体溶液に添加した。上下にピペッティングすることによって溶液を混合し、３０℃で遮光して一晩インキュベートした。
【0103】
遊離ＵＰＤ－ＧａｌＮＡｚを除去するために、４５０μｌのＴＢＳを抗体ＧａｌＴ反応に添加し、収集チューブに取り付けた１０ｋＤａ遠心分離限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）に移した。このユニットを４℃にて１４，０００ｇで５分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。５００μｌ ＴＢＳを添加することによって、アジド修飾抗体試料を洗浄し、４℃にて１４，０００ｇで２０分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。新しい収集チューブ中でこのユニットを上下逆転させることによって試料を収集し、短時間（１０００ｇ、２０秒）遠心分離した。
【0104】
オリゴヌクレオチドをコンジュゲートするために、３μｌの１ｍＭジベンゾシクロオクチンをコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド（５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４オリゴヌクレオチド）を抗体溶液（２０～３０μｌ）に添加し、切断されたａｓｎ－２９７グリカン部分のＤＮＡでの置き換えを促進した。Ｃ’Ｅループ又は／及びＣγ２－Ｃγ３ドメインへのＤＮＡ結合のＫｄはマイクロモル濃度範囲なので、完全な置き換えのためにはミリモル未満～ミリモル範囲の有効濃度が必要である。混合物を遮光して４℃で一晩インキュベートした。化学選択的ライゲーション反応の低い二分子速度定数は、オリゴヌクレオチドの速い非共有結合が先行するので、克服されると考えられる。
【0105】
抗体標識の効率を検出するために、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づく電気泳動図分析によって、コンジュゲート抗体の効率を決定した。１００μｌのＰｉｅｒｃｅ（商標）タンパク質Ａ／Ｇアガロースレジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＭｏｂｉｃｏｌ Ｓｐｉｎカラムに充填した。２ｍｌのＴＢＳでレジンを洗浄し、短時間（１０００ｇ、２０秒）遠心分離して、レジンから排液させた。抗体－オリゴヌクレオチド混合物全体をレジン上に載せ、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、レジンを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、短時間遠心分離した。製造者に従い、５０μｌの溶出緩衝液（ｐＨ３）をレジンに添加することによって、抗体を溶出させ、室温にて１０分間インキュベートした。チューブを短時間（１０００ｇ、２０秒）遠心分離し、ｐＨ中和緩衝液中でフロースルーを収集した。オリゴヌクレオチドによる抗体の標識化効率を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）上でＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０チップを使用して決定する（製造者の説明書に従う）。
【0106】
比較として、Ｔｈｕｎｄｅｒ－Ｌｉｎｋ（登録商標）ＰＬＵＳ Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（製造者により提供されるＥｘｐｅｄｅｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｅｒｖｉｃｅ）を使用して、抗体の共有結合による非選択的コンジュゲーションを行った。図２で示されるように、これは、製造条件下でおよそ１０％の標識効力をもたらす。ＭＷマーカーのオリゴヌクレオチドコンジュゲーション－レーン１、ペルツズマブ非コンジュゲート抗体－レーン２、ペルツズマブオリゴヌクレオチドコンジュゲート－レーン３、トラスツズマブ非コンジュゲーション抗体－レーン４、トラスツズマブオリゴヌクレオチドコンジュゲート－レーン５。４－１２％ビス－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、還元試料及びＭＯＰＳ緩衝液中で行った。左－オリゴヌクレオチドＤＮＡを検出するＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色、右－タンパク質を検出するＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色。推定される標識効力は、およそ１０％である（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００上で行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０チップに基づく）。
【0107】
図３で示されるように、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０チップを使用して、ＤＮＡコンジュゲートトラスツズマブ抗体を分析した。水平スケールは、ｋＤ（キロダルトン）である。２６．５のピークは抗体軽鎖であり、一方で５３．７のピークは抗体重鎖である。標識化された重鎖の分子量は６９．６ｋＤであり、これは、計算された分子量と一致する。表１に従う、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０ Ｃｈｉｐの実行（図３から）。計算した標識化効力は、１つの重鎖に対して９９．３％であり（１－［ｐｅａｋ５３．７／［ｐｅａｋ５３．７－ｐｅａｋ６９．６］］＝０．９９３）、抗体全体の標識化効率は９９．９９５％であり、これは実際には１００％であると考えられる。
【表1】
【0108】
実施例２
抗体調製
本プロセスのために１００～１５０μｇのトラスツズマブＩｇＧ抗体を使用した。１００ｋＤ限外ろ過カラム（Ｓｉｇｍａ，ＵＦＣ５１００９６）を使用して、抗体をＲＮＡｓｅ不含の超純水（ＵＰＷ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２４３６５７４）に入れて再緩衝化し、４５０μｌの体積のＵＰＷを添加し、４℃にて１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを廃棄する。このプロセスをもう一度繰り返した。カラムを上下反転させて新しい収集チューブに入れ、短時間のスピン（１，０００ｇ、２０秒）によって抗体を収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌである。
抗体調製
本プロセスのために１００～１５０μｇのトラスツズマブＩｇＧ抗体を使用した。１００ｋＤ限外ろ過カラム（Ｓｉｇｍａ，ＵＦＣ５１００９６）を使用して、抗体をＲＮＡｓｅ不含の超純水（ＵＰＷ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２４３６５７４）に入れて再緩衝化し、４５０μｌの体積のＵＰＷを添加し、４℃にて１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを廃棄する。このプロセスをもう一度繰り返した。カラムを上下反転させて新しい収集チューブに入れ、短時間のスピン（１，０００ｇ、２０秒）によって抗体を収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌである。
【0109】
脱グリコシル化：抗体のＦｃドメイン上での炭水化物の修飾
再緩衝化した抗体を１．５ｍｌの反応チューブに移し、４μｌ ＥｎｄｏＳ酵素及び４μｌ １０ｘＧｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）を抗体に添加した。ＲＮＡｓｅ不含の超純水を４４μｌまで添加した。上下にピペッティングすることによって反応物を混合した。３７℃で１時間抗体をインキュベートした。その後、１ｘＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）中で脱グリコシル化抗体を再緩衝化した。このために、脱グリコシル化抗体を、１００ｋＤ限外ろ過カラムに添加する。抗体溶液から脱グリコシル化緩衝液を除去するために、４５０μｌの体積の１ｘＴＢＳを添加して再緩衝段階を２回行い、カラムを２ｍｌ収集チューブに入れ、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離し、これらのステップをもう一度繰り返した。フロースルーを廃棄した。カラムを上下反転させて新しい収集チューブに入れ、抗体を短時間スピンすること（１，０００ｇ、２０秒）によって収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌであった。
再緩衝化した抗体を１．５ｍｌの反応チューブに移し、４μｌ ＥｎｄｏＳ酵素及び４μｌ １０ｘＧｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）を抗体に添加した。ＲＮＡｓｅ不含の超純水を４４μｌまで添加した。上下にピペッティングすることによって反応物を混合した。３７℃で１時間抗体をインキュベートした。その後、１ｘＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）中で脱グリコシル化抗体を再緩衝化した。このために、脱グリコシル化抗体を、１００ｋＤ限外ろ過カラムに添加する。抗体溶液から脱グリコシル化緩衝液を除去するために、４５０μｌの体積の１ｘＴＢＳを添加して再緩衝段階を２回行い、カラムを２ｍｌ収集チューブに入れ、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離し、これらのステップをもう一度繰り返した。フロースルーを廃棄した。カラムを上下反転させて新しい収集チューブに入れ、抗体を短時間スピンすること（１，０００ｇ、２０秒）によって収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌであった。
【0110】
ＭＳＴ結合アッセイ：グリコシル化及び非脱グリコシル化されたトラスツズマブ抗体を使用し、リジン一級アミン残基のブロックを伴うか又はブロックを伴わない。
一級リジン残基をブロックする効果を調べた。実験は、抗体の正荷電リジン残基と負荷電ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の電荷を伴う相互作用に基づいて抗体とＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間で非共有結合が起こるか否かを調べる。Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＲＥＤ－ＮＨＳ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎキットを、標識化及び色素除去を含む製造者のプロトコールに従って使用した。色素は、一級アミン（リジン残基）と反応して共有結合を形成する反応性ＮＨＳ－エステル基を保有する。従って、リジン一級アミン残基がブロックされる。ＲＥＤ色素はＭｏｎｏｌｉｔｈ及びＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴに適している。ＲＥＤ検出器（Ｎａｎｏ及びＰｉｃｏ）及びＤｉａｎｔｈｕｓ ＮＴ．２３ ｓｅｒｉｅｓを伴う自動化装置。リガンドオリゴヌクレオチド（名称：ＬＩＧＯ
５’－ＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣＣ－３’ ５９ｂｐ）（配列番号１）を、アッセイ設定で示されるように使用した。
一級リジン残基をブロックする効果を調べた。実験は、抗体の正荷電リジン残基と負荷電ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の電荷を伴う相互作用に基づいて抗体とＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間で非共有結合が起こるか否かを調べる。Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＲＥＤ－ＮＨＳ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎキットを、標識化及び色素除去を含む製造者のプロトコールに従って使用した。色素は、一級アミン（リジン残基）と反応して共有結合を形成する反応性ＮＨＳ－エステル基を保有する。従って、リジン一級アミン残基がブロックされる。ＲＥＤ色素はＭｏｎｏｌｉｔｈ及びＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴに適している。ＲＥＤ検出器（Ｎａｎｏ及びＰｉｃｏ）及びＤｉａｎｔｈｕｓ ＮＴ．２３ ｓｅｒｉｅｓを伴う自動化装置。リガンドオリゴヌクレオチド（名称：ＬＩＧＯ
５’－ＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣＣ－３’ ５９ｂｐ）（配列番号１）を、アッセイ設定で示されるように使用した。
【表2】
【0111】
【0112】
【0113】
【0114】
結果を図７に示す。
【0115】
結果
生体分子間の相互作用の生物物理学的な分析のためにマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用した。ＭＳＴを、非蛍光オリゴヌクレオチドリガンドの濃度の関数としての抗体標的の温度誘導性蛍光変化のために使用した。ＭＳＴ測定を行って、抗体の標識化のために使用されるｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体自身との間の結合能を同定した。抗体標的に関する自己蛍光（トリプトファン蛍光に基づく）条件下で、０．１ｍＭよりも高いオリゴヌクレオチド濃度は、特徴的な結合曲線を示し、このような曲線は、グリコシル化及び非グリコシル化トラスツズマブ抗体の両方に対して検出された（図４及び５）。一方で、抗体リジン残基をブロックする条件下では、このような結合曲線は検出されなかった（図６及び７）。実験結果から、抗体とＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の非共有結合が、抗体（正荷電リジンと仮定）と負荷電ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の荷電相互作用に基づくことが確認される。
生体分子間の相互作用の生物物理学的な分析のためにマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用した。ＭＳＴを、非蛍光オリゴヌクレオチドリガンドの濃度の関数としての抗体標的の温度誘導性蛍光変化のために使用した。ＭＳＴ測定を行って、抗体の標識化のために使用されるｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体自身との間の結合能を同定した。抗体標的に関する自己蛍光（トリプトファン蛍光に基づく）条件下で、０．１ｍＭよりも高いオリゴヌクレオチド濃度は、特徴的な結合曲線を示し、このような曲線は、グリコシル化及び非グリコシル化トラスツズマブ抗体の両方に対して検出された（図４及び５）。一方で、抗体リジン残基をブロックする条件下では、このような結合曲線は検出されなかった（図６及び７）。実験結果から、抗体とＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の非共有結合が、抗体（正荷電リジンと仮定）と負荷電ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドとの間の荷電相互作用に基づくことが確認される。
【0116】
実施例３－抗体標識化のための代替的な高効率プロトコール
１００μｇトラスツズマブ抗体の再緩衝化
簡潔に述べると、１００ｋＤ限外ろ過カラム（Ｓｉｇｍａ，ＵＦＣ５１００９６）を使用して、４５０μｌの体積のＵＰＷ、超純水（ＵＰＷ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２４３６５７４）を添加し、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離し、フロースルーを廃棄する。このプロセスをもう一度繰り返した。カラムの上下を反転させて新しい収集チューブに入れ、短時間のスピン（１，０００ｇ、２０秒）によって抗体を収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌである。２０μｌの再緩衝化抗体に３μｌのＥｎｄｏＳ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）、３μｌの１０ｘＧｌｙｃｏ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）及びＵＰＷを３０μｌの総体積になるまで添加することによって、脱グリコシル化ステップを行った。パラフィルムで覆って３７℃で１時間、混合物をインキュベートした。ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ連結のために、２．５ｍｇ ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚの１本のバイアルに２５０μｌのＵＰＷを添加し、２０分間再構成した。脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｓｏｌａｔｅｄ）抗体反応に、０．５μｌの緩衝液添加剤（Ａｃｔｏｍｅ）、３μｌの再構成されたＧａｌＮＡｚ及びＵＰＷを４３．５μｌの総体積までを添加し、混合した。混合後、１．３μｌのＧａｌＴ（Ａｃｔｏｍｅ）を添加し、混合し、パラフィルムで覆って遮光して３０℃にて一晩インキュベートした。
１００μｇトラスツズマブ抗体の再緩衝化
簡潔に述べると、１００ｋＤ限外ろ過カラム（Ｓｉｇｍａ，ＵＦＣ５１００９６）を使用して、４５０μｌの体積のＵＰＷ、超純水（ＵＰＷ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２４３６５７４）を添加し、４℃にて１４，０００ｇで３分間遠心分離し、フロースルーを廃棄する。このプロセスをもう一度繰り返した。カラムの上下を反転させて新しい収集チューブに入れ、短時間のスピン（１，０００ｇ、２０秒）によって抗体を収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌである。２０μｌの再緩衝化抗体に３μｌのＥｎｄｏＳ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）、３μｌの１０ｘＧｌｙｃｏ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｐ０７４１Ｌ）及びＵＰＷを３０μｌの総体積になるまで添加することによって、脱グリコシル化ステップを行った。パラフィルムで覆って３７℃で１時間、混合物をインキュベートした。ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ連結のために、２．５ｍｇ ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚの１本のバイアルに２５０μｌのＵＰＷを添加し、２０分間再構成した。脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｓｏｌａｔｅｄ）抗体反応に、０．５μｌの緩衝液添加剤（Ａｃｔｏｍｅ）、３μｌの再構成されたＧａｌＮＡｚ及びＵＰＷを４３．５μｌの総体積までを添加し、混合した。混合後、１．３μｌのＧａｌＴ（Ａｃｔｏｍｅ）を添加し、混合し、パラフィルムで覆って遮光して３０℃にて一晩インキュベートした。
【0117】
１００ｋＤ限外ろ過カラム（Ｓｉｇｍａ，ＵＦＣ５１００９６）を使用して、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚを除去した。４００μｌの体積の１ｘＴＢＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）を添加し、４℃にて１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。このプロセスをもう一度繰り返した。カラムの上下を反転させて新しい収集チューブに入れ、短時間のスピン（１，０００ｇ、２０秒）によって抗体を収集した。フロースルーの体積は約２０～３０μｌであった。
【0118】
クリックケミストリーを、２μｌの１ｍＭ ５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－オリゴヌクレオチドを抗体調製物に添加し、ボルテックスミキサーにより混合し、次いで短時間スピンを行い、パラフィルムで覆って、４℃で一晩インキュベートすることによって行った。製造者の説明書に従い、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０キットを用いて４μｌの標識化された抗体溶液を分析した。標識化効率を計算した：
【数1】
【0119】
図９は、本方法が、オリゴヌクレオチドにより標識化されたトラスツズマブを９９．２％の標識化効率で生成することことを示す。２６ｋＤのピークは軽鎖を示し、５２．１ｋＤのピークは抗体の非標識化重鎖を示し、抗体の標識化重鎖は７４ｋＤである。
【0120】
抗体標識化のために同じプロトコールを使用し、２μｌの１ｍＭ ５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４オリゴヌクレオチドの代わりに５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４オリゴヌクレオチドの異なる濃度を使用して効率を決定し、３μｌ（０．１５ｍＭ）、初期設定２μｌ（０．１ｍＭ）（プロトコールで見られる）、１．５μｌ（０．０７ｍＭ）及び０．３μｌ（０．０１５ｍＭ）を使用して実験を行い、標識化有効性の濃度依存性を実証した。
【0121】
結果
３μｌ（０．１５ｍＭ）、初期設定の２μｌ（０．１ｍＭ）（上記参照）、１．５μｌ（０．０７ｍＭ）及び０．３μｌ（０．０１５ｍＭ）の１ｍＭ ５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４オリゴヌクレオチドを使用して、標識化有効性の濃度依存性が実証され、図９で示されるような抗体と核酸との間の測定されたＭＳＴ親和性を裏付ける。このことは、高濃度オリゴヌクレオチドが、実質的に１００％の標識化効率をもたらす高い標識化効率のために必要であることを実証する。
３μｌ（０．１５ｍＭ）、初期設定の２μｌ（０．１ｍＭ）（上記参照）、１．５μｌ（０．０７ｍＭ）及び０．３μｌ（０．０１５ｍＭ）の１ｍＭ ５’－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４オリゴヌクレオチドを使用して、標識化有効性の濃度依存性が実証され、図９で示されるような抗体と核酸との間の測定されたＭＳＴ親和性を裏付ける。このことは、高濃度オリゴヌクレオチドが、実質的に１００％の標識化効率をもたらす高い標識化効率のために必要であることを実証する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【配列表】
【国際調査報告】